CZ20031219A3 - Způsob detekce imunoglobulinů založený na alergenovém čipu - Google Patents
Způsob detekce imunoglobulinů založený na alergenovém čipu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20031219A3 CZ20031219A3 CZ20031219A CZ20031219A CZ20031219A3 CZ 20031219 A3 CZ20031219 A3 CZ 20031219A3 CZ 20031219 A CZ20031219 A CZ 20031219A CZ 20031219 A CZ20031219 A CZ 20031219A CZ 20031219 A3 CZ20031219 A3 CZ 20031219A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- allergens
- immobilized
- allergen
- microarray chip
- chip
- Prior art date
Links
- 239000013566 allergen Substances 0.000 title claims abstract description 270
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 title claims abstract description 51
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 title claims abstract description 51
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 title claims abstract description 31
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 84
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims abstract description 59
- 230000007815 allergy Effects 0.000 claims abstract description 54
- 238000002493 microarray Methods 0.000 claims abstract description 54
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 49
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 claims description 31
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 16
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 11
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 10
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 6
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000010703 silicon Substances 0.000 claims description 4
- 239000013568 food allergen Substances 0.000 claims description 3
- 229940043517 specific immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 2
- 239000002435 venom Substances 0.000 claims 1
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 claims 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 claims 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 11
- 229960004784 allergens Drugs 0.000 description 133
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 77
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 31
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 28
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 23
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 19
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 19
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 19
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 18
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 13
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 229940074608 allergen extract Drugs 0.000 description 11
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 11
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 7
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 6
- 241000220225 Malus Species 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 5
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 5
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 231100000640 hair analysis Toxicity 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 3
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- -1 microtiter plates Substances 0.000 description 3
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 3
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 2
- 241000272201 Columbiformes Species 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 2
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 241000746981 Phleum Species 0.000 description 2
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 2
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 101000930463 Sus scrofa Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 2
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFBNIEXDEFEJDR-UHFFFAOYSA-N (4-isothiocyanatophenyl)thiourea Chemical compound NC(=S)NC1=CC=C(N=C=S)C=C1 KFBNIEXDEFEJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000035285 Allergic Seasonal Rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 206010002199 Anaphylactic shock Diseases 0.000 description 1
- 240000007087 Apium graveolens Species 0.000 description 1
- 235000015849 Apium graveolens Dulce Group Nutrition 0.000 description 1
- 235000010591 Appio Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 241000269837 Artemisia dubia Species 0.000 description 1
- 235000003261 Artemisia vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 206010003645 Atopy Diseases 0.000 description 1
- 241000219429 Betula Species 0.000 description 1
- 235000003932 Betula Nutrition 0.000 description 1
- 241000238658 Blattella Species 0.000 description 1
- 101000800130 Bos taurus Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 101000693911 Equus caballus Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 206010052140 Eye pruritus Diseases 0.000 description 1
- 208000004262 Food Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010061958 Food Intolerance Diseases 0.000 description 1
- 206010016946 Food allergy Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 230000010663 Gene Expression Interactions Effects 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010034983 Hev b 10 Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 1
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 241000721662 Juniperus Species 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000555688 Malassezia furfur Species 0.000 description 1
- 206010027439 Metal poisoning Diseases 0.000 description 1
- 241000237852 Mollusca Species 0.000 description 1
- 102100031639 Nascent polypeptide-associated complex subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 101000930455 Ovis aries Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000595626 Plodia Species 0.000 description 1
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 102000011195 Profilin Human genes 0.000 description 1
- 108050001408 Profilin Proteins 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 208000037339 Rare allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 241001014642 Rasta Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000006694 Stellaria media Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000001467 acupuncture Methods 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000021016 apples Nutrition 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000003659 bee venom Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 1
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000012502 diagnostic product Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000005357 flat glass Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000020932 food allergy Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940015043 glyoxal Drugs 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 239000000383 hazardous chemical Substances 0.000 description 1
- 235000013402 health food Nutrition 0.000 description 1
- 208000010501 heavy metal poisoning Diseases 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000005497 microtitration Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 108010037351 nascent-polypeptide-associated complex Proteins 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 235000014571 nuts Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000004223 overdiagnosis Methods 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- FZHAPNGMFPVSLP-UHFFFAOYSA-N silanamine Chemical compound [SiH3]N FZHAPNGMFPVSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009890 sinusitis Diseases 0.000 description 1
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QLNOVKKVHFRGMA-UHFFFAOYSA-N trimethoxy(propyl)silane Chemical group [CH2]CC[Si](OC)(OC)OC QLNOVKKVHFRGMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 229920003176 water-insoluble polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
ZPŮSOB DETEKCE IMUNOGLOBULINŮ ZALOŽENÝ NA ALERGENOVÉM ČIPU
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká způsobu detekce imunoglobulinu, který se váže na alergen ve vzorku, a také způsobu in vitro diagnostiky alergií u pacientů.
Dosavadní stav techniky
Alergie je reakce vytvářená tělním imunitním systémem na látku, která by byla normálně považována za neškodnou. Je to právě tato reakce, která způsobuje symptomy, které jsou klasifikovány jako alergické reakce. Alergie tedy není projevem selhání imunitního systému, ale-naopak jeho nadměrné aktivity. Reakce alergické osoby na alergen může vést k celé řadě rozmanitých symptomů. Někteří lidé trpí symptomy jako je například astma, ekzém, vyrážka, svědění očí, sinusitida, ucpaný nebo stále vlhký nos a senná rýma, nicméně mohou se objevit i vážnější symptomy. U alergií jako například alergií na jedy, ořechy a některé měkkýše, může například nastat potenciálně život ohrožující stav nazývaný anafylaktický šok. K tomu dojde, když organismus vytváří reakci tak silnou, že dojde k otoku hrdla, poklesne krevní tlak a postižená osoba má dýchací obtíže. V některých případech tento typ reakce může být i fatální.
Výskyt alergií se výrazně zvyšuje v rozvinutých zemích (tj. v Evropě, Severní Americe a Japonsku). Odhaduje se, že 20 až 50 % populace je postiženo alergiemi. Nyní je již známo, že alergie jsou výsledkem nerovnováhy v kompartmentu T lymfccytú * · 4 ··· imunitního systému. Přesněji řečeno, alergie jsou doprovázeny zvýšením aktivity tzv. pomocných T lymfocytů 2 (Th2) vzhledem k aktivitě pomocných T lymfocytů 1 (Thl), což vede ke zvýšení tvorby IgE.
IgE (imunoglobulin E) je přinejmenším jedna z látek, které způsobují alergické reakce. IgE specifický pro alergen není normálně v krvi detekován a tvoří se jedině tehdy, když je osoba senzibilizována určitou látkou (stane se citlivou k látce). Látky způsobující alergie (nazývané alergeny) vedou k tvorbě specifického IgE, který je unikátní a bude reagovat jedině s látkou, která jeho tvorbu vyvolala. Tato reakce mezi IgE a alergenem se modelově znázorňuje jako zámek a klíč. IgE, když je spojen s alergenem, působí na buňky tak, že uvolňují chemické sloučeniny (např. histamin), které způsobují symptomy alergie. Jedna osoba může mít specifické IgE pro více než jednu látka a může tak být alergická na více než jednu látku. Výsledky testování na IgE jsou vyjadřovány jako stupeň, který ukazuje, jaké množství IgE specifického pro testovanou látku je přítomno v krvi. Čím vyšší stupeň, tím více je pravděpodobné, že pacient je alergický. V uplynulých desetiletích se alergické nemoci diagnostikovaly jen s použitím hrubě purifikovaných extraktů pocházejících z hlavních zdrojů alergenů. Je však zřejmé, že tyto surové směsi jsou komplexní a z hlediska složení značně variabilní. V důsledku toho diagnostický potenciál těchto extraktů je také proměnlivý a může vést i ke vzniku falešně negativních výsledků. To se připisovalo zejména nestálosti alergenů v extraktech. Další nevýhodou použití takových extraktů při diagnózách alergií je špatná standardizace komerčně dostupných produktů, pokud jde o jejich alergenové složení. Jednotky, kterými se vyjadřuje síla alergenu a také způsoby výpočtu jsou různé pro různé komerční společnosti. V důsledku toho diagnostické produkty od různých firem mohou být jen těžko srovnávány.
Nejdůležitější složky související s onemocnění, tj . hlavní alergeny, byli identifikovány v uplynulých desetiletích, avšak jejich kvantifikace není užívána jako východisko pro standardizaci alergenových extraktů. Monoklonální protilátky proti většině hlavních alergenů jsou nyní dostupné.
Testy na alergie metodami podle známého stavu techniky nejsou jednoduchým postupem. Tyto metody mohou být užitečné za předpokladu, že je provedena anamnéza, aby bylo možné určit, které testy by byly nejvhodnější. Nicméně dosud existuje jen velmi málo lékařsky uznávaných testů, které mohou identifikovat alergie, a jako obecný pravidlo platí, že tyto testy jsou omezeny na klinické laboratoře nebo specializovaná centra. Zatímco diagnóza atopie nebo alergie u kvalifikovaného praktika nebo specialisty na alergii může být relativně snadno provedena, pro potvrzení jsou často vyžadovány další testy.
Dále jsou uvedeny pro příklad různé typy testů na alergie.
1. Test podkožní injekcí
Podezřelý alergen je injikován pod povrch kůže a reakce je pozorována kvalifikovanou ošetřovatelkou nebo lékařem. Jak se reakce vyvíjí, vzniká zóna zčervenání, a čím silnější je reakce, tím větší je tato zóna. Kožní test je docela citlivý, ačkoli ne všechny alergie mohou být identifikovány tímto způsobem.
2. Náplasťový test
Náplasťový test může být užitečný v případě kontaktní « » V * ···· r
dermatitidy. Testovací látky jsou obvykle aplikovaný na kůži pokrytou náplastí a ponechán na místě po dobu 48 hodin. Kladná reakce vytváří malou oblast ekzému. Stejně jako v předchozím případě reakce je pozorována kvalifikovanou ošetřovatelkou nebo lékařem.
3. Alternativní test na alergii
Existují mnohé alternativy testů na alergie a bohužel jen málokteré jsou dostatečně přesné nebo uznávané lékaři. Tyto alternativní testy jsou často klamné a mnohdy i velmi nákladné.
4. Test Vega
Test Vega je elektrický test popisovaný jako bioenergetická regulační technika. Přístroj měří vodivost Wheatstonovým obvodem. Elektrody jsou připojeny na akupunkturní body nebo je pacient drží v rukou. Různé roztoky se pak umisťují na kovový podnos. Přístroj je pak kalibrován tím, že se na podnos umístí skleněná lahvička obsahující toxickou látku. Lahvička vyvolá snížení elektrické vodivostí. Další látky jsou pak umisťovány na podnos a jestliže dávají podobnou hodnotu, pak jde o alergickou reakci nebo „citlivost na látku. Tato technika je velmi rozšířena, zejména v obchodech s tzv. zdravými potravinami, nicméně její hodnota dosud nebyla prokázána a nebyly provedeny žádné platné klinické zkoušky, který by podložily tato tvrzení
5. Test na toxicitu pro leukocyty (leukocytotoxicitu)
Tento test zahrnuje smíchání bílých krvinek pacienta s extrakty ze specifických jídel a pak měření buňky (různými
| 5 | • · * » 4 4 4 4 4 4 · · · ·· * · 1 | 4 » · · ~ »«44444 4 4 4 4 · · »4 » *· | ||
| <1 1 způsoby), | aby se | zjistila nějaká forma | změny. | Zde dochází |
| k vysokému | počtu | falešně pozitivních a | falešně | negativních |
| reakcí a Americká | Akademie Alergie došla | k závěru | , že dosud | |
| neexistuje | žádný | důkaz, že by tento test byl | účinný pro |
diagnózu alergie na jídlo nebo inhalovanou látku.
