JP2002541165A - Hiv−1のtatタンパク質の全体又は一部を含有する抗hiv−1ワクチン - Google Patents
Hiv−1のtatタンパク質の全体又は一部を含有する抗hiv−1ワクチンInfo
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Abstract
Description
HIV−1ワクチン、幾つかのTat変異体を認識できるモノクローナル抗体又
はポリクローナル抗体の製造、及び生体試料中のTatの検出方法である。
、このウイルスの調節タンパク質、即ちTatタンパク質の使用、及びHIVに
感染した個体におけるこのタンパク質の検出に関する。
イルスタンパク質である。Tat遺伝子は、単離株によって異なるが、99乃至
106残基からなるタンパク質をコードする2個のエキソンからなる。しかし、
C末端の一部が欠失した86残基を含む型のTat活性が、既に報告されている
。86残基を含むこれらのTat誘導体は、実験室のアーティファクトか、もは
や天然状態では存在しない先祖型であると考えられている。このタンパク質は、
HIV−1のmRNAの5´末端に位置するTARと命名されたヌクレオチド標
的と結合することによって、HIV−1遺伝子を活性化させる。このタンパク質
は、HIVに感染した細胞から分泌され、HIV−1の有効な逆転写に必須であ
る。細胞外に出ると、このタンパク質は、離れた感染細胞を活性化でき、非感染
T細胞の免疫不全を引き起こすことができる。更に、このタンパク質は、カポシ
肉腫などのAIDS関連の病理学的疾患に直接関与する。
、AIDSに対するワクチンの製造には、2点の主要な困難性がある。第1点は
、エンベロープタンパク質であるGP120の非常な変異性に関連する。第2の
困難性は、抗GP120抗体は、明白なAIDS患者に対しては病気を悪化させ
るらしいという事実による。しかし、予備的な結果によると、それ以前に汚染さ
れていなかった人々においては、抗GP120抗体によって防御効果が可能であ
りうることが示されている。抗GP120ワクチンによるフェーズIIが、米国
においてRoche社によって開始されている。このフェーズIIのために選別
された集団は、医学的観点から十分に監視されている。しかし、ワクチンが上市
されると、同等な医学的指示を得ることは困難であろう。
ウイルスに感染した細胞全部を除去する役割を担うマクロファージと細胞障害性
Tリンパ球(CTL)の活性は、徐々にTatによってブロックされる。それ故
、Tatは、免疫抑制物質として働く。抗Tat抗体(又はTatを標的とする
活性な成分)は、CTLやマクロファージの活性を回復させるはずである。
方のために、好ましい標的である。
組換えTatタンパク質(Tatトキソイド)を用いて行われた前臨床試験によ
ると、血清反応陰性の患者において、Tatトキソイドは、高いかつ持続的な抗
Tat抗体の産生を引き起こすことが特に示された(Le Buanec et al., 1998)
。血清反応陽性及び免疫不全の患者においては、抗Tat抗体レベルの顕著な増
大が、通常の抗Tat抗体レベルと比較して観察される(Westendorp et al., 1
995)。
的に不活性になっている組換えタンパク質である。本発明者らはまた、カルボキ
シメチル化Tat(Tat Bru cmC)を製造でき、トランス活性化活性
の喪失も観察した(遊離のシステインを有する同じTat変異体(Tat Br
u fC)が、トランス活性化ができるにもかかわらず)。Tat Bru c
mCは、Tat Bru fCに匹敵するアフィニティでTARと結合できる。
システインの化学修飾によって、本発明者らが円二色性とNMRで観察したコン
フォメーション変化が引き起こされるということである。コンフォメーション変
化は種々のTat変異体間に存在するが、システインのカルボキシメチル化は、
Tatのペプチド鎖のフォールディングにおいて大きな変化をもたらし、結果と
して、それは、抗Tatワクチンの製造のための良い候補とはならない。
似した構造的特徴を有するTatタンパク質を使用することが賢明である。この
Tatは、自然のTatによって引き起こされる免疫応答と同様の免疫応答を引
き起こすことができるように、できるだけ自然のTatタンパク質に近いが、ト
ランス活性化できない、即ち、上記のように、離れた感染細胞を活性化できず、
非感染T細胞の免疫不全を引き起こすことができない、三次元構造を実際は有す
べきである。この免疫不全性を阻害することは実に決定的である。
適切な免疫アジュバントと組み合わせて、TARと結合でき、かつトランス活性
化できない、少なくとも1種のHIV−1のTatタンパク質の全体又は一部を
含有する抗HIV−1ワクチンである。このTatタンパク質は、それを投与さ
れる動物において、このタンパク質の他の変異体を認識できる抗体の産生を、該
