FR2792206A1 - Vaccin anti-vih-1 comprenant tout ou partie de la proteine tat de vih-1 - Google Patents

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Abstract

La présente invention a pour objet un vaccin anti-VIH-1 comprenant tout ou partie de la protéine Tat de VIH ainsi que la mise en évidence de cette protéine chez des individus infectés par le VIH. En particulier, la protéine Tat est celle du variant VIH-I Oyi.

Description

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La présente invention a pour objet un vaccin anti-VIH-1 comprenant tout ou partie de la protéine Tat de VIH-1 ainsi que la préparation d'anticorps polyclonaux aptes à reconnaître plusieurs variants de Tat et un procédé de détection de Tat dans un échantillon biologique.
L'objet de la présente invention concerne l'utilisation d'une protéine de régulation du virus de l'immunodéficience humaine (VIH), la protéine Tat, comme vaccin contre ce virus ainsi que la mise en évidence de cette protéine chez des individus infectés par le VIH
Tat est une protéine virale essentielle pour l'expression des gènes viraux et la réplication du virus VIH-1. Cette protéine permet l'activation des gènes du VIH-1 grâce à sa fixation sur une cible nucléotidique appelée TAR localisée à l'extrémité 5' des ARNm de VIH-1. Elle est sécrétée par les cellules infectées par le VIH et est indispensable pour une transcription réverse efficace de VTH-1. Une fois à l'extérieur de la cellule, elle est capable d'activer des cellules infectées éloignées et d'induire l'immunodéficience de cellules T non infectées. En outre, elle est directement impliquée dans des pathologies liées au SIDA, comme le sarcome de Kaposi.
La mise au point du vaccin contre le SIDA est très attendue au niveau planétaire mais l'obtention d'un vaccin contre le SIDA présente deux difficultés majeures. La première est liée à l'extrême variabilité de la protéine d'enveloppe GP120. La deuxième difficulté est due au fait que des anticorps anti-GP120 semblent aggraver la maladie pour des patients ayant un SIDA déclaré. Toutefois des résultats préliminaires indique qu'un effet protecteur pourrait être possible avec des anticorps anti-GP120 chez des personnes n'étant pas contaminées au préalable. Une phase II avec un vaccin anti-GP120 a été lancée par la société Roche aux Etats Unis. Les cohortes sélectionnés pour cette phase II sont bien
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suivis au niveau médical. Il sera toutefois difficile d'obtenir une surveillance médicale équivalente lorsque le vaccin sera commercialisé.
Avec la GP120, Tat est la seule autre protéine du VIH détectée dans le sang de patients contaminés par le VIH-1. Les lymphocytes "tueurs" (CTL) chargés d'éliminer toutes les cellules contaminées par un virus sont inhibés dans le cas du SIDA du fait de l'activité répresseur de la protéine Tat pour les gènes de classe 1 du Complexe Majeur d'Histocompatibilité. Des anticorps anti-Tat (mais également des principes actifs ciblant Tat) devraient permettre la restauration de l'activité des CTL.
Tat est donc une cible privilégiée aussi bien pour le développement d'antiviraux anti Tat que pour une approche vaccinale.
La protéine Tat a donc déjà fait l'objet d'expérimentations. En particulier, des essais précliniques, obtenus avec une protéine Tat recombinante biologiquement inactive (Tat toxoïde), ont montré que Tat toxoïde entraîne, chez les patients séronégatifs une forte et persistante production d'anticorps anti-Tat (Le Buanec et al., 1998). Chez des patients séropositifs et immunodéficients une augmentation significative du taux d'anticorps anti-Tat est observé par rapport au taux normal d'anticorps anti-Tat (Westendorp et al., 1995).
Cette Tat toxoïde est une protéine recombinante qui est rendue biologiquement inactive après la carboxyméthylation des cystéines de Tat Les inventeurs ont pu produire également une Tat carboxyméthylée (Tat Bru cmC) et ils ont observé également une perte de l'activité de transactivation alors que le même variant Tat avec les cystéines libres (Tat Bru fC) est capable de transactiver.
Tat Bru cmC est capable de se fixer sur TAR avec une affinité comparable à Tat Brute.
Un inconvénient majeur dans l'utilisation comme vaccin de Tat carboxyméthylée est que la modification chimique des cystéines entraîne des changements conformationnels que les inventeurs ont observé par dichroïsme circulaire et RMN. Bien que des changements conformationnels existent parmi les
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différents variants Tat, la carboxyméthylation des cystéines entraîne des modifications majeures dans le repliement de la chaîne peptidique de Tat qui, de ce fait, n'est pas un bon candidat pour la préparation d'un vaccin anti-Tat.
Il convient par conséquent d'utiliser dans un vaccin anti-VIH-1 une protéine Tat défectueuse mais possédant les caractéristiques structurales similaires aux Tat fonctionnelles. Cette Tat devrait en effet présenter une structure conformationnelle la plus proche possible des protéines Tat naturelles, mais ne pouvant pas transactiver, c'est-à-dire, comme précédemment indiqué, incapable d'activer des cellules infectées éloignées et induire l'immunodéficience de cellules T non infectées. Il est en effet crucial d'inhiber cette immunodéficience.
