FR2631349A1 - Systeme de dosage immunologique a enzyme - Google Patents
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Abstract
Un système de dosage immunologique à enzyme à utiliser dans la détection et/ou la quantification des anticorps dans un échantillon, ce système comprenant : (a) un support en phase solide dont la surface qui doit être exposée à l'échantillon contenant les anticorps est revêtu de l'antigène spécifique, (b) la réaction de l'échantillon contenant les anticorps avec l'antigène lié au support, de sorte que les anticorps présents dans l'échantillon qui sont spécifiques de l'antigène lié se lient audit antigène lié, et le lavage pour éliminer l'excès d'anticorps non lié, et (c) l'incubation des anticorps liés à l'aide d'un conjugué de dosage immunologique constitué d'un récepteur actif pour l'immunoglobuline qui se lie aux anticorps liés, et d'un marqueur enzymatique actif, et le lavage par une solution aqueuse pour éliminer l'excès de conjugué non lié, et (d) le dosage de l'activité enzymatique du marqueur enzymatique par incubation à l'aide d'un substrat approprié. Un kit pour test comprenant un système de dosage immunologique à enzyme tel que défini ci-dessus.
Description
La présente invention concerne un nouveau procédé de dosage immunoLogique, les réactifs mis en oeuvre dans ce dosage et leur utilisation, et les kits pour la mise en oeuvre de ce dosage.
Plus particulièrement, la présente invention concerne un nouveau réactif pour lier et détecter les anticorps, et les kits et les procédés incorporant ledit réactif.
Les systèmes de dosage immunologique à enzyme (EIA) sont
Largement utiLises dans Le sérodiagnostic d'un grand nombre de maladies, notamment ceLles mettant en oeuvre des agents viraux. Ces systèmes de dosage présentent non seulement les nombreux avantages initiaux des systèmes de dosage radioimmunologique (RIA), mais encore sont plus faciles, plus sûrs et plus économiques que Les systèmes RIA. Bien que le système EIA offre un potentiel pour le test sérologique de haute qualité, il n'a pas été exploite jusqu'à présent à un degré étendu Un tel test doit être idéalement rapide, économique, simple à conduire et à interpréter, doit utiliser des réactifs robustes et être sur à mettre en oeuvre à l'extérieur du laboratoire.Aucune configuration du système EIA présentement disponible ne satisfait à tous ces critères.,
Un certain nombre d'enzymes a été largement utilisé dans le système EIA incluant La peroxydase du raifort, la phosphatase alcaline et la p-galactosidase. Toutefois, de nombreux rapports récents (Yolken et al., J. Imm. Methods 73, 109-123, 1984 ; Wagla et al., Indian J. Med.Res. 81, 275-280, 1985) présentent la p-lactamase comme un marqueur pour Les dosages immunologiques à enzyme (EIA). Sa grande disponibilité, son bas prix, sa vitesse de renouvellement élevée à La température ambiante, son substrat sur et son absence totale des tissus de mammifères, La comparent favorablement avec Le coût élevé, la di.sponibilité Limitée et les substrats potentiellement carcinogènes d'autres systèmes enzymatiques. De même, L'activité de La p-lactamase peut etre déterminée visuellement par la vitesse de décoloration du complexe alcool polyviny Lique (PVA)/iode bleu foncé que à l'ioduration de L'acide pénicilloique, Le produit final de lthydrolyse de la pénicitline par la p-lactamase.
Largement utiLises dans Le sérodiagnostic d'un grand nombre de maladies, notamment ceLles mettant en oeuvre des agents viraux. Ces systèmes de dosage présentent non seulement les nombreux avantages initiaux des systèmes de dosage radioimmunologique (RIA), mais encore sont plus faciles, plus sûrs et plus économiques que Les systèmes RIA. Bien que le système EIA offre un potentiel pour le test sérologique de haute qualité, il n'a pas été exploite jusqu'à présent à un degré étendu Un tel test doit être idéalement rapide, économique, simple à conduire et à interpréter, doit utiliser des réactifs robustes et être sur à mettre en oeuvre à l'extérieur du laboratoire.Aucune configuration du système EIA présentement disponible ne satisfait à tous ces critères.,
Un certain nombre d'enzymes a été largement utilisé dans le système EIA incluant La peroxydase du raifort, la phosphatase alcaline et la p-galactosidase. Toutefois, de nombreux rapports récents (Yolken et al., J. Imm. Methods 73, 109-123, 1984 ; Wagla et al., Indian J. Med.Res. 81, 275-280, 1985) présentent la p-lactamase comme un marqueur pour Les dosages immunologiques à enzyme (EIA). Sa grande disponibilité, son bas prix, sa vitesse de renouvellement élevée à La température ambiante, son substrat sur et son absence totale des tissus de mammifères, La comparent favorablement avec Le coût élevé, la di.sponibilité Limitée et les substrats potentiellement carcinogènes d'autres systèmes enzymatiques. De même, L'activité de La p-lactamase peut etre déterminée visuellement par la vitesse de décoloration du complexe alcool polyviny Lique (PVA)/iode bleu foncé que à l'ioduration de L'acide pénicilloique, Le produit final de lthydrolyse de la pénicitline par la p-lactamase.
