PL197666B1 - Szczepionka anty-HIV-1, sposób wytwarzania poliklonalnych przeciwciał anty-TAT, sposób wykrywania obecności białka TAT w próbce biologicznej, zestaw do diagnozowania zakażenia HIV i sposób wytwarzania wariantu TAT - Google Patents
Szczepionka anty-HIV-1, sposób wytwarzania poliklonalnych przeciwciał anty-TAT, sposób wykrywania obecności białka TAT w próbce biologicznej, zestaw do diagnozowania zakażenia HIV i sposób wytwarzania wariantu TATInfo
- Publication number
- PL197666B1 PL197666B1 PL353033A PL35303300A PL197666B1 PL 197666 B1 PL197666 B1 PL 197666B1 PL 353033 A PL353033 A PL 353033A PL 35303300 A PL35303300 A PL 35303300A PL 197666 B1 PL197666 B1 PL 197666B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- tat
- hiv
- protein
- tat protein
- antibodies
- Prior art date
Links
- 229940033332 HIV-1 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 8
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 title description 2
- 108700010908 HIV-1 proteins Proteins 0.000 title 1
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 claims abstract description 188
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims abstract description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 41
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 claims abstract description 31
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 27
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 35
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 34
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 26
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 10
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 10
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 claims description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 8
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 claims description 8
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 6
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 claims description 5
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 4
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical group NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 claims description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 3
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000011269 tar Substances 0.000 claims description 3
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 claims description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 17
- 230000004044 response Effects 0.000 abstract description 4
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 15
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 6
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 6
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 6
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 4
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 3
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical group SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000036449 good health Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 108700004027 tat Genes Proteins 0.000 description 2
- 101150098170 tat gene Proteins 0.000 description 2
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JJVXHDTWVIPRBZ-VKHMYHEASA-N (2r)-2-[carboxy(methyl)amino]-3-sulfanylpropanoic acid Chemical group OC(=O)N(C)[C@@H](CS)C(O)=O JJVXHDTWVIPRBZ-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- RDJLIBMVLWBMKX-UHFFFAOYSA-N 1-(3,4-dihydro-2h-chromen-2-ylmethyl)piperidine Chemical compound C1CC2=CC=CC=C2OC1CN1CCCCC1 RDJLIBMVLWBMKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CXBDYQVECUFKRK-UHFFFAOYSA-N 1-methoxybutane Chemical compound CCCCOC CXBDYQVECUFKRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124718 AIDS vaccine Drugs 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BYXHQQCXAJARLQ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ala Chemical group C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BYXHQQCXAJARLQ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N Ethane Chemical compound CC OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 229940033330 HIV vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- PNPYKQFJGRFYJE-GUBZILKMSA-N Lys-Ala-Glu Chemical group [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PNPYKQFJGRFYJE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 208000001388 Opportunistic Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 108010028263 bacteriophage T3 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- MIOPJNTWMNEORI-UHFFFAOYSA-N camphorsulfonic acid Chemical compound C1CC2(CS(O)(=O)=O)C(=O)CC1C2(C)C MIOPJNTWMNEORI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006743 cytoplasmic accumulation Effects 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 150000004662 dithiols Chemical class 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000000423 heterosexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009521 phase II clinical trial Methods 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012514 protein characterization Methods 0.000 description 1
- 108020001775 protein parts Proteins 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 208000010648 susceptibility to HIV infection Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 230000006648 viral gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
- C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
- C12N2740/16334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/974—Aids related test
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/975—Kit
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
1. Szczepionka anty-HIV-1, znamienna tym, ze zawiera co najmniej jedno bia lko TAT HIV-1, obejmuj a- ce pomi edzy 99 a 106 aminokwasów, zdolne do wi azania si e z celem nukleotydowym nazywanym TAR (region wra zliwy na transaktywacj e) zlokalizowanym na ko ncu 5' mRNA HIV-1 i niezdolny do transaktywacji LTR HIV-1, w kombinacji z farmaceutycznie dopuszczalnym no snikiem. 10. Sposób wytwarzania poliklonalnych przeciwcia l anty-TAT zdolnych do rozpoznawania kilku warian- tów TAT, znamienny tym, ze immunizuje si e zwierz eta za wyj atkiem cz lowieka poprzez wstrzykiwanie bia lka TAT odpowiadaj acego wariantowi Oyi w po laczeniu z adiuwantem odpowiedzi immunologicznej i oczyszcza si e specy- ficzne przeciwcia la zawarte w surowicy immunizowanych zwierz at. 12. Sposób wykrywania obecno sci bia lka TAT w próbce biologicznej, znamienny tym, ze kontaktuje si e próbk e biologiczn a z przeciwcia lami anty-TAT zdolnymi do tworzenia kompleksów antygen-przeciwcia lo z kilkoma wariantami TAT, uzyskanymi sposobem okre slonym w zastrz. 10 i stwierdza si e obecno sc kompleksów antygen- -przeciwcia lo. PL PL PL PL
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest szczepionka anty-HIV-1, sposób wytwarzania poliklonalnych przeciwciał anty-TAT, sposób wykrywania obecności białka TAT w próbce biologicznej, zestaw do diagnozowania zakażenia HIV i sposób wytwarzania wariantu TAT.
Zgodnie z wynalazkiem wykorzystano białko regulacyjne ludzkiego wirusa nabytego braku odporności (HIV), białko Tat, jako szczepionkę przeciwko temu wirusowi, jak również do wykrywania tego białka u osób zakażonych HIV.
Tat jest białkiem wirusowym o zasadniczym znaczeniu dla ekspresji genów wirusowych i replikacji wirusa HIV-1. Gen Tat składa się z dwóch egzonów, kodujących białko o długości od 99 do 106 reszt w zależności od izolatów. Aktywność Tat w postaciach o 86 resztach, po delecji części od strony C-końcowej, została już jednak opisana. Te pochodne Tat o 86 resztach uważa się za artefakty laboratoryjne lub dawne formy, nie istniejące już w stanie naturalnym. Białko to umożliwia aktywację genów HIV-1 dzięki przyłączaniu się do celu nukleotydowego, zwanego TAR, umiejscowionego na końcu 5' mRNA HIV-1. Wydzielane jest przez komórki zakażone HIV i jest niezbędne do skutecznej odwrotnej transkrypcji HIV-1. Po wyjściu na zewnątrz komórki białko to jest zdolne do aktywowania odległych komórek zakażonych i do spowodowania zaburzeń odporności w niezakażonych limfocytach T. Ponadto bierze ono bezpośredni udział w procesach patologicznych związanych z AIDS, takich jak mięsak Kaposiego.
Pomimo że, opracowanie szczepionki przeciwko AIDS jest bardzo oczekiwane na całym świecie, napotyka ono jednak na dwie zasadnicze trudności. Pierwsza z nich związana jest ze skrajną zmiennością białka otoczki GP120. Druga spowodowana jest tym, że przeciwciała anty-GP120 wydają się zaostrzać przebieg choroby u pewnych chorych z AIDS. Jednakże wyniki wstępne wskazują, że możliwe byłoby uzyskanie działania ochronnego poprzez zastosowanie przeciwciał anty-GP120 u osób uprzednio nie zakaż onych. Firma Roche rozpoczęła badania kliniczne fazy II w Stanach Zjednoczonych szczepionki anty-GP120. Grupy chorych dobrane do tych badań fazy II są ściśle kontrolowane pod względem lekarskim. Trudno będzie jednak uzyskać taki sam nadzór lekarski po wprowadzeniu szczepionki na rynek.
Przy zastosowaniu GP120 we krwi chorych zakażonych HIV-1 wykrywa się Tat. Tat coraz silniej blokuje czynność makrofagów i limfocytów T cytotoksycznych (CTL) mających za zadanie usuwanie komórek zakażonych przez wirus, działa zatem immunosupresyjnie. Przeciwciała przeciwko Tat (lub związki czynne ukierunkowane na Tat) powinny umożliwić przywrócenie aktywności CTL i makrofagów.
Tat jest zatem uprzywilejowanym miejscem docelowym zarówno do wytwarzania środków przeciwwirusowych, jak i do wytwarzania szczepionek.
Białko Tat było już zatem przedmiotem doświadczeń. W szczególności, badania przedkliniczne, uzyskane przy zastosowaniu rekombinacyjnego, nieczynnego biologicznie białka Tat (toksoidu Tat) wykazały, że toksoid Tat powoduje u chorych seronegatywnych długotrwałe wytwarzanie dużych ilości przeciwciał przeciwko Tat (Le Buanec i wsp., 1998). U chorych seropozytywnych i z zaburzeniami odporności stwierdza się znamienne podwyższenie poziomu przeciwciał anty-Tat w stosunku do prawidłowego poziomu przeciwciał anty-Tat (Westendorp i wsp., 1995).
Ten toksoid Tat jest białkiem rekombinacyjnym, któremu nieaktywność biologiczną nadaje karboksymetylacja reszt cysteinowych Tat. Autorom udało się wytworzyć również Tat karboksymetylowane (Tat Bru cmC), zaobserwowali także utratę, aktywności transaktywacji, podczas gdy ten sam wariant Tat z wolnymi resztami cysteinowymi (Tat Bru fC) jest zdolny do transaktywacji. Tat Bru cmC jest zdolny do umocowywania się na TAR z powinowactwem porównywalnym z Tat Bru fC.
