MXPA01010482A - Vacuna anti-vih-1 que comprende toda o parte de la proteina tat de vih-1. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a una vacuna anti-VIH-1 que comprende toda o parte de la proteina Tat de VIH, junto con la identificacion de dicha proteina en individuos afectados por el VIH; la proteina Tat es una proteina de la variante Oyi de VIH-1.

Description

VACUNA ANTI-V1H-1 QUE COMPRENDE TODA O PARTE DE LA PROTEINA TAT DE VIH-1 MEMORIA DESCRIPTIVA El objetivo de la presente invención es una vacuna anti-VIH-1 que comprende toda o parte de proteína Tat de VIH-1 y la preparación de anticuerpos monoclonales o policlonales capaces de reconocer diferentes variantes de Tat y un método para detectar Tat en una muestra biológica. El objetivo de la presente invención se refiere al uso de proteína reguladora del virus de inmunodeficiencia humana (VIH), la proteína Tat, como una vacuna contra este virus y la detección de esta proteína en individuos infectados con VIH. Tat es una proteína viral la cual es esencial para la expresión de los genes virales y la replicación del virus VIH-1. El gen Tat está compuesto de dos exones que codifican para una proteína de 99 a 106 residuos dependiendo de los aislados. Sin embargo, ya ha sido descrita una actividad de Tat con formas que contienen 86 residuos que tienen una porción del extremo C-terminal el cual ha sido suprimido. Se cree que estos derivados de Tat con 86 residuos son artefactos de laboratorio o formas ancestrales que ya no existen en el estado natural. Esta proteína permite la activación de los genes de VIH-1 en virtud de su unión a un objetivo nucleótidico llamado TAR localizado en el extremo 5' de los ARNm de VIH-1. Es secretada por células con VIH y es esencial para una transcripción inversa efectiva de VIH-1. Una vez fuera de la célula, es capaz de activar células infectadas distantes y de inducir la inmunodeficiencia de células T no infectadas. Además, está directamente involucrada en condiciones patológicas relacionadas con el SIDA, tales como sarcoma de Kaposi. El desarrollo de la vacuna contra el SIDA es altamente anticipado por todo el planeta, pero la producción de una vacuna contra el SIDA tiene dos dificultades principales. La primera está relacionada con la variabilidad extrema de la proteína de cubierta GP120. La segunda dificultad se debe al hecho de que los anticuerpos anti-GP120 parecen agravar la enfermedad para pacientes con SIDA declarado. Sin embargo, los resultados preliminares indican que puede ser posible un efecto protector con anticuerpos anti-GP120 en gente que no ha sido previamente contaminada. Se ha iniciado una fase II con una vacuna anti-GP120 por la compañía Roche en los Estados Unidos. Los grupos seleccionados para esta fase II están bien monitoreados desde el punto de vista médico. Sin embargo, será difícil obtener una supervisión médica equivalente cuando la vacuna sea comercializada. Con GP120, Tat es detectada en la sangre de pacientes infectados con VIH-1. La actividad de los macrofágos y los linfocitos T citotóxicos (CTL) responsables de eliminar todas las células infectadas con un virus se bloquea gradualmente mediante Tat, la cual por lo tanto, actúa un inmunosupresor. Los anticuerpos Anti-Tat (o ingredientes activos orientados a deben permitir la restauración de la actividad de los CTL y de los - ? macrófagos. Por lo tanto, Tat es un objetivo preferido tanto para el desarrollo de antivirales anti-Tat, como para un método de vacuna. 5 La proteína Tat ha sido por lo tanto el objetivo de experimentos. Los análisis preclínicos, obtenidos con una proteína Tat recombinante biológicamente inactiva (toxoide Tat), han mostrado en particular que el toxoide Tat ocasiona, en pacientes seronegativos, una producción alta y persistente de anticuerpos anti-Tat (Le Buanec et al., 1998). En pacientes 10 seropositivos e inmunodeficientes, se observa un incremento significativo en el nivel de anticuerpos anti-Tat en comparación con el nivel normal de anticuerpo anti-Tat (Westendorp et al., 1995). Este toxoide Tat es una proteína recombinante la cual se hace biológicamente inactiva después de carboximetilación de las cisteínas Tat. Los 15 inventores también han podido producir un Tat carboximetilado (Tat Bru cmC) y también observaron una pérdida de la actividad de transactivación aún cuando la misma variante de Tat con las cisteínas libres (Tat Bru fC) es capaz de transactivación. Tat Bru cmC es capaz de unirse a TAR con una afinidad comparable a Tat Bru fC. 20 Una principal desventaja en el uso de Tat carboximetilado como una vacuna, es que la modificación química de la cisteína ocasiona cambios de conformación que los inventores observaron mediante dicroismo circular y RMN. Aunque los cambios de conformación existen entre las diferentes de Tat, la carboximetilación de las cisteínas ocasiona mayores modificaciones en el doblez de la cadena peptídica de Tat la cual, como resultado no es un buen candidato para la preparación de una vacuna anti- Tat. Por lo tanto, es conveniente utilizar, en una vacuna anti-VIH-1 , una proteína Tat que sea defectuosa, pero la cual posea características estructurales similares a las Tat funcionales. Esta Tat debe tener, desde luego, una estructura tridimensional tan cercana a las proteínas Tat naturales como sea posible a manera de ser capaz de inducir una respuesta inmune similar a la inducida por las Tat naturales, pero la cual no pueda transactivar, es decir, como se indicó anteriormente, incapaz de activar células infectadas distantes y de inducir la inmunodeficiencia de células T no infectadas. Desde luego, es crucial inhibir esta inmunodeficiencia. El objetivo de la presente invención es por lo tanto una vacuna anti-VIH-1 que comprenda toda o parte de por lo menos una proteína Tat de VIH-1 capaz de unirse a TAR y que sea incapaz de transactivación, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable y, cuando sea adecuado, uno o más adyuvantes de inmunidad adecuados. Esta proteína Tat debe ser capaz de generar, en un animal al cual esta proteína pudiera ser administrada, una producción de anticuerpos capaces de reconocer otras variantes de esta proteína en un nivel el cual sea suficiente para inhibir la transactivación de dichas variantes.