La présente invention a donc pour objet un vaccin anti-VIH-1 comprenant tout ou partie d'au moins une protéine Tat de VIH-1 capable de se fixer sur TAR et incapable de transactiver, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable et, le cas échéant, un ou plusieurs adjuvant (s) del'immunité approprié(s).
Ainsi, une protéine Tat peut être utilisée pour la préparation d'un vaccin conforme à l'invention mais également seulement une ou plusieurs partie (s) cette protéine susceptible(s) de remplir les fonctions recherchées pour la protéine Tat dans le cadre de la présente invention. Le susdit vaccin peut également comprendre une combinaison de différentes protéines Tat ou encore des parties de protéines Tat différentes.
La protéine Tat susceptible d'être utilisée dans le vaccin conforme à l'invention doit donc être différente des protéines Tat fonctionnelles dites naturelles , c'est-à-dire extraites de différentes souches de VIH-1 présentes à l'état naturel, de façon à être incapable de transactiver tout en se fixant sur TAR C'est la raison pour laquelle, les Tat utilisées dans le vaccin conforme à l'invention présentent une séquence nucléotidique ayant au moins une mutation par rapport à
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la séquence nucléotidique d'une Tat fonctionnelle. Cette mutation, généralement ponctuelle, peut par exemple donner lieu à la suppression, l'ajout ou substitution d'un ou plusieurs acide(s) aminé(s).
Dans le cadre de leurs travaux, les inventeurs ont tout d'abord étudié le variant Tat correspondant à l'isolat Bru (86 résidus) puis ont synthétisé cinq autres variants représentatifs chacun de la diversité structurale observée avec cette protéine (Grégoire et Loret, 1996) : Z2 (86 résidus), Tat Mal (87 résidus), Tat Eli (99 résidus), Tat Oyi (101 résidus) et Tat Jr (101 résidus). 6 groupes structuraux parmi tous les isolats de VIH-1 ont ainsi été déterminés en fonction de la taille des protéines et de la nature de leurs mutations. Il était vraisemblable que tous ces variants avaient des activités pharmacologiques similaires à Tat Bru qui a été synthétisée deux fois, avec les cystéines carboxyméthylées (Tat Bru cmC) et ensuite avec les cystéines libres (Tat Bru fC) La chimie utilisée est de type fastFmoc avec l'activateur HBTU. La purification des protéines a été effectuée par chromatographie liquide haute performance Il s'est avéré que toutes ces protéines synthétiques sont capables de se fixer sur TAR mais de grandes disparités se sont révélées dans le test de transactivation sur cellule HeLa. Le résultat le plus surprenant fut l'absence de transactivation observée avec le variant Tat Oyi. Aucune transactivation n'a été observée non plus avec le dérivé Tat Bru possédant les cystéines carboxyméthylées. L'étude par dichroïsme circulaire (CD) en phase aqueuse de ces protéines synthétiques montre bien que la modification chimique de Tat Bru cmC a modifié de manière significative la structure de Tat Bru. Par contre Tat Oyi a une structure similaire aux autres comme l'atteste son spectre CD.
La souche VIH-1 Oyi a été identifiée chez un patient Gabonais (plus précisément une femme enceinte) en 1988 (Huet et al., 1989). Ce patient, bien que séropositif depuis plusieurs années, était en parfaite santé. Apparemment, le fait d'avoir une protéine Tat défectueuse dans cette souche VIH-1, a empêché l'évolution vers un SIDA chez ce patient et lui a conféré une immunité contre le
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virus du SIDA. En effet, les études épidémiologiques effectuées sur le terrain ont montré que les patients infectés par le VIH-1 Oyi étaient des non progresseurs à long terme.
La souche VIH Oyi appartient au sous-type B correspondant aux souches VIH-1 les plus répandues en Europe et en Amérique du Nord. La femme gabonaise chez laquelle la souche VIH Oyi a été identifiée appartenait à un groupe de 31personnes localisées dans la province rurale du Haut Ogooué dans le sud est du Gabon. Ce groupe avait été identifié en 1986 lors d'une analyse séro- épidémiologique effectuée sur environ 2 000 personnes infectées dans l'ensemble du Gabon. Ce groupe du Haut Ogooué avait attiré l'attention car les personnes infectées étaient en bonne santé et présentait également un profil Western Blot tout à fait atypique. En effet, il n'était pas possible de détecter, chez ces personnes, la présence d'anticorps anti gp 120, gp 160 et gp 41 alors que les anticorps anti gag et pol étaient identifiés (Huet et al., 1989).
Un groupe de 750 femmes enceintes, originaires de cette même province du Haut Ogooué, fut ensuite étudié et révéla que 25 d'entre elles (soit 3,3 %) étaient VIH-positives en test ELISA. Parmi ces 25 femmes, 23 avaient un profil Western Blot atypique caractéristique de la région (voir ci-dessus). Une dizaine de femmes a été suivie pendant 2 ans dont celle possédant la souche VIH-1 Oyi.
Pendant cette période, le profil sérologique atypique resta constant excluant la possibilité d'une infection récente qui n'aurait pas laissé le temps à la formation d'anticorps anti gp 120. La présence d'une infection au VIH-2 fut exclue car il n'y avait pas de réaction à gag VIH-2 et uniquement 2 cas de contamination VIH-2 avaient été reportés au Gabon, localisés dans une région littorale. Tous les patients suivis restèrent en bonne santé avec aucune perte de poids ou maladie opportuniste pendant les 2 années de l'étude (Huet et al., 1989).
