NO326603B1 - Anti-HIV-1 vaksine som omfatter et HIV-1 TAT Oyi protein eller ekspressjonsvektor omfattende nukleotidsekvens som koder for variantproteinet og fremgangsmate for fremstilling av anti-Tat polyklonale antistoffer og fremstilling av Tat-varianten - Google Patents

Abstract

Det er beskrevet en oppfinnelse som angår en anti-HTV-1 -vaksine som omfatter hele eller delen av Tat HTV-1 -proteinet, i tillegg til identifikasjon av nevnte protein hos individer affisert av HIV. Tat-proteinet er et protein av HIV-1 Oyi-varianten.

Description

Hensikten med den foreliggende oppfinnelsen er en anti-HIV-1-vaksine som omfatter HIV-1 Tat Oyi variantproteinet og fremstilling av monoklonale eller polyklonale antistoffer som er i stand til å gjenkjenne flere Tat-varianter.

Hensikten med foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av regulatorisk protein i human immunsviktvirus (HIV), Tat-proteinet, som en vaksine mot dette viruset.

Tat er et viralt protein som er essensielt for uttrykket av de virale gener og replikasjon av HIV-1-viruset. Tat-genet er sammensatt av to eksoner som koder et protein på 99 til 106 residuer avhengig av isolatene. En Tat-aktivitet med former som inneholder opp til 86 residuer har imidlertid en del av den C-terminale enden som er blitt deletert og har allerede blitt beskrevet. Disse Tat-derivatene med 86 residuer er tenkt å være laboratorieartefakter eller nedarvede former som ikke lenger eksisterer i naturlig tilstand. Dette proteinet tillater aktivering av HIV-1-genene ved hjelp av at det festes til et nukleotidmål som kalles TAR lokalisert på 5'-enden av HIV-1 mRNA. Det blir sekrert av celler infisert med HIV og er essensielt for en effektiv revers transkripsjon av HIV-1. Når den er på utsiden av cellen er den i stand til å aktivere fjerninfiserte celler og å indusere immunsvikt i ikke-infiserte T-celler. I tillegg er den direkte involvert i AIDS-relaterte patologiske tilstander så som Kaposis sarkom.

Utvikling av en vaksine mot AIDS er i stor grad ønsket av hele verden, men produksjonen av en vaksine mot AIDS har to viktige vanskeligheter. Den første er koblet til den ekstreme variabiliteten av kappeproteinet GP120. Den andre vanskeligheten skyldes det faktum at anti-GP120 antistoffer synes å alvorliggjøre sykdommen for pasienter med utviklet AIDS. Imidlertid angir preliminære resultater at en beskyttende virkning kunne være mulig med anti-GP120 antistoffer hos folk som ikke tidligere er blitt kontaminert. En fase II med en anti-GP120-vaksine har blitt igangsatt av firmaet Roche i De Forente Stater. Kohortene valgt for denne fase II er vel overvåket fra et medisinsk synspunkt. Det vil imidlertid være vanskelig å oppnå en ekvivalent medisinsk overvåkning når vaksinen blir markedsført.

Med GP120, blir Tat detektert i blodet hos pasienter infisert med HIV-1. Aktiviteten til makrofagene og de cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) ansvarlige for eliminering av alle celler infisert med en virus blir gradvis blokkert av Tat, som derfor virker som et immunundertrykkende middel. Anti-Tat-antistoffer (eller aktive ingredienser som målretter Tat) skulle tillate gjenoppretting av aktiviteten av CTL og av makrofagene.

Tat er derfor et favorisert mål både for utviklingen av anti-Tat antivirale midler og for en vaksinetilnærming.

DE-A-195 14 089 og US 5,891,994 tilkjennegir fremstillingen av antistoffer ved dyreimmunisering med en del av Tat-proteinet. Den potensielle interessen for HIV-1 Tat-proteinet i en vaksine mot AIDS har også blitt beskrevet i 1996 av Goldstein (Nature Medicine), der nevnte Tat-protein likevel omfatter 72 aminosyrer.

Tat-proteinet har derfor blitt gjenstand for eksperimenter. Prekliniske forsøk, oppnådd med et biologisk inaktivt rekombinant Tat-protein (Tat-toksoid) har vist spesielt at Tat-toksoidet forårsaker, i seronegative pasienter, en høy og vedvarende produksjon av anti-Tat antistoffer (Le Buanec et al., 1998). I seropositive og immunsviktende pasienter, er en signifikant økning i anti-Tat antistoffnivået observert sammenlignet med det normale anti-Tat antistoffnivået (Westendorp et al., 1995).

Dette Tat-toksoidet er et rekombinant protein som er gjort biologisk inaktivt etter karboksymetylering av Tat-cysteinene. Oppfinnerne har også vært i stand til å produsere et karboksymetylert Tat (Tat Bru cmC) og de har også observert et tap av transaktiveringsaktiviteten selv om den samme Tat-varianten med de frie cysteinene (Tat Bru fC) er i stand til transaktivering. Tat Bru cmC er i stand til å bindes til TAR med en sammenlignbar affinitet til Tat Bru fC.

En viktig ulempe ved anvendelsen av karboksymetylert Tat som en vaksine er at den kjemiske modifikasjonen av cysteinene forårsaker konformasjonelle forandringer som oppfinnerne observerte ved sirkelformet dikroisme og NMR. Skjønt konformasjonelle forandringer eksisterer blant de forskjellige Tat-variantene, forårsaker karboksymetylering av cysteinene viktige modifikasjoner i foldingen av peptidkjeden til Tat som følgelig ikke er en god kandidat til fremstillingen av en anti-Tat-vaksine.

Det er derfor tilrådelig å bruke, i en anti-HIV-1-vaksine, et Tat-protein som er defekt men som har strukturelle egenskaper lik de funksjonelle Tat. Denne Tat burde virkelig ha en tredimensjonal struktur som'er så tett opptil de naturlige Tat-proteinene som mulig slik at de er i stand til å indusere en lik immunrespons til den

t

indusert av de naturlige Tat, men som ikke kan transaktivere, det vil si, som indikert overfor, er inkapable til å aktivere fjerninfiserte celler og å indusere immunsvikten til ikke infiserte T-celler. Det er virkelig kritisk å inhibere denne immunsvikten.

