DD296965A5 - Hefeverarbeitungssystem - Google Patents
Hefeverarbeitungssystem Download PDFInfo
- Publication number
- DD296965A5 DD296965A5 DD90338353A DD33835390A DD296965A5 DD 296965 A5 DD296965 A5 DD 296965A5 DD 90338353 A DD90338353 A DD 90338353A DD 33835390 A DD33835390 A DD 33835390A DD 296965 A5 DD296965 A5 DD 296965A5
- Authority
- DD
- German Democratic Republic
- Prior art keywords
- glu
- leu
- polypeptide
- asp
- amino acids
- Prior art date
Links
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 118
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 114
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 107
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 100
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 97
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 91
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 91
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 66
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 claims abstract description 62
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 claims abstract description 61
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 48
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims abstract description 41
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 31
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims abstract description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 14
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 22
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 12
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 10
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims description 4
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 4
- UZGFHWIJWPUPOH-IHRRRGAJSA-N Arg-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N UZGFHWIJWPUPOH-IHRRRGAJSA-N 0.000 claims description 3
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 claims description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 3
- PXXLQQDIFVPNMP-UHFFFAOYSA-N 3-(diethylcarbamoyl)benzoic acid Chemical compound CCN(CC)C(=O)C1=CC=CC(C(O)=O)=C1 PXXLQQDIFVPNMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 claims description 2
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 claims description 2
- 101150071434 BAR1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 claims description 2
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 claims description 2
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims description 2
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims description 2
- 108010071289 Factor XIII Proteins 0.000 claims description 2
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 claims description 2
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 claims description 2
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims description 2
- 101100378536 Ovis aries ADRB1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 claims description 2
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 claims description 2
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 claims description 2
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 claims description 2
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 claims description 2
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 claims description 2
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 claims description 2
- 229940012444 factor xiii Drugs 0.000 claims description 2
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 claims description 2
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 claims description 2
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 claims description 2
- PCTMTFRHKVHKIS-BMFZQQSSSA-N (1s,3r,4e,6e,8e,10e,12e,14e,16e,18s,19r,20r,21s,25r,27r,30r,31r,33s,35r,37s,38r)-3-[(2r,3s,4s,5s,6r)-4-amino-3,5-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-19,25,27,30,31,33,35,37-octahydroxy-18,20,21-trimethyl-23-oxo-22,39-dioxabicyclo[33.3.1]nonatriaconta-4,6,8,10 Chemical compound C1C=C2C[C@@H](OS(O)(=O)=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2.O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 PCTMTFRHKVHKIS-BMFZQQSSSA-N 0.000 claims 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims 1
- 108010071185 leucyl-alanine Proteins 0.000 claims 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 claims 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 abstract description 7
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 77
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 75
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 70
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 49
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 44
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 16
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 16
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 12
- 101150033985 TPI gene Proteins 0.000 description 12
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 10
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 7
- 102100033598 Triosephosphate isomerase Human genes 0.000 description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 4
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 3
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 101150045458 KEX2 gene Proteins 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 2
- LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N ac1ldcw0 Chemical compound Cl.C1CN(C)CCN1C1=C(F)C=C2C(=O)C(C(O)=O)=CN3CCSC1=C32 LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000007261 sc medium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SBKVPJHMSUXZTA-MEJXFZFPSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-5-amino-2-[[2-[[(2S)-1-[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]amino]-5-oxopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 SBKVPJHMSUXZTA-MEJXFZFPSA-N 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dithiothreitol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FJVAQLJNTSUQPY-CIUDSAMLSA-N Ala-Ala-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN FJVAQLJNTSUQPY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- BEMGNWZECGIJOI-WDSKDSINSA-N Ala-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BEMGNWZECGIJOI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- YHBDGLZYNIARKJ-GUBZILKMSA-N Ala-Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](C)N YHBDGLZYNIARKJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N Arginine Chemical compound OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWOGMPWRQQWPPF-GUBZILKMSA-N Asp-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O DWOGMPWRQQWPPF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 101100228206 Caenorhabditis elegans gly-6 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 101500025354 Homo sapiens Insulin B chain Proteins 0.000 description 1
- 102100027612 Kallikrein-11 Human genes 0.000 description 1
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 101150118523 LYS4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000235087 Lachancea kluyveri Species 0.000 description 1
- NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 101150012394 PHO5 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000582914 Saccharomyces uvarum Species 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 1
- 101710152431 Trypsin-like protease Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007675 cardiac surgery Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N diazepam Chemical compound N=1CC(=O)N(C)C2=CC=C(Cl)C=C2C=1C1=CC=CC=C1 AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000000988 hyperfibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- -1 insulin precursors) Chemical compound 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 235000019988 mead Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- DJDSLBVSSOQSLW-UHFFFAOYSA-N mono(2-ethylhexyl) phthalate Chemical group CCCCC(CC)COC(=O)C1=CC=CC=C1C(O)=O DJDSLBVSSOQSLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- VBEGHXKAFSLLGE-UHFFFAOYSA-N n-phenylnitramide Chemical compound [O-][N+](=O)NC1=CC=CC=C1 VBEGHXKAFSLLGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- JTJMJGYZQZDUJJ-UHFFFAOYSA-N phencyclidine Chemical compound C1CCCCN1C1(C=2C=CC=CC=2)CCCCC1 JTJMJGYZQZDUJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229940057838 polyethylene glycol 4000 Drugs 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000004739 secretory vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
- C07K14/8117—Bovine/basic pancreatic trypsin inhibitor (BPTI, aprotinin)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/033—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a motif for targeting to the internal surface of the plasma membrane, e.g. containing a myristoylation motif
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/04—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing an ER retention signal such as a C-terminal HDEL motif
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Mycology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Botany (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
- Processing Of Solid Wastes (AREA)
- Silver Salt Photography Or Processing Solution Therefor (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Thermotherapy And Cooling Therapy Devices (AREA)
Abstract
Ein Polypeptid fuer die Produktion in Hefe besteht aus einer Verschmelzung von Signalpeptid, Fuehrungspeptid und heterologem Protein oder Polypeptid. Das Polypeptid wird in der Aminosaeurenfolge im Anschlusz an eine Hefeverarbeitungsstelle modifiziert, die sich zwischen dem C-Terminalende des Fuehrungspeptids und dem N-Terminalende des heterologen Proteins befindet, um so eine Darbietung der Verarbeitungsstelle zu schaffen, die sie zum proteolytischen Schneiden zugaenglich macht. Das geschieht durch Hinzufuegen von einer oder mehreren Aminosaeuren (von denen wenigstens eine negativ geladen ist) entweder am C-Terminalende des Fuehrungspeptids oder am N-Terminalende des Proteins oder an beiden. Das heterologe Protein kann beispielsweise Aprotinin oder ein Insulinvorlaeufer oder deren Analog sein.{Polypeptid; Produktion in Hefe; modifizierte Hefeverarbeitungsstelle; proteolytisches Schneiden; negativ geladene Aminosaeure}
Description
Hierzu 18 Seiten Zeichnungen
Anwendungsgebiet der Erfindung
Vorliegende Erfindung bezieht sich auf Polypeptide, die in Hefe expressiert und verarbeitet werden, ein DNA-Gebilde, welches eine DNA-Folge mit einer Codierung dieser Polypeptide enthält. Vektoren, welche diese DNA-Fragmente tragen, und Hefezellen, welche mit den Vektoren transformiert sind, sowie ein Verfahren zur Herstellung von heterologen Proteinen in Hefe.
Ausgangssituation der Erfindung
Hefeorganismen produzieren eine Reihe von Proteinen, welche intrazellular produziert werden, aber eine Funktion außerhalb der Zelle haben. Diese extrazellularen Proteine werden als sekretierte Proteine bezeichnet. Diese sekretierten Proteine werden zunächst innerhalb der Zelle in einem Vorläufer oder einer Protein-Vorform expressiert, die eine Vorsequenz enthalten, welche die wirksame Steuerung des expressierten Produktes durch die Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) gewährleistet. Die Vorsequenz, die normalerweise als Signalpeptid bezeichnet wird, wird im allgemeinen während der Translozierung von dem gewünschten Produkt abgeschnitten. Sobald das Protein in die sekretorische Bahn gelangt ist, wird es zum Golgi-Apparattransportiert. Vom Golgi-Apparat aus kann das Protein verschiedenen Routen folgen, die zu Abteilen führen, wie der Zellvakuole oder der Zellmembran, oder es kann aus der Zelle herausgeführt werden, um in das äußere Medium sekretiert zu werden (Pfeffer, S. R. und Rothman, J. E„ Ann. Rev. Biochem. 56 [1987], 829-852). Verschiedene Verfahren für die Expression und Sekretion von Proteinen, die heterolog zu Hefe sind, in Hefe wurden vorgeschlagen. Die veröffentlichte europäische PA Nr. 0088632 A beschreibt einen Prozeß, bei dem Proteine, die heterolog zu Hefe sind, expressiert, verarbeitet und sekretiert werden durch Transformation eines Hefeorganismus mit einem Expressionsvehikel, welche eine DNA aufgenommen hat, das das gewünschte Protein codiert, und ein Signalpeptid, durch Herstellung einer Kultur des transformierten Organismus, Züchten der Kultur und Gewinnung des Proteins aus dem Kulturmedium. Das Signalpeptid kann das eigene Signalpeptid der gewünschten Proteine, ein heterologes Signalpeptid oder ein Hybrid aus natürlichem und heterologen Signalpeptid sein.
Ein Problem, das bei der Verwendung von Signal peptiden auftreten kann, die heterolog zu Hefe sind, könnte darin bestehen, daß das heterologe Signalpeptid keine effiziente Translozierung und/oder Schneidung hinter dem Signalpeptid gewährleistet. S. cerevisiae MFQ1 (α-Faktor) wird als Präroform von 165 Aminosäuren synthetisiert, die ein 19 Aminosäuren langes Signal- oder Vorpeptid aufweist, gefolgt von einem 64 Aminosäuren langen „Führungs-" oder Vorpeptid, das drei N-gelinkte Glykosylationsstellen einschließt, gefolgt von (LysArg[Asp/Glu, Ala]2-3a-Faktor)4 (Kurjan, J. und Herskowitz, I., Cell 30 [1982], 933-943). Der Signalführungsteil von PräproMFI wurde verbreitet eingesetzt, um die Synthese und Sekretion von heterologen Proteinen in S. cerevisiae zu erreichen.
Der Einsatz von Signal-/Führungspeptiden, die homolog zu Hefe sind, ist aus der US-PS 4546 082, den veröffentlichten europäischen PA Nr. 0116201 A, 0123294A, 0123544A, 0163529A und 0123289A und den dänischen PS 2484/84 und 3614/83 bekannt.
In EP 0123289 A wird die Verwendung des S. cerevisiae-a-Faktor-Vorläufers beschrieben, während DK-PS 2484/84 die Verwendung des Invertase-Signalpeptids von Saccharomyces cerevisiae und DK-PS 3614/83 die Verwendung des PHO 5-Signalpeptids von Saccharomyces cerevisiae für die Sekretion von Fremdproteinen beschreiben. US-PS 4 546082, EP 0016201A, 0123294 A, 0123544 A und 0163529 A beschreiben Verfahren, bei denen der aFaktor-Signalführer von Saccharomyces serevisiae(MFa1 oder MFa2) genutzt wird im Sekretionprozeß der expressierten heterologen Proteine in Hefe. Durch Verschmelzen der DNA-Folge, welche die S.cerevisiae-MFa1 )-Signal-/Führungsfolge am 5'-Ende des Gens für das gewünschte Protein codiert, wurde die Sekretion und Verarbeitung des gewünschten Proteins demonstriert.
EP 206783 legt ein System für die Sekretion von Polypeptiden von S.cerevisiae offen, bei welchem die a-Faktorführungsfolge verkürzt wurde, um die vier a-Faktorpeptide auszuschalten, die an der natürlichen Führungsfolge vorhanden sind, um so das Führungspeptid selbst zu belassen, das über die a-Faktorverarbeitungsstelle LysArgGluAlaGluAla an ein heterologes Polypeptid verschmolzen wird. Es wird angegeben, daß diese Konstruktion zu einem effizienten Verfahren für kleinere Peptide führt, weniger als 50 Aminosäuren. Für die Sekretion und Verarbeitung von größeren Polypeptiden wurde die natürliche a-Faktorführungsfolge verkürzt, um ein oder zwei a-Faktorpolylpeptide zwischen dem Führungspeptid und dem Polypeptid zu belassen.
Eine Reihe von sekretierten Proteinen wird so geführt, daß sie einem proteolytischen Verarbeitungssystem ausgesetzt sind, welches das Peptid schneiden kann, welches an das Karboxyende von zwei aufeinanderfolgenden basischen Aminosäuren gebunden ist. Diese enzymatische Aktivität wird bei S.cerevisiae durch das Gen KEX2 codiert (Julius, D.A. u.a.. Cell 37 [1984b], 1075). Die Verarbeitung des Produktes durch das Genprodukt KEX2 ist für die Sekretion des aktiven S. cerevisiae-Paaru ngsfaktors α 1 (MFa 1 oder α-Faktor) erforderlich, ist aber nicht an der Sekretion des aktiven S. cerevisiae-Paarungsfaktors a beteiligt.
Die Sekretion und korrekte Verarbeitung eines Polypeptide, das sekretiert werden soll, erreicht man in einigen Fällen, wenn ein Hefeorganismus gezüchtet wird, der mit einem Vektor transformiert wird, der so aufgebaut wird, wie das in der oben genannten Folge von Referenzen ausgeführt wird. In vielen Fällen ist jedoch der Sekretionspegel sehr gering oder es erfolgt keine Sekretion oder die proteolytische Verarbeitung kann unkorrekt oder unvollständig sein. Die Autoren der vorliegenden Erfindung nehmen an, daß die bis zu einem gewissen Maße auf eine unzureichende Exponierung der zwischen dem C-Terminalendedes Führungspeptids und dem N-Terminalende des heterologen Proteins vorhandenen Verarbeitungsstelle zurückzuführen ist, so daß diese für das proteolytische Schneiden unzugänglich oder zumindest weniger zugänglich ist.
