FI120046B - Menetelmä yhdistelmä-DNA-adenovirusgenomin valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä yhdistelmä-DNA-adenovirusgenomin valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI120046B FI120046B FI973309A FI973309A FI120046B FI 120046 B FI120046 B FI 120046B FI 973309 A FI973309 A FI 973309A FI 973309 A FI973309 A FI 973309A FI 120046 B FI120046 B FI 120046B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- plasmid
- genome
- adenovirus
- region
- adenovirus genome
- Prior art date
Links
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 title claims abstract description 92
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 105
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 64
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 48
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 29
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 21
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 claims description 15
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 15
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 claims description 14
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 13
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 claims description 9
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 claims description 9
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 claims description 9
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 claims description 9
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 claims description 9
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 241000701157 Canine mastadenovirus A Species 0.000 claims description 3
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 claims description 3
- 101000768957 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 37.2 kDa protein Proteins 0.000 claims description 2
- 101000823746 Acidianus ambivalens Uncharacterized 17.7 kDa protein in bps2 3'region Proteins 0.000 claims description 2
- 101000916369 Acidianus ambivalens Uncharacterized protein in sor 5'region Proteins 0.000 claims description 2
- 101000769342 Acinetobacter guillouiae Uncharacterized protein in rpoN-murA intergenic region Proteins 0.000 claims description 2
- 101000823696 Actinobacillus pleuropneumoniae Uncharacterized glycosyltransferase in aroQ 3'region Proteins 0.000 claims description 2
- 101000786513 Agrobacterium tumefaciens (strain 15955) Uncharacterized protein outside the virF region Proteins 0.000 claims description 2
- 101000618005 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_00885 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100020724 Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 101000967489 Azorhizobium caulinodans (strain ATCC 43989 / DSM 5975 / JCM 20966 / LMG 6465 / NBRC 14845 / NCIMB 13405 / ORS 571) Uncharacterized protein AZC_3924 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000823761 Bacillus licheniformis Uncharacterized 9.4 kDa protein in flaL 3'region Proteins 0.000 claims description 2
- 101000819719 Bacillus methanolicus Uncharacterized N-acetyltransferase in lysA 3'region Proteins 0.000 claims description 2
- 101000789586 Bacillus subtilis (strain 168) UPF0702 transmembrane protein YkjA Proteins 0.000 claims description 2
- 101000792624 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YbxH Proteins 0.000 claims description 2
- 101000790792 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YckC Proteins 0.000 claims description 2
- 101000819705 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxR Proteins 0.000 claims description 2
- 101000948218 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YtxJ Proteins 0.000 claims description 2
- 101000718627 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Putative RNA polymerase sigma-G factor Proteins 0.000 claims description 2
- 101000641200 Bombyx mori densovirus Putative non-structural protein Proteins 0.000 claims description 2
- 101000947633 Claviceps purpurea Uncharacterized 13.8 kDa protein Proteins 0.000 claims description 2
- 101000948901 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 16.0 kDa protein in segB-ipI intergenic region Proteins 0.000 claims description 2
- 101000805958 Equine herpesvirus 4 (strain 1942) Virion protein US10 homolog Proteins 0.000 claims description 2
- 101000790442 Escherichia coli Insertion element IS2 uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 claims description 2
- 101000788354 Escherichia phage P2 Uncharacterized 8.2 kDa protein in gpA 5'region Proteins 0.000 claims description 2
- 101000770304 Frankia alni UPF0460 protein in nifX-nifW intergenic region Proteins 0.000 claims description 2
- 101000797344 Geobacillus stearothermophilus Putative tRNA (cytidine(34)-2'-O)-methyltransferase Proteins 0.000 claims description 2
- 101000748410 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in fumA 3'region Proteins 0.000 claims description 2
- 101000772675 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) UPF0438 protein HI_0847 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000631019 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Uncharacterized protein HI_0350 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000768938 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 8.9 kDa protein in int-C1 intergenic region Proteins 0.000 claims description 2
- 101000785414 Homo sapiens Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000782488 Junonia coenia densovirus (isolate pBRJ/1990) Putative non-structural protein NS2 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000811523 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 55.8 kDa protein in cps region Proteins 0.000 claims description 2
- 101000818409 Lactococcus lactis subsp. lactis Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in lacX 3'region Proteins 0.000 claims description 2
- 101000878851 Leptolyngbya boryana Putative Fe(2+) transport protein A Proteins 0.000 claims description 2
- 101000758828 Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) Uncharacterized protein Mbar_A1602 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001122401 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF3 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001055788 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) Pentapeptide repeat protein MfpA Proteins 0.000 claims description 2
- 101710087110 ORF6 protein Proteins 0.000 claims description 2
- 101000740670 Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus Protein C42 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000769182 Photorhabdus luminescens Uncharacterized protein in pnp 3'region Proteins 0.000 claims description 2
- 101000961392 Pseudescherichia vulneris Uncharacterized 29.9 kDa protein in crtE 3'region Proteins 0.000 claims description 2
- 101000731030 Pseudomonas oleovorans Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase 2 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001065485 Pseudomonas putida Probable fatty acid methyltransferase Proteins 0.000 claims description 2
- 101000711023 Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Uncharacterized protein in tfuA 3'region Proteins 0.000 claims description 2
- 101000948156 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 47.3 kDa protein in thcA 5'region Proteins 0.000 claims description 2
- 101000917565 Rhodococcus fascians Uncharacterized 33.6 kDa protein in fasciation locus Proteins 0.000 claims description 2
- 101000790284 Saimiriine herpesvirus 2 (strain 488) Uncharacterized 9.5 kDa protein in DHFR 3'region Proteins 0.000 claims description 2
- 101000936719 Streptococcus gordonii Accessory Sec system protein Asp3 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000788499 Streptomyces coelicolor Uncharacterized oxidoreductase in mprA 5'region Proteins 0.000 claims description 2
- 101001102841 Streptomyces griseus Purine nucleoside phosphorylase ORF3 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000708557 Streptomyces lincolnensis Uncharacterized 17.2 kDa protein in melC2-rnhH intergenic region Proteins 0.000 claims description 2
- 101000649826 Thermotoga neapolitana Putative anti-sigma factor antagonist TM1081 homolog Proteins 0.000 claims description 2
- 101710095001 Uncharacterized protein in nifU 5'region Proteins 0.000 claims description 2
- 101000827562 Vibrio alginolyticus Uncharacterized protein in proC 3'region Proteins 0.000 claims description 2
- 101000778915 Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 (strain RIMD 2210633) Uncharacterized membrane protein VP2115 Proteins 0.000 claims description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 claims 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 4
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 abstract description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 34
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 15
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 9
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102100038909 Caveolin-2 Human genes 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000740981 Homo sapiens Caveolin-2 Proteins 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 3
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 102100035888 Caveolin-1 Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 101000715467 Homo sapiens Caveolin-1 Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001731 2-cyanoethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C([H])([H])C#N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- RSIWALKZYXPAGW-NSHDSACASA-N 6-(3-fluorophenyl)-3-methyl-7-[(1s)-1-(7h-purin-6-ylamino)ethyl]-[1,3]thiazolo[3,2-a]pyrimidin-5-one Chemical compound C=1([C@@H](NC=2C=3N=CNC=3N=CN=2)C)N=C2SC=C(C)N2C(=O)C=1C1=CC=CC(F)=C1 RSIWALKZYXPAGW-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- -1 ApoAIV Proteins 0.000 description 1
- 102000013918 Apolipoproteins E Human genes 0.000 description 1
- 108010025628 Apolipoproteins E Proteins 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000252505 Characidae Species 0.000 description 1
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000007702 DNA assembly Methods 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 1
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 1
- 241000353621 Eilat virus Species 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 description 1
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004038 Glia Maturation Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000495 Glia Maturation Factor Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 1
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 description 1
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 1
- 241001666145 Noia Species 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- JNTOCHDNEULJHD-UHFFFAOYSA-N Penciclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(CCC(CO)CO)C=N2 JNTOCHDNEULJHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000053208 Porcellio laevis Species 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 101100379247 Salmo trutta apoa1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100032889 Sortilin Human genes 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N aciclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCO)C=N2 MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 239000003914 blood derivative Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009852 coagulant defect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- AVAACINZEOAHHE-VFZPANTDSA-N doripenem Chemical compound C=1([C@H](C)[C@@H]2[C@H](C(N2C=1C(O)=O)=O)[C@H](O)C)S[C@@H]1CN[C@H](CNS(N)(=O)=O)C1 AVAACINZEOAHHE-VFZPANTDSA-N 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000001343 mnemonic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Inorganic materials [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Mycology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
Mens fe e Imä yhd i s fee Ima - DNÄ-adeno vi rus genomin valmi s fc ami seksi
Esillä oleva keksintö koskee uutta menetelmää yh-5 distelmä-DNA-adenovirusten valmistamiseksi sekä näiden adenovirusten käyttöä geeniterapiassa. Keksintö koskee myös prokarypottisia plasmidej a, jotka sopivat näiden adenovirusten valmi s tukseen.
