CZ305183B6

CZ305183B6 - Způsob detekce imunoglobulinů založený na alergenovém čipu

Info

Publication number: CZ305183B6
Application number: CZ2003-1219A
Authority: CZ
Inventors: Reinhard Hiller; Christian Harwanegg; Manfred W. MĂĽller
Original assignee: Phadia Multiplexing Diagnostics Gmbh
Priority date: 2000-10-03
Filing date: 2001-10-03
Publication date: 2015-06-03
Also published as: CN1325919C; HUP0303663A2; EE200300128A; DE60108256T3; CA2424661A1; HU228066B1; SI1322960T2; SI1322960T1; EP1195606A1; CN1527943A; HK1066276A1; DE60108256D1; CA2424661C; DE60108256T2; PT1322960E; ATE286597T1; AU1230602A; AU2002212306B2; EP1322960B1; CZ20031219A3

Abstract

Způsob detekce IgE imunoglogulinu, který se váže na alergen ve vzorku, spočívá v tom, že jeden nebo více purifikovaných jednotlivých alergenů je imobilizováno na mikročipu, na kterém se vzorek inkubuje s imobilizovanými alergeny tak, že IgE imunoglobuliny, jež jsou specifické pro alergeny, se navážou na specifické alergeny, a pak jsou detekovány IgE imunoglobuliny, které jsou navázány na specifické imobilizované alergeny.

Description

Předkládaný vynález se týká způsobu detekce IgE imunoglobulinu, který se váže na alergen ve vzorku, a také způsobu in vitro diagnostiky alergii u pacientů.

Dosavadní stav techniky

Alergie je reakce vytvářená tělním imunitním systémem na látku, která by byla normálně považována za neškodnou. Je to právě tato reakce, která způsobuje symptomy, které jsou klasifikovány jako alergické reakce. Alergie tedy není projevem selhání imunitního systému, ale naopak jeho nadměrné aktivity. Reakce alergické osoby na alergen může vést k celé řadě rozmanitých symptomů. Někteří lidé trpí symptomy jako je například astma, ekzém, vyrážka, svědění oči, sinusitida, ucpaný nebo stále vlhký nos a senná rýma, nicméně mohou se objevit i vážnější symptomy. U alergií jako například alergii na jedy, ořechy a některé měkkýše, může například nastat potenciálně život ohrožující stav, nazývaný anafylaktický šok. K tomu dojde, když organismus vytváří reakci tak silnou, že dojde k otoku hrdla, poklesne krevní tlak a postižená osoba má dýchací obtíže. V některých případech tento typ reakce může být i fatální.

Výskyt alergii se výrazně zvyšuje v rozvinutých zemích (tj. v Evropě. Severní Americe a Japonsku). Odhaduje se, že 20 až 50 % populace je postiženo alergiemi. Nyní je již známo, že alergie jsou výsledkem nerovnováhy v kompartmentů T lymfocytů imunitního systému. Přesněji řečeno, alergie jsou doprovázeny zvýšením aktivity tzv. pomocných T lymfocytů 2 (Th2) vzhledem k aktivitě pomocných T lymfocytů 1 (Thl), což vede ke zvýšení tvorby IgE.

IgE (imunoglobulin E) je přinejmenším jedna z látek, které způsobují alergické reakce. IgE specifický pro alergen není normálně v krvi detekován a tvoří se jedině tehdy, když je osoba senzibilizována určitou látkou (stane se citlivou k látce). Látky způsobující alergie (nazývané alergeny) vedou k tvorbě specifického IgE, který je unikátní a bude reagovat jedině s látkou, která jeho tvorbu vyvolala. Tato reakce mezi IgE a alergenem se modelově znázorňuje jako zámek a klíč. IgE, když je spojen s alergenem, působí na buňky tak, že uvolňují chemické sloučeniny (např. histamin), které způsobují symptomy alergie. Jedna osoba může mít specifické IgE pro více než jednu látka a může tak být alergická na více než jednu látku. Výsledky testování na IgE jsou vyjadřovány jako stupeň, který ukazuje, jaké množství IgE specifického pro testovanou látku je přítomno v krvi. Čím vyšší stupeň, tím více je pravděpodobné, že pacient je alergický. V uplynulých desetiletích se alergické nemoci diagnostikovaly jen s použitím hrubě puntíkovaných extraktů pocházejících z hlavních zdrojů alergenů. Je však zřejmé, že tyto surové směsi jsou komplexní a z hlediska složení variabilní. V důsledku toho diagnostický potenciál těchto extraktů je také proměnlivý a může vést i ke vzniku falešně negativních výsledků. To se připisovalo zejména nestálosti alergenů v extraktech. Další nevýhodou použití takových extraktů při diagnózách alergií je špatná standardizace komerčně dostupných produktů, pokud jde o jejich alergenové složení. Jednotky, kterými se vyjadřuje síla alergenu, a také způsoby výpočtu jsou různé pro různé komerční společnosti. V důsledku toho diagnostické produkty od různých firem mohou být jen těžko srovnávány.

Nejdůležitější složky související s onemocněním, tj. hlavní alergeny, byly identifikovány v uplynulých desetiletích, avšak jejich kvantifikace není užívána jako východisko pro standardizaci alergenových extraktů. Monoklonální protilátky proti většině hlavních alergenů jsou nyní dostupné.

- 1 CZ 305183 B6

Testy na alergie metodami podle známého stavu techniky nejsou jednoduchým postupem. Tyto metody mohou být užitečné za předpokladu, že je provedena anamnéza, aby bylo možné určit, které testy by byly nejvhodnější. Nicméně dosud existuje jen velmi málo lékařsky uznávaných testů, které mohou identifikovat alergie, a jako obecné pravidlo platí, že tyto testy jsou omezeny na klinické laboratoře nebo specializovaná centra. Zatímco diagnóza atopie nebo alergie u kvalifikovaného praktika nebo specialisty na alergii může být relativně snadno provedena, pro potvrzení jsou často vyžadovány další testy.

Dále jsou uvedeny pro přiklad různé typy testů na alergie.

1. Test podkožní injekcí

Podezřelý alergen je injikován pod povrch kůže a reakce je pozorována kvalifikovanou ošetřovatelkou nebo lékařem. Jak se reakce vyvíjí, vzniká zóna zčervenání, a čím silnější je reakce, tím větší je tato zóna. Kožní test je docela citlivý, ačkoli ne všechny alergie mohou být identifikovány tímto způsobem.

2. Náplasťový test

Náplasťový test může být užitečný v případě kontaktní dermatitidy. Testovací látky jsou obvykle aplikovaný na kůži pokrytou náplastí a ponechány na místě po dobu 48 hodin. Kladná reakce vytváří malou oblast ekzému. Stejně jako v předchozím případě reakce je pozorována kvalifikovanou ošetřovatelkou nebo lékařem.

3. Alternativní test na alergii

Existují mnohé alternativy testů na alergie a bohužel jen málokteré jsou dostatečně přesné nebo uznávané lékaři. Tyto alternativní testy jsou často klamné a mnohdy i velmi nákladné.

4. Test Vega

Test Vega je elektrický test popisovaný jako bioenergetická regulační technika. Přístroj měří vodivost Wheatstonovým obvodem. Elektrody jsou připojeny na akupunktumí body neboje pacient drží v rukou. Různé roztoky se pak umisťují na kovový podnos. Přístroj je pak kalibrován tím, že se na podnos umístí skleněná lahvička obsahující toxickou látku. Lahvička vyvolá snížení elektrické vodivosti. Další látky jsou pak umisťovány na podnos, a jestliže dávají podobnou hodnotu, pak jde o alergickou reakci nebo „citlivost“' na látku. Tato technika je velmi rozšířena, zejména v obchodech s tzv. zdravými potravinami, nicméně její hodnota dosud nebyla prokázána a nebyly provedeny žádné platné klinické zkoušky, které by podložily tato tvrzení.

5. Test na toxicitu pro leukocyty (leukocytotoxicitu)

Tento test zahrnuje smíchání bílých krvinek pacienta s extrakty ze specifických jídel a pak měření buňky (různými způsoby), aby se zjistila nějaká forma změny. Zde dochází k vysokému počtu falešně pozitivních a falešně negativních reakcí a Americká Akademie Alergie došla k závěru, že dosud neexistuje žádný důkaz, že by tento test byl účinný pro diagnózu alergie na jídlo nebo inhalovanou látku.

6. Analýza vlasů

Další formou testování je vlasová analýza. Vlasy mohou být analyzovány na přítomnost toxických kovů jako je například olovo, rtuť a kadmium nebo nízké hladiny selenu, zinku, chrómu, manganu a hořčíku. Otravy těžkými kovy jsou dobře známy a dokumentovaný v kriminalistické vědě a analýza vlasů může skutečně indikovat expozici těmto kovům. Nicméně analýza vlasů

-2CZ 305183 B6 jakožto prostředek pro diagnózu alergii, ani užitím metody jako například „proutkaření“, nikdy nebyla potvrzena.