Hensikten med den foreliggende oppfinnelsen er en anti-HIV-1-vaksine som omfatter et HIV-1 Tat Oyi variantprotein, som omfatter mellom 99 og 106 aminosyrer, som er i stand til å bindes til TAR inkapabel til transaktivering, der nukleotidsekvensen har minst en mutasjon sammenlignet med nukleotidsekvensen til en funksjonell Tat, i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer og, hvor det er egnet, en eller flere passende immunitetsadjuvanser. Dette Tat-proteinet skulle være i stand til å danne, i et dyr som dette proteinet kan administreres til, en produksjon av antistoffer som er i stand til å gjenkjenne andre varianter av dette proteinet og på et nivå som er tilstrekkelig til å inhibere transaktiveringen av nevnte varianter.

I henhold til en fordelaktig utforming av oppfinnelsen, så omfatter Tat-proteinet 101 aminosyrer.

Tat-proteinet som kan brukes i vaksinen i henhold til oppfinnelsen bør derfor være forskjellig fra de funksjonelle Tat-proteiner som er betegnet som "naturlige", det vil si som blir ekstrahert fra forskjellige HIV-1-stammer tilstede i naturlig tilstand, slik at de er i stand til å være inkapable til transaktivering mens de bindes til TAR. Dette er årsaken til at Tat brukt i vaksinen i henhold til oppfinnelsen har en nukleotidsekvens som har minst en mutasjon sammenlignet med nukleotidsekvensen til en funksjonell Tat. Denne mutasjonen, som generelt er en punktmutasjon, kan for eksempel gi opphav til undertrykking, tilføying eller substitusjon av en eller flere aminosyrer.

I sammenheng med deres undersøkelser, studerte oppfinnerne aller først Tat-varianten som tilsvarer Bru-isolatet (86 residuer) og syntetiserte deretter fem andre varianter som hver var representative for den strukturelle diversiteten observert hos dette proteinet (Grégoire et Loret, 1996): Tat Z2 (86 residuer), Tat Mal (87 residuer), Tat Eli (99 residuer), Tat Oyi (101 residuer), og Tat Jr (101 residuer). 6 strukturelle grupper blant alle HIV-1-isolatene har således blitt bestemt i henhold til størrelsen på proteinene og typen av deres mutasjoner. Det var mulig at alle disse variantene hadde like farmakologiske aktiviteter til Tat Bru som er blitt syntetisert to ganger, med de karboksymetylerte cysteinene (Tat Bru cmC) og deretter med de frie cysteinene (Tat Bru fC). Kjemien benyttet er av fastFmoc-type med HBTU-aktivator. Rensingen av proteinene ble utført ved HPLC. Det er blitt funnet at alle disse syntetiske proteinene er i stand til å bindes til TAR men store ulikheter er blitt observert i transaktiveringstesten med HeLa-celle. Det mest overraskende resultatet var fraværet av transaktivering observert med Tat Oyi-varianten. Det var heller ingen transaktivering observert med Tat Bru-derivatet som har de karboksymetylerte cysteinene. Det vandige fase sirkulære dikroisme (CD) studiet på disse syntetiske proteinene viser virkelig at den kjemiske modifikasjonen av Tat Bru cmC signifikant modifiserte strukturen til Tat Bru. På den annen side, har Tat Oyi en lignende struktur til de andre som konfirmert ved dets CD-spektrum.

HIV-1 Oyi-stammen ble identifisert hos en gabonsk pasient (mer presist en gravid kvinne) i 1988 (Huet et al., 1989). Denne pasienten var fullstendig frisk, skjønt hun hadde vært seropositiv i mange år. Tilsynelatende hindret det faktum at et defekt Tat-protein var til stede i denne HIV-1-stammen utvikling av AIDS hos denne pasienten og ga henne immunitet mot AIDS-viruset. De epidemiologiske undersøkelsen utført i felten har virkelig vist at pasienter infisert med HIV-1- Oyi ikke utviklet sykdommen over lang tid.

HIV Oyi-stammen hører til undertype B som tilsvarer HIV-stammene som er de mest forekommende i Europa og Nord-Amerika. Den gabonske kvinnen i hvilken HIV Oyi-stammen ble identifisert hørte til en gruppe på 31 mennesker som var lokalisert i den landlige provinsen i Haut Ogooué i den sydøstlige delen av Gabon. Denne gruppen ble identifisert i 1986 under en seroepidemiologisk analyse utført på ca. 2000 mennesker infisert i hele Gabon. Denne Haut Ogooué-gruppen hadde tiltrukket seg oppmerksomhet fordi de infiserte menneskene var ved god helse og utviste også en fullstendig atypisk Western blot-profil. I virkeligheten var det ikke mulig hos disse menneskene å detektere nærvær av anti-gp 120, anti-gp 160 og anti-gp 41 antistoffer mens anti-gag og anti-pol antistoffer ble identifisert (Huet et al., 1989).

En gruppe på 750 gravide kvinner fra den samme Haut Ogooué-provinsen ble deretter undersøkt og viste at 25 av dem (det er 3,3 %) var HIV-positive ved ELISA-testen. Blant disse 25 kvinnene hadde 23 en atypisk Western blot-profil karakterisert ved regionen (se ovenfor). Omkring 10 av disse kvinnene ble fulgt opp i 2 år inkludert henne som hadde HIV-1 Oyi-stammen. Under denne perioden hvorved den atypiske serologiske profilen forble konstant og som ekskluderer muligheten av en nylig infeksjon som ikke ville ha blitt gitt tid til dannelse av anti-gp 120 antistoffer. Nærværet av en HIV-2-infeksjon ble ekskludert fordi det ikke var noen reaksjon på HIV-2- gag og bare 2 tilfeller av HIV-2-infeksjon er blitt rapportert i Gabon, lokalisert i en kystregion. Alle pasientene som var overvåket forble ved god helse uten vekttap eller opportunistiske sykdommer i løpet av de 2 årene studiet varte (Huet et al., 1989).

Kvinnen som ble identifisert med Oyi var av landlig opprinnelse, ved god helse og seronegativ for HTLV-1 og HIV-2. Samkulturen av hennes lymfocytter med PPMC ga en RT-aktivitet bare etter 15 dager, noe som er meget uvanlig. Viruset hadde også en nesten udetekterbar cytopatisk aktivitet. Skjønt kultursupernatanten tillot infeksjon av PBMC, var praktisk talt ingen replikasjon mulig på normale lymfocyttiske linjer, så som H-9 og CEM eller U-937-monocytter. For å validere denne analysen, ble lignende resultater observert med 17 andre pasienter fra samme region, og konfirmerte fravær av anti-gp 120 antistoffer i alle tilfellene. Det er av interesse å notere seg at serum fra en normal HIV-1-donor er i stand til å gjenkjenne HIV-1 Oyi gp 120 (Huet et al., 1989). HIV-1 Oyi-viruset ble derfor klonet, og sekvenseringen ga ingen feil unntatt for Tat-genet (Huet et al., 1989). Mutasjonen av Cys 22 til Ser synes å være årsaken til tapet av transaktiveringen og reversjon av denne mutasjonen gjør det mulig å gjenopprette Tat-aktiviteten.

