NO326603B1 - Anti-HIV-1 vaksine som omfatter et HIV-1 TAT Oyi protein eller ekspressjonsvektor omfattende nukleotidsekvens som koder for variantproteinet og fremgangsmate for fremstilling av anti-Tat polyklonale antistoffer og fremstilling av Tat-varianten - Google Patents
Anti-HIV-1 vaksine som omfatter et HIV-1 TAT Oyi protein eller ekspressjonsvektor omfattende nukleotidsekvens som koder for variantproteinet og fremgangsmate for fremstilling av anti-Tat polyklonale antistoffer og fremstilling av Tat-varianten Download PDFInfo
- Publication number
- NO326603B1 NO326603B1 NO20014841A NO20014841A NO326603B1 NO 326603 B1 NO326603 B1 NO 326603B1 NO 20014841 A NO20014841 A NO 20014841A NO 20014841 A NO20014841 A NO 20014841A NO 326603 B1 NO326603 B1 NO 326603B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- tat
- hiv
- protein
- vaccine
- variant
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 38
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 37
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 title claims abstract description 34
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims description 14
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims description 3
- 229940033332 HIV-1 vaccine Drugs 0.000 title description 6
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 claims abstract description 150
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 26
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 claims description 33
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 32
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 28
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 12
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 12
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 11
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 10
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 8
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 claims description 7
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 7
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 4
- 229940033330 HIV vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 claims description 3
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 3
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical group NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims description 2
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 claims description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 claims 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 8
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 6
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 6
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 5
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 5
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000036449 good health Effects 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 2
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000006743 cytoplasmic accumulation Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011841 epidemiological investigation Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 2
- 108700004027 tat Genes Proteins 0.000 description 2
- 101150098170 tat gene Proteins 0.000 description 2
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 1,1-ethanedithiol Chemical compound CC(S)S DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RDJLIBMVLWBMKX-UHFFFAOYSA-N 1-(3,4-dihydro-2h-chromen-2-ylmethyl)piperidine Chemical compound C1CC2=CC=CC=C2OC1CN1CCCCC1 RDJLIBMVLWBMKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CXBDYQVECUFKRK-UHFFFAOYSA-N 1-methoxybutane Chemical compound CCCCOC CXBDYQVECUFKRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BSJFQLTXMSGMPX-UHFFFAOYSA-N 2,3-diaminobenzenecarboximidamide Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC(N)=C1N BSJFQLTXMSGMPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BYXHQQCXAJARLQ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BYXHQQCXAJARLQ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- PNPYKQFJGRFYJE-GUBZILKMSA-N Lys-Ala-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PNPYKQFJGRFYJE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 108010017893 alanyl-alanyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MIOPJNTWMNEORI-UHFFFAOYSA-N camphorsulfonic acid Chemical compound C1CC2(CS(O)(=O)=O)C(=O)CC1C2(C)C MIOPJNTWMNEORI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000001688 heteronuclear two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000000423 heterosexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003322 phosphorimaging Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000009979 protective mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012514 protein characterization Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000011894 semi-preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 208000010648 susceptibility to HIV infection Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
- C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
- C12N2740/16334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/974—Aids related test
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/975—Kit
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Det er beskrevet en oppfinnelse som angår en anti-HTV-1 -vaksine som omfatter hele eller delen av Tat HTV-1 -proteinet, i tillegg til identifikasjon av nevnte protein hos individer affisert av HIV. Tat-proteinet er et protein av HIV-1 Oyi-varianten.
Description
Hensikten med den foreliggende oppfinnelsen er en anti-HIV-1-vaksine som omfatter HIV-1 Tat Oyi variantproteinet og fremstilling av monoklonale eller polyklonale antistoffer som er i stand til å gjenkjenne flere Tat-varianter.
Hensikten med foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av regulatorisk protein i human immunsviktvirus (HIV), Tat-proteinet, som en vaksine mot dette viruset.
Tat er et viralt protein som er essensielt for uttrykket av de virale gener og replikasjon av HIV-1-viruset. Tat-genet er sammensatt av to eksoner som koder et protein på 99 til 106 residuer avhengig av isolatene. En Tat-aktivitet med former som inneholder opp til 86 residuer har imidlertid en del av den C-terminale enden som er blitt deletert og har allerede blitt beskrevet. Disse Tat-derivatene med 86 residuer er tenkt å være laboratorieartefakter eller nedarvede former som ikke lenger eksisterer i naturlig tilstand. Dette proteinet tillater aktivering av HIV-1-genene ved hjelp av at det festes til et nukleotidmål som kalles TAR lokalisert på 5'-enden av HIV-1 mRNA. Det blir sekrert av celler infisert med HIV og er essensielt for en effektiv revers transkripsjon av HIV-1. Når den er på utsiden av cellen er den i stand til å aktivere fjerninfiserte celler og å indusere immunsvikt i ikke-infiserte T-celler. I tillegg er den direkte involvert i AIDS-relaterte patologiske tilstander så som Kaposis sarkom.
Utvikling av en vaksine mot AIDS er i stor grad ønsket av hele verden, men produksjonen av en vaksine mot AIDS har to viktige vanskeligheter. Den første er koblet til den ekstreme variabiliteten av kappeproteinet GP120. Den andre vanskeligheten skyldes det faktum at anti-GP120 antistoffer synes å alvorliggjøre sykdommen for pasienter med utviklet AIDS. Imidlertid angir preliminære resultater at en beskyttende virkning kunne være mulig med anti-GP120 antistoffer hos folk som ikke tidligere er blitt kontaminert. En fase II med en anti-GP120-vaksine har blitt igangsatt av firmaet Roche i De Forente Stater. Kohortene valgt for denne fase II er vel overvåket fra et medisinsk synspunkt. Det vil imidlertid være vanskelig å oppnå en ekvivalent medisinsk overvåkning når vaksinen blir markedsført.
Med GP120, blir Tat detektert i blodet hos pasienter infisert med HIV-1. Aktiviteten til makrofagene og de cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) ansvarlige for eliminering av alle celler infisert med en virus blir gradvis blokkert av Tat, som derfor virker som et immunundertrykkende middel. Anti-Tat-antistoffer (eller aktive ingredienser som målretter Tat) skulle tillate gjenoppretting av aktiviteten av CTL og av makrofagene.
Tat er derfor et favorisert mål både for utviklingen av anti-Tat antivirale midler og for en vaksinetilnærming.
DE-A-195 14 089 og US 5,891,994 tilkjennegir fremstillingen av antistoffer ved dyreimmunisering med en del av Tat-proteinet. Den potensielle interessen for HIV-1 Tat-proteinet i en vaksine mot AIDS har også blitt beskrevet i 1996 av Goldstein (Nature Medicine), der nevnte Tat-protein likevel omfatter 72 aminosyrer.
Tat-proteinet har derfor blitt gjenstand for eksperimenter. Prekliniske forsøk, oppnådd med et biologisk inaktivt rekombinant Tat-protein (Tat-toksoid) har vist spesielt at Tat-toksoidet forårsaker, i seronegative pasienter, en høy og vedvarende produksjon av anti-Tat antistoffer (Le Buanec et al., 1998). I seropositive og immunsviktende pasienter, er en signifikant økning i anti-Tat antistoffnivået observert sammenlignet med det normale anti-Tat antistoffnivået (Westendorp et al., 1995).
Dette Tat-toksoidet er et rekombinant protein som er gjort biologisk inaktivt etter karboksymetylering av Tat-cysteinene. Oppfinnerne har også vært i stand til å produsere et karboksymetylert Tat (Tat Bru cmC) og de har også observert et tap av transaktiveringsaktiviteten selv om den samme Tat-varianten med de frie cysteinene (Tat Bru fC) er i stand til transaktivering. Tat Bru cmC er i stand til å bindes til TAR med en sammenlignbar affinitet til Tat Bru fC.
