HU228066B1 - Allergen microarray assay - Google Patents

Description

Alíergéu mérésére szolgáló «íemsmnK-trúg? mérési eljárás

A találmány tárgyát, képezik allcrgéut kötő IsumungtóböliH mintában lörtéoé detskhllására szolgáló eljárás, valamint allergiák betegben történő őt rtmo diagnózisára szolgál® eljárás.

Az allergia olyan reakció, amelyet a test immunrendszere mutat normális kórülmények között ártatmatlann&k gondolt anyaggal szemben Ez a válaszreakció az, amely az allergiás reakciókként besorolt tüneteket okozza. Az allergia ezért sem az immunrendszer gyengesége, hanem túlműködése. Allergiás személy sBergé&re adott válaszreakciója a tünetek széles skáláját mutathatja,. Egyesek olyan tünetektől szenvednek, mint az aszkma, ekcéma, .kiütések, szemviszketés, arcüreg-gyelladás, bedugult vagy csöpögő orr és szénanátha, azonban súlyosabb tünetek is előfordulhatnak. Például a állatok mérgével (w»o»í) diófélékkel és kssgyiókkttl szembeni allergiák esetében egy potenciálisan életveszélyes állapot az an&blakíikus sokk léphet fel Ez akkor történik, ha a test olyan súlyos tüneteket produkál, mint a torokdüzzasaí, a vérnyomás csökkenése és a személynek légzési nehézségei vannak Bizonyos esetekben az ilyen típusú reakció végzetes lehet.

Az allergiák .előfordulási aránya a tej lelt országokban i azaz Európában, Észak-Amerikában és Japánban) növekvő. Becslések szerint a lakosság 2S-S0%-a érintett. Ismert tény, hogy az allergiákat az immunrendszer kásgyensülyozadaa T~sejtes részmüködése okozza. Pontosabban az allergiákat az úgynevezett (segítő) T2-sejtekaek.(Th2) a üNper l-sejtekhez viszonyított megnövelt aktivitása kísért, amely megnövelt .IgE-termelést okoz.

AzigE az egyik anyag, amely allergiás reakciókat okoz. Az aitergénre specifikus IgE normális körülmények között nem detektálható a vérben, és csak akkor termelődik. ha valaki valamilyen anyaggal .szemben érzékennyé válik Az allergiát okozó ;myagok (amelyeket aílergéodcnek nevezünk) olyas speciíikns ígE termelését váltják ki, amely egyedi, és amely csak azzal az: anyaggal reagál. Az ígE és az aliergén közötti ilyen reakció a zár és a kulcs esetére emlékeztet Az .ígE az ailergétsnel kapcsolódva a sejteket kémiai anyagok (p:l. hisztamín) kibocsátására készteti, amelyek az allergia tüneteit okozzák. Hordozhatunk több,, mint egy sttyagra specíhkus IgE-tés ezáltal lehetünk allergiásak több anyagra. Az IgE-iesztek eredményeit olyan fokozatokban adják meg, ami azt jelzi, hogy a vérben mennyi a tesztelt anyagra specifikus IgE, Minél nagyobb ez az arány, annál valószínűbb, hogy a beteg allergiás. Az utóbbi évtizedekben az allergiás betegségeket a fő tófergésíonúsokhői részlegesen megtisztított extraktumok alkalmazásával diagnosztizálták. Nyilvánvaló módon az ilyen nyers keverékek összetétele komplex és változó. Ennek kővetkeztnényekénf az ilyen extrakrómokhnn rejlő diagnosztikai lehetőségek változóak és rófe negatív eredményekhez vezethetnek. Az utóbbit tóképp az sllergének estraktninokhaa tapasztalt instabilitásának íalajdoiáíotíák. Az exratomok allergiák diagnosztikájában történő alkaiaiasássnak egy másik hátránya a kereskedelmi forgalomban, hozzáférhető termékek aUergénősszeíéíel szempor^áböl gyenge standardízállratósága, A batássosság jellemzők kltójezó egységek és a számítási eljárások mindem kereskedelmi cég esetében különböző. Ennek következtében a különböző cégektől származó diagnosztikai termékek nehezen ósszefeasonKtfeaíosk.

A legfontósabh, betegséggel összefüggő komponenseket, a tó allergéneket az utóbbi évtizedekben azonosították, azonban mennyiségi meghatározásuk nem szokásos az silergénextraktumok standardizálása céljából. A fő allergénekkeí szembeni menoklonális antitestek már hozzáférhetőek.

Az allergiateszt Ismert eljárásokkal történő végrehajtása nem célravezető. Ezek az eljárások alkalmasak lehetnek, feltéve., hogy anamnézist veszünk fel a legalkalmasabb teszt azonosítása céljából. Azonban csak né« «φ«κ +*ν·* ** * * φ * # * » * X *.♦«· ««

ΦΦΦΧ Φ « « Κ * X « « »φ φφ φφφ φφ hány olya® eHsnsert orvosi teszt van, amely alkalmas allergiák azonosítására, és .általános szabály, hagy esek alkalmazását klinikai laboratóriumokra vagy specialistákra korlátozzák. Az átépít*. vagy allergia diagnózisát képzett gyakorló orvos vagy specialista viszsonyiag könnyen felállíthatja. azonban gyakran további tesztek, szükségesek ennek igazolására.

Az alábbiakban ismertetjük & különböző sfegi&tosztolö eljárásokat:

1. Bórkareolási eljárás

A lélfétefezeb ailergéneket a bor alá «yektábák, és a reakciói képzett nővér vagy orvos állapítja meg. A reakció kifejlődésével vörös sáv látható, és őrinél erősebb a reakció, annál nagyobb a. sáv. A börteszt egészen érzékeny, azonban nem minden aifergra azonosíibató ezzel az eljárással.

2. Tapaszteszt

A tapasztoszí alkalmas lehet kontakt tfermaíiiisz esetében, A tesztaajagot rendszerük & tapasszal fedett bőrre viszik fel, és 4S órán át tartják ott. Pozitív reakció kis területen ekcémát okoz, A reakciót ebben az esetben is képzett nővér vagy orvos állapítja meg.

3. Álieraativ allergiateszt

Sok alternatív teszttípus van, ás sajnos kevés köztük a pontos vagy az orvost szakma által elismert Ezek az alternatív tesztek gyakran felrevezetőek, valamint költségesek,

4. fegu-teszí.

Ά Pegö-teszt elektromos teszt amelyet bioenergettkus szabályozó eljárásként írnak le. A berendezés vezetőképességei mér í'Páenístone-kör alkalmazásával. Elektródákat vezetnek az akupunkforás pontokhoz, vagy a beteg a kezében tartja ezeket. Különböző oldatokat helyeznek fémtálcára. Ezután kalibrálják a készüléket olyan módon, hogy a tálcára toxikus anyagos tartelnrasó üvegtlolöt helyeznek. A rfola az elektromos vezetőképesség csökkenését okozza, Ezótán más anyagokat teszitek a tálcára, és ha hasonló eredményű: adnak, ez allergiás vagy „érzékenységi” reakciót jelent. Ezt a technikát széles körben alkalmazzák az „egészséges élelmiszert” kínáló üzletekben (bioboltok), azonban alkalmazhatósága nem bizonyított és nincs érvényes- vizsgálat, amely igazolná az állításokat

5. T-ottko-eitoíoxikus teszt

A leuko-citotoxicsíáss eljárásban a beteg fehérvérsejtjeit specifikus étel kivonatával keverik, és ezután a sejteket különböző módokon méréseknek vetik alá a változás bizonyos formáinak megállapítására. Sok pozitív es/ó/í ttegaíiv reakció fordul elő, az Amerikai Afegiaakadémia azt a következtetést vonta íe, hogy a teszt alkalmassága éfoJaÖeigá vagy belegzésseí bejutó allersén okozta allergia tt»gnózis&s nern bizonyított.

ő. Hajvizsgálat

A. tesztelés egy másik formája a hajvsxsgálaí. A haj vizsgálható toxikus fémek, mint például ólom, higany vagy kadmíum, vagy kis mennyiségű szelén, cink, krém, mangán és magnézium jelenlétére. A nehézfomtsérgezás (vizsgálata) elismert és jól dokumentált eljárás a törvényszéki orvoslásban, és a haj-vizsgálat femeknek vak? kitettséget jelezhet, A hajvízsgáhtt alkalmazhatóságát allergia diagnózisában azonban a „varázsvesszőhöz;’ hasonlóan sohasem igazolták.

?. Alkalmazott kiaezfolőgia

Az. ételminíát a beteg nyelve alá helyezik, v&gy ovegíartályban a. kezébe adják, Ezután a beteg másik kezével a vizsgáló készülékre nyomást gyakorol. Az allergiás válaszreakciót ügy detektálják, hogy az csökkent izoxnreakeióbísn nyilvánul meg, és a beteg a kezét nehézen emeli fel. Ez az eljárás csődöt mond, ha kettős vak&

ΦΦ

ΦΦ* ΦΧ φ *«*«' ΦΦ φ ♦ X X Φ » X Φ

X Φ Φ ΦΦ Φ*χ

ΧΧΦΦ V Φ Φ Φ Φ Φ X

V Λ* ΦΧ ΧΦΦ φφ próbának vetjük alá.

Szett felül az allergiák diagnózisára sok /«· vitrn eljárás; van, amelyek a beteg vérében IgE- vagy IgQmttitesteket detektál:

& Hagyományos- eljárásokat, mim például £.ő/Xd-t vagy alkalmaznak a beteg száramáfean antitestek (rebomhinám} nllergének segítségével történő (IgB) detektálására.