La synthèse d'un conjugué d'une enzyme avec une molécule qui réagit spécifiquement avec Les immunoglobulines offre une application étendue. Des rapports antérieurs ont décrit la liaison par covalence de la ss-lactamase avec les anticorps polyclonaux, les anticorps monoclonaux et l'avidine et l'utilisation de ces conjugués de protéines enzymatiques dans les systèmes EIA (Yolken et coll., J. Imm. Methods 73, 109-123, 1984, Wagle et coll., Indian
J. Med. Res 81, 275-280, 1985). Toutefois, un conjugué d'une enzyme avec la protéine de staphylocoque A ou la protéine de streptocoque
G, qui se lie spécifiquement à la région Fc des immunoglobulines provenant d'un grand nombre d'espèces, pourrait fournir un outil universel pour la détection de ces anticorps.De plus, les conjugués de -lactamase/protéine A ou G retiennent une affinité significative pour les quatre sous-classes de IgG humaines. Bien que ces deux protéines se Lient spécifiquement à la région Fc des immunoglobulines, elles n'entravent pas la capacité desdites immunoglobulines à se lier à un antigène. En outre, la ss-lactamase peut être liée à la protéine A ou à la protéine G pour donner des conjugués qui retiennent une proportion significative- de leur activité enzymatique et immunologique.
J. Med. Res 81, 275-280, 1985). Toutefois, un conjugué d'une enzyme avec la protéine de staphylocoque A ou la protéine de streptocoque
G, qui se lie spécifiquement à la région Fc des immunoglobulines provenant d'un grand nombre d'espèces, pourrait fournir un outil universel pour la détection de ces anticorps.De plus, les conjugués de -lactamase/protéine A ou G retiennent une affinité significative pour les quatre sous-classes de IgG humaines. Bien que ces deux protéines se Lient spécifiquement à la région Fc des immunoglobulines, elles n'entravent pas la capacité desdites immunoglobulines à se lier à un antigène. En outre, la ss-lactamase peut être liée à la protéine A ou à la protéine G pour donner des conjugués qui retiennent une proportion significative- de leur activité enzymatique et immunologique.
Le concept de ltutilisation de la protéine A ensemble avec la ss-lactamase dans un système de dosage immunologique à enzyme a été présenté par Ambedkar et coll. (Hindustan Antibiotics Bulletin 29, 4-5, 1987) et Citri demande de brevet israélien nO 80313 déposée le 15 octobre, 1986).
La présente invention concerne un nouveau système EIA qui utilise une protéine de liaison de l'immunoglobuline conjuguée à une enzyme appropriée pour La détection et/ou la quantification des anticorps vis-à-vis d'un ou plusieurs antigènes spécifiques dans un échantillon. Le système EIA met en oeuvre :: (a) un support en phase solide, dont la surface qui doit être expo
sée à l'échantillon contenant L'anticorps, est revêtu de
L'antigène spécifique, (b) la réaction de L'échantillon contenant L'anticorps avec L'anti
gène Lié au support, de sorte que les anticorps présents dans
l'échantillon qui sont spécifiques de l'antigène lié se lient
audit antigène lié,
et le lavage pour éliminer l'excès d'anticorps non liés, et (c) L'incubation de L'anticorps lié à l'aide d'un conjugué de
dosage immunologique constitué d'un récepteur actif pour
L'immunoglobuline qui se lie à l'anticorps lié, et d'un
marqueur enzymatique actif,
et le lavage par une solution aqueuse pour éliminer l'excès de
conjugué non lié, et (d) Le dosage de l'activité enzymatique du marqueur enzymatique par
incubation avec un substrat approprié, par exemple, un
substrat qui conduit à un changement de couleur visible d'un
réactif approprié, dans lequelleconju3ué enylhatique est un
marqueur enzymatique pour L'immunoglobuline liée et indique la
présence de l'anticorps.
sée à l'échantillon contenant L'anticorps, est revêtu de
L'antigène spécifique, (b) la réaction de L'échantillon contenant L'anticorps avec L'anti
gène Lié au support, de sorte que les anticorps présents dans
l'échantillon qui sont spécifiques de l'antigène lié se lient
audit antigène lié,
et le lavage pour éliminer l'excès d'anticorps non liés, et (c) L'incubation de L'anticorps lié à l'aide d'un conjugué de
dosage immunologique constitué d'un récepteur actif pour
L'immunoglobuline qui se lie à l'anticorps lié, et d'un
marqueur enzymatique actif,
et le lavage par une solution aqueuse pour éliminer l'excès de
conjugué non lié, et (d) Le dosage de l'activité enzymatique du marqueur enzymatique par
incubation avec un substrat approprié, par exemple, un
substrat qui conduit à un changement de couleur visible d'un
réactif approprié, dans lequelleconju3ué enylhatique est un
marqueur enzymatique pour L'immunoglobuline liée et indique la
présence de l'anticorps.
La présente invention ournit donc un réactif de dosage immunologique pour lier et détecter les anticorps, ledit réactif comprenant un récepteur actif pour l'immunoglobuline et un marqueur enzymatique actif.
