CN103675271B - 过敏性疾病变应原胶体金诊断试纸条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种过敏性疾病变应原胶体金诊断试纸条，所述试纸条包括样品孔、胶体金垫、膜条、吸水垫和PVC板，其中膜条包被有吸入组过敏原Ⅰ、吸入组过敏原Ⅱ、食物组过敏原以及鼠抗羊IgG抗体，形成三条检测带和一条质控带。该试纸条包括的每一种变应原能代表80%患者群体的变应原分子，在检测膜条上，用包被标志性变应原分子代替变应原提取物，从技术上实现了快速诊断过敏性疾病的目的。用该试纸条检测耗时5～30分钟，特异性强、灵敏度高、简易快速，能现场检测，操作人员无需专业培训，按说明书即可完成操作，实现过敏性疾病的快速诊断。

Description

过敏性疾病变应原胶体金诊断试纸条及其制备方法

技术领域

本发明涉及变应原检测领域，具体地说，涉及一种过敏性疾病变应原胶体金诊断试纸条及其制备方法。

背景技术

变应性疾病（又称过敏性疾病）包括特应性皮炎、食物过敏、变应性鼻炎和过敏性哮喘等，其发病率日益增高，且病情逐趋复杂化。WHO已将变应性疾病列为21世纪重点研究和防治的疾病。近年，随着免疫组化、分子生物学技术和临床新技术，如纤维支气管镜的开展，已对此病有了共识，即其属于过敏性炎症，在炎症区有大量炎症细胞（包括嗜酸粒细胞、淋巴细胞、肥大细胞、嗜碱粒细胞等）浸润。该病发病主要涉及变应原、抗体、细胞、受体和介质5个环节。当过敏原激发后，在15～20分钟所发生的速发相反应主要与肥大细胞有关，而在激发后4～24小时所发生的迟发反应则被认为有嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞参与。这两个时相的反应均依赖于T淋巴细胞，特别是辅助T细胞（TH）中的一个亚型TH₂。变应原是引起过敏性炎症的原因，因此若能发现致敏变应原种类，则对防治过敏性疾病具有重要意义。

过敏性疾病大多为I型***反应性疾病，是临床多发病症，具有季节性和区域性高发的特点。多因吸入尘螨、植物花粉、毛屑等变应原或因呼吸道感染病原微生物感染而引起。

呼吸道过敏反应最常见的典型疾病是变应性鼻炎和支气管哮喘。支气管哮喘在许多国家其患病率和死亡率有增加的趋势，如美国、英国、澳大利亚、新西兰等国近一年内的哮喘发生率在10-30%之间。2003年中国城区儿童哮喘患病率调查结果显示：0-15岁儿童哮喘现患病率为0.12～3.34%，全国平均为1.54%；累计患病率为1.97%，与10年前（1988～1990抽样调查，0.11～2.03%）相比明显增加。70%患儿首次喘息发作在3岁内；以呼吸道感染和过敏为诱因导致发作者占94.62%，分析认为其中部分可能为过敏性鼻炎症状。该调查显示，哮喘给患儿、患儿家庭和社会经济造成了严重的影响。病人及家长医疗需求迫切。关于哮喘的诱发因素，大量研究表明，过敏是致喘的重要因素，其中尘螨、室尘、花粉较为重要。

特应性皮炎（atopicdermatitis,AD）是儿童期最常见的一种慢性皮肤炎症，全世界儿童5%～20%患有特应性皮炎，其中60%进入***后仍有特应性皮炎表现。将近80%患者有发生呼吸道***反应的危险，包括变应性鼻炎和哮喘。吸入性变应原，包括室内尘螨和动物皮毛，是特应性皮炎的潜在诱因。在一项双盲对照研究中，Tan等发现尘螨避免可改善特应性皮炎。由此可见，进行皮肤点刺试验或特异性血清IgE测定对确定特应性皮炎患者是否有气传变应原***反应及采取合适的变应原避免措施非常有效。

