HU201296B

HU201296B - Process for stereospecific production of 3-substituted 1-(alkylamino)-2-propanol

Info

Publication number: HU201296B
Application number: HU86609A
Authority: HU
Inventors: Mauro Attilio Bertola; Hein Simon Koger; Arthur Friedrich Marx; Gareth Thomas Phillips; Brian William Robertson; Peter Douglas Watts
Original assignee: Gist Brocades Nv; Shell Int Research
Priority date: 1985-02-13
Filing date: 1986-02-12
Publication date: 1990-10-28
Also published as: NO166726C; FI86890C; NZ215065A; ES551925A0; EP0193227A1; FI860598A; NO860507L; FI860598A0; FI86890B; HUT40071A; AU589594B2; DK67786A; PT82019B; NO166726B; DK67786D0; AU5327086A; GR860402B; DE3670289D1; CN86102227A; PT82019A

Description

A találmány tárgya új eljárás az (I) általános képletű 3-szubsztituált-l-(alkil-amino)-2-propanol-származékok vagy gyógyszerészetileg elfogadható savaddíciós sóik - a képletben

Rí jelentése fenilcsoport vagy 4-es helyzetben karbamoil-1-(1-4 szénátomos)alkil- vagy (1-4 szénatomos)alkoxi-(l-4 szénatomos)alkilcsoporttal szubsztituált fenilcsoport,

R₂ jelentése 2-6 szénatomos alkilcsoport sztereospccifikus formában való előállítására, oly módon, hogy egy (III) általános képletű vegyületet olyan mikroorganizmus hatásának tesszük ki, amely képes egy (III) általános képletű vegyületet sztereoszelektíven legalább 80 tömeg%-ban S-konfigurációjú (II) általános képletű fenil-(2,3-epoxil-propil)-éterré oxidálni, a kapott (II) általános képletű vegyületet 2-6 szénatomos alkil-aminnal reagáltatjuk, és az (I) általános képletű vegyületet elkülönítjük és/vagy az (I) általános képletű vegyületet gyógyszerészetileg elfogadható sójává alakítjuk.

A továbbiakban a 2,3-epoxi-l-propÍl-csoportot glicidilként nevezzük.

Általánosan ismeretes, hogy számos biológiailag aktív vegyület sztereoizomerek elegyeként létezik. Leggyakrabban ezeket az elegyeket alkalamazzák mezőgazdasági és gyógyszerészeti felhasználásoknál. A fő ok az, hogy az elválasztási költségek nagyobbak a hatásnövekedés potenciális hasznánál. Általában a kívánt biológiai hatással az egyik sztereoizomer rendelkezik, így legjobb esetben az elegy hatásossága felére csökkent. Kétségtelen azonban, hogy a modern farmakológusok az elegyek beadására vonatkozólag egyre inkább más nézeteket vallanak, amennyiben egy vagy több sztereoizomert szennyezésnek tekintenek, amely nemhogy nem rendelkezik a kívánt gyógyászati hatással, hanem nagyonis más nemkívánt fiziológiás hatásai vannak, például toxikus. Számos példát idéznek a biológiai hatás egyetlen sztereoizomerrel való összefüggésének szemléltetésére.

A gyógyszerészeti területen a legtöbb béta-adrenerg blokkoló szert elegyként árulják, bár a hatás egy sztereoizomerre korlátozódik. A labetalol néven ismert hatóanyag például kombinált alfa-adrenerg blokkoló és béta-adrenerg blokkoló hatással rendelkezik, amely hatásról kimutatták, hogy négy izomer elegyéből csak két különálló párnak tulajdonítható. N. Toda és munkatársai közölték a J .PharmacoI.Exp.Ther. 207,311 (1978)-ban, hogy a (-)-mctoprolol 270-380-szor hatásosabb, mint a (-t- )-metoprolol a nyíri szívpitvar és légcső izmoknak izoprotereholra (béta-adrenoreceptor stimuláns) való válaszának csillapításában. Metoprolol:

1- (izopropil-amino)-3-(4-(2-metoxi-etil)-fenoxi)2- propancl.

Egyetlen szterecázcmcr béta-blokkolóhoz vezető jelenleg szokásos előállítás módszerek vagy kémiai resolválások vagysztereoizomer prekurzorokból kiiudn'ó meglehetősen hosszadalmas kémiai szintizések, amilyeneket például a 4 408 063 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban és a J. Org. Chem. 41 3121 (1976)-ban L.M. Weinstok és munkatársai írnak le. így ezeknek a leírt eljárásoknak az analógiájára a metoprolol S2 enantiomerét (optikailag aktív sztereoizomerét) ipari méretekben gazdaságilag nem előnyös előállítani. Ennélfogva a jelen találmány célja az, hogy ilyen sztereoizomerek előállítására olyan termelékeny eljárást biztosítson, amely ipari méretben gazdaságilag kedvezően kivitelezhető.

J.Tramper és munkatársai bemutatták mikroorganizmusok azon képességét, hogy rövidszénláncú (1-4 szénatomos) alkéneket gáz/szilárdfázisú vagy két folyadékfázisú bioreaktorban sztereospecifikusan a megfelelő epoxi-alkánokká alakítanak át, (3rd European Congress on Biotechnology, München, 1984. szeptember 10-14.) Epoxi-alkánok mikrobiológiai előállítására egy másik példát a 4,106,986 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban közölnek, ahol 1-20 szénatomot tartalmazó egyenesláncú 1-lakének 1,2-epoxi-alkánokká való átalakítását írják le. A 0099609 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentésben példákat adnak meg propén és 1-oktén megfelelő epoxi-alkánokká való átalakítására. Szubsztituált alkének, például (III) általános képletű éter-származékok átalakítása azonban semmiképp sem vezethető le ezekből az ismert eljárásokból, amelyek csak egyenesláncú vagy néha elágazó láncú alkénekre alkalmazhatók.

Kiterjedt kutatás és kísérletezés eredményeként egy tökéletesített szintézist fedezhetünk fel az (I) általános képletű vegyület S-enantiomerének (III) általános képletű vegyületből való előállítására, amelynek során olyan baktériumokat használunk fel, melyek képesek (III) általános képletű vegyületeket legalább 80 tömeg%-ban S-konfigurációjú (II) általános képletű vegyületekké epoxidálni, és az illető (II) általános képletű vegyületet valamilyen alkil-aminnal reagáltatva megfelelő (I) általános képletű vegyületté alakítjuk.

Részletesebben kifejtve a jelen találmány tárgya eljárás (I) általános képletű gyógyászatilag hatásos vegyületek vagy gyógyszerészetileg elfogadható savaddíciós sóik sztereospecifikus formában való előállítására, amelyek képletében

Rl jelentése fenilcsoport vagy 4-es helyzetében karbamoil-1-(1-4 szénatomos)-alkil- vagy (1-4 szénatomos)alkoxi-(l-4 szénatomos)-alkil-csoporttal szubsztitutált fenilcsoport, és R₂ jelentése 2-6 szénatomot tartalmazó alkilcsoport amelyre azjcllentő, hogy egy (III) általános képletű vegyületet - amely képletben

Rl jelentése az előbb megadottakkal azonos (III) általános képletű vegyületek legalább 80 tömeg%-ban S-konfigurációjú (II) általános képletű vegyületekké való sztereoszelektív epoxidálására képes mikroorganizmus hatásának tesszük ki, a (II) általános képletű vegyületet esetleg elkülönítjük, és a (II) általános képletű vegyületet egy 2-ó szénatomos alkil-aminnal reagáltatjuk, elkülönítjük az (I) általános képletű vegyületet, és/vagy gyógyszerészetileg elfogadható sójává alakítjuk át. Az alkalmazott alkil-amin előnyösen izopropil-amin vagy tercier butil-amin.

Az Rí csoport előnyös jelentése 4-(karbamoilmetil)-fenil-, fenil-, vagy 4-(2-metoxi-etil)-fenil-, csoport.