De plus, la méthode de dosage par Liaison spécifique conformément à La présente invention peut être appliquée à La détection et/ou à La quantification d'un haptène ou d'un antigène dans un échazilLon, constitué d'un miLieu Liquide, par un dosage immunologique du type "sandwich" selon lequel l"'anticorps de capture" est immobilisé sur la surface solide pour capter lthaptène ou l'antigène présent dans l'échantillon. Un "second" anticorps vis-à-vis de L'haptène ou de l'antigène est ensuite appliqué pour former un "sandwich", et la liaison de ce second anticorps peut être révélée par incubation à L'aide du récepteur d'immunoglobuline marqué enzymatiquement (par exemple protéine G/protéine A) et par détermination de L'activité enzymatique (comme dans les étapes (c) et (d) mentionnées ci-dessusl. La seule condition requise de cette méthode est que le récepteur de liaison de l'immunoglobuline marqué enzymatiquement ne se Lie pas à L'anticorps de capture.
Cette condition requise peut être satisfaite en utilisant des anticorps de capture qui ne se lient pas au récepteur de liaison de l'immunoglobuline (par exemple dans le cas de la protéine G, on utilise l'IgM et dans le cas de la protéine A, on utilise l'IgY provenant du sérum de poulet ou du jaune d'oef.
Une méthode alternative pour la détection et/ou la quantification de l'haptène ou de l'antigène dans un échantillon constitué d'un milieu liquide, consiste à ajouter audit échantillon un anticorps spécifique de l'haptène ou de L'antigène à détecter, et à incuber le mélange réactionnel au contact d'un support solide à la surface duquel est fixe le même haptène ou antigène à doser.
La quantité d'anticorps disponible pour la liaison à L'haptène ou à
L'antigène fixé sur la surface solide est proportionnellement réduite. Apres séparation dudit échantillon du support solide par rinçage par une solution aqueuse, les étapes (c) et (d) décrites ci-dessus sont conduites et l'activité enzymatique est inversement proportionnelle à la concentration en haptène ou en antigène dans l'échantillon. Par comparaison avec une série d'échantillons de référence ayant des concentrations standards connues en haptène ou en antigène, il est possible de calculer la concentration en haptène ou en antigène dans L'échantiLlon.
L'antigène fixé sur la surface solide est proportionnellement réduite. Apres séparation dudit échantillon du support solide par rinçage par une solution aqueuse, les étapes (c) et (d) décrites ci-dessus sont conduites et l'activité enzymatique est inversement proportionnelle à la concentration en haptène ou en antigène dans l'échantillon. Par comparaison avec une série d'échantillons de référence ayant des concentrations standards connues en haptène ou en antigène, il est possible de calculer la concentration en haptène ou en antigène dans L'échantiLlon.
Un autre objet de la présente invention est de fournir un système EIA autonome sous la forme d'une configuration en kit. La configuration en kit consiste en une seringue àu en un système capillaire spécialement dessiné, qui, pris ensemble avec le conjugué d'enzyme-protéinede liaison de l'immunoglobuline, fournit un test rapide autonome qui est bon marché, facile à utiliser, ne requiert aucun instrument, met en oeuvre un nombre minimum d'étapes, est lisible visuellement, est à jeter après usage, minimise le contact avec Les échantillons et les réactifs, et satisfait généralement à tous les critères pour un test rapide.
Les protéines de liaison de L'immunoglobuline qui peuvent être conjuguées à l'enzyme de EIA incluent tous Les immunoréactifs qui peuvent être conjugués à ladite enzyme. Les immunoréactifs appropriés incluent les suivants : immunoglobulines, avidine, biotine et d'autres protéines de liaison de l'immunoglobuline, par exemple la protéine L du Peptococcus magnus qui a une forte affinité pour les chaines Légères d'immunoglobulines (Lars Bjorck et col., J. Imm. Methods 140(4), 1194, 1988). Les protéines de liaison de L'immunoglobuline préférées qui peuvent être utilisées conformément à la présente invention comprennent la protéine A et la protéine G, plus préférablement la protéine G.
Les enzymes appropriées pour L'EIA sont celles qui fournissent une détection du point final visuel par réaction avec des substrats de réactifs colorés pour donner un changement de couleur clairement visible et distincte. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la p-lactamase est L'enzyme conjuguée qui catalyse l'hydrolyse de la pénicilline en acide pénicilloique dont la présence est indiquée par un changement de couleur distinct des solutions de PVA/iode ou d'amidon/iode.
Le système EIA décrit ici peut être utilisé pour La detec- tion des anticorps de n'importe quel antigène, en particulier, des antigènes viraux ou bactériens. Ce système peut également convenir pour la détection des maladies mycosiques ou parasitaires, des maladies d'autoimmunité, du venin de serpent, des composants du sérum, des stéroides, des hormones ou de tout autre agent qui se trouve dans les fluides biologiques pour lesquels te système EIA conventionnel est insuffisant. Les fluides biologiques incluent le sang complet, le sérum, le plasma, la salive et les fluides cérébraux spinaux.Ainsi, les antigènes qui peuvent être appliqués sur le support en phase solide peuvent inclure ceux dérivés du virus de
L'hépatite B, du virus de la rubéole, du virus de Epstein-Barr, du cyto-mégalovirus et du virus d'immunodéficience humaine CHIV).