慢性荨麻疹、湿疹是常见的复发性、过敏性皮肤病，病因复杂，往往无法根治，易复发；前者为机体接触变应原后发生I型或III型***反应及非***反应两条途径致病，后者是由内外激发因子引起的一种迟发型***反应。其中60～80%发病与特异性变应原有关，一次变应原的作用是发病关键，若能及时检测出患者的变应原，对预防和治疗这类疾病极有意义。

过敏性疾病变应原的诊断方法分为体内试验和体外试验，体内试验有皮内试验和点刺试验两种方法。体外试验的方法主要有免疫印迹、酶联免疫分析发、放射性免疫分析法和荧光免疫分析。

皮肤试验的原理是使微量无害的变应原进入皮肤，与皮下肥大细胞表面的特异性IgE抗体结合，经过一系列的酶激活，使肥大细胞脱颗粒，释放组胺等多种化学介质，从而使局部血管扩张、通透性增加，出现丘疹和红晕反应。临床上根据反应情况，对I型***反应性疾病的病因进行诊断。其试验的方法有多种，较常用的有皮内试验和皮肤点刺试验（SPT）。皮内试验变应原液是进入真皮，而SPT变应原液仅进入表皮。

过敏性疾病变应原的诊断，是一个***性排除筛查试验，往往为了确诊患者的过敏原，需要进行几十种疑是变应原的筛查，初次筛查利用体内皮肤试验，会给患者带来很大不必要的痛苦。在过敏性疾病变应原诊断的流程中，先通过体外诊断试纸条初筛确诊具体变应原，然后通过体内试验确认过敏变应原。因此过敏性疾病变应原体内诊断和体外诊断的方法是相辅相成，体外诊断避免了用体内试验带来的不必要痛苦和危害。

过敏性疾病变应原体外诊断的主要原理为变应原与患者血清中的特异性IgE结合，然后再与酶标、放射性同位素标记、荧光素标记的二抗结合，再与底物反应，病人血清中的特异性IgE与底物反应的强度成正比。

目前上市的过敏性疾病变应原体外诊断试纸条为免疫印迹和酶联免疫分析为原理的试纸条，操作时间长（150min～240min），操作步骤复杂（包括孵育，洗脱等步骤），配套设备昂贵（10～30万元），操作需要经过专业培训的技术员来操作。严重的影响了变应原体外检测方法的普及，目前国内大型医院才拥有变应原体外检测的能力，而多数基层医院和部队野外医院均不能开展变应原体外诊断的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种过敏性疾病变应原胶体金诊断试纸条。

本发明的另一目的是提供所述胶体金诊断试纸条的制备方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种过敏性疾病变应原胶体金诊断试纸条，所述试纸条包括样品孔、胶体金垫、膜条、吸水垫和PVC板，试纸条中的样品孔、胶体金垫、膜条和吸水垫均贴在PVC板上，在PVC板中央贴上包被有过敏原标志性分子混合物和鼠抗羊IgG多克隆抗体的膜条，膜条上缘粘贴吸水垫，膜条下缘粘贴胶体金垫，胶体金垫下缘粘贴样品孔。其中，膜条包被有吸入组过敏原Ⅰ、吸入组过敏原Ⅱ、食物组过敏原以及鼠抗羊IgG抗体，形成三条检测带和一条质控带。

所述吸入组过敏原Ⅰ为户尘螨、粉尘螨、热带无爪螨、德国小蠊、猫皮屑、狗皮屑、链格孢、烟曲霉和点青霉等标志性变应原分子的混合物。混合物中标志性变应原分子包括但不限于Derp1、Derp2、Derf1、Derf2、Blot5、Blag1、Blag2、Canf1、Canf2、Feld1、Feld2、Alta1、Aspf1、Aspf2、Aspf3、Aspf4、Aspf5、Aspf6、Penl3等。

所述吸入组过敏原Ⅱ为花粉类标志性变应原分子的混合物。所述花粉类包括但不限于：蒿属花粉、豚草花粉、葎草花粉、玉米花粉、灰藜花粉、英国梧桐花粉、桦树花粉、杨树花粉、柳树花粉、榆树花粉等。所述吸入组过敏原Ⅱ为标志性变应原分子Artv1、Artv4、Amb1、Humj1、Humj2、Zeam12.3、Cheal、Plaa1、Betv1、Betv2、Betv4、Betv6、Popv1、Sali1、Sali3、Ulm1等的混合物。