Summarische Beschreibung der Erfindung
Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß es durch bestimmte Modifikationen in der Nähe der Verarbeitungsstelle am C-Terminalende des Führungspeptids und/oder am N-Terminalende eines mit dem Führungspeptid verschmolzenen heterologen Polypeptides möglich ist, einen höheren Ertrag des korrekt verarbeiteten Proteins zu erhalten, als mit unmodifizierten Führungspeptid-Heterologpolypeptid-Konstruktionen erreicht werden kann.
Demzufolge bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Polypeptid, das aus einer Verschmelzung eines Signalpeptids, eines Führungspeptids und eines heterologen Proteins oder Polypeptids besteht, wobei dieses Polypeptid in der Aminosäurefolge nahe der Hefeverarbeitungsstelle modifiziert ist, die sich zwischen dem C-Terminalende des Führungspeptids und dem N-Terminalende des heterologen Proteins befindet, so daß die Verarbeitungsstelle präsentiert und für die proteolytische Schneidung zugänglich gemacht wird, wobei das Polypeptid folgende Struktur hat:
Signalpeptid-Führungspeptid-X1-X2-X3-X4-heterologes Protein, worin X1 ein gebundenes Peptid ist oder eine oder mehrere Aminosäuren darstellt, die gleich oder verschieden sein können, X2 und X3 gleich oder verschieden sind und eine basische Aminosäure darstellen, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Lys und Arg gebildet wird, wobei X2 und X3 zusammen eine Hefeverarbeitungsstelle bilden, und X4 ein gebundenes Peptid ist oder eine oder mehrere Aminosäuren darstellt, die gleich oder verschieden sein können, unter der Voraussetzung, daß X1 und/oder X4 eine oder mehrere Aminosäuren darstellen und daß wenigstens eine der Aminosäuren, die durch X'und/oder X4 dargestellt wird, eine negativ geladene Aminosäure ist, die aus der aus GIu und Asp bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Im vorliegenden Zusammenhang versteht man unter dem Begriff „Signalpeptid" eine Präsequenz oder Vorfolge, die vorwiegend hydrophob im Charakter und als eine N-Terminalsequenz an der Vorläuferform eines extrazellularen Proteins vorhanden ist, das in Hefe expressiert wird. Die Funktion des Signalpeptids ist es, das Eintreten des zu sekretierenden heterologen Proteins in das endoplasmatische Retikulum zu ermöglichen. Das Signalpeptid wird normalerweise im Verlauf dieses Prozesses abgeschnitten. Das Signalpeptid kann heterolog oder homolog zu dem Hefeorganismus sein, welches das Protein erzeugt, aber, wie oben ausgeführt wird, eine effizientere Schneidung des Signalpeptids erreicht man, wenn es zum fraglichen Hefeorganismus homolog ist.
Unter dem Begriff „Führungspeptid" versteht man ein vorwiegend hydrophiles Peptid, dessen Funktion es ist, die Steuerung des zu sekretierenden heterologen Proteins aus dem endoplasmatischen Retikulum zum Golgi-Apparat und weiter zu einem sekretorischen Bläschen zur Sekretion in das Medium zu ermöglichen (d.h., Hinausführung des expressierten Proteins oder Polypeptids durch die Zellwand oder wenigstens durch die Zellmembran in den periplasmatischen Raum der Zelle). Mit dem Ausdruck „heterologes Protein oder Polypeptid" bezeichnet man ein Protein oder Polypeptid, das in der Natur durch den Hefewirtsorganismus nicht produziert wird. Die Begriffe „Protein" und Polypeptid" werden im wesentlichen untereinander austauschbar in der nachfolgenden Beschreibung verwendet.
Die Modifikation des Polypeptids an der Verarbeitungsstelle (der Stelle, an welcher das Führungspeptid durch proteolytische Spaltung, die durch proteolytische Hefeenzyme vermittelt wird, aus dem heterologen Protein entfernt wird), welche durch X1 und/oder X4 dargestellt wird, kann die Form einer Erweiterung, Substitution oder Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren am C-Terminalende des Führungspeptids und/oder am N-Terminalende des heterologen Proteins haben. Entsprechend der Erfindung wurde überraschend festgestellt, daß eine effizientere und korrektere Verarbeitung des heterologen Proteins erreicht werden kann, wenn wenigstens eine der Aminosäuren, mit denen die Sequenz des Polypeptids erweitert wurde oder durch die eine oder mehrere der natürlichen Aminosäuren in der Folge substituiert wurden, eine negativ geladene Aminosäure, wie die oben angegebenen, ist. Eine ähnliche Wirkung kann man beobachten, wenn eine negativ geladene Aminosäure in der Nähe der Verarbeitungsstelle durch Deletion geschaffen wird, d. h., durch Deletieren einer oder mehrerer Aminosäuren vom C-Terminalende des Führungspeptids oder vom N-Terminalende der Proteinfolge, bis eine negativ geladene Aminosäure neben der Verarbeitungsstelle vorhanden ist.
Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, wird angenommen, daß diese Wirkung der erhöhten Hydrophilizität zuzuschreiben ist, die durch die negativ geladenen Aminosäuren neben der Verarbeitungsstelle auferlegt wird, die zu einer verstärkten Exponierung der tertiären Struktur des Polypeptids an der Verarbeitungsstelle ist der wäßrigen intrazellularen Umgebung führt und diese damit zugänglicher für das proteolytische Schneiden durch das Verarbeitungsenzym macht. Die
vorteilhafte Wirkung von negativ geladenen Aminosäuren gegenüber neutralen oder positiv geladenen Aminosäuren kann den negativ geladenen Nebenketten dieser Aminosäuren zugeschrieben werden, die zur Hydrophilizität der tertiären Struktur an der Verarbeitungsstelle beitragen, ohne zu einer potentiellen Unterbindung des Verarbeitungsenzyms zu führen.
Möglich ist es auch, daß negativ geladene Aminosäuren zur Schaffung und Erhaltung einer tertiären Struktur an der Verarbeitungsstelle beitragen (z. B. Windungen, Haarnadel- und Schleifenstrukturen), wobei andere Formen wie die Wechselwirkung mit anderen Aminosäureresten im Polypeptid Anwendung finden. Außerdem könnte auch eine direkte Wechselwirkung zwischen negativ geladenen Aminosäuren und dem Verarbeitsenzym erfolgen. Es wird daher angenommen, daß negativ geladene Aminosäuren, die sich angrenzend zu den beiden basischen Aminosäuren der Verarbeitungsstelle befinden, das Verarbeitungsenzym steuern, um ein korrektes und effizientes Schneiden durch Ladungswechselwirkungen zwischen Proteinen und/oder zwischen Protein und Lösungsmittel auszuführen.
Nach einem anderen Gesichtspunkt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein DNA-Gebilde, das eine DNA-Folge enthält, welche das oben definierte Polypeptid codiert.
Nach einem weiteren Gesichtspunkt bezieht sich die Erfindung auf einen rekombinanten Expressionsvektor, der in der Lage ist, Hefe zu replizieren, und der ein DNA-Gebilde trägt, welches das oben definierte Polypeptid codiert, wie auch auf einen Hefestamm, der das heterologe Protein oder Polypeptid expressieren kann und mit diesem Vektor transformiert wird.
Nach noch einem anderen Gesichtspunkt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines heterologen Proteins oder Polypeptides in Hefe, welches darin besteht, den transformierten Hefestamm in einem geeigneten Medium zu kultivieren, um die Expression und Sekretion des heterologen Proteins oder Polypeptide zu erreichen, worauf das Protein oder Polypeptid aus dem Medium isoliert wird.
In Übereinstimmung mit der oben gegebenen Erklärung ist X1, wenn es eine einzelne Aminosäure darstellt, gleich GIu oder Asp.
X1 und/oder X4 stellen vorteilhaft 1 bis 6 Aminosäuren dar.
Wenn X1 eine Folge von zwei Aminosäuren darstellt, kann es die Struktur BA haben, wobei A gleich GIu oder Asp ist und B gleich GIu, Asp, VaI, GIy oder Leu ist, beispielsweise LeuGlu.
Wenn X1 eine Folge von drei Aminosäuren darstellt, kann es die Struktur CBA haben, wobei A und B wie oben definiert sind und C gleich GIu, Asp, Pro, GIy, VaI, Leu, Arg oder Lys ist, beispielsweise AspLeuGlu.
Wenn X1 eine Folge von mehr als zwei Aminosäuren darstellt, kann eine der zusätzlichen Aminosäuren vorteilhaft Pro oder GIy sein, da es bekannt ist, daß diese Aminosäuren Haarnadel- oder Schleifenstrukturen einführen und/oder Teil dieser Elemente sind, die wahrscheinlich die Zugänglichkeit der Verarbeitungsstelle für das proteolytische Enzym erleichtern.
Wenn X1 eine Folge von vier Aminosäuren darstellt, kann es die Struktur DCBA haben, wobei A, B und C wie oben definiert sind und D die gleiche Bedeutung wie C hat, beispielsweise GluArgLeuGlu, LysGluLeuGlu oder LeuAspLeuGlu.
Wenn X1 eine Folge von fünf Aminosäuren darstellt, kann es die Struktur EDCBA haben, wobei A, B, C und D wie oben definiert sind und E die gleiche Bedeutung wie C hat, beispielsweise LeuGluArgLeuGlu.
Wenn X1 eine Folge von sechs Aminosäuren darstellt, kann es die Struktur FEDCBA haben, wobei A, B, C, D und E wie oben definiert sind und F die gleiche Bedeutung wie C hat, beispielsweise ValLeuGluArgLeuGlu.
Es ist selbstverständlich, daß andere Kombinationen von Aminosäuren möglich sind in der Bedeutung von X1, ohne daß das eine Abweichung vom Rahmen der Erfindung darstellt, vorausgesetzt, daß wenigstens eine der Aminosäuren in der Folge eine negativ geladene Aminosäure ist, wie oben erklärt wurde.
Geeignete Bedeutungen für X4 können die für X1 gegebenen sein, obwohl die Reihenfolge der Aminosäuren im typischen Fall umgekehrt ist (d.h., ABC, statt CBA usw.).
In Ausführungsbeispielen des Polypeptids nach der Erfindung, bei denen das heterologe Protein eingeleitet wird durch eine oder mehrere positiv geladene oder hydrophobe Aminosäuren, stellt X4 vorteilhaft eine oder mehrere Aminosäuren, statt einer Peptidbindung, dar, da angenommen wird, daß die eine größere Zugänglichkeit der Verarbeitungsstelle für proteolytische Enzyme darstellt.
In Fällen, in denen X4 eine N-Terminalerweiterung mit 1 bis 6 Aminosäuren darstellt, kann es angemessen sein, eine zusätzliche Verarbeitungsstelle zwischen der Aminosäure oder den Aminosäuren vorzusehen, die durch X4 dargestellt werden, und dem N-Terminalende des heterologen Proteins. Das ist besonders wichtig, wenn das Protein für Zwecke genutzt werden soll, die das Vorhandensein eines Proteins ohne N-Terminalerweiterung verlangen. Die zusätzlichen N-Terminalaminosäuren können in vitro durch proteolytisches Schneiden mit einem geeigneten proteolytischen Enzym, beispielsweise einer trypsinartigen Protease, oder durch Behandlung mit einer Chemikalie, wie Zyanogenbromid, entfernt werden. Möglich ist es auch, das Schneiden an der zusätzlichen Verarbeitungsstelle durch den Hefewirtsorganismus vornehmen zu lassen, wobei eine Verarbeitungsstelle ausgewählt wird, die für ein anderes proteolytisches Hefeenzym spezifisch ist.
Für einige Zwecke aber kann es vorteilhaft sein, die N-Terminalerweiterung so aufzubauen, daß sie einem bestimmten Zweck angepaßt ist. So kann die Erweiterung als Marker für den Nachweis des Proteins, als Säure zum Reinigen des Proteins oder als Mittel zur Steuerung der Wirkung eines Pharmazeutikums in vivo, z. B. zur Verlängerung der Halbwertszeit eines Medikamentes oder zur Steuerung zu einer bestimmten Stelle im Körper, dienen.
Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel des Polypeptids nach der vorliegenden Erfindung stellen X1 und/oder X4 eine Aminosäurefolge mit 1 bis Aminosäuren dar. Bei diesem Ausführungsbeispiel ist die Aminosäure, die sich unmittelbar an X3 anschließt, vorzugsweise GIu oder Asp oder beide sind GIu oder Asp, da das eine vorteilhafte Darstellung der Verarbeitungsstelle auf Grund des hydrophilen Charakters dieser Aminosäuren bildet, wie oben ausführlicher erklärt wurde. Die Aminosäurenfolge, die durch X' oder X4 dargestellt wird, kann zweckmäßigerweise mehr als ein GJu oder Asp aufweisen.
