HU211600A9 - Yeast expressing system - Google Patents
Yeast expressing system Download PDFInfo
- Publication number
- HU211600A9 HU211600A9 HU95P/P00592P HU9500592P HU211600A9 HU 211600 A9 HU211600 A9 HU 211600A9 HU 9500592 P HU9500592 P HU 9500592P HU 211600 A9 HU211600 A9 HU 211600A9
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- glu
- leu
- asp
- ala
- polypeptide
- Prior art date
Links
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims description 87
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 101
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 99
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 95
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 93
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 89
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 77
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 claims description 67
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical group C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 claims description 66
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 65
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 claims description 52
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 49
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 34
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 33
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 23
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 20
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 20
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 20
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 claims description 14
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 12
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 12
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 claims description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 9
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 claims description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 8
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 6
- YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims description 5
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 4
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 claims description 3
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 claims description 3
- UZGFHWIJWPUPOH-IHRRRGAJSA-N Arg-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N UZGFHWIJWPUPOH-IHRRRGAJSA-N 0.000 claims description 3
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 3
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 claims description 2
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 claims description 2
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims description 2
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims description 2
- 108010071289 Factor XIII Proteins 0.000 claims description 2
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 claims description 2
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 claims description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 2
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 claims description 2
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 claims description 2
- NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 claims description 2
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 claims description 2
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 claims description 2
- 229940012444 factor xiii Drugs 0.000 claims description 2
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 claims description 2
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 claims description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 2
- PCTMTFRHKVHKIS-BMFZQQSSSA-N (1s,3r,4e,6e,8e,10e,12e,14e,16e,18s,19r,20r,21s,25r,27r,30r,31r,33s,35r,37s,38r)-3-[(2r,3s,4s,5s,6r)-4-amino-3,5-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-19,25,27,30,31,33,35,37-octahydroxy-18,20,21-trimethyl-23-oxo-22,39-dioxabicyclo[33.3.1]nonatriaconta-4,6,8,10 Chemical group C1C=C2C[C@@H](OS(O)(=O)=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2.O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 PCTMTFRHKVHKIS-BMFZQQSSSA-N 0.000 claims 2
- PXXLQQDIFVPNMP-UHFFFAOYSA-N 3-(diethylcarbamoyl)benzoic acid Chemical group CCN(CC)C(=O)C1=CC=CC(C(O)=O)=C1 PXXLQQDIFVPNMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- WKOBSJOZRJJVRZ-FXQIFTODSA-N Ala-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WKOBSJOZRJJVRZ-FXQIFTODSA-N 0.000 claims 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 claims 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 claims 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 claims 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 claims 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 78
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 72
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 43
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 16
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 16
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 16
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 101150033985 TPI gene Proteins 0.000 description 14
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 13
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 12
- 102100033598 Triosephosphate isomerase Human genes 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 108010038049 Mating Factor Proteins 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- SKEFKEOTNIPLCQ-LWIQTABASA-N mating hormone Chemical compound C([C@@H](C(=O)NC(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCS(C)=O)C(=O)NC(CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CN=CN1 SKEFKEOTNIPLCQ-LWIQTABASA-N 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 2
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 2
- 101150045458 KEX2 gene Proteins 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 2
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N ac1ldcw0 Chemical compound Cl.C1CN(C)CCN1C1=C(F)C=C2C(=O)C(C(O)=O)=CN3CCSC1=C32 LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000007261 sc medium Substances 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N Arginine Chemical compound OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWOGMPWRQQWPPF-GUBZILKMSA-N Asp-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O DWOGMPWRQQWPPF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 101100228206 Caenorhabditis elegans gly-6 gene Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- BCYGDJXHAGZNPQ-DCAQKATOSA-N Glu-Lys-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BCYGDJXHAGZNPQ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102100027612 Kallikrein-11 Human genes 0.000 description 1
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N L-lysyl-L-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 101150118523 LYS4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101710089743 Mating factor alpha Proteins 0.000 description 1
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101100491597 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) arg-6 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- JXWLMUIXUXLIJR-QWRGUYRKSA-N Phe-Glu Chemical class OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 JXWLMUIXUXLIJR-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000582914 Saccharomyces uvarum Species 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 101710152431 Trypsin-like protease Proteins 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000007675 cardiac surgery Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000004640 cellular pathway Effects 0.000 description 1
- 239000004020 conductor Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N diazepam Chemical compound N=1CC(=O)N(C)C2=CC=C(Cl)C=C2C=1C1=CC=CC=C1 AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000988 hyperfibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108091006086 inhibitor proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- YECIFGHRMFEPJK-UHFFFAOYSA-N lidocaine hydrochloride monohydrate Chemical compound O.[Cl-].CC[NH+](CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C YECIFGHRMFEPJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- VBEGHXKAFSLLGE-UHFFFAOYSA-N n-phenylnitramide Chemical compound [O-][N+](=O)NC1=CC=CC=C1 VBEGHXKAFSLLGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 108010012581 phenylalanylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229940057838 polyethylene glycol 4000 Drugs 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000009962 secretion pathway Effects 0.000 description 1
- 210000004739 secretory vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000007514 turning Methods 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 108700030835 yeast plasmid REP Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
- C07K14/8117—Bovine/basic pancreatic trypsin inhibitor (BPTI, aprotinin)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/033—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a motif for targeting to the internal surface of the plasma membrane, e.g. containing a myristoylation motif
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/04—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing an ER retention signal such as a C-terminal HDEL motif
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Mycology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Botany (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Silver Salt Photography Or Processing Solution Therefor (AREA)
- Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
- Processing Of Solid Wastes (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Particle Accelerators (AREA)
Description
A jelen találmány élesztőgombákban expresszált és előállított polipeptidekkel, az ilyen peptideket kódoló DNS szekvenciát tartalmazó DNS szerkezettel, az ilyen DNS fragmenteket hordozó vektorokkal és a vektorokkal transzformált élesztőgomba-sejtekkel, akárcsak az élesztőgombákban való heterológ proteinek termelési folyamatával kapcsolatos.
Az élesztőgombák számos intracellurálisan szintetizált fehérjét termelnek, melyeknek azonban sejten kívüli funkciójuk van. Az ilyen extracelluláris proteinekre, mint kiválasztott proteinekre utalunk. Ezek a kiválasztott proteinek kezdetben a sejten belül expresszálódnak egy az expresszált termék endoplazmás retikulum (ER) membránon keresztül történő hatékony áthaladását biztosító előszekvenciát tartalmazó formájában. A preszekvencia, melyet rendes körülmények között jel peptidnek neveznek, általában lehasad a kívánt termékről a transzlokáció alatt. Amikor belép a kiválasztási reakcióútba a protein a Golgi apparátushoz szállítódik. A Golgi apparátusból a protein különböző útvonalakat követhet, melyek olyan részekhez vezetnek, mint amilyen a sejtvakuolum vagy a sejtmembrán, vagy ki vezetődhetnek a sejtből, hogy a külső tápközegbe választódjanak ki (Pfeffer, S. R. and Rothman, J. E. Ann. Rév. Biochem. 56 (1987), 829-852).
Számos megközelítést javasoltak az élesztőgombák heterológ proteinjeinek élesztőgombákban való expresszálásához. A 0 088 632A számú Európai Közzétett Szabadalmi Alkalmazás leír egy eljárást, mellyel az élesztőgombák hetrológ proteinjei kerülnek expresszálásra, előállításra és kiválasztásra oly módon, hogy egy élesztőgombát transzformáinak egy a kívánt proteint és egy jel peptidet kódoló DNS-at tartalmazó expressziós vektorral, a transzformált mikroszervezetből tenyészetet készítenek, a tenyészetet elszaporítják és a tenyész tápközegből kinyerik a fehérjét. A jel peptid lehet a kívánt proteinek saját jel peptidje, egy heterológ jel peptid vagy az eredeti és heterológ jel peptid egy hibridje.
Az élesztőgombával heterológ jel peptidek használatakor felmerülő probléma lehet, hogy a heterológ jel peptid nem biztosít hatékony transzlokációt és/vagy hasítást a jel peptid után.
A S. cerevisiae MFal (a=faktor) 165 aminosav preproformájaként szintetizálódik, mely aminosav tartalmaz egy 19 aminosav hosszúságú jel vagy prepeptidet, melyet egy 64 aminosav hosszúságú „vezető” vagy propeptid követ, körülvéve 3 N-kötésű glikozilációs helyet, melyet a (LysArg(Asp/Glu, Ala)2.3a-faktor)4 követ (Kurjan, J. and Herskowitz, I. Cell. 30 (1982), 933-943). A prepro MFal jel-vezető részét széleskörűen alkalmazzák a heterológ proteinek S. cerevisiaeben való szintézisének és szekréciójának elérése céljából.
Az élesztőgombákkal homológ jel/vezető peptidek használata ismert a 4 546 082 számú US szabadalmi specifikációból, a 0 116 201 A, 0 123 294 A, 0 123 544 A, 0 163 529 A és 0 123 289 A számú Európai Közzétett Szabadalmi Alkalmazásokból és a 2484/84 és 3614/83 számú dán szabadalmi specifikációkból.
Az EP 0 123 289 A számú szabadalomban a S. cerevisiae a-faktor prekurzor hasznosítása került leírásra, míg a DK 2484/84 számú szabadalomban a Saccharomyces cerevisiae invertáz jel peptid hasznosítását írja le és a DK 3614/83 számú szabadalom a Saccharomyces cerevisiae PH05 jel peptid hasznosítása az idegen proteinek kiválasztása céljából.
A 4 546 082 számú US szabadalmi specifikáció, az EP 016 201 A, 0 123 394 A, 0 123 544 A és 0 163 529 A számú szabadalmak olyan eljárásokat írnak le, melyekkel a Saccharomyces verevisiaeből származó α-faktor jelvezető (MFal, vagy MFa2) kerül alkalmazásra az élesztőgombákban expresszált heterológ proteinek szekréciós folyamatában. A kívánt protein szekréciójához szükséges gén 5’ végén levő S. cerevisiae MFal jel/vezető szekvenciát kódoló DNS szekvencia fuzionálása és a kívánt protein előállítása került bemutatásra.
Az EP 206 783 számú szabadalom leír egy a S. cerevisiaeből történő polipeptidek szekréciójához való rendszert, amiből az α-faktor vezető szekvenciát megcsonkították az eredeti vezető szekvencián jelen levő négy α-faktor peptid eliminálása céljából, azért, hogy a vezető peptidet magát hagyják a heterológ polipeptidhez fuzionálni a LysArgGiuAlaGluAla α-faktor előállítási helyen keresztül. Ez a szerkezet hivatott vezetni a kisebb peptidek (kevesebb mint 50 aminosav) hatékony előállítását. A nagyobb polipeptidek szekréciójá és előállításához az eredeti α-faktor vezető szekvenciát megcsonkították, hogy csupán egy vagy két a-faktor peptidet hagyjanak a vezető peptid és a polipeptid között.
Számos szekretált proteint úgy irányítanak, hogy ki legyen téve egy proteolitikus előállítási rendszernek, mely fel tudja hasítani a peptidkötést két egymás után levő bázikus aminosav karboxil végén. Ezt az enzimatikus aktivitást a 5. cerevisiaben a KEX2 gén kódolja [Julius, D. A. et al.: Cell. 37 (1984 b), 1075]. A termék KEX2 géntermék által történő feldolgozása szüksséges az aktív S. cerevisiae al párosodási faktor (MFal vagy α-faktor) szekréciójához, de nem tartozik bele az aktív 5. cerevisiae a párosodási faktor szekréciójába.
A szekretálásra szánt polipeptid szekrécióját és helyes előállítását néhány olyan esetben lehet elérni, amikor a fent megadott irodalomban jelölt módon megszerkesztett vektorral transzformált élesztőgombát szaporítunk. Számos esetben azonban, a szekréció szintje nagyon alacsony, vagy nincs szekréció, vagy a proteolitikus előállítás nem megfelelő vagy nem teljes. A jelen találmány leírói jelenleg úgy gondolják, hogy ez bizonyos mértékig a vezető peptid C-terminális vége és a heterológ protein N-terminális vége között levő előállító hely nem megfelelő kitevésének tudható be úgy, hogy az nem hozzáférhető vagy legalábbis kevésbé hozzáférhető a proteolitikus hasításhoz.
A következőkben megadjuk a találmány összegzését.
Meglepően azt találtuk, hogy bizonyos módosításokat biztosítva a vezető peptid C-terminális végénél és/vagy a vezető peptidhez fuzionált heterológ polipep2
HU 211 600 A9 tid N-terminális végénél levő előállítási helyhez közel nagyobb hozamot lehet elérni a megfelelően előállított proteinből, mint a módosítás nélküli vezető peptid heterológ polipeptid szerkezettel.
Ennek megfelelően, a jelen találmány egy polipeptiddel kapcsolatos, mely polipeptid tartalmazza egy jel peptid, egy vezető peptid és egy heterológ protein vagy polipeptid fúzióját, mely polipeptidet úgy módosítottuk, a vezető peptid C-terminális vége és a heterológ protein N-terminális vége között pozícionált élesztőgomba-előállítási hellyel szomszédos aminosav szekvenciáját, hogy úgy biztosítsuk az előállítási hely beállítását, hogy hozzáférhető legyen a proteolitikus hasításhoz. A polipeptid szerkezete a következő; jel peptid - vezető peptid -X'-X2-X3-X4- heterológ protein, ahol
X1 egy peptidkötés, vagy egy vagy több aminosavat képvisel, melyek lehetnek azonosak vagy eltérőek,
X2 és X3 azonosak vagy különbözők és egy a Lys-t és
Arg-t tartalmazó csoportból szelektált bázikus aminosavat képviselnek,
X2 és X3 együttesen meghatároznak egy élesztőgomba előállítási helyet és
X4 egy peptidkötés, vagy egy vagy több aminosavat képvisel, melyek lehetnek azonosak vagy különbözők. azzal a feltétellel, hogy X1 és/vagy X4 egy vagy több aminosavat képviselnek és hogy az X1 és/vagy X4 által képviselt aminosavak közül legalább egy a Glu-t és Asp-t tartalmazó csoportból szelektált negatív töltésű aminosav, azzal a további feltétellel, hogy ha X1 egy peptidkötés, akkor X4 jelentése nem lehet Glu-Ala-Glu-Ala vagy GluAla-Glu-Ala-Ser-Leu-Asp, és ha X4 peptidkötés, akkor XI jelentése nem lehet Ser-Leu-Asp.