7. Aplikovaná kinesiologie

Vzorky potravin jsou umístěny pod jazykem nebo drženy ve skleněné nádobce v ruce pacienta. Pacient je pak požádán, aby tlačil svou volnou rukou proti ruce ošetřující osoby, examinátora. Jestliže je detekována alergická reakce, tak se projeví jako redukovaná svalová reakce a pacient má náhle problém zvednou svou paži. Tato technika zcela propadne při provedení dvojitě slepé klinické studie.

Kromě toho existují různé in vitro metody diagnózy alergií, kdy se detekuje přítomnost IgE nebo IgG protilátek v krvi:

8. Obvyklé metody jako je ELISA nebo Western blot:

Tyto testy se užívají k detekci protilátek (IgE) přítomných v séru pacienta pomocí (rekombinantních) alergenů.

9. Radioalergosorbentový test (RASTA™)

V tomto postupuje specifický alergen kondenzován na papírovém disku, a imunospecifický IgE, jestliže je přítomen v testovaném séru (tj. v séru od pacienta), se bude vázat na disk, přičemž následně se provádí detekce pomocí radioaktivně značené anti-IgE. Užívají se různé hodnotící (skórovací) systémy srovnávající výsledky testu s absolutní vazba negativní kontroly. Obecně modifikovaný postup RAST™ je následován inkubací přes noc a umožňuje detekci s vyšší citlivostí.

10. Kvantitativní experimenty inhibice IgE založené na RAST:

V tomto testu je extrakt alergenu „natečkován“ (nanesen v malých skvrnkách) na proužcích nitrocelulózy. Alikvoty séra jsou preinkubovány se směsí specifických rekombinantních alergenů, a po té je tato směs inkubována s nitrocelulózovými proužky. Navázaný IgE je detekován pomocí protilátky antihumánní IgE. V posledním kroku se vypočte procento inhibice vazby IgE přírodními extrakty po preabsorpci s rekombinantní alergeny.

11. Stimulační test buněčných antigenů (CAST)

Bazofilní buňky pacienta jsou stimulovány interleukinem-3 a alergenem a pak následuje měření ELISA de novo vytvořeného a uvolňovaného sulfidoleukotrienu (SLT).

12. Test UniCAP

Rekombinantní alergeny jsou imobilizovány na pevné fázi a pak se detekuje vazba protilátek, které jsou přítomny v séru pacienta, na alergeny.

Nicméně všechny tyto metody vyžadují množství jednotlivých experimentálních kroků, aby bylo možné testovat větší počet (např. 100) různých alergenů. Kromě toho, výše uvedené testy neprojevují dostatečně vysokou citlivost a spolehlivost a jsou velmi náročné na čas. Také množství vzorku (např. séra pacienta), a také purifikovaných, často rekombinantních a nákladných alergenů, která jsou potřebná k provádění těchto testů, jsou velká.

Patent US 4 444 879 se týká metody a zařízeni pro imunotesty k určení celkových imunoglobulinů a IgE. Zde jsou alergeny extrahovány a imobilizovány v jamkách mikrotitrační destičky pota-3 CZ 305183 B6 žené polymerem. Vzorek, který má být analyzován, je pak přidán do jamek a je proveden obvyklý imunotest.

V patentu EP 0 556 745 Al je popsán způsob detekce IgE protilátek proti pšeničnému proteinu v tělních tekutinách, přičemž extrakt pšeničného alergenu je imobilizován na pevnou fázi, kterou je například chromatografický nebo kapilární materiál nebo vlákna, sklo, nylon, celulóza nebo její deriváty ve formě perliček, mikročástic, listů nebo jamek mikrotitrační destičky. Také zde se provádí obvyklý imunotest pro detekci protilátek ve vzorku od pacienta.

Patent US 3 720 760 se týká způsobu analýzy tělesných tekutin na imunoglobuliny. Také zde je alergen obsahující extrakt, který je komerčně dostupný, navázán na ve vodě nerozpustný polymer, na kterém je pak prováděn obvyklý imunotest.

Patent US 4 849 337 se také týká způsobu identifikace hladiny IgE specifického pro alergen v séru pacienta tím, že se konjuguje IgE v séru s alergeny navázanými na nerozpustném nosiči. Zde je alergenem opět extrakt nebo alergen pocházející přímo z pylu, prachu, zvířat apod.

Detekce imunoglobulinů specifických pro alergen pomocí ELISA s extrakty alergenů vázaných na tuhý povrch je popsána v patentu US 4 444 879 A a v patentu EP 0 558 745 A. Mendoza a kol. (Biotechniques 27 (4) (1999)) popisuje vysokovýkonnou („high-throughput“) ELISA založenou na mikromaticích.

Tyto konvenční imunotesty nicméně nejsou použitelné pro testování pacientů s ohledem na přítomnost alergii, jelikož počet různých alergií přesahuje několik set alergií a stále se zvyšuje. Čas a práce nutné pro analýzu pacientova séra na všechny možné a také vzácné alergie jsou příliš vysoké, a proto takové analýzy nemohou být prováděny v laboratořích, kde musejí být analyzovány denně vzorky z několika set pacientů.

Podstata vynálezu

Cílem předkládaného vynálezu je proto poskytnout způsob detekce IgE imunoglobulinu, který se váže na alergen ve vzorku, kterýžto způsob nemá výše uvedené nevýhody a může být prováděn v krátkém čase a jen s malým množstvím vzorku a alergenu, je velmi spolehlivý a citlivý a navíc, což je nejdůležitější, umožňuje detekci prakticky neomezeného počtu alergenů v jednom jediném testu.

Dále předkládaný vynález poskytuje způsob pro in vitro diagnózu alergii u pacienta bez výše uvedených nevýhod.

Výše uvedený způsob je charakterizovaný tím, že jeden nebo více jednotlivých alergenů je imobilizováno na čipu s mikromaticí, na kterém je inkubován vzorek s imobilizovanými alergeny, takže imunoglobuliny, které jsou specifické pro alergeny, se vážou na specifické alergeny, a pak jsou detekovány imunoglobuliny, které jsou navázány na specifické imobilizované alergeny.

Mikromatice („microarrays“'), přip. mikromaticové čipy, byly nedávno užity pro celou řadu postupů manipulace s DNA, přičemž tyto postupy byly již dávno užívány vědeckou komunitou. Tyto čipy s mikromaticí DNA, tzv. DNA čipy, se staly běžně dostupnými v mnoha různých formátech a nakonec vedly k podstatné změně způsobů navrhování a provádění v běžné laboratorní praxi. In vitro DNA diagnostika je nyní méně časově náročná a méně pracná, protože tyto nové technologie umožňují komplexní testy ve vysokovýkonném a vysokokapacitním formátu („highthroughput“'). V důsledku toho i v oblasti proteomického výzkumu byly klasické substráty pevná fáze, jako například mikrotitrační destičky, membránové filtry a mikroskopická sklíčka, nahrazeny formátem mikromatic s vysokou hustotou. Nová a všestranná technologie proteinových matic

-4CZ 305183 B6 nakonec umožňuje i high-throughput screening genové exprese a molekulárních interakci (Walter a kol., Curr. Opin. Microbiol. 2000 Jun., 3 (3): 298-302, Emili & Cagney. Nat. Biotechnol. 2000 Apr., 18 (4) 393-397). Nedávno byl také koncept proteinové matice použit pro imunologické testy.

Biočip je popisován jako čip vhodný pro vysokovýkonnou (HT,“ high-throughput“'), mnohočetnou analýzu s enzymem navázaným na imunosorbent (ELISA). Takové biočipy mohou sestávat například z opticky ploché skleněné destičky obsahující 96 jamek vytvořených vložením hydrofobní teflonové masky, nicméně jsou známy a používány i jiné látky a formy biočipů. Experimenty ukazují, že specifická mnohočetná detekce proteinových antigenů uspořádaných v matici na skleněném nosiči je proveditelná. Další možnosti použití tohoto nového vysokovýkonného testovacího (HTS, „high-throughput screening“') formátu zahrnují přímé stanovení profilů exprese buněčných proteinů, mnohočetné testy pro detekce infekčních agens a diagnostiku nádorů (Mendoza LG a kol., Biotechniques 1999 Oct., 27 (4): 778-780).

Avšak při použití těchto známých čipů s mikromaticí pro testování proteinů jsou protilátky mobilizovány na mikromaticový čip. Překvapivě bylo zjištěno, že je možné navázat na mikromaticový čip nejen protilátky, ale také alergeny, které jsou antigeny odpovídajícími specifickým protilátkám, konkrétně IgE a IgG. Tento fakt je zvláště překvapující, neboť funkční alergeny vykazují zvláštní sekundární strukturu, která může být modifikována, když jsou navázány k pevné fázi a v ní obsaženy v takové vysoké hustotě, jako na mikromaticový čip. Taková modifikace struktury alergenu by narušila vazbu, protilátka-alergen, což by vedlo k falešně negativním výsledkům. Protilátky, fragmenty protilátek nebo peptidy jsou relativně malé a vykazují vysokou stabilitu, proto protilátky mají větší stabilitu v roztoku ve srovnání s jim odpovídajícími antigeny. Nicméně když jsou imobilizovány na pevné fázi dokonce i v případě protilátek, jen malé procento jich zůstává neporušených a účinných.