De esta forma, una proteína Tat no solamente puede ser utilizada para la preparación de una vacuna de acuerdo con la invención, sino además solamente una o más porciones de esta proteína capaz de cumplir las funciones deseadas para la proteína Tat en el contexto de la presente invención. La vacuna antes mencionada puede también comprender una combinación de diferentes proteínas Tat o las porciones de diferentes proteínas Tat. De acuerdo con una modalidad ventajosa de la invención, cuando se utiliza la proteína Tat en su totalidad, de preferencia comprende de 99 a 106 aminoácidos, y de preferencia incluso 101 aminoácidos. La expresión "parte de la proteína Tat" se entiende cualquier fragmento o combinación de fragmentos de una o más proteínas Tat que pertenecen a la misma variante, la cual sea suficientemente inmunogénica para dar lugar a una producción de anticuerpos. De preferencia, dicho fragmento comprende entre 15 y 30 aminoácidos, de preferencia entre 18 y 25 átomos de ácido. Esta definición es válida cada vez que esta expresión se utiliza en la presente solicitud. La proteína Tat, la cual se puede utilizar en la vacuna de acuerdo con la invención, por lo tanto debe ser diferente a las proteínas Tat funcionales las cuales son denominadas "naturales", es decir, las cuales sean extraídas de diferentes cepas de VIH-1 presentes en el estado natural, a modo de que sean incapaces de transactivación mientras se unen a TAR. Esta es la razón por lo que la Tat utilizada en la vacuna de acuerdo con la Invención tiene una secuencia nucleotídica que tiene por lo menos una mutación en comparación con la secuencia nucleotídica de una Tat funcional. Esta mutación, la cual es generalmente una mutación puntual, puede por ejemplo, dar lugar a la supresión, la adición o sustitución de uno o más aminoácidos. En el contexto de sus estudios, los inventores antes que nada estudiaron la variante de Tat correspondiente al aislado Bru (86 residuos) y luego sintetizaron otras cinco variantes, cada una representativa de la diversidad estructural observada con esta proteína (Grégoire y Loret, 1996) : Tat Z2 (86 residuos), Tat Mal (87 residuos), Tat Eli (99 residuos), Tat Oyi (101 residuos) y Tat Jr (101 residuos). De esta manera, se han determinado 6 grupos estructurales entre todos los aislados de VIH-1 de acuerdo con el tamaño de las proteínas y la naturaleza de sus mutaciones. Fue probable que todas estas variantes tuvieran actividades farmacológicas similares a Tat Bru que ha sido sintetizada dos veces, con las cisteínas carboximetiladas (Tat Bru cmC) y luego con las cisteínas libres (Tat Bru fC). La química utilizada es del tipo fastFmoc con el activador HBTU. La purificación de las proteínas se realizó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento. Se encontró que todas estas proteínas sintéticas son capaces de unirse a TAR, pero se han observado grandes disparidades en la prueba de transactivación de células HeLa. El resultado más sorprendente fue la ausencia de transactivación observada con la variante de Tat Oyi. Tampoco existió transactivación observada con el derivado de Tat Bru que posee las cisteínas El estudio de dicroismo circular de fase acuosa (CD) en estas proteínas sintéticas mostró sin duda, que la modificación química de Tat Bru cmC modificó significativamente la estructura de Tat Bru. Por otro lado, Tat Oyi tiene una estructura similar a las otras, según se confirma por su espectro de CD. La cepa VIH-1 Oyi se identificó en un paciente de Gabón (especialmente una mujer embarazada) en 1988 (Huet et al., 1989). Este paciente estaba perfectamente sano aunque había sido seropositivo por varios años. Aparentemente, el hecho de que una proteína Tat defectuosa estuviera presente en esta cepa de VIH-1 evitó la progresión al SIDA en este paciente y le confirió inmunidad contra el virus del SIDA. Desde luego, los estudios epidemiológicos realizados en el campo han mostrado que los pacientes infectados con VIH-1 Oyi no eran progresivos a largo plazo. La cepa de VIH Oyi pertenece al subtipo B correspondiente a las cepas de VIH-1 las cuales son las más difundidas en Europa y el norte de América. La mujer de Gabón en quien se identificó la cepa de VIH Oyi pertenecía a un grupo de 31 personas localizadas en la provincia rural de Haut Ogooué en el sureste de Gabón. Este grupo se identificó en 1986 durante un análisis seroepidemiológico realizado en aproximadamente 200 personas infectadas en todo Gabón. Este grupo de Haut Ogooué llamo la atención porque la gente infectada tenía buena salud y además presentaba un perfil de Western blot completamente atípico. Desde luego, no fue posible detectar, en estas personas, la presencia de anticuerpos anti-gp 120, anti-gp F * * - 160 y anti-gp 41 , mientras que se identificaron anticuerpos anti-gag y anti-po/ (Huet et al., 1989). Un grupo de 750 mujeres embarazadas de esta misma provincia de Haut Ogooué, luego se sometieron a estudios y se mostró que 25 de ellas 5 (es decir, 3.3%) eran VIH positivo mediante la prueba de ELISA. Entre estas 25 mujeres, 23 tenían un perfil de Western blot atípico característico de la región (véase arriba). Aproximadamente 10 de las mujeres fueron observadas durante 2 años incluyendo la que posee la cepa de VIH-1 Oyi. Durante este período, el perfil serológico atípico permaneció 10 constante, excluyendo la posibilidad de una infección reciente la cual no hubiera dejado tiempo para la formación de anticuerpos anti-gp 120. Se excluyó la presencia de una infección de VIH-2 debido a que no hubo reacción para VIH-2 gag y solamente se reportaron dos casos de infección de VIH-2 en Gabón, localizados en una región de costa. Todos los pacientes monitoreados 15 permanecieron con buena salud sin pérdida de peso o enfermedad oportunista durante los dos años del estudio (Huet et al., 1989). La mujer identificada con Oyi era de origen rural, con buena salud y seronegativa para HTLV-1 y VIH-2. El co-cultivo de sus linfocitos con PPMC reveló una actividad de RT solamente después de 15 días, lo cual es 20 muy inusual. El virus también tenía una actividad citopática casi indetectable. Aunque el sobrenadante del cultivo permitió la infección de PBMC, prácticamente no fue posible ninguna replicación en líneas linfocíticas normales tales como monocitos H-9 y CEM o U-937. Para validar este análisis, se observaron resultados similares con otros 17 pacientes de la misma región, confirmando la ausencia de anticuerpos anti-gp 120 en todos los casos. Es de interés señalar que el suero de un donador de VIH-1 es capaz de reconocer la gp 120 de VIH-1 Oyi (Huet et al., 1989). Por lo tanto, el virus de VIH-1 Oyi fue clonado; la secuenciación no reveló falla excepto para el gen 7at (Huet et al., 1989). La mutación de Cys 22 a Ser parece ser la razón de la pérdida de transactivación y la reversión de esta mutación, hace posible restaurar la actividad de Tat. Además, se observó que en ausencia de Tat, la reproducción del virus es posible pero a un nivel muy bajo. Por lo tanto, existe una cercana relación entre la virulencia de VIH y la eficiencia en transactivación de Tat. Este estudio epidemiológico muestra una vez más la cercana relación que existe entre la mortalidad a partir de esta enfermedad y la velocidad de replicación de VIH. Por lo tanto, parece que Tat permite que VIH alcance la velocidad de replicación la cual cambia esta infección viral a una enfermedad mortal. Además, este estudio de estos pacientes atípicos de la región de Haut Ogooué reveló la protección que las cepas de VIH defectuosas parecen proveer en comparación con las cepas de VIH normales. Desde luego, se cree que el análisis de PCR de linfocitos recientemente recolectados de diferentes pacientes atípicos, ha revelado la presencia de cepas de VIH normales. El mecanismo protector no involucra anticuerpos anti-gp 120, éstos últimos M3|1Í ausentes de estos pacientes. La acción de los linfocitos T citotóxicos puede ser el mecanismo que permitió la erradicación del virus. Un estudio epidemiológico relativamente reciente realizado en Gabón (Delaporte et al., 1996) indica un bajo porcentaje de personas infectadas con VIH (2 a 3%) en comparación con otros países africanos. El subtipo Oyi parece haber desaparecido completamente de la población y la mujer gabonesa de la cual se tomó la cepa de VIH-1 Oyi gozaba de perfecta salud en 1995 y dio luz a niños quienes fueron todos seronegativos. El virus de VIH-1 Oyi ya no era detectable en ella. La proteína Tat de la variante de VIH-1 Oyi, por lo tanto parece ser el mejor candidato para empezar la composición de una vacuna anti-VIH- 1. Sin embargo, una Tat inactivada no es necesariamente inmunogénica. Ahora, todo el beneficio de una vacuna es generar la producción de anticuerpos, y lo que es más, en el caso presente, de anticuerpos los cuales sean activos contra otras variantes de Tat. De manera sorprendente, los inventores han podido hacer esta demostración. La vacuna de acuerdo con la invención comprende por lo tanto, de acuerdo a una modalidad particularmente ventajosa, la Tat, en totalidad o en parte, de la variante de VIH-1 Oyi. Las ventajas de una vacuna anti-Tat se pueden incluso contemplar en diferentes niveles. En pacientes asintomáticos, sería posible retardar el avance hacia el SIDA al limitar la inmunodeficiencias. Dicha vacuna podría permitir al paciente retener una inmunidad efectiva contra el virus, parece ser el caso en el inicio de la infección. En particular, la restauración de la actividad de los linfocitos T citotóxicos (CTL) y de los macrófagos, los cuales no están infectados por VIH pero cuya actividad está inhibida por Tat, tendría la consecuencia de permitir que los pacientes se 5 volvieran no progresivos. En pacientes con SIDA declarado, una vacuna anti-Tat limitaría la incidencia de ciertas condiciones patológicas tales como sarcoma de Kaposi o síndromes neurológicos que parecen estar enlazados a una acción directa de la proteína Tat siguiendo su secreción mediante células infectadas 10 por VIH. El beneficio de la variante de VIH-1 Oyi en el contexto de la presente invención, se confirma aún más mediante experimentos de Western blot (fotografía de gel demostradas en la presente solicitud) y la prueba Elisa realizada por los inventores con el fin de determinar si existió reconocimiento 15 cruzado entre las diferentes variantes de Tat. De hecho, en estos dos tipos de experimento, se sometieron a prueba tres diferentes sueros anti-Tat contra siete variantes de Tat. Los inventores inmunizaron ratones con Tat Oyi, Tat Bru cmC y Tat Eli de acuerdo con un protocolo de inmunización convencional en 20 presencia de adyuvante de Freund. Los sueros policlonales obtenidos después de 53 días se analizaron mediante Western blotting y una prueba de Elisa. Los títulos observados son respectivamente 700, 11 y 660 pM para los anticuerpos anti-Oyi, anti-Bru cmC y anti-Eli.