La femme identifiée Oyi était d'origine rurale, en bonne santé et séronégative pour HTLV-1 et VIH-2. La co-culture de ses lymphocytes avec des PPMC révéla une activité RT seulement après 15jours, ce qui est très inhabituel.
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Le virus avait également une activité cytopathique presque indécelable. Bien que du surnageant de culture permettait l'infection de PBMC, pratiquement aucune réplication ne fut possible sur des lignées lymphocytaires normales comme les H-9 et CEM ou encore des monocytes U-937. Pour valider cette analyse, des résultats similaires furent observés avec 17 autres patients de la même région confirmant l'absence d'anticorps anti gp 120 dans tous les cas. Il est intéressant de constater que le sérum d'un donneur VIH-1 normal est capable de reconnaître la gp 120 de VIH-1 Oyi (Huet et al., 1989). Le virus VIH-1 Oyi a donc été cloné, le séquençage ne révéla aucune anomalie à l'exception du gène Tat (Huet et al., 1989).
La mutation de Cys 22 en Ser semble être la raison de la perte de la transactivation et la réversion de cette mutation permet de restaurer l'activité Tat.
Par ailleurs, il a été constaté qu'en l'absence de Tat, la reproduction du virus est possible mais à un niveau très faible. Il existe donc un rapport étroit entre la virulence du VIH et l'efficacité de transactivation de Tat. Cette étude épidémiologique montre encore une fois le lien étroit qui existe entre la mortalité de cette maladie et le taux de réplication du VIH. Tat semble donc permettre au VIH d'atteindre le taux de réplication qui transforme cette infection virale en maladie mortelle.
De plus, cette étude de ces patients atypiques de la région du Haut Ogooué a révélé la protection que semblerait procurer les souches VIH défectueuses vis-à-vis des souches VIH normales. En effet, des analyses par PCR de lymphocytes fraîchement prélevés chez plusieurs patients atypiques auraient révélé la présence de souches VIH normales. Le mécanisme de protection ne fait pas intervenir des anticorps anti gp 120, lesquels sont absents chez ces patients.
L'action des lymphocytes T cytotoxiques pourrait être le mécanisme qui a permis l'éradication du virus.
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Une étude épidémiologique relativement récente faite au Gabon (Delaporte et al., 1996) indique un faible pourcentage de personnes infectées par le VIH (2 à 3 %) par rapport à d'autres pays africains. Le sous-type Oyi semble avoir complètement disparu de la population et la femme gabonaise chez qui la souche VIH-1 Oyi avait été prélevée était en parfaite santé en 1995 et avait donné naissance à 3 enfants, tous séronégatifs. Le virus VIH-1 Oyi n'était plus détectable chez elle.
Par conséquent, la protéine Tat du variant VIH-1 Oyi semble être le meilleur candidat pour entrer dans la composition d'un vaccin anti-VIH-1. Le vaccin conforme à l'invention comprend donc, selon un mode de réalisation particulièrement intéressant, la Tat, en tout ou en partie, du variant VIH-1 Oyi (pour la définition de partie voir ci-dessus).
Les avantages d'un vaccin anti-Tat peuvent même être envisagés à plusieurs niveaux. Chez les patients asymptomatiques, il serait possible de retarder la progression vers le SIDA en limitant l'immuno-déficience. Un tel vaccin pourrait permettre au patient de conserver une immunité efficace contre le virus, comme cela semble être le cas au début de l'infection. En particulier, la restauration de l'activité des lymphocytes T cytotoxiques (LTC) et des macrophages, qui ne sont pas infectés par le VIH mais dont l'activité est inhibée par Tat, pourrait avoir pour conséquence de permettre aux patients de devenir non progresseurs.
Chez les patients ayant un SIDA déclaré, un vaccin anti Tat pourrait limiter l'incidence de certaines pathologies tel que le sarcome de Kaposi ou des syndromes neurologiques qui semblent être liés à une action directe de la protéine Tat suite à leur sécrétion par les cellules infectées par le VIH
L'intérêt du variant VIH-1 Oyi dans le cadre de la présente invention est d'ailleurs confirmé par les expériences de Western Blot (photographies de gel non montrées dans la présente demande) et le test Elisa réalisés par les Inventeurs afin
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de déterminer s'il existait des reconnaissances croisées entre les différents variants de Tat
En effet, dans ces deux types d'expérimentation, trois sérums différents anti-Tat ont été testés à l'encontre de sept variants Tat.
Dans des conditions dénaturantes, les expériences de Western Blot montrent que le sérum anti-Tat Oyi et le sérum anti-Tat Eli sont incapables de montrer une immunogénicité croisée avec tous les variants comme c'est le cas avec le sérum anti-Tat Bru cmC. Tat Bru cmC est un variant dont les cystéines sont carboxyméthylées. Cette modification chimique des cystéines entraîne non seulement la perte de l'activité de transactivation (Péloponèse et al., 1999) mais également la perte de la structure 3D de ce variant qui se transforme en pelote statistique (résultat non publié). Il n'est donc pas surprenant de constater que le sérum anti-Tat Bru cmC est capable de reconnaître tous les variants lorsqu'ils sont dénaturés.