Videre ble det observert at i fraværet av Tat er reproduksjonen av viruset mulig, men på et meget lavt nivå. Det er derfor et tett slektskap mellom virulensen av HIV og Tat transaktiveringseffektiviteten. Den epidemiologiske undersøkelsen viser igjen det tette slektskapet som eksisterer mellom mortaliteten fra denne sykdommen og graden av replikasjon av HIV. Tat synes derfor å tillate HIV å nå den replikasjonsgraden som forandrer den virale infeksjonen til en dødelig sykdom.

Videre viser denne undersøkelsen av disse atypiske pasientene fra Haut Ogooué-regionen den beskyttelsen som de defekte HIV-stammene ville synes å tilveiebringe sammenlignet med de normale HIV-stammene. PCR-analyse av lymfocytter nylig innsamlet fra flere atypiske pasienter er virkelig ment å ha vist nærvær av normale HIV-stammer. Den beskyttende mekanismen involverer ikke anti-gp 120 antistoffer, idet de siste er fraværende hos disse pasientene. Virkningen av de cytotoksiske T-lymfocyttene kunne være mekanismen som tillot utradering av viruset.

Et relativt nylig epidemiologisk studie utført i Gabon (Delparte et al., 1996) indikerer en lav prosentandel av mennesker infisert med HIV (2 til 3 %) sammenlignet med andre afrikanske land. Oyi-undertypen synes å ha forsvunnet fullstendig fra populasjonen og den gabonske kvinnen fra hvem HIV-1 Oyi-stammen ble tatt var ved perfekt helse i 1995 og hadde født 3 barn som alle var seronegative. HIV-1 Oyi-viruset var ikke lenger detekterbart hos henne.

Tat-proteinet i HIV-1 Oyi-varianten synes derfor å være den beste kandidaten til å lage en sammensetning med anti-HIV-1-vaksine. Et inaktivert Tat er imidlertid ikke nødvendigvis immunogent. Når er hele den gunstige virkningen av en vaksine å igangsette produksjonen av antistoffer, og videre, i foreliggende tilfelle antistoffer som også er aktive mot andre Tat-varianter. Overraskende har oppfinnerne vært i stand til å demonstrere dette. Vaksinen i henhold til foreliggende oppfinnelse omfatter derfor, i henhold til en spesielt fordelaktig utforming, hele eller del av Tat, i HIV-1 Oyi-varianten.

Fordelene med en anti-Tat-vaksine kan til og med bli forestilt seg på flere nivåer. I asymptomatiske pasienter ville det være mulig å forsinke utviklingen mot AIDS ved å begrense immunsvikten. En slik vaksine ville tillate pasienten å opprettholde en effektiv immunitet mot viruset, som synes å være tilfelle begynnelsen av infeksjonen. Spesielt ville gjenoppretting av aktiviteten til de cytotoksiske T-lymfocyttene (CTL) og av makrofagene, som ikke er infisert av HIV men hvis aktivitet blir inhibert av Tat, ha den konsekvensen at den tillater pasientene å ikke utvikle sykdommen.

Hos pasienter med erklært AIDS, ville en anti-Tat-vaksine kunne begrense forekomsten av visse patologiske tilstander så som Kaposis sarkom eller nevrologiske syndromer som synes å være koblet til en direkte virkning av Tat-proteinet etterfulgt av deres sekresjon fra HIV-infiserte celler.

Fordelen med HIV-1 Oyi-varianten i sammenheng med foreliggende oppfinnelse er videre konfirmert av Western blot-eksperimenter (gelfotografer ikke vist i foreliggende søknad) og Elisa-testen utført av oppfinnerne for å bestemme om det var kryssgjenkjennelse mellom de forskjellige Tat-variantene.

I disse to typene av eksperimenter ble tre forskjellige anti-Tat-sera virkelig testet mot syv Tat-varianter.

Oppfinnerne immuniserte kaniner med Tat Oyi, Tat Bru cmC og Tat Eli i henhold til en konvensjonell immuniseringsprotokoll i nærværet av Freunds adjuvans. De polyklonale sera oppnådd etter 53 dager ble analysert ved Western blotting og en Elisa-test. De observerte titrene var henholdsvis 700, 11 og 660 pM for anti-Oyi, anti-Bru cmC og anti-Eli antistoffer.

Under denaturerende betingelser viser Western blot-eksperimentene at anti-Tat Oyi-serumet og anti-Tat Eli-serumet er ute av stand til å vise kryssimmunogenisitet med alle variantene som er tilfellet med anti-Tat Bru cmC-serumet.

Tat Bru cmC er en variant hvis cysteiner er karboksymetylerte. Denne kjemiske modifikasjonen av cysteiner forårsaker ikke bare tap av transaktiveringsaktivitet (Péloponése et al., 1999) men også tap av den 3D-strukturen av denne varianten som konverterer til en tilfeldig spiral (upubliserte resultater). Det er derfor ikke overraskende å observere at anti-Tat Bru cmC-serumet er i stand til å gjenkjenne alle variantene når de er denaturert.

Under ikke-denaturerende betingelser viser Elisa-testen (figur 7) at anti-Tat Oyi-serum er i stand til å gjenkjenne alle variantene som anti-Tat Bru cmC-serum. På den annen side er anti-Tat Eli-serum fremdeles ute av stand til å gjenkjenne alle variantene. Det synes derfor som om konserverte 3D-epitoper eksisterer i tallrike Tat-varianter. Bare den spesifikke immunogene karakteren til Tat Oyi gjør det imidlertid mulig å danne disse antistoffer i store mengder. Det er derfor en høy mulighet for nærværet av Tat i pasienter som er blitt underestimert opp til nå. Fortynningen av de tre sera er 1/1000.1 det samme eksperimentet, men uten fortynning, kan anti-Tat Eli-serum også gjenkjenne alle de andre Tat-variantene. Det er fordelaktig å notere seg at acetyleringen av lysin 50 i Tat Bru (Tat Bru K50) tillater gjenkjennelse ved anti-Tat Eli-serum i en lav konsentrasjon.