所述食物组过敏原为鸡蛋清、牛奶、花生、大豆、淡水鱼、海鱼、海虾等标志性变应原分子的混合物。混合物中标志性变应原分子包括但不限于Gald1、Gald2、Gald3、nBosd4、nBosd5、nBosd8、Arah1、Arah2、Arah3、Glym4、Cypc1、Gadc1、Pena1等。

本发明中涉及的标志性变应原分子分离自天然变应原提取物或通过基因工程重组获得。

本发明中涉及的标志性变应原分子可购自Allergon、Indoor等公司，也可自行制备获得。

本发明可将吸入组过敏原I、吸入组过敏原II、食物组过敏原分别包装在同一包装袋中，作为一次检测试验。

本发明所述的胶体金诊断试纸条中的样品孔为玻璃纤维膜。试纸条中的金标垫，为吸附有胶体金复合物的玻璃纤维膜。其中，胶体金复合物为胶体金颗粒-链霉素蛋白-生物素-羊抗人IgE抗体。

试纸条中的膜条，为包被有吸入组过敏原Ⅰ、吸入组过敏原Ⅱ、食物组过敏原标志性变应原分子混合物和鼠抗羊IgG多克隆抗体的醋酸纤维膜、硝酸纤维膜、PVDF等。试纸条中的吸水垫为多层滤纸。

试纸条中的样品孔、金标垫、膜条和吸水垫均贴在PVC底板上。在PVC底板中央贴上包被好过敏原标志性分子混合物和鼠抗羊IgG多克隆抗体的醋酸纤维膜、硝酸纤维膜或PVDF膜条，膜条上缘粘贴吸水滤纸，膜条下缘粘贴胶体金垫，胶体金垫下缘粘贴样品孔。

本发明中试验条的组装优选为：（1）贴吸水垫：吸水滤纸上沿必须和已贴好膜的板子的上沿吻合，吸水纸下沿必须压膜的0.05cm～0.1cm；（2）贴胶体金标记抗体复合物：金标垫上沿必须压着膜的下沿，并超过膜下沿的0.1cm～0.2cm；（3）贴样品孔：样品垫上沿必须压着金标垫的下沿二分之一处。

本发明还提供制备所述过敏性疾病变应原胶体金诊断试纸条的方法，包括以下步骤：

1）膜条的制备：包被过敏原标志性分子混合物，在膜条上形成三条检测带，即吸入组过敏原Ⅰ检测带、吸入组过敏原Ⅱ检测带、食物组过敏原检测带；

2）胶体金垫的制备，即偶联有检测抗体胶体金的制备；

3）试纸条的组装：在PVC板中央贴上步骤1）中制备的膜条，在膜条上缘粘贴吸水垫，膜条下缘粘贴胶体金垫，胶体金垫下缘粘贴样品孔，将组装后的试纸条密封于铝箔袋中。

其中，步骤2）中胶体金垫的制备方法为：

i.将链霉素蛋白偶联到胶体金颗粒上；

ii.将生物素偶联到羊人IgE抗体上；

iii.将i和ii混合，37℃孵育形成胶体金颗粒-链霉素蛋白-生物素-羊抗人IgE抗体复合物；

iv.将上述复合物吸附于玻璃纤维膜上，即得。

具体制备方法包括：

1、包被过敏原标志性分子混合物，在膜条上形成三条带：

其中，吸入组过敏原Ⅰ包括：户尘螨、粉尘螨、热带无爪螨、德国小蠊、猫皮屑、狗皮屑、链格孢、烟曲霉、点青霉变应原标志性分子的混合物；其中混合物中标志性变应原分子为：Derp1、Derp2、Derf1、Derf2、Blot5、Blag1、Blag2、Canf1、Canf2、Feld1、Feld2、Alta1、Aspf1、Aspf2、Aspf3、Aspf4、Aspf5、Aspf6、Penl3。

