FI119994B - Pseudomonas chlororaphis-kanta ja sitä sisältävä koostumus kasvitautien torjumiseksi sekä menetelmä kasvitautien torjumiseksi käyttäen mainittua kantaa - Google Patents

Description

PSEUDOMONAS CHLORORAPHIS -KANTA JA SITÄ SISÄLTÄVÄ KOOSTUMUS KASVITAUTIEN TORJUMISEKSI SEKÄ MENETELMÄ KASVITAUTIEN TORJUMISEKSI KÄYTTÄEN MAINITTUA KANTAA

Keksintö koskee kasviensuojeluvalmisteita.

5 Erityisesti keksintö koskee uutta bakteerilajin Pseudomonas chlororanhis bakteerikantaa ja koostumuksien, jotka sisältävät tämän bakteerikannan tai tämän bakteerikannan tuottamia antipatogeenisesti vaikuttavia metaboliitteja, käyttöä patogeenisten sienien aiheut-10 tamien kasvitautien torjumiseksi.

Useita mikrobiellin luonteen omaavia aineita, joilla on kyky aiheuttaa kasvitauteja saavat aikaan suuria vahinkoja siis taloudellisia tappioita kasvavassa viljassa. Monet niistä käyvät lehtien ja/tai 15 muiden riippuvien kasvinosien kimppuun ja saavuttavat siten yleensä uusia ei-infektoituneita kasvavia viljoja ilmateitse kuljetettujen itiöiden avulla. Toiset siirtyvät yhdestä viljasukupolvesta seuraavaan siementen kantamina ja useat taloudellisesti tärkeät tauteja 20 aiheuttavat aineet ovat maaperän kantamia ja asustavat enemmän tai vähemmän inaktiivisina maaperässä kunnes kasvatetaan vastaanottavaa viljaa.

•‘.J Mikrobien aiheuttamien tauteja aiheuttavien • · . .·. aineiden torjumiseksi käytetyt menetelmät viljatuotan- • · · 25 nossa ovat usein kalliita, mutta useimmissa viljankas- • · . vatusjärjestelmissä taloudellisesti tarpeellisia. Yksi • · · *·*! laajalti käytetty menetelmä on käsittely biostaatti- • · · ’···* silla tai biosidisillä kemikaaleilla. Niitä käytetään • · · *.* * useimmissa tapauksissa niin, että niitä suihkutetaan 30 kasvavien viljojen päälle, siemen tai juuri käsittely- ϊ nä tai maaperää desinfioivana aineena. Muita vakiome- :***; netelmiä ovat itse vil j aj är j estelmän vastustavaksi • · · . *. jalostaminen ja käsitteleminen.

• · · • · · ***.· Näillä vakiotorjuntamenetelmillä on kaikilla • · *···* 35 tiettyjä haittoja. Viljajärjestelmien käsittely on *:·*: tehokasta tai tarkoituksenmukaista ainoastaan tiettyjä ·*·*; tautiongelmia varten. Myös vain tietyissä tapauksissa • · 2 on viljakasvien kasvattaminen vastustaviksi mahdollinen tai sopiva, voi kestää kauan ja saavutettu vastustus voi heikentyä jonkun ajan kuluttua uusien patogeenien kantojen ilmaannuttua. Kemialliset koostumukset 5 ovat usein hyvin tehokkaita, mutta ne saattavat aiheuttaa ei-toivottuja seurauksia ympäristölle, vaativat huolellisen käsittelyn koska useimmat ovat haitallisia ihmisten terveydelle ja ne saattavat myös tulla ei-toimiviksi kun vastustuskykyisiä patogeenisiä kantoja 10 kehittyy.

Biologisten torjunta-aineiden tai biopes-tisidien käyttö voi olla tehokkaampi tai edullisempi kuin muiden torjuntamenetelmien käyttö ja siksi tällaisia aineita on tutkittu perusteellisesti. Tiede-15 tään, että useat bakteeri- ja sienikannat estävät erilaisia mikrobien aiheuttamien tauteja aiheuttavien aineiden kehityksen. Ollakseen tehokkaita ja käyttökelpoisia niiden tulee olla pysyviä, antaa toistettavissa olevia tuloksia kentällä ja tulee olla mahdol-20 lista käyttää niitä kenttäolosuhteissa. Tähän päivään saakka vain jotkut ovat täyttäneet näitä vaatimuksia ja siksi niitä on käytetty kaupallisina tuotteina.

. . Keksintö tuo esiin biologisen torjunta- « · · *· ” aineen, joka on käyttökelpoinen ja tehokas patogeenis- • · · *·!.* 25 ten sienien aiheuttamien kasvitautien torjuntaan kau- *·*’· pallisissa kasvisadoissa. Uusi bakteerin Pseudomonas chlororaphis kanta (MA 342) , joka osoittaa toivotut : ominaisuudet tuodaan esiin. Isolaatti (eriö) on tallen- • · · ;*·*: nettu 14.02.1994 National Collections of Industrial 30 and Marine Bacteria Limited (NCIMB), Aberdeen, Skot- . .·, läntiin Budapest Treaty:n sääntöjen mukaan ja se sai • · · 1*1 tallennusnumeron NCIMB Accession No. 40616.

• · • · *1' Keksintö tuo myös esiin kasvitaudin torjun- • · :.· · ta-koostumuksen, joka vaikuttavana aineosana sisältää • · · 35 uuden MA 342 kannan tai sen viljelmän, joka sisältää sen antipatogeenisesti vaikuttavia metaboliitteja.

• · ..e. Seuraavassa keksintöä kuvataan yksityiskoh- • · • · 3 taisesti viittaamalla oheiseen piirustukseen, jossa kuva 1 esittää MA 342 bakteeri-isolaa-tin(eriön) rasvahappoprofiilin, joka on saatu Microbial Identification System (MIDI), Newark Ltd., USA) 5 mukaisesti.

Alla on esitetty uuden bakteerikannan kuvaaminen ja selitys edullisista menetelmistä kannan pro-liferaatiota ja formulaatiota ja käyttöä kentällä tai kasvihuoneessa varten. Useita esimerkkejä on annettu 10 vielä lisäämään mutta ei rajoittamaan keksinnön mukaista menetelmää ja koostumusta.

