HU226975B1 - Methods for increasing the production of ethanol from microbial fermantation - Google Patents

Description

A találmány tárgyköre

A találmány etanol gázfázisú, legalább egy redukáló gázt tartalmazó szubsztrátból anaerob (vagy fakultatív anaerob) acetogén baktériumok felhasználásával mikrobiális fermentációs úton történő előállítási eljárásának javítására vonatkozik.

A találmány háttere

Etanol - más alkoholok, szerves savak, hidrogén és szerves savak sói mellett - mikrobiális fermentációval, gázfázisú szubsztrátból, alkalmas tápanyagokat és nyomelemeket tartalmazó tápközegben, bizonyos anaerob baktériumok segítségével történő előállítását a jelen találmány feltalálói már ismertették. így például leírták, hogy hígított gázkeveréket vezetnek egy bioreaktorba, amely egy vagy több olyan anaerob baktériumtörzset tartalmaz, amelyek hulladékgáz-komponenseket hasznosítanak a kívánt vegyület termelésére, közvetlen reakcióúton. A terméket a vizes fázisból nyerik ki egy vagy több másik edényben, a termelt vegyületnek megfelelő, alkalmas kinyerési módszerrel. Ilyen kinyerési módszerek például az extrakció, desztilláció vagy ezek kombinációja, vagy pedig más hatékony kinyerési módszerek. A baktériumok a vizes fázisból eltávolíthatók, és visszavezethetők a biorekatorba, a nagy sejtkoncentráció fenntartására, és így a termelékenység maximalizálására. A sejtek kívánt esetben történő elválasztását centrifugálással, membránszűréssel vagy más módszerrel lehet végezni [lásd például WO 98/00558, US-5 807 722, US-5 593 886 és US-5 821 111 számú dokumentumokat].

Az anaerob Clostridium ljungdahlii baktérium törzsei fő termékük, az ecetsav mellett etanolt is képesek termelni szén-monoxid (CO), hidrogén (H₂) és szén-dioxid (CO₂) konverziójával. Az ecetsav (CH₃COOH) és etanol (C₂H₅OH) termelését CO, CO₂ és H₂ keverékéből a következő általános sztöchiometriai egyenletek szemléltetik:

CO+2 H₂O >CH₃COOH+2 CO₂ (1)

H₂+2 CO₂ >CH₃COOH+2 H₂O (2)

CO+3 H₂O>C₂H₅OH+4 CO₂ (3)

H₂+2 CO₂ >C₂H₅OH+3 H₂O (4)

C. ljungdahlii törzsek például a PECT jelű (US-5 173 429), ERI2 jelű (US-5 593 886), valamint a C-01 és 0-52 jelű törzsek (US-6 136 577). Ezek a törzsek az American Type Culture Collection (10801 University Boulvard, Manassas, VA 20110-2209) intézetnél 55383 (korábban ATCC 49587), 55380, 55988 és 55989 számon vannak letétbe helyezve. A C. ljungdahlii törzsek anaerob, Gram-pozitív baktériumok, mintegy 22 mol% guanidin és citozin (G+C) nukleotidtartalommal. E baktériumok számos szubsztrátot hasznosítanak növekedésükhöz, de metanolt és laktátot nem. A törzsek CO-toleranciájuk, specifikus gázfelvételük aránya és fajlagos termelékenységük tekintetében eltérnek egymástól. A természetben található „vad” törzsek esetében nagyon csekély etanoltermelés figyelhető meg. A C. ljungdahlii törzsek ideálisan 37 °C-on működnek, és „vad” állapotban tipikusan 1:20 arányú etanol- és acetiltermelést (1 rész etanol 20 rész acetilrészre vonatkoztatva) mutatnak (ahol az „acetil” kifejezésen szabad vagy molekuláris ecetsavat és acetátsókat értünk). Az etanolkoncentráció tipikusan csupán 1-2 g/l. Ez az etanoltermelő képesség fontos ugyan, de a „vad” baktériumok segítségével - alacsony termelékenységük miatt - nem lehet etanolt gazdaságosan előállítani.

A tápanyagok kisebb manipulálásával az említett C. ljungdahlii törzseket alkalmazzák etanol és acetil 1:1 arányú (azaz etanol és acetil azonos mennyiségű) előállítására, azonban az etanolkoncentráció 10 g/l-nél alacsonyabb, ami alacsony, napi 10 g/l termelékenységet eredményez. Emellett a tenyészet stabilitása olyan tényező, amely elsődlegesen a viszonylag magas (8-10 g/l) acetilkoncentráció (2,5-3 g/l molekuláris ecetsav) és az etanol jelenléte kombinációjának a következménye. Ezenkívül, ahogyan a gázadagolás sebességét az etanoltermelés fokozása érdekében növelik, a tenyészet gátlódik, elsősorban a molekuláris ecetsav, másrészt a CO hatására. Következésképpen a tenyészet instabillá válik, nem veszi fel a gázt, és nem termel további terméket. Ezenkívül a jelen találmány feltalálói egy korábbi munkában kimutatták, hogy nehézségekbe ütközik az etanol és acetil 2:1 -nél nagyobb arányban, folyamatos üzemmódban történő előállítása [lásd például: Kiásson et al., Applied Biochemistry and Biotechnology, Proceedings of the 11^th Symposium on Biotechnology fór Fuels and Chemicals, 24/25:857 (1990); Philips et al., Applied Biochemistry and Biotechnology, Proceedings of the 14^th Symposium on Biotechnology fór Fuels and Chemicals, 39/40:559 (1993)].

Számos dokumentum ismerteti olyan anaerob, C. Ijungdahlii-töl eltérő baktériumok alkalmazását oldószerek termelésére cukrok fermentációjával, amelyek nem hasznosítanak CO-, CO₂- és H₂-gázokat. Az etanol nagy mennyiségben való termelésére tett egyik kísérletben különböző paramétereket változtattak, így a tápanyagok típusát, a mikroorganizmusokat, redukálószerek megadott adagolását, pH-t és exogén gázok adagolását [lásd például: Rothstein ef al., J. Bacteriol., 165(1):319-320 (1986); Lovitt et al., J. Bacteriol., 170(6):2809 (1988); Taherzadeh et al., Appl. Microbiol. Biotechnoi., 46:176 (1996)].

Továbbra is szükség van azonban gázfázisú ipari szubsztrátok feldolgozására annak érdekében, hogy értékes anyagokat nyerjünk az ilyen gázokból, különösen hulladék gázokból, például H₂-, CO- és CO₂-tartalmú gázokból. Szükség van továbbá az etanol termelésének a fokozására a többi termékhez viszonyítva, amelyek az ilyen gázok acetogén baktériumokkal történő fermentációja során képződnek.

A találmány összefoglalása

A fenti szükségletek kielégítésére új, folyamatos, stacioner módszereket dolgoztunk ki, amelyek 10 g/l-nél nagyobb etanolkoncentrációt és 8-10 g/l-nél kisebb acetilkoncentrációt eredményeznek, miközben fenntartjuk a tenyészet növekedését és a tenyészet jó stabilitását.

HU 226 975 Β1

A jelen találmányt az Amerikai Egyesült Államok kormányának Energiaügyi Osztálya által DE-FC04-94AL98770, 85X-TA046V és 85X-SX613V számon, valamint a Mezőgazdasági Osztály által 96-AARC-1-0077 számon nyújtott kormánytámogatása segítségével dolgoztuk ki. Az Amerikai Egyesült Államok kormánya bizonyos jogokkal rendelkezik a jelen találmánnyal kapcsolatosan.

A találmány tárgya tehát egyrészt folyamatos eljárás etanol termelésére gázfázisú, szén-monoxidot tartalmazó szubsztrát anaerob bakteriális fermentációjával, amelynek során fermentáló bioreaktorban, kalcium-pantotenátot tartalmazó folyékony tápközegben, 5,5-nél alacsonyabb pH-nál etanolt termelni képes Clostridium ljungdahlii baktériumot tenyésztünk, a fermentáló bioreaktorban a szabad ecetsavkoncentráció 5 g/l-nél alacsonyabb, és a bioreaktorban levő fermentlében az etanol és acetát aránya 1:1-20:1. Atalálmány értelmében a fermentáló bioreaktorba kalcium-pantotenátot adagolunk, a bioreaktorban termelődött baktérium száraz sejttömegére vonatkoztatva 0,5-50 pg/g mennyiségben, a bioreaktorban a fajlagos szén-monoxid-felvételt a baktérium száraz sejttömegére vonatkoztatva percenként legalább 0,3 mmol/g értéken tartjuk, és az etanolt 10 g/l/nap értéknél nagyobb termelékenységgel termeljük.

A találmány szerinti megoldás egy megvalósítási módja értelmében a manipulációs lépésben a következők közül egy vagy több, de legalább egy paramétert változtatunk meg: a tápközeg összetétele, tápanyagadagolás sebessége, vízadagolás sebessége, nyomás, pH, gázfázisú szubsztrát mennyisége, gázadagolás sebessége, a fermentlé keverésének a sebessége, termékgátlás lépése, sejtsűrűség és szubsztrátgátlás.

A találmány szerinti megoldás egy másik megvalósítási módja értelmében a manipulációs lépésben a bioreaktorba redukáló gázt - CO-ot - tartalmazó gázfázisú szubsztrátot vezetünk, a felvételnek megfelelő kívánt sebességgel. Ez a sebesség kívánatosán a bioreaktorban levő baktériumsejtek szárazanyag-tartalmának grammjaira vonatkoztatva percenként 0,3-2 mmol CO.

A találmány szerinti megoldás egy további megvalósítási módja értelmében a manipulációs lépésben a fermentáló bioreaktorba olyan tápközeget adagolunk, amely a kalcium-pantotenát limitáló mennyiségét tartalmazza. A kalcium-pantotenát mennyisége a bioreaktorban termelt baktériumsejtek szárazanyag-tartalmára vonatkoztatva kívánatosán 0,5-50 pg/g.

A találmány szerinti megoldás egy még további megvalósítási módja értelmében fölösleges mennyiségű H₂ redukáló gázt vezetünk a bioreaktorba, mielőtt a kalcium-pantotenát limitáló mennyiségét adagolnánk.

A találmány szerinti megoldás egy még további megvalósítási módja értelmében a manipulációs lépésben a fermentáló bioreaktorba olyan tápközeget vezetünk, amely a kobalt limitáló mennyiségét tartalmazza. A kobalt mennyisége a bioreaktorban termelt baktériumsejtek szárazanyag-tartalmára vonatkoztatva kívánatosán 5-100 pg/g.

A találmány szerinti megoldás egy még további megvalósítási módja értelmében megakadályozzuk, hogy a baktériumok a bioreaktorban hozzászokjanak a kobalt említett mennyiségéhez, oly módon, hogy konstans kobaltkoncentrációt tartunk fenn, és egy vagy több paramétert, így a gázadagolás sebességét, a folyadékadagolás sebességét, a keverés sebességét és a H₂gáz parciális nyomását állítjuk be.

A módszer további adott esetben végzett lépésében a fermentléből vett mintából centrifugálással eltávolítjuk a sejteket, és gázkromatográfiás úton ellenőrizzük a sebesség- és/vagy termelékenységi értékek fenntartását.

A találmány szerinti megoldás egy még további megvalósítási módja értelmében a gázfázisú szubsztrátban a H₂ olyan mennyiségét adagoljuk, amely enyhén meghaladja az etanol termeléséhez szükséges sztöchiometrikus mennyiséget.

A találmány szerinti megoldás egy még további megvalósítási módja értelmében a gázfázisú szubsztrát a CO olyan mennyiségét tartalmazza, amely enyhén meghaladja a baktériumok által megkívánt mennyiséget, így a baktériumok H₂-felvétele gátlódik, és a fermentlében a NAD(P)H:NAD(P) arány emelkedik.

A találmány szerinti megoldás egy még további megvalósítási módja értelmében az eljárás magában foglal egy olyan lépést, amelynek során csökkentjük a molekuláris ecetsav által kifejtett gátlást a vizes fázis adagolási sebességének növelésével, amikor a fermentlében jelen levő molekuláris ecetsav mennyisége eléri vagy meghaladja a 2 g/l értéket.

A találmány szerinti megoldás egy még további megvalósítási módja értelmében a manipulációs lépésben a bioreaktorban levő tápközeget, a baktériumokat és a gázfázisú szubsztrátot megválasztott sebességgel keverhetjük. így például a keverési sebesség csökkentésével csökken a fermentlébe jutó CO mennyisége. A CO-adagolás ilyen csökkentése a H₂-konverzió fokozódását eredményezi, hogy a redukáló gáz, H₂ a bioreaktorban a baktériumok növekedéséhez szükséges mennyiséget meghaladja. A CO-adagolás csökkentésére hasonlóképpen csökkenthető a gázadagolás sebessége, ami a H₂-konverzió fokozódását eredményezi, hogy a redukáló gáz, H₂ a bioreaktorban a baktériumok növekedéséhez szükséges mennyiséget meghaladja.

A találmány szerinti megoldás egy még további megvalósítási módja értelmében a baktériumtenyészet sejtkoncentrációját a bioreaktorban kívánt értékre beállítjuk, mielőtt a tápközegben limitálnánk a kalcium-pantotenát vagy a kobalt koncentrációját.

A találmány szerinti megoldás egy még további megvalósítási módja értelmében kétfokozatú CSTR-t (bioreaktort) alkalmazunk, amely növesztőreaktorból és termelőreaktorból áll, a növesztőreaktorból juttatjuk a fermentlét a termelőreaktorba, amelyben az etanol fő tömege képződik.

A találmány szerinti megoldás egy még további megvalósítási módja értelmében adott esetben a következő lépéseket végezzük: kinyerjük az etanolt, a fer3

HU 226 975 Β1 mentiének a bioreaktorból történő elvételével; a fermentléből ledesztilláljuk az etanolt; és kinyerjük az etanolt. Ezenkívül előnyösen a fermentléből vett mintából centrifugálással eltávolítjuk a sejteket, és gázkromatográfiás úton ellenőrizzük az arányok fenntartását.

A találmány szerinti megoldás egy még további megvalósítási módja értelmében az etanol termelése során nyert vizet (amely 5 g/l-ig terjedő mennyiségű acetilt tartalmaz) visszavezetjük a reaktorba, hogy egyensúly legyen a reaktorban az etanol és az acetil között. Ennek eredményeképpen a reaktorba adagolt és termékké alakított CO, CO₂ és H₂ nagyobb mennyisége fordítódik etanoltermelésre.

A találmány szerinti megoldás további megvalósítási módjait és előnyeit az alábbiakban részletesen ismertetjük.

A rajzok rövid ismertetése

Az 1. ábra a találmány szerinti folyamatos, a termék kinyerését magában foglaló fermentációs módszer folyamatábrája. Az

I gázfázisú szubsztrátot és a 2 folyékony fázisú tápközeget a 3 bioreaktorba vezetjük, amely az alkalmazott baktériumok tenyészetét tartalmazza. A gázfázisú szubsztrát etanollá és ecetsavvá történő konverziója a 3 bioreaktorban történik. A 3 bioreaktorból eltávozó 4 kilépő gázt, amely CO-tól, CO₂-tól és H₂-től eltérő gázokat, valamint nem konvertált CO-ot, CO₂-ot és H₂-t tartalmaz, lefúvatjuk és fűtőanyagként vagy egyéb módon elégetjük. A sejtek visszavezetéséhez az 5 effluenst a 6 sejtleválasztó egységbe juttatjuk, ahol a 7 sejteket és a sejtmentes 8 permeátumot elválasztjuk. A 7 sejteket visszavezetjük a 3 bioreaktorba, és a 8 permeátumot elvezetjük a termék kinyeréséhez. Az etanolt a 8 permeátumból nyerjük ki (vagy más módon az 5 effluensből, ha nem alkalmazunk sejtleválasztó egységet). A 8 permeátumot a desztillálóoszlopban szeparáljuk, ahol 95%-os etanol 10 fejterméket, valamint

II vizet kapunk, amely utóbbit visszavezetjük a 3 bioreaktorba. A 95%-os etanol fejterméket egy 12 molekulaszűrőre vezetjük, ahol a kívánt terméket, 13 vízmentes etanolt elválasztjuk a 14 híg etanoltól, amelyet visszavezetünk a 9 desztillálóoszlopra.

A 2. ábra egy kétfokozatú, folyamatosan kevert reaktor (CSTR) rendszer folyamatábrája, javított tenyészetstabilitáshoz. A növesztés! fázisú 1 CSTR-be 2 folyékony tápközeget vezetünk. A termelési fázisú 4 CSTR-ből a 3 nem konvertált gázt a növesztés! fázisú 1 CSTR-be vezetjük. A termelési fázisú 4 CSTR-t friss 5 gázbetáplálással és friss 6 tápközeggel, valamint a növesztés! fázisú 1 CSTR-ből elvezetett 7 sejttenyészettel tápláljuk. A 8 sejtvisszavezető egységet azért alkalmazzuk, hogy a legtöbb terméket tudjuk elválasztani a 9 sejtektől, amelyeket a termelőfázisú 4 CSTR-be visszavezetünk. A 10 folyékony terméket, amely a híg etanolt tartalmazó fermentumból áll, az 1. ábrán bemutatott módon vízmentes etanollá dolgozzuk fel.

A találmány részletes ismertetése

A találmány tárgya tehát eljárás olyan gázfázisú szubsztrátok anaerob fermentációjára etanol termelése céljából, amelyek legalább egy redukáló gázt, különösen ipari hulladék és szintézisgázokat (például CO-ot, CO₂-ot és H₂-t) tartalmaznak. A módszerrel - az alkalmazott baktériumok biológiai útvonalainak manipulálásával - az etanolt napi 10 g/l-nél nagyobb termelékenységgel lehet előállítani. A találmány szerinti megoldás egyik módszerével a NAD(P)H fölöslegbe kerül a NAD(P)-hez viszonyítva. A NAD(P)H oxidálása NAD(P)-vé azt eredményezi, hogy a tenyészet által termelt ecetsav etanollá redukálódik. Etanol nagy koncentrációban anaerob fermentációval történő előállítása érdekében eljárhatunk úgy is, hogy csökkentjük a fermentlé redoxpotenciálját, és így az ecetsavat etanollá redukáljuk. A találmány szerinti módszerekkel etanolt nagy koncentrációban (azaz mintegy 10 g/l-nél nagyobb, előnyösen 15 g/l-nél nagyobb koncentrációban) és az ecetsavat/acetátot kis koncentrációban (azaz mintegy 5 g/l-nél kisebb koncentráció a szabad ecetsavra nézve a bioreaktorban) állítunk elő. Ezekkel a módszerekkel fenntartjuk és szabályozzuk az etanol és ecetsav folyamatos termelésének körülményeit is, hogy elősegítsük a rendszer gyors helyreállítását az esetleges működési zavarokból. Ezenkívül a találmány szerinti módszerekkel megelőzhető, hogy a tenyészet akklimatizálódjon az alacsony tápanyag-koncentrációhoz, ami káros lehet a tenyészet termelőképességére nézve. A találmány tehát hasznos ipari megoldást biztosít etanol előállítására.

I. Definíciók

Hacsak másképpen nem jelezzük, a leírásunkban alkalmazott kifejezések jelentése a következő.

A „folyamatos eljárás” kifejezésen olyan fermentációs módszert értünk, amely magában foglalja a tápanyagok és szubsztrát folyamatos betáplálását a bioreaktorba, a sejtek folyamatos termelődését a bioreaktorban, valamint a sejtek és a termék folyamatos elvételét (vagy kiürítését) a bioreaktorból. Ez a folyamatos betáplálás, eltávolítás és sejttermelés történhet azonos vagy különböző áramokban. Egy folyamatos eljárás azt eredményezi, hogy stacioner állapotot érünk el a bioreaktoron belül. A „stacioner állapot” kifejezésen azt értjük, hogy a mérhető változók mindegyike (azaz a betáplálás sebessége, a szubsztrát és a tápanyagok bioreaktorban fenntartott koncentrációja, a sejtkoncentráció a bioreaktorban és a sejtek elvétele a bioreaktorból,

HU 226 975 Β1 a termék elvétele a bioreaktorból, valamint a szokásos változók, például a hőmérséklet és nyomás) állandó, azaz az idő változásával nem változnak.