変異体のトランス活性化を阻害するのに十分なレベルで引き起こすことができる
べきである。
本発明においてTatタンパク質に所望される機能を果たすことができるこのタ
ンパク質の1種以上の部分も使用することができる。上記ワクチンはまた、種々
のTatタンパク質、又は種々のTatタンパク質の部分の組み合わせも含みう
る。
場合、Tatタンパク質は、好ましくは99乃至106個のアミノ酸からなり、
更により好ましくは101個のアミノ酸からなる。
ない1種以上のTatタンパク質の任意のフラグメント、又はフラグメントの組
み合わせ(抗体の産生を引き起こすために十分に免疫原性である)を意味するも
のと理解されたい。好ましくは、該フラグメントは、15乃至30アミノ酸から
なり、好ましくは18乃至25アミノ酸からなる。この定義は、この表現が、本
出願で使用されるときにはいつでも有効である。
はできないがTARとは結合できるように、“天然”と呼ばれる、即ち、天然状
態で存在する種々のHIV−1株から抽出される、機能的なTatタンパク質と
は異なるべきである。そういうわけで、本発明のワクチンに使用されるTatは
、機能的なTatのヌクレオチド配列と比較して少なくとも1個の変異を有する
ヌクレオチド配列を有する。この変異は、一般的に点変異であり、例えば、1個
以上のアミノ酸のサプレッション、付加、又は置換を引き起こしうる。
異体(86残基)を研究し、次いで、このタンパク質で観察される構造的多様性
を各々が代表する5種の他の変異体を合成した(Gregoire et Loret, 1996)。
即ち、Tat Z2(86残基)、Tat Mal(87残基)、Tat El
i(99残基)、Tat Oyi(101残基)、及びTat Jr(101残
基)。全てのHIV−1単離株のうち、6つの構造的な群が、タンパク質の大き
さと変異の性質に基づき決定された。これらの全ての変異体は、カルボキシメチ
ル化システイン(Tat Bru cmC)を有するものと、次いで遊離システ
イン(Tat Bru fC)を有するものと、2度合成されたTat Bru
と類似の薬理活性を恐らく有していた。使用した化学は、HBTUアクティベー
タを用いるfastFmocタイプのものである。タンパク質の精製は、高速液
体クロマトグラフィーで行った。これらの全ての合成タンパク質はTARに結合
できることが見出されたが、大きな相違がHeLa細胞のトランス活性化試験で
観察された。最も驚くべき結果は、Tat Oyi変異体で観察された、トラン
ス活性化の無いことであった。また、カルボキシメチル化システインを有するT
at Bru誘導体でもトランス活性化は観察されなかった。これらの合成タン
パク質における水相円二色性(CD)研究は実際に、Tat Bru cmCの
化学修飾は、Tat Bruの構造を顕著に改変したことを示す。一方、Tat
Oyiは、そのCDスペクトルによって実証されたように、他のものと類似の
構造を有する。
で同定された(Huet et al., 1989)。この患者は、数年間血清反応陽性であっ
たが、完全に健康であった。明らかに、欠陥のあるTatタンパク質が、このH
IV−1株に存在するという事実によって、この患者におけるAIDSへの進行
が妨げられ、彼女にAIDSウイルスに対する免疫が与えられていた。実際、フ
ィールドで行われた疫学的研究は、HIV−1 Oyiに感染した患者が、長期
間非進行者であったことを示している。
タイプBに属する。HIV Oyi株が同定されたガボン人女性は、ガボンの南
東のHaut Ogooueという田舎の州に住む31人のグループに属してい
た。このグループは、1986年、ガボン全体で感染した約2000人に対し行
われた血清疫学的解析の間に見出された。このHaut Ogooueグループ
は注目をあびた。というのは、感染した人々は、健康良好で、また、全く例外的
なウエスタンブロットプロフィールをも示したからである。実際に、これらの人
々において、抗gp120抗体、抗gp160抗体、抗gp41抗体の存在を検
出できなかったが、抗gag抗体、抗pol抗体は同定された(Huet et al., 1
989)。
れ、彼女らのうち25人(即ち、3.3%)がELISA試験でHIV陽性であ
ることが示された。これらの25人の女性のうち、23人がこの地区に特徴的な
例外的ウエスタンブロットプロフィール(上記参照)を有していた。HIV−1
Oyi株を有するその一人を含む約10人の女性が、2年間追跡調査された。
最近感染したこと(最近感染したのならば、抗gp120抗体の形成のための時
間が無かったであろう)の可能性を除外している。HIV−2感染の存在は除外
された。というのは、HIV−2 gagに対する反応が無く、HIV−2感染
は、ガボンでは2ケースが報告されるのみであり、それらは沿岸地域に位置して
いたからである。モニタリングされた全ての患者は、2年間の研究の間、健康良
好で、体重の減少は無く、日和見疾患も無かった(Huet et al., 1989)。
