WO2000040970A1 - Detection et suivi des infections virales a vih - Google Patents

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WO2000040970A1
WO2000040970A1 PCT/FR1999/003311 FR9903311W WO0040970A1 WO 2000040970 A1 WO2000040970 A1 WO 2000040970A1 FR 9903311 W FR9903311 W FR 9903311W WO 0040970 A1 WO0040970 A1 WO 0040970A1
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mixotope
hiv
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antigenic peptide
pol
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PCT/FR1999/003311
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Denis Tranchand-Bunel
Claude Auriault
Original Assignee
Institut Pasteur De Lille
Centre National De La Recherche Scientifique-Cnrs
Gras-Masse, Hélène
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    • G01N2333/161—HIV-1, HIV-2 gag-pol, e.g. p55, p24/25, p17/18, p.7, p6, p66/68, p51/52, p31/34, p32, p40

Definitions

  • the present invention relates to a reagent for detecting and monitoring viral infections caused by the human immunodeficiency virus (HIV) and to its applications for the detection of human immunodeficiency.
  • HIV human immunodeficiency virus
  • the first HIV infection screening trials implemented in 1983 and 1985, used a viral lysate to capture anti-HIV antibodies. These tests had the major disadvantage of lacking both sensitivity and specificity.
  • due to the use of a viral lysate there was a difficulty in reproducing viral antigens from batch to batch and the need to carry out virus cultures in large quantities, which presented a danger for the manipulator. .
  • EP 181 150 and EP 387 914 describe the use of genetic engineering, for obtaining polypeptides (antigens), with a view to detecting anti-HIV1 antibodies.
  • the immunoassays using such reagents generally have a low sensitivity, especially when there is a low affinity between the antibody to be tested and the selected antigen. This is particularly the case during a recent seroconversion and / or when a new HIV subtype appears.
  • one or more amino acids selected from a mixture of amino acids selected from known variants of said epitopic domain or selected arbitrarily.
  • compositions or mixtures generally contain between 2 and 2000 and up to 10 10 peptides which comprise different individual peptide sequences which are found as close as possible to a predefined statistical distribution; they can be used as immunological reagents.
  • HIV1 virus is subject to frequent mutations; in this context, some of these viruses are little or not detected by these tests because of the mutations they carry, which results in the non-detection of subjects contaminated by these viruses (false negatives).
  • the Applicant has set itself the goal of providing a new reagent for detecting HIV infections, capable of being used in immunoenzymatic tests, which is both specific and sensitive and which makes it possible to obtain a gain. sensitivity of at least 15 to 30% compared to the reagents of the prior art. Such a reagent better meets the needs of the practice than the reagents of the prior art, in the context of immunoenzymatic tests, in particular of the ELISA type.
  • the subject of the present invention is a reagent for detecting an infection caused by a human immunodeficiency virus, characterized in that it comprises a mixture consisting of (1) an antigenic fragment or peptide encoded by the pol gene of HIV1 comprising at most 60 amino acids, preferably between 20 and 40 amino acids and (2) a mixture (called mixotope) of convergent combinatorial peptides, derived from said antigenic fragment.
  • mixture of (1) and (2) means either the association of (1) and (2) in said mixture, or the sequential association of (1) and (2) on solid support.
  • the term “mixotope” is intended to mean the mixture of all the combinatorial peptides obtained from the selected antigenic fragment by artificial or constructed degeneration; they are preferably obtained during a single synthesis and represent the peptide antigen and its variability, in its function of recognition of a population of antibodies; different mixotopes can be obtained from the same peptide; the factors which intervene in the constitution of a mixotope are:
  • the percentage of degeneration of the selected native antigenic peptide (total or partial degeneration);
  • the mode of selection of the substitution of amino acids of said native antigenic peptide for each position of the sequence of the native antigenic peptide chosen, the amino acid substitution is selected on the basis of the replacement matrix, established by HM GEYSEN et al. (J. Mol. Recog., 1988, 1, 32-41), or modified, as illustrated in FIG. 1, taking into account the tolerance of antibody recognition, depending on the substitution of amino acids in the linear epitopes: preferably, for a given position, the amino acids having the highest percentage of "replaceability" are chosen. However, it is better to take into account the conformation of natural epitopes, before degeneration.
  • the mixotope within the meaning of the present invention consisting of convergent combinatorial peptides, derived from a native antigenic peptide, therefore represents an artificial and unnatural degeneration of the native structure by the systematic or partial replacement of each amino acid by another from the replaceable matrix of GEYSEN or of the matrix according to FIG. 1.
  • Said mixotope which can also be called convertope, differs from the mixotopes described in H. GRAS-MASSE et al. (Peptide Research, 1992, 5, 4, 211-216), which are divergent peptides obtained by natural degeneration taking into account natural antigenic variations or frequently observed during evolution and for vaccine purposes.
  • the term constructed replaceability matrix means a matrix which does not reproduce the natural variations or frequently observed in evolution; the GEYSEN replaceability matrix or the matrix according to FIG. 1 are particularly suitable.
  • the reagents according to the invention make it possible to obtain reliable, reproducible, very sensitive and very specific results, insofar as the combinations according to the invention have a synergistic effect in the detection of antibodies induced by viruses. ; in particular, a sensitivity gain of 15 to 30% is obtained.
  • said antigenic peptide corresponds to an integrase epitope coded by the pol gene of HIV1, and preferably corresponds to the sequence KIQNFRNYYRDSRDPLWKGPAKLLWKGEGAVVIQDN (SEQ ID NO: 1) (HIV- POL); it has the advantage of having only few natural permutations within the groups M and O and of the subtypes of the class M.