Článek Haab a kol. (Genom. Biology 2000, 1 (6): pre-print 0001, 1-0001, 22) který byl přijatý 9. listopadu 2000, se týká proteinových mikromatic pro detekci a kvantifikaci proteinů a protilátek v roztoku. Výsledky analýz prováděných podle této publikace ukázaly, že jen 50 % antigenů v matici a 20 % protilátek v matici poskytlo specifické a přesné měření odpovídajících alergenů.

Navíc diverzita možných alergenů je samozřejmě mnohem vyšší než diverzita protilátek, pokud jde o zpracování proteinů, obzvláště imobilizaci a značení takové série strukturálně různorodých alergenů. Nicméně bylo překvapivě ukázáno, že alergeny imobilizované na mikromaticový čip vykazovaly vysokou spolehlivost a senzitivitu při detekci IgE imunoglobulinů ve vzorku.

Tento způsob dovoluje uskutečnit test na mnoho IgE imunoglobulinů, kteiý vážou specifický alergen, vjednom experimentálním kroku, přičemž test může také být atomizován: více než 100 různých alergenů může být testováno, aniž by se provádělo mnoho individuálních experimentálních kroků, jako když se provádí test v obvyklé mikrotitrační formě. Kromě toho, tento test vykazuje vysoký stupeň senzitivity a spolehlivosti. Také výsledky z testu prováděného tímto způsobem mohou být získány v krátkém časovém období, např. přibližně za tři hodiny, což zkracuje čas potřebný pro test ve srovnání s obvyklými testy RAST nebo ELISA.

Kromě toho, mikromaticový test je vysoce reprodukovatelný, když se provádějí opakované experimenty s čipy obsahujícími vzorky od různých osob, např. s maskou podobnou mikrotitrační destičce, kdy každá jamka obsahuje několik různých alergenů a vzorek jedné osoby je přidán na jamku. Dále výhodou způsobu podle předkládaného vynálezu je skutečnost, že velký počet různých sond zaujímá relativně malou plochu, která je obsazena vysokou hustotou. Malá povrchová plocha matice umožňuje existenci mimořádně jednotných vazebných podmínek (teplotní regulace, obsah soli apod.), zatímco mimořádně velký počet sond umožňuje souběžné zpracování velkého počtu hybridizací. Protože matice s vysokou hustotou obsahuji tak velký počet sond, je možné poskytnout současně četné kontroly, a to včetně například kontroly pro variace nebo mu-5CZ 305183 B6 táce konkrétního alergenu, kontroly pro celkové hybridizační podmínky, kontroly pro podmínky přípravy vzorku a záměnu kontroly pro nespecifickou vazbu nebo zkříženou hybridizaci.

Dále způsob testu podle vynálezu vyžaduje jen minimální zlomek látky (alergenu i vzorku) ve srovnání s obvyklými testovacími systémy. To znamená, že se stejným množstvím výchozího materiálu je možné vyrobit mnohem větší počet testovacích souprav, když se použije mikromaticová forma, a také může být odebráno menší množství vzorku pro větší množství IgE imunoglobulinů, které vážou alergeny. Také díky malému objemu vazba se uskuteční velmi rychle.

Přírodní intaktní „imunoglobuliny“ nebo protilátky jsou tvořeny obecně tetramemí molekulou ve tvaru Y mající vazebné místo pro antigen na konci každého horního ramene. Vazebné místo pro antigen se skládá z variabilní domény těžkého řetězce spojené s variabilní doménou lehkého řetězce. Konkrétně protilátkové vazebné místo pro antigen je v podstatě tvořeno 3 CDR (úseky určujícími komplementaritu) variabilní domény těžkého řetězec (V_H) a 3 CDR variabilní domény lehkého řetězce (V_L).

Obecně se termín „antigen“' týká látky schopné vyvolat imunitní reakci a běžně je to také látka použitá pro detekci odpovídající protilátky v jedné z mnoha in vitro a in vivo imunologických metod pro demonstraci interakce antigen-protilátka.

Podobně, termín „alergen“ se používá pro označení antigenů, který má schopnost indukovat specifickou protilátku (tj. IgE), a také se na ni vázat, přičemž jde o protilátku zodpovědnou za běžné alergie. Nicméně tato druhá definice nevylučuje možnost, že alergeny mohou také indukovat reaktivní protilátky, ke kterým patří imunoglobuliny jiných tříd než IgE.

„Imobilizace“' v kontextu s proteiny nebo peptidy se týká navázání nebo napojení proteinu/peptidu na pevný nosič obvyklým známým způsobem, buďto s dodatečnou spojkou („spací“) mezi pevnou fází a alergenem nebo bez ní. Imobilizace peptidu/proteinu na nosič je v oboru dobře známa, do rozsahu předkládaného vynálezu spadá jakýkoliv způsob imobilizace, např. kovalentní nebo nekovalentní vazbou, zejména hydrofobní interakcí, například na membrány a syntetické povrchy, apod.

„Mikromatice“ je matice určitých prvků (např. „bodů“ neboli „skvrnek“) mající hustotu jednotlivých prvků alespoň přibližně 16/cm², výhodně alespoň přibližně 64/cm², ještě výhodněji přibližně 96/cm² a nejvýhodněji alespoň přibližně 1000/cm². Prvky mikromatice mají charakteristické rozměry, např., průměry, v rozsahu mezi přibližně 10 až 2000 pm, výhodně přibližně 50 až 500 pm, ještě výhodněji přibližně 150 až 250 pm, a jsou odděleny od jiných prvků v matici přibližně stejnými vzdálenostmi. Proto mikromatice podle předkládaného vynálezu použitelná pro rutinní screening ve velkém měřítku může obsahovat alespoň 500, výhodně alespoň 1000 individuálních prvků - bodů (skvrn) obsahujících alergeny, standardy a kontroly.

„Čip“ podle předkládaného vynálezu může být doslova jakéhokoliv tvaru, např. sklíčko, nebo jamka mikrotitrační destičky nebo také mnohočetný povrch, ačkoliv rovinný typ čipu je výhodný.

Detekční krok může být prováděn nějakým obvyklým způsobem, který je odborníkovi v oboru znám, např. využitím fyzikální, enzymatické nebo chemické reakce, apod.

Podle předkládaného vynálezu jsou IgE detekovány jako imunoglobuliny. IgE je známý jako látka způsobující alergické reakce a je tvořen jedině tehdy, když se osoba stane citlivou na látku, tj· vyvine se u ní alergie. Proto pro testování toho, zdaje vzorek od pacienta, který je alergický na specifický alergen, je vzorek testován na IgE jako imunoglobuliny. Čím vyšší množství IgE je ve vzorku, tím je pravděpodobnější, že vzorek byl odebrán z pacienta alergického na specifický alergen.

-6CZ 305183 B6

Je známo, že imunoglobulin IgG má být přítomen ve vzorku od pacienta, který je alergický na jídlo.

Výhodně jeden nebo více puntíkovaných alergenů je imobilizováno na mikromaticovém čipu. Tyto jednotlivé alergeny jsou například purifikovány z alergenového extraktu, např. ze specifické potraviny nebo rostliny. Samozřejmě jeden nebo více alergenů specifického druhu může být analyzováno najednou.

Metody purifikace jsou odborníkům známy, je to např. chromatografická purifikace, purifikace separaci podle hmotnosti, purifikace specifickou vazbou alergenu na pevnou fázi, např. prostřednictvím protilátky, apod. Použití vysoce purifikovaných alergenů pro masovou výrobu testů na alergie není zatím navrhováno.

„Purifikovaný“ alergen označuje, na rozdíl od extraktu, jednotlivý alergen, kterým může být například nativní, rekombinantní nebo synteticky připravený alergen. Tyto purifikované alergeny vykazují řadu důležitých výhod proti alergenovým extraktům, když jsou imobilizovány na pevné fázi: vzhledem k tomu, že jde o směs různých proteinů, které jsou přítomny v jakémkoliv extraktu, je koncentrace alergenu, který má být testován, velmi nízká ve srovnání s puntíkovaným preparátem jednotlivého alergenu. Purifikovaný jednotlivý alergen může proto být imobilizován na mikromatici ve velice vysoké koncentraci. Vzhledem k přesným a definovaným molekulám přítomným v preparátu puntíkovaného alergeny jen definovaný alergeny bude imobilizován na mikromatici. Proto mikromatice a způsob detekce protilátky pomoci purifikovaných alergenů mohou být standardizovány a podrobeny přesným kontrolám kvality.

Kromě toho vzhledem k vysoké koncentraci puntíkovaného alergenu v přípravku jsou alergeny na mikromatici imobilizovány s vyšší hustotou, a proto i jakýkoliv detekční způsob založený na takové mikromatici je citlivější než odpovídající mikromatice s pouhými extrakty obsahujícími alergeny. Další výhodou purifikovaných jednotlivých alergenů proti alergenovým extraktům spočívá ve skutečnosti, že imobilizované purifikované alergeny jsou přesně definovány. Na rozdíl od purifikovaných alergenů zahrnují alergenové extrakty například dva, tři nebo více různých alergenů z jednoho organismu nebo předmětu. Například v případě jablka, extrakt bude obsahovat směs různý jablečných alergenů, zatímco přípravek podle vynálezu obsahuje jeden z purifikovaných jablečných alergenů.