V−2に対し血清反応陰性であった。彼女のリンパ球とPPMCの共培養は、1
5日間後のみRT活性を示した。これは、非常に異常である。該ウイルスはまた
、殆ど検出できない細胞変性活性しか有しなかった。培養上清は、PBMCを感
染させることができたが、H−9やCEM又はU−937単球などの正常なリン
パ球株では、実質的に複製は不可能であった。この解析の正当性を実証すべく、
全てのケースで抗gp120抗体の非存在を確認している、同じ地区の17人の
他の患者でも、同様の結果が観察された。通常のHIV−1ドナーの血清は、H
IV−1 Oyi gp120を認識できることに注目することは、興味深い(
Huet et al., 1989)。それ故、HIV−1 Oyi ウイルスはクローニング
された。Tat遺伝子を除いて配列決定は成功した(Huet et al., 1989)。
れ、この変異の復帰が、Tat活性の回復を可能とする。
であることが観察された。それ故、HIVの毒性とTatトランス活性化効率の
間に密接な関連がある。この疫学的研究は、今一度、この疾患の死亡率とHIV
複製速度の間に存在する密接な関連を示す。それ故、Tatは、このウイルス感
染を命にかかわる疾患に変化させる複製速度にHIVが到達するのを可能にする
と考えられる。
から、正常なHIV株と比較して、欠陥のあるHIV株が提供するように考えら
れる防御が示された。実際に、数人の例外的な患者からの新しく集められたリン
パ球のPCR解析は、正常なHIV株の存在を示したらしい。該防御機構は抗g
p120抗体を含まない。抗gp120抗体はこれらの患者には存在しないから
である。細胞障害性Tリンパ球の作用は、該ウイルスの除去を可能にする機構で
ありうる。
、他のアフリカ諸国と比較してHIV感染者の割合が低い(2乃至3%)ことが
わかる。Oyiサブタイプは、集団から完全に消失したようであり、HIV−1
Oyi株が採取されたガボン人女性は、1995年において完全に健康であり
、3人の子供を産んだ。3人とも全て血清反応陰性であった。HIV−1 Oy
iウイルスは、もはや彼女において検出できなかった。
チンの組成物に入れる最良の候補であると考えられる。しかし、不活性化された
Tatは、必ずしも免疫原性ではない。目下、ワクチンの全ての利点は、抗体の
産生を引き起こすことであり、本ケースでは、更に、他のTat変異体に対して
活性な抗体の産生を引き起こすことである。驚くべきことに、本発明者らは、こ
の証明をすることができた。それ故、本発明のワクチンは、特に好適な実施態様
によれば、HIV−1 Oyi変異株のTatの全体又は一部を含有する。
者において、免疫不全性を制限することによって、AIDSへの進行を遅らせる
ことは可能であろう。このようなワクチンは、感染の開始においてそうであると
考えられるように、患者が該ウイルスに対し有効な免疫を保持するのを可能にす
るだろう。特に、細胞障害性Tリンパ球(CTL)とマクロファージ(それらは
HIVに感染しないが、それらの活性はTatによって阻害される)の活性の回
復は、結果的に患者が非進行者になることを可能にするだろう。
atタンパク質の分泌後のTatタンパク質の直接的な作用に関連していると考
えられる、カポシ肉腫又は神経学的症候群などのある種の病理学的疾患の発生を
制限できよう。
間の交差認識があるかどうかを決定するために本発明者らが行った、ウエスタン
ブロット実験(ゲルの写真は、本出願で示さず)とELISA試験によって、更
に確認される。
7種のTat変異体に対して試験された。
従い、ウサギをTat Oyi、Tat Bru cmC、Tat Eliで免
疫化した。53日後に得られたポリクローナル血清をウエスタンブロッティング
とELISA試験で解析した。観測された力価は、抗Oyi抗体、抗Bru c
mC抗体、抗Eli抗体に関して、それぞれ700、11、660pMである。
t Eli血清は、全ての変異体と交差免疫原性を示すことができないことがわ
かる(抗Tat Bru cmC血清の場合は交差免疫原性を示すのだが)。
変異体である。システインのこの化学修飾は、トランス活性化活性の喪失(Pelo
ponese et al., 1999)を引き起こすだけではなく、この変異体の3D構造の喪
失も引き起こす(ランダムコイルに変換する)(結果は発表されていない)。そ
れ故、全ての変異体が変性している場合、抗Tat Bru cmC血清がそれ
ら全てを認識できることが観察されるのは、驚くべきことではない。
Tat Bru cmC血清と同様、全ての変異体を認識できることがわかる。
一方、抗Tat Eli血清は、やはり全ての変異体を認識できない。それ故、
保存された3Dエピトープが多数のTat変異体に存在すると考えられる。しか
し、Tat Oyiの特別な免疫原性の特徴のみが、これらの抗体を大量に産生
させることを可能とする。それ故、今まで、患者におけるTatの存在が過少評
