ES2267794T3

ES2267794T3 - Metodo para incrementar la produccion de etanol a partir de fermentacion microbioana.

Info

Publication number: ES2267794T3
Application number: ES01954884T
Authority: ES
Inventors: James L. Gaddy; Dinesh K. Arora; Ching-Whan Ko; John Randall Phillips; Rahul Basu; Carl V. Wikstrom; Edgar C. Clausen
Original assignee: Emmaus Foundation Inc
Current assignee: Emmaus Foundation Inc
Priority date: 2000-07-25
Filing date: 2001-07-23
Publication date: 2007-03-16
Anticipated expiration: 2021-07-23
Also published as: US8642301B2; UA76117C2; DE60121335T2; US8642302B2; ECSP034418A; IL153876A; US20120094349A1; US7285402B2; CR6891A; MXPA03000711A; AU7710301A; US8647851B2; WO2002008438A2; US20120115198A1; NZ523484A; EA006106B1; IL193679A0; IL153876A0; PT1303629E; PL205622B1

Abstract

UN MÉTODO EJEMPLIFICANTE DE LA PRESENTE INVENCIÓN Se introduce continuamente un gas de síntesis ó gas agotado que contiene CO con ó sin CO2/H2 dentro de un tanque biorreactor agitado que contiene una cepa de C. ljungdahlii, junto con un medio líquido convencional que contiene vitaminas, metales traza y sales. En la Tabla 1 abajo se reporta un medio nutriente deseable. Durante el arranque del método empleando un inoculo de cultivo de 10 % ó menos, se opera el reactor en una fase líquida por lote, en la cual no se alimenta de modo continuo el reactor con medio líquido. Así, la fase líquida en el reactor consiste en un lote de medio nutriente con una concentración nominal de nutriente limitante, sea pantontenato de calcio ó cobalto, Alternativamente también puede emplearse un medio rico que contiene extracto de levadura, tripticasa u otros nutrientes complejos.

Description

Métodos para incrementar la producción de etanol a partir de fermentación microbiana.

Campo de la invención

La presente invención se dirige al mejoramiento de los métodos de fermentación microbiana para la producción de etanol, a partir de un sustrato gaseoso que incluye monóxido de carbono, usando una bacteria acetogénica anaeróbica (ó facultativa).

Fundamento de la invención

Han sido divulgados por estos inventores métodos para producir etanol, entre otros ácidos orgánicos, alcoholes, hidrógeno y sales de ácidos orgánicos, a partir de la fermentación microbiana de sustrato gaseoso en medios que contienen nutrientes adecuados y trazas de minerales, empleando ciertas bacterias anaeróbicas. Por ejemplo, previamente los inventores han divulgado que se introducen mezclas gaseosas diluidas en un biorreactor que contiene una ó más cepas de bacterias anaeróbicas que utilizan los componentes del gas de desecho mediante una vía directa, para producir un compuesto deseado. Se recupera el compuesto de la fase acuosa en un recipiente ó recipientes separados empleando un método de recuperación adecuado para el compuesto producido. Los ejemplos de métodos de recuperación incluyen destilación, extracción ó combinación de ellos, u otros métodos eficientes de recuperación. Las bacterias pueden ser removidas de la fase acuosa y recicladas al biorreactor para mantener altas concentraciones celulares, maximizando de ese modo la productividad. Si se desea, la separación de la célula es lograda mediante centrifugación, filtración por membrana u otras técnicas. Ver por ejemplo la Aplicación de la Patente Internacional No. WO98/00558 publicada en Enero 8 1.998; Patente de EEUU No. 5.807.722; Patente de EEUU No. 5.593.886 y Patente de EEUU
No. 5.821.111.

Adicionalmente a su mayor producto, ácido acético, las cepas de las bacterias anaeróbicas Clostridium ljungdahlii son también capaces de producir etanol como un producto de la conversión de monóxido de carbono (CO), Hidrógeno (H_{2}) y dióxido de carbono (CO_{2}).

La producción de ácido acético (CH_{3}COOH) y etanol (C_{2}H_{5}OH) a partir de CO, H_{2} y CO_{2} es mostrada por las siguientes ecuaciones estequiométricas globales:

4CO + 2H_{2}O - - - - - - - - - - - CH_{3}COOH + 2CO_{2}: (1)

4H_{2} + 2CO_{2} - - - - - - - - - - - CH_{3}COOH + 2H_{2}O: (2)

6CO + 3H_{2}O - - - - - - - - - - - C_{2}H_{5}OH + 4CO_{2}: (3)

6H_{2} + 2CO_{2} - - - - - - - - - - - C_{2}H_{5}OH + 3H_{2}O: (4)

Varias cepas ejemplares de C. ljungdahlii incluyen la cepa PETC (Patente de EEUU No. 5.173.429); cepa ERI2 (Patente de EEUU No.5.593.886) y cepas C-01 y O-52 (Patente de EEUU No.6.136.577). Estas cepas están depositadas cada una en el American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, bajo Accesos Nos.: 55383 (antes ATCC No. 49587), 55380, 55988, y 55989 respectivamente. Cada una de las cepas de C. ljungdahlii es una bacteria grampositiva anaeróbica con un contenido de nucleótido guanina y citosina (G+C) de cerca de 22% de moles. Esta bacteria emplea una variedad de sustratos para crecimiento, pero no metanol ó lactato. Estas cepas difieren en su tolerancia al CO, velocidades específicas de ingesta de gas y productividades específicas. En las condiciones "salvajes" halladas en la naturaleza se nota poca producción de etanol. Las cepas de C. ljungdahlii operan idealmente a 37ºC y típicamente producen una relación etanol a acetilo (es decir la que se refiere tanto al ácido acético molecular ó libre como a las sales de acetato) de aproximadamente 1:20 (una parte de etanol por 20 partes de acetilo) en el estado "salvaje". Las concentraciones de etanol son típicamente de sólo 1-2 g/L. Mientras que ésta habilidad para producir etanol es de interés, debido a la baja productividad de etanol, la bacteria "salvaje" no puede ser empleada para producir etanol de forma económica sobre una base comercial.

Las cepas arriba mencionadas de C. ljungdahlii han sido empleadas con una manipulación menor de nutriente para producir etanol y acetilo con una relación de producto de 1:1 (partes iguales de etanol y acetilo) pero la concentración de etanol es menor de 10 g/L, un nivel que resulta en baja productividad, por debajo de 10 g/L por día. Adicionalmente, la estabilidad del cultivo es un problema, primariamente debido a la concentración relativamente alta (8-10 g/L) de acetilo (2,5 a 3 g/L de ácido acético molecular) en combinación con la presencia de etanol. Además, en un esfuerzo por producir más etanol, a medida que la tasa de gas es incrementada, el cultivo es inhibido primero por el ácido acético y luego por el CO. Como resultado, el cultivo se vuelve inestable y falla en tomar gas y producir producto adicional. Además, un trabajo anterior de los inventores mostró dificultad para producir una relación mayor de 2:1 de etanol a acetilo, en un estado estable de operación. Ver por ejemplo Klasson et al, 1990 Applied Biochemistry and Biotechnology, Proceedings of the 11th Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals, 24/25: 857; Phillips et al, 1993 Applied Biochemistry and Biotechnology, Proceedings of the 14th Symposium of Biotechnology from Fuels and Chemicals, 39/40: 559, entre otros.

Un gran número de documentos describe el empleo de bacterias anaeróbicas diferentes de C. ljungdahlii, en la fermentación de azúcar, las cuales no consumen CO_{2}, CO y H_{2} para producir solventes. En un intento por dar altos rendimientos de etanol, se han alterado una variedad de parámetros, los cuales incluyen: tipos de nutriente, microorganismo, adición específica de agentes reductores, variaciones de pH y la adición de gases exógenos. Ver por ejemplo Rothstein et al, 1986 J. Bacteriol., 165 (1): 319-320; Lovitt et al, 1988 J. Bacteriol., 170 (6): 2809; Taherzadeh et al, 1996 Appl. Microbiol. Biotechnol., 46-176.

Subsiste una necesidad en el arte de la manipulación de sustratos gaseosos industriales, sobre la habilidad para extraer bienes valiosos a partir de tales gases, particularmente gases de desecho, tales como CO_{2}, CO y H_{2}. Hay una necesidad de incrementar la producción de etanol frente a la producción de otros productos generados normalmente mediante la fermentación de tales gases por bacterias acetogénicas.

Resumen de la invención

En respuesta a la necesidad existente, la presente invención suministra un método de estado estable y continuo el cual, en las modalidades preferidas, es capaz de generar concentraciones de etanol mayores de 10 g/L y concentraciones de acetato menores de aproximadamente 8-10 g/L, mientras continua permitiendo el crecimiento y buena estabilidad del cultivo.

De acuerdo con la invención, se suministra un método continuo para producir etanol a partir de la fermentación bacteriana anaeróbica de un sustrato gaseoso que incluye monóxido de carbono, incluyendo el método el cultivar la bacteria C. ljungdahlii en un biorreactor de fermentación, la cual es capaz de producir etanol en un medio nutriente líquido que incluye pantotenato de calcio y a un pH menor de 5,5, siendo la concentración de ácido acético libre en el biorreactor de fermentación menor de 5 g/L, y estando la relación de etanol a acetato en el caldo de fermentación en el biorreactor entre 1:1 y 20:1; caracterizado en que al pantotenato de calcio es alimentado al biorreactor de fermentación a una cantidad de 0,5 a 50 \mug/g de célula seca de bacteria producida en el biorreactor y en que se mantiene en el biorreactor una tasa específica de ingesta de monóxido de carbono de por lo menos 0,5 mmol de CO/g de peso de célula seca de bacteria/minuto, con lo cual en un estado estable el etanol es producido a una productividad superior a 10 g/L/día.

En una forma de mirar la invención, las bacterias en el biorreactor son manipuladas mediante la reducción del potencial rédox ó incremento de la relación NAD(P)H a NAD(P) en el caldo de fermentación después de que las bacterias alcanzan un estado estable, es decir una concentración estable de células en el biorreactor. Los pasos de cultivo y manipulación hacen que las bacterias en el biorreactor produzcan etanol en un caldo de fermentación a una productividad mayor de 10 g/L por día. Tanto el etanol como el acetato son producidos en el caldo de fermentación a una relación de etanol a acetato que varía entre 1:1 y 20:1.

En una modalidad de éste método el paso de manipulación incluye uno ó más de los siguientes pasos: alteración de por lo menos un parámetro seleccionado de entre el grupo que consiste en contenido de nutrientes del medio, velocidad de alimentación de nutrientes, velocidad de alimentación acuosa, presión de operación, pH de operación, contenido de gases del sustrato, velocidad de alimentación del gas, velocidad de agitación del caldo de fermentación, paso del producto de inhibición, densidad celular e inhibición del sustrato.

El sustrato gaseoso que incluye el gas reductor, CO, es suministrado al biorreactor a una velocidad deseada de ingesta de por lo menos 0,05 y deseablemente hasta 2 mmol de CO/gramo de células secas de bacteria en dicho biorreactor por minuto.

Otra modalidad del método incluye el suministro a dicho biorreactor de un exceso del gas reductor H_{2}, antes de suministrar la cantidad limitante de pantotenato de calcio.

En otro aspecto adicional, la invención suministra un método en el cual el paso de manipulación del método incluye la alimentación dentro de dicho biorreactor de fermentación, de dicho medio nutriente el cual incluye una cantidad limitante de cobalto. Deseablemente, la cantidad de cobalto está en el rango de 5 a 100 \mug de cobalto/gramo de células secas de bacterias producidas en dicho biorreactor.

En otra modalidad el método de la invención incluye la prevención de la aclimatación a dicha cantidad de cobalto por parte de dichas bacterias en dicho biorreactor, manteniendo una concentración constante de cobalto y ajustando uno ó más parámetros tales como relación de gas, velocidad del liquido y, si es apropiado, presión parcial del
gas H_{2}.

Pasos adicionales de estos métodos incluyen el someter una muestra de caldo a centrifugación para eliminar las células y a cromatografía de gases para vigilar el mantenimiento de los valores de la relación y/o productividad.

En otra modalidad el método incluye alimentar, como parte del sustrato gaseoso, una cantidad de H_{2} en ligero exceso sobre la cantidad estequiométrica para la producción de etanol. Aún en otra modalidad, la cantidad empleada de CO está en ligero exceso sobre las cantidades requeridas por las bacterias, donde la ingesta de H_{2} por las bacterias esta inhibida y se incrementa la relación NAD(P)H a NAD(P) en el caldo.

En otra modalidad del método, se suministra un paso en el cual se reduce la inhibición por el ácido acético molecular, mediante el incremento de la velocidad de alimentación acuosa cuando el ácido acético molecular presente en el caldo de fermentación se aproxima ó excede a 2 g/L.

En otra modalidad del método, el paso de manipulación puede incluir la agitación del medio, bacterias y sustrato gaseoso en el biorreactor a una velocidad de agitación seleccionada. Por ejemplo, la reducción en la velocidad de agitación reduce la cantidad de CO transferida al caldo de fermentación. Esta reducción en la tasa de transferencia de CO genera un incremento en la conversión de H_{2}, de manera que el gas reductor, H_{2}, puede estar presente en el biorreactor en exceso sobre los requerimientos de crecimiento de las bacterias. La relación de gases puede también ser similarmente reducida para bajar la cantidad de CO transferida, incrementando de éste modo la conversión de H_{2}, de modo que el gas reductor, H_{2}, puede estar presente en el biorreactor de fermentación en exceso sobre los requerimientos de crecimiento de las bacterias.

Aún en otra modalidad del método, el cultivo bacteriano puede ser traído inicialmente hasta la concentración celular deseada en el biorreactor antes de limitar la concentración de pantotenato de calcio ó cobalto en el medio nutriente.

En otra modalidad del método de ésta invención, se emplea un TRAC (biorreactor), el cual consiste en un reactor de crecimiento que alimenta el caldo de fermentación a un reactor de producción en el cual se produce la mayoría del etanol.

En otro aspecto de la invención, el método descrito arriba incluye los pasos opcionales de: recuperación del etanol por remoción del caldo de fermentación del biorreactor; destilación del etanol de caldo; y recuperación del etanol. Adicionalmente ó preferiblemente, se somete a centrifugación una muestra del caldo para eliminar las células y se vigila el mantenimiento de la relación empleando cromatografía de gases.

En otro aspecto, el método de la invención puede además emplear un paso adicional de recirculación de agua (que contiene hasta 5g/L de acetilo) retornando desde la producción de etanol hasta el reactor de modo que se establece un equilibrio entre el etanol y el acetilo en el reactor. Como resultado, más de CO_{2}, CO y H_{2} alimentados al reactor y convertidos en productos resultan en producción de etanol.

Otros aspectos y ventajas de la invención, son descritos con mayor profundidad en la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas de la misma.

Breve descripción de los dibujos

La Fig 1 es un diagrama esquemático que ilustra un método de fermentación continua con recuperación de producto, de acuerdo con ésta invención. Al biorreactor 3, el cual contiene el cultivo bacterial, son alimentados el sustrato gaseoso 1 y el medio nutriente en fase líquida. La conversión del sustrato gaseoso en etanol y ácido acético tienen lugar en el biorreactor 3. Los gases agotados 4, que contienen gases diferentes de CO_{2}, CO y H_{2} y gases CO_{2}, CO y H_{2} del biorreactor 3 no convertidos, son venteados, quemados como combustible ó inflamados. El efluente líquido 5 es enviado, con el recirculado celular, al separador celular 6 donde se separan las células 7 y el permeado libre de células 8. Se retornan las células 7 al biorreactor 3 y se envía el permeado 8 a recuperación de producto. Puede recuperarse etanol del permeado 8 (ó alternativamente del efluente 5 si es que no se emplea separación celular). Se separa el permeado 8 en la columna de destilación 9 para producir una cabeza 10 de etanol del 95% y agua 11 para retornar para reciclado al biorreactor 3. Se envía la cabeza 10 de etanol del 95% a un tamiz molecular 12 donde se separa el etanol anhidro 13, el producto final deseado, del etanol diluido 14 el cual es retornado a la columna de destilación 9.

La Fig. 2 es un diagrama esquemático de un sistema de reactor de agitación continua (TRAC) de dos pasos, para estabilidad mejorada del cultivo. La etapa de crecimiento TRAC 1 es alimentada con el medio líquido 2. El gas no convertido 3 de la etapa de producción TRAC es alimentado a la etapa de crecimiento TRAC 1. La etapa de producción TRAC 4 es alimentada con un gas de alimentación fresco 5 y con una alimentación de medio fresco 6, así como con alimentación de cultivo 7 a partir de la etapa de crecimiento TRAC 1. Se emplea el reciclado celular 8 para alcanzar la máxima producción de las células 9 enviadas a la etapa de producción TRAC 4. Las células 9 no son recicladas a la etapa de producción TRAC. El producto líquido 10, que consiste en etanol diluido, en el caldo de fermentación es producido como producto final de destilación y se recupera como etanol anhidro, como se muestra en la Fig 1.

Descripción detallada de la invención

La presente invención implica métodos para la fermentación anaeróbica de sustrato gaseoso que contienen al menos monóxido de carbono como gas reductor, particularmente los componentes gaseosos de desechos industriales y gases de síntesis (es decir CO_{2}, CO y H_{2}), hasta etanol. Estos métodos rinden productividades de etanol superiores a 10 g/L por día, mediante la manipulación de las rutas biológicas de las bacterias sujeto. Un método de la invención genera una abundancia de NAD(P) H sobre NAD(P). La oxidación de NAD(P)H a NAD(P) hace que el ácido acético producido por el cultivo sea reducido hasta etanol. Alternativamente, otros métodos para la producción de altas concentraciones de etanol en una fermentación anaeróbica de ésta invención, involucran la reducción del potencial redox del caldo de fermentación, reduciendo de éste modo el ácido acético hasta etanol. En modalidades preferidas, los métodos de ésta invención son capaces de producir altas concentraciones de etanol (es decir mayores de aproximadamente 10 g/L y preferiblemente mayores de aproximadamente 15 g/L) y bajas concentraciones de acetato (es decir menos de aproximadamente 5 g/L de ácido acético libre en el biorreactor). Estos métodos también mantienen y controlan las condiciones de método para que la producción continua de etanol y ácido acético ayude al sistema a recuperarse rápidamente de desajustes. Además, los métodos de ésta invención ayudan a prevenir la aclimatación del cultivo a bajas concentraciones de nutrientes, lo cual puede ir en detrimento del desempeño del cultivo. La presente invención suministra un método comercial viable para la producción de etanol.

