FI86890C - Foerfarande foer framstaellning av arylglycidyletrar och 3-substituerade 1-alkylamino-2-propanoler - Google Patents

Description

86890

Menetelmä aryyliglysidyylieettereiden ja 3-substituoitu-jen l-alkyyliamino-2-propanolien valmistamiseksi -Förfarande för framställning av arylglycidyletrar och 3-substituerade l-alkylamino-2-propanoler 5 Tällä hakemuksella on rinnakkaishakemus n:o 86 0599, jonka nimitys on: Menetelmä 4-(2-metoksietyyli)-fenyyli-glysidyylieetterin ja/tai metoprololin valmistamiseksi 10 Tämä keksintö koskee menetelmää farmaseuttisesti aktiivisen, kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi stereo-spesifisessä muodossa 15 Ri-O-CHj-CHOH-CHj-NH-Rj (I) tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan, kuten happoadditiosuolan valmistamiseksi ja/tai kaavan II mukaisen yhdisteen valmistamiseksi stereospesifisessä 20 muodossa

Ri - O - CH2 - CH - CH2 (II) joissa kaavoissa R2 on mahdollisesti substituoitu fenyyli-ryhmä, ja R2 on 2-6 hiiliatomia sisältävä alkyyliryhmä, 25 jossa menetelmässä kaavan III mukainen yhdiste r1-o-ch2-ch=ch2 (III) saatetaan sukuun Rhodococcus. sukuun Mycobacterium. su-30 kuun Nocardia tai sukuun Pseudomonas kuuluvan bakteerin vaikutuksen alaiseksi, jolla on kyky stereoselektiivises-ti epoksoida kaavan (III) mukainen yhdiste kaavan (II) mukaiseksi yhdisteeksi siten, että saadaan ainakin 80 % painosta S-konfiguraatiota ja jossa menetelmässä ainakin 35 osaksi kaavan (II) mukainen yhdiste erotetaan ja/tai kaavan (II) mukainen yhdiste saatetaan tunnetulla tavalla reagoimaan C2-C6-alkyyliamiinin kanssa, ja/tai kaavan (I) mukainen yhdiste muutetaan sen farmaseuttisesti 86890 2 hyväksyttäväksi suolaksi.

On yleisesti tunnettua, että useat biologisesti aktiiviset yhdisteet ovat stereoisomeerien seoksena. Useimmiten näitä seoksia käytetään sellaisinaan maanviljelyn ja farmasian 5 sovellutuksissa. Pääsyynä on, että erottamiskustannukset yhä ylittävät aktiivisuuden lisääntymisessä saavutettavan potentiaalisen edun. Tavallisesti haluttu biologinen aktiivisuus on yhdellä stereoisomeerilla niin, että parhaimmillaan seoksen teho on alentunut puoleen. Kuitenkin on selvää, että nykyiset 10 farmakologistit enenevässä määrin tiedostavat seosten käytön muut seuraukset, silloin kun seoksissa on epäpuhtautena yksi tai useampi stereoisomeeri, joilla ei ole toivottua terapeuttista vaikutusta, mutta joilla voi hyvin olla muita ei-toi-vottuja fysiologisia vaikutuksia, mm. toksisuus. Eräitä esi-15 merkkejä on esitetty tässä kuvaamaan biologisen aktiivisuuden liittymistä yksittäiseen stereoisomeeriin.

Farmasian alalla useimmat beta-adrenergisesti salpaavat aineet on myyty seoksina, vaikka aktiivisuus on yhdellä stereoisomeerilla. Eräänä esimerkkinä on lääkeaine, joka tunnetaan 20 nimellä labetaloli. Sillä on yhdistynyt alfa-adrenergisesti salpaava ja beta-adrenergisesti salpaava vaikutus, jonka on osoitettu olevan peräisin kahdesta eri isomeeriparista, jotka saadaan neljän isomeerin seoksesta. N. Toda et ai. ovat esit-: täneet julkaisussa J. Pharmacol. Exp. Ther. 207, (1978) 311, 25 että (-)-metoprololi on 270 - 380 kertaa tehokkaampi kuin :: (+)-metoprololi, vaimentaen isoproterenolilla (beta-adreno- reseptori-stimulantti) aikaansaatua kaniinin sydämen ja henki-torven lihasten reaktiota.

Nykyisiä menetelmiä yksittäisten stereoisomeeristen beta-sal-30 paajien valmistamiseksi ovat tavallisesti kemialliset erottamiset tai melko pitkät kemialliset synteesit, joissa lähde-tään stereoisomeerisista prekursoreista, joita on kuvattu : esimerkiksi US-patentissa 4,408,063 ja julkaisussa J. Org.

3 86890

Chem. 4_1_, (1976) 3121 , L. M. Weinstok et al. . Siten nämä kuvatut menetelmät, joissa analogisesti valmistetaan metopro-lolin S-enantiomeeria (optisesti aktiivinen stereoisomeeri), eivät ole taloudellisesti käyttökelpoisia teollisissa sovel-5 lutuksissa. Sen tähden tämän keksinnön tarkoituksena on esittää tehokas menetelmä tällaisten stereoisomeerien valmistamiseksi, joka menetelmä voidaan suorittaa teollisessa mittakaavassa taloudellisesti kannattavalla tavalla.

Mikro-organismien kykyä muuttaa stereospesifisesti lyhytket-10 juiset alkeenit (C^C^) niitä vastaaviksi epoksialkaaneiksi kaasu/kiinteä-faasissa tai kaksi nestefaasia käsittävässä bioreaktorissa on kuvannut J. Tramper et ai. (Bioteknologian 3. eurooppalainen kongressi, Munchen, 10-14. syyskuuta, 1984). Eräs toinen esimerkki epoksialkaanien mikrobiologisesta valmis-15 tuksesta on esitetty US-patentissa 4,106,986, jossa kuvataan suoraketjuisten 1-alkeenien (C^-C2q) muuttamista 1,2-epoksi-alkaaneiksi. Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 0099609 on esitetty esimerkkejä propeenin ja 1-okteenin muuttamisesta niitä vastaaviksi epoksialkaaneiksi. Kuitenkaan substituoitu-20 jen alkeenien, kuten kaavan (III) mukaisen eetteriyhdisteen muuttamista ei voi millään tavoin johtaa näistä tunnetuista menetelmistä, joita on sovellettu ainoastaan suoraketjuisiin tai jonkin kerran haarautuneisiin alkeeneihin.

Tuloksena laajasta tutkimuksesta ja kokeilusta on nyt yllät-25 täen löydetty parannettu synteesi erityisesti kaavan (I) mukaisen yhdisteen S-enantiomeerin ja kaavan (II) mukaisen yhdisteen S-enantiomeerin valmistamiseksi, lähtemällä kaavan (III) mukaisesta yhdisteestä ja käyttämällä bakteereita, jotka ovat aktiivisia kaavan (III) mukaisen yhdisteen epoksidoin-30 nissa tuottaen kaavan (II) mukaisen yhdisteen, jossa ainakin 80% painosta on S-konfiguraatiota, jonka jälkeen ainakin osaksi kaavan (II) mukainen yhdiste erotetaan ja/tai mainittu kaavan (II) mukainen yhdiste saatetaan reagoimaan alkyyli-amiinin kanssa mainitun, kaavan (I) mukaisen yhdisteen valmis-35 tamiseksi.