価されてきた可能性が高い。3種の血清の希釈は1/1000である。希釈しな
い以外は同一の実験においては、抗Tat Eli血清もまた全ての他のTat
変異体を認識できる。Tat Bruのリシン50(Tat Bru K50)
のアセチル化は、低濃度で抗Tat Eli血清による認識を可能とすることに
注目するのは、好都合である。
験によって、ワクチンとしてのTat Oyiの利点が確認される。更に、抗T
at Oyi血清は、Tat Bru又はTat EliによるHeLa細胞に
おけるトランス活性化を阻害できる。対照として使用された抗Tat Eli血
清は、活性な変異体からの抗体の産生でさえ、Tat Oyiで観察されている
ようには全てのTat変異体の交差認識を保証しないことを示す。長い変異体で
ある(101残基)Tat Oyiは、短い変異体である(86残基)Tat
Bru cmCと比較して、Tat変異体のより良好な認識を可能とする。短い
Tat変異体を有するHIV−1株は実際的に消失して、それは、実験室のアー
ティファクトであったと考えられる(Jeang et al., 1999)。更に、抗Tat
Oyi血清は、もはや、変性型(即ち、線状エピトープ)を認識しないので、そ
れは、高特異性を示す。逆に、抗Tat Bru cmC血清は、Tat Br
u cmCの大きな構造的多様性の故に、ヒトにおいて自己免疫抗体を産生する
顕著なリスクがある。本発明者らは実際に、ヒトアルブミンを認識できる抗体が
抗Tat Bru cmC血清中に存在することを観察した(データは示さず)
。
3D抗体による他のTat変異体の認識に必須である。
トランス活性化を阻害できることも示した。
モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の製造方法である。それ故、これら
の抗体が、HIVに感染したかもしれない個体において、変異体にかかわらず、
血液中にTatタンパク質の存在を検出するのに使用し得ることは、実際に強調
されるべきである。
ル抗体の製造方法であって、 −免疫応答アジュバントと組み合わせて、Tatタンパク質又はこのTatタン
パク質の一部によって動物を免疫化すること、 −該免疫化した動物の血清中に含まれる特異的抗体を精製すること、 を含む方法に関する。
筋肉内などの、Tatタンパク質又はこのTatタンパク質の一部をこの動物内
に導入する任意のやり方で行うことができる。
又は一部の配列ばかりではなく、Tatタンパク質の発現に必要な全てのシステ
ムを担持するベクターをin vivo及びin situで発現させることに
よって行うこともできる。
立ったタンパク質又はタンパク質の一部が前もって結合されているアフィニティ
ーカラムで行うことができる。
タンパク質又はTatタンパク質の一部は、Oyi変異体又はBru cmC変
異体に対応する。
。
度に保存されている。トランス活性化のために、これらのシステイン残基のうち
6個が重要であることが、文献(Jeang, 1996)に広範に記載されている。
される性質を有するようにするために、これらのシステインの少なくとも一つに
おいて、Tat変異体を変異させることを想起することは大いに可能である。こ
の変異は、例えば、システインのセリン又はアラニンなどの別のアミノ酸への置
換でありうる。
り、Tat変異体において保存されるべき標的領域を更に同定した。この標的は
部分的には、Tat配列のN末端領域と塩基性領域からなる。
と塩基性領域の3次元空間に近いことを示す。このことは、システインのカルボ
キシメチル化は恐らく、この標的の構造を改変することを示す。また、このこと
から、このように改変されたTatは、抗HIVワクチンの製造のために可能性
ある候補として考えることができないという事実が確認される。
子生物学によって製造されるTatと比較して、製造費の安いこと、より良好な
収率、及びコンタミネーションの無いことにある。
は、固相化学合成、例えば、FMOCタイプ、好ましくはfastFMOCタイ
プの合成によって製造される。このタイプの保護基を用いる合成方法もまた、本
発明の主題である。
ば、当業者に周知の組換え技術によっても合成することができる。これらの技術
において使用されるこれらのクローニング及び発現システムは、大腸菌、バチル
ス、ストレプトマイセス、サッカロマイセスなどの微生物ばかりでなく、酵母、
昆虫細胞、哺乳動物細胞に由来し得る。バキュロウイルス発現システムも想起す
ることができる。Tatタンパク質の全体又は一部の配列を担持するベクターは
、当業者に周知の技術に従い、上記のことをするために必要な発現システムを全
て含むことは、きわめて明白である。
スクの可能性を避けるために、全てのTat変異体の配列のC末端に存在するA
rg−Gly−Asp配列を改変することが賢明であろう。この配列は細胞表面
の膜レセプターを認識するので(Jeang, 1996)、膜移行に実に必須である。よ