En viktig ulempe ved anvendelsen av karboksymetylert Tat som en vaksine er at den kjemiske modifikasjonen av cysteinene forårsaker konformasjonelle forandringer som oppfinnerne observerte ved sirkelformet dikroisme og NMR. Skjønt konformasjonelle forandringer eksisterer blant de forskjellige Tat-variantene, forårsaker karboksymetylering av cysteinene viktige modifikasjoner i foldingen av peptidkjeden til Tat som følgelig ikke er en god kandidat til fremstillingen av en anti-Tat-vaksine.
Det er derfor tilrådelig å bruke, i en anti-HIV-1-vaksine, et Tat-protein som er defekt men som har strukturelle egenskaper lik de funksjonelle Tat. Denne Tat burde virkelig ha en tredimensjonal struktur som'er så tett opptil de naturlige Tat-proteinene som mulig slik at de er i stand til å indusere en lik immunrespons til den
t
indusert av de naturlige Tat, men som ikke kan transaktivere, det vil si, som indikert overfor, er inkapable til å aktivere fjerninfiserte celler og å indusere immunsvikten til ikke infiserte T-celler. Det er virkelig kritisk å inhibere denne immunsvikten.
Hensikten med den foreliggende oppfinnelsen er en anti-HIV-1-vaksine som omfatter et HIV-1 Tat Oyi variantprotein, som omfatter mellom 99 og 106 aminosyrer, som er i stand til å bindes til TAR inkapabel til transaktivering, der nukleotidsekvensen har minst en mutasjon sammenlignet med nukleotidsekvensen til en funksjonell Tat, i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer og, hvor det er egnet, en eller flere passende immunitetsadjuvanser. Dette Tat-proteinet skulle være i stand til å danne, i et dyr som dette proteinet kan administreres til, en produksjon av antistoffer som er i stand til å gjenkjenne andre varianter av dette proteinet og på et nivå som er tilstrekkelig til å inhibere transaktiveringen av nevnte varianter.
I henhold til en fordelaktig utforming av oppfinnelsen, så omfatter Tat-proteinet 101 aminosyrer.
Tat-proteinet som kan brukes i vaksinen i henhold til oppfinnelsen bør derfor være forskjellig fra de funksjonelle Tat-proteiner som er betegnet som "naturlige", det vil si som blir ekstrahert fra forskjellige HIV-1-stammer tilstede i naturlig tilstand, slik at de er i stand til å være inkapable til transaktivering mens de bindes til TAR. Dette er årsaken til at Tat brukt i vaksinen i henhold til oppfinnelsen har en nukleotidsekvens som har minst en mutasjon sammenlignet med nukleotidsekvensen til en funksjonell Tat. Denne mutasjonen, som generelt er en punktmutasjon, kan for eksempel gi opphav til undertrykking, tilføying eller substitusjon av en eller flere aminosyrer.
I sammenheng med deres undersøkelser, studerte oppfinnerne aller først Tat-varianten som tilsvarer Bru-isolatet (86 residuer) og syntetiserte deretter fem andre varianter som hver var representative for den strukturelle diversiteten observert hos dette proteinet (Grégoire et Loret, 1996): Tat Z2 (86 residuer), Tat Mal (87 residuer), Tat Eli (99 residuer), Tat Oyi (101 residuer), og Tat Jr (101 residuer). 6 strukturelle grupper blant alle HIV-1-isolatene har således blitt bestemt i henhold til størrelsen på proteinene og typen av deres mutasjoner. Det var mulig at alle disse variantene hadde like farmakologiske aktiviteter til Tat Bru som er blitt syntetisert to ganger, med de karboksymetylerte cysteinene (Tat Bru cmC) og deretter med de frie cysteinene (Tat Bru fC). Kjemien benyttet er av fastFmoc-type med HBTU-aktivator. Rensingen av proteinene ble utført ved HPLC. Det er blitt funnet at alle disse syntetiske proteinene er i stand til å bindes til TAR men store ulikheter er blitt observert i transaktiveringstesten med HeLa-celle. Det mest overraskende resultatet var fraværet av transaktivering observert med Tat Oyi-varianten. Det var heller ingen transaktivering observert med Tat Bru-derivatet som har de karboksymetylerte cysteinene. Det vandige fase sirkulære dikroisme (CD) studiet på disse syntetiske proteinene viser virkelig at den kjemiske modifikasjonen av Tat Bru cmC signifikant modifiserte strukturen til Tat Bru. På den annen side, har Tat Oyi en lignende struktur til de andre som konfirmert ved dets CD-spektrum.
HIV-1 Oyi-stammen ble identifisert hos en gabonsk pasient (mer presist en gravid kvinne) i 1988 (Huet et al., 1989). Denne pasienten var fullstendig frisk, skjønt hun hadde vært seropositiv i mange år. Tilsynelatende hindret det faktum at et defekt Tat-protein var til stede i denne HIV-1-stammen utvikling av AIDS hos denne pasienten og ga henne immunitet mot AIDS-viruset. De epidemiologiske undersøkelsen utført i felten har virkelig vist at pasienter infisert med HIV-1- Oyi ikke utviklet sykdommen over lang tid.
HIV Oyi-stammen hører til undertype B som tilsvarer HIV-stammene som er de mest forekommende i Europa og Nord-Amerika. Den gabonske kvinnen i hvilken HIV Oyi-stammen ble identifisert hørte til en gruppe på 31 mennesker som var lokalisert i den landlige provinsen i Haut Ogooué i den sydøstlige delen av Gabon. Denne gruppen ble identifisert i 1986 under en seroepidemiologisk analyse utført på ca. 2000 mennesker infisert i hele Gabon. Denne Haut Ogooué-gruppen hadde tiltrukket seg oppmerksomhet fordi de infiserte menneskene var ved god helse og utviste også en fullstendig atypisk Western blot-profil. I virkeligheten var det ikke mulig hos disse menneskene å detektere nærvær av anti-gp 120, anti-gp 160 og anti-gp 41 antistoffer mens anti-gag og anti-pol antistoffer ble identifisert (Huet et al., 1989).
En gruppe på 750 gravide kvinner fra den samme Haut Ogooué-provinsen ble deretter undersøkt og viste at 25 av dem (det er 3,3 %) var HIV-positive ved ELISA-testen. Blant disse 25 kvinnene hadde 23 en atypisk Western blot-profil karakterisert ved regionen (se ovenfor). Omkring 10 av disse kvinnene ble fulgt opp i 2 år inkludert henne som hadde HIV-1 Oyi-stammen. Under denne perioden hvorved den atypiske serologiske profilen forble konstant og som ekskluderer muligheten av en nylig infeksjon som ikke ville ha blitt gitt tid til dannelse av anti-gp 120 antistoffer. Nærværet av en HIV-2-infeksjon ble ekskludert fordi det ikke var noen reaksjon på HIV-2- gag og bare 2 tilfeller av HIV-2-infeksjon er blitt rapportert i Gabon, lokalisert i en kystregion. Alle pasientene som var overvåket forble ved god helse uten vekttap eller opportunistiske sykdommer i løpet av de 2 årene studiet varte (Huet et al., 1989).
Kvinnen som ble identifisert med Oyi var av landlig opprinnelse, ved god helse og seronegativ for HTLV-1 og HIV-2. Samkulturen av hennes lymfocytter med PPMC ga en RT-aktivitet bare etter 15 dager, noe som er meget uvanlig. Viruset hadde også en nesten udetekterbar cytopatisk aktivitet. Skjønt kultursupernatanten tillot infeksjon av PBMC, var praktisk talt ingen replikasjon mulig på normale lymfocyttiske linjer, så som H-9 og CEM eller U-937-monocytter. For å validere denne analysen, ble lignende resultater observert med 17 andre pasienter fra samme region, og konfirmerte fravær av anti-gp 120 antistoffer i alle tilfellene. Det er av interesse å notere seg at serum fra en normal HIV-1-donor er i stand til å gjenkjenne HIV-1 Oyi gp 120 (Huet et al., 1989). HIV-1 Oyi-viruset ble derfor klonet, og sekvenseringen ga ingen feil unntatt for Tat-genet (Huet et al., 1989). Mutasjonen av Cys 22 til Ser synes å være årsaken til tapet av transaktiveringen og reversjon av denne mutasjonen gjør det mulig å gjenopprette Tat-aktiviteten.