I. Definiciones

A menos que se defina de otra forma, tal como se usan a través de ésta especificación, los siguientes términos son definidos como sigue:

El término "método continuo" es usado aquí pare referirse a un método de fermentación que incluye continua alimentación de nutriente, alimentación de sustrato, producción celular en el biorreactor, remoción celular (ó purga) a partir del biorreactor, y remoción de producto. Esta alimentación continua, remoción ó producción celular pueden ocurrir en la misma ó en diferentes corrientes. Un proceso continuo resulta en el logro de un estado estable dentro del biorreactor. Por "estado estable" se entiende que todas las variables medibles (es decir velocidades de alimentación, concentraciones de nutriente y sustrato mantenidas dentro del biorreactor, concentración celular en el biorreactor y remoción celular desde el biorreactor, remoción de producto desde el biorreactor, así como variables de condiciones tales como temperaturas y presiones) son constantes sobre el tiempo.

Los sustratos gaseosos empleados incluyen monóxido de carbono. Así, ellos pueden ser CO solo, CO y H_{2}, ó CO_{2}, CO y H_{2}, opcionalmente mezclados con otros elementos o compuestos, incluyendo nitrógeno y metano en estado gaseoso. Tales sustratos gaseosos incluyen gases ó corrientes, que son típicamente liberados ó agotados a la atmósfera bien sea directamente ó a través de combustión. En algunas modalidades de éste método el sustrato gaseoso incluye CO. En otras modalidades el sustrato gaseoso incluye CO y H_{2}. En una modalidad particularmente preferida, el sustrato gaseoso incluye CO_{2}, CO y H_{2}. Aún, otros sustratos de la invención pueden incluir aquellos componentes mencionados arriba y por lo menos un gas de nitrógeno, CO_{2}, etano y metano. Así, tales sustratos incluyen lo que se denomina convencionalmente como "singas" ó gas de síntesis a partir de la gasificación de productos de carbono (incluyendo metano) así como gases de desecho de una variedad de métodos industriales.

Por la frase "una cantidad de gas reductor superior a la cantidad requerida para el crecimiento de las bacterias" se entiende una cantidad de gas reductor (CO ó CO+H_{2}) que supera la cantidad que las bacterias pueden usar para el crecimiento ó metabolismo, dados los ingredientes de medio nutriente. Esta cantidad puede ser lograda incrementando la cantidad neta de gas reductor ó reduciendo los ingredientes nutrientes clave, de manera que se logra la cantidad en exceso del gas sin necesidad de aumentar el gas, ó mediante el incremento de la velocidad de entrega de gas a las bacterias. Cuando las bacterias son expuestas a más gas reductor que el requerido para el crecimiento, las bacterias responden incrementando la producción de etanol.

La bacteria empleada es la bacteria anaeróbica (ó facultativa) acetogénica Clostridium ljungdahlii la cual es capaz de convertir monóxido de carbono y agua en etanol y ácido acético. Pueden emplearse varias cepas de ésta bacteria: Por ejemplo C. ljungdahlii PGTC, C. ljungdahlii ER12, C. ljungdahlii C-01 y C. ljungdahlii 0-52.

Los términos "biorreactor", "reactor" ó "biorreactor de fermentación", incluyen un dispositivo de fermentación que consiste en uno ó más recipientes y/o torres ó arreglos de tuberías, los cuales incluyen un Tanque Reactor de Agitación Continua (TRAC), Reactor de Células Inmovilizadas (RCI), Reactor de Lecho de Goteo (RLG), Columna de Burbujeo, Fermentador Elevador de Gas, Mezclador Estático, u otro dispositivo adecuado para contacto gas-líquido. Preferiblemente, para el método de ésta invención, el biorreactor de fermentación incluye un reactor de crecimiento que alimenta el caldo de fermentación a un segundo biorreactor de fermentación, en el cual se produce la mayoría del etanol.

"Medio nutriente" es usado generalmente para describir el medio de crecimiento bacteriano convencional, que contiene vitaminas y minerales suficientes para permitir el crecimiento de la bacteria sujeto seleccionada. En éstos medios no se incluyen los azúcares. Son conocidos y reportados en publicaciones anteriores componentes de una variedad de medios nutrientes adecuados al uso de ésta invención, incluidos éstos de los inventores. Ver las fórmulas de medios nutrientes descritas en Aplicación de la Patente Internacional No. WO98/00558; Patente de EEUU No. 5.807.722; Patente de EEUU No. 5.593.886, Patente de EEUU No. 5.821.111, así como en las publicaciones identificadas arriba. De acuerdo con la presente invención, un típico medio nutriente de laboratorio para la producción de acetato a partir de CO_{2}, CO y H_{2} contiene 0,9 mg/L de pantotenato de calcio. Sin embargo, un típico medio nutriente de laboratorio para la producción de etanol a partir de CO_{2}, CO y H_{2} contiene 0,02 mg/L de pantotenato de calcio.

Los términos "sustrato limitante" ó "nutriente limitante" definen una sustancia en el medio nutriente ó en sustrato gaseoso que, durante el crecimiento del cultivo bacteriano en el biorreactor, es consumida por el cultivo hasta un nivel en el que ya no soporta más estado estable ó crecimiento bacteriano estable en el biorreactor. Todas las otras sustancias en el medio nutriente ó en el sustrato gaseoso están así presentes en exceso y son "no limitantes". La evidencia para la limitación es que un incremento en la velocidad de adición del sustrato limitante, es decir en la velocidad de adición del nutriente ó velocidad de adición del gas al cultivo, genera un correspondiente incremento en la velocidad de ingesta de gas (mmol/min de gas) debido al incremento en la densidad celular.

A menos que se declare de otra forma, el término "acetato" es empleado para describir la mezcla de ácido acético molecular ó libre y sal acetato presentes en el caldo de fermentación. La relación de ácido acético molecular a acetato depende del pH del sistema, es decir para una concentración constante de "acetato", cuanto menor sea el pH, más alta es la concentración de ácido acético molecular relacionada con la sal acetato.

La "concentración celular" en ésta especificación está basada en el peso seco de las bacterias por litro de muestra. La concentración celular es medida directamente ó mediante calibración con una correlación con la densidad
óptica.

El término "estado natural" describe cualquier compuesto, elemento ó ruta que no tiene protones ó electrones adicionales que están normalmente presentes. Inversamente, el término "estado de reducción" describe cualquier compuesto, elemento ó ruta que tiene un exceso de uno ó más electrones. Se logra el "estado de reducción" adicionando uno ó más electrones al "estado natural", es decir bajando el potencial redox del caldo de fermentación.

"Productividad de etanol" es la productividad volumétrica de etanol, calculada como la relación de concentración de etanol del estado estable y el Tiempo de Retención de Líquido (TRL) en sistemas continuos, ó la relación de la concentración de etanol y el tiempo requerido para producir aquella concentración en sistemas de producción por lote. La frase "alta productividad de etanol" describe una productividad volumétrica de etanol superior a 10 g/L por día.

La frase "alta concentración de etanol" significa superior que aproximadamente 10 g/L, preferiblemente mayor que 15 g/L, de etanol en el caldo de fermentación ó una relación de producto etanol a acetato de 5:1 ó más.

El "exceso de H_{2}" es disponible para la producción de etanol cuando la relación entre las moles de H_{2} en el gas de alimentación y la suma de dos veces las moles de CO convertido más tres veces las moles de CO_{2} convertido, es superior a 1,0. Si ésta relación es menor que 1,0, el exceso de H_{2} no está disponible y el etanol puede ser producido sólo a través de un diferente mecanismo de control.

II Las Rutas Biológicas Empleadas en el Método de esta Invención

Sin desear estar atados por la teoría, los inventores teorizan que los métodos para incrementar la producción anaeróbica de etanol a partir de los métodos descritos aquí, están basados en las rutas biológicas que implican la conversión de NAD(P)H a NAD(P) en los ciclos de ruta básica de la ruta acetogénica para crecimiento autotrófico. La invención involucra la manipulación de aquellas rutas para facilitar la producción continua y el mantenimiento de altas concentraciones de etanol con bajas concentraciones de acetato bajo condiciones estables de operación, suministrando de éste modo métodos comercialmente útiles para la producción de etanol a partir de gases industriales.

El involucramiento esencial de NAD(P)H a NAD(P) en las rutas biológicas se describe como sigue: La producción de etanol a partir de componentes gaseosos tales como CO_{2}, CO y H_{2} ocurre en un método de tres pasos biológicos:

En el primer paso se oxidan los sustratos CO y H_{2} y al hacerlo liberan NAD(P)H

NAD(P) - - - - - - NAD(P)HCO + H_{2} + H_{2}O - - - - - - CO_{2} + 4 H^{+}

Los productos del paso 1 son luego convertidos en ácido acético, un paso que requiere

NAD(P)H: NAD(P)H - - - - - - - - - - - NAD(P)CO + CO_{2} + 6 H^{+} - - - - - - - - - - - CH_{3}COOH + H_{2}O

Finalmente, si está disponible un exceso de NAD(P)H debido a que la reacción del paso 1 ocurre a una velocidad mayor que la reacción del paso 2, el ácido acético es reducido a etanol

NAD(P)H - - - - - - - - - - NAD(P)CH_{3}COOH + 4 H^{+} - - - - - - - - - - C_{2}H_{5}OH + H_{2}O

Así, la disponibilidad de exceso de NAD(P)H del sustrato de oxidación conduce a la producción de etanol desde ácido acético. Hay dos ciclos de ruta básica conocidos en la ruta acetogénica: (1) El ciclo AcetilCoA y (2) el ciclo THF en el cual el CO_{2} es reducido a un grupo metilo. En J. R. Phillips et al., 1994 Applied Biochemistry and Biotechnology, 45/4 6: 145 se ilustra la secuencia para la generación de etanol y ácido acético. El ciclo AcetilCoA tiene un ciclo interior, denominado aquí como el ciclo CO. Como el ciclo de CO reacciona normalmente en el sentido de las manecillas del reloj, la ferredoxina es reducida. La ferredoxina puede también ser reducida con H_{2} a medida que es oxidada por la enzima hidrogenasa. Como resultado, el ciclo AcetilCoA también reacciona en el sentido de las manecillas del reloj, y la ferredoxina es oxidada. Si el ciclo interior CO y el ciclo AcetilCoA reaccionan a las mismas velocidades, la ferredoxina está en un estado de equilibrio redox. Sin embargo, si éstos dos ciclos no ocurren a la misma velocidad, es decir el ciclo CO reacciona a una velocidad más alta que el ciclo AcetilCoA, se construye ferredoxina reducida. También con un exceso de H_{2}, puede producirse ferredoxina reducida en exceso. Este exceso de ferredoxina reducida hace que el NAD(P) sea regenerado (reducido) hasta NAD(P)H lo cual construye un exceso que debe ser aliviado hasta el equilibrio, y al hacer eso reduce el ácido acético hasta etanol.

El ciclo THF funciona para el crecimiento celular y es necesario para un cultivo continuo; por eso el no puede ser detenido completamente. La reducción de la velocidad del ciclo THF también sirve para generar una más alta relación NAD(P)H a NAD(P). El NAD(P)H es oxidado en dos lugares. Limitando su oxidación, lo cual mantendría en balance la relación celular total NAD(P)H a NAD(P), el NAD(P)H es empleado para reducir el ácido acético hasta etanol.

Un segundo método básico para hacer que el ácido acético se reduzca hasta etanol, es bajando directamente el potencial redox del caldo de fermentación. Un estado de reducción lo suficientemente más bajo que el del estado natural del cultivo hace que haya abundancia de NAD(P)H y promueva la reducción de ácido acético hasta etanol.

III Los Métodos de la Invención

Los pasos básicos del método incluyen lo siguiente: Un método continuo de fermentación con recuperación de producto, es descrito mediante referencia a la Fig. 1 y es ejemplificado en el Ejemplo 1, abajo. Se suministra a una velocidad de alimentación de gas seleccionada, un flujo continuo de sustrato gaseoso 1 que incluye por lo menos un gas reductor, por ejemplo CO ó CO y H_{2}, y se suministra un flujo continuo de medio nutriente en fase líquida 2 a una velocidad de alimentación de nutriente seleccionada, a un biorreactor de fermentación 3, el cual contiene la bacteria sujeto. En el biorreactor 3 las bacterias fermentan el sustrato gaseoso y el medio, para producir etanol y ácido acetato. Una vez que se alcanza una concentración celular estable bajo condiciones de estado estable, se manipulan los componentes del sistema continuo para reducir el potencial redox, ó incrementar la relación NAD(P)H a NAD(P) en el caldo de fermentación, mientras se mantiene la concentración de ácido acético libre en el biorreactor en menos de 5 g/L. Los métodos de ésta invención están diseñados para permitir y mantener la producción de etanol y acetato en el caldo de fermentación tal que la productividad de etanol es superior a los 10 g/L por día a una relación etanol a acetato entre 1:1 y 20:1. En una modalidad, esa relación es superior a 3:1. En otra modalidad, esa relación es mayor a 5:1. Aún en otra modalidad, esa relación es superior a 10:1. Aún en otra modalidad, esa relación es superior a 15:1. Alternativamente, el método de ésta invención es efectivo para aumentar la producción estable continua (estado estable) de elevadas concentraciones del etanol (15-35 g/L de etanol) y bajas concentraciones de acetato (0-5 g/L de acetato), es decir relación de producto etanol a acetato de 3:1 ó más, a partir de CO_{2}, CO y H_{2} con buena estabilidad del método.

Periódicamente, durante el curso de los métodos de ésta invención, se toman muestras del caldo para determinar la relación por un método de ensayo convencional. Por ejemplo, se separan las células de la muestra, puede ser por centrifugación y luego se somete la muestra libre de células a un método de análisis tal como el método de análisis preferido de la cromatografía de gases. Sin embargo, una persona conocedora del tema puede seleccionar otros métodos convencionales. Se añaden los pasos opcionales adicionales del método para alcanzar y/o mantener la relación. El Ejemplo 2 muestra tal método de ensayo.

Los pasos empleados para manipular los componentes del sistema y mantener y/o lograr la productividad deseada de etanol ó la relación etanol a acetato incluyen por lo menos uno y, deseablemente, combinaciones de los siguientes pasos: alteración del contenido de nutrientes del medio, pH de operación, velocidad de alimentación de nutrientes, velocidad de alimentación acuosa, presión de operación, contenido del sustrato gaseoso, velocidad de alimentación del gas, velocidad de agitación del caldo de fermentación, evitar el paso de inhibición del producto, disminuir la densidad celular en el biorreactor ó prevenir la inhibición del sustrato. Algunas manipulaciones preferidas incluyen suministrar al biorreactor limitación de nutriente de cobalto en fase líquida empleando un ligero exceso de CO y H_{2} en el gas de alimentación, minimizar la concentración de acetato, evitar la aclimatación del cultivo a bajas concentraciones de nutrientes en la fase líquida, llevar el cultivo hasta una adecuada concentración celular a una velocidad relativamente alta, elevar el pH del cultivo por encima de 4,5, purgar las células bacterianas del biorreactor hasta una concentración celular menor que la concentración del estado estable que emplea todos los gases reductores ó sustratos de nutrientes en el biorreactor, e incrementar la velocidad de alimentación acuosa cuando la porción del ácido acético libre del acetato presente en el caldo del biorreactor de fermentación supera los 2 g/L, inhibiendo de éste modo cualquier incremento no deseado en la concentración de ácido acético libre. Abajo se describen en detalle todos éstos pasos.

El gas de salida 4 del reactor que contiene los gases diferentes a CO_{2}, CO y H_{2} y a CO_{2}, CO y H_{2} no convertidos, son venteados del reactor y son empleados por su valor como combustibles. Si se usa como mecanismo de control un exceso de H_{2}, se emplean la presión parcial del H_{2} en el gas de salida y la relación de la presión parcial del H_{2} a la presión parcial de CO_{2} en el gas de salida para identificar el control de la relación de etanol a acetato en ese paso. Se usa el reciclado de células (aunque no es requerido) para incrementar la concentración celular dentro del biorreactor y suministrar de ese modo más biocatalizador para la conversión de CO_{2}, CO y H_{2}. Con reciclaje celular, se envía el efluente líquido del reactor 5 a un separador celular 6 donde se separan la células 7 y el permeado 8 (líquido libre de células). Se retornan las células 7 al biorreactor y se envía el permeado a recuperación de producto.

Se logra la separación celular usando una centrífuga continua, un sistema de filtración de espiral enroscada ó de fibra hueca, sistema de filtro de cerámica u otro separador sólido/líquido. Puede recuperarse el etanol del permeado (ó alternativamente el efluente del reactor 5 si es que no se emplea separación celular) mediante una variedad de técnicas que incluyen destilación y adsorción. Se separa el permeado 8 en una columna de destilación para producir una cabeza 10 de etanol del 95% y agua 11 para ser retornada al reactor 3. El agua de reciclado 11 tiene un exceso de nutrientes no empleados en la fermentación, pero cualquier exceso de vitaminas de la fermentación ó de la lisis celular es destruido por destilación térmica. Se envía la cabeza 10 de etanol del 95% a un tamiz molecular 12 donde se separa el etanol anhidro 13, el producto final deseado, del etanol diluido 14, el cual es retornado a la columna de destilación 9.

La combinación continua de crecimiento, muerte y purga celular mantiene una concentración celular constante, tal que un método continuo usado para producir etanol (y pequeñas cantidades de ácido acético) puede operar por muchos meses siendo alimentado con CO_{2}, CO y H_{2} junto con nutrientes, sin necesidad de suministro adicional del cultivo. Los métodos de ésta invención mantienen y controlan las condiciones para la producción continua de etanol y ácido acético y previene o corrige rápidamente los desajustes del método. Los métodos de ésta invención también ayudan a prevenir la aclimatación del cultivo a baja concentración de nutrientes, lo cual puede ir en detrimento del desempeño del cultivo. En las descripciones de abajo y en los ejemplos, a menos que se establezca de otro modo, la presión empleada es de 1 atmósfera y la temperatura empleada está entre 36-41ºC. Las temperaturas y presiones deseables pueden ser determinadas por una persona diestra en el tema, dependiendo del microorganismo seleccionado para uso en el biorreactor.

Una variedad de manipulaciones, descritas específicamente abajo, adicionadas a los pasos básicos de ésta invención, permiten un aumento en la producción de etanol. La limitación del nutriente pantotenato en fase líquida y preferiblemente la limitación del nutriente cobalto en fase líquida, ó el empleo de un exceso de CO o H_{2} son los pasos del método de la invención, descritos en detalle abajo, usados para alcanzar y mantener la productividad deseada de etanol y permitir la producción de concentraciones y relaciones estables de etanol a acetato en el caldo de fermentación. Estas condiciones permiten la producción de concentraciones estables de etanol y acetato en el caldo de fermentación. En una modalidad preferida, la relación de etanol a acetato producidos en el caldo de fermentación es superior a 10:1 y la concentración de etanol es mayor a 15 g/L.