A jelen összefüggésben a .jel peptidet” úgy kell értelmezni, mint egy előszekvenciát, mely túlnyomóan hidrofób természetű és egy élesztőgombában expreszszált extracelluláris protein prekurzor formáján N-terminális szekvenciaként van jelen. A jel peptid funkciója, hogy lehetővé tegye a szekretálandó heterológ protein számára, hogy belépjen az endoplazmás retikulumba. A jel peptid rendes körülmények között ezen folyamat során lehasad. A jel peptid lehet heterológ vagy homológ a proteint termelő élesztő szervezettel, de mint azt fent magyaráztuk, a jel peptiddel sokkal hatékonyabb hasítást lehet elérni, ha az homológ a kérdéses élesztő szervezettel.
A „vezető peptid” kifejezést úgy kell értelmezni, hogy egy túlnyomórészt hidrofil peptidet jelöl, melynek az a funkciója, hogy lehetővé tegye a szekretálandó heterológ protein számára, hogy az endoplazmás retikulumból a Golgi apparátushoz irányítódjon, majd tovább egy szekréciós vezikulumba, a tápközegbe való kiválasztódás céljából (azaz, egy expresszált protein vagy polipeptid exportálását a sejtfalon keresztül vagy legalább a sejtmembránon át a sejt periplazmás terébe).
A „heterológ protein vagy polipeptid” kifejezés egy olyan proteint vagy polipeptidet hivatott jelölni, mely a természetben nem termelődik a gazda élesztő szervezetben. A „protein” és „polipeptid” fogalmakat alapjában véve egymással kicserélhető fogalmakként használjuk a következő leírásban.
A polipeptid előállítási helynél lévő módosítása (az a hely, ahol a vezető peptidet a heterológ proteinből élesztőgomba protelitikus enzimekkel végzett proteolitikus hasítással távolítottuk el), mely módosítást az X1 és/vagy X4 képviseli, lehet a vezető peptid C-terminális végén és/vagy a heterológ protein N-terminális végén levő egy vagy több aminosav extenziójának, helyettesítésének vagy deléciójának formájában.
A találmány értelmében, meglepően azt találtuk, hogy sokkal hatékonyabb és helyesebb heterológ proteinelőállítást lehet elérni, ha legalább egy azon aminosavak közül, melyekkel a polipeptid szekvenciáját kibővítettük, vagy melyekkel a szekvenciában levő eredeti aminosavak közül egyet vagy többet helyettesítettünk, negatív töltésű aminosav, mint azok, melyeket fent jelöltünk. Hasonló hatás figyelhető meg, amikor negatív töltésű aminosavat biztosítottunk delécióval az előállító hely közelében, azaz eltávolítottunk egy vagy több aminosavat a vezető peptid C-terminális végéből vagy a protein szekvencia N-terminális végéből míg egy negatív töltésű aminosav van jelen az előállítási hely közelében.
Bármely adott elméletre való korlátozódás óhaja nélkül, az a feltételezés, hogy ez a hatás az előállítási hely szomszédságában levő negatív töltésű aminosavak által adott megnövekedett hidrofilitásnak tudható be, ami a vizes intracelluláris környezetben ez előállítási helynél levő polipeptid tercier szerkezetének megnövekedett kitettségét eredményezi, így sokkal hozzáférhetőbb az előállító enzim által történő proteolitikus hasításhoz. A negatív töltésű aminosavak előnyös hatása a pozitív töltésű vagy semleges aminosavakkal szemben az ezen aminosavak negatív töltésű oldalláncainak tulajdonítható, mely az előállítási hely tercier szerkezetének hidrofilitásához járul hozzá anélkül, hogy az előállító enzimet bármilyen lehetséges módon gátolná.
Az is lehetséges, hogy a negatív töltésű aminosavak hozzájárulnak az előállítási hely tercier szerkezetének létrehozásához és fenntartásához (pl. fordulók, hajtűk vagy hurok szerkezetek) máshogy, mint pl. a polipeptidekben levő más aminosav maradékokkal való kölcsönhatás a negatív töltésű aminosavak és az előállító enzim között. így, úgy gondoljuk, hogy az előállítási hely két bázikus aminosavjával szomszédos elhelyezkedésű negatív töltésű aminosavak irányíthatják az előállító enzimet, hogy egy megfelelő és hatékony hasítást végezzen a proteinek közötti és/vagy a protein és oldószer közötti töltés kölcsönhatások révén.
Más szempontból a jelen találmány a fent meghatározott polipeptidet kódoló DNS szekvenciát tartalmazó DNS szerkezettel kapcsolatos.
Egy további szempontból a jelen találmány egy rekombináns expressziós vektoreal kapcsolatos, mely képes élesztőgombában replikálódni és mely a fent meghatározott peptidet kódoló DNS szerkezetet hor3
HU 211 600 A9 doz, kapcsolatos egy élesztőgomba törzzsel is, mely képes expresszálni a heterológ proteint vagy polipeptidet és melyet ezzel a vektorral transzformáltunk.
Egy még további szempontból a jelen találmány kapcsolatos egy az élesztőgombában való heterológ protein vagy polipeptid termelésére való eljárással, mely tartalmazza a transzformált élesztőgomba törzs egy megfelelő tápközegben való szaporítását a heterológ protein vagy polipeptid expressziójának és szekréciójának elérése céljából, mely után a proteint vagy polipeptidet izoláljuk a tápközegből.
A következőkben megadjuk a találmány részletes leírását.
A fent megadott magyarázattal összhangban, ha X1 egy magányos aminosav, akkor Glu vagy Asp.
X1 és/vagy X4 megfelelően 1-6 aminosavat képvisel.
X1 két aminosav szekvenciáját képviseli, akkor BA szerkezete lehet, ahol A Glu vagy Asp és B Glu, Asp, Val, Gly vagy Leu, pl. LeuGlu.
Ha X1 három aminosav szekvenciáját képviseli, CBA szerkezete lehet, ahol Aés B a fenti meghatározás szerinti és C Glu, Asp, Pro, Gly, Val, Leu, Arg vagy Lys, pl. AspLeuGlu.
Ha X1 kettőnél több aminosav szekvenciáját képviseli, a további aminosavak egyike megfelelően lehet Pro vagy Gly, minthogy ezek az aminosavak úgy ismertek. hogy fordulók, hajtűk és hurok szerkezeteket vezetnek be és/vagy ezek részét képezik, valószínűleg elősegítik az előállítási hely hozzáférhetőségét a proteolitikus enzim számára.
Ha X1 négy aminosav szekvenciáját képviseli, DCBA szerkezete lehet, ahol A, B, és C olyan amilyennek fent meghatároztuk és D-nek ugyanolyan jelentései vannak, mint C-nek, pl. GluArgLeuGlu, LysGluLeuGlu vagy LeuAspLeuGlu.
Ha X1 öt aminosav szekvenciáját képviseli, szerkezete EDCBA lehet, ahol A, B, C és D olyan amilyennek fent meghatároztuk és E-nek ugyanolyan jelentései vannak, mint C-nek. pl. LeuGluArgLeuGlu.
Ha X1 hat aminosav szekvenciáját képviseli, szerkezete EDCBA lehet, ahol A, B, C, D és E olyan amilyennek fent meghatároztuk és F-nek ugyanolyan jelentései vannak, mint C-nek, pl. ValLeuGluArgLeuGlu.
Érthető, hogy az aminosavak más kombinációi is lehetségesek, mint X1 jelentései, a találmány elméletétől való eltávolodás nélkül, azt biztosítva, hogy a szekvenciában az aminosavak közül legalább egy negatív töltésű aminosav, mint azt fent meghatároztuk.
Az X4 megfelelő jelentései lehetnek az X1 esetében bemutatottak, bár az aminosav sorrendje tipikusan fordított (pl. ABC CBA helyett stb.).
A találmány polipeptidjeinek megtestesülésében, ahol a heterológ proteint egy vagy több pozitív töltésű aminosav vagy hidrofób aminosav iniciál, X4 előnyösen egy vagy több aminosavat képvisel a peptidkötések helyett, mivel azt gondoljuk, hogy ez a proleolitikus enzimek számára nagyobb hozzáférhetőséget biztosít.
Olyan esetekben, ahol X4 1-6 aminosavnak egy N-terminális extenzióját képviseli, megfelelő lehet egy további előállítási hely biztosítása az X4 és a heterológ protein N-terminális vége által képviselt aminosav vagy aminosavak között. Ez különösen akkor fontos, amikor a proteint olyan célokra kívánjuk felhasználni, ahol N-terminális extenzióval nem rendelkező protein jelentése a kívánatos. A további N-terminális aminosavak in vitro proteolitikus hasítással el lehet távolítani megfelelő proteolitikus enzimet alkalmazva, mint amilyen pl. egy tripszin-szerű proteázt vagy egy vegyszert, mint pl. a cianogén bromidot alkalmazva. A további előállítási helynél levő hasítást befolyásolni lehet gazda élesztő szervezettel egy másik élesztő proteolitikus enzimre specifikus előállítási helyet szelektálva.
Néhány célból azonban előnyös lehet az N-terminális extenziót úgy tervezni, hogy speciális célhoz legyen megfelelő. így az extenzió markerként szolgálhat a protein detektálásához, mint a protein tisztításánál segítségként, vagy egy gyógyszer hatásának in vivő szabályozására, pl. egy szer felezési idejének megnyújtására vagy a testben való speciális elhelyezés tervezésénél.
A jelen találmány polipeptidjének előnyben részesített megtestesítésében X1 és/vagy X4 IX aminosavak aminosav szekvenciáját képviselik. Ebben a megtestesítésben az X2-vel közvetlenül szomszédos aminosav előnyösen Glu vagy Asp, az X3-mal közvetlenül szomszédos aminosav előnyösen Glu vagy Asp vagy mindkettő Glu vagy Asp, mivel ez az előállítási hely kedvező elhelyezkedését biztosítja ezen aminosavak hidrofil tulajdonságának köszönhetően, ahogy azt a fentiekben bővebben részleteztük. Az X1 vagy X4 által képviselt aminosav szekvencia megfelelően tartalmazhat egynél több Glu-t vagy Asp-t.
A találmány polipeptidjének egy másik érdekes megtestesítésében X1 és X4 mind egy vagy több aminosavat képvisel, más szóval a polipeptid módosított mind a vezető peptid C-terminális végénél, mind a heterológ protein N-terminális végénél. Ebben a megtestesítésben X1 és X4 szimmetrikusan azonos lehet, azaz az X1 és X4 által képviselt aminosav vagy aminosavak ugyanazok sorrendben az X2-ből és X3-ból kinyúlva.
A találmány polipeptidjének jel peptid szekvenciája bármely jel peptid lehet, mely biztosítja az expresszált polipeptid sejtben való kiválasztási reakcióútjára való hatékony irányítását. A jel peptid lehet egy a természetben előforduló jel peptid vagy annak funkcionális részei, vagy lehet egy szintetikus peptid. Az a-faktor jel peptidet az egér nyál amiláz jel peptidjet, a módosított karboxipeptidáz jel peptidet vagy az élesztőgomba BARI jel peptidet megfelelő jel peptideknek találtuk, Az egér nyál amiláz jel szekvenciát O. Hagenbüchle et al., írták le, Natúré 289, 1981, pp. 643-646. A karboxipeptidáz jel szekvenciát L. A. Valis et al. írták le Cell 48, 1987, pp. 887-897. A BARI jel peptidet a WO 87/02 670 számú szabadalomban írták le.
A találmány polipeptidjének vezető peptid szekvenciája lehet bármely olyan vezető peptid. mely részt
HU 211 600 A9 vesz az expresszált polipeptid endoplazmás retikulumhoz való irányításában és tovább a kiválasztási útvonalon. Lehetséges vezető szekvenciák, melyek erre a célra megfelelőek, élesztőgombákból vagy más szervezetekből származó természtes vezető szekvenciák, mint amilyen az α-faktor vezető vagy annak egy funkcionális analógja. A vezető peptid lehet egy szintetikus vezető peptid is, pl. az egyik szintetikus vezetőt a WO 89/02463 közzétételi számú International Patent Application-ben írták le a következő aminosav szekvenciával:
A. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-GluIle-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Gly-Phe-Leu-AspLeu-Ala-Gly-Glu-Glu-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-ThrLeu-Ala
B. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-GluIle-Pro-Glu-Glu-Ser-LEu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-ThrThr-Leu-Ala
C. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-GluIle-Pro-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala
D. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-GluIle-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-ThrThr-Leu-Ala-Asn-Val-Ala-Met-Ala és
E. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-GluIle-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-ThrThr-Leu-Ala-Asn-Val-Ala-Met-Ala vagy ezek egy származézával.