A „gázfázisú szubsztrát” kifejezésen önmagában CO-ot, CO és H₂ keverékét, CO₂ és H₂ keverékét, valamint CO, CO₂ és H₂ keverékét értjük, adott esetben más elemekkel vagy vegyületekkel, például nitrogénnel és metánnal keverve, gáz formájában. Az ilyen gázfázisú szubsztrát lehet olyan gáz vagy gázáram, amelyet tipikusan közvetlenül vagy égetéssel kijuttatnak vagy kiszellőztetnek a légtérbe. A találmány szerinti megoldás egyes megvalósítási módjai esetén a gázfázisú szubsztrát CO-ot tartalmaz. Más megvalósítási módok esetén a gázfázisú szubsztrát CO₂-ot és H₂-t tartalmaz. Még további megvalósítási módok esetén a gázfázisú szubsztrát CO-ot és H₂-t tartalmaz. Egy különösen előnyös megvalósítási mód esetén a gázfázisú szubsztrát CO-ot, CO₂-ot és H₂-t tartalmaz. A találmány szerinti megoldásban alkalmazhatók olyan szubsztrátok is, amelyek a fent említett komponenseken kívül nitrogén, szén-monoxid, etán és metán közül legalább egy gázt tartalmaznak. Az ilyen szubsztrát tehát lehet a szokásosan „szingáz” vagy szintézisgáz néven említett, széntermékek (például metán) elgázosításából származó gáz, valamint különböző ipari módszerekből származó hulladék gázok.

A „redukáló gáz” kifejezésen CO-ot vagy H₂-t, vagy pedig mindkettőt értjük. A „baktériumok növekedéséhez szükségesnél nagyobb mennyiségű redukáló gáz” kifejezésen azt értjük, hogy a redukáló gáz mennyisége meghaladja azt a mennyiséget, amennyit a baktériumok a tápközeg adott összetétele esetén növekedésükhöz vagy metabolizmusukhoz fel tudnak használni. Ez a nagyobb mennyiség elérhető úgy, hogy növeljük a redukáló gáz nettó mennyiségét, vagy pedig csökkentjük a tápanyagkomponenseket, hogy a gáz fölöslegét mennyiségének növelése nélkül érjük el, vagy pedig növeljük a gáz betáplálásának sebességét. Ha a baktériumok több redukáló gáznak vannak kitéve, mint amennyi növekedésükhöz szükséges, etanol termelésének fokozásával válaszolnak.

Az „alkalmazott baktériumok” kifejezésen acetogén anaerob (vagy fakultatív anaerob) baktériumokat értünk, amelyek képesek a CO-ot és vizet, vagy pedig H₂-t és CO₂-ot etanollá és ecetsavvá alakítani. A találmány szerinti megoldásban alkalmazható baktériumok például - de nem kizárólag - Acetogenium kivui, Acetobacterium woodii, Acetoanaerobium noterae, Clostridium aceticum, Butyríbacteríum methylotrophicum, C. acetobutylicum, C. thermoaceticum, Eubacterium limosum, C. Ijungdahlii PECT, C. Ijungdahlii ERI2, C. Ijungdahlii C-01, C. Ijungdahlii 0-52 és Peptostreptococcus productus. Más acetogén baktériumok szintén alkalmazhatók a találmány szerinti megoldásban.

A „törzskeverék” kifejezésen két vagy több alkalmazott baktérium tenyészetének keverékét értjük. A fent felsorolt baktériumok ilyen „törzskeverékét” alkalmazzuk a találmány szerinti módszerekben.

A „bioreaktor”, „reaktor” és „fermentációs bioreaktor” kifejezéseken olyan fermentálóegységet értünk, amely egy vagy több edényből és/vagy toronyból vagy csőelrendezésből áll, ilyen a folyamatosan kevert tankreaktor (CSTR), immobilizált sejtreaktor (ICR), szivárgóágyas reaktor (TBR), buborékoszlop, gázliftes fermentor, sztatikus keverő vagy más, gáz/folyadék érintkeztetésre alkalmas berendezés. A találmány szerinti megoldás esetén a fermentációs bioreaktor előnyösen magában foglal egy növesztőreaktort, amelyből a fermentlét egy második fermentációs bioreaktorba tápláljuk, amelyben a termék, az etanol legnagyobb része képződik.

A „tápközeg” kifejezést általában a szokásos baktériumnövesztő tápközegek leírására alkalmazzuk, amelyek az adott, alkalmazott baktériumok növekedéséhez elegendő vitaminokat és ásványi anyagokat tartalmaznak. Ezek a tápközegek cukrot nem tartalmaznak. A találmány szerinti megoldásban alkalmazható különböző tápközegek komponensei ismertek, például a jelen találmány feltalálói által korábban publikált közleményekből (lásd például a WO 98/00558; US-5 807 722; US-5 593 886; US-5 821 111 számú iratokat és az ezekben idézett publikációkat). A találmány szerinti megoldás értelmében egy tipikus, CO, CO₂ és H₂ keverékéből acetát termelésére szolgáló laboratóriumi tápközeg 0,9 mg/l kalcium-pantotenátot tartalmaz. Egy tipikus, CO, CO₂ és H₂ keverékéből etanol termelésére szolgáló laboratóriumi tápközeg viszont 0,02 mg/l kalcium-pantotenátot tartalmaz.

A „limitáló szubsztrát” és „limitáló tápanyag” kifejezésen olyan anyagot értünk a tápközegben vagy a gázfázisú szubsztrátban, amelyet a baktériumtenyészet növekedése során a bioreaktorban olyan mértékben elfogyaszt, ami már nem biztosítja a stacioner állapotot vagy a stabil baktériumnövekedést a bioreaktorban. A tápközegben vagy a gázfázisú szubsztrátban ezáltal az összes többi anyag fölöslegben, „nem limitáló” mennyiségben lesz jelen. A limitálás bizonyítéka, hogy a limitáló szubsztrát tenyészethez való adagolási sebességének fokozása, azaz a tápanyag-betáplálás sebességének fokozása vagy a gázbevezetés sebességének fokozása a gázfelvétel sebességének (gáz mmol/perc) megfelelő emelkedését eredményezi, ami a sejtsűrűség emelkedésének a következménye.

Hacsak másképpen nem jelezzük, az „acetát kifejezésen a fermentlében jelen levő molekuláris vagy szabad ecetsav és acetátsók keverékét értjük. A molekuláris ecetsav és az acetátsók aránya a rendszer pH-jától függ, azaz konstans „acetát”-koncentráció esetén minél alacsonyabb a pH, annál nagyobb a molekuláris ecetsav koncentrációja az acetátsókhoz képest.

A „sejtkoncentráció” kifejezésen baktériumok szárazanyag-tartalmának tömegét értjük a minta 1 literére számítva. A sejtkoncentrációt mérhetjük közvetlenül, vagy pedig az optikai sűrűségnek megfelelő kalibrációval.

A „természetes állapot” kifejezésen a vegyületek, elemek vagy biológiai útvonalak olyan állapotát értjük, amikor ezek a normálisan jelen levőkhöz képest nem tartalmaznak további elektronokat vagy protonokat.

HU 226 975 Β1

Fordítva, a „redukált állapot” kifejezésen a vegyületek, elemek vagy biológiai útvonalak olyan állapotát értjük, amikor ezek a normálisan jelen levőkhöz képest további egy vagy több elektront tartalmaznak. A redukált állapotot úgy érjük el, hogy egy vagy több elektront adunk a „természetes állapot-hoz, azaz csökkentjük a fermentlé redoxpotenciálját.

A „termelékenység etanolra nézve” kifejezésen az etanol termelésének térfogat szerinti hatékonyságát értjük, amelyet a stacioner állapot etanolkoncentrációja és folyamatos rendszerek folyadék retenciós ideje (LRT) arányaként, vagy pedig az etanol koncentrációja és a szakaszos üzemmódban e koncentráció eléréséhez szükséges idő arányaként számolunk. A „nagy termelékenység etanolra nézve” kifejezésen napi 10 g/l-nél nagyobb termelékenységet értünk.

A „nagy etanolkoncentráció” kifejezésen a fermentlében mintegy 10 g/l-nél nagyobb, előnyösen 15 g/l-nél nagyobb koncentrációt, vagy 5:1 vagy ennél nagyobb etanol/acetát termékarányt értünk.

A „H₂-fölösleg” vagy „fölös H₂” kifejezés az etanoltermelés esetén azt jelenti, hogy a betáplált gázban a H₂ móljai, valamint az átalakított CO móljai kétszerese és az átalakított CO₂ móljai háromszorosa összegének az aránya 1,0 értéknél nagyobb. Ha ez az arányszám 1,0 értéknél kisebb, nincs H₂-fölösleg, és az etanol csak más szabályozómechanizmuson keresztül termelődik.

//. A találmány szerinti megoldásban hasznosított biológiai útvonalak

Anélkül, hogy bármely elmélethez ragaszkodnánk, feltételezzük, hogy az etanol anaerob termelésének fokozására szolgáló ismertetett eljárások azon biológiai útvonalakon alapszanak, amelyek magukban foglalják a NAD(P)H->NAD(P) átalakítást az autotróf növekedéshez szolgáló acetogén útvonal alap-útvonalciklusaiban. A találmány szerinti módszerben manipuláljuk ezeket az útvonalakat, hogy lehetővé tegyük a folyamatos termelést, és magas etanolkoncentrációt alakítsunk ki alacsony acetátkoncentráció mellett, stabil működési körülmények között, és ezzel kereskedelmileg hasznosítható módszereket biztosítsunk etanol termelésére ipari gázokból.

A NAD(P)H->NAD(P) átalakítás biológiai útvonalakban való alapvető részesedése a következő. Az etanol gáznemű komponensekből, így CO, CO₂ és H₂ keverékéből való termelése egy háromlépéses folyamatban történik. Az első lépésben a CO- és H₂-szubsztrátok oxidálódnak, amelynek során NAD(P)H szabadul fel:

NAD(P) >NAD(P)H CO+H₂+H₂O >CO₂+4H⁺

Az első lépés termékei azután ecetsavvá alakulnak egy olyan lépésben, amely NAD(P)H-t igényel:

NAD(P)H >NAD(P)

CO+CO₂+6H⁺ >CH₃COOH+H₂O

Végül, ha a NAD(P)H fölöslegben van jelen, mivel az első lépés reakciója gyorsabban megy végbe, mint a 2. lépés reakciója, az ecetsav etanollá redukálódik:

NAD(P)H >NAD(P)

CH₃COOH+4H⁺ >C₂H₅OH+H₂O így a szubsztrát oxidációjából származó NAD(P)H fölöslegének hozzáférhetősége etanol ecetsavból való képződéséhez vezet.

Két alapvető útvonalciklus ismeretes az acetogén útvonalban: (1) az acetil-CoA-ciklus és (2) a THF-ciklus, amelyben a CO₂ metilcsoporttá redukálódik. Az etanol és abból az ecetsav képződésének reakciósorát a következő szakirodalmi helyen ismertetik: L. R. Phillips et al., Applied Biochemistry and Biotechnology, 45/46:145 (1994). Az acetil-CoA-ciklusnak van egy belső ciklusa, amelyet a továbbiakban CO-ciklusnak nevezünk. Ahogyan a CO-ciklus normálisan óramutató járásával egyezően megy végbe, ferredoxin redukálódik. A ferredoxin H₂-nel is redukálódhat, ahogyan hidrogenáz enzimen oxidálódik. Ennek eredményeképpen az acetil-CoA-ciklus szintén óramutató járásával megegyezően megy végbe, és ferredoxin oxidálódik. Ha a belső CO-ciklus és az acetil-CoA-ciklus azonos sebességgel megy végbe, a ferredoxin egyensúlyi redox állapotban van. Ha azonban e két ciklus nem azonos sebességben fut le, azaz a CO-ciklus gyorsabban megy végbe, mint az acetil-CoA-ciklus, redukált ferredoxin halmozódik fel. Fölösleges H₂-nel szintén ferredoxin termelhető fölöslegben. Ez a fölöslegben levő ferredoxin eredményezi, hogy a NAD(P) regenerálódik (redukálódik) NAD(P)H-vá, ami fölösleget képez, amelyet az egyensúly elérése érdekében el kell szállítani, és ennek során az ecetsav etanollá redukálódik.

A THF-ciklus a sejtnövekedés érdekében működik, és a folyamatos sejtnövekedéshez van rá szükség, ezért nem állítható le teljesen. A THF-ciklus sebességének csökkentése szintén a NAD(P)H >NAD(P) átalakulás nagyobb arányának kialakítására szolgál. A NAD(P)H két helyen oxidálódik. Ezen oxidáció korlátozásával, amely egyensúlyban tartaná a teljes celluláris NAD(P)H->NAD(P) átalakulási arányt, a NAD(P)H-t az ecetsav etanollá való redukálására használjuk.

Az ecetsav etanollá való redukálásának másik alapvető módszere a fermentlé redoxpotenciáljának közvetlen csökkentése. Egy olyan redukciós állapot, amely kellő mértékben alacsonyabb, mint a tenyészet természetes állapota, azt okozza, hogy a NAD(P)H fölöslegben van, és elősegíti az ecetsav etanollá történő redukálását.

///. A találmány szerinti módszerek

A módszer alapvető lépései a következők: folyamatos fermentációs eljárás termékkinyeréssel, amelyet az

1. ábrán és az 1. példában mutatunk be. Egy, alkalmazott baktériumok tenyészetét tartalmazó 3 fermentációs bioreaktorba megválasztott betáplálási sebességgel 1 gázfázisú szubsztrát folyamatos áramát, amely legalább egy redukáló gázt, például CO-ot vagy H₂-t tartalmaz, valamint megválasztott betáplálási sebességgel folyékony fázisú 2 tápközeg folyamatos áramát tápláljuk. A 3 bioreaktorban a tápközeget és a gázfázisú szubsztrátot baktériumokkal fermentáljuk, így etanolt és ecetsavat kapunk. Ha stacioner körülmények között stabil sejtkoncentrációt értünk el, a folyamatos rendszer komponenseit úgy manipuláljuk, hogy csökkenjen a redoxpo6

HU 226 975 Β1 tendál, vagy emelkedjék a NAD(P)H->NAD(P) átalakulás aránya a fermentlében, miközben a bioreaktorban a szabad ecetsav koncentrációját 5 g/l érték alatt tartjuk. A találmány szerinti módszereket úgy terveztük, hogy lehetővé tegyék és fenntartsák az etanol és acetát termelését a fermentlében úgy, hogy a termelékenység etanolra nézve - 1:1 és 1:20 etanol/acetát arány mellett 10 g/l-nap értéknél nagyobb legyen. A találmány szerinti megoldás egy megvalósítási módja esetén az arány nagyobb, mint 3:1. A találmány szerinti megoldás egy másik megvalósítási módja esetén az arány nagyobb, mint 5:1. A találmány szerinti megoldás egy további megvalósítási módja esetén az arány nagyobb, mint 10:1. A találmány szerinti megoldás egy még további megvalósítási módja esetén az arány nagyobb, mint 15:1. A találmány szerinti módszer ezenkívül elősegíti, hogy CO, CO₂ és H₂ elegyéből etanolt nagy koncentrációban (15-35 g/l etanol) alacsony acetátkoncentráció mellett (0-5 g/l) stabilan, folyamatosan (azaz stacioner módon) állítsunk elő, azaz az etanol és az acetát termékek aránya stabil módon 3:1 vagy ennél nagyobb legyen.

A találmány szerinti eljárás során valamely szokásos módszerrel periodikusan mintát veszünk a fermentléből az arányok meghatározására. így például a sejteket elválasztjuk a mintából, például centrifugálással, és a sejtmentes mintát vetjük alá elemzésnek, például gázkromatográfiának. Szakember azonban más szokásos elemző módszert is választhat. Ezenkívül adott esetben további lépések végezhetők az arány elérésére és/vagy fenntartására. A 2. példában ilyen elemző módszert mutatunk be.

A rendszer komponenseinek manipulálása és a kívánt etanoltermelés vagy etanol/acetát arány fenntartása és/vagy elérése érdekében legalább egy, de kívánt esetben több következő lépést teszünk: megváltoztatjuk a tápközeg összetételét, a tápközeg betáplálásának a sebességét, a vizes közeg betáplálásának a sebességét, a nyomást, pH-t, a gázfázisú szubsztrát összetételét, a gáz betáplálási sebességét, a fermentlé keverési sebességét, kiküszöböljük a termékgátlást, csökkentjük a sejtsűrűséget a bioreaktorban, megelőzzük a szubsztrátgátlást. Előnyös manipulációk például: a bioreaktort folyékony fázisú, limitáló tápanyaggal (pantotenát vagy kobalt) látjuk el, a betáplált gázban kis fölöslegben alkalmazzuk a CO-ot és H₂-t, minimalizáljuk az acetátkoncentrációt, megakadályozzuk, hogy a tenyészet akklimatizálódjon a folyékony fázisú tápanyagok alacsony koncentrációjához, a tenyészetet viszonylag gyorsan egy alkalmas sejtkoncentrációra állítjuk be, a tenyészet pH-ját 4,5 érték fölé emeljük, a bioreaktorból baktériumsejteket távolítunk el olyan sejtkoncentrációig, amely alacsonyabb, mint a stacioner állapotnak megfelelő, amikor az összes redukáló gáz vagy tápanyag hasznosul a bioreaktorban, és emeljük a vizes fázis betáplálási sebességét, amikor a fermentációs bioreaktorban levő fermentlében jelen levő acetát szabad ecetsavrészaránya meghaladja a 2 g/l értéket, ezzel a szabad ecetsav koncentrációjának bármilyen nemkívánatos emelkedését meggátoljuk. Ezeket a lépéseket részletesen ismertetjük a későbbiekben.

A 4 kilépő gázt - amely a CO, CO₂ és H₂ keveréktől eltérő gázokat, valamint a reaktorból származó nem konvertált CO, CO₂ és H₂ keveréket tartalmaz - lefúvatjuk a reaktorból, és fűtőértékét hasznosítjuk. Ha szabályozómechanizmusként H₂-fölösleget használunk, akkor a kilépő gázban a H₂ parciális nyomását, valamint a kilépő gázban a H₂ parciális nyomásának és a CO₂ parciális nyomásának arányát alkalmazzuk az ezen lépésben termelt etanol és acetát arányának meghatározására és szabályozására. A sejtek visszacirkuláltatását alkalmazzuk (de nem szükségszerűen) a sejtkoncentráció növelésére a bioreaktorban, és ezzel több biokatalizátort biztosítunk a CO, CO₂ és H₂ konverziójához. A sejtek cirkuláltatásával a reaktorból elfolyó 5 effluenst a 6 sejtszeparátorba juttatjuk, ahol elválasztjuk a 7 sejteket és a 8 (sejtmentes folyékony) permeátumot. A 7 sejteket visszaküldjük a bioreaktorba, és a 8 permeátumot termékkinyerésre.

A sejtek elválasztását folyamatos centrifuga, szűrő vagy felcsévélt spirál szűrőrendszer, kerámia szűrőrendszer vagy más szilárd/folyadék elválasztó berendezés alkalmazásával végezzük. Az etanolt a permeátumból (vagy pedig az 5 reaktorból elfolyó effluensből, ha nem alkalmazunk sejtelválasztást) különböző módszerekkel nyerhetjük ki, beleértve a desztillációt és adszorpciót. A 8 permeátumot egy desztillálóoszlopban választjuk el, így 95%-os etanol 10 fejpárlatot és 11 vizet kapunk, amelyet visszavezetünk a 3 reaktorba. A visszavezetett 11 víz a fermentációban el nem fogyasztott fölösleges tápanyagokat tartalmazza, azonban a fermentációból vagy sejtlizátumból származó bármilyen fölösleges vitamin elbomlik a desztilláció hőhatására. A 95%-os etanol 10 fejpárlatot a 12 molekulaszűrőre juttatjuk, ahol 13 vízmentes etanolt, a kívánt terméket elválasztjuk a 14 híg etanoltól, amelyet visszavezetünk a 9 desztillálóoszlopra.

A sejtek növekedésének, elhalásának és elvételének folyamatos kombinálása konstans sejtkoncentrációt tart fenn, így az etanol (és kis mennyiségű ecetsav) termelésére alkalmazott folyamatos módszer több hónapon keresztül működtethető CO, CO₂ és H₂, valamint tápanyagok adagolásával, anélkül hogy a tenyészetet ki kellene egészíteni. A találmány szerinti módszerrel fenntartjuk és szabályozzuk az etanol és ecetsav folyamatos termelését, és megakadályozzuk vagy gyorsan korrigáljuk a folyamat zavarait. A találmány szerinti módszer ezenkívül elősegíti, hogy megakadályozzuk, hogy a tenyészet akklimatizálódjon a tápanyagok alacsony koncentrációjához, ami káros lehet a tenyésztés végbemenetelére nézve. Az alábbiakban és a példákban ismertetett eljárásokban a nyomás 101,3 kPa és a hőmérséklet 36—41 °C, hacsak nem jelezzük másképpen. A kívánatos nyomás- és hőmérsékletértékeket szakember egyszerűen meghatározhatja a bioreaktorban alkalmazott mikroorganizmustól függően.