Uuden bakteerikannan MA 342 karakterisointi

Morfologisia tuntomerkkejä: Pesäkkeen morfo- 15 logia TSA 10:llä (10 g Tryptic Soy Broth (Difco Ltd.), 12 g Technical Agar (Oxoid Ltd.) 1000 ml:ssa tislattua vettä) on pyöreitä, valkoisia kohtuullisesti kuperia bakteeripesäkkeitä, jotka muodostavat hyvin näkyviä läpinäkyviä kiteitä agarissa korkeilla solutiheyksil-20 lä. Se on gram-negatiivinen sauva, joka osoittaa kirkkaan keltaisen fluoresenssin Kings medium B:llä (1,5 g KjHPO,,; 1,5 g MgS04.7H20; 20 g Proteose Peptone (Difco . Ltd.); 10 ml glyserolia, 15 g Bacto Agar (Difco Ltd.) • · · .* 1000 ml:ssa tislattua vettä).

• · · ’·*·[ 25 Rasvahappo analyysi: Bakteerin rasvahappopro-

fiili on esitetty kuvassa 1. Analyysi suoritettiin ..li* käyttämällä Microbial Identification System (MIDI

·.·.· Ltd., Newark, USA), muunnelmaa 3.7. Tämän testiohjel- man mukaan MA 342 muistuttaa eniten Pseudomonas chlo-30 roraphista. sopimusindeksillä 0,705.

• · · • · · • · · .···. Biokemialliset tuntomerkit: • · • · · • · i Tuntomerkit testattu API MA 342 isolaatin reaktio 35 20 NE* nopealla testillä • __________________________________________________ • · · · · • ·

Nitraattipelkistys • · • · 4

Indolimuodostus Happoa glukoosista

Arginiinidihydrolaasi +

Ureaasi 5 Eskuliinihydrolyysi

Gelatiinihydrolyysi + β-galaktosidaasi

Glukoosiassimilaatio +

Arabinoosiassimilaatio 10 Mannoosiassimilaatio -?

Mannitoliassimilaatio + N-asetyyli-glukosamiiniassimi-laatio

Maltoosiassimilaatio 15 Glukonaattiassimilaatio +

Kapraattiassimilaatio Adipaattiassimilaatio Malaattiassimilaatio +

Sitraattiassimilaatio + 20 Fenyyliasetaattiassimilaatio

Sytokromi-oksidaasi + . . *API System Ltd., Ranska • · · • · · • · • · · *···' 25 Tuntomerkit testattiin * * lisäksi testeillä • · · • — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — • ·* · :: : Levanmuodostus • · · :*·*: Ksyloosiassimilaatio -? 30 Sorbitoliassimilaatio +? • · · • · · y*'.' Edullisia menetelmiä kannan proliferatiota ja • · formulaatioita ja käyttöä varten kentällä tai kasvi- • · ·.: · huoneissa • · · 35 Tehokkaan kannan suuria määriä saadaan par- haiten käymisprosessilla, johon kuuluu kannan puhdas- • · viljelyn näytteen siirrostaminen nestemäiseen ravis- • · • · 5 tusviljelyyn tai fermentoriin, jossa on sopiva käymis-väliaine. Kantaa voidaan myös kasvattaa steriilillä pinnalla, esim. agarpinnalla ja kun se on kasvanut valmiiksi, solut voidaan suspendoida veteen tai toi-5 seen alalla ennestään tunnettuun nestemäiseen väliaineeseen. Kasvatusväliaine voi periaatteessa mikä tahansa bakteerinen kasvatusväliaine, joka on ennestään tunnettu alalla. Käyminen suoritetaan kunnes on saatu riittävä konsentraatio soluja, esim. n. 5 - 109 cfu 10 (colony forming units; pesäkkeitä muodostavia yksikköä) /ml nestemäisiä viljelyjä varten. Näin saatu käy-misliemi tai bakteerisuspensio voidaan käyttää sellaisenaan kasvinsuojeluksessa tai ne voidaan käsitellä tai formuloida ennen kun niitä käytetään.

15 Eräässä käsittelytyypissä voidaan baktee risolut käymisliemessä tappaa, esim. kuumentamalla, tai sentrifugoida pois ja jäljelle jäävää lientä tai supernatanttia, joka sisältää bakteerisia metaboliit-teja, voidaan käyttää kasvinsuojelutarkoituksiin, yh-20 dessä puhdistuksen ja/tai konsentraation kanssa tai ilman. Bakteerisuspensiot ja käymisliemet voidaan myös sekoittaa homogeenisesti yhden tai useamman ennestään ^ . alalla tunnetun yhdisteen tai yhdisteryhmän kanssa • · · * .* sillä ehdolla, että sellaiset yhdisteet ovat yhteenso- • · · *···[ 25 pivia bakteerikannan tai sen antipatogeenisesti tehok- * * kaiden metaboliittien tai johdannaisten kanssa. Sopi- ..li* via yhdisteitä voivat olla jauhemaiset lisäaineet tai ί.ί.ϊ kiinteät kantajat, kuten esim. talkki, kaoliini, ben- toniitti tai montmorilloniitti, kostuvat alalla ennes-30 tään tunnetut jauheet, hiilipitoiset ravintoaineet . (kuten glukoosi, sukroosi ja fruktoosi) tai kompleksit * · · .···. bakteeriset ravintoaineet (kuten esim. hiivaekstrakti, • · *** bakteerinen peptoni ja tryptoni) , metallisuoloja, ras- • · i vahapposuoloja, rasvahappoestereitä, ionisia tai ei- • · · 35 ionisia pinta-aktiivisia aineita, kasviravinteita, kasvien kasvusäätäjiä, fungisidit, insektisidit, bak- • · terisidit ja sen tapaiset. Bakteerisuspensiot ja käy- • · • · 6 misliemet voidaan myös kuivata tai pakastekuivata ennenkuin tai sen jälkeen kun ne on sekoitettu sopivien yhdisteiden kanssa ja tuloksena saatua tuotetta käytetään kasviensuojeluun. Sopiva kuivaustapa on esim.

5 vermikuliitin, joka on täydennetty bakteerisella käy-misliemellä, ilmankuivaus.

Bakteeri- ja metaboliittivalmisteita voidaan käyttää millä tunnetulla tavalla tahansa, jota voidaan käyttää siemenviljan, vegetatiivisten lisäysyksikkö-10 jen, kasvien ja maaperän käsittelemiseksi bakteerikannoilla. Voidaan valita suihkuttaminen, sumuttaminen, pölyttäminen, levitys, pellettisointi, kastaminen tai valaminen yhdessä tarkoitetun esineen ja vallitsevien olosuhteiden mukaisesti. Edullisia käyttömääriä sie-15 menten käsittelyyn ovat tavallisesti 1011 - 1012 cfu/ha ja suihkutukseen 1012 - 1014 cfu/ha tai vastaava määrä bakteerisia metaboliitteja.