Videre ble det observert at i fraværet av Tat er reproduksjonen av viruset mulig, men på et meget lavt nivå. Det er derfor et tett slektskap mellom virulensen av HIV og Tat transaktiveringseffektiviteten. Den epidemiologiske undersøkelsen viser igjen det tette slektskapet som eksisterer mellom mortaliteten fra denne sykdommen og graden av replikasjon av HIV. Tat synes derfor å tillate HIV å nå den replikasjonsgraden som forandrer den virale infeksjonen til en dødelig sykdom.
Videre viser denne undersøkelsen av disse atypiske pasientene fra Haut Ogooué-regionen den beskyttelsen som de defekte HIV-stammene ville synes å tilveiebringe sammenlignet med de normale HIV-stammene. PCR-analyse av lymfocytter nylig innsamlet fra flere atypiske pasienter er virkelig ment å ha vist nærvær av normale HIV-stammer. Den beskyttende mekanismen involverer ikke anti-gp 120 antistoffer, idet de siste er fraværende hos disse pasientene. Virkningen av de cytotoksiske T-lymfocyttene kunne være mekanismen som tillot utradering av viruset.
Et relativt nylig epidemiologisk studie utført i Gabon (Delparte et al., 1996) indikerer en lav prosentandel av mennesker infisert med HIV (2 til 3 %) sammenlignet med andre afrikanske land. Oyi-undertypen synes å ha forsvunnet fullstendig fra populasjonen og den gabonske kvinnen fra hvem HIV-1 Oyi-stammen ble tatt var ved perfekt helse i 1995 og hadde født 3 barn som alle var seronegative. HIV-1 Oyi-viruset var ikke lenger detekterbart hos henne.
Tat-proteinet i HIV-1 Oyi-varianten synes derfor å være den beste kandidaten til å lage en sammensetning med anti-HIV-1-vaksine. Et inaktivert Tat er imidlertid ikke nødvendigvis immunogent. Når er hele den gunstige virkningen av en vaksine å igangsette produksjonen av antistoffer, og videre, i foreliggende tilfelle antistoffer som også er aktive mot andre Tat-varianter. Overraskende har oppfinnerne vært i stand til å demonstrere dette. Vaksinen i henhold til foreliggende oppfinnelse omfatter derfor, i henhold til en spesielt fordelaktig utforming, hele eller del av Tat, i HIV-1 Oyi-varianten.
Fordelene med en anti-Tat-vaksine kan til og med bli forestilt seg på flere nivåer. I asymptomatiske pasienter ville det være mulig å forsinke utviklingen mot AIDS ved å begrense immunsvikten. En slik vaksine ville tillate pasienten å opprettholde en effektiv immunitet mot viruset, som synes å være tilfelle begynnelsen av infeksjonen. Spesielt ville gjenoppretting av aktiviteten til de cytotoksiske T-lymfocyttene (CTL) og av makrofagene, som ikke er infisert av HIV men hvis aktivitet blir inhibert av Tat, ha den konsekvensen at den tillater pasientene å ikke utvikle sykdommen.
Hos pasienter med erklært AIDS, ville en anti-Tat-vaksine kunne begrense forekomsten av visse patologiske tilstander så som Kaposis sarkom eller nevrologiske syndromer som synes å være koblet til en direkte virkning av Tat-proteinet etterfulgt av deres sekresjon fra HIV-infiserte celler.
Fordelen med HIV-1 Oyi-varianten i sammenheng med foreliggende oppfinnelse er videre konfirmert av Western blot-eksperimenter (gelfotografer ikke vist i foreliggende søknad) og Elisa-testen utført av oppfinnerne for å bestemme om det var kryssgjenkjennelse mellom de forskjellige Tat-variantene.
I disse to typene av eksperimenter ble tre forskjellige anti-Tat-sera virkelig testet mot syv Tat-varianter.
Oppfinnerne immuniserte kaniner med Tat Oyi, Tat Bru cmC og Tat Eli i henhold til en konvensjonell immuniseringsprotokoll i nærværet av Freunds adjuvans. De polyklonale sera oppnådd etter 53 dager ble analysert ved Western blotting og en Elisa-test. De observerte titrene var henholdsvis 700, 11 og 660 pM for anti-Oyi, anti-Bru cmC og anti-Eli antistoffer.
Under denaturerende betingelser viser Western blot-eksperimentene at anti-Tat Oyi-serumet og anti-Tat Eli-serumet er ute av stand til å vise kryssimmunogenisitet med alle variantene som er tilfellet med anti-Tat Bru cmC-serumet.
Tat Bru cmC er en variant hvis cysteiner er karboksymetylerte. Denne kjemiske modifikasjonen av cysteiner forårsaker ikke bare tap av transaktiveringsaktivitet (Péloponése et al., 1999) men også tap av den 3D-strukturen av denne varianten som konverterer til en tilfeldig spiral (upubliserte resultater). Det er derfor ikke overraskende å observere at anti-Tat Bru cmC-serumet er i stand til å gjenkjenne alle variantene når de er denaturert.
Under ikke-denaturerende betingelser viser Elisa-testen (figur 7) at anti-Tat Oyi-serum er i stand til å gjenkjenne alle variantene som anti-Tat Bru cmC-serum. På den annen side er anti-Tat Eli-serum fremdeles ute av stand til å gjenkjenne alle variantene. Det synes derfor som om konserverte 3D-epitoper eksisterer i tallrike Tat-varianter. Bare den spesifikke immunogene karakteren til Tat Oyi gjør det imidlertid mulig å danne disse antistoffer i store mengder. Det er derfor en høy mulighet for nærværet av Tat i pasienter som er blitt underestimert opp til nå. Fortynningen av de tre sera er 1/1000.1 det samme eksperimentet, men uten fortynning, kan anti-Tat Eli-serum også gjenkjenne alle de andre Tat-variantene. Det er fordelaktig å notere seg at acetyleringen av lysin 50 i Tat Bru (Tat Bru K50) tillater gjenkjennelse ved anti-Tat Eli-serum i en lav konsentrasjon.
Disse eksperimentene utført med de tre kanin polyklonale sera konfirmerer derfor fordelen med Tat Oyi som en vaksine. Videre er anti-Tat Oyi-serum i stand til å inhibere transaktivering på HeLa-celler med Tat Bru eller Tat Eli. Anti-Tat Eli-serumet brukt som en kontroll viser at produksjonen av antistoffer fra til og med en aktiv variant ikke sikrer en kryssgjenkjennelse av alle Tat-variantene som observert med Tat Oyi. Tat Oyi som er en lang variant (101 residuer) tillater bedre gjenkjennelse av Tat-variantene sammenlignet med Tat Bru cmC som er en kort variant (86 residuer). HIV-I-stammer med korte Tat-varianter har praktisk talt forsvunnet og synes å ha vært et laboratorieartefakt (Jeang et al., 1999). Videre utviser anti-Tat Oyi-serum høy spesifisitet siden det ikke lenger gjenkjenner de denaturerte formene (eller lineære epitoper) av Tat-variantene. I motsatt tilfelle er det en signifikant risiko for at anti-Tat Bru cmC-serum skal danne autoimmune antistoffer hos mennesker på grunn av den høye strukturelle variabiliteten til Tat Bru cmC. Oppfinnerne observerte virkelig at antistoffer i stand til å gjenkjenne humant albumin eksisterte i anti-Tat Bru cmC-serum (data ikke vist).
Preserveringen av den tredimensjonale strukturen til minst en Tat-epitop er derfor essensiell for gjenkjennelse av andre Tat-varianter ved anti-Tat 3D antistoffer.
Videre har oppfinnerne også vist at anti-Tat Oyi antistoffer var i stand til å inhibere transaktivering av Tat Eli-proteinene.
Hensikten med foreliggende oppfinnelse er derfor også en fremgangsmåte til å fremstille anti-Tat monoklonale eller polyklonale antistoffer som er i stand til å gjenkjenne flere Tat-varianter. Det skal virkelig understrekes at disse antistoffene derfor kan brukes til å detektere, i individer som kan ha blitt infisert med HIV, nærværet av Tat-proteinet i deres blod uavhengig av varianten.