吸入组变应原Ⅱ，包括：蒿属花粉、豚草花粉、葎草花粉、玉米花粉、灰藜花粉、英国梧桐花粉、桦树花粉、杨树花粉、柳树花粉、榆、树花粉；其中混合物中标志性变应原分子为：Artv1、Artv4、Amb1、Humj1、Humj2、Zeam12.3、Cheal、Plaa1、Betv1、Betv2、Betv4、Betv6、Popv1、Sali1、Sali3、Ulm1。

食物组变应原为鸡蛋清、牛奶、花生、大豆、淡水鱼、海鱼、海虾变应原标志性分子混合物；其中混合物中标志性变应原分子为Gald1、Gald2、Gald3、nBosd4、nBosd5、nBosd8、Arah1、Arah2、Arah3、Glym4、Cypc1、Gadc1、Pena1。

将吸入组过敏原Ⅰ标志性变应原分子按一定比例混合、吸入组过敏原Ⅱ标志性变应原分子按一定比例混合、食物组过敏原标志性变应原标志性分子按一定比例混合，其中混合物的蛋白浓度不超过1mg/mL，混合后的混合物依次包被在硝酸纤维膜、醋酸纤维膜货PVDF膜上形成三条检测带。

2、胶体金颗粒-链霉素蛋白-生物素-羊抗人IgE抗体的制备：

（1）胶体金颗粒的制备

15nm、18nm～30nm、40nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl₄水溶液100mL，加热煮沸。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4mL、2.5mL、1mL或0.75mL，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、18nm～30nm、40nm和50nm。

（2）链霉素蛋白和胶体金颗粒的结合

①0.1mol/LK₂CO₃或0.1mol/LHCl调节金溶胶至所需pH值。

②于100mL金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液搅拌2～3分钟。

③加入5mL1%PEG20000溶液。

④于10000～100000g离心30～60分钟小心吸去上清液（切忌倾倒）。

⑤将沉淀悬浮于一定体积含0.2～0.5mg/mLPEG20000的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，浓度以A_540nm=1.5左右为宜，防腐置4℃保存。

⑥包被后的金溶胶也可浓缩后于SephadexG-200柱进行凝胶层析分离纯化，以含0.1%BSA的缓冲溶液洗脱。通常用IgG包被的金溶胶洗脱液pH为8.2。

以上操作应注意，一切溶液中不应含杂质微粒，可用高速离心或微孔滤膜预处理。

（3）生物素标记的羊抗人IgE抗体的制备

①用二甲基亚砜配制10mg/mL的N-羟琥珀酰亚胺生物素（应根据需要选用不同大小和间臂长的生物素化琥珀酰酯）。

②用硼酸钠缓冲液（0.1mol/L，pH8.0）稀释单抗溶液至1-3mg/mL。

③每毫克抗体加入25-250μg生物素化琥珀酰酯，混匀后，室温作用4小时。

④按每250μg生物素化琥珀酰酯加入20μl1mol/LNH₄Cl终止反应，室温放置10分钟。

⑤以PBS充分透析除去游离生物素，标记抗体冻存。

（4）胶体金颗粒-链霉素蛋白-生物素-羊抗人IgE抗体的制备

将制备好的胶体金和链霉素蛋白复合物与生物素标记的羊抗人IgE抗体按1:1比例混合，37℃孵育1h，制备得胶体金颗粒-链霉素蛋白-生物素-羊抗过人IgE抗体复合物。

（5）胶体金蛋白结合物玻璃纤维素膜制备

用喷点仪将胶体金标记的羊抗人IgE喷在玻璃纤维素膜上，真空干燥2h。

3、胶体金膜条的制备：

将吸入组过敏原Ⅰ标志性变应原分子混合物、吸入组过敏原Ⅱ变应原标志性分子混合物、食物组过敏原标志性变应原分子混合物和鼠抗羊IgG抗体稀释到一定浓度，用喷点仪喷在硝酸纤维膜上，37℃干燥4h，形成检测带和质控带。