Disse eksperimentene utført med de tre kanin polyklonale sera konfirmerer derfor fordelen med Tat Oyi som en vaksine. Videre er anti-Tat Oyi-serum i stand til å inhibere transaktivering på HeLa-celler med Tat Bru eller Tat Eli. Anti-Tat Eli-serumet brukt som en kontroll viser at produksjonen av antistoffer fra til og med en aktiv variant ikke sikrer en kryssgjenkjennelse av alle Tat-variantene som observert med Tat Oyi. Tat Oyi som er en lang variant (101 residuer) tillater bedre gjenkjennelse av Tat-variantene sammenlignet med Tat Bru cmC som er en kort variant (86 residuer). HIV-I-stammer med korte Tat-varianter har praktisk talt forsvunnet og synes å ha vært et laboratorieartefakt (Jeang et al., 1999). Videre utviser anti-Tat Oyi-serum høy spesifisitet siden det ikke lenger gjenkjenner de denaturerte formene (eller lineære epitoper) av Tat-variantene. I motsatt tilfelle er det en signifikant risiko for at anti-Tat Bru cmC-serum skal danne autoimmune antistoffer hos mennesker på grunn av den høye strukturelle variabiliteten til Tat Bru cmC. Oppfinnerne observerte virkelig at antistoffer i stand til å gjenkjenne humant albumin eksisterte i anti-Tat Bru cmC-serum (data ikke vist).

Preserveringen av den tredimensjonale strukturen til minst en Tat-epitop er derfor essensiell for gjenkjennelse av andre Tat-varianter ved anti-Tat 3D antistoffer.

Videre har oppfinnerne også vist at anti-Tat Oyi antistoffer var i stand til å inhibere transaktivering av Tat Eli-proteinene.

Hensikten med foreliggende oppfinnelse er derfor også en fremgangsmåte til å fremstille anti-Tat monoklonale eller polyklonale antistoffer som er i stand til å gjenkjenne flere Tat-varianter. Det skal virkelig understrekes at disse antistoffene derfor kan brukes til å detektere, i individer som kan ha blitt infisert med HIV, nærværet av Tat-proteinet i deres blod uavhengig av varianten.

Den foreliggende oppfinnelsen angår derfor en fremgangsmåte til å fremstille anti-Tat polyklonale antistoffer som er i stand til å gjenkjenne flere Tat-varianter, som består av: - immunisering av et dyr, unntatt mennesker, ved hjelp av et Tat-protein, kjemisk syntetisert, kombinert med en immunresponsadjuvans, - rensing av de spesifikke antistoffene inneholdt i serumet til de immuniserte dyrene,

Der Tat-proteinet som blir benyttet i immuniseringstrinnet tilsvarer Oyi-varianten.

Immunisering av dyret kan utføres ved enhver fremgangsmåte til å innføre Tat-proteinet eller del av dette Tat-proteinet inn i dyret, så som injeksjon, innhalasjon, oral administrering, subkutan, intradermal, intraperitoneal, intravenøs eller intramuskulær.

Immuniseringen av dyret kan også utføres ved hjelp av en in vivo eller in situ ekspresjon av en vektor som ikke bare bærer sekvensen til Tat-proteinet som et hele eller delvis, men også hele systemet nødvendig for ekspresjonen av Tat-proteinet i henhold til teknikker velkjente for en person med kunnskap på området.

Rensing av de spesifikke antistoffene inneholdt i serumet til det immuniserte dyret kan for eksempel utføres på en affinitetskolonne til hvilken proteinet eller del av proteinet som tjener som antigen er blitt festet på forhånd.

Posisjonen til syv cysteinresiduer (region 22-37) er i stor grad konservert hos alle Tat-variantene og viktigheten av 6 av disse cysteinresidiuene for transaktiveringen er godt beskrevet i litteraturen (Jeang, 1996).

Oppfinnerne har, gjennom bestemmelse av 3D-strukturen til Tat Bru ved heteronukleær 2D NMR, videre identifisert et målområde som bør være konservert i Tat-variantene. Dette målet består delvis av den N-terminale regionen og den basale regionen for Tat-sekvensen.

Den 3D-strukturen til Tat Bru-varianten viser at regionen som er rik på cysteiner er nær det tredimensjonale rommet til den N-terminale regionen og til den basale regionen. Dette indikerer at karboksymetyleringen av cysteinene muligens modifiserer strukturen til dette målet og konfirmerer det faktum at Tat således modifisert ikke kan betraktes som en potensiell kandidat for fremstillingen av en anti-HIV-vaksine.

Videre har oppfinnerne utført fastfase kjemisk syntese av de forskjellige Tat-proteinene. På det nåværende kunnskapsnivået på området består fordelene presentert ved denne syntesemetoden i de lavere produksjonsomkostningene, bedre utbytte sammenlignet med Tat produsert ved molekylær biologi og fraværet av kontamineringer.

Således blir fordelaktig Tat brukt i vaksinen i henhold til oppfinnelsen fremstilt ved kjemisk syntese og mer spesielt ved fastfase kjemisk syntese, så som en syntese av FMOC, og fortrinnsvis fastFMOC, type. En syntesefremgangsmåte som benytter beskyttende grupper av denne type er også en hensikt med foreliggende oppfinnelse.

Tat brukt i vaksinen i henhold til oppfinnelsen kan imidlertid også syntetiseres på enhver annen måte, for eksempel ved hjelp av rekombinante teknikker velkjente for en person med kunnskaper på området. Disse klonings- og ekspresjonssystemene brukt i sammenheng med disse teknikkene kan avledes fra mikroorganismer så som Escherichia coli, Bacillus, Streptomyces og Saccharomyces men også fra gjær, insekt- og pattedyrceller. Baculovirus ekspresjonssystemer kan også vurderes. Helt klart vil vektorene som bærer sekvensen til Tat-proteinet som et hele eller deler omfatte hele ekspresjonssystemet som er nødvendig for å gjøre dette, i henhold til teknikker som er velkjente for en person med kunnskap på området.