Den foreliggende oppfinnelsen angår derfor en fremgangsmåte til å fremstille anti-Tat polyklonale antistoffer som er i stand til å gjenkjenne flere Tat-varianter, som består av: - immunisering av et dyr, unntatt mennesker, ved hjelp av et Tat-protein, kjemisk syntetisert, kombinert med en immunresponsadjuvans, - rensing av de spesifikke antistoffene inneholdt i serumet til de immuniserte dyrene,
Der Tat-proteinet som blir benyttet i immuniseringstrinnet tilsvarer Oyi-varianten.
Immunisering av dyret kan utføres ved enhver fremgangsmåte til å innføre Tat-proteinet eller del av dette Tat-proteinet inn i dyret, så som injeksjon, innhalasjon, oral administrering, subkutan, intradermal, intraperitoneal, intravenøs eller intramuskulær.
Immuniseringen av dyret kan også utføres ved hjelp av en in vivo eller in situ ekspresjon av en vektor som ikke bare bærer sekvensen til Tat-proteinet som et hele eller delvis, men også hele systemet nødvendig for ekspresjonen av Tat-proteinet i henhold til teknikker velkjente for en person med kunnskap på området.
Rensing av de spesifikke antistoffene inneholdt i serumet til det immuniserte dyret kan for eksempel utføres på en affinitetskolonne til hvilken proteinet eller del av proteinet som tjener som antigen er blitt festet på forhånd.
Posisjonen til syv cysteinresiduer (region 22-37) er i stor grad konservert hos alle Tat-variantene og viktigheten av 6 av disse cysteinresidiuene for transaktiveringen er godt beskrevet i litteraturen (Jeang, 1996).
Oppfinnerne har, gjennom bestemmelse av 3D-strukturen til Tat Bru ved heteronukleær 2D NMR, videre identifisert et målområde som bør være konservert i Tat-variantene. Dette målet består delvis av den N-terminale regionen og den basale regionen for Tat-sekvensen.
Den 3D-strukturen til Tat Bru-varianten viser at regionen som er rik på cysteiner er nær det tredimensjonale rommet til den N-terminale regionen og til den basale regionen. Dette indikerer at karboksymetyleringen av cysteinene muligens modifiserer strukturen til dette målet og konfirmerer det faktum at Tat således modifisert ikke kan betraktes som en potensiell kandidat for fremstillingen av en anti-HIV-vaksine.
Videre har oppfinnerne utført fastfase kjemisk syntese av de forskjellige Tat-proteinene. På det nåværende kunnskapsnivået på området består fordelene presentert ved denne syntesemetoden i de lavere produksjonsomkostningene, bedre utbytte sammenlignet med Tat produsert ved molekylær biologi og fraværet av kontamineringer.
Således blir fordelaktig Tat brukt i vaksinen i henhold til oppfinnelsen fremstilt ved kjemisk syntese og mer spesielt ved fastfase kjemisk syntese, så som en syntese av FMOC, og fortrinnsvis fastFMOC, type. En syntesefremgangsmåte som benytter beskyttende grupper av denne type er også en hensikt med foreliggende oppfinnelse.
Tat brukt i vaksinen i henhold til oppfinnelsen kan imidlertid også syntetiseres på enhver annen måte, for eksempel ved hjelp av rekombinante teknikker velkjente for en person med kunnskaper på området. Disse klonings- og ekspresjonssystemene brukt i sammenheng med disse teknikkene kan avledes fra mikroorganismer så som Escherichia coli, Bacillus, Streptomyces og Saccharomyces men også fra gjær, insekt- og pattedyrceller. Baculovirus ekspresjonssystemer kan også vurderes. Helt klart vil vektorene som bærer sekvensen til Tat-proteinet som et hele eller deler omfatte hele ekspresjonssystemet som er nødvendig for å gjøre dette, i henhold til teknikker som er velkjente for en person med kunnskap på området.
Videre, for å unngå enhver mulig risiko for toksisitet på grunn av passasjen av Tat Oyi proteinet inn i membranene, vil det være tilrådelig å modifisere sekvensen Arg-Gly-Asp tilstede på C-terminus av sekvensen til alle Tat-variantene. Denne sekvensen er virkelig essensiell for membranpassering på grunn av at den gjenkjenner en membranreseptor på overflaten av cellene (Jeang, 1996). Mer spesielt kan denne modifikasjonen bestå av substitusjon av denne sekvensen med sekvensen Lys-Ala-Glu som ikke ville ha noen innflytelse på strukturen, eller muligens sekvensen Ala-Ala-Ala.
Som angitt ovenfor er det meget mulig at antallet mennesker infisert med HIV er blitt underestimert opp til nå på grunn av manglende mulighet til å detektere hos dem, for eksempel i deres blod, nærværet av Tat-proteinet. Fordelen med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe midler for å detektere det største mulige antallet av Tat-varianter ved hjelp av et begrenset antall antistoffer.
Oppsummert gjelder oppfinnelsen således en anti-HIV-1-vaksine som er kjennetegnet ved at den omfatter et HIV-1 Tat Oyi variant protein, som omfatter mellom 99 og 106 aminosyrer, som er i stand til å bindes til TAR og ikke i stand til transaktivering, hvori nukleotidesekvensen til Tat har minst en mutasjon sammenlignet med nukleotidsekvensen til en funksjonell Tat, og hvor mutasjonen påvirker minst ett av cysteinene i Tat-proteinet, i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer og, hvor det egnet, en eller flere egnede immunitetsadjuvanser.
Oppfinnelsen gjelder også en anti-HIV vaksine som er kjennetegnet ved at den inneholder en ekspresjonsvektor som omfatter en nukleotidsekvens som koder for et HIV-1 Tat-protein som definert ifølge oppfinnelsen, og elementene som er nødvendige for dens ekspresjon.
Til slutt vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte for å fremstille anti-Tat polyklonale antistoffer som er i stand til å gjenkjenne flere Tat-varianter, som omfatter: - immunisering av et dyr, unntatt mennesker, ved hjelp av injeksjon av et Tat-protein som definert ifølge oppfinnelsen kombinert med en immunresponsadjuvans, - rensing av de spesifikke antistoffene inneholdt i serumet til de immuniserte
dyrene,
kjennetegnet ved at Tat-proteinet brukt i immuniseringstrinnet tilsvarer Oyi eller Bru cmcC-varianten, og en fremgangsmåte for å syntetisere en Tat-variant som angitt ifølge oppfinnelsen, som er kjennetegnet ved at den anvender beskyttende grupper av FMOC-typen, fortrinnsvis av den hurtige FMOC-typen.
FIGURER
Figur 1: Sammenligning av de forskjellige Tat-proteinene.
Tat-proteinene ble delt opp i 6 strukturelle grupper som er nevnt i fet skrift i figur IA og understreket i figur IB.
Figur IA: Aminosyresekvensene til Tat-proteinene.
TatZ2 blir oppnådd fra et HIV-1-isolat nær de beslektede stammene fra viruset (Zhu et al., 1998). Tat Mal og Tat Eli blir oppnådd fra en HIV-1-stamme isolert i 80-årene i Sentral-Afrika i heteroseksuelle HIV-infeksjoner (Alizon et al., 1986). Tat Br omfatter sekvensen oftest brukt i laboratoriet og er oppnådd fra en HIV-1-stamme isolert i Frankrike (Barre-Sinoussi et al., 1983), mens Tat Jr blir oppnådd fra et amerikansk HIV-1-isolat (0'Brien et al., 1990). Tat Oyi er nært beslektet med Tat Jr og Tat Bru, men blir oppnådd fra en HIV-stamme identifisert i en frisk pasient i Gabon (Huet et al., 1989). Figur IB: Klassifisering av Tat-proteinene som en funksjon av deres størrelse og av mutasjoner som de omfatter for MULTALIN-programmet (Corpet, 1989). Figur 2; Sekvens av Tat-proteinet fra HIV-Oyi-varianten (beskrevet av Huet et al., 1989). Figur 3: Rensing av 6 Tat-varianter ved reversfase HPLC-kromatografi med C8 podede kolonner på 280 nm (se Materialer og metoder for den eksperimentelle prosedyren).
