KR810001056B1 - 항생물질 c-15003의 제조법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

항생물질 C-15003의 제조법

본 발명은 신규 항생물질 C-15003의 제조법에 관한 것이다.

본 발명자들은 다종류의 토양등의 시료를 채취해서, 그것으로부터 분리되는 미생물에 대하여, 그 생산되는 항생물질을 검색하고, 어느 종류의 미생물이 신규한 항생물질을 생산하는 것, 이 생산물은 노칼디아속에 속하는 것, 이 미생물을 적의의 영양배지로 배양하는 것에 의해 이 항생물질을 배양물줄에 축적시킬 수 있는 것을 알게되어, 또 얻어진 이 항생물질에서 유도체를 얻는 것을 알아서, ej욱 연구한 결과, 본 발명을 완성하였다. 즉, 본 발명은 다음 일반식(I)으로 표시되는 노칼디아속에 속하는 항생물질 C-15003 생성균을 배지에 배양하고, 배양물중에 항생물질 C-15003을 생성 축적시키고, 이것을 채취하는 것을 특징으로 하는 항생물질 C-15003의 제조법이다.

본 발명에 있어서는, ＂항생물질 C-15003＂이라 함은 상기 일반식(I)에서 표시되는 3개의 화합물의 총칭, 2개 또는 3개의 혼합물 또는 각각의 단일화합물을 지칭하기로 한다.

또, 일반식(I)에 있어서 R이

의 화합물을 ＂항생물질 C-15003 P-3＂ 혹은 ＂C-15003 P-3＂라고 하고, R이 -CO-CH₂-CH₂CH₃의 화합물을 ＂항생물질 C-15003 P-3'＂ 혹은 단지 ＂C-15003 P-3'＂라 하고, R이

의 화합물을 ＂항생물질 C-15003 P-4＂ 혹은 단지 ＂C-15003 P-4＂라고, 각각 칭하는 것으로 한다.

본 발명의 항생물질 C-15003을 생산하는 균으로서는, 예를 들면 본 발명자들이 항생물질 생산균의 탐색중에 토양등으로부터 분리된 방선균(放線菌) No. C-15003주(株) 등을 들 수 있다.

No. C-15003주의 균학적 제성질을 시어링 및 고트리브의 방법[인터내쇼날 저널 오브 시스테매틱 박테리오르지(Inter national Journal of Systematic Bacteriology), 제16권, 313면~340면, 1966]에 준해서 검사하고, 28℃로 21일간에 걸쳐서 관찰한 결과는 다음과 같다.

1) 형태적 특성

기생균사(基生菌사)는 한천배지상 및 액체배지중 다 같이 잘 신장되고, 분지(分枝)한다.

그 직결의 대분분은 0.8~1.2㎛이고, 때로는 간균상 또는 분지된 짧은 균사상으로 분단하는 일이 있다.

여러가지의 분류용 배지상에서 잘 생육되고, 기균사는 기생균 사상에 발육하지만 속상체(50~200㎛×200~1000㎛)를 형성하고, 이들의 위에 발육하는 일이 많다.

기균사의 형상의 대부분은 굴곡상태 또는 직선상태를 나타내고, 간혹 완만한 나선형상을 나타내는 것도 볼 수 있다.

성숙된 배양을 검경하면 포자가 연쇄상태로 되어 있다고 생각되는 것은 적으며, 이들의 배양표면에서 채취한 균현탁액 대하여 검경한 바, 장타원형(0.8~1.2㎛×4.8~6.8㎛) 및 타원형(0.8~1.2×1.0~2.0㎛)의 분절포자 모양의 것이 많이 관찰되고, 전자현미경에 의한 관찰에서는 그 표면은 평활하였다.

2) 균체 조성

본 균주를 I.S.P No.1의 개변배지(改變培地) 중에서 28℃, 66~90시간 진탕배양해서, 균체를 모아서, 세척하였다.

상기 균체를 비ㆍ백커들의 방법[애프라이드, 마이크로바이오로지(Applied Microbiology), 12권, 421면, 1964년] 및 엠ㆍ비레취바리어의 방법[저널ㆍ오브ㆍ라보레이토리ㆍ앤드ㆍ크리니칼ㆍ메디신(Journal of Laboratory and Clinical Medicine) 71권, 934면, 1968년]에 따라서 균체세포중의 디아미노피멜산 및 당조성을 검사한 결과, 전자는 메소체(meso-torm)인것, 후자는 갈락토스 및 아라비노오체에 상당하는 점적의 존재가 확인되었다.

3) 분류용배지상의 제성질

본 균주는 각종 배지상에서, 어느 것이나 비교적 잘 발육하고, 그 기생균사는 배양초기 무색 내지 담황색으로, 그 후, 담황갈색 또는 황갈색을 나타낸다.

또 여러가지의 분류용 배지중에 황색 내지 황갈색의 가용성 색소를 생성한다.

기균사는 분체상으로, 일반적으로는 중간정도로 발육하고, 백색 내지 황색 또는 담황갈색을 나타낸다.

본 균주의 각종 분류용 배지상에 있어서의 제성질과 상태는 제1표에 표시한 바와 같다.