Dans des conditions non dénaturantes, le test Elisa montre que le sérum anti-Tat Oyi est capable de reconnaître tous les variants comme le sérum anti-Tat Bru cmC. Par contre, le sérum anti-Tat Eli est toujours incapable de reconnaître tous les variants. Il est intéressant de constater que l'acétylation de la lysine 50 de Tat Bru (Tat Bru K50) permet une reconnaissance par le sérum anti-Tat Eli.
Ces expériences effectuées avec trois sérums polyclonaux de lapin confirment donc l'intérêt de Tat Oyi non seulement comme vaccin mais également pour sa spécificité à l'égard des protéines non dénaturées (à la différence de Tat Bru cmC), ce qui le rend particulièrement intéressant pour le dépistage d'une infection au VIH. De plus, le sérum anti-Tat Eli montre que la production d'anticorps à partir d'un variant ne garantit pas la reconnaissance croisée de tous les variants Tat comme cela est observé avec Tat Oyi et Tat Bru cmC. Il y a donc une forte probabilité pour que la présence de Tat chez les patients ait été sousestimée jusqu'à présent. Par conséquent, l'utilisation d'anticorps ou de sérum antiTat Oyi et/ou anti-Tat Bru cmC pourrait permettre l'identification de la présence
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de Tat chez les patients de manière bien plus fiable que jusqu'à présent du fait de l'antigénicité croisée de ces deux protéines qui, dans le cas présent, ont été obtenues par synthèse peptidique.
Par ailleurs, les Inventeurs ont également montré que les anticorps anti-Tat Oyi étaient capables d'inhiber la transactivation des protéines Tat Eli et Tat Bru.
La présente invention a donc également pour objet un procédé de préparation d'anticorps anti-Tat aptes à reconnaître plusieurs variants de Tat. En effet, il est à souligner que ces anticorps peuvent donc être utilisés afin de détecter, chez les individus susceptibles d'avoir été infectés par le VIH, la présence de la protéine Tat dans leur sang quel qu'en soit le variant.
La présente invention concerne donc un procédé de préparation d'anticorps polyclonaux anti-Tat aptes à reconnaître plusieurs variants de Tat, comprenant : - l'immunisation d'un animal au moyen d'une protéine Tat ou partie de cette protéine Tat associée à un adjuvant de la réponse immunitaire, - la purification des anticorps spécifiques contenus dans le sérum des animaux immunisés.
L'immunisation de l'animal peut être effectuée par tout mode d'introduction de la protéine Tat ou partie de cette protéine Tat dans cet animal telle que : injection, inhalation, administration orale...
Par partie de la protéine Tat on entend tout fragment ou combinaison de fragments d'une ou plusieurs protéine (s) appartenant ou non au même variant, suffisamment immunogène pour donner lieu à une production d'anticorps.
Cette définition est valable à chaque fois que cette expression est utilisée dans la présente demande.
La purification des anticorps spécifiques contenus dans le sérum des animaux immunisés peut par exemple être effectuée sur une colonne d'affinité sur laquelle la protéine ou partie de la protéine ayant servi d'antigène a été préalablement fixée.
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Selon un mode de réalisation avantageux de la présente invention, la protéine Tat ou partie de la protéine Tat utilisée dans l'étape d'immunisation du susdit procédé correspond au variant Oyi ou au variant Bru cmC.
Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, la susdite protéine est une protéine synthétisée chimiquement.
La position de sept résidus cystéine (région 22-37) est très conservée parmi tous les variants Tat et l'importance des résidus cystéine pour la transactivation est largement décrite dans la littérature (Jeang, 1996)
Les inventeurs, par la détermination de la structure 3D de Tat Bru par RMN 2D hétéronucléaire, ont par ailleurs identifié une région cible qui devrait être conservée chez les variants Tat. Cette cible est constituée en partie par la région N-terminale et la région basique de la séquence de Tat.
La structure 3D du variant Tat Bru montre que la région riche en cystéines est proche de l'espace tridimensionnel de la région N-terminale et de la région basique. Ceci indique que la carboxyméthylation des cystéines modifie probablement la structure de cette cible et confirme le fait que la Tat ainsi modifiée ne peut être considérée comme un candidat potentiel pour la préparation d'un vaccin anti-VIH.
Par ailleurs, les inventeurs ont réalisé la synthèse chimique en phase solide des différentes protéines Tat. Les avantages présentés par ce mode de synthèse résident dans les coûts de production moindres, les meilleurs rendements par rapport à la Tat produite par biologie moléculaire et l'absence de contaminations.
Ainsi, de manière avantageuse, la Tat mise en #uvre dans le vaccin conforme à l'invention est préparée par synthèse chimique et plus particulièrement par synthèse chimique en phase solide.
De plus, afin d'éviter tout risque potentiel de toxicité du fait du passage de la protéine Tat, en particulier Tat Oyi, dans les membranes, il conviendrait de modifier la séquence Arg-Gly-Asp présente en C-terminal de la séquence de tous les variants Tat. Cette séquence est en effet essentielle pour le passage
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membranaire car elle reconnaît un récepteur membranaire à la surface des cellules (Jeang, 1996). Plus particulièrement, cette modification pourrait consister en la substitution de cette séquence par la séquence Lys-Ala-Glu ce qui n'aurait pas d'influence sur la structure, ou éventuellement par la séquence Ala-Ala-Ala.