Az alábbiakban ismertetett, az alapvető lépéseken túlmenően alkalmazott különböző manipulációk lehetővé teszik az etanol fokozott termelését. Előnyösen folyékony fázisban tápanyag- (pantotenát- vagy kobalt-)

HU 226 975 Β1 limitálást, vagy pedig a H₂ vagy CO fölöslegét alkalmazzuk - az alábbiakban ismertetett módon - az etanoltermelés kívánt hatékonyságának elérésére és fenntartására, valamint az etanol és acetát stabil koncentrációban és arányokban történő termelésének lehetővé tételére a fermentlében. Ezek a körülmények az etanol és acetát stabil koncentrációban történő termelését teszik lehetővé a fermentlében. Egy előnyös megvalósítási mód szerint az etanol és acetát termelésének aránya a fermentlében 10:1 értéknél nagyobb, és az etanol koncentrációja 15 g/l értéknél nagyobb.

A) Kalcium-pantotenát limitálása

A találmány szerinti megoldás egy megvalósítási módja értelmében a biológiai útvonalaknak az etanoltermelés elősegítése és az ecetsavtermelés korlátozása érdekében végzett manipulálása során a tápközegben olyan mértékre korlátozzuk a kalcium-pantotenátot, amely kevesebb mint amennyi a baktériumok olyan stabil, stacioner koncentrációban való tartásához szükséges, amellyel a rendelkezésre álló kalcium-pantotenát teljes mértékben felhasználódna. A pantotenát az acetil-CoA-ciklus egy komponense, így a tápközegben a kalcium-pantotenát korlátozásával az acetil-CoA-ciklus sebessége a CO-ciklus sebességéhez képest csökken. Ez a redukált ferredoxin felszaporodásához és a NAD(P)->NAD(P)H átalakulás csökkenéséhez vezet, és így az etanol végtermék termelését fokozza.

A pantotenátlimitálás akkor figyelhető meg, ha a reaktorban termelt sejtek száraz tömegének grammjaira számítva az adagolt kalcium-pantotenát mennyisége 0,5-100 pg. Az adagolt kalcium-pantotenát mennyisége előnyösen 2-75 pg a reaktorban termelt sejtek száraz tömegének grammjaira számítva. Az adagolt kalcium-pantotenát mennyisége még előnyösebben 0,5-50 pg a reaktorban termelt sejtek száraz tömegének grammjaira számítva. Egy másik megvalósítási mód szerint az adagolt kalcium-pantotenát mennyisége mintegy 1-25 pg a reaktorban termelt sejtek száraz tömegének grammjaira számítva. Egy további megvalósítási mód szerint az adagolt kalcium-pantotenát mennyisége mintegy 10-30 pg a reaktorban termelt sejtek száraz tömegének grammjaira számítva. A tápanyag ilyen mennyisége fenntartja, hogy az etanoltermelés kerüljön előtérbe az acetáttermeléssel szemben. Egy ilyen megvalósítási módot ismertetünk a 4. példában.

A találmány egy másik szempontja szerint a fermentáló bioreaktorban levő baktériumok alacsony, limitáló kalcium-pantotenát-koncentrációhoz való akklimatizálódását úgy akadályozzuk meg, hogy a fermentációs paramétereket úgy szabályozzuk, hogy konstans kalcium-pantotenát-koncentrációt tartunk fenn, miközben a gázbevezetés sebessége, folyadékadagolás sebessége, keverési sebesség és H₂ parciális nyomás közül legalább egy, de néha több paramétert állítunk. A tápanyagokban történő nagyobb változtatásokat elkerüljük, viszonylag konstans tápanyagkoncentrációadagolást tartunk fenn. Ha a tenyészetet hagyjuk akklimatizálódni a folyadékfázis alacsony limitáló tápanyagkoncentrációjához, gyenge, 0,1 g-etanol/g-acetát vagy ennél alacsonyabb termékkihozatalt kapunk, irreverzíbilis módon. így a reaktor leeresztése és újrainokulálása válik szükségessé. A biológiai útvonalat előnyösen úgy szabályozzuk, hogy az elősegítse az etanol termelését, és korlátozza az ecetsav termelését, először a betáplált gázban a H₂ fölöslegének adagolásával a bioreaktorba, és azután a kalcium-pantotenát korlátozásával a tápközegben, amint az alábbiakban ismertetjük.

Valójában úgy járunk el, hogy induláskor a normálisan korlátozó, folyadékfázisbeli tápanyagot, a kalciumpantotenátot fölöslegben tartjuk, hogy megakadályozzuk az alacsony koncentrációhoz való akklimatizálódást, egy olyan állapotot, ami nagyon gyenge hozamot és a tenyészet azon képességének elvesztését okozhatja, hogy 10 g/l-nap értéknél magasabb etanoltermelést érjen el, ha a H₂-t nem fölöslegben adagoljuk. A fermentációs paraméterek ilyen szabályozását mutatjuk be a 17. példában egy adott baktériumtenyészet esetén.

B) Kobalt limitálása

A találmány szerinti megoldás egy másik megvalósítási módja értelmében a biológiai útvonalaknak az etanoltermelés elősegítésére és az ecetsavtermelés korlátozására szolgáló manipulálása során a kobalt mennyiségét a tápközegben olyan értékre korlátozzuk, amely kevesebb mint amennyi a baktériumok stabil stacioner állapotban való tartásához szükséges, amellyel a rendelkezésre álló kobalt teljes mértékben felhasználódna. A kobaltlimitálás akkor figyelhető meg, ha a bioreaktorban termelt sejtek száraz tömegének grammjaira számítva az adagolt kobalt mennyisége 5-100 pg. Az adagolt kobalt mennyisége előnyösen 20-50 pg a reaktorban termelt sejtek száraz tömegének grammjaira számítva. Ilyen mennyiségű kobalt elősegíti az etanol termelését az eljárásban az acetáthoz képest. A 18. példában bemutatunk egy ilyen megvalósítási módot, a kobalt limitálását a reaktorban.

A kobalt limitálása a fermentlében csökkentheti az acetil-CoA-ciklus sebességét is. Mivel a kobalt visz át egy metilcsoportot a THF-ciklusból az acetil-CoA-ciklusba, a fermentlében a kobalt limitálása csökkenti a THF-ciklus funkcióját is az átvitel gátlásával. A kobalt limitálása csökkenti a THF-ciklus sebességét, ami magasabb NAD(P)H:NAD(P) arányt, és így etanoltermelést eredményez.

Az eljárásban további manipulációt végzünk oly módon, hogy megakadályozzuk az alacsony kobaltkoncentrációhoz való akklimatizálódást. Ugyanolyan módon, ahogyan az alacsony pantotenátkoncentrációhoz való akklimatizálódást megakadályozzuk, állandó kobaltkoncentrációt tartunk fenn, miközben egy vagy több fermentációs paramétert (gázadagolás sebessége, folyadékadagolás sebessége, keverés sebessége, CO₂-tartalom, H₂ parciális nyomása) állítunk. A tápanyagokban történő nagyobb változtatásokat elkerüljük, viszonylag konstans tápanyag-koncentrációt tartunk fenn. A fermentációs paraméterek ilyen szabályozásának egy példáját a 19. példában mutatjuk be, egy adott baktériumtenyészethez.

HU 226 975 Β1

Előnyösen úgy járunk el, hogy a biológiai útvonalat az etanoltermelés elősegítése és az acetáttermelés korlátozása révén szabályozzuk, elsősorban úgy, hogy a reaktorba a H₂-t fölöslegben adagoljuk, majd a kobaltot limitáljuk a tápközegben, ahogyan az előbbiekben ismertettük. Induláskor a folyadékfázisú tápközegben a kobalt mennyiségét fölöslegben tartjuk, hogy megakadályozzuk az alacsony koncentrációkhoz való akklimatizálódást, egy olyan állapotot, ami a tenyészet nagyon gyenge termelékenységét és a tenyészet azon képességének elvesztését okozhatja, hogy a termékeket 1:1 aránynál nagyobb arányban termelje.

C) Hidrogén túladagolása

A találmány szerinti megoldás egy további megvalósítási módja értelmében a biológiai útvonalat az etanoltermelés elősegítése és az acetáttermelés korlátozása révén úgy manipuláljuk, hogy a H₂-t fölöslegben alkalmazzuk az adagolt gázban, vagy pedig korlátozzuk a széntartalmú gázok adagolását, ezzel a H₂ fölöslegbe kerül, amit a biológiai útvonal hasznosít. Előnyösen úgy járunk el, hogy a H₂ redukáló gázt fölöslegben alkalmazzuk a CO-hoz képest, és a fölöslegben vett H₂ a baktériumokat arra készteti, hogy a fermentlében az etanolt nagyobb arányban termeljék az acetáthoz képest. Ha a H₂ aránya (mol-ban kifejezve a betáplált gázban) a CO konvertált mennyiségének kétszerese (mol-ban kifejezve a gázban) és a CO₂ konvertált mennyiségének háromszorosa (mol-ban kifejezve a gázban) összegéhez viszonyítva nagyobb, mint 1, a fermentort szénre nézve limitáltnak nevezzük. A H₂ parciális nyomása a kilépő gázban előnyösen

40,5 kPa-nál nagyobb érték. A H₂ parciális nyomása és a CO₂ parciális nyomása arányának 3,0 értéknél nagyobbnak kell lennie ahhoz, hogy elegendő H₂ legyen jelen az összes CO₂ felhasználásához. Ha a CO₂ parciális nyomásának értéke 10,13 kPa-nál nagyobb érték, akkor valószínű, hogy a növekedés más módon korlátozódik. A 20. példában illusztráljuk a módszer ezen lépését.

Induláskor a H₂ fölöslegének az alkalmazása előnyösebb, mint a tápanyag-limitálás, főleg azért, mert ezt könnyebb szabályozni. A H₂ fölöslegének alkalmazása azzal az előnnyel jár, hogy ezzel kiküszöböljük az ecetsav fölös termelődését, ami gyenge termékarányokhoz és potenciális ecetsavgátláshoz, valamint az alacsony tápanyag-koncentrációhoz való akklimatizálódáshoz vezethet.

D) Szén-monoxid túladagolása

A módszer komponensei manipulálásának egy másik módja a redukáló gáz CO túladagolása a biológiai útvonalban alkalmazott, gázfázisú szubsztrátban, ami közvetlenül csökkenti a fermentlé redoxpotenciálját. Ennek megfelelően ezen megvalósítási mód értelmében a bioreaktorba CO-ot tartalmazó gázfázisú szubsztrátot vezetünk, a bioreaktorban jelen levő CO mennyisége nagyobb, mint amennyi a baktériumok olyan stabil állandó koncentrációban való tartásához szükséges, hogy a biztosított CO teljes mértékben felhasználódjon.

A CO-túladagolás - mint az ecetsavtermeléssel szemben az etanoltermelés biztosításának módszere - akkor valósul meg, ha a CO felvételének fajlagos aránya (millimól CO per gramm sejt száraz tömeg percenként a reaktorban, vagyis mmol/g-sejt/perc) 0,3 értéknél nagyobb. Még előnyösebb, ha ebben a lépésben a CO felvételének fajlagos aránya 0,5 értéknél nagyobb. Ez azt jelenti, hogy a CO-ot átlagosan minden sejt metabolizmusa során legalább 0,3 mmol/g/perc sebességgel, vagy még ideálisabb esetben legalább 0,5 mmol/g/perc sebességgel hasznosítja. A CO-ot előnyösen olyan sebességgel adagoljuk, hogy a CO-felvétel 0,3-2 mmol CO/g-baktériumsejt-száraz tömeg/perc érték legyen. Egy másik megvalósítási mód értelmében CO-ot olyan sebességgel adagoljuk, hogy a CO-felvétel 0,5-1,5 mmol CO/g-baktériumsejt-száraz tömeg/perc érték legyen. Egy további megvalósítási mód értelmében a CO-ot olyan sebességgel adagoljuk, hogy a CO-felvétel mintegy 1 mmol CO/g-baktériumsejt-száraz tömeg/perc érték legyen. A 24. példában e módszer egy megvalósítási módját mutatjuk be.

A CO-felvétel ilyen sebessége biztosítja, hogy etanol termelődjön acetáttal szemben. Ha a CO-ot a gáz nyomása vagy a különösen jó tömegátadás segítségével úgy adagoljuk, hogy az oldott CO a fermentlében jelentős mennyiségben legyen jelen, a fermentlé redukáltabbá válik. A CO túladagolásának két további előnye van. A CO fölöslege azt okozhatja, hogy a CO-ciklus gyorsabban megy végbe, és ha az acetil-CoA-ciklus más módon korlátozódik, és nem tud lépést tartani a CO-ciklussal, a redukált ferredoxin felszaporodik. A CO a teljes háromlépéses módszerben szubsztrátgátlással lelassíthatja a 2. lépést is (az intermedier ecetsav termelését). A 2. lépésnek az 1. lépéshez viszonyított ilyen csökkent sebessége a NAD(P)H fölöslegét eredményezi, ami elősegíti az etanoltermelést az ecetsavtermeléshez viszonyítva.

Bár a CO fölöslege fokozhatja az etanoltermelést azáltal, hogy közvetlenül csökkenti a fermentlé redoxpotenciálját, a CO fölöslegének jelenléte gátolja a növekedést is a CO-dehidrogenáz, és így a H₂ felvételének gátlásával. A CO fölöslegének jelenléte sajnos gyenge H₂-konverziót is okoz, ami gazdaságilag nem előnyös. A szubsztrátgátlás alatt történő kiterjedt működés következménye a gyenge H₂-felvétel. Ez nyilvánvalóan sejtlízist okoz, és szükségessé teszi a reaktor újraindítását. Ha a módszer következménye véletlenül bekövetkező szubsztrátgátlás (túl sok CO jelenléte a rendelkezésre álló sejtek számára) a tenyészet kezdeti növekedése során vagy később, a gázadagolás és/vagy a keverés sebességét csökkentjük, amíg a szubsztrátgátlás nem enyhül. A 21. példában bemutatjuk a gázadagolás vagy a keverés sebességének csökkentését az említett hatás elérésére.

E) További manipulációs lépések

A fent ismertetett főbb, az eljárást elősegítő lépések mellett kívánatos további néhány lépést elvégezni az etanol termelésére szolgáló eljárásban.

HU 226 975 Β1

1. Tömegátadás fokozása

Egy ilyen további lépés annak biztosítása, hogy a CO és H₂ tömegátadása a betáplált gázból a folyékony fermentlébe gyorsabb legyen, mint ahogyan a baktériumok oldott gázt hasznosítani képesek. így például ha a C. Ijungdahlii tenyészetet tartalmazó bioreaktorba CO, CO₂ és H₂ keverékét adagoljuk, és tápanyagok (például pantotenát és kobalt) limitációja vagy fölösleges mennyiségű H₂ jelenléte nélkül működtetjük, a sejtek növekedését a gáz mennyiségének a folyadékfázisba való bejutása korlátozza, és a rendszer ecetsavat termel. Ha a tenyészetet a növekedéséhez szükségeshez képest CO vagy H₂ enyhe fölöslegével látjuk el, akkor etanolt termel. Ha azonban túl sok gáz jut a folyadékfázisba, szubsztrátgátlás következik be, ami a tenyészet egyensúlyának felborulásához és a sejtek pusztulásához vezet. A fölös tömegátadással való működtetésnek tehát nagyon szűk tartománya van. A 22. példában ezt a módszert mutatjuk be.

Az acetil-CoA-ciklus esetén a redukált ferredoxin fölöslegben való termeléséhez a CO-ciklusnak vagy a ferredoxin hidrogenázok által való redukciójának gyorsabban kell végbemennie, mint az acetil-CoA-ciklusnak. Az említett módszerek korlátozzák azt a sebességet, amellyel az organizmusok hasznosítják az oldott gázokat, oly módon, hogy korlátozzuk azt a sebességet, ahogyan az esszenciális tápanyagok, például a kalcium-pantotenát vagy a kobalt vagy más szubsztrátok, például a CO₂-gáz hozzáférhetők a baktériumok számára, vagy pedig fölösleges mennyiségű szubsztrátot, így H₂-t vagy CO-ot juttatunk a tenyészetbe.

A tömegátadás elméleti sebessége, ami gyorsabb, mint ahogyan a baktériumok - egyéb korlátozás nélkül - felhasználják a szubsztrátot, számolható. Ezt a sebességet, ha elérjük, korlátozza az organizmusok természetes növekedési sebessége. Ezért a leghatékonyabb kiviteli mód az, ha a tömegátadás (gázadagolás vagy a keverés sebessége) gyorsabb, mint az a sebesség, amelynél a legmagasabb sejtkoncentráció a szubsztrátot egyéb korlátozás nélkül hasznosítja. Ez nagyon szűk működési tartomány, mivel a szubsztrátgátlás nagyon gyorsan sejtpusztulást okozhat, és olyan melléktermék képződhet, amely toxikus a tenyészetre nézve.

2. CO és H₂ fölöslegének biztosítása

A találmány szerinti megoldás egy további megvalósítási módja esetén a magas etanolkoncentráció/korlátozott ecetsavtermelés stabilitását olyan módszerrel érjük el, amelyben korlátozzuk a kobalt vagy kalcium-pantotenát adagolását, vagy pedig a H₂-t vagy CO-ot fölöslegben alkalmazzuk. E lépés szerint - mivel a tenyészet a CO, H₂ és CO₂ gázfázisú szubsztrátokat szén- és energiaforrásként használja - a CO-ot és H₂-t enyhe fölöslegben alkalmazzuk. A CO és H₂ enyhe fölöslegét úgy alkalmazzuk, hogy egyenletes működést érünk el, majd fokozatosan emeljük a gázadagolás sebességét és/vagy a keverés sebességét (10%-kal vagy ennél kisebb mértékben), amíg a CO és H₂ konverziója éppen el nem kezd csökkenni. Ez az egyik eszköze annak, hogy megelőzzük a korlátozott tömegátadást, ami az ecetsavtermelést segíti elő, fölösleges mennyiségű redukált ferredoxint biztosítsunk a NAD(P)->NAD(P)H redukáláshoz, valamint az etanoltermeléshez. Ha a CO-ot és H₂-t nem alkalmazzuk enyhe fölöslegben, korlátozott tömegátadás következik be, és az útvonal kiegyensúlyozódik. Ez az etanol- és acetáttermelés gyenge arányát (magas acetátkoncentrációt) eredményezi. A magas acetátkoncentráció azután ecetsavgátlást okozhat, ami korlátozza a baktériumok H₂-felvevő képességét, és végső fokon a tenyésztés sikertelenségéhez vezet.

A korlátozott tömegátadás megelőzésére tett lépések közé tartozik a keverés sebességének vagy a gázadagolás sebességének fokozása annak érdekében, hogy több CO-ot és H₂-t juttassunk a folyadékfázisba, és így visszatérjünk az enyhe CO- és H₂-fölösleghez. Ha a korlátozott tömegátadás következtében termékgátlás jön létre, a folyadékadagolás sebességét kell növelni, hogy hígítással csökkentve az acetátkoncentrációt megszüntessük az ecetsavgátlást. Mivel a tápközeg adagolási sebességének növelésével emelkedne a pantotenátnak vagy kobaltnak a termelt sejtek grammjaira vonatkoztatott értéke pg-ban kifejezve, ezt a sebességnövelést csak rövid ideig szabad végezni, vagy pedig a pantotenát vagy kobalt fölöslegét meg kell szüntetni a koncentráció beállításával a tápközegben vagy a vízbevezetés sebességének a növelésével.

3. Az ecetsavgátlás szabályozása

A fent ismertetett módszerek esetén ecetsav által okozott termékgátlás következhet be, ha túl sok, azaz >2 g/l molekuláris ecetsav szaporodik fel a bioreaktorban, ami gátolja a sejtnövekedést és a további etanoltermelést. Egy másik manipulációs lépést alkalmazunk a tenyésztés sikertelenségének megelőzésére. Egyfajta módosítás abban áll, hogy rövid ideig növeljük a folyadék- vagy vizes fázis betáplálási sebességét, a gátló ecetsavkoncentráció 2 g/l érték alá történő csökkentésére a folyadékfázisban. E lépést egy adott tenyészet esetén a 23. példában mutatjuk be.

4. A víz cirkuláltatása

Egy további adott esetben végzett lépés a találmány szerinti módszer esetén az olyan stabil tenyészet fenntartására, amely etanolt termel egyedüli termékként, ecetsav termelése nélkül, hogy a desztillálással kapott vizet visszavezetjük a bioreaktorba (lásd például a 15. példát). Amint korábban megjegyeztük, a víz (legfeljebb 5 g/l acetáttartalommal) visszavezetése azzal az előnnyel jár, hogy az acetát terméket visszavezetjük a reaktorba, így tiszta ecetsavat nem termelünk. így a reaktorban egyensúlyt hozunk létre az etanol és az acetát között. Ennek eredményeképpen a reaktorba betáplált és termékké alakított összes CO, CO₂ és H₂ etanoltermelést eredményez, kivéve, ami a tenyészet fenntartására használódik el.