Esimerkki 1 20 Mikro-organismin MA 342 eristäminen

Kasvin Empetrum nigrum ylöskaivettuja juuria pestiin steriilissä vesijohtovedessä kiinnikäyneen . . mullan poistamiseksi. Nuoresta juuresta leikattiin 2 - • · · *· ]· 3 cm pitkä kappale, joka käsiteltiin steriileissä olo- • · · 25 suhteissa. Pala otettiin alueelta, joka oli juuren *·’*· pään alueen yläpuolella. Juuripalaan tehtiin pieniä >φ·;* leikkauksia liekitetyllä skalpellilla. Juuripalaa hie- : rottiin tämän jälkeen TSA 10 agarin pintaa vastaan.

• · ·

Sen jälkeen kun bakteerit olivat kasvaneet ulos ero-30 tettiin MA 342 ja kasvatettiin puhdasviljelmänä TSA

• 10:llä.

• · · • · ·

Esimerkki 2 • · • · *;* Mikro-organismin MA 342 säilöntä • · ·.· | Puhdasviljelmä syväjäädytettiin pienissä am- :***: 35 pulleissa lämpötilassa - 70 °C. Jäätymisenestoaineena käytettiin 10 % glyserolia vesijohtovedessä, pH sää- • · ... dettiin arvoon 7,15 autoklavoinnin jälkeen. Syväjäädy- • · · • · • · 7 tyksen jälkeen lämpötilaan - 70 °C ampullit säilytettiin lämpötilassa - 20 °C.

Pitkäaikaista säilytystä varten isolaat-ti(eriö) pakastekuivattiin. 48 h kasvatuksen jälkeen 5 TSA 10 agarilla bakteerikasvusto raaputettiin agarin pinnalta, sekoitettiin jäätymisenestoaineen (50 g Dex-tran T 70 (Pharmacia Fine Chemicals Ltd.); 50 g Na-L-glutamaattia (Kebo AB) 1000 mlrssa tislattua vettä) kanssa, kaadettiin pieniin ampulleihin (20 ml) ja lai-10 tettiin Hetosicc pakastinkuivaajaan (Heto Ltd., Tanska) 24 h ajaksi. Pakastekuivauksen jälkeen ampullit suljettiin kaasutiiviisti kumitulpilla ja säilytettiin lämpötilassa 4 °C.

15 Esimerkki 3 MA 342:den teho Microdochium nivalea vastaan primaarisissa kasvihuone seulonnoissa

Bakteeri pantiin vehnän jyvien päälle seuraa-valla tavalla: 24 h vanhoja lämpötilassa 15 °C TSA:11a 20 kasvatettuja viljelmiä raaputettiin 9 cm Petri-maljan agarin pinnalta ja sekoitettiin 40 ml ravintoliemen (SNB: 18 g sukroosia; 5 g bakteerista peptonia (Oxoid . . Ltd.); 2 g hiivauutetta (Oxoid Ltd.); 0,5 g ICHPO. ja • · ·

*· ” 0,25 g MgS04.7H20 1000 ml:ssa tislattua vettä ja pH

• · · *·!·* 25 säädettiin arvoon 7,2 - 7,4) ja 40 ml 2 % (p/v) natri- ’**’· umkarboks ime tyyli selluloosaa (CMC) steriilissä tisla- tussa vedessä liuoksen kanssa. Tämä liuos kaadettiin jyvien päälle. 20 min kuluttua ylimääräinen seos kaa-·*·*; dettiin pois ja siemenet kuivattiin puhaltimen alla 30 yli yön.

. .·. Jokaista käsittelyä varten tässä kasvihuone • · · seulonnassa kylvettiin kaksi ruukkua kumpaankin ruuk- • · *;* kuun 50 jyvää. Ruukkujen halkaisija oli 18 cm ja kor- • · · keus 4 cm ja ne täytettiin kaksikolmasosaan steriloi-

S ϊ 35 mattomalla kaupallisella turveseoksella (Enhetsjord K

Normal) , johon oli sekoitettu 20 % (v/v) hiekkaa.

• ♦ ... Talvivehnäjyviä (cv. "Kosack") saastutettiin • · » • · • · 8 keinotekoisesti M^_ nivalella ennen käsittelyä bakteerin kanssa. Patogeeni kasvatettiin seitsemän päivää peruna-dekstroosiliemessä (24 g Potato Dextrose Broth (Difco Ltd.) 1000 ml tislattua vettä kohden) huoneen 5 lämpötilassa pyörivässä ravistimessa. Tuloksena saatu suspensio homogenisoitiin keittiötehosekoittimellä ja kaadettiin jyvien päälle. 30 min jälkeen neste kaadettiin pois ja jyvät jätettiin kuivumaan tuulettimen alle yli yön. Tällä tavalla saastutetut jyvät käsitel-10 tiin tämän jälkeen MA 342 kanssa ja kylvettiin ruukkuihin niin kuin edellä on esitetty.

Kylvön jälkeen ruukut peitettiin lasikansilla ja laitettiin pimeään lämpötilassa 6 °C. Viiden päivän päästä kannet poistettiin, jokainen ruukku kasteltiin 15 100 ml vettä ja laitettiin viiden litran muovipussin, joka oli tuettu kahdella puutikulla, sisään. Ruukut asetettiin tämän jälkeen kasvihuoneeseen lämpötilaan 12 - 15 °C kahdeksaksi päiväksi.

Seuraavia jyvien käsittelyjä testattiin:

20 1. P_;_ chlororaphis kanta MA 342, sekoitettuna SNB/CMC

kanssa, M.nivale-saastutetuilla jyvillä 2. Mj. Nivale-saastutettu! a jyviä, taudinvertailuna .·. j 3. Käsittelemättömiä jyviä terveyden vertailuna.

• · ·

Tautia ehkäisevä vaikutus kirjattiin prosent- • · · ·**. 25 teinä näistä kylvöistä esiintulevia, terveitä (= ilman huovastoja) kasveja suhteessa kylvettyihin. Tulokset • · · tyypillisestä It nivale primaarisesta seulonnasta on ·.·.· esitetty taulukossa 1 • · · • · · • · · 30 Taulukko 1. MA 342:den vaikutus taudin syntyyn ja ke- ; hitykseen talvivehnässä, joka on kasvatettu nivale- • · · .···. saastutetuista jyvistä.

• · · • - — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — _ — • · • · · :·1 ! Käsittely Prosenttia (%) Prosenttia (%) ter- • · · ·...· 35 syntyneitä veitä kasveja kyl- ·;··· vetyistä ·· · __ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ • · a — • · • · 9 1. MA 342 87 81 2. Taudintorjunta 13 7 3. Käsittelemätön vertailu 90 89 5 ------------------------------------------------------

Esimerkki 4

MA 342 teho Drechslera teresta vastaan sekundaarisissa kasvihuone seulonnoissa 10 Näitä seulontoja varten isolaatti(eriö) MA

342 kasvatettiin 48 h puolivahvassa (15 g/1) Tryptic soy broth (Difco Ltd.) pyörivässä tärystimessä pimeässä lämpötilassa 18 - 20 °C. Jyviä ohrakultivarista "Golf", joita luonnollisesti oli saastutettu Dj. tere-15 sen kanssa sekoitettiin tämän jälkeen 300 ml tuloksena saadun bakteerisuspension kanssa kg:a siemeniä kohden muovipussissa ja sekoituksen jälkeen pussia ravistettiin noin 4 min. Siten käsitellyt jyvät kuivattiin puhaltimen alla huoneen lämpötilassa päivän ja kylvet-20 ti in tämänjälkeen ruukkuihin niin kuin esimerkissä 3 on esitetty.

Kylvetyt ruukut kolme käsittelyä kohden ase- . tettiin ensin pimeään lämpötilassa 6 °C seitsemäksi • · · päiväksi ja sen jälkeen kasvihuoneeseen lämpötilaan n.

• · · **’·[ 25 20 °C niin kuin esimerkissä 3 on esitetty. Käsittelyn vaikutuksen lukemiseksi kehittyneiden kasvien lukumää- rä ja kasvien lukumäärä, joissa oli primaarinen hyök- käys ensimmäiseen lehteen, laskettiin. Bakteerivaiku- : : : tus suhteutettiin käsittelemättömään vertailuun ia • ** 30 jyviin, joita on käsitelty fungisidin Panoctine Plus ; 400 (guatsatine 150 g/1 + imatsalil 10 g/1) , Rhone - • · · .···. Poulenc Ltd. , kanssa annoksena 4 ml kg jyviä kohden.

• · • · · • · i.i l Taulukko 2. MA 342 ja Panoctine Plus 400 vaikutus D^_ • · · ·...· 35 teresiä vastaan ohrassa tyypillisessä kasvihuone se- kundaarisessa seulonnassa • · 1 · · • · · • · • · 10 Käsittely Prosenttia itä- Prosenttia kasveja neitä kasveja joissa oli hyökkäys ensimmäisellä leh- 5 dellä

Vertailu 92,5 13,0

Panoctine Plus 400, 4 ml/kg 95,5 0,0 10 MA 342, 300mg/kg 96,1 0,0

Esimerkki 5 MA 342 vaikutus kasvipatogeeneihin kenttäko- 15 keissa

Kenttäkokeilla, joita oli suunniteltu satunnaistettuina lohkoina ja kolmesta kahdeksaan toisintona, oli palstakokoja, jotka vaihtelivat välillä 0,15 m2 (yksi Tj_ caries koe) - n. 15 m2 (useimmat kokeet) . 20 Kokeet suoritettiin eri seuduilla Ruotsissa ja useimmissa tapauksissa savipitoisilla maaperillä, joissa oli n. 3 % humuspitoisuus.

. Jyvien käsittely bakteerilla ja Panoctine • · ♦ * .* Plus 400 tehtiin niin kuin esimerkissä 4 edellä on • · · *···) 25 esitetty. Sen jälkeen kun käsitellyt jyvät oli kuivat- * * tu puhaltimella ne varastoitiin huoneen lämpötilassa ..ΙΓ eri aikoja ennen kuin ne kylvettiin kenttäpalstoille.

ί.ί.ϊ Kaikki jyvät, paitsi Ί\ cariesilla saastutetut, oli luonnossa saastuneita tai infektoitiin eri testatta- 30 villa taudeilla. Talvivehnän (cv."Kosack") jyviä saas- . tutettiin keinotekoisesti T. cariesin itiöillä sekoit- • · « ' * · · .···. tamalla 2 kg murskattua Ί\_ caries-tähkää 1 kg vehnäjy- • » ·* vien kanssa « · * · · • ♦ · »·· · « · · 35 MA 342 vaikutus Tilletia cariesiin

Vaikutus luettiin saastuneitten tähkien luku- • · määränä kypsymisaikana. Tulokset, joita saatiin saa- • ♦ • ♦ 11 tiin kahdesta kokeesta vuosina 1991/1992 ja kahdessa kokeessa 1992/1993 on esitetty taulukossa 3. Ero bakteerisen käsittelyn ja fungisidikäsittelyn välillä on huomattava vuosina 1992/1993.

5

Taulukko 3. MA 342 bakteerisuspension vaikutus jy-väsyntyiseen Tilletia caries infektioon.

10 Käsittely Prosenttia infektoituneita tähkiä 1991/1992 1992/1993

Vertailu 23 65 15 Panoct.4001, 4ml/kg 2 24 MA 342, 300 mg/kg 0 9 *Panoctine 400 (guatsatine 150 g/1), Rhone-Poulenc

Ltd.

20 MA 342 vaikutus Drechslera teresiin. D. Gra- mineaan. D. avenaeaan ~ia Ustilaao avenaeaan . . Kenttäkokeissa näillä patogeeneillä mitattiin • · · ’1 / lukumäärä itäneitä kasveja m2 kohden ja lukumäärä saas- • · · ’·!·1 25 tuneita kasveja m2 kohden ja lisäksi useimmissa kokeis- * 1 sa myös i) jyvien saanto ii) tuhannen jyvän paino ja ..li' iii) paino hehtolitraa kohden.

: Vaikutus Drechslera teresiin: Tuloksia kenttäkokeista, • · · 1 :1·1: joita suoritettiin vuosina 1991 - 1993 kerättiin, ja 30 jossa vaikutusta D^. teres-infektoitumista vastaan . .·. testattiin ohrassa on esitetty taulukoissa 4, 5 ja 6.

• · ·

Taulukko 4. Tuloksia neljästä kenttäkokeesta ohrassa, • · joka on infektoitu Drechslera teresillä vuonna 1991.

:.· · Keskiarvot neljästä kokeesta joita tehtiin Alnarpissa, • · · 35 lannassa, Strängnäsissä ja Ultunassa.

· • · · ~ — — ______ —· “ • · · • · • · 12 Käsittely Saanto Määrä Infek- Hehto- 1000-jyvää kg/ha kasve- toituja litra paino, g ja/m2 kasve- paino, ja/m2 kg 5 Vertailu 4970 361 47 64,7 41,5

Pan.Plus 400, 4ml 5390 353 1 66,3 43,8 MA 342, 5480 353 1 66,0 43,7 300 ml/kg 10 ------------------------------------------------------

Taulukko 5 tuloksia viidestä kenttäkokeesta ohralla, joka on infektoitu Drechslera teresillä vuonna 1992. Keskiarvot kokeista, joita suoritettiin Svalöfissä, 15 Nygärdissa, Kölbäckissä, Ultunassa ja Rödbäcksdalenis- sa.