표 1 No. C-15003주의 분류용 배지상의 제성질

(가) 자당(蔗糖)ㆍ질간염 한천배지

생육(G) : 풍부, 황색(3ia)※ 내지 담황갈색(3lc)※, 속상체(束狀體) 형성

기균사(AM) : 빈약, 백색

가용성색소(SP) : 없거나 또는 미황갈색

(나) 글리세롤 ㆍ질산염 한천배지

G : 중 정도, 담황색(2ca)※, 속상체 형성

AM : 중 정도, 백색

SP : 없 음

(다) 포도당ㆍ아스파라진 한천배지

G : 중 정도, 담명황색(2pa)※, 속상체 형성※

AM : 빈약, 백색

SP : 명황색(2pa)※

(라) 글리세롤ㆍ아스파라진 한천배지

G : 중 정도, 담황색(2ca)※, 속상체 형성

AM : 빈약, 백색

SP : 없 음

(마) 전분 한천배지

G : 중 정도, 담황색(2ca) 내지 담황갈색(2ea)※, 속상체 형성

AM : 풍부, 담황색(2ca)※

SP : 없 음

(바) 영양 한천배지

G : 중 정도, 담황색(2ca)※, 내지 황색(2ga)※, 속상체 형성

AM : 빈약, 백색

SP : 없 음

(사) 능금산칼슘 한천배지

G : 중 정도, 담황색(2ca)※, 내지 담황갈색(2ea)※, 속상체 형성

AM : 중 정도, 백색 내지 담황색(2ca)※

SP : 없 음

(아) 효모추출물ㆍ맥아추출물 한천배지

G : 중 정도, 담황갈색(3lc)※, 내지 명갈색(3la)※, 속상체 형성

AM : 중 정도, 백색 내지 담황색(2ca)※

SP : 없 음

(자) 오우트미일 한천배지

G : 중 정도, 담황색(2ca)※, 내지 황색(2ga)※, 속상체 형성

AM : 빈약, 백색 내지 담황색

SP : 없 음

(차) 펩톤ㆍ효모추출물ㆍ철(鐵) 한천배지

G : 중 정도, 황색(2ga)※

AM : 없 음

SP : 황색(2ga)※

(카) 티로신 한천배지

G : 중 정도, 담황색(2ca)※, 내지 황색(3ea)※, 속상체 형성

AM : 중 정도, 백색 내지 담황색(2ca)※

SP : 황갈색(3ie)※

※ 컬러ㆍ하아모니ㆍ매뉴얼ㆍ제4판,(콘테이너ㆍ코오포레이션ㆍ오브어메리카, 1958년 발행)에 의한 색명기호

4) 생리적 성질

본 균주의 생리적 성질은 표 2에 표시한 바와 같다.

즉, 생육온도범위는 12℃ 내지 38℃, 또 한천배지(ISP No.2) 상에서 기균사가 잘 착생되는 온도범위는 20℃ 내지 35℃이다.

표 2 No. C-15003주의 생리적 성장

생육 온도 범위 : 12℃~38℃ 질산 염환 원능 : 양 성

기균사 착생온도 : 20℃~35℃ 밀크ㆍ펩톤화 : 양 성

젤라틴 액화 : 양 성 밀크ㆍ응고 : 음 성

전분 가수 분해 : 양 성 카제인분해능 : 양 성

멜라닌 모양의 색소형성(펩톤ㆍ효모추출물 철 한천배지) : 음성,

(티로신 한천배지) : 양 성 히포크산틴 분해능 : 음 성

티로신 분해능 : 양 성 리소자임 내성 : 양 성

크산틴 분해능 : 음 성 식염 내성 : 2％

5) 각종 탄소원의 이용성

프리담 및 고트리브의 방법[저널ㆍ오브ㆍ박테리오로지(Journal of Bactoriology) 56권, 107면 1948년]에 기재되어 있는 배지 및 이것에 효모추출물(박토 : Bacto)를 0.1％ 첨가한 기초배지를 사용하여, 각종 탄소원의 이용성을 검사하고, 이들의 결과를 표 3에 표시하였다.

표 3 No. C-15003주의 탄소원 이용성

※ 효모추출물 0.1％ 첨가 기초배지

주

: 풍부한 발육 ±: 약간 발육함

: 비교적 양호한 발육 - : 발육하지 않음

+ : 발육을 인정함

6) 기타의 제성질

전술 2)에 표시한 방법으로 균체를 모으고, 이들과 제이ㆍ마아마아들의 방법[저널 오브 모레큐라 바이오로지(Journal of Molecular Biology) 3권, 208면, 1961년]에 준하여 DNA를 조제하고, DNA의 G-C 함량을 검사하였더니 약 71몰％이었다.

본 균주의 영양균사를 그램 염색하였더니 양성이었다.

이상 설명한 No. C-15003주의 제성질을 에스ㆍ에이ㆍ왁스맨 저, 더ㆍ악티노미세트스(The Actinomycetes), 제2권, 더ㆍ윌리엄스ㆍ앤드윌킨스ㆍ캄파니 발행, 1961년, 알ㆍ이ㆍ부파난ㆍ앤드ㆍ엔ㆍ이ㆍ기본스편, 버지스ㆍ매뉴얼ㆍ오브ㆍ데이터미내티브ㆍ박테리오로지(Bergey's Manuol of Determinatve Bocterolog) 제8판, 1974년 및 기타의 문헌에 따라서 검색하였다.