Bajo condiciones desnaturalizantes, los experimentos Western blot muestran que el suero anti-Tat Oyi y el suero anti-Tat Eli son incapaces de mostrar inmunogenicidad cruzada con todas las variantes, como es el caso con el suero anti-Tat Bru cmC. Tat Bru cmC es una variante cuyas cisteínas son carboximetiladas. Esta modificación química de la cisteínas no solamente ocasiona la pérdida de actividad de transactivación (Péloponése et al., 1999), sino también la pérdida de la estructura tridimensional de esta variante, la cual se convierte en una enroscamiento aleatorio (resultado no publicado). Por lo tanto, no es sorprendente observar que el suero anti-Tat Bru cmC es capaz de reconocer todas las variantes cuando están desnaturalizadas. Bajo condiciones no desnaturalizantes, la prueba de Elisa (figura 7) muestra que el suero anti-Tat Oyi es capaz de reconocer todas las variantes como el suero anti-Tat Bru cmC. Por otro lado, el suero anti-Tat Eli es incluso incapaz de reconocer todas las variantes. Por lo tanto, parece que los epítopes tridimensionales conservados existen en numerosas variantes de Tat. Sin embargo, solamente el carácter inmunogénico específico de Tat Oyi hace posible generar esos anticuerpos en una gran cantidad. Existe, por lo tanto, una gran probabilidad de la presencia de Tat en pacientes que hasta ahora han sido subestimados. La dilución de los tres sueros es 1/1000. En el mismo experimento, pero sin dilución, el suero anti-Tat Eli también puede reconocer todas las demás variantes de Tat. Es conveniente señalar que la acetilación de lisina 50 de Tat Bru (Tat Bru K50) permite reconocimiento por parte del suero anti-Tat Eli en una baja concentración. Estos experimentos realizados con estos tres sueros policlonales de conejo, confirman por lo tanto el beneficio de Tat Oyi como una vacuna. Además, el suero anti-Tat Oyi es capaz de inhibir transactivación en células HeLa con Tat Bru o Tat Eli. El suero anti-Tat Eli utilizado como un control, muestra que la producción de anticuerpos, incluso de una variante activa, no asegura reconocimiento cruzado de todas las variantes de Tat como se observa con Tat Oyi. Tat Oyi, la cual es una gran variante (101 residuos), permite mejor reconocimiento de las variantes de Tat en comparación con Tat Bru cmC la cual es una variante corta (86 residuos). Las cepas de VIH-1 con pequeñas variantes de Tat han desaparecido prácticamente y parecen haber sido un artefacto de laboratorio (Jeang et al., 1999). Además, el suero anti-Tat Oyi presenta alta especificidad debido a que ya no reconoce las formas desnaturalizadas (o epítopes lineales) de las variantes de Tat. De manera contraria, existe un riesgo significativo para el suero anti-Tat Bru cmC para generar anticuerpos autoinmunes en seres humanos debido a la alta diversidad estructural de Tat Bru cmC. Los inventores, desde luego observaron que existieron anticuerpos capaces de reconocer albúmina humana en el suero anti-Tat Bru cmC (datos no mostrados). La conservación de la estructura tridimensional de por lo menos un epítope de Tat es, por lo tanto, esencial para el reconocimiento de otras variantes de Tat por los anticuerpos anti-Tat tridimensionales.