9. Ratlks-allergénszorben» test (RARW);

Ebben az eljárásban speelEkus allergént körnek psplrfemezre; a (beteg) tesztezeremhan esetlegesen. jelen lévő immunspeeilíkus IgtS a lemezre kötődik; a detektálást radíozotóppal jelölt, IgE-eliem antitesttel hajtják végre. Különböző pontozási rendszereket alkalmaznak a teszteredmények összehasordttásástt a negatív kontroll maximális (abszolút) kötésével, Álteiábsn a móílosltottRdú'(©-eljárást egy éjszakán át történő irskubáiás követi, és ez nagyobb érzékenységet etedméayez.

lő, £AS7©~alapú kvantitatív IgE-gátlási kísérlet, amelyben alfergén-exuaktumekat visznek (el pontokban ín»;} maocellálőz-esasokm. Ssérummht-ákat {a/á?aet) előinkubálrtak speeitlkns mkembináns allergének keverékével, majd ezt a keveréket inksbáhák a nitroeeilulóz-cslktíkon. A kötődött IgE-t humán ÍgE-eÖeai sitdtestekköl detektálják. Utolsó lépésként a fekombináns afergéttekkei történő eiőabszorpció után a. természetes exteakttunok IgE általi kötésének gátlását számítják.

i. Ceiluláris antígénstumilálssi teszt (GÖ’f), amelyben a beteg bazotH sejtjeit interleukin-3-mal sthunIálják, majd EB/S/l-ban mérik a de «ovo teietkezettés felszabadult sznlEd-ieuköíriént (SLT).

12. UniCAP: Rekombináns alfergéneket inimobi&áln&k szilárd fázisú szerkezeten, majd olyan antigéneket kötnek rá, amelyeket a beteg szérumában találtak, és amelyek az allergén ellen termelődlek.

Ezek •az eljárások azonban az egyedi kísérteti lépések sokaságát igénylik nagyszámú (pl. 1ÖÖ) különböző allergén teszteléséhez. Ráadásul a. fent ismertetett tesztek nem eléggé érzékenyek és megbízhatóak, ezenkívül idíirablóak. Ezen kívül nagy a minta (pl, a beteg széruma) mennyisége, valamint a tisztított, esetleg retesnbiaáas, költséges allergén mennyisége is,_: amelyek az ilyen tesztek végrehajtásához szükségesek.

A US 4 444 879. sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat tárgyúi képezi olyan, immunológiai mérési eljárás és berendezés, amely teljes smnungloboiin és IgE meghatározására alkalmas. Itt az aliergéneket extrahálják és míkrotiterlemez polimerrel burkolt mélyedéseiben itntnobáízálják, A vizsgálandó mintát ezután a mélyedésekhez adják és hagyományos immunológiai mérési eljárást hajtanak végre.

Az EP 0 556 745 Al, sz, európai szabadalmi iratban leírnak búzafehérje ellem IgE-amítesiek testfolyadékokban történő detektálására szolgáló eljárást, attól a b&maUergén-extraktumet szilárd fázisra immohilizúlják, ahol a szilárd fázis például krojmttográfíás vagy kapilláris közeg vagy rost, üveg, nylon, cellulóz vagy ezek származékai üveggyöngyökön, mikrorészecskéken, lemezeken vagy mikrolíter-lentezekea. Itt is 'nagyományos immunológiai mérési eljárást hajtanak végre antitestek betegből származó mintájában történő detektálása céljából

A US 3 720 ?öö sz. amerikai egyesük államokbeli szabadalmi irat tárgyát képezi mmtungfobalinok festfolyadékokban való vizsgálatára szolgáló eljárás. Emlék során is kereskedelmi forgatómban beszerezhető, aliergéntertálmú extoktumokat vízben nem oldódó polimerhez kapcsolnak, majd hagyományos immunológiai mérési eljárást hajtanak végre.

A US 4 849 337. sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi íratnák is tárgyát képezi aliergénspeeihkus igE-szintek azonosítására szolgáló eljárás, amelynek sorát! a szémm-lgE-l oldhatatlan hordozóhoz kilapasztetí aBergenaeí fcoujugáláak. 14 az allergén lehet extraktum vagy közvetlenül pollenekből, porból, állatokból stb. származó .aikagének.

Ezek a hagyományos iannonológiai mérési eljárások azonban -nem -alkahaasak beteg allergia szempontjából történő tesztelésére, mivel a különböző allergiák száma néhány százra nőtt, és folyamatosa» nő. Egy beteg szérumának minden lehetséges és ritka allergiára tőrtéaÖ vizsgálatához szükséges idő és munka túlságosat? sok, és nem hajtható végre olyan kiboratőriumokbaa, ahol nti?xier: nap betegek százainak .mintáit keli vizsgálni.

A találmány tárgyát képezi ezért ailergánt kőié immunglobulin detektálására szolgáló olyan eljárás biztosítása, amely nem mutatja ^a feat ismertetett hátrányokat, és mely végrehajtható- rövid idő alatt, kis mennyiségű minta és sifcrgén felhasználásával, amely nagyon megbízható és érzékeny, és ami a legfontosabb, lehetővé teszi «gyeden mérési eljárásban gyakorlatilag korlátlan számú ailergén detektálását

A találmány tárgyát képezi továbbá allergiák betegben történő m viteo diagnózisára szolgáló olyan eljárás biztosítása, amely nélkülözi a fest ismertetett hátrányokat

A fenti eljárást az jellemzi, hogy egy vagy több adergést mietw&*ey-chtp-«a immobSizáinsk, majd a mintát az itnmobáizálí sliergénekkel iskubáijsk úgy, hogy az allergénekre specifikus imnmnglobnlinök a specifikus alfergénhez kötődnek, majd az allergéneket detektáljak.

A mfcrww-ofcat az utóbbi Időben adaptálták számos olyan DNS-manipuláláss eljárás céljára, amelyek •a tudományos közösségben azóta meghonosodtak. Ezek a DNS-cátp-ek számos, különböző illákban hozzáférhetővé váltak, és végső soron meg fogják változtatni a kísérletek tervezésének módját a rutinszerű laboratóriumi mmkábatt Az fo vltiro DNS-diagnózis kevésbé időrabló és munkaigényes, mivel ez az új technológia lehetővé teszi az eljárás komplexitását nagy átbocsátó képességű tormában. Ennek következtében a proteomikai kutatásban a klasszikus szilárd fázisú ssubsztrátok, mint a míkrotiter-lemezek, membránszürók és míkroszköptárgylemezek nugy sűrűségű mtc«smty-fermáí vesznek fet Az új és sokoldalú fohérje-űrray-tochnológla végső soron lehetővé teszt a géntechnológiai és molekuláris kölcsönhatások nagy átbocsátó képességű szfcríáelését („Ingb-through-puí”, HTi [Walter és ?nísai,, Curr. Opín. Mferohiol. 30), (jón.) 298-302 (2000); Emiií & Cagney, Nát Eiotechneh l§(ápr.): 393-7 (2ÖÖÖ)]. Az utóbbi időben a fehérje-uírűy koncepcióját adaptálták irosnunolégiaí mérési eljárásokba?? történő alkaitnazásokra.

Leírják a .gfocájn-et, amely tehetővé' teszi a nagy átbocsátó képességű, többszörössé tett (,.multiplex), Enzimmel kapcsolt im?rtunszorhens mérési eljárásokat (EZJX-l-kat). Ezek a bíeebipsk tartelmnzhamak például optikailag sík üveglapot, amely 9ő mélyedést: tartalmaz, hídroióh 71?l?w-sabloitBsl' kialakítva, azonban másformájú és anyagú hiocbipek is ismertek.. Kísérletek bizonyítják, hogy úvegfemieten (szubsztráton) elrendezett ícfeérje-antigének specifikus, multiplex detektálása végrehajtható. Az ilyen új, nagy átbocsátó képességű szkrixielésre alkalmas (HTS) formáim további alkalmazásai többek között a ceitoláns fehétje-expresszíoproSi közvetlen meghatározása, fertőző részecskék multiplex meghatározása, és ráktiíagnosztika [hlendoza, L, G .és mísai., Biötechniques 27(4); 778-80 (1999)).

Az Ilyen ismert, rnjkro-ítmty-cbi.p-eljárásokbmt azonban az antitesteket inratobiiizáiíák a. tnikro-örmychipen. Meglepő módon azt találtok, hogy a nííkro-mvny-chipre nemcsak antitestek, hanem akár aiiergéoek kötése is lehetséges^, amelyek specifikus antitestek, közelebbről IgE és IgG megfelelő antigénjei. Ez a tény különösen meglepő, mivel: a fenkcíoaáhs allergének meghatározott másodlagos szerkezettel rendelkeznek. amely módosulhat az ilyen nagy sűrűségben: szilárd fázishoz, ínint például mikroehiphez történő kötéskor. Az sitergének szerkezete ilyen módosulása iuterferálhal az anatest-altergén-kötéssel, ami fals negatív eredményekhez φ * .·· * ♦ * φφ ««.«. φφ *

v«2efeet Az antitestek, astaimt-fegttteasek vagy peptidek viszonylag kisméretűek és stabilak, ezáltal az antitestek viszonylag stabilabbak ©Maiban, mist a megfelelő antigének. Szilárd hordozón ünmobilfeálva azonban még az anfeestek is csak néhány szszalékhan mM; intaktak és aköv&k.

I-laab- és munkatársai cikke [i-laab és másai., Genom Btology 1(6): preprini 0001,1- öOöl,22 (2900)1 amelyet. 2Ö0Ö, november 9fen fogadtak el, fehérjék és antitestek oldatban történd detektálására és mennyiségi meghatározására szolgáló £ehéde- mferotewv-t ír le. A közleményben letek szerint végrehajtott vizsgálat eredményei azt mntmják, hogy a felvitt antigéneknek csak 50%-a. és a felvitt antitestek 20%-a tette lehetővé a megfelelő aifergének speesükus és pontos mérését.

Ráadásul a tehetséges ütegének öiverzitása természetesen sokkal nagyobb, mint az antitest-diverziíás, a fehérjék szempontjából (111, a fehérjékkel való munka szempontjából), különösen a szerkezetileg változatos aífergénsk ilyen sorozata immofeiiizáfe és festése szempomjáböl. Meglepő módon azonban- kimutattuk, hogy ?«?c.ma,m«y-ehipen ímuíobőizált felemének nagy megbízhatóságot és érzékenységet mutatnak immungfebulmok. mintában történő detektálására szolgáló eljárásban.