L'hépatite B, du virus de la rubéole, du virus de Epstein-Barr, du cyto-mégalovirus et du virus d'immunodéficience humaine CHIV).
Les supports en phase solide qui peuvent être utilisés incluent n'importe quel support de Liai son d'antigène approprié, en particulier tes systèmes capillaires et les seringues, incluant les systèmes à jeter après emploi, qui permettent de conduire le dosage conformément à L'invention et qui sont également susceptibles de donner une détection du point final usuel.
Les avantages du système EIA conformément à La présente inventin incluent Les suivants : 1. la décoloration du PVA/iode par le conjugué protéine G-p-lactamase se compare bien avec d'autres systèmes de détection du point de vue sensibilité.
2. La préparation du conjugué est simple et peu coûteuse.
3. La ss-lactamase a un taux de renouvellement élevé, un prix bas et est absente dans les tissus de mammifères.
4. Des rapports indiquent que les conjugués sont stables pendant de longues périodes de temps, c'est-å-dire d'au moins une année (IgG/p-Lactamase, Wagle et coll. 1985 et Protein A/alkaline phosphatase, Paln et coll. 1981), indiquant un Long stockage possible des conjugués de protéine G- et de protéine A-ss-lactamase et éventuellement d'autres conjugués.
5. Possibilité de dosage à site alternatif, ledit dosage étant autonome, rapide et facile à conduire, comportant peu d'étapes, utilisant des réactifs robustes, non toxiques qui peuvent -être jetés en toute sécurité et donnant des résultats-visuels rapides faciles à interpréter.
6. La possibilité de conduire des tests multiples en un seul système, les mêmes témoins étant inclus dans le système quel que soit L'antigène de revêtement.
On décrira L'invention en plus ample détail en référence à des modes de réalisation préférés, afin de rendre L'invention totalement compréhensible. En particulier, la description suivante décrit l'invention développée spécifiquement pour détecter les anticorps du HIV. Toutefois, l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation préférés décrits ici et doit couvrir toutes les variantes, les modifications et les équivalents, lesquels sont inclus dans le cadre de l'invention tel que défini par les revendications ci-jointes.
Les protocoles et Les exemples suivants, qui incluent les modes de réalisation préférés, servent à illustrer la mise en pratique de la présente invention et sont donnés seulement pour présenter la description de procédé la plus utile ainsi que Les principes et les aspects conceptuels de La présente invention.
Revêtement d'antigène sur des supports en phase solide
Les supports en phase solide sont revêtus pendant une nuit par 10 pg/ml de copolymère au hasard de L-Lysine, de L-phénylalanine (PLP, Cat. nO P 3150, Sigma Chemical Co.), dans L'eau distillée, rincés par une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et activés pendant 24 h par 1 X de glutaraldéhyde (Cat. n G 6257,
Sigma Chemical Co.) dans du PBS. Les supports sont rincés par du
PBS et ensuite revêtus pendant une nuit par 50-100 pg/ml de lysat viral entier dans du NaHC03, 0,1 M, à pH 9,6 ou avec 100 pg/ml de peptides synthétiques dans une solution saline tamponnée au borate (BBS) à pH 8,4. Les supports témoins sont revêtus du tampon seul.
Les supports en phase solide sont revêtus pendant une nuit par 10 pg/ml de copolymère au hasard de L-Lysine, de L-phénylalanine (PLP, Cat. nO P 3150, Sigma Chemical Co.), dans L'eau distillée, rincés par une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et activés pendant 24 h par 1 X de glutaraldéhyde (Cat. n G 6257,
Sigma Chemical Co.) dans du PBS. Les supports sont rincés par du
PBS et ensuite revêtus pendant une nuit par 50-100 pg/ml de lysat viral entier dans du NaHC03, 0,1 M, à pH 9,6 ou avec 100 pg/ml de peptides synthétiques dans une solution saline tamponnée au borate (BBS) à pH 8,4. Les supports témoins sont revêtus du tampon seul.
Un procédé de revêtement alternatif peut comprendre le mélangeage de la protéine ou du peptide Cl mg/ml dans du PBS, à pH 6,4) avec le PLP (1 mg/ml dans l'eau distillée) et ensuite L'addition de 100 ug de l-éthyl-3-C3-diméthylaminopropyl).-carbodiinide (EDAC,
Cat. n E 6383, Sigma Chemica-l Co., ou un agent de réticulation similaire quelconque) fraîchement dissous, L'incubation pendant 6 h à 250C puis dilution de 1 à 10 dans du PBS et le revêtement des surfaces pendant une nuit.
Cat. n E 6383, Sigma Chemica-l Co., ou un agent de réticulation similaire quelconque) fraîchement dissous, L'incubation pendant 6 h à 250C puis dilution de 1 à 10 dans du PBS et le revêtement des surfaces pendant une nuit.
Après l'application du revêtement d'antigène, les supports en phase solide sont revêtus de blanc Coffee à î X (non-lacte) ou de BLOTTO à 1 x (poudre de lait écrémé) (Johnson et coll. Gene
Anal. Techn. 1, 3-8, 1984) dans du PBS pour bloquer La liaison non spécifique des protéines durant l'EIA. Toutefois, le sérum du foetus de veau, la gélatine ou un mélange des protéines précitées peut fournir des solutions alternatives appropriées.