Bei einem anderen interessanten Ausführungsbeispiel des Polypeptids nach der vorliegenden Erfindung stellen X1 und X4 beide eine oder mehrere Aminosäuren dar, mit anderen Worten, das Polypeptid ist sowohl am C-Terminalende des Führungspeptids als auch am N-Terminalende des heterologen Proteins modifiziert. Bei diesem Ausführungsbeispiel können X1 und X4 symmetrisch identisch sein, d. h., die durch X1 und X4 dargestellte(n) Aminosäure(n) sind die gleichen und gehen von X2 bzw. X3
Die Signalpeptidsequenz des Polypeptids nach der Erfindung kann jedes Signalpeptid sein, das eine wirksame Lenkung des expressierten Polypeptids in die sekretorische Bahn der Zelle gewährleistet Das Signalpeptid kann ein natürlich vorkommendes Signalpeptid oder funktioneile Teile davon sein, oder es kann ein synthetisches Peptid sein Es wurde festgestellt, daß geeignete Signalpeptide des a-Faktorsignalpeptid, das Signalpeptid der Speichelamylase der Maus, ein modifiziertes Karboxypeptidasesignalpeptid oder das Hefe-BAR1-Signalpeptid sein Das Speichelamylasesignalpeptid der Maus wird von O Hagenbuchle u a , Nature 289,1981, S 643-646, beschrieben Die Karboxypeptidasesignalsequenz wird durch L A VaIIs u a, Cell 48 1987, S 887-897, beschrieben Das BAR 1-Signalpeptid wird in WO 87/02670 offengelegt Die Fuhrungspeptidsequenz des Polypeptids nach der Erfindung kann jedes Fuhrungspeptid sein das funktionell bei der Steuerung des expressierten Polypeptids in das endoplasmatische Retikulum und weiter längs der sekretorischen Bahn wirkt Mögliche Fuhrungssequenzen, die fur diesen Zweck geeignet sind, sind natürliche Fuhrungspeptide die von Hefe oder anderen Organismen abgeleitet wurden, beispielsweise der a-Faktorfuhrer oder dessen funktionelles Analog Das Fuhrungspeptid kann auch ein synthetisches Fuhrungspeptid sein, ζ B einer der synthetischen Fuhrer, die in der internationalen Patentanmeldung, Publikation Nr WO 89/02463, offengelegt werden, mit den folgenden Aminosaurefolgen A Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu Glu-Ser-Leu-Ile-Gly-Phe-Leu-Asp-Leu AIa-GIy-GIu GIu-IIe-AIa-GIu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala
B Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala C Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala D Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp Glu-Ser-Ser-Val GIu-lle-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-lle-lle-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr Leu-Ala-Asn-Val-Ala-Met-
AIa und E Gln-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala-Asn-Val-Ala-Met-Ala oder ein Derivat davon
Das heterologe Protein, das nach der Methode der Erfindung produziert wird, kann jedes Protein sein, das vorteilhaft in Hefe produziert wird Beispiele fur solche Proteine sind Aprotinin oder andere Proteaseunterdrucker, Insulin (einschließlich der Insulinvorlaufer), menschliches oder Rinderwachstumshormon, Interleukin, Glukagon, Gewebeplasminogenaktivator, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor XIII, der plattchenabgeleitete Wachstumsfaktor, Enzyme usw oder deren funktionelles Analog Im vorliegenden Zusammenhang versteht man unter dem Begriff „funktionelles Analog" ein Polypeptid mit einer ähnlichen Funktion wie das natürliche Protein (was sich auf die Natur, den Charakter beziehen soll, nicht auf den Pegel der biologischen Aktivität des naturlichen Proteins) Das Polypeptid kann dem naturlichen Protein strukturell ähnlich sein und kann vom natürlichen Protein durch den Zusatz von einer oder mehreren Aminosäuren zu einem der beiden oder zu beiden, dem C- und dem N-Terminalende des natürlichen Proteins, Substitution eines oder mehrerer Aminosäuren an einer oder an einer Reihe von verschiedenen Stellen in der natürlichen Aminosaurefolge, Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren an einem der beiden oder an beiden Enden des naturlichen Proteins oder an einer oder mehreren Stellen in der Aminosaurefolge oder durch Einfügung einer oder mehrerer Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen in der natürlichen Aminosaurefolge abgeleitet werden Solche Modifikationen sind fur mehrere der oben genannten Proteine bekannt Nach der Erfindung wurde überraschenderweise festgestellt, daß Modifikationen am C-Terminalende des Fuhrungspeptids oder am N-Terminalende des heterologen Proteins, wie sie oben beschrieben wurden, die Produktion von korrekt verarbeitetem Aprotinin (oder dessen funktionellen Analogs, wie es oben definiert wurde) in hohen Ertragen ermöglichen Aprotinin ist ein proteaseunterdruckendes Protein, dessen Eigenschaften es fur eine Reihe von medizinischen Zwec<en geeignet machen (ζ Β bei der Behandlung von Pankreatis, dem septischen Schocksyndrom, hyperfibrinolytische Hamorrhag und dem Myokardinfarkt) Die Verabreichung von Aprotinin in hohen Dosen verringert den Blutverlust in Verbindung mit Herzoperationen oder anderen großen chirurgischen Eingriffen erheblich Aprotinin ist auch als Zusatz zu Kulturmedien geeignet, aa es die Proteasen der Wirtszelle unterbindet, die andernfalls zum unerwünschten proteolytischen Schneiden der expressierten Proteine fuhren konnten Bei der Verwendung der bekannten natürlichen Fuhrungsfolgen, beispielsweise dem a-FaKtorfuhrer, traten Schwierigkeiten damit auf, hohe Ertrage an korrekt verarbeitetem Aprotinin in Hefe zu erhalten Natürliches, ursprüngliches Aprotinin wird am N-Terminal durch eine basische Aminosäure (Arg) eingeleitet, und aus diesem Grunde kann die vorausgehende Vera rbeitungsstelle fur das proteolytische Schneiden (wie das oben erklart wurde) weniger geeignet sein, wenn eines der bekannten Fuhrungspeptide (z B der a-Faktorfuhrer) eingesetzt wird, ohne nach der vorliegenden Erfindung modifiziert zu sein, was zu geringen Ertragen an korrekt verarbeitetem Aprotinin fuhrt, wenn überhaupt Ertrage erzielt werden Nach der vorliegenden Erfindung wurden besonders gute Ergebnisse hinsichtlich der Produktion von Aprotinin erzielt, wenn X1 G luArgLeuGlu darstellt oder wenn X4GIuLeU oder GluLeuAspLeu darstellt (siehe die folgenden Beispiele), obwohl erwartet wird, daß auch mit anderen Bedeutungen von X1 und X4 vorteilhafte Ertrage an Aprotinin erzielt werden vorausgesetzt, daß wenigstens eine Aminosäure und am besten die der Verarbeitungsstelle am nächsten hegende eine negativ geladene Aminosäure ist, wie das oben erklart wurde
Nach der Erfindung wurde außerdem festgestellt, daß Modifikationen am C-Terminalende des Fuhrungspeptids oder am N-Terminalendedes heterologen Proteins, wie sie oben beschrieben wurden, auch die Produktion ces korrekt verarbeiteten Insulinvorlaufers (oder dessen funktionellen Analogs, wie das oben definiert wurde) in hohen Ertragen ermöglichen Bei diesem Ausfuhrungsbeispiel der Erfindung kann X1 Glu-Arg-Leu-Glu oder Lys-Glu-Leu-Glu darstellen, wobei X4 dann üblicherweise eine Peptidbindung ist Als Alternative dazu kann X4 GIu sein, in diesem Fall stellt X1 üblicherweise eine Peptidbindung dar Vorteilhafte Ergebnisse wurden insbesondere nach der Erfindung hinsichtlich der Expression des Insulin-Analogvorlaufers B(1-29)-AlaAlaLys-A(1-29) erzielt, wenn X1 LysGluLeuGlu darstellt oder wenn X4 eine Substitution von Phe als der ersten Aminosäure des Insulinvorlaufers durch GIu darstellt (siehe die folgenden Beispiele) Angemessene Ergebnisse beim Insulm-Analogvorlaufer B(1-29)-SerAspAspAlaLys-A(1-29) wurden auch erzielt, wenn X1 Lys-Glu-Leu-Glu darstellt Außerdem wird erwartet, daßmanhohe Ertrage des Insulinvorlaufers erzielt, wenn X1 und X4 eine andere Bedeutung haben, vorausgesetzt, daß wenigstens eine Aminosäure, und vorzugsweise die der Verarbeitungsstelle am nächsten gelegene eine negativ geladene Aminosäure ist, wie das oben erklart wurde
Das DNA-Gebilde nach der Erfindung, welches das Polypeptid nach der Erfindung codiert, kann synthetisch nach bekannten Standardmethoden hergestellt werden, ζ B durch die Phosphoamiditmethode, die von S L BeaucageundM H Caruthers,
Tetrahedron Letters 22,1981, S. 1859-1869, beschrieben wird, oder durch die von Matthes u.a., EMBO Journal 3,1984, S.801-805, beschriebene Methode. Nach der Phosphoamiditmethode werden Oligonukleotide synthetisiert, z.B. in einem automatischen DNA-Synthesegerät, gereinigt, dupliziert und ligiert, um das synthetische DNA-Gebilde zu bilden. Das DNA-Gebilde nach der Erfindung kann auch genomischen odercDNA-Ursprungs sein, kann beispielsweise gewonnen werden durch Herstellung einer genomischen oder cDNA-Bibliothek und Screenieren nach DNA-Folgen, welche das gesamte oder einen Teil des Polypeptids nach der Erfindung codieren durch Hybridisierung unter Anwendung von synthetischen Oligonukleotidsonden nach Standardmethoden (siehe T.Maniatis u.a.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulares Klonieren. Ein Laborhandbuch), Cold Spring Harbor, 1982). In diesem Fall kann eine genomische oder cDNA-Folge, welche ein Signal- und Führungspeptid codiert, an eine genomische oder cDNA-Folge gebunden werden, die das'heterologe Protein codiert, worauf die DNA-Folge an einer Stelle modifiziert werden kann, die der Aminosäurefolge X1-X2-X3-X4 des Polypeptids entspricht, z. B. durch stellengerichtete Mutagenese unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide, die die gewünschte Aminosäure codieren, zur homologen Rekombination nach allgemein bekannten Verfahren.
Schließlich kann das DNA-Gebilde gemischten synthetischen und genomischen, gemischten synthetischen und cDNA- oder gemischten genomischen und cDNA-Ursprungs sein und durch Hybridisierung von Fragmenten synthetischen, genomischen odercDNA-Ursprungs (was jeweils zutrifft) hergestellt werden, wobei die Fragmente verschiedenen Teilen des DNA-Gesamtgebildes entsprechen und wobei Standardverfahren angewendet werden. Es ist beispielsweise vorstellbar, daß die DNA-Folge, welche das heterologe Protein codiert, genomischen Ursprungs ist, während die Folge, welche das Führungspeptid codiert, synthetisch hergestellt sein kann.
Bevorzugte DNA-Gebilde, welche Aprotinin codieren, werden in den beigefügten Abbildungen 4,7,9,11 und 12 gezeigt, ebenso geeignete Modifikationen, welche Aprotinin oder dessen funktionelle Analoge codieren. Beispiele für geeignete Modifikationen der DNA-Folge sind Nukleotidsubstitutionen, die nicht zum Entstehen einer anderen Aminosäurefolge des Proteins führen, die aber der Kodonnutzung des Hefeorganismus entsprechen können, in welches das DNA-Gebilde eingefügt wird, oder Nukleotidsubstitutionen, die zum Entstehen einer unterschiedlichen Aminosäurefolge und damit, möglicherweise, zu einer unterschiedlichen Proteinstruktur führen, ohne jedoch die Antiprotease-Eigenschaften des natürlichen Aprotinins zu beeinträchtigen. Andere Beispiele für mögliche Modifikationen sind die Einführung von einem oder mehreren Nukleotiden in die Folge, die Addition von einem oder mehreren Nukleotiden an einem Ende der Folge und die Deletion von einem oder mehreren Nukleotiden an einem der Enden oder innerhalb der Folge. Beispiele für spezielle Aprotininanaloge sind die, welche in der europäischen Patentanmeldung, Publikation Nr.339942, beschrieben werden.
Bevorzugte DNA-Gebilde mit der Codierung für Insulinvorläufer werden in den beigefügten Abbildungen 16 und 17 gezeigt oder deren Modifikationen gemäß vorstehender Definition.
Der rekombinante Expressionsvektor, der eine DNA-Folge mit der Codierung des Polypeptids nach der Erfindung trägt, kann jeder Vektor sein, der zur Replikation in Hefeorganismen in der Lage ist. In dem Vektor sollte die DNA-Folge mit der Codierung für das Polypeptid nach der Erfindung operabel mit einer geeigneten Promotersequenz verbunden sein. Der Promoter kann jede DNA-Folge sein, die Transkriptionsaktivität in Hefe aufweist, und sie kann von Genen abgeleitet sein, die Proteine homolog oder heterolog zu Hefe codieren. Der Promotor wird vorzugsweise von einem Gen abgeleitet, das Protein homolog zu Hefe codiert. Beispiele für geeignete Promoter sind die Promoter Saccharomyces cerevisiae Ma 1, TPI, ADH oder PGK. Die DNA-Folge, welche das Polypeptid nach der Erfindung codiert, sollte auch operabel mit einem geeigneten Terminator verbunden sein, z.B. dem TPI-Terminator (sieheT.Alber und G.Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1,1982, S.419-434). Der rekombinante Expressionsvektor nach der Erfindung weist außerdem eine DNA-Folge auf, die es dem Vektor ermöglicht, sich in Hefe zu replizieren. Beispiele für solche Folgen sind die Hefeplasmid-2 μ-Replikationsgene REP 1-3 und der Replikationsursprung. Der Vektor kann auch einen selektierbaren Markerenthalten, z.B. dasTPI-Gen von Schizosaccharomyces pombe, wie das von P. R. Rüssel, Gene 40,1985, S. 125-130, beschrieben wird.