For hver ramme representerer den nederste kurven resultatene av peptidsyntesen før rensing, mens den øvre kurven representerer resultatet av syntesen etter det siste rensetrinnet. Tat Bru (A), Tat Jr (B), TatZ2 (C), Tat Oyi (D), Tat Mal (E) og Tat Eli (F) ble spaltet fra harpikset med TFA. Etter utfelling med butylmetyleter, ble proteinene oppløst i TFA-buffer ved 0,1 % (nedre kurve i hver ramme). For hvert protein ble rensingen utført med 2 påfølgende semipreparerende HPLC-kjøringer på Hybar Merk C8-kolonner (4,5 x 125 mm, gjennomstrømningshastighet 0,8 ml/minutt) og deretter ble de rene fraksjonene analysert (øvre kurve i hver ramme) og identifisert ved massespektrometri og ved analyse av aminosyrene (data ikke vist). I hvert tilfelle er det observert at den prinsipale HPLC-toppen representerer den fullstendige sekvensen. Toppene mellom 10 og 15 min representerer derivater av 50 residuer mens toppene nær ved de prinsipale fraksjonene er derivater med 1 til 15 delesjoner fra den N-terminale enden. De sterkt hydrofobe fraksjonene er derivater med en høy molekylvekt sannsynligvis på grunn av de ufullstendige ubeskyttede sidekj edene.
Figur 4: Måling av affinitetskonstanten til de syntetiske Tat for nukleotidmålet TAR ved elektroforese (se testene for elektroforetiske mobilitetsforskyvninger under Materialer og metoder).
Proteinkonsentrasj onen (ng/^il) er angitt på toppen av hvert gelbånd. Det frie eller komplekserte RNA blir identifisert ved henholdsvis/(for fri) og c. Det samme RNA-preparatet blir brukt for titrering med de 6 proteinene. Et Tat Bru-derivat med karboksymetylerte cysteiner (Bru CmC) ble også testet. Dissosiasjonskonstantene ved likevekt (Kd) ble målt direkte fra elektroforetiske mobilitetsforskyvningstester. Kd-verdiene varierer omtrentlig fra 50 nm for Tat Eli og Tat Mal til omkring 140 nm for Tat Oyi og Tat Jr. Videre har oppfinnerne notert seg at i tillegg til variasjonen i Kd-verdier, er bindingsprofilene med de forskjellige proteinene noe forskjellige. For eksempel lave konsentrasjoner av Tat Bru produserer et enkelt godt oppløst kompleks og det er bare med heller høyere konsentrasjoner (> 4,5 ng/jil) at aggregater dannes og som ikke kan penetrere inn i akrylamidgelene. I kontrast til dette blir multimere komplekser lett identifisert med Tat Eli selv ved lave konsentrasjoner. Det er mulig å observere opptil 3 retarderte bånd med Tat Eli og i en mindre grad med Tat Jr. Slike effekter er ikke observert med kortere proteiner, så som Tat Bru og Tat Mal for eksempel, og med Tat Oyi som er et lengre protein.
Figur 5: Test på transaktivering av de syntetiske Tat-proteinene på HeLa-celler. Disse cellene blir transfektert med HIV-1 LTR med hvilket et LacZ rapportørgen er assosiert. Nivået til P-gal-protein produsert er proporsjonalt til transaktiveringskapasiteten til de forskjellige syntetiske Tat. LTR inneholder DNA-sekvensene nedstrøms og oppstrøms som er nødvendige for transkripsjon av HIV og TAR, er tilstede i begynnelsen av mRNA (Claven og Charneau, 1994). De cellulære kofaktorene nødvendige for transaktiveringen av HIV er tilstede i HeLa-cellene. Uten Tat er det en basal ekspresjon av P-gal som er angitt som en kontroll
(C). Det neste histogrammet viser transaktiveringen observert med de forskjellige Tat-variantene ved å bruke to konsentrasjoner: 1 |iM (lys grå søyle) og 5 |J,M (mørk
grå søyle). I hvert tilfelle blir Tat tilsatt den cellulære bufferen og derfor betyr en høyere ekspresjon av p-gal enn kontrollen at det syntetiske Tat er i stand til å krysse de nukleære og cytoplasmatiske membraner, til å bindes til TAR og til å interagere med cellulære kofaktorer. Bare Tat Bru cmC (data ikke vist) og Tat Oyi
er defekte i dette eksperimentet mens de bindes til TAR (figur 1). Tat Mal og Tat Eli viser et transaktiveringsnivå 3 til 4 ganger høyere enn det til Tat Bru. Tat Z2, det nærmeste av de nedarvede Tat-proteinene, utviser et lavt transaktiveringsnivå og evolusjonen kunne begunstige HIV-1-isolatene med en mer effektiv Tat. Lignende resultater er blitt oppnådd med andre transfeksjonstester ved å bruke luciferase som rapportørgenet og Tat Mal og Tat Eli ved 1 ^iM virkelig transaktiverte LTR på et sammenlignbart nivå til det oppnådd med en transaktivert Tat-pCMV (data ikke vist). Konsentrasjonsområdet brukt i de forskjellige eksperimentene strekker seg fra 0,1 ^iM til 10 ^iM (data ikke vist). Ved 0,1 \ lM viser bare Tat Eli et signifikant høyere transaktiveringsnivå enn det basale nivået. Ved 10 u,M viser de 6 Tat slike høye transaktiveringsnivåer at det er umulig å observere forskjellene mellom dem på grunn av metningen.
Figur 6: Dikroiske spektra av Tat Z2 (hvit trekant), Tat Oyi (svart trekant), Tat Bru (hvit ring), Tat Bru cmC (intet symbol), Tat Jr (svart ring), Tat Mal (hvit firkant) og Tat Eli (svart firkant) varianter.
Spektrene er målt i fosfatbuffer ved 20 mM, pH-verdi 4,5; de er registrert fra 260 til 178 nm med en optisk veilengde på 50 \ im. Forskjellene observert i CD-spektraet angir en strukturell heterogenitet mellom Tat-variantene uavhengig av deres størrelse. Det er ikke mulig å samle CD-spektraet i 2 kategorier som består av korte Tat (hvite symboler) og lange Tat (svarte symboler). CD-spektrene er karakterisert av et negativt bånd nær 200 nm typisk for de uorganiserte strukturene. Den intense størrelsen til båndet på 200 nm observert med Tat Bru cmC viser at modifikasjonen til cysteinene har forårsaket store konformasjonelle forandringer sammenlignet med de andre Tat. Figur 7; Elisa-tester utført med tre fortynninger av kanin polyklonale sera (anti-Tat Bru cmC, anti-Tat Oyi og anti-Tat Eli) med hensyn på 7 varianter av Tat-proteinet under denaturerende betingelser. Figur 8: Inhibisjon av transaktiveringen ved Tat Eli med anti-Tat Eli, anti-Tat Oyi og anti-Tat Bru cmC-sera.
Den foreliggende oppfinnelsen er ikke begrenset til ovenstående beskrivelser. Den vil forstås klarere i lys av eksemplene som bare er nevnt som illustrasjon.