Další výhodou purifikovaných alergenů ve srovnání s nepurifikovanými alergeny například přítomnými v extraktu spočívá ve skutečnosti, že kvůli dalším nečistotám přítomným v extraktu není extrakt stabilní déle než jen omezený časový interval a pak může například být plesnivý. To však ovlivni detekci alergií, protože alergie proti plísním také existuje, a v tomto případě pak bude získán falešně pozitivní výsledek.

Kromě toho kvůli přítomnosti proteáz v extraktech jsou extrakty nestálé, což neplatí pro purifikované alergeny.

Také vzhledem k existujícím terapiím pomoci purifikovaných alergenů provádění diagnózy se stejným purifikovaným alergenem je hlavní výhodou oproti diagnostice s nepurifikovanými alergeny. Takové diagnózy jsou zejména výhodné, aby následovaly po terapii purifikovanými alergeny a umožnily testovat individuální reakci na specifickou terapii a dovolily tak poskytnout individuální, konkrétnímu pacientovi přizpůsobenou terapii.

Z výše uvedených důvodů způsoby detekce IgE imunoglobulinu, který se váže na alergen ve vzorku, kdy jeden nebo více purifikovaných alergenů je imobilizováno na mikromaticový čip, jsou obzvláště výhodné.

-7CZ 305183 B6

Výhodně je jeden nebo více rekombinantních alergenů imobilizováno na mikromaticovém čipu.

V posledních několika letech bylo připraveno mnoho rekombinantních alergenů. Produkce rekombinantních alergenů je také v principu známa ve stavu techniky, ale dosud měla jen malý dopad na rutinní testy na alergie. Avšak pomocí rekombinantních alergenů je možné připravit velké množství jednoho nebo více specifických alergenů, a proto optimalizovat test. Dále je možné modifikovat rekombinantní alergeny specificky tak, aby se získala jakákoliv mutace alergenu pro detekci specifického IgE imunoglobulinu. Kromě toho používání hlavních alergenů jako rekombinantních proteinů poskytuje alternativu k testům založeným na extraktech, pokud jde o stabilitu testu a také pokud jde o standardizaci diagnostiky. Výše uvedené výhody puntíkovaných alergenů ve srovnání s nepurifikovanými alergeny (extrakty) platí tím spíše pro rekombinantní alergeny než pro puntíkované nativní alergeny: rekombinantní alergeny mohou být navrženy a připraveny ještě s větší specifitou než puntíkované nativní alergeny, a proto je možné optimalizovat afinitu a specifitu testu s rekombinantními alergeny. Rekombinantní alergeny jsou také lepší pro standardizaci, co se týká způsobu jejich produkce. Navíc rozdíly mezi jednotlivými výrobními šaržemi jsou menší pro rekombinantní alergeny než pro alergeny pocházející z přírodního zdroje. Bylo překvapivě ukázáno v předkládaném vynálezu, že použití těchto rekombinantních alergenů v rutinních in vitro diagnostických testech podle vynálezu je lepší než obvyklé testovací systémy založené na extraktech. Na rozdíl od rutinního sériového testování podle stavu techniky, testování alergenů podle vynálezu s použitím rekombinantních alergenů přináší zcela novou kvalitu, pokud jde o standardizaci, možnost kontroly, senzitivitu, reprodukovatelnost, schopnost testu poskytnout diagnosticky relevantní informace apod.

Rekombinantní alergeny byly například popsány v publikacích Chapman a kol., Alergy, 52:374379 (1997), Laffer a kol., J. Alergie Clin. Immunol., sv. 98, č. 2, 652-658 (1996), Můller a kol., Clinical and Experimental Allergy, sv. 27 9, 915-920 (1997), Niederberger a kol., J. Alergy Clin. Immunol., sv. 102, č. 4, část 1, 579-591 (1998), Menz a kol., Clinical and Experimental Allergy, sv. 26, 50-60 (1996), kteréjsou zahrnuty formou odkazu v tomto textu. Dalšími příklady (rekombinantních) alergenů jsou, aniž by výčet byl omezující, rBetvl, rBetv2, rBetv4, rJuno2, Cassl, rPhlpl, rPhlp2, rPhlp4, rPhlp5a, rPhlpó, rPhlp7, rPhlpl 1, rPhlpl2, rParj2, Artvla. Mugwort profilin, Apigl, Apigl.0201, Daucl.2, rArah2, rArah5, Maldl, Mald2, rPenal, recCarp, rDerpl, rDerp2. 0101, rDerp2, rDerp2b, rDerp5, rDerp5a, rDerp7, rDerp8, rDerplO, rTyrp2, rLepd2.01, rLepdl3, rEurm2. 0101, rFeldl, rFeldla, rBosd2, reprezentativní alergen z kočky, reprezentativní alergen ze psa, reprezentativní alergen z BSA, reprezentativní alergen z myši, reprezentativní alergen z laboratorního potkana, reprezentativní alergen z vepře, reprezentativní alergen z ovce, reprezentativní alergen z kuřete, reprezentativní alergen z králíka, reprezentativní alergen z křečka, reprezentativní alergen z koně, reprezentativní alergen z holuba, reprezentativní alergen albuminu morčete, HSA, a-NAC, rPenc3, Pennl3, rPencl9a, rPencl9b, rAspfl, rAspfla, rAspf3, rAspf3a, rAspf4, rAspf4a, rAspfó, rAspfóa, rAspf7, rAspf8, rAltal, rAlta2, rMalfl, rMalf5, rMalfó, rMalf7, rMalfB, rMalfů, rHevbl, rHevbla, rHevb3, rHevb8, rHevb9, rHevblO, rHevbll, rAK, rBlag2, rBlag4, rBlag5, fosfolipáza A, hyaluronidáza, rVesv5 a rVesg5.

V dalším výhodném provedení je jeden nebo více synteticky připravených alergenů imobilizováno na mikromaticovém čipu. Tady platí stejné výhody proti alergenovým extraktům a také proti purifikovaným nativním alergenům, jaké byly uvedeny výše pro rekombinantní alergeny. Způsob syntetické přípravy peptidů nebo proteinů je dobře znám ve stavu techniky, syntetickou přípravou alergenů je možné získat vysoce purifikované alergeny ve velkém množství a při nízkých nákladech, neboť tyto metody přípravy jsou vysoce automatizované. Kromě toho přesná sekvence jakéhokoliv alergenu může být získána s modifikacemi nebo bez modifikací, které zvyšují senzitivitu a spolehlivost způsobu detekce IgE imunoglobulinů podle vynálezu.

Je také možné použití jen alergenního determinantu nebo alergenní domény specifického alergenu pro testování podle předkládaného vynálezu. Tím se mohou vyloučit rizika a nevýhody plynoucí z práce s velkým proteiny, protože s kratšími peptidovými strukturami se snadněji zachází při rutinní přípravě biočipů. To platí pro všechny purifikované nativní, rekombinantní a syntetic-8CZ 305183 B6 kém alergeny. Toto by dále umožnilo detekovat jednopeptidové epitopy, což by ještě více zlepšilo diagnostický test a terapii, zejména pokud jde o specifitu.

Zvláště výhodné je poskytnout nativní formu alergen a současně také syntetickou nebo rekombinantní formu alergenu na tomtéž čipu. Zatímco je výhodné použít hlavně rekombinantní nebo syntetické alergeny, nativní formy alergenů mohou být užity alespoň jako kontroly nebo další zdroje informace o kvalitě čipu. Výhodný čip podle předkládaného vynálezu proto obsahuje nativní a syntetickou nebo rekombinantní formu alespoň jednoho alergenu. To poskytuje také zlepšenou kontrolu kvality a standardizaci různých šarži alergenů.

Výhodně je jeden nebo více haptenů imobilizováno jako alergeny na mikromaticovém čipu. „Hapten“'je nízkomolekulámí (typicky s molekulovou hmotností menší než přibližně 7000 daltonů) látka, která je obecně neschopná jako samotná vyvolat významnou tvorbu protilátek po podávání do zvířecího organismu, včetně člověka. To je proto, že hapten je příliš malý na to, aby mohl být rozpoznáván imunitním systémem organismu. Avšak když je hapten kondenzován na větší, nosičovou molekulu, hapten získá antigenní vlastnosti. Jinými slovy, vazba haptenu na nosičovou molekulu (čímž vznikne kombinace molekul analyt-nosič) dovolí imunitnímu systému organizmu zvířete rozpoznávat hapten. Imunoprecipitační reakce tak může proběhnout mezi haptenem (kondenzovaným na nosičové molekule) a protilátkou proti haptenu. Přípravou haptenů, které jsou imobilizovány na mikromaticovém čipu může být dosažena na čipu vyšší hustota.

Je samozřejmě možné kombinovat výše uvedené různé formy alergenů, např. použít současně rekombinantní a (purifikované) nativní alergeny. Kombinace těchto různých forem umožňuje srovnávat je a také např. užít jako kontrolu rekombinantní alergeny pro různé šarže nativního alergenu, které mohou být odlišné v důsledku rozdílů v biologických zdrojích, způsobu přípravy, čistotě apod.