Die Verfahren, die zum Ligieren der DNA-Folgen eingesetzt werden, welche das Polypeptid nach der Erfindung codieren, also des Promoters bzw. des Terminators, sowie zu deren Einfügen in geeignete Hefevektoren, welche die für die Hefereplizierung notwendige Information enthalten, sind Fachleuten allgemein bekannt (siehe beispielsweise Maniatis u. a., ebenda). Es versteht sich von selbst, daß der Vektor hergestellt werden kann entweder durch zuerst die Schaffung eines DNA-Gebildes mit der gesamten DNA-Folge, die das Polypeptid nach der Erfindung codiert, und anschließend das Einfügen dieses Fragments in einen geeigneten Expressionsvektor oder durch sequentielles Einfügen von DNA-Fragmenten, die genetische Informationen für die einzelnen Elemente enthalten (beispielsweise das Signal, den Führer oder das heterologe Protein), gefolgt vom Ligieren. Der im Verfahren der Erfindung eingesetzte Hefeorganismus kann jeder geeignete Hefeorganismus sein, der bei der Züchtung große Mengen an heterologem Protein oder Peptid der fraglichen Spezies produziert. Beispiele für geeignete Hefeorganismen können Stämme der Hefespezies Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe oder Saccharomyces uvarum sein. Die Transformation der Hefezellen kann beispielsweise durch Protoplastbildung (siehe untenstehendes Beispiel 1), gefolgt von der Transformation auf eine bekannte Weise, ausgeführt werden. Das Medium, das zum Züchten der Zellen verwendet wird, kann jedes herkömmliche Medium sein, das für die wachsenden Hefeorganismen geeignet ist. Das sekretierte Protein, ein heterologes Protein, von dem im Medium ein signifikanter Teil in korrekt verarbeiteter Form vorhanden ist, kann aus dem Medium nach herkömmlichen Verfahren entfernt werden, einschließlich der Abtrennung der Hefezellen vom Medium durch Zentrifugieren oder Filtern, Ausfällen der proteinhaltigen Komponenten der obenaufschwimmenden Schicht oder des Filtrats durch ein Salz, z. B. Ammoniumsulfat, gefolgt von der Reinigung durch eine Reihe chromatografischer Verfahren, z. B. der lonenaustauschchromatografie, der Affinitätschromatografie oder ähnlichen. Nach einem zusätzlichen Gesichtspunkt bezieht sich die Erfindung auf ein neuartiges Aprotininanalog mit der allgemeinen Formel X4-Aprotinin(1-58), worin X4 eine N-Terminalerweiterung um eine oder mehrere Aminosäuren darstellt, von denen wenigstens eine eine negativ geladene Aminosäure ist, die aus der aus GIu und Asp bestehenden Gruppe ausgewählt wird. X4 kann eine Folge von 1 bis 6 Aminosäuren, insbesondere 1 bis 4 Aminosäuren, darstellen und kann jede der oben gegebenen Bedeutungen haben. Besonders bevorzugte Bedeutungen für X4 sind Glu-Leu und Glu-Leu-Asp-Leu.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen weiter offengelegt, in denen
Abb. 1: die DNA- und die Aminosäurefolge von Aprotinin (1 bis 58) zeigt; die gestaffelten Linien in der DNA-Folge
zeigen Stellen, an denen Duplexe aus synthetischen Oligonukleotiden ligiert wurden; Abb. 2: die Konstruktion von Plasmid pKFN-802 und pKFN-803 zeigt;
Abb.3: die Konstruktion von Plasmid pKFN-849 und pKFN-855 zeigt;
Abb. 4: die DNA-Folge eines EcoRI-Xbal-Fragmentes zu 406 bp von pKFN-849 und pKFN-855 zeigt; der Pfeil bezeichnet
die Stelle, an welcher während der Sekretion des proteolytische Schneiden erfolgt; Abb. 5Au. 5 B: die Unterbindung von Trypsin bzw. Plasmin durch Aprotinin zeigen; e bezeichnet pankreatisches
Rinderaprotinin, X bezeichnet GluLeu-Aprotinin und Δ bezeichnet GluLeuAspLeu-Aprotinin; Abb. 6: die Konstruktion der Plasmide pKFN-852 und pKFN-858 zeigt;
Abb. 7: die DNA-Folge eines EcoRI-Xbal-Fragmentes zu 412 bp von pKFN-852 und pKFN-858 zeigt; der Pfeil bezeichnet
die Stelle, an welcher während der Sekretion des proteolytischeSchneiden erfolgt; Abb. 8: die Konstruktion von Plasmid pKFN-995 und pKFN-998 zeigt;
Abb. 9: die DNA-Folge eines EcoRI-Xbal-Fragmentes zu 412 bp von pKFN-995 und pKFN-998 zeigt; der Pfeil bezeichnet
die Stelle, an welcher während der Sekretion des proteolytischeSchneiden erfolgt; Abb. 10: die Konstruktion der Plasmide pKFN-1000 und pKFN-1003zeigt;
Abb. 11: die DNA-Folge des EcoRI-Xbal-Fragmentes zu 412 bp von pKFN-1000 und pKFN-1003 zeigt; der Pfeil bezeichnet
die Stelle, an welcher während der Sekretion die proteolytische Schneidung erfolgt; Abb. 12: die DNA-Folge eines synthetischen Aprotinin(3-58)-Gens zeigt; die gestaffelten Linien innerhalb der Folge
bezeichnen die Stellen, an denen fünf Duplexe, die aus 10 synthetisierten Oligonukleotiden gebildet werden, ligiert werden;
Abb. 13: die Konstruktion von Plasmid pKFN-305 und pKFN-374/375 zeigt;
Abb. 14: die Konstruktion von Plasmid pMT-636 zeigt;
Abb. 15: die Konstruktion von Plasmid pLaC-240zeigt;
Abb. 16: die DNA-Folge des modifizierten Führungs-Insulinvorläufergens von pLaC-240 zeigt;
Abb. 17: die DNA-Folge eines EcoRI-Xbal-Fragments zu 508 bp von pKFN-458 zeigt, das den MF 1-Signal-Führer(1-58)
und Insulinanalogvorläufer B(1-29,1GIu + 27 Glu)-AlaAlaLys-A(1-21) zeigt.
Herstellung von Glu-Leu-Aprotinin(1-58) aus dem Hefestamm KFN-837
a) Konstruktion von Plasmid pKFN-802
Ein synthetisches Gen mit der Codierung für Aprotinin(1-58) wurde durch Ligierung aus 10 Oligonukleotiden hergestellt.
Die Oligonukleotide wurden auf einem automatischen DNA-Synthesegerät unter Verwendung von Phorphoramiditchemikalie auf einer regulierten Porenglasauflage (Beaucage, S. L., und Caruthers, M. H., Tetrahedron Letters 22, [1981], 1859 bis 1869).
Es wurden folgende 10 Oligonukleotide synthetisiert:
NOR-760: CATGGCCAAAAGAAGGCCTGATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCC NOR-754: TTACATGGACCAGTGTATGGAGGTTCCAAACAGAAATCAGGCCTTCTTTTGGC NOR-354: ATGTAAAGCTAGAATCATCAGATACTTCTACAACG
NOR-355: CTTGGCGTTGTAGAAGTATCTGATGATTCTAGCT
NOR-356: CCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCA NOR-357: CTCTGCAGCCACCGTAAACGAAAGTTTGACACAAACCAGC NOR-358: GCAGCGCTAAGAGAAACAAGTTCAAGT
NOR-359: AGCAGACTTGAAGTTGTTTCTCTTAG
NOR-360: CTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGTGGTGCCTAAT NOR-631: CTAGATTAAGGCACCACCACAAGTTCTCATGCAGTCTTC
Aus den oben genannten 10 Oligonukleotiden wurden, wie in der Abb. 1 gezeigt wird, 5 Duplexe, Abis E, gebildet.
Aus den entsprechenden Paaren von 5'-phosphorylierten Oligonukleotiden wurden jeweils 20 pMol der Duplexe A bis E durch zehnminütiges Erhitzen bei 900C, gefolgt vom Abkühlen auf Zimmertemperatur über einen Zeitraum von 75 Minuten, gebildet.
Die fünf Duplexe wurden gemischt und mitT4-DNA-Ligase behandelt. Das synthetische Gen wurde als Band zu 191 bpnach der Elektrophorese des Ligationsgemischs auf einem 2%igen Agarosegel isoliert. Das gewonnene synthetische Gen wird in der Abb.1 gezeigt.
Das synthetische Gen wurde an ein EcoRI-Ncol-Fragment zu 209 bp von pLaC212spx3 und an das EcoRI-Xbal-Fragment zu 2,7 kb von Plasmid pUC 19 ligiert (Yanisch-Perron, C, Vieira, J., und Messing, J., Gene 33 [1985], 103-119). Plasmid pLaC212spx3 wird in Beispiel 3 der internationalen Patentanmeldung, Publikation Nr. WO 89/02463, beschrieben.
Das EcoRI-Ncol-Fragment zu 209bp von pLaC212spx3 codiert ein synthetisches Hefeführungspeptid.
Das Ligationsgemisch wurde zum Transformieren eines kompetenten E. coli-Stammes (r~, m+) mit Selektion auf Ampicillinresistenz verwendet. Die Sequenzierung eines 32P-Xbal-EcoRI-Fragmentes (Maxam, A., und Gilbert, W., Methods Enzymol. 65 [1980] 499-560) zeigte, daß Plasmide aus den resultierenden Kolonien die korrekte DNA-Folge für Aprotinin(1-58) enthielten.
Ein Plasmid pKFN-802 wurde für die weitere Verwendung ausgewählt. Die Konstruktion von Plasmid pKFN-802 wird in Abb. 2 veranschaulicht.
b) Konstruktion der Plasmide pKFN-849, pKFN-855 und des Hefestammes KFN-837 Das Ncol-Stul-Fragment zu 3,0kb von pKFN-802 wurde an das synthetische Fragment NOR-790/791 mit T4-DNA-Ligase ligiert:
MAKRELR CATGGCTAAGAGAGAATTGAGA C GATTCTCTCTTAACTCT
Das Ligationsgemisch wurde mit dem Restriktionsenzym Stul verdaut, um jeden möglichen Hintergrund von pKFN-802 zu verringern, und das resultierende Gemisch wurde zur Transformation eines kompetenten E. coli-Stammes (r~, m+) mit Selektion für Ampicillinresistenz verwendet. Durch DNA-Sequenzierung (Sanger, F., Micklen, S. und Coulson, A. R., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 [1977], 5463-5467) wurde gezeigt, das Plasmid pKFN-849von einer der resultierenden Kolonien die DNA-Folge von Glu-Leu-Aprotinin{1-58), korrekt mit dem synthetischen Hefeführungsgen verschmolzen, enthält. Die Konstruktion von Plasmid pKFN-849 wird in der Abb. 3 veranschaulicht.
pKFN-849 wurde mit EcoRI und Xbal geschnitten, und das 406-bp-Fragment wurde an das 9,5-kb-Ncol-Xbal-Fragment von pMT636 und das 1,4-kb-Ncol-EcoRI-Fragment von pMT636 ligiert, was das Plasmid pKFN-855 ergab, siehe Abb.3. Plasmid pMT636wird in der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/DK88/00138 beschrieben.
pMT636 ist ein E. coli-S. cerevisiae-Schaukelvektor, der das Schizosaccharomyces pombe-TPI-Gen (POT) (Russell, P. R., Gene 40 [1985], 125-130), den S.cerevisiae-Triosephosphatisomerasepromotor und -terminator, TPIp und TPTT (Alber, T., und Kawasaki, G., J. Mol. Appl. Gen. 1 [1982], 419-434) enthält. Plasmid pKFN-855 enthält folgende Sequenz:
TPIP-LaC212spx3-Signal-Führung-Glu-Leu-Aprotinin(1-58)-TPIT, wobei der Signalführer LaC212spx3 der synthetische Hefeführer ist, der in der internationalen Patentanmeldung, Publikation Nr. WO 89/02463, beschrieben wurde. Die DNA-Folge des EcoRI-Xbal-Fragmenteszu406bp von pKFN-849 und pKFN-855 wird in der Abb. 4 gezeigt.
Der S. cerevisiae-Stamm MT663 (E2-7 B XE11-36 a/a, Δίρί Δίρί pep 4-3/pep 4-3) wurde auf YPGaL (1 % Bacto-Hefeextrakt, 2% Bacto-Pepton,2% Galaktose, 1 % Laktat) bis auf einen Außendurchmesser von 0,6 bei 600 nm gezogen. Durch Zentrifugieren wurden 100 ml der Kultur geerntet, mit 10 ml Wasser gewaschen, erneut zentrifugiert und wieder in 10 ml einer Lösung suspendiert, die 1,2M Sorbitol, 25 mM Na2EDTA, pH-Wert 8,0 und 6,7mg/ml Dithiotreitol enthielt. Die Suspension wurde 15 Minuten lang bei 3O0C inkubiert, zentrifugiert und die Zellen wieder in 10ml einer Lösung suspendiert, die 1,2 M Sorbitol, 10mM Na2EDTA, 0,1 M Natriumzitrat, pH-Wert 5,8, und 2 mg Novozym® 234 enthielt. Die Suspension wurde 30 Minuten lang bei 3O0C inkubiert, die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, in 10 ml 1,2 M Sorbitol und 10 ml CAS (1,2 M Sorbitol, 1OmM CaCI210mMTris-HCL(Tris = Tris(hydroxymethyl)aminomethan) pH-Wert 7,5) gewaschen und in 2 ml CAS wieder suspendiert. Zur Transformation wurden 0,1 ml CAS-resuspendierte Zellen mit etwa 1 μg des Plasmids pKFN-855 gemischt und 15 Minuten bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Es wurde 1 mi von (20% Polyethylenglykol 4000, 2OmM CaCI2,1OmM CaCI2,1OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5) zugesetzt und das Gemisch weitere 30 Minuten bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Das Gemisch wurde zentrifugiert und das Pellet wieder in 0,1 ml SOS (1,2 M Sorbitol, 33% YPD, 6,7 mM CaCI2,14 цд/тІ1.еигіп) suspendiert und zwei Stunden lang bei 3O0C inkubiert. Dann wurde die Suspension zentrifugiert und das Pellet wieder in 0,5 ml von 1,2 M Sorbitol suspendiert. Anschließend wurden bei 520C 6ml Top-Agar (das SC-Medium von Sherman u.a., Methods in Yeast Genetics (Methoden in der Hefegenetik), Cold Spring Harbor Laboratory [1981], das 1,2 M Sorbitol plus 2,5% Agar enthielt) zugesetzt und die Suspension oben auf Platten gegossen, welche das gleiche agarverfestigte,sorbitolhaltige Medium enthielten. Nach 3 Tagen bei 3O0C wurden transformante Kolonien herausgegriffen, reisoliert und zum Ansetzen von Flüssigkulturen verwendet. Ein solcher Transformant, KFN-837, wurde für die weitere Charakterisierung ausgewählt.
Der Hefestamm KFN-837 wurde auf YPD-Medium (1 % Hefeextrakt, 2% Pepton [von den Difco-Laboratories] und 6% Glukose) gezogen. Eine Kultur dieses Stammes zu 200 ml wurde bei 300C mit 250 U/min 3 Tage lang auf einen Außendurchmesser von 20 bei 600nm geschüttelt (trockene Hefebiomasse 18,8g/l). Nach dem Zentrifugieren wurde die obenaufschwimmende Schicht durch FPLC-Ionenaustauschchromatografie analysiert. Die obenaufschwimmende Hefeschicht wurde durch eine Millex-GV-Filtereinheit von 0,22 pm gefiltert, und 1 ml wurde auf eine MonoS-Kationenaustauschkolonne (0,5 cm χ 5cm), die mit 2OmM Bizin, pH-Wert 8,7, äquilibriert worden war, gegeben. Nach dem Waschen mit Äquilibrationspuffer wurde die Kolonne mit einem linearen NaCI-Gradienten (0-1 M) in Äquilibrationspuffer eluiert. Die Trypsinunterbindungsaktivität wurde in den eluierten Fraktionen durch spektrofotometrische Analyse (Kassel, B., Methods Enzymol. 19 [1970], 844-852) und weiter bestimmt durch Integration der Absorption bei 280 nm aus.