Käsit- Saanto Määrä Infek- Hehto- 1000-jyvää 20 tely kg/ha kasve- toituja litra paino, g ja/m2 kasve- paino, j a/m2 kg • · —————————————————————————————————————————————————————— • · · ’· / vertailu 4290 358 48 67,9 51,7 • · · *···* 25 Pan. Plus 400, 4ml 4380 378 1 67,8 50,5 MA 342, 4300 380 1 68,3 52,6 300 ml/kg • · · • · · ___________________________ _____— — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — • · · 30 . Taulukko 6 Tuloksia kahdesta kenttäkokeesta ohralla, • · · • · · ,···. joka on infektoitu Drechslera teresillä vuonna 1993.

• · *1* Keskoarvot kokeista, joita tehtiin Kölbäckissä ja Ui- • · : tunassa.

«·· : : 35

»M

• __ ___________ — — — — — — — — — — — — — _____ _ _ _ _ _ ___________ 111 · · • · ;·#·# Käsittely Saanto Infektoitu • · • · 13 kg/ha kasveja/m2

Vertailu 6310 74

Pan. Plus 400,4 ml 6730 1 5 MA 342, 200 ml/kg 6720 5

Vaikutus Drechslera gramineaan: Tuloksia kenttäkokeista, joissa vilja infektoitiin IL. graminealla, joita 10 tehtiin vuosina 1991 - 1993 on esitetty taulukoissa 7, 8 ja 9.

Taulukko 7 Tuloksia kenttäkokeista vuodelta 1991, joita suoritettiin Uppsalassa ohralla, jota oli infektoi-15 tu D^_ graminealla.

Käsittely Saanto Infektoitu kg/ha kasveja/m2 20 ------------------------------------------------------

Vertailu 3440 31

Pan. Plus 400, 4 ml 4160 2 . MA 342, 200 ml/kg 4390 1 • · · • · _ _ 9 • · · • · · ··· 25 9 * 1 Taulukko 8. Tuloksia viidestä kenttäkokeesta, joita tehtiin vuonna 1992 ohralla, jota infektoitiin Dj. gra- 9 ί,·,ί minealla. Keskiarvot kokeista, joita tehtiin Svalövis- sä, Nygärdissa, Kölbäckissä, Ultunassa ja Rödbäcksda-30 lenissa.

• · · • · · • · · ··· — — — — - — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — —— — — — — — — — • · • · *** Käsit- Saanto Määrä Infek- Hehto- 1000-jyvää • 9 : tely kg/ha kasve- toituja litra paino, g 35 ja/m kasve- paino, ja/m2 kg • · · · — — — — — - — — — — — — — — — — — — — - - - - — — — — — — — — — — - — “ — — — — — — — • · · • · • · 14

Vertai- 2590 383 101 66,2 40,2 lu

Pan.Plus 400, 4ml 3470 381 5 66,6 39,9 5 MA 342, 3460 368 7 66,2 39,8 300 ml/kg

Taulukko 9. Tulokset kahdesta kenttäkokeesta, joita 10 tehtiin vuonna 1993 ohralla, jota oli infektoitu D: Graminealla. Keskiarvot on saatu kokeista, joita on tehty Kölbäckissa ja Ultunassa.

15 Käsittely Saanto Infektoitu kg/ha kasveja/m2

Vertailu 2810 46

Pan. Plus 400, 4 ml 4160 1 20 MA 342, 200 ml/kg 3990 8 . . Vaikutus Drechslera avenaeseen: Tulokset kokeista, • · · — • · · ' .* jossa kauran jyviä infektoitiin D^_ avenaella tehtiin • · · ’···[ 25 vuosina 1991 - 1993 on esitetty taulukoissa 10, 11 ja 12.

• · · # · t ·

Taulukko 10. Tulokset yhdestä kenttäkokeesta vuonna :*·*: 1991, joka tehtiin Uppsalassa kauralla ("Puhti"), jota 30 infektoitiin D^_ avenaella.

• · · • · · «·· • · • · *!* Käsittely Saanto Infektoitu • ♦ : kg/ha kasveja/m2 • · · 35 ------------------------------------------------------

Vertailu 4940 74 • · .. . Pan. Plus 400, 4 ml 4860 32 • · · ' • · • · 15 ΜΑ 342, 200 ml/kg 5090 17

Taulukko 11. Tulokset neljästä kenttäkokeesta, joita 5 tehtiin vuonna 1992 kauralla ("Puhti" ja "Vital"), jota infektoitiin D^. avenaella. Keskiarvot kokeista, joita tehtiin Svalövissä ja Ultunassa.

Käsit- Saanto Määrä Infek- Hehto- 1000-jyvää 10 tely kg/ha kasve- toituja litra paino, g ja/m2 kasve- paino, ja/m2 kg

Vertailu 3990 428 22 57,5 35,4 15 Pan.Plus 400, 4ml 4080 456 13 57,8 35,5 MA 342, 4000 445 3 57,5 35,0 300 ml/kg 20

Taulukko 12 Tuloksia kenttäkokeesta, joka tehtiin Uppsalassa vuonna 1993 kauralle ("Vital"), joka on infek- . . toitu D. avenaella.

• · ♦ " • ·· • · _______________________________________ • · · *·:·1 25 Käsittely Saanto Infektoitu • 1 kg/ha kasveja/m2 ··· • — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — ···· : Vertailu 7570 79 ···

Pan. Plus 400,4 ml 7870 14 30 MA 342, 200 ml/kg 7680 27 • ______________________________________________________ • · · • · ·

Vaikutus Ustilaao avenaeseen: Kenttäkokeissa IL·, avena- *!1 elia haisunokikorvat m kohti tai prosentteina hai- • · ·.: · sunokikorvia määrättiin kypsymis aikaan. Jyväsaantoa 35 ei mitattu. Tulokset kolmesta kokeesta, joita tehtiin vuosina 1991 - 1993 on esitetty taulukossa 13.

• · · · • · · • · • · 16

Taulukko 13. Tuloksia kolmesta kenttäkokeesta, joita tehtiin vuosina 1991 - 1993 Uppsalassa kauralla, jota oli infektoitu Ustilaoo avenaella.

5 Käsittely 1991 1992 1993 haisu- % in- haisu- noki täh- fektoi- nokitäh- kiä/m2 tuneita kiä/m2 tähkiä 10 ------------------------------------------------------

Vertailu 7 10,6 95

Panoctine Plus 400, 4 ml 3 8,7 ei kokeiltu MA 342, 300 11 15 ml/kg 1 1,7 15 11 300 ml 1991 ja 1992; 200 ml 1993.