5. A sejtsűrűség csökkentése

Az eljárásban alkalmazható, egy további manipulációs lépés szerint periodikusan vagy folyamatosan bak10

HU 226 975 Β1 tériumsejteket veszünk el a bioreaktorból, hogy csökkentsük a sejtkoncentrációt. Ez a manipulációs lépés arra szolgál, hogy a sejtkoncentrációt alacsonyabb értékre csökkentsük, mint a stabil, stacioner állapot azon sejtkoncentrációja, ahol a redukáló gáz vagy a bioreaktorban levő tápanyagok teljes mértékben felhasználódnak. Ezáltal a sejtsűrűség megváltozatásával elősegítjük az etanol termelését az acetáttal szemben. Lásd például a 25. példát.

6. Kétfokozatú CSTR

Az etanol tápközeg-limitációval történő előállításával kapcsolatos egyik probléma az, hogy a tenyészet képes vagy hajlamos végül adaptálódni a korlátozó körülményekhez, és néhány hónapig tartó működés után nem termel tovább etanoit. Ehelyett végül az acetát lesz a domináns termék. Ez a korlátozó tápanyaghoz való akklimatizálódás olyan tenyészetet eredményez, amely több ecetsavat termel, mint etanoit (etanol/acetát termékarány 1,0 vagy ennél kisebb), és alacsony etanolkoncentrációt (néha csupán 1 g/l) eredményez. Az adaptálódás leginkább akkor alakul ki, ha a tenyészet induláskor nincs ellátva elegendő tápanyaggal, amikor a növekedési sebesség fontosabb, mint az etanoltermelés aránya. Emellett fennáll az a veszély, hogy a tenyészet akklimatizálódhat az alacsony tápanyagkoncentrációhoz a stacioner fázisban, különösen mivel a tápanyag-koncentrációkat lefelé szorítjuk, hogy a reakciórendszert megszabadítsuk az acetáttól.

Az adaptáció és az említett veszély megelőzésére a pantotenát- vagy kobaltlimitáló lépés alkalmazásakor - ahelyett, hogy a tenyészetet a rendelkezésre álló tápanyagokkal hagynánk növekedni - a módszer egy másfajta módosítását végezhetjük. így kétfokozatú CSTR rendszert alkalmazunk, amelyben elsődlegesen jó tenyészetnövekedés következik be az első fokozatban a korlátozó tápanyagok enyhe fölöslegén (esetleg ecetsavtermeléssel társulva), majd a termelőfokozatban az első fokozatból származó tenyészetet a korlátozó tápanyaggal korlátozzuk és etanol nagy koncentrációjának termelésére használjuk. Ez a módosítás lehetővé teszi, hogy stabil tenyészetet tartsunk fenn, amely nem akklimatizálódik a csökkent pantotenát- vagy kobaltkoncentrációhoz. Ez a módosítás magában foglal egy kétfokozatú CSTR-t, amelyben egy növesztőreaktorból (1. fokozat) tápláljuk a termelőreaktort (2. fokozat), ahol az etanol fő tömegének termelése történik. A növesztőreaktorban nem alkalmazzuk a fent említett tápanyag-limitáló lépést, így a tenyészet nem olyan érzékeny a korlátozó körülményekhez való akklimatizálódásra.

Egy kétfokozatú CSTR rendszert a 2. ábrán mutatunk be sematikusan, és az alábbi leírásban erre az ábrára hivatkozunk. E megvalósítási mód szerint a növesztőfokozatot körülbelül 24 óra folyadék retenciós idővel (LRT) működtetjük. Az 1 növesztőfokozatú CSTR-be a 2 tápközegben elegendő mennyiségű pantotenátot és kobaltot adagolunk, hogy egészséges tenyészetet kapjunk (és kevés ecetsavat is termelhetünk). így fölös mennyiségű ecetsavat termelünk a reaktorban, de fokozott stabilitással. Ez a pantotenátés kobaltkoncentráció több annál, mint amennyit egy etanoit termelő egyedüli CSTR-be táplálnánk. Az e reaktorba táplált gáz a 4 termelőfokozatból származó 3 nem konvertált gáz, a betáplált folyadék pedig friss 2 tápközeg. A növesztési fokozatú CSTR-t sejt-visszacirkuláltatás nélkül működtetjük. E növesztőfokozatú reaktor alkalmazásának célja, hogy a későbbi etanoltermelést egészséges tenyészettel lássuk el, amely nem akklimatizálódik az alacsony pantotenátkoncentrációhoz.

A 4 termelési fokozatú reaktort 20 óránál rövidebb nominális LRT-vel működtetjük. Ezt a sejt-visszacirkuláltatással működtetett CSTR-t 5 friss gázbetáplálással látjuk el, és itt a konverzió alacsony lehet. Friss 6 tápközeg-betáplálással és a növesztőfokozatból származó 7 tenyészetbetáplálással tápláljuk. Ebbe a reaktorba minimális pantotenátot és kobaltot juttatunk, mivel a fölösleg a növesztőfokozatból hozzáférhető. Ennél a reaktornál 8 sejt-visszacirkuláltatást alkalmazunk, hogy a 9 reaktorba visszajuttatott sejtekkel a legnagyobb kihozatalt érjük el. A 10 folyékony termék kilépő etanoltartalmának 20 g/l-nél nagyobbnak kell lennie. A kétfokozatú CSTR rendszerre jellemző, hogy az alacsony pantotenát- vagy kobaltkoncentrációhoz való akklimatizálódásban csekély a változás; az átlagos LRT 30 óra vagy kevesebb; várható nagyobb az etanoltermelékenység és magasabb az etanolkoncentráció, mint azonos méretű egyedüli CSTR esetén.

7. Módosítás az indításnál

A találmány szerinti módszerben előnyösen alkalmazható további lépés szerint a fermentációs tenyésztés kezdetén sejtszaporítást végzünk. Az etanol és ecetsav termeléséhez CO-dal, CO₂-dal és H₂-nel táplált bioreaktor indítását úgy végezzük, hogy törzssejttenyészetből adagonként beoltjuk (11. példa), vagy pedig egy meglevő reaktorból folyamatosan beoltjuk tenyészetbetáplálás formájában (12. példa). Amint a fentiekben, a tenyészet alacsony pantotenát- vagy kobaltkoncentrációkhoz való akklimatizálódásának megelőzése kapcsán említettük, kívánatos, hogy a tenyészetet nagy sejtkoncentrációra állítsuk be, mielőtt a tápanyagkorlátozást beállítanánk, és fölösleges mennyiségű H₂-t adagolnánk. Ez a gyors indulás megelőzi, hogy a tenyészet akklimatizálódjon, és jó termékarányt (magas etanol- és alacsony acetátkoncentrációt) eredményez. Ha nem alkalmazzuk a gyors indítást, gyenge termékarányok alakulhatnak ki, és a tenyészet akklimatizálódhat a folyadékfázis alacsony tápanyag-koncentrációihoz, és így a reaktort újra kell indítani.

A reaktort egy adag folyadékfázissal indítjuk (a folyékony fázist induláskor nem adagoljuk folyamatosan a reaktorba), alacsony keverési sebességnél (mintegy 400-600 rpm laboratóriumi New Brunswick Scientific Bioflo® reaktorban) és a kívánt pH-nál. így a folyadékfázis a reaktorban vitaminokat és sókat tartalmazó tápközeg egy adagjából áll, a korlátozó tápanyagok - akár a kalcium-pantotenát, akár a kobalt - nominális koncentrációjával (például 20 pg/l pantotenát vagy 75 ppb

HU 226 975 Β1 kobalt). Ha egy meglévő reaktorból származó folyamatos beoltást alkalmazunk, nem szükséges az adagonként! folyadékfázissal való működtetést alkalmazni. Ebben az esetben induláskor a gázt folyamatosan, kis sebességgel tápláljuk a reaktorba. Ideális esetben induláskor a gázfázisban nincs CO₂, H₂-ben gazdag, és a gázadagolás és a keverés sebessége alacsony, hogy megakadályozzuk a CO szubsztrátgátlást.

Az etanolkoncentráció CO, CO₂ és H₂ keverékéből gazdaságilag életképes módon történő termelésének és fenntartásának általános indulási eljárása például három elkülönülő fázisból áll: (a) kezdeti indulás, ahol a sejtszaporítás kritikus; (b) felfutás, ahol a termelési arány válik kritikussá, és (c) stacioner működés. A kezdeti indulásra lényegében véve az jellemző, hogy egy adag folyadékkal oltunk be, amely nominális koncentrációban tartalmazza a kobaltot (75 ppb) vagy a kalcium-pantotenátot (20 pg/l), kívánt pH-nál (tipikusan 4,5-5,5 értéknél). A felfutás elősegítésére a gázbevezetés sebességét és a keverési sebességet előnyösen alacsony értéken tartjuk, miközben a H₂-t fölöslegben adagoljuk. A felfutás során az etanoltermelés oka a fölöslegben adagolt H₂; a tápanyag-korlátozást a későbbiekben alkalmazzuk. így a folyékony tápanyagok fölöslege jelen van a felfutás során, hogy a tenyészet ne akklimatizálódjon nemkívánatos módon az alacsony tápanyag-koncentrációkhoz. Ahogyan a fermentáció előrehalad a beoltástól számítva néhány órán át, CO₂ termelődik, és a H₂ fogy. Ezek arányának változása figyelmeztet, hogy a keverés nominális sebességét lassan emelni kell (talán 200-300 rpm-mel egy laboratóriumi reaktorban, 2-3 napon át), a korlátozott tömegátadás miatt.

A CO₂-képződés ilyen megindulása sokkal gyorsabban következik be olyan rendszerekben, amelyeknél folyamatos inokulálást végzünk, mint az olyanoknál, ahol szakaszos inokulálást tenyészet-törzsszuszpenzióból. Ha azonban a keverési sebességet túl gyorsan emeljük, CO szubsztrátgátlás következik be. A H₂konverzió (vagy CO₂-termelés) figyelése, miközben a keverési sebességet nominális emeljük, viszonylag rövid ideig szükséges, míg a kívánt keverési sebességet el nem érjük. A szakaszos tenyésztésben a keverési sebesség emelésének ezen ideje alatt a legfontosabb a sejtszaporítás, a termékképződéssel szemben.

Ha elértük a megcélzott keverési sebességet (800-1000 rpm laboratóriumi New Brunswick Scientific Bioflo® reaktornál), hagyjuk, hogy a tenyészet H₂-felvétele állandósuljon. A kezdeti állapot átmegy egy olyan módozatba, ahol a termelési arány fontossá válik. Kívánatos, hogy a CO-konverzió meghaladja a 80%-ot, és a kilépő gázban a H₂ parciális nyomása nagy (legalább 55,7 kPa) legyen, hogy biztosítsuk az etanoltermelést, miközben korlátozzuk az acetát- és szabad ecetsavkoncentrációt. Ezután beindítjuk a folyékony tápoldat adagolását (olyan rendszerek esetén, amelyeket szakaszosan inokulálunk tenyészet-törzsszuszpenzióból) a folyamatos adagoláshoz, és a gázadagolás sebességét 10%-os lépésekkel növeljük a kívánt átfolyási sebesség eléréséig. A H₂-adagolást fölöslegben tartjuk, hogy megelőzzük a fölösleges ecetsavtermelést. Ahogyan a gázadagolást növeljük, a folyékony tápanyagokat (kalcium-pantotenát vagy kobalt) limitáljuk, és az ilyen limitálás hatására kismértékben csökken a termékképződésben megnyilvánuló H₂-konverzió.

Stacioner működtetés esetén 15-35 g/l etanol és 0-5 g/l acetát termelését érjük el. Ebben a fokozatban a korlátozó tápanyagok, a folyadékadagolás és a gázadagolás sebességének kismértékű igazítása szükséges, ezt szakember a technika állása és az itt közölt ismeretek alapján meg tudja határozni. Ha az etanoltermeléshez sejt-visszacirkuláltatást is alkalmazunk, akkor ezt a gázadagolás sebességének (emelésével) és a tápanyag-koncentráció (csökkentésével) beállításával együtt végezzük.

Az etanol folyamatos termelésének és magas szinten való tartásának fent ismertetett módszere, egyidejűleg a melléktermék acetát alacsony koncentrációban történő termelésével, stabil működési körülmények között, elősegíti az alkalmazott baktériumok ipari méretekben etanol termelésére való hasznosítását. A fent ismertetett módszer lépéseivel kiküszöböljük az alkalmazott baktériumok ipari méretekben történő hasznosításának korlátáit etanol CO, CO₂ és H₂ keverékéből való előállításában. A módszerben előnyösen folyamatos bioreaktort alkalmazunk, azonban szakaszos reaktort és szakaszos adagolással végzett fermentációs módszert is alkalmazhatunk, amelyek azonban nagy léptékű etanoltermelésre nem annyira gazdaságosak.

A találmány szerinti megoldást a következő példákkal szemléltetjük, a korlátozás szándéka nélkül. A példákban a gáz összetételének megadásánál alkalmazott „%” értékek térfogatszázalékot jelentenek; „rpm” jelentése fordulat/perc.

1. példa

Egy találmány szerinti megoldás

CO-ot és/vagy CO₂/H₂-t tartalmazó szintézisgázt vagy hulladék gázt vezetünk folyamatosan egy C. Ijungdahlii törzset tartalmazó, kevert bioreaktorba, vitaminokat, nyomelemeket és sókat tartalmazó szokásos folyékony tápközeggel együtt. Egy szokásos folyékony tápközeg összetételét az 1. táblázatban adjuk meg.

Az eljárás indításakor, 10% vagy ennél kevesebb inokulum alkalmazása mellett, a reaktort a folyadékfázis szakaszos adagolásával működtetjük. így a reaktorban a folyadékfázis egy adag olyan tápközeg, amely a korlátozó tápanyagokat - akár a kalcium-pantotenátot, akár a kobaltot - nominális koncentrációban tartalmazza. Eljárhatunk úgy is, hogy élesztőkivonatot, triptikázt vagy más komplex tápanyagokat tartalmazó, gazdag tápközeget alkalmazunk.

Ideális esetben induláskor a gázfázis CO₂-tól mentes, és a H₂-t fölöslegben tartalmazza. A gázadagolás és a keverés sebességét alacsonyan (500 rpm-nél alacsonyabb értéken, egy New Brunswick Scientific Bioflo® fermentációs bioreaktorban) tartjuk, hogy a CO és H₂ enyhe fölöslegben legyen, de ugyanakkor megelőzzük a CO szubsztrátgátlást. Egy 1 literes New Bruns12

HU 226 975 Β1 wick Scientific Bioflo® fermentációs bioreaktorban például - amelyet 63% H₂, 32% CO és 5% CH₄ összetételű gázzal táplálunk - a kezdeti szakaszban a keverés sebessége 400 rpm, és a gázadagolás sebessége 20 ml/perc. Az indulási szakaszban az etanoltermelés a fölöslegben levő H₂ hatására következik be, a tápanyag-korlátozás később történik. A kezdeti szakaszban tehát fölös mennyiségű folyékony tápközeg (pantotenát és kobalt) van jelen, hogy megelőzzük a tenyészet nem kívánt akklimatizálódását az alacsony tápanyag-koncentrációhoz.

Ahogyan a fermentáció folyik az inokulálás után néhány órán át, CO₂ képződik a CO konverziójával, és a H₂ a CO₂-dal együtt fogy, ami azt jelzi, hogy a keverés sebességét nominálisan fokozni kell, hogy elkerüljük a korlátozott tömegátadást. A New Brunswick Scientific Bioflo® CSTR esetén a kilépő gáz összetétele: 25% CO, 67% H₂, 2% CO₂ és 6% CH₄. Ha a keverés sebességét túlságosan fokozzuk, CO szubsztrátgátlás következik be, amit a metánkoncentráció csökkenése jelez a keverés sebességének fokozása után. A keverés sebességét tipikusan 24 óra alatt 200 rpm-mel fokozzuk. A CO₂-termelés (vagy H₂-konverzió) ellenőrzése - miközben a keverés sebességét nominálisan fokozzuk viszonylag gyors ütemben történik, míg a kívánt keverési sebességet el nem érjük. Egy New Brunswick Scientific Bioflo® fermentációs bioreaktorban a kívánt keverési sebesség tipikusan 900 rpm. A szakaszosan táplált folyékony tenyészet keverési sebességének emelése idején a sejtszaporítás a legfontosabb, a termékképződés helyett. így körülbelül 1,5 g/l sejtkoncentrációt érünk el, miközben a szakaszos tenyészetből a tipikus termékkoncentráció 10 g/l etanol és 2 g/l acetát.

Ha elértük a kívánt keverési sebességet, a rendszert hagyjuk növekedni a maximális H₂-felvételig. Kívánatos, hogy a kilépő H₂-koncentráció nagyon magas legyen (tipikusan >60%), hogy biztosítsuk az etanoltermelést, miközben korlátozzuk az ecetsavtermelést. A folyékony tápközeg adagolásával ezután (az olyan rendszerek esetén, ahol szakaszos inokulumadagolást alkalmazunk tenyészet-törzsszuszpenzióból) folyamatos módra térünk át, és a gázadagolás sebességét a kívánt átfolyási sebességre fokozzuk. Egy New Brunswick Scientific Bioflo® fermentációs bioreaktorban a folyadékadagolási sebesség tipikusan 0,5 ml/perc, miközben a gáz átfolyási sebességét 24 óránként 10—15%-kal emeljük, a kívánt 125 ml/perc értékig.

Fontos, hogy a H₂ fölöslegben legyen a betáplált gázban, hogy elkerüljük a fölös ecetsavtermelést. Ahogyan a gáz átfolyási sebességét fokozzuk, a sejtszaporodás fokozódik, amíg a reaktorban a folyadékfázis tápanyagai (kalcium-pantotenát vagy kobalt) nem korlátozzák, amit a H₂-konverzió kis csökkenése jelez a kívánt termelékenységnél. A New Brunswick Scientific Bioflo® CSTR-ben ez a H₂-konverzió 10%-os csökkenéséből észlelhető, 20 g/l-nap kívánt termelékenység mellett.

Az eljárást és a reaktort ezután stacioner módon működtetjük, 15-35 g/l etanolt és 0-5 g/l acetátot termelünk, a korlátozó tápanyagok, folyadék- és gázadagolási sebesség esetenkénti kisebb utánállításával. Egy New Brunswick Scientific Bioflo® laboratóriumi fermentációs bioreaktor esetén - sejt-visszacirkuláltatás nélkül - a tipikus stacioner körülmények a következők: gáz retenciós idő (gázátáramlási sebesség/reaktor folyadéktérfogata) 20 perc, folyadék retenciós idő (folyadékátáramlási idő/reaktor folyadéktérfogata) 30 óra, keverési sebesség 900 rpm, így 92% CO-konverziót és 60% H₂-konverziót érünk el, pantotenátlimitálással.

E módszer egy másik megvalósítási módja szerint, melyben sejt-visszacirkuláltatást is végzünk, ezt a gázadagolás sebességének (emelésével) és a tápanyagkoncentrációk (csökkentésével) egyidejű beállításával végezzük. A sejt-visszacirkuláltatással működtetett New Brunswick Scientific Bioflo® CSTR esetén a gáz retenciós ideje tipikusan 8 perc, a folyadék retenciós ideje 12 óra, a sejtek retenciós ideje 40 óra, és a keverési sebesség 900 rpm. így tipikusan 92% CO-konverziót és 50% H₂-konverziót érünk el, pantotenátlimitálással.

2. példa

Gázkromatográfiás mintaelemzés

Ahhoz, hogy megfelelő termelékenységet és arányt érjük el és/vagy tartsunk fenn, a fermentációs bioreaktorból vett fermentléből időközönként mintát kell venni. A bioreaktorban levő tenyészetből 1,5 ml-nél nagyobb mintát veszünk. A mintát mikrocentrifugacsőbe helyezzük, és a csövet egy Fisher Scientific Micro 14 jelű centrifugába tesszük, a kiegyensúlyozáshoz szükséges ballaszttal. A mintát 1,5 percig 8000 rpm-mel centrifugáljuk. A felülúszó 0,500 ml mintáját egy 1,5 ml-es, gázkromatográfiás mintázáshoz tervezett fiolába visszük. Belső standardként 5 g/l n-propanol és 5 térfogat% 85%-os foszforsav ionmentesített vízzel készült 0,500 ml oldatát alkalmazzuk. A foszforsav biztosítja, hogy az összes acetát ecetsavvá alakuljon, és a gázkromatográfiával detektálásra kerüljön.