E2M (Aprotinin) = 8,3
Der Ertrag lag bei 120mg/l an Glu-Leu-Aprotinin(1-58).
Zur Analyse der Aminosäuren und zur N-Terminalsequenzierung wurde die Konzentration und weitere Reinigung des eluierten Gradienten (Glu-Leu-Aprotinin[1-58]) durch Hochdruckflüssigkeitschromatografie (HPLC) auf einer Gegenphasenkolonne (VydacC64,4,6 mm x 250 mm) durchgeführt. DieEluierung erfolgte mit einem CH3CN-Gradienten in 0,1 %TFA. Die aufgefangenen Fraktionen wurden durch Vakuumzentrifugieren auf etwa 100μΙ konzentriert, und zur N-Terminalsequenzierung und Aminosäureanalyse wurden Proben entnommen.
Durch N-Terminalsequenzierung wurde folgende Sequenz ermittelt:
Glu-Leu-Arg-Pro-Asp-Phe-X-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-X-Lys-Ala-Arg-Ile-Ile-Arg-Tyr-Phe-Tyr-Asn-Ala-Lys-Ala
was bestätigt, daß das N-Terminalende korrekt ist. Zysteinhalbreste werden nach dieser Methode nicht bestimmt, was mit den Leerzyklen (X) übereinstimmt, die für die Reste Ä7 und 16 ermittelt wurden.
Die Aminosäurenanalyse wird in der Tabelle 1 gezeigt. Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, daß das Produkt die erwartete Aminosäurenzusammensetzung hat, d.h. mehr GIu und Leu. Der leicht verringerte Gehaltan He kann höchstwahrscheinlich der unvollständigen Hydrolyse von lle(18)-lle(19) zugeschrieben werden (was in Fachkreisen allgemein bekannt ist). Auch liegt der Arg-Anteil etwas höher als erwartet.
Das kann jedoch auch bei natürlichem Aprotinin festgestellt werden (Tabelle 1, dritte Spalte).
Bei einem Vergleich nach der oben genannten Methode von Kassel wurde festgestellt, daß die spezifische Aktivität von Glu-Leu-Aprotinin(1-58) innerhalb des experimentellen Fehlers mit der spezifischen Aktivität von natürlichem Aprotinin identisch ist. Die Trypsin- und Plasmin-Unterbindung durch Glu-Leu-Aprotinin(1-58) in Begriffen der Titrationskurven, die auf die unten beschriebene Weise ermittelt wurden, war von der von pankreaktischem Rinderaprotinin (Aprotinin Novo) nicht zu unterscheiden. Nachdem das Enzym 30 Minuten lang mit Aprotinin oder dessen Analogen inkubiert worden war, wurden 0,6mM S2251 (KabiVitrum) zugesetzt, und die Aktivität wurde als Rate der Nitroanilinproduktion gemessen. Die Aktivität als Funktion der Aprotininkonzentration wird in den Abbildungen 5Aund 5 B grafisch dargestellt. Es wurde eine vollständige Unterbindung beider Enzyme mit allen drei Inhibitoren beobachtet.
Produktion von Glu-Leu-Asp-Leu-Aprotinin(1-58) aus dem Hefestamm KFN-840 Wie im Beispiel 1 beschrieben, wurde ein synthetisches Gen mit der Codierung für Glu-Leu-Asp-Leu-Aprotinin (1-58) konstruiert. Anstelle von NOR-790/791 wurde das synthetische Fragment NOR-793/794 verwendet:
MAKREL DLR CATG GCTAAG AG AGAATTG GACTTGAGA CGATTCTCTCTTAACCTGAACTCT
Das pUC19-abgeleitete Plasmid pKFN-852 wurde auf ähnliche Weise wie pKFN-849 konstruiert.
Unter Anwendung des Verfahrens aus Beispiel 1 erhielt man ein Plasmid pKFN-858, das folgende Konstruktion enthielt:
TPIp-LaC212spx3-Signal-Führer-GluLeuAspLeu-Aprotinin(1-58)-TPIT.
Die Konstruktion der Plasmide pKFN-852 und pKFN-858 wird in der Abb.6 veranschaulicht. Die DNA-Folge des EcoRI-Xbal-Fragmenteszu 412 bp von pKFN-852 und pKFN-858wird in der Abb. 7 gegeben.
Plasmid pKFN-858 wurde wie oben beschrieben in den Hefestamm MT663 transformiert, was den Hefestamm KFN-840 ergab.
Eine Kultur von KFN-840 zu 200 ml in YPD-Medium wurde bei 30°C mit 250 U/min drei Tage lang auf einen Außendurchmesser von 18 bei 600 mm geschüttelt (trockene Biomasse 16,7 mg/l). Die FPLC-Ionenchromatografie, die wie oben an der obenaufschwimmenden Schicht ausgeführt wurde, brachte einen Ertrag von 90mg/l Glu-Leu-Asp-Leu-Aprotinin (1-58).
Die Aminosäureanalyse ergibt sich aus der Tabelle 1 und bestätigt die erwartete Aminosäurenzusammensetzung.
Die Titrationskurven der Trypsin- und Plasmin-Unterbindung von Glu-Leu-Asp-Leu-Aprotinin(1-58) waren nicht von denen von pankreatischem Rinder-Aprotinin (Aprotinin Novo) zu unterscheiden, siehe Abbildungen 5 A und 5 B.
Produktion von Aprotinin(1-58) aus dem Hefestamm KFN-1006
Plasmid pKFN-995 wurde aus pKFN-802 durch Ugat'ion des Ncol-Stul-Fragmentes zu 3,0 kb an das synthetische Fragment NOR-848/849 konstruiert:
MAAKE KE KRR CATGGCTAAGGAATTGGAGAAGAGAAGG CGATTCCTTAACCTCTTCTCTTCC
Das Ligationsgemisch wurde mit dem Restriktionsenzym Ball verdaut, um einen möglichen Hintergrund von pKFN-802zu reduzieren.
Das Hefeexpressionsplasmid pKFN-998 wurde im wesentlichen so konstruiert, wie das im Beispiel 1 beschrieben und in der Abb. 8 gezeigt wurde:
TPTp-LaC212spx3-Signal-Führer(1-47)-Lys-Glu-Leu-Glu(Lys-Arg)-Aprotinin(1-58)-TPIT.
Die DNA-Folge des EcoRi-Xbal-Fragmentes zu 412 bp von pKFN-995 und pKFN-998 wird in der Abb. 9 gegeben.
Plasmid pKFN-998 wurde in den Hefestamm MT663 transformiert, wie das im Beispiel 1 beschrieben wurde, was den Hefestamm KFN-1 006 ergab. Die Züchtung des transformierten Stammes KFN-1106 in YPD-Medium und die Analyse nach Aprotinin(1-58) in der obenaufschwimmenden Schicht wurde wie oben ausgeführt.
Der Ertrag lag bei 30 mg/l Aprotinin(1-58).
Die Aminosäurenanalyse des gereinigten Materials bestätigte die erwartete Aminosäurezusammensetzung.
Produktion von Aprotinin(1-58) aus dem Hefestamm KFN-1 008
Das pUC-abgeleitete Plasmid pKFN-1 000 wurde wie im Beispiel 1 durch Ligationdes Ncol-Stul-Fragmentes zu 3,0 kb an das synthetische Fragment NOR-850/851 konstruiert:
МАЕ RLE KRR CATG GCTGAGAGATTG GAGAAGAGAAGG CGACTCTCTAACCTCTTCTCTTCC
Unter Anwendung des Verfahrens aus den Beispielen 1 und 3 wurde ein Hefeexpressionsplasmid pKFN-1003 gewonnen, das folgende Konstruktion TPIp-LaC212spx3-Signal-Führer(1-47)-GluArgLeuGlu(Lys-Arg)-Aprotinin-(1-58)-TPIT enthielt.
Die Konstruktion der Plasmide pKFN-1000 und pKFN-1003 wird in der Abb. 10 veranschaulicht. Die DNA-Folge des EcoRI-Xbal-Fragmentes zu 412 bp von pKFN-1000 und pKFN-1003 wird in der Abb. 11 gegeben.
Plasmid pKFN-1003 wurde im Hefestamm MT663 transformiert, wie das oben beschrieben wurde, und ergab den Hefestamm KFN-1 008.
Die Züchtung des transformierten Stamms KFN-1 008 in YPD-Medium und die Analyse nach Aprotinin(1-58) in der obenaufschwimmenden Schicht wurde wie oben ausgeführt. Der Ertrag lag bei 120mg/l Aprotinin(1-58).
Die Aminosäurenanalyse des gereinigten Materials bestätigte die erwartete Aminosäurezusammensetzung. Außerdem wurde durch Gasphasensequenzierung des reduzierten, pyridylethylierten Polypeptides die Bestätigung der vollständigen Primärstruktur ermittelt.
Außerdem war die spezifische unterbindende Aktivität des rekombinanten Aprotinins(1-58) gegenüber Trypsin nicht von der von pankreatischem Rinderaprotininzu unterscheiden.
Plasmid pKFN-802 (siehe Beispiel 1) wurde mit EcoRI und Xbal geschnitten, und das 400-bp-Fragment wurde an das 9,5-kb-Ncol-Xbal-Fragmentvon pMT636 und das 1,4-kb-Ncol-EcoRI-Fragment von pMT636 ligiert, was Plasmid pKFN-803 ergab, siehe Abb.2. pKFN-803 enthält die folgende Konstruktion:
TPIP-LaC212spx3-Signal-Führer-Aprotinin(1-58)-TPIT.
Plasmid pKFN-803 wurde wie oben beschrieben im Hefestamm MT663 transformiert. Die Züchtung des transformierten Hefestamms KFN-783 in YPD-Medium und die FPLC-Ionenchromatografie der obenaufschwimmenden Schicht wurden so ausgeführt, wie das oben beschrieben wurde. Aprotinin(1—58) wurde quantitativ bestimmt durch Vergleich mit der Chromatografie von einer standardisierten Lösung authentischen Aprotinins, das aus der Rindspankreas gereinigt worden war. Der Ertrag an Aprotinin(1-58) lag bei weniger als 1 mg/l.
Tabelle 1 Amninosäurezusammensetzung
| Aminosäure | Aprotimn | Aprotimn | KFM-837 | KFN-840 |
| theoretisch | ermittelt | ermittelt | ermittelt | |
| Asp | 5 | 5,00 | 4,95 | 5,93 (+1) |
| Thr | 3 | 2,86 | 2,84 | 2,85 |
| Ser | 1 | 0,94 | 0,92 | 0,93 |
| GIu | 3 | 3,04 | 3,97 ( + 1) | 3,99 ( + 1) |
| Pro | 4 | 4,18 | 3,90 | 3,86 |
| GIy | 6 | 5,95 | 5,91 | 5,94 |
| AIa | 6 | 5,85 | 5,92 | 5,94 |
| Cys | 6 | 5,20 | 5,21 | 5,22 |
| VaI | 1 | 0,99 | 1,00 | 1,01 |
| Met | 1 | 0,83 | 0,65 | 0,67 |
| He | 2 | 1,39 | 1,58 | 1,58 |
| Leu | 2 | 1,97 | 3,00 ( + 1) | 4,00 (+2) |
| Tyr | 4 | 3,84 | 3,74 | 3,71 |
| Phe | 4 | 3,98 | 3,94 | 3,92 |
| Lys | 4 | 3,92 | 3,99 | 3,99 |
| Arg | 6 | 6,39 | 6,33 | 6,34 |
| Total | 58 | 56,33 | 57,87 | 59,88 |
Ein synthetisches Gen für Aprotinin (3-58) wurde durch Ligation aus einer Reihe von Nukleotiden konstruiert. Die folgenden lOOIigonukleotide wurden so synthetisiert, wie das im Beipsiel 1 beschrieben wurde:
I: AAAGAGATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCC
37-mer II: TTACATGGACCAGTGTATGGAGGTTCCAAACAGAAACT
38-mer III: ATGTAAAGCTAGAATCATCAGATACTTCTACAACG
35-mer IV: CTTGGCGTTGTAGAAGTATCTGATGATTCTAGCT
34-mer V: CCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCT
39-mer Vl: CTCTGGAGCCACCGTAAACGAAAGTTTGACACAAACCAGC
40-mer VII: GCAGAGCTAAGAGAAACAACTTCAAGT
27-mer VIII: AGCAGACTTGAAGTTGTTTCTCTTAG
26-mer IX: CTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGTGGTGCCTAAT
39-mer X: CTAGATTAGGCACCACCACAAGTTCTCATGCAGTCTTC 38-mer
Aus den oben genannten 10 Oligonukleotiden wurden 5 Duplexe, A bis E, gebildet, wie das in der Abb. 12 gezeigt wird. Von jedem der Duplexe A bis E wurden 2OpMoI aus den entsprechenden Paaren der 5'-phosphorylierten Oligonukleotide I bis X durch fünfminütiges Erhitzen auf 900C, gefolgt vom Abkühlen auf Zimmertemperatur über eine Zeitspanne von 75 Minuten, gebildet. Die fünf Duplexe wurden gemischt und mit T4-Ligase behandelt. Das synthetische Gen wurde nach Elektrophorese des Ligationsgemischs auf einem 2%igen Agarosegel als Band zu 176bp isoliert. Das gewonnene synthetische Gen wird in der Abb. 12 gezeigt.
Ein synthetisches Gen zu 176bp wurde an ein 330-bp-EcoRI-Hgal-Fragment von Plasmid pKFN-9 mit der Codierung für den Anpassungsfaktor α 1 der Signalführungsfolge (1—85) von S. cerevisiae (Markussen, J. u.a. Protein-Engineering 1 [1987], 215-223) und an das 2,7-kb-EcoRI-Xbal-Fragment von pUC 19 (Yanish-Perron, C, Vieira, J. und Messing, J., Gene 33 [1985],
1 03-119) ligiert. Die Konstruktion von pKFN-9, das die Hgal-Stelle unmittelbar hinter der MF1-Führungsfolge enthält, wird in EP 214826 beschrieben.