Videre, for å unngå enhver mulig risiko for toksisitet på grunn av passasjen av Tat Oyi proteinet inn i membranene, vil det være tilrådelig å modifisere sekvensen Arg-Gly-Asp tilstede på C-terminus av sekvensen til alle Tat-variantene. Denne sekvensen er virkelig essensiell for membranpassering på grunn av at den gjenkjenner en membranreseptor på overflaten av cellene (Jeang, 1996). Mer spesielt kan denne modifikasjonen bestå av substitusjon av denne sekvensen med sekvensen Lys-Ala-Glu som ikke ville ha noen innflytelse på strukturen, eller muligens sekvensen Ala-Ala-Ala.

Som angitt ovenfor er det meget mulig at antallet mennesker infisert med HIV er blitt underestimert opp til nå på grunn av manglende mulighet til å detektere hos dem, for eksempel i deres blod, nærværet av Tat-proteinet. Fordelen med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe midler for å detektere det største mulige antallet av Tat-varianter ved hjelp av et begrenset antall antistoffer.

Oppsummert gjelder oppfinnelsen således en anti-HIV-1-vaksine som er kjennetegnet ved at den omfatter et HIV-1 Tat Oyi variant protein, som omfatter mellom 99 og 106 aminosyrer, som er i stand til å bindes til TAR og ikke i stand til transaktivering, hvori nukleotidesekvensen til Tat har minst en mutasjon sammenlignet med nukleotidsekvensen til en funksjonell Tat, og hvor mutasjonen påvirker minst ett av cysteinene i Tat-proteinet, i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer og, hvor det egnet, en eller flere egnede immunitetsadjuvanser.

Oppfinnelsen gjelder også en anti-HIV vaksine som er kjennetegnet ved at den inneholder en ekspresjonsvektor som omfatter en nukleotidsekvens som koder for et HIV-1 Tat-protein som definert ifølge oppfinnelsen, og elementene som er nødvendige for dens ekspresjon.

Til slutt vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte for å fremstille anti-Tat polyklonale antistoffer som er i stand til å gjenkjenne flere Tat-varianter, som omfatter: - immunisering av et dyr, unntatt mennesker, ved hjelp av injeksjon av et Tat-protein som definert ifølge oppfinnelsen kombinert med en immunresponsadjuvans, - rensing av de spesifikke antistoffene inneholdt i serumet til de immuniserte dyrene, kjennetegnet ved at Tat-proteinet brukt i immuniseringstrinnet tilsvarer Oyi eller Bru cmcC-varianten, og en fremgangsmåte for å syntetisere en Tat-variant som angitt ifølge oppfinnelsen, som er kjennetegnet ved at den anvender beskyttende grupper av FMOC-typen, fortrinnsvis av den hurtige FMOC-typen.

FIGURER

Figur 1: Sammenligning av de forskjellige Tat-proteinene.

Tat-proteinene ble delt opp i 6 strukturelle grupper som er nevnt i fet skrift i figur IA og understreket i figur IB.

Figur IA: Aminosyresekvensene til Tat-proteinene.

TatZ2 blir oppnådd fra et HIV-1-isolat nær de beslektede stammene fra viruset (Zhu et al., 1998). Tat Mal og Tat Eli blir oppnådd fra en HIV-1-stamme isolert i 80-årene i Sentral-Afrika i heteroseksuelle HIV-infeksjoner (Alizon et al., 1986). Tat Br omfatter sekvensen oftest brukt i laboratoriet og er oppnådd fra en HIV-1-stamme isolert i Frankrike (Barre-Sinoussi et al., 1983), mens Tat Jr blir oppnådd fra et amerikansk HIV-1-isolat (0'Brien et al., 1990). Tat Oyi er nært beslektet med Tat Jr og Tat Bru, men blir oppnådd fra en HIV-stamme identifisert i en frisk pasient i Gabon (Huet et al., 1989). Figur IB: Klassifisering av Tat-proteinene som en funksjon av deres størrelse og av mutasjoner som de omfatter for MULTALIN-programmet (Corpet, 1989). Figur 2; Sekvens av Tat-proteinet fra HIV-Oyi-varianten (beskrevet av Huet et al., 1989). Figur 3: Rensing av 6 Tat-varianter ved reversfase HPLC-kromatografi med C8 podede kolonner på 280 nm (se Materialer og metoder for den eksperimentelle prosedyren).

For hver ramme representerer den nederste kurven resultatene av peptidsyntesen før rensing, mens den øvre kurven representerer resultatet av syntesen etter det siste rensetrinnet. Tat Bru (A), Tat Jr (B), TatZ2 (C), Tat Oyi (D), Tat Mal (E) og Tat Eli (F) ble spaltet fra harpikset med TFA. Etter utfelling med butylmetyleter, ble proteinene oppløst i TFA-buffer ved 0,1 % (nedre kurve i hver ramme). For hvert protein ble rensingen utført med 2 påfølgende semipreparerende HPLC-kjøringer på Hybar Merk C8-kolonner (4,5 x 125 mm, gjennomstrømningshastighet 0,8 ml/minutt) og deretter ble de rene fraksjonene analysert (øvre kurve i hver ramme) og identifisert ved massespektrometri og ved analyse av aminosyrene (data ikke vist). I hvert tilfelle er det observert at den prinsipale HPLC-toppen representerer den fullstendige sekvensen. Toppene mellom 10 og 15 min representerer derivater av 50 residuer mens toppene nær ved de prinsipale fraksjonene er derivater med 1 til 15 delesjoner fra den N-terminale enden. De sterkt hydrofobe fraksjonene er derivater med en høy molekylvekt sannsynligvis på grunn av de ufullstendige ubeskyttede sidekj edene.

Figur 4: Måling av affinitetskonstanten til de syntetiske Tat for nukleotidmålet TAR ved elektroforese (se testene for elektroforetiske mobilitetsforskyvninger under Materialer og metoder).

Proteinkonsentrasj onen (ng/^il) er angitt på toppen av hvert gelbånd. Det frie eller komplekserte RNA blir identifisert ved henholdsvis/(for fri) og c. Det samme RNA-preparatet blir brukt for titrering med de 6 proteinene. Et Tat Bru-derivat med karboksymetylerte cysteiner (Bru CmC) ble også testet. Dissosiasjonskonstantene ved likevekt (Kd) ble målt direkte fra elektroforetiske mobilitetsforskyvningstester. Kd-verdiene varierer omtrentlig fra 50 nm for Tat Eli og Tat Mal til omkring 140 nm for Tat Oyi og Tat Jr. Videre har oppfinnerne notert seg at i tillegg til variasjonen i Kd-verdier, er bindingsprofilene med de forskjellige proteinene noe forskjellige. For eksempel lave konsentrasjoner av Tat Bru produserer et enkelt godt oppløst kompleks og det er bare med heller høyere konsentrasjoner (> 4,5 ng/jil) at aggregater dannes og som ikke kan penetrere inn i akrylamidgelene. I kontrast til dette blir multimere komplekser lett identifisert med Tat Eli selv ved lave konsentrasjoner. Det er mulig å observere opptil 3 retarderte bånd med Tat Eli og i en mindre grad med Tat Jr. Slike effekter er ikke observert med kortere proteiner, så som Tat Bru og Tat Mal for eksempel, og med Tat Oyi som er et lengre protein.