Główną przeszkodą w powszechnym wykorzystaniu karboksymetylowego Tat jako szczepionki jest to, że chemiczna modyfikacja reszt cysteinowych powoduje zmiany konformacji, które twórcy wynalazku zaobserwowali poprzez dichroizm kołowy i NMR. Jakkolwiek istnieją zmiany konformacji między różnymi wariantami Tat, karboksymetylacja reszt cysteinowych powoduje istotne zmiany w pofałdowaniu łańcucha peptydowego Tat, który, z tego powodu nie nadaje się do wytwarzania szczepionki przeciwko Tat.
W związku z tym zalecane jest stosowanie do wytwarzania szczepionki przeciwko HIV-1 defektywnego białka Tat HIV-1, jednak o strukturze podobnej do Tat funkcjonalnych. To Tat mogłoby w istocie mieć strukturę trójwymiarową najbardziej zbliżoną do naturalnych Tat, tak aby było zdolne do powodowania reakcji immunologicznej podobnej do reakcji wywoływanej przez Tat naturalne, nie byłoby jednak zdolne do transaktywacji, to znaczy, jak to wskazano uprzednio, byłoby niezdolne do aktywowaPL 197 666 B1 nia odległych komórek zakażonych i wywoływania niedoboru odporności niezakażonych limfocytów T. Istotnie, zahamowanie tego niedoboru odporności ma znaczenie kluczowe.
Przedmiotem wynalazku jest szczepionka anty-HIV-1, charakteryzująca się tym, że zawiera co najmniej jedno białko TAT HIV-1, obejmujące pomiędzy 99 a 106 aminokwasów, zdolne do wiązania się z celem nukleotydowym nazywanym TAR (region wrażliwy na transaktywację) zlokalizowanym na końcu 5' mRNA HIV-1 i niezdolny do transaktywacji LTR HIV-1, w kombinacji z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
Korzystnie sekwencja nukleotydowa białka TAT zawiera co najmniej jedną mutację w porównaniu z sekwencją nukleotydową funkcjonalnego białka TAT, które zdolne jest do wiązania się z TAR i transaktywacji LTR HIV-1.
Korzystniej mutacja dotyczy co najmniej jednej z cystein białka TAT.
Korzystnie białko TAT stanowi białko TAT wariantu Oyi HIV-1.
Korzystnie białko TAT stanowi syntetyczne białko TAT.
Korzystniej białko TAT stanowi białko TAT wytworzone drogą syntezy na fazie stałej.
Korzystnie białko TAT stanowi rekombinowane białko TAT.
Korzystnie zawiera wektor ekspresyjny obejmujący sekwencję nukleotydową dla TAT oraz elementy niezbędne do jej ekspresji.
Korzystnie region Arg-Gly-Asp zlokalizowany na końcu C białka TAT jest zmodyfikowany.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania poliklonalnych przeciwciał anty-TAT zdolnych do rozpoznawania kilku wariantów TAT, polegający na tym, że immunizuje się zwierzęta za wyjątkiem człowieka poprzez wstrzykiwanie białka TAT odpowiadającego wariantowi Oyi w połączeniu z adiuwantem odpowiedzi immunologicznej i oczyszcza się specyficzne przeciwciała zawarte w surowicy immunizowanych zwierząt.
Korzystnie jako białko TAT do immunizacji stosuje się syntetyczne białko TAT.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób wykrywania obecności białka TAT w próbce biologicznej, polegający na tym, że kontaktuje się próbkę biologiczną z przeciwciałami anty-TAT zdolnymi do tworzenia kompleksów antygen-przeciwciało z kilkoma wariantami TAT, uzyskanymi sposobem określonym powyżej i stwierdza się obecność kompleksów antygen-przeciwciało.
Przedmiotem wynalazku jest także zestaw do diagnozowania zakażenia HIV przez oznaczanie obecności białka TAT w próbce biologicznej, charakteryzujący się tym, że obejmuje odczynniki do wytwarzania odpowiedniego środowiska do reakcji immunologicznej obejmującej przeciwciała poliklonalne wytworzone sposobem powyżej; odczynniki pozwalające na detekcję kompleksów antygen-przeciwciało wytworzonych podczas reakcji immunologicznej; ewentualnie referencyjną próbkę biologiczną bez antygenu (kontrola negatywna); ewentualnie referencyjną próbkę biologiczną z określoną ilością antygenu (kontrola pozytywna).
Korzystnie odczynniki do wytwarzania odpowiedniego środowiska do reakcji immunologicznej obejmują przeciwciała określone powyżej.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania wariantu TAT określonego powyżej, polegający na tym, że stosuje się grupy zabezpieczające typu FMOC, korzystnie typu fastFMOC.
Szczepionka anty-HIV-1 według wynalazku zawiera co najmniej jedno białko Tat HIV-1, zdolne do wiązania się z TAR i niezdolne do transaktywacji, wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, lub ewentualnie z jednym lub kilkoma adiuwantami immunologicznymi. To białko Tat powinno być zdolne do wywołania u zwierzęcia, któremu je podano, wytwarzania przeciwciał zdolnych do rozpoznawania innych wariantów tego białka w ilości wystarczającej do zahamowania transaktywacji tych wariantów.
Do wytwarzania szczepionki według wynalazku można wykorzystywać białko Tat, albo jego jedną lub kilka części białka, zdolne do spełniania wskazanych funkcji białka Tat. Powyższa szczepionka może również zawierać połączenie różnych białek Tat lub też części różnych białek Tat.
W zalecanym wykonaniu biał ko Tat stosuje się w całoś ci, i zawiera ono dogodnie od 99 do 106 aminokwasów, dogodniej, 101 aminokwasów.
Pojęcie „część białka Tat” w rozumieniu niniejszego opisu oznacza każdy fragment lub połączenie fragmentów jednego lub kilku białek Tat, należących, lub nie, do tego samego wariantu, dostatecznie immunogennych do spowodowania wytwarzania przeciwciał. Dogodnie, fragment ten zawiera 15 - 30 aminokwasów, zwłaszcza, od 18 do 25 aminokwasów.
Białko Tat do zastosowania w szczepionce według wynalazku powinno zatem różnić się od funkcjonalnych białek Tat, zwanych „naturalnymi”, to znaczy wyciągów z różnych szczepów HIV-1, obecnych w stanie naturalnym, w taki sposób, że jest niezdolne do transaktywacji, przy czym jednocześnie
PL 197 666 B1 wiąże się z TAR. Dlatego też Tat stosowane w szczepionce według wynalazku mają sekwencję nukleotydową z co najmniej jedną mutacją w stosunku do sekwencji nukleotydowej Tat funkcjonalnego. Mutacja ta, zwykle punktowa, może na przykład powodować delecje, insercje lub substytucje jednego lub kilku aminokwasów.
Twórcy wynalazku w ramach swych prac zbadali najpierw wariant Tat, odpowiadający izolatowi Bru (86 reszt), po czym zsyntetyzowali pięć innych wariantów, reprezentujących zmienność strukturalną, obserwowaną w przypadku tego białka (Gregoire i Loret, 1996): Tat Z2 (86 reszt), Tat Mal (87 reszt), Tat Eli (99 reszt), Tat Oyi (101 reszt) i Tat Jr (101 reszt). W ten sposób ustalono 6 grup strukturalnych, w zależności od wielkości białka i rodzaju mutacji, spośród wszystkich izolatów HIV-1. Prawdopodobnie wszystkie te warianty mają aktywność farmakologiczną podobną do Tat Bru, które zsyntetyzowano dwukrotnie, z karboksymetylowymi resztami cysteinowymi (Tat Bru cmC) i następnie z wolnymi resztami cysteinowymi (Tat Bru fC). Zastosowano procesy chemiczne typu fastFmoc z aktywatorem HBTU. Oczyszczenia białek dokonano przez wysokosprawną chromatografię cieczową. Okazało się, że wszystkie te białka syntetyczne są zdolne do wiązania się z TAR, stwierdzono jednak znaczne różnice w wynikach badania transaktywacji na komórce HeLa. Najbardziej nieoczekiwanym wynikiem było to, że nie stwierdzano transaktywacji przy wariancie Tat Oyi. Nie obserwowano też transaktywacji w przypadku pochodnej Tat Bru, zawierającej karboksymetylowane reszty cysteinowe. Badanie techniką dichroizmu kołowego (CD) w fazie wodnej tych białek syntetycznych wykazało, że modyfikacja chemiczna Tat Bru cmC istotnie zmieniła strukturę Tat Bru. Tat Oyi, przeciwnie, ma strukturę podobną do innych, o czym świadczy jego widmo CD.
W 1988 u chorej z Gabonu (dokładniej, u kobiety ciężarnej) zidentyfikowano szczep HIV-1 Oyi (Huet i wsp., 1989). Chora ta, mimo że seropozytywna od kilku lat, cieszyła się doskonałym zdrowiem. Najwyraźniej fakt posiadania defektywnego białka Tat w tym szczepie HIV-1 zapobiegł rozwojowi zakażenia w kierunku AIDS u tej chorej i nadał jej odporność przeciwko wirusowi powodującemu AIDS. Istotnie, badania epidemiologiczne, przeprowadzone w terenie, wykazały, że u chorych zakażonych HIV-1 Oyi przez długi czas nie dochodzi do rozwoju choroby.