A találmány módszerével létrehozott heterológ protein lehet bármely olyan protein, melyet előnyösen lehet termelni élesztőgombában. Az ilyen proteinekre példák az aprotinin, vagy más proteáz inhibitorok, az inzulin (ide értve az inzulin prekurzorokat), a humán vagy szarvasmarha növekedési hormon, az interleukin, a glukagon. a szövet plazminogén aktívátor, a VII Faktor. a VIII Faktor, a XIII Faktor, a trombocita eredetű növekedési faktor, az enzimek stb., vagy ezek egy funkcionális analógja. A jelen összefüggésben a „funkcionális analóg” fogalom egy a természetes proteinnel hasonló funkciójú polipeptidet hivatott jelölni (ezt úgy kell értelmezni, hogy inkább a természetes protein természetére, mintsem a biológiai aktivitás szintjére vonatkozik). A polipeptid szerkezetileg lehet hasonló a természetes proteinhez és származhat a természetes proteinből a természetes protein C és N terminális végeinek egyikéhez vagy mindkettőhöz való egy vagy több aminosav hozzáadásával, a természetes aminosav szekvencia egy vagy több különböző helyén, vagy egy vagy több aminosav helyettesítésével a természetes protein egyik vagy mindkét végén vagy az aminosav szekvencia egy vagy több helyén, vagy egy vagy több aminosav deléciójával, vagy a természetes aminosav szekvenciában egy vagy több helyen egy vagy több aminosav inzertálásával. Jól ismertek ilyen módosítások számos fent említett protein esetében.
A találmánynak megfelelően, meglepően azt tapasztaltuk, hogy a vezető peptid C-terminális végén vagy a heterológ protein N-terminális végén levő módosítások. ahogy fent leírtuk, lehetővé teszik a helyesen előállított aprotinin (vagy ahogy fent meghatároztuk egy funkcionális analógjának) magas hozamú termelését. Az aprotinin egy proteázgátló protein, melyet tulajdonságai hasznossá tesznek számos orvosi célra (pl. a pancreatitis kezelésében, a szeptikus sokk szindrómában, a hiperfibrinolitikus vérzésben és a szívinfarktus esetén). Az aprotinin adagolás nagy dózisban csökkenti a vérveszteséget szívsebészet vagy más nagyobb sebészeti beavatkozás esetében. Az aprotinin hasznos, mint tenyésztápközeg-adalék, mivel gátolja a gazda sejt proteázokat, melyek máskülönben az expresszált proteinek nemkívánatos proteolitikus hasítását okozzák. Élesztőgombákban helyesen előállított aprotinin magas hozamának elérése nehézségekbe ütközött ismert természetes vezető szekvenciákat - mint pl. amilyen az α-faktor vezetőt - használva. A természetes aprotinint az N-végnél egy bázikus aminosav (Arg) iniciálja és ezen oknál fogva az előző előállítási hely kevésbé megfelelő lehet a proteolitikus hasításhoz (mint azt fent magyaráztuk), ha az ismert vezető peptidek (pl. az α-faktor vezető) egyikét a jelen találmánynak megfelelő módosítás nélkül alkalmazzuk, a helyesen előállított aprotinin alacsony hozamát eredményezve, ha van egyáltalán hozam.
A jelen találmánynak megfelelően, különösen jó eredményeket értünk el az aprotinin termelést figyelembe véve, ha X1 GluArgLeuGlu-t képvisel, vagy ha X4 GluLeu vagy GluLeuAspLeu (lásd a következő példákat), bár azt várjuk, hogy kedvező aprotinin hozamokat lehet elérni X1 és X4 más jelentéseivel, feltéve, ha legalább egy aminosav - és legelőnyösebben az előállítási helyhez legközelebb levő - egy negatív töltésű aminosav, ahogy azt fent magyaráztuk.
Szintén a találmánynak megfelelően, azt találtuk, hogy a fent leírtak szerint a vezető peptid C-terminális végén vagy a heterológ polipeptid N-terminális végén levő módostások lehetővé teszik a helyesen előállított inzulin prekurzor vagy ahogy fent meghatároztuk ennek egy funkcionális analógja magas hozamú termelését. A találmány ezen megtestesítésében η X1 Glu-ArgLeu-Glu-t vagy Lys-Glu-Leu-Glu-t képviselhet, mely esetben X4 általában egy peptidkötést képvisel. Másik lehetőségként X4 a Glu-t képviselheti, mely esetben X1 általában egy peptidkötést képvisel. Különösen előnyös eredményeket értünk el a találmánynak megfelelően a B61-29)-AlaAlaLys-A(l-29) inzulin analóg prekurzor expresszióját tekintve, ha X1 LysGluLeuGlut képvisel vagy ha X4 a Phe Glu-val való helyettesítését képviseli - mint az inzulin prekurzor első aminosavját - (lásd a következő példákat). A B(l-29)SerAspAspAlaLys-A(l-29) inzulin analóg prekurzorból is elfogadható mennyiséget lehetett elérni, ha X1 Lys-Glu-LeuGlu-t képviselt. Továbbá azt várjuk, hogy az inzulin prekurzorból magas hozamot lehet elérni az X1 és X4 más jelentéseivel, feltételezve, hogy legalább egy aminsav és legelőnyösebben az, amelyik az előállítási helyhez legközelebb van, egy negatív töltésű aminosav, amint azt korábban magyaráztuk.
A találmány polipeptidjét kódoló DNS szerkezet előállítható szinetikusan, megalapozott standard módszerekkel pl. az S. L. Beaucage and Μ. H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981, pp. 1859-1869 által leírt
HU 211 600 A9 foszforamidit módszertel, vagy a Matthes etal., EMBO Journal 3, 1984 pp. 801-805 által leírt módszerrel. A foszforamidit módszernek megfelelően oligonukleotidokat szintetizálunk pl. egy automata DNS szintetizálón, tisztítjuk őket, duplexeket képezünk és ligáluk a szintetikus DNS szerkezet létrehozása céljából.
A találmány DNS szerkezete lehet genom vagy cDNS eredetű, pl. egy genom vagy cDNS könytár preparálásával és a találmány polipeptidjének egészét vagy részét kódoló DNS szekvencia standard technikáknak megfelelően (lásd T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982) szintetikus oligonukleotid próbákkal végzett hiridizációjával való szkrineléssel lehet kinyerni. Ebben az esetben egy a jel és a vezető peptidet kódoló genom vagy cDNS szekvencia kapcsolódhat egy a heterológ proteint kódoló genom vagy cDNS szekvenciával, mely után a DNS szekvenciát módosítani lehet a polipeptid X'-T2-T3-X4 aminosav szekvenciának megfelelő helynél, pl. helyirányított mutagenezissel, a homológ rekombinációhoz szükséges kívánt aminosav szekvenciái kódoló szintetikus oligonukleotidokat használva. a jól ismert eljárásokkal egyező módon.
Végül a DNS szerkezet lehet kevert szintetikus és genom DNS, kevert szintetikus és cDNS vagy kevert genom és cDNS. melyeket a szintetikus genom vagy cDNS eredetű fragmentek - mely fragmentek megfelelnek a teljes DNS szerkezet különböző részeinek kétszálúvá tételével készítettünk (megfelelően), standard technikáknak megfelelően. így előre látható, hogy a heterológ proteint kódoló DNS szekvencia genom eredetű, míg a vezető peptidet kódoló szekvencia szintetikusan állítható elő.
Az aprotinint kódoló előnyben részesített DNS szerkezetek olyanok, mint amilyenek a 4. 7. 9. 11. és
12. csatolt ábrákban láthatók, vagy ezek aprotinint kódoló megfelelő módosításai, vagy ezek funkcionális analógjai. A DNS szekvenciák megfelelő módosításaira példák a nukleotid helyettesítések, melyek nem változtatják meg a protein aminosav szekvenciáját, de amely egyezik az élesztő szervezet kódon használatával, melybe a DNS szerkezetet inzertáltuk, vagy nukletoid helyettesítések, melyek hozzájárulnak egy eltérő aminosav szekvencia kialakulásához és ezért feltehetően egy eltérő protein szerkezethez, anélkül azonban, hogy káros hatással lennének az eredeti aprotinin antiprotenáz tulajdonságaira. A lehetséges módosításokra más példák a szenvenciába való egy vagy több nukleotid inzertálása, a szekvencia bármely végére való egy vagy több nukletoid hozzáadása és egy vagy több nukletoid deléciója a szekvencia bármely végén vagy a szekvencián belül. A specifikus aprotinin analógokra példák a 339 942 közzétételi számú Európai Patent Alkalmazásban kerültek leírásra.
Az inzulin prekurzorokat kódoló előnyben részesített DNS szerkezetek azok, amelyeket a 16. és 17. csatolt ábrákban mutattunk be, vagy azok megfelelő módosításai, ahogy fent meghatároztuk.
A találmány polipeptidjét kódoló DNS szekvenciát hordozó rekombináns expressziós vektor bármely vektor lehet, mely képes élesztő szervezetekben replikálódni. A vektorban a találmány polipeptidjét kódoló DNS szekvencia működőképesen kell kapcsolódjon egy megfelelő promoter szekvenciához. A promoter lehet bármely DNS szekvencia, mely transzkripciós aktivitást mutat élesztőgombában és származhat az élesztőgombákkal akár homológ, akár heterológ proteineket kódoló génekből. A promoter előnyösen származhat egy az élesztőgombával homológ proteint kódoló génből. A megfelelő promoterekre példák a Saccharomyces cerevisiae Mai, TPI, ADH, vagy PKG promoterek.
A találmány polipeptidjét kódoló DNS szekvencia működőképesen kell kapcsolódjon egy megfelelő terminátorhoz is, pl. a TPI terminátorhoz (lásd T. Alber and G. Kawasaki, J. Mól. Appl. Génét. 1, 1982, pp. 419-434).
A találmány rekombináns expressziós vektora továbbá tartalmaz egy DNS szekvenciát, mely képessé teszi a vektort az élesztőgombában való replikálódásra. Az ilyen szekvenciákra példák az élesztőgomba plazmid REP 1 -3 2 μ-os replikációs génjei és a replikációs origó. A vektor tartalmazhat egy szelektálható markert is, pl. Schizosaccharomycer pombe TPI gént, amint azt P. R. Russell Gene 40, 1985, pp. 125-130 leírta.
A találmány polipeptidjét kódoló DNS szekvenciák sorrendben a promoter és a terminátor ligálásához használt eljárások és ezek az élesztőgombában való replikációhoz szükséges információt hordozó megfelelő élesztőgomba vektorokba való inzertálásához használt eljárások jól ismertek a tudomány e területén képzett szakember számára (lásd pl. Maniatis et al., op. cit.). Érthető, hogy a vektor megszerkeszthető úgy, hogy vagy először a találmány polipeptidjét kódoló teljes DNS szekvenciát tartalmazó DNS szerkezetet hozzuk létre és ezt követően ezt a fragmentet egy alkalmas expressziós vektorba inzertáluk, vagy folyamatosan inzertáljuk az egyes elemek (mint pl. a jel-vezető vagy heterológ protein) genetikai információit tartalmazó DNS fragmenteket a ligálást megelőzően.
A találmány eljárásában használt élesztő szervezet lehet bármely alkalmas élesztő szervezet, mely a tenyésztés során nagy mennyiségben termeli a kérdéses heterológ proteint vagy polipeptidet. Az alkalmas élesztő szervezetekre példák lehetnek a saccharomyces cerevisiae. a saccharomyces kuyveri, Schizosaccharomyses pombe vagy a Saccharomyces uvarum élesztő fajok törzsei. Az élesztőgomba sejtek transzformációját protoplaszt képzéssel lehet befolyásolni, pl. (ld. később az 1. Példát), melyet a per se ismert módon végzett transzformáció követ. A sejtek szaporításához használt tápközeg bármely hagyományos tápközeg lehet, mely alkalmas élesztő szervezetek szaporítására. A szelektált heterológ proteint melynek egy jelentős része a tápközegben lesz jelen megfelelően előállított formában hagyományos eljárásokkal lehet a tápközegből kinyerni. Ezen eljárások magukba foglalják az élesztőgomba sejtek szeparlását a tápközegből centrifugálással vagy szűréssel, a felülúszó
HU 211 600 A9 vagy szűrlet proteines tartalmának egy sóval pl. ammónium szulfáttal való kicsapatását, melyet számos kromatográfiás eljárással, pl. inocserés kromatográfiával. affinitás kromatográviával vagy hasonlókkal végzett tisztítás követ.
További szempontból a találmány kapcsolatos az általános formájú X4-aprotinin(l-58) egy új aprotinin analógjával, ahol X4 egy vagy több aminosavból álló N-terminális extenziót képvisel, mely aminosavak közül legalább egy a Glu-t és Asp-t tartalmazó csoportból szelektált negatív töltésű aminosav. Az X4 egy 1-6 aminosavból álló szekvenciát képviselnek előnyösen 1-4 aminosavból állót és a fent leírt jelentések valamelyikét tartalmazhatja. A különösen előnyben részesített X4 jelentés a Glu-Leu és GluLeu-Asp-Leu.
A következőkben megadjuk a találmány ábráinak rövid ismertetését.
A találmányt a továbbiakban a következő példákban írjuk le a csatolt rajzokra hivatkozva, melyekben: Lábra: az aprotinin(l-58) DNS és aminosav sorrendjét szemlélteti. A DNS szekvenciában látható lépcsőzetes vonalak azokat a helyeket jelölik, ahová a szintetikus oligonukleotidokból képzett duplexeket ligáltuk.
2. ábra: A pKFN-802 és a pKFN-803 plazmid szerkezetét mutatja.
3. ábra: A pKFN-849 és pKFN-855 plazmid szerkezetét mutatja.
4. ábra: A pKFN-849 és a pKFN-855 plazmidokból való 406 bpár hosszúságú EcoRl-Cbal fragment DNS szekvenciáját mutatja. A nyíl azt a helyet jelöli, ahol a szekréció során a proteolitikus hasítás lezajlik.