Das Ligationsgemisch wurde zurTransformation des kompetenten E. coli-Stammes(r~,m+) mit Selektion auf Ampicillinresistenz verwendet. Die Sequenzierung eines 32P-Xbal-EcoRI-Fragmentes (Maxam, A. und Gilbert, W., Methods Enzymol. 65 [1980], 499-560) zeigte, daß die Plasmide aus den resultierenden Kolonien die korrekte DNA-Folge für Aprotinin(3 bis 58) enthielten. Ein Plasmid, pKNF305, wurde für die weitere Verwendung ausgewählt. Die Konstruktion von Plasmid pKFN 305 wird in der Abb. 13 gezeigt.
ρKFN 305 wurde mit EcoRI und Xbal geschnitten, und das Fragment zu 0,5 kb wurde an das 9,5-kb-Ncol-Xbal-Fragment von ρ MT636 und das 1,4-kb-Ncol-EcoRI-Fragment von pMT636 ligiert, was Plasmid pKFN 374 ergab, siehe Abb. 13. Plasmid pMT636 wurde aus pMT608 nach Deletierung des LEU-2-Gens und aus pMT479 konstruiert, siehe Abb. 14- pMT6Q8 wird in EP 195691 beschrieben. pMT479 wird in EP 163529 beschrieben. pMT479 enthält das Schizosaccharomyces pombe-TPI-Gen (POT), den S. cerevisiae-Triosephosphatisomerasepromotor und -terminator, TPIp und ΤΡΙγ (Alber, T. und Kwasaki, G., J. Mol. Appl. Gen. 1 [1982], 419-434). Plasmid pKFN 374 enthält folgende Sequenz:
TPIP-MFa1-Signal-Führer(1-85)-Aprotinin(3-58)-TPIT,
wobei MFa 1 der Anpassungsfaktor Alpha 1 von S. cerevisiae mit der Codierungssequenz ist (Kurjan, J. und Herskowitz, I., Cell 30 [1982], 933-943), wobei man unter Signalführer (1-85) versteht, daß die Sequenz die ersten 85 Aminosäurereste der MFai-Signalführungsfolge enthält, und Aprotinin(3-85) ist die synthetische Sequenz, die ein Aprotininderivat codiert, dem die beiden ersten Aminosäurereste fehlen
Der S. cerevisiae-Stamm MT663 (E2-7B XE11-36 a/a, utpiutpi, pep 4-3/pep 4-3) wurde auf YPGaI (1 % Bacto-Hefeextrakt,
2 % Bacto-Pepton, 2% Galaktose, 1 % Laktat) auf einen Außendurchmesser bei 600 nm von 0,6 gezogen.
Durch Zentrifugieren wurden 100 ml der resultierenden Kultur geerntet, mit 10 ml Wasser gewaschen, wieder zentrifugiert und in 10 ml einer Lösung wieder zu Suspension gebracht, die 1,2 M Sorbitol, 25 rtiM Na2 EDTA, pH-Wert 8,0, und 6,7 mg/ml Dithiotreitol enthält. Die Suspension wurde 15 Minuten lang bei 30°C inkubiert, zentrifugiert und die Zellen wieder in 10ml einer Lösung suspendiert, die 1,2M Sorbitol, 1OmM Na2EDTA, 0,1 M Natriumzitrat, pH-Wert 5,8, und 2mg Novozym®234 enthielt. Die Suspension wurde 30 Minuten lang bei 300C inkubiert, die Zellen durch Zentrifugieren aufgefangen, in 10 ml von 1,2 M Sorbitol und 10 ml CAS (1,2 M Sorbitol, 1OmMCaCI2,1OmMTMs-HCI (Tris = Tris(hydroxymethyl)aminomethan), pH-Wert 7,5) gewaschen und in 2 ml CAS wieder suspendiert. ZurTransformation wurden 0,1 ml CAS-resuspendierte Zellen mit etwa 1 цд Plasmid pKFN374 gemischt und 15 Minuten lang bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Es wurde 1 ml von (20% Polyethylenglykol4000,1OmM CaCI2,1OmM Tris-HCL, pH-Wert 7,5) zugesetzt und das Gemisch weitere 30 Minuten bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Das Gemisch wurde zentrifugiert und das Pellet in 0,1 ml SOS (1,2 M Sorbitol, 33% YPD, 6,7 mM CaCI2,14цд je Milliliter Leuzin) erneut suspendiert und bei 300C für die Dauer von 2 Stunden inkubiert. Dann wurde die Suspension zentrifugiert und das Pellet wieder in 0,5 ml 1,2 M Sorbitol suspendiert. Anschließend wurden bei 520C 6 ml Top-Agar (das SC-Medium von Sherman u. a., Methods in Yeast Genetics [Methoden in der Hefegenetik], Cold Spring Harbor Laboratory, [1981 ], das 1,2 M Sorbitol plus 2,5% Agar enthielt) zugesetzt und die Suspension oben auf Platten gegossen, die das gleiche agar-verfestigte, sorbitolhaltige Medium enthielten. Nach 3 Tagen bei 300C wurden transformante Kolonien herausgegriffen, reisoliert und zum Ansetzen von Flüssigkulturen verwendet. Einer der Transformanten, KFN322, wurde zur weiteren Charakterisierung ausgewählt. Hefestamm KFN322 wurde auf YPD-Medium (1 % Hefeextrakt, 2% Pepton [von den Difco Laboratories] und 2% Glukose) gezogen. Eine Kultur des Stammes zu 10 ml wurde bei 3O0C auf einen Außendurchmesser bei 600 nm von 32 geschüttelt. Nachdem Zentrifugieren wurde die obenaufschwimmende Schicht durch FPLC-lonenaustauschchromatografie analysiert. Die obenaufschwimmende Hefeschicht wurde durch eine MillexR-GV-Filtereinheit von 0,22μητι gefiltert, und 1 ml wurde auf einer MonoS-Kationenaustauschkolonne (0,5 χ 5cm) eingesetzt, die mit 2OmM Bizin, pH-Wert 8,7 äquilibriert worden war. Nach dem Waschen mit dem Äquilibrationspuffer wurde die Kolonne mit einem linearen NaCI-Gradienten (0 bis 1 M) in Äquilibrationspuffer eluiert. Die Trypsinunterbindungsaktivität in den eluierten Fraktionen wurde durch spektrofotometrische Analyse quantitativ bestimmt sowie durch Absorptionsintegration bei 280 nm aus
1% E (Aprotinin) = 8,3.
Der Ertrag lag bei etwa 3mg/l Aprotinin(3-58).
Produktion des Insulinvorläufers B(1-29)-AlaAlaLys-A(1-21) aus dem Hefestamm LaC 1667 Die Fragmente Sphl-Ncol zu 589bp und Hpal-Xbal zu 172 bp wurden aus pLAC212spx3 (in WO 89/02463 beschrieben) isoliert. Diese Fragmente wurden mit dem synthetischen Adapter
MAKELEKRFV NOR-962 CATGGCTAAGGAATTGGAAAAGAGATTCGTT NOR-964 CGATTCCTTAACCTTTTCTCTAAGCAA
verbunden und dem 10 kb-Xbal-Sphl-Fragment von pMT743 (das in WO 89/02463 beschrieben wird), was das Plasmid pLaC 240 (siehe Abb. 15) ergibt. Die DNA-Folge des modifizierten Führungs-Insulinvorläufer-Gens von pLaC 240 wird in der Abb. 16 gezeigt. Die Transformation des Hefestammes MT663 mit dem Plasmid pLaC240 ergab einen den Insulinvorläufer sekretierenden Stamm, LaC 1 667 (MT663/pLaC240), dessen Produktivität im Verhältnis zum Stamm LaC 1 414 (MT663/pLaC212spx3), welcher das Gen für den unmodifizierten Vorläufer von Insulin enthält, der in WO 89/02463 beschrieben wird, 165% beträgt.
Durch Ligation von 10 Oligonukleotiden wurde ein synthetisches Gen mit der Codierung für den Insulinanalogvorläufer B(1-29,1 Glu+27Glu)-AlaAlaLys-A(1-21) konstruiert. B(1-29,1 Glu+27Glu) bezeichnet das Polypeptid, welches die ersten 29 Aminosäurereste der B-Kette von menschlichem Insulin enthält, wobei die Glu-Reste an die Stelle von B1Phe- und B27Thr-Resten getreten sind. A(1—21) ist die Α-Kette von menschlichem Insulin. Ein Tripeptid, AlaAlaLys, verbindet den B29Lys-Rest, mit dem A1Gly-Rest.
Es wurden folgende 10 Oligonukleotide synthetisiert:
NOR-542: AAAGAGAAGTTAACCAACACTTGTGCGGTTCCAC NOR-543: AACCAAGTGGGAACCGCACAGTGTTGGTTAACTTC NOR-69: TTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCT NOR-73: GTAGAAGAAACCTCTTTCACCGCAAACCAAGTACAAAGCTTC NOR-315: TCTACGAACCTAAGGCTGCTAAGGGTATTGCT NOR-316: ATTGTTCGACAATACCCTTAGCAGCCTTACGTTC NOR-70: GAACAATGCTGTACCTCCATCTGCTCCTTGTACCAAT NOR-71: TTTTCCAATTGGTACAAGGAGCAGATGGAGGTACAGC NOR-78: TGGAAAACTACTGCAACTAGACGCAGCCCGCAGGCT NOR-72: CTAGAGCCTGCGGGCTGCGTCTAGTTGCAGTAG
Aus den obengenannten 10 Oligonukleotiden wurden 56 Duplexe gebildet, und die Duplexe wurden auf ähnliche Weise wie im Beispiel 1 ligiert.
Das synthetische 178-bp-Gen wurde an das 330-bp-EcoRI-Hgal-Fragment von pKFN-9 mit der Codierung für die S. cerevisiae-Anpassungsfaktor-Alpha-1-Signalführungs(1-85)-Folge(Markussen, J. u.a., Protein Engineering 1 [1987], 215-223) und an das 2,7-kb-EcoRI-Xbal-Fragmentvon Plasmid pUC19 (Yanish-Perron, C, Vieira, J. und Messing, J. Gene33 [1985], 103-119) ligiert.
Das Ligationsgemisch wurde zur Transformation eines kompetenten E.coli-Stammes (r~, rrT) mit Selektion für Ampizillinresistenz verwendet. Die Sequenzierung eines 32P-Xbal-EcoRI-Fragmentes (Maxam, A. und Gilbert, W., MethodsEntzymol. 65 [1980], 499-560) zeigte, daß die Plasmide von den resultierenden Kolonien die korrekte DNA-Folge für den Insulinanalogvorläufer enthielten.
Ein Plasmid, pKFN-456, wurde für die weitere Verwendung ausgewählt.
Nach dem Verfahren aus Beispiel 1 wurde ein Hefeexpressionsplasmid pKFN-458 gewonnen, welches folgende Expressionskassette enthielt:
TPIp-MF 1-Signal-Führer(1-85)-B(1-29,1Glu+27Glu)-AlaAlaLys-A(1-21)-TPIT.
Die DNA-Folge des EcoRI-Xbal-Fragmentes zu 508 bp von pKFN-456 und pKFN-458 wird in der Abb. 17 gegeben.
Plasmid pKFN-458 wurde in den Hefestamm MG-663 transformiert, wie das oben beschrieben wurde, was den Hefestamm KFN-470 ergab.
Die Züchtung des transformierten Hefestamms KFN-470 in YPD-Medium wurde in der oben beschriebenen Weise ausgeführt.
Der Ertrag an Insulinanalogvorläufer in der obenaufschwimmenden Schicht wurde durch HPLC in der beschriebenen Weise ausgeführt (L. Snel u. a., Chromatographia 24 [1987], 329 bis 332).
In der Tabelle 2 werden die Expressionspegel der Insulinanalogvorläufer B(1-29,1Glu+27Glu)-AlaAlaLys-A(1-21) und B(1-29,27Glu)-AlaAla-Lys-A(1-21) und des Insulinvorläufers B(1-29)-AlaAla-Lys-A(1-21) verglichen. Alle drei Vorläufer wurden in den gleichen Wirtsstamm, MT-663, expressiert, der mit dem S. pombe-TPI-Gen transformiert worden war, das Plasmide mit der Expressionskassette enthielt.
TPIp-MFa 1-Signal-Führer(1-85)-Vorläufer-TPIT.
Vorläufer Expressionspegel*
B(1-29)-AlaAlaLys-A(1-21) 100%
B(1-29)(27Glu)-AlaAlaLys-A(1-21) 148%
B(1-29),1Glu + 27Glu)-AlaAlaLys-A(1-21) 479%
* Die Expressionspegel werden als Prozentsatz des Expressionspegels des Insulinvorläufers B(1-29)-AlaAlaLys-A(1-21 (angegeben, der willkürlich auf 100% festgelegt wird.
Claims (44)
1. Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es besteht aus einer Verschmelzung eines Signalpeptids, eines Führungspeptids und eines heterologen Proteins oder Polypeptids, wobei dieses Polypeptid in seiner Aminosäurefolge im Anschluß an eine Hefeverarbeitungsstelle modifiziert ist, die sich zwischen dem C-Terminalende des Führungspeptids und dem N-Terminalende des heterologen Proteins befindet, um so die Darbietung einer Verarbeitungsstelle zu schaffen, durch welche diese für das proteolytische Schneiden zugänglich wird, wobei das Polypeptid folgende Struktur hat Signalpeptid-Führungspeptid-X1-X2-X3-X4-heterologes Protein, worin X1 eine Peptidbindung ist oder eine oder mehrere Aminosäuren darstellt, die gleich oder verschieden sein können, X2 und X3 gleich oder verschieden sind und eine basische Aminosäure darstellen, die aus der aus Lys und Arg bestehenden Gruppe ausgewählt wird, X2 und X3 zusammen eine Hefeverarbeitungsstelle bilden, und X4 eine Peptidbindung ist oder eine oder mehrere Aminosäuren darstellt, die gleich oder verschieden sein können, unter der Voraussetzung, daß X1 und/oderX4 eine oder mehrere Aminosäuren darstellen und daß wenigstens eine derdurch X1 und/oder X4 dargestellten Aminosäuren eine negativ geladene Aminosäure ist, die aus der aus GIu und Asp bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
2. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X1 GIu oder Asp darstellt.
3. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X1 eine Folge von zwei Aminosäuren mit der Struktur BA darstellt, worin A GIu oder Asp ist und B GIu, Asp, VaI, GIy oder Leu ist.
4. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X1 eine Folge von drei Aminosäuren mit der Struktur CBA darstellt, worin A und B wie oben definiert sind und C GIu, Asp, Pro, GIy, VaI, Leu, Arg oder Lys ist.
5. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X1 eine Folge von vier Aminosäuren mit der Struktur DCBA darstellt, worin A, B und C wie oben definiert sind und D die gleiche Bedeutung wie C hat.
6. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X1 eine Folge von fünf Aminosäuren mit der Struktur EDCBA darstellt, worin A, B, C und D wie oben definiert sind und E die gleiche Bedeutung wie C hat.
7. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X1 eine Folge von sechs Aminosäuren mit der Struktur FEDCBA darstellt, worin A, B, C, D und E wie oben definiert sind und F die gleiche Bedeutung wie C hat.
8. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X4 ein GIu oder Asp ist.
9. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X4 eine Folge von zwei Aminosäuren mit der Struktur AB darstellt, worin A GIu und Asp ist und B GIu, Asp, VaI, GIy oder Leutist.
10. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X4 eine Folge von drei Aminosäuren mit der Struktur ABC darstellt, worin A und B wie oben definiert sind und C GIu, Asp, Pro, GIy, VaI, Leu, Arg oder Lys ist.
11. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X4 eine Folge von vier Aminosäuren mit der Struktur ABCD darstellt, worin A, B und C wie oben definiert sind und D die gleiche Bedeutung wie C hat.
12. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X4 eine Folge von fünf Aminosäuren mit der Struktur ABCDE darstellt, worin A, B, C und D wie oben definiert sind und E die gleiche Bedeutung wie C hat.
13. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X4 eine Folge von sechs Aminosäuren mit der Struktur ABCDEF darstellt, worin A, B, C, D und E wie oben definiert sind und F die gleiche Bedeutung wie C hat.
14. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure, die unmittelbar an X2 angrenzt, GIu oder Asp ist, die Aminosäure, die unmittelbar an X3 angrenzt, GIu oder Asp ist, oder beide GIu oder Asp sind, wenn X1 und/oder X4 >1 Aminosäure darstellen.
15. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß entweder X1 oderX4 oder beide mehr als ein GIu oder Asp aufweisen, wenn X1 und/oder X4 mehr als eine Aminosäure darstellen.
16. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X1 und X4 beide >1 Aminosäure darstellen.
17. Polypeptid nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß X2 und X4symmetrisch identisch sind.
18. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen X4 und dem N-Terminalende des heterologen Proteins eine zusätzliche Verarbeitungsstelle geschaffen wird, wenn X4 eine oder mehrere Aminosäuren darstellt.
19. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Signalpeptid dasa-Faktor-Signalpeptid, das Signalpeptid von Speichelamylase der Maus, das Karboxypeptidasesignalpeptid oder das Hefe-BAR1-Signalpeptid ist.
20. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Führungspeptid ein natürliches Führungspeptid, wie das a-Faktorführungspeptid ist.
21. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Führungspeptid ein synthetisches Führungspeptid ist wie
A. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Gly-Phe-Leu-Asp-Leu-Ala-Gly-Glu-Glu-Ile-Ala-Glu-Aan-Thr-Thr-Leu-Ala
B. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pre-Glu-Glu-Ser-Lei-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala
C. Als-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala
D. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala-Asn-Val-Ala-Met-Ala und
E. Gin-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala-Asn-Val-Ala-Net-Ala.
22. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das heterologe Protein oder Polypeptid aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus Aprotinin oder anderen Proteaseunterbindern, Insulin und Insulinvorläufern, menschlichem oder Rinderwachstumhormon, Interleukin, Gewebeplasminogenaktivator, Glukagon, Faktor VII, Faktor VIII, FaktorXIII, blättchenabgeleitetem Wachstumsfaktor, Enzymen und einem funktioneilen Analog jedes dieser Proteine.
23. Polypeptid nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das heterologe Protein oder Polypeptid Aprotinin oder dessen funktionelles Analog ist.
24. Polypeptid nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß X1 Glu-Arg-Leu-Glu oder Lys-Glu-Leu-GIu ist.
25. Polypeptid nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß X4 Glu-Leu oder Glu-Leu-Asp-Leu ist.
26. Polypeptid nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das heterologe Protein oder Polypeptid Insulin oder ein Insulinvorläufer oder deren funktionelles Analog ist.
27. Polypeptid nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß X1 Glu-Arg-Leu-Glu oder Lys-Glu-Leu-GIu ist.
28. Polypeptid nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß X4 GIu ist.
29. Polypeptid nach einem der Ansprüche 26 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß das heterologe Protein oder Polypeptid der Insulinanalogvorläufer B(1-29)-A!aAlaLys-A(1-29) ist und X Lys-Glu-Leu-Glu ist.
30. Polypeptid nach einem der Ansprüche 26 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß das heterologe Protein oder Polypeptid der Insulinanalogvorläufer B(1-29)-SerAspAspAlaLys-A(1-29) ist und X1 Lys-Glu-Leu-Glu ist.
31. DNA-Gebilde, dadurch gekennzeichnet, daß es eine DNA-Folge mit der Codierung für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 30 aufweist.
32. DNA-Gebilde nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß es die DNA-Folge aufweist, die in der Abb. 4, 7, 9 oder 11 gezeigt wird, oder deren geeignete Modifikation.
33. Rekombinanter Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er sich in Hefe replizieren kann und ein DNA-Gebilde nach Anspruch 31 oder 32 trägt.
34. Hefe-Stamm, dadurch gekennzeichnet, daß er ein heterologes Protein oder Polypeptid expressieren kann und mit einem Vektor nach Anspruch 33 transformiert wird.
35. Verfahren für die Herstellung eines heterologen Proteins oder Polypeptids in Hefe, dadurch gekennzeichnet, daß es besteht aus der Züchtung eines Hefestamms nach Anspruch 34 in einem geeigneten Medium um die Expression und Sekretion/Verarbeitung des heterologen Proteins oder Polypeptids zu erreichen, worauf das Protein oder Polypeptid aus dem Medium isoliert wird.
36. Aprotininanalog mit der allgemeinen Formel X4-Aprotinin(1-58), dadurch gekennzeichnet, daß X4 eine N-Terminalerweiterung um eine oder mehrere Aminosäuren darstellt, von denen wenigstens eine eine negativ geladene Aminosäure ist, die aus der aus GIu und Asp bestehenden Gruppe ausgewähltwird.
37. Analog nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß X4 GIu oder Asp ist.
38. Analog nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß X4 eine Folge von zwei Aminosäuren mit der Struktur AB darstellt, worin AGIu oder Asp ist und B GIu, Asp, VaI, GIy oder Leu ist.
39. Analog nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß X4 eine Folge von drei Aminosäuren mit der Struktur ABC darstellt, worin A und B wie oben definiert sind und C GIu, Asp, Pro, Giy, VaI, Leu, Arg oder Lys ist.
40. Analog nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß X4 eine Folge von vier Aminosäuren mit der Struktur ABCD darstellt, worin A, B und C wie oben definiert sind und D die gleiche Bedeutung wie C hat.
41. Analog nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß X4 eine Folge von fünf Aminosäuren darstellt mit der Struktur ABCDE, worin A, B, C und D wie oben definiert sind und E die gleiche Bedeutung wie C hat.
42. Analog nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß X4 eine Folge von sechs Aminosäuren mit der Struktur ABCDEF darstellt, worin A, B, C, D und E wie oben definiert sind und F die gleiche Bedeutung wie C hat.
43. Polypeptid nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß X4mehr als ein GIu oder Asp aufweist, wenn X4 mehr als eine Aminosäure aufweist.
44. Analog nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß X4 Glu-Leu oder Glu-Leu-Asp-Leu ist.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK105489A DK105489D0 (da) | 1989-03-03 | 1989-03-03 | Polypeptid |
| DK494189A DK494189D0 (da) | 1989-10-06 | 1989-10-06 | Polypeptid |
| PCT/DK1990/000058 WO1990010075A1 (en) | 1989-03-03 | 1990-03-01 | Yeast processing system comprising a negatively charged amino acid adjacent to the processing site |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD296965A5 true DD296965A5 (de) | 1991-12-19 |
Family
ID=26065137
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD90338353A DD296965A5 (de) | 1989-03-03 | 1990-03-02 | Hefeverarbeitungssystem |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5395922A (de) |
| EP (1) | EP0461165B2 (de) |
| JP (1) | JP2609367B2 (de) |
| KR (1) | KR970005928B1 (de) |
| AT (1) | ATE110414T1 (de) |
| AU (1) | AU624694B2 (de) |
| CA (1) | CA2050336C (de) |
| CZ (1) | CZ285239B6 (de) |
| DD (1) | DD296965A5 (de) |
| DE (1) | DE69011853T3 (de) |
| DK (2) | DK105489D0 (de) |
| ES (1) | ES2062514T5 (de) |
| FI (1) | FI104985B (de) |
| HU (2) | HU215538B (de) |
| IE (1) | IE66469B1 (de) |
| IL (1) | IL93609A (de) |
| NO (2) | NO304236B1 (de) |
| NZ (1) | NZ232742A (de) |
| PL (1) | PL163532B1 (de) |
| RU (1) | RU2194758C2 (de) |
| UA (1) | UA27706C2 (de) |
| WO (1) | WO1990010075A1 (de) |
| ZA (1) | ZA901476B (de) |
Families Citing this family (72)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5591603A (en) * | 1987-08-28 | 1997-01-07 | Novo Nordisk A/S | Process for preparing aprotinin and aprotinin analogs in yeast cells |
| DK105489D0 (da) * | 1989-03-03 | 1989-03-03 | Novo Nordisk As | Polypeptid |
| KR920701460A (ko) * | 1989-05-19 | 1992-08-11 | 원본미기재 | 생체내에서 해독후 변형부위를 포함하는 융합단백질과 그 융합 단백질의 제조 및 정제방법 |
| GB9015825D0 (en) * | 1990-07-18 | 1990-09-05 | Ciba Geigy Ag | In vitro processing of fusion proteins |
| DK300090D0 (da) * | 1990-12-19 | 1990-12-19 | Novo Nordisk As | Fremgangsmaade til fremstilling af leadersekvenser |
| GB9106185D0 (en) * | 1991-03-22 | 1991-05-08 | Wellcome Found | Biological control agents |
| FR2686899B1 (fr) * | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| FI92601C (fi) * | 1992-03-11 | 1994-12-12 | Marja Makarow | Menetelmä hyötyproteiinien erittämiseksi hiivoista |
| US5521086A (en) * | 1993-09-16 | 1996-05-28 | Cephalon, Inc. | Secretion sequence for the production of a heterologous protein in yeast |
| DE4417353A1 (de) * | 1994-05-18 | 1996-01-25 | Bayer Ag | Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Aprotinin und rekombinanten Aprotinin Varianten mit der natürlichen N-terminlaen Sequenz |
| US6500645B1 (en) | 1994-06-17 | 2002-12-31 | Novo Nordisk A/S | N-terminally extended proteins expressed in yeast |
| ZA954983B (en) * | 1994-06-17 | 1996-02-14 | Novo Nordisk As | N-terminally extended proteins expressed in yeast |
| US5861267A (en) * | 1995-05-01 | 1999-01-19 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Methods, nucleotide sequences and host cells for assaying exogenous and endogenous protease activity |
| ZA9610456B (en) * | 1995-12-20 | 1997-06-20 | Novo Nordisk As | N-terminally extended proteins expressed in yeast |
| US5851800A (en) * | 1996-05-14 | 1998-12-22 | Pharmacia & Upjohn Ab | Process for producing a protein |
| DE19629982A1 (de) | 1996-07-25 | 1998-01-29 | Bayer Ag | Aprotinin-Varianten mit verbesserten Eigenschaften |
| JP4275741B2 (ja) * | 1996-12-13 | 2009-06-10 | ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス， インコーポレーテッド | 血小板由来増殖因子タンパク質の分析および分離 |
| DE69735242T2 (de) * | 1996-12-20 | 2006-09-21 | Novo Nordisk A/S | N-terminal verlängerte proteine exprimiert in hefe |
| WO1998032867A1 (en) * | 1997-01-24 | 1998-07-30 | Novo Nordisk A/S | Synthetic leader peptide sequences |
| US6046000A (en) * | 1997-11-07 | 2000-04-04 | Millennium Biotherapeutics, Inc. | Method for identifying genes encoding signal sequences |
| KR20010034305A (ko) | 1998-01-23 | 2001-04-25 | 한센 핀 베네드 | 효모에서 원하는 폴리펩티드를 만드는 방법 |
| DE60044728D1 (de) | 1999-12-29 | 2010-09-02 | Novo Nordisk As | VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON INSULINVORLäUFERN UND ANALOGEN VON INSULINVORLÄUFERN MIT VERBESSERTER FERMENTATIONSAUSBEUTE IN HEFE |