Más aún, los inventores también han mostrado que los anticuerpos anti-Tat Oyi fueron capaces de inhibir la transactivación de las proteínas Tat Eli. El objetivo de la presente invención es por lo tanto, también un método para preparar anticuerpos policlonales o monoclonales anti-Tat capaces de reconocer diferentes variantes de Tat. Desde luego, se debe enfatizar que estos anticuerpos se pueden utilizar por consiguiente para detectar, en individuos quienes han sido infectados con VIH, la presencia de la proteína Tat en su sangre sin considerar la variante. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método para preparar anticuerpos policlonales anti-Tat capaces de reconocer diferentes variantes de Tat, que comprende: - la inmunización de un animal por medio de una proteína Tat o parte de esta proteína Tat combinada con un adyuvante de respuesta inmune, - la purificación de los anticuerpos específicos contenidos en el suero de los animales inmunizados. La inmunización del animal se puede realizar a través de cualquier modo para introducir la proteína Tat o parte de esta proteína Tat en este animal, tal como: inyección, inhalación, administración oral, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular. La inmunización del animal también se puede realizar a través de una expresión in vivo e in situ de un vector que no solamente porta la secuencia de la proteína Tat como un todo o en parte, sino también todo el .l.Ltl.,^ «aAjfei,, *. -->--«-a-J>--- .«»IM-fc...M-- M. ^J>|t^...... . ?. «huk^ ****^ *^***^ ** •#$« sistema necesario para la expresión de la proteína Tat de acuerdo con técnicas conocidas para el experto en el área. La purificación de los anticuerpos específicos contenidos en el suero de los animales inmunizados se puede realizar por ejemplo, en una 5 columna de afinidad, a la cual de antemano se ha unido la proteína o parte de la proteína que sirvió como antígeno. De acuerdo con una modalidad ventajosa de la presente invención, la proteína Tat o parte de la proteína Tat utilizada en el paso de inmunización del método antes mencionado, corresponde a la variante Oyi o a 10 la variante Bru cmC. De acuerdo con otra modalidad de la presente invención, la proteína antes mencionada es una proteína químicamente sintetizada. La posición de siete residuos de cisteína (región 22-37) es altamente conservada entre todas las variantes de Tat y la importancia de 6 15 de estos residuos de cisteína para la transactivación se describe ampliamente en la literatura (Jeang, 1996). Por consiguiente, es completamente posible contemplar la mutación de una variante de Tat en por lo menos una de estas cisteínas con el fin de hacer que dicha variante sea capaz de transactivarse mientras tiene 20 las propiedades deseadas en el contexto de la presente invención. Esta mutación puede consistir por ejemplo, en una sustitución de la cisteína por otro aminoácido tal como una serina o una alanina. til» Los inventores, a través de la determinación de la estructura tridimensional de Tat Bru mediante RMN 2D, han identificado más aún una región objetivo la cual debe ser conservada en las variantes de Tat. Este objetivo consiste parcialmente en la región N-terminal y la región básica de la 5 secuencia de Tat. La estructura tridimensional de la variante Tat Bru muestra que la región rica en cisteína está cercana al espacio tridimensional de la región N- terminal y de la región básica. Esto indica que la carboximetilación de las cisteínas probablemente modifica la estructura de este objetivo y confirme el 10 hecho de que la Tat modificada no pueda ser considerada como un candidato potencial para la preparación de una vacuna anti-VIH. Más aún, los inventores han llevado a cabo las síntesis química de fase sólida de las diferentes proteínas Tat. En el nivel actual de conocimiento en el campo, las ventajas 15 presentadas por este modo de síntesis consiste en los bajos costos de producción, los mejores rendimientos comparados con la Tat producida mediante biología molecular y la ausencia de contaminaciones. De esta forma, ventajosamente, la Tat utilizada en la vacuna de acuerdo con la invención, se prepara mediante síntesis química y en 20 particular, mediante síntesis química en fase sólida, tal como una síntesis del tipo FMOC, y preferiblemente fastFMOC. Un método de síntesis que utiliza grupos protectores de este tipo también es un objetivo de la presente invención.