Comme indiqué plus haut, il est très probable que l'on ait sous-estimé jusqu'à présent le nombre de personnes infectées par le VIH faute d'avoir pu déceler chez elles, par exemple dans leur sang, la présence de la protéine Tat.
L'intérêt de la présente invention est de fournir les moyens de déceler le plus grand nombre possible de variants Tat au moyen d'un nombre restreint d'anticorps.
L'invention a donc également pour objet un procédé de mise en évidence de la présence de la protéine Tat ou d'une partie de la protéine Tat dans un échantillon biologique, comprenant : - la mise en contact dudit échantillon avec des anticorps anti-Tat capables de donner lieu à des complexes antigène-anticorps avec plusieurs variants de Tat, - la détermination de la présence des complexes antigène-anticorps.
Par anticorps anti-Tat , on entend non seulement des anticorps entiers mais également des fragments d'anticorps ou anticorps chimériques capables de remplir la fonction recherchée dans le cadre de la présente invention, à savoir reconnaître tout ou partie de la protéine Tat.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, les anticorps anti-
Tat mis en oeuvre dans ce procédé sont des anticorps anti-Tat Oyi ou anti-Tat Bru cmC ou une combinaison des deux.
La détermination de la présence des complexes antigène-anticorps se fait selon des méthodes bien connues de l'homme du métier. En particulier, les réactifs permettant la détection de ces complexes peuvent porter un marqueur ou être susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué, plus particulièrement dans le cas où l'anticorps utilisé n'est par marqué.
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La mise en contact de l'échantillon biologique dans le procédé conforme à l'invention avec des anticorps anti-Tat peut également être effectuée avec un sérum anti-Tat.
Par échantillon biologique on entend tout échantillon liquide, cellulaire ou tissulaire prélevé chez un patient et susceptible de contenir l'antigène apte à réaliser un complexe antigène-anticorps en présence du ou des anticorps approprié(s). De préférence, cet échantillon biologique est du sang.
Enfin, la présente invention a également pour objet une trousse de diagnostic de l'infection par le VIH par la détermination de la présence de la protéine Tat ou d'une partie de la protéine Tat dans un échantillon biologique, comprenant : - des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à la réaction immunologique, - des réactifs permettant la détection des complexes antigène-anticorps produit par la réaction immunologique, - éventuellement, un échantillon biologique de référence (témoin négatif) dépourvu d'antigène, - éventuellement, un échantillon biologique de référence (témoin positif) contenant une quantité prédéterminée d'antigènes.
Selon un mode de réalisation avantageux de la présente invention, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique comprennent des anticorps anti-Tat capables de donner lieu à des complexes antigènes-anticorps avec plusieurs variants Tat et de préférence comprennent des anticorps anti-Tat Oyi, anti-Tat Bru cmM ou une combinaison des deux.
FIGURES
Figure 1 : Comparaison des différentes protéines Tat.
Les protéines Tat ont été réparties en 6 groupes structuraux qui sont
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mentionnés en gras sur la Figure 1 A et soulignés sur la Figure 1B.
Figure 1A :Séquences en acides aminés des protéines Tat.
TatZ2 provient d'un isolat de VIH-1 proche des souches ancestrales du virus (Zhu et al., 1998). Tat Mal et Tat Eli proviennent d'une souche VIH-1 isolée pendant les années 80 en Afrique Centrale à l'occasion d'infections hétérosexuelles à VIH (Alizon et al., 1986). Tat Br comprend la séquence la plus utilisée en laboratoire et provient d'une souche VIH-1 isolée en France (BarreSinoussi et al., 1983), tandis que Tat Jr provient d'un isolat VIH-1 américain (O'Brien et al., 1990). Tat Oyi est étroitement apparenté à Tat Jr et Tat Bru mais provient d'une souche VIH identifiée chez un patient sein au Gabon (Huet et al., 1989).
Figure 1B : Classification des protéines Tat en fonction de leur taille et des mutations qu'elles comprennent pour le programme MULTALIN (Corpet, 1989).
Figure 2 : Séquence de la protéine Tat du variant VIH-Oyi (décrite par Huet et al, 1989)
Figure 3 : Purification des 6 variants Tat par chromatographie liquide haute performance en phase reverse avec colonne greffée C8 à 280 nm (voir Matériels et Méthodes pour la procédure expérimentale).
Pour chaque cadre, le tracé inférieur représente le résultat de la synthèse peptidique avant purification, tandis que le tracé supérieur représente le résultat de la synthèse après la dernière étape de purification. Tat Bru (A), Tat Jr (B), Tat Z2 (C), Tat Oyi (D), Tat Mal (E) et Tat Eli (F) ont été clivées à partir de la résine avec TFA. Après précipitation avec de l'éther de butyle méthyle, les protéines ont été dissoutes dans du Tampon TFA à 0,1% (tracé inférieur dans chaque cadre). Pour chaque protéine, la purification a été effectuée avec 2 migrations HPLC sur colonnes Hybar Merk C8 (4,5 x 125 mm, débit 0,8 ml/min) semi-préparatives
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successives et ensuite les fractions pures ont été analysées (tracé supérieur de chaque cadre) et identifiées par spectrométrie de masse et par une analyse des acides aminés (données non montrées). Dans chaque cas, il s'avère que le pic principal HPLC représente la séquence complète. Les pics entre 10 et 15 min représentent des dérivés de 50 résidus tandis que les pics proches de la fraction principale sont des dérivés avec 1 à 15 délétion (s) partir de l'extrémité N- terminale. Les fractions hautement hydrophobes sont des dérivés avec un poids moléculaire élevé probablement dû aux chaînes latérales incomplètement déprotégées.