6. Analýza vlasů
Další formou testování je vlasová analýza. Vlasy mohou být analyzovány na přítomnost toxických kovů jako je například olovo, rtuť a kadmium nebo nízké hladiny selenu, zinku, chrómu, manganu a hořčíku. Otravy těžkými kovy jsou dobře známy a dokumentovaný ve kriminalistické vědě a analýza vlasů může skutečně indikovat expozici těmto kovům. Nicméně analýza vlasů jakožto prostředek pro diagnózu alergii, ani užitím metody jako například proutkaření, nikdy nebyla potvrzena.
7. Aplikovaná kinesiologie
Vzorky potravin jsou umístěny pod jazykem nebo drženy ve skleněné nádobce v ruce pacient.a Pacient je pak požádán, aby tlačil svou volnou rukou proti ruce ošetřující osoby, examinátora. Jestliže je detekována alergická reakce, tak se projeví jako redukovaná svalová reakce a pacient má náhle problém zvednou svou paži. Tato technika zcela propadne při provedení dvojitě slepé klinické studie.
Kromě toho existují různé in vitro metody diagnózy alergií, kdy se detekuje přítomnost IgE nebo IgG protilátek v krvi:
8. Obvyklé metody jako je ELISA nebo Western blot:
Tyto testy se užívají k detekci protilátek (IgE) * · · * ···· přítomných v séru pacienta pomocí (rekombinantních) alergenů.
9. Radioalergosorbentový test (RASTA™)
V tomto postupu je specifický alergen kondenzován na papírovém disku, a imunospecifický IgE, jestliže je přítomen v testovaném séru (tj. v séru od pacienta), se bude vázat na disk, přičemž následně se provádí detekce pomocí radioaktivně značené anti-IgE. Užívají se různé hodnotící (skórovací) systémy srovnávající výsledky testu s absolutní vazba negativní kontroly. Obecně modifikovaný postup RAST™ je následován inkubací přes noc a umožňuje detekci s vyšší citlivostí.
10. Kvantitativní experimenty inhibice IgE založené na RAST:
V tomto testu je extrakt alergenu „natečkován (nanesen v malých skvrnkách) na proužcích nitrocelulózy. Alikvoty séra jsou preinkubovány se směsí specifických rekombinantních alergenů, a po té je tato směs inkubována s nitrocelulózovými proužky. Navázaný IgE je detekován pomocí protilátky antihumánní IgE. V posledním kroku se vypočte procento inhibice vazby IgE přírodními extrakty po preabsorpci s rekombinantní alergeny.
11. Stimulační test buněčných antigenů (CAST)
Bazofilní buňky pacienta jsou stimulovány interleukinem-3 a alergenem a pak následuje měření ELISA de novo vytvořeného a uvolňovaného sulfidoleukotrienu (SLT).
φφφ • · · * • » φ * φφ φφ
12. Test UniCAP
Rekombinantní alergeny jsou imobilizovány na pevné fázi a pak se detekuje vazba protilátek, které jsou přítomny v séru pacienta, na alergeny.
Nicméně všechny tyto metody vyžadují množství jednotlivých experimentálních kroků, aby bylo možné testovat vetší počet (např. 100) různých alergenů. Kromě toho, výše uvedené testy neprojevují dostatečně vysokou citlivost a spolehlivost a jsou velmi náročné na čas. Také množství vzorku (např. séra pacienta), a také purifikovaných, často rekombinantních a nákladných alergenů, která jsou potřebná k provádění těchto testů, jsou velká.
Patent US 4 444 879 se týká metody a zařízení pro imunotesty k určení celkových imunoglobulinů a IgE. Zde jsou alergeny extrahovány a imobilizovány v jamkách mikrotitrační destičky potažené polymerem. Vzorek, který má být analyzován, je pak přidán do jamek a je proveden obvyklý imunotest.
V patentu EP 0 556 745 Al je popsán způsob detekce IgE protilátek proti pšeničnému proteinu v tělních tekutinách, přičemž extrakt pšeničného alergenu je imobilizován na pevná fázi, kterou je například chromatografický nebo kapilární materiál nebo vlákna, sklo, nylon, celulóza nebo její deriváty ve formě perliček, mikročástic, listů nebo jamek mikrotitrační destičky. Také zde se provádí obvyklý imunotest pro detekci protilátek ve vzorku od pacienta.
Patent US 3 720 7 60 se týká způsobu analýzy tělesných tekutin na imunoglobuliny. Také zde je alergen obsahující extrakt, který je komerčně dostupný, navázán na s vodou nerozpustný polymer, na kterém je pak prováděn obvyklý imunotest.
· • 9 • 9 • 9 • » » 9 • * ··· • · · ·
Patent US 4 849 337 se také týká způsobu identifikace hladiny IgE specifického pro alergen v séru pacienta tím, že se konjuguje IgE v séru s alergeny navázanými na nerozpustném nosiči. Zde je alergenem opět extrakt nebo alergen pocházející přímo z pylu, prachu, zvířat apod.
Tyto konvenční imunotesty nicméně nejsou použitelné pro testování pacientů pokud jde o přítomnost alergií, jelikož počet různých alergií přesahuje mnoho set alergií a stále se zvyšuje. Čas a práce nutné pro analýzu pacientova séra na všechny možné a také vzácné alergie jsou příliš vysoké a proto takové analýzy nemohou být prováděny v laboratořích, kde musí být analyzovány denně vzorky z několika set pacientů.
Podstata vynálezu
Cílem předkládaného vynálezu je proto poskytnout způsob detekce imunoglobulinu, který se váže na alergen ve vzorku, kterýžto způsob nemá výše uvedené nevýhody a může být prováděn v krátkém čase a jen s malým množstvím vzorku a alergenu, je velmi spolehlivý a citlivý a navíc, což je nejdúležítější, umožňuje detekci prakticky neomezeného počtu alergeny v jednom jediném testu.
Dále předkládaný vynález poskytuje způsob pro in vitro diagnózu alergií u pacienta bez výše uvedených nevýhod.
Způsob podle vynálezu je charakterizovaný tím, že jeden nebo více alergenů jsou imobilizovány na čipu s mikromaticí, na kterém je inkubován vzorek s imobilizovanými alergeny, takže imunoglobuliny, které jsou specifické pro alergeny, se vážou na specifické alergeny, a pak jsou detekovány imunoglobuliny, které jsou navázány na specifické imobilizované alergeny.
• ·
Mikromatice („microarrays), přip. mikromaticové čipy, byly nedávno užity pro celou řadu postupů manipulace s DNA, přičemž tyto postupy byly již dávno užívány vědeckou komunitou. Tyto čipy s mikromaticí DNA, tzv. DNA čipy, se staly běžně dostupnými v mnoha různých formátech a nakonec vedly k podstatné změně způsobů navrhování a provádění v běžné laboratorní praxi. In vitro DNA diagnostika je nyní méně časově náročná a méně pracná, protože tyto nové technologie umožňují komplexní testy ve vysokovýkonném a vysokokapacitním formátu {„high-throughput). V důsledku toho i v oblasti proteomického výzkumu byly klasické substráty pevná fáze, jako například mikrotitrační destičky, membránové filtry a mikroskopická sklíčka, byly nahrazeny formátem mikromatic s vysokou hustotou. Nová a všestranná technologie proteinových matic nakonec umožňuje i high-throughput screening genové exprese a molekulárních interakcí (Walter a kol., Curr Opin Microbiol 2000 Jun,3(3):298-302, Emili & Cagney, Nat Biotechnol 2000 Apr,18(4)393-7). Nedávno byl také koncept proteinové matice použit pro imunologické testy.
Biočip je popisován jako čip vhodný pro vysokovýkonnou (HT, „high-throughput), mnohočetnou analýzu s enzymem navázaným na ímunosorbent (ELISA). Takové biočipy mohou sestávat například z opticky ploché skleněné destičky obsahující 96 jamek vytvořených vložením hydrofobní teflonové masky, nicméně jsou známy a používány i jiné látky a formy biočipů. Experimenty ukazují, že specifická mnohočetná detekce proteinových antigenů uspořádaných v matici na skleněném nosiči je proveditelná. Další možnosti použití tohoto nového vysokovýkonného testovacího (HTS, „high-throughput screening) formátu zahrnují přímé stanovení profilů exprese buněčných proteinů, mnohočetné testy pro detekce infekčních agens a diagnostiku nádorů (Mendoza LG a kol., Biotechniques 1999 • 9
9« *· • ····
9·
9 · • 9 9 9 · 9 «9 9« 9
Oct,27(4):778-80).
Avšak při použití těchto známých čipů s mikromaticí pro testování proteinů jsou protilátky imobilizovány na mikromaticový čip. Překvapivě bylo zjištěno, že je možné navázat na mikromaticový Čip nejen protilátky, ale také alergeny, které jsou antigeny odpovídajícími specifickým protilátkám, konkrétně IgE a IgG, v daném pořadí. Tento fakt je zvláště překvapující, neboť funkční alergeny vykazují zvláštní sekundární strukturu, která může být modifikována, když jsou navázány k pevné fázi v takové vysoké hustotě jako na mikromaticový čip. Taková modifikace struktury alergenu by narušila vazbu protilátka-alergen, což by vedlo k falešně negativním výsledkům. Protilátky, fragmenty protilátek nebo peptidy jsou relativně malý a vykazují vysokou stabilitu, proto protilátky mají větší stabilitu v roztoku ve srovnání s jim odpovídajícími antigeny. Nicméně když jsou imobilizovány na pevná fázi dokonce i v případě protilátek jen malé procento jich zůstává neporušených a účinných.
Článek Haab a kol. (Genom Biologie 2000, I (6): pre-print 0001,1-0001,22) který byl přijatý 9. listopadu 2000, se týká proteinových mikromatic pro detekci a kvantifikaci proteinů a protilátek v roztoku. Výsledky analýz prováděných podle této publikace ukázaly, že jen 50 % antigenů v matici a 20 % protilátek v matici poskytlo specifické a přesné měření odpovídajících alergenů.
Navíc diverzita možných alergenů je samozřejmě mnohem vyšší než diverzita protilátek, pokud jde o zpracování proteinů, obzvláště imobilizaci a značení takové série strukturálně různorodých alergenů. Nicméně bylo překvapivě ukázáno, že alergeny imobilizované na mikromaticový čip vykazovaly vysokou spolehlivost a senzitivitu při detekci imunoglobulinů ve vzorku.
·« · · · • · · • · · *« · • * * · · ·· ··
Tento způsob dovoluje uskutečnit test na mnoho imunoglobulínů, který vážou specifický alergen, v jednom experimentálním kroku, přičemž test může také být atomizován: více než 100 různých alergenů může být testováno aniž by se provádělo mnoho individuálních experimentálních kroků, jako když se provádí test v obvyklé mikrotitrační formě. Kromě toho, tento test vykazuje vysoký stupeň senzitivity a spolehlivosti. Také výsledky z testu prováděného tímto způsobem mohou být získány v krátkém časovém období, např. přibližně za tři hodiny, což zkracuje čas potřebný pro test ve srovnání s obvyklými testy RAST nebo ELISA.
Kromě toho, mikromaticový test je vysoce reprodukovatelný, když se provádějí opakované experimenty s čipy obsahujícími vzorky od různých osob, např. s maskou podobnou mikrotitrační destičce, kdy každá jamka obsahuje několik různých alergenů a vzorek jedné osoby je přidán do jamky. Dále výhodou způsobu podle předkládaného vynálezu je skutečnost, že velký počet různých sond zaujímá relativně malou plochu, která je obsazena vysokou hustotou. Malá povrchová plocha matice umožňuje existenci mimořádně jednotných vazebných podmínek (teplotní regulace, obsah solí apod.), zatímco mimořádně velký počet sond umožňuje souběžné zpracování velkého počtu hybridizací. Protože matice s vysokou hustotou obsahují tak velký počet sond, je možné poskytnout současně četné kontroly, a to včetně například kontroly pro variace nebo mutace konkrétního alergenu, kontroly pro celkové hybridizační podmínky, kontroly pro podmínky přípravy vzorku a záměnu kontroly pro nespecifickou vazbu nebo zkříženou hybridizací.