Esimerkki 6 20 MA 342 käyttö jyviin ja muihin kasvinosiin

Vesipitoisten seosten, jotka sisältävät MA

342. paneminen jyvien päälle. Bakteerisuspensioita, .·. : joita on tuotettu niin kuin edellä on esitetty esimer- • ·♦ kissä 3 tai selitetty esimerkissä 4 sekoitettiin jo- • · · ***. 25 kaisen seuraavista aineiden tai yhdisteiden kanssa:

Talkkijauhoa (Kebo Lab AB), 48 g/1 bakteerisuspensiota • · · •••i Bakteriologista peptonia (Oxoid, Ltd.) 5 g/1 baktee- risuspensiota ··· V: Tween 20 (Merck Ltd.) 20 ml/1 bakteerisuspensiota 30 Metocel (Cellulose ether, Sveda Kemi AB) , 12 g/1 bak- : teerisuspensiota ··· .***. Lissapol (ICI Agrochemicals Ltd.), 1 g/1 bakteerisus- ··» pensiota • · · ··· · Bond (Newman Agrochemicals Ltd.) 1 g/1 bakteerisuspen- 35 siota ·;··· Muissa kokeissa bakteerisuspensiot sentrifu- goitiin 10,000 x g noin 10 min ja tuloksena saadut • · 17 pelletit suspendoitiin joko 0,1 M MgS0„ tai peptonive-teen (5 g bakteriologista peptonia (Oxoid Ltd.) litraa vesijohtovettä kohden).

Kunnollisen sekoittamisen jälkeen tuloksena 5 saadut suspensiot pantiin jyvien päälle niin kuin esimerkissä 4 on esitetty sekoittamattomia bakteerisus-pensioita varten.

Pakastekuivattuien bakteerien paneminen kasvijyvien 10 päälle MA 342 bakteereja, joita on kasvatettu ravis-tusviljelyssä niin kuin on esitetty esimerkissä 4 edellä sentrifugoitiin ja tuloksena saadut pelletit suspendoitiin kuorittuun maitoliuokseen (200 g kuorittua maitojauhetta, Semper AB, Ruotsi, litraa steriiliä 15 tislattua vettä kohden) pakastekuivausestoaineena. Seosta vaippajäähdytettiin lasipurkeissa ja pakaste-kuivattiin tämän jälkeen näissä purkeissa noin 48 h Hetosicc pakastinkuivaajassa (Heto Ltd. Tanska). Tuloksena saatu jauhe varastoitiin lämpötilassa 4 °C 20 muovipusseissa tai muovipulloissa, joissa oli ruuvi-korkki niiden käyttöönottoon saakka. Jyvien päälle panoa varten jauhe joko sekoitettiin veteen tai muuhun .·. : vesipitoiseen liuokseen ja pantiin tämän jälkeen jyvi- • · · en päälle niin kuin esimerkissä 4 on esitetty baktee- • · · '**. 25 risuspensioita varten tai sekoitettiin jyvien kanssa kuivissa olosuhteissa ravistamalla jauhetta kunnolla • · · ···· (noin 10 g jauhetta kg jyviä kohden) muovisessa säili- össä.

• · · • · · • · · 30 MA 342:11a käsiteltyjen jyvien pelletointi. Ma 342 : bakteereja, joita on kasvatettu ravistusviljelmässä • · · .*··. niin kuin esimerkissä 4 edellä on esitetty sekoitet- • · · . ·. tiin volyymisuhteessa 1 : 1 liimautuvan aineen (2 % • · · :·: : p/v natriumkarboksymetyyliselluloosa vesiliuoksen tai 35 50 % p/v gummi arabicumi vesiliuoksen) kanssa. Jyvät ·;··· käsiteltiin tämän sekoituksen kanssa niin kuin esimer- kissä 4 edellä on esitetty. Ylimäärä bentoniittiä • · * • · 18 (Dresser Minerals Inc.) tai talkkijauhetta (Kebo Lab AB) lisättiin tämän jälkeen muovipussiin, pussia täytettiin kaasulla ja ravistettiin voimakkaasti pari minuuttia. Tämän jälkeen jyvät levitettiin suurille 5 tarjottimille puhaltimen alle ja annettiin kuivua huoneen lämpötilassa.

Kasvien versonen suihkuttaminen bakteerisusnensioilla. MA 342 bakteereja, joita on kasvatettu ravistusviljel-10 mässä niin kuin esimerkissä 4 edellä on esitetty, täytettiin muovisiin käsisuihkutuspulloihin tai mekaaniseen pulveriruiskuun ja suihkutettiin tämän jälkeen kasvien lehdille ja versoille. Toisissa käsittelyissä bakteeri sentrifugoitiin ensin noin 10.000 x g kymme-15 nen minuuttia, pelletit suspendoitiin uudestaan vesijohtoveteen ja tämä tuloksena saatu bakteerisuspensio käytettiin kasvien lehtien ja versojen suihkuttami-seen.

Esimerkki 7 20 MA 342:sta saatavien puhdistettujen metabo- liittien vaikutus Drechslera teresin aiheuttamiin tauteihin kasvihuonekokeissa.

.·. : Isolaatti (eriö) MA 342 kasvatettiin 48 h puo- • · · livahvassa (15 g/1) Tryptic soijaliemessä (Difco Ltd.) • · · ***. 25 pyörivässä ravistimessa pimeässä lämpötilassa 18 - 20 °C. Tuloksena saatu bakteerisuspensio sentrifugoitiin • · · 48,000 g 30 min ja metaboliitit supernatantissa puuh-distettiin vielä Sep-pak C 18 filteripaperilla (Waters • · · ·.· · Associates) seuraavalla tavalla: 30 1. 80 ml supernatanttia lisättiin Sep-pak:iin, joka : aktivoitiin 10 ml metanolia.

• · · ·1; 2. Sep-pak pestiin ensin 5 ml 30 % etanolia ja sen • · · . *. jälkeen 5 ml 40 % etanolia.

• · · · 3. Metaboliitit eluoitiin 5 ml 70 % etanolia.

• · · • · *·..* 35 4. 70 % etanoli-eluaatti haihdutettiin pyörivässä ·;··; haihduttimessa kunnes noin 1,5 ml vesiliuos oli jäl- j*.·. jellä. Se laimennettiin tämän jälkeen vesijohtovedellä • · 19 volyymiin 6,5 ml.