Szczep HIV Oyi należy do podtypu B i odpowiada szczepom HIV-1 najbardziej rozpowszechnionym w Europie i Ameryce Północnej. Kobieta z Gabonu, u której wykryto szczep HIV Oyi, należała do grupy 31 osób w rolniczej prowincji Haut Ogooue na południowym wschodzie Gabonu, u których go wykryto. Grupę te zidentyfikowano w 1986 r. W trakcie analizy seroepidemiologicznej, przeprowadzonej u około 2000 zakażonych osób w całym Gabonie. Ta grupa z Haut Ogooue przyciągnęła uwagę, ponieważ stan zdrowia osób zakażonych był dobry, a ich profil Western blot był zupełnie nietypowy. Nie można było mianowicie wykryć u tych osób obecności przeciwciał przeciwko gp 120, gp 160 i gp 41, stwierdzono natomiast obecność przeciwciał anty gag i pol (Huet i wsp., 1989).
Następnie przeprowadzono badania na grupie 750 kobiet ciężarnych, pochodzących z tej samej prowincji Haut Ogooue, stwierdzając, że 25 z nich (czyli 3,3%) było HIV-dodatnich w teście ELISA. Spośród tych 25 kobiet u 23 profil Western blot był atypowy, charakterystyczny dla tego regionu (zob. niżej). Około dziesięciu kobiet obserwowano przez 2 lata, w tym kobiety, u których wykrywano szczep HIV-1 Oyi. W tym czasie atypowy profil serologiczny pozostawał stały z wyłączeniem możliwości niedawnego zakażenia, nie pozostawiającego czasu na wytworzenie przeciwciał anty-gp 120. Obecność zakażenia HIV-2 była wykluczona, ponieważ nie stwierdzano reakcji na gag HIV-2, i w Gabonie odnotowano jedynie dwa przypadki zakażenia HIV-2, w regionie nadmorskim. Wszyscy obserwowani chorzy pozostawali w dobrym zdrowiu, bez ubytku masy ciała, i nie występowały u nich zakażenia oportunistyczne przez 2 lata trwania badania (Huet i wsp., 1989).
Kobieta, u której stwierdzono Oyi, pochodziła z regionu wiejskiego, była w dobrym stanie zdrowia i była seronegatywna w odniesieniu do HTLV-1 i HIV-2. Jednoczesna hodowla limfocytów z PPMC pozwoliła wykryć aktywność RT zaledwie po 15 dniach, co jest bardzo nietypowe. Wirus wykazywał również niemal niewykrywalną aktywność cytopatyczną. Jakkolwiek nadsącz hodowli umożliwiał zakażenie PBMC, replikacja nie była praktycznie możliwa na prawidłowych liniach limfocytarnych, takich jak H-9 i CEM, ani na monocytach U-937. Przy potwierdzaniu tej analizy podobne wyniki obserwowano u 17 chorych z tego samego regionu, co potwierdza nieobecność przeciwciał anty-gp 120 we wszystkich przypadkach. Ciekawe było stwierdzenie, że prawidłowa surowica dawcy HIV-1 jest zdolna do rozpoznawania gp 120 HIV-1 Oyi (Huet i wsp., 1989). Wirus HIV-1 Oyi poddano zatem klonowaniu i sekwencjonowanie nie ujawniło żadnych nieprawidłowości z wyjątkiem genu Tat (Huet i wsp., 1989).
Przyczyną utraty zdolności do transaktywacji wydaje się mutacja Cys 22 do Ser; odwrócenie tej mutacji wydaje się odtwarzać aktywność Tat.
PL 197 666 B1
Stwierdzono ponadto, że w nieobecności Tat reprodukcja wirusa jest możliwa, lecz na niskim poziomie. Istnieje zatem ścisły związek między zjadliwością HIV a skutecznością transaktywacji Tat. To badanie epidemiologiczne wykazuje raz jeszcze istnienie ścisłego związku między umieralnością na tę chorobę a poziomem replikacji HIV. Tat umożliwia zatem HIV, jak się wydaje, osiągniecie poziomu replikacji przekształcającego to zakażenie wirusowe w śmiertelną chorobę.
Ponadto to badanie nietypowych chorych z regionu Haut Ogooue ujawniło działanie ochronne, jakie wydają się zapewniać defektywne szczepy HIV w stosunku do zwykłych szczepów HIV. Istotnie, analizy PGR limfocytów świeżo pobranych od kilku nietypowych chorych ujawniły obecność zwykłych szczepów HIV. Mechanizm działania ochronnego nie obejmuje udziału przeciwciał anty gp 120, nieobecnych u tych chorych. Działanie limfocytów T cytotoksycznych mogłoby stanowić mechanizm umożliwiający wykorzenienie wirusa.
Badanie epidemiologiczne, względnie niedawno przeprowadzone w Gabonie (Delaporte i wsp., 1996) wykazało niewielki odsetek osób zakażonych HIV (2 - 3%) w porównaniu z innymi krajami afrykańskimi. Wydaje się, że podtyp Oyi całkowicie zanikł w populacji, a kobieta gabońska, u której wykryto szczep HIV-1 Oyi pozostawała w 1995 r. w doskonałym zdrowiu i od czasu pierwszego badania urodziła troje seronegatywnych dzieci. Nie wykrywano już u niej wirusa HIV-1 Oyi.
Białko Tat wariantu HIV-1 Oyi wydaje się zatem najlepiej nadawać na składnik szczepionki przeciwko HIV-1. Jednakże nieaktywne Tat nie zawsze jest immunogenne. Cała trudność w wytworzeniu szczepionki polega na spowodowaniu wytwarzania przeciwciał, w danym przypadku, przeciwciał czynnych także w stosunku do innych wariantów Tat. Twórcom wynalazku udało się nieoczekiwanie tego dokonać. Szczepionka według wynalazku może zawierać zatem, w zalecanym wykonaniu, Tat, w całości lub w części, wariantu HIV-1 Oyi.
Szczepionka przeciwko Tat jest dogodna pod kilkoma względami. U chorych bezobjawowych można opóźnić postęp w kierunku AIDS, zmniejszając niedobory odporności. Taka szczepionka powinna umożliwić choremu zachowanie skutecznej odporności przeciw wirusowi, tak jak (prawdopodobnie) na początku zakażenia. W szczególności odtworzenie aktywności limfocytów T cytotoksycznych (CTL) i makrofagów, które nie są zakażone HIV, lecz których aktywność jest zahamowana przez Tat, mogłoby w konsekwencji spowodować brak postępu choroby.
U chorych z rozwiniętym AIDS szczepionka przeciwko Tat mogłaby zmniejszyć częstość występowania pewnych chorób i zaburzeń, takich jak mięsak Kaposiego lub zespoły neurologiczne, które wydają się mieć związek z bezpośrednim działaniem białka Tat po ich wydzieleniu przez komórki zakażone HIV.
Możliwość dogodnego zastosowania wariantu HIV-1 Oyi zgodnie z wynalazkiem została ponadto potwierdzona doświadczeniami Western blot (zdjęcia żelu nie zostały dołączone do niniejszego opisu) i testem ELISA, przeprowadzonymi przez twórców wynalazku w celu stwierdzenia, czy istnieje reaktywność krzyżowa między różnymi wariantami Tat.
Istotnie, w tych dwóch typach doświadczeń badano reakcje trzech różnych surowic przeciwko Tat na siedem wariantów Tat.
Twórcy wynalazku uodpornili króliki Tat Oyi, Tat Bru cmC i Tat Eli według klasycznego sposobu immunizacji z zastosowaniem adiuwanta Freunda. Surowice poliklonalne, uzyskane po 53 dniach, analizowano techniką Western blot i testem ELISA. Otrzymano miana, odpowiednio, 700, 11 i 660 pM dla przeciwciał anty-Oyi, Bru cmC i Eli.
W warunkach denaturujących doświadczenia Western blot wykazały, że surowica anty-Tat Oyi i surowica anty-Tat Eli są niezdolne do wykazania immunogenności krzyżowej z wszystkimi wariantami, jak surowica anty-Tat Bru cmC.
Tat Bru cmC jest wariantem, w którym reszty cysteinowe są karboksymetylowane. Ta chemiczna modyfikacja reszt cysteinowych powoduje nie tylko utratę aktywności transaktywacji (Peloponese i wsp., 1999), lecz również utratę struktury trójwymiarowej tego wariantu, przekształ cają cego się w kłębek statystyczny (wynik niepublikowany). Nie jest zatem dziwne, że stwierdzono, iż surowica anty-Tat Bru cmC jest zdolna do rozpoznawania wszystkich wariantów w stanie denaturacji.
W warunkach niedenaturują cych test ELISA (fig. 7) wykazuje, ż e surowica anty-Tat Oyi jest zdolna do rozpoznawania wszystkich wariantów podobnie, jak surowica anty-Tat Bru cmC. Przeciwnie, surowica anty-Tat Eli jest zawsze niezdolna do rozpoznawania wszystkich wariantów. Wydaje się zatem, że istnieją epitopy trójwymiarowe, zachowane w licznych wariantach Tat. Jednakże jedynie szczególny charakter immunogenny Tat Oyi pozwala wytwarzać te przeciwciała w dużej ilości. Istnieje zatem duże prawdopodobieństwo, że aż do tej pory obecność Tat u chorych była niedoszacowana.