5/A és 5/B ábra: A tripszin és plazmid aprotinin általi gátlását mutatja, ·’ a szarvasmarha pankreatikus aprotinint jelöli, x a GluLeu aprotinit jelöli és Δ a GluLeuAspLeu aprotinit jelöli.
6. ábra: a pKFN-852 és pKFN-858 plazmidok szerkezetét mutatja.
7. ábra: a pKFN-852 és a pKFN-858 plazmidokból való 412 bázispár hosszúsága EcoRl-Xbal fragment DNS szekvenciáját mutatja. A nyíl azt a helyet jelöli, ahol a szekréció során a proteolitikus hasítás lezejlik.
8. ábra: A pKNF-995 és pKNF-998 plazmidok szerkezetét mutatja.
9. ábra: A pKFN-995 és a pKFN-998 plazmidokból való 412 bázispár hosszúságú EcoRl-Xbal franment DNS szekvenciáját mutatja. A nyíl azt a helyet jelöli, ahol a szekréció során a proteolitikus hasítás lezajlik.
10. ábra: A pKFN-1000 és a pKFN-1003 plazmidok szerkezetét mutatja.
11. ábra: a pKFN-1000 és a pKFN-1003 plazmidokból való 412 bázispár hosszúságú £coRIXbal fragment DNS szekvenciáját mutatja. A nyíl azt a helyet jelöli, ahol a szekréció alatt a proteolitikus hasítás történik.
12. ábra: A szintetikus aprotinin(3-58) gén DNS szekvenciáját mutatja. A lépcsőzetes vonal azt a helyet jelöli, a szekvencián belül, ahová a 10 szintetizált oligonukleotidból képzett 5 duplexet ligáltuk.
13. ábra: A pKFN-305 és pKFN-374/375 plazmidok szerkezetét mutatja.
14. ábra: A pMT636 plazmid szerkezetét mutatja.
15. ábra: A pLaC240 plazmid szerkezetét mutatja.
16. ábra: A pLaC240-ből való módosított vezető inzulin prekurzor gén DNS szekvenciáját mutatja.
17. ábra: a pKFN-458 plazmidból való 508 bázispár hosszúságú EcoRl-Xbal fragment DNS szekvenicáját mutatja, mely az MFa-jel-vezető(l-85)-öt és az inzulin analóg prekurzor B(l-29, lGlu+27Glu)-AlaAlaLys-A(l-21)et kódolja.
A következőkben példákkal szemléltetjük a találmányt.
1. Példa
A KNF-837 élesztőgomba törzsből való Glu-LeuA-aprotinin (1-58) termelés
a) A pKFN—802 plazmid megszerkesztése Ligálással 10 oligonukleotidból szerkesztettünk meg egy az aprotinin(l-58)-at kódoló szintetikus gént.
Az oligonukletoidokat automata DNS szintetizálón szintetizáltuk foszforamidit kémiát alkalmazva szabályozott pórusos üveg segítségével (Beaucage, S. L. and
Caruthers, Μ. H., Tetrahedron Letters 22 (1981) 18591869).
A következő 10 oligonukleotidot szintetizáltuk:
NOR-760: CATGGCCAAAAGAAGGCCTGATTT CTGTTTGGAACCTCCATACACTGG TCC
NOR-754: TTACATGGACCAGTGTATGGAGGT TCCAAACAGAAATCAGGCCTTCTT TTGGC
NOR-354: ATGTAAAGCTAGAATCATCAGATA CTTCTACAACG
NOR-355: CTTGGCGTTGTAGAAGTATCTGAT GATTCTAGCT
NOR-356: CCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTT TCGTTTACGGTGGCT
NOR-357: CTCTGCAGCCACCGTAAACGAAA GTTTGACACAAACCAGC
NOR-358: GCAGAGCTAAGAGAAAGAACTTCA AGT
NOR-359: AGCAGACTTGAAGTTGTTTCTCTT AG
NOR-360: CTGCTGAAGACTGCATGAGAACTT GTGGTGGTGCCTAAT
NOR-361: CTAGATTAGGCACCACCACAAGTT CTCATGCAGTCTTC
Öt duplexet A-E hoztunk létre a fenti 10 ligonukleotidból, melyek az 1. ábrán láthatók.
pmol-t képeztünk a duplexek mindegyikéből
A-E, 5’ foszforilált oligonukleotidok megfelelő párjai7
HU 211 600 A9 ból 5 percig tartó hevítéssel 90 ”C hőmérsékleten, melyet szobahőmérsékletre való hűtés követett 75 perces időtartam alatt. Az 5 duplexet összekvertük és T4 DNS ligázzal kezeltük. A szintetikus gént a ligációs keverék 2%-os agaróz gélen való elektroforézisét követően izolultuk, mint egy 191 bázispár hosszúságú sávot. A nyert szintetikus gént az 1. ábra mutatja.
A szintetikus gént ligáltuk egy a pLaC212spx3 plazmidból származó 209 bázispár hosszúságú EcoRICMroI fragmenthez és a pUC19 plazmid 2,7 kbázisú EcoRi-Xbaí fragmentjéhez (Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J., Gene 33, (1985), 103-119). A pLaC 212spx3 plazmid a WO 89/02463 közzétételi számú International Patent Application 3. példájában került leírásra.
ApLaC212spx3 plazmid 209 bpár hosszúságú EcoRI-M?ol fragmentje egy szintetikus élesztőgomba vezető peptidet kódol.
A ligációs elegyet kompetens E. coli(r~, m+) törzsek transzformálására használtuk és ampicillin rezisztenciára szelektáltuk. Egy 22P-Xbal-Ecol fragment szekvenálása (Maxem. A. and Gilbert, W., Methods Enzymol. 65 (1980) 495-560) azt mutatta, hogy a kapott telepekből származó plazmidok tartalmazzák az aprotinin(l58) helyes DNS szekvenciáját.
Egy pKFN-802 plazmidot izoláltunk további használat céljából. A 2. ábra mutatja a pKFN-802 plazmid szerkezetét.
b) A pKFN-849, pKFN-855 plazmidok és a KFN837 élesztőgomba törzs megszerkesztése.
A pKFN-802 3. o kbázisú Ncoí-Stui fragmentjét ligáltuk a NOR-790/791 szintetikus fragmentjéhez T4 DNS ligázzal:
MAKRELR
CATGGCTAAGAGAGAATGAGA
CGATTCTCTCTTAACTCT
A ligációs elegyet a Stul resktrikciós enzimmel emésztettük, hogy csökkentsük a pKFN-802 bármilyen hátterét és a nyert elegyet kompetens E. coli (τ', m+) törzsek transzformálására használtuk, ampicillin rezisztenciára való szelektálással. A nyert telepek egyikéből származó pKFN-849 plazmidról DNS szekvenálással mutattuk ki [Sanger, E, Micklen, S., and Coulson, A. R., Proc. Natl. Acad Sci. USA 74 (1977) 54635467), hogy a szintetikus élesztőgomba vezető génhez helyesen fuzionálva tartalmazza a Glu-Leu-Aprotinin(l—58) DNS szekvenciát. A pKFN-849 plazmid szerkezetét a 3. ábra illusztrálja.
A pKFN-849 plazmidot vágtuk az £coRL-gyel és Cbal-gyel és a 406 bpár hosszúságú fragmentet ligáltuk a pMT636-ból való 9,5 kbázisú Ncol-Xbal fragmenthez és a pMT636-ból való 1,4 kbázisú Ncol-EcoRI fragmenthez. mely a pKFN-855 plazmidot eredményezte, lásd a 3. ábrát. A pMT636 plazmid a PCT/DK88/00138 számú International Patent Application-ben került leírásra.
A pMT636 egy E. coli-S. cerevisiae hordozó vektor. mely tartalmazza a Schizosaccharomyces pombe TP1 gént (PÓT) [Russel. P. R., Gene 40 (1985), 125130), a 5. cerevisiae trióz-foszfát izomeráz promotert és terminátort, a TPIp-t és TPIT-t (Alber, T., and Kawasaki, G., J. Mól. Appl. Gén. 1 (1982), 419^134). A pKFN-855 plazmid a következő szekvenciát tartalmazza:
TPIp-LaC212spx3 jel-vezető-Glu-Leu-aprotinin(l-58)-TPIT ahol LaC212spx3 jel-vezető az a szintetikus élesztőgomba vezető, ami a WO 89/0263 közzétételi számú International Patent Application-ben került leírásra. A pKFN-849 és pKFN-855 plazmidokból származó 406 bázispár hosszúságú EcoRl-Xbal fragment DNS szekvenciáját a 4. ábra mutatja.
AS. cerevisiae MT663 törzset (Έ2-7Β ΧΕ11-36 a/, tpi tpi, pép 4-3/pep 4-3)YPGal-on (1% Bacto élesztőkivonat, 2% Bacto pepton, 2% galaktóz, 1% laktát) szaporítottuk 600 nm hullámhosszon mért 0,6 O. D. értékig.
100 ml tenyészetből gyűjtöttük össze a sejteket centrifugálással, 10 ml vízzel mostuk, újra centrifugáltuk és 1.2 M szorbitot, 215 mM Na2EDTA-t pH=8,0 és 6,7 mg/ml ditiotreitolt tartalmazó 10 ml oldatban szuszpendáltuk. A szuszpenziót 30 °C hőmérsékleten 15 percig inkubáltuk, centrifugáltuk és a sejteket 10 ml 1,2 M szorbit 10 mM Na2EDTA-t 10,1 M Na-citrátot. pH=5,8 és 2 mg NovozymR-234-et tartalmazó elegyben reszuszpendáltuk. Az elegyet 30 °C hőmérsékleten 30 percig inkubáltuk, a sejteket centrifugálással összegyűjtöttük 10 ml 1,2 M szorbitot és 10 ml CAS-t (1,2 M szorbit, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris-Hcl (Tris=Tris (hidroximetil)aminometán) pH=7 .5) tartalmazó elegyben mostuk és 2 ml CASben reszuszpendáltuk. A transzformáláshoz 0,1 ml CAS-ben reszuszpendált sejtet kevertünk megközelítően 1 pg pKFN-855 plazmiddal és a keveréket 15 percig szobahőmérsékleten hagytuk. 1 ml 20%-os polietilén glikol 4000-ret, 20 mM CaCI2t, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl-ot, pH=7,5 tartalmazó elegyet adtunk hozzá és a keveréket további 30 percig szobahőmérsékleten hagytuk. A keveréket centrifugáltuk és a pelletet 0,1 ml SOS-ben (1,2 M szorbit, 33% v/v YPD. 6,7 mM CaCl2, 14 pg/ml leucin) resuszpendáltuk és 2 órán át 30 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A szuszpenziót ezután centrifugáltuk és a pelletet 0,5 ml 1,2 M-os szorbitban reszuszpendáltuk. Ezután 52 °C hőmérsékleten 6 ml fedő agart (Sherman et al., SC tápközege, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1981)], mely 1,2 M szorbitot + 2,5% agart tartalmaz) adtunk hozzá, majd a szuszpenziót ugyanezen agarral szilárdított szorbit tartalmú tápközeget tartalmazó lemezek tetejére öntöttük. A transzformáns telepeket 30 ’C hőmérsékleten való 3 napig tartó inkubálás után újra izoláltuk és folyékony tenyészetek inokulálásához használtuk. Egy ilyen KFN-837 transzformánst szelektáltunk a további jelleméshez.
A KFN-837 élesztőgomba törzset YPD tápközegen |1% élesztőki vonat, 2% pepton (Difco Laboratoriestól) és 6% glükóz) szaporítottuk. A törzs tenyészetének 200 ml mennyiségét rázattuk 250 rpm fordulaton 30 °C hőmérsékleten 3 napig 600 nm hullámhosszon mért 20
HU 211 600 A9
O. D. értékig (a száraz élesztőgomba biomassza 18,8 g/liter). Centrifugális után a felülúszót analizáltuk FPLC inocserés kromatográfiával. Az élesztőgomba felülúszót 0,22 pm Millex GV szűrőegységen szűrtük keresztül és 1 ml-t 20 mM Bicine-nel (pH=8,7) equlibrált MonoS kationcserés oszlopra (0,5x5,0 cm) helyeztük. Az equlibrációs pufferrel való mosás után az oszlopot equlibrációs pufferben lineáris NaCl grádienssel (0-1 M) eluáltuk. A tripszin inhibitor aktivitást spektrofotometriás vizsgálattal (Kassel, B., Methods Enzymol. 19 (1970), 844-852) határoztuk meg az eluált frakciókban, majd a továbbiakban a 280 nm hullámhosszon mért abszorpció integrálásával a következő egyenletből:
1%
E (aprotinin)=8,3
A hozam 120 mg/liter Glu-Leu-aprotinin(l-58) volt.
Az aminosav analízishez és az N-terminális szekvenáláshoz a grádiens eluált Glu-Leu-aprotinin(l58)-at koncentráltuk és fordított fázisú oszlopon (Vydac C4 4,6x250 mm) végzett HPLC-vel tisztítottuk. Az eluálást 0,1%-os TFA-ban CHjCN grádienssel végeztük. Az összegyűjtött frakciókat 100 μΙ-re koncentráltuk be vákum centrifugálással és a mintákat N-terminális szekvenáláshoz és aminosav analízishez használtuk.
Az N-terminális szekvencálással a következő szekvenciáit találtuk:
Glu-Leu-Arg-Pro-Asp-Phe-X-Leu-Glu-Pro-Pro-TyrThr-Gly-Pro-X-Lys-Ala-Arg-Ile-Ile-Arg-Tyr-Phe-TyrAsn-Ala-Lys-Ala megerősítve, hogy az N-terminális vég helyes. A félcisztein maradékokat nem határoztuk meg ezzel a módszerrel, melyeket a vak ciklusokkal (X) megegyezően a 7-es és 16-os számú maradékokra kaptunk.