Geeniterapiassa korjataan puutos tai epänormaalius 10 (mutaatio, poikkeava ilmentyminen jne.) viemällä sairastuneeseen soluun tai elimeen geneettistä tietoa. Tämä geneettinen tieto voidaan viedä joko in vitro elimestä uutettuun soluun, minkä jälkeen modifioitu solu viedään takaisin organismiin, tai suoraan in vivo sopivaan kudok-15 seen. Tässä jälkimmäisessä tapauksessa on olemassa erilaisia tekniikoita, joista mainittakoon erilaiset trans-fektointitekniikat, joissa käytetään komplekseja DNÄ:.sta ja DEAE-dekstraanista [Pagano et ai. . J. Virol. 1 (1967) 891], DNA:Sta ja tumaproteiineista [Kaneda et ai. , Science 20 243 (1989) 375] , DNA:sta ja lipideistä [Feigner et ai, .
PNAS 84 (1987) 7413], liposomeja [Fraley et ai.. J. Biol.
Chem, 255 {I960) 10431] jne. Nyttemmin virusten käyttö vektoreina geenien siirtämiseksi on ilmaantunut lupaavaksi 1 vaihtoehdoksi näille fyysisille transfektointitekniikoil- j 25 le. Tässä suhteessa on testattu eri virusten kykyä tartuttaa tiettyjä solupopulaatioita, erityisesti retroviruksia (RSV, HMS, MMS jne.), HSV-virusta, adenoliitteisiä viruksia ja adenoviruksla, ξ Näistä viruksista adenovirukset osoittavat tietty- il 30 ja käyttöä geeniterapiassa silmällä pitäen kiinnostavia j ominaisuuksia. Etenkin niiden isäntäskaala on suhteelli- 1 sen laaja, ne kykenevät tartuttamaan lepotilassa olevia soluja, ne eivät integroidu tartutetun solun genomiin, ja j niitä ei ole tähän päivään mennessä yhdistetty merkittä- j 35 viin ihmispatologioihin. Adenqviruksia on siten käytetty f \ \ | .2' kiinnostavien geenien siirtämiaeksi lihakseen [Ragot. et. ai, , Nature 3 61 {1993} 647] , maksaan [ Jaf f e et ai.· » Nature Genetics 1 (1992) 3 72] , keskushermostoon [Akli et. ai,, Nature Genetics 3. ¢1993} 224] jne.
5 Adenovirukset ovat lineaarisia kaksisäikeisiä DNA- viruksia, joiden koko on noin 36 ke. Niiden genomi käsittää etenkin toistuvan käänteisen sekvenssin (ITR) kummassakin päässä, k ap s i d a a t i o s ekvens s i n (Psi), varhaisgeenej ä ja myöhäisgeenejä (vrt. kuvio 1), Pääasialliset varhais-10 geenit sisältyvät alueisiin El, E2, E3 ja E4, Näistä alueeseen El sisältyvät geenit ovat välttämättömiä viruksen lisääntymiselle; Pääasialliset myöhä!sgeenit sisältyvät alueisiin LI - L5. Adenoviruksen Ad5 genomi on kokonaisuudessaan sekventoitu ja se on saatavana annettujen arvojen 15 perusteella (katso etenkin Genebank M73260). Samoin osia muista adenovirusgenomeista, tai jopa ne kokonaisuudessaan , on myös sekventoitu (Ad2, AdT, Adl2 jne.).
Ottaen huomioon adenovirusten edellä mainitut ominaisuudet ja ottaen huomioon, että on mahdollista saada 20 korkeita virustiittereitä, näitä on jo käytetty geenien siirtämiseksi in vivo. Tässä tai'koituksessa on valmistettu erilaisia adenövirusperäisiä vektoreita, jotka sisältävät eri geenejä (15-gal, OTC, a-ΙΑΤ, sytokiinit jne.) . Kussakin näistä jrakenteista adenovirus ta on modifioitu sen 25 tekemiseksi kykenemättömäksi repiikoitumaan geenisiirron jälkeen. Täten alan teknisen tason puitteissa kuvatut rakenteet ovat adenoviruksia, joista on deletoitu alueet El ja mahdollisesti Ξ3, joiden tilalle, on Insertoitu hetero-logisia DNA-sekvenssej ä [Levrero: et. ai. . Gene 101 (19 91) 30 195; Gosh-Choudhury et ai . . Gene 50 (1986) 161] . Toiset rakenteet käsittävät deleetion alueella El ja niistä on deletoitu alueen E4 epäoleellinen osa (WQ94/12 649} tai ne käsittävät modifioidun genomiorganisaation (FR 9 413 355).
Kuitenkin adenovirusten teollinen ja terapeuttinen 3 5 hyödyntäminen on edelleen rajoitettua tämänhetkisillä, me- 3 netelmillä näiden yhdistelmä-DNA-adenovirusten valmistamiseksi .
Näitä adenoviruksia tuotetaan itse asiassa trans-fektoimalla yhdistelmä-DNA-viruksen DNA t ran s f o rmo i t umi s-5 kelpoiseen kapsidaatiosolulinjaan. Kyseessä voi olla yksinkertainen transfektointi silloin, kun käytettävissä on rakenne, joka käsittää yhdistelmä-DNA-viruksen genomin kokonaisuudessaan, tai kuten useimmiten on asianlaita, useampien DNA-fragmenttien kotransfektointi, jotka käsitit) tavat yhdisielmä-DNÄ-adenovirusgenomin. eri osat. Tässä tapauksessa menetelmässä on yksi tai useampi homologinen DNA-yhdistymisvaihe eri rakenteiden, välillä kapsidaatio-solulinjassa yhdistelmä-DNA-viruksen DNA:n muodostamiseksi. Jommankumman näistä menetelmistä suorittamiseksi on 15 siten välttämätöntä hankkia sopivat rakenteet, jotka käsittävät kokonaisuudessaan tuotettavaksi halutun yhdistelmä -DNA- adeno viruksen genomin tai osia siitä.
On olemassa erilaisia, alan teknisen tason puitteissa kuvattuja menetelmiä näiden rakenteiden valmista-20 miseksi in vitro. Yleisimmin käytetyn tekniikan mukaan virus-DNA eristetään, minkä jälkeen sitä modifioidaan in vitro molekyylibiologian tavanomaisilla menetelmillä (pilkkominen, ligatointi jne.) . Saatuja rakenteita puhdistetaan sitten ja niitä käytetään kapsidaatiosolulinjo-25 jen transfektoimiseksi. Kuitenkin tämän tekniikan mukaan on valmistettava virusvarastoja ja puhdistettava virus-DNA kohden kutakin rakennetta tai kohden kutakin yhdis-telmä-DNA-viruksen DNA:n manipulointia. Toinen tekniikkaa perustuu plasmidin käyttöön, joka käsittää osan yhdistel-30 mä-DNA-adenoviruksen genomista, ja joka kotransfektoidaan viruksen kanssa, joka käsittää genomin puuttuvan osan. Kuitenkin kuten edellä mainittiin tämän menetelmän mukaan tapahtuu DNA-yhdistyminen kapsidaatiosolulinjassa ja käytettävissä on oltava sopiva ylimääräinen virus. Näiden 3 5 haittojen korj aami seksi on ehdotettu prokaryoottisten 4 plasmidien käyttämistä transfektointiin käytettävien virus -DNA- sekvenssien valmistamiseksi. Erityisesti Bett et ai. FPNAS 91 (1994) 8802] kuvaavat EN. collssa replikoitu-van plasmidin rakentamista, joka käsittää modifioidun 5 adenovirusgenomin (plasmidi pBHGIO). Täsmällisemmin tämä plasmidi käsittää adenovirusgenomin, josta on deletoitu alueet El, E3 ja Psi, josta on tehty ympyränmuotoinen yhdistämällä ITR-sekvenssit ja joka käsittää adenovirusgenomin alueelle 188 - 1 339 insertoituna osan plasmidista 10 pBR322. Tämä plasmidi voi replikoitua EN. colissa. jota on manipuloitu kiinnostavien geenien insertoimiseksi, mutta sillä on edelleen huonoja puolia. Sen käyttöön virusten tuottamiseksi liittyy etenkin vähintään toisen plasmidin käyttö, joka käsittää virusgenomin vasemmanpuoleisen 15 alueen. Muita tämän tyyppisiä plasmideja, joilla on samankaltaisia huonoja puolia, ovat kuvanneet esimerkiksi Sraham [EMBQ J. 3.:12 (1984) 2917] . Näitä plasmideja käy tettäessä on myös välttämätönkö suorittaa DNA-yhdistyrni s-vaihe kap s i da a t i o s oi ui s sa.
20 Erityisesti näiden teknologioiden yhteydessä on välttämätöntä käyttää eri plasmideja adenovirusgenomin eri alueiden manipuloinnin mahdollistamiseksi. Lisäksi yhdiste 1 m ä - DNA - v i. r u k s i a saadaan vasta kapsidaatiosoluihin kot-ransfektoitujen genomifragmenttien homologisen DNÄ-yhdis-25 tymisen, jälkeen. Tämä rajoittaa edelleen - yhdistelmä-DNA-virusten saantitiheyttä, ja kokonaisprosessi on hidas.
Täten alan teknisen tason puitteissa on olemassa selvä tarve saada käyttöön sopivia plasmideja, joita voidaan manipuloida helposti ja monistaa in vitro, yhdistel-3 0 mä-DNA-aclenovirusgenomien valmistamiseksi . On samoin tär keätä, että näin tuotetut genomit ovat käytännöllisesti katsoen vailla plasmidista peräisin olevia alueita, jotka mahdollisesti (i) indusoivat immuunivasteen, (ii) koodit ·· tavat resistenssiproteiineja ja (lii) laskevat viruksen 35 kapasiteettia vektorina.
s
Esillä olevalla keksinnöllä on mahdollista korjata nämä haitat. Esillä oleva keksintö kuvaa itse asiassa plasmideja, jotka täyttävät kaikki nämä vaatimukset, ja malldol is tavat siten terapeuttisesti käyttökelpoisten yh-5: distelmä-DNA-adenovirusten nopean ja tehokkaan klonaali- sen tuotannon.