Dále způsob testu podle vynálezu vyžaduje jen minimální zlomek látky (alergenu i vzorku ) ve srovnání s obvyklými testovacími systémy. To znamená, že se stejným množstvím výchozího materiálu je možné vyrobit mnohem větší počet • ···· testovacích souprav, když se použije mikromaticová forma, a také může být odebráno menší množství vzorku pro větší množství imunoglobulinů, které vážou alergeny. Také díky malému objemu vazba se uskuteční velmi rychle.
Přírodní intaktní imunoglobuliny nebo protilátky jsou tvořeny obecně tetramerní molekulou ve tvaru Y mající vazebné míst pro antigen na konci každého horního ramene. Vazebné místo pro antigen se skládá z variabilní domény těžkého řetězce spojené s variabilní doménou lehkého řetězce. Konkrétně protilátkové vazebné místo pro antigen je v podstatě tvořeno 3 CDR (úseky určujícími komplementaritu) variabilní domény těžkého řetězec (VH) a 3 CDR variabilní domény lehkého řetězce (VL) .
Obecně se termín antigen týká látky schopné vyvolat imunitní reakci a běžně je to také látka použitá pro detekci odpovídající protilátky v jedné z mnoha in vitro a ín vivo imunologických metod pro demonstraci ' interakce antigenprotilátka.
Podobně, termín alergen označuje antigen, který má schopnost indukovat specifickou protilátku (tj, IgE), a také se na ni vázat, přičemž jde o protilátku zodpovědnou za běžné alergie. Nicméně tato druhá definice nevylučuje možnost, že alergeny mohou také indukovat reaktivní protilátky, ke kterým patří imunoglobuliny jiných tříd než IgE.
Imobílízace v kontextu s proteiny nebo peptidy se týká navázaní nebo napojení proteinu/peptidu na pevný nosič obvyklým známým způsobem, buďto s dodatečnou spojkou („spacer) mezi pevnou fází a alergenem nebo bez ní. Imobilizace peptidu/proteinu na nosič je v oboru dobře známa, do rozsahu předkládaného vynálezu spadá jakýkoliv způsob imobilizace, např. kovalentní nebo nekovalentní vazbou, zejména hydrofobní interakcí, například na membrány a syntetické povrchy, v daném pořadí, apod.
Mikromatice je matice určitých prvku (např. bodů neboli „skvrnek) mající hustotu jednotlivých prvků alespoň přibližně 16/cm2, výhodně alespoň přibližně 64/cm2, ještě výhodněji přibližně 96/cm2 a nejvýhodnější alespoň přibližně 1000/cm2. Prvky mikromatice mají charakteristické rozměry, např., průměry, v rozsahu mezi přibližně 10 až 2000 pm, výhodně přibližně 50 až 500 pm, ještě výhodněji přibližně 150 až 250 pm, a jsou odděleny od jiných prvků v matici přibližně stejnými vzdálenostmi. Proto mikromatice podle předkládaného vynálezu použitelná pro rutinní screening ve velkém měřítku může obsahovat alespoň 500, výhodně alespoň 1000 individuálních prvků - bodů (skvrn) obsahujících alergeny, standardy a kontroly.
Čip podle předkládaného vynálezu může být doslova jakéhokoliv tvaru, např. sklíčko, nebo jamka mikrotitrační destičky nebo také mnohočetný povrch, ačkoliv rovinný typ čipu je výhodný.
Detekční krok může být prováděn nějakým obvyklý způsobem, který je odborníkům znám, např. využitím fyzikální, enzymatické nebo chemické reakce, apod.
Podle výhodného provedení předkládaného vynálezu jsou IgE detekovány jako imunoglobuliny. IgE je známý jako látka způsobující alergické reakce a je tvořen jedině tehdy, když se osoba stane citlivou na látka, tj . vyvine se u ní alergie. Proto pro testování toho, zda je vzorek od pacienta, který je alergický na specifický alergen, je vzorek testován na IgE jako imunoglobuliny. Čím vyšší množství IgE je ve vzorku, tím je pravděpodobnější, že vzorek byl odebrán z pacienta alergického na specifický alergen.
Výhodně jsou detekovány jako imunoglobuliny IgG ** I · · « »···· · · · ? ·····*· · ··..· «· ·· ·· · ·· ·· imunoglobuliny. IgG je známý tím, že je přítomen ve vzorku od pacienta, který je alergický na jídlo, proto může být detekce IgG použita jako indikace potravinové nesnášenlivosti.
Výhodně jeden nebo více purifikovaných alergenů je imobilizováno na mikromaticovém čipu. Tyto jednotlivé alergeny jsou například purifikovány z alergenového extraktu, např. ze specifické potraviny nebo rostliny. Samozřejmě jeden nebo více alergenů specifického druhu může být analyzováno najednou.
Metody purifikace jsou odborníkům známy, je to např. chromatografická purifikace, purifikace separací podle hmotnosti, purifikace specifickou vazbou alergenu na pevnou fázi, např, prostřednictvím protilátky, apod. Použití vysoce purifikovaných alergenů pro masovou výrobu testů na alergie nebylo zatím navrhováno.
Purifikovaný alergen označuje, na rozdíl od extraktu, jednotlivý alergen, který může být například nativní, rekombinantní nebo synteticky připravený alergen. Tyto purifikované alergeny vykazují řadu důležitých výhod proti alergenovým extraktům, když jsou imobilizovány na pevná fázi: vzhledem k tomu, že jde o směs různých proteinů, které jsou přítomny v jakémkoliv extraktu, je koncentrace alergenu, který má být testován, velmi nízká ve srovnání s purifikovaným preparátem jednotlivého alergenu. Purifikovaný jednotlivý alergen může proto být imobilizován na mikromatici ve velice vysoké koncentraci. Vzhledem k přesným a definovaným molekulám přítomným v preparátu purifikovaného alergeny jen definovaný alergeny bude imobilizován na mikromatici. Proto mikromatice a způsob detekce protilátky pomocí purifikovaných alergenů může být standardizována a podrobena přesným kontrolám kvality.
Kromě toho vzhledem k vysoké koncentraci purifikovaného alergenu v přípravku jsou alergeny na mikromatici imobilizovány s vyšší hustotou a proto· i jakýkoliv detekční e· 4 * « »·«·« « 4 4 4 · 4 · ·· 4· ·· ♦ způsob založený na takové mikromatici je citlivější než odpovídající mikromatice s pouhými extrakty obsahujícími alergeny. Další výhodou purifikovaných jednotlivých alergenů proti alergenovým extraktům spočívá ve skutečností, že imobilizované purifikované alergeny jsou přesně definovány. Na rozdíl od purifikovaných alergenů zahrnují alergenové extrakty například dva, tři nebo více různých alergenů z jednoho organismu nebo předmětu. Například v případě jablka, extrakt bude obsahovat směs různý jablečných alergenů, zatímco přípravek podle vynálezu obsahuje jeden z purifikovaných jablečných alergenů, nebo - v závislosti na použití definovanou směs dvou nebo více jablečných nebo různých alergenů.
Další výhodou purifikovaných alergenů ve srovnání s nepurifikovanými alergeny například přítomnými v extraktu spočívá ve skutečnosti, že kvůli dalším nečistotám přítomným v extraktu není extrakt stabilní déle než jen omezený časový interval a pak může například být plesnivý. To vsak ovlivní detekci alergií, protože také alergie proti plísním také existuje, a v tomto případě pak bude získán falešně pozitivní výsledek.
Kromě toho kvůli přítomnosti proteáz v extraktech jsou extrakty nestálé, což neplatí pro purifikované alergeny.
Také vzhledem k existujícím terapiím pomocí purifikovaných alergenů provádění diagnózy se stejným purifikovaným alergenem je hlavní výhoda proti diagnostice s nepurifikovanými alergeny. Takové diagnózy jsou zejména výhodné, aby následovaly po terapii purifikovanými alergeny a umožnily testovat individuální reakcí na specifickou terapii a dovolili tak poskytnout individuální, konkrétnímu pacientovi přizpůsobenou terapii.
Z výše uvedených důvodů způsoby detekce imuncglobulinu, který se váže na alergen ve vzorku, kdy ječen nebo více purifikovaných alergenů je imobilizováno na mikromaticový čip, jsou obzvláště výhodné.
Výhodně je jeden nebo více rekombinantních alergenů imobilizováno na mikromaticovém čipu. V posledních několika letech bylo připraveno mnoho rekombinantních alergenů. Produkce rekombinantních alergenů je také v principu známa ve stavu techniky, ale dosud měla jen malý dopad na rutinní testy na alergie. Avšak pomocí rekombinantních alergenů je možné připravit velké množství jednoho nebo více specifických alergenů a tak optimalizovat test. Dále je možné modifikovat rekombinantní alergeny specificky tak, aby s získala jakákoliv mutaci alergenu pro detekci specifického imunoglobulinu. Kromě toho používání hlavních alergenů jako rekombinantních proteinů poskytuje alternativu k testům založeným na extraktech, pokud jde o stabilitu testu a také pokud jde o standardizaci diagnostiky.
Výše uvedené výhody purifikovaných alergenů ve srovnání s nepurifikovanými alergeny (extrakty) platí tím spíše pro rekombinantní alergeny než pro purifikované nativní alergeny: rekombinantní alergeny mohou být navrženy a připraveny ještě s větší specifitou než purifikované nativní alergeny a proto je možný optimalizovat afinitu a specifitu testu s rekombinantními alergeny. Rekombinantní alergeny jsou také lepší pro standardizaci co se týká způsobu jejich produkce. Navíc rozdíly mezi jednotlivými výrobními šaržemi jsou menší pro rekombinantní alergeny než pro alergeny pocházející z přírodního zdroje. Bylo překvapivě ukázáno v předkládaném vynálezu, že použití těchto rekombinantních alergenů v rutinních in vitro diagnostických testech podle vynálezu je lepší než obvyklé testovací systémy založené na extraktech. Na rozdíl od rutinního sériového testování podle stavu techniky
| testování alergenů | podle vynálezu s | použitím rekombinantních | ||
| alergenů přináší | zcela | novou | kvalitu | pokud jde |
| o standardizaci, | možnost | kontroly, | senzitivitu, | |
| reprodukovatelnost, | schopnost | testu | poskytnout | diagnosticky |
| relevantní informace | : apod. | |||
| Rekombinantní | alergeny | byly | například | popsány v |
| publikacích Chapman | a kol. Alergie, | 52:374-379 ( | )1997), Laffer |
a kol. J Alergie Clin Immunol Vol 98 No. 2, 652-658 (1996), Miiller a kol. Clinical and Experimental Allergy Vol 27 9, 915920 (1997), Niederberger a kol. J Alergie Clin Immunol Vol 102 No. 4, part 1, 579-591 (1998), Menz a kol. Clinical and Experimental Allergy Vol 26, 50-60 (1996), které jsou zahrnuty formou odkazu v tomto textu. Dalšími příklady (rekombinantních) alergenů jsou, aniž by výčet byl omezující, rBetvl, rBetv2, rBetv4, rJunO2, Cassl, rPhlpl, rPhlp2, rPhlp4, rPhlpSa, rPhlp6, rPhlp7, rPhlpll, rPhlpl2, rParj2, Artvla, Mugwort profilin, Apigl, Apigl,0201, Daucl,2, rArah2, rArahS, Maldl, Mald2, rPenal, recCarp, rDerpl, rDerp2,0101, rDerp2, rDerp2b, rDerp5, rDerpSa, rDerp7, rDerp8, rDerplO, rTyrp2, rLepd2,01, rhepdl3, rEurm2,0101, rFeldl, rFeldla, rBosd2, reprezentativní alergen z kočky, reprezentativní alergen ze psa, reprezentativní alergen z BSA, reprezentativní alergen z myši, reprezentativní alergen alergen z laboratorního potkana, reprezentativní alergen z vepře, reprezentativní alergen z ovce, reprezentativní alergen z kuřete, reprezentativní alergen z králíka, reprezentativní alergen z křečka, reprezentativní alergen z koně, reprezentativní alergen z holuba, reprezentativní alergen albuminu morčete, HSA, a-NAC, rPenc3, Pennl3, rPencl9a, rPencl9b, rAspfl, rAspfla, rAspf3, rAspf3a, rAspfl, rAspf4a, rAspf6, rAspf6a, rAspf7, rAspf8, rAltal, rAlta2, rMalfl, rMalfS, rMalf6, rMalf7, rMalf8, rMaif9, rHevbl, rHevbla, rHevb3, rHevb8, • · 9 9 9 • · · * · 9 ·
99999 · *
rHevb9, rHevblO, rHevbll, rAK, rBlag2, rBlag4, rBlagS, fosfolipáza A, hyaluronidáza, rVesvS a rVesg5.