Az elkészített minta 1 μΙ-ét egy, 007 FFA Quadrex jelű, 25 mx0,53 mm méretű, alaktartó, szilícium-oxidkapillárissal felszerelt Hewlett-Packard 5890 Series II gázkromatográfba injektáljuk. Az elemzést hélium vivőgázzal, osztott gázáram módozatban, 66 ml/perc osztott gázárammal és 7,93 ml/perc injektoröblítéssel folytatjuk. Az oszlop fejnyomása 27,6 kPa, ez az oszlop vivőgázának 7 ml/perc sebességű áramlását eredményezi. A hőmérsékletprofil: 0,2 perc 75 °C, emelkedés 30 °C/perc sebességgel 190 °C-ra, és tartás 190 °C-on 5,17 percig. így a futtatási idő 8 perc. A berendezést etanolra (0-25 g/l), ecetsavra (0-25 g/l), n-butanolra (0-5 g/l) és vajsavra (0-5 g/l) kalibráljuk. A kalibráláshoz reagens tisztasági fokozatú anyagokból készített öt mintát alkalmazunk. Ha a minta kívül esik a kalibrációs koncentrációtartományon (például >25 g/l etanol), a fiolába 0,250 ml mintát és 0,250 ml ionmentesített vizet mérünk be, 0,500 ml belső standarddal, és a hígítási faktort figyelembe vesszük az elemzésnél.

HU 226 975 Β1

3. példa

Savtermelés laboratóriumi CSTR-ben sejtvisszacirkuláltatással

Egy New Brunswick Scientific Bioflo® fermentációs bioreaktort sejt-visszacirkuláltatással működtettünk, Clostridium ljungdahlii ERI2 (ATCC 55380) törzs alkalmazásával ecetsav előállítására CO, CO₂ és H₂ keverékéből. A betáplált gáz 40% H₂-t, 50% CO-ot és 10% N₂-t tartalmazott, a gáz retenciós ideje egy 1 literes reaktor esetén 7,7-8,6 perc volt. A vitaminokat, sókat és nyomelemeket tartalmazó folyékony tápközeget

2,6-2,9 óra retenciós idővel tápláltuk be. A pH-t 5,1-5,2 értékre állítottuk, a keverést 1000 rpm-mel végeztük, és a sejtek retenciós ideje körülbelül 40 óra volt. A tömegátadás (és nem a tápanyag) ilyen korlátozott körülményei között a CO-konverzió 94-98%, és a H₂-konverzió 80-97% volt. A sejtkoncentráció 4-8 g/l, és az acetáttermelés 10-13 g/l volt. Etanol nem képződött. Bár a reaktort tömegátadás korlátozásával működtettük (a gáz tenyészethez való odajutásának korlátozásával), és így termékként csak ecetsavat kaptunk, az etanoltermeléshez szolgáló, pantotenátlimitálás, kobaltlimitálás vagy H₂- vagy CO-fölösleg jelenlétének paramétereit nyomon követtük, hogy összehasonlító adatokat kapjunk arra az esetre, amikor az etanol a fő termék.

Amint a 2. táblázatban látható, az egységnyi termelt sejtre számított adagolt Ca-d-pantotenát mennyisége 1575-3150 pg/g termelt sejt volt. Hasonlóképpen az egységnyi termelt sejtre számított adagolt kobalt mennyisége 1734-3468 pg/g termelt sejt volt. A fajlagos CO-felvétel percenként 0,35-0,61 mmol/g-sejt volt. A betáplált H₂ mennyisége a konvertált CO móljainak kétszerese és a konvertált CO₂ móljainak háromszorosa összegére számítva kevesebb mint 0,46 mól volt. Vagyis a paraméterek egyike sem volt a kívánt működési tartományban, ahol a tenyészet etanolt termel.

Amint látható, pantotenátot és kobaltot nagy fölöslegben adagoltunk, amikor ecetsav volt a fő termék, tömegátadás korlátozása mellett. Ez azt jelenti, hogy a pantotenát- és/vagy kobaltszint jelentősen csökkenthető, és még mindig a pantotenát- vagy kobaltlimitálás szintje fölött leszünk. Ennek illusztrálására az 1 literes New Brunswick Scientific Bioflo® fermentációs bioreaktorba adagolt tápközeg összetételét módosítottuk, jelentősen csökkentve az adagolt kobalt mennyiségét, olyan szintre, amely éppen valamivel a kobaltlimitálás szintje fölött volt. A reaktor szintén C. ljungdahlii ERI2 törzset tartalmazott, ecetsav termeléséhez CO, CO₂ és H₂ keverékéből. A betáplált gáz 55% H₂-t, 25% CO-ot, 15% CO₂-ot és 5% CH₄-t (referenciagáz) tartalmazott, a gáz retenciós ideje 7,5-8,0 perc volt. Vitaminokat, sókat és nyomelemeket tartalmazó folyékony tápközeget adagoltunk 3,0-3,5 óra retenciós idővel, és a sejtek retenciós ideje 40 óra volt. A pH 5,0-5,3 érték, a keverés sebessége 900-1000 rpm volt. Ilyen körülmények között a CO-konverzió 95-99%, és a H₂-konverzió 94-98% volt. A sejtkoncentráció 2,5-4,0 g/l volt, és az egyedüli termékként képződött acetát 10-14 g/l volt.

A sejtgrammonként adagolt Ca-d-pantotenát mennyisége 2250-3600 pg/g termelt sejt volt. Az egységnyi termelt sejtre számított adagolt kobalt mennyisége 62,0-99,2 pg/g termelt sejt volt. A fajlagos CO-felvétel percenként 0,325-0,4 mmol/g-sejt volt. A betáplált H₂ mennyisége a konvertált CO móljainak kétszerese és a konvertált CO₂ móljainak háromszorosa összegére számítva 0,875 mól volt.

4. példa

Etanol termelése laboratóriumi CSTR-ben, pantotenátlimitálással

Egy New Brunswick Scientific Bioflo® II laboratóriumi fermentációs bioreaktort egyenáramban átfolyó CSTR-ként (sejt-visszacirkuláltatás nélkül) működtettünk, C. ljungdahlii C-01 (ATCC 55988) törzs használatával etanol termelésére CO, CO₂ és H₂ keverékéből, pantotenátlimitálással. A betáplált gáz 63,3% H₂-t, 31,4% CO-ot és 5,3% C₂H₅-t (referenciagáz) tartalmazott, a gáz retenciós ideje 27 perc volt. A vitaminokat, sókat és nyomelemeket, valamint limitált mennyiségű pantotenátot tartalmazó folyékony tápközeget az 1,55 literes reaktorba 31,4 óra retenciós idővel tápláltuk be. A pH-t 4,6-4,7 értékre állítottuk, a keverést 650 rpm-mel végeztük. Ilyen körülmények között a CO-konverzió 98%, a H₂-konverzió 83% és a sejtkoncentráció 1,5-2,0 g/l volt. Az etanoltermelés 15-19 g/l, és az acetáttermelés 1,5 g/l volt. Etanolra nézve a termelékenység 11,5-14,5 g/l-nap volt.

Az etanoltermelés paramétereinek elemzése során a pantotenátlimitálást a termelt sejtekre számított 17,7-23,6 pg/g termelt sejt értéknél történő működtetés esetén figyeltük. Ezt az értéket a 3. példa szerinti savtermelés során alkalmazott 2250-3600 pg/g termelt sejt és 1575-3150 pg/g termelt sejt értékkel vetettük össze. A betáplált kobalt mennyisége 5000-600 pg/g termelt sejt volt, ami magasabb a 3. példában alkalmazott értéknél, és biztosítja, hogy ne legyen kobaltlimitálás. A fajlagos CO-felvétel percenként 0,23-0,30 mmol/g-sejt volt. A betáplált H₂ mennyisége a konvertált CO móljainak kétszerese és a konvertált CO₂ móljainak háromszorosa összegére számítva 1,03 mól volt, és a H₂ parciális nyomása a kilépő gázban 55,7-64,8 kPa volt. Az etanoltermelést akár a fölösleges H₂, akár a pantotenát limitált jelenléte okozhatta.

Az etanol pantotenátlimitálással történő termelését egy másik New Brunswick Scientific Bioflo® II laboratóriumi fermentációs bioreaktorban is végeztük, amelyet C. ljungdahlii C-01 (ATCC 55988) törzs visszacirkuláltatásával működtettünk. A reaktorba 61,7% H₂-t, 30,6% CO-ot és 5,2% C₂H₆-t (referenciagáz) tartalmazó keveréket tápláltunk, 12,3 perc retenciós idővel. A limitált mennyiségű pantotenátot, fölös mennyiségű sókat és nyomelemeket tartalmazó folyékony tápközeget a 2,4 literes reaktorba 24,8 óra retenciós idővel tápláltuk. A sejtek visszacirkuláltatásához egy 0,2 pm pórusméretű membránt alkalmaztunk, a sejtek retenciós ideje 69 óra volt. A pH 4,6 érték és a keverés sebessége 650 rpm volt. Ilyen körülmények között a CO-konverzió

HU 226 975 Β1

90%, a H₂-konverzió 53% és a sejtkoncentráció 2,5 g/I volt. Az etanol koncentrációja 18 g/I, és az acetát koncentrációja 3 g/I volt. Etanolra nézve a termelékenység 17,4 g/l-nap volt.

Az etanoltermelés paramétereinek elemzése során (2. táblázat) az adagolt pantotenát mennyisége a termelt sejtekre számított 8,08 pg/g termelt sejt érték volt. A pantotenátlimitálással biztosítottuk, hogy az acetáttermeléshez szükséges értéknél lényegesen alacsonyabb értéknél dolgozzunk. A betáplált kobalt mennyisége 3960 pg/g termelt sejt volt. A fajlagos CO-felvétel percenként 0,33 mmol/g-sejt volt. A betáplált H₂ mennyisége a konvertált CO móljainak kétszerese és a konvertált CO₂ móljainak háromszorosa összegére számítva 1,14 mól volt, és a H₂ parciális nyomása a kilépő gázban 60,8-65,8 kPa volt. Az etanoltermelést a fölösleges H₂ jelenléte okozhatta, azonban a kilépő gáz nagy CO₂-tartalma (14,2 kPa) azt mutatja, hogy a sejtnövekedést a pantotenáttartalom korlátozta.

Egy másik kísérletben C. Ijungdahlii ERI2 törzset 1500-3600 pg/g termelt sejt mennyiségű pantotenáttal láttunk el az acetát CO, CO₂ és H₂ keverékéből történő előállítása során, amikor a reaktort nem korlátoztuk pantotenátra nézve (vagy más tényezőre nézve, kivéve a tenyészet gázzal való ellátását), így a termékben nem volt jelen etanol.

Az etanol CO, CO₂ és H₂ keverékéből C. Ijungdahlii C-01 törzs segítségével pantotenátlimitálás mellett történő előállítása során 8-24 pg/g termelt sejt mennyiségű pantotenátot adagoltunk, miközben minden más tápanyagot fölöslegben tartottunk. Ilyen körülmények között a C-01 törzs 15-19 g/I etanolt és 1,5-3,0 g/I acetátot termelt.

5. példa

Etanol termelése laboratóriumi CSTR-ben, kobaltkorlátozással

Egy New Brunswick Scientific Bioflo® II laboratóriumi fermentációs bioreaktort egyenáramban átfolyó CSTR-ként (sejt-visszacirkuláltatás nélkül) működtettünk, C. Ijungdahlii C-01 (ATCC 55988) törzs használatával etanol termelésére CO, CO₂ és H₂ keverékéből, kobaltlimitálással. A betáplált gáz 60% H₂-t, 35% CO-ot és 5% CH₄-t (referenciagáz) tartalmazott, a gáz retenciós ideje 14 perc volt. A vitaminokat, sókat és nyomelemeket (kivéve a kobaltot, amely a korlátozó tényező volt) fölöslegben tartalmazó folyékony tápközeget a 2,5 literes reaktorba 40 óra retenciós idővel tápláltuk be. A pH-t 4,9 értékre állítottuk, a keverést 650 rpm-mel végeztük. Ilyen körülmények között a CO-konverzió 91% és a H₂-konverzió 20 és 80% között változott, normális esetben azonban 55% volt. Az etanoltermelés 26 g/I és az acetáttermelés 4 g/I volt, és a sejtkoncentráció 2,5-2,0 g/I volt. Etanolra nézve a termelékenység 15,6 g/l-nap volt.

Az etanoltermelés paramétereinek elemzése során a pantotenátot a sejtszaporításnál 15,2 pg/g termelt sejt értékkel adagoltuk. Ez az érték olyan alacsony, hogy kobaltlimitálás nem biztosítható a pantotenátlimitálással szemben. A kobaltlimitálást 33,3 pg/g termelt sejt értéknél figyeltük meg, ez a szint 100-szor alacsonyabb, mint a kobaltlimitálás nélkül működtetett reaktorok esetén alkalmazott. A betáplált H₂ mennyisége a konvertált CO móljainak kétszerese és a konvertált CO₂ móljainak háromszorosa összegére számítva 0,94 mól volt. A fajlagos CO-felvétel percenként 0,37 mmol/g-sejt volt.

Az etanol kobaltlimitálással történő termelését egy CSTR-ben, C. Ijungdahlii C-01 (ATCC 55988) törzs visszacirkuláltatásával is végeztük. Ezt a kísérletet az előző példa szerinti módszerrel ellentétben a kobaltlimitálás pantotenát fölöslege jelenlétében való alkalmazásának bemutatására végeztük. A 0,2 pm pórusméretű membrán sejt-visszacirkuláltatóval felszerelt New Brunswick Scientific Bioflo® 2000 laboratóriumi fermentációs bioreaktorba 60% H₂-t, 35% CO-ot és 5% CH₄-t (referenciagáz) tartalmazó keveréket tápláltunk, 5 perc retenciós idővel. A fölös mennyiségű sókat, vitaminokat és nyomelemeket (ismét kivéve kobaltot) tartalmazó folyékony tápközeget az 1,2 literes reaktorba 16 óra retenciós idővel tápláltuk. A pH 5,1 érték és a keverés sebessége 825 rpm volt. A sejtek retenciós ideje ebben a CSTR-ben 40 óra volt. Ilyen körülmények között a CO-konverzió 83%, a H₂-konverzió 50% és a sejtkoncentráció 4,2 g/I volt. Az etanol koncentrációja 18 g/I és az acetát koncentrációja 4 g/I volt. Etanolra nézve a termelékenység 27 g/l-nap volt.

Az etanoltermelés paramétereinek elemzése során (2. táblázat) az adagolt pantotenát mennyisége a termelt sejtekre számított 85,7 pg/g termelt sejt érték volt, ami 5,5-szer magasabb érték, mint amennyit az előző reaktorban alkalmaztunk. A kobaltlimitálást 47,6 pg/g termelt sejt értéknél vizsgáltuk. A betáplált H₂ mennyisége a konvertált CO móljainak kétszerese és a konvertált CO₂ móljainak háromszorosa összegére számítva 1,03 mól volt, és a H₂ parciális nyomása a kilépő gázban 60,78 kPa volt. Az etanoltermelést a fölösleges H₂ jelenléte okozhatta, azonban a kilépő gáz nagy CO₂-tartalma (10,1-15,2 kPa) azt mutatja, hogy a sejtnövekedést a kobalttartalom korlátozta. A fajlagos CO-felvétel percenként 0,50 mmol/g-sejt volt.

6. példa

Etanol termelése laboratóriumi CSTR-ben, CO fölöslegének jelenlétében

Egy nagynyomású AUTOKLÁV™ reaktort (Buchi) CSTR-ként működtettünk, sejt-visszacirkuláltatással, C. Ijungdahlii C-01 törzs használatával etanol termelésére CO, CO₂ és H₂ keverékéből, CO-fölösleg jelenlétében 50 óra hosszat. A reaktort 172,25 kPa-nál működtettük, a betáplált gáz 57% H₂-t, 36% CO-ot és 6% C₂H₆-t tartalmazott. A gáz retenciós ideje változó, normálisan azonban 3,0 perc volt. A vitaminokat (beleértve a pantotenátot is), sókat és nyomelemeket fölöslegben tartalmazó folyékony tápközeget a 600 milliliteres reaktorba 8,2 óra retenciós idővel tápláltuk be. A sejtek retenciós ideje 18,5 óra volt, amelyet a reaktor effluensének kerámiaszűrőn történő átvezetésével kaptunk. A pH-t 4,5 értékre állítottuk, a keverést 450 rpm-mel végeztük, és a folyadék visszacirkuláltatásának aránya

HU 226 975 Β1

0,4-0,5 gpm volt. Ilyen körülmények között a gázkonverzió változó volt, a CO-konverzió normálisan 72% és a H₂-konverzió 12% volt. A sejtkoncentráció 2,7 g/l volt. Az etanoltermelés 9,9 g/l és az acetáttermelés

2,6 g/l volt. Etanolra nézve a termelékenység 29,0 g/l-nap volt.

Az etanoltermelés paramétereinek elemzése során a pantotenátot a sejtszaporításnál 97 pg/g termelt sejt értékkel adagoltuk. Ez az érték elég magas ahhoz, hogy a pantotenáttartalom ne legyen korlátozó tényező. A betáplált kobalt mennyisége a sejtszaporításnál 836 pg/g termelt sejt volt, ami szintén elég magas ahhoz, hogy a kobalttartalom ne legyen korlátozó tényező. A betáplált H₂ mennyisége a konvertált CO móljainak kétszerese és a konvertált CO₂ móljainak háromszorosa összegére számítva 1,09 mól, a H₂ parciális nyomása 162 kPa volt. A kilépő gáz nagy CO₂-tartalma (50,65 kPa) azt mutatja, hogy a H₂ fölöslege nem eredményezett etanoltermelést. A fajlagos CO-felvétel percenként 1,34 mmol/g-sejt volt, ez a szint CO-fölösleget jelent az etanoltermelés biztosítására.

Az etanol CO-fölösleg alkalmazásával történő termelését egy másik kísérletben is vizsgáltuk, C. Ijungdahlii C-01 törzs alkalmazásával, AUTOKLÁV™ reaktorban (Buchi), szintén sejt-visszacirkuláltatással, 24 óra hosszat. Ebben a kísérletben egy 600 ml-es reaktorba 15,8% H₂-t, 36,5% CO-ot, 38,4% N₂-t és 9,3% CO₂-ot tartalmazó keveréket tápláltunk, 1,4 perc retenciós idővel. A reaktor nyomását 275,6 kPa értéken tartottuk. A fölös mennyiségű sókat, vitaminokat és nyomelemeket tartalmazó folyékony tápközeget 4,8 óra retenciós idővel tápláltuk be, a sejtek retenciós ideje 19,2 óra volt, amelyet az effluens kerámiaszűrőn való átvezetésével kaptunk. A pH 4,5 érték, a keverés sebessége 1000 rpm és a folyadék visszacirkuláltatási aránya 0,4-0,5 gpm volt. Ilyen körülmények között a CO-konverzió 71,6% és a H₂-konverzió 11,8% volt. A sejtkoncentráció 7,1 g/l volt, a termelt etanol koncentrációja 12,0 g/l és az acetát koncentrációja 2,7 g/l volt. Etanolra nézve a termelékenység 60 g/l-nap volt.

Az etanoltermelés paramétereinek elemzése során (2. táblázat) az adagolt pantotenát mennyisége a sejtszaporításnál 294 pg/g termelt sejt érték volt. Ez a szint messze meghaladja azt a minimális szintet, amely a pantotenátlimitálással történő etanoltermeléshez szükséges. A betáplált kobalt mennyisége 735 pg/g termelt sejt érték volt, amely szintén olyan mennyiség, ami a kobalt fölöslegben való jelenlétét biztosítja. A betáplált H₂ mennyisége a konvertált CO móljainak kétszerese és a konvertált CO₂ móljainak háromszorosa összegére számítva 0,3 mól volt. A fajlagos CO-felvétel percenként 0,67 mmol/g-sejt volt, amely szintén olyan mennyiség, ami biztosítja, hogy a CO fölöslegben legyen az etanoltermelés elősegítésére.

7. példa

Etanol termelése H₂ fölöslegének jelenlétében

Egy New Brunswick Scientific Bioflo laboratóriumi fermentációs bioreaktort egyenáramban átfolyó CSTRként (sejt-visszacirkuláltatás nélkül) működtettünk, C.

Ijungdahlii C-01 (ATCC 55988) törzs használatával etanol termelésére CO, CO₂ és H₂ keverékéből, H₂-fölösleg jelenlétében. A betáplált gáz 77% H₂-t, 19% CO-ot és 4% CH₄-t (referenciagáz) tartalmazott, a gáz retenciós ideje 30 perc volt. A vitaminokat, sókat és nyomelemeket fölöslegben tartalmazó folyékony tápközeget a reaktorba 36 óra retenciós idővel tápláltuk be. A pH-t 5,0 értékre állítottuk, a keverést 1000 rpm-mel végeztük. Ilyen körülmények között a CO-konverzió 97-99% és a H₂-konverzió 60-80% volt. A sejtkoncentráció 0,8-1,0 g/l, az etanoltermelés 10 g/l és az acetáttermelés 3,3 g/l volt. Etanolra nézve a termelékenység

6,7 g/l-nap volt.