EKSEMPLER
1) MATERIALER OG METODER SOM TILSVARER FIGUR 3 TIL 6
Proteinsvntese, rensing og karakterisering
Peptider ble satt sammen i henhold til metoden til Barany og Merrifield (1980) på en harpiks forladet med 4-hydroksymetyl-fenoksymetyl-kopolystyrendivinylbenzen ved 1 % (HMP) (0,5-0,65 mmol) (Perkin Eimer, Applied Biosystem Inc., Forster City, CA) på en automatisert syntetiseringsanordning (ABI433A, Perkin Eimer, Applied Biosystem Inc., Forster City, CA). For å unngå å oppnå derivater som utviser delesjoner, ble de N-terminale gruppene uten Fmoc beskyttet med en acetylgruppe etter behandling med en blanding som omfatter 4,75 % av eddiksyreanhydrid (Merck), 6,25 % av DIEA ved 2,0 M, 1,5 % av 1-hydroksybenzotriazol 1 M (HOBt) (Perkin Eimer, Applied Biosystem Inc., Warrington, GB) og 87,5 % av N-metylpyrrolidon (Perkin Eimer, Forster City, CA). Hvert avbeskyttelsestrinn ble kontrollert med en konduktivitetsanordning. Peptidene ble avbeskyttet og fjernet fra harpiksen med trifluoreddiksyre (TFA) tilsatt 10 % metylfenylsulfid (Merck) og 5 % etanditiol (Merck). Rensingen ble utført med et Beckman høyytelseskromatografi (HPLC) apparat på en Merck C8 reversert fasekolonne (10 x 250 mm). Buffer A besto av vann med 0,1 % TF A og buffer B besto av acetonitril med 0,1 % TFA. Gradienten besto av 20 til 40 % buffer B over 40 minutter og en gjennomstrømningshastighet på 2 ml/minutt. Et elektrospray massespektrometer ble utført med en Perkin Eimer PE-SCIEX API 150ex enkel kvad. Analyse av aminosyrene ble utført på en Beckman modell 6300, analyseanordning.
Elektroforetiske mobilitetsforskvvningstester
De 59 nukleotidene i TAR RNA som inneholder den essensielle pyrimidin UUU-gruppen ble fremstilt in vitro ved transkripsjon med RNA polymerase T3. Bindingsreaksjonsblandingene (20 inneholdt 0,2 nmol radiomerket TAR RNA, 0-100 ng Tat i TK-buffer (50 mM Tris pH 7,4, 20 mM KC1, 0,1 % Triton X-100). Kompleksene ble separert fra det ubundne RNA ved elektroforese på 8 % denaturerende polyakrylamidgeler som inneholdt 0,1 % Triton X-100. Gelen ble forkjørt i 30 minutter før prøven ble opplastet (20 Elektroforesen ble fortsatt i 90 minutter ved ca. 200 V. De relative mengdene av fri og/eller bundet RNA ble bestemt ved fosforbilleddannelse.
Sirkulær dikroisme ( CD)
De sirkulære dikroismespektra ble målt med en optisk veilengde på 50 \ im fra 260 til 178 nm på et Jobin-Yvon CD UV-spektrofotometer (Long-Jumeau, Frankrike)
(Mark VI). Instrumentet ble kalibrert med (+)-10-kamfersulfonsyre. Et forhold på 2,1 ble funnet mellom det positive CD-båndet på 290,5 nm og det negative båndet på 192,5 nm. Dataene ble oppsamlet med et intervall på 0,5 nm med en skanningshastighet på 1 nm per minutt. CD-spektrene ble plottet inn i form av Ae
per amid. Prøvene ble fremstilt i en fosfatbuffer ved 20 mM (pH 4,5). Proteinkonsentrasjonen var i et område på 0,5 til 1 mg/ml.
Transaktivering med celler transfektert med HIV LTR
Den funksjonelle transaktiveringen med en syntetisk Tat ble bestemt ved å bruke P4-celler. Disse CD4-HeLa-cellene bærer det bakterielle lacZ-genet under kontroll av HIV LTR og den cytoplasmatiske akkumuleringen av p-galaktosidase var strengt avhengig av nærværet av Tat. 80 % av konfluente celler platet på en 12-brønners plate ble innkubert i 24 timer ved 37°C, i nærværet av 5 % CO2, med Tat-proteinet inneholdt i et DMEM-medium tilsatt med 0,1 % BSA. Etter denne inkubasjonsperioden ble cellene vasket med fosfatbufret saltoppløsning og proteinene ble ekstrahert og analysert for P-galaktosidase med en kommersiell immunabsorpsjonstest som bruker et enzym koblet til et antigen (ELISA) for P-galaktosidase (Boehringer Mannheim, Frankrike), i henhold til produsentens instruksjoner. Verdiene ble normalisert ved å bruke konsentrasjonen av de totale proteinene i de forskjellige cellelysatene som bestemt av Bradfordmetoden.
Inhibision av transaktivering
De ovennevnte eksperimentene med transaktivering med celler transfektert med HIV LTR ble reprodusert, men denne gangen med tilsetting til kulturmediet enten av et anti-Tat Eli-serum eller av et anti-Tat Oyi-serum, eller av et anti-Tat Bru-serum. Tat-proteinet var for sin del oppnådd fra Eli-varianter.
Oppfinnerne observerte en inaktivering av transaktiveringen med anti-Tat Oyi antistoffene av Tat Eli-proteinet sammenlignet spesielt med kontrollmediet som ikke omfattet antistoffer.
2) MATERIALER OG METODER TILSVARENDE FIGUR 7
Immuniseringsbetingelsene er en intradermal injeksjon av 100 \ ig renset Tat-protein i 0,5 ml av 100 mM fosfatbuffer, pH 4,5, pluss 0,5 ml av Freunds fullstendige adjuvans (dag 0). En første "booster" blir utført på D21 under de samme betingelsene men med Freunds ufullstendige adjuvans (0,5 ml). En andre "booster" blir utført på D42 identisk til D41. Blod blir innsamlet på D53 i FST-rør og serumet blir oppnådd etter sentrifugering ved 2000 omdreininger/minutt. Fortynningen av serumet er 1/1000.
Elisa: Testen blir utført på en Maxisorp U96-plate (Polylabo). Proteinene i fosfatbuffer, pH 4,5, blir innkubert på platen natten over ved 4°C. Etter metning i MPBS-buffer (8 g/l NaCl, 0,2 g/l KC1, 1,44 g/l Na2HP04, 0,24 g/l KH2P04, 5 % skummet melk justert til pH 7,4 med HC1), blir proteinene innkubert med kanin primært antistoff i 1 time. Deretter innkubering med et geit antistoff koblet til peroksidase spesifikt for kanin Fc-fragment (Cappel) i 1 time. Detekteringen blir utført i nærværet av H2O2, 100 mM sitronsyre, 50 mM NaOH og 0,2 mg/ml ABTS (Boehringer). Absorbansen blir lest ved 405 nm.
Uten fortynning er anti-Tat Eli-serum i stand til å gjenkjenne alle Tat-variantene eller derivatene.
3) MATERIALER OG METODER FOR WESTERN BLOTTING
Western blotting: Proteinene blir først denaturert i nærværet av 3 M Tris-HCl, pH 8,8, 5 % P-merkaptoetanol, 2 % SDS, 10 % glyserol og bromfenolblått. De blir separert ved elektroforese på 15 % polyakrylamidgel. Proteinene blir deretter overført på nitrocellulosemembraner slik at de kan detekteres ved immundeteksjon. De spesifikke stedene blir blokkert med en PBS-oppløsning (8 g/l NaCl, 0,2 g/l KC1, 1,44 g/l Na2HP04, 0,24 g/l KH2P04, justert til pH 7,4 med HC1) inneholdende 5 % skummet melk. Nitrocellulosemembranen blir innkubert med kanin primært antistoff i 1 time. Deretter innkubering med et geit antistoff koblet til peroksidase spesifikt for kanin Fc-fragment (Sigma). Detektering ble utført i nærværet av H2C02, PBS og diaminobenzamidin. (Fotografi av gelen er ikke vist i foreliggende oppfinnelse).
4) MATERIALER OG METODER TILSVARENDE FIGUR 8
Transaktiveringen blir målt med humane HeLa-celler transfektert med HIV-1 LTR og et rapportørgen for (3-galaktosidaseproteinet (LacZ) i henhold til protokollen beskrevet i figur 5.
Seraene blir oppnådd fra kaniner i henhold til protokollen beskrevet for figur 7.