Jyviä ohraviljelystä "Golf", joka oli luonnollisesti infektoitu Dl teresillä kastettiin tähän 6,5 ml metaboliitti vesiliuokseen 30 min ja kylvet-5 ti in tämän jälkeen ruukkuihin , 50 jyvää ruukkua kohden. Ruukut peitettiin lasikansilla ja laitettiin pimeään lämpötilassa 6 °C. Yhdeksän päivän päästä kannet poistettiin ja ruukut laitettiin kasvihuoneeseen lämpötilaan 15 - 22 °C noin kahdeksi viikoksi. Itäneet 10 kasvit ja tautihyökkäykset määritettiin tämän jälkeen niin kuin esimerkissä 4 edellä on esitetty. Vertailuna käytettiin 1) käsittelemättömiä jyviä ja 2) jyviä, joita on käsitelty supernatant il la, joka ei ole puhdistettu Sep-pak:illa ja sisältää MA 342 soluja.

15

Taulukko 14. MA 342:sta puhdistettujen metaboliittien ja supernatantin, joka sisältää MA 342 soluja vaikutus D. terestä vastaan ohrassa tyypillisessä kasvihuoneko-keessa 20 ----------------------------------------------------- Käsittely Prosenttia itä- Prosenttia kasveja neitä kasveja joissa on pilaantu- .·. : nut ensimmäinen • · · lehti • · · • · · ···. 25 ------------------------------------------------------ Käsittelemätön vertailu 97,0 21,6 • · · • ••ί Supernatantti, jossa on MA 342 soluja 99,0 1,0 • · · V · Haihdutettu soluvapaa 30 eluaatti 99,0 0,0 • · · — — — — — — — — — ~ — _____ — — — — — — _ ____________ _ ______ _ _ • · · • · · 20 chlororaphis isolaattin(eriön), joilla on taulukossa 1 määritetyt nimet, testattiin yhdessä MA 342 isolaatin kanssa vaikutusta lehtilaikkutautia ohrassa vastaan ja biokemiallisissa testeissä indusoituja reaktioita tes-5 tijärjestelmän API 20 NE mukaan. Lisäksi isolaattien bakteeripesäke esiintyminen ja kidemuodostus agarle-vyillä verrattiin. 11 ei-ruotsalaista isolaattia olivat eri maista ja tallennettu neljään eri hyvämainei-seen viljelykokoelmaan (Taulukko 1) 10

Taudinvastustuskyky koe kasvihuonekokeissa

Kokeet suoritettiin Drechslera teres-infektoituneella ohralla, niin kuin esimerkissä 4 edellää on esitetty, ja kaikki isolaatit testattiin 15 samanaikaisesti jotta saatiin riittävä vertailu. Niin kuin taulukosta 1 selvästi käy ilmi tulokset osoittavat, että MA 342 on selvästi uniikki siinä mielessä, että ei millään muulla isolaatilla, jota tässä testattiin, ollut ominaisuuksia, jotka olisivat olleet sa-20 manlaisia kuin MA 342 tämän tapaisessa testissä, nimittäin kyky estää Drechslera teresin infektio.

: Taulukko 1. Nimet, alkuperäismaat ja MA 342:n ja 11 • · · // muun P_;_ chlororaphis isolaatin vaikutukset teres- • · · ***. 25 infektiota ohrassa vastaan kasvihuonekokeissa • · • · · ···! Isolaatin Maa Vaikutus lehtilaikkutautiin nimi kasvihuone kokeissa.

• · · :.· · % infektoituneita kasveja 30 kyseisellä isolaatilla käsit- : telyn jälkeen • · · « · · • · — — — — — — — — — — — ~ — ~ — — — — — ~ “ — " — — — — — • · • · · • · :·: · MA 342 Ruotsi 9 • · · 35 USDA B2075 Tsekkoslovakia 53 ....: USDA B1869 Uusi Seelanti 60 • · USDA B14874 USA, Colorado 56 • · 21 USDA B14869 USA, Illinois 58 USDA B1854 USA, Loisiana 43 NCTC 10686 Englanti 54 NCTC 7357 Englanti 58 5 DSM 6508 Saksa 56 ATCC 9446 USA 61 ATCC 17414 USA 50

AtCc 17811 USA 58 Käsittelemätön 10 vertailu 71

Reaktioiden induktio biokemiallisissa testeissä testijärjestelmän ΆΡΙ 20 NE mukaan 15 Testit tehtiin niin kuin edellä on esitetty.

Tulokset on esitetty taulukossa 2. Ne osoittavat, että myös tässä suhteessa MA 342 oli uniikki ja voitiin erottaa muista 11 testatusta isolaatista. Jotkut iso-laateista, joita testattiin ei voida pitää tämän tes- 20 tin mukaan olevan keskeisiä Pseudomonas chlororaphis-laj issa.

• · • · · • · · • · • · · • · · ·· · • · e ··· ···· • · · • · · • · · ··· • · · ♦ · · • · · • · · • · · • · · • · • · • · · • · • · · • · · • · · · • · · • · • · • · · 1 2 · 2 · • · · • · • · 1 «β I—1 4-) rd o h

H -H UH

ε 4J ^ ® CD ^ h + i i + ) + )+1+ + +1++1+ + + + ^ (ί 0 0)

*H S-l u H

Λ U -Φ rrt H ^ ,|J Jj rtlH+ll + ll + l+ l+ + +l++l++l + cq cq cq -h :(d > U Ό

i-l -H CJ

!(|j <;σι+ιι + ιι + ι+ ι+ + +ι++ι++ι +

B ’H

CQ 00 m O S o 2 o. ω in «1 »H QVD+II + IIII+ + + + +I++I+ + + + ro d) (ö >-r <d o [" G 4-> H in G 4-> un φ >r| 55 r** + i i + i i + i + !+ + +!++·+ + + +

O

m λ: D il u co

3 2 H VO

40-1-1 U o

JJ SH+II + II + I+ + + + +I++I+ + +I

cd = 4-> +

ω = S

(D co 4_> . CQH+II + II + I+ I+ + +I+ + + + + + +

G

(d (d 4-> Id CTi

H U

O G ® CN -H H PQ|—Il i i i I I I I +1 + 1 1 I + + I + + + +

(N J-J

λ; m rd s ·41 0) i- ^4 r-, 00 04 m rl I I I + I I I I +1 I I I I++1+ + + +

OS

•rn M

R £j -H σ, . . -H ^ ti ^ • · · n 4-J oo *. ·; 0(-l <ep3rH+ll+llll+ + + + +l++l+ + + +