Az aminosav analízist az 1. táblázat mutatja. Ebből a táblázatból kitűnik, hogy a termékek a várt aminosav összetétele van. pl. több Glu és Leu. A kicsit alacsonyabb Ile tartalom legvalószínűbben az Ile( 18)-Ile( 19) nem teljes hidrolízisének tulajdonítható (ez jól ismert a tudomány számára). Az Arg szintén egy kevéssel több, mint vártuk. Ez azonban a természetes aprotinin esetén is látható (1. táblázat, 3. oszlop).
Ha Kassel fent említett módszerével összehasonlítjuk a Glu-Leu-aprotinin(l-58) specifikus aktivitása megegyezik a kísérleti hibán belül a természetes aprotinin aspecifikus aktivitásával. A Glu-Leu-aprotinin (1-58) tripszin és plazma gátlása a később leírtak szerini meghatározott titrálási görbe szempontjából elkülöníthetetlen volt a szarvasmarha pankreáz aprotininétől (Aprotinin Novo). Az enzim aprotininnel vagy annak analógjával való 30 percig tartó inkunbálása után 0.6 mM S 2251 -et (KabiVitrum) adtunk és az aktivitást, mint a nitroanilin termelés arányát határoztuk meg. Az aktivitást az aprotinin koncentráció függvényeként ábrázoltuk az 5A és 5B ábrákban. Mind a 3 inhibitorral mindkét eznim teljes gátlását figyeltük meg.
2. példa
A Glu-Leu-Asp-Leu-aprotinin( 1-58) KFN-840 élesztőgomba törzsben való termelése
Egy a Glu-Leu-Asp-Leu-aprotinin(l-58)-at kódoló szintetikus gént az 1. Példában leírtak szerint szerkesztettük meg. A NOR-793/794 szintetikus fragmentet használtuk a NOR-790/791 helyett:
MAKRELDLR
CATGGCTAAGAGAGAATTGGACTTGAGA
CGATTCTCTCTTAACCTGAACTCT
A pUC19 eredetű pKFN-852 plazmidot a pKFN849 plazmidhoz hasonló módon szerkesztettük meg.
Az 1. Példa eljárását követve egy pKFN-858 plazmidot nyertünk, mely a következő szerkezetet tartalmazza:
TPIP-LaC212spx3-jel-vezető-GluLeuAspLeu-aprotinin (l-58)-TPIT.
A pKFN-852 és pKFN-858 plazmidok megszerkesztését a 6. ábra illusztrálja. A pKFN-852 és pKFN858 plazmidokból való 412 bázispár hosszúságú EcoRI-ΧάαΙ fragment DNS szekvenciáját a 7. ábrában adtuk meg.
A pKFN-858 plazmidot az MT663 élesztőgomba törzsbe transzformáltuk, mely a KFN-840 élesztőgomba törzset eredményezte. A kFN-840 200 ml tenyészetét YPD tápközegben rázattuk 250 rpm fordulaton 30 °C hőmérsékleten, 3 napig 600 nm hullámhosszon mért 18 O. D. értékig (a száraz biomassza 16,7 mg/liter). A felülúszó FPLC ion kromatográfiája, ahogy fent leírtuk 90 mg/liter Glu-Leu-Asp-Leu-aptoinin (1-58) hozamot eredményezett.
Az aminosav analízis az 1. táblázatban látható és megerősíti a várt aminosav összetételt.
A Glu-Leu-Asp-Leu-aprotinin(l-58) tripszin és plazmin gátlási titrációs görbéi elkülöníthetetlenek voltak a szarvasmarha pankreáz aprotininétől (Aprotinin Novo). lásd az 5/A és %/B ábrákat.
3. Példa
A KFN-1006 élesztőgomba törzsből való aprotinin(l-58) termelése
A pKFN-995 plazmidot a pKFN-802 plazmidból szerkesztettük meg, a 3,0 kbázis hosszúságú Ncol-Stul fragment NOR-848/849 szintetikus fragmenthez való ligái ásával:
MaAKELERKRR
CATGGCTAAGGAATTGGAGAAGAGAAGG
CGATTCCTTAACCTCTTCTCTTCC
A ligációs elegyet a Ball restrikciós enzimmel emésztettük, hogy csökkentsük a pKFN-802 bármilyen hátterét.
A pKFN-998 élesztőgomba expressziós plazmidot alapjában véve az 1. példában leírtak szerint szerkesztettük meg. amint azt a 8. ábra mutatja:
TPlP-LaC212spx3 jel-vezető(l-47) Lys-Glu-LeuGlu (Lys-Arg)-Aprotinin(l-58)-TPIT.
A pKFN-995 és pKFN-998 plazmidokból való 412 bázispár hosszúságú FcoRI-ΧάαΙ fragment DNS szekvenciáját a 9. ábrán adtuk meg.
HU 211 600 A9
A pKFN-998 plazmidot az MT663 élesztőgomba törzsbe tranformáltuk az 1. példában leírtak szerint, mely a KFN-1006 élesztőgomba törzset eredményezte. A transzformált kKFN-1006 törzset YPD tápközegben való tenyésztését és az aprotinin(l-58) felülúszóban való analízisét a fent leírtak szerint végeztük.
Az aprotinin(l-58) hozam 30 mg/liter volt.
A tisztított anyag aminosav analízise megerősítette a várt aminosav összetételt.
4. Példa
A KFN-1008 élesztőgomba törzsből való aprotinin( 1-58) termelés
ApUC eredetű pKFN-1000 plazmidot az 1. példában leírtak szerint szerkesztettük meg a pKFN-802 plazmnid 3,0 kbázisű Ncol-Stul fragment NOR850/851 szintetikus fragmenthez való ligálásával: M-AERLEKRR
CATGGCTGAGAGATTGGAGAAGAGAAGG
CGACTCTCTAACCTCTTCTCTTCC
Az 1. és 3. példa eljárását követve egy pKFN-1003 élesztőgomba expressziós plazmidot nyertünk, mely a következő szerkezetet tartalmazta:
TPIP-LaC212spx3-jel-vezető(l—47)-GluArgLeuG lu(Lys-Arg)-aprotinin(l-58)-TPIT.
A pKFN-1000 és pKFN-1003 plazmidok szerkezetét a 10. ábra illusztrálja. A pKFN-1000 és pKFN-1003 plazmidokból való 412 bázispár hosszúságú £coRI-Y6aI fragment DNS szekvenciáját all. ábrán adtuk meg.
A pKFN-1003 plazmidot az MT663 élesztőgomba törzsbe transzformáltuk a fent leírtak szerint, mely a KFN-1008 élesztőgomba törzset eredményezte.
A transzformált KFN-1008 törzs YPD tápközegben való tenyésztését és az aprotinin( 1-58) felülúszóban való analízisét a fent leírtak szerint végeztük. Az aprótinin) 1-58) hozam 120 mg/liter volt.
A tisztított anyag aminosav analízise igazolta a várt aminosav összetételt. Továbbá a teljes elsődleges szerkezet igazolását a redukált piridiletilált polipeptid gáz fázisú szekvenálásával nyertük.
Továbbá a rekombináns aprotinin(l-58) tripszinnel szembeni specifikus gátló aktivitása megkülönböztethetetlen volt a szarvasmarha pankreáz aprotininétől.
5. Példa
A KFN-783 élesztőgomba törzsből való aprotinin( 1-58) termelés
A pKFN-802 plazmidot (lásd az 1. példát) £coRIgyel és ΧάαΙ-gyel vágtuk és a 400 bázispár hosszúságú fragmentet a pMT636 plazmidból származó 9,5 kbázisú Ncol-Xbal fragmenthez és a pMT636 plazmidból származó 1,4 kbázisú Ncol-Ecol fragmenthez ligáltuk, mely a pKFN-803 plazmidot eredményezte, lásd a 2. ábrát. A pKFN-803 a következő szerkezetet tartalmazza:
TPIP-LaC212spx3 jel-vezető-aprotinin( 1—58)—TPIT.
1. Táblázat Aminosav összetétel
| Aminosav | Aprotinin Elméleti | Aprotinin Mért | KFN-837 Mért | KFN-840 Mért |
| Asp | 5 | 5,00 | 4,95 | 5,93 (+1) |
| Thr | 3 | 2,86 | 2,84 | 2,85 |
| Ser | 1 | 0,94 | 0,92 | 0,93 |
| Glu | 3 | 3,04 | 3,97 (+1) | 3,99 (+1) |
| Pro | 4 | 4,18 | 3,90 | 3,86 |
| Gly | 6 | 5,95 | 5,91 | 5,94 |
| Alá | 6 | 5,85 | 5,92 | 5,94 |
| Cys | 6 | 5.20 | 5,21 | 5.22 |
| Val | 1 | 0,99 | 1,00 | 1,01 |
| Met | 1 | 0,83 | 0,65 | 0,67 |
| Ile | 0 | 1.39 | 1,58 | 1,58 |
| Leu | Ί | 1.97 | 3,00(+1) | 4,00 (+2) |
| Tyr | 4 | 3,84 | 3,74 | 3,71 |
| Phe | 4 | 3,98 | 3,94 | 3,92 |
| Lys | 4 | 3,92 | 3,99 | 3,99 |
| Arg | 6 | 6,39 | 6,35 | 6,34 |
| Összesen | L | 56.33 | 57.87 | 59.88 |
A fent leírtak szerint transzformáltuk az MT663 35 élesztőgomba törzsbe a pKFN-803 plazmidot. A fent leírtak szerint tenyésztettük a transzformált KFN-783 törzset YPD tápközegben és a felülúszó FPLC ion kormatográfiáját a fent leírtak szerint végezzük. Az aprotinin(l-58) mennyiségi meghatározását a szarvasmarha pankreázból tisztított autentikus aprotinin standardizált oldatának kromatográfiájával való összehasonlítással végeztük. Az aprotinin( 1-58) hozama 1 mg/liter alatt volt.
6. Példa
Az aprotininf 3-58) termelése
Az aprotinin (3-58) szintetikus génjét ligálással szerkesztettük meg, számos oligonukleotidból.
Az 1. példában leírtak szerint szintetizáltuk a következő 10 oligonukleotidot.
I : AAAGAGATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCC
II : TTACATGGACCAGTGTATGGAGGTTCCAAACAGAAACT
III : ATGTAAAGCTAGAATCATCAGATACTTCTACAACG
IV: CTTGGCGTTGTAGAAGTATCTGATGATTCTAGCT
V: CCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCT
VI : CTCTGCAGCCACCGTAAACGAAAGTTTGACACAAACCAGC
VII: GCAGAGCTAAGAGAAACAACTTCAAGT
VIII: AGCAGACTTGAAGTTGTTTCTCTTAG
IX: CTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGTGGTGCCTAAT
X: CTAGATTAGGCACCACCACAAGTTCTCATGCAGTCTTC
5-mer 3 8-mer 3 5-mer 34-mer
39- mer
40- mer 27-mer 26-mer 39-mer 38-mer
HU 211 600 A9
Öt duplexet A-E hoztunk létre a fenti oligonukleotidokból, amint azt a 12. ábra mutatja.
A duplexek A-E mindegyikéből 20 pmol mennyiséget hoztunk létre az 5’-foszforilált oligonukleotidok I-X megfelelő párjaiból 5 percig tartó 90 ’C hőmérsékleten való hevítéssel, melyet 75 percig tartó szobahőmérsékletre való hűtés követett. Az 5 duplexet összekevertük és T4 ligázzal kezeltük. A szintetikus gént, mint egy 176 bázispár hosszúságú sávot izoláltuk a ligációs keverék 2%-os agaróz gélen való elektroforézise után. A nyert szintetikus gént a 12. ábrán mutatjuk.
A szintetikus 176 bázispár hosszúságú gént ligáltuk egy a 5. cerevisiae al párosodási faktor jel-vezető(l85) szekvenciát (Markussen, J. et al., Protein-Engineering 1. (1987), 215-223] kódoló pKFN-9 plazmidból származó 330 bázispár hosszúságú EcoJti-Hgal fragmenthez és a pUC19 (Yanisch-perron, C., Vieira, J. and Messing, J„ Gene 33 (1985), 103-119] plazmidból származó 2,7 kbázisú EcőftA-Xba\ fragmenthez. Az MFal vezető szekvencia után közvetlenül egy Hga\ helyet tartalmazó pKFN-9 szerkezete az EP 214826 sz. szabadalomban került leírásra.
A ligitációs keveréket egy kompetens E coli (r, m+)törzs tranformálására használtuk ampicillin renisztencára való szelektálással. A 32P-Xi>alragment szelektálása (Maxam, A., and Gilbert, W., Methods Enzymol 65 (1980). 499-560) azt mutatta, hogy a nyert telepekből származó plazmidok az aprotinin (3-58) helyes DNS szekvenciáját tartalmazzák.
Egy plazmidot. a pKFN-305 plazmidot, szelektáltuk további használat céljából. A pKFN-305 plazmid szerkezetét a 13. ábrán illusztráltuk.