| US20050100991A1 (en) * | 2001-04-12 | 2005-05-12 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| CA2405709A1 (en) * | 2000-04-12 | 2001-10-25 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US7507413B2 (en) * | 2001-04-12 | 2009-03-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US20050054051A1 (en) * | 2001-04-12 | 2005-03-10 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US7595172B2 (en) | 2001-07-24 | 2009-09-29 | Novo Nordisk A/S | Method for making acylated polypeptides |
| CA2471363C (en) * | 2001-12-21 | 2014-02-11 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| EP1463752A4 (de) * | 2001-12-21 | 2005-07-13 | Human Genome Sciences Inc | Albuminfusionsproteine |
| WO2004024885A2 (en) | 2002-09-13 | 2004-03-25 | Cornell Research Foundation, Inc. | Using mutations to improve aspergillus phytases |
| CA2513213C (en) | 2003-01-22 | 2013-07-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| JP2007532096A (ja) | 2003-11-14 | 2007-11-15 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | アシル化されたインスリンの製造方法 |
| WO2005054291A1 (en) | 2003-12-03 | 2005-06-16 | Novo Nordisk A/S | Single-chain insulin |
| WO2007020256A1 (en) | 2005-08-16 | 2007-02-22 | Novo Nordisk A/S | Method for making mature insulin polypeptides |
| JP5202338B2 (ja) | 2006-02-27 | 2013-06-05 | ノボ・ノルデイスク・エー／エス | 新規インシュリン誘導体 |
| US20080026376A1 (en) * | 2006-07-11 | 2008-01-31 | Huaming Wang | KEX2 cleavage regions of recombinant fusion proteins |
| US8198046B2 (en) | 2006-07-11 | 2012-06-12 | Danisco Us Inc. | KEX2 cleavage regions of recombinant fusion proteins |
| ES2601839T3 (es) | 2006-09-22 | 2017-02-16 | Novo Nordisk A/S | Análogos de insulina resistentes a proteasas |
| EP2069502B1 (de) | 2006-09-27 | 2014-02-26 | Novo Nordisk A/S | Verfahren zur herstellung gereifter insulinpolypeptide |
| WO2008062010A2 (en) | 2006-11-22 | 2008-05-29 | Novo Nordisk A/S | Method for making activated carboxypeptidases |
| JP5688969B2 (ja) | 2007-07-16 | 2015-03-25 | ノボ・ノルデイスク・エー／エス | プロテアーゼに対して安定しているペグ化インスリンアナログ |
| CN101778862B (zh) | 2007-08-13 | 2014-12-17 | 诺沃-诺迪斯克有限公司 | 快速作用的胰岛素类似物 |
| CA2695970A1 (en) | 2007-08-15 | 2009-02-19 | Novo Nordisk A\S | Insulin analogues with an acyl and aklylene glycol moiety |
| US8962794B2 (en) | 2007-08-15 | 2015-02-24 | Novo Nordisk A/S | Insulins with an acyl moiety comprising repeating units of alkylene glycol containing amino acids |
| US8501449B2 (en) * | 2007-12-04 | 2013-08-06 | Proteon Therapeutics, Inc. | Recombinant elastase proteins and methods of manufacturing and use thereof |
| MX2010009850A (es) | 2008-03-18 | 2010-09-30 | Novo Nordisk As | Analogos de insulina acilados y etabilizados contra proteasas. |
| CN102065903B (zh) | 2008-04-01 | 2015-02-18 | 诺沃-诺迪斯克有限公司 | 胰岛素清蛋白缀合物 |
| AU2010223154B2 (en) * | 2009-03-12 | 2014-10-09 | Bigtec Private Limited | A polynucleotide and polypeptide sequence and methods thereof |
| ES2440289T3 (es) | 2009-06-26 | 2014-01-28 | Novo Nordisk A/S | Preparación que comprende insulina, nicotinamida y arginina |
| WO2011064282A1 (en) | 2009-11-25 | 2011-06-03 | Novo Nordisk A/S | Method for making polypeptides |
| ES2543634T3 (es) | 2010-01-22 | 2015-08-20 | Novo Nordisk A/S | Proceso para preparación de FGF-21 con grado de O-glicosilación bajo |
| CN102985440B (zh) | 2010-06-23 | 2016-10-26 | 诺沃-诺迪斯克有限公司 | 包含额外的二硫键的胰岛素衍生物 |
| US8815798B2 (en) | 2010-06-23 | 2014-08-26 | Novo Nordisk A/S | Insulin analogues containing additional disulfide bonds |
| WO2011161083A1 (en) | 2010-06-23 | 2011-12-29 | Novo Nordisk A/S | Human insulin containing additional disulfide bonds |
| EP2651432A1 (de) | 2010-12-14 | 2013-10-23 | Novo Nordisk A/S | Schnellwirkendes insulin in verbindung mit langwirkendem insulin |
| RU2013130374A (ru) | 2010-12-14 | 2015-01-20 | Ново Нордиск А/С | Препарат, содержащий инсулин, никотинамид и аминокислоту |
| JP6058646B2 (ja) | 2011-06-15 | 2017-01-11 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | 多置換インスリン |
| RU2460795C1 (ru) * | 2011-07-06 | 2012-09-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | Способ микробиологического синтеза секретируемого соматотропина человека и штамм дрожжей saccharomyces cerevisiae - продуцент секретируемого соматотропина человека |
| WO2013186138A1 (en) | 2012-06-14 | 2013-12-19 | Novo Nordisk A/S | Preparation comprising insulin, nicotinamide and arginine |
| WO2014088836A1 (en) | 2012-12-03 | 2014-06-12 | Merck Sharp & Dohme Corp. | O-glycosylated carboxy terminal portion (ctp) peptide-based insulin and insulin analogues |
| CN103254277B (zh) | 2013-05-03 | 2017-02-08 | 南京工业大学 | 强分泌性信号肽增强小肽模序及其应用 |
| EP3004156A1 (de) | 2013-06-07 | 2016-04-13 | Novo Nordisk A/S | Verfahren zur herstellung von reifen insulinpolypeptiden |
| PL233560B1 (pl) | 2014-12-05 | 2019-10-31 | Mabion Spolka Akcyjna | Sposób otrzymywania insuliny lub analogu insuliny z prekursora rekombinowanego białka |
| WO2016144658A1 (en) | 2015-03-10 | 2016-09-15 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Process for preparing recombinant insulin using microfiltration |
| US11208452B2 (en) | 2015-06-02 | 2021-12-28 | Novo Nordisk A/S | Insulins with polar recombinant extensions |
| AU2016311283B2 (en) | 2015-08-25 | 2020-10-08 | Novo Nordisk A/S | Novel insulin derivatives and the medical uses hereof |
| JP2018531901A (ja) | 2015-08-25 | 2018-11-01 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | 新規インスリン誘導体及びその医学的使用 |
| CN108368163A (zh) | 2015-08-25 | 2018-08-03 | 诺和诺德股份有限公司 | 新型胰岛素衍生物及其医学用途 |
| KR102043067B1 (ko) * | 2017-08-08 | 2019-11-11 | 엘지전자 주식회사 | 차량용 사이드 미러 및 차량 |
| US10919949B2 (en) | 2017-08-17 | 2021-02-16 | Novo Nordisk A/S | Acylated insulin analogues and uses thereof |
| CN114787184A (zh) | 2019-12-11 | 2022-07-22 | 诺和诺德股份有限公司 | 新型胰岛素类似物及其用途 |
| WO2023144240A1 (en) | 2022-01-26 | 2023-08-03 | Novo Nordisk Research Centre Oxford Limited | Glucose sensitive insulin derivatives and uses thereof |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU5712580A (en) * | 1979-04-05 | 1980-10-09 | James Joseph Connell | Engine charging and scavenging |
| US4546082A (en) * | 1982-06-17 | 1985-10-08 | Regents Of The Univ. Of California | E. coli/Saccharomyces cerevisiae plasmid cloning vector containing the alpha-factor gene for secretion and processing of hybrid proteins |
| JPS60501140A (ja) * | 1983-04-22 | 1985-07-25 | アムジエン | 酵母による外因性ポリペプチドの分泌 |
| US4588684A (en) * | 1983-04-26 | 1986-05-13 | Chiron Corporation | a-Factor and its processing signals |
| DK58285D0 (da) * | 1984-05-30 | 1985-02-08 | Novo Industri As | Peptider samt fremstilling og anvendelse deraf |
| JPS61264000A (ja) * | 1985-03-21 | 1986-11-21 | イミユネツクス コ−ポレイシヨン | 標識ペプチドによるタンパク質の合成 |
| JPS6236183A (ja) * | 1985-06-20 | 1987-02-17 | ザ・サルク・インステイチユ−ト・バイオテクノロジ−／インダストリアル・アソシエイツ・インコ−ポレ−テツド | サツカロミセス・セレビシエからのポリペプチドの発現および分泌 |
| MC1834A1 (fr) * | 1986-07-10 | 1988-06-03 | Transgene Sa | Bloc fonctionnel d'adn et plasmide codant pour l'hirudine,levure transformee,procede de preparation de l'hirudine,hirudine obtenue et son utilisation |
| DK175535B1 (da) * | 1987-03-04 | 2004-11-29 | Daiichi Suntory Pharma Co Ltd | Fremgangsmåde til fremstilling af et fysiologisk aktivt cysteinholdigt peptid |
| JPH03503596A (ja) * | 1987-06-24 | 1991-08-15 | ノボ・ノルディスク エー／エス | 蛋白質若しくはポリペプチドの調製方法、該ポリペプチドをコードするｄｎａ配列、該ｄｎａ配列およびポリペプチドを有する微生物および該ポリペプチドの薬学的製剤としての利用 |
| DK450187D0 (da) * | 1987-08-28 | 1987-08-28 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til fremstilling af proteiner |
| DK463887D0 (da) * | 1987-09-07 | 1987-09-07 | Novo Industri As | Gaerleader |
| JPH01240191A (ja) * | 1988-02-16 | 1989-09-25 | Green Cross Corp:The | 酵母で機能する新規シグナルペプチドおよびこれを用いた異種蛋白質の分泌発現 |
| DK336188D0 (da) * | 1988-06-20 | 1988-06-20 | Nordisk Gentofte | Propeptider |
| HU213571B (en) * | 1988-07-23 | 1997-08-28 | Delta Biotechnology Ltd | Process for producing peptides and dna sequences |
| DK105489D0 (da) * | 1989-03-03 | 1989-03-03 | Novo Nordisk As | Polypeptid |
-
1989
- 1989-03-03 DK DK105489A patent/DK105489D0/da not_active Application Discontinuation
-
1990
- 1990-02-27 ZA ZA901476A patent/ZA901476B/xx unknown
- 1990-03-01 KR KR1019910701029A patent/KR970005928B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-03-01 EP EP90904258A patent/EP0461165B2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-01 CA CA002050336A patent/CA2050336C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-03-01 WO PCT/DK1990/000058 patent/WO1990010075A1/en active IP Right Grant
- 1990-03-01 AT AT90904258T patent/ATE110414T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-03-01 RU SU5010019/13A patent/RU2194758C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1990-03-01 UA UA5010019A patent/UA27706C2/uk unknown
- 1990-03-01 DK DK90904258.2T patent/DK0461165T3/da active
- 1990-03-01 JP JP2504527A patent/JP2609367B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-01 ES ES90904258T patent/ES2062514T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-01 NZ NZ232742A patent/NZ232742A/xx unknown
- 1990-03-01 DE DE69011853T patent/DE69011853T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-01 AU AU52612/90A patent/AU624694B2/en not_active Ceased
- 1990-03-01 HU HU902376A patent/HU215538B/hu not_active IP Right Cessation
- 1990-03-02 DD DD90338353A patent/DD296965A5/de unknown
- 1990-03-02 IE IE74990A patent/IE66469B1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-03-02 IL IL9360990A patent/IL93609A/en not_active IP Right Cessation
- 1990-03-02 PL PL90284146A patent/PL163532B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1990-03-02 CZ CS901039A patent/CZ285239B6/cs not_active IP Right Cessation
-
1991
- 1991-09-02 NO NO913427A patent/NO304236B1/no unknown
- 1991-09-02 FI FI914125A patent/FI104985B/fi not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-02-15 US US08/196,887 patent/US5395922A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-03-02 US US08/397,597 patent/US5514585A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-02 US US08/397,595 patent/US5510249A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-29 HU HU95P/P00592P patent/HU211600A9/hu unknown
-
1997
- 1997-10-23 NO NO974899A patent/NO974899L/no unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DD296965A5 (de) | Hefeverarbeitungssystem | |
| US5631144A (en) | Application of novel DNA fragments as a coding sequence for a signal peptide for the secretion of mature proteins by recombinant yeast, expression cassettes, transformed yeast and corresponding process for the preparation of proteins | |
| EP0602688B1 (de) | Methioninfreier G-CSF aus Prokaryonten | |
| US5726038A (en) | DNA construct encoding the YAP3 signal peptide | |
| DD268976A5 (de) | Verfahren zur Herstellung von Humaninsulinanaloga | |
| DD254212A5 (de) | Verfahren zur herstellung eines hefehybrivectors, der einen oder mehrere DNS-inserts enthalt | |
| DE69434909T3 (de) | Herstellung von humaninsulin | |
| DD273285A5 (de) | Verfahren zur Herstellung von Polyeptiden/Proteinen in wesentlichen mit d en Eigenschaften der Vascular-Antikoagulierenden proteinen und deren Verwendung | |
| EP0347781A2 (de) | Mini-Proinsulin, seine Herstellung und Verwendung | |
| DE60209883T2 (de) | Übersekretierte peptide, deren herstellung, und gleichzeitige verbesserung der sekretierten form eines oder mehrerer anderer polypeptide | |
| DE69735242T2 (de) | N-terminal verlängerte proteine exprimiert in hefe | |
| DE69634757T2 (de) | Vektor zur expression von n-terminal verlängerten proteinen in hefezellen | |
| DE69732583T2 (de) | Verfahren zur Spaltung eines chimeren Proteins mittels eines 'processing'-Enzyms | |
| DE60037508T2 (de) | Verfahren zur herstellung von rekombinantem insulin durch fusionsproteine | |
| DD274053A5 (de) | Verfahren zur Produktion eines menschlichen, einkettigen Plasminogenaktivators | |
| DD284045A5 (de) | Verfahren zur herstellung von desulfarohirudinmutanten | |
| EP0716705B1 (de) | Verfahren zur rekombinanten herstellung von proteinen in der hefe hansenula | |
| DD284044A5 (de) | Verfahren zur herstellung von desulfatohirudinmutanten | |
| DE3735916A1 (de) | Neue polypeptide, ihre herstellung und verwendung | |
| DE3919852A1 (de) | Mini-proinsulin, seine herstellung und verwendung | |
| DE3900626A1 (de) | Hirudin-derivat | |
| DD283839A5 (de) | Verfahren zur herstellung eines hefestammes ohne carboxyteptidase-ysc alpha-aktivitaet | |
| DE3940651A1 (de) | Verfahren zur expression von fremdgenen in hefen | |
| DD290426A5 (de) | Human insulin analoge | |
| DD255170A5 (de) | Verfahren zur Herstellung von proteinen mit Hirudinaktivität |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF04 | In force in the year 2004 |
Expiry date: 20100303 |