4、试纸条的组装：

在干燥间内准备好吸水滤纸、样品垫、PVC底板，在PVC底板中央贴上包被好的硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上缘粘贴吸水滤纸，硝酸纤维素膜下缘粘贴胶体金垫，胶体金垫下缘粘贴样品垫，完成后用裁切机将贴好的试纸板切成4mm宽的试纸条。再将试纸条密封于铝箔袋中，完成产品的组装。

本发明进一步提供所述过敏性疾病变应原胶体金诊断试纸条的使用方法，包括：

A：待测血清100μl加入到该胶体金试纸条的样品孔中。

B：5～30min之内读数，实际操作时间不超过1min。

最终形成胶体金－链霉素蛋白－生物素－羊抗人IgE抗体－特异性人IgE抗体复合物，质控带包被有鼠抗羊IgG抗体。该试纸条检测总时间为5～30分钟。该试纸条是一种特异性强、灵敏度高、简易快速，能现场检测，操作人员无需专业培训，按说明书即可完成过敏性疾病快速诊断的试纸条。

本发明提供的过敏性疾病快速诊断试纸条相对现有的变应原体外诊断试纸条/试剂盒的优点在于：

（一）检测快速（5～30min）、简便，不需其它任何仪器设备，操作简单，无需专业人员，携带方便，可随时随地进行，廉价，可立刻拿到结果，不必等待，稳定性好，灵敏度高，可长期保存。

（二）本试纸条能快速的确诊患者是否为常见过敏原导致的过敏性疾病，也能快速定性患者过敏原的类型，为现有变应原体外检测试纸条的互补。

（三）本试纸条相比现有上市的试纸条/试剂盒，用过敏原标志性变应原分子包被载体代替了过敏原提取物包被载体，从技术上实现了快速诊断过敏性疾病的目的。

（四）本试纸条涉及的变应原囊括了常见过敏性疾病的变应原，包括昆虫、动物皮毛、花粉、食物过敏原。

（五）本试纸条膜条上包被的标志性变应原分子，为对应过敏原过敏患者80%以上患者体内存在对应的sIgE。

本发明提供的过敏性疾病变应原胶体金诊断试纸条，能够在短时间内诊断患者是否因过敏原过敏而发病。相对现有过敏原体外诊断的方法，本发明提供的方法能够短时间内对患者致病的原因进行定性，排除了一部分非过敏患者进行过敏原全面筛查试验，避免医疗浪费。本发明提供的方法也能对一些重症患者，短时间内确证病因。本发明提供的方法和现有过敏原体外诊断方法是一种互补的方法。在临床上，首先使用本发明的方法确诊患者是否是过敏原导致的疾病，对于诊断为过敏原诱发疾病的患者，再用其它方法进一步确定诱发疾病的过敏原。

附图说明

图1为本发明实施例1中组装的过敏性疾病变应原胶体金诊断试纸条成品；其中，质控线对应于鼠抗羊IgG抗体形成的质控带；1-3分别对应于吸入组过敏原Ⅰ、吸入组过敏原Ⅱ、食物组过敏原形成的三条检测带。

图2为本发明实施例1中组装的过敏性疾病变应原胶体金诊断试纸条成品的结构示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1过敏性疾病变应原胶体金诊断试纸条的制备

1、包被过敏原标志性分子混合物，在膜条上形成三条带

其中，吸入组过敏原Ⅰ包括：户尘螨、粉尘螨、热带无爪螨、德国小蠊、猫皮屑、狗皮屑、链格孢、烟曲霉、点青霉变应原标志性分子的混合物；其中混合物中标志性变应原分子为：Derp1、Derp2、Derf1、Derf2、Blot5、Blag1、Blag2、Canf1、Canf2、Feld1、Feld2、Alta1、Aspf1、Aspf2、Aspf3、Aspf4、Aspf5、Aspf6、Penl3。