り詳細には、この改変は、構造には何の影響も与えないであろうLys−Ala
−Glu配列、又は、ことによるとAla−Ala−Ala配列で、この配列を
置換することでありうる。
の血液中におけるTatタンパク質の存在を検出するのに失敗したために、過少
評価されてきた可能性が高い。本発明の利点は、限られた数の抗体によって、最
大可能数のTat変異体を検出する手段を提供することである。
パク質の一部の存在の検出方法であって、 −該試料を、幾つかのTat変異体と抗原−抗体複合体を生じさせることができ
る抗Tat抗体と接触させること、 −該抗原−抗体複合体の存在を測定すること、 を含む方法である。
される役割を果たすことができる、即ち、Tatタンパク質の全体又は一部を認
識できる抗体のフラグメント又はキメラ抗体をも意味するものと理解されたい。
れらの複合体の検出を可能とする試薬はマーカーを含んでもよく、あるいは、よ
り詳細には使用される抗体が非標識である場合、今度は標識試薬によって認識さ
れるものであってもよい。
at血清によって行いうる。
又は組織試料を意味し、適当な抗体の存在下、抗原−抗体複合体を産生できる抗
原を含んでいそうであるものと理解されたい。好ましくは、この生体試料は血液
である。
パク質の一部の存在を測定することによる、HIV感染の診断用キットであって
、 −免疫学的反応に適した媒質の調製のための試薬、 −免疫学的反応によって産生される抗原−抗体複合体の検出を可能とする試薬、
−任意で、抗原を含まない参照生体試料(陰性対照)、 −任意で、所定量の抗原を含む参照生体試料(陽性対照)、 を含むキットである。
の試薬は、幾つかのTat変異体と抗原−抗体複合体を生じさせることができる
抗Tat抗体を含む。好ましくは、該試薬は、抗Tat Oyi抗体もしくは抗
Tat Bru cmM抗体又はこれら2つの組み合わせを含む。
は太字で言及され、図1Bでは下線が引いてある。
れる(Zhu et al., 1998)。Tat MalとTat Eliは、異性愛HIV
感染において中央アフリカで80年代に単離されたHIV−1株から得られる(
Alizon et al., 1986)。Tat Brは、実験室で最も広範に使用される配列
を含み、フランスで単離されたHIV−1株から得られる(Barre-Sinoussi et
al., 1983)。一方、Tat Jrは、アメリカのHIV−1単離株から得られ
る(O'Brien et al., 1990)。Tat Oyiは、Tat JrとTat Br
uに密接に関連するが、ガボンの健康な患者で同定されたHIV株から得られる
(Huet et al., 1989)。
、それらが含む変異の関数としてのTatタンパク質の分類(Corpet,1989)。
に記載)。
ロマトグラフィーによる6つのTat変異体の精製(実験方法の材料及び方法を
参照)。
し、一方、上のトレーシングは、最後の精製工程後の合成の結果を示す。Tat
Bru(A)、Tat Jr(B)、TatZ2(C)、Tat Oyi(D
)、Tat Mal(E)、及びTat Eli(F)を、TFAによって樹脂
から切断した。ブチルメチルエーテルによる沈殿後、タンパク質を、0.1%と
なるようにTFA緩衝液に溶解した(各フレームにおける下のトレーシング)。
各タンパク質について、Hybar Merk C8カラム(4.5×125mm、流速0.8mL/分)上
で2回の連続的半分取HPLCランにより精製を行い、次いで、純粋なフラクシ
ョンを解析し(各フレームの上のトレーシング)、質量分析とアミノ酸分析によ
って同定した(データは示さず)。各場合において、主要HPLCピークは完全
な配列を示すことが観察される。10分乃至15分の間のピークは、50残基の
誘導体を表し、一方、主要フラクションに近いピークは、N末端から10乃至1
5欠失を有する誘導体である。高度に疎水性のフラクションは、恐らく不完全に
未保護の側鎖による高分子量の誘導体である。
ニティ定数の測定(材料及び方法の電気泳動移動度シフトの試験を参照)。
NA又は複合体を形成したRNAは、それぞれf(遊離の場合)及びcによって
示している。同じRNA調製物を、6つのタンパク質による滴定のために使用す
る。カルボキシメチル化システインを有するTat Bru誘導体(Bru c
mC)も試験した。平衡における解離定数(Kd)は、電気泳動移動度シフト試
験から直接測定された。Kd値は、Tat EliとTat Malの場合の約
50nMからTat OyiとTat Jrの場合の約140nMまで変動する
。更に、本発明者らは、Kd値のバリエーションに加えて、種々のタンパク質に
よる結合プロフィールがやや異なることに注目した。例えば、Tat Bruは
、低濃度では単一の良く分離された複合体を生じ、凝集物が形成されてアクリル
アミドゲルを通り抜けられないのは、かなり高濃度(4.5ng/μL超)の場
合だけである。対照的に、Tat Eliでは、多量体の複合体が低濃度でさえ