-2HU 201296 Β

A jelen találmány szerinti eljárást előnyösen olyan (III) általános képletű vegyületekből kiindulva hajtjuk végre, amelyek képletében Rí jelentése 4-(2-meto»-etil)-fenil-, 4-(karbamoil-metil)-feníl-, fenil-csoport, és még előnyösebben olyan (III) általános képletű vgyülettel, amelynek képletében Rí jelentése 4-(2-meto»-etil)-fenilcsoport. Egy előnyös megvalósításban az eljárást olymódon hajtjuk végre, hogy olyan mikroorganizmusokat alkalmazunk, amelyek legalább 90 tömeg% S-konfigurációjú vegyületet termelnek.

A mikroorganizmus Nocardia corallina, Rhodococcus sp. (NCIB 11277), Mycobacterium rhodochrous, Rhodococcus equi, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas putida, Mycobacterium WM1 (NCIB 11626). A mikroorganizmusokat adott esetben valamilyen polimer gélhez kötjük. Az allil-(4-(2-metoxi)-etil)fenil)-éter epoxidálására alkalmas mikroorganizmusok a Nocardia corallina fajhoz (a faj mintáját az ATCC-bcn 31338 nyilvántartási szám alatt helyezték letétbe), Rhodococcus sp. fajhoz (NCIB 11277), Mycobacterium rhodochrous fajhoz (a faj mintákat az NCIB-ben 9703 nyilvántartási szám alatt helyezték letétbe), Rhodococcus equi fajhoz (a faj mintáját az NCIB-ben 12035 nyilvántartási szám alatt helyezték letétbe), Pseudomonas aeruginosa fajhoz (a faj mintáját az NCIB-ben 12036 nyilvántartási szám alatt helyezték letétbe), Pseudomonas oleovorans fajhoz (a faj mintáját az ATCC-ben 29347 nyilvántartási szám alatt helyezték letétbe), Pseudomonas putida fajhoz (a faj mintáját az NCIB-ben 9571 nyilvántartási szám alatt helyezték letétbe) és a Pseudomonas aeruginosa fajhoz (a faj mintáját az NCIB-ben 8704 nyilvántartási szám alatt helyezték letétbe) tartoznak.

Az allil-fenil-éter epoxidálására alkalmas mikroogranizmus a Mycobacterium WM1 (NCIB 11626 nyilvántartási szám alatt helyezték letétbe) tenyészetéhez tartoznak.

A 4-(allil-oxi-fenil)-acetamid epoxidálására alkalmas mikroorganizmusok a Pseudomonas oleovorans faj (a faj mintáját az ATCC-ben 29347 nyilvántartási szám alatt helyezték letétbe) tenyészetéhez tartoznak.

A jelen találmány szerinti eljárás előnyös megvalósításának gyakorlatában allil-[4-(2-metoxi-etil)fenil]-éter legalább 90 tömeg%-ban S-konfigurációjú glicidil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]-éterré való átalakítására képes mikroorganizmust kell szelektálni az előbb említett mikroorganizmusokból 0,5-10 napig tenyészetem kell, majd a bakteriumsejteket el kell különíteni a tenyészfolyadékból, a sejteket folyékony táptalajban kell szuszpendálni, és az allil-[4-(2-metoxi-etÍl)-fenil]-étert a sejtek hatásának kell kitenni.

A jelen találmányban felhasznált, epoxidáló hatást mutató mikroorganizmusokat körülbelül 0,510 napig tenyészteni kell, majd a sejteket valamilyen folyékony táptalajban, előnyösen valamilyen folyékony minimál táptalajban kell szuszpendálni, és a (III) általános képletű vegyületet a sejtek hatásának kell kitenni. Az előbb említett körülbelül 0,5-10 napos tenyésztés után a sejteket elkülönítjük a tenyésztáptalajtól, mielőtt a sejteket a minimál tápta4 lajban szuszpendáljuk. A (III) általános képletű vegyüeltek sztereoszelektív epoxidálására használt mikroorganizmusok tenyésztésére valamilyen asszimilálható szénforrást (például glükózt, tejsavat, szénhidrogéneket, így tetradecént stb.), valamilyen nitrogénforrást (például ammónium-szulfátot, ammónium-nitrátot, ammónium-kloridot stb.), valamilyen szerves hatóanyagkivonatot (például élesztőkivonatot, malátakivonatot, peptont, húskivonatot stb.) és valamilyen szervetlen tápanyagforrást (például foszfátot, magnéziumot, káliumot, cinket, vasat és más fémeket nyomnyi mennyiségben) tartalmazó közönséges táptalajt használhatunk. Adott esetben valamilyen indukáló anyagot (például dietoxi-metánt) is adunk a tápoldathoz. A hőmérsékeltet 0 °C és 45 °C között és a pH-t 3,5 és 9 között tartjuk a mikroorganizmusok tenyésztése közben. A mikroorganizmusokat előnyösen 20 °C és 37 °C közötti hőmérsékleten és 5 és 8 közötti ρΗ-nál tenyésztjük.

A mikroorganizmusok tenyésztése alatt szükséges aerob körülmények bármely jól megtervezett módszerrel fenntarthatók, feltéve hogy az oxigénellátás elegendő a mikroorganizmusok anyagcsereszükségletének kielégítésére. Ez legkönyebben a gázalakú oxigén, előnyösen levegő formájában való biztosításával érhető el.

A (III) általános képletű vegyület (II) általános képletű vegyületté való átalakítása alatt a mikrooranizmusok növekedési szakaszban vannak, és az előbb említett közönséges táptalajt hasznosítják. A mikroorganizmusok valamilyen koszubsztráttal is elláthatók.

A (III) általános képletű vegyület (II) általános képletű vegyületté való átalakítása alatt a mikroorganizmusok előnyösen lényegében nem növekedési szakaszban tarthatók valamilyen minimál táptalaj alkalmazásával. Minimál táptalajként szükség esetén valamilyen asszimiláló szénforrást (például glükózt, laktátot, szénhidrogéneket, így tetradecént stb.), szükség esetén valamilyen nitrogénforrást (például ammónium-szulfátot, amroónium-nitrátot, ammónium-kloridot stb.), szükség esetén valamilyen szerves hatóanyagforrást (például élesztőkivonatot, malátakivonatot, peptont, húskivonatot stb.) és szükség esetén valamilyen szervetlen tápanyagforrást (például foszfátot, magnéziumot, káliumot, cinket, vasat és más fémeket nyomni mennyiségben) tartalmazó közönséges tenyésztő táptalaj használható. A mikroorganizmusok a nem növekedési szakaszban tarthatók például az asszimilálható szénforrás megvonásával vagy a nitrogénforrás megvonásával. A hőmésékleten ebben a szakaszban 0 °C és 45 °C között és a pH-t 3,5 és 9 között tartjuk. A mikroorganizmusokat előnyösen 20 °C és 37 °C közötti hőmérsékleten és 5 és 8 közötti ρΗ-nál tartjuk. Az ebben az szakaszban szükséges aerob körülmények az előbb említett eljárásokkal tarthatók fenn, feltéve hogy az oxigénellátás elegendő a mikroorganizmusok anyagcsereszükségletének kielégítésére, valamint a (Hl) általános képletű vegyületek (II) általános képletű vegyietekké való átalakításához. A mikroorganizmusok által termelt (II) általános képletű vegyület, amint előbb említettük, bármely megfelelő eljárás3

-3HU 201296 Β sál elkülöníthető és megtisztítható.

A jelen találmány szerint előállított (Ha) és (Ilb) általános képletű vegyületek amely képletben

Rí jelentése az (I) általános képletnél megadot- 5 takkal azonos vagy ezek elegyei izopropil-aminnal vagy tercierbutil-aminnal reagáltatva (la), (Ib) általános képletű vegyületekké, illetve ezek elegyével alakíthatók át. Az (S) abszolút konfigurációjú béta-adrenerg 10 receptor blokkoló ágensek (S) abszolút konfigurációjú aril-glicidil-éterekbŐl való előállítási reakciójára a 2453324 számú nyilvánosságra hozott német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi bejelentésben írnak le egy példát. 15

Különösen a túlnyomórészt (Ib) általános képletű vegyületeket tartalmazó keverékek használhatók előnyösen gyógyszerkészítményekben. Előnyösen a legalább 80 tömeg%-ban és még előnyösebben a legalább 90 tömeg%-ban S-konfigurációjú vegyüle- 20 tek használhatók gyógyszerkészítményekben. Az (I) általános képletű vegyületek vagy gyógyszerészetileg elfogadható sóik, így savaddíciós sóik bétaadrenerg receptor blokkoló tulajdonsággal rendelkeznek. A gyógyszerészetileg elfogadható sókra 25 példák a Metoprololból és L-borkősavból előállított Metoprolol-tartarát és a 3-fenoxi-l-(izopropilamino)-2-propanolból és sósavból előállított 3-fenoxM-(izopropil-amino)-2-propanol-hidroklorid. Előnyösen azokat a béta-adrenerg receptor biok- 30 kóló vegyületeket állítjuk elő a jelen találmány szerinti eljárással, amelyek legalább 80 tömeg%-ban és előnyösebben legalább 90 tömeg%-ban S-konfigurációban képződnek.