본 균주는 노칼디아(Nocerdia) 속의 그룹 III에 속하는 것으로 생각되나, 이미 알려진 균주중에는 상기 제 성질을 갖는 종류는 발견되지 않고, 신균종으로 인정되었다.

본 균주 No. C-15003주는, 일본국 공업기술원 미생물 공업기술 연구소에 신청서 접수번호 제3992호로, 또 일본국 재단법인 발효연구소에 IFO-13726으로서, 각각 기탁되어 있다.

이상 설명한 바와 같이 No. C-15003주는 노칼디아속의 신종이지만, 미생물의 일반적 성질로서 자연적으로 또는 변이제에 의해서 변이를 일으킬 수 있다.

예를 들면 X선, 감마선, 자외선 등의 방사선의 조사, 단포자분리, 여러가지의 약제를 함유하는 배지상에서의 배양, 기타의 수단으로 변이 시켜서 얻어지는 많은 변이주, 혹은 자연적으로 얻어지는 돌연변이주 등이었어도, 상기한 균학적 성질상태 또는 다음에 표시한 바와같은 균학적 성질상태와의 비교에 있어서 실질적으로 별종으로 하는데 지나지 않으며, 더욱이 C-15003주 P-3, P-3' 및(또는) P-4를 생산하는 성질을 갖는 것은 모두 본 발명의 방법에 이용할 수 있다.

예를 들면 C-15003주를 여러가지로 변이 처리하므로서, 가용성 색소를 거의 생성하지 않는 것, 기생균사가 무색인 것, 황녹색의 것, 적갈색 내지 등적색을 나타내는 것, 균사가 간균상 또는 분지된 짧은 균사로 분단되기 쉬운것 및 기균사가 많고 백색 또는 기균사를 거의 착생하지 않는 변이주가 얻어지고 있다.

항생물질 C-15003 생산균의 배양에 사용되는 배지는 이 균주가 이용할 수 있는 영양원을 함유하는 것이면, 액체상이거나 고체상이라도 되나, 대량을 처리할때에는 액체배지를 사용하는 것이 보다 적당하다. 배지에는 C-15003주가 등화될 수 있는 탄소원, 소회될 수 있는 질소원, 무기물질, 미량영양소 등이 적의 배합된다.

탄소원으로서는, 예를 들면 포도당, 유당, 자당, 맥아당, 덱스트린, 전분, 글리세롤, 만니톨, 솔비톨등, 유지류(예, 대두유, 라아드유, 치킨유 등) 기타가, 진소원으로서는 예를 들면 고기추출물, 효모추출물, 건조효모, 대두분, 옥수수침지액, 펩톤, 면실분, 당밀, 요소, 암모늄염류(예, 황산암모늄, 염화암모늄, 질산암모늄, 아세트산암모늄 등) 기타가 사용된다.

또한 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등을 함유한 염류, 철, 망간, 아연, 코발트, 니켈 등의 금속염류, 인산, 붕산 등의 염류나 아세트산, 프로피온산 등의 유기산의 염류가 적의 사용된다.

기타, 아미노산(예, 글루타민산, 아스파라긴산, 아라닌, 글리신, 리신, 메티오닌, 프로린 등), 펩티드(예, 디펩티드, 트리펩티드 등), 비타민류(예, B₁, B₂, 니코틴산, B₁₂, Vc, E 등), 헥산류(예, 푸린, 피리미딘 및 그의 유도체) 등을 함유시켜도 된다.

물론 배지의 pH를 조절하는 목적으로 무기 또는 유기의 산, 알칼리류, 완충제 등을 가하고, 혹은 소포의 목적으로 유지류, 표면환성제 등의 적량을 첨가하여도 된다.

배양의 수단은 정치배양이나, 진동 배양 혹은 통기교반배양법 등의 수단을 이용하여도 된다.

대량의 처리에는, 소위 심부통기교반 배양에 의하는 것이 바람직한 것은 말할 것도 없다.

배양의 조건은 배지의 상태, 조성, 균주의 종류, 배양의 수단 등에 따라서 일정하지 않는 것은 당연하지만, 이들은 통상 20℃~35℃의 온도에서, 초발 pH를 중성부근에 선택하는 것이 좋다.

그중에서도, 배양중기의 온도는 23℃~30℃, 또 초발 pH는 6.5~7.5의 조건이 바람직하다.

배양기간도 상기의 제조건에 따라 일정하지 않으나, 소망하는 항생물질 농도가 최대로 될때까지 배양하는 것이 좋다.

이에 요하는 시간은 액체배지를 사용하는 진동배양 또는 통기교반 배양의 경우는 2~6일간 정도이다.