4 86890

Erityisesti tämä keksintö koskee menetelmää farmaseuttisesti aktiivisen kaavan (I) mukaisen yhdisteen valmista-5 miseksi stereospesifisessä muodossa tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan, kuten happoadditiosuolan valmistamiseksi ja/tai kaavan (II) mukaisen yhdisteen valmistamiseksi stereospesifisessä muodossa, joissa kaavoissa R: on mahdollisesti substituoitu fenyyliryhmä, ja 10 R2 on 2-6 hiiliatomia sisältävä alkyyliryhmä, jossa menetelmässä kaavan (III) mukainen yhdiste saatetaan jonkin edellämainitun bakteerisuvun vaikutuksen alaiseksi, jolla on kyky stereoselektiivisesti epoksoida kaavan (III) mukainen yhdiste kaavan (II) mukaiseksi yhdisteeksi si-15 ten, että saadaan ainakin 80 % painosta S-konfiguraa- tiota, ja jossa menetelmässä ainakin osaksi kaavan (II) mukainen yhdiste erotetaan ja/tai kaavan (II) mukainen yhdiste saatetaan reagoimaan C2-C6-alkyyliamiiniryhmän kanssa, ja ainakin osaksi kaavan (I) mukainen yhdiste 20 erotetaan ja/tai muutetaan kaavan (I) mukainen yhdiste sen farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi. Mieluimmin alkyyliamiini on isopropyyliamiini tai tert.-butyyliamii-ni. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Mieluimmin Rx on 2-tolyyli-, 3-tolyyli-, 2,3-dimetyyli- 2 fenyyli-, 2-kloori-5-metyylifenyyli-, 2-allyylifenyyli-, 3 2-allyylioksifenyyli-, 2-syklopropyylifenyyli-, 2-syklo- 4 heksyylifenyyli-, 2-syklopentyylifenyyli-, 2-syanofenyy- 5 li-, 2-metoksifenyyli-, 2-metyylitiofenyyli-, 2-(tetra- 6 hydrofuran-2-yyli)-metoksifenyyli-, 4-asetamidofenyyli-, 7 4-karbamoyy1imetyy1ifenyy1i-, 4 - [ 2 - (metyy1iformyy1iami- 8 no)-etyyli]fenyyli-, 2-asetyyli-4-butyyriamidofenyyli-, 9 fenyyli-, 4-(3-sykloheksyyliureido)-fenyyli-, 4-(2-metok- 10 sietyyli)-fenyyli-, 4-(2-metoksietoksi)-fenyyli-, (2- 11 asetyyli)-bentsofuran-7-yyli-, 2,5-dikloorifenyyli-, 2-(2-propenyylioksi)-fenyyli-, 2-asetyyli-4-(3,3-dietyy-liureido)-fenyyli-, 4-[2-(syklopropyylimetoksi)-etyyli]- 5 86890 fenyyli-, (4-asetoksi-2,3,5-trimetyyli)-fenyyli-, 2-fe-noksifenyyli-, 2-(N-beta-hydroksietyylikarbamoyylimetok-5 si)-fenyyli- tai 2-(N-metyylikarbamoyylimetoksi)-fenyyli-ryhmä.

Mieluimmin tämän keksinnön mukainen menetelmä suoritetaan lähtemällä kaavan (III) mukaisesta yhdisteestä, jossa 10 tarkoittaa 4-(2-metoksietyyli)-fenyyliä, 2-allyylioksi-fenyyliä, 4-karbamoyylimetyylifenyyliä tai fenyyliä ja vielä mieluimmin lähtemällä yhdisteestä, jsosa Rx tarkoittaa 4-(2-metoksietyyli)-fenyyliä. Edullisessa suoritusmuodossa menetelmä suoritetaan sillä tavalla, että valit-15 semalla sopivat bakteerit, muodostuu ainakin 90 % painosta S-konfiguraatiota.

Sukuihin Rhodococcus. Mycobacterium. Nocardia ja Pseudomonas kuuluvat bakteerit on mahdollisesti immobilisoitu 20 polymeerigeelillä. Bakteereihin, jotka epoksidoivat 4-(2-metoksietyyli)-fenyyliallyylieetterin, kuuluvat seuraa-vien lajien viljelmät Nocardia corallina (esimerkki tästä lajista on tallennettu ATCC:hen talletusnumerolla 31338), Rhodococcus sp. (esimerkki tästä lajista on tallennettu 25 NCIB:hen talletusnumerolla 11277), Mycobacterium rhodo-chrous (esimerkki tästä lajista on tallennettu NCIB:hen talletusnumerolla 9703), Rhodococcus eaui (esimerkki tästä lajista on tallennettu NCIB:hen talletusnumerolla 12035), Pseudomonas aeruginosa (esimerkki tästä lajista 30 on tallennettu NCIB:hen talletusnumerolla 12036), Pseudomonas oleovorans (esimerkki tästä lajista on tallennettu ATCCrhen talletusnumerolla 29347), Pseudomonas putida (esimerkki tästä lajista on tallennettu NCIBihen talletusnumerolla 9571) ja Pseudomonas aeruginosa (esimerkki 35 tästä lajista on tallennettu NCIBrhen talletusnumerolla 8704).

6 86890

Bakteereihin, jotka epoksidoivat fenyyliallyyli-eetterin, kuuluu Mycobacterium WMI-laiin viljelmä (esimerkki tästä 5 lajista on tallennettu NCIB:hen talletusnumerolla 11626).

Bakteereihin, jotka epoksidoivat 4-allyylioksifenyy-liasetamidin, kuuluu Pseudomonas oleovorans-laiin viljelmä (esimerkki tästä lajista on tallennettuu ATCC:hen 10 talletusnumerolla 29347).

Käytännössä tämän keksinnön mukaisen menetelmän edullisessa suoritusmuodossa bakteeri, jolla on kyky muuttaa 4-(2-metoksietyyli)-fenyyliallyylieetteri 4-(2-metoksietyy-15 li)-fenyyliglysidyylieetteriksi siten, että saadaan aina kin 90 % painosta S-konfiguraatiota, on valittava edellä mainituista bakteereista, sitä on viljeltävä 0,5 - 10 päivää, jonka jälkeen bakteerisolut kerätään viljely-liuoksesta, solut suspendoidaan nestemäiseen ravintoalus-20 taan ja 4-(2-metoksietyyli)-fenyyliallyylieetteri saatetaan kosketukseen solujen kanssa.

Bakteereita, joita käytetään tässä keksinnössä ja joilla on epoksidointiaktiivisuus, on viljeltävä noin 0,5 - 10 25 päivää, jonka jälkeen solut suspendoidaan nestemäiseen ravintoalustaan mieluimmin nestemäiseen minimaaliravinto-alustaan ja kaavan (III) mukainen yhdiste saatetaan kosketukseen solujen kanssa. Edellä mainitun noin 0,5 - 10 päivän viljelyn jälkeen solut voidaan eristää viljely-30 alustasta ennen kuin ne suspendoidaan nestemäiseen mini-maaliravintoalustaan. Kaavan (III) mukaisen yhdisteen stereoselektiiviseen epoksidointiin käytettyjen bakteerien kasvattamiseen voidaan käyttää tavallisia viljely-alustoja, jotka sisältävät assimiloituvan hiililähteen 35 (esimerkiksi glukoosin, laktaatin, hiilihydraatteja, kuten tetradekaanin (C14), jne), typpilähteen (esimerkiksi ammoniumsulfaatin, ammoniumnitraatin, ammoniumkloridin, 7 86890 jne.) ja lisäksi orgaanisen ravintolähteen sisältävän aineen (esimerkiksi hiivauutteen, mallasuutteen, pepto-5 nin, lihauutteen, jne.) ja epäorgaanisen ravintolähteen (esimerkiksi fosfaatin, magnesiumin, kaliumin, sinkin, raudan ja pieniä määriä muita metalleja). Mahdollisesti viljelyalustaan lisätään indusoiva aine (esimerkiksi dietoksimetaani). Bakteerien kasvatuksen aikana lämpötila 10 pidetään 0-45°C:ssa ja pH välillä 3,5-9. Mieluimmin bakteerit kasvatetaan lämpötilassa, joka on 20-37°C ja pH on 5-8.