  • said selected antigenic peptide has been rigorously degenerated on the basis of the replacement matrix established by GEYSEN et al., Cited above or modified as illustrated in FIG. 1, which allows obtaining more than 10 10 peptides.
  • an integrase epitope preferably an immunodominant fragment
  • a mixotope derived from said epitope
  • MIXO HIV-POL
  • HIV-POL with its mixotope, MIXO (HIV-POL)
  • MIXO MIXO
  • the mixture of degenerate peptides, artificially produced, during the same synthesis is combined with the native peptide. Such a combination makes it possible, unexpectedly, to increase the reactivity of the mixture of antigens produced with respect to the antibodies naturally induced by the virus.
  • the antigenic peptide (1) and the mixotope (2) are fixed on a solid support, preferably microtitration plates.
  • said peptide (1) and said mixotope (2) are sequentially fixed on said support.
  • the ratio of antigenic fragment: mixotope in the mixture is between 1: 10 and 1: 100.
  • the present invention also relates to a method for diagnosing an HIV1 infection, by an immunoenzymatic method, characterized in that it uses a reagent according to the invention.
  • a support such as a microtiter plate
  • the present invention further relates to a kit or kit for diagnosing a viral HIV infection, characterized in that it comprises at least one reagent according to the invention.
  • HIV 1 -POL determined 24 h after total acid hydrolysis (HAT) (black histograms), compared with the theoretical composition, calculated on the basis of an equi-molecular quantity of each amino acid, introduced in the degenerate positions (histograms white).
  • the one letter code is used for amino acids.
  • B represents Asn or Asp
  • Z represents Glu and Gln.
  • FIG. 3 represents the amino acid composition of the mixotop-MIXO (HIV-POL), determined 24 h after total acid hydrolysis (HAT) (black histograms), compared with the theoretical composition, calculated on the basis of an equimolecular quantity of each amino acid, introduced into the degenerate positions (white histograms).
  • the one letter code is used for amino acids.
  • B represents Asn or Asp
  • Z represents Glu and Gln.
  • FIG. 4 illustrates the IgG reactivity of 20 seropositive HIV1 sera (! and 26 seronegative HIV1 sera (O), characterized by immunofluorescence with the HIV-POL peptide fixed on a solid support at the rate of 0.1 ⁇ g / well ( Figure 4A) or at a rate of 1 ⁇ g / well ( Figure 4B).
  • the horizontal line represents the threshold value, corresponding to the average obtained with seronegative sera + 3 standard deviations (SD).
  • SD standard deviations
  • FIG. 5 represents the effect of the MIXO mixotope (HIV-POL) on the reactivity of the IgGs of the seropositive HIV1 sera (!) and of the seronegative sera (O) at two different concentrations: 1 ⁇ g / well (FIG. 5 A) or at 10 ⁇ g / well (FIG. 5B), in an ELISA test.
  • the horizontal line represents the threshold value corresponding to the mean of the control sera + 3 SD.
  • FIG. 6 illustrates the effect of the HIV-POL peptide + MIXO mixotope (HIV-POL) combination on the IgG reactivity of seropositive (!) and seronegative (O) sera in ELISA tests.
  • Each microtiter plate well is sequentially coated with 1 ⁇ g of HIV-POL peptide, then 10 ⁇ g of MIXO mixotope (HIV-POL) and brought into contact with the sera.
  • the native HIV-POL peptide (SEQ ID NO: 1) is synthesized in solid phase using the conventional strategy of the Boc-benzyl type (or Fmoc), in an automated peptide synthesizer (model 43 OA, Applied Biosystems Inc.).
  • the side chain protection groups are: Asn (Trt), Gin (Trt), Asp (OChx), Glu (OChx), Ser (Bzl), Thr (Bzl), Arg (Tos), Cys (4- MeBzl), and His (Dnp) (see RC SHEPPARD, Peptide, Synthesis, Comp. Org. Chem., 1979, 5, 321-363).
  • Amino acids are introduced using the HBTU / ⁇ OBt activation protocol with systematic double coupling on a Boc-Gln-Pam resin (Applied Biosystems). After thiolysis of the dinitrophenyl Dnp group, followed by a final deprotection and a cleavage with hydrofluoric acid, the cleaved and deprotected peptide is precipitated and washed with cold diethyl ether, then dissolved in 5% acetic acid and lyophilized. The peptide is more than 90% purified on a 5 mm x column
  • the purity of the peptide, greater than 96% is determined by analytical reverse phase HPLC.
  • sequence identity of the purified peptide is confirmed by determining the amino acid composition and by mass spectrometry recorded on a mass spectrometer (MALDI) (calculated 4258.9 [M + H] + , found 4260.0) .
  • MALDI mass spectrometer
  • a first coupling is carried out with 1 mmol (total amount) of Boc-amino acid (or of a mixture of Boc-amino acids).
  • a second coupling, using 2 mmol (total amount), is then systematically carried out.
  • the crude peptide is dissolved in TFA (30 ml) and precipitated by adding the said peptide in a solution of cold diethyl ether (300 ml).
  • the precipitate is dissolved in water and lyophilized. After oxidation in air of the solution at neutral pH, the mixotope is purified by gel filtration on a TSK HW40S column (Merck, Darmstadt, FRG). An aliquot of each purified mixotope is subjected to total acid hydrolysis for 24 hours with an HCl 6N: phenol mixture (10: 1), for the determination of the amino acid composition.
  • FIG. 1 The replacement of the amino acids of MIXO (HIV-POL) is specified in FIG. 1.
  • TSK HW 40S gel filtration
  • a sample of the fraction used in the ELISA tests is subjected to a HAT, the result of which is presented in FIG. 3.