Pro vysoce účinné testy je výhodné použít alergeny, které vykazují optimální vlastnosti, např. vysokou vazebnou schopnost. Nicméně použití méně nebo odlišně účinných antigenů je výhodné pro detekcí variant alergenů s neúčinnou vazbou, např. pro použití při hyposenzitizační terapii.

Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu jsou alergeny imobilizovány na mikromaticový čip do „bodu“ či „skvrnky“ („spot“') o průměru 10 až 2000 pm, výhodně 50 až 500 pm, ještě výhodněji 150 až 250 pm. Protože tyto nanesené body mají malý průměr, je možné imobilizovat velký množství různých alergenů a různé koncentrace určitého alergenu v samostatných „bodech“ mikromaticového čipu, což dovoluje připravit jediný mikromaticový čip, který může být v jednom - automatizovaném - kroku použit pro analýzu velkého počtu alergenů a/nebo mnoha různých koncentraci alergenu.

Výhodně jsou alergeny imobilizovány na pevné fázi, výhodně na skleněném nosiči, syntetickém nosiči, křemíkovém čipu nebo membráně. Takové čipy mohou být vyráběny například postupem popsaným v Ge H. (2000), Nucleic Acids Research 28, e3 (i-vii), Oian W. a kol. (2000), Clinical Chemistry 46 (1456-1463), MacBeath G. a kol. (2000), Science 289, (1760-1763), který je zahrnut v předkládané přihlášce formou odkazu. Každý z těchto uvedených materiálů vykazuje specifické vlastnosti a výhody, které jsou odborníkovi v oboru známy. Tudíž vhodný materiál pro mikromaticový čip bude vybrán podle alergenu, který má být testován, způsobu detekce navázaných IgE imunoglobulinů a použitých pufrů. Kromě toho, volba vhodného materiálu je také závislá na financích.

Výhodně je mikromaticový čip chemicky modifikovaný, výhodně aminoreaktivními a karboxyreaktivními modifikacemi. To umožní přesně stanovit způsob, jakým se alergen váže na mikromaticový čip.

-9CZ 305183 B6

Výhodně jsou alergeny kovalentně vázány na mikromaticovém čipu. To poskytuje stabilní vazbu alergenů k mikromaticovému čipu, a proto je způsob podle vynálezu mimořádně spolehlivý.

Podle dalšího výhodného provedení předkládaného vynálezu jsou IgE imunoglobuliny detekovány ve vzorku krevního séra. U pacientů, kteří jsou alergičtí na alergen, se imunoglobuliny vytvářejí hlavně v krevním séru, takže analýza krevního séra poskytuje spolehlivý způsob pro detekci IgE imunoglobulinů. Kromě toho, krevní sérum může být snadno odebíráno pacientům velmi jednoduchých způsobem a odběr vzorku může být proveden dokonce u pacienta doma.

Výhodně se krevní sérum naředí 1:1 až 1:15, výhodněji 1:5. Ředění může být prováděno jakýmkoliv vhodným roztokem, např. Ix TBST (10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 % TWEEN 20).

Výhodně je pak vzorek inkubován 1 minutu až 24 hodin, výhodněji 1 až 2 hodiny, s alergeny. Samozřejmě je možné inkubovat vzorek s alergeny dokonce i po dobu více dnů. Nicméně to již nevede ke zvýšení intenzity signálu nebo specifity. Obecně platí, že inkubace po dobu 1 hodiny je dostatečná pro získání spolehlivého a citlivého výsledku.

Kromě toho, vzorky s alergeny jsou výhodně inkubovány při teplotě mezi 0 a 60 °C, výhodněji ve 37 °C. Inkubace při nižší teplotě nevede ke zvýšení signálu, ale spíše vedou ke zvýšení nespecifické vazby a hladiny šumu (pozadí). Inkubace při 37 °C poskytuje přesné a spolehlivé výsledky pro testy alergenů u lidí.

Výhodně je navázaný IgE imunoglobulin detekován alespoň jednou značenou specifickou antiIgE imunoglobulinovou protilátkou. Termín „protilátka“', jak se v tomto textu používá, se týká jak intaktní molekuly protilátky, tak i jejich fragmentů, jako jsou například Fa. F(ab)₂ a Fv, které jsou schopné vázat se na epitopovou determinantu. Protilátky mohou být připraveny použitím intaktních polypeptidů nebo fragmentů obsahujících požadovaný malý peptid jakožto očkovacího antigenu. Polypeptid nebo peptid použitý pro imunizaci zvířete může být přípraven translací RNA nebo může být syntetizován chemicky a může být kondenzován na nosičový protein, je-li to třeba. Obecně používané nosiče, které jsou chemicky kondenzovány s peptidy, zahrnují bovinní sérový albumin a thyreoglobulin. Kondenzovaný peptid je pak použit pro imunizaci zvířete (např. myši, laboratorního potkana nebo králíka).

V kontextu předkládaného vynálezu termín protilátka zahrnuje jak monoklonální, tak polyklonální protilátky, přičemž monoklonální protilátky mohou být připraveny s použitím jakékoliv známé techniky, která umožňuje produkovat protilátkové molekuly v kontinuální buněčné kultuře. Patří sem, avšak bez omezení, technika hybridomů, technika humánních B lymfocytových hybridomů a IBV hybridomů.

Kromě toho mohou být připraveny chimérické protilátky, jednořetězcové protilátky a také synteticky připravené protilátky.

Protilátka může být značena kterýmkoliv známým způsobem, kteiý dovoluje kvalifikovat a výhodně i kvantifikovat navázané protilátky. Detekovatelné značky vhodné pro použití v předkládaném vynálezu zahrnují jakoukoliv kompozici detekovatelnou spektroskopický, fotochemickým, biochemickým, imunochemickým, elektrickým, optickým nebo chemickým způsobem. K užitečným značkám patří biotin pro značení pomocí kondenzace se streptavidinem, magnetické (mikro)perličky, fluorescenční barviva (např. fluorescein, texaská červeň, rhodamin, zelený fluorescenční protein apod.), radioaktivní značky neboli radioznačky (např. ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C nebo ³²P), enzymy (např. křenová peroxidáza, alkalická fosfatáza a další běžně používané v ELISA testech) a kolorimetrické značky jako je například koloidní zlato nebo perličky z barevného skla nebo plastu (např. polystyren, polypropylén, latex apod.).

-10CZ 305183 B6

Prostředky pro detekci výše uvedených značek jsou odborníkovi v oboru známé. Tak například radioznačky se mohou detekovat s použitím fotografického filmu nebo scintilačního počítače, fluorescenční značky mohou být detekovány s použitím fotodetektorů detekujících vyzařované světlo. Enzymatické značky jsou typicky detekovány tím, že se enzymu poskytne substrát a detekuje se reakční produkt vytvořený působením enzymu na substrát a kolorimetrické značky jsou detekovány tím, že se jednoduše vizualizuje barevná značka.

Výhodně jsou navázané IgE imunoglobuliny detekovány užitím alespoň jedné fluorescenčně a radioaktivně, značenou specifickou anti-imunoglobulinovou protilátkou. To jsou klasické metody kvalitativní a kvantitativní analýzy navázaných IgE protilátek, které jsou velmi specifické a velmi spolehlivé.

Jiné výhodné detekční systémy pro mikromatice jsou například systémy popsané v publikacích: Schult K. a kol., Anal. Chem., 71 (5430-5435), Vo-Dinh T. a kol. (1999), Anal. Chem., 71 (358363), Brignac SJ Jr, a kol. (1999), IEEE Eng. Med. Biol. Journal, 18 (120-122), Otamiri M. a kol. (1999), Int. J. Biol. Macromol., 26 (263-268), Wright. GL Jr, a kol., Prostatě Cancer and Prostatic Deseases, 2 (264-276), Nelson RW. a kol. (2000), Electrophoresis 21 (1155-1163), Rich RL. a kol. (2000), Curr. Opin. Biotechnol. 11 (54-61), Chen JJ. a kol. (1998), Genomics. 51 (313-324), které jsou zahrnuty v tomto textu formou odkazu.

Výhodně se jako alergeny imobilizuje jeden nebo více vnitřních (domácích) alergenů. To jsou např. alergeny roztočů Tyr, put., Lep. Dest. nebo mayrei, Felis, Bos, Albumin, Pen. cit., Pen. not. Asp. Fumigatus, Alt. alt., Malassezia furfur, Latex, Plodia a Blatella, aniž by tento výčet byl omezující.

Podle dalšího výhodného provedení se jako alergeny imobilizují jeden nebo více venkovních alergenů. To jsou např. alergeny zBetula, Juniperus, Phleum, Parietaria judicea, aniž by tento výčet byl omezující.

A dále mohou být jako alergeny imobilizovány jeden nebo více potravinových alergenů, např. alergen z celeru, karotky, arašídů, jablka, krevet a ryb.

A dále mohou být jako alergeny imobilizovány jeden nebo více jedových antigenů. To mohou být např. antigeny z jedu včel nebo vos, aniž by tento výčet byl omezující.