吸入组变应原Ⅱ，包括：蒿属花粉、豚草花粉、葎草花粉、玉米花粉、灰藜花粉、英国梧桐花粉、桦树花粉、杨树花粉、柳树花粉、榆、树花粉；其中混合物中标志性变应原分子为：Artv1、Artv4、Amb1、Humj1、Humj2、Zeam12.3、Cheal、Plaa1、Betv1、Betv2、Betv4、Betv6、Popv1、Sali1、Sali3、Ulm1。

食物组变应原为鸡蛋清、牛奶、花生、大豆、淡水鱼、海鱼、海虾变应原标志性分子混合物；其中混合物中标志性变应原分子为Gald1、Gald2、Gald3、nBosd4、nBosd5、nBosd8、Arah1、Arah2、Arah3、Glym4、Cypc1、Gadc1、Pena1。

将吸入组过敏原Ⅰ标志性变应原分子按一定比例混合、吸入组过敏原Ⅱ标志性变应原分子按一定比例混合、食物组过敏原标志性变应原标志性分子按一定比例混合，其中混合物的蛋白浓度不超过1mg/mL，混合后的混合物依次包被在硝酸纤维膜、醋酸纤维膜货PVDF膜上形成三条检测带。

2、胶体金颗粒-链霉素蛋白-生物素-羊抗人IgE抗体的制备

（1）胶体金颗粒的制备

15nm、18nm～30nm、40nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl₄水溶液100mL，加热煮沸。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4mL、2.5mL、1mL或0.75mL，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、18nm～30nm、40nm和50nm。

（2）链霉素蛋白和胶体金颗粒的结合

①0.1mol/LK₂CO₃或0.1mol/LHCl调节金溶胶至所需pH值。

②于100mL金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液搅拌2～3分钟。

③加入5mL1%PEG20000溶液。

④于10000～100000g离心30～60分钟小心吸去上清液（切忌倾倒）。

⑤将沉淀悬浮于一定体积含0.2～0.5mg/mLPEG20000的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，浓度以A_540nm=1.5左右为宜，防腐置4℃保存。

⑥包被后的金溶胶也可浓缩后于SephadexG-200柱进行凝胶层析分离纯化，以含0.1%BSA的缓冲溶液洗脱。通常用IgG包被的金溶胶洗脱液pH为8.2。

以上操作中应注意，一切溶液中不应含杂质微粒，可用高速离心或微孔滤膜预处理。

（3）生物素标记的羊抗人IgE抗体的制备

①用二甲基亚砜配制10mg/mL的N-羟琥珀酰亚胺生物素（应根据需要选用不同大小和间臂长的生物素化琥珀酰酯）。

②用硼酸钠缓冲液（0.1mol/L，pH8.0）稀释羊抗人IgE抗体溶液至1-3mg/mL。

③每毫克抗体加入25-250μg的生物素化琥珀酰酯，混匀后，室温作用4小时。

④按每250μg生物素化琥珀酰酯加入20μl1mol/LNH₄Cl终止反应，室温放置10分钟。

⑤以PBS充分透析除去游离生物素，标记抗体冻存。

3、胶体金蛋白结合物玻璃纤维素膜制备

用喷点仪将胶体金标记的羊抗人IgE喷在玻璃纤维素膜上，真空干燥2h。

4、胶体金膜条的制备

将标志性变应原分子混合物和鼠抗羊IgG抗体稀释到一定浓度，用喷点仪喷在硝酸纤维膜上，37℃干燥4h，形成三条检测带和一条质控带。

5、试纸条的组装

在干燥间内准备好吸水滤纸、样品垫、PVC底板，在PVC底板中央贴上包被好的硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上缘粘贴吸水滤纸，硝酸纤维素膜下缘粘贴胶体金垫，胶体金垫下缘粘贴样品垫，完成后用裁切机将贴好的试纸板切成4mm宽的试纸条。再将试纸条密封于铝箔袋中，完成产品的组装（图1和图2）。

实施例2过敏性疾病变应原胶体金诊断试纸条的质量检验

本发明实施例1中制备的试纸条质量标准依据中华人民共和国《药典》三部，最低检出限、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、精密性均符合国家标准（表1）。