Ez az szíjára» lehetővé teszi nagy szántó, spedSkas allergénhez kötődő immunglobulin egyetlen kísérlett lépésben történő kimutatására szolgáló mérési: eljárás végrehajtását, ahol a mérési eljárás szintén atomizálható; több, mint 1ÖÖ különböző allergsn tesztelhető anélkül, hogy több, -egyedi kísérteti lépést kellene végrehajtani, ahogyan a hagyományos mikröstrálási formánál szükséges. Ráadásul ez a mérési eljárás nagyon érzékeny és megbízható. Az. ilyen eljárás teszteredményeit rövid időn beiül megkaphatjuk, például körülbelül bárom órás belül, a hagyományos &4ST- vsgyjEZJS/l-tesztekhez: viszonyítva lerövidítve a mérési időt.

Ráadásai a mi&vsfrsy mérési eljárás nagymértékben reprodukálható, ha különböző személyektől származó mintákat tartalmazó chipekkel ismételt kísérleteket hajtunk végre, például mikroiítertemez-sze.rü maszkkal, ahol minden mélyedés számos, különböző sitergés foltját tartalmazza, és egy szentélytől származó mintát adunk mélyedésenként. A találmány szerint eljárás -egy további előnye abból a tényből származik, hogy nagyszámú, különböző próba viszonylag kis helyet foglal el, ami nagy- söröséget. tesz lehetővé. Az «wy kis fel-szte extrém módon egységes kötési feltéteteket enged meg íhómérséktetszsbályozás, sótartalom, stb.), míg a próbák extrém nagy száma tehetővé teszi a hibridizáció sagyrotekbea párhuzamos feldolgozását. A nagy sűrűség» iím-jy-k nagyszámú próbát tartaimazmak, ezért lehetséges számos kontroll biztosítása, például többek között kontrollok az adod allergén változataihoz vagy mutációihoz, kontrollok az általános hibridizációs kötúlmésyekbez, kontrollok a muiía-előállhási körúhnényetehez és: bázispárösodásihiba-konmoiiok (mteteá; szándékolta® téves párosításéi minták kontrolijai) a sem specifikus kötéshez vagy kereszihdbridizációhez.

Ráadásul a mérési eljáráshoz csak minimális anyagrészieí szükséges (altergért, vsiamná minta), a b&~ gyomrmyos mérési rendszerekhez vsszonyiíva. Ez azt jelenti, hogy azonos mennyiségű klíndulásj anyaggal sokkal több mérési reagenskésztet állítható elő a síteíourrny forma alkalmazásával, és kisebb mennyiségű anyag szükséges a nagyszámú, allergénekhez kötő immunglobulin tesztelésére. Ezen felül kis térfogatokban a kötés nagyon gyorsan végreltojthatő.

A természetes, intakt „inmmnglohülinök’’ vagy antitestek általában ¥ alakú íetramer molekulák» ahol a felső karok végén antlgénköíő helyek vannak. Egy artigénkötöhely a nehéziáue variábilis domenjából és az azzal kapcsolódó, kösnyülánc-variábilisdnn-éHból áll. Közelebbről, egy antitest antigén-kötőhelyét alapvetően a nehéziáne variábilis doteaja (V. Ή.) 3 CDR-e (komplementaritást meghatározó régiók), és a kőnnyölánc variábilis doménia (V.L.) 3 CDR-e alkotja, ·*’».» φ* * *·♦♦·♦ φ φ • ♦ * Φ« *ΦΦ Φφ ♦ *»* » « χ * φ * Φ * *Χ *φ ΦΦΦ ΦΦ

- 6 Általában az „antigén” kifejezése» immunválasz kiváltására képes anyagot értünk, és rendszerint est az anyagot alkalmazzuk a megfelelő antitestek detefeálásráa & sok in v/tro és in vívó immünölégkíi eljárás során, amelyek rendeltetéssé állnak az antigén-aiititest-kölcsőnhaíások bemutatására.

Hasotáó módon az „allss-gén” kifejezést alkalmazzak antigénre, amely specifikus (azaz IgE) antitesteket indukál és ezekkel kosnbioálódlk, és amely a gyakran. előforduló allergiákért felelős;: azonban ez. utóbbi definíció nem· zárja ki annak tehetőségét, hogy az sltergéu reaktív antitesteket is indukálhat, amelyek, az lg.E-töl eltérő osztályú immunglobulinok is lehetnek.

Fehérjék vagy peptidék esetében az „ínímobtlizálás” kifejezésen a fehérje vagy pepiid szilárd hordozóhoz való, hagyományos eljárásokkal történő kapcsoklsát értjük, a szilárd hordozó és az silergén közötti további távtartó fosp&cer”) alkalmazásával vagy anélkül. Fehérjék vagy gepúdek hordozóhoz való ímmobüizáiása a tecbsárában Ismert eljárás; a találmány oltalmi körébe tartozik bármely innuobifeáláss eljárás, például a kovalens, nem kovalens, különösen a hidrolób kölcsönhatások például a membránokkal és szintetikus teteinekted, stfe.

A „ntíOí'Ortzröy különböző „jellegzetes minták’' (pl. „födök’'} elrendeződése, ahol a diszkrét minták sűrűsége legalább körülbelül lő/crró, előnyösen legalább körülbelül 64/ctt?, előnyösebben legalább körülbelül Üő/em'· és a legelőnyösebben legalább körülbelül Iflöő/cm'. Á minták a mícro.'zrrsy-on tipikus dimenziókkal, például átmérővel rendelkezik, körülbelül a lö-SSOö pm-es tartományban, előnyösen körülbelül az 50-500 pmes tartománybasn előnyösebben körülbelül az I50-25Ö pm-es tartományban, és az omry-on tnás mintáktól körülbelül ugyannkkors távolsággal elválasztva. Ezáltal a találmány szerinti, rutinszerű, tömeges szkrínelésre alkalmas «tícíornTny-oo legalább 5őti, előnyösen 1000 egyedi felt van, amely allergénekel, standardokat és kontroliokat tartalmaz.

A. találmány szerbül „cltip” gyakorlatilag bármilyen formájú lehet, például tárgylemez vagy mikrohíerlemez mélyedése, vagy akár felszínek seteága, azonban előnyős a planátis n.oojy-felszln.

A detektálást lépés végrehajtható bármely, a szakember számára ismert hagyományos eljárással, például fizikai, enzhsatikus, kémiai reakcióval, stb.

A találmány előnyös megvalósítási módja szerint immuísglobulmkéttí IgE-koí detektálunk. Ismereteink szerint az IgE az az anyag, amely allergiás reakciót okoz, és amely csak akkor termelődik, ha valaki egy anyagra érzékennyé válik, azaz allergia esetén. Ezáltal akkor, ha egy mmta esetében azt teszteljük, hogy az specifikus atiergénre érzékeny allergiás betegtől szárasszík-e, a mintát HntnunglobuhnkénE igE-re teszteljük. Minél magasabb a mintában az IgE mennyisége, árnál valószttíűbb, hogy a mintát adó beteg allergiás, a. specifikus allergénre nézve.

Előnyösen Igö-t detektálunk íntmnrsglöbuktAént. Ismereteink szerint igfí vas jelen olyat) beteg miníaElönyösen egy vagy több, tisztított afiergéní immobiiizálunk a mferoarroy-chipen. Ezeket az -- egyedi ~ ailergéneket például afiergénexímkfifmböl tisztítjuk, például specifikus élelmiszerből vagy növényekből Természetesen specifikus fajták egy vagy több alfergénfe vizsgálható egyidejűleg.

A tisztítási eljárások ismertek a szakember számára, például kromatográfiás tisztítás, tisztítás tömeg szerinti elválasztással az ailerges szilárd hordozóhoz történő specifikus kötésével történő tisztítás, például antitest által, ssb, A nagy tisztaságú alfergánek alkalmazását nagyszámú allergiateszt előállításába;) eddig nem javasolták.

• Χ*φ X

X 4> X **♦

Φ ♦ χ» »« *

A Aisztitott” atisrgén kifejezés olyas egyedi aiíergénekre vonatkozik, amelyek lehetnek például natív, rekotobináns vagy szintetikus ótoo elöállitotí aliergének, Ezek -a tisztított allergének számos fontos, előnyős tulajdonsággal rendelkeznek az aSergénexíraktümhoz viszonyítva, ha szilárd hordozón immcbihzáljuk: a bármely extraktumbaa előforduló, különböző fehérjék keveréke miatt a tesztelendő aliergérsek konceanttciója nagyon alacsony a tisztítóit, egyedi aflergénpteparáKmokhaz viszonyítva, A tisztított, egyedi allergének ezáltal nagyon nagy koncettíráctobatr imatobíSzálhatóak a íBteruamfy-a. Mivel a tisztított alfergénekst tertebnaző preparátumban egzakt és tnsghatározott molekulák vasasak jelen, csak a meghatározott allergéneket iíKínobikzáljuk a fntoroöfroy-n. Ezáltal a microefray és az atitkesteket tisztított aliergének segítségévei meghatározó e|áxás.smáajxSzÁlbató és pontos minőségi kontroliaknak vethetjük alá.

Ráadásul -atkétótoényfeea sí tisztított aliergéttek nagy koncentrációja miatt az alíergénsket nagyobb koncenteáctóbs» immobiiizáljnk a ??ítotwr?-ay-n, és szidtál az ilyen weröűmry segítségévei történő bármely detektálási eljárás érzékenyebb, mitat az allergéní tartalmazó exíraktumot tartalmazó Micraamtp-í alkalmazó eljárás. A tisztított, egyedi aílergéttefc egy másik előnye az allergériextrafcfeunokktíl szemben abban a tényben rgjük, hogy az immobtiizsh, tisztított ategóaek exakt: módon meghatározottak A tisztított aifergénekkel szemben az ahergénexírakíumok tartalmazzák például egy organizmus vagy objektum két, három vagy több, ktdönbözó alíergénjék például az alma esetében egy sxtraktínn különböző aknaaliergéneket tartalmaz, .míg: a találmány szerinti készítmény a tisztított airnaaSefgének közül egyet; tartalmaz, vagy —az: alkalmazástól Riggöes- két vagy több alma- vagy más allergéö meghatározott keverékét

A tisztított allergések aess tisztított, s&rgénekhez, például az extraktumokhoz viszonyított további előnye abban a tényben rejlik, hogy a további szennyezések miatt az extraktom csak 'bizonyos ideig stobíí, és példán! penészedhet. Ez azonban hatást gyakorol az allergiák detektálására, mivel léteznek penészre jelentkező allergiák, amelyek esetében pozitív eredményt kapánk.