Figur 5: Test på transaktivering av de syntetiske Tat-proteinene på HeLa-celler. Disse cellene blir transfektert med HIV-1 LTR med hvilket et LacZ rapportørgen er assosiert. Nivået til P-gal-protein produsert er proporsjonalt til transaktiveringskapasiteten til de forskjellige syntetiske Tat. LTR inneholder DNA-sekvensene nedstrøms og oppstrøms som er nødvendige for transkripsjon av HIV og TAR, er tilstede i begynnelsen av mRNA (Claven og Charneau, 1994). De cellulære kofaktorene nødvendige for transaktiveringen av HIV er tilstede i HeLa-cellene. Uten Tat er det en basal ekspresjon av P-gal som er angitt som en kontroll

(C). Det neste histogrammet viser transaktiveringen observert med de forskjellige Tat-variantene ved å bruke to konsentrasjoner: 1 |iM (lys grå søyle) og 5 |J,M (mørk

grå søyle). I hvert tilfelle blir Tat tilsatt den cellulære bufferen og derfor betyr en høyere ekspresjon av p-gal enn kontrollen at det syntetiske Tat er i stand til å krysse de nukleære og cytoplasmatiske membraner, til å bindes til TAR og til å interagere med cellulære kofaktorer. Bare Tat Bru cmC (data ikke vist) og Tat Oyi

er defekte i dette eksperimentet mens de bindes til TAR (figur 1). Tat Mal og Tat Eli viser et transaktiveringsnivå 3 til 4 ganger høyere enn det til Tat Bru. Tat Z2, det nærmeste av de nedarvede Tat-proteinene, utviser et lavt transaktiveringsnivå og evolusjonen kunne begunstige HIV-1-isolatene med en mer effektiv Tat. Lignende resultater er blitt oppnådd med andre transfeksjonstester ved å bruke luciferase som rapportørgenet og Tat Mal og Tat Eli ved 1 ^iM virkelig transaktiverte LTR på et sammenlignbart nivå til det oppnådd med en transaktivert Tat-pCMV (data ikke vist). Konsentrasjonsområdet brukt i de forskjellige eksperimentene strekker seg fra 0,1 ^iM til 10 ^iM (data ikke vist). Ved 0,1 \ lM viser bare Tat Eli et signifikant høyere transaktiveringsnivå enn det basale nivået. Ved 10 u,M viser de 6 Tat slike høye transaktiveringsnivåer at det er umulig å observere forskjellene mellom dem på grunn av metningen.

Figur 6: Dikroiske spektra av Tat Z2 (hvit trekant), Tat Oyi (svart trekant), Tat Bru (hvit ring), Tat Bru cmC (intet symbol), Tat Jr (svart ring), Tat Mal (hvit firkant) og Tat Eli (svart firkant) varianter.

Spektrene er målt i fosfatbuffer ved 20 mM, pH-verdi 4,5; de er registrert fra 260 til 178 nm med en optisk veilengde på 50 \ im. Forskjellene observert i CD-spektraet angir en strukturell heterogenitet mellom Tat-variantene uavhengig av deres størrelse. Det er ikke mulig å samle CD-spektraet i 2 kategorier som består av korte Tat (hvite symboler) og lange Tat (svarte symboler). CD-spektrene er karakterisert av et negativt bånd nær 200 nm typisk for de uorganiserte strukturene. Den intense størrelsen til båndet på 200 nm observert med Tat Bru cmC viser at modifikasjonen til cysteinene har forårsaket store konformasjonelle forandringer sammenlignet med de andre Tat. Figur 7; Elisa-tester utført med tre fortynninger av kanin polyklonale sera (anti-Tat Bru cmC, anti-Tat Oyi og anti-Tat Eli) med hensyn på 7 varianter av Tat-proteinet under denaturerende betingelser. Figur 8: Inhibisjon av transaktiveringen ved Tat Eli med anti-Tat Eli, anti-Tat Oyi og anti-Tat Bru cmC-sera.

Den foreliggende oppfinnelsen er ikke begrenset til ovenstående beskrivelser. Den vil forstås klarere i lys av eksemplene som bare er nevnt som illustrasjon.

EKSEMPLER

1) MATERIALER OG METODER SOM TILSVARER FIGUR 3 TIL 6

Proteinsvntese, rensing og karakterisering

Peptider ble satt sammen i henhold til metoden til Barany og Merrifield (1980) på en harpiks forladet med 4-hydroksymetyl-fenoksymetyl-kopolystyrendivinylbenzen ved 1 % (HMP) (0,5-0,65 mmol) (Perkin Eimer, Applied Biosystem Inc., Forster City, CA) på en automatisert syntetiseringsanordning (ABI433A, Perkin Eimer, Applied Biosystem Inc., Forster City, CA). For å unngå å oppnå derivater som utviser delesjoner, ble de N-terminale gruppene uten Fmoc beskyttet med en acetylgruppe etter behandling med en blanding som omfatter 4,75 % av eddiksyreanhydrid (Merck), 6,25 % av DIEA ved 2,0 M, 1,5 % av 1-hydroksybenzotriazol 1 M (HOBt) (Perkin Eimer, Applied Biosystem Inc., Warrington, GB) og 87,5 % av N-metylpyrrolidon (Perkin Eimer, Forster City, CA). Hvert avbeskyttelsestrinn ble kontrollert med en konduktivitetsanordning. Peptidene ble avbeskyttet og fjernet fra harpiksen med trifluoreddiksyre (TFA) tilsatt 10 % metylfenylsulfid (Merck) og 5 % etanditiol (Merck). Rensingen ble utført med et Beckman høyytelseskromatografi (HPLC) apparat på en Merck C8 reversert fasekolonne (10 x 250 mm). Buffer A besto av vann med 0,1 % TF A og buffer B besto av acetonitril med 0,1 % TFA. Gradienten besto av 20 til 40 % buffer B over 40 minutter og en gjennomstrømningshastighet på 2 ml/minutt. Et elektrospray massespektrometer ble utført med en Perkin Eimer PE-SCIEX API 150ex enkel kvad. Analyse av aminosyrene ble utført på en Beckman modell 6300, analyseanordning.