表1过敏性疾病快速诊断试纸条质量标准和检验

实施例3过敏性疾病变应原胶体金诊断试纸条的稳定性考察

将本发明实施例1中制备的试纸条于37℃放置8天，然后用标准血清试验，CV＜15%（表2）。

表2试纸条的稳定性试验结果

实施例4过敏性疾病变应原胶体金诊断试纸条的临床性能评估

过敏性疾病变应原胶体金诊断试纸条的临床性能评估，主要以皮肤点刺、Phadia100体外诊断结合临床诊断为对照，在5家临床试验中心共纳入2280例患者，评价该试纸条的灵敏度和特异性。结果表明，所述试纸条的灵敏度为90%，特异性为85%。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种过敏性疾病变应原胶体金诊断试纸条，其特征在于，所述试纸条包括样品孔、胶体金垫、膜条、吸水垫和PVC板，试纸条中的样品孔、胶体金垫、膜条和吸水垫均贴在PVC板上，在PVC板中央贴上包被有过敏原标志性分子混合物和鼠抗羊IgG多克隆抗体的膜条，膜条上缘粘贴吸水垫，膜条下缘粘贴胶体金垫，胶体金垫下缘粘贴样品孔；

其中，膜条包被有吸入组过敏原Ⅰ、吸入组过敏原Ⅱ、食物组过敏原以及鼠抗羊IgG抗体，形成三条检测带和一条质控带；

所述吸入组过敏原Ⅰ为户尘螨、粉尘螨、热带无爪螨、德国小蠊、猫皮屑、狗皮屑、链格孢、烟曲霉和点青霉标志性变应原分子的混合物；

所述吸入组过敏原Ⅱ为花粉类标志性变应原分子的混合物；

所述吸入组过敏原Ⅰ为标志性变应原分子Derp1、Derp2、Derf1、Derf2、Blot5、Blag1、Blag2、Canf1、Canf2、Feld1、Feld2、Alta1、Aspf1、Aspf2、Aspf3、Aspf4、Aspf5、Aspf6、Penl3的混合物；

所述花粉类包括但不限于：蒿属花粉、豚草花粉、葎草花粉、玉米花粉、灰藜花粉、英国梧桐花粉、桦树花粉、杨树花粉、柳树花粉、榆树花粉；

所述吸入组过敏原Ⅱ为标志性变应原分子Artv1、Artv4、Amb1、Humj1、Humj2、Zeam12.3、Cheal、Plaa1、Betv1、Betv2、Betv4、Betv6、Popv1、Sali1、Sali3、Ulm1的混合物；

所述食物组过敏原为鸡蛋清、牛奶、花生、大豆、淡水鱼、海鱼、海虾标志性变应原分子的混合物；

所述食物组过敏原为标志性变应原分子Gald1、Gald2、Gald3、nBosd4、nBosd5、nBosd8、Arah1、Arah2、Arah3、Glym4、Cypc1、Gadc1、Pena1的混合物。

2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述膜条包括但不限于醋酸纤维膜、硝酸纤维膜、PVDF。

3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述胶体金垫为包被有胶体金复合物的玻璃纤维膜；其中，所述胶体金复合物为胶体金颗粒-链霉素蛋白-生物素-羊抗人IgE抗体。

4.权利要求1-3任一项所述试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)膜条的制备：包被过敏原标志性分子混合物，在膜条上形成三条检测带，即吸入组过敏原Ⅰ检测带、吸入组过敏原Ⅱ检测带、食物组过敏原检测带；

2)胶体金垫的制备；

3)试纸条的组装：在PVC板中央贴上步骤1)中制备的膜条，在膜条上缘粘贴吸水垫，膜条下缘粘贴胶体金垫，胶体金垫下缘粘贴样品孔，将组装后的试纸条密封于铝箔袋中。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中胶体金垫的制备方法为：

i.将链霉素蛋白偶联到胶体金颗粒上；

ii.将生物素偶联到羊人IgE抗体上；

iii.将i和ii混合，37℃孵育形成胶体金颗粒-链霉素蛋白-生物素-羊抗人IgE抗体复合物；

iv.将上述复合物吸附于玻璃纤维膜上，即得。