Ráadásul az extrttktnmokban jelen levő proteázok miatt az extraktumok a tisztított aifergénekkel ellentétben instabilak.

Ráadásul a jefeníeg létezd, tisztított alfergéaeket alkalmazó terápiáknak köszönhetően az azonos, tisztított itílergénkomponensseí történő diagnózis -jelentős előny a nem tisztított ahergértekkel történő diagnosztikával szemben. Ás ilyet*, diagnosztikák köiöttösett előnyösek az szí. követő, tisztított tthergénekke! végrehajtott terápia szempontjából és a specifikus terápiára adott egyedi reakció szcnipomjáböl, és ezáltal „betegre szabott terápia biztosítható,

A fenti okokból különösen előnyös az ailergénhez kötődő inmmnglöbufm. mintában történő detektálására szolgáló olyan eljárás, ahol egy vagy több allergént ttóAtoírmtv-chipen immobÜizáluak.

Előnyösen egy vagy' több rekombínáas: aliergént Immobtlfeálunk merwmty-chípen. Az utóbbi néhány évben számos rekembtoáns ailergént állítottak elő. A rekombtóas alk-rgének előállítása elvben szintén ismert a technika állástt szerint, azonban kevéssé gyakorolt hatást a rutinszerű alkrgisteszíelésrfi, Refeotabmáas afegéaek alkalmazásával lehetséges egy vagy több specifikus aüergén nagy mennyisége biztosítása, és ezáltal teszt érKékenységörtek opttfaalizálása. Ráadásai lehetséges: a rekojnbbáns altergének specifikus módosítása aUergéittottiációk előállítására speciílkas immattglöbslinnk detektálása céljából. Ráadásul a fö allergének rekonróínáas fehérjék tonnájában íörtésto felhasználása az extraktemokon alapaió tesztek alternatíváját biztosítja a stabilitás, valamint a diagnosztikai standardizálás szempontjából. A tisztított allergéuek nem tisztított sllergénekhez (extraktetok) viszonyított, fettt ismertetett előnyei közül még több alkalmazható a rekombináns ahergénre a tiszti:

» ·> *'♦*'«· *

* Μ φ»

Φ « * « X * *« «XX «χ * Φ « » Φ »

ΦΦ ΦΦΦ φφ tott, natív tűlergénekkel szemben; a rekembísáas: afegenek még specífiteabbsn tervezhetőek, mint a tisztított, natív allergenek, és esálíal lehetséges rekombiríáirs ategéneket alkalmazó teszi affinitásának és speeiőiásának optímaHzáíása. A rekombináns allergéuek szántén Jobban standanSzálhatóak az előállítási módinkra tekintettel. Ráadásul az előállítási tételek („sarzsokí*) közötti külöubsé'gek kisebbek a rekotnbíttáns allergénekttál, mint a természetes forrásból szárraazo allergének esetében. A találmány szerinti megoldás kidolgozásakor meglepő módos kimutattuk, hogy sa ilyen rekofubioáns aUérgeaek alkalmazása a találmány tárgyát képezik rutinszerű m vdro diagnosztikai tesztekben előnyösebb a hagyományos, extraktomokon alapuló tesztrendszerekhez viszonyítva. A technika állása szerinti, rtiimszera, sorozatos tesztelési eljásrásofckal szemben a találmány szerinti, rekombínáns allergétseket is alkalmazó aliergóntesztelési^ eljárás teljesen áj minőséget képvisel a sísttdardizalás, a konttodálhatóság, az érzékenység, reproáaldlhsiöság, a diagnosztikáikig lényeges ínlormáeíó tesztelési 'képessége sfb. szempontjából a standard alSergiatesztelés céljaira..

A fekombínáns allergének például azok, amelyek leírását a kővetkező közleményekben találjuk: Chapman és_: munkatársai, Allergy, 52: 374-279 (1997); Lafeer és mtsat., I Alíetgy Clin. Immunok 9k(2): 652658 (1996); Mtlller és uatsai., Clmíeal and Sxpereneufel Aifergy 27(9): 915-920 (1997); Níedexberger és mtsaí., J. Allergy Clin. Immunoi .192(4,1): 579-591 (1993); Menz és mis&i., CÜrneal and Bxperimental. Allergy 26:5060 (1996), ttmely közleményekre úgy hivatkozunk, mintha a leírásba építettük volna, és ezek a kjtaniíás részét képezik A (refcombniáns) allergéuek további példái többek kősóit, de nem kizárólagosan: rBeíví, röetv'2, rBeivd, rJur-02, Cassi, rPiápl, rFhlpz. rPhlp4, rPhlpSa, rPhlpö, rPhlp?, rPhlpi 1,rPhlpIS, rPaij2, Artvla, fckeíeuröm-profiSin, ApigI, .ApígLö201, Dancl.2, r,Arah2, rÁtrahS, Maldl, Mald2, rPenal, RecCarp, rDerpl, iDetp2.ölöl, rDerp2, t£terp2b, rDérp5, d)er5a, rDerp?, rDerpS, rDsrpIÖ, rTyrp2. ,r.Lepd2.Öl, rí..epdI3. t:Eurm2.Ölöl, rFeídl, rfeldla, rSosá2, egy reprezentatív, m.acskaeredetű allergéu, egy' reprezentatív, kutyaeredetn aliergés, egy reprezenttitiv, BSA-eredetű aliergés, egy reprezentatív, egérsredető aliergés, egy reprezentatív, patkányeredetti állergén, egy reprezentatív, seríéseredeta állergén, egy reprezentatív, juheredetö sllergén, egy reprezentatív, cslrkeersdeiő süergén, sgy reprezentatív, nyúiérsdetü állergén, egy' reprezentatív, hörcsögeredetű aiiergén, egy reprezenttsív, löemdctü állergén, egy reprezentatív, gálám beredeiü állergén, egy reprezentatív, gúmeo-albumin-eredeíií aliergés, HSA, a-Nas, rPene.1, PenslS, r?encI9a, rPencI9b, rAspíi, rAspfla, rAspö, r?\spí3a, rAspib. rAspfen, rAsptb, tAspfea, rAspí?, rAspiB, rAJta2, rMalfl. rMalíS, rMallb, rMalí7, nMaífS, rMaffi, rHevbl, feievbla, rHevb3, rí-íevhfe rHevb9, rHevfclö, rHevbll, rBla§2, rfííagd, rBlsgS, löszihlipáz-A, kiaiorodmáz, tV«sv5. rVesgő,

A találmány további előnyős megvalósítást módja szerint egy vagy több, szintetikus úton előállított alletgént imusobdizáiunk urfezőomuv-ehipeu, Itt a refeombínáas alfetgének esetébe» ugyanazok a fent ismertetett előnyök alkalmazhatóak az allergésexírskfemokkaí szemben és a iiszístoíl, natív alktgénekkel színűben. Peptidek vagy fehérjék szintetikus úton történő előállítására. szolgáié eljárás ismert a technika állása szerint; ailergéuek szintetikus úton történő eióálíiiásávíd lehetséges nagy tisztaságú alfergének biztosítása nttgy mennyiségben és alacsony költséggel, mivel az ilyen előállítási eljárások nagymértékben -automatízáítak. Ráadásai bármely aifcrgéa pontos szekvenciája biztosítható módosításokkal vagy anélkül, ami megnöveli az itawsnglobuiinok detektálására szolgáló eljárás érzékenységéi és megbízhatóságát

Lehetséges az is, hogy specifikus aBergémsek csak ahergéudeteinmrinsáf vagy allergéndoménját alkalmazzuk a találmány szerinti tesztben. £z kiküszöbölheti a nagy fehérjékkel való munka kockázatait és hátrányait, mivel bloehlpck rutinszerű előállításakor rövldebb peptidszerkezeiekeí könnyebb kezelni. £z minden tisztitolt, oatív, rekömbináos és szintetikus: allergén esetére igaz. Ez tehetővé teszi a. továbbiakban egyedi pepiidepiíépok detektálását, amely to vább javítja a diagnosztikai tesztet és a terápiás alkalmazások lehetőségét, küld.nősen a spec ifichás szempontjából.

Különösen előnyős az allergén natív tonnája, vatelint az allergén szintetikus vagy mtembináas formájának azonos chipen történő biztosítása. Előnyös-a tőképp rekombináns vagy szintetikus altergén alkalmazása, azonban az allergén natív formája biztosítható legalább kontrollként további minőségi írtförmacíó nyerése céljából. A találmány szerinti előnyös ehip tehát legalább egy allergén natív és szintetikus vagy rekombináns formáját tartalmazza. Ez biztosítja az altergének különböző tételei javított minőségi kontrollját és standardlzálásáf

Előnyösen egy vagy több kaptám immobil szülünk ailergénkápt a ntioroűrm'-chlpen. Á „kupiért” kifejezésen kis moieknlattoegő (tipikus® kisebb, mint körülbelül 700Ö dalion) anyagot értünk, amely általában állatnak vagy embernek: történő beadáskor önmaga nem képes jelentős mértékben antitestek termelésére. Ez azért tehetséges, mert a haptén túl kiesi althoz, hogy az ímmunreruiszer felismerje. 'Ha azonban haptént nagyobb hordozó molekulához kapcsotok, a httplén sníigéoszsrtí tulajdonságokat nyer. .Más szavakkal a hapténí hordozó hordoztoo&Soáához való kölese (,,asalit”-hordöző-motekdakombmác:i6 létrehozása) lehetővé teszi, hogy « kötött haptérö az állat/ember immunrendszere felismerje, IxEiínuuprecipitációs reakció mehet végbe a hordosőmotekulához kötött) baptén és a baptén ekem antitest között A-&vr>mroy-ekipers immohdizáh haptének biztosításával a chipen nagytsbb sűrűséget érhetünk el.

Természetesen lehetséges az. sllergének fent Ismertetett, különböző formát kombinálása, például rekombiaáas és natív (tisztított) alfelének egyidejűleg történő alkalmazása. E különböző formák kombinálása tehetővé teszi összehasonlításukat és például a rekombtom altergének kontroliját, azonban tehetővé teszi az ailergének különböző, natív preparátumai kontrollját is, amelyek különbözhetnek a biológiai fonások, az előállítási sUsrásók különbözősége, stb, miatt.

