CN103333845B - 一种绿针假单胞菌及其发酵培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种绿针假单胞菌及其发酵培养方法，该绿针假单胞菌，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No6773，其发酵培养方法包括以下步骤：1)将经活化的绿针假单胞菌nlsy001接种到该菌专用发酵培养基中，在26-28℃、pH6.5-7.2下培养18-28小时，得到种子液；2)将步骤1)制备的种子液接种到该菌专用发酵培养基中，在26-28℃、pH6.5-7.2下通气培养；以绿针假单胞菌nlsy001CGMCC No6773为活性成分的菌剂。与现有技术相比，本发明绿针假单胞菌nlsy001CGMCC No6773发酵周期短，其菌剂制备工艺简单，具有工业化生产的可能性。
Description
技术领域
本发明涉及一株生防菌株，尤其是涉及一种绿针假单胞菌及其发酵培养方法。
背景技术
植物根际中存在着一些有益的细菌，它们可以通过直接或间接的方式促进植物生长并对由病原菌引起的植物病害起到防治作用，这些能够促进植物生长、防治病害并增加作物产量的微生物统称为植物根际促生菌(plant growthpromoting rhizobacteria，PGPR)。此类根际微生物种类丰富多样，选择适当的根际促生细菌对植物进行处理(如浸种或喷雾)，可以改善根际微生态环境、促进植物生长、抑制或减轻植物病害、减少化肥和农药投入、减轻环境污染等作用。本发明提供的细菌是从植物根部分离获得，属于根际促生细菌。
发明内容
本发明的目的就是为了提供一种具有防治病害作用的绿针假单胞菌及其发酵培养方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种绿针假单胞菌，其特征在于，该绿针假单胞菌，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.6773。
所述的绿针假单胞菌的形态特征为：菌体为杆状，0.3μm～0.8μm×1.0μm～1.1μm，革兰氏染色阴性，无芽孢，单极生鞭毛，能运动，在KMB培养基上培养24h后可形成1.2mm菌落，菌落可产生橙色色素，圆形，表面凸起，光滑，较粘稠，易挑起，边缘整齐。
所述的绿针假单胞菌的生理生化特征为：能产生荧光色素，能水解精氨酸双水解酶、脂酶、氧化酶、过氧化氢酶、柠檬酸盐、明胶，不水解淀粉，也不产生H2S，都不能利用聚β-羟基丁酸盐作碳源。最适培养温度为28℃～30℃，最适生长pH值为7.0～7.5，可产生橙色非荧光色素，能利用卵磷脂酶，可把蔗糖转化为果聚糖，不产生脓青素，也不进行反硝化作用。最适生长的NaCl浓度为0～6％，当NaCl浓度大于7％时，生长被抑制。
一种绿针假单胞菌的发酵培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)将经活化的绿针假单胞菌nlsy001接种到该菌专用发酵培养基中，在26-28℃、pH6.5-7.2下培养18-28小时，得到种子液；
2)将步骤1)制备的种子液接种到该菌专用发酵培养基中，在26-28℃、pH6.5-7.2下通气培养；
所述步骤1)和步骤2)中专用发酵培养基配方为：每1000毫升水中含玉米粉10-15克，豆饼粉30-40克，K2HPO40.1-0.2克，KH2PO40.15-0.25克，MgSO40.4-0.5克，起始pH6.5-7.5。
步骤1)中对绿针假单胞菌nlsy001菌株进行活化的方法为：将该绿针假单胞菌nlsy001菌株接种到KB培养基中，在26-28℃下培养18-28小时；所述KB的配方为：每1000毫升水中含含蛋白胨20克、甘油15毫升、K2HPO40.392克和MgSO40.732克，pH为6.5-7.5。
所述的绿针假单胞菌nlsy001专用发酵培养基配方为：每1000毫升水中含玉米粉10克，豆饼粉35克，K2HPO40.15克，KH2PO40.2克，MgSO40.4-0.5克，起始pH6.5-7.5。
步骤1)中的接种比例为2-5％，培养条件为在26℃、pH6.8、220rpm下震荡培养；步骤2)中的接种比例为6-8％，通气量以发酵液与每分钟通气量体积比计为1∶0.2-0.4，培养所用培养罐的罐压为1.2-1.8F/cm2，培养罐带有搅拌装置，搅拌速度为180-240rpm，培养时间为24-48小时。
步骤2)的发酵培养条件为在26℃、pH6.8下进行，培养时间为36-48小时。