Aerobiset olosuhteet, jotka tarvitaan bakteerien kasvun 15 aikana, voidaan aikaansaada käyttäen mitä tahansa hyvin tunnettua menetelmää edellyttäen, että hapen syöttö on riittävä bakteerien metabolisen tarpeen tyydyttämiseksi. Tämä voidaan tehdä kaikkein helpoimmin siten, että syötetään kaasumaista happea, mieluimmin ilman muodossa. Kun 20 kaavan (lii) mukainen yhdiste muuttuu kaavan (II) mukaiseksi yhdisteeksi, bakteerit voivat olla kasvuvaiheessa käytettäessä edellä mainittua tavanomaista viljelyalus-taa. Bakteereita voidaan täydentää lisäsubstraatilla. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Mieluimmin kaavan (III) mukaisen yhdisteen muuttuessa 2 kaavan (II) mukaiseksi yhdisteeksi bakteerit voidaan 3 pitää olennaisesti kasvamattomassa vaiheessa käyttämällä 4 minimaali-viljelyalustaa. Minimaali-viljelyalustana voi 5 daan käyttää tavallista viljelyalustaa, joka tarvittaessa 6 sisältää assimiloituvan hiililähteen, (esimerkiksi glu 7 koosia, laktaattia, hiilihydraatteja, kuten tetradekaania 8 (C14), jne.), tarvittaessa typpilähteen (esimerkiksi 9 ammoniumsulfaattia, ammoniumnitraattia, ammoniumkloridia, 10 jne.), tarvittaessa orgaanisen ravintolähteen sisältävän 11 aineen (esimerkiksi hiivauutetta, mallasuutetta, pepto-nia, lihauutetta, jne.) ja tarvittaessa epäorgaanisen ravintolähteen (esimerkiksi fosfaattia, magnesiumia, 8 86890 kaliumia, sinkkiä, rautaa ja muita metalleja vähäisissä määrissä). Bakteerit voidaan pitää kasvamattomassa vai-5 heessa esimerkiksi poistamalla assimiloituva hiililähde tai typpilähde. Lämpötila pidetään tässä vaiheessa välillä 0-45°C ja pH arvossa 3,5-9. Mieluimmin bakteereita pidetään lämpötilassa, joka on 20-37°C ja pH:ssa, joka on välillä 5-8. Aerobiset olosuhteet, jotka tässä vaiheessa 10 tarvitaan, voidaan aikaansaada edellä mainituilla menetelmillä, edellyttäen, että hapen syöttö on riittävä bakteerien metabolisen tarpeen tyydyttämiseksi ja myös kaavan (III) mukaisen yhdisteen muuttamiseksi kaavan (II) mukaiseksi yhdisteeksi. Edellä mainittujen bakteerien 15 tuottama, kaavan (II) mukainen yhdiste voidaan ottaa talteen ja puhdistaa millä tahansa hyvin tunnetulla menetelmällä.

( - ) -R,-0-CH2-CH-CH2, ( + ) -Rj-O-CHj-CH-CHj 20 \/ ''O7 tai näiden seokset, jotka valmistetaan tämän keksinnön mukaisesti, voidaan muuttaa (+ )-Ηχ-0-0Η2-0Η0Η-0Η2-ΝΗ-Η2, ( - )-R1-0-CH2-CH0H-CH2-NH-R2 tai niiden seoksiksi kemialli-25 sella reaktiolla isopropyyliamiinin tai vastaavasti tert.-butyyliamiinin kanssa. Esimerkki reaktiosta, jossa muodostetaan beta-adrenergista reseptoria salpaavat aineet, joilla on absoluuttinen (S)-konfiguraatio, lähtemällä aryyliglysidyylieettereistä, joilla on absoluutti-30 nen (S)-konfiguraatio, kuvataan saksalaisessa patenttihakemuksessa 2453324.

Erityisesti seoksia, joissa on vallitseva määrä kaavan 9 86890 (-)~R^-0-CH2~CH0H-CH2-NH-R2 mukaista yhdistettä, voidaan edullisesti käyttää farmaseuttisiin valmisteisiin. Mieluimmin voidaan farmaseuttisiin valmisteisiin käyttää sellaisia yhdisteitä, joissa ainakin 80% ja vielä mieluimmin ainakin 5 90% painosta on S-konfiguraatiota. Yhdisteet, joilla on kaa va R.|-0-CH2~CH0H-CH2~NH-R2 ovat yhdisteitä, joilla on beta-adrenergista reseptoria salpaava vaikutus, tällaisia ovat esimerkiksi tolemololi, toliprololi, D-32, bupranololi, alprenololi, oksprenololi, prokinololi, eksaprololi, penbu-10 tololi, bunitrololi, moprololi, triprenololi, bufetololi, praktololi, karatsololi, atenololi, asebutololi, propranolo-li, pamatololi, talinololi, idropranololi, dropranololi, bunololi, K 4423, USVC 6524, indenololi, pindololi, bukumo-loli, S 2395, timololi, nadololi, metorpololi, H 87/07, klo-15 ranololi, pargololi, karteololi, seliprololi, betaksololi, mepindololi, metipranololi, PHQA 33, tatsololi ja kromipra-noli tai näiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat, kuten happoadditiosuolat.

Esimerkkejä farmaseuttisesti hyväksyttävistä suoloista ovat: 20 metoprololin tartraatti, joka valmistetaan metoprololista ja L-viinihaposta, ja 1-isopropyyliamino-3-fenoksi-2-propa-nolin hydrokloridi, joka valmistetaan 1-isopropyyliamino-3-fenoksi-2-propanolista ja hydrokloridista. Mieluimmin nämä beta-adrenergista reseptoria salpaavat yhdisteet valmistetaan 25 tämän keksinnön mukaisesti ja ne valmistetaan siten, että ainakin 80 % tai mieluimmin ainakin 90 % painosta on S-kon-figuraatiossa.

Optinen puhtaus, joka mainitaan selityksessä, on esitetty prosentuaalisena enantiomeeriylimääränä: S-R/S+R.

30 Tätä keksintöä kuvaavat edelleen seuraavat esimerkit yhdessä niihin liittyvien kuvioiden kanssa, tämän keksinnön piiri ei kuitenkaan rajoitu näihin esimerkkeihin.

ίο 86 8 90

Kuvioiden lyhyt selitys:

Kuvio 1 esittää ( + )- ja (+)-4-(2-metoksietyyli)-fenyyligly-sidyylieetterin osittaista PMR-sepektriä europium - siirtymä-reagenssin läsnäollessa.

5 A: ( + ) tai (+)-4-(2-metoksietyyli)-fenyyliglysidyylieetteri ilman siirtymäreagenssia.

B: (+)-4-(2-metoksietyyli)-fenyyliglysidyylieetteri Eu(hfc) 3:n läsnäollessa suhde Eu(hfc)3/(+)-4-(2-metoksietyyli)-fenyyliglysidyylieetteri = 0,10 10 C: (+)-4-(2-metoksietyyli)-fenyyliglysidyylieetteri Eu(hfc)3: n läsnäollessa; suhde Eu(hfc)3/ (+)-4-(2-metoksietyyli)-fenyyliglysidyylieetteri = 0,12.

Kuvio 2 esittää (-)-metoprololin PMR-spektriä.

Kuvio 3 esittää (-)-metoprololin massaspektriä, joka on mää-15 ritetty C.1. (CH4):llä.

Kuvio 4 esittää fenyyliglysidyylieetterin panostuotantoa kannalla Mycobacterium WM1 kaksi-faasi systeemissä (2,25 litran mittakaava) (750 ml soluja (kuivapaino 6,9 g/1) + 1500 ml iso-oktaania, joka sisältää 2,5 % fenyyliallyyli-20 eetteriä).

Kuvio 5 esittää (-)-1-isopropyyliamino-3-fenoksi-2-propano-lin PMR-spektriä.

Kuvio 6 esittää (-)-1-isopropyyli-amino-3-fenoksi-2-propa-nolin C.I. (CH^)-spektriä.

25 Esimerkki I

4-(2-metoksietyyli)-fenyyliallyylieetterin muuttaminen ( + )-4-(2-metoksietyyli)-fenyyliglysidyylieetteriksi kannalla Rhodococcus equi NCIB 12035 n 86890

Noin puolet biomassasta, joka saatiin viljelemällä kantaa Rhodococcus equi NCIB 12035 72 tuntia 30°C:ssa tetradekaa-nilla (1 ml) ASM-mineraalisuolaalustassa (100 ml), joka sisälsi hiivauutetta (0,02 %), siirrettiin kartiomaiseen pul-5 loon (tilavuus 250 ml), joka sisälsi ASM:ää (50 ml), hiiva-uutetta (0,02 %:iin), tetradekaania (0,15 ml), oktaania (1 ml), Tween 80:tä (0,05 ml) ja 4-(2-metoksietyyli)-fenyyli-allyylieetteriä (0,05 ml). Seosta inkuboitiin 30°C:ssa kehä-ravisteli jassa ja näytteet uutettiin metyleenikloridiin en-10 nen kaasukromatografista analysointia Varian 3700-laitteella. (Kolonni: 3% VI WHP 100-120:llä, 50 cm x 2 mm sisähalk.,

100°C-200°C, 10°C/min, N2 30 ml/min). ASM sisältää NH4C1 (0,535 g/1), KH2P04 (0,531 g/1), Na2HP04 (0,866 g/1), K2S04 (0,174 g/1), MgS04 · 7H20 (0,037 g/1), CaCl2*2H20 (0,00735 g/1), 15 TK^-hivenaineita (1,0 ml/1), ja FeS04'7H20 (1,0 ml 0,1 M

liuosta/1) . TK3 sisältää ZnS04*7H20 (0,288 g/1), MnSC>4*4H20 (0,224 g/1), H3B03 (0,0618 g/1), CuS04* 5H20 (0,1248 g/1), Na2Mo04*2H20 (0,0484 g/1), CoC12*6H20 (0,0476 g/1), KI (0,083 g/1), 1 M H2S04 (1 ml/1), pH 7,0.