Tarkemmin ottaen keksinnön ensimmäinen kohde on prökaryöottinen plasmidi, joka käsittää yhdistelmä-DNA-adenovirusgenamin yhden tai useamman restriktiokohdan ra-10 jaamana, jota/joita mainittu genomi ei sisällä.
Täilaista plasmidia esittää esimerkiksi kuvio 2.
Keksinnön mukaisissa plasmideissa esiintyvä yhdiste 1 mä-DNA-adenovirusgenomi on edullisesti täydellinen genomi. Tämä on erityisen kiinnostavaa, koska täten voidaan 15 välttää toisen rakenteen käyttö, joka toisi mukanaan vi-rusgenomin toisen osan, sekä DNA-yhdistymisvaihe kapsi-daatiosolulinjassa. Keksinnön mukaisten plasmidlen toinen etu johtuu seikasta, etteivät adenovirusgenomia katkaise prokaryoottisten plasmidih alueet. Tämän vuoksi tuotetut: 20 genomit eivät sisällä plasmidialueita, joiden haitat on mainittu edellä. Sitä paitsi keksinnön mukaisissa plasmideissa aderiqvirusgehamin ITRiia ei ole yhdistetty, mikä tekee mahdolliseksi lineaaristen virus-DNA-sekvenssien saamisen, jotka ovat suoraan käyttökelpoisia yhdistelmään DNA-virusten tuottamiseksi.
Edullisemmin keksinnön mukaiset plasmidit käsittävät siten ensimmäisen alueen, joka mahdollistaa replikaa- tion prokaryoottisissä soluissa, ja toisen alueen, joka käsittää adanovirusgenomin yhden tai useamman restriktio-30 kohdan rajaamana, jota/joita mainittu genomi ei sisällä. i
Edullisemmin keksinnön mukaiset plasmidit käsittävät samoin alueen, joka mahdollistaa mainitun plasmidin sisältävien prokaryoottisten solujen valikoinnin. Tämä alue voi koostua etenkin mistä tahansa geenistä, joka 35 tuottaa resistenssin jollekin yhdisteelle, ja erityisesti 6 antibioottiile. Täten voidaan mainita geenit, jotka tuottavat resistenssin esimerkiksi kanamysiinille (Kanr), arn-pisilliinille (Amor) , tetrasykliinille (tetr) tai spekti-riomysiinille, joita käytetään nykyään molekyylibiologias-5 sa (Maniatis et ai., 1989). Plasmidien valikointi voi ta pahtua muiden geenien avulla kuin geenien, jotka koodit-. t;atat antibiöbttiresistenssirrierkkejä. Yleensä ottaen kyseessä on geeni, joka antaa bakteerille funktion·, jota sillä ei enää ole (tämä voi vastata geeniä, joka on delβίο toitu kromosomista, tai josta on tehty inaktiivinen), jolioin plasmidin käsittämä geeni palauttaa tämän funktion. Esimerkiksi kyseessä voi olla siirto-RNA-geeni, joka palauttaa defaktiivisen kromosomifunktion (Somoes et ai. . 199:1) , 15 keksinnön mukaisissa plasmideissa käytetty alue, joka mahdollistaa replikaation prökaryoottisissa soluissa, voi olla mikä tahansa valituissa soluissa funktionaalinen replikaatloalkukohta. Kyseessä voi olla replikaa-tioalkukohta, joka on peräisin inkompabiliteettiryhmän P 20 plasmidista (esimerkiksi pRK290) , joka mahdollistaa replikaation jEk_ coli -kannoissa pol A. Yleisemmin kyseessä voi olla mikä tahansa replikaatloalkukohta, joka on pe- i räisin prokaryoottisissä soluissa replikoituvasta plasmidista . Tämä plasmidi voi olla pBR322-johdannainen (Boliv-25 ar et ai. , 1977) , pUC-johdannainen (Viera ja Messing, 1982) tai muista plasmideista, jotka ovat peräisin samasta inkompabiliteettiryhmästä, eli esimerkiksi ColEl tai pMBl. Nämä plasmidit voidaan sitä paitsi valita muista Escherichia colissa rep1ikoituvista inkompabiliteettiryh- 30 mistä. Kyseessä voivat olla plasmidit, jotka on saatu plasmideista, jotka kuuluvat inkompabiliteettiryhmiin A, B, FI, FII, Fill, FIV, Hl, HU, II, 12, ΰ, K, L, N, OF, P, Q, T, U, W, X, Y, 2 tai 9 esimerkiksi. Muitakin plasrnideja voidaan käyttää, joista mainittakoon plasmidit, jotka ei-35 vät replikoidu Ek. colissa vaan muissa isännissä kuten EL_ 7 subtilis, Streptomvcss, P. putida, P. aeruginosa, Rhizo-bium mellloti, Agrobacterium tumefaciens, Staphylococcus aureus . St rentomvces pristinaespiralis, Enterococcus fae-cium tai Clostridium. Edullisesti käytetään replikaatioal-5 kukohtia, jotka ovat peräisin Et. colissa replikoituvista plasiriideista.
Kuten edellä on mainittu, keksinnön mukaisissa plasmideissa esiintyvä adenovirusgenomi on edullisesti täydellinen tai funktionaalinen genomi, eli genomi, joka 10 ei vaadi muiden alueiden mukaan tuomista DNA-yhdistymisellä tai ligatoinnilla virusvarastojen tuottamiseksi valituissa kapsidaatiosolulinjoissa.
Edullisesti yhdistelmä-DNA-adenovirusgenomi käsittää vähintään ITR-sekvenssit ja kapsidaation mahdollista-15 van sekvenssin.
Toistuvat käänteiset sekvenssit (ITR) muodostavat adenovirusten replikaatlqalkukohdan. Ne sijaitsevat v.i~ rusgenomiri päissä (vrt. kuvio 1), joista ne voidaan hei- | posti eristää molekyylibiologian tavanomaisten, alan am-20 mattilaiselle tuttujen tekniikoiden mukaan. Ihtnisadenovi- j rusten ITR-sekyenssien nukleotidisekvenssiä (erityisesti j serotyyppien Ad2 ja Ad5) kuvataan kirjallisuudessa, kuten ! myös koira-adenovirusten (etenkin CAV1 ja CAV2). Mitä tu- j lee esimerkiksi adenovirukseen Ad5, vasemmanpuoleinen ITR- \ 25 sekvenssi vastaa aluetta, joka käsittää genomin nukleoti- \ dit 1 - 103. |
Kapsidaatiosekvenssi (jota kutsutaan myös sekvens- | siksi Psi) on välttämätön virusgenomin kapsidaatiolle. Se ) sijaitsee villiadenovirusten genomissa vasemmanpuoleisen | 30 ITR:n ja alueen El välissä (vrt. kuvio 1) . Se voidaan eristää tai syntetisoida keinotekoisesti molekyylibiolo- ί gian tavanomaisilla tekniikoilla. Ihmisadenovirusten kap- ! sidaatiosekvenssin nukleotidisekvenssiä (erityisesti serotyyppien Ad2 ja Ad5j kuvataan kirjallisuudessa, kuten 35 myös koira-adenovirusten (etenkin CAV1 ja CAV2). Mitä tu- 3 s lee esimerkiksi adenoviruks een Ad5, funktionaalinen kapsi-daatiosekvenssi sisältyy genomin nukleotidien 194 ja 35Θ väliin.
Keksinnön edullisessa suoritusmuodossa käytetyn 5 adenoviruksen genomi on vailla aluetta El kokonaisuudes saan tai osittain. Alue El on itse asiassa oleellinen viruksen replikaatiolle ja sen inaktivointi johtaa repli-kaation suhteen defektiivisten virusten muodostumiseen, eli virusten muodostumiseen, jotka eivät kykene replikoi-10 tumaan itsenäisesti geenisiirron in vivo jälkeen. Alueesta El, tai mistä tahansa muusta kyseessä olevasta virus-alueesta, voidaan tehdä ei-funktionaalinen millä tahansa alan ammattilaiselle tutulla tekniikalla,, ja etenkin yhden tai useamman emäksen täydellisellä suppressiolla, 15 substituutiolla, osittaisella deleetiolla tai additiolla kyseessä olevassa geenissä tai kyseessä olevissa geeneissä. Tällaisia modifikaatioita voidaan suorittaa helposti suoraan keksinnön mukaisiin plasmideihin, esimerkiksi geenimanipulaatiotekniikoita käyttäen. Edullisesti käyte-20 tyn adenoviruksen genomi on vailla alueen El osaa, joka on nukleotidien 454 ja 3 328 (fragmentti PvuII-Bglll) tai 362 - 3 446 (fragmentti HinfII-Saul A) välissä. i
Erityisen edullisen suoritusmuodon mukaan käytetyn adenoviruksen genomi on samoin vailla aluetta E3 ja/tai E4 25 ja/tai IVA2 kokonaisuudessaan tai osittain. Hakija on nyt osoittanut, että on mahdollista rakentaa viruksia, jotka käsittävät näitä eri tyyppisiä deleetioita. Nämä ylimääräiset deleetiot mahdollistavat vektorin turvallisuuden ja sen kapasiteetin lisäämisen.