容易に同定される。Tat Eliでは3つまでの遅延バンドを観察することが
可能であり、Tat Jrではより少ない程度で観察することが可能である。こ
のような効果は、例えば、Tat BruやTat Malなどのより短いタン
パク質、及びより長いタンパク質であるTat Oyiでは観察されない。
これらの細胞を、LacZレポーター遺伝子が結合しているHIV−1 LTR
でトランスフェクトした。産生されたβ−galタンパク質のレベルは、種々の
合成Tatのトランス活性化能力に比例する。LTRは、HIVの転写のために
必要な上流と下流のDNA配列を含み、TARは、mRNAの始まりに存在する
(Claven and Charneau, 1994)。HIVのトランス活性化に必要な細胞の補因
子は、HeLa細胞に存在する。Tatが無ければ、対照(C)として示される
β−galの基礎量の発現がある。次の柱状グラフは、2つの濃度、即ち、1μ
M(明灰色ボックス)と5μM(暗灰色ボックス)を用いて、種々のTat変異
体で観察されるトランス活性化を示す。各々の場合に、Tatは細胞緩衝液に加
えられるので、対照より高いβ−galの発現は、合成Tatが核膜と細胞質膜
を通過することができ、TARと結合でき、細胞補因子と相互作用できることを
意味する。Tat Bru cmC(データは示さず)とTat Oyiのみが
、この実験で欠陥があるが、それらはTARと結合する(図1)。Tat Ma
lとTat Eliは、Tat Bruより3乃至4倍高いトランス活性化のレ
ベルを示す。Tat Z2は、先祖Tatタンパク質に最も近いが、それは、低
レベルのトランス活性化を示す。進化はより有効なTatを有するHIV−1単
離株を選択するのだろう。同様の結果が、レポーター遺伝子としてルシフェラー
ゼを用いた、他のトランスフェクション試験で得られた。Tat MalとTa
t Eliは、1μMで、トランス活性化Tat−pCMVによって得られたも
のに匹敵するレベルでLTRを実際にトランス活性化した(データは示さず)。
種々の実験で使用される濃度範囲は、0.1μM乃至10μMである(データは
示さず)。0.1μMで、Tat Eliのみが、基礎レベルより有意に高いト
ランス活性化レベルを示す。10μMで、6つのTatは、非常に高いトランス
活性化レベルを示すので、飽和の故に、それらの間で差異を観察することは不可
能である。
(白円)、Tat Bru cmC(記号無し)、Tat Jr(黒円)、Ta
t Mal(白四角)、Tat Eli(黒四角)変異体の二色性スペクトル。
、光路長50μmで、260から178nmまで記録する。CDスペクトルで観
察された差異は、サイズにかかわらず、Tat変異体間で構造的な不均一性を示
す。短いTat(白記号)と長いTat(黒記号)からなる2つのカテゴリーに
CDスペクトルを整理することは不可能である。CDスペクトルは、無秩序な構
造に典型的な200nmに近い負バンドによって特徴づけられる。Tat Br
u cmCで観察された200nmのバンドの強い大きさは、システインの修飾
が、他のTatと比較して、大きなコンフォメーション変化を引き起こしたこと
を示す。
リクローナル血清(抗Tat Bru cmC、抗Tat Oyi、抗Tat
Eli)の希釈液を用いて行われたELISA試験。
mC血清による、Tat Eliによるトランス活性化の阻害。
実施例によってより明確に理解されよう。
433A, Perkin Elmer, Applied Biosystem Inc., Forster City, CA)で、1%の
4−ヒドキシメチル−フェノキシメチル−コポリスチレン ジビニルベンゼン(
HMP)(0.5−0.65mmol)で予めチャージした樹脂(Perkin Elmer
, Applied Biosystem Inc., Forster City, CA)上で合成した。欠失を示す誘導
体が得られるのを避けるために、無水酢酸(Merck)4.75%、2.0MのD
IEA6.25%、1Mの1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)(Pe
rkin Elmer, Applied Biosystem Inc., Warrington, GB)1.5%、及びN−メ
チルピロリドン(Perkin Elmer, Forster City, CA)87.5%を含む混合物に
よる処理後、FmocのないN末端をアセチル基で保護した。各脱保護工程は導
電率デバイスで制御した。ペプチドを脱保護し、10%メチルフェニルスルフィ
ド(Merck)と5%エタンジチオール(Merck)を補充したトリフルオロ酢酸(T
FA)によって樹脂から切り離した。精製は、Beckman高速液体クロマトグラフ
ィー(HPLC)装置とMerck C8逆相カラム(10×250mm)によって行っ
た。緩衝液Aは水と0.1%TFAからなり、緩衝液Bはアセトニトリルと0.