Az etanoltermelés paramétereinek elemzése során a pantotenátot a sejtszaporításnál 900-1125 pg/g termelt sejt értékkel adagoltuk, ezzel biztosítottuk, hogy fölös mennyiségű pantotenát legyen jelen. Hasonlóképpen, a betáplált kobalt mennyisége a sejtszaporításnál 991-1239 pg/g termelt sejt érték volt, ami szintén azt biztosította, hogy fölös mennyiségű kobalt legyen jelen. A fajlagos CO-felvétel percenként 0,28-0,35 mmol/g-sejt volt, ez olyan szint, ami nem jelent elég fölösleget ahhoz, hogy etanoltermelést okozzon. A betáplált H₂ mennyisége a konvertált CO móljainak kétszerese és a konvertált CO₂ móljainak háromszorosa összegére számítva 1,96 mól volt, azaz 1,0 fölötti arány, ahol fölösleges H₂ van jelen, ami az etanoltermelést szabályozhatja. A H₂ parciális nyomása a kilépő gázban 70,9-88,1 kPa, és a H₂ és CO₂ parciális nyomásának aránya a kilépő gázban 65 volt. így a reaktor a H₂ fölöslegének jelenléte következtében etanolt termelt. Egy másik kísérletben egy nagynyomású AUTOKLÁV™ reaktort (Buchi) CSTR-ként működtettünk, sejt-visszacirkuláltatással, C. Ijungdahlii C-01 törzs alkalmazásával etanol termelésére CO, CO₂ és H₂ keverékéből, H₂-fölösleg jelenlétében. A betáplált gáz 81% H₂-t, 16% CO-ot és 3% CH₄-t (referenciagáz) tartalmazott, a gáz retenciós ideje 2,21 perc volt. A vitaminokat, sókat és nyomelemeket fölöslegben tartalmazó folyékony tápközeget 8,91 óra retenciós idővel tápláltuk a reaktorba. A sejtek retenciós ideje 22,7 óra volt. A pH-t 4,5 értékre állítottuk, a keverést 800 rpm-mel végeztük. Ilyen körülmények között a CO-konverzió 91,5% és a H₂-konverzió 43,4% volt. A sejtkoncentráció 5,5 g/l és az acetátkoncentráció 2,85 g/l volt. Etanolra nézve a termelékenység 215-240 g/l-nap volt.

Az etanoltermelés paramétereinek elemzése során a pantotenátot a sejtszaporításnál 46 pg/g termelt sejt értékkel adagoltuk, ami pantotenátlimitálást iniciálhat. A betáplált kobalt mennyisége a sejtszaporításnál 460 pg/g termelt sejt volt, ami elég magas ahhoz, hogy a kobalttartalom ne legyen korlátozó tényező. A fajlagos CO-felvétel percenként 1,68 mmol/g-sejt volt, ez a szint arra utalhat, hogy CO-fölösleg volt jelen, ha ezt nem támogatta a magas, percenként 4,14 mmol/g-sejt H₂-felvétel, ami azt jelzi, hogy a H₂-konverzióra nézve szubsztrátgátlás nem következett be. A betáplált H₂ mennyisége a konvertált CO móljainak kétszerese és a konvertált CO₂ móljainak háromszorosa összegére

HU 226 975 Β1 számítva 5,67 mól volt, ami lényegesen több annál, mint amennyi a H₂-fölösleg jelenlétére utaló 1,0 arány. A kilépő gázban a H₂ parciális nyomása 264,4 kPa, és a H₂ és CO₂ parciális nyomásának aránya 10,9 volt. A reaktor így, a H₂-fölösleg jelenlétének eredményeképpen etanolt termelt.

A 3-7. példákban bemutatott módszerek paramétereinek és eredményeinek összehasonlítását a 2. táblázatban foglaltuk össze.

8. példa

A termék eltolódása C. Ijungdahlii ERI2, C-01 és

PETC törzsek alkalmazása esetén, a tápközeg változtatásával

A találmány szerinti módszert bármely C. Ijungdahlii törzsre alkalmazhatjuk. Az ERI2, C-01 és PETC törzsek alkalmazásával végzett tápközeg-manipulációs kísérletek eredményét a 3. táblázatban foglaltuk össze. E kísérletek célja annak bemutatása volt, hogy mindegyik törzs esetén eltolható az ecetsavtermelés az etanoltermelés irányába, csupán a tápközeg manipulálásával. A tenyészet számára tehát fölös mennyiségű tápközeget biztosítottunk (beleértve a pantotenátot és a kobaltot is), hogy fő termékként ecetsavat termeljen, majd a pantotenát vagy a kobalt mennyiségét korlátoztuk, hogy fő termékként etanol képződjön. Hangsúlyozzuk, hogy e kísérletek egyetlen célja annak bemutatása volt, hogy a tápközeg manipulálása minden törzs esetén a termék eltolódását eredményezheti. Magas termékkoncentrációk és magas termelékenységek elérése tehát nem volt célja a kísérleteknek.

A reaktort egyenáramban átfolyó CSTR-ként (sejtvisszacirkuláltatás nélkül) működtettük minden tenyésztési kísérletben. Normálesetben a gáz retenciós idejét 50 percre, a folyadék retenciós idejét 40 órára és a keverés sebességét 1000 rpm-re állítottuk be. Ezeket a körülményeket a törzsek összehasonlításához, és nem a nagy termelékenység eléréséhez választottuk meg.

Amint a 3. táblázatból látható, az ERI2 törzs esetén a tápközegen öt változtatást végeztünk, ami a fő termékként kapott etanol és ecetsav közötti ide-oda tolódást eredményezte. Mind a pantotenátlimitálás, mind a kobaltlimitálás etanoltermelést eredményezett ennél a törzsnél. A C-01 törzs esetén háromféle tápközeg-manipulációt végeztünk, itt szintén az etanoltermelés elősegítésére szolgáló mechanizmusnak bizonyult mind a pantotenátlimitálás, mind a kobaltlimitálás. A PETC törzs esetén csak egyféle manipulációt hajtottunk végre, az etanoltermelést kobaltlimitálással segítettük elő. Mindegyik törzs magas H₂-konverziót mutatott, amikor inkább ecetsavat, mint etanolt termelt fő termékként. Ez azért lehetséges, mert az ecetsavtermelés tömegátadás-korlátozás közben megy végbe (korlátozott mennyiségű gáz jut a tenyészethez), míg etanol akkor képződik, amikor a tápanyagokat korlátozzuk, és így fölös mennyiségű gáz van jelen, ami negatív módon befolyásolhatja a gázkonverziót. Kis mennyiségű acetát mindig jelen van a termékáramban, ha a fő termék etanol. Ha azonban az ecetsav a fő termék, etanol rendszerint nincs jelen mérhető koncentrációban. Amikor a fő terméket a tápközeg manipulálásával etanol felől ecetsav irányába toltuk el, úgy találtuk, hogy nagyon nehéz az etanolnyomokat teljesen eltávolítani. Az etanol teljes eltávolítása csak akkor következett be, amikor néhány héten át dolgoztunk ecetsavtermelést elősegítő tápközegen.

9. példa

Stacioner működtetés sejt-visszacirkuláltatással és anélkül

Az etanol CO, CO₂ és H₂ keverékéből történő előállításának végső kereskedelmi célja az, hogy állandó magas etanolkoncentrációt érjünk el, magas etanol/acetát aránnyal és magas termelékenységgel. A 4. táblázatban összefoglaltuk a stacioner állapot adatait az etanol CO-ban gazdag gázból történő előállításához, amelynek során 20% H₂-t, 65% CO-ot, 10% CO₂-ot és 5% CH₄-t tartalmazó gázt és C. Ijungdahlii C-01 törzset alkalmaztunk egyenáramban átfolyó CSTR-ben (sejt-visszacirkuláltatás nélkül). A táblázatban „GRT” jelentése gáz retenciós idő (a folyadék térfogatának és a bevezetett gáz áramlási sebességének az aránya), „LRT” jelentése folyadék retenciós idő (a folyadék térfogatának és a folyadék átfolyási sebességének az aránya) és „XRT” jelentése sejt retenciós idő (a sejtek átlagos tartózkodási ideje a reaktorban). Amint a 4. táblázatból látható, 17,5-33 g/l etanolkoncentrációt és 14,4-21,1 g/l-nap etanoltermelékenységet kaptunk.

Hasonló eredményeket kaptunk etanol előállítása esetén olyan gázból, amely CO-ban gazdag. A C. Ijungdahlii C-01 törzs alkalmazásával sejt-visszacirkuláltatás nélkül végzett kísérletben - amelynek eredményeit az 5. táblázatban foglaltuk össze - alkalmazott gáz összetétele: 16% H₂, 27% CO, 6% CO₂ és 51% N₂. A kapott etanolkoncentráció 11-26 g/l volt, 2,0-5,0 g/l acetát melléktermékkel. Az etanoltermelékenység 11,1-20,1 g/l-nap volt. A táblázatban jelentése: sejtkoncentráció a száraz sejttömeg alapján.

Végül a 6. táblázatban összefoglaltuk egy stacioner művelet adatait olyan gáz alkalmazásával, amelynek összetétele: 50% H₂, 45% CO és 5% CH₄, CSTR-ben C. Ijungdahlii 0-52 (ATCC 55989) törzs alkalmazásával sejt-visszacirkuláltatás nélkül. A kapott etanolkoncentráció 18-23,5 g/l, acetátkoncentráció 3,0-5,7 g/l, az etanoltermelékenység 21,1-39,0 g/l-nap.

10. példa

Magas etanoltermelékenység, CSTR-ben sejtvisszacirkuláltatással, nyomás alatt

Egy nagynyomású AUTOKLÁV™ reaktort (Buchi)

CSTR-ként működtettünk, sejt-visszacirkuláltatással, C. Ijungdahlii C-01 törzs használatával etanol termelésére CO, CO₂ és H₂ keverékéből. A reaktort

206,7 kPa-nál működtettük, a betáplált gáz 62% H₂-t, 31% CO-ot és 5% C₂H₆-t tartalmazott. A gáz retenciós ideje (atmoszferikus alapon) 1,14 perc, ténylegesen

3,5 perc volt. A vitaminokat, sókat és nyomelemeket fölöslegben tartalmazó folyékony tápközeget a 600 millili17

HU 226 975 Β1 teres reaktorba 3,6 óra retenciós idővel tápláltuk be. A pH-t 4,5 értékre állítottuk, a keverést 825 rpm-mel végeztük. Ilyen körülmények között a sejtkoncentráció 8 g/l, a CO-konverzió 90% és a H₂-konverzió 40% volt. A termékáram 20 g/l etanolt és 2,75 g/l acetátot tartalmazott. Etanolra nézve a termelékenység 150 g/l-nap volt.

Egy másik nagynyomású AUTOKLÁV™ reaktort (Buchi) CSTR-ként működtettünk, sejt-visszacirkuláltatással, C. Ijungdahlii C-01 törzs használatával, 600 kPa-nál, a betáplált gáz 55% H₂-t, 30% CO-ot, 5% CH₄-t és 10% CO₂-ot tartalmazott. A gáz retenciós ideje (atmoszferikus alapon) 1 perc, ténylegesen 6,0 perc volt. A vitaminokat, sókat és nyomelemeket fölöslegben tartalmazó folyékony tápközeget 1,62 óra retenciós idővel tápláltuk a reaktorba. A sejtek retenciós ideje 24 óra volt, a pH-t 4,5 értékre állítottuk, a keverést 800 rpm-mel végeztük. Ilyen körülmények között a sejtkoncentráció 2,0 g/l, a CO-konverzió 95% és a H₂-konverzió 60% volt. A termékáram 25 g/l etanolt és 3 g/l acetátot tartalmazott. Etanolra nézve a termelékenység 369 g/l-nap volt.

11. példa

Kiindulás tenyészet-törzsszuszpenzióból, H₂fölösleg jelenlétében

A szakaszosan alkalmazott, tenyészet-törzsszuszpenzióból származó inokulummal való indulás biztosítja az egészséges, szennyezéstől mentes inokulumot, azonban beoltási módszerként nem mindig sikeres a meglehetősen alacsony alkalmazott sejtsűrűség miatt, különösen ha a működési paramétereket, például a gázadagolást és a keverés sebességét túl gyorsan emeljük hamarosan az inokulálás után.

Ebben a példában bemutatjuk a szakaszosan alkalmazott, tenyészet-törzsszuszpenzióból származó inokulummal való indulást. A reaktor inokulálásához alkalmazandó tenyészet-törzsszuszpenzió előállításához C. Ijungdahlii C-01 (ATCC55988) törzset 150 ml-es szérumpalackokban, CO, CO₂ és H₂ keverékében, 1 g/l élesztökivonatot és 1 g/l triptikázt, valamint sókat és vitaminokat tartalmazó tápközegen növesztettünk. A 0,4 ml/l mennyiségben alkalmazott vitaminkoncentrátum összetétele: 50,5 mg/l kalcium-pantotenát, 20,6 mg/l d-biotin és 50,6 mg/l tiamin-HCI vizes oldatban. A palackokat 37 °C-on, rázatóinkubátorban inkubáltuk. A tenyészeteket exponenciális növekedési fázisig növesztettük, vizuális megfigyelés alapján. Az egyes inokulálások alkalmával mintegy 90 ml tenyészet-törzsszuszpenziót vittünk át a szérumpalackokból 1 liter tápközegbe, ami 9 térfogat%-os inokulálást képvisel. Egy sikeres inokulálást az alábbiakban ismertetünk. A vázolt módszer néhányszor ismételhető, a sikeres inokulálás biztosítása érdekében.

Sikeres inokuláláshoz 90 ml/l inokulumot adtunk 1 liter alaptápközeghez (1. táblázat), amely 0,4 ml/l vitaminokat és sókat tartalmazott (t=0). A keverési sebesség 240 rpm, pH=5,3, hőmérséklet 38,5 °C, és a gáz retenciós ideje (folyamatos gázáramlás) 110 perc volt. A betáplált gáz 62% H₂-t, 31% CO-ot és 7%

C₂H₆-t tartalmazott. 13 óra múlva (t=13 óra) némi CO-konverzió volt megfigyelhető, és a t=23 óra időpontban a keverési sebességet 240 rpm-ről 300 rpm-re emeltük. A gáz retenciós idejét a t=27 óra időpontban 100 percre, míg a t=46 óra időpontban tovább csökkentettük. A keverési sebességet szintén emeltük 100 rpm-es fokozatokban a t=28 óra, 59 óra, 72 óra és 85 óra időpontokban.

A t=110 óra időpontban a rendszer 80 perc gáz retenciós idővel és 600 rpm keverési sebességgel működött. A sejtkoncentráció 0,5 g/l és a CO-konverzió 35% volt. H₂-konverzió még nem volt, azonban kis mennyiségű etanol és acetát (-1 g/l mindegyikből) felszaporodott a szakaszos tenyészlében. Az eddig tett erőfeszítések a reaktorban a sejtszaporodást szolgálták.

A tápközeg adagolását a t=120 óra időpontban kezdtük meg, 0,4 ml/perc sebességgel, az alaptápközegnek megfelelő koncentrációval. Ezután megkezdtük a gázadagolás sebessége, keverés sebessége és tápközeg-adagolás sebessége emelésének programját, miközben gondosan ügyeltünk, hogy a rendszerben H₂-fölösleget tartsunk fenn. A t=210 óra időpontra az etanol koncentrációja 17 g/l, az acetátkoncentráció 1 g/l, a sejtkoncentráció 1,6 g/l, a CO-konverzió közel 100% és a H₂-konverzió 90% volt. A termelékenység etanolra nézve elérte a 11,4 g/l-nap értéket.

Ismét elkezdtük a gázadagolás sebességének fokozatos emelését. Ezzel párhuzamosan a vitaminkoncentrációt is emeltük (lásd az 1. táblázatot) 0,7 ml/l tápközeg értékre. A t=610 óra időpontban a reaktor 20 g/l etanolt és körülbelül 2 g/l acetátot termelt. A CO-konverzió közel 100% és a H₂-konverzió 85% volt. A termelékenység etanolra nézve 14 g/l-nap volt.

12. példa

Indulás meglevő CSTR-ből származó inokulummal

Egy CSTR folyamatos, egy másik működő CSTRből származó inokulummal történő indítása sokkal gyorsabb és megbízhatóbb módszer, mint a tenyészettörzsszuszpenziókból szakaszosan történő indítás. Egy C. Ijungdahlii C-01 (ATCC 55988) törzset tartalmazó CSTR-t, amelyben már majdnem megszűnt az etanoltermelés, és amely folyékony termékként 2-3 g/l etanolt, 7-8 g/l acetátot és körülbelül 0,3 g/l butanolt termelt, újraindítottunk egy másik CSTR-ből származó folyamatos inokulummal.

A másik CSTR, amelyből az inokulum származott, körülbelül 17 g/l etanolt és 1-2 g/l acetátot termelt, és 25 perc gáz retenciós idővel, 32 óra folyadék retenciós idővel, 650 rpm keverési sebességgel működött,

38,5 °C-on, pH=4,66 értéknél. A sejtkoncentráció

1,7 g/l, a CO-konverzió lényegében véve 100% és a H₂-konverzió 85% volt.

A folyamatos inokulumadagolást indítottuk (t=0), és ekkor a keverési sebességet 500 rpm-re csökkentettük, míg a gáz retenciós idejét 38 percre állítottuk. A termelő reaktorból származó effluens (0,5 ml/perc) szolgált inokulumként az inokulálandó CSTR-hez, néhány órán át tartó folyamatos inokuláláshoz. A t=5 óra időpontra (5 órával a folyamatos inokulálás megkezdé18

HU 226 975 Β1 se után) ellenőriztük a gázkonverziót, és a keverési sebességet 700 rpm-re emeltük. A folyamatos inokulálást a t=28 óra időpontban kikapcsoltuk. A gázkonverzió folyamatosan javult, ami lehetővé tette a gázadagolás sebességének fokozását (a gáz retenciós idő csökkentését) és a keverési sebesség 750 rpm-re való növelését. A t=30 óra időpontban a CO-konverzió 95% és a H₂-konverzió 80% volt. Az etanolkoncentráció 13 g/l, az acetátkoncentráció 1,5 g/l volt, és jó 100 órán át 1,4 g/l értéken állandósult. Ezen idő alatt a termelékenység etanolra nézve 10-15 g/l-nap volt.

13. példa

A módszer súlyos működési zavarának rendbehozatala

C. Ijungdahlii C-01 törzset tartalmazó, folyamatos gáz- és tápközeg-betáplálással és sejt-visszacirkuláltatással működtetett, stacioner módon 15-35 g/l etanolt és 0-5 g/l acetátot termelő (például az 1. példa szerinti) CSTR működésében az eljárási körülményekben - például a reaktor mechanikai problémái miatt - bekövetkezett, előre nem várt változások miatt zavar állhat be. A reaktorrendszer zavara lehet kisebb mértékű, például a gázadagolás sebességének rövid ideig történő emelkedése, ami rövid ideig tartó szubsztrátgátlást okoz, vagy pedig nagyobb mérvű, például a gázadagolás sebességének hosszabb ideig tartó növekedése, ami esetleg több ecetsav termeléséhez vagy molekuláris ecetsav hatására fellépő súlyosabb termékgátláshoz vezet.

Rövid ideig tartó zavarok könnyen korrigálhatók oly módon, hogy a paramétereket csupán újraállítjuk (például a gázadagolás sebességét visszaállítjuk az eredeti szintre), és megfigyeljük a reaktorban bekövetkező változásokat, annak biztosítására, hogy a zavar ne okozzon hosszabb ideig fennálló problémákat.

Az ecetsav hatására fellépő termékgátlás azonban súlyosabb probléma. Ha a tenyészet fölösleges mennyiségű ecetsavat termel a hosszú ideig fennálló szubsztrátgátlás, a fölös tápközeg-adagolás, CO₂ felszaporodása vagy különféle mechanikai problémák következtében, először a fölös ecetsav következtében fellépő problémát kell korrigálni. A fölös mennyiségű ecetsavat, amely gyorsan termékgátláshoz vezet, kiiktatjuk a rendszerből, oly módon, hogy fokozzuk a folyadékadagolást az ecetsavnak a rendszerből történő kimosása céljából (ami sajnos egyúttal etanol eltávolításával is jár). Ha az acetátkoncentráció már 3-5 g/l alatt van, a folyadékadagolás sebességét visszaállítjuk, és a reaktort újra H₂-fölösleg, vagy pedig vitamin- vagy kobaltlimitálás alá helyezzük (sejt-visszacirkuláltatással vagy anélkül). A reaktor visszaállítása magában foglalja a gázadagolás sebességének a csökkentését is, hogy megelőzzük a szubsztrátgátlást és/vagy a keverés sebességének a csökkentését, mielőtt a sejtek kimosódása és lízise bekövetkezne. A keverés és a gázadagolás sebességét az 1. példában megadott mértékre állítjuk.