20 Tuotetta, (+)-4-(2-metoksietyyli)-fenyyliglysidyylieetteriä, havaittiin 48 tunnin inkuboinnin jälkeen ja sen määrä lisääntyi kunnes 96 tunnin kuluttua epoksin määrä oli noin 15 % jäljellä olevasta 4-(2-metoksietyyli)-fenyyliallyylieetteristä.

Jotta saataisiin kerättyä riittävät määrät (+)-4-(2-metoksi-25 etyyli)-fenyyliglysidyylieetteriä, viljelyliemi 10 x 50 ml:n ja 5 x 500 ml:n inkuboinneista (olosuhteet edellä kuvatut) uutettiin metyleenikloridilla (350 ml). Uute kuivattiin Na2SC>4:n päällä, liuotin haihdutettiin ja epoksidi puhdistettiin piihappogeelillä käyttäen heksaani/eetteri-gradient-30 tia (epoksidi eluoitui 30%:sella eetterillä), saatiin (+)-4-(2-metoksietyyli)-fenyyliglysidyylieetteriä (353 mg), jolla on (a)^ = +8,11° (c = 0,95, etanoli).

12 86890 (+)-4-(2-metoksietyyli)-fenyyliglysidyylieetterin optinen puhtaus tutkittiin käyttäen PMR-spektriä (protonin magneettinen resonanssispektri) europium siirtymäreagenssin Eu(hfc)3 läsnäollessa (katso Kuvio 1). Lisäämällä siirtymäreagenssia, 5 signaalivyöhykkeet kemiallisesti syntetisoidun (+)-4-(2- metoksietyyli)-fenyyliglysidyyli-eetterin kustakin geminaali-sesta protonista (merkitty (a) ja (b)) (Kuvio 1A) siirtyvät alaspäin ja jokainen jakaantui kahteen signaalivyöhykkeeseen, joilla on sama intensiteetti (Kuvio 1B, (a)+(b))). Kuitenkin 10 samoissa oloissa ainoastaan yksi signaalivyöhyke oli havaittavissa mikrobeilla tuotetun (+)-4-(2-metoksietyyli)-fenyyliglysidyylieetterin kustakin geminaalisesta protonista (Kuvio 1C, (a)+(b)). Näinollen (+)-4-(2-metoksietyyli)-fenyyliglysidyylieetterin, joka oli saatu mikrobiaalisella epoksidoinnil-15 la, optinen puhtaus määritettiin 100 %:ksif PMR-mittausten kokeellinen virhe huomioiden.

Esimerkki II

(+)-4-(2-metoksietyyli)-fenyyliglysidyylieetterin muuttaminen (-)-metoprolollksi_ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Liuosta, jossa oli (+)-4-(2-metoksietyyli)-fenyyliglysidyyli- 2 eetteriä (290 mg, katso esimerkki I) kuivassa etanolissa 3 (6,2 ml), joka sisälsi isopropyyliamiinia (1,84 ml), kuumen 4 nettiin palautusjäähdyttäen 3 tuntia, jonka jälkeen liuottimet 5 poistettiin haihduttamalla. Muodostunut öljy liuotettiin mety- 6 leenikloridiin (10 ml) ja uutettiin 0,2 N kloorivetyhappoon 7 (10 ml), joka sen jälkeen pestiin metyleenikloridilla (2 x 10 8 ml). Happokerros tehtiin emäksiseksi 2 N natriumhydroksidillä 9 (3 ml) ja tuote uutettiin metyleenikloridiin (10 ml). Metylee- 10 nikloridiuute kuivattiin Na2S0^:n päällä ja liuotin poistet- 11 tiin haihduttamalla, jolloin saatiin tahmea kiinteä aine.

12

Tuote kiteytettiin uudestaan heksaanista, jolloin saatiin 13 (-) -metoprololia (260 mg), jolla oli (a)^ = -5,46° (c = 14 1,01, etanoli) ja sul.p. 42-45°C. Kemiallisesti valmistettu 15 (+)-metoprololi (sul.p. 49-51°C) oli odotetusti optisesti 16 inaktiivinen.

13 86 890 (-)-metoprololin PMR- ja massaspektrit (Kuviot 2-3) ja (+)-metoprololin PMR- ja massaspektrit (ei esitetty) olivat rakenteeltaan vaaditun kaltaisia eikä niitä voinut erottaa metoprololi-tartraatin kaupallisesta näytteestä uutetun { + )-5 metoprololin (sul.p. 48,5-50,5°C) PMR-spektristä.

(-)-metoprololin optinen puhtaus määritettiin erottamalla sen S-leusyyli-diastereomeeriset amidijohdannaiset käänteis-faasi-HPLC-kolonnissa (Lichrosorb RP8 (10 μπι) , 25 cm x 1/4" ulkohalk., 4,9 mm sisähalk., liikkuva faasi: 40 % asetonit-10 riiliä 0,1 M Na-fosfaattipuskurissa pH 3,0, 2,5 ml/min., UV-detektio). Johdannaisesta valmistettiin saattamalla meto-prololi reagoimaan tert.-butoksikarbonyyli-S-leusiinin (BOC-S-leusiini) symmetrisen anhydridin kanssa, jonka jälkeen BOC-ryhmä poistettiin trifluorietikkahapolla, kuten on esit-15 tänyt J. Hermansson ja C. J. Von Bahr julkaisussa J. Chrom., 227, 113 (1982). (+)-metoprololista johdetun näytteen analyysissä saatiin tuloksena kaksi samankokoista piikkiä, kuten odotettiinkin rasemaatin ollessa kyseessä. (-)-metoprololista johdetun näytteen analyysissä saatiin kaksi piikkiä, joiden 20 intensiteettisuhde oli 97,7 : 2,3, vastaten 95,4 %:ista optista puhtautta.

Esimerkki III

4-(2-metoksietyyli)-fenyyliallyylieetterin muuttaminen (+)- 4- (2-metoksietyyli)-fenyyliglysidyylieetteriksi kannalla 25 Pseudomonas aeruginosa NCIB 12036, jonka jälkeen yhdiste muu-tetaan (-)-metoprololiksi___

Pseudomonas aeruginosa NCIB 12036-suspensio valmistettiin suspendoimalla uudestaan solut (jotka oli kasvatettu ASM-mineraalisuola-alustalla, joka sisälsi 0,75% Na-laktaattia '30 ja 0,05 % dietoksimetaania, kasvatusaika oli 24 tuntia ja lämpötila 30°C). ASM-alustaan tilavuuteen, joka oli 1/10 alkuperäisestä viljelytilavuudesta.

14 86890

Solususpensiota (1100 ml) inkuboitiin 4-(2-metoksietyyli)-fenyyliallyylieetterin (3,3 g) kanssa 30°C:ssa, 220 kierr./ min. 24 tunnin kuluttua reaktioseos uutettiin metyleeniklo-ridilla (500 ml), uute kuivattiin Na2SO^:llä ja liuotin 5 haihdutettiin, jolloin saatiin öljy (2,67 g). Puhdistamalla piihappogeelillä (kuten esimerkissä 1) saatiin (+)-(2-metok-sietyyli)-fenyyliglysidyyli-eetteriä (930 mg), jolla oli (a)p5 = +8,21° (c = 0,943, etanoli).