  • HAT of the native peptide HAT of the native peptide
  • I isoleucine
  • valine being replaced by isoleucine in the mixotope and being part of a highly hydrophobic sequence of the mixotope, and therefore difficult to hydrolyze, makes it possible to explain the reduced quantities of Val and Ile in the result of this HAT (FIG. 3 ).
  • the sequence of the HIV-POL peptide and the mixotopes derived therefrom are shown in FIG. 1. These reagents are preferably fixed on a solid support (microplate) at a concentration of 0.1 ⁇ g / well, for the HIV-POL peptide and at a concentration of 10 ⁇ g / well for the mixotopes.
  • EXAMPLE 2 Immuno-enzymatic test using a reagent according to the invention for the serodetection of HIV1.
  • HIV-POL peptide SEQ ID ⁇ O: l
  • MIXO HV-POL
  • MIXO mixotope
  • phosphate buffer comprising 1.8% NaCl, pH 7.4 (PBS) and the excess binding sites are blocked with albumin (addition of 0.3 ml of 2% BSA (bovine serum albumin) in PBS, at 37 ° C, for 60 minutes).
  • BSA bovine serum albumin
  • PBS-T buffer the human sera to be tested are diluted 1/50 in PBS-T comprising 2% bovine serum albumin (BSA) and are incubated in wells containing the reagent according to the invention as specified above. above, for 120 minutes at
  • the peroxidase-goat antibody-anti-human IgG-AM conjugates (Pasteur diagnostic), diluted to 1 / 10,000 in PBS-T buffer comprising 2% BSA, are incubated for 60 minutes at 37 ° vs.
  • the conjugated antibody which binds to the Ig fixed on the support, is revealed for its peroxidase activity, using as substrate o-phenylenediamine dihydrochloride and H 2 O 2 , in a 0.05 M citrate buffer. , pH 5.5, for 30 minutes in the dark and at room temperature.
  • the reaction is blocked by the addition of H 2 SO 4 4N (50 ⁇ l).
  • the absorbance is recorded against a blank at 492 nm A 492 ), with a multi-channel automatic reader (M R 5000, Dynatech).
  • M R 5000, Dynatech The mean A 492 + 3 standard deviations (SD) of the seronegative samples is used as a threshold value in the ELISA tests.
  • the specificity of binding of positive sera to the different mixotopes in the solid phase is evaluated by the absorption of the antibodies by the native HIV-POL antigen in solution, using the method of B. FRIGUET et al. (J. Immunol. Methods, 1985, 77, 305-319).
  • This method is based on the measurement of the concentration of free antibody by an indirect ELISA method, when the HIV-POL antigen and the antibodies are in equilibrium in solution.
  • the HIV-POL antigen at different concentrations (10 "10 M to 2.10 “ 6 M) is first incubated in solution (PBS-T buffer + 2% BSA) with an seropositive serum, at constant concentration (1/50 ) until the equilibrium state is reached.
  • MIXO HAV-POL
  • NAHCO 3 50 mM, pH 9.6.
  • the bound immunoglobulins are detected by the addition of goat anti-human IgG-A-M antibodies, coupled to peroxidase.
  • the reactivity of human anti-HIV-POL IgG with respect to the HIV-POL peptide is analyzed by an ELISA test, on different sera: 20 sero-positive sera (confirmed in western blot) and 26 seronegative sera.
  • the mixotopes were tested as antigens in solid phase, at two concentrations, namely 0.1 ⁇ g and 10 ⁇ g / well (FIG. 5).
  • MIXO HV-POL
  • FIGS. 5A and 5B The use of MIXO (HIV-POL) alone in the ELISA tests (FIGS. 5A and 5B) is not satisfactory since the sensitivity of the detection of IgG does not exceed 50% at the best coating concentration (FIG. 5B) .

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Abstract

Réactif de détection et de suivi des infections virales, provoquées par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) et ses applications pour la détection de l'immunodéficience humaine. Ladite réaction comprend un mélange constitué par (1) un peptide antigénique codé par le gène pol du VIH1 comprenant au plus 60 acides aminés, de préférence entre 20 et 40 acides aminés et (2) un mélange (dénommé mixotope) de peptides combinatoires convergents, dérivés dudit peptide antigénique.

Description

DETECTION ET SUIVI DES INFECTIONS VIRALES A VIH
La présente invention est relative à un réactif de détection et de suivi des infections virales, provoquées par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) et à ses applications pour la détection de l'immunodéficience humaine.
Les premiers essais de dépistage de l'infection à VIH, mis en place en 1983 et 1985, utilisaient un lysat viral pour capturer les anticorps anti-VIH. Ces tests présentaient l'inconvénient majeur de manquer à la fois de sensibilité et de spécificité. En outre, du fait de l'utilisation d'un lysat viral, il existait une difficulté de reproduction des antigènes viraux de lot à lot et la nécessité d'effectuer des cultures de virus en grande quantité, ce qui présentait un danger pour le manipulateur.
La connaissance de la séquence complète du virus VIH1 (S. Wain- Hobson et al., Cell, 1985, 40, 9-17) a ouvert la voie à de nouvelles approches pour la production d'antigènes. Ainsi les brevets européens EP 181 150 et EP 387 914 décrivent l'utilisation du génie génétique, pour l'obtention de polypeptides (antigènes), en vue de détecter les anticorps anti-VIHl.
Ces avancées ont permis le développement du sérodiagnostic (détection des immunoglobulines dans le sérum) du VIH. Les anticorps anti-VIHl produits sont ainsi détectés par réaction avec un ou plusieurs antigènes qui réagissent plus ou moins spécifiquement avec lesdits anticorps.