A pKFN-305 plazmidot EcoRI-gyel és ΧάαΙ-gyel vágtuk és a 0.5 kbázisú fragmentet ligáltuk a pMT636 plazmidból származó 9,5 kbázisú Ncol-Xbal fragmenthez és a pMT636 plazmidból származó 1,4 kbázisú M?oI-£coRI fragmenthez, mely a pKFN374 plazmidot eredményezte, lásd a 13. ábrát. A pMT636 plazmidot a pMT608 palzmidból a LEU-2 gén deléciója után és a pMT479 plazmidból szerkesztettük meg. lásd a 14. ábrát. A pMT608 plazmid az EP 195 691 számú szabadalomban került leírásra. A pMT479 plazmid az EP163 529 számú szabadalomban került leírásra. A pMT 479 plazmid tartalmazza a Schizosaccharomyces pombe TPI gént (PÓT), a S. cerevisiae triózfoszfát izomeráz promotert és terminátort. a TPIP-t és a TPIT-t (Aber, T. and Kawasaki, G„ J. Mól. Appl. Gén. 1 (1982), 419-434]. A pKFN374 plazmid a következő TPIP-MF 1-jel-vezetői 1-85 )-aprotinin(3-58)-TPIT, ahol MFa a 5. cerevisiae 1 párosodási faktort kódoló szekvencia (Kurjan. J. and Herskowitz, I., Cell 30(1982), 933-943), a jel-vezetó(l-85) azt jelenti, hogy a szekvencia tartalmazza az MFal jel-vezető szekvencia első 85 aminosav maradékát és az aprotinin (3-58) egy az első két aminosav maradékkal nem rendelkező aprotinin származékot kódoló szintetikus szekvencia.
A 5. cerevisiae MT663 törzsét (E2-7B XE11-36 a/aAtpiAtpi. pep4-3/pep4-3) YPD tápközegen (1%
Bacto élesztőkivonal, 2% Bacto pepton, 2% galaktóz, 1% laktát) szaporítottuk 600 nm hullámhosszon mért 0,6 O. D: értékig.
A nyert tenyészet 100 ml mennyiségből a sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, 10 ml vízzel mostuk, újra centrifugáltuk és 10 ml 1,2 M szorbitot, 25 mM Na2EDTA-t (pH=8,0) és 6,7 mg/ml ditiotreitolt tartalmazó oldatban szuszpendáltuk. A szuszpenziót 15 percig 30 ’C hőmérsékleten inkubáltuk, centrifugáltuk és a sejteket 10 ml 1,2 M szorbitot, 10 mM Na2EDTA-t, 0,1 M nátrium-citrátot (pH=5,8) és 2 mg NovozymR 234-et tartalmazó oldatban reszuszpendáltuk. A szuszpenziót 30 percig 3§ ’C hőmérsékleten inkubáltuk, a sejteket centrifugálással összegyűjtöttük 10 ml 1,2 ml 1,2 M szorbit és 10 ml CAS (1,2 M szorbit, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl (Tris-Tris(hidroximetil)aminomentán (pH=7,5) elegyében mostuk és 2 ml CAS-ben reszuszpendáltuk. A transzformációhoz a 0,1 ml CAS-ben reszuszpendált sejteket összekevertük megközelítően lpg pKFN374 plazmiddal és 15 percig szobahőmérsékleten hagytuk. Egy ml 20% polietilén glikol 4000, lOmM CaCl2, 10 mM Tris HCI (pH=7,5) elegyét adtuk hozzá és a keveréket további 30 percig szobahőmérsékleten hagytuk. A keveréket centrifugáltuk és apelletet 0,1 ml SOS-ben (1,2 M szorbit, 33% v/v YPD, 6,7 mM CaCl2, 14 pg/ml leucin) reszuszpendáltuk és 2 órán keresztül 30 ’C hőmérsékleten inkubáltuk. A szuszpenziót ekkor centrifugáltuk és a pelletet reszuszpendáltuk 0,5 ml 1,2 M-os szorbitban. Ezután 6 ml fedő agart (Sherman et al.-fék SC tápközeg (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratories, 1981), mely 1,2 M szorbitot +2,5% agart tartalmaz] adtunk 52 ’C hőmérsékleten hozzá és a szuszpenziót ugyanezen ágánál szilárdított szorbit tartalmú tápközeget tartalmazó lemezek felületére öntöttük. Atranszformáns telepeket 30 ’C hőmérsékleten 3 nap után újra izoláltuk és folyadék tenyészetek indításához használtuk őket. Egy ilyen KFN-322 transzformánst szelektáltunk további jellemzés céljából.
A KFN-322 élesztőgomba törzset YPD tápközegen szaporítottuk [1% élesztőkivonat, 2% pepton (a Difco Laboratoriestól) és 2% glükóz]. A törzs 10 ml tenyészetét 30 ’C hőmérsékleten rázattuk, 600 nm hullámhosszon mért 32 O. D. értékig. Centrifugálás után a felülúszót FPLC ioncserés kromatográfiával vizsgáltuk. Az élesztőgomba felülúszót 0,22 pm-es MillexR GV szűrőegységen szűrtük át és 1 ml-t adtunk egy MonoS kationcserés oszlopra (0,5x5 cem), melyet 20 m -os Bicine-nel (pH=8,7) equlibráltunk. Az equlibrációs pufferrel való mosás után az oszlopot equlibrációs pufferben levő lineáris NaCl grádienssel (0-1 M) eluáltuk. A tripszin inhibitor aktivitás mennyiségi meghatározását az eluált frakciókban spektrofotometriás vizsgálattal végeztük, majd a továbbiakban a 280 nm hullámhosszon mért abszorpció integrálásával a következő egyenletből:
1% ^280 (aprotinin)=8,3
A hozam kb.3 mg/liter aprotinin(3-58) volt.
HU 211 600 A9
7. Példa
Az inzulin prekurzor B(J-29)-AlaAlaLys-A( J-21) termelése a LaCl 667 élesztőgomba törzsből A WO 89/02 463 számú szabadalomban leírt pLac
212spx3 plazmidból izoláltuk az 589 bpár hosszúságú Sphl-Ncol és a 172 bpár hosszúságú Hpal-Xbal fragmenteket. Ezeket a ragmenteket kapcsoltuk a szintetikus adaptorhoz:
MAKELEKRFV
NOR-962 CATGGCTAAGGAATTGGAAAAGA GATTCGTT
NOR-964 CGATTCCTTAACCTTTTCTCTAAGC AA és a pMT-743 plazmidból való a WO 89/02463 számú szabadalmakban leírt 10 kbázisú Xbal-Sphl fragmenthez, mely a pLaC240 plazmidot eredményezte (lásd a 15. ábrát). A pLaC24O plazmidból való módosított vezetőinzulin prekurzor gén DNS szekvenciáját a 16. ábra mutatja.
Az MT663 élesztőgomba törzs pLaC240 plazmiddal való transzformálása egy inzulin prekurzort szekretáló törzshöz a LaCl 1667-hez (MT663/PlaC240) vezetett. melynek produktivitása 165%-a a WO 89/02463 számú szabadalomban leírt módosítás nélküli vezetőinzulin prekurzort kódoló gént tartalmazó LaC1414 (MT663/pLaC212spx3) törzshöz viszonyítva.
8. Példa
Az inzulin analóg prekurzor B( 1-29,
IGlu+27Glu)-AlaAlaLys-A( 1-2]) termelése a
KFN^47O élesztőgomba törzsből
Tíz oligonukleotid ligálásával egy az inzulin analóg prekurzor B(l-29, lGlu+27Glu)-AlaAlaLysA(l —21 )-et kódoló szintetikus gént szerkesztettünk meg. A B (1-29. lGlu+27Glu) a humán inzulin B láncának (melyben Glu maradékokkal helyettesítették a BIPhe és a B27Thr maradékokat) első 29 aminosav maradékát tartalmazó polipeptidet juttatja kifejezésre. Az A(l—21) a humán inzulin A lánca. Az AlaAIaLys tripeptid a B29Lys maradékot kapcsolja az AlGly maradékhoz.
A következő 10 oligonukleotid szintetizáltuk: NOR-542: AAAGAGAAGTTAACCAACACTTG
TGCGGTTCCCAC
NOR-543: AACCAAGTGGGAACCGCACAAGT GTTGGTTAACTTC
NOR-69: TTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTT TGCGGTGAAAGAGGTTTCT
NOR-73: GTAGAAGAAACCTCTTTCACCGCA AACCAAGTACAAAGCTTC
NOR-315: TCTACGAACCTAAGGCTGCTAAGG GTATTGCT
NOR-316: ATTGTTCGACAATACCCTTAGCAG CCTTACGTTC
NOR-70: GAACAATGCTGTACCTCCATCTGC TCCTTGTACCAAT
NOR-71: TTTTCCAATTGGTACAAGGAGCAG ATGGAGGTACAGC
NOR-78: TGGAAAACTACTGCAACTAGACG CAGCCCGCAGGCT
NOR-72: CTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCTAG TTGCAGTAG
Öt duplexet képeztünk a fenti 10 oligonukleotidból és a duplexeket az 1. Példában leírtakhoz hasonló módon ligáltuk. A szintetikus 175 bázispár hosszúságú gént ligáltuk a S. cerevisiae 1 párosodási faktor jel-vezető (1-85) szekvenciát (Markussen, J. et. al., Protein Engineering 1 (1987), 215-223] kódoló pKFN-9 plazmidból való 330 bázispár hosszúságú EcoRl-Hgal fragmenthez és a pUC19 plazmid (Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J., Gene 33 (1985), 103-119] 2,7 kbázisú EchoR\-Xba\ fragmentjéhez.
A ligációs keveréket eg kompetens E. coli (r'm+) törzs transzformálására használtuk, amplicillin rezisztenciára szelektálva. A 22P-Xbal-EcoRl fragment szekvenálására [Maxam, A. and Gilbert, W., Methods Enzymol. 65 (1980) 499-560] azt mutatta, hogy a kapott telepekből származó plazmidok tartalmazták az inzulin analóg prekurzor helyes DNS szekvenciáját.
Egy plazmidot, a pKFN-456 plazmidot szelektáltuk további használatra.
Az 1. Példa eljárását követve egy élesztőgomba expressziós plazmidot, a pKFN-458 plazmidot nyertük, mely a következő expressziós kazettát tartalmazza: TPlp-MF 1 -jel-vezetőd -85 )-B( 1-29, 1G1u+27G1u)AlaAlaLys-A(l-21)-TPIT.
A pKFN-456 és pKFN-458 plazmidokból származó 508 bázispár hosszúságú EcoRl-Xbal fragment DNS szekvenciáját a 17. ábrában adtuk meg.
A pKFN-458 plazmidot az MT663 élesztőgomba törzsbe transzformáltuk a fent leírtak szerint, mely a KFN-470 élesztőgomba törzset eredményezte.
A KFN-470 transzformált törzs YPD tápközegen való tenyésztését a fent leírtak szerint végeztük. A felülúszóban levő inzulin analóg prekurzor hozamot a leírtak szerint [L. Snel et al., Chromatographia 24 (1987), 329-332) HPLC-vel határoztuk meg.
A 2. táblázatban az inzulin analóg prekurzorok a B(l—29, 1G1u+27G1u)-AlaAIaLys-A(l-21) és Bf 1-29, 27Glu)-AlaAlaLys-A(l-21) és az inzulin prekurzor B (l-29)-AlaAlaLvs-A( 1-21) expressziós szintjeit hasonlítottuk össze. Mind a három prekurzort ugyanabban a gazda törzsben, az MT663-ban expresszáltuk és az expressziós kazettát tartalmazó plazmidokat tartalmazó S. pombe TPI génnel transzformáltuk. Az expressziós kazetta:
TPIp-MF 1 -jel-vezető( 1-85 )-pre kurzor-ΤΡ1Ψ.
2. táblázat
Élesztőgomba transzformánsokban levő inzulin és inzulin analóg prekurzorok expressziós szintjei Prekurzor Expressziós szint’
B(l-29)-AlaAlaLys-A(l-21) 100%
B( 1-29. 27Glu)-AlaAlaLys-A(l-21) 148%
B(l-29. lGlu+27Glu)-AlaAlaLysA(l-21) 479%
Az expressziós szinteket az inzulin prekurzor B(l29)-AlaAlaLvs-A(l-21) expressziós szintjének százalékában adtuk meg, melyet önkényesen 100%-nak vettünk.
Claims (44)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Egy jel peptid, egy vezető peptid és egy heterológ protein vagy polipeptid fúzióját tartalmazó polipeptid, mely polipeptidnek módosítottuk egy élesztőgomba előállítási hellyel szomszédos aminosav szekvenciáját, melyet úgy pozícionáltunk a vezető peptid C-terminális vége és a heterológ protein N-terminális vége közé, hogy biztosítsa az előállítási hely egy olyan beállítását, mely hozzáférhetővé teszi azt a proteolitikus hasítás számára, a polipeptidnek a következő szerkezete van:jel peptid-vezetó peptid-X’-X2-X3-X4-heterológ protein, aholX1 egy peptid kötés, vagy egy vagy több aminosavat képvisel, melyek lehetnek azonosak vagy eltérőek,X2 és X3 ugyanolyanok vagy eltérőek és egy a Lys-t ésArg-t tartalmazó csoportból szelektált bázikus aminosavat képvsileik,X2 és X3 együttesen egy élesztőgomba előállítási helyet határoznak meg, ésX4 egy peptid kötés vagy egy vagy több aminosavat képvisel, melyek azonosak vagy eltérőek lehetnek, azzal a feltétellel, hogy X1 és/vagy X4 egy vagy több aminosavat képviselnek és hogy legalább egy az X1 és/vagy X4 által képviselt aminosav a Glu-t és Asp-t tartalmazó csoportból szelektált negatív töltésű aminosav, azzal a további feltétellel, hogy ha X’ jelentése peptidkötés, akkor X4 nem lehet Glu-Ala-Glu-Ala vagy Glu-Ala-Glu-Ala-Ser-LeuASp, és ha X4 jelentése peptidkötés, akkor X1 jelentése nem lehet Ser-Leu-Asp.
- 2. Egy az 1. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy X1 Glu-t vagy Asp-t képvisel.
- 3. Egy az 1, igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy X' egy a BA szerkezetű két aminosavból álló szekvenciát képvisel, ahol A Glu vagy Asp és B Glu. Asp, Val, Gly vagy Leu.