Sin embargo, la Tat utilizada en la vacuna de acuerdo con la invención, también se puede sintetizar de otra forma, por ejemplo por medio de técnicas recombinantes conocidas para el experto en la técnica. Estos sistemas de clonación y expresión utilizados en el contexto de estas técnicas se pueden derivar de microorganismos tales como Escherichia coli, Bacillus, Streptomyces y Saccharomyces, pero también de células de mamíferos, insectos y levaduras. También se contemplan los sistemas de expresión de Baculovirus. Obviamente, los vectores que portan la secuencia de la proteína Tat como un todo o en parte, comprenderán todo el sistema de expresión necesario para hacerlo, de acuerdo con las técnicas conocidas para el experto. Además, con el fin de evitar cualquier riesgo potencial de toxicidad debido al paso de la proteína Tat, en particular Tat Oyi, en las membranas, sería aconsejable modificar la secuencia Arg-Gly-Asp presente en la terminal C de la secuencia de todas las variantes de Tat. Esta secuencia es desde luego esencial para el paso de membrana, debido a que reconoce un receptor de membrana en la superficie de las células (Jeang, 1996). Particularmente, esta modificación puede consistir en la sustitución de esta secuencia por la secuencia Lys-Ala-Glu la cual no tendría influencia en la estructura, o posiblemente la secuencia Ala-Ala-Ala. Como se mencionó anteriormente, es altamente probable que el número de personas infectadas con VIH se haya subestimado hasta ahora debido a la falla para detectar en ellas, por ejemplo en su sangre, la presencia "de la proteína Tat. El beneficio de la presente invención es proveer medios para detectar el mayor número posible de variantes de Tat por medio de un número limitado de anticuerpos. El objetivo de la invención es por lo tanto, también un método para detectar la presencia de la proteína Tat o de parte de la proteína Tat en una muestra biológica, que comprende: - poner dicha muestra en contacto con anticuerpos anti-Tat capaces de dar lugar a complejos antígeno-anticuerpo con diferentes variantes de Tat, - determinar la presencia de los complejos antígeno-anticuerpo. La expresión "anticuerpo anti-Tat" significa no solamente anticuerpos intactos, sino también fragmentos de anticuerpos o anticuerpos quiméricos capaces de cumplir el papel deseado en el contexto de la presente invención, a saber, reconocer toda o parte de la proteína Tat. La determinación de la presencia de los complejos antígeno-anticuerpos se realiza a través de métodos conocidos para el experto en la técnica. En particular, los reactivos que permiten la detección de estos complejos pueden portar un marcador o pueden ser capaces de ser reconocidos a su vez por un reactivo marcado, particularmente en el caso en el que el anticuerpo utilizado no esté marcado. La puesta en contacto de la muestra biológica en el método de acuerdo con la invención, con anticuerpos anti-Tat puede llevarse a cabo con un suero anti-Tat. ÍAiA?? ??*kA.?^ Se entiende que la expresión "muestra biológica" significa cualquier muestra líquida, celular o de tejido recolectada de un paciente y que de igual manera contiene el antígeno capaz de producir un complejo antígeno- anticuerpo en presencia del anticuerpo o anticuerpos apropiados. Preferiblemente, esta muestra biológica es sangre. Finalmente, un sujeto de la presente invención es también un equipo para el diagnóstico de la infección de VIH al determinar la presencia de la proteína Tat o de parte de la proteína Tat en una muestra biológica, que comprende: - reactivos para la preparación de un medio adecuado para la reacción inmunológica, - reactivos que permiten la detección de complejos de antígeno- anticuerpo producidos mediante la reacción inmunológica, - opcionalmente, una muestra biológica de referencia (control negativo) libre de antígeno, - opcionalmente, una muestra biológica de referencia (control positivo) que contiene una cantidad predeterminada de antígeno. De acuerdo con una modalidad útil de la presente invención, los reactivos para preparar el medio adecuado para la reacción inmunológica comprende anticuerpos anti-Tat capaces de motivar los complejos de antígeno-anticuerpo con muchas variantes de Tat y preferiblemente comprende anticuerpos anti-Tat Oyi o anti-Tat Bru cmM o una combinación de los dos. & fIGURAS Figura 1 : Comparación de varias proteínas Tat 5 Las proteínas Tat se dividieron en 6 grupos estructurales que se mencionan en negritas en la figura 1A y se subrayan en la figura 1 B.

Figura 1A: Secuencias de aminoácidos de las proteínas Tat TatZ2 se obtiene de un aislado de VIH-1 cercano a las cepas 10 ancestrales del virus (Zhu et al., 1998). Tat Mal y Tat Eli se obtienen de una cepa de VIH-1 aislada en los años ochenta en África central en infecciones de VIH heterosexuales (Alizon et al., 1986). Tat Br comprende la secuencia más ampliamente utilizada en el laboratorio y se obtiene a partir de una cepa de VIH-1 aislada en Francia (Barre-Sinoussi et al., 1983), mientras que Tat Jr se 15 obtiene a partir de un aislado de VIH-1 de América (O'Brien et al., 1990). Tat Oyi se relaciona cercanamente con Tat Jr y Tat Bru pero se obtiene a partir de una cepa de VIH identificada en un paciente saludable en Gabón (Huet et al., 1989). 20 Figura 1 B: Clasificación de las proteínas Tat como una función de su tamaño y de sus mutaciones que comprenden para el programa MULTALIN (Corpet, 1989).

Figura 2: Secuencia de la proteína Tat de la variante VIH-Oyi (descrita por Huet et al., 1989).

Figura 3: Purificación de las 6 variantes de Tat mediante cromatografía líquida de rendimiento elevado de fase invertida con columnas injertadas de C8 a 280 nm (véase Materials and Methods for the experimental procedure). Para cada estructura, el rastreo inferior representa el resultado de la síntesis del péptido antes de la purificación, mientras que el rastreo superior representa el resultado de la síntesis después del último paso de la purificación. Tat Bru (A), Tat Jr (B), TatZ2 (C), Tat Oyi (D), Tat Mal (E) y Tat Eli (F) se segmentaron de la resina con TFA. Después de la precipitación con éter butilmetílico, las proteínas se disolvieron en regulador de pH de TFA a 0.1 % (rastreo inferior en cada estructura). Para cada proteína, la purificación se llevó a cabo con dos corridas de CLAR semipreparativas sucesivas en columna C8 Hybar Merk (4.5 x 125 mm, velocidad de flujo 0.8 ml/min) y entonces las fracciones puras se analizaron (rastreo superior de cada estructura) y se identificaron mediante espectrometría de masa y mediante análisis de los aminoácidos (no se muestran los datos). En cada caso, se observó que el pico de CLAR principal representa la secuencia completa. Los picos entre 10 y 15 minutos representan derivados de 50 residuos mientras que los picos cercanos a la fracción principal son derivados con 1 a 15 deleciones a partir del extremo N-terminal. Las fracciones altamente hidrófobas son derivados con un peso molecular elevado probablemente debido a las cadenas laterales incompletamente sin proteger.

Figura 4: Medición de la constante de afinidad de Tat sintética para TAR objetivo de nucleótidos mediante electroforesis (véanse las pruebas de desplazamientos de movilidad electroforéticos bajo materiales y métodos. La concentración de proteínas (ng/µl) se indica en la parte supepor de cada banda de gel. El ARN libre o complejo se identifica mediante f (libre) y c respectivamente. La misma preparación de ARN se utiliza para la titulación con las 6 proteínas. Un derivado de Tat Bru con cisteínas carboximetiladas (Bru CmC) también se analizaron. Las constantes de disociación a un equilibrio (kd) se midieron directamente a partir de las pruebas de desplazamiento de movilidad electroforético. Los valores de kd varían aproximadamente de 50 nM para Tat Eli y Tat Mal a aproximadamente 140 nM para Tat Oyi y Tat Jr. Además, los inventores han notado que además de la variación en los valores kd, los perfiles de unión con varias proteínas son algo diferentes. Por ejemplo, las bajas concentraciones de Tat Bru producen un solo complejo bien resuelto y es únicamente con concentraciones claramente elevadas (> 4.5 mg/µl) que agregan forma y no pueden penetrar en los geles de acrilamida. En contraste, los complejos multiméricos se identifican fácilmente con Tat Eli aún a bajas concentraciones. Es posible observar hasta tres bandas retardadas con Tat Eli y a un grado menor con Tat Jr. Dichos efectos se observan con proteínas más cortas tales como Tat Bru y Tat Mal, por ejemplo, y con TaMDyj que es una proteína más larga.