Optinen puhtaus, joka mitattiin PMR:llä europium-siirtymä-10 reagenssin Eu(hfc)3 läsnäollessa (kuten esimerkissä I), määritettiin 100 %:ksi, PMR-mittausten kokeellinen virhe huomioiden.

(+)-4-(2-metoksietyyli)-fenyyliglysidyylieetteriä (694 mg) käytettiin (menetelmä kuten esimerkissä II) valmistettaessa 15 (-)-metoprololia (579 mg), sul.p. 44-46°C, = -5,49° (=1,02, etanoli).

Optinen puhtaus määritettiin 98%:ksi (menetelmä kuten esimerkissä II). Emäliuos kiteytettiin, jolloin saatiin (-)-meto-prololia (113 mg), jonka optinen puhtaus oli 96%.

20 Esimerkki IV

4-(2-metoksietyyli)-fenyyliallyylieetterin muuttaminen (+)- 4-(2-metoksietyyli)-fenyyliglysidyylieetteriksi kannalla Pseudomonas aeruginosa NCIB 8704, jonka jälkeen yhdiste muu-tetaan (-)-metoprololiksi__ 25 Pseudomonas aeruginosa NCIB 8704-solususpensiota (valmistus esimerkissä III kuvatulla tavalla) inkuboitiin 4-(2-me-toksietyyli)-fenyyliallyylieetterin (2 g) kanssa 30°C:ssa 24 tuntia, jonka jälkeen suspensio uutettiin ja puhdistettiin (esimerkissä III esitetyllä tavalla), saatiin (+)-4-30 (2-metoksietyyli)-fenyyliglysidyylieetteriä (91 mg). Epok-sidin optinen puhtaus, joka mitattiin PMR:llä europium- 15 86890 siirtymäreagenssin Eu(hfc)3 läsnäollessa (kuten esimerkissä I), määritettiin 100%:ksi, PMR-mittausten virheet huomioiden.

(+)-4-(2-metoksietyyli)-fenyyliglysidyylieetteriä (76 mg) käytettiin (menetelmä kuten esimerkissä II) valmistettaessa 5 (-)-metoprololia (55 mg), sul.p. 42-45°C, (a)^ = -4,93° (c = 0,944, etanoli), optinen puhtaus oli 98,8 % kun se määritettiin yhdisteen S-leusyyli-diastereomeeri-johdannaisten HPLC-analyysillä (kuten esimerkissä II). Haihduttamalla emä-liuos saatiin (-)-metoprololia (17 mg), jonka optinen puh-10 taus oli 95,2 %.

Esimerkki V

4- (2-metoksietyyli)-fenyyliallyylieetterin muuttaminen (+)-4-(2-metoksietyyli)-fenyyliglysidyyli-eetteriksi kannalla Pseudomonas putida NCIB 9571, jonka jälkeen yhdiste muute-15 taan (-)-metoprololiksi_

Pseudomonas putida NCIB 9571-solususpensiota (200 ml) (valmistus) kuten esimerkissä III) inkuboitiin 4-(2-metoksietyyli)-fenyyliallyylieetterin (1 g) kanssa 30°C:ssa 24 tuntia, jonka jälkeen seos uutettiin metyleenikloridiin ja puhdistettiin 20 (kuten esimerkissä III), saatiin (+)-4-(2-metoksietyyli)- fenyyliglysidyylieetteriä (324 mg), jolla oli (a)^5 = +6,42° (c = 0,88, etanoli). Optinen puhtaus, joka mitattiin PMRsllä europium-siirtymäreagenssin Eu(hfc)3 läsnäollessa (kuten esimerkissä I), oli 100%, PMR-mittausten kokeelliset virheet 25 huomioiden.

(+)-4-(2-metoksietyyli)-fenyyliglysidyylieetteri (214 mg) kondensoitiin isopropyyliamiinin kanssa (kuten esimerkissä II), jolloin saatiin (-)-metoprololia (146 mg), sul.p. 44-46°C

(a)p^ = -5,00° (c = 1,01, etanoli). Optinen .puhtaus (menetelmä 30 kuten esimerkissä II) määritettiin 98%:ksi. Haihduttamalla emäliuos saatiin (-)-metoprololia (9 mg), jonka optinen puhtaus oli 97,5 *· 16 86890

Esimerkki VI

4-(2-metoksietyyli)-fenyyliallyylieetterin muuttaminen ( + )-4-(2-metoksietyyli)-fenyyliglysidyylieetteriksi kannalla Pseudomonas oleovorans ATCC 29347, jonka jälkeen yhdiste muu-5 tetaan (-)-metoprololiksi_

Pseudomonas oleovorans ATCC 29347-solususpensiota (200 ml) (valmistus kuten esimerkissä III) inkuboitiin 4-(2-metoksietyyli) -fenyyliallyylieetterin (2 g) kanssa 30°C:ssa 5 tuntia. Uuttamalla metyleenikloridiin ja puhdistamalla piihappogee-10 Iillä (kuten esimerkissä I) saatiin (+)-4-(2-metoksietyyli)-fenyyliglysidyylieetteriä (289 mg) jonka (a)p5 = +8,02° (c = 1,16, etanoli). Optinen puhtaus, joka mitattiin PMRsllä europium-siirtymäreagenssin Eu(hfc)3 läsnäollessa (kuten esimerkissä I), määritettiin 100 %:ksi, PMR-mittausten kokeelli-15 set virheet huomioiden.

(+)-4-(2-metoksietyyli)-fenyyliglysidyyli-eetteri (171 mg) saatettiin reagoimaan isopropyyliamiinin kanssa (menetelmä kuten esimerkissä II), jolloin saatiin (-)-metoprololia (154 mg), sul.p. 44-45°C ja (a)*5 = -5,27° (c = 0,967, etanoli). Opti-20 nen puhtaus määritettiin 98,4 %:ksi S-leusyyli-diastereomee-risten johdannaisten HPLC-analyysin perusteella (kuten esimerkissä II). Haihduttamalla emäliuos saatiin (-)-metoprololia (6 mg), jonka optinen puhtaus oli 92,2 %.

Esimerkki VII

25 4-(2-metoksietyyli)-fenyyliallyylieetterin mikrobinen muutta- minen (+)-4-(2-metoksietyyli)-fenyyliglysidyylieetteriksi_

Mineraalisuola- kasvualusta (50 ml), joka sisälsi Tween 80:tä (0,05 ml), tetradekaania (0,05 ml) ja 4-(2-metoksietyyli)-fenyyliallyylieetteriä (0,05 ml), ympättiin joko kannalla 30 Nocardia corallina ATCC 31338, kannalla Rhodococcus sp.

NCIB 11277 tai kannalla Mycobacterium rhodochrous NCIB 9703 ,7 86890 (Kaikkia esikasvatettu 72 tuntia 0,05 %:isella tetradekaa-nilla) , sen jälkeen inkuboitiin 30°C:ssa. Näytteet otettiin 24 tunnin ja 96 tunnin kuluttua uuttamalla metyleenikloridiin ja analysoimalla kaasukromatografisesti (GC).

5 Jokaisessa tapauksessa piikit, jotka vastasivat 4-(2-metoksi-etyyli)-fenyyliglysidyylieetteriä, havaittiin seuraavin muutoksin: Mycobacterium rhodochrous 2 % 24 tunnin kuluttua; Rhodococcus sp. 1 % 96 tunnin kuluttua ja Nocardia coralIina 5 % 96 tunnin kuluttua. Lisävahvistus rakenteesta saatiin, 10 kun suuremmassa mittakaavassa tehdyn kokeen, jossa käytettiin kantaa Nocardia corallina, (500 ml:n viljelmä, olosuhteet kuten edellä), sisältö uutettiin metyleenikloridiin, jonka jälkeen puhdistettiin piihappogeelillä ja suoritettiin PMR-analyysi. 4-(2-metoksietyyli)-fenyyliglysidyylieetterin PMR-15 europium-siirtymä-spektrin perusteella optinen puhtaus oli 100 % ja spektri oli identtinen Rhodococcus equi-kannalla saadun (+)-4-(2-metoksietyyli)-fenyyliglysidyylieetterin europium- PMR-spektr in kanssa.