Az optikai tisztaságot, amit a továbbiakban a 35 részletes leírásban említjük, az enantiomer-felesleg százalékában fejezzük ki: S - R/S + R.

A jelen találmányt a továbbiakban a példákkal és a mellékelt ábrákkal részletesebben szemlélttj ük, anélkül azonban, h ogy a jelen találmány oltalmi 40 köre csak ezekre a példákra korlátozódna.

Az ábrák rövid magyarázata:

1. ábrák ( + ) és (±)-glicidil[4-(2-metoxi-etil)fenil]-éter európium shift-reagens jelenlétében felvett részleges Protonmágneses r ezonanciapsektru- 45 mait ábrázolják.

l.a) ábra: (±)- vagy ( + )-glicidil[4-(2-metoxietil)-fenil]-éter shift-reagens nélkül.

í.b) ábra: (±)-GIicidil-[4-(2-metoxi-etil)-feniljéter Eu (hfc)3 reagenssel. Éu(hfc)3 és (±)-glicidil- 50 [4-(2-metoxi-etil)-fenil]-éter aránya = 0,10.

1. c) ábra: (+ )-Glicidil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil[éter Eu(hí’c)3 reagenssel. Eu(hfc)3 és ( + )-gIicidil[4-(2-metoxi-etil)-fenil]-éter aránya = 0,12.

2. ábra: (-)-Metoprolol protonmágneses rezo- 55 naneiapseklruma.

3. ábra: (-)-Metoprolol C.l. (CH4)-gyel meghatározott tömegspektruma.

4. ábra: Fenil-glicidil-éter előállítása Mycobactcrium WMl-gyel nagy méretben (2,25 liter) kétíá- 60 zisú rendszerben. [750 ml sejt (6,9 g/liter száraz tömeg) + 1500 ml 2,5% allil-fenil-étert tartalmazó izooktán]. Az ábrán a fekete négyzetek a fenil-glicidil-éter koncentrációt mutatják az izooktán rétegben. A körök a párhuzmosan végzett kontrollkí- 65 sérletben (4 ml sejt + 10 ml 2,5% allil-fenil-étert tartalmazó izooktán) keletkező fenil-glicidil-éter koncentrációját mutatják.

5. ábra: (-)-3-Fenoxi-l-(izopropil-amino)-2propanol protonmágneses rezonanciaspektruma.

6. ábra: (-)-3-Fenoxi-l-(izopropil-amino)-2propanol C.l. (CFUj-gyel felvett tömegspektruma.

1. példa

Allil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]-éter átalakítása (+)-glicidil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]-éterré Rhodococcus equi NCIB 12035-tel.

Rhodococcus equi NCIB 12035 30 °C-on 1 ml tetradekánon 0,02% élesztőkivonatot tartalmazó 100 ml ASM ásványi sós táptalajon növesztett 72 órás tenyészete biomasszájának körülbelül a felét átvisszűk egy 250 ml-es Erlenmeyer lombikba, amely 0,02% élesztókivonatot tartalmazó 50 ml ASM táptalajt, 0,15 ml tetradekánt, 1 ml oktánt, 0,05 ml Tween-80-t és 0,05 ml allil-[4-(2-metoxietil)-fenil]-étert tartalmaz. A lombik tartalmát 30 °C-on körkörös rázógépen inkubáljuk, és mintákat veszünk, amelyeket diklór-metánnal való extrahálás után Varian 3700 gázkromatográfon analizálunk. (Oszlop: 3% OVI WHP 100-120-on; 50 cm hossz; 2 mm belső átmérő; 100 °C-tól 200 °C-ig 10 °C/perc; N2 30 ml/perc).

ASM táptalaj: 0,535 g/litcr ammónium-klorid; 0531 g/liter kálium-dihidrogén-foszfát; 0,866 g/liter dinátrium-hidrogén-foszfát; 0,174 g/liter káliumszulfát; 0,037 g/Uter magnézium-szulfát-heptahidrát; 0,00735 g/liter kalcium-klorid-dihidrát; 1,0 ml/liter TK3 nyomelem oldat és 1,0 ml/liter 0,1 mólos vas(II)-szulfát-heptahidrát oldat.

A TK3 nyomelem oldat 0,288 g/liter cink-szulfátheptahidrátot, 0224 g/liter mangán-szulfát-tetrahidrátot, 0,0618 g/liter bórsavat, 0,1248 g/liter rézszulfát-pentahidrátot, 0,0484 g/liter nátrium-molibdenát-dihidrátot, 0,0476 g/liter kobalt(II)-klorid-hexahidrátot, 0,083 g/liter kálium-jodidot és 1 ml/liter 1 mólos kénsavoldatot tartalmaz; pH = 7,0.

A termék, a ( + )-glicidil-[4-(2-metoxi-etil)-fenilj-éter 48 óra inkubálás után jelenik meg, és 96 óráig növekszik a mennyisége, amíg az epoxid körülbelül a megmaradó allil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]-éter mennyiségnek körülbelül 15%-át éri el.

Megfelelő mennyiségű ( + )-glicidil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]-éter összegyűjtése céljából 10 x 50 ml és 5 x 500 ml (előbb leírt körülmények között készített) tenyészetet 350 ml diklór-metánnal extraháljunk. Az extraktumot nátrium-szulfáton szárítjuk, az oldószert eldesztilláljuk, és az epoxidot szilikagélen hexán/dietil-éter gradienssel eluálva tisztítjuk. A 30% dietil-étert tartalmazó elegy eluálja az epoxidot. Ilymódon 353 mg (+l-glicidil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]étcrt kapunk. [αΓϋ - +8,11° (c = 0,95; etanol).

A (+)-glicidÍl-[4-(2-metoxi-eoxi)-fenil]-éter optikai tisztaságát protonmágneses rezonanciaspektroszkópiával vizsgáljuk trisz[3-(heptafluorpropil-hidroxi-metilén)-d-kámforato]-európÍum( III) Eu(hfc)3] shift reagens jelenlétében (lásd 1. ábra). Á shift reagens hozzáadására a kémiailag szintetizált (±)-glicidil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]éterbendévő egyes geminális protonokból szárma-4HU 201296 Β zó jelek burkoló görbéje (lásd l.a. ábra (a) és (b) jelzése) lefelé eltolódik, és mindegyikük két egyenlő intenzitású sávra hasad fel (lásd l.b. ábra (a) + (b)). A mikrobiológiailag előállított ( + )-glicidil-[4-(2-metoa-etiI)-fenil]-éterben lévő geminális protonok mindegyikéből ugyanilyen körülmények között azonban csak egy jelgörbe észlelhető (lásd l.c. ábra (a) + (B). így mikrobiológiai epoxidálással kapott (+)-gÚcidil44-(2-mctQxi-etil)-fenii J-éter optikai tisztasága a protonmágneses rezonanciaspektroszkópiás mérések kísérleti hibáján belül 100%-nak vehető.

2. példa (+ )-Glicidil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]’éter átalakítása (-)-metoprolollá.