Figura 5: Prueba de transactivación de las proteínas Tat sintéticas en células HeLa. Estas células se transfectan con LTR de VIH1 con el cual un gen reportero LacZ se relaciona. El nivel de la proteína ß-gal producida es proporcional a la capacidad de transactivación de varias Tats sintéticas. El LTR contiene las secuencias de ADN hacia el extremo 3' y hacia el extremo 5' que se requieren para la transcripción de VIH y TAR está presente en el inicio de ARNm (Claven and Charneu, 1994). Los cofactores celulares requeridos para la transactivación de VIH están presentes en las células He La. Sin Tat existe una expresión basal de ß-gal que se indica como un control (C). El siguiente histograma muestra la transactivación observada con las variantes de Tat diferentes utilizando dos concentraciones: 1µM (caja gris claro) y 5 µM (caja color gris obscuro). En cada caso, Tat se agrega al regulador de pH celular y por lo tanto una expresión superior de ß-gal en comparación con el control significa que Tat sintética es capaz de entrecruzar las membranas nucleares y citoplásmicas, de unir a TAR e interactuar con cofactores celulares. Únicamente Tat Bru cmC (los datos no se muestran) y Tat Oyi son deficientes en este experimento en donde se unen a TAR (figura 1). Tat Mal y Tat Eli muestran un nivel de transactivación 3 a 4 veces más alto que Tat Bru. Tat Z2, la más cercana de las proteínas Tat ancestrales, presenta un nivel bajo de transactivación y la evolución puede favorecer a los aislados de VIH-1 con una Tat más efectiva. Se han obtenido resultados similares con otras pruebas de transfección utilizando luciferasa como el gen reportero y Tat Mal y Tat Eli a 1 µM de hecho transactivando el LTR a un nivel comparable al obtenido con Tat-pCMV transactivada (los datos no se 5 muestran). La escala de concentraciones utilizada en varios experimentos se extiende de 0.1 µM a 10 µM (los datos no se muestran). A 0.1 µM, únicamente Tat Eli muestra un nivel de transactivación significativamente elevado en el nivel basal. A 10 µM, 6 Tats muestran dichos niveles de transactivación elevados es decir son imposibles de observar diferencias entre ellos debido a 10 su saturación.

Figura 6: Espectros dicróicos de variantes de Tat Z2 (triángulo blanco), Tat Oyi (triángulo negro), Tat Bru (círculo blanco), Tat Bru cmC (sin símbolo), Tat Jr (círculo negro), Tat Mal (cuadro blanco) y Tat Eli (cuadro 15 negro). Los espectros se miden en regulador de pH de fosfato a 20 mM con un pH de 4.5; se registran desde 260 a 178 nm, con una longitud de trayectoria óptica de 50 µm. Las diferencias observadas en el espectro de CD revelan una heterogeneidad estructural entre las variantes de Tat con relación 20 a su tamaño. No es posible juntar los espectros de CD en dos categorías que consisten en Tats cortas (símbolos blancos) y Tats largas (símbolos negros). Los espectros de CD se caracterizan por una banda negativa cercana a 200 nm típica de las estructuras no organizadas. Esta magnitud intensa de la con otras Tats.

Figura 7: Las pruebas de Elisa llevadas a cabo con tres diluciones de suero policlonal de conejo (anti-Tat Bru cmC, anti-Tat Oyi y anti- Tat Eli) con relación a 7 variantes de la proteína Tat bajo condiciones de desnaturalización.

Figura 8: Inhibición de la transactivación por medio de Tat Eli con el suero anti-Tat Eli, anti-Tat Oyi y anti-Tat Bru cmC. La presente invención no se limita a la descripción anterior. Se entenderá más claramente a la luz de los ejemplos que se mencionan únicamente por medio de ilustración.

EJEMPLOS 1 ) Materiales y métodos gue corresponden a la figura 3 a 6 Síntesis de proteína, purificación y caracterización Los péptidos se juntan de conformidad con el método Barany y Merrifield (1980) en una resina precargada con 4-hidroximetil-fenoximetil- copoliestiren divinilbenceno a 1% (HMP) (0.5-0.65 mmoles) (Perkin Elmer, Applied Biosystem Inc., Forster City, CA) en un sintetizador automatizado (ABI 433A, Perkin Elmer, Applied Biosystem Inc., Forster City, CA). Para evitar obtener derivados que presenten deleciones, los extremos N-terminales sin Fmoc se protegieron un grupo acetilo después del tratamiento con una mezcla que comprende 4.75% de anhídrido acético (Merck), 6.25% de DIEA a 2.0 M, 1.5% de 1 -hidroxibenzotriazol 1 M (HOBt) (Perkin Elmer, Applied Biosystem Inc., Warrington, GB) y 87.5% de N-metilpirrolidona (Perkin Elmer, Forster City, CA). Cada paso de desprotección se controló con un dispositivo de conductividad. Los péptidos se desprotegieron y removieron de la resina con ácido trifluroacético (TFA) suplementado con sulfuro de metil fenilo al 10% (Merck) y 5% de etan ditiol (Merck). La purificación se llevó a cabo con un aparato de cromatografía líquida de alto rendimiento Beckman (CLAR) y una columna de base invertida C8 Merck (10 x 250 mm). Un regulador de pH A consistía en agua con 0.1 % de TFA y regulador de pH B consistía en acetonitrilo con 0.1% de TFA. El gradiente contiene 20 a 40% de regulador de pH B sobre 40 minutos y una velocidad de flujo de 2 ml/minuto. Una ectometría de masa electroasperjada se llevó a cabo con un cuadrante simple de Perkin Elmer PE-SCIEX API 150ex. El análisis de aminoácidos se "Kk llevó a cabo en un analizador modelo 6300 Beckman. 5 Pruebas de desplazamiento de movilidad electroforético Los 59 nucleótidos de ARN TAR que contienen la protuberancia UUU de pirimidina esencial se preparó ¡n vitro mediante transcripción con polimerasas T3 de ARN. Las mezclas de reacción de unión (20 µl) contenían 0.2 moles de ARN TAR radioetiquetadas, 0-100 ng de Tat en regulador de pH 10 de TK (50 mM Tris pH 7.4, 20 mM KCl, 0.1 %, de Tritón X-100). Los complejos se separaron a partir de ARN sin unir mediante electroforesis en geles de poliacrilamida de desnaturalización al 8% que contiene 0.1% de Tritón X-100. El gel se activó con anterioridad durante 30 minutos antes de cargar la muestra (25 µl). La electroforesis se continuó durante 90 minutos a 15 aproximadamente 200 V. Las cantidades relativas de ARN libre y/o unido se determinaron mediante el phosphorus imaging.