30 Edullisesti adenovirusgenomi on vailla E4-alueen osaa, joka käsittää vähintään faasit ORF3 ja ORF6. Adenovi rusgenomi a on voitu samoin modifioida kuten kuvataan FR-patenttihakemusjulkaisussa 9 413 355, joka sisällytetään tähän viitteeksi, replikaatiopartikkelien aiheuttaman kon-35 taminaation vaarojen välttämiseksi.
9
Edullisesti yhdistelmä-DMA-adenovirusgenomi sisal-tää lisäksi kiinnostavan nukleiinihapon. Kiinnostava nukleiinihappo voidaan insertoida adenovirusgenomissa eri kohtiin. Edullisesti se insertoidaan alueelle El, Ξ3 tai 5 S4. Kuitenkin selvää on, että muitakin kohtia voidaan käyttää. Erityisesti genomin nukleotidisekvenssin saatavilla olo tekee alan ammattilaiselle mahdolliseksi identifioida alueita, joille kiinnostava; nukleiinihappo voidaan insertoida.
10 Kiinnostava nukleiinihappo voi olla mikä: tahansa mukaan tuotu DNA-sekvenssi, jonka siirtoa kohdesoluun ja/tai ilmentämistä siinä halutaan.
Erityisesti se voi käsittää yhden tai useamman terapeuttisen geenin ja/tai yhden tai useamman geenin, joka 15 koodittaa/jotka koodittavat antigeenisiä peptidejä.
Terapeuttisia geenejä, joita voidaan tällä tavalla siirtää, ovat mitkä tahansa geenit, joiden transkriptiossa ja mahdollisesti translaatiossa kohdesolussa muodostuu tuotteita, joilla on terapeuttinen vaikutus.
20 Kyseessä voi olla kohdesoluun nähden homologinen tuote (eli tuote, joka normaalisti ilmentyy kohdesolussa j silloin, kun tämä ei osoita mitään patologiaa). Tässä ta- j pauksessa ilmentämisellä on mahdollista esimerkiksi lievittää riittämätöntä ilmentymistä solussa tai ilmentää 25 modifikaation vuoksi inaktiivinen tai heikosti aktiivinen proteiini, tai edelleen ilmentää hyvin runsaasti mainittua: proteiinia. Terapeuttinen geeni voi myös kaodittaa soluproteiinimutanttia, jonka stabiilisuus on parempi, aktiivisuus on modifioitu jne. Tuote voi myös olla hete-30 rologinen kohdesoluun nähden. Tässä tapauksessa ilmennetty proteiini voi esimerkiksi täydentää tai tuoda solussa defaktiivisen aktiivisuuden mahdollistaen sen taistelun patologiaa vastaan.
Terapeuttisista tuotteista voidaan mainita erityi-35 semmin entsyymit, verijohdannaiset, hormonit, lymfokii- \ | 10 nit: interleukiinit, interferonit, TNF jne. (W093/19 191) , kasvutekijät, hermon välittäjäaineet tai niiden prekurso-rifc tai synteesientsyymit, troofi.set tekijät: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 jne.; apolipoproteii-5 -n.it: ApoAI, ApoAIV, ApoE jne. (W094/25 073), dystrofiini tai minidystrofiini (FR 91/11 947) , kasvaimia suppressoi. -vat geenit: p53, Eb, raplA, DCC, k-rev jne. (W094/24 297), koagulaatiotekijoitä koodittävat geenit: tekijät VII, VIII, IX, itsemurhageenit (TK jne.) jne.
10 Terapeuttinen geeni voi samoin olla antisense-gee ni tai -sekvenssi, joka kohdesolussa ilmentämällä. on mahdollista kontrolloida geenien ilmentymistä tai solu-raRNA-sekvenssien transkriptiota. Tällaiset sekvenssit voidaan esimerkiksi kopioida kohdesolussa solu-mRNA-sekvensseihin 15 nähden komplementaariseksi RNÄ:ksi , jolloin ensin mainit ·· tujen translaatio proteiiniksi salpautuu, tekniikan mukaan, jota kuvataan EP-patentti julkaisussa: 140 308.
Kuten edellä on mainittu, kiinnostava nukleiinihappo voi myös käsittää yhden tai useamman geenin, joka 20 koodittaa/jotka koodittavat antigeenistä peptidiä, joka kykenee, tuottämaan ihmisessä immuunivasteen. Tässä eri- ! tyisessä suoritusmuodossa keksinnöllä on siten mahdollista toteuttaa rokotteita, jotka tekevät mahdolliseksi ihmisen immunoinnin, etenkin mikrp-organismeja tai viruksia 25 vastaan, Kyseessä voivat olla etenkin antigeeniset peptidit, jotka ovat spesifisiä Epstein-Barr-virukselle, HIV-virukselle, hepatiitti-B-virukselle (EP 185 573) , pseudo-vesikauhuyirukselle tai edelleen spesifisiä kasvaimille (EP 259 212).
BO Yleensä .kiinnostava nukleiinihappo käsittää myös terapeuttisen geenin ja/tai antigeenistä peptidiä koodit- 1 tavan geenin ilmentymisen tartutetussa solussa mahdollistavia sekvenssejä. Kyseessä voivat pila sekvenssit, jotka ovat luonnollisesti vastuussa kyseessä olevan geenin il-35 mentymisestä silloin, kun nämä sekvenssit voivat toimia ] | $ ii tartutetussa: solussa. Kyseessä voivat olla myös eri alkuperää olevat sekvenssit (jotka ovat vastuussa muiden: proteiinien ilmentymisestä tai jotka ovat jopa synteettisiä).
Etenkin kyseessä voivat olla eukaryöottisten tai virusgee-5 mien promöottorisekvenssit. Esimerkiksi kyseessä voivat olla promoottorisekvenssit, jotka ovat peräisin sen solun genomista, joka halutaan tartuttaa. Samoin kyseessä voivat olla promoottorisekyenssit, jotka ovat peräisin viruksen genomista, mukaan lukien käytetty adenovirus. Tässä suh-10 teessä voidaan mainita, esimex-kiksi geenien ElÄ, MLP, CMV, RBV jne. promoottorit. Lisäksi näitä ilmentämissekvenssejä voidaan modifioida lisäämällä aktivaatio-, säätely- jne. sekvenssejä. Lisäksi kun insertoitu geeni ei .käsitä ilmen-tämissekvenssejä, se voidaan insertoida defektiivisen viis ruksen genomiin myötävirtaan tällaisesta sekvenssistä.
Lopuksi kiinhostava nukleiinihappo voi samoin käsittää erityisesti terapeuttisesta geenistä ylävirtaan signaali-sekvenssin, joka ohjaa syntetisoidun terapeuttisen tuotteen kohdesolun eritysreiteille . Tämä signaalisekvenssi 20 voi olla terapeuttisen tuotteen luonnollinen signaalisek- venssi, mutta kyseessä voi olla myös mikä tahansa muu j funktionaalinen signaalisekyenssi, tai keinotekoinen signaal is ekvenssi .
Keksinnön mukaiset plasmidit voidaan rakentaa 25 käyttäen eri alkuperää olevia adenoviruksia. Eri sero- tyyppejä edustavia adenoviruksia, joiden rakenne ja ominaisuudet vaihtelevat jonkin verran, on itse asiassa karakterisoitu. Näistä serotyypeistä esillä olevan keksinnön piirissä käytetään edullisesti i hmi sadenovi ruks i a 3 0 tyyppiä 2 tai 5 (Ad2 tai Ad5) tai eläinalkuperää olevia ] adenoviruksia (katso W0-patenttihakemusjulkaisu 94/ | 26 914) . Esillä olevan keksinnön piirissä käyttökelpoisista eläinalkuperää olevista adenoviruksista voidaan mainita adenovirukset, jotka ovat peräisin koirasta, nau- j
35 dastä, hiirestä [esimerkiksi Havi , Beard et ai.. Virology J
j 12 75 (1990) 81), lampaasta, siasta, linnusta tai edelleen apinasta (esimerkiksi SÄV.) . Edullisesti eläinalkuperäa oleva adenovirus on koi ra-adenovirus, edull isemmin adenovirus CAV2 [esimerkiksi kanta Manhattan tai A26/61 (ATCC 5 VR-800)].
Keksinnön erityisen suoritusmuodon mukaan käytetty adenovirus on ihmisalkuperää oleva adenovirus. Toisen edullisen muodon mukaan adenovirus on eläinalkuperää oleva: adenovirus.
1Q Kuten edellä on mainittu, yhdistelmä-DNA-adenovi- rusgenomia rajaa edullisesti yksi tai useampi mainitusta genomista puuttuva restriktiokohta. Tämän kohdan tai näiden kohtien avulla on mahdollista leikata yksinkertaisesti ja tehokkaasti yhdistelmä-DMA-adenovirusgenomi plasmi-15 dista. Adenovirusgenomin sekvenssin ollessa tunnettu ja saatavilla alan ammattilainen voi valita rutiinikokeilla tästä genomista puuttuvia restriktiokohtia. Esimerkiksi voidaan mainita kohdat Paot, NsoV ja Swal (AdS:Ile) tai Snabl {Ad2!ssa). On samoin mahdollistä tehdä tietyistä 20 kohdista yksittäisiä modifioimalla adenovirusgenomisekvenssiä . Täten muitakin entsyymejä voidaan käyttää, jos vastaavat restriktiokohdat on supprimoitu, modifioitu tai deletoitu EL, coliin rakennetussa adenovirussekvenssissä.