1%TFAからなっていた。グラジエントは、緩衝液Bが20から40%で、4
0分かけ、流速は2mL/分であった。エレクトロスプレー質量分析は、Perkin
Elmer PE-SCIEX API 150ex simple quadを用いて行った。アミノ酸分析は、Bec
kman, model 6300 analyzerで行った。
in vitroで、RNAポリメラーゼT3による転写によって調製した。結
合反応混合液(20μL)は、TK緩衝液(50mM Tris pH7.4,
20mM KCl,0.1%Triton X−100)中に0.2nmolの
放射性標識TAR RNA、0−100ngのTatを含んでいた。0.1%T
riton X−100を含む8%変性ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動に
よって、複合体を非結合RNAから分離した。試料(25μL)を負荷する前に
、ゲルを30分間予め作動した。電気泳動は、約200Vで90分間続ける。遊
離及び/又は結合RNAの相対量は、リンイメージングによって測定した。
meau, FRANCE)(Mark VI)上で、光路長50μmで、260nmから1
78nmで測定した。装置は、(+)−10−カンファースルホン酸で較正した
。290.5nmでの正のCDバンドと192.5nmでの負のバンドの間で、
比2.1が見出された。データを、スキャニング速度1nm/分で、0.5nm
の間隔で集めた。CDスペクトルはアミド当たりΔεの形式でプロットした。試
料を20mMリン酸緩衝液(pH4.5)中に調製した。タンパク質濃度は、0
.5乃至1mg/mLの範囲であった。
のCD4−HeLa細胞は、HIV LTRの制御下に細菌のlacZ遺伝子を
担持し、β−ガラクトシダーゼの細胞質蓄積は、厳密にTatの存在に依存した
。12ウエルプレート上にまかれた80%コンフルエントな細胞を、5%CO2
存在下、37℃で24時間、0.1%BSAを補充したDMEM培地に含まれる
Tatタンパク質と共にインキュベートした。このインキュベーションの期間の
後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、タンパク質を抽出して、β−ガラク
トシダーゼの場合に抗原に結合した酵素を用いる市販の免疫吸着試験(ELIS
A)(Boehringer Mannheim, FRANCE)により、製造業者の指示に従ってβ−ガ
ラクトシダーゼを分析した。Bradford法によって測定した、異なる細胞溶解液の
全タンパク質の濃度を用いて、値を基準に合わせた。
ru血清を培養培地に添加する以外は、HIV LTRでトランスフェクトされ
た細胞によるトランス活性化の上記実験を再現した。Tatタンパク質は、その
役目のためにEli変異体から得た。
体により、Tat Eliタンパク質のトランス活性化が不活化されることを観
察した。
の完全フロイントアジュバント中の精製Tatタンパク質100μgの皮内注射
である(0日)。21日目に、不完全フロイントアジュバント(0.5mL)を
用いる以外は同一条件下で、最初のブースターを行う。42日目に、41日目と
同一で、2回目のブースターを行う。53日目に血液をFSTチューブに集め、
2000回転/分の遠心後に血清を得る。血清の希釈は1/1000である。
5中のタンパク質を、4℃で一晩プレート上でインキュベートする。MPBS緩
衝液(8g/L NaCl,0.2g/L KCl,1.44g/L Na2H
PO4,0.24g/L KH2PO4,5%スキムミルク,HClでpH7.4
に調整)中で飽和後、タンパク質を、ウサギ1次抗体と1時間インキュベートす
る。次いで、ペルオキシダーゼと結合した、ウサギFcフラグメントに特異的な
ヤギ抗体(Cappel)と1時間インキュベートする。発色は、H2O2,100mM
クエン酸,50mM NaOH,0.2mg/mL ABTS(Boehringer)の
存在下で行う。吸光度を405nmで読む。
識できる。
%β−メルカプトエタノール,2%SDS,10%グリセロール,ブロモフェノ
ールブルーの存在下で、タンパク質を変性させる。それらを15%ポリアクリル
アミドゲル上の電気泳動で分離する。次いで、免疫検出によって示されるように
、該タンパク質をニトロセルロース膜上にトランスファーする。5%スキムミル
クを含むPBS溶液(8g/L NaCl,0.2g/L KCl.1.44g
/L Na2HPO4,0.24g/L KH2PO4,HClでpH7.4に調整
)で、特定の部位をブロッキングする。ニトロセルロース膜を、ウサギ1次抗体
と1時間インキュベートする。次いで、ペルオキシダーゼと結合した、ウサギF
cフラグメントに特異的なヤギ抗体(Sigma)とインキュベートする。発色は、
H2CO2,PBS,ジアミノベンズアミジンの存在下で行う(ゲル写真は、本発
明では示さず)。
TRとβ−ガラクトシダーゼタンパク質のレポーター遺伝子(LacZ)でトラ
ンスフェクトされたヒトHeLa細胞を用いて測定する。
i、抗Tat Bru cmCを希釈倍率を上げながら、細胞培養培地に加え、
次いで、100μLのTat Eli変異体を1又は5μM加える。それ故、β