Toutefois, les immunoessais mettant en œuvre de tels réactifs présentent de manière générale une faible sensibilité, notamment lorsqu'il existe une faible affinité entre l'anticorps à tester et l'antigène sélectionné. Ceci est notamment le cas lors d'une séroconversion récente et/ou lors de l'apparition d'un nouveau sous- type de VIH.
En effet, un tel immunoessai doit être sensible, fiable, spécifique, simple et rapide ; toutefois, la sensibilité de ces tests est essentiellement fonction du choix de l'antigène ou réactif. C'est la raison pour laquelle de nombreuses recherches ont été effectuées pour mettre au point des antigènes plus sensibles et plus spécifiques. Pour résoudre en particulier le problème du manque de sensibilité, certains Auteurs, ont proposés d'utiliser, en combinaison, différents antigènes.
Les différentes voies d'approche qui ont été utilisées sont les suivantes : - utilisation d'un ou plusieurs peptides de synthèse, de différentes régions codantes du VIH (J. Wang et al., PNAS, 1986, 83, 6159-6163) ; la Demande EP 220 273, par exemple, décrit une série de peptides de 6 à 49 acides aminés, et notamment un peptide contenant l'épitope immunodominant de la glycoprotéine transmembranaire gp41 (peptide 39) ; - utilisation d'antigènes peptidiques marqués provenant d'un domaine du VIH (Brevet US 5 221 610) ;
- utilisation de peptides biotinylés issus de la gp41, de la boucle V3 ou de la gpl20 : WO 93/18054 ; EP 307 149.
Les travaux sur les peptides de synthèse (J. Wang et al., PNAS, 1986, 83, 6159-6163 et Demande EP 220 273, par exemple) ont démontré l'intérêt d'utiliser des peptides de synthèse et leur mélange, pour la détection d'anticorps anti- VIH, en vue d'améliorer la qualité des dosages immunologiques, à la place des protéines recombinantes ou du virus complet (lysat viral).
Les tests fondés sur l'utilisation desdits peptides ont entraîné de meilleures performances en terme de sensibilité, spécificité et reproductibilité, avec un prix de revient des réactifs diminué et l'absence de tout danger de contamination, lié à la mise en culture du virus. Ces travaux ont ensuite été suivis par de nombreuses équipes (Demande EP 0 278 148, Demande EP 0 214 709).
Toutefois, ces peptides de synthèse et leur mélange ne permettent toujours pas d'éviter les faux-négatifs (sensibilité insuffisante).
Dans le but d'atteindre une sensibilité suffisante pour pouvoir détecter les séroconversions récentes ainsi que les nouveaux sous-types de VIH, il a été proposé (Demande EP 0 857 731) d'utiliser, comme réactif :
* des mélanges de peptides, obtenus à partir d'une séquence comprenant un domaine épitopique variable issu de la gp41, ou de la gpl20 ; lesdits peptides présentent une longueur de 6 à 50 acides aminés, constituent des variantes dudit domaine épitopique (homologies de séquence d'au moins 30 % avec le domaine épitopique natif ou une séquence consensus) et contiennent en des positions sélectivement choisies :
- au moins un groupe de marquage, d'activation ou de liaison à une phase solide et/ou
- un ou plusieurs acides aminés sélectionnés à partir d'un mélange d'acides aminés sélectionnés à partir de variants connus dudit domaine épitopique ou sélectionnés arbitrairement.
* des compositions antigéniques multimériques présentant la formule générale P' {P2[P3(P4)t]s}r, dans laquelle P1, P2, P3 et P4 représentent des mélanges peptidiques tels que définis ci-dessus, r = 1 ou 2, s = 0 à 4 et t = 0 à 8, ou
* des compositions polyhapténiques de formule générale : (P)nT(-L)m ou T(-P-Lm)n dans laquelle T représente un support, P représente les peptides du mélange de peptides, tel que défini ci-dessus, L représente des groupes de marquage ou de liaison à une phase solide, n est un nombre entier compris entre 2 et 100 et m est un nombre entier compris entre 1 et 10.
Ces différentes compositions ou mélanges contiennent généralement entre 2 et 2000 et jusqu'à 1010 peptides qui comprennent des séquences peptidiques individuelles différentes qui se retrouvent le plus près possible d'une distribution statistique prédéfinie ; ils peuvent être utilisés comme réactifs immunologiques.
Toutefois, même si ces mélanges permettent d'obtenir une meilleure sensibilité, ils ne permettent notamment pas de résoudre effectivement le problème de la détection fiable de nouveaux sous-types de virus et de virus mutés. Or, le virus VIH1 est sujet à de fréquentes mutations ; dans ce contexte, certains de ces virus sont peu ou pas détectés par ces tests en raison même des mutations qu'ils portent, ce qui a pour conséquence, la non-détection des sujets contaminés par ces virus (faux négatifs).
C'est pourquoi la Demanderesse s'est donné pour but de pourvoir à un nouveau réactif de détection des infections à VIH, apte à être utilisé dans les tests immunoenzymatiques, qui soit à la fois spécifique et sensible et qui permette d'obtenir un gain de sensibilité d'au moins 15 à 30 % par rapport aux réactifs de l'art antérieur. Un tel réactif répond mieux aux besoins de la pratique que les réactifs de l'Art antérieur, dans le cadre des tests immunoenzymatiques, notamment de type ELISA.
Ce nouveau réactif permet notamment de résoudre effectivement le problème de la détection de nouveaux sous-types de virus et de virus mutés. La présente invention a pour objet un réactif de détection d'une infection provoquée par un virus de l'immunodéficience humaine, caractérisé en ce qu'il comprend un mélange constitué par (1) un fragment ou peptide antigénique codé par le gène pol du VIH1 comprenant au plus 60 acides aminés, de préférence entre 20 et 40 acides aminés et (2) un mélange (dénommé mixotope) de peptides combinatoires convergents, dérivés dudit fragment antigénique.