Kohdat voidaan sijoittaa suoraan adenovirusgenomin päiden 25 viereen, tai muutaman emäksen päähän.
Keksinnön mielessä erityisen edullinen plasmidi on plasmidi pXL2638, joka käsittää plasmidin RK2 replikaatio-alkukohdan, tetrasykliiniresistenssigeenin ja yhdistelmä- I
DMA-adenovirusgenomin, jossa alueet El ja E3 ovat ei-funk-30 tionaaliset ja jota rajaavat kaksi Pad-kohtaa. Kiinnostava nukleiinihappo voidaan insertoida adenovirusgenomin eri kohtiin, ja etenkin alueille El, E3 ja E4. Eri restriktiokohtia voidaan käyttää tähän tarkoitukseen, kuten etenkin kohtaa Xbal.
13
Esillä olevan keksinnön mukaiset plasmidit voidaan rakentaa eri tavoin. Edullisen menetelmän mukaan ensiksi rakennetaan fragmentteja, jotka käsittävät adenovirusge-nomin ITR:t, joita rajaa yksi tai useampi sopiva restrik-5 tiokohta. Nämä ITR: t viedään sitten prokaryoottiseen plasmidiin, minkä jälkeen kolmantena vaiheena yhdistelmä-DNA-adenovirusgenomi rakennetaan ITR:ien väliin joko 11-gatoimalla tai DNA-yhdistymisellä. Edullisesti genomi rakennetaan DNA-yhdis tyrni sei la halutun yhd i st e 1 mä - DNA ~ ade -10 novirusgenomin ja plasmidin homologisten alueiden {jotka käsittävät ITR: t ja sivuavat alueet) välillä.
Tarkemmin ottaen genomi voidaan rakentaa Eh_ colis-sa käyttäen kantaa noIA homologisten DNA-yhdistymistapahtumien suhteen valikoimiseksi. Ilmeistä on, että nämä ra-15 kenteet voidaan myös toteuttaa systeemien DNÄ-yhdistymis-tapahtumien suhteen valikoimiseksi puuttuessa. Itse asiassa tällaiset DNA-yhdistyrnis tapahtumat voidaan seuloa tnini-preparaatilla, merkin menetyksestä tai hankinnasta tai sitten seulomalla radioaktiivisilla koettimilla, jotka 20 ovat spesifisiä saatujen tai menetettyjen liitosten suhteen. Lisäksi on olemassa muita tekniikoita, jotka mahdollistavat homologisten DNA-yhdistymIstapahtumien suhteen valikoinnin JjL. colissa. Näistä mainithakoon rep-likaatiossaan lämpöherkkien plasmidien käyttö (Hamilton et 25 ai.... 1989} , ei - replikoi tuvien ympyränmuotoisten molekyyli en käyttö (joita kuvaavat esimerkiksi Slater ja Maurer, 1993) / kantoj en käyttö:, joissa käytetty vektori ei repii -koidu (Miller ja Mekalanos, 1988; Zeef et ai., 1994) jne.
Kaikkia näitä systeemejä voidaan käyttää golA-kantojen 3 G asemesta,: ja transfö.rmointia p:BR3:22-peräiäellä p las mi dii- j la, tai sen lukuisilla johdannaisilla, tai muilla plasmi- j deilla, joiden repllkaatio on Po IA- riippuvainen tai. plus- ] mideja, jotka eivät replikoidu Escherichia colissa.
Esillä olevan patenttihakemuksen seuraava kohde oon ] 35 mikä tahansa prokaryoo11inen solu, joka sisältää edellä | 1
J
] 14 määriteliγη mukaisen plasmidin. Kyseessä voi olla erityisesti mikä tahansa bakteeri, jolle on olemassa. vektorisysteemi * johon rekombinantti-DNÄ voidaan viedä. Mainittakoon: esimerkiksi Escherichia coli, Salmonella typhimurium, 5/ Bad Uus subtil is, Pseudomonas putida. Pseudomonas aeru ginosa, Aqrobacterinm tumefaeiens, Rhizohium meiiloti tai suvun Streptomvces bakteerit. Nämä solut saadaan edullisesti transformoimalla alan ammattilaiselle tutuilla tekniikoilla. Transformointi voidaan etenkin suorittaa CaCl2-10 tran-Sformointitekniikalla (Dagert ja Ehrlich, 1.979) tai tekniikalla, jonka ovat kehittäneet Hanahan et ai. (1983), tai millä tahansa tästä saadulla tekniikalla (Maniatis et ah, 1989} , sekä elektrohransf ormoinnilla (Wirth d ai, , 198 9} . Katso myös molekyylibiologi ah yleiset tekniikat 15 jäljempänä.
Esillä olevan keksinnön seuraava kohde on menetelmä yhdistelmä-DNA-adenovirusgenomien tuottamiseksi. Tämän menetelmän mukaan edellä kuvatun kaltaisia prokaryootti-sla soluja viljellään, minkä jälkeen toisena vaiheena 20 plasmidit otetaan talteen. Edullisesti viljelyä jatketaan riittävän pitkän ajan sopivien plasmidimäärien tuottamiseksi . Plasmidi voidaan ottaa talteen millä tahansa alan I
ammattilaiselle tutulla tekniikalla plasmidi-DNA:n vai- j mistamiseksi. Täten se voidaan ottaa talteen valmistamal-25 la kirkas lysaatti, joka sentrifugoidaan käyttäen seesium- kloridigradienttia (Maniatis et ai., 1989), Muitakin tekniikoita voidaan käyttää hyödyntäen muita lyysimenetelmiä esimerkiksi käyttäen Triton X·· 100 -valmistetta (Ausubel et ai. , 1987) tai anioninvaihtokolonnia lyysivaiheen ja plas- 30 midi-DNA:n erotuksen valtaosasta kromosomi-DNA:ta ja pro teiineista jälkeen. Näin talteen otettuja plasmideja voidaan sitten puhdistaa ja käsitellä restriktioentsyymillä, joka västäa virusgenomia rajaavia kohtia. Tällöin on mahdollista luoda yhdessä vaiheessa lineaarinen yhdistelmä- s 15 DNA-adenovirusgenomi, jota voidaan suoraan käyttää yhdiste lmä- DNA- virusten klonaaliseen tuotantoon.
Tässä suhteessa ensimmäisessä menetelmässä yhdistelmä -DNA- virusten valmistamiseksi keksinnön mukaisista 5 plasmideista tuotettu virusgenomi transfektoidaan trans-formöitumiskelpoiseen kapsidaatiosolulinj aan, eli solu-linjaan, joka käsittää en trans kaikki defektiivisen viruksen täydentämiseksi tarvittavat funktiot. Nämä funktiot on edullisesti integroitu solun genomiin, mikä valo hentää DNA-yhdistymisvaaroja, ja tuottaa solulinjalle kasvaneen stabiilisuuden,
Toisen lähestymistavan mukaan sopivaan soluiinjaan kotränsfektoidaan valmistettu yhdistelmä-DNA-genomi j a DNA yhdestä tai useammasta apuviruksesta tai -plasrnidista.
15 Tämän menetelmän mukaan ei tarvitse käyttää transförmoitu-miskelpoista solulinjaä, joka kykenee täydentämään yhdis-telmä-DNA-aderioviruksen kaikki defektiiviset funktiot.
Osan näistä funktioista täydentää itse asiassa yksi tai useampi apuvirus. Tämä apuvirus on tai nämä apuvirUkset 20 ovat sinänsä defektirvisiä.
Käyttökelpoisista soluiinjöistä voidaan mainita etenkin ihmisen alkion munuaissoluiinja 293 [Graham et ai. . J . Gen. Virol. 3 6 (1977) 59] . Tämä soluiinj a sisäl tää etenkin, genomiinsa integroituna ihmisadenoviruksen Äd5 25 genomin vasemmanpuoleisen osan (12 %) . Transfektointi voidaan suorittaa edullisesti suoraan plasmidim pilkkömis-tuötteella, joka on saatu edellä kuvatulla menetelmällä, ilman vaihetta, jossa adenovirusgenomia puhdistetaan., |
Esillä oleva keksintö koskee myös kaikkia farma-30 seuttisia koostumuksia, jotka käsittävät yhtä tai useampaa tämän menetelmän mukaan valmistettua yhdistelmä-DNÄ-adenovirusta. Keksinnön mukaiset farmaseuttiset koostumukset voidaan koostaa annettaviksi paikallisesti,: suun kautta, ruoansulatuskanavan ulkopuolisia s ti.,, nenänsisäi- 16 eesti, laskimonsisäisesti, lihaksensisäisesti, ihonalaisesti, silmänsisäisesti, ihon kautta jne.
Edullisesti farmaseuttinen koostumus: sisältää ruiskeena annettavaan koostumukseen farmaseuttisesti hy-5 väksyttäviä nestemäisiä kantajia. Kyseessä voivat olla erityisesti suolaliuokset (mononatrium-, dinatriumfos-faatti, natrium-, kalium-, kalsium- tai magnesiumkloridi jne. tai tällaisten suolojen yhdistelmät), jotka ovat steriilejä ja isotoonisia, tai kuivat, etenkin kylmäkui-10 vatut, koostumukset, joista lisäämällä tapauksesta riippuen steriloitua vettä tai fysiologista seerumia on mahdollista rekonstituoida ruiskeena annettavia liuoksia.