290 mg ( + )-glicidil-[4-(2-metoxi-etil)-feniljéter (lásd 1. példa) 6,2 ml vízmentes etanoilal és

I, 84 ml izopropil-aminnal készített oldatát visszafolyató hűtő alatt 3 óra hosszat forraljuk, majd az oldószereket eldesztilláljuk. A kapott olajat 10 ml diklór-metánban oldjuk, és 10 ml 0,2 n sósavoldatba extraháljuk, amelyet utána 2 x 10 ml diklór-metánnal mosunk. A savas oldatot 3 ml 2 n nátrium-hidroxid oldattal meglúgosítjuk, és a terméket 10 ml diklór-metánba extraháljuk. A diklór-metános extraktumot nátrium-szulfáton szárítjuk, és az oldószer eldesztillálásával ragacsos szilárd anyaghoz jutunk. A terméket hexánból átkristályosítva 260 mg (-)-metaprololt kapunk, amelynek olvadáspontja 42-45 ’C; [aj D = -5,46’ (c = 1,01; etanol). A kémiai úton előállított (± j-metaprolol olvadáspontja 49-51 ’C, és optikailag inaktív, amint várható.

A (-)-metoprolol protonmágneses rezonanciaspektruma és tömegspektruma (2. és 3. ábrák) és a (± )-metoprolol hasonló adatai (itt nem mutatjuk be külön) egyeznek a kívánt szerkezettel, és megkülönböztethetetlenek a metoprolol-tartarát kereskedelmi mintából extrahált ( ± )-metoprolol (olvadáspont: 48,5-50,5 °C) protonmágneses rezonanciaspektrumtól.

A (-)-metoprolol optikai tisztaságát S-leucildiasztereomer amid-származékának fordított fázisú nagyhatékonyságú foiyadékkromatogrfáfiás (HPLC) oszlopon [Lichrosorb 11Ρ8(10μΐη), 25 cm x 1/4 (0,635 cm) külső átmérő, 4,9 cm belső átmérő, mozgó fázis: 40% acetonitril 3,0 pH-jú 0,1 mólos nátrium-foszfát pufferban, 2,5 ml/perc, U.V. detektálás] végzett elválasztásával határozzuk meg, A származékot úgy állítják elő, hogy metoprololt (terc-butoxi-karbonil)-S-leucin (BOC-S-leucin) szimmetrikus anhidridjével reagáltatunk, majd ezt követően a BOC-csoportot trifluor-ecetsawal eltávolítjuk, ahogy J- Hermansson és CJ. Von Bahr a

J. Chrom., 227,113 (1982)-ben leírják. A (±)-metoprololból készített hasonló minta analízise két egyenlő intenzitású csúcsot eredményez, amint ez racemát esetében várható. A (-)-metoprololból készített minta 97,7:23 intenzitásarányú két csúcsot eredményezett, ami 95,4%-os optikai tisztaságnak felel meg.

3. példa

Allil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]-éter átalakítása (+ )-glicidil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]-éterré Pseudomonas aeruginosa NCIB 12036-tal, majd ezt követően ennek átalakítása (-)-metopreUá,

Pseudomonas aeruginosa NCIB 12036 szuszpenziót készítünk úgy, hogy 0j75% nátrium-laktátot és 0,05% dietoxj-metánt tartalmazó ASM ásványi sós táptalajban 24 óráig 30 ’C-on tenyésztett sejteket az eredeti sejttenyészet térfogata egytizedének megfelelő ASM táptalajban reszuszpendálunk.

1100 ml ilyen sejtszuszpenziót 33 g allil-[4-(2metoxi-etil)’fenil}-éterrel 30 ’C-on ?20 ford./percnél inkubálunk. A reakcióelegyet 24 óra múlva 500 ml diklór-metánnal extraháljuk, az extraktumot nátrium-szulfáton szárítjuk, és az oldószer ledesztillálása után 2,67 g olajat kapunk. Szilikagélen végzett tisztítás (lásd 1. példa) 930 mg (+)-glkidil-[4(2-metoxi-etÚ)’fenilJ-étert eredményez; + 8,21’ (c -0,943; etanol).

Az Eu(hfc)3 euröpium shíft-reagens jelenlétében protonmágneses rezonanciapsektroszkópiával mért optikai tisztaság (lásd 1. példában) a protonmágneses rezonanciaspektrum mérések kísérleti hibáján belül 100%-nak bizonyul.

694 mg (-t-)-gücidil-[4-(2-raetoxi-etil)-fenil]éterbql (a 2. példában leírt módszer szerint) 579 mg (-)-metoprololt állítunk elő, amelynek olvadáspontja 44-46’CiJaj^D = -5,49* (c =$1*02; etanol). Az optikai tisztaság (a 2. példában leírt módszerrel meghatározva) 98%-nak bizonyul, Az^nyalúg kristályosításával 113 mg (-)-metoprplolt kapunk, amelynek optikai tisztasága 96%.

4. példa

Allil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]-éter átalakítása Pseudomonas aeruginosa NCIB 8704-gyel ( + )-glicidil-[4-(2-metoxi-eti])-fenil]-éterré, majd ennek átalakítása (-)-metoprolollá.

200 ml Pseudomonas aeruginosa NCIB 8704 sejtszuszpenziót (készítés a 3. példában, leírtak szerint) inkubálunk 2 g allil-[4-(2-metoxj-etil)-fenil}éterrel 30 ’C-on 24 óráig, majd a szuszpepziót (a 3. példában leírtak szerint) extraháljuk, és tisztítjuk. Ilymódon 91 mg (+ )-glicidll-[4-(2-metp»-etíl)-fenŰ]-étert kapunk. Az epoxid Eu(hfc)? euröpium shift-reagens jelenlétében protonmágneses rezonanciaspektroszkópiával mért optikai tisztasága (lásd 1. példa) a protonmágneses rezpeandaspektroszkópiás mérések hibáin belül 100%-nak bizonyul.

mg (+ )-glicidil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]éterből (a 2. példában leírt módszer felhasználásával) 55 mg (-)-mctoprololt állítunk elő, amelynek olvadáspontja 42-45 °C [aj^D = -4,93’ (c = 0,944; etanol), S-leucil-diasztereomer származékának (a

2. példában leírtak szerint) nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiával meghatározott optikai tisztasága 98,8%. Az anyalúg bepárlásával 17 mg 95,2% optikai tisztaságú (-)-metoprololt kapunk.

5. példa

AlUl’(4-(2-metoxi-etil)-fenil]-éter átalakítása Pseudomonas putida NCIB 9571-gyel ( + )-gücidil[4-(2-metoxi-etil)-fenil]-éterré, majd ennek átalakítása (-)-metoprolollá.

200 ml (a 3. példában leírtak szerint készített)

-5HU 201296 Β

Pseudomonas putida NCIB 9571 sejtszuszpenziót 1 g allil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]-éterrel 30 ’C-on 24 óra hosszat inkubálunk, utána diklór-metánnal extraháljuk, és (a 3. példában leírtak szerint) tisztítás után 324 mg ( + )-gücidil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]étert kapunk; [a] 1D = +6,42* (c = 0,88; etanol). Az Eu(hfc)3 európium shift-reagens jelenlétében (az 1. példa szerint) protonmágneses rezonanciapsektroszkópiával mért optikai tisztaság 100% a protonmágneses rezonanciaspektroszkópiás mérések kísérleti hibáin belül.

214 mg ( + )-glicidil-[4-(2-metoxi-etil-fenil]étert (a 2. példában leírtak szerint) izopropil-aminnal kondenzálva 146 mg (-)-metoprololt kapunk, amelynek olvadáspontja 44-46 ’C, [aj D = -5,00° (c = 1,01; etanol).

Az optikai tisztaság (a 2. példában leírt módszer szerint) 98%-nak bizonyul. Az anyalúg bepárlásával 9 mg 97,5%-os optikai tisztaságú (-)-metoprololt kapunk.

6. példa

Allil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]-éter átalakítása. Pseudomonas oleovorans ATCC 29347-tel ( + )glicidil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]-éterré, majd ennek átalakítása (-)-metoprolollá.