이들 항생물질의 역가측정은 테트라피메나ㆍ피리포미스 W주(tetraphymena pyriformisw)를 시험미생물로서 검정배지[트리프로스·펩톤(디프코사 제) 20g, 효모추출물(디프코사 제) 1g, 포도당 2g, 증류수 1000ml 및 1몰 인산완충액 pH 7.0, 10ml]를 사용하여 28℃로 44시간 내지 48시간 배양하고, 그 생육을 탁도로 측정하는 액체회석검정법 및 다음에 표시하는 박층 크로마토그라피법(이하 TLC라고 칭함)에 의해 측정하였다. 이와 같이 하여 배양된 배양물중에 신규 항생물질 C-15003 P-3, P-3' 및(또는) P-4가 생산축적되어, 이들은 여과액 및 균체추출액의 어느 것에도 함유된다.

또 이들의 물질은 TLC법에 의해 검색되었다.

즉, 배양물을 여과 또는 원심분리로 균체와 여과액으로 나누고, 여과액은 그대로 여과액과 같은 양의 아세트산에틸로 추출한다.

균체에는 여과액과 같은 양의 70％ 아세톤수를 가하여 20℃로 1시간 교반하여 여과한다.

여과액중의 아세톤을 유거하여 얻어진 여과액을 아세트산에틸(ethylacetate)로 추출한다.

각기의 추출액의 100배 농축한 액을 실리카겔 유리판(서독 멜코사, 키셀겔 60F₂₅₄0.25mm, 20×20)를 담체로 한 박층크로마토그라피(TLC)에 붙여(용매 : 클로로포름ㆍ메타놀= 9 : 1) 자외선 2537Å를 조사하여 검출되는 흡수상의 강도로부터 측정된다.

배양물중에 생산된 C-15003 P-3, P-3' 및(또는) P-4를 채취하려면 본 물질균이 중성지용성이기 때문에, 이러한 미생물 대사물을 채취하기 위해서 통상 사용되는 분리정제의 방법이 적의 이용된다.

예를 들면 불순물과의 용해도의 차를 이용하는 수단, 환성탄, 마크로 다공성 비 이온계수지, 실리카겔 알루미나 등 각종의 흡착제의 흡착친화력의 차를 이용하는 수단, 이온교환수지에 의한 불순물의 제거수단의 어느 것이나 각각 단독으로, 또는 조합해서, 혹은 반복하여 이용된다. 상기와 같이 C-15003 P-3, P-3' 및 P-4는 배양여과액과 균체의 쌍방에 함유되어 있으므로, 이들의 흡착제를 사용할 경우, 배양 여과액에서는 직접 혹은 용매추출후, 균체에서는 용매추출후 흡착제에 흡착시켜 분리 정제한다.

용애로 추출하는 경우에는 (1) 균체를 분리하지 않는 전 배양물에서 용매추출 하거나, 혹은 (2) 여과 또는 원심분리 등으로 분리한 균체 및 배양여과액의 각기에서 용매추출하는 등 방법으로도 사용할 수 있다.

여과액과 균체를 개별적으로 추출하는 경우에는, 다음의 방법으로 실시하는 것이 유리하다.

여과액으로부터의 추출에 적당한 용매로서는 물과 혼합되지 않는 유기용매, 예를 들면 아세트산에틸, 아세트산아밀(amyleacetate) 등의 지방산에스테르, 부타놀 등의 알코올류, 클로로포름 등의 할로겐화탄화수소, 메틸이소부틸케톤 등의 케톤류가 사용된다.

추출은 중성부근에서 행하여지며, 바람직하게는 pH 7%로 조정된 배양 여과액으로부터 아세트산에틸을 사용하여 행하여진다.

추출액을 수세후 감압하에 농축하고, 석유에테르, n-헥산과 같은 비극성 용매를 가해서 유효성분을 함유하는 조물질 I을 채취한다.

이 속에는 TLC 위에서 C-15003 이외의 다수의 점적에 감지되기 때문에 단계적으로 다음의 정제공정이 이용된다.

즉, 통상 사용되는 정체법으로서 여러가지의 흡착크로마토그래피가 효과가 있으며, 흡착제로서는, 일반적으로 사용되는 담체, 예를 들면 실리카겔, 알루미나, 마크로다공성, 비이온계 흡착수지 등이 사용할 수 있으나, 조물질 I에서의 정제에는 실리카겔이 가장 유효하게 이용되고, 비극성용매, 예를 들면, 석유에테르 n-헥산으로부터 전개를 시작하여, 아세트산에틸, 아세톤,에타놀, 메타놀과 같은 극성용매를 첨가하므로서 항생물질 C-15003의 용출을 행한다.

그 일례를 설명하면 실리카겔(서독 멜크 0.05~0.2mm)을 담체로 하고, n-헥산, 아세트산에틸의 혼합비를 순차 증가하면서 컬럼크로마토그래피를 행하고, 용출액을 TLC로 조사하여 C-15003을 함유하는 부분을 모아서, 감압농축하여 석유에테르 또는 n-헥산을 가해 조물질 II를 얻는다.

그 속에는 아직 다른 불순물을 함유하기 때문에, 다음의 정제를 행한다.

예를 들면 용매계를 바꾼 제2의 실리카겔 컬럼에 의해 정제한다.

이 경우의 전개용매에는, 디클로로메탄, 클로로포름과 같은 함 할로겐탄화수소류에서 전개를 시작하고, 에타놀, 메타놀과 같은 알코올류, 아세톤, 메틸에틸케톤과 같은 케톤류 등 극성용매를 첨가하므로서 항생 물질 C-15003을 분리 채취한다.