PL 197 666 B1
Rozcieńczenie trzech surowic wynosiło 1/1000. W tym samym doświadczeniu, bez rozcieńczenia, surowica anty-Tat Eli może również rozpoznawać wszystkie inne warianty Tat. Co ciekawe, stwierdzono, że acetylacja reszty lizynowej 50 Tat Bru (Tat Bru K50) umożliwia rozpoznawanie przez surowicę anty-Tat Eli w niskim stężeniu.
Te doświadczenia, przeprowadzone z trzema surowicami poliklonalnymi na królikach, potwierdzają zatem korzystne cechy Tat Oyi w roli szczepionki. Ponadto surowica anty-Tat Oyi jest zdolna do hamowania transaktywacji na komórkach HeLa z Tat Bru lub Tat Eli. Surowica anty-Tat Eli, stosowana jako kontrola, wykazała, że wytwarzanie przeciwciał z jednego wariantu, nawet aktywnego, nie gwarantuje rozpoznawania krzyżowego wszystkich wariantów Tat, jak w przypadku Tat Oyi. Tat Oyi, który jest wariantem o dużej długości (101 reszt), umożliwia lepsze rozpoznawanie wariantów Tat w porównaniu z Tat Bru cmC, który jest wariantem o małej długości (86 reszt). Szczepy HIV-1 z wariantami Tat o małej długości praktycznie zanikły i wydaje się, że stanowiły artefakt laboratoryjny (Jeang i wsp., 1999). Ponadto surowica anty-Tat Oyi wykazuje dużą swoistość, ponieważ nie rozpoznaje postaci zdenaturowanych (czyli epitopów liniowych) wariantów Tat. Przeciwnie, nie do pominięcia jest ryzyko, że surowica anty-Tat Bru cmC spowoduje wytwarzanie przeciwciał autoimmunologicznych u człowieka, z uwagi na dużą różnorodność strukturalną Tat Bru cmC. Twórcy wynalazku istotnie zaobserwowali, że w surowicy anty-Tat Bru cmC znajdują się przeciwciała zdolne do rozpoznawania albuminy ludzkiej (dane nie ukazane).
Zachowanie trójwymiarowej struktury co najmniej jednego epitopu Tat ma zatem zasadnicze znaczenie dla rozpoznawania innych wariantów Tat przez trójwymiarowe przeciwciała anty-Tat.
Twórcy wynalazku wykazali zresztą również, że przeciwciała anty-Tat są zdolne do hamowania transaktywacji białek Tat Eli.
Zgodnie z wynalazkiem opracowano również sposób wytwarzania poliklonalnych przeciwciał anty-Tat, zdolnych do rozpoznawania kilku wariantów Tat. Należy podkreślić, że przeciwciała te można zatem stosować do wykrywania u osób narażonych na zakażenie HIV obecności białka Tat we krwi, niezależnie od wariantu HIV.
Sposób wytwarzania poliklonalnych przeciwciał anty-Tat według wynalazku, zdolnych do rozpoznawania kilku wariantów Tat, może obejmować:
- immunizację zwierzęcia, za wyjątkiem człowieka, za pomocą białka Tat lub części tego białka Tat, w połączeniu z adiuwantem reakcji immunologicznej
- oczyszczenie swoistych przeciwciał, zawartych w surowicy immunizowanych zwierząt.
Immunizacji zwierzęcia można dokonać stosując dowolny sposób wprowadzenia białka Tat lub części tego białka Tat do organizmu zwierzęcia, na przykład: wstrzyknięcie, inhalacje, podanie doustne, podanie podskórne, śródskórne, dootrzewnowe, dożylne lub domięśniowe.
Immunizację zwierzęcia można również przeprowadzić za pomocą ekspresji in vivo i in situ wektora zawierającego nie tylko sekwencję białka Tat w całości lub w części, lecz również cały system niezbędny do ekspresji białka Tat, sposobami znanymi specjalistom.
Oczyszczenie swoistych przeciwciał, znajdujących się w surowicy immunizowanych zwierząt, można na przykład przeprowadzić na kolumnie powinowactwa, na której uprzednio osadza się białko lub część białka, stanowiącego antygen.
W zalecanym wykonaniu białko Tat lub cześć białka Tat, stosowane w etapie immunizacji według powyższego sposobu, może odpowiadać wariantowi Oyi lub wariantowi Bru cmC.
W innym wykonaniu powyższe białko stanowi białko syntetyzowane chemicznie.
Pozycja siedmiu reszt cysteinowych (region 22-37) wykazuje dużą zachowawczość wśród wszystkich wariantów Tat, a znaczenie 6 z tych reszt cysteinowych dla transaktywacji szeroko opisano w piśmiennictwie (Jeang, 1996).
W związku z tym można przewidywać mutacje wariantu Tat na co najmniej jednej z tych reszt cysteinowych, tak aby wariant stał się niezdolny do transaktywacji, zachowując dogodne właściwości według wynalazku. Mutacja ta może na przykład obejmować substytucje reszty cysteinowej inną resztę aminokwasową, taką jak seryna lub alanina.
Twórcy wynalazku, poprzez oznaczenie struktury trzeciorzędowej Tat Bru w heteronuklearnym NMR, zidentyfikowali ponadto region docelowy, który musi być zachowany w wariantach Tat. Cel ten tworzy się częściowo z regionu N-końcowego i regionu zasadowego sekwencji Tat.
Struktura trójwymiarowa wariantu Tat Bru wykazuje, że region bogaty w reszty cysteinowe jest bliski przestrzeni trójwymiarowej regionu N-końcowego i regionu zasadowego. Wskazuje to, że karboksymetylacja reszt cysteinowych zmienia prawdopodobnie strukturę tego celu i potwierdza to,
PL 197 666 B1 że tak zmodyfikowanego Tat nie można uważać za białko potencjalnie nadające się do wytwarzania szczepionki anty-HIV.
Twórcy wynalazku przeprowadzili ponadto syntezę chemiczną w fazie stałej różnych białek Tat. Według obecnego stanu wiedzy to wykonanie jest zalecane z uwagi na zmniejszenie kosztów produkcji, lepszą wydajność w stosunku do Tat wytwarzanego metodami biologii molekularnej i brak zanieczyszczeń.
I tak, według zalecanego wykonania, Tat do zastosowania do wytwarzania szczepionek, wytwarza się sposobem według wynalazku poprzez syntezę chemiczną, dokładniej, poprzez syntezę chemiczną w fazie stałej, na przykład syntezę typu FMOC, korzystnie, FastFMOC.
Jednakże Tat stosowany do wytwarzania szczepionki według niniejszego wynalazku można również wytwarzać zupełnie innym sposobem, na przykład z zastosowaniem technik rekombinacyjnych, znanych specjalistom. Te systemy klonowania i ekspresji mogą obejmować zastosowanie drobnoustrojów, takich jak Escherichia coli, Bacillus, Streptomyces i Saccharomyces, lecz również komórek drożdży, owadów i ssaków. Przewiduje się również systemy ekspresji pochodzące z bakulowirusa. Oczywiście, wektory zawierające sekwencję białkową Tat w całości lub części mogą zawierać cały niezbędny do tego system ekspresji, zgodnie z wiedzą specjalistów.
Ponadto w celu uniknięcia potencjalnego ryzyka toksycznego wpływu pasażu białka Tat, zwłaszcza Tat Oyi, na błony, korzystna jest modyfikacja sekwencji Arg-Gly-Asp, obecnej na końcu C sekwencji wszystkich wariantów Tat. Sekwencja ta ma w istocie zasadnicze znaczenie dla przechodzenia przez błony komórkowe, ponieważ rozpoznaje ona receptor błonowy na powierzchni komórek (Jeang, 1996). Bardziej szczegółowo, modyfikacja ta mogłaby obejmować substytucje tej sekwencji przez sekwencje Lys-Ala-Glu, co nie miałoby wpływu na strukturę, lub ewentualnie przez sekwencję Ala-Ala-Ala.
Jak to wspomniano powyżej, bardzo możliwe jest, że dotąd niedoszacowywano liczbę osób zakażonych HIV, ponieważ nie było możliwości wykrycia u nich, na przykład we krwi, obecności białka Tat. Zgodnie z wynalazkiem zapewniono sposoby wykrywania jak największej liczby wariantów Tat za pomocą ograniczonej liczby przeciwciał.
Sposób wykrywania obecności białka Tat lub części białka Tat w próbce biologicznej według wynalazku może obejmować:
- kontaktowanie tej próbki z przeciwciałami anty-Tat zdolnymi do utworzenia kompleksów antygen-przeciwciało z kilkoma wariantami Tat
- oznaczanie obecności kompleksów antygen-przeciwciało.
Pojęcie „przeciwciała anty-Tat” obejmuje nie tylko całe przeciwciała, lecz również fragmenty przeciwciał lub przeciwciała chimeryczne, zdolne do spełniania zalecanej tu funkcji, to znaczy do rozpoznawania całości lub części białka Tat.
Oznaczania obecności kompleksów antygen-przeciwciało dokonuje się sposobami znanymi specjalistom. W szczególności, odczynniki umożliwiające wykrywanie tych kompleksów mogą zawierać marker lub też mogą być rozpoznawanie przez znakowany marker, szczególnie w przypadku, gdy stosowane przeciwciało nie jest znakowane.