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká použití in vitro diagnózy alergií u pacienta, přičemž způsob spočívá v tom, že vzorek séra od pacienta je analyzován na IgE imunoglobuliny, které se vážou na alergeny způsobem podle předkládaného vynálezu, přičemž je použit mikromaticový čip, na kterém je imobilizováno alespoň 10, výhodně alespoň 50, ještě výhodněji alespoň 90, různých alergenů, po té se detekuje kladná reakce mezi vzorkem a imobilizovanými alergeny a ta je diagnostikována jako alergie. Výše uvedené definice a výhody se týkají také tohoto způsobu in vitro diagnózy alergií ve srovnání se známými metodami diagnózy alergií. Způsob podle vynálezu vykazuje výhodu, že může být současně diagnostikován velký počet alergií s jen jediným vzorkem, jelikož všechny alergeny, které mají být testovány, jsou imobilizovány na jednom jediném mikromaticovém čipu. Každý krok je proto prováděn jen na jednom čipu, přičemž čip může dále obsahovat body, kde není imobilizován žádný alergen, a tím poskytovat současnou negativní kontrolu detekce. Počet alergenů, které mohou být testovány, není nijak omezen, a v případě potřeby se připraví dva nebo více mikromaticových čipů.

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká použití mikromaticového čipu, na kterém je imobilizován jeden nebo více alergenů pro detekci IgE imunoglobulinu. Také pro tento aspekt předkládaného vynálezu platí výše uvedené definice a výhody.

- 11 CZ 305183 B6

Výhodně jsou alergeny imobilizovány v „bodech“ o průměru 100 až 500 pm, výhodněji o průměru 200 až 300 pm.

Pro mikromaticovový čip je výhodným nosičem sklo, syntetický nosič, křemíkový čip nebo membrána.

Výhodně je mikromaticovový čip chemicky modifikovaný, výhodně aminoreaktivní nebo karboxyreaktivní modifikací.

Výhodně jsou alergeny na mikromaticový čip kovalentně navázány.

Další aspekt podle předkládaného vynálezu se týká použití soupravy, která obsahuje mikromaticový čip podle předkládaného vynálezu, jak byl popsán výše, a první činidlo obsahující alespoň detekční činidlo nejméně jednoho imunoglobulinu, výhodně anti-imunoglobulinovou protilátku, výhodně ve známé koncentraci, a případně druhé činidlo jakožto pozitivní vzorek obsahující alespoň jeden imunoglobulin, který se váže na alergen. První činidlo obsahující detekční činidlo alespoň jednoho imunoglobulinu, výhodně anti-imunoglobulinovou protilátku, může být použito pro detekci navázaného imunoglobulinu, a v tomto případě je anti-imunoglobulinová protilátka výhodně značena, jak bylo uvedeno výše. Výhodně je protilátka přítomna v prvním činidle ve známé koncentraci, a proto umožňuje získávat v testu reprodukovatelně výsledky. Kromě toho, souprava výhodně obsahuje druhé činidlo jako pozitivní vzorek obsahující alespoň jeden IgE imunoglobulin, který se váže na alergen. Také zde je výhodné, když IgE imunoglobulin je přítomen ve známé koncentraci v druhém činidle, a tak umožňuje kvantifikovat IgE imunoglobulin přítomný ve vzorku tím, že se srovnávají výsledky ze vzorku od pacienta s výsledky pozitivního kontrolního vzorku (tj. druhého činidla).

Souprava podle vynálezu je určená k provádění způsobu podle předkládaného vynálezu, jak bylo uvedeno výše. Pro tento účel jsou první a druhé činidlo navrženy tak, aby umožnily detekovat jeden specifický IgE imunoglobulin, který se váže na jeden specifický alergen, neboli aby detekovaly jednu specifickou alergií u pacienta. Nicméně, souprava může také být navržena také tak, aby detekovala celou řadu imunoglobulinů, které vážou specifické alergeny, neboli detekovat tak celou řadu alergií u pacienta.

Předkládaný vynález je nyní podrobněji popsán a vysvětlen v následujících příkladech a pomocí obrázků, které v žádném případě rozsah vynálezu nijak neomezují.

Objasnění výkresů

Obr. 1 ukazuje schéma mikromatice alergenů.

Obr. 2 ukazuje snímek matice alergenů testované se sérem alergického jedince.

Obr. 3a až 3c ukazují test rozptylu (Scatterplot Test) z trojího opakování testu.

Obr. 4a až 4c ukazují výsledky měření fluorescence (v %) pro imobilizované extrakty a mobilizované rekombinantní alergeny.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Nanášení alergenů („spotting“')

- 12CZ 305183 B6

Alergeny byly naneseny do matice s použitím nanášecího („spotovacího“') zařízení GMS 417 od firmy Genetic Micrsystems. Proteiny byly naneseny na derivatizované skleněné podložky („sklíčka“). Individuální alergeny byly naneseny jediným dotekem do jednoho bodu a ve třech opakováních (triplikáty). Body (tj. skvrnky) měly průměr přibližně 200 pm.

Alergeny byly uspořádány do funkčních skupin následujícím způsobem:

(A) Venkovní alergeny (I. Stromy [l=rBetvl, 2=rBetv2, 3=rBetv4, 4=rJunO2, 5=Cassl] , II. Trávy [6=rPhlp2, 7=rPhlp4, 8=rPhlp5a, 9=rPhlpl, 10=rPhlp6, H=rPhlp7, 12=rPhlpl 1, 13=rPhlpl2], III. Plevele [14=rParj2, 15=Artvla, 16=Mugwort profilin]), (C) Potravinové alergeny (X. Zeleniny [17=Apigl, 18=Apigl, 0201, 19=Daucl,2, 20=rArah2, 21=rArah5], XI. Plody [22=Maldl, 23=Mald2], XII. Krevety [24=rPenal], XIII. Ryby [25=recCarp]), (B) Vnitřní (domácí) alergeny (IV. Roztoči [26=rDerpl, 27=rDerp2, 0101, 28=rDerp2, 29=rDerp2b, 30=rDerp5, 31=rDerp5a, 32=rDerp7, 33=rDerp8, 34=rDerplo, 35=rTyrp2], V. Zvířata [36=rLepd2, 01, 37=rLepdl3, 38=rEurm2, 0101, 39=rFeldl, 40=rFeldla, 41=rBosd2, 42=reprezentativní alergen z kočky, 43 reprezentativní alergen ze psa, 44=BSA, 45=reprezentativní alergen z myši, 46=reprezentativní alergen z laboratorního potkana, 47=reprezentativní alergen z prasete, 48=reprezentativní alergen z ovce, 49=reprezentativní alergen z kuřete, 50=reprezentativní alergen z králíka, 51 reprezentativní alergen z křečka, 52=reprezentativní alergen z koně, 53-reprezentativní alergen z holuba, 54=albumin z morčete], VI. Plísně [55=rPenc3, 56=rPencl9a, 57=rpencl9b, 58=Pennl3, 59=rAspfl, 60=rAspf3, 61rAspf4, 62=rAspf6, 63=rAspfla, 64=rAspf3a, 65=rAspf4a, 66rAspf6a, 67=rAspf7, 68=rAspf8, 69=rAltal, 70=rAlta2], VII. Kvasinky [71=rMalf7, 72=rMalfl, 73=rMalf5, 74=rMalf6, 75=rMalf8, 76=rMalf9), VIII. Latex [77=rHevbl, 78=rHevbla, 79=rHevb3, 80=rHevb8, 81=rHevb9, 82=rHevblO, 83-rHevbll], IX. Hmyz [84=rAK, 85=rBlag2, 86=rBlag4, 87rBlag5]), (D) Jedy (XIV. Včela [88=Ag5, 89=Fosfolipáza, 90=Hyaluronidáza, 91=rVesv5, 92-rVesg5], XV. Vosa [93=Ag5]), (E) Autoalergeny (94=HSA, 95=a-NAC)

Dále, body obsahující pouze pufr byly rozmístěny mezi podskupiny alergenů a sloužily jako kontrola pozadí, označeny byly „X“, a dále „ab“ označuje protilátku, (viz obr. 1:1864x1182 pixelů, 1,86x1,18 cm, 1000 pixelů na cm, pixel hloubka/barviva 8/256/, 1 pixel odpovídá 10 pm).

100 pm alikvoty alergenů byly rozděleny do jamek 96jamkové mikrotitrační destičky v koncentraci přibližně 200 ng/pl v nanášecím pufru (300 mM fosfátový pufr pH 8,5). Optimální koncentrace pro imobilizaci alergenů byla určena titraěním experimentem s několika alergeny v různých pufrovacích roztocích, a také na různých sklíčkách. Testované proteiny vykazovaly saturační chování v koncentraci shodné nebo vyšší než 100 ng/pl, jak bylo zjevné z bílého signálu konstantní síly při měření GMS snímačem. Při této koncentraci vazebné chování alergenů byl nezávislé na složení skladovacího a nanášecího pufru.

Příklad 2

SOPHIA (Test na imunosorbentu v pevná fázi)

Následně po inkubaci přes noc byly nosičové destičky („sklíčka“) buďto koupené od firmy CEL Associates (aldehydové nosiče) nebo připravená v laboratoři původců byly promyty v lx TBST (10 mM Tris pH 8,0/150 mM NaCl/0,5 % Tween 20) za energického třepání v kyvetě Falcon při teplotě místnosti. Jako blokovací krok byla sklíčka přenesena do lx TBST roztoku obsahujícího 0,01 % BSA na dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Následně byla sklíčka promyta v lx TBST po dobu 15 minut a pak krátce opláchnuta destilovanou vodou.