제1, 제2의 실리카겔 컬럼의 용매계의 조합에는, 전후를 반대로 하여도 가능하며, 기타 통상 사용되는 유기용매가 적의 조합된다. 조물질 II의 정제수단으로서, 마크로다공성 흡착성수지를 사용할때 항생물질 C-15003을 용출하려면, 저급알코올류, 혹은 저급케톤류, 에스테르유와 물과의 혼합물을 사용한다.

저급 알코올류로서는, 예를 들면 메탄놀, 에타놀, 프로파놀, 부타놀 등, 저급 케톤류로서는, 예를 들면 아세톤, 메틸에틸케톤, 에스테르류로서는, 아세트산에틸 등이 이용될 수 있다.

그 일례를 설명하면 60％ 메탄놀수에 조물질 II를 녹여서, 다이아이온 HO-10(미쓰비시가세이) 컬럼에 통과시켜서 흡착시키고, 70％ 메탄놀수로 세정후 90％ 메타놀수로 용출하면 목적물 항생물질 C-15003이 용출된다.

어느 쪽의 방법이라도,얻어진 항생물질 C-15003의 부분을 감압농축하고, 건조물에 대하여 5~8배량의 아세트산에틸을 가해 방치하면, 항생물질 C-15003의 결정이 석출한다.

이 결정중에는 C-15003 P-3, P-3' 및 P-4가 함유되고, 다음에 이들은 다시 상기의 흡착제를 이용하여 분리된다.

즉, 실리카겔 또는 마크로다공성 비이온성 흡착수지를 사용하여, 각각 전술한 용매에 의해 분리 용출하는 것이 가능하며, 예를 들면 실리카겔을 사용할때는 n-헥산, 아세트산에틸계 또는 클로로포름 메탄놀계의 용매로 전개하고, C-15003 P-4, P-3', P-3의 순으로 용출되므로, 각각 TLC에 의해 검출후, C-15003 P-4, P-3', P-3 구분을 감압 농축하고, 아세트산에틸을 가해서 각기의 결정을 얻을 수 있다.

또, 마크로다공성 비이온계 흡착수지를 사용할때는, 알코올류, 케톤류, 에스테르류와 물과의 혼합비를 바꾸는 경사용출법, 예를 들면 5％ 식염을 함유한 60％ 메타놀수와 95％ 메타놀수를 사용한 경사용출법을 사용하면 C-15003 P-3, P-3' P-4의 순서로 용출되어, 각 구분을 각각 TLC에 의해 검출후 감압 농축하고, 아세트산에틸로부터 결정으로서 단리 채취된다.

이들의 결정은 아세트산에틸을 결정용매로 하여 함유하기 때문에, 70℃, 감압하에 5산화린 위에서 8시간 건조후 측정되는 물리화학적 성상은 다음과 같다. (표 4)

[표 4]

상술과 같이 분자식과, 후술하는 항미생물환성 및 항종양활성 등에서 이미 알려진 항생물질군과 비교하였으나, 본 항생물질 C-15003과 같은 그룹은 확인되지 않았다.

그러나 식물성분 기타 천연 유기화합물 군에서, 마찬가지인 자외선 흡수를 나타내는 물질을 검색한 바, 메이타나신그룹을 들 수 있고, 특히 분자식에서 질소 2개를 함유하는 메이타나신 그룹인 것이 추정된다.

메이타나신은 식물성분으로서 얻어지며, 그 구조는 (I')에 표시되고, 저널ㆍ오브ㆍ어메리탄ㆍ케미칼ㆍ소사이티(Journal of American Chemical Society), 97권, 5294면, (1975)에 보고되어 있다.

또 메이타나신의 질량스펙트럼의 데이터는 다음과 같이 표시된다.

C-15003 P-3, P-3', P-4에서도 마찬가지로 m/e 485, 470, 450이 확인되므로서 기본골격은 메이타나신과 같으나, 3위의 아실기의 상이한 것임이 용이하게 추정되며, 항생물질 C-15003-신규화합물인 것을 알 수 있다.

C-15003 P-3, P-3', P-4를 각각 알칼리 분해에 붙이고, 생성되는 칼본산을 가스크로마토그래피로 조사하면 C-15003 P-3에서는 이소부틸산, C-15003 P-3' 에서는 노말부틸산, C-15003 P-4에서는 이소발레릭산이 얻어졌다. 이상의 데이터에서 C-15003 P-3, P-3', P-4의 추정구조는 (I')에 표시된다.

생물환성

A) 항 미생물 환성

트립티케이스 소이 한천배지(BBl제)를 검정배지로 하여, 다음에 표시한 미생물에 대한 발육저지기능을 페이퍼ㆍ디스크법으로 검사하였다.

즉, 다음 미생물 함균평판배지 상에서 C-15003 P-3, P-3' 및 P-4의 300㎛/ml의 용액의 0.02ml를 페이퍼ㆍ디스크(도오요오제작소제품, 박형 직경 8mm)에 함침시킨 것에 의해 생육저지능을 검사하였다.