Figure 4 : Mesure de la constance d'affinité des Tat synthétiques pour la cible nucléotidique TAR par électrophorèse (voir les tests de déplacement de mobilité électrophorétique dans Matériels et Méthodes.
La concentration protéique (ng/ul) est indiquée au sommet de chaque bande de gel. L'ARN libre ou complexé est identifié par f (pour free/libre) et c respectivement. La préparation du même ARN est utilisée pour la titration avec les 6 protéines. Un dérivé Tat Bru avec des cystéines carboxyméthylées (Bru CmC) a également été testé. Les constantes de dissociation à l'équilibre (Kd) ont été mesurées directement à partir de tests de déplacement de mobilité électrophorétique. Les valeurs de Kd varient approximativement de 50 nM pour Tat Eli et Tat Mal à environ 140 nM pour Tat Oyi et Tat Jr. De plus, les inventeurs ont noté qu'au-delà de la variation des valeurs de Kd, les profils de liaison avec les diverses protéines sont quelques peu différents Par exemple, des concentrations faibles de Tat Bru produisent un complexe simple bien résolu et ce n'est qu'avec des concentrations plutôt supérieures (> 4,5 ng/ l que des agrégats se forment et ne peuvent pas pénétrer dans les gels d'acrylamide. Au contraire, des complexes multimères sont aisément identifiés avec Tat Eli même à de faibles concentrations. On peut voir jusqu'à 3 bandes retardées avec Tat Eli, dans une moindre mesure avec Tat Jr. De tels effets ne sont pas observés avec des protéines
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plus courtes telles que Tat Bru et Tat Mal par exemple, ainsi qu'avec Tat Oyi qui est une protéine plus longue.
Figure 5 : Test de transactivation des protéines Tat synthétiques sur cellule HeLa. Ces cellules sont transfectées par le LTR du VIH-1 auquel est associé un gène rapporteur LacZ. Le taux de protéine P-gal produit est proportionnel à la capacité de transactivation des différentes Tat synthétiques. Le LTR contient les séquences d'ADN en aval et en amont requises pour la transcription du VIH et TAR est présent au début de l'ARNm (Clavel et Chameau, 1994). Les cofacteurs cellulaires requis pour la transactivation du VIH sont présents dans les cellules HeLa. Sans Tat, il y a une expression basale de P-gal qui est indiquée comme contrôle (C). L'histogramme suivant montre la transactivation observée avec les différents variants de Tat utilisant 2 concentrations : 1 M (boîte gris clair) et 5 M (boîte gris foncé). Dans chaque case, Tat a été additionnée au tampon cellulaire et donc une expression de ss-gal supérieure au contrôle signifie que la Tat synthétique est capable de traverser les membranes nucléaires et cytoplasmiques, de se lier à TAR et d'interagir avec des cofacteurs cellulaires. Seul Tat Bru cmC (donnée non montrée) et Tat Oyi sont déficientes dans cette expérimentation alors qu'elles se lient à TAR (Figure 1). Tat Mal et Tat Eli montrent un niveau de transactivation 3 à 4 fois supérieur à celui de Tat Bru. Tat Z2, le plus proche des protéines Tat ancestrales, présente un faible niveau de transactivation et l'évolution pourrait favoriser les isolats de VIH-1 avec une Tat plus efficace. Des résultats similaires ont été obtenus avec d'autres tests de transfection utilisant la luciférase comme gène reporter et Tat Mal et Tat Eli à 1 M transactivaient bien le LTR à un niveau comparable à celui obtenu avec une Tat-pCMV transfectée (donnée non montrée) La gamme de concentrations utilisées dans les différentes expérimentations s'étend de 0,1 M à 10 M (donnée non montrée). A 0,1 M seule Tat Eli montre un niveau de transactivation
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significativement supérieur au niveau de base. A 10 M, les 6 Tat montrent des niveaux de transactivation tellement élevés qu'il est impossible d'observer des différences entre elles en raison de la saturation.
Figure 6 : Spectres dichroïques des variants Tat Z2 (triangle blanc), Tat Oyi (triangle noir), Tat Bru (cercle blanc), Tat Bru cmC (pas de marque), Tat Jr (cercle noir), Tat Mal (carré blanc) et Tat Eli (carré noir).
Les spectres sont mesurés en tampon phosphate à 20 mM pH 4,5, ils sont enregistrés de 260 à 178 nm avec un trajet optique de 50 m. Les différences observées dans les spectres CD révèlent une hétérogénéité structurale entre les variants Tat quelle que soit leur taille. Il n'est pas possible de rassembler les spectres CD dans 2 catégories constituées des Tat courtes (marques blanches) et des Tat longues (marques noires). Les spectres CD sont caractérisés par une bande négative proche de 200 nm typique des structures non organisées La magnitude intense de la bande de 200 nm observée avec Tat Bru cmC montre que la modification des cystéines a entraîné des changements conformationnels majeurs par rapport aux autres Tat.
Figure 7: Résultats d'un test Elisa effectués avec trois sérums polyclonaux de lapin (anti-Tat Bru cmC, anti-Tat Oyi et anti-Tat Eli) à l'égard de 7 variants de Tat. Les conditions sont dénaturantes.