Kontaktowania próbki biologicznej w sposobie według wynalazku z przeciwciałami anty-Tat można również dokonać z użyciem surowicy anty-Tat.
Pojęcie „próbka biologiczna” oznacza każdą próbkę płynu ustrojowego, komórek lub tkanek, pobraną od pacjenta, która może zawierać antygen zdolny do tworzenia kompleksu antygen-przeciwciało w obecności jednego lub więcej odpowiednich przeciwciał. Zalecaną próbką biologiczną jest krew.
Zestaw do rozpoznawania zakażenia HIV poprzez oznaczenie obecności białka Tat według wynalazku lub części białka Tat w próbce biologicznej, może obejmować:
- odczynniki do wytwarzania środowiska sprzyjającego reakcji immunologicznej,
- odczynniki umożliwiające wykrywanie kompleksów antygen-przeciwciało, wytworzonych w wyniku reakcji immunologicznej,
- ewentualnie, referencyjną próbkę biologiczną bez antygenu (kontrola ujemna),
- ewentualnie, referencyjną próbkę biologiczną, zawierającą z góry określoną ilość antygenu (kontrola dodatnia).
W jednym wykonaniu odczynniki do wytwarzania środowiska sprzyjającego reakcji immunologicznej mogą obejmować przeciwciała anty-Tat zdolne do wytworzenia kompleksów antygen-przeciwciało z kilkoma wariantami Tat, takie jak przykładowo anty-Tat Oyi, anty-Tat Bru cmM lub połączenie obu tych przeciwcia ł..
PL 197 666 B1
R y s u n e k
Figura 1: porównanie różnych białek Tat.
Białka Tat podzielono na 6 grup strukturalnych, wytłuszczonych na fig. 1A i podkreślonych na fig. 1B.
Figura 1A: sekwencje aminokwasowe białek Tat.
TatZ2 pochodzi z izolatu HIV-1, pokrewnego szczepom rodzicielskim wirusa (Zhu i wsp., 1998). Tat Mal i Tat Eli pochodzą ze szczepu HIV-1, izolowanego w latach 80. W Afryce Środkowej w trakcie badań nad zakażeniami heteroseksualnymi HIV (Alizon i wsp., 1986). Tat Br zawiera sekwencję najczęściej stosowaną w laboratorium i pochodzi ze szczepu izolowanego we Francji (Barre-Sinoussi i wsp., 1983), natomiast Tat Jr pochodzi z amerykań skiego izolatu HIV-1 (O'Brien i wsp., 1990). Tat Oyi jest blisko spokrewniony z Tat Jr i Tat Bru, pochodzi jednak ze szczepu HIV zidentyfikowanego od pacjenta z Gabonu (Huet i wsp., 1989).
Figura 1B: klasyfikacja białek Tat w zależności od ich wymiarów i mutacji, które zawierają, do programu MULTALIN (Corpet, 1989).
Figura 2: sekwencja białka Tat wariantu HIV-Oyi (opisanego przez Huet i wsp., 1989).
Figura 3: oczyszczanie 6 wariantów Tat w wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami z kolumną szczepioną C8 przy długości fali 280 nm (procedurę doświadczalną opisano w podrozdziale „Materiał i metody”).
W przypadku każ dej kratki ś lad dolny obrazuje wynik syntezy peptydowej przed oczyszczeniem, natomiast ślad górny obrazuje wynik syntezy po ostatnim etapie oczyszczania. Tat Bru (A), Tat Jr (B), Tat Z2 (C), Tat Oyi (D), Tat Mal (E) i Tat Eli (F) rozszczepiono z zastosowaniem żywicy z TFA. Po strąceniu eterem butylowo-metylowym białka rozpuszczono w buforze TFA w stężeniu 0,1% (ślad dolny na każdej z ramek). Dla każdego białka oczyszczenia dokonano z 2 migracjami HPLC kolejno na kolumnach Hybar Merk C8 (4,5 x 125 mm, przepływ 0,8 ml/min) półpreparacyjnych, po czym przeprowadzono analizę czystych frakcji (ślad górny na każdej ramce) i zidentyfikowano je poprzez spektrometrię masową i analizę aminokwasów (dane nieprzedstawione). W każdym przypadku okazało się, że główny szczyt HPLC odpowiada pełnej sekwencji. Szczyty między 10 a 15 min odpowiadają 50 resztom, natomiast szczyty bliskie frakcji głównej są pochodnymi z 1 - 15 delecjami od końca N. Frakcje wysoce hydrofobowe są pochodnymi o masie cząsteczkowej podwyższonej, prawdopodobnie ze względu na niecałkowite odłączenie grup zabezpieczających z łańcuchów bocznych.
Figura 4. Pomiar stałości powinowactwa syntetycznych Tat dla celu nukleotydowego TAR metodą elektroforezy (zob. testy zmiany ruchliwości elektroforetycznej w podrozdziale „Materiały i metody”).
Na szczycie każdego prążka żelu oznaczono stężenie białka (ng/μΐ). RNA wolne lub sprzężone oznaczono, odpowiednio, literami f („free” - wolne) i c („complexed” - sprzężone). Do oznaczania miana 6 białek stosuje się wytwarzanie tego samego RNA. Zbadano również pochodną Tat Bru z karboksymetylowanymi resztami cysteinowymi (Bru cmC). Stałe dysocjacji w stanie równowagi (Kd) zmierzono bezpośrednio z zastosowaniem testów zmiany ruchliwości elektroforetycznej. Wartości Kd zmieniają się z około 50 nM dla Tat Eli i Tat Mal do około 140 nM dla Tat Oyi i Tat Jr. Ponadto twórcy zauważyli, że poza zmiennością wartości Kd, profile wiązane z różnymi białkami są nieco różne. Na przykład słabe stężenie Tat Bru daje prosty kompleks o dobrej rezolucji, i dopiero przy wyższych stężeniach (>4,5 ng/μΐ) tworzą się agregaty, które nie są w stanie przenikać do żeli akrylamidowych. Przeciwnie, kompleksy multimerowe można łatwo identyfikować samym Tat Eli nawet w małym stężeniu. Można obserwować do 3 opóźnionych prążków przy zastosowaniu Tat Eli, w mniejszym stopniu przy zastosowaniu Tat Jr. Takich efektów nie obserwuje się przy zastosowaniu białek krótszych, takich jak Tat Bru i Tat Mal, na przykład, jak również Tat Oyi - białka o większej długości.
Figura 5: test transaktywacji syntetycznych białek Tat na komórce HeLa. Komórki te transfekuje się przez LTR HIV-1, z którym związany jest gen reporterowy LacZ. Ilość wytworzonego białka (β-gal jest proporcjonalna do zdolności transaktywacji i różnych syntetycznych Tat. LTR zawiera sekwencje DNA w kierunku końców 3' i 5', konieczne do transkrypcji HIV, a na początku mRNA obecny jest TAR (Clavel i Charneau, 1994). Kofaktory komórkowe, niezbędne do transaktywacji HIV, znajdują się w komórkach HeLa. Bez Tat dochodzi do podstawowej ekspresji (3-gal, zaznaczonej jako kontrola (C), Następny wykres ukazuje transaktywację, obserwowaną przy zastosowaniu różnych wariantów Tat, z zastosowaniem 2 stężeń: 1 μΜ (słupek jasnoszary) i 5 μΜ (słupek ciemnoszary). W każdym przypadku do buforu komórkowego dodano Tat, tak więc ekspresja β-gal wyższa od kontroli oznacza, że Tat syntetyczne jest zdolne do przechodzenia przez błony jądrowe i cytoplazmatyczne, do wiązanie się z Tar i do interakcji z kofaktorami komórkowymi. Jedynie Tat Bru cmC (dane nieprzedstawione) i Tat Oyi nie przebadano w tym doświadczeniu, podczas gdy łączą się one z TAR (fig. 1). Tat Mal i Tat Eli
PL 197 666 B1 przedstawiają poziom transaktywacji 3-4-krotnie wyższy, niż Tat Bru. Tat Z2, najbliższe z macierzystych białek Tat, wykazuje niski poziom transaktywacji i ewolucja mogłaby sprzyjać izolatom HIV-1 z bardziej skutecznym Tat. Podobne wyniki uzyskano w innych testach transfekcji z zastosowaniem lucyferazy, ponieważ gen reporterowy oraz Tat Mal i Tat Eli w stężeniu 1 μΜ transaktywowały LTR na poziomie porównywalnym z poziomem uzyskanym z zastosowaniem transfekowanego Tat-pCMV (dane nieprzedstawione).
W rozmaitych doświadczeniach stosowano stężenie od 0,1 μM do 10 μM (dane nieprzedstawione). W stężeniu 0,1 μM jedynie Tat Eli wykazuje poziom transaktywacji znamiennie wyższy od poziomu wyjściowego. W stężeniu 10 μM, 6 Tat wykazują poziom transaktywacji na tyle podwyższony, że nie można zaobserwować różnic między nimi w odniesieniu do nasycenia.
Figura 6: widma dichroizmu wariantów Tat Z2 (białe trójkąty), Tat Oyi (czarne trójkąty), Tat Bru (białe kółka), Tat Bru cmC (bez oznaczenia), Tat Jr (czarne kółka), Tat Mal (białe kwadraty) i Tat Eli (czarne kwadraty).