2 =S Z

• · · rrj £ (C o

··· g 1-t 4J “ 1C

....: 5 <u o £

• Ϊ -H . , H O

-H 3 OQCNIII + II + I+ + + + +I++I++II

G S ti S

* V 1 5

£ »1 S S

··· +R 1r-i Eh 2rnii> + »i + ,+1, + »'+,,++l + ··· Π5 -H ^ • · · (ti , t ro

• · · O

Ti 03 ro -rH

0 0) J 4J o cq μ Γ o <d -h

H ? -H 0 <0 44 0 0 O

• -H 0 4J O-HH O Ιί-rt-H O-H

: : : ns -h μ ·η -h -4 ·η « ·η ο ·η ·η λ o o -h o o

... 'HCQjj 3 :id tn tn tnin 4-)id4Jid£44iHidid4Jid-H-H

... i-4 ro <τί 3 “ >1 (TS (ts >1>1 (Oi—1(0 (TS-H (0-H (CS (tJ (0(04-4 tn • · m .1 —_ tn tn 4J -i—> ro Ni Ni -h id ή id i—i tn id £ h h ιβ i—i id id ·...· 7. U) -h -h tn ω tn h h h tn h E h -h tn h -h -h -h m h id id ro ru (d 4-j oo id -h -h -h ε id -h tn ε ε -h ε h ts . . ’ β1! G Ö to 4β 4-1 10 k Sl )l (U E tn E -H -H £ ra H H E -H -H -rl ... O) o \ -Htu h ti) od OOO-Htn-Hinfi-Hidtntn-Htn£tn • · · Λί--4 ε 4-1 o o O >1 ^S-Htnidtntn-Htn-Htntntntn-HAi • n o ατ3 ΛίΛ Λ Λ tntn-Htnid£tn4Jididtnidtno .···. ro ro η ·η o 3 -h -h -h o id tn ie -n id id 4J -h -h id -h tn -h

• . Λ! td 3 2 44 3Hd s e (J-rH O-HH-H-H Ij 44 44 Ή 4J Id E

··· M cq = 4J 4J ε cn-H T4-H-H>;tnotno[ntnid4J4J4J4J-HO

• Geo i 4-> o d h ctn-rH-iHid0fi04->00d<d(d4-)<diHS-i • (doi UH O-H |JH4) H ο-H ο-H O O O Λ Id Id Id >|4<;

*:·1: T " 44 ^ O α.·Η Id 3 Id (ίΛ!Λ β CÄ44^ M Q,« H NO

d . _ “H 44fl ΡιΟΙΙ^Η Did Id β β βΗ 3 α,-Η H 44 β 44 ... ro -h <d ujo, HCidNi^tniuiHi-iieidHidHidTSidHtu^

: · j h H -n H < S h K < G H C5 CQ-O «ISSUSONSrtJSWhW

• · m 23

Bakteeripesäkkeiden esiintymisen ja kidemuodon vertailu agarlevyillä

Isolaatit kasvatettiin Petri-maljoissa TSA 10:llä niin kuin edellä on esitetty. Havaittiin pieniä 5 eroja bakteeripesäkkeiden esiintymisessä kaikkien eri isolaattien välillä mutta kaikkia isolaatteja ei voitu erottaa tällä tavalla. Kuitenkin MA 342 isolaatti oli ainoa isolaatti, joka muodosti tyypillisiä läpinäkyviä kiteitä agarissa ja voitiin siksi tämän ominaisuuden 10 takia erottaa kaikista muista isolaateista.

• · • · · • · · • · • · · • · · • · · • · 9 9 99 • ···· • · · • · · ··· • · · • · · • · · • · · • · · ··· ··· • · • · • · · • · • · · • · · ··· · ··· • · • · ··· 1 2 · 2 · • · · • · • ·

Claims (18)

1. Pseudomonas chlororaphis kanta, joka on tallennettu The National Collections of Industrial and

2. Koostumus patogeenisten sienien aiheutta-10 mien kasvitautien torjumiseksi, tunnettu siitä, että koostumus vaikuttavana aineosana sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaisen mikro-organismin tai sen viljelyliemen, joka sisältää sen antipatogeenisesti vaikuttavia metaboliitteja.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että patogeeni on sieni Drechslera teres.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että patogeeni on sieni

20 Drechslera graminea.

5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että patogeeni on sieni : Drechslera avenae.

. 6. Patenttivaatimuksen 2 mukainen koostumus, • · · 25 tunnettu siitä, että patogeeni on sieni Mic- • · . rodochium nivale.

··· ~ ···· 7. Patenttivaatimuksen 2 mukainen koostumus, • · · *·ί·* tunnettu siitä, että patogeeni on Tilletia · · · V : caries.

5 Marine Bacteria Limited, Aberdeen, Scotland NCIMB tal-lennusnumerolla 40616 tai sen biologisesti puhtaat viljelmät, joilla on kyky tuottaa antipatogeenisesti vaikuttavia metaboliitteja.

8. Patenttivaatimuksen 2 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että patogeeni on sieni Usti- :1: laoo avenae.

··· . *. 9. Patenttivaatimusten 2-8 mukainen koostu- • · t * mus, tunnettu siitä, että vaikuttava aine on • · · ' • · ’···* 35 sekoitus maanviljelyskäytännössä hyväksyttävän kanta- ·;··: ja-koostumuksen kanssa.

·*·*; 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen koostumus, • · tunnettu siitä, että vaikuttava aine on sekoitus nestemäisen kantajan kanssa.

11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että vaikuttava aine on kyl- 5 lästetty kiinteään huokoiseen aineeseen.

12. Patenttivaatimuksen 9 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että koostumus lisäksi sisältää lisäaineita, jotka toimivat liimautuvina aineina.

13. Patenttivaatimuksen 9 mukainen koostumus, 10 tunnettu siitä, että koostumus lisäksi sisältää ravintoainelähteen.

14. Menetelmä patogeenisten sienien aiheuttamien kasvitautien torjumiseksi, johon kuuluu vaikuttavan aineen vaikuttavan annoksen vieminen ympäristöön, 15 jossa tautia aiheuttava aine tulee estää, t u n n e tt u siitä, että vaikuttavat aineet koostuvat patenttivaatimuksessa 1 mainitusta mikro-organismista tai sen viljelyliemestä, joka sisältää sen antipatogeenisesti vaikuttavia metaboliitteja.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetel mä, tunnettu siitä, että vaikuttavaa ainetta pannaan jyvien päälle.

: 16. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetel- • ·· * · . .·. mä, tunnettu siitä, että vaikuttava aine pan- • · · 25 naan kasvin vegetatiivisiin lisäysyksikköihin.

• · . 17. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetel- ··« •**j mä, tunnettu siitä, että vaikuttava aine pan- • · · ’···' naan kasvien päälle. ··· V1

18. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetel- 30 mä, tunnettu siitä, että vaikuttava aine pan- : ϊ : naan kasvatusväliaineeseen, jossa kasvi viljellään tai :***: tullaan viljelemään. ··· • · • · · • · · »M · • M • · • · ··· · • t · • · · • · • · I / f