V dalším výhodném provedení je jeden nebo více synteticky připravených alergenů imobilizováno na mikromaticovém čipu. Tady platí stejné výhody proti alergenovým extraktům a také proti purifíkovaným nativním alergenům jak byly uvedeny výše pro rekombinantní alergeny. Způsob syntetické přípravy peptidů nebo proteinů je dobře znám ve stavu techniky, syntetickou přípravou alergenů je možné získat vysoce purifikované alergeny ve velkém množství a při nízkých nákladech, neboť tyto metody přípravy jsou vysoce automatizované. Kromě toho přesná sekvence jakéhokoliv alergenu může být získána bez modifikací nebo s modifikacemi, které zvyšují senzitivitu a spolehlivost způsobu detekce imunoglobulinů podle vynálezu.
Je také možné použití jen alergenní determinantu nebo alergenní doménu specifického alergenu pro testování podle předkládaného vynálezu. Tím se mohou ' vyloučit rizika a nevýhody plynoucí z práce s velkým proteiny, protože s kratšími peptidovými strukturami se snadněji zachází při rutinní přípravě biočipů. To platí pro všechny purifikované nativní, rekombinantní a syntetickém alergeny. Toto by dále umožnilo detekovat jednopeptidové epitopy, což by ještě více zlepšilo diagnostický test a terapii, zejména pokud jde o specifitu.
Zvláště výhodné je poskytnout nativní formu alergen a současně také syntetickou nebo rekombinantní formu alergenu na tomtéž čipu. Zatímco je výhodné použít hlavně rekombinantní nebo syntetické alergeny, nativní formy alergenů mohou být užity alespoň jako kontroly nebo další zdroje informace o kvalitě čipu. Výhodný čip podle předkládaného vynálezu proto obsahuje nativní a syntetickou nebo rekombinantní formu alespoň jednoho alergenu. To poskytuje • · » * ···· » • · · · « · * a · t « · · «» · · ·· ·· «» 4 ·4 · · také zlepšenou kontrolu kvality a standardizaci různých šarži alergenů.
Výhodně je jeden nebo více haptenů imobilizováno jako alergeny na mikromaticovém čipu. Hapten je nízkomolekulární (typicky s molekulovou hmotností menší než přibližně 7000 Daltonu) látka, která je obecně neschopná jako samotná vyvolat významnou tvorbu protilátek po podávání do zvířecího organismu, včetně člověka. To je proto, že hapten je příliš malý na to, aby mohl být rozpoznáván imunitním systémem organismu. Avšak když je hapten kondenzován na větší, nosičovou molekulu, hapten získá antigenní vlastnosti. Jinými slovy, vazba haptenu na nosičovou molekulu (Čímž vznikne kombinace molekul analyt-nosič) dovolí imunitnímu systému organizmu rozpoznávat hapten. Imunoprecipitační reakce tak může proběhnout mezi haptenem (kondenzovaným na nosičové molekule) a protilátkou proti haptenu. Přípravou haptenů, které jsou imobilizovány na mikromaticovém čipu může být dosažena na čipu vyšší hustota.
Je samozřejmě možné kombinovat výše uvedené různé formy alergenů, např. použít současně rekombinantní a (purifikované) nativní alergeny. Kombinace těchto různých forem umožňuje srovnávat je a také např. užít jako kontrolu rekombinantní alergeny pro různé šarže nativního alergenu, které mohou být odlišné v důsledku rozdílů v biologických zdrojích, způsobu přípravy, čistotě apod.
Pro vysoce účinné testy je výhodné použít alergeny, kterého vykazují optimální vlastnosti, např. vysokou vazebnou schopnost. Nicméně použití méně nebo odlišně účinných antigenů je výhodné pro detekci variant alergenů s neúčinnou vazbou, např. pro použití při hyposensitizační terapii.
Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu jsou alergeny imobilizovány na mikromaticovový čip do „bodu či „skvrnky • 4 « * · 4 4··
4 4 94444 • · 4 · 4 1 1
44 4· 4 · 4 44 („spot) o průměru 10 až 2000 pm, výhodně 50 až 500 pm, ještě výhodněji 150 až 250 pm. Protože tyto nanesené body mají malý průměr, je možné imobilizovat velký množství různých alergenů a různé koncentrace určitého alergenu v samostatných „bodech mikromaticového čipu, což dovoluje připravit jediný mikromaticový čip, který může být v jednom - automatizovaném kroku použit pro analýzu velkého počtu alergenů a/nebo mnoha různých koncentrací alergenu.
Výhodně jsou alergeny ímobilizovány na pevná fázi, výhodně na skleněném nosiči, syntetickém nosiči, křemíkovém čipu nebo membráně, v daném pořadí. Takové čipy mohou být vyráběny například postupem popsaným v Ge, H. (2000), Nucleic Acids Research 28, e3 (i-vii), Qian W. a kol. (2000), Clinical Chemistry 46 (1456-1463), MacBeath G. a kol. (2000), Science 289, (1760-1763), který jsou zahrnuty v předkládané přihlášce formou odkazu. Každý z těchto uvedených materiálů vykazuje specifické vlastnosti a výhody, které jsou odborníkům známy. Tudíž vhodný materiál pro mikromaticový čip bude vybrán podle alergenu, který má být testován, způsobu detekce navázaných imunoglobulinů a použitých pufrů. Kromě toho, volba vhodného materiálu je také závislá na financích.
Výhodně je mikromaticový čip chemicky modifikovaný, výhodně aminoreaktivními a karboxyreaktivními modifikacemi, v daném pořadí. To umožní přesně stanovit způsob, jakým se alergen váže na mikromaticový čip.
Výhodně jsou alergeny kovalentně vázány na mikromaticovém čipu. To poskytuje stabilní vazbu alergenů k mikromaticovému čipu, a proto je způsob podle vynálezu mimořádně spolehlivý.
Podle dalšího výhodného provedení předkládaného vynálezu jsou imunoglobuliny detekovány ve vzorku krevního séra. U pacientů, kteří jsou alergičtí na alergen, se imunoglobuliny vytvářejí hlavně v krevním séru, takže analýza krevního séra · · · · · • 9 9 9 · · ···· 9 9 • 999 *9 9 9 · 9 99 99 99 9 «9 99 t
poskytuje spolehlivý způsob pro detekci imunoglobulinu. Kromě toho, krevní sérum může být snadno odebíráno pacientům velmi jednoduchých způsobem a odběr vzorku může být proveden dokonce u pacienta doma.
Výhodně se krevní sérum naředí 1:1 až 1:15, výhodněji 1:5. Ředění může být prováděno jakýmkoliv vhodným roztokem, např. lx TBST (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% TWEEN 20).
Výhodně je pak vzorek inkubován 1 minutu až 24 hodin, výhodněji 1 až 2 hodiny, s alergeny. Samozřejmě je možné inkubovat vzorek s alergeny dokonce i po dobu více dnů. Nicméně to již nevede ke zvýšení intenzity signálu nebo specifity. Obecně platí, že inkubace po dobu 1 hodiny je dostatečná pro získání spolehlivého a citlivého výsledku.
Kromě toho, vzorky s alergeny jsou výhodně inkubovány při teplotě mezi 0 a 60 °C, výhodněji ve 37 °C. Inkubace při nižší teplotě nevede ke zvýšení signálu, ale spíše vedou ke zvýšení nespecifické vazby a hladiny šumu (pozadí). Inkubace ve 37 °C poskytuje přesné a spolehlivé výsledky pro testy alergenů u lidí.
Výhodně je navázaný imunoglobulin detekován alespoň jednou značenou specifickou anti-imunoglobulinovou protilátkou. Termín protilátka, jak se v tomto textu používá, se týká jak íntaktní molekuly protilátky tak i jejích fragmentů, jako jsou například Fa, F(ab)2 a Fv, které jsou schopné vázat se na epitopovou determinantu. Protilátky mohou být připraveny použitím intaktního polypeptidu nebo fragmentů obsahujících požadovaný malý peptid jakožto očkovacího antigenu. Polypeptid nebo peptid použitý pro očkování zvířete může být připraven translací RNA nebo může být syntetizován chemicky a může být kondenzován na nosičový protein, je-li to třeba. Obecně používané nosiče, které jsou chemicky kondenzovány s peptidy, zahrnují bovinní sérový albumin a thyreoglobulin. Kondenzovaný • 4 • · · ·· *4 • 4 4 4 4 4 4
4 «·«· 4 · 4 4 • 4 4 4 4 4 4
4 44 44 peptid je pak použit pro očkování zvířete (např. myši, laboratorního potkana nebo králíka).
V kontextu předkládaného vynálezu termín protilátka zahrnuje jak monoklonální tak polyklonální protilátky, přičemž monoklonální protilátky mohou být připraveny s použitím jakékoliv známé techniky, která umožňuje produkovat protilátkové molekuly v kontinuální buněčné kultuře. Patří sem, avšak bez omezení, technika hybridomů, technika humánních B lymfooytových hybridomů a IBV hybridomů. Kromě toho mohou být připraveny chimérické protilátky, jednořetězcové protilátky, a také synteticky připravené protilátky.
Protilátka může být značena kterýmkoliv známým způsobem, který dovoluje kvalifikovat a výhodně i kvantifikovat navázané protilátky. Detekovatelné značky vhodné pro použiti v předkládaném vynálezu zahrnují jakoukoliv kompozici detekovatelnou spektroskopický,, fotochemickým, biochemickým, imunochemickým, elektrickým, optickým nebo chemickým způsobem. K užitečným značkám patří biotin pro značení pomocí kondenzace se streptavidinem, magnetické (mikro)perličky, fluorescenční barviva (např. fluorescein, texaská červeň, rhodamin, zelený fluorescenční protein apod.), radiaoktivní značky neboli radioznačky (např. 3H, 125I, 35S, 14C nebo 32P) , enzymy (např. křenová peroxidáza, alkalická fosfatáza a další běžně používané v ELISA testech) a kolorimetrické značky jako je například koloidní zlato nebo perličky z barevného skla nebo plastu (např. polystyren, polypropylén, latex apod.).
Prostředky pro detekci výše uvedených značek jsou odborníkům známé. Tak například radioznačky se mohou detekovat s použitím fotografického filmu nebo scintilačního počítače, fluorescenční značky mohou být detekovány s použitím fotodetektorů detekujících vyzařované světlo. Enzymatické značky jsou typicky detekovány tím, že se enzymu poskytne • 9
9 9 ···· «V * 999 99999 · 9
9 · · 99 9 9 · ·
9· ·· 99 « 99 substrát a detekuje se reakční produkt vytvořený působením enzymu na substrát a kolorimetrické značky jsou detekovány tím, že se jednoduše vizualizuje barevná značka.