Widma mierzono w buforze fosforanowym w stężeniu 20 μM i pH 4,5, rejestrowano je przy długości fali od 260 do 178 nm przy drodze optycznej 50 μm. Różnice obserwowane w odniesieniu do widm CD ujawniają heterogenność struktury między wariantami Tat, niezależnie od ich wielkości. Nie można połączyć widm CD w 2 kategoriach, utworzonych przez Tat o małej długości (białe oznaczenia) i Tat o dużej długości (czarne oznaczenia). Widma CD cechują się obecnością prążka ujemnego bliskiego 200 nm, typowego dla struktur niezorganizowanych. Intensywna wielkość prążka 200 nm, obserwowana przy badaniu Tat Bru cmC, dowodzi, że modyfikacja reszt cysteinowych spowodowała znaczne zmiany konformacji w stosunku do innych Tat.
Figura 7: testy ELISA przeprowadzone z trzema rozcieńczeniami króliczych surowic poliklonalnych (anty-Tat Bru cmC, anty-Tat Oyi i anty-Tat Eli) i z 7 wariantami białka Tat w warunkach denaturujących.
Figura 8: hamowanie transaktywacji przez Tat Eli z surowicami anty-Tat Eli, anty-Tat Oyi i Tat Bru cmC.
Niniejszy wynalazek nie jest ograniczony do powyższego opisu. Jest on poniżej dokładniej objaśniony w przykładach, które mają na celu jedynie ilustrację wynalazku.
P r z y k ł a d y
1) Materiały i metody odpowiadające fig. 3A - 6
Synteza białka, oczyszczanie i charakterystyka
Peptydy połączono sposobem Barany i Merrifield (1980) na żywicy uprzednio naładowanej
4-hydroksymetylofenoksymetyloko-polistyrenem w stężeniu 1% (HMP) (0,5 - 0,65 mmol) (Perkin Elmer, Applied Biosystem Inc., Forster City, CA, Stany Zjednoczone). W celu uniknięcia uzyskania pochodnych z delecjami, końce N bez Fmoc zabezpieczono grupą acetylową po potraktowaniu mieszaniną, zawierająca 4,75% bezwodnego kwasu octowego (Merck), 6,25%: DIEA w stężeniu 2,0 M, 1,5% 1M 1-hydroksybenzotriazolu (HOBt) (Perkin Elmer, Applied Biosystem Inc., Warrington, Wielka Brytania) i 87, 5% N-metylopirolidonu (Perkin Elmer, Forster City, CA, Stany Zjednoczone). Każdy etap odłączania grup zabezpieczających kontrolowano aparatem do mierzenia przewodności. Od peptydów odłączono grupy zabezpieczające i usunięto je z żywicy z zastosowaniem kwasu trójfluorooctowego (TFA), uzupełnionego 10% siarczkiem metylofenylowym (Merck) i 5% etanem ditiolowym (Merck). Oczyszczenie przeprowadzono z zastosowaniem aparatu do wysokosprawnej chromatografii cieczowej dużej wydajności Beckmana (HPLC) i kolumny z odwróconymi fazami C8 Mercka (10 x 250 mm). Bufor A składał się z wody z 0,1%, TFA, natomiast bufor B składał się z acetonitrylu z 0,1% TFA. Gradient tworzył bufor B w stężeniu od 20 do 40% przez czas 40 min z przepływem 2 ml/min. Spektrometrię masową przez elektrowaporyzację przeprowadzono z zastosowaniem PE-SCIEX API 150ex prostego poczwórnego Perkin Elmer. Analizy aminokwasów przeprowadzono na analizatorze Beckmana, model 6300.
Testy zmiany ruchliwości elektroforetycznej
Wytworzono 59 nukleotydów RNA TAR, zawierających zasadnicze zgrupowanie pirymidynowe UUU, in vitro, poprzez transkrypcję z polimerazą RNA T3. Mieszaniny reakcyjne wiązania (20 μΓ) zawierały 0,2 nmol znakowanego radioaktywnie RNA TAR, 0 - 100 ng Tat w buforze TK (50 mM Tris pH 7,4, 20 mM KCl, 0,1% Triton X-100). Kompleksy oddzielono od RNA niezwiązanego w czasie elektroforezy na poliakrylamidowych żelach denaturujących w stężeniu 8%, zawierających 0,1% Triton Χ-100. Żel poddano migracji wstępnej w czasie 30 min przed nałożeniem próbki (25 μ^. Elektroforezę
PL 197 666 B1 prowadzono przez 90 min przy napięciu około 200 V. Względna ilość RNA wolnego i/lub związanego oznaczono przez obrazowanie fosforem.
Dichroizm kołowy (CD)
Widmo dichroizmu kołowego mierzono z zastosowaniem drogi optycznej 50 μm przy długości fali od 260 do 178 nm na spektrofotometrze CD UV Jobin-Yvon (Long-Jurneau, Francja) (Mark VI). Aparat kalibrowano kwasem (+) -10-kamforosulfonowym. Stwierdzono stosunek równy 2,1 między prążkiem CD dodatnim przy długości fali 290,5 nm a prążkiem ujemnym przy długości fali 192,5 nm. Dane zebrano w odstępie 0,5 nm przy analizie co 1 nm na minutę. Widma CD przedstawiono w postaci Δε na amid. Próbki wytwarzano w buforze fosforanowym w 20 mM (pH 4,5). Stężenie białka wynosiło od 0,5 do 1 mg/ml.
Transaktywacja komórek transfekowanych LTR HIV
Transaktywację czynnościową syntetycznym Tat oznaczono z zastosowaniem komórek P4. Te komórki CD4-HeLa zawierają bakteryjny gen lacZ pod kontrolą LTR HIV i gromadzenie w cytoplazmie (β-galaktozydazy ścisłe zależy od obecności Tat. 80% komórek o wzroście zlewnym, rozmieszczonych na płytce 12-zagłebieniowej, inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37°C w obecności CO2 w stężeniu 5%, przy czym białko Tat znajdowało się w pożywce DMEM uzupełnionej 0,1% BSA. Po tym okresie inkubacji komórki przepłukano roztworem soli fizjologicznej zbuforowanym fosforanem i białka ekstrahowano i analizowano pod kątem zawartości β-galaktozydazy dostępnym w handlu testem immunoabsorpcyjnym, z zastosowaniem enzymu związanego z antygenem (ELISA dla βgalaktozydazy, Boehringer Mannheim, Francja) zgodnie z zaleceniami producenta. Wartości znormalizowano, stosując całkowite stężenie białka z różnych lizatów komórkowych, jak to określono w metodzie Bradforda.
Hamowanie transaktywacji
Powtórzono powyższe doświadczenia transaktywacji z zastosowaniem komórek transfekowanych LTR HIV, tym razem z dodatkiem pożywki hodowlanej albo do surowicy anty-Tat Eli, albo do anty-Tat Oyi lub do anty-Tat Bru. Białko Tat pochodziło z wariantów Eli.
Twórcy wynalazku stwierdzili inaktywację transaktywacji przez przeciwciała anty-Tat Oyi białka Tat Eli w porównaniu zwłaszcza z pożywką kontrolną, nie zawierająca przeciwciał.
2) Materiały i metody odpowiadające fig. 7
Warunki immunizacji są następujące; wstrzyknięcie śródskórne 100 μg oczyszczonego białka Tat w 0,5 ml 100 mM buforu fosforanowego o pH 4,5 plus 0,5 ml pełnego adiuwanta Freunda (dzień 0). Pierwsze wstrzyknięcie przypominające przeprowadzono w dniu 21 w tych samych warunkach, jednak z dodatkiem niepełnego adiuwanta Freunda (0,5 ml). Drugie wstrzyknięcie przypominające przeprowadzono w dniu 42 w sposób identyczny, co w dniu 21. W dniu 53 pobrano krew do probówek FST i poprzez odwirowanie z prędkością 2000 obr./min uzyskano surowice. Rozcieńczenie surowic wynosiło 1:1000.
ELISA: test prowadzono na płytce Maxisorp U96 (Polylabo). Białka w buforze fosforanowym o pH 4,5 inkubowano na płytce przez noc w temperaturze 4°C. Po nasyceniu buforem MPBS (NaCl 8 g/l, KCl 0,2 g/l, Na2HPO4 1,44 g/l, KH2PO4 0,24 g/l, mleko odtłuszczone 5%, doprowadzone do pH 7,4 z zastosowaniem HCl), białka inkubowano z pierwszorzędowym przeciwciałem króliczym przez jedną godzinę. Następnie prowadzono inkubację z przeciwciałami kozimi, sprzężonymi z peroksydazą swoistą dla fragmentu Fc królika (Cappel) przez jedną godzinę. Wynik wywoływano w obecności H2O2, 100 mM kwasu cytrynowego, 50 mM NaOH i 0,2 mg/ml ABTS (Boehringer). Absorbancję odczytywano przy długości fali 405 nm.
Bez rozcieńczenia surowica anty-Tat Eli jest w stanie rozpoznawać wszystkie warianty i pochodne Tat.