La présente invention ne se limite pas à la description ci-dessus Elle sera mieux comprise à la lumière des exemples qui ne sont mentionnés qu'à titre illustratif.
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EXEMPLES
1) MATERIELS ET METHODES CORRESPONDANT AUX
FIGURES 3 A 6
Synthèse protéique, purification et caractérisation
Des peptides ont été assemblés selon la méthode de Barany et Merrifield (1980) sur une résine préchargée de divinylbenzène de 4-hydroxyméthyl-phénoxyméthyl-copolystyrène à 1 % (HMP) (0,5-0,65 mmol) (Perkin Elmer, Applied Biosystem Inc., Forster City, CA) sur un synthétiseur automatisé (ABI 433A, Perkin Elmer, Applied Biosystem Inc., Forster City, CA). De façon à éviter l'obtention de dérivés présentant des délétions, les extrémités N-terminales sans Fmoc ont été protégées par un groupement acétyl après traitement par un mélange comprenant 4,75 % d'anhydre acétique (Merck), 6,25 % de DIEA à 2,0 M, 1,5 % de 1-hydroxybenzotriazol 1M (HOBt) (Perkin Elmer, Applied Biosystem Inc., Warrington, GB) et 87,5 % de N-méthylpirrolidone (Perkin Elmer, Forster City, CA). Chaque étape de déprotection a été contrôlée avec un dispositif de conductivité. Les peptides ont été déprotégés et retirés de la résine avec de l'acide trifluoroacétique (TFA) complémenté avec 10 % de méthyl-phényl-sulphide (Merck) et 5 % d'éthane dithiol (Merck). La purification a été réalisée avec un appareil de chromatographie liquide à haute performance de Beckman (HPLC) et une colonne en phase reverse C8 de Merck (10 x 250 mm). Le Tampon A était constitué d'eau avec 0,1% de TFA et le Tampon B était constitué d'acétonitrile avec 0,1% de TFA. Le gradient était constitué de Tampon B de 20 à 40 % en 40 min et un débit de 2 ml/min. Une spectrométrie de masse par électrovaporisation a été réalisée avec un PE-SCIEX API 150ex simple quad de Perkin Elmer. Des analyses d'acides aminés ont été réalisées sur un analyseur de Beckman, modèle 6300.
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Tests de déplacement de mobilité électrophorétique
Les 59 nucléotides de l'ARN de TAR contenant le renflement pyrimidine UUU essentiel a été préparé in vitro par transcription avec l'ARN polymérase T3. Les mélanges de réaction de liaison (20 l) contenaient 0,2 nmole d'ARN de TAR radiomarqué, 0-100 ng de Tat dans un Tampon TK (50 mM de Tris pH 7,4, 20 mM de KCI, 0,1% de Triton X-100). Les complexes ont été séparés de l'ARN non lié par électrophorèse sur des gels dénaturants de polyacrylamide à 8 % contenant 0,1% de Triton X-100. Le gel a été pré-migré pendant 30 min avant le chargement de l'échantillon (25 (il). L'électrophorèse s'est poursuivie pendant 90 min à environ 200 V. Les quantités relatives d'ARN libre et/ou lié ont été déterminées par imagerie au phosphore.
Dichroïsme circulaire (CD)
Les spectres de dichroïsme circulaire ont été mesurés avec un trajet optique de 50 m de 260 à 178 nm sur un spectrophotomètre CD UV de JobinYvon (Long-Jumeau, FRANCE) (Mark VI). L'instrument a été calibré avec de l'acide (+)-10-camphorsulfonique. Un rapport de 2,1 a été trouvé entre la bande CD positive à 290,5 nm et la bande négative à 192,5 nm. Les données ont été collectées à 0,5 nm d'intervalle avec un taux de balayage de 1 nm par minute. Les spectres CD ont été reportés sous forme de ## par amide. Les échantillons ont été préparés dans un tampon phosphate à 20 mM (pH 4,5). Les concentrations protéiques étaient comprises dans une gamme de 0,5 à 1 mg/ml.
Transactivation avec des cellules transfectées par LTR de HIV
La transactivation fonctionnelle par une Tat synthétique a été déterminée en utilisant des cellules P4. Ces cellules CD4-HeLa portent le gène lacZ bactérien sous le contrôle de LTR de VIH et l'accumulation cytoplasmique de ssgalactosidase est strictement dépendante de la présence de Tat. 80 % des cellules
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confluantes étalées sur une plaque à 12 puits ont été incubées pendant 24 h à 37 C, en présence de CO2 à 5 %, avec la protéine Tat comprise dans un milieu DMEM supplémenté avec 0,1 % de BSA. Suite à cette période d'incubation, les cellules ont été lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate et les protéines ont été extraites et analysées pour la ss-galactosidase avec un test d'immunoabsorption du commerce mettant en #uvre une enzyme liée à un antigène (ELISA pour -galactosidase, Boehringer Mannheim, FRANCE), selon les instructions du fabricant. Les valeurs ont été normalisées au moyen de la concentration des protéines totales des différents lysats cellulaires comme déterminé par la méthode de Bradford.