Dicroismo circular (CD) El espectro de dicroismo circular se midió con una longitud de 20 trayectoria óptica de 50 µm desde 260 a 178 nm en una espectrofotómetro de rayos UV CD de Jobin-Yvon (Long-Jumeau, FRANCIA) (Mark VI). El instrumento se calibró con ácido (+)-10-canforsulfónico. Una relación de 2.1 se encontró entre la banda de CD positiva a 290.5 nm y la banda negativa a intervalo de 0.5 nm con unaf -, minuto. El espectro de CD se muestras se prepararon en un regulador de pH de fosfato a 20 mM (pH 4.5). Las concentraciones de proteína se concentraron en la escala de 0.5 a 1 mg/ml.

Transactivación con células transfectadas con LTR de VIH La transactivación funcional por medio de Tat sintética se determinó utilizando células P4. Estas células CD-4-HeLa transportan el gen lacZ bacteriano bajo el control de LTR de VIH y la acumulación citoplásmica de ß-galactosidasa fue estrictamente dependiente en presencia de Tat. 80% de las células confluentes depositadas en placas en una placa de 12 excavaciones de incubaron durante 24 horas a 37°C, en presencia de 5% de C02 con la proteína Tat contenida en un medio DMEM suplementado con 0.1 % de BSA. Después de este período de incubación, las células se lavaron con solución salina regulada con pH de fosfato y las proteínas se extrajeron y analizaron para ß-galactosidasa con una prueba de inmunoabsorción comercial utilizando una enzima unida a un antígeno (ELISA) para ß- galactosidasa, Boehringer Mannheim, FRANCIA), de conformidad con las instrucciones del fabricante. Los valores se normalizaron utilizando la concentración de las proteínas totales de los lisatos de células diferentes como se determinó mediante el método de Bradford.

Inhibición de la transactivación Los experimentos anteriores de la transactivación con células transfectadas con LTR de VIH se reprodujeron, pero esta vez con la adición al 5 < medio de cultivo ya sea de un suero anti-Tat Eli, o de un suero anti-Tat Oyi, o 5 de un suero anti-Tat Bru. La proteína Tat, por su parte, se obtuvo a partir de variantes Eli. Los inventores observaron una inactivación de la transactivación, mediante los anticuerpos anti-Tat Oyi, de la proteína Tat Eli en comparación en particular con el medio de control que no comprende anticuerpos. 10 2) Materiales y métodos gue corresponden a la figura 7 Las condiciones de inmunización son una inyección intradérmica de 100 µg de proteína Tat purificada en 0.5 ml de regulador de pH de fosfato a 100 mM, pH 4.5, más 0.5 ml de adyuvantes de Freund completos (día 0). Un 15 primer impulsor se realiza en D21 bajo las mismas condiciones pero con adyuvantes de Freund incompletos (0.5 ml). Un segundo impulsor se realiza en D42 idéntico a D41. Se recolecta sangre en D53 en tubos FST y el suero se obtiene después de la centrifugación a 200 revoluciones/minuto. La dilución del suero es 1/1000. 20 Elisa: La prueba se realiza en una placa Maxisorp U96 (Polylabo). Las proteínas en el regulador de pH de fosfato, con pH de 4.5 se incubaron en la placa durante la noche a 4°C. Después de la saturación en MPBS (8 g/l de NaCI, 0.2 g/l de KCl, 1.44 g/l de Na2HP0 , 5% de leche desnatada ajustada a un pH de 7.4 con HCl), las proteínas se incubaron con anticuerpos primarios del conejo durante 1 A =J hora. Posteriormente la incubación con un anticuerpo de cabra se acopló a la peroxidasa específica para el fragmento Fc de conejo (Cappel) durante una hora. La revelación se llevó a cabo en presencia de H202, 100 mM, de ácido cítrico, 50 mM de NaOH y 0.2 mg/ml de ABTS (Boehringer). La absorbancia se leyó a 405 nm. Sin dilución, el suero anti-Tat Eli es capaz de reconocer todas las 10 variantes de Tat o derivados. 3) Materiales y métodos para Western Blotting Western blotting: Las proteínas primero se desnaturalizaron en presencia de 3 M de Tris-HCl, pH 8.8, 5% de ß-mercaptoetanol, 2% de SDS, 15 10% de glicerol, y azul bromofenólico. Se separan mediante electroforésis en gel de poliacrilamida al 15%. Posteriormente las proteínas se transfirieron en membranas de nitrocelulosa para revelarse mediante inmunodetección. Los sitios específicos se bloquean con una solución de PBS (8 g/l de NaCI, 0.2 g/l de KCl, 1.44 g/l de Na2HP04, 0.24 g/l de KH2P04, ajustados a un pH de 7.4 20 con HCl) que contiene 5% de leche desnatada. La membrana de nitrocelulosa se incuba con anticuerpos primarios de conejo durante una hora. Posteriormente la incubación con un anticuerpo de cabra se acopló a la peroxidasa específica para el fragmento de Fc de conejo (Sigma). La revelación se llevó a cabo en presencia de H2C02, PBS y diaminobenzamidina. (La fotografía del gel no se muestra en la presente invención). 4) Materiales y métodos gue corresponden a la figura 8 La transactivación se mide con células HeLa de humano transfectadas con LTR de HIV-1 y un gen reportero para la proteína ß- galactosidasa (LacZ) de conformidad con el protocolo descrito para la figura 5. Los sueros se obtienen en conejos de conformidad con el protocolo descrito por la figura 7. Se agregan 100 µ de tres sueros anti-Tat, principalmente anti-Tat Eli, anti-Tat Oyi y anti-Tat Bru cmC en diluciones que incrementan, a un medio de cultivo celular, seguido por 100 µl de la variante Tat Eli a 1 ó 5 µM. La acumulación citoplásmica de ß-galactosidas por lo tanto depende de la presencia de Tat. Antes que nada, se observa, en la dilución del equivalente, que el suero anti-Tat Eli es el más efectivo. Esto es lógico ya que el suero contiene anticuerpos producidos contra la misma variante que aquella cuya actividad de transactivación debe investigarse para neutralizar. Sin embargo, debe enfatizarse que Tat Oyi es capaz de generar anticuerpos que neutralizan significativamente la actividad de transactivación de Tat Eli. Esta inhibición es de hecho mayor a la que se observó en particular para la dilución 1/10 utilizando el suero anti-Tat Bru cmC. Esto confirma el beneficio de los anticuerpos anti-Tat Oyi contra otras variantes de Tat. REFERENCIAS Alizon, M., Wain-Hobson, S., montagnier, L., & Sonigo, P. (1986) Cell 46, 63- 74 -Barany, G. & Merrifield, R.B. (1980) in Gross, E., & Meinhofer, J. (Eds) The peptide : Analysis, Synthesis, Biology. Academic Press, New York, Vol. 2, pp 1-284 Barre-Sinoussi, F., Chermann, J.C., Rey, F., Nugeyre, M.T., Chamaret, S., Gruest, J., Dauguet, C, Axler-Blin, C, Vezinet-Brun, F., ROUZIOUX, C, Rozenbaum, W. & Montagnier, L. (1983) Science 220, 868-871 Clavel, F. & Charneau, P. (1994) J. Virol 68, 1179-1185 Corpet, F. (1989) Nucí. Acid. Res. 22, 10881-10890 Delaporte E., Janssens W., Peeters M., Buve A., Dibanga G., Perret J.L., Ditsambou V., Mba J.R., Courbot M.C., Georges A., Bourgeois A., Samb B., Henzel D., Heyndrickx L., Fransen K., van der Groen G., Larouze B. (1996) AIDS 8, 903-910 Grégoire, C. & Loret, E.P. 1996, J. Biol. Chem. 271, 22641-22646 Huet, T., Dazza, M.C., Brun-Vezinet, F., Roelants, G.E. & Wain-Hobson, S. 1989 AIDS 3, 707-715 Jeang, K.T. (1996) in Los Alamos National Laboratory (Ed) HIV-1 Tat: Strucutre & Function Human Retroviruses & AIDS compendium. lll, pp 3-18 Jeang, K.T., Xiao, H., & Rich, E.A. (1999) J. Biol. Chem. 21 A, 28837-28840.