Nagymértekben hatékony teszt céljára előnyös olyan altergének alkalmazása, amelyek optimális tulajdonságokkal, például mgy kötési kapacitással rendelkeznek. Előnyős azonban kevésbé vagy különböző mértékben aktív antigének alkalmazása a nem hatékonyan kötődő altergért-válfozaíok detektálására, például híperszenzitizálo terápiákban történő alkalmazásra.

A találmány egyik előnyös megvalósítása módja szerint az allergéoekef a mícmsmry-etópea 1C-2Q00 pm átmérőjű, előnyösen 5Ö-5O(t gm átmérőjű, előnyösebbért I5Ő-25Ö pm átmérőjű fokokban visszük fel. .A foltok átmérője kicsi, ezért lehetséges nagy számú, különböző allergén és különböző koncentrációjú, specifikus allergén imnrobilizáláas a mteroörtny-chipso, ezáltal lehetővé teve egy mtercwmty'-chip biztosítását, amely alkalmas egy - automatizált - lépésben nagyszámú allergén vagy aliergénkoneentrációk vizsgálatát

Előnyösen az allergénekst szilárd hordozott tmmöbillzáliuk, előnyösen üvegből készült hordozóm szintetikus hordozón, sztlikosrfepkáo („x-psu-): és membránon. Az ilyen chipek eiőállithaíőak például a kővetkező közleményekben leírtok szerint Ge, H., Náciéin Acids: .Research, 2S(e3): i-vil (2000); Quisn, W. és mísaL Chaical Chermsby. 46: 1456-1463 (2000); MaeBeaás, G, és mtsaí,, Science, 289: 1760-1763 (2ÖÍ10), amely közleményekre úgy hivatkoznak, mintha a leírásba építettük volna, és ezek: a kibontás részét képezik. .Az ilyen anyagok mindegyike specifikus jellegzetességeket és előny őket mutat, amelyek a szakember számára jól ismertek. Ezáltal a arteoarnsy-Chíp anyagát a tesztelendő ailergénnek, a kötött: immunglobulinok detektálására szolgáló eljárásnak, az alkalmszoti puffereknek t?5c-gfel«lően válsszijnk ki. Az anyagválasztás ráadásul finauciáhs kérdés.

«· 0

ΙΟ «♦*« «« ««XX »« « * » * « X

X »χ *«* «·* χχ* * « χ * « 1» * «♦ »♦ *«« ♦«

Előnyősén a wbwarísiy^tópol kémsailag médösbjuk, előnyösen amuíorsaktfv és k«»boxireátöv nsédo.siiással, Ez lehetővé teszi azt, hegy pontosan meghámozzák az aílergén «licf'oafrav-ehipre való kötődésének médiát

Előnyösen az sllergénekst kovalens ntőáoa kötjük a /8K.w«ms^-ctópre. Ez lehetővé teszí sz allergiát .mmm^mzy-ehlpre való stabil kötődését, ezáltal különösen megbízható eljárás biztosítását.

A találmány egy másik, előnyős megvalósítási módja -szerint az immunglobulinokat misíábaa» .azaz' vérszérumban detektáljuk. Adott allergémsei szemben érzékeny allergiás betegben az immunglobulinok főképp a vámáramban termelődnek, így a vérszérum vizsgálata az immunglobulinok detektálásának megbízható eljárását biztosítja. Ráadásul a vérszemmel a betegtől könnyen nyerhetjük, és a mintavételt akár a beteg otthonában is végrehajthatjuk.

-Előnyösen a vérszéramof 1:1 - 1:15 arányban, előnyösön 1:5 arányban hígítjuk. A hígítást végrehajthatjuk bármely, alkabaas oldattal, például !x TBST-vei (1Ö niM Tris-BCl, pH «.0, 150 asM NaO, 0.5% Tweea-20),

Előnyösen a mintát 1 perc - 24 órán át, előnyösebben 1-2 órán át mkubábuk az- aiíergénnel. Természetesen lehetséges, hogy a mintát az allergénekks! napokon át: inkubáljuk. Ez, azonban .nem eredményezi a Jel intenzitásának vagy .specifiíásának növekedését. Általában 1 órás inkubálás elegendő a megbízható és érzékeny eredmény eléréséhez.

Ráadásul -a mintát előnyösen 0-öO^aC közötti, előnyösebben 3T€-os· hőmérsékleten mkubáliuk az allergénekkel. Alacsonyabb hőmérsékleteken történő snkubálás nem eredményezi a jel növekedését, azonban megnöveli. a nem specifikus kötést és a háttérzajt. Kimutattuk, hogy a ?7^uC-on történő inkubálas egzakt és megbízható eredményeket ad a barnán allergésíesztak esetébea.

Előnyösen a kötődött immarígiobulint legalább egy specifikus, jelölt antitesttel detektáljuk, Az „antitest” kifejezésen- ériünk intakt molekulát és -olyan feígmenseít is, mint például Fa-t, E(ab>í (2. alosztály} és Fv-t, amelyek alkalmasak az epitópdetermínasshoz való kötésre. Antitesteket előállíthatunk intakt polipeptídek alkalmazásával, vagy a lényeges, kis pepddeket tartalmazó fragmensek, mint immunizáló antigén- alkalmazásával Állat smmusizálásábÍH! alkalmazott polípeptiá vagy pepiid származhat kémiailag szintetizált RNS átalakításából vagy kémiailag szintetizálva, és konjugálhatő haídozófehésjsYei szükség esetén, Általánosan alkalmazott hordozók azok, amelyeket kémiailag kapcsolnak peptidekhes, például többek között a szémmalbumin és hreoglobalm. A kapcsolt pepiidet alkalmazzuk ez.tnáa az állat (pl. egér, patkány vagy syúl) immunizálására.

A találmány tárgyköre ismertetésekor az antitest kifejezésen monoklonális vagy poiíklonális antitestet értőnk, attól monoklonáíis antitest előállítható olyan technika alkalmazásával, amely lehetővé teszí antitestmolekuták termelését folyamatos sejtvonalak által, tenyészetben. Ezek többek között, de nem kizárólag. a hjbrjdóma-teehu&a, a humán eredetű B-sejt-blbridőma-teehmka és a IBV-tóbridénaa-technika.

Ráadásul előállíthatunk kiméra-antitesteket is, valamim egyláncű antitesteket és szisíedkusttn előállítod antitesteket is.

Az antitest jelölhető bármely ismert eljárás alkalmazásával, amely lehetővé teszi a kötődött antitest mistőségi, és előnyösen mmnybégj meghakuOzásáf. Á találmány szerinti megoldásban alkalntazható, detektálható jelölés többek közöd a spektroszkópiai, teúofcármtd, biokémiai, immunkémiai, elektromos, optikai vagy kémiai eszközökkel detektálható bármely vegyidet. Az alkalmas jelölések többek között a bioba a streptavidiostel jelölt konjugátum. festésére, a mágnesese gyöngyök, a imoreszcsns festékek (pl. Suoreszcein, féxss-vörSs, rhodaxnla,

- 11 * ** »-ί>

* Λ' * * χ # ♦ * * * ·»♦ *** *·♦· * **+ » » » * ♦ « ♦ * X* <«i *1 söld fluoreszcens fehérje és ebhez hasonlók}/ radioizoíópos jelúlések (pl. Ή, ^U5Í, -‘^sS, ^MC vagy ^;UP), enzimek (pL tormaperoxidáz, alkalikus íbszfetáz és más, ez £Ú2Sd-ba« általánosan alkalmazóié enzim), és kolorúnetriás jelölések, ndút a kolloid arany vagy festett üveg vagy műanyag (pl. polisstirén, polipropilén latex., stb.) gyöngyök.

Az ilyen jelölések detektálására szolgáló eszközök jói ismertek a szakember számára. így például radioizö'őpök detektálhatok íofeSsrek vagy szeiníilláeiös számlálók alkalmazásával, ÖwreszeeBsjelőlések detektábstók iotedeSekter alkahuazásával az emíttált fém/ detektálásával. Enzimatikos jelöléseket tipikusan ágy detektálnak, hogy az. enzimhez adjuk a szobsztrátot, és az enzim szubsztráíra gyakorolt hatása által keletkezett reakcíóterméket detektáljak,, és & koferimeíriás jelöléseket a színes jelölés egyszerű, vlzualizálásával detektáljak.

Előnyösen a kötött immunglobulinokat legalább egy fluoreszcens vagy radioaktív módon jelölt specifikus, itntntmglo.bultn-eifer;i antitesttel detektáljuk. Ezek a klasszikus eljárások a kötött antitest minőségi és utenyoysségi vizsgálatára, amelyek nagyon specifikusak és megbízhatóak.

Más, előnyös detektálást rendszerek leírása található a következő: közleményekben; Schult, K, és misei,, Anal Gheut, ?(: 5430-5435 (1799); Vo-Dinh, T. és mtsai., Asal. Chem. 71.: 358-363 (1999); Brigsae, S3. Ír. és mtsah, IEEE Eug. Med. Bioi. Mag., 18: 120-122 (1.999); Otamírt, M, és mtsa;,, Int, J. Bioi, Macromol. 26: 263268 s 1999); Wright, G.l,. és mtsai., Prosrate C&ncer ami Brostaiíc D'iseases, 2: 264-276 (2090); Nelson, R.W. és «Hsat, Eleetrophoresis 2j.: Π 55-11.63 i2ööö); Rte-h, R.L> és mtsal, Curr. Opim Biotechnoi .1.1; 54-61 (2090); Cben, kJ. és mtsai., Geoomscs, .51: 313-324 (1998), amely közleményekre úgy hivatkozunk, mintha a leírásba építettük volna, és ezek a kstanítás részét képezik.

Előnyösen egy vagy több, szobai (fedoor) altergént immobllizáituík aliergénkúní. Ezek lehetetek példánk de nem kizárólagosaira következők: atkák, 7>r, pút.,. Les. Dest vagy zaayrei, macska, Sor, sibumiu, /fen. C/í:, Pest. Afet. Eumigíído:, dfe a&, M»'tess«zte fisfifí·. óuíex; Ekw'ü?, SteMa.