Elektroforetiske mobilitetsforskvvningstester

De 59 nukleotidene i TAR RNA som inneholder den essensielle pyrimidin UUU-gruppen ble fremstilt in vitro ved transkripsjon med RNA polymerase T3. Bindingsreaksjonsblandingene (20 inneholdt 0,2 nmol radiomerket TAR RNA, 0-100 ng Tat i TK-buffer (50 mM Tris pH 7,4, 20 mM KC1, 0,1 % Triton X-100). Kompleksene ble separert fra det ubundne RNA ved elektroforese på 8 % denaturerende polyakrylamidgeler som inneholdt 0,1 % Triton X-100. Gelen ble forkjørt i 30 minutter før prøven ble opplastet (20 Elektroforesen ble fortsatt i 90 minutter ved ca. 200 V. De relative mengdene av fri og/eller bundet RNA ble bestemt ved fosforbilleddannelse.

Sirkulær dikroisme ( CD)

De sirkulære dikroismespektra ble målt med en optisk veilengde på 50 \ im fra 260 til 178 nm på et Jobin-Yvon CD UV-spektrofotometer (Long-Jumeau, Frankrike)

(Mark VI). Instrumentet ble kalibrert med (+)-10-kamfersulfonsyre. Et forhold på 2,1 ble funnet mellom det positive CD-båndet på 290,5 nm og det negative båndet på 192,5 nm. Dataene ble oppsamlet med et intervall på 0,5 nm med en skanningshastighet på 1 nm per minutt. CD-spektrene ble plottet inn i form av Ae

per amid. Prøvene ble fremstilt i en fosfatbuffer ved 20 mM (pH 4,5). Proteinkonsentrasjonen var i et område på 0,5 til 1 mg/ml.

Transaktivering med celler transfektert med HIV LTR

Den funksjonelle transaktiveringen med en syntetisk Tat ble bestemt ved å bruke P4-celler. Disse CD4-HeLa-cellene bærer det bakterielle lacZ-genet under kontroll av HIV LTR og den cytoplasmatiske akkumuleringen av p-galaktosidase var strengt avhengig av nærværet av Tat. 80 % av konfluente celler platet på en 12-brønners plate ble innkubert i 24 timer ved 37°C, i nærværet av 5 % CO2, med Tat-proteinet inneholdt i et DMEM-medium tilsatt med 0,1 % BSA. Etter denne inkubasjonsperioden ble cellene vasket med fosfatbufret saltoppløsning og proteinene ble ekstrahert og analysert for P-galaktosidase med en kommersiell immunabsorpsjonstest som bruker et enzym koblet til et antigen (ELISA) for P-galaktosidase (Boehringer Mannheim, Frankrike), i henhold til produsentens instruksjoner. Verdiene ble normalisert ved å bruke konsentrasjonen av de totale proteinene i de forskjellige cellelysatene som bestemt av Bradfordmetoden.

Inhibision av transaktivering

De ovennevnte eksperimentene med transaktivering med celler transfektert med HIV LTR ble reprodusert, men denne gangen med tilsetting til kulturmediet enten av et anti-Tat Eli-serum eller av et anti-Tat Oyi-serum, eller av et anti-Tat Bru-serum. Tat-proteinet var for sin del oppnådd fra Eli-varianter.

Oppfinnerne observerte en inaktivering av transaktiveringen med anti-Tat Oyi antistoffene av Tat Eli-proteinet sammenlignet spesielt med kontrollmediet som ikke omfattet antistoffer.

2) MATERIALER OG METODER TILSVARENDE FIGUR 7

Immuniseringsbetingelsene er en intradermal injeksjon av 100 \ ig renset Tat-protein i 0,5 ml av 100 mM fosfatbuffer, pH 4,5, pluss 0,5 ml av Freunds fullstendige adjuvans (dag 0). En første "booster" blir utført på D21 under de samme betingelsene men med Freunds ufullstendige adjuvans (0,5 ml). En andre "booster" blir utført på D42 identisk til D41. Blod blir innsamlet på D53 i FST-rør og serumet blir oppnådd etter sentrifugering ved 2000 omdreininger/minutt. Fortynningen av serumet er 1/1000.

Elisa: Testen blir utført på en Maxisorp U96-plate (Polylabo). Proteinene i fosfatbuffer, pH 4,5, blir innkubert på platen natten over ved 4°C. Etter metning i MPBS-buffer (8 g/l NaCl, 0,2 g/l KC1, 1,44 g/l Na2HP04, 0,24 g/l KH2P04, 5 % skummet melk justert til pH 7,4 med HC1), blir proteinene innkubert med kanin primært antistoff i 1 time. Deretter innkubering med et geit antistoff koblet til peroksidase spesifikt for kanin Fc-fragment (Cappel) i 1 time. Detekteringen blir utført i nærværet av H2O2, 100 mM sitronsyre, 50 mM NaOH og 0,2 mg/ml ABTS (Boehringer). Absorbansen blir lest ved 405 nm.

Uten fortynning er anti-Tat Eli-serum i stand til å gjenkjenne alle Tat-variantene eller derivatene.

3) MATERIALER OG METODER FOR WESTERN BLOTTING

Western blotting: Proteinene blir først denaturert i nærværet av 3 M Tris-HCl, pH 8,8, 5 % P-merkaptoetanol, 2 % SDS, 10 % glyserol og bromfenolblått. De blir separert ved elektroforese på 15 % polyakrylamidgel. Proteinene blir deretter overført på nitrocellulosemembraner slik at de kan detekteres ved immundeteksjon. De spesifikke stedene blir blokkert med en PBS-oppløsning (8 g/l NaCl, 0,2 g/l KC1, 1,44 g/l Na2HP04, 0,24 g/l KH2P04, justert til pH 7,4 med HC1) inneholdende 5 % skummet melk. Nitrocellulosemembranen blir innkubert med kanin primært antistoff i 1 time. Deretter innkubering med et geit antistoff koblet til peroksidase spesifikt for kanin Fc-fragment (Sigma). Detektering ble utført i nærværet av H2C02, PBS og diaminobenzamidin. (Fotografi av gelen er ikke vist i foreliggende oppfinnelse).