Inhibition de la transactivation
Les expérimentations ci-dessus de transactivation avec des cellules transfectées par LTR du VIH ont été reproduites mais cette fois avec ajout au milieu de culture un sérum anti-Tat Oyi. La protéine Tat provenait quant à elle des variants Eli et Bru.
Les inventeurs ont observés une inactivation de la transactivation par les anticorps anti-Tat Oyi des protéines Tat Eli et Tat Bru en comparaison avec le milieu contrôle qui ne comprenait pas d'anticorps (données non montrées).
2) MATERIELS ET METHODES CORRESPONDANT A LA
FIGURE 7
Elisa : Le test se fait sur une plaque Maxisorp U96 (Polylabo). Les protéines en tampon phosphate pH 4. 5 sont incubées sur la plaque toute la nuit à 4 C. Après saturation en tampon MPBS (NaCI 8 g/L, KCI 0,2 g/L, Na2HP04
1,44 g/L, KH2P04 0,24 g/L, lait écrémé 5 % ajusté à pH 7,4 avec HCI), les protéines sont incubées avec l'anticorps primaire de lapin pendant une heure.
Ensuite incubation avec un anticorps de chèvre couplé à la péroxydase spécifique du fragment Fc de lapin (Cappel) pendant une heure. La révélation se fait en
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présence d'H202, de 100 mM acide citrique, 50 mM NaOH et 0,2 mg/ml ABTS (Boerhinger). La lecture de l'absorbance se fait à 405 nm.
3) MATERIELS ET METHODES DU WESTERN BLOT
Western Blot : Les protéines sont d'abord dénaturées en présence de 3 M Tris-HCI, pH 8,8,5 % p-mercaptoéthanol, 2 % SDS, 10 % glycérol, et Bleu de bromophénol. Elles sont séparées par électrophorèse sur gel polyacrylamide 15 %.
Les protéines sont ensuite transférées sur feuilles de nitrocellulose afin d'êtres révélées par immunodétection. Les sites aspécifiques sont bloqués par une solution PBS (NaCI 8 g/L, KCI 0,2 g/L, Na2HP04 1,44 g/L, KH2P04 0,24 g/L, ajusté à pH 7,4 avec HCI) contenant du lait écrémé 5 %. La feuille de nitrocellulose est mise à incuber avec l'anticorps primaire de lapin pendant une heure. Ensuite incubation avec un anticorps de chèvre couplé à la péroxydase spécifique du fragment Fc de lapin (Sigma). La révélation se fait en précense d'H2C02, PBS et diaminobezamidine. (Photographie du gel non montrée dans la présente invention).
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(1998) Nature 391,594-597

Claims (14)

REVENDICATIONS
1. Vaccin anti-VIH-1 comprenant tout ou partie d'au moins une protéine Tat de VIH-1 capable de se fixer sur TAR et incapable de transactiver, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable et, le cas échéant, un ou plusieurs adjuvant(s) de l'immunité approprié(s).
2. Vaccin selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il s'agit d'une Tat dont la séquence nucléotidique présente au moins une mutation par rapport à la séquence nucléotidique d'une Tat fonctionnelle.
3. Vaccin selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait qu'il s'agit de la Tat du variant VIH-1 Oyi ou partie de cette Tat.
4. Vaccin selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait qu'il s'agit d'une Tat synthétique chimique.
5. Vaccin selon la revendication 4, caractérisé par le fait que la Tat est synthétisée en phase solide.
6. Vaccin selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait qu'il comprend au moins la région N-terminale et/ou la région basique de la séquence de Tat.
7. Vaccin selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait que la région Arg-Gly-Asp située à l'extrémité C-terminale de Tat est modifiée.
8. Procédé de préparation d'anticorps polyclonaux anti-Tat aptes à reconnaître plusieurs variants de Tat, comprenant : l'immunisation d'un animal par injection d'une protéine Tat ou partie de cette protéine Tat associée à un adjuvant de la réponse immunitaire, - purification des anticorps spécifiques contenus dans le sérum des animaux immunisés.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la protéine Tat ou partie de la protéine Tat utilisée dans l'étape d'immunisation correspond au
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variant Oyi ou Bru cmC.
10. Procédé selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que la protéine Tat ou partie de la protéine Tat utilisée dans l'étape d'immunisation est telle que définie dans la revendication 4.
11. Procédé de mise en évidence de la présence de la protéine Tat ou d'une partie de la protéine Tat dans un échantillon biologique, comprenant : - la mise en contact dudit échantillon avec des anticorps anti-Tat capables de donner lieu à des complexes antigène-anticorps avec plusieurs variants de Tat, la détermination de la présence des complexes antigène-anticorps.
12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel les anticorps anti-Tat sont des anticorps anti-Tat Oyi ou anti-Tat Bru cmC ou une combinaison des deux
13. Trousse de diagnostic de l'infection par le VIH par la détermination de la présence de la protéine Tat ou d'une partie de la protéine Tat dans un échantillon biologique, comprenant : des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à la réaction immunologique, - des réactifs permettant la détection des complexes antigène-anticorps produits par la réaction immunologique, - éventuellement, un échantillon biologique de référence (témoin négatif) dépourvu d'antigène, éventuellement, un échantillon biologique de référence (témoin positif) contenant une quantité prédéterminée d'antigène.
14. Trousse selon la revendication 13, dans laquelle les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique comprennent des anticorps tels que définis dans la revendication 11 ou 12.
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