100 |il av tre anti-Tat-sera, nemlig anti-Tat Eli, anti-Tat Oyi og anti-Tat Bru cmC i økende fortynninger blir tilsatt et cellekulturmedium, fulgt av 100 jil av Tat Eli-varianten ved 1 eller 5 ^iM. Den cytoplasmatiske akkumuleringen av P-galaktosidase avhenger derfor av nærværet av Tat.
For det første er det observert at ved ekvivalent fortynning er anti-Tat Eli-serumet det mest effektive. Dette er logisk fordi serumet inneholder antistoffer produsert mot den samme varianten som den hvis transaktiveringsaktivitet er søkt å nøytralisere. Imidlertid skal det understrekes at Tat Oyi er i stand til å danne antistoffer som signifikant nøytraliserer transaktiveringsaktiviteten til Tat Eli. Denne inhibisjonen er faktisk større enn den observert spesielt for 1/10 fortynning brukt med anti-Tat Bru cmC-serum. Dette bekrefter fordelen til anti-Tat Oyi antistoffer mot andre Tat-varianter.
REFERANSER
Alizon, M., Wain-Hobson, S., Montagnier, L., & Sonigo, P. (1986) Cell 46, 63-74.
Barany, G. & Merrifield, R.B. (1980) in Gross, E., & Meinhofer, J. (Eds) The peptide: Analysis, Synthesis, Biology. Academic Press, New York, Vol. 2, pp 1-284.
Barre-Sinoussi, F., Chermann, J.C., Rey, F., Nugeyre, M.T., Chamaret, S., Gruest, J., Dauguet, C, Axler-Blin, C, Vezinet-Brun, F., Rouzioux, C, Rozenbaum, W. & Montagnier, L. (1983) Science 220, 868-871.
Clavel, F. & Charneau, P. (1994) J. Virol 68, 1179-1185.
Corpet, F. (1989) Nucl. Acid. Res. 22, 10881-10890.
Delaporte E., Janssens W., Peeters M., Buve A., Dibanga G., Perret J.L., Ditsambou V., Mba J.R., Courbot M.C., Georges A., Borgeois A., Samb B., Henzel D. , Heyndrickx L., Fransen K., van der Groen G., Larouze B. (1996) AIDS 8, 903-910.
Grégoire, C, & Loret, E.P. 1996. J. Biol. Chem. 271, 22641-22646.
Huet, T., Dazza, M.C., Brun-Vezinet, F., Roelants, G.E. & Wain-Hobson, S. 1989 AIDS 3, 707-715.
Jeang, K.T. (1996) in Los Alamos National Laboratory (Ed) HIV-1 Tat: Structure & Function Human Retroviruses & AIDS compendium. III, pp 3-18.
Jeang, K.T., Xiao, H. & Rich, E.A. (1999) J. Biol. Chem. 274, 28837-28840.
Le Buanec, H., Lachgar, A., Bizzini, B., Zagury, J.F., Rappaport, J., Santagostino, E. , Muca-Perja, M. & Gringeri, A. 1998. Biomed. Pharmacother 10, 431-435.
0'Brien, W.A., Koyanagi, Y., Namazie, A., Zhao, J.Q., Diagne, A., Idler, K., Zack, J.A. & Chen, I.S. (1990) Nature 348, 69-73.
Westendorp, M.O., Frank, R., Ochsenbauer, C, Stricker, K., Dhein, J., Walczak, H., Debatin, K.M. & Krammer, P.H. 1995 Nature 375, 497-500.
Zhu, T., Korber, B.T., Nahmias, A.J., Hooper, E., Sharp, P.M. & Ho, D.D. (1998) Nature 391, 594-597.
Claims (9)
1. Anti-HI V-1 - vaksine,
karakterisert ved at den omfatter et HIV-1 Tat Oyi variant protein, som omfatter mellom 99 og 106 aminosyrer, som er i stand til å bindes til TAR og ikke i stand til transaktivering, hvori nukleotidesekvensen til Tat har minst en mutasjon sammenlignet med nukleotidsekvensen til en funksjonell Tat, og hvor mutasjonen påvirker minst ett av cysteinene i Tat-proteinet, i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer og, hvor det egnet, en eller flere egnede immunitetsadjuvanser.
2. Vaksine som angitt i krav 1,
karakterisert ved at den er kjemisk syntetisk Tat.
3. Vaksine som angitt i krav 2,
karakterisert ved at Tat er syntetisert i en fast fase.
4. Vaksine som angitt i krav 1,
karakterisert ved at den er en rekombinant Tat.
5. Anti-HI V vaksine,
karakterisert ved at den inneholder en ekspresjonsvektor som omfatter en nukleotidsekvens som koder for et HIV-1 Tat-protein som definert i krav 1, og elementene som er nødvendige for dens ekspresjon.
6. Vaksine som angitt i krav 1,
karakterisert ved at den omfatter minst den N-terminale regionen og/eller den basale regionen til Tat-sekvensen.
7. Vaksine som angitt i ett av kravene 1 til 6,
karakterisert ved at Arg-Gly-Asp-regionen plassert i den C-terminale enden av Tat er modifisert.
8. Fremgangsmåte til å fremstille anti-Tat polyklonale antistoffer som er i stand til å gjenkjenne flere Tat-varianter, som omfatter: - immunisering av et dyr, unntatt mennesker, ved hjelp av injeksjon av et Tat-protein som definert i krav 5 kombinert med en immunresponsadj uvans, - rensing av de spesifikke antistoffene inneholdt i serumet til de immuniserte
dyrene,
karakterisert ved at Tat-proteinet brukt i immuniseringstrinnet tilsvarer Oyi eller Bru cmcC-varianten.
9. Fremgangsmåte til å syntetisere en Tat-variant som angitt i ett av kravene 1, 6 og 7,
karakterisert ved at den anvender beskyttende grupper av FMOC-typen, fortrinnsvis av den hurtige FMOC-typen.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR9904610A FR2792204B1 (fr) | 1999-04-13 | 1999-04-13 | Vaccin anti-vih-1 comprenant tout en partie de la proteine tat de vih-1 |
FR9916633A FR2792206B1 (fr) | 1999-04-13 | 1999-12-29 | Vaccin anti-vih-1 comprenant tout ou partie de la proteine tat de vih-1 |
PCT/FR2000/000938 WO2000061067A2 (fr) | 1999-04-13 | 2000-04-12 | Vaccin anti-vih-1 comprenant tout ou partie de la proteine tat de vih-1 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO20014841D0 NO20014841D0 (no) | 2001-10-04 |
NO20014841L NO20014841L (no) | 2001-11-27 |
NO326603B1 true NO326603B1 (no) | 2009-01-19 |
Family
ID=26234914
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20014841A NO326603B1 (no) | 1999-04-13 | 2001-10-04 | Anti-HIV-1 vaksine som omfatter et HIV-1 TAT Oyi protein eller ekspressjonsvektor omfattende nukleotidsekvens som koder for variantproteinet og fremgangsmate for fremstilling av anti-Tat polyklonale antistoffer og fremstilling av Tat-varianten |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7087377B2 (no) |
EP (1) | EP1169057B1 (no) |
JP (1) | JP4860823B2 (no) |
KR (1) | KR100725637B1 (no) |
AT (1) | ATE280586T1 (no) |
AU (1) | AU775560B2 (no) |
BR (1) | BR0009758A (no) |
CA (1) | CA2370563C (no) |
DE (1) | DE60015312T2 (no) |
DK (1) | DK1169057T3 (no) |
ES (1) | ES2231178T3 (no) |
FR (1) | FR2792206B1 (no) |
HK (1) | HK1044463B (no) |
HU (1) | HUP0200841A2 (no) |
IL (2) | IL145884A0 (no) |
MX (1) | MXPA01010482A (no) |
NO (1) | NO326603B1 (no) |
PL (1) | PL197666B1 (no) |
PT (1) | PT1169057E (no) |
WO (1) | WO2000061067A2 (no) |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100465589B1 (ko) * | 2001-04-20 | 2005-01-13 | 허만욱 | 비만 억제 폴리펩타이드 |
FR2868318B1 (fr) * | 2004-04-01 | 2012-11-16 | Commissariat Energie Atomique | Antigene tat stabilise et ses applications pour la vaccination anti-vih |
ES2500265T3 (es) * | 2008-04-22 | 2014-09-30 | Université D'aix-Marseille | Proteína Tat Oyi mutada para prevenir o tratar SIDA |
US8530431B2 (en) * | 2009-03-23 | 2013-09-10 | Pin Pharma, Inc. | Treatment of cancers with immunostimulatory HIV TAT derivative polypeptides |
EP3187585A1 (en) | 2010-03-25 | 2017-07-05 | Oregon Health&Science University | Cmv glycoproteins and recombinant vectors |
WO2011128720A1 (en) * | 2010-04-14 | 2011-10-20 | Mymetics Corporation | Trans-activator of transcription protein |