Ruiskeeseen käytetyt virusannokset voidaan sovittaa eri parametrien funktiona, ja etenkin käytetyn anto-15 muodon, kyseessä olevan patologian, ilmennettävän geenin tai edelleen hoidon halutun keston funktiona. Yleensä ottaen keksinnön mukaiset yhdistelmä-DNA~adenovirukset koostetaan annoksiksi ja annetaan annoksina, jotka ovat 104 -lö*14 pmy, ja edullisesti 10s - 1010 pmy. Ilmaisu "pmy" 20 ("plakin muodostava yksikkö") vastaa virusliuoksen tartu- tuskykyä, ja se määritetään tartuttamalla sopiva soluviljelmä ja mittaamalla yleensä 15 päivän kuluttua tartutettujen solujen plakkien lukumäärä. Tekniikat virusliuoksen pmy-tiitterin määrittämiseksi on kirjallisuudessa perus-25 teellisesti dokumentoitu.
Insertoidun heterologisen DNA-sekvenssin mukaan keksinnön mukaisia adenoviruksia voidaan käyttää lukuisten patologioiden hoitamiseksi tai estämiseksi, mukaan lukien geneettiset sairaudet {dystrofia, kystinen fibroo-30 si jne.), hermoston rappeutumissairaudet (Alzheimer, Par kinson , AL·S jne.), syövät, koagulaatiohäiriöihin tai dys-lipoproteinimiaan liittyvät patologiat, virustartuntoihin liittyvät patologiat (hepatiitti, aids jne.) jne.
17
Esillä olevaa keksintöä kuvataan täydellisemmin seuraavien esimerkkien avulla, jotka on katsottava havainnollistaviksi eikä rajaaviksi.
Kuv i o s e1itykse t .S Kuvio 1 adenaviruksen AdSi geneettinen organisaa tio.
.Kuvio 2 pXL2626':;n ja pXL2627:n resitriktiokartat.
Ampr: ampisilliiniresistenssigeehi; pMBl Ori, pMBl:n replikaatioalkukohta; Tetr, tetrasykliiniresistens-10 sigeeni; EK2 Ori, plasmidin RK2 replikaatioalkukohta.
Rlasirsidikarttojen ympyränmuotoiset osat eivät ole samassa mittakaavassa kuin kahdelle TTRrlle merkitty 0,8 ke.
Kuvio ,3 plasmidin pXL2638 .rakentaminen.
Tämä rakennelma toteutetaan kuten kuvataan esimer-15 kissa 1-2 homologisella DNA-yhdistymisellä SF800:ssa (E.
Goli polA). Ampr: ampisilliiniresistensSigeeni; pMBl Ori, pMBl:n x"eplikaatioalkukohta; Tetr, tetrasykliiniresis-tenssigeeni; RK2 Ori, plasmidin RK2 replikaatioalkukohta. PlasmidikarttGjen ympyränmuotoiset osat, adenovirussek-20 venssit eivät: ole samassa mittakaavassa.
Molekyylibiologian yleiset kloonaustekniikat Molekyylibiologian tavanomaisia menetelmiä, kuten plasmidi^DKA.: n sentrifugointi seesiumkloridigradienttia, j e t i diumbromidi a käyttäen, pilkkomiset restriktioentsyy-25 meillä, geelielektroforeesi, transformointi EL. coliin. nukleiinihappojen saostaminen jne., kuvataan kirjallisuudessa (Maniatis et ai., 1989).
Entsyymit saatiin taholta New-England Biolabs (Beverly, MA). | 30 Ligatointeja silmällä pitäen DNA-fragmentit erote- | taan kokonsa perusteella 0,8 - 1,5~%:isissä agaroosigee- j leissä, puhdistetaan GeneCleanvalmisteella (BI0101, La- 1
Jolla, CA) ja inkuboidaan yön yli 14 °C:ssa 50 mM Tris-HCl- I
! puskurissa, pH 7,4, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 tnM ATP, T4- ] 35 fagin DNA-ligaasin läsnä ollessa. | ] | 18
Ligatoiduilla DNA-sekvensseillä transformoidaan transformoitumiskelpoiseksi tehty kanta Eh. coli TGI [D-(lac proA,B), supE, thi,hsdDS/ F1 traD36, proA+, B+, laclq,
IacZDMISi (Maniatis et, ai. , 1982) , tai kanta HL. coli no IA 5 SF800 (Heffron et ai. , 1977), Monistaminen PCR:llä (poly meraasiketjureaktio) suoritetaan niinikään Maniatiksen et ai, 1989, mukaan seuraavin spesifikaätioin:
MgCl2:n pitoisuus nostetaan 8 mMlksi.
Denaturointilämpötila 95 °C, hybridisaatiolämpöti-10 la 55 °C, laajennuslämpötila 72 °C, Tämä sykli toistetaan 25 kertaan PE9600 Thermaleycler -laitteessa (Perkin Elmer, Norwalk, CO).
Oligonukleotidit syntetisoidaan käyttäen fosfor-amidiittikemiaa syänoetyyliryhmällä β-asemassa suojatuin 15 yhdistein (Sinha et ai. , 1984; Giles , 1985) ja automaattista DNA-syntetisaattoria Applied Biosystem malli 394 (Applied Biosystem, Foster City, CA) valmistajan suositusten mukaän.
Sekventointi suoritettiin kaksisäikeisillä matrii-20 selliä ketjupäämenetelmän mukaan käyttäen fluoresoivia f alukkeita. Käytimme sekventointipakkausta Täq Dye Primer Kit valmistajalta Applied Biosystem (Applied Biosystem,
Foster City, CA) valmistajan spesifikaatioiden mukaan.
Esimerkki 1 25 Adenovirusgenomin,: Ihmisadenovirus tyyppiä 5, jota rajaavat yksittäiset restriktiokohdat, klonaaminen inkom-pabiliteettiryhmän P plasmidiin, joka replikoituu E. colissa,
Esimerkki 1-1 I
3 0 Tässä esimerkissä esitetään, miten adenovirusgeno- 1 min päät voidaan monistaa PCR:llä päiden (ITR) rajaarni- | seksi Pad -kohdall a. j
Tyydyttävien DNA-yhdistymistiheyksien saamiseksi j jatkossa valitsimme noin 400 ep;n fragmentteja, jotka mo- j 35 nistettiin. j \ :ί 19
Valittiin kolme oligonukleotidia:
Oligo 1 on yhteinen kahdelle monistukselle, koska se vastaa ITR.-päitä.
Kuusi ensimmäistä nukleotidiä muodostavat hännän, 5 jolla vältetään sekundaarirakenteiden muodostuminen. Seu- ravaat 6 nukleotidiä muodostavat EcoRI-restriktiökohdan, jota käytetään välikloonausvaiheissa, Seuraavat 8 nukleotidiä muodostavat Pad-kohdan, joka puuttuu AdS-genomista (adenoviruksen Ad.5 sekvenssi on saatavana laitoksesta 10 Genebank, mnemoniikka ADRGÖMPGEN).
Seuraavat 27 nukleotidiä vastaavat Ad5-genomin vasemmanpuoleista päätä, asemat 1 - 27.
Qligön 1 sekvenssi: 15 5 ' -CGGCGGGAATTCTTAATTAACATCATCAATäATATACCTTATTTTGG-3 ' SEQ ID N° 1
Rl Pad
Oligon 1 kanssa käytetty oligo 3 mahdollistaa 384 epm .fragmentin vasemmassa päässä monistamisen. Se käsit-20 tää 6 nukleotidin hännän. Seuraavat 18 nukleotidiä muodostavat kohdat Pstl. Koni ja Spel. Seuraavat 24 nukleotidiä vastaavat valitun sekvenssin käänteistä komplementaarista sekvenssiä Ad5:ssä asemien 361 ja 385 välillä.
Oligon 3 sekvenssi: 25 5 1 -CACCACCTGCAGGGTACCACTAGTGTCTCCACGTAAACGGTCAAAGTC-3 1 SEQ ID N°3 beu. spm spei
Vasemman pään monistamiseksi valittu matriisi on 30 plasmidi pCLAI. Plasmidi pCLAI sisältää vasemman pään 454 epm EcoRI-Xbal - fragment tina kloonattuna pIC19H:hon.
Oligon 1 kanssa käytetty oligo 2 mahdollistaa 418 ep:n fragmentin monistamisen oikeanpuoleisessa päässä, se käsittää 6 nukleotidin hännän. Seuraavat 6 nukleotidiä 35 muodostavat Pstl-kohdan. Seuraavat 24 nukleotidiä vastaa- 20 vat valittua sekvenssiä Ad5:ssä asemien 35 517 ja 35 540 välillä.
Öligon 2 sekvenssit 5 5'-CACCACCTGCAGGGCAGCCATAACAGTCAGCCTTACC-3'SEQ ID N°2
PstI
öikeanpupleisen pään monistamiseksi valittu matriisi on piasmidi pY23. plasmidi pY23 sisältää oikeanpuo-10 1 eleen pään 470 ep :n ÄvnII-Bell-fragment tina kloonattuna pIC19H:n yhteensopiviin kohtiin Xbal-BamHI.