A. Limitación de Pantotenato de Calcio

La manipulación de las rutas biológicas para favorecer la producción de etanol y limitar la producción de ácido acético involucran limitar la cantidad de pantotenato de calcio en el medio nutriente hasta una cantidad tal que es menor que la requerida para mantener las bacterias en una concentración estable de estado estable la cual podría emplear totalmente el pantotenato de calcio suministrado. El pantotenato es un componente de AcetilCoA y por ello, limitando el pantotenato de calcio en el medio nutriente, se reduce la velocidad del ciclo de AcetilCoA frente a la velocidad del ciclo de CO. Esto genera una construcción de ferredoxina reducida y la reducción de NAD(P) a NAD(P)H, incrementando de éste modo la producción de etanol como el producto final.

La limitación del Pantotenato es observada cuando los \mug de pantotenato de calcio alimentados al reactor por gramo (g) de células secas producidas en el reactor está en el rango de 0,5 a 50. Una limitación más deseable de pantotenato está en el rango de 2 a 50 \mug de pantotenato de calcio por gramo (g) de células secas producidas en el reactor. Otra modalidad de ésta limitación está en aproximadamente 1 a 25 \mug de pantotenato de calcio por gramo (g) de células producidas en el reactor. Otra modalidad de ésta limitación está en aproximadamente 10 a 30 \mug de pantotenato de calcio por gramo (g) de células producidas en el reactor. Esta cantidad de nutriente mantiene la producción de etanol en preferencia a la producción de acetato. En el Ejemplo 4 se ilustra una modalidad de éste método.

En otro aspecto de éste método, se evita la aclimatación de la bacteria en el biorreactor de fermentación ante bajas concentraciones del pantotenato de calcio limitante, mediante la regulación ó ajuste de los parámetros de fermentación, de manera que se mantiene una concentración estable de pantotenato de calcio, mientras que se ajusta por lo menos uno, y a veces más de uno, de éstos parámetros: velocidad de alimentación del gas, velocidad de alimentación del líquido, velocidad de agitación ó presión parcial de H_{2}. Se evitan cambios mayores en los nutrientes, pero se mantiene una concentración de alimentación de nutriente relativamente constante. Si se permite que el cultivo se aclimate a bajos nutrientes en la fase líquida, ocurren bajas relaciones de producto de 1,0 g de etanol/g de acetato ó menos, en un método irreversible. Así, es necesario apagar el reactor y re-inocular. Preferiblemente, la ruta biológica es controlada para favorecer la producción de etanol y limitar la producción de ácido acético suministrando primero un exceso de H_{2} en el gas de alimentación al biorreactor y luego limitando el pantotenato de calcio en el medio como se describió arriba.

En efecto, en el arranque se mantiene un exceso del pantotenato de calcio, nutriente de fase líquida que es normalmente limitante, para evitar la aclimatación a bajas concentraciones de nutriente, una condición que puede resultar en un muy pobre desempeño y la pérdida de la capacidad del cultivo para alcanzar altas productividades de etanol de más de 10 g/L por día. si no se emplea exceso de H_{2}. En el Ejemplo 17 se ilustra tal regulación de los parámetros de fermentación para un cultivo bacteriano particular.

B. Limitación de cobalto

En una modalidad de ésta invención, se limita la cantidad de cobalto en el medio nutriente hasta una cantidad que es menor que la requerida para mantener las bacterias en una concentración de estado estable estacionario que emplearía completamente el cobalto suministrado, manipulando de este modo adicionalmente las rutas biológicas para favorecer la producción de etanol y limitando la producción de ácido acético. Se observa limitación de cobalto cuando los microgramos (\mug) de cobalto alimentados al reactor por g de células (peso seco) producidas en el biorreactor están en el rango de 5 a 100. Preferiblemente, una limitación de cobalto implica suministrar al reactor cerca de 20 a 50 \mug de cobalto por g de células producidas en el reactor. Esta cantidad de cobalto mantiene la producción de etanol en preferencia sobre el acetato en el proceso. El Ejemplo 18 ilustra una modalidad del método del cobalto limitante en el reactor, de acuerdo con éste método.

El cobalto limitante en el caldo de fermentación también puede reducir la velocidad del ciclo de Acetil CoA. Puesto que el cobalto es usado para transferir un grupo metilo desde el ciclo THF hasta el ciclo Acetil CoA, la limitación de la cantidad de cobalto en el caldo de fermentación también reduce la función del ciclo THF, al no permitir la transferencia. La limitación del cobalto reduce la velocidad del ciclo THF, lo cual también genera una mayor relación NAD(P)H a NAD(P), produciendo por ello etanol.

El método es manipulado adicionalmente, previniendo la aclimatación a bajas concentraciones de cobalto limitante. Con mucho, de la misma forma que se evita la aclimatación a bajas concentraciones de pantotenato de calcio, se mantiene una concentración constante de cobalto mientras se ajusta uno ó más parámetros de la fermentación (velocidad del gas, velocidad del líquido, velocidad de agitación, contenido de CO_{2} ó presión parcial de H_{2}). Se evitan cambios mayores en los nutrientes, pero en lugar de ello se mantiene una concentración de alimentación de nutriente relativamente constante. En el Ejemplo 19 se ilustra tal regulación de los parámetros de fermentación para un cultivo bacteriano particular.

Preferiblemente se controla la ruta biológica para favorecer la producción de etanol y limitar la producción de ácido acético, alimentando primero un exceso de H_{2} al reactor y luego limitando el cobalto en el medio nutriente como se describió arriba. En el arranque, se mantiene un exceso de cobalto, nutriente de fase líquida que es limitante, para evitar la aclimatación a bajas concentraciones de nutriente, una condición que puede resultar en un muy pobre desempeño del cultivo y la pérdida de la capacidad del cultivo para producir relaciones de producto superiores a 1:1.

C. Sobredosificación de Hidrógeno

En otra modalidad, la manipulación de las rutas biológicas para favorecer la producción de etanol y limitar la producción de ácido acético, involucra adicionalmente alimentar un exceso de H_{2} en el gas de alimentación, ó limitar el carbono gaseoso lo que resulta en exceso de H_{2}, el cual es luego usado en la ruta biológica. Preferiblemente, el gas reductor H_{2} está en exceso frente al CO y el exceso de H_{2} hace que las bacterias produzcan una alta relación etanol a acetato en el caldo de fermentación. Si la relación de H_{2} (moles de gas alimentado) a la suma de dos veces el CO convertido (en moles de gas) y tres veces el CO_{2} (en moles de gas) convertido es superior a 1, el fermentador es limitado por el carbono. El H_{2} parcial presente en el gas de salida es preferiblemente superior a 0,4 atm. Finalmente, la relación de la presión parcial de H_{2} a la presión parcial de CO_{2} debe ser superior a 3,0 para asegurar que está disponible suficiente H_{2} para usar todo el CO_{2}. Si la presión parcial del CO_{2} es superior a 0,1 atm es probable que el crecimiento haya sido limitado de otra manera. Para una ilustración de éste paso del método, ver el Ejemplo 20.

Durante el arranque, se favorece el empleo de exceso de H_{2} sobre la limitación de nutriente principalmente porque es más fácil de controlar. Los beneficios de emplear exceso de H_{2} radican en que se evita la producción excesiva de ácido acético, la cual puede llevar a pobres relaciones de producto y potencial inhibición por ácido acético así como a la aclimatación a la baja concentración de nutrientes.

D. Sobredosificación de Monóxido de Carbono

Una manipulación adicional de los componentes del método es lograda mediante la sobredosificación del gas reductor, CO, en el sustrato gaseoso para empleo en la ruta lo cual sirve para reducir directamente el potencial redox en el caldo de fermentación. Así, de acuerdo con ésta modalidad, se alimenta al biorreactor con sustrato gaseoso que incluye CO, donde la cantidad de CO presente en el biorreactor es superior a la cantidad requerida para mantener las bacterias en una concentración de estado estable estacionario que utilizaría totalmente el CO suministrado. Ocurre la sobredosificación del CO como un método para favorecer la producción de etanol sobre la producción de ácido acético cuando la velocidad específica de ingesta de CO (milimoles de CO por gramo de células (peso seco) en el reactor por minuto en mmol/g de células por min) es superior a 0,5. Esto significa que en promedio cada célula está utilizando CO en su metabolismo a una velocidad de por lo menos 0,5 mmol/g por min. Preferiblemente, el CO es suministrado a una velocidad tal que la ingesta de CO está entre 0,5 y 2 mmol CO/gramo de células (peso seco) de bacterias por minuto. En otra modalidad el CO es suministrado a una velocidad de 0,5 a 1,5 mmol CO/gramo de células (peso seco) de bacterias por minuto. En otra modalidad el CO es suministrado a una velocidad de 1,0 mmol CO/gramo de células (peso seco) de bacterias por minuto. El Ejemplo 24 suministra una ilustración de una modalidad de éste paso del método.

Esta velocidad de ingesta de CO mantiene la producción de etanol en preferencia a la producción de acetato. Si el CO es suministrado tal que el CO disuelto en el caldo de fermentación es significativo por la presión del gas ó por una transferencia de masas extremadamente buena, la fermentación del caldo se vuelve más reducida. La sobredosificación de CO tiene dos beneficios adicionales. El exceso de CO puede hacer que el ciclo de CO opere a una velocidad mayor y si el ciclo de Acetil CoA es limitado de otra forma y no puede mantenerse con el ciclo de CO, se producirá ferredoxina reducida. El CO puede también hacer más lento el paso 2 (producción del ácido acético intermedio) en el método global de tres pasos, a través de la inhibición del sustrato. Esta disminución de la velocidad del paso 2 frente al paso 1 genera un exceso de NAD(P)H, lo cual conduce a la producción de etanol a expensas del ácido acético.

Aunque el exceso de CO puede generar un incremento en la producción de etanol mediante la reducción directa del potencial redox del caldo de fermentación, la presencia del exceso de CO también inhibe el crecimiento inhibiendo la CO-deshidrogenasa y por ello la ingesta de H_{2}. Infortunadamente la presencia del exceso de CO genera pobre conversión de H_{2}, lo cual puede no ser económicamente favorable. La consecuencia de la operación extendida bajo inhibición del sustrato es una pobre ingesta de H_{2}. Finalmente esto causa lisis celular y hace necesario reiniciar el reactor. Donde éste método tiene un resultado no intencionado de inhibición del sustrato CO (presencia de demasiado CO para las células disponibles) durante el crecimiento inicial del cultivo ó después del mismo, se reduce la velocidad de alimentación del gas y/o la velocidad de agitación hasta que se alivia la inhibición del sustrato. En el Ejemplo 21 se ilustra como ajustar la velocidad de alimentación del gas o la velocidad de agitación para lograr éste efecto.

E. Pasos de Manipulación Adicional

En adición a los principales pasos de incremento en el método descritos arriba, se incluyen de modo deseable varios pasos del método en el método de producción de etanol.

1. Incremento en la transferencia de masa

Tal modalidad adicional involucra asegurar que la transferencia de masas de CO ó CO y H_{2} desde el gas de alimentación hasta el caldo líquido de fermentación sea más rápida que la capacidad de las bacterias para emplear los gases disueltos. Por ejemplo, si el biorreactor que contiene C. ljungdahlii es alimentado con CO_{2}, CO y H_{2} y se opera sin limitación de nutrientes (pantotenato ó cobalto) ó la presencia de un exceso H_{2}, el crecimiento celular está limitado por la cantidad de gas transferido hasta la fase líquida y el sistema produce ácido acético como producto. Si el cultivo es alimentado en una baja cantidad de CO ó un exceso de CO y H_{2} frente al requerido por el crecimiento del cultivo, se produce etanol. Sin embargo, si se transfiere demasiado gas hasta la fase líquida para que el cultivo lo use, ocurre inhibición del sustrato, lo cual puede conducir a desajustes del cultivo y muerte celular. Por esto hay un rango muy estrecho de operación cuando hay exceso de transferencia de masas. El Ejemplo 22 suministra una ilustración de éste método.

Con referencia al ciclo de Acetil CoA, para que se produzca el exceso de ferredoxina reducida, el ciclo de CO ó la reducción de ferredoxina a través de la hidrogenasa, deben ocurrir más rápido que el ciclo Acetil CoA. Los métodos descritos acá limitan la velocidad a la cual los organismos pueden utilizar los gases disueltos, restringiendo la velocidad a la cual los nutrientes esenciales (es decir cobalto ó pantotenato de calcio, u otros sustratos tales como CO_{2} gas están disponibles para las bacterias ó suministrando en exceso sustrato H_{2} ó CO al cultivo.

Puede calcularse una velocidad teórica de transferencia de masas, que es más rápida que la velocidad a la cual las bacterias pueden emplear el sustrato, incluso sin otras limitaciones. Una vez lograda, aquella velocidad es limitada por la velocidad natural de crecimiento del organismo. Por esto la modalidad más productiva es aquella donde la transferencia de masa (velocidad de flujo de gas ó velocidad de agitación) es más rápida que la velocidad a la cual la concentración celular más alta posible, puede emplear el sustrato sin ninguna limitación. Habría un rango de operación muy estrecho puesto que la inhibición del sustrato podría causar rápidamente la muerte celular y una concentración resultante de subproductos que es tóxica para el cultivo.

2. Suministro de un exceso de CO y H_{2}

En otra modalidad de un método de ésta invención, se logra la estabilidad en la producción de alta concentración de etanol/limitado por ácido acético en los métodos en los que se limita el cobalto ó pantotenato de calcio ó se suministra una abundancia de CO ó CO y H_{2}. De acuerdo con éste paso. A medida que el cultivo emplea los sustratos gaseosos CO y H_{2} y el CO_{2} como fuente de carbono y energía, se suministran CO y H_{2} en ligero exceso. Se logra un ligero exceso de CO y H_{2} alcanzando una operación estable y luego incrementando gradualmente la velocidad de adición de gas y/o la velocidad de agitación (incrementos de 10% ó menos) justo hasta que las conversiones de CO y H_{2} comienzan a declinar. Esta es una forma de evitar la limitación en la transferencia de masa, la cual favorece la producción de ácido acético, y suministrar un exceso de ferredoxina reducida para reducir el NAD(P) a NAD(P)H y producir etanol. Si no se suministra CO y H_{2} en ligero exceso, ocurre limitación en la transferencia de masa y se balancea la ruta. Esto causa una pobre relación etanol a acetato (altas concentraciones de acetato). En últimas las altas concentraciones de acetato generan inhibición por ácido acético, la cual limita la habilidad de las bacterias para tomar H_{2} y pueden finalmente generar falla del cultivo.

Los pasos para evitar ésta limitación en la transferencia de masa incluyen un incremento en la velocidad de agitación ó en la tasa de gas para transferir más CO y H_{2} a la fase líquida y así retornar a la presencia de un ligero exceso de CO y H_{2}. Si ocurre inhibición de producto como consecuencia de limitación en la transferencia de masa, es necesario incrementar la velocidad de alimentación de líquido para eliminar la inhibición por ácido acético, mediante la dilución hasta una concentración más baja del acetato resultante. Puesto que el incremento en la velocidad de alimentación del medio incrementaría los \mug de cobalto ó pantotenato por gramos producidos de célula, esto debe ser hecho solo brevemente ó debe eliminarse el exceso de cobalto ó pantotenato ajustando la concentración del medio ó incrementando la velocidad de alimentación del agua.

3. Control de la inhibición de producto por ácido acético

En los métodos descritos arriba, puede ocurrir la inhibición de producto por ácido acético si en el biorreactor se acumula demasiado ácido acético molecular, es decir > 2 g/L, para permitir crecimiento celular y subsecuente producción de etanol. Se emplea otro paso de manipulación para evitar la falla del cultivo. Una modificación implica incrementar brevemente la velocidad de alimentación líquido ó acuosa para reducir la concentración del inhibidor ácido acético en la fase líquida, hasta menos de 2 g/L. En el Ejemplo 23 se ilustra éste paso para un cultivo particular en un reactor.

4. Paso de reciclado de agua

Aún otro paso opcional del método para mantener un cultivo estable que produzca etanol como único producto, sin producción neta de ácido acético, en los métodos de ésta invención, involucra la adición de agua reciclada desde la torre de destilación hasta el reactor de fermentación (ver Ejemplo 15). Como se anotó antes, reciclar agua (que contiene hasta 5 g/L de acetato) tiene el beneficio de reciclar el acetato producido hasta el reactor de manera que no hay producción neta de ácido acético. Así, se establece un equilibrio entre el etanol y el acetato en el reactor. Como resultado, todo el CO_{2}, CO y H_{2} alimentados al reactor y convertidos en productos generan producción de etanol, excepto los usados para mantenimiento del cultivo.

5. Reducción de la densidad celular

Aún otro paso de manipulación útil en el método es la iniciación de purgas periódicas ó continuas de células bacterianas desde el reactor para reducir la concentración celular en el biorreactor. Esta manipulación sirve para reducir la concentración celular hasta menos que una concentración celular estable de estado estable, que emplea todos los gases reductores ó sustratos nutrientes en el biorreactor. Alterando de éste modo la densidad celular, se favorece la producción de etanol sobre la producción de acetato en el biorreactor. Ver Ejemplo 25.

6. TRAC de dos pasos

Uno de los problemas asociados con la producción de etanol con limitación de medio es la habilidad ó tendencia del cultivo para adaptarse finalmente a las condiciones limitantes y no continuar produciendo etanol después de varios meses de operación. En lugar de ello, finalmente el acetato se convierte en el producto dominante. Esta aclimatación a bajas concentraciones de nutriente limitante genera un cultivo que produce más ácido acético que etanol (relación de etanol a acetato de 1,0 ó menos) y rinde bajas concentraciones de etanol (algunas veces tan bajas como 1 g/L). La adaptación ocurre con mayor probabilidad cuando durante el arranque no se suministran al cultivo suficientes nutrientes, pues allí la velocidad de crecimiento es más importante que la velocidad de producción de etanol. Además, existe el peligro de que el cultivo pueda aclimatarse a bajas concentraciones de nutriente limitante durante la operación de estado estable, particularmente puesto que las concentraciones de nutriente limitante son ajustadas hacia abajo para desembarazar al sistema de reacción del acetato.