200 ml Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 sejtszuszpenziót (amelyet a 3. példában leírtak szerint készítünk) 2 g allil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]éterrel 30 ’C-on 5 óra hosszat inkubálunk. Diklórmetánnal végzett extrakció és szilikagélen (az 1. példa szerint) végzett extrakció és szilikagélen (az 1. példa szerint) végzett tisztítás után 289 mg ( +_)glicil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]-étert kapunk; [a] d = +8,02’ (c = 1,16; etanol). Az Eu(hfc)3 európium shift-reagens jelenlétében (az 1. példa szerint) protonmágneses rezonanciaspektroszkópiával mért optikai tisztaság a protonmágneses rezonanciaspektroszkópiás mérések kísérleti hibáin belül 100%.

171 mg ( + )-glicidil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]étert (a 2. példában leírtak szerinti módszerrel) izopropil-aminnal reagáltatva 154 mg 44-45 ’C olvadáspontú (-)-metoprololt kapunk; [a] d = · 5,27° (c = 0,967; etanol). Az optikai tisztaság az

S-leucil-diasztereomer-származékok (2. példa szerinti) nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás vizsgálata alapján 98,4%. Az anyalúg bepárlásával 6 mg 92,2%-os optikai tisztaságú (-)-metoprololt kapunk.

7. példa

Allil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]-éter mikrobiológiai átalakítása ( + )-glicil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]éterré.

ml ásványi sós táptalaj, 0,05 ml Tween 80,0,05 ml tetradekán és 0,05 ml allil-[4-(2-metoxi-etií)-fenil]-éter elegyét inkubáljuk vagy Nocardia corallina ATCC 31338-eal vagy Rhodococcus sp. NCIB 11277-tel vagy Mycobacterium rhodochrous NCIB 9703-mal (melyeket előtte 72 óra hosszat 0,5% tetradekánon tenyésztünk), majd 30 ’C-on inkubáljuk. Mintákat veszünk 24 óra és 96 óra után, diklór-metánnal extraháljuk, és gázkromatográfiával (GC) analizáljuk.

A glicidil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]-6ternek megfelelő csúcsokat az egyes esetekben meghatározva a következő konverziókat az egyes esetekben meghatározva a következő konverziókat kapjuk: Mycobacterium rhodochrous 24 óra múlva 2%; Rhodococcus sp. 96 óra múlva 1% és Nocardia corallina 96 óra múlva 5%.

A szerkezet további bizonyítását úgy kapjuk, hogy egy Nocardia corallina felhasználásával (500 ml tenyészet, körülmények az előbbiek) végzett pontosan bemért kísérleti tenyészetet diklór-metánnal extrahálunk, majd szilikagélen tisztítjuk, és protonmágneses rezonanciaspektroszkópiával analizáljuk. A glicidil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]-éter európium shift-reagens jelenlétében felvett protonmágneses rezonanciaspektruma 100%-os optikai tisztaságot bizonyít, és azonos a Rhodococcus equivel kapott ( + )-glicidil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]éter európium shift-reagenssel felvett protonmágneses rezonanciaspektrumával.

8. példa

Allil-fenil-éter átalakítása Mycobacterium NCIB 11626-tal ( + )-fenil-glicidil-éterré, majd ennek átalakítása (-)-3-fenoxi-l-(izopropil-amino)-2propanollá.

Folytonos tenyésztési körülmények: 2,7 literes tenyészet-térfogat; AM2 táptalaj [amely 1,45 g/liter ammónium-szulfátot, 1,0 g/liter foszforsavat, 0,099 g/liter magnézium-szulfát-heptahidrátot, 0,015 g/liter kalcium-klorid-dihidrátot, 2 ml/liter TK3 nyomelem-oldatot, 1 ml/liter 0,1 mólos vas(Il)-szulfátheptahidrát oldatot tartalmaz]; szénforrás; 25 ml/perc etilén; levegő; 300 ml/perc; keverő sebessége: 280 ford/perc; hőmérséklet: 28 “C; pH = 6,8; hígítási sebesség: 0,02/óra (p._max = kb. 0,03/óra).

Ezek a körülmények körülbelül 3,2 g/liter szárazsúly biomassza szintet biztosítanak. A sejteket felhasználás előtt általában centrifugálással koncentráljuk, majd a megadott közegben reszuszpendáljuk.

A fenil-glicidil-étert gázkromatográfiával analizáljuk (oszlop és körülmények az előbbi példában megadottakkal azonosak, azzal az eltéréssel, hogy a hőmérséklet-program 50 ’C - 100 °C-ig 10 ’C/perc-nél).

Egy 2,25 literes térfogatú kétfázisú rendszert használunk a fenil-glicidil-éter előállításához. Az átalakítást 750 ml sejtszuszpenzióval (6,9 g/liter szárazsúly) és 1500 ml 2,5 térf. = térf.% allil-fenilétert tartalmazó izooktánnal töltött fermentorban hajtjuk végre (lásd 4. ábra). Az epoxid 193 pmól/óra/g száraz súly (0,03 gjőtejg száraz súly) sebességgel termelődik, és 10 óra múlva szilikagélen végzett kromatográfiával különítjük el, majd desztillációval tisztítva 750 mg ( + )-fenil-g!icidilétert kapunk.

A mikrobiológiai úton előállított ( + )-fenil-glicidil-éter protonmágneses rezonanciaspektruma és tömegspektruma egyezik a megfelelő szerkezettel, és azonos fenil-allil-éter m-klór-perbenzoesawal való reagáltatásával kémiai úton előállított (±)-fenil-glicidil-éter spektrumával. A (+ )-feniI-glicidil-6HU 201296 Β

Az optikai tisztaságot Eu(hfc)3 európium shiftreagens jelenlétében az 1. példában leírtakhoz hasonlóan protonmágneses rezonanciaspektroszkópiával vizsgáljuk. A shift-reagens hozzáadására az egyes gemmális protonoktól származó jelek burkoló görbéje a kémiailag szintetizált ( ± )-fenil-glicidil-éterben lefelé tolódik, és mindegyik két egyenlő intenzitású jelsávra hasad fel, míg a mikrobiológiailag előállított ( + )-fenil-gücidil-éterben lévő geminális protonoktól származó jelek sávja 6,7:1 arányban hasad fel. Ez az eredmény azt jelzi, hogy a molekulák 87%-a van az egyik enantiomer formában, ami 74%-os optikai tisztaságnak felel meg. A mikrobiológiai és kémiai forrásból származó epoxidok keverékének analízise olyan jelarányt ad, ami azt tanúsítja, hogy a (+)-feml-glicidil-éter 90%-a van az egyik enantiomer formában, ami 80%-os optikai tisztaságot jelent.

A ( + )-fenil-glicídil-éter optikai tisztaságának további vizsgálatát (-)-3-fenoxi-l-(izopropil-amino)-2-propanollá való átalakítása után végezzük el

300 mg (-t-)-fenil-glÍcidil-étert (a 2. példában leírtak szerint) izopropil-aminnal reagáltatva 125 mg (-)-3-fenoxi-l-(izopropil-amino)-2-propanolt kapunk, amelynek olvadáspontja 42-44 ’C; [aj^D = -6,5Γ (c = 0,984; etanol).

Hasonlóképpen szintetizálunk (±)-3-fenoxi-l(izopropil-amino)-2-propanolt ( ± )-fenil-glicidiléterből. A (-)-3-fenoxi-l-(izopropil-amino)-2-propanol protonmágneses rezonanciaspektruma és tömegspektruma (5. és 6. ábrák) és a (± )-3-fenoxi-l(izopropil-amíno)-2-propanol hasonló spektrumai (itt nem ábrázoljuk) egyeznek a megfelelő szerkezettel. Optikai tisztaságot a megfelelő S-leucil-diasztereomer származékok nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiájával mérünk (mint a 2. példában) és 80%-nak határozzuk meg.

9. példa (4-Allil-oxi-fenil)-acetamid átalakítása Pseudomonas oleovorans ATCC 29347-tel ( + )-(4/(2,3epoxi/propoxi)-fenil]-acetainiddá, majd ennek át alakítása (-)-3-(izopropíl-amino)-l-[4-(karbamoílmetil)-fenoxi]-2-propanollá, (-)-Atcnolol-lá.

Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 szuszpenziót készítünk (0,75% nátrium-laktátot és 0,05% dietoxi-metánt tartalmazó PSX ásványi sós táptalajon, pH 7-en, 30 ’C-on 24 óra hosszat tenyésztett) sejtek 7,5 pH-jú PSX táptalajban az eredeti sejttenyészet térfogata egytizedének megfelelő térfogatára való reszuszpendálásával. A PSX táptalaj 8,92 g/liter kálium-dihidrogén-foszfátot, 294 g/liter dinátrium-hidrogén-foszfátot, 0,2 g/liter ammónium-szulfátot, 0,2 g/liter kálium-kloridot, 0,294 g/liter trinátrium-citrátot, 0,005 g/liter kalciumszulfát-dihidrátot, 0,2 g/liter magnézium-szulfátheptahidrátot és 10 ml/liter PSII nyomelem oldatot tartalmaz. A PS II nyomelem oldat összetétele: 0,25 g/liter vas(II) -diammónium-szulfát-hexahidrát, 0,05 g/liter cink-szulfát-heptahidrát, 0,03 g/liter mangán (U)-klorid-tetrahidrát, 0,015 g/liter réz(II)szulfát-pentahidrát, 0,015 g/liter kobalt (Il)-kloridhexahidrát, 0,005 g/liter bórsav, 0,0055 g/liter nátrium-molibdenát-dihidrát, 0,01 g/liter kálium-jodid, sósavval pH 3,0-ra állítva.

Egy 2,5 literes Erlenmeyer-lombikba 1100 ml sejtszuszpenziót rázóasztalon 30 ’C-on 3,3 g 4-(alliloxi-fenilj-acetamiddal inkubálunk, amelyet 5% Tween-80-at tartalmazó vízzel golyósmalomban készített 10%-os szuszpenzióként adunk a sejtszuszpenzióhoz. Az inkubált elegyet 72 óra múlva 1000 ml diklór-metánnal extraháljuk, az oldatot megszárítjuk, majd bepároljuk. Utána a maradékot acetonból átkristályosítva 2,27 g fehér kristályos anyagot kapunk, amelynek összetétele 90% (4-alliloxi-fenil)-acetamid és 10% (4-(2,3-epoxi-propoxi)fenllj-acetamld a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás meghatározás szerint. [Oszlop: Lichrosorb RP8 (10 μη), 25 cm x 1/4 (6,35 mm) külső átm., 4,9 mm belső átm., mozgó fázis 40% acetonitril vízben, 2 ml/perc, UV detektálás].

A körülbelül 230 mg [4-(2,3-epoxi-propoxi)-fenilj-acetamidot tartalmazó kristályosított extraktumot 40 ml vízmentes etanolban oldjuk, utána 2,5 ml izopropil-aminnal visszafolyó hűtő alatt 5 óra hosszat forraljuk, majd a felesleges oldószert eldesztilíáljuk. A maradékot 50 ml diklór-metánban oldjuk, és 3 x 50 ml 0,2 n sósavoldatta] exiraháljuk. A savas fázisokat egyesítjük, diklór-metánnal mossuk, majd utána 5 n nátrium-hidroxid oldattal megiíigosítj uk. A keletkező fehér csapadékot 3 x 100 ml diklór-metánnal extraháljuk, az extraktumot nátrium-szulfáton szárítjuk, majd az oldószert ledesztilláljuk. A kapott fehér szilárd anyag hexán/etil-acetát elegyből végzett átkristályosításával 76 mg (-)Atenololt kapunk, amelynek olvadáspontja 146148 “C, [u] d = -3,9“ (c = 1,01; etanol).

A protonmágneses rezonanciaspektrum (CHCb, 360 MHz) adatat: δ 1,1 (d,6H,ch3); δ FŐZŐ sáv (s, 2H, NH, OH); ó 2,82 (m, 1H, NHCH); δ 2,75/2,95 (m, 2H CH₂NH); δ 3,53 (s, 2H, COCK₂); δ 3,98 (m, 3H, -O-CH₂ CH-); δ 5,35 sáv (s, 2H, NH₂); δ 6,9 (d, 2H, para-szubsztituált aromás); δ 7,2 (d, 2H, para-szubsztituált aromás).

A kémiai ionizációs (NH3) tömegspektrum egy m/e 267 (Μ + H) ⁺ molekuláris iont adott, 266 molekulasúlyt jelezve, ami egyezik a feltételezett tömeggel. A protonmágneses rezonanciaspektrum és a tömegspektrum azonos a kémiailag előállított (± )-Atenolol hasonló adataival.

A (-)-Atenolol optikai tisztaságát dibenzoil-borkősav-monoászter diasztereomer-származékainak fordított fázisú nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás oszlopon [Uichrosorb RP8 lOj^rn), 25 cm x 1/ (6,35 mm) jjvlső átmérő, 4,9 mm beúő átmérő, mozgó f$zis 2% ecetsav (pH 3,7-ra ammóniával) 50:50 metanol, 1,5 ml/perc] való elválasztásával határozzuk meg. A származék készítését ( ±)- vagy (-)-AtenoIol (R,R)-0,0-dibenzoil-borkősavanhídriddel a W.L,inder és munkatársai által a J.Chrom. 316,605-616 (1984)-ben leírtak szerint való reagáltatásával végezzük. A (± )-Atenololból készített származék analízise két közel egyenlő intenzitású diasztereomer csúcsot mutat, míg a (-)-Atenololból készített származék esetében a két csúcs intenzitásának aránya 1,5 : 98^5, ami 97,0%-os optikai tisztaságának felel meg,

10. példa (4-Allil-oxi-fenil)-acetamid átalakítása Pseudo7

-7HU 201296 Β monas oleovorans ATCC 29347-tel [4-(2,3-epoxipropoxi)-fenil]-acetamiddá.

Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 szuszpenziót készítünk (0,75% glicerint és 0,05% dietoxi-metánt tartalmazó PSX ásványi sós táptalajban 7 pH-nál 30 ’C-on 24 óra hosszat tenyésztett) sejtek

7,5 pH-nál az eredeti sejttenyészet térfogata egytizedének megfelelő térfogatú PSX táptalajban való reszuszpendálásával.

ml (12,6 g/liter szárazsúly) sejtszuszpenziót egy 250 ml-es ledugaszolt Erlehmeyer-lombikban vízmentes körkörös rázógépen 30 ’C-on inkubálunk 0,5 ml 90 mg/ml töménységű golyósmalomban őrölt és ultrahanggal homogenizált (4-allil-oxi-fenil)-acetamid szuszpenzióval, amely még 50 mg/ml Tween 80-at is tartalmaz. 1 ml-es mintákat 2 ml diklór-metánnal extrahálunk, az oldószert eldesztilláljuk, majd a maradékot a [9. példában a [4-(2,3cpon-propoxi)-fenii]-acetanud analízisére leírt körülmények között végzett] nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás analízis előtt dimetil-formamidban oldjuk. Az inkubációs elegybe a [4-(2,3cpoxi-propoxi)-fenil]-acetamid szintje 0,9 g/liter, illetve 1,3 g/liter 3 óra, illetve 24 óra ínkubálás után.

11. példa (4-Allil-oxi-feail)-acetamid átalakítása Pseudomonas aerugiuosa NCIB 12036-tal, Pseudomonas aeruginosa NCIB 8704-gyel és Pseudomonas púddá NCIB 9571-gyel [4-(2,3-epoxi-propoxi)-feml]acetamíddá.

Pseudomonas aeruginosa NCIB 12036, Pseudomonas aeruginosa NCIB 8704 és Pseudomonas púddá NCIB 9571 sejtszuszpenziókat készítünk (0,75% nátrium-laktátot és 0,05% dietoxi-metánt tartalmazó PSX ásványi savas táptalajon, 7 pH-n, 30 ’C-on 24 óra hosszat tenyésztett) sejteknek az eredeti sejttenyészet térfogata egytizedének megfelelő térfogatú 7,5 pH-jú PSX-táptalajban való reszuszpendálásával.

ml sejtszuszpenziót vízszintes körkörös rázógépen 250 ml-es ledugaszolt Erlenmeyer-lombikban 0,5 ml 10%-os töménységű golyósmalomban őrölt (2-allil-oxí-feníl)-acetamjd szuszpenzióval (amely még 5% Tween 80-at is tartalmaz) 30 ’C-on inkubálunk. Az. inkubációs elegyeket 24 óra múlva diklór-metánnal extraháljuk. Az inkubációs elegyekcl 24 óra múlva diklór-metánnal extraháljuk, és a következő [4-(2,3-epoxi-propoxi)-fenil]-acetamid koncentrációkat találjuk: Pseudomonas aeruginosa NCIB 12036-nál 0,07 g/liter; Pseudomonas aerugínosa NCIB 8704-nél 0,0S g/liter; Pseudomonas pulija NCIB 9571-nél 0,19 g/liter (analízis nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiával, mint az előbbi példákban).