PCR-tuotteet sijoitettiin agaroosigeelille. Odotettua kokoa vastaavat fragmentit pilkottiin EcoRI:1lä ja PstI:llä, puhdistettiin ja ligatoitiin EcoRI;Ilä ja 15 PstI:llä pilkotun pUClSm läsnä ollessa. Saadut kaksi yh-distelmä-DNA-plasmidiä nimettiin pXL2623:ksi vasemmanpuoleisen pään osalta ja pXL2624:ksi oikeanpuoleisen pään osalta. Mutaation puuttuminen insertistä vahvistettiin sekventoimalla. Häiden plasmidien EcoRI-PstI-fragmentti 20 puhdistettiin kuten on kuvattu edellä. Kyseiset kaksi fragmenttia ligatoitiin yhteen EcoRI:llä linearisoidussa pUClPvssä, Saatu yhdistelmä-DNA-plasmidi nimettiin pXL2626:ksi, se sisältää Ad5:n päät päittäin {kuvio 2).
Esimerkki 1 - 2 25 Plasmidin rakentaminen, joka sisältää adenovirus- genomin delta-El, delta-E3 Pad-kohtien rajaamana, EL. co-llssa.
Adenovirusgenomin vastaanottamaan valittu vektori on pRK29Q (Ditta et ai. , 1980), j oka kuuluu P-inkompabi-30 liteettiryhmään. Tämä vektori replikoituu EL. coli polA -kannoissa.
Käytetty integraatiostrategia on homologinen DNA-yhdistymihen kannassa |L_ coll SF80Q pXL2627:n ja plasmidin pFG144 (Graham et ai., 1986) välillä.
21
Plasmidi pFG144 sisältää Ad5: n genomin kokonaisuudessaan lukuun ottamatta kahta deleetiota alueilla El ja E3. Se on peräisin pMX2:sta ja siinä on sekä atnpisillii-niresistenssigeeni että replikaatioalkuköhta pMBl, joka ei 5 salli sen replikaatiota kannassa Ej_ coli SF8Q0.
Ensiksi AdS-genomin päittäiset päät kloonattiin pRK290:n yksittäiseen EooRl-kohtaan protokollan mukaan, jota kuvattiin jo pXL2:S26:n rakentamiseksi. Kannan Et. coli SF800 soluista tehtiin transformoitumiskelpoisia ja trans-10 formoitiin pXL2627:llä. Viljelmät levitettiin LB-kasvu-alustalle, joka sisälsi tetrasykliiniä. Vuorollaan tetras-ykliiniresistentistä kloonista saadut solut tehtiin trans-formoitumiskelpoisiksi, ne transformoitiin plasmidilla pFG144, ja levitettiin sitten LB-kasvualustalle, joka si-15 saisi tetrasykliiniä ja ampisilliiniä. Ottaen huomioon, ettei tämä plasmidi replikoida Eh. coll SF800 -kannassa, tetrasykliini- ja ampisilliiniresistenssi on voitu saada vain homologisen DNA-yhdi s tymi s t apahtuman välityksellä näiden kahden plasrnldin välillä. Itse asiassa näillä on 20 yhteisenä oikeanpuoleiset päät, 418 ep, ja vasemmanpuoleiset päät, 384 ep, Ad5-genomista. Tästä ensimmäisestä DNA-yhdistymistapahtumasta saaduilla plasmideilla on kaksi sarjaa päitä (kuvio 2), Toinen, plasmidin sisäinen cros-sing-over voi siten tapahtua. Tässä tapauksessa kahdesta 25 mahdollisesta tapahtumasta vain yksi johtaa haluttuun rakenteeseen, toinen johtaa AdS-genomin täydelliseen delee-tioon ja ampisilliihlresiStenssigeenin menetykseen. Tätä toista DNA-yhdistymistä suosittiin sarjalla viljelmälai-mennoksia, jotka edustivat 60 polvea, LB-kasvualustassa, 30 jota oli täydennetty tetrasykliinillä ja ampisilliinillä. Eristettyjen kloonien DNA: 11a suoritettiin Southern.! n blot-anayysi. Syntetisoitiin seuraava oligonukleotidikoe- j tin: 5'-CGTGGAGäCACTAGTGGTAGGCTGCAGGGGäGCCATA Sekvenssi tunnusnumero 4.
22
Emäkset 1 - 9 vastaavat vasemmanpuoleista aluetta asemaväliilä 377 - 385 Ad5-sekvenssissä. Emäkset 28 - 36 vastaavat oikeanpuoleisen alueen sekvenssiä asemaväliilä 35 517 - 35 525. Pilkkomiset endonukieaaseilla Pad ja 5 Cl ai, tai myös Pad ja NdeX, osoittivat odotetun plasmi- d-i rakenteen-» Saatiin talteen klooni, joka vastasi tällaista tapahtumaa ja jolla oli kuviossa 3 kuvattu plasmidirak-enne. Tämä nimettiin pXL2628:ksi.
pXL2628 pilkottiin Xbal:llä. uudelleenligatoitiin 10 ja transformoitiin sitten transformoitumiskelpoisiin X
ö g coli TG1-soluihin. Saatiin klooni Tet ja Amp . Sen res-triktioprofiilista ilmenee, että pMX2:ta vastaava alue on deletoitu. Tämä klooni nimettiin pXL263S:ksi.
pXL2638:n pilkkominen Pad:llä vapauttaa Ad5-geno-15 min 34 ke:n fragmentin muodossa. Tätä fragmenttia voidaan käyttää sellaisenaan adenoviruksen El-funktiot transkomp-lementoivien nisäkässolujen transfektointikpkeisiiti.
Esimerkki 2
Yfadi s t elmä-DNA-adenovirust en tuo t ant o 20 Yhdistelmä-DMA-adenovirusklooneja voidaan rakentaa ensimmäisessä vaiheessa Escherichia colissa insertörmällä fragmentteja, jotka sisältävät useampia geenejä sopivin säätelysignaalein näiden geenien ilmentämiseksi tutkituissa nisäkässoluissa, tai deletoimalla tiettyjä frag-25 mänttejä adenovirusgenomista> tai edelleen näiden kahden tapahtuman yhdistelmällä, minkä jälkeen tuottajasolujen transfektoinnin jälkeen voidaan saada tällaisen yhdistelmä -DMA-viruksen varasto.
Plasmidi pXL2 638 puhdistettiin transfrömöitujen, 30 transformoitumiskelpoisten Ek. coliTGl-solujen viljelmästä. Adenovirusgenomi vapautettiin pilkkomalla entsyymillä Pad . Pilkkomistuotetta käytettiin suoraan yhdistelmä-DNA-adenovirustefi tuottamiseksi. Tätä varten solulinjan 2 93 soluja transfektoitiin pXL2638:n pilkkomistuotteella kal-35 siumfosfaatin läsnä ollessa. Tuotetut yhdistelmä-DNA-ade-: 23 novirukset valikoidaan sitten plakkipuhdistuksella. Eristyksen jälkeen yhdistelraä-DNA-adenovirusta monistetaan solulinjassa 293, mikä johtaa viljelmäsupernatanttiin, joka sisältää ei puhdistettua yhdistelmä-DNA-adenovirusta, in 5 jonka tiitteri on noin 10 pmy/ml...
Viruspar-tikkelit puhdistetaan sitten sentrifugoi-malla seesiumkloridigradienttia käyttäen tuttujen tekniikoiden mukaan [katso etenkin Graham et ai. . Virology 52 (1973) 456] . Adenovirusta voidaan säilyttää -80 °C:ssa 10 2 0-%:isessa glyserolissa.
24
KirjallisuusluettelQ
Ausubel et al„ 1987. Current protocols in molecular biology 1987-1988. John Willey and Sons, Hew York.
Mvar eta!., 1977. Gene 2:95.
Dagert et a!,, 1979., Gene, 6, 23-28.
Xtftta et aL, 1980. Plasmid, 13,149-154.
Ghosh-Choudhurry et al. 1986. Gene,50 ,163-171.
Hamilton et al,, 1989. J. Bacteriol. 171:4617-4622.
Hanahan, D, 1983. J. Mol. Biol 166:557.
Heffron eta!., 1977.Proc.NatI.Acad.Sci. USA, 74,702-706.
Manlatis T., et al. 1982.
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, New York. Miller, et ah, 1988J. Bacteriol. 170:2575-2583.
Simoes, et al. 1991. New York Acad. Sci. 646:254-258.
Sinha N.D, et al. 1984. Nucl.Acids Res., 12,4539-4557.
Slater, et al. 1993.. 3. Bacteriol. 175:4260-4262.
Viera, et al„1982. Gene, 19,259-268.
Wirth, et aL 1989. Möi. Gen. Genet., 216,175-177.
Zeef, et al. 1994. EMBO j. 13:5113-5120.