Egy konkrét esetben egy C. Ijungdahlii C-01 törzset tartalmazó, sejt-visszacirkuláltatással működtetett, CO,

CO₂ és H₂ keverékéből etanolt termelő CSTR mechanikai problémák következtében elkezdett ecetsavat termelni. A 2100 ml-es reaktorba 62% H₂-t, 31% CO-otés 7% C₂H₆-t tartalmazó gázt adagoltunk 15 perc retenciós idővel, és 600 rpm keverési sebességgel 4,86 pH-nál működtettük. A folyadék retenciós ideje 23 óra, és a sejtek retenciós ideje 68 óra volt. A folyékony tápközegben, amely sókat és vitaminokat tartalmazott, literenként 0,4 ml B-vitamin-oldat (50,5 mg/l kalcium-pantotenátot, 20,6 mg/l d-biotint és 50,6 mg/l tiamin-HCI-ot tartalmazó vizes oldat) volt jelen (lásd a

2. táblázatot). Az etanolkoncentráció 7 g/l-re esett, miközben az acetátkoncentráció 7 g/l-re emelkedett, ami olyan állapot, amely se nem stabil a reaktor működése szempontjából, se nem gazdaságos az etanol termeléséhez. A sejtkoncentráció 2,4 g/l volt, a CO-konverzió 85%-os és a H₂-konverzió 25%-os volt.

A reaktor működésének rendbehozatalához alkalmazott stratégia abban állt, hogy először igen jelentősen csökkentettük a gázadagolás sebességét, majd fokozatosan korrigáltuk a működést fölös H₂ jelenlétében. A folyadékadagolást nem csökkentettük a termékgátlás megszüntetésére, mert az acetátkoncentráció nem volt túlságosan magas. Ehelyett a gázadagolás csökkentésével és azután fölös H₂ jelenlétében való működtetéssel hagytuk, hogy az acetátkoncentráció fokozatosan csökkenjen a nem gátló szintre. A reaktor rendbehozatalához alkalmazott konkrét módszert az alábbiakban ismertetjük.

A sejt-visszacirkuláltatást kikapcsoltuk, és a gázadagolást 70%-kal csökkentettük 62 perc gáz retenciós idő eléréséig, miközben a folyadék retenciós idejét enyhén emeltük 23 óráról 30 óra retenciós időre (t=0). A tápközeg vitaminkoncentrációját nem változtattuk. A gázadagolás ilyen változtatásával a CO-konverzió 98%-ra és a H₂-konverzió 80%-ra emelkedett. Még fontosabb, hogy a rendszerben H₂-fölösleg volt, amint a kilépő gázban a CO₂ 19%-ról 5%-ra történt csökkenése mutatta. A H₂ fölöslegének megjelenésével az acetátkoncentráció csökkent, és az etanolkoncentráció emelkedett. A t=66 óra időpontban (66 órával a sejtvisszacirkuláltatás kikapcsolása után) például az acetátkoncentráció 4 g/l-re esett, és az etanolkoncentráció enyhén, 7,5 g/l-re emelkedett.

A H₂-fölösleg jelenléte (és a csökkent acetátkoncentráció) azután lehetővé tette a gázadagolás sebességének emelését, először lassan, majd gyorsabban. A t=215 óra időpontban a gáz retenciós ideje 29 perc, az etanolkoncentráció 12 g/l és az acetátkoncentráció 3 g/l volt. A termelékenység etanolra nézve 8 g/l-nap volt. A kilépő gázban 6% CO₂ volt jelen, a CO-konverzió 98% és a H₂-konverzió 80% volt. A t=315 óra időpontban az etanolkoncentráció 16 g/l és az acetátkoncentráció 4 g/l volt, szintén jó konverziófokkal és 20 perc gáz retenciós idővel. A termelékenység etanolra nézve 11 g/l-nap volt. A t=465 óra időpontban az etanolkoncentráció 20 g/l értéket ért el, és az acetátkoncentráció 3,5-4 g/l volt. A termelékenység etanolra nézve 16 g/l-nap volt. A gáz retenciós ideje 16 percre esett, a CO- és H₂-konverzió 95%, illetve 73% volt. Ezt

HU 226 975 Β1 az állapotot közel 200 óra hosszat sikerült tartani, folyamatos működtetés mellett, ami azt mutatta, hogy a reaktorrendszer működési zavarát sikerült kiiktatni, és az etanoltermelő képesség rendbe jött, és a rendszer lényegében véve visszatért az előző működési feltételekhez.

14. példa

Etanol termelése CO-túladagolással

Egyszerű kísérletet folytattunk egy nagynyomású, kevert, folyamatos, sejt-visszacirkuláltatással működtetett tankreaktorban annak bemutatására, hogy az ecetsavtermelés nagy CO-koncentrációval az etanoltermelés irányába eltolható. A kísérlet előtt a C. Ijungdahlii C-01 törzset tartalmazó reaktort 137,8-172,25 kPa nyomáson, 57% H₂-t, 36% CO-ot és 7% C₂H₆-t tartalmazó gáz betáplálással működtettük. A gáz retenciós ideje 2 percnél kisebb, a folyadék retenciós ideje 28 óra, a keverés sebessége 600 rpm és a hőmérséklet 38 °C volt. Ilyen körülmények között a CO-konverzió változó, átlagosan 85%, és a H₂-konverzió változó, átlagosan 2% volt. A sejtkoncentráció körülbelül 2,5 g/l volt, és a termékáram 9 g/l etanolt és 3 g/l acetátot tartalmazott.

Első lépésben próbaképpen a gáz retenciós idejét növeltük, hogy CO-fölösleg ne legyen jelen. A nyomást 158,5-165,4 kPa értéken tartottuk. A pH-t elég hosszú ideig figyeltük ahhoz, hogy stabilan a normál működési tartományban, 4,5-4,6 értéken legyen. Ezután tiszta CO-ot kevertünk a szokásosan betáplált gázhoz, így 47% H₂-t, 47% CO-ot és 6% C₂H₆-t tartalmazó keveréket adagoltunk, 2,3 perc retenciós idővel. Ezután az idő függvényében figyeltük a reaktorban a pH-t, valamint a kilépő gáz és a termékáram összetételét.

A 7. táblázatban látható a pH-változás és a termék összetétele az idő függvényében, a hozzáadott CO rendszerbe történő adagolásától kezdődően. A CO adagolásától számított 30 perc múlva a pH 5,25 értékre emelkedett, és a termék 1,54 g/l (0,0257 mol/l) acetátot és 1,12 g/l (0,0243 mol/l) etanolt tartalmazott. A pH-változás a szabad ecetsav etanollá történő változásának a következménye. E változást a CO-konverzió 91%-ról 71%-ra való csökkenése kísérte. A tenyészet visszacirkuláltatásának 0,4 gpm-ről 0,15 gpm-re való csökkentésével a pH értéke csökkent, de az etanol- és az acetátkoncentráció megmaradt.

A CO adagolása után ötven perccel az etanolkoncentráció 11,29 g/l és az acetátkoncentráció 1,75 g/l volt. Ekkor a fölös CO adagolását kikapcsoltuk, ezért az etanolkoncentráció és a pH elkezdett esni, míg az acetátkoncentráció emelkedni. A pH csökkenése az etanol molekuláris ecetsavvá történő alakulásának volt a következménye. A CO túladagolásának hatására bekövetkező etanol/ecetsav eltolódás tehát reverzibilis.

15. példa

A víz cirkuláltatása az acetáttermelés minimalizálására

A víz visszacirkuláltatása a fermentáló bioreaktorba az etanol kinyerésére végzett desztilláció után azért fontos, hogy minimalizáljuk az effluenstermelést, és maximalizáljuk az etanolkihozatalt, ugyanakkor korlátozzuk az ecetsavtermelést. Úgy találtuk, hogy a desztillálás a leggazdaságosabb módszer arra, hogy a reaktorban kapott 15-35 g/l-es etanolt 95%-os etanollá koncentráljuk. Utána még molekulaszűrővel történő adszorpciót végzünk az etanol további, kívánt koncentrációra való töményítésére. A desztillálás során tejtermékként 95%-os vizes etanolt kapunk. A vizet maradékként kapjuk a desztillálás során. A maradék tartalmazza a fermentáció során a reaktorban képződött (3-5 g/l acetát) ecetsavat és a fermentáció során el nem használt, illetve a desztillációban hőhatásra elbomlott tápanyagokat, így a nyomelemeket és más anyagokat. A tápanyagok visszatáplálása csökkenti a kezelendő effluens és később a fermentációs bioreaktorba adagolandó tápanyagok mennyiségét. Az acetát visszacirkuláltatása megakadályozza további ecetsav képződését azzal, hogy egyensúlyt alakít ki az etanol és az ecetsav között. így a víz visszacirkuláltatásával nettó ecetsav nem képződik. 3-5 g/l-nél több acetát visszacirkuláltatása ecetsavgátlást okozhat a reaktorban. így a visszacirkuláltatott acetátot tartalmazó víz hatására a CO, CO₂ és H₂ szubsztrát egyetlen termékként etanollá konvertálható.

A 8. táblázat egy olyan gáz fermentálásának eredményét mutatja, amely 50% CO-ot, 45% H₂-t és 5% CH₄-t tartalmazott, C. Ijungdahlii 0-52 törzs felhasználásával és víz visszacirkuláltatásával. E kísérletekben a sejt-visszacirkuláltatásra alkalmazott szűrőn végzett szűréssel kapott permeátumot vittük desztillációra. Az etanol eltávolítása után a vizet 0,2 pm-es szűrőn átszűrtük, hogy a kicsapódott melléktermékeket kiszűrjük. A visszacirkuláltatott víz és a reaktorba betáplált összes víz (tápközeg) aránya ezekben a kísérletekben 25-100% volt. A 100% visszacirkuláltatott vízzel végzett kísérlet közel 500 óra hosszat vagy körülbelül 20 folyadék retenciós időn át tartott. A 100% vízvisszacirkuláltatással nettó ecetsav nem termelődött. Valójában kevés ecetsav végül is elfogyott. A termelékenység etanolra nézve 12-27 g/l-nap volt.

16. példa

Kétfokozatú CSTR rendszer pantotenátadagolással a növesztési fokozatban A növesztési fokozatban a megfelelő pantotenátbetáplálás változó, amelyet optimalizálni kell. Egy tipikus, C. Ijungdahlii C-01 törzset tartalmazó növesztési fokozatú reaktorral kapott eredményeket ismertettünk a 11. és 12. példában, azzal az eltéréssel, hogy egy kicsivel több ecetsav termelődne a reaktorban, mivel további pantotenátot vagy kobaltot adagolunk a növesztési fokozatban, hogy egészséges és stabil tenyészetet biztosítsunk. Az alkalmazott vitaminkoncentráció 0,7-0,8 ml/l tápközeg, 50,5 mg/l kalcium-pantotenátot, 20,6 mg/l d-biotint és 50,6 mg/l tiamin-HCI-ot tartalmazó vizes oldatból. A sejt-visszacirkuláltatással működtetett, termelési fokozatú CSTR-t a növesztési fokozatú reaktorból származó effluenssel tápláljuk, és így fő termékként etanolt kapunk. A reaktorba adagolt pantotenát kon20

HU 226 975 Β1 centrációja sokkal alacsonyabb, mint a növesztési fokozat esetén, csupán 0,1-0,2 ml összes vitamin a tápközeg literjeire számítva, 50,5 mg/l kalcium-pantotenátot,

20,6 mg/l d-biotint és 50,6 mg/l tiamin-HCI-ot tartalmazó oldatból. A gáz retenciós ideje a termelési fokozatban 11-30 perc, a folyadék retenciós ideje körülbelül 20 óra, a sejtek retenciós ideje 30-50 óra, a keverés sebessége 800-900 rpm. A pH értéke 5,0, és a hőmérséklet 38 °C. Ha a reaktor elérte a stacioner állapotot, a gáz retenciós idejét állandó 11 perc értéken tartjuk, a folyadék retenciós idejét 19 óra értékre állítjuk, a sejtek retenciós idejét állandó 37 óra és a keverés sebességét 900 rpm értéken tartjuk. A CO-konverzió átlagosan 96% és a H₂-konverzió átlagosan 60%. Az etanolkoncentráció 25-30 g/l, körülbelül 3 g/l ecetsavtartalommal. A termelékenység etanolra nézve 31,6-37,9 g/l-nap.

17. példa

A fermentációs paraméterek szabályozása a limitáló, alacsony kalcium-pantotenátkoncentrációhoz való akklimatizálódás elkerülésére A tenyészetnek a limitáló, alacsony kalcium-pantotenát-koncentrációhoz való akklimatizálódását a bioreaktorban úgy kerüljük el, hogy a fermentációs paramétereket (gázadagolás, folyadékadagolás és keverés sebessége, H₂ parciális nyomása) szabályozzuk, miközben elkerüljük a nagyobb változásokat a tápközegben, ehelyett viszonylag állandó tápközeg-koncentráció adagolását tartjuk fenn, a következőképpen.

Egy, C. ljungdahlii C-01 törzset tartalmazó, laboratóriumi New Brunswick Scientific Bioflo® CSTR-be kezdéskor a tenyészet táplálásához szükséges, vitaminokat, nyomelemeket és sókat tartalmazó folyékony tápközeget adagoltunk. A tápközegben a pantotenátkoncentráció 20 pg/l volt. Ez a koncentráció - a tápközeg lassú adagolásával - biztosítja a termelt sejtek grammjaira számítva több mint 100 pg kalcium-pantotenát (fölös pantotenát) adagolását a bioreaktorban a sejtek lassú termelődése következtében. Hasonlóképpen a kobalt koncentrációja a tápközegben 1 ppm volt, ami biztosítja, hogy szintén fölös kobalt legyen jelen. A H₂ parciális nyomását a kilépő gázban 55,7 kPa fölöslegben tartottuk, oly módon, hogy CO₂-ot nem, 63,3% H₂-t, 31,4% CO-ot és 5,3% C₂H₆-t tartalmazó gázt adagoltunk, így a betáplált H₂ és a konvertált CO kétszerese plusz a konvertált CO₂ háromszorosa összegének arányában 1-nél nagyobb értéket értünk el, és a gázadagolás és a keverés sebességének óvatos szabályozásával 95%-nál nagyobb CO-konverziót és 80%-nál nagyobb H₂-konverziót értünk el. Ahogyan ezt a magas konverziófokot elértük, a sejtkoncentráció a kezdeti 0 g/l értékről körülbelül 1,5 g/l értékre emelkedett.

Mivel a pantotenátkoncentrációt konstans értéken tartottuk a kezdésnél, a termelt sejtek grammjaira számított pantotenát mennyisége fokozatosan csökkent, míg a 15 pg/g-sejt értéket el nem érte, azaz olyan értéket, amely limitáló. Tehát a rendszer pantotenátlimitálttá alakul. A kezdésnél a fölös H₂ hatására magas etanol/acetát termelési arányokat értünk el. Eljárhatunk úgy is, hogy a kezdés korai szakaszában hagyjuk, hogy a reaktor ecetsavat termeljen, és a termelési arányt később vonjuk szabályozás alá pantotenátlimitálással.

18. példa

Kobalt limitálása a reaktorban

C. ljungdahlii ERI2 törzset 62-3500 pg/g-sejt kobalttal tápláltunk ecetsav CO, CO₂ és H₂ keverékéből történő előállítása során, olyan körülmények között, amelyek a reaktorra nézve nem kobaltlimitáltak (vagy bármilyen más limitáló tényező nem áll fenn, kivéve a gáz tenyészethez való szállítódásának képességét), és a termékáramban nem volt jelen etanol. Az etanol CO, CO₂ és H₂ keverékéből való előállítása érdekében történt kobaltlimitálás során C. ljungdahlii C-01 törzset 33-48 pg/g-sejt kobalttal tápláltunk, miközben az összes többi tápanyagot fölöslegben tartottuk. Ilyen körülmények között a C-01 törzs 18-26 g/l etanolt és körülbelül 4 g/l acetátot termelt.

19. példa

Az alacsony, limitáló kobaltkoncentrációhoz való akklimatizálódás elkerülése A tenyészetnek a limitáló alacsony kobaltkoncentrációhoz való akklimatizálódását a bioreaktorban úgy kerüljük el, hogy a fermentációs paramétereket (gázadagolás, folyadékadagolás és keverés sebessége, H₂ parciális nyomása) szabályozzuk, miközben elkerüljük a nagyobb változásokat a tápközegben, ehelyett viszonylag állandó tápközeg-koncentráció adagolását tartjuk fenn, a következőképpen.

Egy, C. ljungdahlii C-01 törzset tartalmazó, laboratóriumi New Brunswick Scientific Bioflo® CSTR-be kezdéskor a tenyészet táplálásához szükséges, vitaminokat, nyomelemeket és sókat tartalmazó folyékony tápközeget adagoltunk. A tápközegben a kobaltkoncentráció 75 ppb volt. Ez a koncentráció - a tápközeg lassú adagolásával - biztosítja a termelt sejtek grammjaira számítva több mint 50 pg kobalt (fölös kobalt) adagolását a bioreaktorban a sejtek lassú termelődése következtében. Hasonlóképpen a pantotenát koncentrációja a tápközegben 20 pg/l volt, ami biztosítja, hogy szintén fölös pantotenát legyen jelen. A H₂ parciális nyomását a kilépő gázban 55,7 kPa fölöslegben tartottuk, oly módon, hogy nagy mennyiségű H₂-t, és CO₂-ot nem tartalmazó gázt adagoltunk, és óvatosan szabályoztuk a gázadagolás és a keverés sebességét, így 95%-nál nagyobb CO-konverziót és 80%-nál nagyobb H₂-konverziót értünk el. Ahogyan ezt a magas konverziófokot elértük, a sejtkoncentráció a kezdeti 0 g/l értékről körülbelül 1,5 g/l értékre emelkedett. Mivel a kobaltkoncentrációt konstans értéken tartottuk a kezdésnél, a termelt sejtek grammjaira számított kobaltmennyiség fokozatosan csökkent, míg az 50 pg/g-sejt értéket el nem érte, azaz olyan értéket, amely limitáló. Tehát a rendszer kobaltlimitálttá alakul. A kezdésnél a fölös H₂ hatására magas etanol/acetát termelési arányokat értünk el. Eljárhatunk úgy is, hogy a kezdés korai szakaszában hagyjuk, hogy a reaktor ecetsavat termeljen, és a ter21

HU 226 975 Β1 melési arányt később vonjuk szabályozás alá kobaltlimitálással.

20. példa

Hidrogén túladagolása

Egy folyadék- és sejt-visszacirkuláltatással CSTRként működtetett laboratóriumi AUTOKLÁV™ reaktorban (Buchi) C. Ijungdahlii sejteket a tenyésztéshez szükséges vitaminokkal, nyomelemekkel és sókkal láttunk el. A reaktorba fölös mennyiségű H₂-t tartalmazó gázt adagoltunk, annyit, hogy a betáplált H₂ móljainak és a konvertált CO móljai kétszerese, valamint a konvertált CO₂ móljai háromszorosa összegének aránya 5,67 volt. Ha ez az arány 1,0 értéknél nem magasabb, nincs ^-fölösleg jelen a reaktorban, és etanoltermelés a H₂-fölösleg hatására nem tud bekövetkezni. Ezenkívül a H₂ parciális nyomása a kilépő gázban 264,4 kPa volt, ami meghaladja az etanoltermeléshez szükséges 40,5 kPa H₂-fölösleg értéket. Végül a H₂ parciális nyomásának és a CO₂ parciális nyomásának aránya a kilépő gázban 10,88 érték volt, ami nagyobb, mint a 3,0 érték, és biztosítja, hogy elég H₂ legyen jelen az összes jelen levő szén hasznosítása érdekében. Ilyen körülmények között a reaktor közel 26 g/l etanolt és kevesebb mint 3 g/l acetátot termelt. A termelékenység etanolra nézve 200 g/l nap volt. Ha a fenti kritériumok közül bármelyik nem teljesül, a reaktor nem tud etanolt termelni a H₂-fölösleg jelenlétének következtében. Egy másik szempont, hogy a H₂-fölösleg további redukált ferredoxint eredményez a hidrogenázzal való oxidáció hatására.

21. példa

A CO szubsztrátgátlás csökkentése

Egy 800 rpm keverési sebességgel működtetett laboratóriumi New Brunswick Scientific Bioflo® CSTR esetén a CO-kibocsátás a kilépő gázban 10%, amely korábban mindössze 5% volt. A keverési sebesség 600 rpm-re való csökkentésével a CO-gátlást megszüntetjük, így a CO-kibocsátás visszaáll 5%-ra. Ez fokozott H₂-felvételt eredményez, ami a reaktorba táplált gáz hatékony hasznosításának szükséges feltétele.