72. példa

Alíil-[4-(2-metoxi-etii)-fenil]-éter átalakítása glicidil-[4-(2-mctoxi~ctil)-feml]-éterré Pseudomonas oleovorans ATCC 29347-tel.

Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 szuszpenziót készítünk (0,075% glicerint és 0,05% dietoxi-metánt tartalmazó 7 pH-jú PSX ásványi sós táptalajon 30 “C-on állandó fázisig tenyésztett) sejteknek az eredeti sejttenyészet térfogata egytizedé8 nek megfelelő térfogatú 7,5 pH-jú PSX táptalajban való reszuszpendálásával.

Egy 250 ml-es Erlenmeyer lombikban 10 ml (12,6 g/liter szárazsúlyú) sejtszuszpenziót inkubálunk vízszintes körkörös rázógépen 37 ’C-on 250 μΐ allil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]-éterrel és 50 ml glükózzal. A glicidil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]-éter képződését diklór-metánnal végzett extrakció után gázkromatográfiával követjük nyomon (az előbbi példákban leírt körülmények között). Az inkubációs elegyben a glicídil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]-éter koncentrációja hat óra múlva 7,30 g/liter.

13. példa

4-(2-CikIopropil-metoxi-etil)-fenil-allil-éter átalakítása Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 törzzsel ( + )-4-(2-ciklopropil-metoxi-etil)-fenilglicidil-éterré

Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 0,5 g/l dietoxi-metánt tartalmazó, 100 ml PSX ásványi sós közegben (pH = 7,0) 7,5 g/l glicerinen 30 ’C-on tenyésztett 24 órás biomasszáját 10 ml PSX közeget (pH = 7,5), 5 g/l glükózt és 25 g/l 4-(2-ciklopropilmetoxi-etil)-allil-étert tartalmazó 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba töltjük. A lombik tartalmát 30 ’Con körkörös rázógépen inkubáljuk, és mintákat veszünk, amelyeket diklór-metánnal való extrahálás után Varian 3400 gázkromatográfon analizálunk (oszlop: 3% OVI WHP 100-120-on; 50 cm hossz; 2 mm átmérő; 100—tói 170 ’C-ig 10 ’C/perc; N₂ 30 ml/perc).

PSX közeg: 8,92 g/l kálium-dihidrogén-foszfát, 2,94 g/l dinátrium-hidrogén-foszfát, 1,0 g/l diammónium-hidrogén-foszfát, 0,2 g/l amtnónium-szulfát, 1,0 g/l cliammónium-hidrogén-foszfát, 0,2 g/l ammónium-szulfát, 0,2 g/l kálium-klorid, 0,294 g/l trinátrium-citrát, 0,005 g/l kalcium-szulfát-dihidrát, 0,2 g/l magnézium-szulfát-heptahidrát és 10 ml/1 PS II nyomelem oldat (PS II nyomelem oldat összetétele: 0,25 g/l ammónium-szulfát-vas-szulfáthexahidrát, 0,05 g/l cink-szulfát-heptahidrát, 0,03 g/l mangán-klorid-tetrahidrát, 0,015 g/l réz-szulfátpentahidrát, 0,015 g/l kobalt-klorid-hexahidrát, 0,005 g/l bórsav, 0,0055 g/l bórsav, 0,0055 g/l nátrium-molibdenát-dihidrát, 0,01 g/l kálium-jodid és 3 ρΗ-ig sósav).

A (+)-4-(2-cikIopropil-metoxi-etil)-fenil-glicidil-éter termék három órás inkubálás után jelenik meg, és 24 óra alatt 3,03 g/l koncentrációra dúsul.

Megfelelő mennyiségű (+ )-4-(2-ciklopropilmetoxi-etil)-fenil-glicidil-éter feldúsítására az előbb leírt körülmények között hat óra hosszat, de 37 ’C-on inkubált 10X10 ml-es tenyészeteket 500 ml diklór-metánnal extraháljuk. A kivonatot nátriumszulfáton szárítjuk, az oldószert elpárologtatjuk, és az epoxidot kovasavgélen hexán és éter elegyével gradiens eluálással (az epoxid 45-60% éterrel eluálható) tisztítva 188 mg ( + )-4-(2-cíklopropiJ-metoxi-etil)-fenil-glicidil-étert kapunk, [aj d = +1,8° (c = 1,0, kloroformban).

A termék PMR spektruma megfelel a kívánt szerkezetnek, és azonos a kémiai szintézissel előállított 4-(2-ciklopropil-metoxi-etil)-fenil-glicidiléter spektrumával.

A termék optikai tisztaságát enantiomerjeinek

-8HU 201296 Β királis HPLC oszlopon (Daicel chiralcel OD; 25 cm x 4,6 mm; mozgó fázis: hexán, 2-propanol és dietilamin 800:200:1; 0,6 ml/perc, UV-dctektálás 254 nm) végzett vizsgálatával igazoljuk.

A kémiai szintézissel előállított 4-(2-ciklopropilmetoxi-etil)-fenil-glicidil-éter elemzése két, körülbelül egyenlő intenzitású csúcsot mutat a racemátnak megfelelően. A Pseudomonas oleovorans alkalmazásával előállított minta csak egy kimutatható csúcsot mutat, amely a kémiai szintézissel készített minta egyik csúcsának felel meg.

14. példa (4-Metoxi-fenil)-allil-éter átalakítása ( + )-(4metoxi-fenil)-glicidil-éterré Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 törzzsel

Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 0,5 g/l dietoxi-metánt tartalmazó, 100 ml PSX ásványi sós közegben (pH = 7,0) 7,5 g/l glicerinen 30 °C-on tenyésztett 24 órás biomasszáját 10 ml PSX közeget (pH = 7,5), 5 g/l etanolt és 25 g/l (4-metoxi-fenil)allil-étert tartalmazó 250 ml-es Erlenmeyer-lom bikba töltjük. A lombik tartalmát 37 °C-on körkörös rázógépen inkubáljuk, és mintákat veszünk, amelyeket diklór-metánnal extrahálunk a 13. példában ismertetett módon végzett gázkromatografálás előtt.

A ( + )-(4-metoxi-fenil)-glicidil-éter termék egy órás inkubálás után jelenik meg, és 4 óra alatt 0,57 g/l koncentrációra dúsul.

Megfelelő mennyiségű ( + )-(4-metoxí-fenil)glicidil-éter feldúsítására az előbb leírt körülmények között három óra hosszat, de 2 literes lombikokban inkubált 6x87 ml-es tenyészeteket 780 ml diklór-metánnal extraháljuk. A kivonatot nátriumszulfáton szárítjuk, az oldószert elpárologtatjuk, és az epoxidot kovasavgélen hexán és éter elegyével tisztítve 190 mg ( + )-(4-metoxi-fenil)-glicidil-étert kapunk. [aj^D = +4,1° (¢ = 1,0, kloroformban).

A termék tömeg- és PMR spektruma megfelel a kívánt szerkezetnek, és azonos a kémiai szintézissel előállított (4-metoxi-fenil)-glicidil-éter spektrumával.

A termék optikai tisztaságát enantiomerjeinek királis HPLC oszlopon a 13. példában leírt módon való szétválasztásával határoztuk meg, de mozgó fázisként hexán, 2-propanol és dietil-amin 900:100:1 arányú elegyét használtuk.

A kémiai szintézissel előállított (4-metoxi-fenil)glicidil-éter elemzése két, körülbelül egyenlő intenzitású csúcsot mutat a racemátnak megfelelően. A Pseudomonas oleovorans alkalmazásával előállított minta csak egy kimutatható csúcsot adott, amely a kémiai szintézissel készített minta egyik csúcsának felel meg.