그결과, 다음 미생물에 대하여는 활성을 나타내지 않았다. 대장균, 프로테우스, 불가리스, 프로테우스, 미라비리스, 슈드모나스, 에어루기노사, 황색포도구균, 고초균, 바틸루스, 세리우스, 폐염간균, 세라티어멜세스센스, 마이코박테륨ㆍ아비움,

한편, 검정배지 제2[인산 나트륨 3.5g, 제일 인산칼륨 0.5g, 효모추출물(디프코) 5g, 글루코오스 10g, 한천 15g, 증류수 1000ml, pH7.0]의 한천평판을 사용하여, 타라로마이세스ㆍ아벨라네우스(Talaromyses avellaneus)를 시험균으로 하여 그 생육능을 검사하면 C-15003 P-3 및 P-3' 는 3㎍/ml, C-15003 P-4는 1.5㎍/ml에서 생육저지력을 나타낸다.

또, 테트라피메나ㆍ피리포어미스 W주를 시험미생물로 해서, 검정배지[트리프토오스 펩톤(디프코) 20g, 효모추출물 1g, 글루코오스 2g, 증류수 1000ml, pH7.0인 1몰 인산완충액 10ml]를 사용하여, 28℃로 44시간 내지 48시간 배양하여, 액체희석검정법에 의해 이 항생물질의 이 미생물발유저지능을 검사하였다.

그 결과, C-15003 P-3 및 P-3' 는 1㎍/ml, 또는 C-15003 P-4는 0.5㎍/ml에서 이 미생물의 발육을 저지한다는 것을 확인하였다.

B) 항 종양활성

종양세포 P 338(1×10⁶세포/마리, 마우스, 복강이식)에 대한 C-15003 P-3 P-3'및 C-15003 P-4의 치료효과(9일간 연속복강내투여)를 조사하였다.

그 결과 이들의 물질에 의한 마우스의 연명율은 대조에 비해, 0.00625mg/kg/일 투여로 200％ 나타내는 항종양작용이 확인 되었다.

C) 독 성

마우스를 공시동물로 한 급성 독성시험에서, C-15003 P-3 P-3' 및 C-15003 P-4를 복강주사한 경우, 이 항생물질은 모두 LD100치가 0.625mg/kg, 또 LD50치는 0.313mg/kg 이상 이었다.

상기한 바와 같이 본 항생물질 C-15003은, 사상균 및 원충에 대해, 강한 발육저지능을 갖고 있으므로 항진균제 또는 항원충제로서도 유용한 것이다.

또, 항생물질 C-15003은, 종양을 가진 포유동물(예, 마우스 등) 에 대해 연명효과를 나타내므로, 항종양제로서도 유용한 것으로 기대된다.

본 항생물질 C-15003을 항진균제 및 항원충제로서 사용하려면, 예를 들어 토양, 활성오니 또는 동물체액 등의 세균상태를 검사할 때 유리하게 사용할 수 있다.

즉, 토양으로부터 유용한 세균류를 분리할 경우, 또는 폐수처리에 사용되고 있는 활성오니법의 운전, 해석에 원충 또는 곰팡이 이외의 세균류의 작용을 검사할 경우, 시료중에 생존하는 곰팡이 또는 원충을 발육시키지 않고, 세균상태를 선택적으로 발육시킬 수가 있다.

구체적으로는 피검시료를 액체 또는 고체배지에 첨가하고, 그 배지 1ml당 본 항생물질 10~100㎍/ml의 1% 메탄놀 함유 수용액을 0.1ml 첨가하여, 배양한다.

이상 C-15003 P-3, P-3', C-15003 P-4는 신규화합물로서, 이것은 어느 것이나 동일골격을 가지고 있으며, 또한 유용한 의약용 화합물의 중간원료로서도 이용된다.

즉, 탈 아실반응에 의해, 3위가 수산기인 C-15003 P-0(메이탄시노올)을 얻을 수가 있다.

이 경우 아실기의 위치가 카르보닐 위의

위에 있기 때문에, 통상 사용되는 환원적가수분해 반응이 유리하게 이용된다.

즉, 저온시(예, -20~0℃)에 착 금속수소화합물[예, 리튬수소화 알루미늄(LiAlH₄)]을 사용하여, 다른 관능기, 예를 들면 카르보닐기, 에폭시기, 탄소-탄소간 이중결합등에 영향을 주지않고, 3위의 0-에스테르결합을 가수분해하므로서 메이탄시노올을 얻을 수가 있다.

여기서 얻어진 메이탄시노올의 물리학적 성질은 Kvpchan들의 기재와 잘 일치된다. [저널ㆍ오브ㆍ어메니칸ㆍ케미칼ㆍ소사이트 97권, 5294~9295면(1975년)참조]

[실시예 1]

효모추출-물맥아효모추출물 사면 한천배지에 배양한 노칼디아 No. C-15003(IFO 13726, 일본국 미생물 공업연구소 신청서 접수번호 제3992호)을, 200ml들이 3각 플라스크내의, 글루코오스 2％, 가용성전분 3％, 생대두분 1％, 옥수수침지액 1％, 폴리펩톤 0.5％, NaCl 0.3％, CaCo₃0.5％, pH 7.0을 함유한 40ml의 종배지의 접종하고, 28℃로, 48시간 회전진동기 위에서 배양하고, 종배양액을 얻었다.