Výhodně jsou navázané imunoglobuliny detekovány užitím alespoň jedné fluorescenčně a radioaktivně, v daném pořadí, značenou specifickou anti-imunoglobulinovou protilátkou. To jsou klasické metody kvalitativní a kvantitativní analýzy navázaných protilátek, které jsou velmi specifické a velmi spolehlivé.
Jiné výhodné detekční systémy pro mikromatice jsou například systémy popsané v publikacích: Schult K. a kol. (1999), Anal Chem, 71 (5430-5435), Vo-dinh T. a kol. (1999), Anal Chem, 71 (358-363), Brignac SJ Jr. a kol. (1999), IEEE Eng Med Biol Journal, 18 (120-122), Otamiri M. a kol. (1999), Int J Biol Macromol, 26 (263-268), Wright, GL Jr. a kol. (2000), Prostatě cancer and Prostatic deseases, 2 (264-276), Nelson RW. a kol. (2000), Electrophoresis 21 (1155-1163), Rích RL. a kol. (2000), Curr Opin Biotechnol 11 (54-61), Chen JJ. a kol. (1998), Genomics, 51 (313-324), které jsou zahrnuty v tomto textu formou odkazu.
Výhodně se jako alergeny imobilizuje jeden nebo více vnitřních (domácích) alergenů. To jsou např. alergeny roztočů Tyr. Dan., Lep. dest. or. mayrei, Felis, Bos, Albumin, Pen. cit., Pen. not. Asp. fumigatus, Alt. alt., Malassezia furfur, Latex, Plodia a Blatella, aniž by tento výčet byl omezující.
Podle dalšího výhodného provedení se jako alergeny imobilizují jeden nebo více venkovních alergenů. To jsou např. alergeny z Betula, Juniperus, Phleum, Parietaria judicea atd., aniž by tento výčet byl omezující.
A dále mohou být jako alergeny imobilizovány jeden nebo více potravinových alergenů, např. alergen z celeru, karotky, • « « • ···· «· ·· ·· ♦ ·* arašídů, jablka, krevet a ryb.
Dále mohou být jako alergeny imobilizovány také jeden nebo více autoalergenů. Takovými autoalergeny jsou např. alergeny jaterní membrány, ssDNA antigeny, antigeny v nebo na svalových buňkách kosterního svalstva, aniž by tento výčet byl omezující.
A dále mohou být jako alergeny imobilizovány jeden nebo více jedových antigenů. To mohou být např. antigeny z jedu včel nebo vos, aniž by tento výčet byl omezující.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu in vitro diagnózy alergií u pacienta, přičemž způsob spočívá v tom, že vzorek séra je odebrán od pacienta, pak je vzorek analyzován na imunoglobuliny, které se vážou na alergeny způsobem podle předkládaného vynálezu, přičemž je použit mikromaticový čip, na kterém je imobilizováno alespoň 10, výhodně alespoň 50, ještě výhodněji alespoň 90, různých alergenů, po té se detekuje kladná reakce mezi vzorkem a imobilizovanými alergeny a ta je diagnostikována jako alergie. Výše uvedené definice a výhody se týkají také tohoto způsobu in vitro diagnózy alergií ve srovnání se známými metodami diagnózy alergií. Způsob podle vynálezu vykazuje výhodu, že může být současně diagnostikován velký počet alergií s jen jediným vzorkem, jelikož všechny alergeny, které mají být testovány, jsou imobilizovány na jednom jediném mikromaticovém čipu. Každý krok je proto prováděn jen na jednom čipu, přičemž čip může dále obsahovat body, kde není imobilizován žádný alergen, a tím poskytovat současnou negativní kontrolu detekce. Počet alergenů, které mohou být testovány, není nijak omezen, a v případě potřeby se připraví dva nebo více mikromaticových čipů.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká mikromaticového čipu, na kterém je imobilizován jeden nebe
4 4 4 4 4 4 · » 4
444 4 *444 4 4 4 4 «444 ·* 4 « · 4 4
4« 44 44 4 44 44 více alergenů. Také pro tento aspekt předkládaného vynálezu platí výše uvedené definice a výhody.
Výhodně jsou alergeny imobilizovány v „bodech o průměru 100 až 500 pm, výhodněji o průměru 200 až 300 μπι.
Pro mikromaticovový čip je výhodným nosičem sklo, syntetický nosič, křemíkový čip nebo membrána, v daném pořadí.
Výhodně je mikromaticovový čip chemicky modifikovaný, výhodně aminoreaktivní a karboxyreaktivní modifikací, v daném pořadí.
Výhodně jsou alergeny na mikromaticový čip kovalentně navázány.
Další aspekt podle předkládaného vynálezu se týká soupravy, která obsahuje mikromaticový čip podle předkládaného vynálezu, jak byl popsán výše, a první činidlo obsahující alespoň detekční činidlo nejméně jednoho imunoglobulinů, výhodně anti-imunoglobulinovou protilátku, výhodně ve známé koncentraci, a případně druhé činidlo jakožto pozitivní vzorek obsahující alespoň jeden imunoglobulin, který se váže na alergen. První činidlo obsahující detekční činidlo alespoň jednoho imunoglobulinů, výhodně anti-imunoglobulinovou protilátku, může být použito pro detekci navázaného imunoglobulinů, a v tomto případě je anti-imunoglobulinová protilátka výhodně značena, jak bylo uvedeno výše. Výhodně je protilátka přítomna v prvním činidle ve známé koncentraci, a proto umožňuje získávat v testu reprodukovatelné výsledky. Kromě toho, souprava výhodně obsahuje druhé činidlo jako pozitivní vzorek obsahující alespoň jeden imunoglobulin, který se váže na alergen. Také zde je výhodné, když imunoglobulin je přítomen ve známé koncentraci v druhý činidle, atak umožňuje kvantifikovat imunoglobulin přítomný ve vzorku tím, že se srovnávají výsledky ze vzorku od pacienta s • « 4 4 4 4 4 4 4 4
4 4 4 · 4444 4 4 4 *
4 4 4 4 4 4 4 · 4 4
4* 44 4* 4 4» ·4
I výsledky pozitivního kontrolního vzorku (tj. druhého činidla).
Výhodně je souprava podle vynálezu určena k provádění způsobu podle předkládaného vynálezu, jak bylo uvedeno výše.
Pro tento účel jsou první a druhé činidlo navrženy tak, aby umožnily detekovat jeden specifický imunoglobulin, který se váže na jeden specifický alergen, nebo-li aby detekovaly jednu specifickou alergii u pacienta. Nicméně, souprava může také být navržena také tak, aby detekovala celou řadu imunoglobulinů, které vážou specifické alergeny, neboli detekovat tak celou řadu alergií u pacienta.
Předkládaný vynález je dále podrobněji popsán a vysvětlen v následujících příkladech a pomocí obrázků, které v žádném případě rozsah vynálezu nijak neomezují.
Popis obrázků
Obr. 1 ukazuje schéma mikromatice alergenů.
Obr. 2 u ukazuje snímek matice alergenů testované se sérem alergického jedince.
Obr. 3a-3c ukazují test rozptylu (Scatterplot Test) z trojího opakování testu.
Obr. 4a-4c ukazují výsledky měření fluorescence (v %) pro ímobilizované extrakty a imobilizované rekombinantní alergeny.
9 9 9··· 99 ·
9 9 » 9 9 9 9 9 9 9
9999 9« 9 999»
99 99 9 9» »9
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Nanášení alergenů („spotting)
Alergeny byly naneseny do matice s použitím nanášecího („spotovacího) zařízení GMS 417 od firmy Genetic Micrsystems. Proteiny byly naneseny na derivatizované podložky („sklíčka). Individuální alergeny byly naneseny jediným dotekem do jednoho bodu a ve třech opakováních (triplikáty). Body (tj. skvrnky)měly průměr přibližně 200 pm.
Alergeny byly uspořádány do funkčních způsobem:
skupin následujícím (A) Venkovní alergeny (I. Stromy [l=rBetvl, 3=rBetv4, 4=rJunO2, 5=Cassl], II. Trávy [6=rPhlp2 8=rPhlp5a, 9=rPhlpl, 10=rPhlp6, ll=rPhlp7, 13=rPhlpl2], III. Plevele [14=rParj2, 15=Artvla, profilin]),
2=rBetv2, , 7=rPhlp4, 12=rPhlpll, 16=Mugwort (C) Potravinové Alergeny (X. 18=Apigl,0201, 19=Daucl,2, 20=rArah2 [22=Maldl, 23=Mald2], XII. Krevety
Zeleniny
21=rArah5] [24=rPenal], [17=Apigl, XI. Plody
XIII. Ryby [25=recCarp]), (B) Vnitřní (domácí) alergeny (IV. Roztoči [26=rDerpl, 27=rDerp2,0101, 28=rDerp2, 29=rDerp2b, 30=rDerp5, 31=rDerp5a, 32=rDerp7, 33=rDerp8, 34=rDerplO, 35=rTyrp2], V. Zvířata [36=rLepd2,01, 37=rLepdl3, 38=rEurm2,0101, 39=rFeldl, 40=rFeldla, 41=rBosd2, 42=reprezentativní alergen z kočky, 43=reorezentstivní aleraen ze psa, 44=ESA, 45=reprezentativní • · «
4 «
I 4 4 « • 4 «4 » · · · ► 4 4444 » 4 »
4 » 4 «
I · I » 4 4 I
44 alergen z myši, 46=reprezentativní alergen z laboratorního potkana, 47=reprezentativní alergen z prasete,
48=reprezentativní alergen z ovce, 49=reprezentativní alergen z kuřete, 50=reprezentativní alergen z králíka, 51=reprezentativní alergen z křečka, 52=reprezentatívní alergen z koně, 53=reprezentatívní alergen z holuba, 54=albumin z morčete], VI. Plísně [55=rPenc3, 56=rPencl9a, 57=rPencl9b, 58=Pennl3, 59=rAspfl,
62=rAspf6, 63=rAspfla, 64=rAspf3a,
68=rAspf8, 69=rAltal, 70=rAlta2], VII. Kvasinky 72=rMalfl, 73=rMalf5, 74=rMalf6, 75=rMalf8,
76=rMalf9], VIII. Latex [77=rHevbl, 78=rHevbla,
80=rHevb8, 81=rHevb9, 82=rHevblO, 83=rHevbll], [84=rAK, 85=rBlag2, 86=rBlag4, 87=rBlag5]), (D) Jedy (XIV. Včela [88=Ag5, 89=Fosfolipáza, 90=Hyaluronidáza, 91=rVesv5, 92=rVesg5], XV. Vosa [93=Ag5]),
60=rAspf3, 61=rAspf4, 65=rAspf4a, 66=rAspf6a,
67=rAspf7, [7l=rMalf7,
79=rHevb3, IX. Hmyz (E) Autoalergeny (94=HSA, 95=a-NAC)
Dále, body obsahující pouze pufr byly rozmístěny mezi podskupiny alergenů a sloužily jako kontrola pozadí, označeny byly X, a dále ab označuje protilátku. (viz obr. 1: 1864x1182 pixelů, 1,86x1,18 cm, 1000 pixelů na cm, pixel hloubka/barviva 8/256/, 1 pixel odpovídá 10 pm) .
100 pm alikvoty alergenů byly rozděleny do jamek 96jamkové mikrotitrační destičky v koncentraci přibližně 200 ng/μΙ v nanášecím pufru (300 mM fosfátový pufr pH 8,5). Optimální koncentrace pro imobilizaci alergenů byla určena titračním experimentem s několik alergeny v různých pufrovacích roztocích, a také na různých sklíčkách. Testované proteiny vykazovaly saturační chování v koncentraci shodné nebo vyšší než 100 ng/pl, jak bylo zjevné z bílého signálu konstantní • · · · · · » ·· · * * · · · * »*·« · · · · *··· · « *·«· ·· ·· ·· · ·· ·* síly při měření GMS snímačem. Při této koncentraci vazebné
| chování alergenů byl nezávislé na nanášecího pufru. | složení | skladovacího a | |
| Příklad 2 | |||
| SOPHIA (Test na imunosorbentu v pevná | fázi) | ||
| Následně po inkubaci přes | noc | byly | nosičové |
| destičky(„sklíčka) buďto koupené od firmy | CEL | Associates |
(aldehydové nosiče) nebo připravená v laboratoři původců byly promyty v lx TBST (10 mM Tris pH 8,0/150 mM NaCl/0,5% Tween 20) za energického třepání v kyvetě Falcon při teplotě místnosti. Jako blokovací krok byla sklíčka přenesena do lx TBST roztoku obsahujícího 0,01% BSA na dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Následně byla sklíčka promyta v lx TBST po dobu 15 minut a pak krátce opláchnuta destilovanou vodou.