Au sens de la présente invention, on entend par mélange de (1) et de (2) soit l'association de (1) et (2) dans ledit mélange, soit l'association séquentielle de (1) et (2) sur un support solide.
Au sens de l'invention, on entend par mixotope, le mélange de tous les peptides combinatoires, obtenus à partir du fragment antigénique sélectionné, par dégénération artificielle ou construite ; ils sont, de préférence, obtenus au cours d'une synthèse unique et représentent l'antigène peptidique et sa variabilité, dans sa fonction de reconnaissance d'une population d'anticorps ; différents mixotopes peuvent être obtenus à partir du même peptide ; les facteurs qui interviennent dans la constitution d'un mixotope sont :
- d'une part, le pourcentage de dégénération du peptide antigénique natif sélectionné (dégénération totale ou partielle) ; et
- d'autre part, le mode de sélection de la substitution des acides aminés dudit peptide antigénique natif ; pour chaque position de la séquence du peptide antigénique natif choisi, la substitution en acides aminés est sélectionnée sur la base de la matrice de remplacement, établie par H.M. GEYSEN et al. (J. Mol. Recog., 1988, 1, 32-41), ou modifiée, comme illustrée à la figure 1, en tenant compte de la tolérance de la reconnaissance d'anticorps, en fonction de la substitution en acides aminés dans les épitopes linéaires : on choisit de préférence, pour une position donnée, les acides aminés présentant le pourcentage de " remplaçabilité " le plus élevé. Toutefois, il est préférable de prendre en compte la conformation des épitopes naturels, avant dégénération.
Le mixotope au sens de la présente invention, constitué de peptides combinatoires convergents, dérivés d'un peptide antigénique natif, représente donc une dégénérescence artificielle et non naturelle de la structure native par le remplacement systématique ou partiel de chaque acide aminé par un autre issu de la matrice de remplaçabilité de GEYSEN ou de la matrice selon la figure 1.
Ledit mixotope qui peut être également dénommé convertope, diffère des mixotopes décrits dans H. GRAS-MASSE et al. (Peptide Research, 1992, 5, 4, 211-216), qui sont des peptides divergents obtenus par dégénérescence naturelle en tenant compte des variations antigéniques naturelles ou observées fréquemment aux cours de l'évolution et à visée vaccinale.
Également au sens de l'invention, on entend par matrice de remplaçabilité construite, une matrice qui ne reproduit par les variations naturelles ou obser- vées fréquemment dans l'évolution ; la matrice de remplaçabilité de GEYSEN ou la matrice selon la figure 1, sont particulièrement adaptées.
De manière surprenante, les réactifs selon l'invention permettent d'obtenir des résultats fiables, reproductibles, très sensibles et très spécifiques, dans la mesure où les combinaisons selon l'invention présentent un effet de synergie dans la détection des anticorps induits par les virus ; en particulier, on obtient un gain de sensibilité de 15 à 30 %.
Selon un mode de réalisation avantageux du réactif selon l'invention, ledit peptide antigénique correspond à un épitope de l'intégrase codée par le gène pol du VIH1, et correspond de préférence à la séquence KIQNFRNYYRDSRDPLWKGPAKLLWKGEGAVVIQDN (SEQ ID NO:l) (HIV- POL) ; il a l'avantage de ne posséder que peu de permutations naturelles au sein des groupes M et O et des sous-types de la classe M.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit peptide antigénique sélectionné (HIV-POL) a été dégénéré de façon rigoureuse sur la base de la matrice de remplacement établie par GEYSEN et al., précité ou modifiée comme illustré à la figure 1, qui permet l'obtention de plus de 1010 peptides. De manière inattendue, la combinaison d'un épitope de l'intégrase (fragment immunodominant, de préférence) avec un mixotope, dérivé dudit épitope, améliore, de manière significative, la sensibilité et la spécificité du sérodiagnostic immunoenzymatique du VIHl ; en effet, un tel réactif va permettre de capter des anticorps de faible affinité pour la séquence native. La combinaison peptide natif avec le mixotope nommé MIXO(HIV-POL) permet d'augmenter la réactivité du mélange d'antigènes vis-à-vis des anticorps naturellement produit vis-à-vis de la structure mère (haute et basse affinité pour celle-ci).
En particulier, la combinaison de HIV-POL avec son mixotope, MIXO(HIV-POL), permet d'augmenter la sensibilité de la sérodétection d'au moins 15 % tout en présentant une spécificité de 100 %.
Le mélange de peptides dégénérés, artificiellement produit, au cours d'une même synthèse est combiné avec le peptide natif. Une telle combinaison permet, de manière inattendue, d'augmenter la réactivité du mélange d'antigènes produit vis-à-vis des anticorps naturellement induits par le virus.
Selon un autre mode de réalisation avantageux du réactif selon l'invention, le peptide antigénique (1) et le mixotope (2) sont fixés sur un support solide, de préférence des plaques de microtitration.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit peptide (1) et ledit mixotope (2) sont fixés séquentiellement sur ledit support.
Selon un autre mode de réalisation avantageux du réactif selon l'invention, le rapport fragment antigénique: mixotope dans le mélange est compris entre 1 :10 et 1 :100.
La présente invention a également pour objet un procédé de diag- nostic d'une infection à VIHl, par une méthode immuno-enzymatique, caractérisé en ce qu'il met en œuvre un réactif selon l'invention.
Selon un mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, il comprend :
- la mise en contact d'un sérum à analyser avec un réactif tel que défini ci-dessus,
- l'addition d'anticorps anti-Ig humaines, couplés à une enzyme et - la révélation qualitative et/ou quantitative des anticorps anti-inté- grase, éventuellement présents dans le sérum à analyser par addition du substrat de l'enzyme.
Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, il comprend :
- la fixation d'un réactif selon l'invention sur un support, tel qu'une plaque de microtitration,
- l'addition du sérum à analyser et
- la détection de la fixation des anticorps anti-intégrase présents dans ledit sérum par addition d'anticorps anti-IgG humaines, couplés à une enzyme et
- la révélation qualitative et/ou quantitative au spectrophotomètre par addition du substrat de l'enzyme.
La présente invention a, en outre, pour objet un kit ou coffret de diagnostic d'une infection virale à VIH, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un réactif selon l' invention.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 illustre une matrice de remplacement des acides aminés, modifiée par rapport à celle de H.M. GEYSEN (référence précitée) ; on obtient le mixotope MIXO(HIV-POL), forme dégénérée par remplacement systématique de chaque acide aminé par son homologue pris dans la matrice de remplaçabilité de GEYSEN. - la figure 2 illustre la composition en acides aminés du peptide
HIV 1 -POL, déterminée 24 h après une hydrolyse acide totale (HAT) (histogrammes noirs), comparée à la composition théorique, calculée sur la base d'une quantité équi- moléculaire de chaque acide aminé, introduit dans les positions dégénérées (histogrammes blancs). Le code une lettre est utilisé pour les acides aminés. B repré- sente Asn ou Asp, Z représente Glu et Gin. - la figure 3 représente la composition en acides aminés du mixo- tope-MIXO(HIV-POL), déterminée 24 h après une hydrolyse acide totale (HAT) (histogrammes noirs), comparée à la composition théorique, calculée sur la base d'une quantité équimoléculaire de chaque acide aminé, introduit dans les positions dégéné- rées (histogrammes blancs). Le code une lettre est utilisé pour les acides aminés. B représente Asn ou Asp, Z représente Glu et Gin.
- la figure 4 illustre la réactivité IgG de 20 sérums HIV1 séropositifs ( ! ) et de 26 sérums HIV1 séronégatifs (O), caractérisés par immunofluorescence avec le peptide HIV-POL fixé sur un support solide à raison de 0,1 μg/puits (figure 4A) ou à raison de 1 μg/puits (figure 4B). La ligne horizontale représente la valeur seuil, correspondant à la moyenne obtenue avec les sérums séronégatifs + 3 déviations standards (SD). Ces figures comportent en abscisse le nombre de sérums et en ordonnée l'absorbance à 492 nm, avec un test ELISA mettant en œuvre la séquence HIV- POL (SEQ ID NO:l). - la figure 5 représente l'effet du mixotope MIXO(HIV-POL) sur la réactivité des IgG des sérums HIV1 séropositifs ( ! ) et des sérums séronégatifs (O) à deux concentrations différentes : 1 μg/puits (figure 5 A) ou à 10 μg/puits (figure 5B), dans un test ELISA. La ligne horizontale représente la valeur seuil correspondant à la moyenne des sérums contrôles + 3 SD. Ces différentes figures comprennent en abscisse le nombre de sérums et en ordonnée l'absorbance à 492 nm.
- la figure 6 illustre l'effet de l'association peptide HIV-POL + mixotope MIXO(HIV-POL) sur la réactivité IgG des sérums séropositifs ( ! ) et séronégatifs (O) dans des tests ELISA. Chaque puits de plaque de microtitration est séquentiellement revêtu de 1 μg de peptide HIV-POL, puis de 10 μg de mixotope MIXO(HIV-POL) et mis en contact avec les sérums.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. EXEMPLE 1 : Préparation des réactifs selon l'invention. a) Synthèse du peptide :
Le peptide natif HIV-POL (SEQ ID NO:l) est synthétisé en phase solide en utilisant la stratégie conventionnelle du type Boc-benzyle (ou Fmoc), dans un synthétiseur de peptides automatisé (modèle 43 OA, Applied Biosystems Inc.). Les groupes de protection des chaînes latérales sont les suivants : Asn (Trt), Gin (Trt), Asp (OChx), Glu (OChx), Ser (Bzl), Thr (Bzl), Arg (Tos), Cys (4-MeBzl), et His (Dnp) (voir R.C. SHEPPARD, Peptide, Synthesis, Comp. Org. Chem., 1979, 5, 321-363).
Les acides aminés sont introduits en utilisant le protocole d'activation HBTU/ΗOBt avec un double couplage systématique sur une résine Boc- Gln-Pam (Applied Biosystems). Après thiolyse du groupe dinitrophényl Dnp, suivie par une déprotection finale et un clivage à l'acide fluorhydrique, le peptide clivé et déprotégé est précipité et lavé avec du diéthyléther froid, puis dissous dans de l'acide acétique à 5 % et lyophilisé. Le peptide est purifié à plus de 90 % sur une colonne de 5 mm x
250 mm, 100 A Nucleosil Cl 8 RP-HPLC préparative (Macherey Nagel, Dϋren, FRG) et ledit peptide est ensuite caractérisé.
L'homogénéité est confirmée par HPLC analytique sur une colonne Vydac Cl 8 éluée avec un système de solvants (TFA-acétonitrile-eau), dans un appa- reil Shimadzu.
La pureté du peptide, supérieure à 96 % est déterminé par HPLC analytique en phase inverse.
L'identité de séquence du peptide purifié est confirmée par la détermination de la composition en acides aminés et par spectrométrie de masse enregistrée sur un spectromètre de masse (MALDI) (calculé 4258,9 [M+H]+, trouvé 4260,0).