Esimerkki VIII

20 Fenyyliallyylieetterin muuttaminen (+)-fenyyliglysidyyli-eetteriksi kannalla Mycobacterium NCIB 11626, jonka jälkeen yhdiste muutetaan (-)-isopropyyliamino-3-fenoksi-2-propano-liksi_

Olosuhteet jatkuvassa viljelyssä: kasvualustan tilavuus 2,7 25 litraa, kasvualusta: AM2 (sisältäen (NH^J^SO^ (1,45 g/1) , H3P04 (1,0 g/1), MgS04.7H20 (0,099 g/1), CaCl2.2H20 (0,015 g/1), TK3 hivenaineliuos (2 ml/1), 0,1 M FeS04.7H20 (1 ml/1).

. . Hiililähde: etyleeniä 25 ml/min, ilmaa 300 ml/min, sekoitus- nopeus: 280 kierr./min, lämpötila 28°C, pH 6,8, laimennussuh-30 de 0,02 h ^ (pmaks = noin 0,03 g ^). Näillä olosuhteilla saatiin biomassan pitoisuudeksi noin 3,2 g/1 kuivapainona. Yleensä solut konsentroitiin ennen käyttöä (sentrifugoimalla, jon- ie 86890 ka jälkeen suspendoitiin takaisin käytettyyn kasvualustaan).

Fenyyliglysidyylieetteri analysoitiin GC:llä (kolonni ja olosuhteet kuten edellä esitetyissä esimerkeissä, paitsi lämpö-tilaohjelma oli 50°C - 100°C, 10°C/min.

5 Fenyyliglysidyylieetterin tuottamiseksi käytettiin 2,25 litran pano-kaksifaasi-systeemiä. Muuttaminen suoritettiin käy-misastiassa, joka sisälsi 750 ml solususpensiota (kuivapaino 6,9 g/1) ja 1500 ml iso-oktaania, joka sisälsi 2,5 % til./til. fenyyliallyyli-eetteriä (kuvio 4). Epoksidia tuotettiin no-10 peudella, joka oli kuivapainona 193 vimol/tunti/g (kuivapaino 0,03 g/tunti/g) ja eristettiin 10 tunnin kuluttua kromatogra-foimalla piihappogeelillä, jonka jälkeen puhdistettiin tislaamalla ja saatiin (+)-fenyyliglysidyylieetteriä 750 mg).

Mikrobisesti tuotetun (+)-fenyyliglysidyylieetterin PMR-spekt- 15 ri ja massaspektri olivat rakenteeltaan vaaditunlaisia ja identtisiä (+)-fenyyliglysidyylieetterin spektrien kanssa, joka yhdiste oli valmistettu kemiallisesti saattamalla fenyy- liallyylieetteri reagoimaan m-klooriperbentsoehapon kanssa.

, ,25 (+)-fenyyliglysidyylieetterin ominaiskierto oli (aj^ = +11,38 20 (c = 1,09, etanoli).

Optinen puhtaus arvioitiin käyttäen PMRrää europium-siirtymä-reagenssin Eu(hfc)3 läsnäollessa, kuten esimerkissä I. Lisäämällä siirtymäreagenssia kemiallisesti syntetisoidun (+)-fe-nyyliglysidyylieetterin jokaisesta geminaalisesta protonista 25 muodostuvien signaalien vyöhyke siirtyy alemmaksi ja niistä jokainen jakautuu yhtä intensiivisten signaalien muodostamaksi kahdeksi vyöhykkeeksi, kun taas mikrobisesti tuotetun (+)-fenyyliglysidyylieetterin geminaalisten protonien signaalien vyöhyke pilkkoutui suhteessa 6,7:1. Tämä tulos osoit-30 taa, että 87% molekyyleistä on yhdessä enantiomeerisessa muodossa, jolloin optiseksi puhtaudeksi tulee 74 %. Mikrobisesti ja kemiallisesti tuotettujen epoksidien seosten analyysillä 19 86890 saatiin signaalisuhteet, jotka vahvistivat, että 90 % ( + )-fenyyliglysidyylieetteristä oli yhdessä enantiomeerisessa muodossa, vastaten 80 %:n optista puhtautta.

(+)-fenyyliglysidyylieetterin optisen puhtauden edelleen 5 vahvistaminen suoritettiin seuraamalla (-)-1-isopropyyliamino- 3-fenoksi-2-propanoliksi. (+)-fenyyliglysidyyli-eetteri (300 mg) saatettiin reagoimaan isopropyyliamiinin kanssa (kuten esimerkissä II), jolloin saatiin (-)-1-isopropyyliamino-3-fe-noksi-2-propanolia (125 mg), jolla oli (a)p^ = -6,51° (c = 10 0,984, etanoli), sul.p. 42-44°C.

<+)-1-isopropyyliamino-3-fenoksi-2-propanoli syntetisoitiin samalla tavalla (+)-fenyyliglysidyylieetteristä. (-)-1-iso- propyyliamino-3-fenoksi-2-propanolin PMR- ja massaspektrit (Kuviot 5-6) ja (+)-1-isopropyyliamino-3-fenoksi-2-propanolin 15 vastaavat spektrit (ei esitetty) vastasivat vaadittua rakennetta. Optinen puhtaus mitattiin vastaavien S-leusyyli-diaste-reomeeri-johdannaisten HPLC:llä (kuten esimerkissä II) ja määritettiin 80 %:ksi.

Esimerkki IX

20 4-allyylioksi-fenyyliasetamidin muuttaminen (+)-4-(2,3-epoksi-propyylioksi)-fenyyliasetamidiksi kannalla Pseudomonas oleo-vorans ATCC 29347, jonka jälkeen yhdiste muutetaan (-)-1-p-karbamoyylimetyylifenoksi-3-isopropyyliamino-2-propanoliksi ( (-)-atenonoli)_ 25 Pseudomonas oleovorans ATCC 29347-suspensio valmistettiin suspendoimalla uudestaan solut (jotka oli kasvatettu PSX-mineraalisuola-kasvualustassa, pH 7, sisältäen 0,75 % natrium-laktaattia ja 0,05 % dietoksimetaania, kasvatusaika 24 tuntia 30°C:ssa) PSX:ään pH 7,5, tilavuuteen, joka oli 1/10 alkupe-30 räisestä viljelytilavuudesta. PSX sisältää: KHjPO^ (8,92 g/1),

Na2HP04 (2,94 g/1), <NH4)2 HP04 (1,0 g/1), (NH4)2S04 (0,2 g/1), 20 86890 KCl (0,2 g/1), Na3-sitraatti (0,294 g/1), CaS04.2H20 (0,005 g/1), MgS04.7H20 (0,2 g/1), ja PS II-hivenaineliuos (10 ml/1). (PS II-hivenaineliuos sisältää: (NH4)2S04.FeS04.6H20 (0,25 g/ 1), ZnS04.7H20 (0,05 g/1), MnCl2.4H20 (0,03 g/1), CuS04.5H20 5 (0,015 g/1), CoC12.6H20 (0,015 g/1), H3B04 (0,005 g/1), Na2 Μο04·2Η20 (0,0055 g/1), KI (0,01 g/1), HC1 pH-arvoon 3).

Solususpensiota (1100 ml) inkuboitiin yhdessä 4-allyylioksi-fenyyliasetamidin (3,2 g) kanssa, joka lisättiin 10%:isena kuulamyllyllä jauhettuna suspensiona vedessä (sisältäen 5 % 10 Tween-80) , yhteentoista 2,5 litran kartionmuotoiseen pulloon kehäravistelijassa, 30°C:ssa. 72 tunnin kuluttua inkubointi-seos uutettiin metyleenikloridilla (1000 ml), liuotin kuivattiin ja haihdutettiin, jonka jälkeen jäännös kiteytettiin uudestaan asetonista, jolloin saatiin 2,27 g valkoista, kiteis-15 tä ainetta, jonka koostumuksesta 90 % oli 4-allyylioksifenyyli-asetamidia ja 10 % 4-(2,3-epoksipropyylioksi)-fenyyliasetami-dia, mikä osoitettiin HPLCrllä (kolonni: Lichrosorb RP8 (10 pm) 25 x 1/4" ulkohalk., 4,9 mm sisähalk., liikkuva faasi 40 % asetonitriiliä vedessä, 2 ml/min., UC-detektio).