Alergenová matice byla inkubována s naředěným sérem (1:5 v lx TBST) po dobu (alespoň) 60 minut, v 37 °C za třepání. Různé stupně ředění séra byly testován, v rozmezí od z 1:1 až 1:15. Obvykle ředění 1:5 poskytla nejlepší výsledky. 30 μΐ naředěného séra bylo přidáno ke sklíčku v uzavíratelných komůrkách od firmy SIGMA Technologies. Komůrky byly použity podle návodu výrobců. Byly testovány různé inkubační doby pro sérum v rozmezí od 60 minut až po inkubaci přes noc. Avšak prodloužená inkubace se sérem nevedla ke zvýšení intenzity signálu ani specifity signálu. Po inkubaci se sérem byla sklíčka promyta v lx TBST (15 minut, okolní teplota) za třepání.
Pět různých sér alergických pacientů, kteří byli vyšetřeni běžnými diagnostickými testy (test injekcí do podkoží, RAST, ELISA) a sérum z r.eatopického pacienta byly vybrány jako • · * * · · a *· · * * · · * ···· · · * · ·*·· ·· · »··* ·« ·· ·· · ·· ♦· »
vhodné pro laboratorní zkoušku alergenové matice. Jednotlivá séra byly testována alespoň dvakrát alergenových čipech připravených ve dvou várkách.
Fluorescenčně značená α-IgE protilátka značená fluorescenčním barvivém AlexaFluor podle protokolu výrobce (Molecular Probes) byla přidána k alergenovému čipu v roztoku obsahujícím 0,01% BSA/1X TBST a vše se inkubovalo po dobu 60 minut při teplotě místnosti. Pracovní ředění protilátky bylo v rozmezí 1:1000 až 1:5000 v závislosti na době a účinnosti značení. Po imunotestu byla sklíčka promyta lx TBST (15 minut, teplota místnosti, třepání) a pak krátce opláchnuta destilovanou vodou.
Následně po imunosorbentovém testu byla sklíčka vyhodnocena pomocí GMS dvoubarevného snímače. Obecně intenzita signálu se jen velmi málo měnila pro rÚ2né testy a různé čipy. Nicméně, hodnoty pozadí se lišil v závislosti na typu použitého čipu. Příklad zobrazení (scan) alergenové matice testované se sérem pacient trpícím alergií je ukázán na obr. 2. Tento pacient vykazuje silnou reakci s antigeny z Phleum, roztočů, kočky a včely (srovnej obr. 1) . Žádný signál pozadí nebyl pozorován pro nespecifickou interakci s body, kde je jen pufr nebo autoalergeny. Po kompletním vyhodnocení výsledků ze séra alergického pacienta byla data porovnána s daty předtím získanými pro totožná séra testy RAST. Data získaná způsobem podle předkládaného vynálezu byla v dobré shodě s těmito datovými soubory.
Příklad 3
Test reprodukovatelnosti na séru pacienta C
Sérum pacienta C byle testováno třikrát na individuálně • · · ···· ·* · • · · · » a aaaa * a » · a a a a · a a · · · ·· ·· ·· · ·« ·· připraveném alrgenovém míkročípu. Experimentální postup byl v podstatě shodný s tím, jak byl popsán výše.
Po testu byla sklíčka skenována s použitím totožného hardwarového nastavení. Analýza dat byla provedena s použitím softwarového balíku GenePix. Vypočtené průměrné hodnoty intenzity signálu pro každý alergen ve třech opakováních byly porovnány po třech opakováních experimentu.
Jedině hodnoty odpovídající signálům, které byly alespoň l,5x vyšší než průměrná hodnota pro samotný pufr byly vybrány pro konečnou analýzu. Průměrná hodnota, směrodatná odchylka a procento směrodatné odchylky pro relevantní signály jsou uvedeny v následující tabulce 1.
Tabulka 1
| Alergen | Testi | Test 2 | Test 3 | Průmě | Směr. odchylka | %prům. |
| tBatvI | 20731 | 21328 | 25282 | 22372.00 | 1916.11 | 6.56 |
| rPhl p 2 | 17176 | 15529 | 14227 | 15644.00 | 1206.67 | LZ1 |
| rPhí d 4 | 36134 | 33511 | 29328 | 32991.00 | 2802.76 | 4.5Q |
| rPht pSa | 56600 | 53068 | 55594 | 55087.33 | 1485.77 | |
| rPM 0 6 | 56244 | 51359 | 37625 | 48409.33 | 7862.14 | 1128 |
| rPhlo 12 | 6291 | 7003 | 12289 | 8527.67 | 2675.50 | 31.37 |
| lESíiZ | Z552 | 7678 | 8224.67 | 863,73 | 10.80 | |
| Artvla | 6997 | 7931 | 11258 | 6728.67 | 1828Z2 | 20.95 |
| Muowort orofl- | 7901 | 7689 | 82S& | 8276.67 | 701.74 | && |
| Ha | ||||||
| Maidl | 9690 | 15295 | siza | 11120.33 | 3033,74 | 27.26 |
| HSA | 9668 | SZ32 | 10708 | 9769.33 | 809.71 | 6.29 |
| Ovčí albumin | 9858 | 4225 | 12222 | 9456.33 | 835.92 | 184 |
| Koňský albumin | 9602 | aasi | 10559 | 9740.67 | 619.37 | O |
| tAsd f 1 íb) | 12218 | 10129 | 10781 | 11042.00 | 8Z-J7 | 7.90 |
| rMal f 5 | 13459 | 11018 | 12035 | 12170.67 | 1001.14 | 528 |
| rAK | 2068Q | 14202 | 19978 | 18286.67 | 2902.48 | naz |
• · · · · · · *· · · · · ···· « · · · ···· »·· ···· ·· ·· ·· · ·♦ ··
Průměrná směrodatná odchylka vypočtená z hodnot získaných pro tři individuální testy byla 12,36 %. To znamená, že imunologický test na čipu, zkoumající přítomnosti IgE v séru pacientů, je vysoce reprodukovateiný. To je také zřejmé, když se kontroluje vynesení jednotlivých naměřených bodů (scatterplots) pocházejících z trojnásobného testu 3, viz obr. 3a-3c, kde obr. 3a ukazuje vynesení bodů testu 1 proti testu 3, obr. 3b vynesení bodů testu 2 proti testu 3 a obr. 3c ukazuje vynesení bodů testu 1 proti testu 2, A znamená alergeny a FI intenzitu fluorescence.
Příklad 4
Srovnání různých mikročipů
Pro otestování optimálního čipu pro předkládaný vynález, byly hodnoceny individuálně připravené nosiče podle kritérií, která jsou následovně uvedena:
- Výrobní postup: čipy byly vyrobeny a hodnoceny podle řady parametrů, jako například potřeba nebezpečných chemických látek a doba výroby
- Cena výroby: čipy připravené v laboratoři a komerčně dostupné byly srovnány podle jejich ceny
- Vazebná kapacita: Různé čipy byly hodnoceny podle vazebné kapacity fluorescenčně značených proteinů
- Reprodukovatelnosti: Sériové experimenty byly prováděny s odlišně ošetřenými čipy a vyhodnoceny podle celkové výkonnosti testu
- Obecné pozadí: Všechny čipy byly hodnoceny před a po test alergie na systematický signál pozadí (šum), který by při detekci mohl zmenšovat poměr signál k šumu.
··· **·· · ♦ « • · » ♦ · · ···· · · · · • · · · ·· · · · · · ·· ·· « · ·* ·*
- Detekční limit: Všechny čipy byly hodnoceny na minimální proteinovou koncentraci detekovatelnou na jeden bod (spot) ve screeningovém testu alergie
- Tolerance séra: Obecné, sérum pacienta je složitá směs proteinů, která často narušuje záporně imunotesty na čipu s různými odběry pacientova séra
- Blokování: Všechny čipy byly hodnoceny na nutnost užít blokovací krok před vlastním testem alergie
- Skladování: Všechny čipy byly hodnoceny z hlediska dlouhodobého skladování od výroby alergenového čipu.
Výsledky výše popsané studie jsou ukázány v tabulce 2:
Tabulka 2
| Chemie reaktivního povrchu/ typ čipu | Výroba | Náklady | Vazebná kapacita | Specificita | Reprodukova- telnost | Pozadí (šum) | Detekční limit | Screening alergie | Blokování/ navázání | Skladování |
| Proteo Bind | + | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | NE | - | |
| CEL(1) | / | ++ | ++ | ++ | - | - | + | ++ | ANO | ++ |
| 3D-Link (2) | / | — | ++ | ++ | + | + | + | - | ANO | - |
| Superaldehyd (1) | / | — | + | + | ++ | - | + | + | ANO | ++ |
| Aminosilan (3) | + | ++ | + | + | — | - | + | + | NE | ++ |
| Glyoxal (3) | - | + | ++ | ++ | — | - | + | ++ | ANO | ++ |
| EGS (3) | - | ± | ++ | ++ | -- | - | + | + | NE | - |
| SulfoKMUS (3) | - | ± | ++ | + | / | - | / | / | NE | / |
| Glutaraldehyd (3) | - | ± | / | / | — | - | / | / | / | ++ |
| Fotozesítení (3) | - | ± | + | / | - | / | / | 1 | / | |
| PEl/EGS(3> | - | — | ++ | + | + | + | / | / | i | / |
| FAST čip (4) | / | — | + | — | - | — | — | - | NE | ++ |
| CAST čip(4) | / | — | + | + | + | — | — | ANO | ++ | |
| Nemodifikované sklo | + | ++ | - | / | — | ++ | — | / | / | / |
• · 4 • 4444 4 • 4 4
4 4
4444 44 4 4*4 44 44 44 * *4
Tabulka 2 ukazuje výsledky vyhodnocení studie popsané v textu.
(++) znamená vynikající výsledek, ( + ) dobrý, (-) slabší a (—) špatný. (/) znamená že čip nebyl testován pro tuto konkrétní kategorii. (1) čipy obsahující funkční povrch s aldehyčovými skupinami. (2) čipy obsahující aminoreaktivní povrch, přesné chemické vlastností nejsou známy (3) čipy připravené v laboratoři s funkčními skupinami, jak byly uvedeny v tabulce
2. (4) čipy obsahující membránu pro imobilizaci proteinů.
FroteoBind je pracovní název pro derivatizaci povrchu přizpůsobenou pro optimalizovaný výkon diagnostického testu na mikročípu obsahujícím (1-[3~[trimethoxysilyl)propyl]-1'(4isothiokyanatofenyl)thiomočovinu), který byl připraven podle Chen a kol. (Nucleic Acids Research, 199, vol,27, č. 2, publikace je zahrnuta formou odkazu v tomto textu).
Podle výsledků studie prezentovaných výše byl vybrán ProteoBind jako nej lepší povrchová derivatizace pro výrobu alergenových mikročipů.
Příklad 5
Srovnání detekce imunoglobulin ve vzorku s imobilizovanými rekombinantními alergeny a s imobilizovaným extraktem
Pro test citlivosti a diagnosticky relevantní informace pomocí purifikovaných rekombinantních alergenů imobilizovaných na mikromaticovém čipu a alergenového extraktu imobilizovaného na mikromaticovém čipu, byly srovnány specifické alergeny jednoho zdroje s alergenovým extraktem stejného zdroje.