4) MATERIALER OG METODER TILSVARENDE FIGUR 8

Transaktiveringen blir målt med humane HeLa-celler transfektert med HIV-1 LTR og et rapportørgen for (3-galaktosidaseproteinet (LacZ) i henhold til protokollen beskrevet i figur 5.

Seraene blir oppnådd fra kaniner i henhold til protokollen beskrevet for figur 7.

100 |il av tre anti-Tat-sera, nemlig anti-Tat Eli, anti-Tat Oyi og anti-Tat Bru cmC i økende fortynninger blir tilsatt et cellekulturmedium, fulgt av 100 jil av Tat Eli-varianten ved 1 eller 5 ^iM. Den cytoplasmatiske akkumuleringen av P-galaktosidase avhenger derfor av nærværet av Tat.

For det første er det observert at ved ekvivalent fortynning er anti-Tat Eli-serumet det mest effektive. Dette er logisk fordi serumet inneholder antistoffer produsert mot den samme varianten som den hvis transaktiveringsaktivitet er søkt å nøytralisere. Imidlertid skal det understrekes at Tat Oyi er i stand til å danne antistoffer som signifikant nøytraliserer transaktiveringsaktiviteten til Tat Eli. Denne inhibisjonen er faktisk større enn den observert spesielt for 1/10 fortynning brukt med anti-Tat Bru cmC-serum. Dette bekrefter fordelen til anti-Tat Oyi antistoffer mot andre Tat-varianter.

REFERANSER

Alizon, M., Wain-Hobson, S., Montagnier, L., & Sonigo, P. (1986) Cell 46, 63-74.

Barany, G. & Merrifield, R.B. (1980) in Gross, E., & Meinhofer, J. (Eds) The peptide: Analysis, Synthesis, Biology. Academic Press, New York, Vol. 2, pp 1-284.

Barre-Sinoussi, F., Chermann, J.C., Rey, F., Nugeyre, M.T., Chamaret, S., Gruest, J., Dauguet, C, Axler-Blin, C, Vezinet-Brun, F., Rouzioux, C, Rozenbaum, W. & Montagnier, L. (1983) Science 220, 868-871.

Clavel, F. & Charneau, P. (1994) J. Virol 68, 1179-1185.

Corpet, F. (1989) Nucl. Acid. Res. 22, 10881-10890.

Delaporte E., Janssens W., Peeters M., Buve A., Dibanga G., Perret J.L., Ditsambou V., Mba J.R., Courbot M.C., Georges A., Borgeois A., Samb B., Henzel D. , Heyndrickx L., Fransen K., van der Groen G., Larouze B. (1996) AIDS 8, 903-910.

Grégoire, C, & Loret, E.P. 1996. J. Biol. Chem. 271, 22641-22646.

Huet, T., Dazza, M.C., Brun-Vezinet, F., Roelants, G.E. & Wain-Hobson, S. 1989 AIDS 3, 707-715.

Jeang, K.T. (1996) in Los Alamos National Laboratory (Ed) HIV-1 Tat: Structure & Function Human Retroviruses & AIDS compendium. III, pp 3-18.

Jeang, K.T., Xiao, H. & Rich, E.A. (1999) J. Biol. Chem. 274, 28837-28840.

Le Buanec, H., Lachgar, A., Bizzini, B., Zagury, J.F., Rappaport, J., Santagostino, E. , Muca-Perja, M. & Gringeri, A. 1998. Biomed. Pharmacother 10, 431-435.

0'Brien, W.A., Koyanagi, Y., Namazie, A., Zhao, J.Q., Diagne, A., Idler, K., Zack, J.A. & Chen, I.S. (1990) Nature 348, 69-73.

Westendorp, M.O., Frank, R., Ochsenbauer, C, Stricker, K., Dhein, J., Walczak, H., Debatin, K.M. & Krammer, P.H. 1995 Nature 375, 497-500.

Zhu, T., Korber, B.T., Nahmias, A.J., Hooper, E., Sharp, P.M. & Ho, D.D. (1998) Nature 391, 594-597.

Claims (9)

1. Anti-HI V-1 - vaksine, karakterisert ved at den omfatter et HIV-1 Tat Oyi variant protein, som omfatter mellom 99 og 106 aminosyrer, som er i stand til å bindes til TAR og ikke i stand til transaktivering, hvori nukleotidesekvensen til Tat har minst en mutasjon sammenlignet med nukleotidsekvensen til en funksjonell Tat, og hvor mutasjonen påvirker minst ett av cysteinene i Tat-proteinet, i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer og, hvor det egnet, en eller flere egnede immunitetsadjuvanser.

2. Vaksine som angitt i krav 1, karakterisert ved at den er kjemisk syntetisk Tat.

3. Vaksine som angitt i krav 2, karakterisert ved at Tat er syntetisert i en fast fase.

4. Vaksine som angitt i krav 1, karakterisert ved at den er en rekombinant Tat.

5. Anti-HI V vaksine, karakterisert ved at den inneholder en ekspresjonsvektor som omfatter en nukleotidsekvens som koder for et HIV-1 Tat-protein som definert i krav 1, og elementene som er nødvendige for dens ekspresjon.

6. Vaksine som angitt i krav 1, karakterisert ved at den omfatter minst den N-terminale regionen og/eller den basale regionen til Tat-sekvensen.

7. Vaksine som angitt i ett av kravene 1 til 6, karakterisert ved at Arg-Gly-Asp-regionen plassert i den C-terminale enden av Tat er modifisert.

8. Fremgangsmåte til å fremstille anti-Tat polyklonale antistoffer som er i stand til å gjenkjenne flere Tat-varianter, som omfatter: - immunisering av et dyr, unntatt mennesker, ved hjelp av injeksjon av et Tat-protein som definert i krav 5 kombinert med en immunresponsadj uvans, - rensing av de spesifikke antistoffene inneholdt i serumet til de immuniserte dyrene, karakterisert ved at Tat-proteinet brukt i immuniseringstrinnet tilsvarer Oyi eller Bru cmcC-varianten.

9. Fremgangsmåte til å syntetisere en Tat-variant som angitt i ett av kravene 1, 6 og 7, karakterisert ved at den anvender beskyttende grupper av FMOC-typen, fortrinnsvis av den hurtige FMOC-typen.