Anal. Techn. 1, 3-8, 1984) dans du PBS pour bloquer La liaison non spécifique des protéines durant l'EIA. Toutefois, le sérum du foetus de veau, la gélatine ou un mélange des protéines précitées peut fournir des solutions alternatives appropriées.
Conjugaison de proteine G-ss-lactamase (Yolken et coll., J. Imm.
Methods 73, 109-23, 1984).
La protéine G est fournie par la firme Pharmacia et la plactamase (EC 3.5.2.6) est fournie par Sigma Chemical Co. (Cat.
n P 0389). La lactamase est dialysée contre trois changements d'eau distillée à 40C. Un rapport molaire de 4:1 ou de 2:1 de la lactamase à la protéine G est conjugué via le glutaraldéhyde : 2,13 mg de lactamase dans 0,5 ml de PBS 0,1 M sont ajoutés à 0,65 mg de protéine G (2 : 1) ou à 0,33 mg de protéine G (4 : 1), et 0,025 ml de glutaraldéhyde à 1 % est ajouté goutte à goutte à la solution. Après l'incubation pendant 2 h à La température ambiante, la solution est dialysée contre trois changements de PBS, à pH 7,4.
La purification des conjugués par chromatographie à exclusion de gel ne conduit- pas à un accroissement de La sensibilité de la réaction comparativement aux conjugués non purifiés (Yolken et collez vraisemblablement en raison du taux élevé-d1incorporation dans le conjugué.
Réactif de détection du point final
La pénicilline G (benzylpénicilline, PEN-K, Sigma Chemical
Co.) ou la pénicilline V (acide phénoxymethyl-penicilLinique, Cat.
La pénicilline G (benzylpénicilline, PEN-K, Sigma Chemical
Co.) ou la pénicilline V (acide phénoxymethyl-penicilLinique, Cat.
n P 1382, Sigma Chemical Co.) est utilisée à 5 mg/ml dans du PBS.
Le réactif substrat PVA/iode/pénicilline comprend 63 mM de KI/12 mM de I2 et 0,5 X de PVA (alcool polyvinylique, BDH, Cat. nO 30573), dans L'eau distillée. Juste avant l'utilisation, la pénicilline est ajoutée à 5 mg/ml à une dilution de 1 : 2 de réactif PVA/iode dans du PBS.
Configuration en kit
Pipettes de transfert en polyéthylène à jeter après usage CDPTP,
Style M Cat. n 223-9563, BIO-RAD)
Elles sont initialement utilisées comme un prototype de seringue. La capacité de travail de la DPTP est de 0,65 ml, le volume du cylindre étant d'environ 0,02 ml. Le dosage immunotogique est conduit dans le cylindre de la DPTP, tandis que les bulbes sont utilisés comme un réservoir pour les solutions de lavage.En bref,
Les cylindres sont revêtus d'antigène, comme décrit précédemment et subséquemment bloqués par du blanc Coffee à 1 i. Le sérum à tester, dilué par du blanc Coffee à 1 X dans -du PBS/O,OS X de tween 20, est incubé dans la DPTP et l'anti sérum non lié est éliminé par lavage par plusieurs volumes de PBS/tween. Après incubation à l'aide du conjugué de protéine G/ss-lactamase, le conjugué non lié est éliminé par lavage à L'aide de PBS/tween. La présence de l'anticorps est indiquée par la décoloration du substrat de PVA/ iode/pénicilline d'une couleur bleue à une solution incolore.
Pipettes de transfert en polyéthylène à jeter après usage CDPTP,
Style M Cat. n 223-9563, BIO-RAD)
Elles sont initialement utilisées comme un prototype de seringue. La capacité de travail de la DPTP est de 0,65 ml, le volume du cylindre étant d'environ 0,02 ml. Le dosage immunotogique est conduit dans le cylindre de la DPTP, tandis que les bulbes sont utilisés comme un réservoir pour les solutions de lavage.En bref,
Les cylindres sont revêtus d'antigène, comme décrit précédemment et subséquemment bloqués par du blanc Coffee à 1 i. Le sérum à tester, dilué par du blanc Coffee à 1 X dans -du PBS/O,OS X de tween 20, est incubé dans la DPTP et l'anti sérum non lié est éliminé par lavage par plusieurs volumes de PBS/tween. Après incubation à l'aide du conjugué de protéine G/ss-lactamase, le conjugué non lié est éliminé par lavage à L'aide de PBS/tween. La présence de l'anticorps est indiquée par la décoloration du substrat de PVA/ iode/pénicilline d'une couleur bleue à une solution incolore.
Chaque test inclut un témoin de sérum positif et négatif et une
DPTP "exempte d'antigène" pour chaque échantillon.
DPTP "exempte d'antigène" pour chaque échantillon.