一种绿针假单胞菌的应用，其特征在于，以绿针假单胞菌nlsy001CGMCCNo6773为活性成分的菌剂。
将绿针假单胞菌nlsy001CGMCC No6773的发酵液与干燥无菌的填充料按重量比5-10∶1混合后，压滤，再遮荫风干，得到绿针假单胞菌nlsy001CGMCCNo6773菌剂；所述填充料为草炭或硅藻土，细度为150-250目。
所述得到的菌剂为150-250目的草炭、硅藻土或高岭土调整至最终的含水量为35％以下。
在实际生产中，根据菌剂含水量的要求，将绿针假单胞菌nlsy001菌剂与填充料混合、压滤后，可再添加一定量的助剂，优选为硅藻土，其细度为150-200目，优选为200目，助剂的添加量可根据菌量和含水量的实际情况而定，在不影响产品效果的前提下，使绿针假单胞菌nlsy001菌剂的含水量达到30-35％即可。
应用本发明的绿针假单胞菌nlsy001或以其为活性成分的菌剂防治植物病害的方法可为：待植物生长至3-4叶期时，将幼苗取出，用浓度为107-109cfu/mL的菌液浸根20-40分钟，或将取出的幼苗以生防菌nlsy001为活性成分的菌剂兑水灌根，菌剂与水混合的重量份数比为1∶400-600，再经移栽、培养，得到抗病害的植物。
在上述的植物病害防治方法中，生防菌nlsy001的菌液优选浓度为108cfu/mL，浸根时间优选为30分钟；以生防菌nlsy001为活性成分的菌剂与水混合的重量份数比为1∶500。
与现有技术相比，本发明提供了一株生防菌nlsy001及以其为活性成分的菌剂，温室盆栽和田间试验证明该菌株具有防病作用，对多种植物土传病害，如辣椒疫病、西瓜枯萎病、水稻纹枯病及油菜菌核病具有显著的防治效果。防治植物病害的主要机制是其良好的植物根际定殖能力和可产生抑制病原菌生长的抗生素类物质。
生防菌nlsy001发酵周期短，其菌剂制备工艺简单，具有工业化生产的可能性。本发明在植物土传病害的防治中具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下述实施举例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有百分浓度均为质量百分浓度，所有培养基中的溶剂均为水。
KB的配方为：每1000mL水中含蛋白胨20克、甘油15毫升、K2HPO40.392克和MgSO40.732克，pH为6.5-7.5。
生防菌nlsy001专用发酵培养基配方为：每1000mL水中含玉米粉10克，豆饼粉35克，K2HPO40.15克，KH2PO40.2克，MgSO40.4-0.5克，起始pH6.5-7.5。
实施例1：
绿针假单胞菌nlsy001的菌种保藏及其发酵培养
1、菌种保藏
生防菌nlsy001分离于安徽省小麦根基土壤，已于2012年11月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.6773。
2、生防菌nlsy001的发酵
生防菌nlsy001的发酵方法包括以下步骤：
1)菌种的活化
将生防菌nlsy001菌株接种到KB培养基中，在26℃下培养20小时。
2)种子罐培养
将步骤1)经活化的生防菌nlsy001按4％接种比例接种到该菌专用发酵培养基中，在26℃、pH6.8、220rpm下震荡培养30小时，得到种子液。
3)发酵罐培养
将步骤1)经制备的种子液按5％接种比例接种到该菌的专用发酵培养基中，在26℃、pH6.8、搅拌速度220rpm、通气量1∶0.2-0.4(发酵液与每分钟通气量体积比)、罐压为1.2-1.8F/cm2下培养45小时得到生防菌nlsy001菌液。
实施例2：
生防菌nlsy001菌剂的制备
生防菌nlsy001菌剂的制备方法为将实施例1发酵制得的生防菌nlsy001菌液与干燥、无菌、细度为200目的硅藻土按重量份数比为9∶1混合后，压滤，再加入适量的200目的硅藻土使菌液与其混合均匀，蔽荫风干，得到生防菌nlsy001菌剂。经检验成品合格，含水量为34％，活菌含量大于80亿个/克。
实施例3：
检测生防菌nlsy001对植物病害防治效果的试验
以青椒疫病为例，检测生防菌nlsy001对植物病害的防治效果，具体方法为：待用灭菌土培育的青椒苗生长至3-4叶期时，将幼苗取出，用浓度为108cfu/mL的生防菌nlsy001菌液浸根30分钟，或将取出的幼苗以生防菌nlsy001为活性成分的菌剂兑水灌根，菌剂与水混合的重量份数比为1∶500，以未经处理和用灭菌水灌根的植株作对照，再将幼苗移至8cm口径的苗钵中，缓苗4天后接种浓度为107cfu/mL的青椒疫病孢子悬浮液50mL/钵，接种病原菌后定期按照病害分级方法调查病情指数，结果经生防菌nlsy001菌液或以其为活性成分的菌剂处理的植株的防治效果达85％以上。用相同方法进行的西瓜枯萎病、水稻纹枯病及油菜菌核病的盆栽和田间抗病性试验结果表明本发明的菌株对上述病害的防治效果也高于65％，上述的实验结果均表明本发明的生防菌nlsy001可显著提高植物的抗病性。