Para evitar esta adaptación cuando se emplean pasos limitantes por pantotenato ó cobalto, en vez de permitir que el cultivo crezca con los nutrientes disponibles, así como evitar el peligro mencionado arriba, puede emplearse otra modificación del método. Ella es un sistema TRAC de dos pasos donde primariamente ocurre un buen crecimiento de cultivo en la primera etapa, sobre un ligero exceso de nutrientes limitantes (tal vez con producción acompañante de ácido acético), seguido por una etapa de producción donde el cultivo de la primera etapa está limitado por el nutriente limitante y es empleado para producir altas concentraciones de etanol. Esta modificación facilita el mantenimiento de un cultivo estable, el cual no se aclimata a concentraciones reducidas de pantotenato ó cobalto. Dicha modificación implica operar un TRAC de dos etapas, en el cual un reactor de crecimiento (Etapa 1) alimenta a un reactor de producción (Etapa 2) en el cual ocurre el grueso de la producción de etanol. El reactor de crecimiento no es operado con los pasos de limitación de nutriente descritos arriba, de manera que el cultivo no es tan susceptible a la aclimatación a una condición limitada.

En la figura 2 se muestra un diagrama esquemático de éste sistema de dos etapas TRAC, y la siguiente descripción hace referencia a ésta figura. De acuerdo con ésta modalidad, la Etapa de Crecimiento es operada a un tiempo de retención de líquido (TRL) de aproximadamente 24 horas. La Etapa de Crecimiento TRAC 1 es alimentada con suficiente pantotenato ó cobalto en el medio 2 para dar un cultivo saludable (e igualmente puede producir algo de ácido acético). Así, en el reactor es producido un exceso de ácido acético, pero con incremento en la estabilidad. Esta concentración de pantotenato ó cobalto está en exceso frente a la que normalmente sería alimentada a un TRAC sencillo empleado para producir etanol. El gas alimentado a éste reactor es gas no convertido 3 de la Etapa de Producción 4 y el líquido alimentado es medio fresco 2. La Etapa de Crecimiento TRAC es operada sin reciclado de células. El propósito de éste reactor de Etapa de Crecimiento es suministrar un cultivo saludable para la producción posterior de etanol, el cual no se aclimata a bajas concentraciones de pantotenato.

El reactor de la Etapa de Producción 4 es operado a un TRL nominal de menos de 20 horas. Este TRAC con recirculación de células es alimentado con un gas de alimentación fresco 5 y puede tener bajas conversiones. El es alimentado con medio fresco de alimentación 6 así como con cultivo de alimentación 7 de la Etapa de Crecimiento. A este reactor se alimenta un mínimo de pantotenato ó de cobalto puesto que está disponible el exceso de la Etapa de Crecimiento. Se usa la recirculación celular 8 en éste reactor para lograr la máxima producción de las células retornadas al reactor 9. La concentración del etanol de salida en el producto líquido 10 debería ser superior a 20 g/L. Los rasgos del sistema TRAC de dos etapas incluyen pequeños cambios para la aclimatación a baja concentraciones de cobalto ó pantotenato; un TRL total menor ó igual a 30 horas; una productividad esperada de etanol y una concentración esperada de etanol superiores, frente a las de un TRAC sencillo del mismo tamaño.

7. Modificaciones de arranque

Aún otros pasos del método, que son empleados preferiblemente en la práctica de ésta invención, involucran la producción de células en el arranque inicial del cultivo de fermentación. Se logra este arranque de un biorreactor alimentado con CO_{2}, CO y H_{2} para producir etanol y ácido acético, mediante la inoculación por lotes a partir de cultivo madre (Ejemplo 11) ó mediante el empleo como alimentación de cultivo, de un inóculo continuo desde un reactor existente (Ejemplo 12). Como se anotó anteriormente en la discusión sobre evitar la aclimatación del cultivo a bajas concentraciones de pantotenato ó de cobalto, muy deseablemente el cultivo es llevado hasta una alta concentración celular antes de limitar los nutrientes, pero suministrando al cultivo un exceso de H_{2}. Este arranque rápido evita la aclimatación del cultivo y rinde buenas relaciones de producto (altas concentraciones de etanol y bajas concentraciones de acetato). Si no se emplea arranque rápido, pueden ocurrir pobres relaciones de producto y el cultivo puede aclimatarse a bajas concentraciones de nutriente en fase líquida y requerir reinoculación del reactor.

El reactor es arrancado con un lote de fase líquida (inicialmente el medio líquido no es alimentado de modo continuo al reactor), a bajas velocidades de agitación (tal vez 400-600 rpm en un reactor New Brunswick Scientific Bioflo ®) y al pH deseado. Así, la fase líquida en el reactor consiste en un lote de medio nutriente que contiene vitaminas y sales, con una concentración nominal de nutriente limitante, sea pantotenato de calcio ó cobalto (20 \mug/L de pantotenato ó 75 ppb de cobalto, como un ejemplo). Si se emplea un inóculo continuo de un reactor existente, probablemente no sea necesaria la operación en lote de fase líquida. En este caso, durante el arranque inicial se alimenta el gas al reactor de modo continuo, a una baja velocidad. Idealmente, en el arranque la fase gaseosa debería ser libre de CO_{2} y abundante en H_{2} y deberían mantenerse la velocidad de gas y la velocidad de agitación a bajos niveles para evitar la inhibición del sustrato por CO.

Un ejemplo general de protocolo de arranque para producir y sostener concentraciones de etanol comercialmente viables, a partir de CO_{2}, CO y H_{2} consiste en tres fases distintas: (a) un arranque inicial donde la producción celular es crítica; (b) un arranque donde la velocidad de producción se vuelve crítica; y (c) una operación de estado estable. Esencialmente, el arranque inicial se caracteriza por la inoculación de un lote líquido, con un nutriente nominal limitante, seleccionado de cobalto (75 ppb) ó pantotenato de calcio (20 \mug/L) y a un pH deseado (típicamente 4,5-5,5). Para facilitar el arranque, preferiblemente se mantienen bajas las velocidades de alimentación de gas y de agitación, mientras que se alimenta en exceso el H_{2}. La causa de la producción de etanol durante el arranque es el exceso de H_{2}. La limitación de nutriente ocurre más tarde. Así, los nutrientes líquidos en exceso están realmente presentes durante el arranque para evitar una indeseada aclimatación del cultivo a bajos nutrientes. A medida que la fermentación se desarrolla durante un período de varias horas después de la inoculación, se produce CO_{2} y se consume H_{2}. El cambio en éstas velocidades indicó que debería incrementarse nominalmente la velocidad de agitación de forma lenta (tal vez en 200-300
rpm en un reactor de laboratorio, por un período de 2 a 3 días) para evitar la limitación por transferencia de masa.

Este comienzo de la producción de CO_{2} tiene lugar mucho más rápidamente en sistemas que emplean inoculación continua, en oposición a inoculación en lote a partir de cultivo madre. Sin embargo, si se incrementa la velocidad de agitación demasiado rápido, ocurre la inhibición del sustrato por CO. Este procedimiento de vigilancia de la conversión de H_{2} (y de producción de CO_{2}) mientras se incrementa nominalmente la velocidad de agitación, ocurre a una velocidad relativamente alta hasta que se alcanza la velocidad objetivo de agitación. Durante este tiempo de incremento en la velocidad de agitación en cultivos líquidos en lote, es de la máxima importancia la producción celular en lugar de la formación de producto.

Una vez que se alcanza la velocidad objetivo de agitación (800-1.000 rpm en un reactor New Brunswick Scientific Bioflo ®) se permite que el cultivo se estabilice para confirmar la ingesta de H_{2}. El arranque se desplaza hasta un modo en el cual la velocidad de producción se vuelve importante. Es deseable tener conversiones de CO que superen el 80% y una alta presión parcial de H_{2} en el gas de salida (por lo menos 0,55 atm) para asegurar la producción de etanol mientras se limita el acetato y la concentración de ácido acético molecular libre. Entonces se inicia la velocidad de alimentación del medio líquido (para sistemas que tienen inoculación por lote a partir de un cultivo madre) para comenzar la alimentación en continuo del líquido y se aumenta la velocidad del gas en incrementos del 10% hasta la velocidad objetivo de flujo. El H_{2} permanece en exceso para evitar el exceso de producción de ácido acético. A medida que se incrementa la velocidad del gas, se limitan los nutrientes de la fase líquida (pantotenato de calcio ó cobalto) y el efecto de tal limitación es una pequeña caída en la conversión de H_{2}, a la producción objetivo.

En operación estable estacionaria, se alcanza una producción de 15-35 g/L de etanol y 0-5 g/L de acetato. En esta etapa se requieren pequeños ajustes en los nutrientes limitantes, en las velocidades de alimentación de líquido y en las velocidades de alimentación de gas y son escogidas por alguien con conocimientos en el tema y en la enseñanza de ésta invención. Si se ha de añadir reciclado de células al método para la producción de etanol, se añade en éste momento junto con un ajuste en la velocidad del gas(incremento) y concentración de nutriente (decremento).

Los métodos descritos arriba para producir de modo continuo y mantener altas concentraciones de etanol y bajas concentraciones del subproducto acetato bajo condiciones estables de operación, aumenta el empleo de la bacteria sujeto en una escala comercial de producción de etanol. Los pasos delineados en los métodos de arriba superan las limitaciones de emplear la bacteria sujeto para la producción comercial de etanol a partir de CO_{2}, CO y H_{2}. Preferiblemente, el método emplea un biorreactor continuo aunque también pueden emplearse métodos de fermentación por lote y de alimentación en lote, pero no es probable que sean económicamente viables para la producción de etanol en gran escala.

Los siguientes Ejemplos ilustran varios aspectos, métodos y pasos de los métodos de acuerdo con ésta invención. Estos Ejemplos no limitan la invención cuyo alcance está inmerso en las Reivindicaciones adjuntas y aquellos Ejemplos tales como el Ejemplo 3 que emplean la Reivindicación 1 proveniente del exterior (exceso de Pantotenato en el caso del Ejemplo 3) son incluidas sólo para propósitos comparativos.

Ejemplo 1 Un método ejemplificante de la presente invención

Se introduce continuamente un gas de síntesis ó gas agotado que contiene CO con ó sin CO_{2}/H_{2} dentro de un tanque biorreactor agitado que contiene una cepa de C. ljungdahlii, junto con un medio líquido convencional que contiene vitaminas, metales traza y sales. En la Tabla 1 abajo se reporta un medio nutriente deseable.

Durante el arranque del método empleando un inoculo de cultivo de 10% ó menos, se opera el reactor en una fase líquida por lote, en la cual no se alimenta de modo continuo el reactor con medio líquido. Así, la fase líquida en el reactor consiste en un lote de medio nutriente con una concentración nominal de nutriente limitante, sea pantontenato de calcio ó cobalto, Alternativamente también puede emplearse un medio rico que contiene extracto de levadura, tripticasa u otros nutrientes complejos.

Idealmente, en el arranque la fase gaseosa es libre de CO_{2} y contiene un exceso de H_{2}. Se mantienen en bajos niveles la velocidad del gas y la velocidad de agitación (menos de 500 rpm en un biorreactor de fermentación New Brunswick Scientific Bioflo ®) para dar CO y H_{2} en ligero exceso, pero evitando al mismo tiempo la inhibición del sustrato por CO. En un biorreactor de fermentación de laboratorio New Brunswick Scientific Bioflo ® de un litro, por ejemplo, donde la composición del gas de alimentación es 63% H_{2}, 32% CO y 5% CH_{4}, la velocidad de agitación para iniciar el arranque es de 400 rpm y la velocidad de gas es 20 ml/min. Durante el arranque, el exceso de H_{2} es la causa de la producción de etanol; la limitación por nutrientes ocurre más tarde. Así, los nutrientes líquidos en exceso (pantotenato, cobalto) están realmente presentes durante el arranque para evitar una indeseada aclimatación del cultivo a bajos nutrientes.

A medida que la fermentación se desarrolla durante un período de varias horas después de la inoculación, se produce CO_{2} a partir de la conversión de CO y se consume H_{2} junto con el CO_{2}, lo cual es una señal para incrementar nominalmente la velocidad de agitación, con objeto de evitar la limitación por transferencia de masa de gas. En el TRAC New Brunswick Scientific Bioflo ®, el gas de salida es 67% H_{2}, 25% CO, 2% CO_{2} y 6% CH_{4}. Si se incrementa la velocidad de agitación demasiado rápido, ocurre la inhibición del sustrato por CO, como se evidencia en un descenso en la concentración de CH_{4}, después de un incremento en la agitación. Así, típicamente podría incrementarse la velocidad de agitación a 200 rpm en 24 horas. Este procedimiento de vigilancia de la producción de CO_{2} (y conversión de H_{2}) mientras se incrementa nominalmente la velocidad de agitación, ocurre a una velocidad relativamente alta hasta que se alcanza la velocidad objetivo de agitación. Una velocidad de agitación objetivo típica en el biorreactor de fermentación New Brunswick Scientific Bioflo ® es 900 rpm. Durante este tiempo de incremento de velocidad de agitación en un cultivo líquido por lote, es de la máxima importancia la producción celular, en lugar de la formación de producto. Así, se obtienen concentraciones celulares de aproximadamente 1,5 g/L, donde las concentraciones típicas de producto son de 10 g/L de etanol y 2 g/L de acetato, a partir del cultivo por lote.

Una vez se ha alcanzado la velocidad de agitación objetivo, se deja que el sistema crezca hasta una ingesta máxima de H_{2}. Es deseable tener concentraciones de salida de H_{2} muy altas (típicamente > 60%) para asegurar la producción de etanol mientras se limita la producción de ácido acético. Luego se prende la alimentación del medio líquido (para sistemas que tienen inoculación por lote a partir de cultivo madre) para iniciar la alimentación continua de líquido y se incrementa la velocidad de alimentación del gas hasta la velocidad objetivo de flujo. En el biorreactor de fermentación de laboratorio New Brunswick Scientific Bioflo ® la velocidad de alimentación del líquido es típicamente 0,5 ml/min mientras se incrementa la velocidad de flujo del gas en un 10 a 15% cada 24 horas hasta una velocidad objetivo de 125 ml/min.

Es importante suministrar exceso de H_{2} en el gas de alimentación para evitar el exceso de producción de ácido acético. A medida que aumenta la velocidad de flujo de gas, aumenta la producción celular hasta que finalmente el reactor es limitado por nutrientes de fase líquida (pantotenato de calcio ó cobalto), como es evidenciado por una pequeña caída en la conversión de H_{2}, a la productividad objetivo. En el TRAC New Brunswick Scientific Bioflo ® esto se reconoce por una caída del 10% en la conversión de H_{2}, a la productividad objetivo de 20 g/L por día.

El método de producción y el sistema de reactor son entonces mantenidos a un estado estable de producción de 15 a 35 g/L de etanol y 0 a 5 g/L de acetato como productos, con sólo pequeños y ocasionales ajustes en nutrientes limitantes, velocidades de líquido y velocidad de gas.

Típicamente las condiciones de estado estable en el biorreactor de fermentación New Brunswick Scientific Bioflo ®
sin reciclaje de células, son un tiempo de retención de gas (velocidad de flujo de gas/volumen de líquido del reactor) de 20 minutos, un tiempo de retención de líquido de (velocidad de flujo de líquido/volumen de líquido del reactor) de 30 horas y una velocidad de agitación de 900 rpm, dando conversiones de CO del 92% y conversiones de H_{2} de 60% con limitación de pantotenato.

En una modalidad de éste método en la cual se adiciona reciclado de células al sistema de reactor, éste es añadido en éste momento junto con un ajuste en la velocidad de gas (incremento) y en concentración de nutriente (decremento). Con el reciclado celular en el TRAC New Brunswick Scientific Bioflo ®, típicamente el tiempo de retención de gas es de 8 minutos, el tiempo de retención de líquido es de 12 horas, el tiempo de retención celular es de 40 horas y la velocidad de agitación es de 900 rpm. Estas condiciones dan típicamente una conversión de CO del 92% y conversiones de H_{2} de 50% con limitación de pantotenato.

Ejemplo 2 Análisis de muestra vía cromatografía de gases

Para lograr y/o mantener adecuadas relación y productividad, debe tomarse periódicamente muestra en el caldo de fermentación del biorreactor de fermentación. Se toma una muestra más grande que 1,5 ml del cultivo del biorreactor. Se coloca la muestra en un tubo de microcentrífuga y éste tubo es colocado en una centrífuga Fischer Scientific Micro 14 con el balasto necesario para balancear. Se somete la muestra a 8.000 rpm durante 1,5 minutos. Se colocan 0,500 ml del sobrenadante en un vial de 1,5 ml diseñado para uso en automuestreador de cromatógrafo de gases. Una muestra de 0,500 ml de una solución de estándar interno que contiene 5 g/L de n-propanol y 5% v/v de ácido fosfórico 85% en agua desionizada. El ácido fosfórico asegura que todo el acetato es convertido en ácido acético para ser detectado por cromatografía de gases.

Luego se inyecta mediante automuestreador 1 \mul de la muestra preparada, en un cromatógrafo de gases Hewlett Packard 5890 serie II equipado con una columna capilar de sílica fundida 007 FFA Quadrex 25 m x 0,53 mm de diámetro interno. El análisis es conducido con un gas de arrastre Helio en modo de flujo dividido, con flujo dividido de 66 ml/min y purga del inyector de 7,93 ml/minuto. Se ajusta la presión de la cabeza de la columna a 4 psig lo cual da un flujo de vehículo en la columna de 7 ml/min. El programa de temperatura es 75ºC por 0,2 minutos, una rampa hasta 190ºC a una velocidad de 30ºC/minuto, y un tiempo de mantenimiento a 190ºC de 5,17 minutos. El tiempo de corrida resultante es de 8 minutos. El instrumento es calibrado para etanol (0-25 g/L), ácido acético (0-25 g/L), n-butanol (0-5 g/L) y ácido butírico (0-5 g/L). Para la calibración se emplean cinco estándares, preparados a partir de materiales grado reactivo. Si la muestra está por fuera del rango de concentración de la calibración (por ejemplo > 25 g/L), se colocan dentro del vial 0,250 ml de la muestra y 0,250 ml de agua desionizada, con 0,500 ml del estándar interno y se incluye en el análisis el factor de dilución.