Seringue jetable
Le dessin d'une seringue jetable conformément à la présente invention est illustré schématiquement à la figure unique, dans laquelle la seringue en polypropylène (5) comporte dans la partie frontale un orifice d'entree (3) et une pièce rapportée en polycarbonate (2) à travers laquelle sont moulés trois capillaires (1) (avec la possibilité de plus de 3). La qualité transparente ou translucide de la seringue et de la pièce rapportée permet une lecture facile de tout changement de couleur à l'intérieur des capillaires. Par actionnement du piston (4), le sérum, le conjugué, les solutions de lavage et le substrat/indicateur peuvent être successivement aspirés par l'orifice d'entrée (3) à travers les capillaires revêtus d'antigène (1) de la pièce rapportée (2) et se rassemblent derrière la pièce rapportée dans le cylindre (6) de La seringue.On envisage qu'une seringue de 10 ml est nécessaire pour avoir un volume adéquat pour tous les réactifs. Les avantages de ce système est que, à part le fait d'être autonome et facile à se défaire, le témoin positif, Le témoin négatif et le sérum à tester peuvent être incorporés dans La même seringue : Le témoin positif peut comprendre un capillaire revêtu d'immunoglobuline tandis que Le témoin négatif sera exempt d'antigène. Il est également possible d'utiliser la seringue dans un système multi-test avec un certain nombre de capillaires revêtus de différents antigènes, par exemple d'antigènes de surface de L'hépatite B et de
HIV, ou des témoins positifs et négatifs sont utilisés pour ce qui est à tester.
Le dessin d'une seringue jetable conformément à la présente invention est illustré schématiquement à la figure unique, dans laquelle la seringue en polypropylène (5) comporte dans la partie frontale un orifice d'entree (3) et une pièce rapportée en polycarbonate (2) à travers laquelle sont moulés trois capillaires (1) (avec la possibilité de plus de 3). La qualité transparente ou translucide de la seringue et de la pièce rapportée permet une lecture facile de tout changement de couleur à l'intérieur des capillaires. Par actionnement du piston (4), le sérum, le conjugué, les solutions de lavage et le substrat/indicateur peuvent être successivement aspirés par l'orifice d'entrée (3) à travers les capillaires revêtus d'antigène (1) de la pièce rapportée (2) et se rassemblent derrière la pièce rapportée dans le cylindre (6) de La seringue.On envisage qu'une seringue de 10 ml est nécessaire pour avoir un volume adéquat pour tous les réactifs. Les avantages de ce système est que, à part le fait d'être autonome et facile à se défaire, le témoin positif, Le témoin négatif et le sérum à tester peuvent être incorporés dans La même seringue : Le témoin positif peut comprendre un capillaire revêtu d'immunoglobuline tandis que Le témoin négatif sera exempt d'antigène. Il est également possible d'utiliser la seringue dans un système multi-test avec un certain nombre de capillaires revêtus de différents antigènes, par exemple d'antigènes de surface de L'hépatite B et de
HIV, ou des témoins positifs et négatifs sont utilisés pour ce qui est à tester.
Contrairement à la DPTP qui nécessite la prise et l'éva- cuation du sérum à tester, des solutions de lavage et du conjugué, le système à seringue est basé sur la prise des réactifs précités dans une seule direction, c'est-à-dire, dans Le cylindre de la seringue, qui peuvent être ensuite jetés en toute sécurité à la fin du test. Un système à rochet peut être envisagé pour délivrer des volumes fixes, mais ceci augmente le coût de production et n'est pas essentiel. Toutefois, la seringue peut etre facilement modifiée pour permettre au piston de se déplacer dans une seule direction, ce qui élimine le problème de refluement.
Des temps d'incubation minimaux et des volumes de Lavage minimaux doivent être estimés en vue de satisfaire aux conditions requises d'un test rapide. Ceci comporte l'optimisation des dilutions de sérum et de conjugué et La réalisation des conditions de revêtement à saturation sans compromettre la sensibilité et la spé cificité du dosage. La préparation du conjugué doit être contrôlée séverement pour assurer une uniformité entre les fournées.
Les exemples qui suivent sont donnés pour illustrer les procédés et l'appareil décrits ci-dessus. Le protocole décrit ciaprès est utilisé pour tous les exemples et inclut Les témoins négatifs (sans antigène) et les témoins positifs (activité anticorps connue par les techniques standards ELISA) 1. Incubation avec du sérum à diverses dilutions dans du blanc Coffee à 1 X dans du PBS/tween pendant 5 min à 250C.
2. Lavage avec du PBS/tween.
3. Incubation avec le conjugué protéine G-ss-lactamase à diverses dilutions dans du blanc Coffee à 1 X dans du PBS/tween pendant 5 min à 250C.
4. Lavage par du iBS/tween.
5. Incubation avec le substrat PVA/iode/pénicilline.
6. Mesure du temps pour le changement de coloration du bleu foncé à une couleur claire, indiquant une réaction positive.
Exemple 1
DPTP - Du sérum provenant d'un donneur ayant un titre élevé contre le toxoide de tétanos (T/T) est dilué à 1 : 1 avec du blanc Coffee à 1 % dans du PBS/tween et le conjugué de lactamase est utilisé à une dilution de 1 : 1000 dans du blanc Coffee à 1 X dans du PBS/ tween. Les surfaces plastiques sont revêtues d'une dilution à 1/100 de solution de réserve de toxoide de tétanos (100Lf/ml, laboratoires de sérum du Commonwealth (CSL)) dans du PBS, à pH 7,2, pendant une nuit à 250C. Les témoins négatifs sont encore colorés en bleu foncé au bout de 72 h alors que l'échantillon testé'prend une couleur claire au bout de-4 min.