实施例4
一种绿针假单胞菌，该绿针假单胞菌，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No6773。所述的绿针假单胞菌的形态特征为：菌体为杆状，0.3μm～0.8μm×1.0μm～1.1μm，革兰氏染色阴性，无芽孢，单极生鞭毛，能运动，在KMB培养基上培养24h后可形成1.2mm菌落，菌落可产生橙色色素，圆形，表面凸起，光滑，较粘稠，易挑起，边缘整齐。所述的绿针假单胞菌的生理生化特征为：能产生荧光色素，能水解精氨酸双水解酶、脂酶、氧化酶、过氧化氢酶、柠檬酸盐、明胶，不水解淀粉，也不产生H2S，都不能利用聚β-羟基丁酸盐作碳源。最适培养温度为28℃～30℃，最适生长pH值为7.0～7.5，可产生橙色非荧光色素，能利用卵磷脂酶，可把蔗糖转化为果聚糖，不产生脓青素，也不进行反硝化作用。最适生长的NaCl浓度为0～6％，当NaCl浓度大于7％时，生长被抑制。
上述绿针假单胞菌的发酵培养方法，该方法包括以下步骤：
1)对绿针假单胞菌nlsy001菌株进行活化的方法为：将该绿针假单胞菌nlsy001菌株接种到KB培养基中，在26℃下培养28小时；所述KB的配方为：每1000毫升水中含含蛋白胨20克、甘油15毫升、K2HPO40.392克和MgSO40.732克，pH为6.5-7.5。
2)将经活化的绿针假单胞菌nlsy001接种到该菌专用发酵培养基中，接种比例为2％，在26℃、pH6.5，220rpm下震荡培养下培养28小时，得到种子液；
3)将步骤1)制备的种子液接种到该菌专用发酵培养基中，接种比例为6％，在26℃、pH6.5下通气培养；通气量以发酵液与每分钟通气量体积比计为1∶0.2，培养所用培养罐的罐压为1.2F/cm2，培养罐带有搅拌装置，搅拌速度为180rpm，培养时间为48小时。
所述步骤1)和步骤2)中专用发酵培养基配方为：每1000毫升水中含玉米粉10克，豆饼粉30克，K2HPO40.1克，KH2PO40.15克，MgSO40.4克，起始pH6.5。
上述绿针假单胞菌的应用，以绿针假单胞菌nlsy001CGMCC No6773为活性成分的菌剂，具体为：将绿针假单胞菌nlsy001CGMCC No6773的发酵液与干燥无菌的填充料按重量比5∶1混合后，压滤，再遮荫风干，得到绿针假单胞菌nlsy001CGMCC No6773菌剂；所述填充料为草炭或硅藻土，细度为150目。
在实际生产中，根据菌剂含水量的要求，将绿针假单胞菌nlsy001菌剂与填充料混合、压滤后，可再添加一定量的助剂，优选为硅藻土，其细度为150-200目，优选为200目，助剂的添加量可根据菌量和含水量的实际情况而定，在不影响产品效果的前提下，使绿针假单胞菌nlsy001菌剂的含水量达到30-35％即可。
应用本发明的绿针假单胞菌nlsy001或以其为活性成分的菌剂防治植物病害的方法可为：待植物生长至3-4叶期时，将幼苗取出，用浓度为107-109cfu/mL的菌液浸根20-40分钟，或将取出的幼苗以生防菌nlsy001为活性成分的菌剂兑水灌根，菌剂与水混合的重量份数比为1∶400-600，再经移栽、培养，得到抗病害的植物。
在上述的植物病害防治方法中，生防菌nlsy001的菌液优选浓度为108cfu/mL，浸根时间优选为30分钟；以生防菌nlsy001为活性成分的菌剂与水混合的重量份数比为1∶500。
实施例5
一种绿针假单胞菌，该绿针假单胞菌，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No6773。所述的绿针假单胞菌的形态特征为：菌体为杆状，0.3μm～0.8μm×1.0μm～1.1μm，革兰氏染色阴性，无芽孢，单极生鞭毛，能运动，在KMB培养基上培养24h后可形成1.2mm菌落，菌落可产生橙色色素，圆形，表面凸起，光滑，较粘稠，易挑起，边缘整齐。所述的绿针假单胞菌的生理生化特征为：能产生荧光色素，能水解精氨酸双水解酶、脂酶、氧化酶、过氧化氢酶、柠檬酸盐、明胶，不水解淀粉，也不产生H2S，都不能利用聚β-羟基丁酸盐作碳源。最适培养温度为28℃～30℃，最适生长pH值为7.0～7.5，可产生橙色非荧光色素，能利用卵磷脂酶，可把蔗糖转化为果聚糖，不产生脓青素，也不进行反硝化作用。最适生长的NaCl浓度为0～6％，当NaCl浓度大于7％时，生长被抑制。