- 4. Egy az 1. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy X' egy a CBA szerkezetű három aminosavból álló szekvenciát képvisel, ahol A és B olyan mint ahogy azt fent meghatároztuk és C Glu, Asp, Pro, Gly, Val, Leu, Arg vagy Lys.
- 5. Egy az 1. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy X1 egy a DCBA szerkezetű négy aminosavból állószekvenciát képvisel, ahol A, B és C olyan mint a fent meghatározott és D ugyanolyan jelentésű, mint C.
- 6. Egy az 1. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy X1 egy az EDCBA szerkezetű öt aminosavból álló szekvenciát képvisel, ahol A, B, C és D olyan, mint a fent meghatározott és E ugyanolyan jelentésű mint C.
- 7. Egy az 1. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy X1 egy az FEDCBA szerkezetű hat aminosavból álló szekvenciát képvisel, ahol A, B, C, D és E olyan mint a fent meghatározott és F ugyanolyan szerkezetű, mint C.
- 8. Egy az 1. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy X4 Glu vagy Asp.
- 9. Egy az 1. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy X4 egy az AB szerkezetű két aminosavból álló szekvenciát képvisel, ahol A Glu vagy Asp és B Glu Asp, Val, Gly vagy Leu.
- 10. Egy az 1. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy X4 egy az ABC szerkezetű három aminosavból álló szekvenciát képvisel, ahol A és B olyan mint a fent meghatározott és C Glu, Asp, Pro, Gly, Val, Leu, Arg vagy Lys.
- 11. Egy az 1. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy X4 egy az ABCD szerkezetű négy aminosavból álló szekvenciát képvisel, ahol A, B és C olyan mint a fent meghatározott és D ugyanolyan jelentésű mint C.
- 12. Egy az 1. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy X4 egy az ABCDE szerkezetű öt aminosavból álló szekvenciát képvisel, ahol ABC és D ugyanolyan mint a fent meghatározott és E ugyanolyan jelentésű, mint C.
- 13. Egy az 1. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy X4 egy az ABCDEF szerkezetű hat aminosavból álló szekvenciát képvisel, ahol A, B, C, D és E olyan mint a fent meghatározott és F ugyanolyan jelentésű, mint C.
- 14. Egy az 1. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy X1 és/vagy X4 1-nél több aminosavat képvisel, az X2-vel közvetlenül szomszédos aminosav Glu vagy Asp, az X3-mal közvetlenül szomszédos aminosav Glu vagy Asp vagy mindkettő Glu vagy Asp.
- 15. Egy az 1. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy ha X1 és/vagy X4 1-nél több aminosavat képvisel, akár X1 akár X4 vagy mindkettő több mint egy Glu-t vagy Asp-t tartalmaz.
- 16. Egy az 1. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy X1 és X4 J 1 aminosavat képvisel.
- 17. Egy a 16. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy XI és X4 szimmetrikusan azonos.
- 18. Egy az 1. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy ha X4 1 vagy több aminosavat képvisel, eg további előállítási hely biztosított az X4 és a heterológ protein N-terminális vége között.
- 19. Egy az 1. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy a jelpeptid egy α-faktor jelpeptid, az egér nyál amiláz jel peptidje, a karbocipeptidáz jel peptid, vagy az élesztőgomba BARI jel peptidje.
- 20. Egy az 1. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy a vezető peptid egy természetes vezető peptid, mint amilyen az α-faktor vezető peptid.
- 21. Egy az 1. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy a vezető peptid egy szintetikus vezető peptid, mint amilyen az:A. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-GluIle-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Gly-Phe-Leu-AspLeu-Ala-Gly-Glu-Glu-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-ThrLeu-AlaB. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-GluIle-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-ThrThr-Leu-AlaC. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-GluIle-Pro-Iel-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-AlaHU 211 600 A9D. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-GluIle-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-ThrThr-Leu-Ala-Asn-Val-Ala-Met-Ala ésE. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-GluIle-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-ThrThr-Leu-Ala-Asn-Val-Ala-Met-Ala vagy ezek egy származékával.
- 22. Egy az 1. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy a heterológ proteint vagy polipeptidet a következőket tartalmazó csoportból szelektáltuk: aportinin vagy más proteáz inhibitorok, inzulin és inzulin prekurzorok, humán vagy szarvasmarha növekedési hormonok, interleukin, szövet plazminogén aktivátor glukagon, VII Faktor, VIII Faktor, XIII Faktor, trombocita eredetű növekedési faktor, enzimek, és ezen proteinek bármelyikének funkcionális analógjai.
- 23. Egy a 22. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy heterológ protein vagy poilpeptid aprotinin vagy annak egy funkcionális analógja.
- 24. Egy a 23. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy X1 Glu-Arg-Leu-Glu vagy Lys-GluLeu-Glu.
- 25. Egy a 23. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy X4 Glu-Leu vagy Glu-Leu-Asp-Leu.
- 26. Egy a 22. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy a heterológ protein vagy polipeptid inzulin vagy egy inzulin prekurzor vagy annak egy funkcionális analógja.
- 27. Egy a 26. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy X1 Glu-Arg-Leu-Glu vagy Lys-GluLeu-Glu.
- 28. Egy a 26. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy X4 Glu.
- 29. Egy a 26-28. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy a heterológ protein vagy polipeptid egy inzulin analóg prekurzor B81—29)AlaAlaLys-A(l-29) és ahol X1 Lys-Glu-Leu-Glu.
- 30. Egy a 26-28. igénypontok bármelyike szerint polipeptid azzal jellemezve, hogy a heterológ protein vagy polipeptid egy inzulin analóg prekurzor B(l-29)-SerAspAspAla Lys-A (1-29) és ahol X1 Lys-Glu-Leu-Glu.
- 31. Egy DNS szerkezet, mely egy az 1-30. igénypontok szerinti polipeptidet kódoló DNS szekvenciát tartalmaz.
- 32. Egy a 31. igénypont szerinti DNS szerkezet azzal jellemezve, hogy tartalmazza a 4., 7., 9. vagy 11. ábrákon bemutatott DNS szekvenciát vagy ennek megfelelő módosítását.
- 33. Egy rekombináns expressziós vektor, mely képes élesztőgombában replikálódni és mely egy a 31. vagy 32. igénypontok szerinti DNS szerkezetet hordoz.
- 34. Egy élesztőgomba törzs, mely képes egy heterológ proteint vagy polipeptidet expresszálni és melyet egy a 33. igénypont szerinti vektorral transzformáltunk.
- 35. Egy eljárás heterológ protein vagy plipeptid élesztőgombában való termelésére, mely tartalmazza egy a 34. igénypont szerinti élesztőgomba törzs egy megfelelő tápközegben való tenyésztését a heterológ protein vagy polipeptid expresszálásának, szekréciójának, előállításának céljából, mely után a proteint vagy polipeptidet a tápközegből izoláljuk.
- 36. Az X4-aprotinin(l-58) általános formula egy aprotinin analógja, ahol X4 egy vagy több aminosav N-terminális extenzióját képviseli, mely aminosavak közül legalább egy a Glu-t és Asp-t tartalmazó csoportból szelektált negatív töltésű aminosav.
- 37. Egy a 36. igénypont szerinti analóg azzal jellemezve, hogy X4 Glu vagy Asp.
- 38. Egy a 36. igénypont szerinti analóg azzal jellemezve, hogy X4 egy AB szerkezetű két aminosavból álló szekvenciát képvisel, ahol a A Glu vagy Asp B Giu, Asp, Val, Glu, vagy Leu.
- 39. Egy a 36. igénypont szerinti analóg azzal jellemezve, hogy X4 egy ABC szerkezetű három aminosavból álló szekvenciát képvisel, ahol A és B olyan mint a fent meghatározott és C Glu, Asp, Pro, Gly, Val, Leu, Arg vagy Lys.
- 40. Egy a 36. igénypont szerinti analóg azzal jellemezve, hogy X4 egy ABCD szerkezetű négy aminosavból álló szekvenciát képvisel, ahol A, B és C olyan mint a fent meghatározott és D ugyanolyan jelentésű mint C.
- 41. Egy a 36. igénypont szerinti analóg azzal jellemezve, hogy X4 egy ABCDE szerkezetű öt aminosavból álló szekvenciát képvisel, ahol A, B, C, és D olyan mint a fent meghatározott és E ugyanolyan jelentésű mint C.
- 42. Egy a 36. igénypont szerniti analóg azzal jellemezve. hogy X4 egy ABCDEF szerkezetű hat aminosavból álló szekvenciát képvisel, ahol A, B, C, D és E olyan mint a fent meghatározott és F ugyanolyan jelentésű mint C.
- 43. Egy a 36. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy X4 egynél több aminosavat képvisel, X4 egynél több Glu-t vagy Asp-t tartalmaz.
- 44. Egy a 36 igénypont szerinti analóg azzal jellemezve, hogy X4 Glu-Leu vagy Glu-Leu-Asp-Leu.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK105489A DK105489D0 (da) | 1989-03-03 | 1989-03-03 | Polypeptid |
| DK494189A DK494189D0 (da) | 1989-10-06 | 1989-10-06 | Polypeptid |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU211600A9 true HU211600A9 (en) | 1995-12-28 |
Family
ID=26065137
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU902376A HU215538B (hu) | 1989-03-03 | 1990-03-01 | Eljárás heterológ proteinek előállítására új élesztő kifejező rendszerrel |
| HU95P/P00592P HU211600A9 (en) | 1989-03-03 | 1995-06-29 | Yeast expressing system |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU902376A HU215538B (hu) | 1989-03-03 | 1990-03-01 | Eljárás heterológ proteinek előállítására új élesztő kifejező rendszerrel |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5395922A (hu) |
| EP (1) | EP0461165B2 (hu) |
| JP (1) | JP2609367B2 (hu) |
| KR (1) | KR970005928B1 (hu) |
| AT (1) | ATE110414T1 (hu) |
| AU (1) | AU624694B2 (hu) |
| CA (1) | CA2050336C (hu) |
| CZ (1) | CZ285239B6 (hu) |
| DD (1) | DD296965A5 (hu) |
| DE (1) | DE69011853T3 (hu) |
| DK (2) | DK105489D0 (hu) |
| ES (1) | ES2062514T5 (hu) |
| FI (1) | FI104985B (hu) |
| HU (2) | HU215538B (hu) |
| IE (1) | IE66469B1 (hu) |
| IL (1) | IL93609A (hu) |
| NO (2) | NO304236B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ232742A (hu) |
| PL (1) | PL163532B1 (hu) |
| RU (1) | RU2194758C2 (hu) |
| UA (1) | UA27706C2 (hu) |
| WO (1) | WO1990010075A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA901476B (hu) |
Families Citing this family (72)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5591603A (en) * | 1987-08-28 | 1997-01-07 | Novo Nordisk A/S | Process for preparing aprotinin and aprotinin analogs in yeast cells |
| DK105489D0 (da) * | 1989-03-03 | 1989-03-03 | Novo Nordisk As | Polypeptid |
| JPH04507341A (ja) * | 1989-05-19 | 1992-12-24 | バイオテクノロジー リサーチ アンド ディヴェロプメント コーポレーション | ｉｎ ｖｉｖｏ翻訳後修飾部位を有する融合タンパク質及び製造及び精製方法 |
| GB9015825D0 (en) * | 1990-07-18 | 1990-09-05 | Ciba Geigy Ag | In vitro processing of fusion proteins |
| DK300090D0 (da) * | 1990-12-19 | 1990-12-19 | Novo Nordisk As | Fremgangsmaade til fremstilling af leadersekvenser |
| GB9106185D0 (en) * | 1991-03-22 | 1991-05-08 | Wellcome Found | Biological control agents |
| FR2686899B1 (fr) * | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| FI92601C (fi) * | 1992-03-11 | 1994-12-12 | Marja Makarow | Menetelmä hyötyproteiinien erittämiseksi hiivoista |
| US5521086A (en) * | 1993-09-16 | 1996-05-28 | Cephalon, Inc. | Secretion sequence for the production of a heterologous protein in yeast |
| DE4417353A1 (de) * | 1994-05-18 | 1996-01-25 | Bayer Ag | Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Aprotinin und rekombinanten Aprotinin Varianten mit der natürlichen N-terminlaen Sequenz |
| ZA954983B (en) * | 1994-06-17 | 1996-02-14 | Novo Nordisk As | N-terminally extended proteins expressed in yeast |
| US6500645B1 (en) | 1994-06-17 | 2002-12-31 | Novo Nordisk A/S | N-terminally extended proteins expressed in yeast |
| US5861267A (en) * | 1995-05-01 | 1999-01-19 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Methods, nucleotide sequences and host cells for assaying exogenous and endogenous protease activity |
| ZA9610456B (en) * | 1995-12-20 | 1997-06-20 | Novo Nordisk As | N-terminally extended proteins expressed in yeast |
| US5851800A (en) * | 1996-05-14 | 1998-12-22 | Pharmacia & Upjohn Ab | Process for producing a protein |
| DE19629982A1 (de) | 1996-07-25 | 1998-01-29 | Bayer Ag | Aprotinin-Varianten mit verbesserten Eigenschaften |