A találmány egy további, előnyös megvalósítási módja szerint egy vagy több, lakáson kívüli (©«aioor)· altergént immőbilfeálttnk sfegérskéstt. Ezek lehetnek például, de nem kizárólagosig a következők·. &?/»/«, .Jíís^em, Eáfeum,/^rkkmáijí&fego.

Ráadásul egy vagy több ételallergént anmohiSzálhafetafc «Sárgánként Példaként említjük a zellert sárgarépát diót, almát rákot és halat

Ráadást·! egy vagy több, állati méregből (yenvm) származó allergésí immobílizáiujik allergéukérst Ezek lehetnek például, de nem kizáróíagosan a méh és darázs mérgei.

A találmány egy további szempontjából a találmány tárgyát, képezi eljárás allergia betegben történő in· váró diagnosztikájára, ahol szétutammtáí veszünk a betegből, majd a mintát olyan immunglobulinokra vizsgáljuk, amelyek az. allergenekhez kőtődrtek a fent ismertetett, találmány szerinti eljárásnak megfelelően, ahol .vífeí-ouí-rm'-chípet alkalmazunk, amelyen legalább lö, előnyösen legalább 59, előnyösebben legalább 90 különböző ailergént inrmobilizáftunk. majd a minta és az immsbi&ák altegéaék közötti pozitív reakciót allergiaként diagnosztizáljak. A fent ismerteted meghatározások és előnyök' vosatkozsak az allergiák ú; diagnosztikája ilyen eljárására is, az allergiák diagnosztikája tssterí eljárásaival szemben. A találmány tárgyát képező eljárásnak az az előnye, begy nagy számú allergiát diagnosztizálható egyidejűleg egy mintából, mivel a tesztelendő aliergéneket egyetlen. ·ί8&·η?«?τ«ν·<:0φβδ. imnuíbikzáljuk. Ezáltal mindért csak egyetlen ehipen hajtunk végre, ami által a chtp ráadásul tartalmazhat lóitokat, amelyek nem tartalmaznak «nmofeilizáM aliergéneket, száltel lehetővé téve tsz egyidejű negatív detektálást, A tesztelendő silergénsk száma nincs korlátozva, ás természeteses e * * « *•9 »** ** » * * <9 ♦·♦ «♦* ··♦'♦·

- 12 lehetséges egy wagy több miczoörrny-chíp biztosítása.

A. találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgyát képezi .mte«nm>«y-chip, amelyen .egy vagy több allergést fetnobilízátenk. Ebből a szempontból atotomzhaíóak a fenti meghatározások és előnyök.

Előnyösen az alíergéneket 100-500 μ® átmérőjű, előnyösen 20Ö-3ÖÖ μη: átmérőid foltokon immobilizáíjuk.

Még előnyösebben arutoroíírí-sy-chip üvegből készéit hordozó, szintetikus hordozó, szilikonrács (watté·) ás membrán.

Előnyösen a mtorearray-chip kémiailag módosítva var,, előnyősén amin-re&ktlv és ksrboxi-reaktív módosításokkal.

Előnyösen az aítérgének kovalens módon vannak a ?téereamre~chípre kötve.

A találmány egy további szempontja szerint a találmány tárgyát képezi reagenskészlet, amely tartalmazza a találmány szermts, lém Ismertetett í»k?ro«r.my-chípeí és egy „első” reagenst, amely tartalmaz legalább egy hrsmusgfobuiln-rletek.'táló reagenst, előnyösen immunglobulin-eltonl antitestet, előnyösen ismert koncentrációban, és lehetséges módon egy „második· reagersté. pozitív mintakén··, amely tartalmaz legalább immur^lohulmt, amely allergénhez kőt Az első, legalább egy immtmglofetéín-detektáíó reagenst, előnyösen immnngiobülineilertí antitestet tartalmazó reagens alkalmazható kötött ijmmmgkíbulin detektálására, amely esetben az hmnusglobulírt-ellesi antitest előnyösen a fent ismertetettek szerint yaa jelölve. Előnyösen az első reagensben jelen levő antitest koncentrációja ismert, ezáltal lehetővé tóve reprodukálható eredmények biztosítását. .Ráadásai a reagenskészlet előnyösen lurtataaz egy második reagenst pozitív mintaként, amely tartalmaz legalább egy írnmunglobtillm, amely allergénhez köt. Előnyös az is, ha a második reagensben az immunglobulin koncentrációja ismert, ezáltal lehetővé tóve s mintában jelen levő immunglobulin mennyiségi meghatározását, a beteg mintája és a pozáív minta (a második reagens) eredményei összehasonlításával.

Előnyősén a reagenskészletet biztosítjuk a találmány szerinti eljárás végrehajtásához, a fentiek szerint. Ebből a célból az első és második reagenst megtervezhetjük egy specifikus allergénhez kötő immunglobulin detektálása céljából, vagy egy specifikus allergia betegben történő detektálása céljából A reageoskészletet azonban az olyan immungfebultnok szeles választéka detektálására, amelyek specifikus aílergónekhez kötődnek, vagy allergiák széles választéka betegben történő detektálása céljából terveztük.

A kővetkezőkben a találmány részletes leírását adjuk meg a következő példák és ábrák segítségével, amelyek természeteses nem szűkítik az oltalmi kort.

?\z i. ábra alergén-mkvsamrny hálózatát mutatja be;

A 2. ábra allergiás személy szérumával vizsgált allergén-orray szkemteléssel nyert képét mutatja be;

A 3a-3c. ábrák a tripla mérési eljárás &z,toe?píor-tésztiéí mutatják be;

A -ía-4c. ábrák ímrnofeilizált extrakíum és immobílizált rekombhtóns allergének esetében méri %~os íluoreszeetrciáí mutatja be.

Az <ursy-ra az ailergéneket GAíS 417 .y?oí;er {Gemtek .zVfemsysfews) alkalmazásával vittük fel. A fehérjéket kezelt üveglemezekre (tárgylemezekre) vittük fel .Az egyedi ailergéneket portionként egy.,,érintéssel vittük fel, hipltkátemhan. A pontok (jegyek) átmérője körülbelül 2Öi) gm volt.

Az ailergéneket funkcionális esoportekként a következőképpen csoportosítottuk:

- 13 « «X Ψ * * « * 1 * ** ♦»* *« *-♦*-» * * * » ft Ο » :♦ *♦ ** ♦♦·♦ *♦ (A) oírtAvori. fák (i-kBetvk zm'Betv, 3=rBeiv4, 4=rJunö2, 5-Cass;), li, iüféiék (6~rPhlp2,7«=rFb.lp4., 8=rPhlpSa, 9=rPhlpi, lOríhlpő, ÍWPidp7, IS-rPhlpH, 13---rPhipl.2}, Hl, gyomok (i4~Parj2, S5~Áxtvla, lö^-lskekteikom-proíshnj.

(B) · Woor IV, atkák (2b=rDerpl, 27=rDetp2.0181, 28~rDcrp2,. 29=rDerp,2fc₍ 3Ö»rDerp5, 31 -tBerp?, 33=rBerpS, 34=rDerl8, 35=ητΤ>τρ2Χ V, állatok (Sö^rlx-jpdí.öl, 37=rtepdf3, 38=r£urm2.Ö101, 39=rfeidl, 4ö=rFeldl:a, 41=rBosd2, 42= macskaeredető reprezentatív aifcrgém 43= fonyaeredetű reprezematív ailsrgén, 44~BSÁ,4S egéreredebü reprezentatív allergén, 46= patkányeredetö reprezentatív aöetgén, 4?==se«ésere<fetS reprezeotadv allergén, 4S= juheredetü reprezentatív allergén, 49= esirkeredetö reprezentatív allergést, 5$~ nyúleredetű reprezentatív aliergén, 5 i« hörcsögeredeíü reprezentatív aUergéo, 52- íőereöetíi reprezeniatív allergén, 53= gateberedetü reprezentatív «Kergén, 54= gnámű-olbumin}, VI, penészgombsk (55=rPenc3, 56=rPencl9a, 57=rFssel9b, 58®Peml3·, S9=rAsgfí, 68=rAspi3, 6l=rAsí4, 62=rA^)f6> 63=rAspfla, M^rAsOa, 65=®asM», 66=rAspf6s, 67wAspf7, S8=rAspfS, ő9=rAit&I, 7Ö=ÍAlta2), VH. élesztők (71=rMaií7, 72«rMaífí_{ ?3=rMal.f5, 74=rMa®, ?5=rMáií8, 76=rMalf9}, Vili. laíex (7?=rtfevbí₅ 78=rílevbla, 79=rHevb3, S0«rHevb8, 81=rHevb9, 82=rHevhlö, 83=rKesbl 11IX. romok<84=rAK, 85»rfSag4, S7=rBlag5}, (D) állati mérgek (veníjm} XÍV. méh (88=A.g5. 89Mbsz£o{jpáz-Á, 98=hia5urosidáz, 91=rVe»v5, $2®rVesg5}, XV, darázs {§3=Ag5), (E) ótooahergének (94=HSA, 9S=NAC).

Ráadásul az allergén-alcsoportok közé puHéipontekat vittünk fel, amelyek Itáttérkontíollként szolgálnak, és amelyeket „X”; „ab” a jelölt aniítesf, (1.. ábra:: 1864x1182 pixel, 1,86x1.18 -cm, 1ÖÖÖ píxeltem, pixelmélység/szsn 8/256,1 pixel 10 pta).

Az allergenekbői 108 pl-t osztottunk szét 96-méiyedésü rtdkrotíter-íetnezen kb. 208 ag/μΐ koncentrációban foltfelvivö (sp&téíxg} puHefbes (300 tnM nátriunuioszfát. pH 8.5}. Az gllesgén-hnmobliizáiás optimális koncentrációját néhány alíergénnel kültohöző pofferoldatban, valamint különböző tárgylemezeken végrehajtott bírálási kísérletek alapjait számítotok. A, vizsgált fehérjék telítési viselkedési matattak a 108 ng/μΐ vagy annál nagyobb koncentrációknál, amint a únM-szkennetrei történő szkenneléskor kapott folyamatosan erős fehér jelből következik, Az ilyen koneentí-áeiönál az: allergén kötési viselkedése föggetíen a vegyüleitől, a tárolástól, valamint a töltve! vivő pufiertöl is.