- 13CZ 305183 B6

Alergenová matice byla inkubována s naředěným sérem (1:5 v lx TBST) po dobu (alespoň) 60 minut, v 37 °C za třepání. Různé stupně ředění séra byly testovány, v rozmezí od 1:1 až 1:15. Obvykle ředění 1:5 poskytla nejlepší výsledky. 30 μΐ naředěného séra bylo přidáno ke sklíčku v uzavíratelných komůrkách od firmy SIGMA Technologies. Komůrky byly použity podle návodu výrobců. Byly testovány různé inkubační doby pro sérum v rozmezí od 60 minut až po inkubaci přes noc. Avšak prodloužená inkubace se sérem nevedla ke zvýšení intenzity signálu ani specifity signálu. Po inkubaci se sérem byla sklíčka promyta v lx TBST (15 minut, okolní teplota) za třepání.

Pět různých sér alergických pacientů, kteří byli vyšetřeni běžnými diagnostickými testy (test injekcí do podkoží. RAST, ELISA) a sérum z neatopického pacienta byly vybrány jako vhodné pro laboratorní zkoušku alergenové matice. Jednotlivá séra byla testována alespoň dvakrát alergenových čipech připravených ve dvou várkách.

Fluorescenčně značená α-IgE protilátka značená fluorescenčním barvivém AlexaFluor podle protokolu výrobce (Molecular Probes) byla přidána k alergenovému čipu v roztoku obsahujícím 0,01 % BSA/IX TBST a vše se inkubovalo po dobu 60 minut při teplotě místnosti. Pracovní ředění protilátky bylo v rozmezí 1:1000 až 1:5000 v závislosti na době a účinnosti značení. Po imunotestu byla sklíčka promyta lx TBST (15 minut, teplota místnosti, třepání) a pak krátce opláchnuta destilovanou vodou.

Následně po imunosorbentovém testu byla sklíčka vyhodnocena pomocí GMS dvoubarevného snímače. Obecně intenzita signálu se jen velmi málo měnila pro různé testy a různé čipy. Nicméně, hodnoty pozadí se lišil v závislosti na typu použitého čipu. Příklad zobrazení (scan) alergenové matice testované se sérem pacient trpícím alergií je ukázán na obr. 2. Tento pacient vykazuje silnou reakci s antigeny z Phleum, roztočů, kočky a včely (srovnej obr. 1). Žádný signál pozadí nebyl pozorován pro nespecifickou interakci s body, kde je jen pufr nebo autoalergeny. Po kompletním vyhodnocení výsledků ze séra alergického pacienta byla data porovnána s daty předtím získanými pro totožná séra testy RAST. Data získaná způsobem podle předkládaného vynálezu byla v dobré shodě s těmito datovými soubory.

Příklad 3

Test reprodukovatelnosti na séru pacienta C

Sérum pacienta C bylo testováno třikrát na individuálně připraveném alergenovém mikročipu. Experimentální postup byl v podstatě shodný s tím, jak byl popsán výše.

Po testu byla sklíčka skenována s použitím totožného hardwarového nastavení. Analýza dat byla provedena s použitím softwarového balíku GenePix. Vypočtené průměrné hodnoty intenzity signálu pro každý alergen ve třech opakováních byly porovnány po třech opakováních experimentu.

Jedině hodnoty odpovídající signálům, které byly alespoň l,5x vyšší než průměrná hodnota pro samotný pufr byly vybrány pro konečnou analýzu. Průměrná hodnota, směrodatná odchylka a procento směrodatné odchylky pro relevantní signály jsou uvedeny v následující tabulce 1.

- 14CZ 305183 B6

Tabulka 1

Průměrná směrodatná odchylka vypočtená z hodnot získaných pro tři individuální testy byla 12,36 %. To znamená, že imunologický test na čipu, zkoumající přítomnosti IgE v séru pacientů, je vysoce reprodukovatelný. To je také zřejmé, když se kontroluje vynesení jednotlivých naměřených bodů (scatterplots) pocházejících z trojnásobného testu 3, viz obr. 3a 3c, kde obr. 3a ukazuje vynesení bodů testu 1 proti testu 3, obr. 3b vynesení bodů testu 2 proti testu 3 a obr. 3c ukaío zuje vynesení bodů testu 1 proti testu 2, A znamená alergeny a FI intenzitu fluorescence.

Příklad 4

Srovnání různých mikročipů

Pro otestování optimálního čipu pro předkládaný vynález, byly hodnoceny individuálně připravené nosiče podle kritérií, která jsou následovně uvedena:

- Výrobní postup: čipy byly vyrobeny a hodnoceny podle řady parametrů, jako například potřeba nebezpečných chemických látek a doba výroby

- Cena výroby: čipy připravené v laboratoři a komerčně dostupné byly srovnány podle jejich ceny

- Vazebná kapacita: Různé čipy byly hodnoceny podle vazebné kapacity fluorescenčně značených proteinů

- Reprodukovatelnosti: Sériové experimenty byly prováděny s odlišně ošetřenými čipy a vyhodnoceny podle celkové výkonnosti testu

- 15CZ 305183 B6

- Obecné pozadí: Všechny čipy byly hodnoceny před a po test alergie na systematický signál pozadí (šum), který by při detekci mohl zmenšovat poměr signál k šumu.

- Detekční limit: Všechny čipy byly hodnoceny na minimální proteinovou koncentraci detekovatelnou najeden bod (spot) ve screeningovém testu alergie

- Tolerance séra: Obecně, sérum pacienta je složitá směs proteinů, která často narušuje záporně imunotesty na čipu s různými odběry pacientova séra

- Blokování: Všechny čipy byly hodnoceny na nutnost užít blokovací krok před vlastním testem alergie

- Skladování: Všechny čipy byly hodnoceny z hlediska dlouhodobého skladování od výroby alergenového čipu.

Výsledky výše popsané studie jsou ukázány v tabulce 2:

Tabulka 2

Chemie reaktivního povrchu/ typ čipu	Výroba	Náklady	Vazebná kapacita	Specificita	Reprodukova- telnost	Pozadí (šum)	Detekční limit	Screening alergie	Blokováni/ navázáni	Skladování
Proteo Bind	+	++	++	++	++	++	++		NE	-
CEL(1)	/	++	++	++	-	-	+	++	ANO	++
3O-Link (2)	/	—	++	++	+	+	+	-	ANO	-
Superaldehyd (1)	/	—	+	+	++	-	+	+	ANO	++
Aminosilan (3)	+	++	+	+	--	-	+	+	NE	++
Glyoxai (3)	-	+	++	++	--	-	+	++	ANO	++
EGS (3)	-	±	++	++	--	-	+	+	NE	-
SulfoKMUS (3)	-	±	++	+	/	-	/	/	NE	/
Glutaratdehyd (3)	-	+	/	/	—	-	/	/	/	++
Fotozesítění (3)	-	±	+	+	/	-	/	/	/	/
PEI/EGS(3)	-	—	++	+	+	+	/	/	/	/
FAST čip (4)	/	..	+	--	-	-	—	-	NE	++
CAST čip(4)	/	--	+	+	+	-	—	--	ANO	++
Nemodifikované sklo	+	++	-	/	—	++	—	/	/	/

Tabulka 2 ukazuje výsledky vyhodnocení studie popsané v textu. (++) znamená vynikající výsle20 dek, (+) dobrý, (-) slabší a (--) špatný. (/) znamená, že čip nebyl testován pro tuto konkrétní kategorii. (1) čipy obsahující funkční povrch s aldehydovými skupinami. (2) čipy obsahující aminoreaktivní povrch, přesné chemické vlastnosti nejsou známy. (3) čipy připravené v laboratoři s funkčními skupinami, jak byly uvedeny v tabulce 2. (4) čipy obsahující membránu pro imobilizaci proteinů. ProteoBind je pracovní název pro derivatizaci povrchu přizpůsobenou pro optima25 lizovaný výkon diagnostického testu na mikročipu obsahujícím (l-[3”-[trimethoxysilyl)propyl]1’ (4”-isothiokyanatofenyl)thiomočovinu), který byl připraven podle Chen a kol. (Nucleic Acids

- 16CZ 305183 B6

Research, 199, sv. 27, č. 2, publikace je zahrnuta formou odkazu v tomto textu).

Podle výsledků studie prezentovaných výše byl vybrán ProteoBind jako nejlepší povrchová derivatizace pro výrobu alergenových mikročipů.

Přiklad 5

Srovnání detekce imunoglobulin ve vzorku s imobilizovanými rekombinantními alergeny a s imobilizovaným extraktem

Pro test citlivosti a diagnosticky relevantní informace pomocí purifikovaných rekombinantních alergenů imobilizovaných na mikromaticovém čipu a alergenového extraktu imobilizovaného na mikromaticovém čipu, byly srovnány specifické alergeny jednoho zdroje s alergenovým extraktem stejného zdroje.