Ejemplo 3 Producción de ácido en un TRAC de laboratorio, con reciclado de células

Se operó un biorreactor de fermentación de laboratorio New Brunswick Scientific Bioflo ® con reciclado celular empleando C. ljungdahlii, cepa ERI2, ATCC 55380 para la producción de ácido acético a partir de CO_{2}, CO y H_{2}. El gas de alimentación contenía 40% H_{2}, 50% CO y 10% N_{2}, y el tiempo de retención de gas en el reactor de un litro fue de 7,7 a 8,6 minutos. Se alimentó un medio líquido que contenía vitaminas, sales y elementos traza con un tiempo de retención de líquido de 2,6 a 2,9 horas. El pH fue 5,1 a 5,2, la velocidad de agitación fue de 1.000 rpm y el tiempo de retención celular fue de aproximadamente 40 horas. Bajo estas condiciones de limitación de transferencia de masa (y no limitación de nutriente) la conversión de CO fue del 94 al 98% y la conversión de H_{2} fue de 80 a 97%. La concentración celular fue de 4 a 8 g/L y el acetato producido fue de 10 a 13 g/L. No se produjo etanol. Aunque el reactor fue operado bajo limitación de transferencia de masa (limitado por la capacidad para transferir gas al cultivo) y produjo de éste modo sólo ácido acético como producto, se vigilaron los parámetros para la producción de etanol mediante limitación de pantotenato, limitación de cobalto o la presencia de exceso H_{2} y CO, con objeto de tenerlos para comparar cuando se produjera etanol como producto dominante.

Como se muestra en la Tabla 2, el d-pantotenato de calcio alimentado por unidad de células producidas fue de 1.575 a 3.150 microgramos por gramo de células producidas (\mug/g de célula producidas). Similarmente, el cobalto alimentado por unidad de células producidas fue de 1.734 a 3.468 \mug/g de célula producidas. La velocidad de ingesta específica de CO fue de 0,35 a 0,61 mmol/g de células por minuto. La relación de moles de H_{2} alimentado a la suma de dos veces las moles de CO convertido y tres veces las moles de CO_{2} convertido fue menor a 0,46. Así, ninguno de los parámetros estuvo en el rango operativo deseado para la producción de etanol por el cultivo.

Se reconoce que el pantotenato y el cobalto fueron alimentados en gran exceso al reactor mencionado arriba cuando se fabricaba ácido acético como producto, bajo la limitación por transferencia de masa. Esto es, los niveles de pantotenato y/o cobalto podrían haber descendido significativamente y aún estar por encima de los niveles de limitación de pantotenato ó de cobalto. Para ilustrar esto, se modificó el medio alimentado al biorreactor de fermentación de un litro New Brunswick Scientific Bioflo ® para reducir significativamente la adición de cobalto a un nivel tal que estuviera justo por encima de la concentración de cobalto correspondiente a la limitación de cobalto. De nuevo el reactor contenía C. ljungdahlii, cepa ERI2, para la producción de ácido acético a partir de CO_{2}, CO y H_{2}. El gas alimentado contenía 55% H_{2}, 25% CO, 15% CO_{2} y 5% CH4 (gas de referencia) y el tiempo de retención de gas fue de 7,5 a 8 minutos. Se alimentó un medio líquido que contenía vitaminas, sales y elementos traza con un tiempo de retención de líquido de 3,0 a 3,5 horas y el tiempo de retención celular fue de 40 horas. El pH fue 5,0 a 5,3, la velocidad de agitación fue de 900 a 1.000 rpm. Bajo estas condiciones la conversión de CO fue del 95 al 99% y la conversión de H_{2} fue de 94 a 98%. La concentración celular era de 2,5 a 4,0 g/L y el acetato fue el único producto, a 10-14 g/L.

El d-pantotenato de calcio alimentado al reactor por gramo de células fue de 2.250 a 3.600 \mug de pantotenato por gramo de células producidas. Se redujo el cobalto alimentado por unidad de células producidas a un rango de 62,0 a 99,2 \mug de cobalto/g de células producidas. La velocidad de ingesta específica de CO fue de 0,325 a 0,4 mmol/g de células por minuto. La relación de H_{2} alimentado a la suma de dos veces el CO convertido y tres veces el CO_{2} convertido fue de 0,875.

Ejemplo 4 Producción de etanol en TRAC's de laboratorio, con limitación de pantotenato

Se operó un biorreactor de fermentación de laboratorio New Brunswick Scientific Bioflo II ®, como un TRAC de flujo directo (sin reciclado de células) empleando C. ljungdahlii, cepa C-01, ATCC 55988 para la producción de etanol a partir de CO_{2}, CO y H_{2}, limitado por pantotenato. El gas alimentado al reactor contenía 63,3% H_{2}, 31,4% CO y 5,3% C_{2}H_{6} (gas de referencia); alimentado a un tiempo de retención de gas de 27 minutos. Se alimentó el reactor de 1,55 litros con un medio líquido que contenía sales y elementos traza y un suministro limitado de pantotenato, con un tiempo de retención de líquido de 31,4 horas. El pH fue 4,6 a 4,7, la velocidad de agitación fue de 650 rpm. Bajo estas condiciones de operación la conversión de CO fue del 98% y la conversión de H_{2} fue de 83% y la concentración celular era de 1,5 a 2,0 g/L. Se produjo etanol a una concentración de 15-19 g/L y el acetato fue producido a 1,5 g/L. La productividad del etanol varió entre 11,5 y 14,5 g/L por día.

En el análisis de los parámetros de producción de etanol, se observó la limitación por pantotenato, operando con una relación de alimentación de pantotenato a producción celular de 17,7 a 23,6 \mug de pantotenato por g de célula producida. Compare ésta relación con la 2.250 a 3.600 \mug de pantotenato por gramo de células producidas y con la 1.575 a 3.150 \mug de pantotenato por gramo de células producidas en el Ejemplo 3 para producción de ácido. El cobalto alimentado por unidad de células producidas fue de 5.000 a 6.000 \mug de cobalto/g de células producidas, un nivel que es incluso superior al del Ejemplo 3 y asegura una no limitación por cobalto. La velocidad de ingesta específica de CO fue de 0,23 a 0,30 mmol/g de células por minuto. La relación de H_{2} alimentado a la suma de dos veces el CO convertido y tres veces el CO_{2} convertido fue de 1,03 y la presión parcial del H_{2} en el gas de salida fue de 0,55 a 0,64 atm. Es posible que bien sea el exceso de H_{2} ó la limitación por pantotenato hayan causado la producción de etanol.

La limitación por pantotenato para la producción de etanol también fue tratada en otro reactor de laboratorio New Brunswick Scientific Bioflo ® II operado con reciclado celular empleando C. ljungdahlii, cepa C-01, ATCC 55988. Este reactor fue alimentado con un gas que contenía 61,7% H_{2}, 30,6% CO y 5,2% C_{2}H_{6} (gas de referencia); a un tiempo de retención de gas de 12,3 minutos. Se alimentó al reactor de 2,4 litros con un medio líquido que contenía un suministro limitado de pantotenato junto con un exceso de sales y elementos traza, a un tiempo de retención de líquido de 24,8 horas. Se suministró reciclado celular empleando una membrana de fibra hueca de 0,2 \mum y el tiempo de retención celular fue de 69 horas. El pH fue 4,6 y la velocidad de agitación fue de 650 rpm. Bajo estas condiciones la conversión de CO fue del 90% y la conversión de H_{2} fue de 53% y la concentración celular era de 2,5 g/L. La concentración de etanol fue de 18 g/L y la concentración de acetato fue de 3 g/L. La productividad del etanol fue de 17,4 g/L por día.

En el análisis de los parámetros para la producción de etanol (Tabla 2), la relación de pantotenato alimentado por unidad de células producidas fue de 8,08 \mug de pantotenato/gramo de células producido. Nuevamente, se asegura la limitación con pantotenato operando a un nivel muy inferior que el requerido para la producción de acetato. El cobalto alimentado por unidad de células producidas fue de 3.960 \mug de cobalto/gramo de células producido. La velocidad de ingesta específica de CO fue de 0,33 mmol/g de células por minuto. La relación de H_{2} alimentado a la suma de dos veces el CO convertido y tres veces el CO_{2} convertido fue de 1,14 y la presión parcial del H_{2} en el gas de salida fue de 0,60 a 0,65 atm. El exceso de H_{2} pudo ser una razón potencial para la producción de etanol; sin embargo, el alto contenido de CO_{2} en el gas de salida (0,14 atm) muestra que el crecimiento fue limitado por el pantotenato.

En otro experimento, se alimentó C. ljungdahlii, cepa ERI2, con 1.500 a 3.600 \mug de pantotenato/gramo de células producido, durante la producción de ácido acético a partir de CO_{2}, CO y H_{2}, una condición en la cual el reactor no estaba limitado por pantotenato (ó por cualquier otra limitación, excepto por la habilidad para transferir gas al cultivo), y no se halló etanol en la corriente de producto.

Durante la limitación por pantotenato para producir etanol a partir de CO_{2}, CO y H_{2}, se alimentó C. ljungdahlii, cepa C-01, con 8 a 24 \mug de pantotenato/gramo de células producido, mientras se mantenían en exceso todos los otros nutrientes. Bajo éstas condiciones, la cepa C-01 produjo 15 a 19 g/L de etanol y 1,5 a 3,0 g/L de acetato.

Ejemplo 5 Producción de etanol en TRAC´s de laboratorio, con limitación de cobalto

Se operó un biorreactor de fermentación de laboratorio New Brunswick Scientific Bioflo II ®, como un TRAC de flujo directo (sin reciclado de células) empleando C. ljungdahlii, cepa C-01, ATCC 55988 para la producción de etanol a partir de CO_{2}, CO y H_{2}, limitado por cobalto. El gas alimentado al reactor contenía 60% H_{2}, 35% CO y 5% CH_{4} (gas de referencia) y fue alimentado a un tiempo de retención de gas de 14 minutos. Se alimentó el reactor de 2,5 litros con un medio líquido que contenía en exceso vitaminas, sales y elementos traza (excepto para el cobalto, que era limitante) con un tiempo de retención de líquido de 40 horas. El pH fue 4,9 y la velocidad de agitación fue de 650 rpm. Bajo estas condiciones de operación la conversión de CO fue del 91% mientras la conversión de H_{2} varió entre 20% y 80%, pero fue nominalmente 55%. Se produjo etanol a 26 g/L y acetato a 4 g/L, y la concentración celular era de 2,5 g/L. La productividad del etanol fue de 15,6 g/L por día.

En el análisis de los parámetros para la producción de etanol, la relación de pantotenato alimentado sobre la producción celular fue de 15,2 \mug de pantotenato/gramo de células producido. Este nivel fue lo suficientemente bajo, tal que la limitación por cobalto podría no ser asegurada a favor del pantotenato. La limitación por cobalto fue vista operando con 33,3 \mug de cobalto/gramo de células producido, un nivel que es 100 veces menor que el empleado en reactores sin limitación por cobalto.

La relación de H_{2} alimentado a la suma de dos veces el CO convertido y tres veces el CO_{2} convertido fue de 0,94. La velocidad de ingesta específica de CO fue de 0,37 mmol/g de células por minuto.

También se demostró la limitación por cobalto para la producción de etanol, en un TRAC con reciclado de células empleando C. ljungdahlii, cepa C-01, ATCC 55988. Se efectuó este experimento para demostrar la limitación por cobalto en presencia de exceso de pantotenato, en contraste con el reactor previo de éste ejemplo.

Se alimentó el biorreactor de fermentación de laboratorio New Brunswick Scientific Bioflo 2000 ® con una membrana de fibra hueca de 0,2 \mum para reciclado de células, con gas que contenía 60% H_{2}, 35% CO y 5% CH_{4} (gas de referencia) a un tiempo de retención de gas de 5 minutos. Se alimentó el reactor de 1,2 litros con un medio líquido que contenía en exceso vitaminas, sales y elementos traza (nuevamente, excepto para el cobalto, que era limitante) a un tiempo de retención de líquido de 16 horas. El pH fue 5,1 y la velocidad de agitación fue de 825 rpm. El tiempo de retención celular en éste TRAC con fibra hueca para reciclado celular fue de 40 horas. Bajo estas condiciones de operación la conversión de CO fue del 83%, la conversión de H_{2} fue de 50% y la concentración celular fue de 4,2 g/L. La concentración de etanol fue 18 g/L y la de acetato fue 4 g/L. La productividad del etanol fue de 27 g/L
por día.

Atendiendo los parámetros para la producción de etanol en éste reactor (Tabla 2), la relación de pantotenato alimentado a producción celular fue de 85,7 \mug de pantotenato/gramo de células producido, un nivel que era 5,5 veces superior que el del reactor previo en éste ejemplo. La limitación por cobalto fue vista operando con 47,6 \mug de cobalto/gramo de células producido. La relación de H_{2} alimentado a la suma de dos veces el CO convertido y tres veces el CO_{2} convertido fue de 1,03 y la presión parcial del H_{2} en el gas de salida fue de 0,60 atm. Nuevamente, el exceso de H_{2} pudo ser una razón potencial para la producción de etanol; sin embargo, el alto contenido de CO_{2} en el gas de salida (0,1 a 0,15 atm) muestra que el crecimiento fue limitado por el cobalto. La ingesta específica de CO fue de 0,50 mmol/g de células por minuto.

Ejemplo 6 Producción de etanol en TRAC´s de laboratorio, cuando se opera con exceso de CO

Se operó un reactor de alta presión AUTOKLAV® (Buchi) como un TRAC con recirculación de cultivo y reciclado celular, empleando C. ljungdahlii, cepa C-01, para la producción de etanol a partir de CO_{2}, CO y H_{2}, en la presencia de un exceso de CO por un período de 50 horas. El reactor fue operado a 25 psig y alimentado con gas que contenía 57% H_{2}, 36% CO y 6% C_{2}H_{6}. El tiempo de retención de gas fue variable pero nominalmente era de 3,0 minutos. Se alimentó el reactor de 600 ml con un medio líquido que contenía en exceso vitaminas (incluyendo pantotenato), sales y metales traza a un tiempo de retención de líquido de 8,2 horas. El tiempo de retención celular, obtenido pasando el efluente del reactor a través de un filtro de cerámica hueca, fue de 18,5 horas. El pH fue 4,5 y la velocidad de agitación fue de 450 rpm y la velocidad de recirculación de líquido fue de 0,4 a 0,5 gpm. Bajo estas condiciones las conversiones fueron variables, pero la conversión de CO fue nominalmente del 72% y la conversión de H_{2} fue nominalmente de 12%. La concentración celular era de 2,7 g/L. Se produjo etanol a 9,9 g/L y se produjo acetato a 2,6 g/L y. La productividad del etanol fue de 29,0 g/L por día.

En el análisis de los parámetros para la producción de etanol, la relación de pantotenato alimentado sobre la producción celular fue de 97 \mug de pantotenato/gramo de células producido. Este nivel fue lo suficientemente alto, para asegurar que el pantotenato no era limitante. La relación de cobalto alimentado frente a la producción celular fue de 836 \mug de cobalto/g de células producidas, nuevamente un nivel que asegura que el cobalto no era limitante. La relación de H_{2} alimentado a la suma de dos veces el CO convertido y tres veces el CO_{2} convertido fue de 1,09 y la presión parcial del H_{2} en el gas de salida fue de 1,6 atm. El alto contenido de CO_{2} en el gas de salida (0, 5 atm) asegura que el exceso de H_{2} no generó producción de etanol. La velocidad de ingesta específica de CO fue de 1,34 mmol/g de células por minuto, un nivel que asegura un exceso de CO como un método para producir etanol.

La técnica para emplear un exceso de CO para la producción de etanol fue también demostrada en otro experimento con C. ljungdahlii, cepa C-01, en el sistema de reactor AUTOKLAV® (Buchi), nuevamente con reciclado celular y con recirculación de cultivo, por un período de 24 horas. En éste experimento, se alimentó el reactor de 600 ml con un gas que contenía 15,8% H_{2}, 36,5% CO, 9,3% de CO_{2} y 38,4% de N_{2} a un tiempo de retención de gas de 1,4 minutos. Se mantuvo la presión del reactor en 40 psig. Se alimentó el reactor con un medio líquido que contenía en exceso vitaminas, sales y elementos traza a un tiempo de retención de líquido de 4,8 horas, y el tiempo de retención celular, obtenido pasando efluente a través de un filtro de fibra cerámica hueca, fue de 19,2 horas. El pH fue 4,5 y la velocidad de agitación fue de 1.000 rpm y la velocidad de recirculación de líquido fue de 0,4 a 0,5 gpm. Bajo estas condiciones, la conversión de CO fue del 71,6% y la conversión de H_{2} de 11,8%. La concentración celular era de 7,1 g/L, se produjo etanol a 12,0 g/L y se produjo acetato a 2,7 g/L y. La productividad del etanol fue de 60 g/L por día.

En el análisis de los parámetros para la producción de etanol (Tabla 2), la relación de pantotenato alimentado sobre la producción celular fue de 294 \mug de pantotenato/gramo de células producido. De lejos éste nivel está en exceso sobre el nivel mínimo requerido para generar producción de etanol debida a la limitación de pantotenato. La relación del cobalto alimentado sobre producción celular fue de 735 \mug de cobalto/gramo de células producido nuevamente un nivel que asegura que el cobalto fue alimentado en exceso. La relación de H_{2} alimentado a la suma de dos veces el CO convertido y tres veces el CO_{2} convertido fue de 0,3. La velocidad de ingesta específica de CO fue de 0,67 mmol/g de células por minuto, un nivel que asegura nuevamente que hay disponible exceso de CO, como en el método que hace que el etanol sea producido.

Ejemplo 7 Producción de etanol con exceso de H_{2} presente

Se operó un biorreactor de fermentación de laboratorio New Brunswick Scientific Bioflo II ®, como un TRAC de flujo directo (sin reciclado de células) empleando C. ljungdahlii, cepa C-01 ATCC 55988, para la producción de etanol a partir de CO_{2}, CO y H_{2}, en presencia de exceso de H_{2}. El gas alimentado al reactor contenía 77% H_{2}, 19% CO y 4% CH_{4} (gas de referencia), alimentado a un tiempo de retención de gas de 30 minutos. Se alimentó el reactor con un medio líquido que contenía en exceso vitaminas, sales y elementos traza con un tiempo de retención de líquido de 36 horas. El pH fue 5,0 y la velocidad de agitación fue de 1.000 rpm. Bajo estas condiciones de operación la conversión de CO fue del 97-99% y la conversión de H_{2} fue de 60% a 80%. La concentración celular era de 0,8 a 1,0 g/L. La concentración de etanol fue de 10 g/L y la concentración de acetato fue de 3,3 g/L. La productividad del etanol fue de 6,7 g/L por día.