Le Buanec, H., Lachgar, A., Bizzini, B., Zagury, J.F., Rappaport, J., Santagostino, E., Muca-Perja, M. & Gringeri, A. 1998. Biomed. Pharmacother 10, 431-435 O'Brien, W.A., Koyanagi, Y., Namazie, A., Zhao, J.Q., Diagne, A., Idler, K., Zack, J.A. & Chen, I.S. (1990) Nature 348, 69-73 estendorp, M.O., Frank, R., Ochsenbauer, C, Stricker, K., Dhein, J., Walczak, H., Debatin, K.M. & Krammer, P.H. 1995 Nature 375, 497-500. Zhu, T., Korber, B.T., Nahmias, A.J., Hooper, E., Sharp, P.M. & Ho, D.D. (1998) Nature 391 , 594-597

Claims (8)

í ?fc ,.- NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una vacuna anti-VIH-1 que comprende toda o al menos parte de al menos una proteína Tat de HIV-1 capaz de unirse a TAR e incapaz de transactivarse, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable y, en donde sea apropiado, uno o más adyuvantes de inmunidad apropiados.

2.- La vacuna de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la proteína Tat comprende entre 99 y 106 aminoácidos.

3.- La vacuna de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque es una Tat cuya secuencia de nucleótidos tiene al menos una mutación en comparación con la secuencia de nucleótidos de una Tat funcional.

4.- La vacuna de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque la mutación afecta al menos una de las cisteínas de la proteína Tat.

5.- La vacuna de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada además porque es la Tat de la variante Oyi de VIH-1 o parte de esta Tat.

6.- La vacuna de conformidad con las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada además porque es una Tat sintética química. ad con la reivindicación 6, a en una fase sólida. 8.- La vacuna de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada además porque es una Tat recombinante. 9.- La vacuna de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada además porque contiene un vector de expresión que contiene una secuencia de nucleótidos para Tat como un todo o en parte y los elementos necesarios para su expresión. 10.- La vacuna de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada además porque comprende al menos la región N-terminal y/o la región básica de la secuencia de Tat. 11.- La vacuna de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada además porque la región Arg-Gly-Asp situada en el extremo C-termínal de Tat se modifica. 12.- Un método para preparar anticuerpos policlonales anti-Tat capaces de reconocer muchas variantes de Tat, que comprende: - la inmunización de un animal al inyectar una proteína Tat o parte de esta proteína Tat combinada con un adyuvante de respuesta inmunológica, - la purificación de los anticuerpos específicos contenidos en el suero de los animales inmunizados. 13.- El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque la proteína Tat o parte de la proteína Tat utilizada en el paso de inmunización corresponde a la variante Oyi o Bru cmC. ndicación 12 ó 13, de la proteína Tat utilizada en el paso de inmunización es como se definió en la reivindicación 6. 15.- Un método para detectar la presencia de la proteína Tat o de parte de la proteína Tat en una muestra biológica, comprende: -poner dicha muestra en contacto con anticuerpos anti-Tat capaces de motivar a complejos de antígenos-anticuerpos, con muchas variantes de Tat, -determinar la presencia de los complejos de antígeno-anticuerpo. 16.- Un equipo para el diagnóstico de la infección de VIH determinando la presencia de la proteína Tat o parte de la proteína Tat en muestras biológicas, comprende: -reactivos para la preparación de un medio adecuado para la reacción inmunológica, -reactivos que permitan la detección de complejos de antígenos-anticuerpos producidos por la reacción inmunológica, -opcionalmente, una muestra biológica de referencia (control negativo) libre de antígenos, -opcionalmente, una muestra biológica de referencia (control positivo) que contenga una cantidad predeterminada de antígenos. 1

7.- El equipo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque los reactivos para preparar el medio adecuado para la reacción inmunológica comprende anticuerpos como se definió en la reivindicación 15. 1

8.- Un método para sintetizar una variante de Tat como se definió en una de las reivindicaciones 1 a 5, 10 y 11, caracterizado además ipo FMOC, preferiblemente del tipo