Po imobilizaci preparátů alergenů na mikromaticový ěip byly různé vzorky obsahující specifické sérum přidány na mikročip a fluorescence, která odpovídá množství protilátky vázané na alergeny, byla měřena. Výsledky jsou ukázány v tabulkách 3, 4 a 5, stejně jako na obrázcích 4a, 4b a 4c, kde „FL“' znamená fluorescenci v %. Z těchto výsledků je jasné, že v případě rekombinantních alergenů, detekce a kvantitativní vyhodnocení jsou mnohem citlivější než v případě alergenových extraktů. Fluorescenční intenzita jednotlivého rekombinantního antigenů je významně vyšší než fluorescenční intenzita extraktu. Kromě toho, v případě extraktu jen zdroj extraktu může být testován a není možné testovat, který specifický antigen zdroje je zodpovědný za alergii, na rozdíl od detekce s rekombinantními alergeny.

Proto je způsob diagnostiky podle vynálezu s použitím jednotlivých purifikovaných alergenů, konkrétně rekombinantních alergenů, výhodnější než použití extraktů obsahujících alergeny.

Tabulka 3

Graf 1	Sérum 1-Sp	Sérum 4-Sp	Sérum 19-5	Sérum 30-5
Bet v la	52028	62529	62932	18847
Bet v la Mut	6590	237	905	139
Bet v ld	1576	14352	252	89
Bet v 2	2196	1408	273	1253
BP -Extrakt	21013	39438	11390	3174

- 17CZ 305183 B6

Tabulka 4

Graf 2	Sérum 5-Sp	Sérum 7-P	Sérum 9-S	Sérum 17-S	Sérum 18-S	Sérum 40-S
Plilp I	45611	12148	21588	5836	23497	23424
Phlp II	209	52043	814	2562	10984	14753
Phlp V	64005	63481	62953	40770	63530	62029
Phl - extrakt	63987	40318	14504	10183	44405	19798

Tabulka 5

Graf 3	Sérum 11-Sp	Sérum 16-Sp	Sérum 39-5	Sérum 40-5
Hev b 3	416	387	108	235
Hev b 5 Mal	350	519	30601	63897
Hev b 8	11146	7977	134	853
Hev b 9	460	631	105	188
Hev b 10	360	429	73	152
Latex B - extrakt	264	202	80	3426
Latex C - extrakt	769	866	5343	30970

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob detekce IgE imunoglobulinů, který se váže na alergen ve vzorku, vyznačující

Claims

1. Způsob detekce IgE imunoglobulinů, který se váže na alergen ve vzorku, vyznačující se tím, že jeden nebo více purifikovaných jednotlivých alergenů je imobilizováno na mikročipu, na kterém se vzorek inkubuje s imobilizovanými alergeny tak, že IgE imunoglobuliny, jež jsou specifické pro alergeny, se navážou na specifické alergeny, a pak jsou detekovány IgE imunoglobuliny, které jsou navázány na specifické imobilizované alergeny.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že jeden nebo více rekombinantních alergenů je imobilizováno na mikročipu.

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že jeden nebo více synteticky připravených alergenů je imobilizováno na mikročipu.

4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že jeden nebo více haptenů je imobilizováno jakožto alergeny na mikročipu.

-18CZ 305183 B6

5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že alergeny jsou na mikročipu imobilizovány jako skvrnky o průměru 10 až 2000 pm.

6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že alergeny jsou na mikročipu imobilizovány jako skvrnky o průměru 50 až 500 pm, výhodně 150 až 250 pm.

7. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že alergeny jsou imobilizovány jako mikročip na pevné fázi.

8. Způsob podle kteréhokoliv z nároků Íaž6, vyznačující se tím imobilizovány jako mikročip na skle nebo syntetickém nosiči.

9. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se tím imobilizovány jako mikročip na křemíkové destičce.

10. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se tím imobilizovány jako mikročip na membráně.

že alergeny jsou že alergeny jsou že alergeny jsou

11. Způsob podle kteréhokoliv z nároků lažlO, vyznačující se tím, že mikročip je chemicky modifikovaný, výhodně aminoreaktivní a karboxyreaktivní modifikací.

12. Způsob podle kteréhokoliv z nároků lažll, vyznačující se tím, že alergeny jsou k mikročipu kovalentně navázány.

13. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že imunoglobuliny jsou detekovány v krevním séru jakožto vzorku.

14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že krevní sérum je naředěno 1:1 až 1:15, výhodně 1:5.

15. Způsob podle kteréhokoliv z nároků lažl4, vyznačující se tím, že vzorek se s alergeny inkubuje 1 minutu až 24 hodin, výhodně 1 až 2 hodiny.

16. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15, vyznačující se tím, že vzorek je inkubován s alergeny při teplotě mezi 0 a 60 °C, výhodně při 37 °C.

17. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 16, vyznačující se tím, že navázané imunoglobuliny jsou detekovány alespoň jednou značenou specifickou anti-imunoglobulinovou protilátkou.

18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že navázané imunoglobuliny jsou detekovány alespoň jednou fluorescenčně značenou specifickou anti-imunoglobulinovou protilátkou.

19. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že navázané imunoglobuliny jsou detekovány alespoň jednou radioaktivně značenou specifickou anti-imunoglobulinovou protilátkou.

20. Způsob podle kteréhokoliv z nároků Íažl9, vyznačující se tím, že jakožto alergeny jsou imobilizovány jeden nebo více vnitřních alergenů.

21. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 19, vyznačující se tím, že jakožto alergeny jsou imobilizovány jeden nebo více venkovních alergenů.

- 19CZ 305183 B6

22. Způsob podle kteréhokoliv z nároků lažl9, vyznačující se tím, že jakožto alergeny jsou imobilizovány jeden nebo více potravinových alergenů.

23. Způsob podle kteréhokoliv z nároku lažl9, vyznačující se tím, že jakožto alergeny jsou imobilizovány jeden nebo více jedových alergenů.

24. Způsob in vitro diagnostiky alergií u pacienta, vyznačující se tím, že se vzorek séra odebraný od pacienta analyzuje na IgE imunoglobuliny, které se vážou na alergeny způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 23, přičemž je použit mikročip, na kterém je imobilizováno alespoň 10, výhodně alespoň 50, ještě výhodněji alespoň 90 různých alergenů, a pozitivní reakce mezi vzorkem a imobilizovanými alergeny je určena jako alergie.

25. Použití mikročipu, na kterém je imobilizován jeden nebo více přečištěných jednotlivých alergenů pro detekci IgE imunoglobulinů.

26. Použití mikročipu podle nároku 25, kde alergeny jsou imobilizovány ve skvrnkách o průměru 100 až 500 pm, výhodně 200 až 300 pm.

27. Použití mikročipu podle nároku 25 nebo 26, kde nosičem je sklo.

28. Použití mikročipu podle nároku 25 nebo 26, kde nosič je syntetický.

29. Použití mikročipu podle nároku 25 nebo 26, kde destička je křemíková.

30. Použití mikročipu podle nároku 25 nebo 26, kde jde o membránu.

31. Použití mikročipu podle kteréhokoliv z nároků 25 až 30, který je chemicky modifikovaný, výhodně aminoreaktivní a karboxyreaktivní modifikací.

32. Použití mikročipu podle kteréhokoliv z nároků 25 až 31, kde alergeny jsou k němu kovalentně navázány.

33. Použití soupravy pro provádění způsobu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 24, která obsahuje mikročip, na kterém je imobilizován jeden nebo více purifikovaných jednotlivých alergenů a první činidlo obsahuje detekční činidlo alespoň jednoho imunoglobulinu, výhodně anti-imunoglobulinovou protilátku, výhodně ve známé koncentraci, a popřípadě druhé činidlo jakožto pozitivní vzorek obsahující alespoň jeden imunoglobulin, který se váže na alergen.

7 výkresů

-20CL 305183 B6

A C • · «X · · X · · · β · · · · X X · •·χχχ«·χ·χ·»χ··χ·χ· · · • · · X · · X · · · · · β · · X χ · ««ΧΧΧ4·Χ·Χ4·Χ··Χ·Χ· · · • · · X · · X · · β · β ·· * X X « ι«χχχ«*χ*χβ*χ*»χ·χι · · _D , . Γ, , Burské oříšky Krevety

Betula Phleum Panetsna ^Celer

Juniperus judics3 Karotka Jablko Ryba | || lil X XI XII XIII

• • • • • • • • X · X · • X • X X • • X • X • • • • · • • • • • • • • • • • • • • • • X • X · • X • X X • • X • X • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • X • X · • X • X X • • X • X • • • • • • • • • • • • •

Roztoči Tyf. Lep. Eur. Feiis Albumine put dest. mayrei Bos

IV IV

• X · X · • • • · · • • • • X · • X X • • • • • • X X • • • • • • • X X • X • • • • X · X · • • • · · • • • • X · • X X • • • • • • X X • • • • • • • X X • X • • • • X · X · • • • · · • • • • X · • X X • • • • • • X X • • • • • • • X X • x • • •

Pen. cit Pen. Asp. fumigatus not. Alt. ait. Malassezia furfur Latex VI Vl^! VIII

Píodia Elatelía

IX

D E • •XX • •XX • •XX • XX • XX • XX