얻어진 종배양액의 0.5ml를 200ml들이 3각 플라스코내의 덱스트린 5％, 옥수수침지액 3％, 폴리펩톤 0.1％, CaCo₃0.5％, pH 7.0을 함유한 40ml의 주배지에 이식하고, 38℃로, 90시간 회전진동기 위에 배양하였다.

이 배양액은 테트라피메나ㆍ필리폴미스 W를 검정균으로 하고, 항생물질 C-1003 P-3을 표준품으로 하여 액체희석법으로 검정하면 25㎍/ml의 생간역가를 나타냈다.

[실시예 2]

실시예 1에서 얻은 종배양액의 10ml를 종배지 500ml를 함유한 2

들이 사카구찌((坂口)플라스코에 이식하고, 28℃로, 48시간 왕복진동기 위에서 배양하였다.

이 배양액 500ml를 종배지 30

를 함유한 50

들이 스테인레스스틸 탱크에 이식하고, 28℃, 통기 30

/분, 교반 200회전/분(1/2DT) 내압 1kg/㎠의 조건으로 48시간 배양해서 종배양액을 얻었다.

얻어진 종배양액을 이식율 10％로 실시예 1에 표시한 것과 마찬가지의 주배지 100

를 함유한 200

들이 스테인레스스틸 탱크에 이식하고, 28℃, 통기 100

/분, 교반 200회전/분(1/2DT) 내압 1kg/㎠의 조건으로 배양하였다.

얻어진 배양액은 실시예 1과 마찬가지의 검정법으로 25㎍/ml의 생산역가를 나타냈다.

[실시예 3]

실시예 2에서 얻어진 배양액 95

에 하이프로 수퍼 셀(미국, 존스만빌 푸로덕트사) 2kg를 가해 잘 교반한다.

혼합물을 가압식 여과기로 여과하고 여과액 85

및 습균체 32kg을 얻는다.

여과액 85

에 아세트산에틸 30

를 가해 교반추출하고, 이 조작을 2회 반복한다.

아세트산에틸층을합해서 물 30

씩으로 2회 수세하고 무수황산나트륨 500

을 가해서 건조후 200ml까지 감압농축하고 석유에테르를 가해, 석출되는 첨진을 여취한다.(53g)

얻어진 조물질 I에 아세트산에틸 100ml를 가해 교반하고, 불용물을 여거하고 여과액에 실리카겔(서독 Merck사 0.05~0.2mm) 10g을 가해서 교반한후, 아세트산에테르를 감압하에 유거하고, 미리 준비한 실리카겔컬럼(400ml)의 상단에 두고 n-헥산 500ml, n-헥산ㆍ아세트산에틸(3 : 1) 500ml, n-헥산·아세트산에틸(1 : 1) 500ml, n-헥산·아세트산에틸(1 : 3) 500ml, 아세트산에틸 500ml, 아세트산에틸ㆍ메타놀(50 : 1) 1

를 붓고 용출액을 100ml씩 구분한다.

각 부분의 1ml씩을 농축 건조하고, 0.1ml의 아세트산에틸을 가해, 실리카겔 유리판(서독 Merck사 키셀겔 60F254 0.2mm 20×20)의 하단에서 2.5cm의 위치에 점적하고, 전개용매, 아세트산에틸ㆍ메타놀(19 : 1)로 약 17cm 전개된다.

전개후 자외선(2537Å)하에서 흡수상을 조사하고, Rf 0.6~0.65 부근에 흡수가 있는 부분 No. 23~28까지를 모아 약 20ml까지 감압농축한다.

농축액에 석유에테르 150ml를 가해 조물질 II을 15g 얻는다.

[실시예 4]

실시예 3에서 얻어진 균체 32kg에 70％ 아세포수 50ℓ를 가해 3시간 교반추출후, 가압식 여과기로 여과한다.

재차 70％ 아세톤수 50ℓ로 추출을 반복하고, 마찬가지로 여과하여 얻어진 여과액을 합치고, 감압농축에 의해 아세톤을 유거한다.

얻어진 수성액을, 다이아이온 HP-10(미쓰비시가세이) 5ℓ의 컬럼에 흘려 보내고, 20ℓ의 물과 50％ 메타놀수로 세척후, 15

의 90％ 메탄놀수로 용출한다. 용출액을 3ℓ까지 감압 농축하고, 물 3ℓ, 아세트산 에틸 3ℓ을 가해 흔들어 섞고, 이 조작을 2회 반복한다.

아세트산에틸층을 합쳐 수세한 무수황산나트륨을 가해 건조후, 200ml까지 감압 농축하고, 석유에테르를 가해서 석출되는 침전을 여취한다. (28g)

얻어진 조물질은 실시예 3과 마찬가지 방법으로 실리카겔컬럼에 의해 정제하고, 조물질 II 8.0g을 얻는다.

[실시예 5]

실시예 3에서 얻은 조물질 II 1.5g을 아세트산에틸 10ml에 용해하고, 실리카겔(서독 Merck사 0.05~0.2mm) 4g을 가해 잘 교반한 후, 아세트산에틸을 감압하에 유거한다.