上述绿针假单胞菌的发酵培养方法，该方法包括以下步骤：
1)对绿针假单胞菌nlsy001菌株进行活化的方法为：将该绿针假单胞菌nlsy001菌株接种到KB培养基中，在28℃下培养28小时；所述KB的配方为：每1000毫升水中含含蛋白胨20克、甘油15毫升、K2HPO40.392克和MgSO40.732克，pH为6.5-7.5。
2)将经活化的绿针假单胞菌nlsy001接种到该菌专用发酵培养基中，接种比例为5％，在28℃、pH7.2，220rpm下震荡培养下培养18小时，得到种子液；
3)将步骤1)制备的种子液接种到该菌专用发酵培养基中，接种比例为8％，在28℃、pH7.2下通气培养；通气量以发酵液与每分钟通气量体积比计为1∶0.4，培养所用培养罐的罐压为1.8F/cm2，培养罐带有搅拌装置，搅拌速度为240rpm，培养时间为24小时。
所述步骤1)和步骤2)中专用发酵培养基配方为：每1000毫升水中含玉米粉15克，豆饼粉40克，K2HPO40.2克，KH2PO40.25克，MgSO40.5克，起始pH7.5。
上述绿针假单胞菌的应用，以绿针假单胞菌nlsy001CGMCC No6773为活性成分的菌剂，具体为：将绿针假单胞菌nlsy001CGMCC No6773的发酵液与干燥无菌的填充料按重量比10∶1混合后，压滤，再遮荫风干，得到绿针假单胞菌nlsy001CGMCC No6773菌剂；所述填充料为草炭或硅藻土，细度为250目。
在实际生产中，根据菌剂含水量的要求，将绿针假单胞菌nlsy001菌剂与填充料混合、压滤后，可再添加一定量的助剂，优选为硅藻土，其细度为150-200目，优选为200目，助剂的添加量可根据菌量和含水量的实际情况而定，在不影响产品效果的前提下，使绿针假单胞菌nlsy001菌剂的含水量达到30-35％即可。
应用本发明的绿针假单胞菌nlsy001或以其为活性成分的菌剂防治植物病害的方法可为：待植物生长至3-4叶期时，将幼苗取出，用浓度为107-109cfu/mL的菌液浸根20-40分钟，或将取出的幼苗以生防菌nlsy001为活性成分的菌剂兑水灌根，菌剂与水混合的重量份数比为1∶400-600，再经移栽、培养，得到抗病害的植物。
在上述的植物病害防治方法中，生防菌nlsy001的菌液优选浓度为108cfu/mL，浸根时间优选为30分钟；以生防菌nlsy001为活性成分的菌剂与水混合的重量份数比为1∶500。
Claims (5)
1.一种绿针假单胞菌的发酵培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)将经活化的绿针假单胞菌接种到该菌专用发酵培养基中，在26-28℃、pH6.5-7.2下培养18-28小时，得到种子液；
2)将步骤1)制备的种子液接种到该菌专用发酵培养基中，在26-28℃、pH6.5-7.2下通气培养；
所述步骤1)和步骤2)中专用发酵培养基配方为：每1000毫升水中含玉米粉10-15克，豆饼粉30-40克，K2HPO40.1-0.2克，KH2PO40.15-0.25克，MgSO40.4-0.5克，起始pH6.5-7.5。
2.根据权利要求1所述的绿针假单胞菌的发酵培养方法，其特征在于，步骤1)中对绿针假单胞菌菌株进行活化的方法为：将该绿针假单胞菌菌株接种到KB培养基中，在26-28℃下培养18-28小时；所述KB的配方为：每1000毫升水中含蛋白胨20克、甘油15毫升、K2HPO40.392克和MgSO40.732克，pH为6.5-7.5。
3.根据权利要求1所述的绿针假单胞菌的发酵培养方法，其特征在于，所述的绿针假单胞菌专用发酵培养基配方为：每1000毫升水中含玉米粉10克，豆饼粉35克，K2HPO40.15克，KH2PO40.2克，MgSO40.4-0.5克，起始pH6.5-7.5。
4.根据权利要求1所述的绿针假单胞菌的发酵培养方法，其特征在于，步骤1)中的接种比例为2-5％，培养条件为在26℃、pH6.8、220rpm下震荡培养；步骤2)中的接种比例为6-8％，通气量以发酵液与每分钟通气量体积比计为1:0.2-0.4，培养所用培养罐的罐压为1.2-1.8F/cm2，培养罐带有搅拌装置，搅拌速度为180-240rpm，培养时间为24-48小时。
5.根据权利要求1所述的绿针假单胞菌的发酵培养方法，其特征在于，步骤2)的发酵培养条件为在26℃、pH6.8下进行，培养时间为36-48小时。
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