15. példa para-Szubsztituált fenil-allil-éterek átalakítása Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 törzzsel megfelelő, optikailag aktív para-szubsztituált fenilglicidil-éterekké

Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 0,5 g/l dietoxi-metánt tartalmazó, 100 ml PSX ásványi sós közegben (pH = 7,0) 7,5 g/l glicerinen 30 °C-on tenyésztett 24 órás biomasszáját 10 ml PSX közeget ló (pH=7,5), 5 g/l mennyiségét tartalmazó 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba töltjük. (Etoxi-fenil)-alliléter és (fenil-fenil)-allil-éter esetében a prekurzort vízzel készült, 5% Tween’80-at tartalmazó, golyósmalomban őrölt, 10%-os szuszpenzióként alkalmazzuk. A lombikokat 37 °C-on körkörös rázógépen inkubáljuk, és mintákat veszünk, amelyeket diklór-metánnal extraháljunk a 13. példában ismertetett módon végzett gázkromatografálás előtt.

Az aril-glicidíl-éter termékek három órás inkubálás után jelennek meg, és öt óra alatt az alábbi koncentrációkra dúsulnak:

Vegyület Koncentráció (g/l)

I (4-klór-fenil)-glicidil-éter l,9i

II (4-etoxi-fenil)-glicidil-éter 0,15

III (4-fluor-fenil)-glicidil-éter 0,26

IV [4/(metil-tio)-fenil]-glicidil-éter 1,52

V (4-nitro-fenil)-glicidiI-éter 3,02

VI (4-fenoxi-fenii)-glicidiI-éter 0,22

VII (4-fenil-fénil)-glicidil-éter 0,4,3

A termékek optikai tisztaságát enantiomerjeiknek királis HPLC oszlopon a 13. példában (II-Ví vegyületek), illetve a 14. példában (I, III és Vll vegyületek) leírt módon való szétválasztásával határoztuk meg.

A kémiai szintézissel előállított aril-glicidil-éterek elemzése két, körülbelül egyenlő intenzitású csúcsot mutat a racemátnak megfelelően. A Pseudomonas oleovorans alkalmazásával előállított minta csak egy kimutatható csúcsot adott, amely a kémiai szintézissel készített minta egyik csúcsának felel meg.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás az (I) általános képletű 3-szubsztituáu l-(alkil-amino)-2-propanolok - a képletben

Rl jelentése fenilcsoport vagy karbamoil-(l-4 szénatomos)-alkil- vagy (1-4 szénatomos)-alkoxi(1-4 szénatomos) alkilcsoporttal szubsztituált fenilcsoport,

R₂ jelentése 2-6 szénatomos alkilcsoport vagy gyógyszerészetileg elfogadható savaddíciós sóik szíereospecifikus formában való előállítására, azzal jellemezve, hogy egy (III) általános képletű vegyületet - a képletben

Rl jelentése az (I) általános képletnél megadottakkal azonos Nocardia corallina, Rhodococcus sp. (NCIB 11277), Mycobacterium rhodochrous, Rhodococcus equi, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas putida, Myobacterium WM1 (NCIB 11626) mikroorganizmussal szterospecifikusan epoxidálunk, és a kapott (II) általános képletű fenil-(2,3-epoxi-l-propil)-étert - Rí a fenti - 2-6 szénatomos alkil-aminnal reagáltatjuk, és a keletkezett (I) általános képletű vegyületet gyógyszerészetileg elfogadható sójává alakítjuk át. (Elsőbbsége: 1985.02.13.)
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 2-6 szénatomos alkil-aminként izopropilamint vagy terc-butil-amint használunk. (Elsőbbsé9

-9HU 201296 Β ge: 1985.02.13.)
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás olyan (1) általános képletű vegyületek előállítására, amelyek képletében

Rl jelentése fenilcsoport vagy 4-helyzetben karbamoÚ-(l-4 szénatomos) alkilcsoporttal vagy az alkilrészekben 1-4 szénatomos alkoxi-alkilcsoporttal szubsztituált fenilcsoport, azzal jellemezve, hogy megfelelő kiindulási vegyületeket reagáltatunk. (Elsőbbsége: 1985.02.13.)
4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, amelyek képletében

Rl jelentése 4-(2-meto»-etil)-fenil-, 4-(karbamoil-metil)-fenil- vagy fenil-csoport, azzal jellemezve, hogy megfelelő kiindulási vegyületeket reagáltatunk. (Elsőbbsége: 1985.02.13.)
5. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, amelyek képletében

Rl jelentése 4-(2-metoxi-etil)-fenilcsoport, azzal jellemezve, hogy megfelelő kiindulási vegyületeket reagáltatunk. (Elsőbbsége: 1985.02.13.)
6. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, amelyek képletében

Rl jelentése 4-(karbamoil-metil)-fenilcsoport, azzal jellemezve, hogy megfelelő kiindulási vegyületeket reagáltatunk. (Elsőbbsége: 1985.10.16.)
7. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, amelyek képletében

Rl jelentése fenilcsoport, azzal jellemezve, hogy megfelelő kiindulási vegyületeket reagáltatunk. (Elsőbbsége: 1985.10.16.)
8. Az 1. igénypont szerinti eljárás l-(izopropilamino)-3-[4/(2-rnetoxi-etil) -fenoxi]-2-propanol előállítására, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Nocardia corallina, előnyösen Nocardia corallina ATCC 31338 mikroorganizmust alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1985.02.13.)
9. Az 1. igénypont szerinti eljárás l-(izopropilamino)-3-[4-(2-metoxi-etil)-fenoxi]-2-propanol előállítására, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Rhodococcus sp. NCIB 11277 mikroorganizmust alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1985.02.13.)
10. Az 1. igénypont szerinti eljárás l-(izopropil¹⁸ amino)-3-[4-(2-metoxi-etil)-fenoxi]-2-propanol előállítására, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Mycobaeterium rhodochróus, előnyösen Mycobaeterium rhodochrous NCIB 9703 mikroorganizmust alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1985.02.13.)
11. Az 1. igénypont szerinti eljárás l-(izopropilamino)-3-[4-(2-metoxi-etil)-fenoxi]-2-propanol előállítására, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Rhodococcus equi, előnyösen Rhodococ10 cus equi NCIB 12035 mikroorganizmust alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1985.02.13.)
12. Az 1. igénypont szerinti eljárás l-(izopropilamino)-3-[4-(2-metoxi-etil)-fenoxi]-2-propanol előállítására, azzal jellemezve, hogy mikroorganiz15 musként Pseudomonas aeruginosa, előnyösen Pseudomonas aeruginosa NCIB 12036 mikroorganizmust alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1985.02.13.)
13. Az 1. igénypont szerinti eljárás l-(izopropilamino)-3-[4-(2-metoxi-etil)-fenoxil-2-propanol el20 őállítására, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Pseudomonas oleovorans, előnyösen Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 mikroorganizmust alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1985.02.13.)
14. Az 1. igénypont szerinti eljárás l-(izopropil25 amino)-3-[4-(2-metoxi-etil)-fenoxi]-2-propanol előállítására, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Pseudomonas putída, előnyösen Pseudomonas putida, előnyösen Pseudomonas putída NCIB 9571 mikroorganizmust alkalmazunk. (El30 sőbbsége: 1985.02.13.)
15. Az 1. igénypont szerinti eljárás l-(izopropilamino)-3-[4-(2-metoxi-etil)-fenoxi]-2-propanol előállítására, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Pseudomonas aeruginosa, előnyösen Pse35 udomonas aeruginosa NCIB 8704 mikroorganizmust alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1985.02.13.)
16. Az 1. igénypont szerinti eljárás l-(izopropilamino)-3-fenoxi-2-propanol előállítására, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Mycobacteri40 um WMí, NCIB 11626 mikroorganizmust alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1985.02.13.)
17. Az 1. igénypont szerinti eljárás l-(izopropilamino)-3-[4-(2-metoxi-etil)-fenoxi]-2-propanol előállítására, azzal jellemezve, hogy mikroorganiz45 musként Pseudomonas oleovorans, előnyösen Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 mikroorganizmust alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1985.10.16.)