22. példa

Tömegátadás

Egy sejt-visszacirkuláltatással, tápanyag-limitálással vagy a betáplált gázban H₂- vagy CO-fölösleg nélkül működtetett, C. Ijungdahlii ERI2 törzset tartalmazó, laboratóriumi CSTR esetén, amelybe tehát több mint 100 pg/g-sejt kalcium-pantotenátot és több mint 100 pg/g-sejt kobaltot adagolunk, a kilépő gázban a H₂ parciális nyomása 20,3 kPa, a fajlagos CO-felvétel kevesebb mint 0,3 mmol/g-sejtperc. A keverési sebesség 800 rpm. Ilyen körülmények között a tenyészet csak ecetsavat termel (a termékáramban nincs jelen etanol). Ha a keverési sebességet gyorsan 900 rpm-re növeljük, vagy a gázadagolás sebességét körülbelül 10%-kal növeljük, a termékáramban etanol figyelhető meg, amíg a sejtkoncentráció emelkedik, hogy felvegye a gázt, vagy amíg a tenyészet el nem pusztul a szubsztrátgátlás következtében.

23. példa

Ecetsav termékgátlás szabályozása

Egy 8 g/l ecetsavat és 10 g/l etanolt termelő laboratóriumi CSTR esetén a folyadék retenciós időt 24 óráról 12 órára csökkentjük 36 óra hosszat, annak érdekében, hogy a fölös ecetsavat - amely korlátozza a tenyészetet abban, hogy több etanolt termeljen - kimossuk a reaktorból. A reaktor működtetésének többi paraméterét és a tápközeggel kapcsolatos körülményeket állandó értéken tartjuk. Az említett idő után a folyadék retenciós idejét visszaállítjuk 24 órára, és így a termékáram 3 g/l acetátot és 15-25 g/l etanolt tartalmaz. A folyadék retenciós idő csökkentést néhányszor ismételni kell, a termékgátlás megszüntetése érdekében. Eljárhatunk úgy is, hogy a betáplált gázhoz H₂-t adagolunk, így H₂-fölösleggel történő szabályozást alakítunk ki, mivel a CO₂-fölösleg szintén ecetsavtermeléshez vezethet az etanoltermelés kárára. Ez a módosítás megakadályozza a fölös ecetsav termelését, és így megelőzi, hogy gyenge termelési arány és alacsony etanoltermelékenység alakuljon ki. Ezután folytatjuk a fölös H₂ alkalmazását a betáplált gázban, illetve a korlátozó tápanyag-koncentráció alkalmazását a folyadékfázisban.

24. példa

Szén-monoxid túladagolása

A C. Ijungdahlii ERI2 törzs fölös tápanyaggal (fölös pantotenáttal vagy kobalttal), H₂-fölösleg nélkül ellátva 0,23-0,48 mmol/gperc fajlagos CO-felvételt mutat, és a termékáramban nincs jelen etanol. A C. Ijungdahlii C-01 törzs azonban hasonlóképpen fölös tápanyaggal ellátva, H₂-fölösleg nélkül, olyan körülmények között, ahol CO-túladagolás következtében etanoltermelés jelentkezett, 0,67-1,34 mmol/g perc fajlagos CO-felvételt mutatott. Ilyen körülmények között a tenyészet 9,9-12,0 g/l etanolt és 2,6-2,7 g/l acetátot termelt.

25. példa

A termékarány szabályozása a sejtek kihajtásával

Gázfázisú szubsztrát (30% CO, 15% H₂, 10% CO₂, 45% N₂) fermentációját végezzük C. Ijungdahlii C-01 törzs alkalmazásával, sejt-visszacirkuláltatással működtetett CSTR-ben (pH=5,0, hőmérséklet: 38 °C, nyomás: 137,8 kPa, a sejtek retenciós ideje 40 óra, a folyadék retenciós ideje 6 óra), a tenyészet növekedését nem korlátozzuk kobalt, pantotenát vagy bármely más tápanyag-limitálással. Ahogyan a sejtek szaporodnak, a sejtsűrűség olyan értéket ér el, hogy a fajlagos felvétel (CO mmol/gramm száraz sejttömeg/perc) 0,5 érték alatt van, és elsősorban ecetsav termelődik etanollal szemben. E jelenség megelőzésére a sejtek kihajtási sebességét fokozzuk, hogy a sejtsűrűség növekedését megelőzzük, amíg a sejtkoncentráció elég alacsony nem lesz ahhoz, hogy a fajlagos CO-felvétel 0,5 mmol/g perc érték fölött legyen. Ennek érdekében a sejtek retenciós idejét 6 és 25 óra közötti értékre csökkentjük.

HU 226 975 Β1

1. táblázat

Tápközeg etanol termeléséhez

Komponens	Mennyiség literenként
2 g/l-es FeCI2-4H2O	10 ml
85%-os H3PO4	0,05 ml
MPFN nyomelemek8	20 ml
(NH4)2HPO4	0,60 g
NH4CI	2,00 g
NaCI	0,20 g
KCI	0,15 g
MgCI2-6H2O	0,50 g

Komponens	Mennyiség literenként
CaCI2-2H2O	0,20 g
Cisztein-HCIH2O	0,25 g
Vitaminoldatb	változó8

^a MPFN nyomelemek oldatának összetétele literenként: 10 ml 85%-os H₃PO₄, 0,10 g ZnSO₄-7H₂O, 0,03 g MnCI₂-4H₂O,

0,3 g H₃BO₃, 0,20 g CoCI₂-6H₂0, 0,02 g CuCI₂-H₂O, 0,04 g NiCI₂-6H₂O, 0,03 g NaMoO₄-2H₂O, 2,00 g FeCI₂-4H₂O, 0,01 g Na₂SeO₃ és 0,10 g Na₂WO₄-2H₂O ^b Vitaminoldat összetétele: 20,6 mg/l d-biotin, 50,6 mg/l tiamin-HCI és 50,5 mg/l d-pantoténsav-kalciumsó ⁸ 0,3-0,5 ml érték beoltáskor, és a nagy gázadagolási sebességeknél 0,7-0,8 ml értékig emelkedik

2. táblázat

A példák szerinti és a kontrollmódszerek paraméterei és eredményei összehasonlításának összefoglalása

Példa száma	Szabályo- zómecha- nizmus	Termék koncentrációja	Etanolter- melékeny- ség (g/l-nap)	Adagolt pantotenát (pg pant./g termelt sejt)	Adagolt kobalt (pg kobalt/g termelt sejt)	H2 adagolt (2COkonv+8CO2 konv)	H2 parciális nyomása a kilépő gázban (atm)	Fajlagos CO-felvétel (mmol/ g-sejt-perc)
Etanol (g/i)	Acetát (g/i)
3.	Tömeg- átadás	0	10-13	0	1575-3150	1734-3468	0,46	0,06-0,07	0,275-0,48
3.	Tömeg- átadás	0	10-14	0	2250-3600	62-99	0,875	0,11-0,20	0,33-0,40
4.	Pantotenát	15-19	1,5	11,5-14,5	18-24	5000-6660	1,03	0,55-0,64	0,23-0,30
4.	Pantotenát	18	3	17,4	8,1	3960	1,14	0,60-0,65	0,33
5.	Kobalt	26	4	15,6	15,2	33	0,94	0,63	0,37
5.	Kobalt	18	4	27,0	85,7	47,6	1,03	0,60	0,50
6.	Fölös CO	9,8	2,6	29,0	97	83,6	1,09	1,6	1,34
6.	Fölös CO	12,0	2,7	60,0	294	735	0,30	0,6	0,67
7.	Fölös H2	10,0	3,3	6,7	900-1125	991-1239	1,96	0,7-0,87	0,28-0,35
7.	Fölös H2	25,96	2,85	215-240	46	460	5,67	2,61	1,68

3. táblázat

Termékeltolódás különböző Clostridium ljungdahlii törzsek esetén

C. ljungdahlii törzs	Tápközeg-korlátozás	Sejtkonc. (g/l) (száraz sejttömeg)	Gázkonverzió	Termékkonc.
CO	h2	Etanol	Acetát
ERI2	ecetsavfokozás	1,1	90	80	0	10
ERI2	pantotenátkorlátozás	0,3	88	20	2,5	0
ERI2	ecetsavfokozás	0,55	90	85	1,0	5,5
ERI2	pantotenátkorlátozás	0,5	90	20	10	1,0
ERI2	ecetsavfokozás	0,8	100	93	1	7
ERI2	kobaltkorlátozás	1,3	80	20	9	3
C-01	ecetsavfokozás	1,2	96	90	1	8
C-01	pantotenátkorlátozás	0,8	60	30	4	0
C-01	ecetsavfokozás	1,2	96	90	<1	9
C-01	kobaltkorlátozás	2,5	80	20	17	2

HU 226 975 Β1

3. táblázat (folytatás)

C. Ijungdahlii törzs	Tápközeg-korlátozás	Sejtkonc. (g/l) (száraz sejttömeg)	Gázkonverzió	Termékkonc.
CO	h2	Etanol	Acetát
PETC	ecetsavfokozás	0,8	65	55	2	10
PETC	kobaltkorlátozás	1,0	95	55	8	1

4. táblázat

A stacioner állapot adatai CO-ban gazdag gáz etanollá történő alakításában, C. Ijungdahlii C-01 törzs alkalmazásával

GRT (perc)	LRT (óra)	Keverés sebessége (ford./perc)	Sejtkonc.* (g/i)	Gázkonverzió (%)	Termék (g/l)	Etanoltermelékenység (g/l-nap)
CO	h2	Etanol	Acetát
13	32,4	700	2,44	91	57	21,6	3,9	16,0
11,93	25,7	750	2,51	92	54	20,6	3,6	19,2
12,67	25,6	750	2,60	93	61	18,7	4,7	17,6
10	24,5	750	2,75	92	43	20,4	6,1	20,0
11,54	23,8	750	2,65	92	40	20,4	5,3	20,6
12,10	23,8	750	2,77	88	18	21	3,1	21,1
13,8	23,8	750	2,70	90	25	18	2,5	18,2
12,7	23,8	750	2,70	92	35	20	3,8	20,2
13,3	24,0	800	2,70	85	10	17,5	5,0	17,5
14,81	31	750	2,50	92	30	25	2,5	19,4
16,9	31	750	3,60	90	18	23	3,0	17,8
18,5	33	750	2,60	94	50	24	3,5	17,5
17,2	34	750	2,50	91	40	24	3,5	16,9
18,5	34	750	2,30	95	63	23	4,0	16,2
19,2	40,6	750	2,70	94	50	28,5	4,0	17,4
19,0	55	750	2,70	94	20	33	4,0	14,4

* Száraz sejttömeg alapján

5. táblázat

A stacioner állapot adatai 27 térfogat% CO-ot, 16 térfogat% H₂-t és 51 térfogat% N₂-t tartalmazó gáz etanollá történő alakításában, C. Ijungdahlii C-01 törzs alkalmazásával, a sejtek visszacirkuláltatása nélkül

GRT (perc)	LRT (óra)	Keverés sebessége (ford./perc)	Sejtkonc.* (g/i)	Gázkonverzió (%)	Termék (g/l)	Etanoltermelékenység (g/l-nap)
CO	h2	Etanol	Acetát
8,89	23,8	750	2,3	84	57	11	2,5	11,1
8,3	23,8	900	2,6	89	55	12	2,0	12,1
8,3	27,7	900	2,7	89	47	15	3,0	13,0
7,1	33,3	900	3,0	86	37	19	3,0	13,7
7,4	33,3	900	3,0	87	40	19,5	3,0	14,1
6,34	33,3	900	3,0	86	37	21	3,5	15,1
6,18	33,3	900	3,0	86	41	20,9	3,1	15,1
5,72	34,3	900	3,0	85	40	22,1	3,8	15,5
5,12	33	900	3,7	85	40	25,0	4,0	18,2
4,59	33	900	4,1	83	33	25	3,5	18,2
4,59	29	900	4,0	80	35	23	4,0	19,0

HU 226 975 Β1

5. táblázat (folytatás)

GRT (perc)	LRT (óra)	Keverés sebessége (ford./perc)	Sejtkonc.* (g/i)	Gázkonverzió (%)	Termék (g/l)	Etanoltermelékenység (g/l-nap)
CO	h2	Etanol	Acetát
4,76	29	900	3,9	90	35	19	5,0	15,7
4,25	28	900	4,2	80	30	23	3,0	19,7
5,5	37	900	3,4	84	40	23	3,0	14,9
5,26	31	900	3,8	84	50	23	3,5	17,8
5,71	31	900	3,7	80	28	26	3,0	20,1
6,25	31	900	3,75	82	30	25,5	3,0	19,7
6,66	31	900	3,6	86	64	22	4,0	17,0

* Száraz sejttömeg alapján

6. táblázat

A stacioner állapot adatai 50 térfogat% H₂-t, 45 térfogat% CO-ot és 5 térfogat% CH₄-t tartalmazó gáz etanollá történő alakításában, 0-52 izolátum alkalmazásával, CSTR-ben, a sejtek visszacirkuláltatásával

GRT (perc)	LRT (óra)	Keverés sebessége (ford./perc)	Sejtkonc.* (g/i)	Gázkonverzió (%)	Termék (g/l)	Etanoltermelékenység (g/l-nap)
CO	h2	Etanol	Acetát
12,5	46,4	23,2	3,8	96,3	81,2	20,4	4,4	21,1
9,7	43,2	17,3	4,9	86,7	49,9	21,1	3,5	29,3
9,2	43,2	17,3	4,6	89,4	64,5	20,5	5,1	28,4
7,5	43,2	17,3	5,0	81,8	42,1	22,2	3,7	30,8
9,2	49,4	17,3	4,6	85,3	52,1	21,1	4,4	29,3
8,4	46,0	16,1	4,5	85,2	61,4	20,8	5,1	31,0
6,8	54,3	16,3	4,7	84,7	57,7	23,4	5,7	34,5
7,2	54,3	16,3	4,0	83,1	55,2	19,0	4,4	28,0
7,4	54,3	16,3	5,0	86,6	66,7	21,9	5,5	32,2
6,4	55,6	16,7	5,6	83,3	53,1	23,5	4,9	33,8
6,2	41,6	14,5	5,7	82,5	55,0	20,1	5,0	33,3
6,0	41,6	14,5	6,0	82,5	50,0	21,5	3,0	35,6
6,0	34,2	12,0	5,7	84,0	56,0	19,5	4,5	39,0
5,7	34,2	12,0	5,7	81,0	45,0	18,0	4,5	36,0

* Száraz sejttömeg alapján

7. táblázat pH és folyadékminta elemzése az acetát-etanol eltolódásban, fölös mennyiségű CO jelenlétében

Idő	pH	Sejtkoncentráció* (g/i)	Etanol (g/l)	Acetát (g/l)	Butanol (g/l)
0	4,69	2,4	10,3	3,1	0,3
30	5,28		11,4	1,5	0,3
35	5,28	2,4	11,6	1,6	0,3
50	4,98		11,3	1,8	0,3
80	4,73	2,4	10,9	2,9	0,3

* Száraz sejttömeg alapján

HU 226 975 Β1

8. táblázat

0-52 izolátum gázfermentációjának adatai sejt- és víz-visszacirkuláltatással

Idő (óra)	Keverés sebessége (ford./perc)	Sejtkonc.* (g/i)	Gázkonverzió (%)	Termék (g/l)	Etanoltermelékenység (g/l-nap)
CO	h2	Etanol	Acetát	Nettó acetát
0-75	25	2,1	95	68	12	4	4	12
75-193	50	2,1	95	75	15	6	5	15
193-462	75	2,1	92	60	17	5	4	17
462-554	50	1,6	85	30	17—>13	5	3	12-16
554-669	75	2,6	92	75	13—>19	5	3	12-18
669-943	100	3,0	92	70	23	6	3	23
943-1087	100	3,0	92	60	23	6	0	23
1087-1232	100	2,7	92	60	23	6	-0	23
1232-1375	100	3,0	91	60	27	6	-1	27
1375-1534	100	3,5	88	35	23	5	0	23

* Száraz sejttömeg alapján

Claims (10)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Folyamatos eljárás etanol termelésére gázfázisú, szén-monoxidot tartalmazó szubsztrát anaerob bakteriális fermentációjával, amelynek során fermentáló bioreaktorban, kalcium-pantotenátot tartalmazó folyékony tápközegben, 5,5-nél alacsonyabb pH-nál etanolt termelni képes Clostridium Ijungdahlii baktériumot tenyésztünk, a fermentáló bioreaktorban a szabad ecetsavkoncentráció 5 g/l-nél alacsonyabb, és a bioreaktorban levő fermentlében az etanol és acetát aránya 1:1-20:1, azzal jellemezve, hogy a fermentáló bioreaktorba kalcium-pantotenátot adagolunk, a bioreaktorban termelődött baktérium száraz sejttömegére vonatkoztatva 0,5-50 pg/g mennyiségben, a bioreaktorban a fajlagos szén-monoxid-felvételt a baktérium száraz sejttömegére vonatkoztatva percenként legalább 0,3 mmol/g értéken tartjuk, és az etanolt 10 g/l/nap értéknél nagyobb termelékenységgel termeljük.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy fermentáló bioreaktorként egy növesztőreaktort alkalmazunk, amelyből egy második bioreaktort táplálunk fermentlével, ahol az etanol fő tömege képződik.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy még a következő lépéseket végezzük: a bioreaktorból eltávolítjuk a fermentlét, ledesztilláljuk, és kinyerjük belőle az etanolt.
4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a desztillációval kapott, acetátot tartalmazó vizet visszacirkuláltatjuk a bioreaktorba.
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Clostridium Ijungdahlii baktériumokat a következő törzsek közül választjuk: PECT, ERI2, 0-52 és/vagy C-01.
6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gázfázisú szubsztrátot a következők közül választjuk: (a) szén-monoxid, (b) szénmonoxid és hidrogén, (c) szén-monoxid, szén-dioxid és hidrogén, valamint (d) az (a)-(c) pontok bármelyike nitrogénnel vagy metánnal.
7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy még a következő lépéseket végezzük:

   (a) a következő paraméterek közül legalább egyet megváltoztatunk: tápközeg összetétele, tápközeg adagolási sebessége, vizes fázis adagolási sebessége, működési nyomás, működési pH, gázfázisú szubsztrát összetétele, gázadagolás sebessége, fermentlé keverési sebessége, termék koncentrációja, sejtsűrűség, szubsztrátgátlás és ezek kombinációja;

   (b) a fermentáló bioreaktorból periodikusan baktériumsejteket hajtunk ki olyan sejtkoncentrációig, amely alacsonyabb, mint a bioreaktorban levő összes redukáló gázt vagy szubsztrátot felhasználó stabil koncentráció;

   (c) a vizes fázis adagolási sebességét növeljük, amikor a fermentlében jelen levő acetát szabad ecetsavtartalma a 2 g/l értéket meghaladja, ezzel csökkentjük a szabad ecetsav koncentrációjának nem kívánt növekedését;

   (d) a gázfázisú szubsztrát adagolási sebességének csökkentésével enyhítjük a szubsztrátgátlást, és fenntartjuk a termelékenységet;

   (e) a keverési sebesség csökkentésével enyhítjük a szubsztrátgátlást, és fenntartjuk a termelékenységet;

   (f) a fermentáló bioreaktorba a gázfázisú szubsztrátot a száraz sejttömegre vonatkoztatva percenként 0,3-2 mmol CO sebességgel adagoljuk;

   (g) a fermentáló bioreaktorban jelen levő szénmonoxid mennyiségét úgy növeljük, hogy a szén-monoxid mennyisége nagyobb annál a mennyiségnél, amely a baktérium stabil koncentrációjának fenntartásához szükséges, amely az összes adagolt szén-monoxidot felhasználná;

   (h) a fermentáló bioreaktorban a szén-monoxid mennyiségét olyan szinten tartjuk, amely az acetát termelésével szemben az etanol termelését tartja fenn;

   HU 226 975 Β1 (i) a fermentáló bioreaktorba olyan tápközeget adagolunk, amely még kobaltot is tartalmaz, a kobalt koncentrációját a termelt baktérium száraz sejttömegére vonatkoztatva 5-100 pg/g értéken tartjuk; és (j) a tenyészet pH-ját 4,5 érték fölé emeljük.
8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a következő paraméterek beállításával megelőzzük, hogy a baktériumok akklimatizálódjanak a kalcium-pantotenát fermentáló bioreaktorban levő mennyiségéhez: gázadagolás sebessége, folyadékadagolás sebessége, keverési sebesség, tápközeg adagolásának sebessége és a hidrogén parciális nyomása.
9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy fölös mennyiségű hidrogén redukáló gázt adagolunk a fermentáló bioreaktorba.
10. 10. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez5 ve, hogy a 7. igénypont szerinti (i) lépést hajtjuk végre, és konstans kobaltkoncentráció fenntartásával és az alábbi paraméterek beállításával megelőzzük, hogy a baktériumok akklimatizálódjanak a kobalt bioreaktorban levő mennyiségéhez: gázadagolás sebessége, fo10 lyadékadagolás sebessége, keverési sebesség, tápközeg adagolási sebessége és a hidrogén parciális nyomása.