2. Példa

ÓOPAööl (sgllárd fázisú immnaszorheas ittítrési eljárás)

Egy éjszakás mkuhálást követően a CEZ ösxocvates-töl {sldehidüvegek) vagy az általunk előállított tárgylemezeket IxTBST-ben mostuk {18 mid frís pH 8.Ö/15Ö oM NaCl/ö.5% Tv,'een-2Ö) Aafcon-esöben erőteljes rázás közben, szobahömérsékfsfén. Blokkoló lépésként a tárgylemezeket 8.01%-os BSA-í tartalmazó IxTBST-oldaíba tettük 2 őrára, szobaltömérsékieten, A lemezeket tovább mostuk IxTBST-bea 15 percig, és desztillált vízzel röviden öblítettük

Az allergén-aff-oy-t hígított széíWtmol irtkubálíuk (1:5, UTBST-bea), {legalább} 68 percig, 37X3-0:5, IS percig, rázás közben. Különböző szérustífeigifásokst ieszietónk, 1:1-től |:l$-ig. Rendszerint az. i :5-ös hígítás adta a legjobb eredményt. 30 pl hígított szérum»: adtunk Fress Seal kamrában, {Ő/GM4 fechao/ogícij, A kamrát a gyártó előírásának megfelelően alkalmaztak. Különböző széremmfcahálási időket vizsgáltunk: 68 perctől egy éjszakáig. A szérummal történő, meghosszabbított inkubálás nem eredményezte a jel intenzitása vagy specifitása növekedését. A szemsimal történő mktíháiást kővetően s tárgylemezeket ix'IBST-vel mostuk (15 perc, szobahőmérséklet), rázással .Allergiás betegtől származó öt kdlönbösö szérumot vizsgáltunk hagyományos diagnosztikai tesztekkel (börkaparóteszt, &45T, SJS4), és m atópiss beteg sxérmaát választottak az sllergén-urray tóijésítméayértskelő tesztjélmz. Az egyedi szérumukat legalább kétszer vizsgáltuk különböző időkben gy-ártott aBergétbamtvok alkalmazásával.

Fluoreszcens jelöléssel ellátón, igE-elfem antitestet, amelyet Afewí'teö?· fiuoreszeeas festékkel jelöltünk a gyártó· (Afo&wfer Pt&bes)· utasításai szerint, az atiergéa-íiwy-boz adtunk 0.0 1% BSA/lxTBST-tartshaazó oldatban, és 60 percig iskebáltuk szöhshőmérfekfeíen, Az antitest alkalmazott hígításai 1:1000 - 1:5000, a jelölés idejétől és batékonyságátél itíggoen, Az immunológia! mérési eljárást követően a tárgylemezeket ixIBST-hen mostuk (15 pere, szobahőmérséklet, rázás), és desztillált vízzel röviden öblítettük.

Az Korntmológlaí mérési eljárást kővetően, a tárgylemezeket „kétszínű GMS-szkms»rrei olvastak te,, /Általában ajelmtenzitások csak kissé tértek el a különböző mérési eljárások és tárgylemezek esetében. A háttérértékek azonban az alkalmazott tárgylemezektől függően. Allergiás beteg szérumával vizsgált aHergén-zsrt-uy szkennelt képei: mutatjuk be a 2. ábrán, Két beteg erős reakciót mutatott a Phíetan., az atka, a macska és méh esetében (íc. ábra). Nem specifikus köicsösdtaíáshói származó háttérjelet nem figyeltünk meg a pufTerponttal vagy az amoailergésekkel. Az. allergiás beteg széruma teljes kiértékelését követően az eredményeket összehasonlítottuk az azonos széttartókkal, a AddT-teszttel kapott, előzetes eredményekkel. A találmány szerinti eljárásban kapott adatok jó egyezést adtak azokkal az atiaífeészletekkel.

3. P&ds

A mérést követően a „C”-beteg szérumát háromszor vizsgáltuk az egyedileg előállított allergén/wscrwmty-oksn. A kísérleti eljárás alapvetöea a korábban leírtakat követte.

Az mérést kővetően a tárgylemezeket azonos: ásrdn.’af-i?~beáli;íások alkalmazásával szkenneltük. Az adafenallzdsí öc.ac/Úv-srytftvöre-csomag alkalmazásával hajtottuk végre. A jelistenzlsás számított átlagértékeit minden sHergéntríptikáium eseiébea három, ismételt kísérlet után Összehasonlítottuk.

A végső analízisre csak a putferpoutfel átlagértékénél legalább l,$x nagyobb jeleket választottuk ki. Az adott jelek átlagértékét, a síandard eltérést és a standard deviáció százalékos értékét az 1, táfetefoaa foglaltuk össze:

1. táblázat

allergén	1. teszi	2. teszt	3. teszt	átlagérték	standard. dev.	% állag :
rSctvj	20731	21325	25060	22372.00	1916.11	8.56
rPhlpz	17176	15529	14227	15644.00	1206.6?	7.71
rPhlp4	3 b 134	33511	29328	32991.00	2802.76	8,50
rPbipSa	56600	53068	55594	55087.33	1485.7?	2.70
rP.hÍp6	56244	51359	37625	48409.33	7882.14	16.28
rPhÍp32	6291	7003	12289	8527.67	2675.50	31,3?
rParj2	7532	7678	9444	8224.6?	863.73	10.50
Artvla	6997	7931	11258	8728.67	1828.70	20.95
feketeűröm-proíílin	7901	7669	9260	8276.67	701.74	8.48
Maídl	9890	15295	8176	1Π 20.33	3033.74	27.28

♦.-· * » · 15 -

HSA	9868	8732	10708	9769.33	3033.74	8.29
fuhalbumin	9868	8295	10222	9458,33	835.92	8.84
lóalbiurun	9602	tel	1055$	9740.3?	619.3?	6.36
réVspHjb)	= 2216	10129	10731	11042.00	371.7?	7.90
rMalfS	13459	11018	12035	12170.6?	1001.14	8.23
rAK	2Ö68Ö	14202	19978	18286.67	2902.48	Í187 >

A három egyedi mérésben kapott adatok adagos standard deviációja 12.36% volt. Ea azt jelenti, hogy a chipalapdimmnaölögsai mérési eljárás, amely a beteg szérumában az 1'gE jelenlétéi vizsgálja, nagymértékben reprodukálrértó. Ez akkor is magától értetődő, ha a tripla mérési eljárásból származó postsörozat-íuggvényt nézzük, a 3a-3e. ábrákon,, alsói a.3a. ábra matatja az 1. tesztet és a 3, tesztet összehasonlító pontfüggvényt, a 3h, ábra a. 2.. tsztet és a 3. tesrtet ősszehasosüító ponifüggsényí, és a 3c. ábra az 1. észtét és a 2. tesztet összehasonlító pontfüggvényt; A mutatja az aliergéseket és El a lluoreszcencía-mterszltásí.

4. Ρ&Ϊ»

A találmány szerinti megoldás számára az optimális tárgylemez tesztelése céljából egyedileg előállított tárgylemezeket mértünk számos feltétéi mellett, íoetyetoaa alábbiakban foglalunk össze;

· Előállítási eljárás: az előállított lemezeket számos psrartréíer szerint értékeltük, mint például a szükséges veszélyes vegyszerek és az előállítási Idó.

- Előállítási költség: az általunk előállkop és a kereskedelmi forgalomban beszerezhető lemezeket összehasonlítottuk az áruk szerint.

- Kötési kapacitás: különböző lemezeket értéketek fluoreszcensen jelölt fehérje- kötési kapacitása alapján.

- Reprodukálhatóság: sorozatkisé!-leteket hajíoíömk végre különbözőképpen előkezelt lemezekkel, amelyeket általános mérési eljárási folyamai szerint értékeltünk ki.

- Általános háttér: minden lemezt kiertékeküak alíergiamérési eljárás előtt és után szisztematikus feiszinhátíér mérése céljából, and csikkkentheti s jel-zaj-vászonyr.

- Detektálási határ: Minden lemezt kiértékeltünk a nxtenáiis, értékelhető fehérjekoncentrációdbit értékre nézve, allergiaszkrínelési mérési eljárásban,

- Szérurntoleraneia: általában a beteg széruma komplex fehérjekeverék, amely gyafera negatív módon inteferál a wfeTOt-rwy-alapú immunológiai mérési eljárással, a beteg különböző időben levett szérummíntái esetében.

- Blokkolás: Minden lemezt kiértékeltünk abból a szempoöthól, hogy szükséges-e a blokkolási lépés az ailergíamérési eljárás előtt.

- Tárolás: Allerglaebíp előállítását követően minden lemezt kiértékeltünk a hosszútávú tárolás szempontjából.