En el análisis de los parámetros para la producción de etanol, la relación de pantotenato alimentado sobre la producción celular fue de 900 a 1.125 \mug de pantotenato/gramo de células producido, asegurando así que había presente exceso de pantotenato. Similarmente, la relación de cobalto alimentado frente a la producción celular fue de 991 a 1.239 \mug de cobalto/g de células producidas, nuevamente asegurando así que había presente exceso de cobalto. La velocidad de ingesta específica de CO fue de 0,28 a 0,35 mmol/g de células por minuto, un nivel tal que el exceso de CO no era una causa para producir etanol. La relación de moles de H_{2} alimentado a la suma de dos veces las moles del CO convertido y tres veces las moles del CO_{2} convertido fue de 1,96, una relación que es superior a 1,0, el nivel donde está presente el exceso del H_{2} y que pudo así estar controlando la producción de etanol. La presión parcial del H_{2} en el gas de salida fue de 0,70-0,87 atm y la relación de la presión parcial de H_{2} a la presión parcial de CO_{2} en el gas de salida fue de 65. Así, el reactor estaba produciendo etanol debido a la presencia de exceso de H_{2}.

En un segundo experimento, se operó un reactor de alta presión AUTOKLAV® (Buchi) como un TRAC con recirculación de cultivo y reciclado celular, empleando C. ljungdahlii, cepa C-01, para la producción de etanol a partir de CO_{2}, CO y H_{2}, en la presencia de un exceso de H_{2}. El reactor fue alimentado con gas que contenía 81% H_{2}, 16% CO y 3% CH_{4} (gas de referencia) alimentado a un tiempo de retención de gas de 2,21 minutos. Se alimentó el reactor con un medio líquido que contenía en exceso vitaminas, sales y elementos traza a un tiempo de retención de líquido de 8,97 horas. El tiempo de retención celular fue de 22,7 horas, el pH fue 4,5 y la velocidad de agitación fue de 800 rpm. Bajo estas condiciones de operación, la conversión de CO fue del 91,5% y la conversión de H_{2} fue de 43,4%. La concentración celular era de 5,5 g/L y la concentración de acetato fue 2,85 g/L. La productividad del etanol en el reactor fue de 215 a 240 g/L por día.

En el análisis de los parámetros para la producción de etanol, la relación de pantotenato alimentado sobre la producción celular fue de 46 \mug de pantotenato/gramo de células producido, un nivel que puede indicar limitación por pantotenato. La relación de cobalto alimentado frente a la producción celular fue de 460 \mug de cobalto/g de células producidas, un nivel que aseguraba que el cobalto no era limitante. La velocidad de ingesta específica de CO fue de 1,68 mmol/g de células por minuto, un nivel que podría indicar que habría presente exceso de CO si no fuese por la alta velocidad de ingesta de H_{2} de 4,14 mmol/g de células por minuto, lo cual indica que no estaba ocurriendo inhibición de sustrato para la conversión de H_{2}. La relación de moles de H_{2} alimentado a la suma de dos veces las moles de el CO convertido y tres veces las moles del CO_{2} convertido fue de 5,67, una relación que está con mucho por encima de la relación requerida de 1,0, para que esté presente exceso de H_{2}. La presión parcial del H_{2} en el gas de salida fue de 2,61 atm y la relación de la presión parcial de H_{2} a la presión parcial de CO_{2} en el gas de salida fue de 10,9. Así, el reactor estaba produciendo etanol como resultado de la presencia de exceso de H_{2}.

En la Tabla abajo se da una comparación resumen de los parámetros del método y resultados, para los Ejemplos 3 a 7.

\newpage

Ejemplo 8 Desplazamiento de producto en C. ljungdahlii, cepas ERI2, C-01, y PETC usando formulaciones de medio

Los métodos de ésta invención pueden ser aplicados a cualquiera de las cepas de C. ljungdahlii. En la Tabla 3 abajo se muestran los resultados de experimentos de la manipulación de los medios empleando cepas ERI2, C-01 y PETC. El propósito de éstos experimentos era demostrar que podía desplazarse cada una de las cepas desde la producción de ácido acético hasta la producción de etanol, simplemente manipulando el medio. Así, se alimentaba un cultivo con exceso de nutrientes (incluyendo pantotenato y cobalto) para producir ácido acético como producto dominante, y luego se limitaba por pantotenato ó cobalto, para producir etanol como producto dominante. Debería enfatizarse que el único propósito de estos experimentos era demostrar que la manipulación del medio puede generar desplazamiento de producto para cada una de las cepas. Así, el foco de éstos experimentos no era el logro de altas concentraciones y productividades.

Se operó el reactor como un TRAC de flujo directo (sin reciclado de células) para cada uno de los experimentos del cultivo. El tiempo de retención de gas fue ajustado nominalmente a 50 minutos. El tiempo de retención de líquido fue ajustado nominalmente a 40 horas y la velocidad de agitación fue ajustada nominalmente a 1.000 rpm. Estas condiciones fueron elegidas para permitir hacer comparaciones entre las cepas, pero no para lograr altas productividades.

Como se nota en la Tabla 3, se nota que la cepa ERI2 fue sometida a cinco cambios de medio, lo cual desplazó los productos hacia atrás y hacia delante del ácido acético, como el producto dominante frente al etanol como producto dominante. Mediante ésta cepa se demostraron para la producción de etanol limitaciones tanto de pantotenato como de cobalto. La cepa C-01 fue desplazada tres veces usando manipulación de medio, nuevamente demostrándose tanto la limitación por pantotenato como la limitación por cobalto, como mecanismo para la producción de etanol. La cepa PETC fue desplazada sólo una vez, con producción de etanol debida a limitación por cobalto. Cada una de las cepas mostró conversiones de H_{2} más altas cuando producían ácido acético, que cuando producían etanol como producto dominante. Esto ocurre porque el ácido acético es producido bajo limitación de transferencia de masas (limitando la cantidad de gas al cultivo), mientras que se produce etanol cuando se limitan los nutrientes, y así se suministra exceso de gas lo cual puede afectar negativamente la conversión de gas. Cuando el producto dominante es etanol, siempre están presentes pequeñas cantidades de acetato en la corriente de producto. Sin embargo, cuando el ácido acético es el producto dominante, usualmente el etanol no está presente en concentraciones mensurables. En el desplazamiento de los productos dominantes desde etanol hasta ácido acético mediante la manipulación del medio, se demostró que era muy difícil remover todas las trazas de etanol. La remoción completa de etanol ocurrió sólo después de varias semanas de operación continua sobre un medio de incremento de ácido acético.

Ejemplo 9 Operación de estado estable, con y sin reciclado celular

El fin comercial último de producir etanol a partir de CO_{2}, CO y H_{2}, es alcanzar altas concentraciones de etanol en estado estable, mientras que al mismo tiempo se obtienen altas relaciones de producto etanol a acetato y alta productividad. En la Tabla 4 se muestran los datos de estado estable, para la producción de etanol a partir de gas rico en CO que contiene 20% H_{2}, 65% CO, 10% de CO_{2} y 5% de CH4 empleando C. ljungdahlii, cepa C-01, en un TRAC de flujo directo (sin recirculación celular). En la Tabla, GRT se refiere al tiempo de retención de gas (relación de volumen de líquido a rata de flujo de gas de entrada), LRT se refiere al tiempo de retención de líquido (relación de volumen de líquido a rata de flujo de líquido) y XRT se refiere al tiempo de retención celular (cantidad promedio de tiempo que gastan las células en el reactor). Como se nota en la Tabla 4, se obtuvieron concentraciones de etanol entre 17,5 y 33 g/L y la productividad para el etanol varió entre 14,4 y 21,1 g/L por día.

Se muestran resultados similares para la producción de etanol a partir de un gas que no es tan rico en CO. El gas usado en el experimento, empleando C. ljungdahlii C-01, sin reciclado, para el cual se reportan los resultados en la Tabla 5, contiene 16% H_{2}, 27% CO, 6% de CO_{2} y 51% de N_{2}. Con éste gas se obtuvieron concentraciones de etanol que variaron entre 11 y 26 g/L, con 2,0 a 5,0 g/L de acetato presente como producto secundario. La productividad de etanol varió entre 11,1 y 20,1 g/L por día. La concentración de las células está basada en el peso seco de las mismas en la Tabla 5.

Finalmente, en la Tabla 6 abajo se muestran los datos de estado estable para la conversión de gas que contiene 50% H_{2}, 45% CO y 5% CH4 en un TRAC con reciclado celular empleando C. ljungdahlii, O52, Accesión ATCC 55989. Se obtuvieron concentraciones de etanol de 18 a 23,5 g/L, con concentración de 3,0 a 5,7 g/L de acetato. La productividad de etanol varió entre 21,1 y 39 g/L por día.

Ejemplo 10 Alta productividad de etanol en un TRAC con recirculación celular y presión

Se operó un reactor de alta presión AUTOKLAV® (Buchi) como un TRAC con recirculación de cultivo y reciclado celular, empleando C. ljungdahlii, cepa C-01, para la producción de etanol a partir de CO_{2}, CO y H_{2}. El reactor fue operado a 30 psig y alimentado con gas que contenía 62% H_{2}, 31% CO y 5% C_{2}H_{6}. El tiempo de retención de gas fue de 1,14 minutos (con base en la presión atmosférica), con un tiempo real de retención de gas de 3,5 min. Se alimentó el reactor de 600 ml con un medio líquido que contenía en exceso vitaminas, sales y elementos traza a un tiempo de retención de líquido de 3,6 horas. El pH fue 4,5 y la velocidad de agitación fue de 825 rpm. Bajo estas condiciones la concentración celular era de 8 g/L. La conversión de CO fue del 90% y la conversión de H_{2} fue de 40%. La corriente de producto contenía 20 g/L etanol y 2,75 g/L de acetato. La productividad del etanol fue de 150 g/L por día.

En otro reactor de alta presión AUTOKLAV® (Buchi) operado como un TRAC con recirculación de cultivo y reciclado celular, empleando C. ljungdahlii, cepa C-01, para la producción de etanol a partir de CO_{2}, CO y H_{2}, el reactor fue operado a 6 atm (75 psig) y alimentado con gas de síntesis que contenía 55% H_{2}, 30% CO, 10% de CO_{2} y 5% CH_{4}. El tiempo de retención de gas fue de 1 minuto (con base en la presión atmosférica), con un tiempo real de retención de gas de 6,0 min. Se alimentó el reactor con un medio líquido que contenía en exceso vitaminas, sales y elementos traza a un tiempo de retención de líquido de 1,62 horas. El tiempo de retención celular fue de 24 horas. El pH fue 4,5 y la velocidad de agitación fue de 800 rpm. Bajo estas condiciones la concentración celular era de 2,0 g/L. La conversión de CO fue del 95% y la conversión de H_{2} fue de 60%. La corriente de producto contenía 25 g/L etanol y 3 g/L de acetato. La productividad del etanol fue de 369 g/L por día.

Ejemplo 11 Arranque a partir de cultivo madre con exceso presente de H_{2}

El arranque empleando un inóculo de lote a partir de cultivo madre asegura un inóculo saludable libre de contaminantes, pero no siempre es exitoso como procedimiento de inoculación debido a la más bien baja densidad celular empleada, especialmente si los parámetros del método, tales como velocidad de gas y velocidad de agitación, son empujados hacia arriba muy rápidamente justo después de la inoculación.

En éste ejemplo se discute el arranque empleando inóculo por lote a partir de cultivo madre. Para preparar los cultivos madre para la inoculación del reactor, se hicieron crecer cultivos de C. ljungdahlii, cepa C-01 (Accesión ATCC 55988), en botellas de suero de 150 ml sobre CO_{2}, CO y H_{2}, en un medio de cultivo que contenía 1 g/L de extracto de levadura y 1 g/L de tripticasa, rico en sales y vitaminas. La concentración empleada de vitamina era de 0,4 ml/L de medio de una solución acuosa que contenía 50,5 mg/L de pantotenato de calcio, 20,6 mg/L de d-biotina y 50,6 mg/L de tiamina HCl. Se incubaron las botellas a 37ºC en un agitador incubador. Se hicieron crecer los cultivos hasta la fase exponencial de crecimiento, según se determinó por inspección visual. Con cada inoculación se transfirieron aproximadamente 90 ml de cultivo madre desde botellas de suero hasta 1 litro de medio, representando una inoculación de 9% en volumen. Más abajo se describe una inoculación exitosa. El procedimiento descrito puede ser repetido varias veces para obtener una inoculación exitosa.

Para obtener una inoculación exitosa, se añadieron 90 ml de inóculo a un lote de 1 litro de medio basal (mostrado en la Tabla 1) que contenía 0,4 ml/L de vitaminas y sales (t=0). La velocidad de agitación fue de 240 rpm, el pH era 5,3, la temperatura era de 38,5ºC y el tiempo de retención de gas (flujo continuo de gas) fue de 110 minutos. El gas alimentado contenía 62% H_{2}, 31% CO y 7% C_{2}H_{6}. Después de 13 horas (t=13 hr) se notó alguna conversión de CO, y a t=23 hr se aumentó la velocidad de agitación de 240 rpm a 300 rpm. A t= 27 hr se redujo el tiempo de retención de gas a 100 min, y a t=46 hr se le efectuó a éste una reducción adicional. También se efectuaron incrementos de 100 rpm a la velocidad de agitación a t=28 hr, 59 hr, 72 hr y 85 hr.

A t=110 hr el sistema estaba operando con un tiempo de retención de gas de 80 minutos y a una velocidad de agitación de 600 rpm. La concentración celular era 0,5 g/L y la conversión de CO era 35%. Aún no había conversión de H_{2}, pero se habían acumulado pequeñas cantidades de etanol y acetato (\sim 1 g/L de cada uno) en el caldo de cultivo del lote. Hasta este punto los esfuerzos se enfocaron al crecimiento celular en el reactor.

A t=120 hr se inició el flujo de medio a una velocidad de 0,4 ml/min, empleando las mismas concentraciones que las de un medio basal. Luego se inició un programa de incrementos nominales de la velocidad de gas, velocidad de agitación y velocidad de medio, mientras el sistema era cuidadosamente mantenido bajo exceso de H_{2}. A t=210 hr la concentración de etanol era 17 g/L, la concentración de acetato era 1 g/L, la concentración celular era 1,6 g/L, la conversión de CO era casi 100% y la conversión de H_{2} era 90%. La productividad de etanol alcanzó 11,4 g/L
por día.

Nuevamente se inició un programa de incrementos graduales de velocidad de gas. Se hicieron incrementos concurrentes de vitamina (ver Tabla 1), para llevar la velocidad de adición de vitamina a 0,7 ml/L de medio. A t=610 hr el reactor estaba produciendo 20 g/L de etanol y aproximadamente 2 g/L de acetato. La conversión de CO era casi 100% y la conversión de H_{2} era 85%. La productividad de etanol alcanzó 14 g/L por día.

Ejemplo 12 Arranque empleando inóculo a partir de TRAC existente

El arranque de un TRAC empleando inóculo continuo a partir de un TRAC existente es mucho más rápido y confiable que un arranque con cultivo madre en botellas por lote. Se reinició un TRAC que contenía C. ljungdahlii, cepa C-01 (Accesión ATCC 55988) aislado, cuya producción de etanol había cesado casi por completo y estaba produciendo 2-3 g/L de etanol, 7-8 g/L de acetato y aproximadamente 0,3 g/L de butanol como productos de fase líquida, usando un inóculo continuo a partir de un TRAC existente.

El TRAC a partir del cual se tomó el inóculo estaba produciendo aproximadamente 17 g/L de etanol y 1-2 g/L de acetato, mientras que operaba a un tiempo de retención de gas de 25 minutos, tiempo de retención de líquido de 32 horas, un velocidad de agitación de 650 rpm, una temperatura de 38,5 y un pH de 4,66. La concentración celular era 1,7 g/L, la conversión de CO era esencialmente 100% y la conversión de H_{2} era de 85%.

Se inició la adición continua de inóculo (t=0), y a este tiempo se redujo la velocidad de agitación a 500 rpm y se ajustó el tiempo de retención de gas a 38 min. El fluente del reactor productivo (0,5 ml/min) sirvió como inóculo continuo para el TRAC que estaba siendo inoculado, donde la inoculación continua ocurría sobre un período de varias horas. A t=5 hr (5 horas después del inicio de la inoculación continua), se notó conversión de gas, y se incrementó la velocidad de agitación a 700 rpm. El inóculo continuo se suspendió a t=28 hr. Las conversiones de gas mejoraron de modo estable, permitiendo incrementos estables en la velocidad del gas (tiempos reducidos de retención de gas) y un incremento en la velocidad de agitación hasta 750 rpm. A t= 30 hr la conversión de CO era 95% y la conversión de H_{2} era de 80%. La concentración de etanol era 13 g/L, la concentración de acetato era 1,5 g/L, y se estabilizó en 1,4 g/L hasta más allá de las 100 horas. Durante éste período de tiempo la productividad de etanol fue de 10 a 15 g/L por día.

Ejemplo 13 Recuperación luego de severos inconvenientes del método

Un TRAC con reciclado celular que contiene C. ljungdahlii, cepa C-01 que está siendo alimentado continuamente con gas y nutrientes líquidos, y produciendo 15-35 g/L de etanol y 0-5 g/L de acetato en un estado estable (es decir Ejemplo 1), se desajusta debido a cambios inesperados en las condiciones del método, por ejemplo problemas mecánicos en el reactor. El desajuste del sistema del reactor puede ser menor, tal como un breve incremento en la velocidad del gas que causa inhibición de corto plazo del sustrato, ó mayor tal como un incremento de largo plazo de la velocidad del gas lo cual puede finalmente conducir a un incremento en la producción de ácido acético y una más severa inhibición de producto por ácido acético molecular.

Los desajustes de corto plazo son corregidos simplemente reajustando el parámetro afectado (por ejemplo reduciendo la velocidad del gas a su valor original) y vigilando el progreso del reactor para asegurar que el desajuste no ha conducido a un problema de término más largo.

Sin embargo, la inhibición de producto por ácido acético es un problema más severo. Si el cultivo produce un exceso de ácido acético molecular como un resultado de la inhibición de largo plazo del sustrato, exceso de adición de nutrientes, acumulación de CO_{2} ó problemas mecánicos de varios tipos, debe corregirse primero el problema que generó al exceso de ácido acético. El exceso de ácido acético, que conduce rápidamente a la inhibición de producto, es entonces removido del sistema mediante el incremento de la velocidad de líquido para lavar el ácido acético (e infortunadamente el etanol) del sistema. Una vez que el nivel de acetato está por debajo de 3-5 g/L, se reajusta la velocidad del líquido y se retorna el reactor a un exceso de alimentación de H_{2} ó limitación por vitamina ó cobalto (con ó sin reciclado celular). Retornar el reactor implica reducir la velocidad de gas para evitar la inhibición de sustrato y/o la velocidad de agitación antes de que tenga lugar el lavado y lisis celular. Luego se incrementa la velocidad de agitación ó la velocidad de gas, como se describió en el Ejemplo 1.