DPTP - Du sérum provenant d'un donneur ayant un titre élevé contre le toxoide de tétanos (T/T) est dilué à 1 : 1 avec du blanc Coffee à 1 % dans du PBS/tween et le conjugué de lactamase est utilisé à une dilution de 1 : 1000 dans du blanc Coffee à 1 X dans du PBS/ tween. Les surfaces plastiques sont revêtues d'une dilution à 1/100 de solution de réserve de toxoide de tétanos (100Lf/ml, laboratoires de sérum du Commonwealth (CSL)) dans du PBS, à pH 7,2, pendant une nuit à 250C. Les témoins négatifs sont encore colorés en bleu foncé au bout de 72 h alors que l'échantillon testé'prend une couleur claire au bout de-4 min.
Exemple 2
DPTP - Des sérums positifs et négatifs pour les anticorps de HIV sont testés par dilution à 1 : 1 par du blanc Coffee à 1 X dans du
PBS/tween ; L'isolat de virus-de CSL est revêtu à 50 aug/ml ; le conjugué de lactamase est utilisé à une dilution de 1 : 1000. Les témoins positifs virent à une couleur claire au bout de 5 min, tandis que les temoins négatifs virent à une couleur claire au bout de 60 min.
DPTP - Des sérums positifs et négatifs pour les anticorps de HIV sont testés par dilution à 1 : 1 par du blanc Coffee à 1 X dans du
PBS/tween ; L'isolat de virus-de CSL est revêtu à 50 aug/ml ; le conjugué de lactamase est utilisé à une dilution de 1 : 1000. Les témoins positifs virent à une couleur claire au bout de 5 min, tandis que les temoins négatifs virent à une couleur claire au bout de 60 min.
Exemple 3
DPTP - Des sérums positifs et négatifs pour les anticorps de HIV sont testés par dilution à 1 : 1 par du blanc Coffee à 1 X dans du
PBS/tween ; le peptide 2 (souche spécifique HIV1) et le peptide 5 (souche spécifique HIV2) sont revêtus comme décrits précédemment.
DPTP - Des sérums positifs et négatifs pour les anticorps de HIV sont testés par dilution à 1 : 1 par du blanc Coffee à 1 X dans du
PBS/tween ; le peptide 2 (souche spécifique HIV1) et le peptide 5 (souche spécifique HIV2) sont revêtus comme décrits précédemment.
Les témoins négatifs sont encore colorés en bleu foncé au bout de 16 h, les DPTP revêtus de HIV2 sont encore colorés en bleu foncé au bout de 16 h, indiquant L'absence de réactivité croisée entre ces épitopes ; Les DPTP revêtus de HIVI virent à une couleur claire au bout de 3 min.
Exemple 4
Seringues - Les sérums positifs et négatifs pour L'anticorps de
HIV sont testés par dilution à 1 : 1 par du blanc Coffee à 1 % dans du PBS/tween ; le peptide 2 (spécifique de HIV1) est revetu sur Les capillaires des pièces rapportées. Les témoins positifs virent au clair au bout de 3-6 min selon le titre d'anticorps des témoins individuels. Les témoins négatifs virent au clair au bout de 30 min.
Seringues - Les sérums positifs et négatifs pour L'anticorps de
HIV sont testés par dilution à 1 : 1 par du blanc Coffee à 1 % dans du PBS/tween ; le peptide 2 (spécifique de HIV1) est revetu sur Les capillaires des pièces rapportées. Les témoins positifs virent au clair au bout de 3-6 min selon le titre d'anticorps des témoins individuels. Les témoins négatifs virent au clair au bout de 30 min.
Claims (22)
1. Un système de dosage immunologique à enzyme à utiliser dans la détection et/ou la quantification d'un ou de plusieurs anticorps dans un échantillon, caractérisé en ce qutil comporte (a) un support en phase solide dont la surface qui doit etre expo
sée à L'échantillon contenant les anticorps est revêtue d'un
antigène spécifique, (b) la réaction de l'échantillon contenant les anticorps avec
l'antigène lié au support, de sorte que les anticorps présents
dans l'échantillon qui sont spécifiques de l'antigène lié se
lieront audit antigène lié, et
le lavage pour éliminer tout excès d'anticorps non Lié, et (c) L'incubation de L'anticorps lié à l'aide d'un conjugué de
dosage immunologique constitué d'un récepteur actif pour
l'immunoglobuline qui lie L'anticorps lié et d'un marqueur
enzymatique actif, et
le lavage par une solution aqueuse pour éliminer L'excès de
conjugué non lié, et (d) le dosage de L'activité enzymatique du marqueur enzymatique par
incubation à L'aide d'un substrat approprie.
2. Un système de dosage immunologique à enzyme selon la revendication 1, caractérisé en ce que le support en phase solide consiste en capillaires ou en seringues.
3. Un système de dosage immunologique à enzyme selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit récepteur actif pour l'immunoglobuline est La protéine A.