| WO1998025963A1 (en) | 1996-12-13 | 1998-06-18 | Chiron Corporation | Analysis and separation of platelet-derived growth factor proteins |
| JP4187796B2 (ja) * | 1996-12-20 | 2008-11-26 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 酵母で発現されたｎ末端伸長タンパク質 |
| EP0954589A1 (en) * | 1997-01-24 | 1999-11-10 | Novo Nordisk A/S | Synthetic leader peptide sequences |
| US6046000A (en) * | 1997-11-07 | 2000-04-04 | Millennium Biotherapeutics, Inc. | Method for identifying genes encoding signal sequences |
| JP2003525570A (ja) | 1998-01-23 | 2003-09-02 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 酵母において所望のポリペプチドを産生する方法 |
| CN1415019A (zh) | 1999-12-29 | 2003-04-30 | 诺沃挪第克公司 | 用于生产在酵母中具有改进发酵产量的胰岛素前体和胰岛素前体类似物的方法 |
| AU2001259063A1 (en) | 2000-04-12 | 2001-10-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US20050100991A1 (en) * | 2001-04-12 | 2005-05-12 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US20050054051A1 (en) * | 2001-04-12 | 2005-03-10 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US7507413B2 (en) * | 2001-04-12 | 2009-03-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US7595172B2 (en) | 2001-07-24 | 2009-09-29 | Novo Nordisk A/S | Method for making acylated polypeptides |
| WO2003059934A2 (en) | 2001-12-21 | 2003-07-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| EP1463751B1 (en) | 2001-12-21 | 2013-05-22 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| CA2498017C (en) | 2002-09-13 | 2016-06-14 | Cornell Research Foundation, Inc. | Using mutations to improve aspergillus phytases |
| EP1594530A4 (en) | 2003-01-22 | 2006-10-11 | Human Genome Sciences Inc | HYBRID PROTEINS OF ALBUMIN |
| EP1687428A1 (en) | 2003-11-14 | 2006-08-09 | Novo Nordisk A/S | Processes for making acylated insulin |
| WO2005054291A1 (en) | 2003-12-03 | 2005-06-16 | Novo Nordisk A/S | Single-chain insulin |
| ES2368500T3 (es) | 2005-08-16 | 2011-11-17 | Novo Nordisk A/S | Método para producir polipéptidos de insulina maduros. |
| ATE482977T1 (de) | 2006-02-27 | 2010-10-15 | Novo Nordisk As | Insulinderivate |
| US20080026376A1 (en) | 2006-07-11 | 2008-01-31 | Huaming Wang | KEX2 cleavage regions of recombinant fusion proteins |
| US8198046B2 (en) | 2006-07-11 | 2012-06-12 | Danisco Us Inc. | KEX2 cleavage regions of recombinant fusion proteins |
| CN101541830A (zh) | 2006-09-22 | 2009-09-23 | 诺沃-诺迪斯克有限公司 | 蛋白酶抗性的胰岛素类似物 |
| JP5503968B2 (ja) | 2006-09-27 | 2014-05-28 | ノボ・ノルデイスク・エー／エス | 成熟インスリンポリペプチドの作製方法 |
| ES2425413T3 (es) | 2006-11-22 | 2013-10-15 | Novo Nordisk A/S | Método para preparar carboxipeptidasa activada |
| WO2009010428A1 (en) | 2007-07-16 | 2009-01-22 | Novo Nordisk A/S | Protease stabilized, pegylated insulin analogues |
| ES2558930T3 (es) | 2007-08-13 | 2016-02-09 | Novo Nordisk A/S | Análogos de la insulina de acción rápida |
| WO2009022013A1 (en) | 2007-08-15 | 2009-02-19 | Novo Nordisk A/S | Insulin analogues with an acyl and aklylene glycol moiety |
| JP5721432B2 (ja) | 2007-08-15 | 2015-05-20 | ノボ・ノルデイスク・エー／エス | アミノ酸含有アルキレングリコール反復単位を含むアシル部を有するインスリン |
| US8501449B2 (en) * | 2007-12-04 | 2013-08-06 | Proteon Therapeutics, Inc. | Recombinant elastase proteins and methods of manufacturing and use thereof |
| EP2910571B1 (en) | 2008-03-18 | 2016-10-05 | Novo Nordisk A/S | Protease stabilized, acylated insulin analogues |
| ES2563553T3 (es) | 2008-04-01 | 2016-03-15 | Novo Nordisk A/S | Conjugados de insulina-albúmina |
| WO2010103546A2 (en) * | 2009-03-12 | 2010-09-16 | Bigtec Private Limited | A polynucleotide and polypeptide sequence and methods thereof |
| ES2543705T3 (es) | 2009-06-26 | 2015-08-21 | Novo Nordisk A/S | Preparación que contiene insulina, nicotinamida y arginina |
| WO2011064282A1 (en) | 2009-11-25 | 2011-06-03 | Novo Nordisk A/S | Method for making polypeptides |
| EP2526117B1 (en) | 2010-01-22 | 2015-05-06 | Novo Nordisk A/S | Process for preparing fgf-21 with low degree of o-glycosylation |
| US8815798B2 (en) | 2010-06-23 | 2014-08-26 | Novo Nordisk A/S | Insulin analogues containing additional disulfide bonds |
| WO2011161083A1 (en) | 2010-06-23 | 2011-12-29 | Novo Nordisk A/S | Human insulin containing additional disulfide bonds |
| RU2598273C2 (ru) | 2010-06-23 | 2016-09-20 | Ново Нордиск А/С | Производные инсулина, содержащие дополнительные дисульфидные связи |
| RU2013130374A (ru) | 2010-12-14 | 2015-01-20 | Ново Нордиск А/С | Препарат, содержащий инсулин, никотинамид и аминокислоту |
| JP2013545782A (ja) | 2010-12-14 | 2013-12-26 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | 長時間作用型インスリンと組み合わせた速効型インスリン |
| WO2012171994A1 (en) | 2011-06-15 | 2012-12-20 | Novo Nordisk A/S | Multi substituted insulins |
| RU2460795C1 (ru) * | 2011-07-06 | 2012-09-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | Способ микробиологического синтеза секретируемого соматотропина человека и штамм дрожжей saccharomyces cerevisiae - продуцент секретируемого соматотропина человека |
| WO2013186138A1 (en) | 2012-06-14 | 2013-12-19 | Novo Nordisk A/S | Preparation comprising insulin, nicotinamide and arginine |
| JP6735561B2 (ja) | 2012-12-03 | 2020-08-05 | メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションＭｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ． | Ｏ−グリコシル化カルボキシ末端部分（ｃｔｐ）ペプチド系のインスリンおよびインスリン類似体 |
| CN103254277B (zh) * | 2013-05-03 | 2017-02-08 | 南京工业大学 | 强分泌性信号肽增强小肽模序及其应用 |
| JP2016521701A (ja) | 2013-06-07 | 2016-07-25 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | 成熟インスリンポリペプチドを作製するための方法 |
| PL233560B1 (pl) | 2014-12-05 | 2019-10-31 | Mabion Spolka Akcyjna | Sposób otrzymywania insuliny lub analogu insuliny z prekursora rekombinowanego białka |
| EP3268384B1 (en) | 2015-03-10 | 2021-11-03 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Process for preparing recombinant insulin using microfiltration |
| US11208452B2 (en) | 2015-06-02 | 2021-12-28 | Novo Nordisk A/S | Insulins with polar recombinant extensions |
| US20180244743A1 (en) | 2015-08-25 | 2018-08-30 | Novo Nordisk A/S | Novel Insulin Derivatives and the Medical Uses Hereof |
| TW201717998A (zh) | 2015-08-25 | 2017-06-01 | 諾佛 儂迪克股份有限公司 | 新穎胰島素衍生物及其醫學用途 |
| US20190010206A1 (en) | 2015-08-25 | 2019-01-10 | Novo Nordisk A/S | Novel Insulin Derivatives and the Medical Uses Hereof |
| KR102043067B1 (ko) * | 2017-08-08 | 2019-11-11 | 엘지전자 주식회사 | 차량용 사이드 미러 및 차량 |
| MX2020001434A (es) | 2017-08-17 | 2020-03-20 | Novo Nordisk As | Analogos de insulina acilados novedosos y usos de estos. |
| BR112022009510A2 (pt) | 2019-12-11 | 2022-08-16 | Novo Nordisk As | Análogo de insulina, composição farmacêutica, e, método de tratamento, prevenção ou alívio de uma doença ou distúrbio ou condição |
| WO2023144240A1 (en) | 2022-01-26 | 2023-08-03 | Novo Nordisk Research Centre Oxford Limited | Glucose sensitive insulin derivatives and uses thereof |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU5712580A (en) * | 1979-04-05 | 1980-10-09 | James Joseph Connell | Engine charging and scavenging |
| US4546082A (en) * | 1982-06-17 | 1985-10-08 | Regents Of The Univ. Of California | E. coli/Saccharomyces cerevisiae plasmid cloning vector containing the alpha-factor gene for secretion and processing of hybrid proteins |
| JPS60501140A (ja) * | 1983-04-22 | 1985-07-25 | アムジエン | 酵母による外因性ポリペプチドの分泌 |
| US4588684A (en) * | 1983-04-26 | 1986-05-13 | Chiron Corporation | a-Factor and its processing signals |
| DK58285D0 (da) * | 1984-05-30 | 1985-02-08 | Novo Industri As | Peptider samt fremstilling og anvendelse deraf |
| EP0195680A3 (en) * | 1985-03-21 | 1987-06-10 | Immunex Corporation | The synthesis of protein with an identification peptide |
| JPS6236183A (ja) * | 1985-06-20 | 1987-02-17 | ザ・サルク・インステイチユ−ト・バイオテクノロジ−／インダストリアル・アソシエイツ・インコ−ポレ−テツド | サツカロミセス・セレビシエからのポリペプチドの発現および分泌 |
| MC1834A1 (fr) * | 1986-07-10 | 1988-06-03 | Transgene Sa | Bloc fonctionnel d'adn et plasmide codant pour l'hirudine,levure transformee,procede de preparation de l'hirudine,hirudine obtenue et son utilisation |
| US4987070A (en) * | 1987-03-04 | 1991-01-22 | Suntory Limited | Use of a 97 amino acid leader sequence from the E. coli B-galactosidase gene for the production of hanp and hptc as fusion proteins |
| WO1988010299A1 (en) * | 1987-06-24 | 1988-12-29 | Novo-Nordisk A/S | A process for preparing a protein or polypeptide, a dna sequence coding for the polypeptide, a microorganism containing the dna sequence as well as the polypeptide and its use as a pharmaceutical preparation |
| DK450187D0 (da) * | 1987-08-28 | 1987-08-28 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til fremstilling af proteiner |
| DK463887D0 (da) * | 1987-09-07 | 1987-09-07 | Novo Industri As | Gaerleader |
| JPH01240191A (ja) * | 1988-02-16 | 1989-09-25 | Green Cross Corp:The | 酵母で機能する新規シグナルペプチドおよびこれを用いた異種蛋白質の分泌発現 |
| DK336188D0 (da) * | 1988-06-20 | 1988-06-20 | Nordisk Gentofte | Propeptider |
| WO1990001063A1 (en) * | 1988-07-23 | 1990-02-08 | Delta Biotechnology Limited | New secretory leader sequences |
| DK105489D0 (da) * | 1989-03-03 | 1989-03-03 | Novo Nordisk As | Polypeptid |
-
1989
- 1989-03-03 DK DK105489A patent/DK105489D0/da not_active Application Discontinuation
-
1990
- 1990-02-27 ZA ZA901476A patent/ZA901476B/xx unknown
- 1990-03-01 WO PCT/DK1990/000058 patent/WO1990010075A1/en active IP Right Grant
- 1990-03-01 ES ES90904258T patent/ES2062514T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-01 CA CA002050336A patent/CA2050336C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-03-01 KR KR1019910701029A patent/KR970005928B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-03-01 HU HU902376A patent/HU215538B/hu not_active IP Right Cessation
- 1990-03-01 AU AU52612/90A patent/AU624694B2/en not_active Ceased
- 1990-03-01 DE DE69011853T patent/DE69011853T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-01 AT AT90904258T patent/ATE110414T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-03-01 NZ NZ232742A patent/NZ232742A/xx unknown
- 1990-03-01 DK DK90904258.2T patent/DK0461165T3/da active
- 1990-03-01 JP JP2504527A patent/JP2609367B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-01 EP EP90904258A patent/EP0461165B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-01 RU SU5010019/13A patent/RU2194758C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1990-03-01 UA UA5010019A patent/UA27706C2/uk unknown
- 1990-03-02 DD DD90338353A patent/DD296965A5/de unknown
- 1990-03-02 CZ CS901039A patent/CZ285239B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1990-03-02 IE IE74990A patent/IE66469B1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-03-02 IL IL9360990A patent/IL93609A/en not_active IP Right Cessation
- 1990-03-02 PL PL90284146A patent/PL163532B1/pl not_active IP Right Cessation
-
1991
- 1991-09-02 NO NO913427A patent/NO304236B1/no unknown
- 1991-09-02 FI FI914125A patent/FI104985B/fi not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-02-15 US US08/196,887 patent/US5395922A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-03-02 US US08/397,595 patent/US5510249A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-02 US US08/397,597 patent/US5514585A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-29 HU HU95P/P00592P patent/HU211600A9/hu unknown
-
1997
- 1997-10-23 NO NO974899A patent/NO974899L/no unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU211600A9 (en) | Yeast expressing system | |
| JP3730255B2 (ja) | イーストにおいて発現されたｎ末端に伸長した蛋白質 | |
| US5162498A (en) | Synthetic yeast leader peptides | |
| RU2143495C1 (ru) | Способ получения гетерологичного белка | |
| US5639642A (en) | Synthetic leader peptide sequences | |
| US6500645B1 (en) | N-terminally extended proteins expressed in yeast | |
| EP0195691A1 (en) | Process for the preparation of Insulin Precursors and process for the preparation of human insulin | |
| JP2001527387A (ja) | 合成リーダーペプチド配列 | |
| EP0946735B1 (en) | N-terminally extended proteins expressed in yeast | |
| EP0868523B1 (en) | Vector for expression of n-terminally extended proteins in yeast cell |