WO2012170765A2 (en) | 2011-06-10 | 2012-12-13 | Oregon Health & Science University | Cmv glycoproteins and recombinant vectors |
AU2012216792A1 (en) | 2011-09-12 | 2013-03-28 | International Aids Vaccine Initiative | Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing HIV-1 proteins by broadly neutralizing antibodies |
US9402894B2 (en) | 2011-10-27 | 2016-08-02 | International Aids Vaccine Initiative | Viral particles derived from an enveloped virus |
EP2679596B1 (en) | 2012-06-27 | 2017-04-12 | International Aids Vaccine Initiative | HIV-1 env glycoprotein variant |
RU2653754C2 (ru) | 2012-12-06 | 2018-05-14 | Пин Фарма, Инк. | Лечение воспалительных, аутоиммунных и нейродегенеративных нарушений иммуннодепрессивными полипетидами, являющимися производными тат |
EP2848937A1 (en) | 2013-09-05 | 2015-03-18 | International Aids Vaccine Initiative | Methods of identifying novel HIV-1 immunogens |
AU2014329393B2 (en) | 2013-10-04 | 2020-04-30 | Pin Pharma, Inc. | Immunostimulatory HIV Tat derivative polypeptides for use in cancer treatment |
US10058604B2 (en) | 2013-10-07 | 2018-08-28 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
US10174292B2 (en) | 2015-03-20 | 2019-01-08 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
EP3072901A1 (en) | 2015-03-23 | 2016-09-28 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4281061A (en) * | 1979-07-27 | 1981-07-28 | Syva Company | Double antibody for enhanced sensitivity in immunoassay |
US5019510A (en) | 1987-10-28 | 1991-05-28 | Institut Pasteur | Isolation, molecular cloning and sequencing of an HIV-1 isolate from a Gabonese donor |
US5132205A (en) * | 1988-10-07 | 1992-07-21 | Eastman Kodak Company | High ph extraction composition and its use to determine a chlamydial, gonococcal or herpes antigen |
US5461029A (en) * | 1992-04-24 | 1995-10-24 | American Cyanamid Company | Method of treating herpes viral infections using HBNF and MK proteins |
FR2700169B1 (fr) * | 1993-01-04 | 1995-03-24 | Transgene Sa | Nouveaux variants trans-dominants TAT du virus de l'immunodéficience humaine. |
PL322143A1 (en) * | 1995-03-08 | 1998-01-05 | Neovacs | Non-topxic immunogenes originating frommretroviral regulator protein, antibodies as such, method of preparing them and pharmaceutic compositions containing them |
DE19514089C2 (de) * | 1995-04-13 | 1997-07-10 | Deutsches Krebsforsch | Nachweisverfahren für HIV-TAT |
JPH10212300A (ja) * | 1996-11-26 | 1998-08-11 | Sankyo Co Ltd | ペプチドワクチン |
US5891994A (en) * | 1997-07-11 | 1999-04-06 | Thymon L.L.C. | Methods and compositions for impairing multiplication of HIV-1 |
-
1999
- 1999-12-29 FR FR9916633A patent/FR2792206B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-04-12 CA CA2370563A patent/CA2370563C/fr not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-12 DE DE60015312T patent/DE60015312T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-12 AT AT00918952T patent/ATE280586T1/de active
- 2000-04-12 BR BR0009758-6A patent/BR0009758A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-04-12 PT PT00918952T patent/PT1169057E/pt unknown
- 2000-04-12 PL PL353033A patent/PL197666B1/pl unknown
- 2000-04-12 JP JP2000610400A patent/JP4860823B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-12 IL IL14588400A patent/IL145884A0/xx active IP Right Grant
- 2000-04-12 MX MXPA01010482A patent/MXPA01010482A/es active IP Right Grant
- 2000-04-12 DK DK00918952T patent/DK1169057T3/da active
- 2000-04-12 ES ES00918952T patent/ES2231178T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-12 EP EP20000918952 patent/EP1169057B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-12 HU HU0200841A patent/HUP0200841A2/hu unknown
- 2000-04-12 WO PCT/FR2000/000938 patent/WO2000061067A2/fr not_active Application Discontinuation
- 2000-04-12 AU AU39724/00A patent/AU775560B2/en not_active Expired
-
2001
- 2001-10-04 NO NO20014841A patent/NO326603B1/no not_active IP Right Cessation
- 2001-10-11 IL IL145884A patent/IL145884A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-10-12 KR KR10-2001-7013031A patent/KR100725637B1/ko active IP Right Grant
-
2002
- 2002-07-09 HK HK02105105.9A patent/HK1044463B/zh not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-10-21 US US10/969,191 patent/US7087377B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU693098B2 (en) | Tandem synthetic HIV-1 peptides | |
US5030718A (en) | Retrovirus capable of causing AIDS, antigens obtained from this retrovirus and corresponding antibodies and their application for diagnostic purposes | |
EP0199301B2 (en) | Recombinant acquired immune deficiency syndrome (AIDS) viral envelope protein fragments and method of testing for AIDS | |
AU632475B2 (en) | Human immunodeficiency virus (hiv) env-coded peptide capable of eliciting hiv-inhibiting antibodies in mammals | |
US7087377B2 (en) | Method and kit for detection of tat protein with anti-tat oyi antibodies | |
US20080261197A1 (en) | Nucleotide sequences of HIV-1 group (or subgroup) O retroviral antigens | |
EP0436634A1 (en) | Hiv proteins and peptides useful in the diagnosis, prophylaxis or therapy of aids | |
De Rossi et al. | Synthetic peptides from the principal neutralizing domain of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) enhance HIV-1 infection through a CD4-dependent mechanism | |
EP0306219A2 (en) | Novel HIV proteins and peptides useful in the diagnosis, prophylaxis or therapy of AIDS | |
Yoshiyama et al. | Characterization of mutants of human immunodeficiency virus type 1 that have escaped neutralization by a monoclonal antibody to the gp120 V2 loop | |
Naylor et al. | Preclinical and clinical studies on immunogenicity and safety of the HIV-1 p17-based synthetic peptide AIDS vaccine—HGP-30-KLH | |
Binninger et al. | Mutational analysis of the simian immunodeficiency virus SIVmac nef gene | |
DURDA et al. | Characterization of murine monoclonal antibodies to HIV-1 induced by synthetic peptides | |
US6290963B1 (en) | Anti-HIV compositions containing native and recombinant peptides | |
US5624795A (en) | Isolation and characterization of a novel chimpanzee lentivirus, designated simian immunodeficiency virus isolate cpz-ant | |
WO1996027012A1 (en) | Specific hiv-1 group o antigens | |
EP0569428B1 (en) | Method for the diagnosis in vitro of hiv-1 virus infections | |
US4963497A (en) | Isolation and purification of the eighth gene of HTLV-III | |
FR2792204A1 (fr) | Vaccin anti-vih-1 comprenant tout en partie de la proteine tat de vih-1 | |
Estaquier et al. | Comprehensive delineation of antigenic and immunogenic properties of peptides derived from the nef HIV-1 regulatory protein | |
CA2055591A1 (en) | Vpt protein, vectors expressing this protein, cell products and assay methods | |
Chun | Structural and functional studies of human immunodeficiency virus-1 transactivating proteintat | |
WO1999038887A1 (en) | Divergent hiv-1 peptides |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MK1K | Patent expired |