20 Kiteytynyt uute, joka sisälsi noin 230 mg 4-(2,3-epoksi- propyylioksi)-fenyyliasetamidia, liuotettiin kuivaan etanoliin (40 ml) jonka jälkeen kuumennettiin palautusjäähdyttäen isopro-pyyliamiinin (2,5 ml) kanssa 5 tuntia, sen jälkeen ylimääräinen liuotin haihdutettiin. Jäännös liuotettiin metyleeniklori-25 diin (50 ml) ja uutettiin 3 x 50 ml 0,2 N kloorivetyhappoa. Happokerrokset yhdistettiin, pestiin metyleenikloridilla, sen jälkeen tehtiin emäksiseksi 5 N natriumhydroksidilla. Muodostunut valkoinen sakka uutettiin metyleenikloridiin (3 x 100 ml), uute kuivattiin Na2S04:n päällä, sen jälkeen liuotin haihdu-30 tettiin ja saatiin valkoinen kiinteä aine, joka kiteytettiin uudestaan heksaani/etyyliasetaatista, jolloin saatiin (-)-atenololia (76 mg), (a)p5 = -3,9° (c = 1,01, etanoli), sul.p. 146-148°C, 1H-NMR (CHCl3) 360 MHz-spektri: delta 1,1 (d, 21 86890 6H, CH3), delta 1,5-2,5 leveä (s, 2H, NH, OH),delta 2,82 (m, Th7 NHCH), delta 2,75/2,95 (m, 2H, CH2NH), delta 3,53 (s, 2H, CO-CH2), delta 3,98 (m, 3H, -0-CH2-CH-), delta 5,35 leveä (s, 2H, NH2), delta 6,9 (d, 2H, parasubstituoitu aro-5 maattinen), delta 7,2 (d, 2H, parasubstituoitu aromaattinen).

Kemiallinen ionisaatio (NH,) massaspektri antoi molekyyli-ioniksi (M+H) m/e 267, osoittaen molekyylipainoksi 266, vastaten odotettua massaa. PMR- ja massaspektrit olivat identtiset kemiallisesti valmistetun (+)-atenololin vastaavien 10 spektrien kanssa.

(-)-atenololin optinen puhtaus määritettiin erottamalla sen di-bentsoyyli-viinihappo-monoesterin diastereomeeriset johdannaiset käänteisfaasi-HPLC-kolonnissa (Lichrosorb RP8) (10 ym) 25 cm x 1/4" ulkohalk. , 4,9 mm sisähalk., liikkuva 15 faasi 2 % etikkahappoa (pH 3,7 NH^rlla) 50:50 metanoli, 1,5 ml/min.). Johdannaiset valmistettiin saattamalla ( + )-tai (-)-atenololi reagoimaan (R,R)-0,0-dibentsoyyliviini-happo-anhydridin kanssa kuten ovat esittäneet W. Linder et ai., julkaisussa J. Chrom. 316, s. 605-616 (1984). Analy-20 soitaessa (+)-atenololista johdettua näytettä, muodostui kaksi, lähes yhtä intensiivistä diastereomeeripiikkiä, kun taas (-)-atenololista johdetusta näytteestä muodostui kaksi piikkiä, joiden intensiteettisuhde oli 1,5 : 98,5 vastaten 97,0 %:n optista puhtautta.

25 Esimerkki X

4-allyylioksi-fenyyliasetamidin muuttaminen 4-(2,3-epoksi-propyylioksi-fenyyliasetamidiksi kannalla Pseudomonas oleo-vorans ATCC 29347_

Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 -suspensio valmistettiin 30 suspendoimalla uudestaa solut (jotka oli kasvatettu 24 tuntia 30°C:ssa PSX-mineraalisuola-kasvualustassa, pH 7, joka sisälsi 0,75 % glyserolia + 0,05 % dietoksimetaania) PSX:ään, 22 86890 pH 7,5. tilavuuteen, joka oli 1/10 alkuperäisestä viljelyti-lavuudesta.

Solususpensiota (10 ml, kuivapaino 12,6 g/1) inkuboitiin 30°C:ssa 0,5 ml:n kanssa 4-allyylioksi-fenyyliasetamidin 5 90 mg/ml kuulajauhettua ja sonikoitua suspensiota (joka si sälsi myös 50 mg/ml Tween-80) 250 ml:n lasitulpallisessa kar-tiopullossa kehäinkubaattorissa. Näytteet (1 ml) uutettiin metyleenikloridiin (2 ml), liuotin haihdutettiin, jonka jälkeen jäännös liuotettiin uudestaan dimetyyliformamidiin en-10 nen HPLC-analyysiä (olosuhteet kuten esimerkissä IX analysoitaessa 2-(2,3-epoksipropyylioksi)-fenyyliasetamidi). 4-(2,3-epoksipropyylioksi)-fenyyliasetamidin pitoisuus inkuboidussa seoksessa nousi 0,9 g:aan/litra 3 tunnin ja vastaavasti 1,3 g: aan/1 24 tunnin jälkeen.

15 Esimerkki XI

4-allyylioksi-fenyyliasetamidin muuttaminen 4-(2,3-epoksipropyylioksi) -fenyyliasetamidiksi kannoilla Pseudomonas aeruginosa NCIB 12036, Pseudomonas aeruginosa NCIB 8704 ja Pseudomonas putidä NCIB 9571_ 20 Pseudomonas aeruginosa NCIB 12036-, Pseudomonas aeruginosa NCIB 8704- ja Pseudomonas putida NCIB 9571-solususpensiot valmistettiin suspendoimalla uudestaan solut (joita oli kasvatettu PSX-mineraalisuola-alustassa, pH 7, joka sisälsi 0,75 % natriumlaktaattia ja 0,05 % dietoksimetaania, kasva-25 tusaika 24 tuntia 30°C:ssa) PSX:ään, pH 7,5, tilavuuteen, joka oli 1/10 alkuperäisestä viljelytilavuudesta.

Solususpensiota (10 ml) inkuboitiin 0,5 ml:n kanssa 4-allyy-lioksi-fenyyliasetamidin 10%:ista kuulajauhettua, vesipitoista suspensiota (joka sisälsi myös 5 % Tween-80) 30°C:ssa la-30 situlpallisessa/250 ml:n kartiopullossa kehäinkubaattorissa.

24 tunnin kuluttua inkubointiseokset uutettiin metyleeniklo- 23 86890 ridiin ja niiden havaittiin sisältävän 4-(2,3-epoksipropyyli-oksi)-fenyyliasetamidia seuraavissa konsentraatioissa: Pseudomonas aeruginosa NCIB 12036, 0,07 g/1; Pseudomonas aeruginosa NCIB 6704 0,08 g/1; Pseudomonas putIda NCIB 9571 0,19 g/1 5 (analyysit suoritettu HPLC:llä kuten edellisissä esimerkeissä).

Esimerkki XII

4-(2-metoksietyyli)-fenyyliallyylieetterin muuttaminen 4-(2-metoksietyyli)-fenyyliglysidyylieetteriksi kannalla Pseudomonas oleovorans ATCC 29347_ 10 Pseudomonas oleovorans ATCC 29347-suspensio valmistettiin suspendoimalla uudestaan solut (jotka oli kasvatettu statio-näärifaasiin PSX-mineraalisuola-alustassa, pH 7, joka sisälsi 0,75 % glyserolia ja 0,05 % dietoksimetaania, 30°C:ssa) PSX: ään, pH 7,5 tilavuuteen, joka oli 1/10 alkuperäisestä vilje-15 lytilavuudesta.

Solususpensiota (10 ml, kuivapaino 12,6 g/1, 250 ml:n kartio-pullossa) inkuboitiin 4-(2-metoksietyyli)-fenyyliallyylieetterin (250 vil) ja glukoosin (50 mg) kanssa 37°C:ssa kehära-vistelijassa. 4-(2-metoksietyyli)-fenyyliglysidyylieetterin 20 muodostumista seurattiin kaasukromatografisesti metyleeni-kloridiuutteista (olosuhteet kuten edellä kuvatuissa esimerkeissä) . 4-(2-metoksietyyli)-fenyyliglysidyyli-eetterin pitoisuus inkubointiseoksessa oli 6 tunnin jälkeen 7,30 g/1.