3) Materiały i metody do prowadzenia reakcji Western blot
Western blot: białka najpierw poddawano denaturacji w obecności 3 M Tris-HCl, pH 8,8, 5% β-merkaptoetanolu, 2% SDS, 10% glicerolu i błękitu bromofenolowego. Rozdzielono je poprzez elektroforezę na 15 żelu poliakrylamidowym. Białka przeniesiono następnie na arkusze nitrocelulozowe w celu wywołania metodą immunodetekcji. Miejsca nieswoiste zablokowano roztworem PBS (NaCl 8 g/l, KCl 0,2 g/l, Na2HPO4 1,44 g/l, KH2PO4 0,24 g/l, doprowadzonym do pH 7,4 z zastosowaniem HCl), zawierającym 5% mleka odtłuszczonego. Arkusz nitrocelulozowy pozostawiono do inkubacji z pierwszorzędowym przeciwciałem króliczym na jedną godzinę. Następnie prowadzono inkubację z przeciwciałami kozimi, sprzężonymi z peroksydazą swoistą dla fragmentu Fc królika (Sigma). Wynik wywoływano w obecności H2O2, PBS i diaminobezamidyny (w opisie nie zamieszczono zdjęcia żelu).
PL 197 666 B1
4) Materiały i metody odpowiadające fig. 8
Mierzono transaktywacje z zastosowaniem ludzkich komórek HeLa, transfekowanyoh LTR HIV-1 i genem reporterowym białka β-galaktoydazy (lacZ) sposobem opisanym dla fig. 5.
Surowice uzyskano od królika sposobem opisanym dla fig. 7.
Do pożywki do hodowli komórek dodano 100 μl trzech surowic anty-Tat, a mianowicie anty-Tat Eli, anty-Tat Oyi i anty-Tat Bru cmC, w rosnącym rozcieńczeniu, i następnie 100 μl wariantu Tat Eli w stężeniu 1 - 5 μΜ. Gromadzenie się w cytoplazmie β-galaktozydazy zależy zatem od obecności Tat.
Na początku stwierdzono, że w stężeniu równoważnym najskuteczniejsza jest surowica anty-Tat Eli. Jest to logiczne, ponieważ surowica ta zawiera przeciwciała wytwarzane w reakcji na ten sam wariant, którego aktywność transaktywacji chcemy zneutralizować. Należy jednak podkreślić, że Tat Oyi jest zdolne do wytwarzania przeciwciał w znamiennym stopniu neutralizujących aktywność transaktywacji Tat Eli. Hamowanie to jest zresztą większe od hamowania obserwowanego zwłaszcza dla stężenia 1:10 przy zastosowaniu surowicy anty-Tat Bru cmC. Potwierdza to zalety przeciwciał anty-Tat Oyi względem innych wariantów Tat.
Piśmiennictwo
Alizon, M., Wain-Hobson, S., Montagnier, L., & Sonigo, P. (1986) Celi 46, 63-74
Barany, G. & Merrifield, R.B. (1980) w: Gross, E., & Meinhofer, J. (red.) The peptide: Analysis, Synthesis, Biology. Academic Press, New York, Vol. 2, str. 1-284
Barre-Sinoussi, F., Chermann, J.C., Rey, F., Nugeyre, M.T., Chamaret, S., Gruest, J., Dauguet, C., Axler-Blin, C, Vezinet-Brun, F., Rouzioux, C, Rozenbaum, W. & Montagnier, L. (1983) Science 220, 868-871
Clavel, F. & Charneau, P. (1994) J. Virol 68, 1179-1185
Corpet,. F. (1989) Nucl. Acid. Res. 22, 10881-10890.
Delaporte E., Janssens W., Peeters M., Buve A., Dibanga G., Perret J.L., Ditsambou V., Mba J.R., Courbot M.C., Georges A., Bourgeois A., Samb B., Henzel D., Heyndrickx L., Fransen K., van der Groen G., Larouze B. (1996) AIDS 8, 903-910
Gregoire, C. & Loret, E.P. 1996. J. Biol. Chem. 271,22641-22646
Huet, T., Dazza, M.C., Brun-Vezinet, F., Roelants, G.E. & Wain-Hobson, S. 1989. AIDS 3, 707-715
Jeang K.T. (1996) w: Los Alamos National Laboratory (red.) HIV-1Tat : Structure & Function. Human Retroviruses & AIDS compendium. III, str. 3-18
Jeang, K.T., Xiao, H., & Rich, E. A. (1999) J. Biol. Chem. 274, 28837-28840.
Le Buanec, H., Lachgar, A., Bizzini, B., Zagury, J.F., Rappaport, J., Santagostino, E., Muca-Perja, M. & Gringeri, A. 1998. Biomed. Pharmacother 10, 431-435
O'Brien, W.A., Koyanagi, Y., Namazie, A., Zhao, J.Q., Diagne, A., Idler, K., Zack, J. A. & Chen,
I. S. (1990) Nature 348, 69-73
Westendorp, M.O., Frank, R., Ochsenbauer, C, Stricker, K., Dnem, J., Walczak, H., Debatin,
K.M. & Krammer, P.H., 1995. Nature 375, 497-500
Zhu, T., Korber, B.T., Nahmias, A.J., Hooper, E., Sharp, P.M. & Ho, D.D. (1998) Nature 391, 594-597.
Claims (15)
1. Szczepionka anty-HIV-1, znamienna tym, że zawiera co najmniej jedno białko TAT HIV-1, obejmujące pomiędzy 99 a 106 aminokwasów, zdolne do wiązania się z celem nukleotydowym nazywanym TAR (region wrażliwy na transaktywację) zlokalizowanym na końcu 5' mRNA HIV-1 i niezdolny do transaktywacji LTR HIV-1, w kombinacji z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
2. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że sekwencja nukleotydowa białka TAT zawiera co najmniej jedną mutację w porównaniu z sekwencją nukleotydową funkcjonalnego białka TAT, które zdolne jest do wiązania się z TAR i transaktywacji LTR HIV-1.
3. Szczepionka według zastrz. 2, znamienna tym, że mutacja dotyczy co najmniej jednej z cystein białka TAT.
4. Szczepionka według zastrz. 1 - 3, znamienna tym, że białko TAT stanowi białko TAT wariantu Oyi HIV-1.
5. Szczepionka według zastrz. 1 - 4, znamienna tym, że białko TAT stanowi syntetyczne białko TAT wytworzone drogą syntezy chemicznej.
PL 197 666 B1
6. Szczepionka według zastrz. 5, znamienna tym, że białko TAT stanowi białko TAT wytworzone drogą syntezy na fazie stałej.
7. Szczepionka według dowolnego z zastrz. 1 - 4, znamienna tym, że białko TAT stanowi rekombinowane białko TAT.
8. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera wektor ekspresyjny obejmujący sekwencję nukleotydową dla TAT oraz elementy niezbędne do jej ekspresji.
9. Szczepionka według dowolnego z zastrz. 1 - 6, znamienna tym, że region Arg-Gly-Asp zlokalizowany na końcu C białka TAT jest zmodyfikowany.
10. Sposób wytwarzania poliklonalnych przeciwciał anty-TAT zdolnych do rozpoznawania kilku wariantów TAT, znamienny tym, że immunizuje się zwierzęta za wyjątkiem człowieka poprzez wstrzykiwanie białka TAT odpowiadającego wariantowi Oyi w połączeniu z adiuwantem odpowiedzi immunologicznej i oczyszcza się specyficzne przeciwciała zawarte w surowicy immunizowanych zwierząt.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że jako białko TAT do immunizacji stosuje się białko określone w zastrz. 6.
12. Sposób wykrywania obecności białka TAT w próbce biologicznej, znamienny tym, że kontaktuje się próbkę biologiczną z przeciwciałami anty-TAT zdolnymi do tworzenia kompleksów antygen-przeciwciało z kilkoma wariantami TAT, uzyskanymi sposobem określonym w zastrz. 10 i stwierdza się obecność kompleksów antygen-przeciwciało.
13. Zestaw do diagnozowania zakażenia HIV przez oznaczanie obecności białka TAT w próbce biologicznej, znamienny tym, że obejmuje odczynniki do wytwarzania odpowiedniego środowiska do reakcji immunologicznej obejmującej przeciwciała poliklonalne wytworzone sposobem określonym w zastrz. 10; odczynniki pozwalające na detekcję kompleksów antygen-przeciwciało wytworzonych podczas reakcji immunologicznej; ewentualnie referencyjną próbkę biologiczną bez antygenu (kontrola negatywna); ewentualnie referencyjną próbkę biologiczną z określoną ilością antygenu (kontrola pozytywna).
14. Zestaw według zastrz. 13, znamienny tym, że odczynniki do wytwarzania odpowiedniego środowiska do reakcji immunologicznej obejmują przeciwciała określone w zastrz. 13.