−ガラクトシダーゼの細胞質蓄積は、Tatの存在に依存する。
される。このことは論理にかなう。該血清は、トランス活性化活性を中和するこ
とが求められているものと同じ変異体に対して産生される抗体を含むからである
。しかし、Tat OyiがTat Eliのトランス活性化活性を顕著に中和
する抗体を産生できることは、強調されるべきである。事実、この阻害は、特に
、抗Tat Bru cmC血清を用いて1/10希釈の場合に観察される阻害
よりも大きい。このことにより、他のTat変異体に対する抗Tat Oyi抗
体の利点が確認される。
図1B:MULTALINプログラムを用いた、Tatタンパク質のサイズと、
それらが含む変異の関数としてのTatタンパク質の分類。
グラフィーによる6つのTat変異体の精製。
定数の測定。
)、Tat Bru cmC(記号無し)、Tat Jr(黒円)、Tat M
al(白四角)、Tat Eli(黒四角)変異体の二色性スペクトル。
ーナル血清(抗Tat Bru cmC、抗Tat Oyi、抗Tat Eli
)の希釈液を用いて行われたELISA試験。
清による、Tat Eliによるトランス活性化の阻害。
護基を使用することを特徴とする請求項1乃至5、10及び11のいずれか1項
に記載のTat変異体の合成方法。
Claims (18)
- 【請求項1】 医薬上許容され得る賦形剤及び、適宜、1種以上の適切な免
疫アジュバントと組み合わせて、TARと結合できるが、トランス活性化ができ
ない少なくとも1種のHIV−1 Tatタンパク質の全体又は一部を含有する
抗HIV−1ワクチン。 - 【請求項2】 Tatタンパク質が99乃至106個のアミノ酸を含むこと
を特徴とする請求項1に記載のワクチン。 - 【請求項3】 Tatタンパク質が、そのヌクレオチド配列が、機能的なT
atのヌクレオチド配列と比較して、少なくとも一つの変異を有するTatであ
ることを特徴とする請求項1又は2に記載のワクチン。 - 【請求項4】 変異が、Tatタンパク質のシステインの少なくとも一つに
作用することを特徴とする請求項3に記載のワクチン。 - 【請求項5】 Tatタンパク質が、HIV−1 Oyi変異体のTat又
はこのTatの一部であることを特徴とする請求項1乃至4に記載のワクチン。 - 【請求項6】 Tatタンパク質が化学合成Tatであることを特徴とする
請求項1乃至5のいずれか1項に記載のワクチン。 - 【請求項7】 Tatが固相で合成されることを特徴とする請求項6に記載
のワクチン。 - 【請求項8】 Tatタンパク質が組換えTatであることを特徴とする請
求項1乃至5のいずれか1項に記載のワクチン。 - 【請求項9】 Tatの全体又は一部のためのヌクレオチド配列と、その発
現のために必要な要素とを含む発現ベクターを含むことを特徴とする請求項1乃
至5のいずれか1項に記載のワクチン。 - 【請求項10】 Tat配列の少なくともN末端領域及び/又は塩基性領域
を含むことを特徴とする請求項1乃至9のいずれか1項に記載のワクチン。 - 【請求項11】 TatのC末端に位置するArg−Gly−Asp領域が
改変されていることを特徴とする請求項1乃至7のいずれか1項に記載のワクチ
ン。 - 【請求項12】 幾つかのTat変異体を認識できる抗Tatポリクローナ
ル抗体の製造方法であって、 −免疫応答アジュバントと組み合わせて、Tatタンパク質又はこのTatタン
パク質の一部を注射することによって、動物を免疫化すること、 −該免疫化した動物の血清に含まれる特異的抗体を精製すること、 を含む方法。 - 【請求項13】 免疫化工程で使用されるTatタンパク質又はTatタン
パク質の一部が、Oyi又はBru cmC変異体に対応することを特徴とする
請求項12に記載の方法。 - 【請求項14】 免疫化工程で使用されるTatタンパク質又はTatタン
パク質の一部が、請求項6に記載のとおりであることを特徴とする請求項12又
は13に記載の方法。 - 【請求項15】 生体試料中の、Tatタンパク質又はTatタンパク質の
一部の存在の検出方法であって、 −該試料を、幾つかのTat変異体と抗原−抗体複合体を生じさせることができ
る抗Tat抗体と接触させること、 −該抗原−抗体複合体の存在を測定すること、 を含む方法。 - 【請求項16】 生体試料中のTatタンパク質又はTatタンパク質の一
部の存在を測定することによる、HIV感染の診断用キットであって、 −免疫学的反応に適した媒質の調製のための試薬、 −免疫学的反応によって産生される抗原−抗体複合体の検出を可能とする試薬、 −任意で、抗原を含まない参照生体試料(陰性対照)、 −任意で、所定量の抗原を含む参照生体試料(陽性対照)、 を含むキット。 - 【請求項17】 免疫学的反応に適した媒質を調製するための試薬が、請求
項15に記載の抗体を含むものである請求項16に記載のキット。 - 【請求項18】 FMOCタイプ、好ましくはfastFMOCタイプの保
護基を使用することを特徴とする請求項1乃至5、10及び11のいずれか1項
に記載のTat変異体の合成方法。
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