4. Un système de dosage immunologique à enzyme selon la revendication 1, caractérisé en ce que Le conjugué de dosage immunologique constitué d un récepteur actif pour l'immunoglobul1ne est
La protéine G.
5. Un système de dosage immunologique à enzyme selon la revendication 1, caractérisé en ce que le marqueur enzymatique actif est la p-lactamase.
6. Un système de dosage immunologique à enzyme selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'anticorps est déterminé par L'activité enzymatique qui est indiquée par un changement de couleur distincte de la solution substrat/indicateur.
7. Un système de dosage immunologique à enzyme selon La revendication 1 ou 6, caractérisé en ce que La solution de substrat/indicateur contient les réactifs iode et alcool polyvinylique, ou iode et amidon.
8. Un système de dosage immunologique à enzyme selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste en un support en phase solide sur la surface duquel est fixé un anticorps de capture ou un haptène ou un antigène de L'anticorps spécifique qui est à doser.
9. Un système de dosage immunologique à enzyme selon la revendication 1, à utiliser pour a détection et/ou La quantification d'un haptène ou d'un antigène dans un échantillon, caractérisé en ce que sur la surface dudit support en phase solide est fixé un anticorps spécifique de l'antigène ou de t'haptène à doser, et en ce qu'un échantillon contenant l'antigène ou l'haptène à doser est incubé au contact du support en phase solide, et après lavage pour éliminer toutes les traces d'haptène ou d'antigène non lié du support solide, un second anticorps qui est spécifique dudit haptène ou dudit antigène mais qui ne se lie pas à l'anticorps de capture, est incubé au contact du support en phase solide et l'excès du second anticorps non Lié est eliminé par rinçage, de sorte que la quantité du second anticorps disponible pour la liaison au conjugué est directement proportionnelle à la concentration en haptène ou en antigène dans l'échantiLlon.
10. Un système de dosage immunologique à enzyme selon la revendication 1 à utiliser pour la détection et/ou la quantification d'un haptène ou d'un antigène dans un échantillon, caractérisé en ce que sur la surface dudit système en phase solide est fixé le même haptène ou antigène à doser, et dans l'étape (a) un anticorps spécifique dudit haptène ou antigène est ajouté à L'échantillon à tester, et comme résultat de La Liaison dudit haptène ou antigène dans ledit échantillon, la quantité d'anticorps disponible pour la liaison à l'haptène ou à l'antigène fixé sur la surface solide est proportionnellement réduite.
11. Un système de dosage immunologique à enzyme selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il contient en outre des solutions standardisées d'un anticorps spécifique à l'haptène ou à L'antigène qui est à doser.
12. Un système de dosage immunologique à enzyme selon la revendication 1, caractérisé en ce que les anticorps à détecter sont spécifiques des antigènes viraux, bactériens, mycosiques, parasitaires ou d'autoimmunité.
13. Un système de dosage immunologique à enzyme selon la revendication 1 ou 11, caractérisé en ce que les antigènes ou les peptides appliqués comme revêtement sur le support en phase solide incluent ceux dérivés du virus de l'hépatite B, du virus de la rubéole, du virus d'Epstein-Barr, du Cyto-mégalovirus, du virus d'immunodéficience humaine- (HIV).
14. Un kit pour test comprenant un système de dosage immunologique à enzyme selon la revendication 7 ou 8.
15. Un kit à utiliser pour ta détection et/ou la quantification des anticorps selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste en supports en phase solide revêtus d'un antigène spécifique ou d'un anticorps de capture, un témoin positif et un témoin négatif, et un conjugué de dosage immunologique.
16. Un kit selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il est contenu à l'intérieur d'un système clos.
17. Un kit selon-la revendication 16, caractérisé en ce que le système clos est une seringue transparente ou translucide.
18. Un kit selon la revendication 16 ou 17, caractérisé en ce que le système de dosage clos est jetable.
19. Un kit selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il est utilisé dans La détection simultanée de plusieurs antigènes spécifiques et/ou d'anticorps spécifiques.
20. Un kit selon la revendication 17, caractérisé en ce que la seringue comporte une pièce rapportée dans la partie frontale de la seringue à travers laquelle sont moulés un ou plusieurs supports en phase solide.
21. Un kit selon la revendication 20, caractérisé en ce que les solutions utilisées dans le dosage incluant l'échantillon, sont aspirées par-dessus les supports en phase solide revêtus d'antigène ou revêtus d'anticorps moulés dans La pièce rapportée et se rassemblent et sont contenues derrière la pièce rapportée dans le cylindre de la seringue.
22. Un kit selon la revendication 20 ou 21, caractérisé en ce que les supports en phase solide sont des capillaires.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AUPI823288 | 1988-05-11 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2631349A1 true FR2631349A1 (fr) | 1989-11-17 |
Family
ID=3773080
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR8906213A Withdrawn FR2631349A1 (fr) | 1988-05-11 | 1989-05-11 | Systeme de dosage immunologique a enzyme |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2631349A1 (fr) |
| WO (1) | WO1989010974A1 (fr) |
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1989
- 1989-05-10 WO PCT/AU1989/000202 patent/WO1989010974A1/fr unknown
- 1989-05-11 FR FR8906213A patent/FR2631349A1/fr not_active Withdrawn
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