En un ejemplo específico, un TRAC con reciclado celular que contenía C. ljungdahlii, cepa C-01 y que estaba produciendo etanol y ácido acético a partir de CO_{2}, CO y H_{2}, comenzó a producir ácido acético en respuesta a un problema mecánico. El reactor de 2.100 ml fue alimentado con un gas que contenía 62% H_{2}, 31% CO y 7% C_{2}H_{6} a un tiempo de retención de gas de 15 minutos, y estaba operando a una velocidad de agitación de 600 rpm y un pH de 4,86. El tiempo de retención de liquido fue de 23 horas y el tiempo de retención celular fue de 68 horas. En el medio líquido que contenía sales y vitaminas a una concentración de 0,4 ml de solución de vitamina por litro de medio, estaba presente una solución de vitamina B (una mezcla acuosa de 50,5 mg/L pantotenato de calcio, 20,6 mg/L de d-biotina y 50,6 mg/L de tiamina HCl) Ver Tabla 2. La concentración de etanol cayó a 7 g/L mientras que la concentración de acetato subió a 7 g/L, condiciones que no son ni estables para operar el reactor ni económicas para la producción de etanol. La concentración celular era de 2,4 g/L y la conversión de CO fue del 85% y la conversión de H_{2} fue de 25%.

La estrategia usada en la recuperación del reactor consistió en primero reducir de forma dramática la velocidad de alimentación del gas al reactor, seguido por una recuperación gradual del reactor en presencia de exceso de H_{2}. En este ejemplo no se redujo la velocidad del líquido al reactor para eliminar la inhibición de producto, porque la concentración de acetato no estaba excesivamente alta. En lugar de ello, se permitió que la concentración de acetato bajara más gradualmente hasta niveles no inhibitorios, con la reducción en la velocidad del flujo de gas y subsecuente operación en presencia de exceso de H_{2}. Abajo se discute el procedimiento específico para la recuperación del reactor.

Se suspendió el reciclado celular y se redujo dramáticamente la velocidad de gas en un 70% hasta un tiempo de retención de gas de 62 minutos, mientras que se ajustó sólo ligeramente el tiempo de retención de líquido desde 23 hasta 30 horas (t=0). La concentración de vitamina en el medio no cambió. Con éste cambio en la velocidad del gas, se incrementó la conversión de CO hasta el 98% y se incrementó la conversión de H_{2} hasta el 80%. De modo más importante, el sistema tenía exceso de H_{2}, como se evidenció en el descenso del CO_{2} del gas de salida, de 19 a 5%. Con el inicio del exceso de H_{2}, la concentración de acetato cayó mientras que la concentración de etanol aumentó. A t=66 (66 horas después de suspendido el reciclado celular), por ejemplo, la concentración de acetato había caído a 4 g/L y la concentración de etanol había aumentado ligeramente a 7,5 g/L.

La presencia de exceso de H_{2} (y la caída de la concentración de acetato) permitieron subsecuentes incrementos en la velocidad del gas, primero lentamente y luego a una rata mayor. A t=215 horas el tiempo de retención de gas era de 29 min, la concentración de etanol era 12 g/L y la concentración de acetato era de 3 g/L. La productividad de etanol era 8 g/L por día. El CO_{2} estaba presente en el gas de salida al 6%, la conversión de CO fue de 98% y la conversión de H_{2} fue de 80%. A t=315 horas la concentración de etanol era de 16 g/L y la concentración de acetato era de 4 g/L, nuevamente con buenas conversiones de gas y con un tiempo de retención de gas de 20 minutos. La productividad de etanol era 11 g/L por día. A t = 465 horas la concentración de etanol había alcanzado 20 g/L, con una concentración de acetato de 3,5 a 4 g/L también presente. La productividad de etanol fue 16 g/L por día. El tiempo de retención de gas había caído a 16 minutos, con conversiones de CO y H_{2} de 95% y 73% respectivamente. Se mantuvieron estas condiciones por aproximadamente 200 horas de operación continua, demostrando que el sistema del reactor había recuperado su capacidad para producir etanol y había retenido esencialmente las condiciones previas de operación.

Ejemplo 14 Método de producción de etanol con sobresuministro de CO

Se ejecutó un experimento simple en un reactor continuo de tanque agitado de alta presión con reciclado celular, para demostrar el desplazamiento de producción de ácido acético hacia producción de etanol, debido a la presencia de altas concentraciones de CO. Previamente a éste experimento, se operó el reactor que contenía C. ljungdahlii, cepa C-01 a una presión de 20-25 psig y se le alimentó gas que contenía 57% H_{2}, 36% CO y 7% C_{2}H_{6}, el tiempo de retención de gas fue menor de 2 minutos, el tiempo de retención de líquido fue de 38 horas y el tiempo de retención celular fue de 28 horas, la velocidad de agitación fue de 600 rpm y la temperatura fue de 38°C. Bajo estas condiciones la conversión de CO fue variable y promedió 85% y la conversión de H_{2} fue variable y promedió 20%. La concentración celular era aproximadamente de 2,5 g/L y la corriente de producto contenía 9 g/L de etanol y 3 g/L de acetato.

Como un primer paso en la preparación para la prueba, se incrementó en tiempo de retención de gas para asegurar que no había exceso de CO presente. Se mantuvo la presión a 23-24 psig. Se hizo seguimiento del pH por un tiempo lo suficientemente largo para asegurar que se mantenía estable en el rango operativo normal de 4,5 a 4,6. Luego se mezcló CO puro con el gas regular de alimentación para dar un gas de alimentación de 47% H_{2}, 47% CO y 6% C_{2}H_{6} a un tiempo de retención de gas de 2,3 minutos. Luego, el pH del reactor, la composición del gas de salida y la corriente de producto fueron vigilados contra el tiempo.

La Tabla 7 muestras los cambios de pH y las composiciones de producto frente al tiempo después de la adición de CO extra al sistema. Treinta minutos después de la adición de CO, el pH del reactor se había incrementado hasta 5,25 y el cultivo se había desplazado 1,54 g/L (0,0257 mol/L) en acetato a 1,12 g/L (0,0243 mol/L) en etanol. El incremento de pH ocurrió como resultado de la conversión de ácido acético libre a etanol. Acompañando éste cambio hubo un descenso en la conversión de CO, de 91% a 71%. Al descender de 0,40 a 0,15 gpm la velocidad de circulación de cultivo, cayó el pH del reactor, pero se mantuvieron las concentraciones de etanol y acetato.

Cincuenta minutos después de la introducción del CO, la concentración de etanol era 11,29 g/L y la concentración de acetato era 1,75 g/L. En este momento se suspendió el exceso de CO y comenzaron a caer la concentración de etanol y el pH y comenzó a aumentar la concentración de acetato. El descenso en el pH se debió a la conversión de etanol en ácido acético molecular. Así, el desplazamiento etanol-ácido acético es reversible a través de la sobredosificación de CO.

Ejemplo 15 Reciclado del agua para minimizar la producción de Acetato

El reciclado del agua del método hasta el biorreactor de fermentación después de la destilación para recuperar etanol, es esencial para minimizar la producción de efluente y para maximizar el rendimiento de etanol del reactor y para limitar la producción de ácido acético. Se ha hallado que la destilación es el método más económico para concentrar el etanol de 15-35 g/L obtenido del reactor, hasta etanol del 95%. Luego se usa la adsorción con tamices moleculares para llevar adicionalmente el etanol hasta la concentración deseada. En la destilación, se obtiene etanol del 95% en agua como producto de cabeza. El agua es generada como producto de los fondos durante la destilación. El producto de los fondos contiene ácido acético del reactor, producidos durante la fermentación (3-5 g de acetato/L) y todos los ingredientes no usados durante la fermentación ó destruidos por el calor de la destilación, tales como trazas de metales y otros minerales. El reciclado de nutrientes minimiza la cantidad de efluente que debe ser tratado así como la cantidad de nutrientes que deben ser subsecuentemente añadidos al biorreactor de fermentación. El reciclado de acetato previene la formación de ácido acético adicional, estableciendo equilibrio entre el etanol y el ácido acético. Así, con el reciclado de agua, no hay producción neta de ácido acético. El reciclado de más de 3-5 g de acetato/L puede generar inhibición por ácido acético en el reactor. Así, como un resultado del reciclado de agua que contiene acetato, puede convertirse al sustrato de CO, CO_{2} y H_{2} en etanol, como único producto.

La Tabla 8 muestra los resultados de la fermentación de un gas que contiene 50% CO, 45% H_{2} y 5% CH_{4} usando C. ljungdahlii, cepa O-52, con reciclado de agua. En éstos experimentos, se envió a destilación el permeado de la filtración por fibra hueca, usado para reciclado celular. Después de la remoción del etanol, se filtró el agua con un filtro de 0,2 micrones para remover cualquier precipitado de subproductos. Comparada con el agua total alimentada al reactor (como medio) en éstos experimentos, la fracción del agua reciclada varió entre 25 y 100%. El experimento con reciclado de 100% de agua duró por cerca de 500 horas ó aproximadamente 20 tiempos de retención de líquido. Como se nota en los resultados con reciclado de 100% de agua, no hubo producción neta de ácido acético. En efecto, finalmente fue consumida una pequeña cantidad de ácido acético. La productividad de etanol varió entre 12 y 27 g/L por día.

Ejemplo 16 Sistema de TRAC de dos etapas con alimentación de pantotenato en la etapa de crecimiento

La alimentación adecuada de pantotenato en la etapa de crecimiento es una variable que debe ser optimizada. Los resultados típicos de un Reactor de Etapa de Crecimiento usando C. ljungdahlii C-01, fueron descritos en los Ejemplos 11 y 12, con la excepción de que en éste reactor se habría producido un poco más de ácido acético, porque se alimentan pantotenato ó cobalto adicionales a la Etapa de Crecimiento, para asegurar un cultivo estable y saludable. La concentración empleada de vitamina fue 0,7-0,8 ml/L de medio, de una solución acuosa que contiene 50,5 mg de pantotenato de calcio/L, 20,6 mg de d-biotina/L y 50,6 mg de Tiamina HCl/L. El TRAC con reciclado celular de la etapa de producción es alimentado con efluente del reactor de la etapa de crecimiento, y produce etanol como producto predominante. La concentración de pantotenato alimentado a éste reactor es mucho más baja que en la Etapa de Crecimiento, sólo 0,1-0,2 ml de vitaminas totales/L de medio de la solución acuosa que contiene 50,5 mg de pantotenato de calcio/L, 20,6 mg de d-biotina/L y 50,6 mg de Tiamina HCl/L. En ésta Etapa de Producción el tiempo de retención de gas fue de 11 a 30 minutos, el tiempo de retención de líquido fue de aproximadamente 20 horas, el tiempo de retención celular fue de 30 a 50 horas y la velocidad de agitación fue de 800-900 rpm. El pH fue 5,0 y la temperatura fue 38ºC. Una vez el reactor alcanzó el estado estable, el tiempo de retención de gas fue mantenido constante en 11 minutos, el tiempo de retención de líquido fue ajustado a 19 horas, el tiempo de retención celular fue constante de 37 horas y la velocidad de agitación fue de 900 rpm. La conversión de CO promedió 96% y la conversión de H_{2} promedió 60%. La concentración de etanol se estabilizó en 25-30 g/L, con aproximadamente 3 g/L de acetato también presentes. La productividad de etanol fue 31,6-37,9 de g/L por día.

Ejemplo 17 Regulación de los parámetros de fermentación para evitar la aclimatación a bajo pantotenato de calcio limitante

Se evita la aclimatación del cultivo en el biorreactor de fermentación a baja concentración limitante de pantotenato de calcio, regulando los parámetros de fermentación (velocidad de gas, velocidad de líquido, velocidad de agitación, presión parcial de H_{2}) mientras se evitan cambios mayores en nutrientes, pero en cambio manteniendo una concentración relativamente constante de alimentación de nutrientes, como sigue:

Durante el arranque de un TRAC de laboratorio New Brunswick Scientific Bioflo ®, se alimentó C. ljungdahlii cepa C-01 a una corriente de nutriente líquido que contenía vitaminas, minerales traza y las sales necesarias para suministrar nutrición al cultivo. La concentración de pantotenato en el medio nutriente fue de 20 \mug/L, una concentración que cuando es acoplada con una baja velocidad de alimentación de medio, asegura que hay más de 100 \mug/l de pantotenato de calcio alimentado por gramo de células producidas (exceso de pantotenato) debido a la baja producción celular en el reactor. Del mismo modo, la concentración de cobalto en el medio era de 1 ppm, una concentración que asegura que el cobalto también está en exceso. En cambio, se mantuvo en exceso la presión parcial de H_{2} en el gas de salida, de 0,55 atmósferas, alimentando un gas que contenía 63,3% H_{2} 31,4% CO, 5,3% C_{2}H_{6} y no contenía CO_{2}, rindiendo así una relación de H_{2} alimentado/(2 CO convertido y 3 CO_{2} convertido), superior a 1, y regulando cuidadosamente la velocidad de alimentación de gas y la velocidad de agitación para lograr una conversión de CO superior a 95% y una conversión de H_{2} superior a 80%. A medida que éstas altas conversiones son obtenidas con el tiempo, se eleva la concentración celular desde un nivel inicial de cerca de 0 g/L hasta aproximadamente 1,5 g/L.

Puesto que durante este arranque se mantiene constante la concentración de pantotenato, gradualmente se reducen los \mug de pantotenato por gramo de célula producida, hasta que son menores de 15 \mug de pantotenato por gramo de célula producida, una condición que es entonces limitación por pantotenato. Así, el sistema crece con limitación por pantotenato. A través del arranque con exceso de H_{2}, se logran altas relaciones de producto etanol:acetato. Alternativamente, se deja que el reactor produzca ácido acético durante las etapas iniciales del arranque, trayendo luego la relación de productos a un nivel bajo control, a través de la limitación por pantotenato.

Ejemplo 18 Cobalto limitante al reactor

Se alimentó C. ljungdahlii cepa ERI2 con 62 a 3.500 \mug de cobalto/gramo de célula producida, durante la producción de ácido acético a partir de CO, CO_{2} y H_{2}, una condición en la cual el reactor no estaba limitado por cobalto, (ó por cualquier otra limitación, excepto por la habilidad para transferir gas al cultivo), y no se halló etanol en la corriente de producto. Durante la limitación por cobalto para la producción de etanol a partir de CO, CO_{2} y H_{2}, se alimentó C. ljungdahlii cepa C-01 con 33 a 48 \mug de cobalto/gramo de célula producida, mientras todos los otros nutrientes eran mantenidos en exceso. Bajo éstas condiciones, la cepa C-01 produjo 18 a 26 g/L de etanol y aproximadamente 4 g/L de acetato.

Ejemplo 19 Evitar la aclimatación a baja concentración de cobalto limitante

Se evita la aclimatación a baja concentración de cobalto limitante, regulando los parámetros de fermentación (velocidad de gas, velocidad de líquido, velocidad de agitación, contenido de CO_{2}) mientras se evitan cambios mayores en nutrientes, pero en cambio manteniendo una concentración relativamente constante de concentración de alimentación de nutrientes, como sigue:

Durante el arranque de un TRAC de laboratorio New Brunswick Scientific Bioflo ®, se alimentó C. ljungdahlii C-01 a una corriente de nutriente líquido que contenía vitaminas, minerales traza y las sales necesarias para suministrar nutrición al cultivo. La concentración de cobalto en el medio nutriente fue de 75 ppb, una concentración que cuando es acoplada con una baja velocidad de medio, asegura que hay más de 50 \mug de cobalto alimentado por gramo de células producidas (exceso de cobalto) debido a la baja producción celular en el biorreactor. Del mismo modo, la concentración de pantotenato en el medio era de 20 \mug/L, una concentración que asegura que el pantotenato también está en exceso. En cambio, se mantuvo en exceso la presión parcial de H_{2} en el gas de salida, de 0,55 atmósferas, alimentando un gas que contenía grandes cantidades de H_{2} no contenía CO_{2}, y mediante la regulación cuidadosa de la velocidad de alimentación del gas y velocidad de agitación, lograr una conversión de CO superior a 95% y una conversión de H_{2} superior a 80%. A medida que éstas altas conversiones son obtenidas con el tiempo, se eleva la concentración celular desde un nivel inicial de cerca de 0 g/L hasta aproximadamente 1,5 g/L. Puesto que durante este arranque se mantiene constante la concentración de cobalto, gradualmente se reducen los \mug de cobalto por gramo de célula producida, hasta que son menores de 50 \mug de cobalto por gramo de célula producida, una condición que es entonces limitación por cobalto. Así, el sistema crece con limitación por cobalto. A través del arranque con exceso de H_{2}, se logran altos rendimientos de etanol. Alternativamente, se deja que el reactor produzca ácido acético durante las etapas iniciales del arranque, trayendo luego la relación de productos a un nivel bajo control, a través de la limitación por cobalto.

Ejemplo 20 Sobresuministro de hidrógeno

Durante la operación de un reactor AUTOKLAV® de laboratorio (Buchi), operado como un TRAC con recirculación de líquido y reciclado celular, se operó C. ljungdahlii, con exceso de vitaminas, minerales traza y las sales necesarias para suministrar nutrición al cultivo. El reactor fue operado con exceso de H_{2} presente en el gas de alimentación, tal que la relación de las moles de H_{2} alimentado a la suma de dos veces las moles de CO convertido y tres veces las moles de CO_{2} convertido fue de 5,67. Si ésta relación no fuera superior a 1,0, no podría estar presente exceso de H_{2} en el reactor y la producción de etanol, debida a la presencia de exceso de H_{2} no podría ocurrir. Además, la presión parcial de H_{2} en el gas de salida fue de 2,61 atmósferas, un nivel que excede el requerimiento de 0,4 atm para que ocurra producción de etanol debida al exceso de H_{2}. Finalmente, la relación de la presión parcial de H_{2} a la presión parcial de CO_{2} en el gas de salida fue de 10,88, un nivel que es mayor que 3,0 y que asegura que está presente suficiente H_{2} para utilizar todo el carbón disponible. Bajo estas condiciones el reactor produjo aproximadamente 26 g/L de etanol y menos de 3 g/L de acetato. La productividad del etanol fue de más de 200 g/L por día. Si cualquiera de los criterios mencionados arriba no se satisface, el reactor no puede producir etanol debido a un exceso de H_{2} presente. Otro aspecto de la abundancia de H_{2} es que genera ferredoxina reducida adicional por oxidación a través de la hidrogenasa.