La composition en acides aminés (à l'exception du tryptophane), contrôlée par hydrolyse acide totale (HAT) est présentée figure 2. On observe une sous-représentation de la valine (figure 2), qui se justifie par un enchaînement d'acides aminés aliphatiques difficilement hydrolysables comportant deux des trois valines (AVVI) du peptide natif HIV-POL. b) Préparation des mixotopes :
Ceux-ci sont préparés comme décrits dans H. GRAS-MASSE et al., précité.
Brièvement, des quantités équimolaires d'acides aminés protégés sont pesées et sont utilisées dans les réactions de couplage.
Pour compenser les différences de cinétique dans les réactivités des différents acides aminés, un premier couplage est réalisé avec 1 mmol (quantité totale) de Boc-acide-aminé (ou d'un mélange de Boc-acides-aminés). Un deuxième couplage, utilisant 2 mmol (quantité totale), est alors systématiquement réalisé. Après un clivage à l'acide fluorhydrique, le peptide brut est dissous dans du TFA (30 ml) et précipité par ajout dudit peptide dans une solution de diéthyléther froid (300 ml).
Après centrifugation, le précipité est dissous dans l'eau et lyophilisé. Après oxydation à l'air de la solution à pH neutre, le mixotope est purifié par filtration sur gel sur une colonne TSK HW40S (Merck, Darmstadt, FRG). Un aliquot de chaque mixotope purifié est soumis à une hydrolyse acide totale pendant 24 heures avec un mélange HC1 6N:phénol (10:1), pour la détermination de la composition en acides aminés.
Le remplacement des acides aminés de MIXO(HIV-POL) est précisé à la figure 1. Après purification en gel filtration (TSK HW 40S) un échantillon de la fraction utilisée dans les tests ELISA est soumise à une HAT dont le résultat est présenté figure 3. On observe comme pour la HAT du peptide natif (HIV-POL) une sous représentation de la valine (V) mais également de l'isoleucine (I) à l'issue de la HAT du MIXO(HIV-POL). La valine étant remplacée par l'isoleucine dans le mixotope et faisant partie d'une séquence hautement hydrophobe du mixotope, et donc difficile- ment hydrolysable, permet d'expliquer les quantités minorées de Val et Ile dans le résultat de cette HAT (figure 3). c) Exemples de différents réactifs conformes à l'invention :
La séquence du peptide HIV-POL et des mixotopes qui en dérivent sont représentés à la figure 1. Ces réactifs sont, de préférence, fixés sur support solide (microplaque) à une concentration de 0,1 μg/puits, pour le peptide HIV-POL et à une concentration de 10 μg/puits pour les mixotopes.
EXEMPLE 2 : Test immuno-enzymatique mettant en oeuvre un réactif selon l'invention pour la sérodétection du VIHl.
A. Matériel et méthodes :
- ELISA :
Des puits de plaques de microtitration (Νunc, Maxisorp, Rocksilde,
Danemark) sont recouverts pendant une nuit à 4°C, soit avec 0,2 ml de peptide HIV- POL (SEQ ID ΝO:l), soit avec un mixotope (MIXO(HIV-POL) (0,5 μg/ml dans 50 mM de NAHCO3, pH 9,6), soit séquentiellement avec 0,2 ml de peptide HIV-POL
(0,5 μg/ml) et 0,2 ml de mixotope (MIXO(HIV-POL) (50 μg/ml).
Chaque puits est ensuite lavé avec un tampon phosphate 0,01 M comprenant du NaCl 1,8 %, pH 7,4 (PBS) et les sites de liaison en excès sont bloqués par de l'albumine (addition de 0,3 ml de BSA 2 % (sérum albumine bovine) dans du PBS, à 37°C, pendant 60 minutes).
Après 3 lavages avec 0,3 ml de PBS 0,5 %-Tween 20 (Sigma)
(tampon PBS-T), les sérums humains à tester sont dilués au 1/50 dans du PBS-T comprenant de la sérum albumine bovine (BSA) 2 % et sont incubés dans des puits contenant le réactif selon l'invention comme précisé ci-dessus, pendant 120 minutes à
37°C, dans une atmosphère humidifiée.
Après 4 lavages, les conjugués peroxydase-anticorps de chèvre-anti- IgG-A-M humaines (Diagnostic Pasteur), dilués au 1/10 000 dans du tampon PBS-T comprenant de la BSA 2 %, sont incubés pendant 60 minutes à 37°C. L'anticorps conjugué, qui se lie aux Ig fixées sur le support, est révélé pour son activité peroxydase, en utilisant comme substrat du dihydrochlorure d'o-phénylènediamine et de l'H2O2, dans un tampon citrate 0,05 M, pH 5,5, pendant 30 minutes à l'obscurité et à température ambiante.
La réaction est bloquée par l'addition d'H2SO4 4N (50 μl). L'absorbance est enregistrée contre un blanc à 492 nm A492), avec un lecteur automatique multicanaux (MR 5000, Dynatech). La moyenne A492 + 3 déviations standards (SD) des échantillons séronégatifs est utilisée comme valeur seuil dans les tests ELISA.
- Mesure de l'avidité de la liaison à l'anticorps :
La spécificité de liaison des sérums positifs aux différents mixotopes en phase solide est évaluée par l'absorption des anticorps par l'antigène HIV-POL natif en solution, en utilisant la méthode de B. FRIGUET et al. (J. Immunol. Methods, 1985, 77, 305-319).
Cette méthode est basée sur la mesure de la concentration en anticorps libre par une méthode ELISA indirecte, lorsque l'antigène HIV-POL et les anti- corps sont à l'équilibre en solution.
L'antigène HIV-POL, à différentes concentrations (10"10 M à 2.10"6 M) est d'abord incubé en solution (tampon PBS-T + BSA 2 %) avec un sérum séropositif, à concentration constante (1/50) jusqu'à l'atteinte de l'état d'équilibre.