A. fenti kiértékelés eredményeit a 2. táblázatban foglaltuk össze:

2. táblázat

Iteatedélszln-kémkvdemeztlpus	1.	7	3.	4.	5,	6.	7.	8.	9.	io. ;
Proteo báré	-r-		44	•r-r	44	•Ή	44	44	N	-
CÉL (.1)	/		+4	44·	-	-	•r	-	f	44-
3D-link(2)	f	-	44	-r-r	-4	4		-	1	-

Superaldehyáe (!)		-	-4·		~~	-	•Τ'	•4	l	4^-
ammosilaae (3)	Ϊ*:	-44·	'4		-	-	-4	4-	N	4~4 :
glyoxal (2)	-		···;	4-4-	-	-	4'		I	4-4-
ŰCS(35	-	•r/-	-rr :	4-4	-	-	’T'	-;·	N	-
Snlfe KMUS (3)	-	Ά-	4'T	+	/	-	! :	:/	N	i
glutaraidebyde (3)	-	vA	/	/		-		í i	/	-í-l··
photoerosslmker (3)	-	W~	-r	.t.	/	-	/	i		i
FE1/EGS (3)	-	-	-K-	4-	4.	4-		!
FÁST lemezek (4)	z	-	4*	-	-	-	-	-	N	4-4
CAST lemezek (4 ·	+	-r+	-	/	-	4~4~	-	/	/	!
sem módosított üveg	-4	t-v		: /	-	•F-+		i

A táblázat fejlécében szereplő körülmények:

1. előállítás

2. költség

3. kötési kapacitás

4. speeiStás

5. reprodukálhatóság

6. általános háttér ?, detektálási határ

8. aBergiaszlafoelés

9. bfokkolá-Vkapesoíás

10. tárolás

A 2. táblázatban íSnteíiük fel a szövegben leírt kiértékelési vizsgálatot. (++) kiváló eredményt, fo) jó eredményi, ·(·}^: jetóételea eredmény, (-} rossz, (/) a lemezt nem vizsgáltuk erre a kategóriára. Az (11 lemezek felszíne aidehídcsoportot tartalmazó fankcionálís felszín. A (2) lemezek amisteektiv felsztrüiek, amely egzakt kémiai tulajdonságai nem ismertek. A (3) lemezek saját gyártmányúak, amelyek feukeíonálís csoportját a táblázatban feltüntettük. A (4j lemezek msM» tarta&naznak fehérjék hmnobilizálása céljából A PzWöSjW .munkaa&vel a mteroömt^-ailapd diagnosztika céljára adaptált optimalizált feLszíh-áta.laldíást jelöltük, amely (P'ltrírmetoxis2áld>propáj-l{4izoöociacáte‘fe»íl)iio?»ea>í tartalmaz, amelyet Ghen és ratusfeaíársai közleménye szériát [Chert és rmsal, Nuciefe Adds Research, 19d, 27. kötet, 2. ss.jj, amely közleményre égy hívafkoznak, miráfea a leírásba építettük volna, és ez a kharntás részét képezi

A főnt ismertetett kiértékelési vizsgalat szerint a /^íeíd&wti-et választódik ki, mint a legjobb felsztukezelést alfegfe-marwűíray előállítása céljára.

5. Pdda

Tisztimé, rekombhíáxis altergéneket és ailergés-exírskíamokat mícröömry-ta tmmobilízálva, az érzékenység és a áiagrtoszbk&ilag releváns infomtádók tesztelése céljából egy forrásból származó specifikus allergéneket és tíka^éa-exÉr^cssmdcst h&senStoöa-já össze.

Aliergér&észhméáy mkroamty-ra történő «mobilizálása után- az azonos, specifikus szérumot tartalmazó,. különböző mhstákat adtuk a mmmaz'py-hoz, mértük a Saoresscenciát, amely a kötött antitestnek felel meg. .Az eredményeket a 3., 4, és 5. iáblásatbart, valamim a 4a, 4b. és 4c. ábrás, mutatlak be, ahol „F a %-os fluoreszcenciát jelölt. Az eredményesből világé» látszik, hogy a mkombináns aíiergének esetében a detektálás és a mennyiségi meghatározás sokkal érzékenyebb, mint az allergénextrakiumok esetében. Egyedi rekombmáns aSergés Euoreszeeseia-mkenzhása sokkal magasabb, mint az extrakten Saowzcencia-intozhása. Ráadásul az extraktum esetében csak az extrakteiomás tesztelhető, és nem. lehetséges annak tesztelése, hogy a forrás melyik specifikus antigénje felelős az allergiáért, a rekombináns aiíergénekkel történő detektálással szemben.

Ezáltal az: egyedi, tisztítod alfergém alkalmazó,, találmány tárgyát képező eljárás jobban alkalmazható az aUergéneket tartalmazó ex.ímkturaokhoz viszonyítva,

3,. táblázat

Lábra	i-sp. szérum	4-sp. szérum	19-sp. szérum	3í)-»p. szénán
Bmvla	52028	62529	62932	16847
BetviaMat	6590	237	905	139
Betvld	1576	14352	252	89
Betv2	2196	14Ö8	273	1253
BF-extraktom	21013	39438	I 1390	3174

4, táblázat

2. ábra	5-sp. szérum	7-sp. szénun	9-sp. szérum	17-sp. száram	18-sp. száram	40-sp. szérum
Phlpí	45611	12148	21588	5838	23497	23424 :
Phlplí	209	52043	814	2562	109:84	14753
PhlpV	6400:5	6343 i	62953	40770	63530	62029
Phi-extraktum	63987	40318	14504	10183	44405	19798

5. táblázat

3, ábra	1 Lsp. szérarn	16-sp. szérum	39-sp. szérum	40-sp, szérum
Hevb5	416	387	108	235
HevbS-Mal	350	519	306ÖI	63897
Bevb8	11146	7977	134	853
Hevb9	460	631	105	188
HevfelÖ	360	429	73	152
Latex-8-Exttakmm	264	202	80	3426
Latex-B-Extraktem	769	866	5343	30970

* .«

Claims (12)

1. Eljárás ailergénhez kötődő IgE immunglobulin mintában történő detektálására, azzal jellemezve, hogy -eljárásként a következő lépésekei. hajijuk végre: egy vagy több tisztí$ tolt, egyedi allergént immobil ixá lünk wcroorassp-cbipen, majd a mintát az immohílizált allergénekkel inkubáljuk úgy, hogy az allergánekre specifikus IgE immunglobulinok a specifikus allergénekhez kötődnek, majd a. specifikus, Irnsnobllizált alle-rgénekhez kötődött IgE Imnrnnglobulinokat detektáljuk.

2. Áz I. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mfemö/w^chípen egy

10 vagy több rekonrbináns allergént immobil bálunk.,

3. Az 1. vagy 2. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tsArwmry-ehlpen egy vagy több, sztiníetikus úton előállított allergént immobil szálunk.

4. Az í-3, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a t??/f.'ro£íf7w~chipen egy vagy több haptént imwohilizálunk.

15 5. Áz 1-4, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzeil jellemezve, hogy az aiiergéneket a mícronmu-cbipre 1Ö-2Ö00 pm átmérőjű, előnyösen 50-500 pm átmérőjű, előnyösebben 150-250 ttm átmérőjű foltokban visszük fel.

6. Az 1-5. igénypontok bármely ike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az allergéneket a we-mumo^chípen szilárd hordozón Immobilizáljuk, előnyösen üveg- vagy szinte20 tikus. hordozón, szihkoulapkán vagy membránon..

7. Áz l-ő. Igénypontok bármelyike szeristi eljárás, azzal jellemezve, hogy a mferornow-chípet kémiailag módosítjuk, előnyösen amin-reaktív vagy fcarboxr-reaktlv módosítással,

8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aller25 géneket a nrimwfw-ehipen kovalens módon kötjük.

9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az immunglobulinokat vérszérumban, mini mintában detektáljuk.

10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vérszérumet 1:1 ··· 1:15arányban, előnyösen 1:5 arányban hígítjuk.

30 11. Áz 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mintát 1 perc - 24 óra közötti Időtartamig, előnyösen 1-2 órán át inkubáljnk az allergénekkel.

12. Áz 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mintát Ö^í;C és óíAC közötti hőmérsékleten, előnyösen 37X-on inknbáljukaz allergénekkel.

13. Áz 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, uc2«//é/<eme2ve, hogy a k-ötő3-5 dött immunglobulinokat legalább egy jelölt, .specifikus, immunglobulin-elleni antitesttel detektáljuk.

* -φ * * » ««φ »**

Φ'*·Χ«

14. Á 13. igénypont szerinti eljárás, íusö/ /eöememy hogy a kötődött i-mmonglóbuHnokat legalább egy, fluoreszcens jelöléssel jelöli, specifikus, inununglöbtdrrudleni antitesttel, vagy legalább egy, radioaktív detektáljuk jelöléssel jelölt, specifikus, immunglobulin-elleni antitesttel detektáljuk,

5 15, Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, uzzo/ /e/knuezve, hogy egy vagy több rnribor (szobai) allergént, egy vagy több owrdbo?· (.kültéri) allergént, egy vagy több ételaliergént, egy vagy több állatlméreg-allergént vagy ezek kombinációját immobilizáljuk aJlergénkéni.

16. Eljárás allergiák betegben történő in v/rto diagnosztikájára, arso/ ye/íe^iezw,

10 hogy az eljárás tartalmazza a következő lépéseket: a betegtől származó szérummintát allergénekhez kötődő Igb immunglobulinokra vizsgáljuk az 1-15. igénypontok .bármelyike szerinti eljárásnak megfelelően, ahol í«íonmmu’~chipet alkalmazunk, -amire legalább 10, előnyösen legalább 5Ö, előnyösebben legalább 90 különböző allergén van immobill'zálva, majd a minta és az immobilízáit allergének közötti pozitív reakciót allergiaként diagnosztizáljuk.

15 17, MtTOmw-chip alkalmazása IgE ímmunoglofeulinok detektálására, amely microarray chipen egy vagy több tisztított, egyedi allergén van immobílizáiva.

18. A m/emurny-ebip 17. igénypont szerinti alkalmazása, amely chipen az allergének 100-500 pm, előnyösen 2ÖO-300 pm átmérőjű foltban vannak immobillzálva,

19. A fmbfOurroy-ebip 17. vagy 18. Igénypontok szerinti alkalmazása,

20 an5elynuíroamm~ehip üvegből készült hordozó, szintetikus hordozó, szilikonlapka vagy membrán.

20. A wczoarray-chip 17-19. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazása, ahol a mieromrny-ebip kémiailag módosítva van, előnyösen rendre aminreaktív és karboxireaktiv módosítással,

25

21. A .orAwamn-’-ehip 17-20. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazása, ahol az aliergőneket a znmmuTöy-ehipre kovalens kötéssel kapcsoljuk.

22. Reagenskészlet alkalmazása az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás kivitelezésére, amely reagenskészlet tartalmaz mfcroíírmv-ehipet, amelyre egy vagy több, tisztított, egyedi allergén lett immobiiizálva, és egy „első” reagenst, amely tartalmaz legalább

30 egy immunglobulint detektáló reagenst, előnyösen immunglobulin-elleni· antitestei, előnyösen ismert, koncentrációban, és lehetséges módon egy második reagenst pozitív mintaként, amely tartalmaz legalább egy immunglobulint, amely allergénhez kötődik.