15. Sposób wytwarzania wariantu TAT określonego w dowolnym z zastrz. 1 - 4, 9 - 10, znamienny tym, że stosuje się grupy zabezpieczające typu FMOC, korzystnie typu fastFMOC.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR9904610A FR2792204B1 (fr) | 1999-04-13 | 1999-04-13 | Vaccin anti-vih-1 comprenant tout en partie de la proteine tat de vih-1 |
FR9916633A FR2792206B1 (fr) | 1999-04-13 | 1999-12-29 | Vaccin anti-vih-1 comprenant tout ou partie de la proteine tat de vih-1 |
PCT/FR2000/000938 WO2000061067A2 (fr) | 1999-04-13 | 2000-04-12 | Vaccin anti-vih-1 comprenant tout ou partie de la proteine tat de vih-1 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL353033A1 PL353033A1 (pl) | 2003-10-06 |
PL197666B1 true PL197666B1 (pl) | 2008-04-30 |
Family
ID=26234914
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL353033A PL197666B1 (pl) | 1999-04-13 | 2000-04-12 | Szczepionka anty-HIV-1, sposób wytwarzania poliklonalnych przeciwciał anty-TAT, sposób wykrywania obecności białka TAT w próbce biologicznej, zestaw do diagnozowania zakażenia HIV i sposób wytwarzania wariantu TAT |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7087377B2 (pl) |
EP (1) | EP1169057B1 (pl) |
JP (1) | JP4860823B2 (pl) |
KR (1) | KR100725637B1 (pl) |
AT (1) | ATE280586T1 (pl) |
AU (1) | AU775560B2 (pl) |
BR (1) | BR0009758A (pl) |
CA (1) | CA2370563C (pl) |
DE (1) | DE60015312T2 (pl) |
DK (1) | DK1169057T3 (pl) |
ES (1) | ES2231178T3 (pl) |
FR (1) | FR2792206B1 (pl) |
HK (1) | HK1044463B (pl) |
HU (1) | HUP0200841A2 (pl) |
IL (2) | IL145884A0 (pl) |
MX (1) | MXPA01010482A (pl) |
NO (1) | NO326603B1 (pl) |
PL (1) | PL197666B1 (pl) |
PT (1) | PT1169057E (pl) |
WO (1) | WO2000061067A2 (pl) |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100465589B1 (ko) * | 2001-04-20 | 2005-01-13 | 허만욱 | 비만 억제 폴리펩타이드 |
FR2868318B1 (fr) * | 2004-04-01 | 2012-11-16 | Commissariat Energie Atomique | Antigene tat stabilise et ses applications pour la vaccination anti-vih |
ES2500265T3 (es) * | 2008-04-22 | 2014-09-30 | Université D'aix-Marseille | Proteína Tat Oyi mutada para prevenir o tratar SIDA |
US8530431B2 (en) * | 2009-03-23 | 2013-09-10 | Pin Pharma, Inc. | Treatment of cancers with immunostimulatory HIV TAT derivative polypeptides |
EP3187585A1 (en) | 2010-03-25 | 2017-07-05 | Oregon Health&Science University | Cmv glycoproteins and recombinant vectors |
WO2011128720A1 (en) * | 2010-04-14 | 2011-10-20 | Mymetics Corporation | Trans-activator of transcription protein |
WO2012170765A2 (en) | 2011-06-10 | 2012-12-13 | Oregon Health & Science University | Cmv glycoproteins and recombinant vectors |
AU2012216792A1 (en) | 2011-09-12 | 2013-03-28 | International Aids Vaccine Initiative | Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing HIV-1 proteins by broadly neutralizing antibodies |
US9402894B2 (en) | 2011-10-27 | 2016-08-02 | International Aids Vaccine Initiative | Viral particles derived from an enveloped virus |
EP2679596B1 (en) | 2012-06-27 | 2017-04-12 | International Aids Vaccine Initiative | HIV-1 env glycoprotein variant |
RU2653754C2 (ru) | 2012-12-06 | 2018-05-14 | Пин Фарма, Инк. | Лечение воспалительных, аутоиммунных и нейродегенеративных нарушений иммуннодепрессивными полипетидами, являющимися производными тат |
EP2848937A1 (en) | 2013-09-05 | 2015-03-18 | International Aids Vaccine Initiative | Methods of identifying novel HIV-1 immunogens |
AU2014329393B2 (en) | 2013-10-04 | 2020-04-30 | Pin Pharma, Inc. | Immunostimulatory HIV Tat derivative polypeptides for use in cancer treatment |
US10058604B2 (en) | 2013-10-07 | 2018-08-28 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
US10174292B2 (en) | 2015-03-20 | 2019-01-08 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
EP3072901A1 (en) | 2015-03-23 | 2016-09-28 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4281061A (en) * | 1979-07-27 | 1981-07-28 | Syva Company | Double antibody for enhanced sensitivity in immunoassay |
US5019510A (en) | 1987-10-28 | 1991-05-28 | Institut Pasteur | Isolation, molecular cloning and sequencing of an HIV-1 isolate from a Gabonese donor |
US5132205A (en) * | 1988-10-07 | 1992-07-21 | Eastman Kodak Company | High ph extraction composition and its use to determine a chlamydial, gonococcal or herpes antigen |
US5461029A (en) * | 1992-04-24 | 1995-10-24 | American Cyanamid Company | Method of treating herpes viral infections using HBNF and MK proteins |
FR2700169B1 (fr) * | 1993-01-04 | 1995-03-24 | Transgene Sa | Nouveaux variants trans-dominants TAT du virus de l'immunodéficience humaine. |
PL322143A1 (en) * | 1995-03-08 | 1998-01-05 | Neovacs | Non-topxic immunogenes originating frommretroviral regulator protein, antibodies as such, method of preparing them and pharmaceutic compositions containing them |
DE19514089C2 (de) * | 1995-04-13 | 1997-07-10 | Deutsches Krebsforsch | Nachweisverfahren für HIV-TAT |
JPH10212300A (ja) * | 1996-11-26 | 1998-08-11 | Sankyo Co Ltd | ペプチドワクチン |
US5891994A (en) * | 1997-07-11 | 1999-04-06 | Thymon L.L.C. | Methods and compositions for impairing multiplication of HIV-1 |
-
1999
- 1999-12-29 FR FR9916633A patent/FR2792206B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-04-12 CA CA2370563A patent/CA2370563C/fr not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-12 DE DE60015312T patent/DE60015312T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-12 AT AT00918952T patent/ATE280586T1/de active
- 2000-04-12 BR BR0009758-6A patent/BR0009758A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-04-12 PT PT00918952T patent/PT1169057E/pt unknown
- 2000-04-12 PL PL353033A patent/PL197666B1/pl unknown
- 2000-04-12 JP JP2000610400A patent/JP4860823B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-12 IL IL14588400A patent/IL145884A0/xx active IP Right Grant
- 2000-04-12 MX MXPA01010482A patent/MXPA01010482A/es active IP Right Grant
- 2000-04-12 DK DK00918952T patent/DK1169057T3/da active
- 2000-04-12 ES ES00918952T patent/ES2231178T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-12 EP EP20000918952 patent/EP1169057B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-12 HU HU0200841A patent/HUP0200841A2/hu unknown
- 2000-04-12 WO PCT/FR2000/000938 patent/WO2000061067A2/fr not_active Application Discontinuation
- 2000-04-12 AU AU39724/00A patent/AU775560B2/en not_active Expired
-
2001
- 2001-10-04 NO NO20014841A patent/NO326603B1/no not_active IP Right Cessation
- 2001-10-11 IL IL145884A patent/IL145884A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-10-12 KR KR10-2001-7013031A patent/KR100725637B1/ko active IP Right Grant
-
2002
- 2002-07-09 HK HK02105105.9A patent/HK1044463B/zh not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-10-21 US US10/969,191 patent/US7087377B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU693098B2 (en) | Tandem synthetic HIV-1 peptides | |
Nara et al. | Persistent infection of chimpanzees with human immunodeficiency virus: serological responses and properties of reisolated viruses | |
AU632475B2 (en) | Human immunodeficiency virus (hiv) env-coded peptide capable of eliciting hiv-inhibiting antibodies in mammals | |
DE3588254T2 (de) | GAG-Antigen und dessen Verwendung zum Nachweis von LAV-Infektion, sowie in immunogenen Zusammensetzungen | |
Lairmore et al. | Human T-lymphotropic virus type 1 peptides in chimeric and multivalent constructs with promiscuous T-cell epitopes enhance immunogenicity and overcome genetic restriction | |
US7087377B2 (en) | Method and kit for detection of tat protein with anti-tat oyi antibodies | |
EP0436634A1 (en) | Hiv proteins and peptides useful in the diagnosis, prophylaxis or therapy of aids | |
NL8701950A (nl) | Monoclonale antilichamen en peptiden, geschikt voor de behandeling en diagnose van hiv infecties. | |
De Rossi et al. | Synthetic peptides from the principal neutralizing domain of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) enhance HIV-1 infection through a CD4-dependent mechanism | |
EP0306219A2 (en) | Novel HIV proteins and peptides useful in the diagnosis, prophylaxis or therapy of AIDS | |
US6042831A (en) | Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) GP160 epitopes that are immunologically homologous to epitopes located in the class I major histocompatibility complex (MHC) heavy chain α-1 domain | |
WO1989010416A1 (en) | PROTECTIVE PEPTIDES DERIVED FROM HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS-1 gp160 | |
Demirhan et al. | Detection of distinct patterns of anti-tat antibodies in HIV-infected individuals with or without Kaposi's sarcoma | |
Babas et al. | Specificity of antipeptide antibodies produced against V2 and V3 regions of the external envelope of human immunodeficiency virus type 2 | |
US6290963B1 (en) | Anti-HIV compositions containing native and recombinant peptides | |
US5562905A (en) | Human immunodeficiency virus (hiv) env-coded peptide capable of eliciting hiv-inhibiting antibodies in mammals | |
FR2792204A1 (fr) | Vaccin anti-vih-1 comprenant tout en partie de la proteine tat de vih-1 | |
WO1999038887A1 (en) | Divergent hiv-1 peptides |