미리 준비한 실리카겔 컬럼 300ml의 상단에 두고, 클로로포름 500ml로 세척후, 클로로포름ㆍ메타놀(50 : 1) 500ml, 클로로포름ㆍ메타놀(20 : 1), 500ml, 클로로포름ㆍ메타놀(10 : 1) 500ml로 용출한다. 용출액은, 25ml씩 구분하고, 각 부분의 0.5ml를 감압 농축하여 0.05ml의 아세트산에틸을 가해, 이것을 표본으로 하여, 박층 크로마토그래피에 붙인다. (전개용매 : 클로로포름ㆍ메탄놀(9 : 1), Rf 0.05~0.60에 2537Å)에서 흡수상을 나타내는 부분 No. 39.40을 감압 농축 건조하여 아세트산에틸 2ml를 가해 방치하면 항생물질 C-15003의 결정이 얻어진다.

위에서 얻어진 항생물질 C-15003결정 150mg을 메타놀 15ml에 녹이고, 이것에 식염 300ml, 물 15ml를 가해서 용해한다.

다이아이온 HP-10(미쓰비시가세이) 200ml를 직경 1.8cm의 컬럼에 채워 5％ 식염을 함유한 50％ 메탄놀수 600ml를 흘려서 조성한다.

앞서 준비한 표본용액을 흘려보낸후 5％ 식염을 함유한 60％ 메타놀수 300ml를 흘려보낸후 5％ 식염을 함유한 60％ 메타놀수 1.5

와 95％ 메타놀수 1.5ℓ와의 사이에서 경사용출을 행한다.

용출액은 15ml씩 구분하고 각 부분을 실리카겔의 박층크로마토그래피에 붙여서 검출한다.

부분 145~153에서 C-15003 P-3, 부분 167~180에서 C-15003 P-3'와 P-4, 부분 185~190에서 C-15003 P-4가 용출된다.

각기를 모아서 농축하고 물 50ml, 아세트산에틸 100ml를 가해 용해하고 분액깔대기에 넣고, 흔들어 혼합한 후 물층을 분리해서, 물 50ml로 2회 수세후, 아세트산에틸층을 무수황산나트륨으로 건조, 농축하여 방치하면 각기의 결정이 석출된다.

결정을 여취 건조한다.

C-15003 P-3 70mg

C-15003 P-3', P-4 18mg

C-15003 P-4 15mg

C-15003 P-3', P-4 혼합결정 18mg을 아세트산에틸 0.3ml에 용해하고, 실리카겔 유리판(서독 Merck사 키셀겔 60F₂₅₄0.25mm 20×20) 3판의 하단에서 2.5cm의 위치에 직선상으로 도포하고 아세트산 에틸ㆍ메타놀(19 : 1)로 전재한다.

약 18cm 전개후, Rf 0.68(P-4), Rf 0.65(P-3')의 흡수상을 각각 긁어내고, 소량의 물을 함유한 아세트산에틸로 2회 따로따로 추출하고, 얻어진 추출 아세트산에틸을 수세후 무수황산나트륨으로 건조 감압 농축하고 방치한다.

Rf 0.68에서 C-15003 P-410mg, Rf치 0.65에서 C-15003 P-3' 3mg의 결정이 얻어진다.

[실시예 6]

실시예 2에 표시한 사카구찌 플라스크 배양액의 1ℓ를 종배지 100ℓ를 함유한 200ℓ 스테인레스스틸 탱크에 접종하고 28℃, 통기 100ℓ/분, 교반 200회전/분으로 48시간 배양하고, 종배양액을 얻었다.

얻어진 종배양액을, 이식율 10％로 실시예 1에 표시한 주배지 1000ℓ를 함유한 2000ℓ들이 스테인레스스틸 탱크에 이식하고, 28℃, 통기 1000ℓ/분, 교반 120회전/분(1/3DT), 내압 1kg/㎠의 조건으로 90시간 배양하였다.

얻어진 배양액은 실시예 1의 검정법으로 20㎍/ml의 생산역가를 나타냈다.

얻어진 배양액 900ℓ의 아세톤을 가해 1시간 교반후, 하이프로수퍼 셀(미국 존스 만빌사 제) 20kg을 가해서 교반하고 가압식 여과기로 여과한다.

얻어진 여액 1700ℓ에 물 500ℓ를 가해 아세트산에틸 1000ℓ로 포드빌니악(미국, podbielniak INC)을 사용하여 추출한다. 얻어진 아세트산 에틸층을 수세하고, 무수황산나트륨을 가해서 건조후, 감압 농축한다.농축액에 석유에테르를 가해 석출되는 침전을 여취 건조하면 조물질 68g이 얻어져, 이하 실시예 3,4,5와 마찬가지 방법으로 정제하면, C-15003-P-39.5g, C-15003 P-3' 300mg, C-15003 P-42.5g이 각각 얻어졌다.

Claims (1)

1. 노칼디아속에 속하는 항생물질 C-15003 생산균주 No. C-15003을 영양배지에, 배양하고, 배양물중에 항생물질 C-15003을 생성축적시키고, 이것을 채취하는 것을 특징으로 하는 항생물질 C-15003의 제조법.