Po imobilizaci preparátů alergenů na mikromaticový čip byly různé vzorky obsahující specifické sérum přidány na mikročíp a fluorescence, který odpovídá množství protilátky • · ··· 44444»« « «
4 4 4 4 · · * * · «4 «4 V* * 44 44 t
vázané na alergeny bylo měřeno. Výsledky jsou ukázány v tabulkách 3, 4 a 5, a také na obrázcích 4a, 4b a 4c, kde
FL znamená fluorescence. Z těchto výsledků je jasné, že v případě rekombinantních alergenů, detekce a kvantitativní vyhodnocení jsou mnohem citlivější než v případě alergenových extraktů. Fluorescenční intenzita jednotlivého rekombinantního antigenu je významně vyšší než fluorescenční intenzita extraktu. Kromě toho, v případě extraktu jen zdroj extraktu může být testován a není možný testovat, který specifický antigen zdroje je zodpovědný za alergii, na rozdíl od detekce s rekombinantními alergeny. Proto je způsob diagnostiky podle vynálezu s použitím jednotlivých purifikovaných alergenů, konkrétně rekombinantních alergenů, výhodnější než použití extraktů obsahujících alergeny.
Tabulka 3
| Graf 1 | Sérum 1-Sp | Sérum 4-Sp | Sérum 19-5 | Sérum 30-5 |
| Betvla | 52028 | 62529 | 62932 | 18847 |
| Betvla Mut | 6590 | 237 | 905 | 139 |
| Betvld | 1576 | 14352 | 252 | 89 |
| Betv2 | 2196 | 1408 | 273 | 1253 |
| BP -Extrakt | 21013 | 39438 | 11390 | 3174 |
4 · 4 · · ♦ * « · · · · ···· • · · · · · * «· O ·· * ♦ · ··
Tabulka 4
| Graf 2 | Sérum 5-Sp | Sérum 7-p | Sérum 9-S | Sérum 17-S | Sérum 18-S | Sérum 40-S |
| Plilpl | 45611 | 12148 | 21588 | 5836 | 23497 | 23424 |
| Phlpll | 209 | 52043 | 814 | 2562 | 10984 | 14753 |
| Phlp V | 64005 | 63481 | 62953 | 40770 | 63530 | 62029 |
| Phl - Extract | 63987 | 40318 | 14504 | 10183 | 44405 | 19798 |
Tabulka 5
| Graf 3 | Sérum 11-Sp | Sérum 16-Sp | Sérum 39-5 | Sérum 40-5 |
| Hev b 3 | 416 | 387 | 108 | 235 |
| Hev b 5 Mal | 350 | 519 | 30601 | 63897 |
| Hev b 8 | 11146 | 7977 | 134 | 853 |
| Hev b 9 | 460 | 631 | 105 | 188 |
| Hev b 10 | 360 | 429 | 73 | 152 |
| Latex B extrakt | 264 | 202 | 80 | 3426 |
| Latex C extrakt | 769 | 866 | 5343 | 30970 |
ί · * · · * ♦ * · · * ft « » ··*· · · · · • o · * · · * · · · · ·· ·· ·♦ * ·* ·· ?/ V0O3-«77
Claims (34)
- PATENTOVÉNÁROKY1. Způsob detekce imunoglobulinu, který se váže na alergen ve vzorku, vyznačující se tím, že jeden nebo více alergenů je imobilizováno na mikromaticovém čipu, na kterém se vzorek inkubuje s imobilizovánými alergeny tak, že imunoglobuliny, které jsou specifické pro alergeny se navážou na specifické alergeny, a pak jsou detekovány imunoglobuliny, které jsou navázány na specifické imobilizované alergeny.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že jakožto imunoglobuliny jsou detekovány IgE.
- 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že jakožto imunoglobuliny jsou detekovány IgG.
- 4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že jeden nebo více nativních alergenů je imobilizováno na mikromaticovém čipu.
- 5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že jeden nebo více rekombinantních alergenů je imobilizováno na mikromaticovém čipu.
- 6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že jeden nebo více synteticky připravených alergenů je imobilizováno na mikromaticovém čipu.• · * * · » ··** · · «·* · * * »· » «· ·· ·· · ♦· ··
- 7. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že jeden nebo více haptenů je imobilizováno jakožto alergeny na mikromaticovém Čipu.
- 8. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že alergeny jsou na mikromaticovém čipu imobilizovány jako skvrnky o průměru 10 až 2000 pm, výhodně 50 až 500 um, ještě výhodněji 150 až 250 pm.
- 9. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že alergeny jsou imobilizovány jako mikromaticový čip na pevné fázi.
- 10. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že alergeny jsou imobilizovány jako mikromaticový čip na skle nebo syntetickém nosiči.
- 11. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že alergeny jsou imobilizovány jako mikromaticový čip na křemíkové destičce.
- 12. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že alergeny jsou imobilizovány jako mikromaticový čip na membráně.
- 13. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že mikromaticový čip je chemicky modifikovaný, výhodně aminoreaktivní a karboxyreaktivní modifikací.9 9 9 *9 9 9 99999999 » 9 9 9999 • 9 99 99 9 99 99
- 14. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že alergeny jsou k mikromaticovému čipu kovalentně navázány.
- 15. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14, vyznačující se tím, že imunoglobuliny jsou detekovány v krevním séru jakožto vzorku.
- 16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že krevní sérum je naředěno 1:1 až 1:15, výhodně 1:5.
- 17. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 16, vyznačující se tím, že vzorek se s alergeny inkubuje 1 minutu až 24 hodin, výhodně 1 až 2 hodiny.
- 18. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17, vyznačující se tím, že vzorek je inkubován s alergeny při teplotě mezi 0 a 60 °C, výhodně ve 37 °C.
- 19. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 18, vyznačující se tím, že navázané imunoglobuliny jsou detekovány alespoň jednou značenou specifickou anti-imunoglobulinovou protilátkou.
- 20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že navázané imunoglobuliny jsou detekovány alespoň jednou fluorescenčně značenou specifickou anti-imunoglobulinovou protilátkou.• 99 9 9 9» 9 9 * • · 9 9 9 · »9·· 9 9 9 9 • •99 · · · 9 · ·99 99 99 · 9* *9
- 21. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že navázané imunoglobuliny jsou detekovány alespoň jednou radioaktivně značenou specifickou anti-imunoglobullnovou protilátkou.
- 22. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 21, vyznačující se tím, že jakožto alergeny jsou imobilizovány jeden nebo více vnitřních alergenů.
- 23. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 21, vyznačující se tím, že jakožto alergeny jsou imobilizovány jeden nebo více venkovních alergenů.
- 24. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 21, vyznačující se tím, že jakožto alergeny jsou imobilizovány jeden nebo více potravinových alergenů.
- 25. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 21, vyznačující se tím, že jakožto alergeny jsou imobilizovány jeden nebo více jedových alergenů.
- 26. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 21, vyznačující se tím, že jakožto alergeny jsou imobilizovány jeden nebo více autoalergenů.
- 27. Způsob in vyznačuj ící pacienta analyzuj aleruenv způsobem vitro diagnostiky alergií u pacienta se tím, že se vzorek séra odebraný od e na imunoglobuliny, které se vážou na podle kteréhokoliv z nároků 1 až 26, přičemž • 9 9 9 9 9 9 · ·9 9 9 9 9 9 9999 9 9 9 99999 99 9 9 ·9999 99 99 9 99 99 je použit jnikromaticový Čip, na kterém je imobilizován alespoň 10, výhodně alespoň 50, ještě výhodněji alespoň 90 různých alergenů, a pozitivní reakce mezi vzorkem a imobilizovaným alergenem je určena jako alergie.
- 28. Mikromaticový čip vyznačující se tím, že je na něm imobilizován jeden nebo více alergenů.
- 29. Mikromaticov čip podle nároku 28 vyznačující se tím, že alergeny jsou imobilizovány ve skvrnkách o průměru 100 až 500 μιτι , výhodně 200 až 300 pm.
30. v y z Mikromaticový čip načující se t podle i m , že nároku 28 nebo nosičem je sklo. 29, 31. Mikromaticový čip podle nároku 28 nebo 29, v y z načující se t i m , že nosič je syntetický. 32. Mikromaticový čip podle nároku 28 nebo 29, v y z načující se tím, že nosič je křemíková destička. - 33. Mikromaticový čip podle vyznačující se tím, že nároku nosič je28 nebo membrána.29,
- 34. Mikromaticový čip podle kteréhokoliv z nároků 28 až 33, vyznačující se tím, že je chemicky modifikovaný, výhodně aminoreaktivní a karboxyreaktivní modifikací.• 44 4 4 · * 4 4 ·4 4 « · · · 4444 4 · • 44« «4 4 444 4« 44 4 ··
- 35. Mikromatícový čip podle kteréhokoliv z nároků 28 až 34, vyznačující se tím, že alergeny jsou k němu kovalentně navázány.
- 36. Souprava vyznačující se tím, že obsahuje mikromatícový čip podle kteréhokoliv z nároků 28 až 35, a první činidlo obsahující detekční činidlo alespoň jednoho imunoglobulinu, výhodně anti-imunoglobulinovou protilátku, výhodně ve známé koncentraci, a případně druhé činidlo jakožto pozitivní vzorek obsahující alespoň jeden imunoglobulin, který se váže na alergen.