Ejemplo 21 Alivio de la inhibición del sustrato por CO

Un TRAC de laboratorio New Brunswick Scientific Bioflo ® operando a una velocidad de agitación de 800 rpm muestra una concentración de CO del 10% en el gas de salida, cuando había estado operando previamente con sólo 5% CO en el gas de salida. Bajando la velocidad de agitación a 600 rpm, se eliminó la inhibición por CO y la concentración de CO en la salida retornó al 5%. Esto genera un incremento en la ingesta de H_{2} una condición necesaria para emplear de modo eficiente todo el gas alimentado al reactor.

Ejemplo 22 Transferencia de masa

Como un ejemplo de un exceso de transferencia de masa que genera producción de etanol, consideremos un TRAC de laboratorio con reciclado celular, que contiene C. ljungdahlii, cepa ERI2, operando sin limitación de nutriente ó exceso de H_{2} ó CO en el gas de alimentación. Esto es, se alimenta el pantotenato a una velocidad de más de 100 \mug de pantotenato de calcio por gramo de células producidas y el cobalto es alimentado a una velocidad de más de 100 \mug por gramo de células producidas. El H_{2} está presente en el gas de salida a aproximadamente 0,2 atm y la velocidad de ingesta específica de CO es menor de 0,3 mmol de CO/g de células por minuto. La velocidad de agitación es 800 rpm. Bajo éstas condiciones el cultivo produce sólo ácido acético (no hay etanol presente en la corriente de producto). Si se incrementa rápidamente la velocidad de agitación hasta 900 rpm ó se incrementa la velocidad del gas en aproximadamente 10%, se observa etanol en la corriente de producto, hasta que se incrementa la concentración celular con objeto de tomar el gas ó hasta que el cultivo muere debido a la inhibición de sustrato.

Ejemplo 23 Control de la inhibición de producto por ácido acético

En un TRAC de laboratorio que está produciendo 8/g/L de ácido acético y 10 g/L de etanol, se reduce el tiempo de retención de líquido de 24 horas a 12 horas por un período de 36 horas, como un intento para lavar el exceso de ácido acético del reactor, el cual está limitando la capacidad del cultivo para producir más etanol. Se mantienen constantes todas las otras condiciones operativas y nutrientes del reactor. Después de éste período de tiempo, se retorna el tiempo de retención de líquido a 24 horas y resulta una corriente de producto que tiene 3 g/L de acetato y 15-25 g/L de etanol. Para eliminar la inhibición de producto, se requieren varios intentos para reducir el tiempo de retención de líquido. Alternativamente, se añade H_{2} a la alimentación de gas para permitir el control del exceso de H_{2}, puesto que el exceso de CO_{2} puede también conducir a la producción de ácido acético en favor del etanol. Estas modificaciones previenen el exceso de producción de ácido acético y así previenen una pobre relación de producto, y una baja productividad de etanol. Después, se resume el uso de un exceso de H_{2} en el gas de alimentación ó limitación de la concentración de nutriente en fase líquida.

Ejemplo 24 Sobresuministro de monóxido de carbono

Cuando el C. ljungdahlii, cepa ERI2 fue alimentado con exceso de nutrientes (pantotenato y cobalto en exceso) y sin abundancia de H_{2} en el gas de alimentación, tuvo una velocidad de ingesta específica de CO de 0,23 a 0,48 mmol/g por minuto y no se halló etanol en la corriente de producto. Sin embargo, cuando el C. ljungdahlii, cepa C-01 fue similarmente alimentada con exceso de nutrientes y sin abundancia de H_{2} en el gas de alimentación, pero bajo una condición donde un sobresuministro de CO estaba causando la producción de etanol, la velocidad de ingesta específica de CO fue de 0,67 a 1,34 mmol/g por minuto. Bajo éstas condiciones el cultivo produjo 9,9 a 12,0 g/L de etanol y 2,6 a 2,7 g/L de acetato.

Ejemplo 25 Control de las relaciones de producto mediante purga celular

En un TRAC (pH= 5,0, temperatura 38ºC, presión 20 psig) tiene lugar la fermentación de un sustrato gaseoso (30% CO, 15% H_{2}, 10% CO_{2}, 45% N_{2}) empleando C. ljungdahlii, cepa C-01 con reciclado celular (tiempo de retención celular 40 horas y tiempo de retención de líquido 6 horas), y el crecimiento del cultivo no está limitado por pantotenato ó cobalto ó cualquier otro nutriente. A medida que el cultivo crece, se obtiene una densidad celular tal que la ingesta específica (mmol de CO por gramo de células secas por minuto) es inferior a 0,5 y se produce ácido acético preferiblemente al etanol. Para prevenir ésta ocurrencia, se incrementa la velocidad de purga celular para prevenir un incremento en la densidad celular, tal que se mantiene la concentración estable de células lo suficientemente baja para mantener una ingesta específica superior a 0,5 mmol de CO por gramo de células secas por minuto. Al hacer esto, se reduce el tiempo de retención celular a entre 6 y 25 horas.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Medio de Producción de Etanol

1

2

TABLA 3 Resumen de desplazamiento de producto con cepas de Clostridium ljungdahlii

C. ljungdahlii	Medio	Conc.	Conversión	Conversión	Concentración	Concentración
		Celular *	de Gas CO	de Gas H_{2}	de producto	de producto
Cepa	Limitación	(g/L)			Etanol	acetato
ERI2	Aumento del	1,1	90	80	0	10
	ácido acético
ERI2	Limitación del	0,3	88	20	2,5	0
	pantotenato
ERI2	Aumento del	0,55	90	85	1,0	5,5
	ácido acético
ERI2	Limitación del	0,5	90	20	10	1,0
	pantotenato
ERI2	Aumento del	0,8	100	93	1	7
	ácido acético
ERI2	Limitación	1,3	80	20	9	3
	de Cobalto
C-01	Aumento del	1,2	96	90	1	8
	ácido acético
C-01	Limitación del	0,8	60	30	4	0
	pantotenato
C-01	Aumento del	1,2	96	90	< 1	9
	ácido acético
C-01	Limitación	2,5	80	20	17	2
	de Cobalto
PETC	Aumento del	0,8	65	55	2	10
	ácido acético
PETC	Limitación	1,0	95	55	8	1
	de Cobalto
* Base peso seco de células

TABLA 4 Datos de Estado Estacionario para la Conversión de gas Rico en CO a Etanol usando Clostridium ljungdahlii cepa C-01

TRG	TRL	Velocidad	Conc.	Conversión	Conversión	Producto	Producto	Productividad
(min)	(hr)	de agitación	Celular *	de Gas (%)	de Gas (%)	(g/L)	(g/L)	de etanol
		(rpm)	(g/L)	CO	H_{2}	Etanol	Acetato	g/L por día
13	32,4	700	2,44	91	57	21,6	3,9	16,0
11,93	25,7	750	2,51	92	54	20,6	3,6	19,2
12,67	25,6	750	2,60	93	61	18,7	4,7	17,6

TABLA 4 (continuación)

TRG	TRL	Velocidad	Conc.	Conversión	Conversión	Producto	Producto	Productividad
(min)	(hr)	de agitación	Celular *	de Gas (%)	de Gas (%)	(g/L)	(g/L)	de etanol
		(rpm)	(g/L)	CO	H_{2}	Etanol	Acetato	g/L por día
10	24,5	750	2,75	92	43	2,4	6,1	20,0
11,54	23,8	750	2,65	92	40	2,4	5,3	20,6
12,10	23,8	750	2,77	88	18	21	3,1	21,1
13,8	23,8	750	2,70	90	25	18	2,5	18,2
12,7	23,8	750	2,70	92	35	20	3,8	20,2
13,3	24,0	800	2,70	85	10	17,5	5,0	17,5
14,81	31	750	2,50	92	30	25	2,5	19,4
16,9	31	750	3,60	90	18	23	3,0	17,8
18,5	33	750	2,60	94	50	24	3,5	17,5
17,2	34	750	2,50	91	40	24	3,5	16,9
18,5	34	750	2,30	95	63	23	4,0	16,2
19,2	40,6	750	2,70	94	50	28,5	4,0	17,4
19,0	55	750	2,70	94	20	33	4,0	14,4
* Base peso seco de células

TABLA 5 Datos de Estado Estacionario para la Conversión de gas que contiene 27% CO, 16% H_{2} y 51% N_{2} a Etanol usando Clostridium ljungdahlii cepa C-01. Sin reciclado celular

TRG	TRL	Velocidad	Conc.	Conversión	Conversión	Producto	Producto	Productividad
(min)	(hr)	de agitación	Celular *	de Gas (%)	de Gas (%)	(g/L)	(g/L)	de etanol
		(rpm)	(g/L)	CO	H_{2}	Etanol	Acetato	g/L por día
8,89	23,8	750	2,3	84	57	11	2,5	11,1
8,3	23,8	900	2,6	89	55	12	2,0	12,1
8,3	27,7	900	2,7	89	47	15	3,0	13,0
7,1	33,3	900	3,0	86	37	19	3,0	13,7
7,4	33,3	900	3,0	87	40	19,5	3,0	14,1
6,34	33,3	900	3,0	86	37	21	3,5	15,1
6,18	33,3	900	3,0	86	41	20,9	3,1	15,1
5,72	34,3	900	3,0	85	40	22,1	3,8	15,5
5,12	33	900	3,7	85	40	25,0	4,0	18,2
4,59	33	900	4,1	83	33	25	3,5	18,2

TABLA 5 (continuación)

TRG	TRL	Velocidad	Conc.	Conversión	Conversión	Producto	Producto	Productividad
(min)	(hr)	de agitación	Celular *	de Gas (%)	de Gas (%)	(g/L)	(g/L)	de etanol
		(rpm)	(g/L)	CO	H_{2}	Etanol	Acetato	g/L por día
4,59	29	900	4,0	80	35	23	4,0	19,0
4,76	29	900	3,9	90	35	19	5,0	15,7
4,25	28	900	4,2	80	30	23	3,0	19,7
5,5	37	900	3,4	84	40	23	3,0	14,9
5,26	31	900	3,8	84	50	23	3,0	17,8
5,71	31	900	3,7	80	28	26	3,5	20,1
6,25	31	900	3,75	82	30	25,5	3,0	19,7
6,66	31	900	3,6	86	64	22	4,0	17,0

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 6 Datos de Estado Estacionario para la Conversión de gas que contiene 50% H_{2}, 45% CO, y 5% CH_{4} a Etanol usando aislado O-52 en un TRAC con reciclado celular

TRG	TRL	LRT	Conc.	Conversión	Conversión	Producto	Producto	Productividad
(min)	(hr)	(hr)	Celular *	de Gas (%)	de Gas (%)	(g/L)	(g/L)	de etanol
			(g/L)	CO	H_{2}	Etanol	Acetato	g/L por día
12,5	46,4	23,2	3,8	96,3	81,2	20,4	4,4	21,1
9,7	43,2	17,3	4,9	86,7	49,9	21,1	3,5	29,3
9,2	43,2	17,3	4,6	89,4	64,5	20,5	5,1	28,4
7,5	43,2	17,3	5,0	81,8	42,1	22,2	3,7	30,8
9,2	49,4	17,3	4,6	85,3	52,1	21,1	4,4	29,3
8,4	46,0	16,1	4,5	85,2	61,4	20,8	5,1	31,0
6,8	54,3	16,3	4,7	84,7	57,7	23,4	5,7	34,5
7,2	54,3	16,3	4,0	83,1	55,2	19,0	4,4	28,0
7,4	54,3	16,3	5,0	86,6	66,7	21,9	5,5	32,2
6,4	55,6	16,7	5,6	83,3	53,1	23,5	4,9	33,8
6,2	41,6	14,5	5,7	82,5	55,0	20,1	5,0	33,3
6,0	41,6	14,5	6,0	82,5	50,0	21,5	3,0	35,6
6,0	34,2	12,0	5,7	84,0	56,0	19,5	4,5	39,0
5,7	34,2	12,0	5,7	81,0	45,0	18,0	4,5	36,0
* Base peso seco de células

TABLA 7 Análisis de muestra líquida y pH en desplazamiento de Acetato hasta Etanol en presencia de exceso de CO

Tiempo	pH	Conc. Celular	Etanol (g/L)	Acetato (g/L)	Butanol (g/L)
		(g/L)
0	4,69	2,4	10,3	3,1	0,3
30	5,28	-	11,4	1,5	0,3
35	5,28	2,4	11,6	1,6	0,3
50	4,98	-	11,3	1,8	0,3
80	4,73	2,4	10,9	2,9	0,3
* Base peso seco de células

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 8 Datos para la Fermentación de Gas por aislado O-52 con reciclado celular y de agua

Tiempo	% de	Conc.	Conversión	Conversión	Producto	Producto	Producto	Productividad
(hr)	reciclado	Celular	de gas (%)	de gas (%)	(g/L)	(g/L)	(g/L)	de etanol
	de agua	(g/L)	CO	H_{2}	Etanol	Acetato	Acetato	g/L por día
							neto
0-75	25	2,1	95	68	12	4	4	12
75-193	50	2,1	95	75	15	6	5	15
193-462	75	2,1	92	60	17	5	4	17
462-554	50	1,6	85	30	17\rightarrow13	5	3	12 - 16
554-669	75	2,6	92	75	13\rightarrow19	5	3	12 - 18
669-943	100	3,0	92	70	23	6	3	23
943-1.087	100	3,0	92	60	23	6	0	23
1.087-1.232	100	2,7	92	60	23	6	-0	23
1.232-1.375	100	3,0	91	60	27	6	-1	27
1.375-1.534	100	3,5	88	35	23	5	0	23
* Base peso seco de células

Claims

1. Un método continuo para producir etanol a partir de la fermentación anaeróbica bacteriana de un sustrato gaseoso que incluye monóxido de carbono, donde el método incluye cultivar en un biorreactor de fermentación unas bacterias Clostridium ljungdahlii capaces de producir etanol en un medio nutriente líquido que incluye pantotenato de calcio, y a un pH menor de 5,5, siendo la concentración de ácido acético libre en el biorreactor de fermentación menor de 5 g/L y la relación de etanol a acetato en el caldo de fermentación del biorreactor de 1:1 a 20:1, caracterizado en que se alimenta el pantotenato de calcio al biorreactor de fermentación en una cantidad de 0,5 a 50 \mug/g de células secas de bacterias producidas en el biorreactor, y que se mantiene una velocidad específica de ingesta de monóxido de carbono de por lo menos 0,5 mmol de CO/g de células secas de bacteria por minuto, donde en un estado estable se produce etanol a una productividad superior a 10 g/L por día.

2. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1, caracterizado en que el biorreactor de fermentación incluye un reactor de crecimiento que alimenta el caldo de fermentación resultante a un segundo biorreactor, en el cual se produce la mayoría del etanol.

3. Un método de acuerdo con la Reivindicación 1 ó 2, que incluye además remover el caldo de fermentación del biorreactor, destilar el etanol del caldo y recuperar el etanol.

4. Un método de acuerdo con la Reivindicación 3, que además incluye reciclar el agua que contiene acetato, desde el paso de destilación hasta el biorreactor.

5. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, caracterizado en que la bacteria Clostridium ljungdahlii es seleccionado de entre las cepas PETC, ERI2, O-52 y C-01.

6. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, caracterizado en que el sustrato gaseoso es seleccionado de entre (a) monóxido de carbono, (b) monóxido de carbono e hidrógeno, (c) monóxido de carbono, dióxido de carbono e hidrógeno y (d) cualquiera de (a) a (c) con nitrógeno ó metano.

7. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6, que además incluye un paso seleccionado de

(a): Alteración de por lo menos un parámetro seleccionado de entre contenido de nutrientes del medio, velocidad de alimentación de nutrientes, velocidad de alimentación acuosa, presión de operación, pH de operación, contenido del sustrato gaseoso, velocidad de alimentación del gas, velocidad de agitación del caldo de fermentación, concentración de producto, densidad celular, inhibición de sustrato, y combinación de los mismos.

(b): Purga periódica de las células bacterianas del biorreactor de fermentación hasta una concentración celular menor que la concentración estable que emplea todos los gases reductores ó sustratos de nutriente en el biorreactor.

(c): Incremento de la velocidad de alimentación acuosa cuando la porción de ácido acético libre del acetato presente en el caldo de fermentación excede los 2 g/L, reduciendo de éste modo cualquier incremento no deseado en la concentración de ácido acético libre.

(d): Reducción de la velocidad de alimentación del sustrato gaseoso para atenuar la inhibición por sustrato y mantener la productividad.

(e): Reducción de la velocidad de agitación para atenuar la inhibición de sustrato y mantener la productividad.

(f): Suministro del sustrato gaseoso al biorreactor de fermentación a una velocidad de 0,3 a 2 mmol de CO/g de células secas de bacterias en dicho biorreactor, por minuto.

(g): Incremento de la cantidad de CO presente en el biorreactor de fermentación, de manera que la cantidad de CO es superior a la cantidad requerida para mantener las bacterias en una concentración bacteriana estable que podría emplear completamente el CO suministrado.

(h): Mantener el CO presente en el biorreactor de fermentación en una cantidad que mantiene la producción de etanol en preferencia frente a la producción de acetato.

(i): Alimentar al biorreactor de fermentación con el medio nutriente que además incluye cobalto, donde el cobalto es mantenido en el biorreactor a una cantidad de 5 a 100 \mug de cobalto/gramo de células bacterianas secas producidas; y

(j): Elevación del pH del cultivo por encima de 4,5

\newpage

8. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 7, que además incluye el paso para prevenir la aclimatación de las bacterias en el biorreactor de fermentación a la cantidad de pantotenato de calcio, mediante el ajuste de los parámetros seleccionados de entre velocidad de gas, velocidad del líquido, velocidad de agitación, velocidad de alimentación de nutriente, y presión parcial de hidrógeno.

9. Un método de acuerdo con la Reivindicación 8, que además incluye el suministro de exceso del gas reductor hidrógeno al biorreactor de fermentación.

10. Un método de acuerdo con la Reivindicación 7, caracterizado en que se ejecuta el paso (i) definido en la reivindicación 7 y se previene la aclimatación de las bacterias al cobalto en el biorreactor de fermentación, manteniendo una concentración constante de cobalto y ajustando los parámetros seleccionados de entre velocidad del gas, velocidad del líquido, velocidad de agitación, velocidad de alimentación de nutriente, y presión parcial del gas hidrógeno.