24 8 6 8 9 0

Esimerkki XIII

4-(2-syklopropyylimetoksietyyli)fenyyliallyylieetterin muuttaminen (+)-4-(2-syklopropyylimetoksietyyli)fenyyli-glysidyylieetteriksi kannalla Pseudomonas oleovorans ATCC 29347_

Biomassa kannan Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 24 tunnin viljelmästä, jota oli kasvatettu 30 eC:ssa glyserolin päällä (7,5 g/1) PSX-mineraalisuola-kasvualustassa (100 ml, pH 7,0), joka sisälsi dietoksimetaania (0,5 g/1), siirrettiin erlenmeyer-kolviin (250 ml), jossa oli PSX:ää (10 ml, pH 7,5), glukoosia (5 g/1) ja 4-(2-syklopropyyli-metok-sietyyli)fenyyliallyylieetteriä (25 g/1). Sisältöä inku-boitiin 30 °C:ssa kiertoravistelijassa ja näytteet uutettiin dikloorimetaaniin ennen analysointia kaasugromatogra-filla (Varian 3400). (Kolonni 3%OVl WHP:llä 100-120 mesh, 50 cm x 2 mm sisäläpimitta, 100-170 eC 10 °C/min. N2 30 ml/min.).

PSX sisältää: KH2P04 (8,92 g/1), Na2HP04 (2,94 g/1), (NH4)2HP04 (1,0 g/1), (NH4)2S04 (0,2 g/1), KCl (0,2 g/1), Na3sitraatti (0,294 g/1), CaS04.2H20 (0,005 g/1), MgS04.7H20 (0,2 g/1), ja PS II hivenaineliuos (10 ml/1). PS II hiven-aineliuos sisältää: (NH4)2S04.FeS04.6H20 (0,25 g/1), ZnS04.7H20 (0,05 g/1), MnCl2.4H20 (0,03 g/1), CuS04.5H20 (0,015 g/1), CoCl2.6H20 (0,015 g/1), H3B04 (0,005 g/1), Na2Mo04.2H20 (0,0055 g/1), KI (0,01 g/1), pH säädetty HCl:llä arvoon 3.

Tuote, ( + )-4-(2-syklopropyylimetoksietyyli)fenyyliglysi-dyylieetteri tuli esiin kolmen tunnin inkubaation jälkeen ja lisääntyi konsentraatioon 3,03 g/1 24 tunnissa.

Jotta saataisiin riittävä määrä (+)-4-(2-syklopropyyli-me-toksietyyli)fenyyliglysidyylieetteriä, 10 x 10 ml:n inku-baatioeristä, joita oli inkuboitu kuusi tuntia yllä kuva- 86890 tuissa olosuhteissa, kuitenkin 37 °C:ssa, saadut viljely-liemet uutettiin dikloorimetaanilla (500 ml). Uute kuivattiin Na2S04:n päällä, liuotin haihdutettiin, ja epoksidi puhdistettiin piihappogeelillä käyttäen heksaani/eetteri-gradienttia (epoksidi eluoitui 45-60%:isella eetterillä), jolloin saatiin (+)-4-(2-syklopropyylimetoksi-etyyli)fenyy-liglysidyylieetteriä (188 mg), jonka [a]25D = +1,8 (c = 1,0, kloroformi).

Tuotteen PMR-spektri vastasi haluttua rakennetta ja oli identtinen kemiallisella synteesillä valmistetun 4-(2-syk-lopropyylimetoksietyyli)fenyyliglysidyylieetterin spektrin kanssa.

Tuotteen optinen puhtaus määritettiin erottamalla sen enantiomeerit kiraalisessa HPLC-kolonnissa (Daicel chiral-cel OD, 25 cm x 4,6 mm sisähalk., liikkuva faasi heksaani: propan-2-olirdietyyliamiini (800:200:1), 0,6 ml/min, UV-detektio 254 nm).

Kemiallisella synteesillä valmistetun 4-(2-syklopropyyli-metoksietyyli)fenyyliglysidyylieetterin analyysissä saatiin kaksi suunnilleen yhtä suurta piikkiä, mikä on odotettavissa rasemaatille. Näyte, joka oli valmistettu käyttäen Pseudomonas oleovorans-kantaa, antoi ainoastaan yhden havaittavan piikin, joka vastasi toista kemiallisesti valmistetun näytteen piikeistä.

Claims (12)

1. 26 86 8 90
2. 1. Menetelmä kaavan (I) mukaisen farmaseuttisesti aktiivisen yhdisteen valmistamiseksi stereospesifisessä muodossa R1-0-CH2-CH0H-CH2-NH-R2 (I) tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan, kuten hap-poadditiosuolan valmistamiseksi ja/tai kaavan (II) mukaisen yhdisteen valmistamiseksi stereospesifisessä muodossa Rx - O - CH2 - CH - CH2 (II) N0/ joissa kaavoissa R-j^ on mahdollisesti substituoitu fenyyli-ryhmä, ja R2 on 2-6 hiiliatomia sisältävä alkyyliryhmä, tunnettu siitä, että kaavan (III) mukainen yhdiste r1-o-ch2-ch=ch2 (III) saatetaan sukuun Rhodococcus, sukuun Mycobacterium, sukuun Nocardia tai sukuun Pseudomonas kuuluvan bakteerin vaikutuksen alaiseksi, jolla on kyky stereoselektiivisesti epoksoida kaavan (III) mukainen yhdiste kaavan (II) mukaiseksi yhdisteeksi, siten että saadaan ainakin 80 % painosta S-konfiguraatiota, ja jossa menetelmässä kaavan (II) mukainen yhdiste ainakin osaksi erotetaan ja/tai kaavan (II) mukainen yhdiste saatetaan tunnetulla tavalla reagoimaan C2-Cg-alkyyliamiinin kanssa, ja kaavan (I) mukainen yhdiste ainakin osaksi erotetaan ja/tai kaavan (I) mukainen yhdiste muutetaan farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään isopropyyliamiinia. 1 Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Rj^ on 4-substituoitu fenyyliryhmä. 27 86890
4. 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että R-l on 4-(2-metoksietyyli)-fenyyliryhmä.
5. 5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että on 4-karbamoyylimetyylifenyyliryhmä.
6. 6. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R-j^ on fenyyliryhmä.
7. 7. Patenttivaatimusten 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu bakteeri kykenee muuttamaan kaavan (III) mukaisen yhdisteen kaavan (II) mukaiseksi yhdisteeksi siten, että saadaan ainakin 90 % painosta S-konfiguraatiota.
8. 8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että R1 on 4-(2-metoksietyyli)-fenyyliryhmä ja R2 on isopropyyliryhmä ja käytetty bakteeri on Nocardia corallina, edullisesti Nocardia corallina ATCC 31338.
9. 9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että R1 on 4-(2-metoksietyyli)-fenyyliryhmä ja R2 on isopropyyliryhmä ja käytetty bakteeri kuuluu sukuun Rhodococcus ja on edullisesti Rhodococcus sp. NCIB 11277 tai Rhodococcus equi NCIB 12035.
10. 10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R1 on 4-(2-metoksietyyli)-fenyyliryhmä ja R2 on isopropyyliryhmä ja käytetty bakteeri on Mycobacterium rhodochrous, edullisesti Mycobacterium rhodochrous NCIB 9703. 1 Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R! on fenyyliryhmä ja R2 on isopropyyliryhmä ja käytetty bakteeri on Mycobacterium WM1, edullisesti Mycobacterium WM1 NCIB 11626. 28 86890
11. 12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että R1 on 4-(2-metoksietyyli)-fenyyliryhmä ja R2 on isopropyyliryhmä ja käytetty bakteeri kuuluu sukuun Pseudomonas ja on edullisesti Pseudomonas aeruginosa NCIB 12036, Pseudomonas oleovorans ATCC 29347, Pseudomonas pu-tida NCIB 9571 tai Pseudomonas aeruginosa NCIB 8704.
12. 13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että R^ on 4-karbamoyylimetyylifenyyliryhmä ja R2 on isopropyyliryhmä ja käytetty bakteeri on Pseudomonas oleovorans, edullisesti Pseudomonas oleovorans ATCC 29347. 29 86890