- 37. Souprava podle nároku 36, vyznačující se tím, že je určena pro provádění způsobu podle kteréhokoliv z nároků
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP00890296A EP1195606A1 (en) | 2000-10-03 | 2000-10-03 | Allergen-microarray assay |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20031219A3 true CZ20031219A3 (cs) | 2003-10-15 |
| CZ305183B6 CZ305183B6 (cs) | 2015-06-03 |
Family
ID=8175969
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2003-1219A CZ305183B6 (cs) | 2000-10-03 | 2001-10-03 | Způsob detekce imunoglobulinů založený na alergenovém čipu |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20050101031A1 (cs) |
| EP (2) | EP1195606A1 (cs) |
| CN (1) | CN1325919C (cs) |
| AT (1) | ATE286597T1 (cs) |
| AU (2) | AU1230602A (cs) |
| BR (1) | BRPI0114343B8 (cs) |
| CA (1) | CA2424661C (cs) |
| CZ (1) | CZ305183B6 (cs) |
| DE (1) | DE60108256T3 (cs) |
| DK (1) | DK1322960T4 (cs) |
| EE (1) | EE05465B1 (cs) |
| ES (1) | ES2234909T5 (cs) |
| HK (1) | HK1066276A1 (cs) |
| HU (1) | HU228066B1 (cs) |
| MX (1) | MXPA03002750A (cs) |
| PT (1) | PT1322960E (cs) |
| RU (1) | RU2276790C2 (cs) |
| SI (1) | SI1322960T2 (cs) |
| SK (1) | SK286541B6 (cs) |
| WO (1) | WO2002029415A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA200302172B (cs) |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030109067A1 (en) * | 2001-12-06 | 2003-06-12 | Immunetech, Inc. | Homogeneous immunoassays for multiple allergens |
| EP1338895A1 (en) * | 2002-02-21 | 2003-08-27 | Co-Wealth Medical Science & Biotechnology, Inc. | High density allergen microarray |
| DE50310049D1 (de) * | 2002-12-23 | 2008-08-07 | Febit Biotech Gmbh | Einbau von hapten-gruppen bei der herstellung von trägern für die analytbestimmung |
| EP1733234B1 (en) * | 2004-04-06 | 2011-09-14 | Mount Sinai School Of Medicine | Methods of determining allergen response using microarray immunoassay techinques |
| AU2006287336A1 (en) * | 2005-09-09 | 2007-03-15 | The University Of Chicago | Methods and compositions for diagnosis and immunotherapy of pollen allergy |
| US7761149B2 (en) * | 2007-03-28 | 2010-07-20 | The Institute Of Natural Health Technologies, Inc. | Electrical stimulus allergy treatment method |
| CA2702561A1 (en) * | 2007-10-07 | 2009-04-16 | Jordan Scott | Portable device for detecting food allergens |
| CA2707190C (en) * | 2007-11-30 | 2018-01-02 | Phadia Ab | Novel wheat allergens |
| KR101490377B1 (ko) * | 2008-05-08 | 2015-02-05 | 삼성전자주식회사 | 알레르기 질환 진단용 표면탄성파 센서 및 상기 센서를이용한 알레르기 질환 진단방법 |
| EP2382471A4 (en) * | 2009-01-29 | 2012-09-05 | Siemens Healthcare Diagnostics | MICROARRAYS FOR IGE SPECIFIC OF AN ALLERGEN |
| US20110243993A1 (en) * | 2010-03-29 | 2011-10-06 | Broo Kerstin S | Method for diagnosing and creating immunogenic tolerance in contact allergy and other epithelial immunotoxicological ailments |
| CN102478571A (zh) * | 2010-11-23 | 2012-05-30 | 南京神州英诺华医疗科技有限公司 | 一种新的过敏原体外诊断实验方法及其装置 |
| EP2694966A4 (en) * | 2011-03-20 | 2014-12-24 | Univ Colorado Regents | METHOD FOR PREDICTING THE GRAVITY OF AN ALLERGIC REACTION |
| GB2490652A (en) | 2011-04-18 | 2012-11-14 | Microtest Matrices Ltd | Methods of quantifying antibodies, especially IgE antibodies in a sample |
| WO2013039450A1 (en) | 2011-09-14 | 2013-03-21 | Phadia Ab | Calibration reagent and method |
| FR2987129B1 (fr) * | 2012-02-21 | 2014-03-14 | Commissariat Energie Atomique | Capteurs de nez ou de langue electronique |
| GB201223256D0 (en) * | 2012-12-21 | 2013-02-06 | Microtest Matrices Ltd | Immunoassay |
| CN103454412B (zh) * | 2013-09-16 | 2015-02-18 | 南京博敏达生物科技有限公司 | 一种用于过敏原特异性抗体检测的液相芯片及其制备方法 |
| CN103675271B (zh) * | 2013-12-23 | 2016-01-06 | 北京新华联协和药业有限责任公司 | 过敏性疾病变应原胶体金诊断试纸条及其制备方法 |
| CA2955348A1 (en) | 2014-07-21 | 2016-01-28 | Phadia Ab | Novel allergen |
| PE20171093A1 (es) | 2014-11-14 | 2017-08-07 | Biomerica Inc | Composiciones, dispositivos, y metodos de pruebas de sensibilidad del ibs |
| US10596065B2 (en) | 2014-12-09 | 2020-03-24 | Nader Soliman | Treatment of allergies and autoimmune diseases |
| AU2016321353A1 (en) * | 2015-09-09 | 2018-04-05 | Biomerica, Inc. | Compositions, devices, and methods of osteoarthritis sensitivity testing |
| PT3436823T (pt) | 2016-03-30 | 2021-04-22 | Macroarray Diagnostics Gmbh | Matriz antigénica |
| EP3468458A4 (en) * | 2016-06-13 | 2020-01-22 | Biomerica Inc. | COMPOSITIONS, DEVICES, AND METHODS FOR ASSESSING SUSCEPTIBILITY TO PATHOLOGIC GASTROESOPHAGIC REFLUX |
| EP3497447A4 (en) * | 2016-07-08 | 2020-01-22 | Biomerica Inc. | COMPOSITIONS, DEVICES, AND METHODS FOR ASSESSING SENSITIVITY TO LOW PRESSURE |
| CN108802399A (zh) * | 2017-04-28 | 2018-11-13 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 一种检测过敏原的新型蛋白质芯片 |
| BR102017027544A2 (pt) * | 2017-12-20 | 2021-11-09 | Fundação Universidade Estadual Do Ceará - Funece | Kit e processo para detecção de imunoglobulinas e e imunoglobulinas g1 |
| US11408895B1 (en) | 2018-04-09 | 2022-08-09 | Hob Biotech Group Corp., Ltd. | Allergen characterization, potent allergen product formulation, comprehensive allergen reagent, and allergy assay |
| JP7510620B2 (ja) | 2019-07-25 | 2024-07-04 | 東レ株式会社 | アレルゲン固定化担体の製造方法及びアレルゲン特異的抗体の検出方法 |
| WO2023287325A1 (ru) * | 2021-07-13 | 2023-01-19 | Дмитрий Евгеньевич ГЛУХОВ | Способ мультиспектрального зондирования для диагностики биологических объектов |
Family Cites Families (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US444879A (en) * | 1891-01-20 | Insulator | ||
| US3720760A (en) * | 1968-09-06 | 1973-03-13 | Pharmacia Ab | Method for determining the presence of reagin-immunoglobulins(reagin-ig)directed against certain allergens,in aqueous samples |
| US4444879A (en) * | 1981-01-29 | 1984-04-24 | Science Research Center, Inc. | Immunoassay with article having support film and immunological counterpart of analyte |
| NL8102178A (nl) * | 1981-05-02 | 1982-12-01 | Stichting Centraal Lab | Werkwijze voor het aantonen van tegen bepaalde antigenen gerichte antistoffen, alsmede inrichting en reagentia voor het uitvoeren van deze werkwijze. |
| US4629706A (en) * | 1982-02-01 | 1986-12-16 | Miles Laboratories, Inc. | Method for determining allergic sensitivity |
| US4845027B1 (en) * | 1982-10-13 | 1994-05-10 | Biowhittaker Inc | Fluorometric assay of allergic reactions |
| US4844966A (en) * | 1982-10-13 | 1989-07-04 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Assaying total IgE levels with fluorogenic enzyme labeled antibody |
| US4564600A (en) * | 1982-10-26 | 1986-01-14 | Majid Ali | Allergens and antibodies from allergen extracts and pooled serum |
| US4849337A (en) * | 1983-01-31 | 1989-07-18 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Assaying allergen specific IgE levels with fluorogenic enzyme labeled antibody |
| US4949338A (en) * | 1987-04-06 | 1990-08-14 | Racal Data Communications Inc. | Arbitration in multiprocessor communication node |
| US5807755A (en) * | 1987-08-06 | 1998-09-15 | Multilyte Limited | Determination of ambient concentrations of several analytes |
| US5075077A (en) * | 1988-08-02 | 1991-12-24 | Abbott Laboratories | Test card for performing assays |
| US6416952B1 (en) * | 1989-06-07 | 2002-07-09 | Affymetrix, Inc. | Photolithographic and other means for manufacturing arrays |
| US5512283A (en) * | 1990-07-06 | 1996-04-30 | Allergene, Inc. | Methods for the selective suppression of an immune response to dust mite der Pi |
| EP0556745A1 (en) * | 1992-02-21 | 1993-08-25 | Abbott Laboratories | Method for detection of anti-wheat-protein antibodies |
| US5480972A (en) * | 1992-10-30 | 1996-01-02 | The University Of Melbourne | Allergenic proteins from Johnson grass pollen |
| JP3507852B2 (ja) * | 1993-12-10 | 2004-03-15 | ジェネンテク，インコーポレイテッド | アレルギー診断法および抗アレルギー性治療剤のスクリーニング法 |
| US5945294A (en) * | 1996-11-26 | 1999-08-31 | Heska Corporation | Method to detect IgE |
| WO1999025826A1 (en) * | 1997-11-13 | 1999-05-27 | University Of Manitoba | Method and kit for determining severe inflammatory reactions to mosquito bites |
| US6406921B1 (en) * | 1998-07-14 | 2002-06-18 | Zyomyx, Incorporated | Protein arrays for high-throughput screening |
| EP1785726A1 (en) * | 1999-02-17 | 2007-05-16 | Carbozyme NT Ltd | Combinatioral complex carbohydrate libraries and methods for the manufacture and uses thereof |
| US20030166518A1 (en) * | 2000-01-13 | 2003-09-04 | Beardslee Thomas A. | Method for allergen characterization |
| US6531283B1 (en) * | 2000-06-20 | 2003-03-11 | Molecular Staging, Inc. | Protein expression profiling |
| CA2314398A1 (en) * | 2000-08-10 | 2002-02-10 | Edward Shipwash | Microarrays and microsystems for amino acid analysis and protein sequencing |
| US20020187464A1 (en) * | 2000-09-22 | 2002-12-12 | Klempner Mark S. | Microarray-based method for rapid identification of cells, microorganisms, or protein mixtures |
| US6528325B1 (en) * | 2000-10-13 | 2003-03-04 | Dexall Biomedical Labs, Inc. | Method for the visual detection of specific antibodies in human serum by the use of lateral flow assays |
-
2000
- 2000-10-03 EP EP00890296A patent/EP1195606A1/en not_active Withdrawn
-
2001
- 2001-10-03 WO PCT/EP2001/011429 patent/WO2002029415A1/en active IP Right Grant
- 2001-10-03 MX MXPA03002750A patent/MXPA03002750A/es active IP Right Grant
- 2001-10-03 EE EEP200300128A patent/EE05465B1/xx unknown
- 2001-10-03 US US10/398,266 patent/US20050101031A1/en not_active Abandoned
- 2001-10-03 AU AU1230602A patent/AU1230602A/xx active Pending
- 2001-10-03 AU AU2002212306A patent/AU2002212306B2/en not_active Expired
- 2001-10-03 EP EP01980473A patent/EP1322960B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-03 SI SI200130325T patent/SI1322960T2/sl unknown
- 2001-10-03 ES ES01980473T patent/ES2234909T5/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-03 DK DK01980473.1T patent/DK1322960T4/da active
- 2001-10-03 DE DE60108256.7T patent/DE60108256T3/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-03 CZ CZ2003-1219A patent/CZ305183B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-10-03 HU HU0303663A patent/HU228066B1/hu unknown
- 2001-10-03 CN CNB018167969A patent/CN1325919C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-03 BR BRPI0114343A patent/BRPI0114343B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-10-03 PT PT01980473T patent/PT1322960E/pt unknown
- 2001-10-03 RU RU2003112699/15A patent/RU2276790C2/ru active IP Right Revival
- 2001-10-03 CA CA2424661A patent/CA2424661C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-03 SK SK537-2003A patent/SK286541B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2001-10-03 AT AT01980473T patent/ATE286597T1/de active
-
2003
- 2003-03-18 ZA ZA200302172A patent/ZA200302172B/en unknown
-
2004
- 2004-11-16 HK HK04109024A patent/HK1066276A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-10-30 US US11/929,498 patent/US20080139406A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1322960B1 (en) | Allergen-microarray assay | |
| AU2002212306A1 (en) | Allergen-microarray assay | |
| US11740232B2 (en) | Antigen array | |
| US5270167A (en) | Methods of identification employing antibody profiles | |
| Harwanegg et al. | Protein microarrays for the diagnosis of allergic diseases: state-of-the-art and future development | |
| US20110065594A1 (en) | Identification of discriminant proteins through antibody profiling, methods and apparatus for identifying an individual | |
| JP2015007651A (ja) | 補体固定抗体の検出のための方法および組成物 | |
| Mari et al. | Microarrayed allergen molecules for the diagnosis of allergic diseases | |
| Feyzkhanova et al. | Development of hydrogel biochip for in vitro allergy diagnostics | |
| US20110065601A1 (en) | Identification of discriminant proteins through antibody profiling, methods and apparatus for identifying an individual | |
| EP2732288B1 (en) | Biological microchip for the estimation of immunoglobulin e and g levels in human blood, method of assay thereof, and reagent kit comprising same | |
| JP2003166994A (ja) | アレルゲン特異的ＩｇＥの分析方法 | |
| EP2936152B1 (en) | Immunoassay | |
| Hamilton et al. | Antigen quantification: Measurement of multivalent antigens by solid-phase immunoassay |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20211003 |