Après une incubation pendant 18 heures à 4°C, 200 μl de chaque mélange est transféré et incubé pendant 60 min à 20°C dans les puits d'une plaque de microtitration, préalablement recouverte de peptide HIV-POL (0,2 ml, correspondant à
0,5 μg/ml) ou d'un mixotope (MIXO(HIV-POL) (50 μg/ml, 0,2 ml), dans du
NAHCO3 50 mM, pH 9,6.
Après lavage avec du tampon PBS-T, les immunoglobulines liées sont détectées par addition d'anticorps de chèvre anti-IgG-A-M humaines, couplés à de la peroxydase.
L'anticorps conjugué, qui se lie aux Ig, est révélé par l'activité peroxydase comme décrit ci-dessus. Cette méthode donne les courbes de déplacement de la liaison A/Ao par rapport à log(ao). Une estimation précise de l'avidité moyenne du sérum contenant les anticorps anti-HIV-POL est donnée par l'équation
Figure imgf000014_0001
dans laquelle ao est la concentration en antigène soluble total, A et Ao sont les absorbances à 492 nm avec ou sans antigène bloquant, respectivement et v est la fraction d'anticorps lié, si les différentes conditions exposées dans FRIGUET et al. sont satisfaites. B. Résultats a) Liaison anticorps sérigues-HIV-POL (ELISA HIV-POL) :
La réactivité des Ig G humaines anti-HIV-POL vis-à-vis du peptide HIV-POL est analysée par un test ELISA, sur différents sérums : 20 sérums séro- positifs (confirmés en western blot) et 26 sérums séronégatifs.
65 % des sérums HIV1 séropositifs (13 sérums sur 20) dilués au
1/50 sont détectés avec l'antigène HIV-POL utilisé à une concentration de " coating " de 0,1 μg/puits (figure 4A). Une concentration supérieure (1 μg/puits) entraîne l'apparition d'un sérum faux-positifs faisant chuter la spécificité de 100 % à 95 % (figure 4B). b) Liaison anticorps sériques mixotopes (ELISA mixotope) :
Les mixotopes ont été testés comme antigènes en phase solide, à deux concentrations , à savoir 0,1 μg et 10 μg/puits (figure 5).
L'utilisation de MIXO(HIV-POL) seul dans les tests ELISA (figures 5 A et 5B) n'est pas satisfaisante puisque la sensibilité de la détection des IgG ne dépasse pas 50 % à la meilleure concentration de coating (figure 5B).
En revanche, on constate avec le mixotope MIXO(HIV-POL), une diminution du signal produit par les sérums de patients HIV1 séronégatifs. Cette propriété du mixotope est mise à profit dans le test de combinaison des peptides. c) Liaison anticorps sériques-réactif selon l'invention (combinaisons peptide HIV-POL+ mixotope^) (ELISA HIV-POL + mixotope) :
Si un " coating " séquentiel des plaques ELISA est réalisé avec le peptide natif à une concentration de 1 μg/puits entraînant une diminution de la spécificité (figure 4B) puis avec son mixotope MIXO(HIV-POL) à sa concentration la plus efficace (10 μg/puits), on observe (figure 6) que cette combinaison ne laisse apparaître aucun sérum faux-positif et, surtout, permet de passer de 65 % (peptide natif seul) à 80 % de détection des sérums HIV1 positifs. La combinaison de HIV-POL avec son mixotope, MIXO(HIV-POL), a permis d'augmenter la sensibilité de la sérodétection de 15 % tout en présentant une spécificité de 100 %. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS
1°) Réactif de détection d'une infection provoquée par un virus de l'immunodéficience humaine, caractérisé en ce qu'il comprend un mélange constitué par (1) un peptide antigénique codé par le gène pol du VIHl comprenant au plus 60 acides aminés, de préférence entre 20 et 40 acides aminés et (2) un mélange, dénommé mixotope, de peptides combinatoires convergents, dérivés dudit peptide antigénique.
2°) Réactif selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit peptide antigénique correspond à un épitope de l'intégrase codée par le gène pol du VIHl. 3°) Réactif selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit peptide antigénique correspond à la séquence KIQNFRVYYRDSRDPLWKGPAKLL WKGEGAVVIQDN (SEQ ID NO:l) (HIV-POL).
4°) Réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le mixotope correspond à une dégénération de l'ensemble du peptide antigénique sélectionné.
5°) Réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le peptide antigénique (1) et le mixotope (2) sont fixés sur un support solide, de préférence des plaques de microtitration.
6°) Réactif selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit peptide antigénique (1) et ledit mixotope (2) sont fixés séquentiellement sur ledit support.
7°) Réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le rapport peptide antigénique :mixotope dans le mélange est compris entre 1 :10 et 1:100. 8°) Procédé de diagnostic d'une infection à VIHl, par une méthode immuno-enzymatique, caractérisé en ce qu'il met en œuvre un réactif de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
9°) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en contact d'un sérum à analyser avec un réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, - l'addition d'anticorps anti-Ig humaines, couplés à une enzyme et
- la révélation qualitative et/ou quantitative des anticorps anti- intégrase, éventuellement présents dans le sérum à analyser par addition du substrat de l'enzyme. 10°) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend :
- la fixation d'un réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 sur un support, tel qu'une plaque de microtitration,
- l'addition du sérum à analyser et - la détection de la fixation des anticorps anti-intégrase présents dans ledit sérum par addition d'anticorps anti-IgG humaines, couplés à une enzyme et
- la révélation qualitative et/ou quantitative au spectrophotomètre par addition du substrat de l'enzyme.
11°) Kit ou coffret de diagnostic d'une infection virale à VIHl, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un réactif selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
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