25
Sekvertss i li s taus .(.1) YLEISET TIEDOT: (i) HAKIJA:
(A): NIMI: RHONE POULENC RORER
(3) KATU:20 AVENUE RAYMOND ARON
(C) KAUPUNKI: ANTONY CEDEX
(E) MAA: FRANCE
(F) PÖ:S TIKOODI:: 92165 (G) PUHELIN: 40,91.69.2:2 (H) TELEFAX: 4D.91.72.91 (il) KEKSINNÖN NIMITYS: Menetelmä yhdistelmä-DNA- adeiiovirusgenomin valmistamiseksi (lii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 4 (lv) KONEKOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Levyke (B) TIETOKONE: IBM PC yhteensopiva
(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DÖS/MS-DOS
(D) OHJELMISTO: Patentin Release #1.0, versio #1.25 (2) SEKVENSSIN NRO I TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 47 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiini (O JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: ADNc (Xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 1: CGGCGGGAAT TCTTAATTAA CATCATCAAT AATATACC'PT ATTTTGG 47 (2) SEKVENSSIN NRO 2 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 37 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: ADNc (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 2: CACCACCTGC AGGGCAGCCÄ TAÄCÄGTGAG CCTTACC 37 26 (2) SEKVENSSIN NRO 3 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 48 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (li) MÖLEKYYLITYYPPI : ADNc (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 3: CACCACCTGC AGGGTACCAC TAGTGTCTCC ACGTAAACGG TCAAAGTC 48 (2) SEKVENSSIN NRO 4 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 37 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksisäikeinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: ADNc (xi.) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 4: CGTGGAGACA CTAGTGGTAC CCTGCAGGGC AGCCATA 37
Claims (23)
- 27 Patent t ivaatimukset
- 1. Prokaryöottinen plasmidi, joka käsittää yhdiste Imä- DNA- adenovirus genomin yhden tai useamman restrik- 5 tiokohdan rajaamana, joka ei/jotka eivät sisälly mainittuun genomiin, yhdistelniä-DNA-adenovirusgenomin käsittäessä vähintään ITR-sekvenssit ja kapsidaatiosekvenssin.
- 2. Prokaryoottinen plasmidi, t U n n e t t u siitä, että se käsittää ensimmäisen alueen, joka mahdollistaa 10 replikaation prokaryoottisissa soluissa, ja toisen, alueen, joka käsittää adenovirusgenomin yhden tai useamman restrik-tiokohdan rajaamana, joka ei/jotka eivät sisälly mainittuun genomiin,
- 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen plasmidi, 15. u n n e t t u siitä, että replikaation mahdollistava alue käsittää prokaryoottisissa soluissa: funktionaalisen replikaatioalkukohdan.
- 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen plasmidi, t u n n e t t u siitä, että replikaatioalkukohtä on peräi- 20. in bakteeriplasmidista, joka valitaan RX2:sta, pBR322:sta ja pUGiStä,;
- 5. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen plasmidi, t u n n e t t u siitä, että replikaation mahdollistava ensimmäinen alue käsittää myös alueen, joka mah- j 25 dollistaa mainitun plasmidin sisältävien prokaryoottisten solujen valinnan.
- 6. Jonkin edel tävän patenttivaatimuksen mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että yhdis teImä-DNA-adenovirusgenomi käsittää vähintään ITR-sekvenssit ja kap- 30 sidaatiosekvens s in.
- 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen plasmidi, tunne t t u siitä, että adenovirusgenomi on vailla kokonaisuudessaan tai osittain aluetta El,
- 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen plasmidi, 35. u n n e t t u siitä, että adenovirusgenomi on vailla alueen El osaa, joka vastaa tähteitä 454 - 3 328 tai 382 - 3 446. 28
- 9. Patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukainen plasmidi, tunne t t μ siitä:, että adenovirusgenomi on vailla ,ko- 5: konaisuudessaan. tai osittain aluetta E4 ja/tai E3 ja/ tai Iva 2.
- 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen plasmidi, t. u nn e t t u siitä, että adenovirus genomi on vailla alueen: E4 osaa, joka käsittää vähintään faasit ORF3 ja/tai
- 10 ORF6-. 11. jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen plasmidi, tunne t t u siitä, että adenovirusgenomi on ihmis- tai eläinalkuperää,
- 12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen plasmidi, 15. u n n e t t u siitä, että adenovirus genomi on ihmis- adenovirusgenomi tyyppiä 2 tai 5.
- 13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen plasmidi, t u n. h e t t u siitä, että adenovirusgenomi on koira-aäenovirusgenomi, joka valitaan serotyypistä CAV2.
- 14. JorO^in edeltävän patenttivaatimuksen mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että yhdistelmä-DNA-adenovirusgenomi on peräisin adenoviruksesta Ad5 ja sitä ra jaavat kohdat Pad, NspV tai Swells . Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen 25 plasmidi, t u n n e t t u siitä, että yhdistelmä-DNA-adenovirusgenomi käsittää kiinnostavan nukleiinihapon.
- 16. Plasmidi pXL2638, t u n n e t t u siitä, että se käsittää plasmidin RK2 replikaatioalkukohdan, tetrasyk- ! liinires is tens s igeenin j a yhdistelmä-DNA-adenovirusgenomin, 30 jossa alueet El ja E3 ovat ei-funktionaaliset ja jota rajaa kaksi Pacl-kohtaa.
- 17. Prokaryoottinen solu, joka sisältää jonkin, patenttivaatimuksen 1-16 mukaisen plasmidin.
- 18. Menetelmä yhdistelmä-DNA-adenovirusgenomien 35 tuottamiseksi, jonka mukaan viljellään patenttivaatimuksen 29 17 mukaisia prokaryoottisia soluja ja otetaan plasmidit talteen.
- 19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnet t u siitä, että ylimääräisessä vaiheessa plas- 5 mideja käsitellään adenöyirusgenomin leikkaamiseksi.
- 20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnet t u siitä, että plasmideja käsitellään re-striktioentsyymin läsnä ollessa, joka vastaa adenovirusge-nomia rajääviä kohtia.
- 21. Menetelmä yhdistelmä-DNA-adenovirusten valmis tamiseksi , tunnet tu siitä, että kapsidaatiosolu-1 in jaan transfektoidaan patenttivaatimuksen 18, 19 tai 20 menetelmän mukaan valmistettu adenovirusgenomi ja tuotetut adenovirukset otetaan talteen.
- 22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen menetelmä, t u n n e t t u siitä, että solulinja on soluiinja 293.
- 23. Farmaseuttinen koostumus, joka käsittää yhtä tai useampaa, patenttivaatimuksen 18 mukaisen menetelmän avulla valmistettua yhdistelmä-DNA-adenovirusta, 30
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9501632 | 1995-02-13 | ||
| FR9501632A FR2730504B1 (fr) | 1995-02-13 | 1995-02-13 | Procede de preparation de genomes d'adenovirus recombinants |
| FR9600215 | 1996-01-10 | ||
| PCT/FR1996/000215 WO1996025506A1 (fr) | 1995-02-13 | 1996-02-09 | Procede de preparation de genome d'adenovirus recombinants |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI973309A FI973309A (fi) | 1997-08-12 |
| FI973309A0 FI973309A0 (fi) | 1997-08-12 |
| FI120046B true FI120046B (fi) | 2009-06-15 |
Family
ID=9476085
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI973309A FI120046B (fi) | 1995-02-13 | 1997-08-12 | Menetelmä yhdistelmä-DNA-adenovirusgenomin valmistamiseksi |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6261807B1 (fi) |
| EP (1) | EP0809704B1 (fi) |
| JP (1) | JP3842818B2 (fi) |
| KR (1) | KR100575521B1 (fi) |
| AT (1) | ATE405662T1 (fi) |
| AU (1) | AU716777B2 (fi) |
| BR (1) | BRPI9607583B8 (fi) |
| CA (1) | CA2210956C (fi) |
| CZ (1) | CZ294338B6 (fi) |
| DE (1) | DE69637648D1 (fi) |
| FI (1) | FI120046B (fi) |
| FR (1) | FR2730504B1 (fi) |
| HU (1) | HU222808B1 (fi) |
| IL (1) | IL117115A (fi) |
| MX (1) | MX9705937A (fi) |
| NO (1) | NO327980B1 (fi) |
| SK (1) | SK286965B6 (fi) |
| WO (1) | WO1996025506A1 (fi) |
| ZA (1) | ZA961153B (fi) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020136708A1 (en) * | 1993-06-24 | 2002-09-26 | Graham Frank L. | System for production of helper dependent adenovirus vectors based on use of endonucleases |
| DE19620687A1 (de) * | 1996-05-22 | 1997-11-27 | Centeon Pharma Gmbh | Neuer adenoviraler Vektor für den Transfer humaner Gene in vivo |
| ATE256196T1 (de) | 1997-06-09 | 2003-12-15 | Genvec Inc | Chimäre vektoren, die die verpackungsregion eines phagengenoms und einen teil des genoms eines eukaryontischen virus enthalten |
| WO1999015686A1 (en) * | 1997-09-23 | 1999-04-01 | Genvec, Inc. | Plasmids for construction of eukaryotic viral vectors |
| CN1342206A (zh) * | 1998-08-28 | 2002-03-27 | 杜克大学 | 在IVa2,100K和/或preterminal protein序列上有缺失的腺病毒 |
| JP2004501602A (ja) * | 1999-02-18 | 2004-01-22 | メルク アンド カンパニー インコーポレイテッド | エンドヌクレアーゼの使用に基づくヘルパー依存アデノウイルスベクターの生産のためのシステム |
| FR2794771B1 (fr) | 1999-06-11 | 2001-08-10 | Aventis Pharma Sa | Adenovirus recombinants codant pour le transporteur specifique de l'iode (nis) |
| FR2799472B1 (fr) | 1999-10-07 | 2004-07-16 | Aventis Pharma Sa | Preparation d'adenovirus recombinants et de banques adenovirales |
| US6998263B2 (en) | 2000-02-09 | 2006-02-14 | Genvec, Inc. | Methods of preparing and using a viral vector library |
| US7198924B2 (en) | 2000-12-11 | 2007-04-03 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites |
| US6573092B1 (en) | 2000-10-10 | 2003-06-03 | Genvec, Inc. | Method of preparing a eukaryotic viral vector |
| AUPR518501A0 (en) | 2001-05-22 | 2001-06-14 | Unisearch Limited | Yin yang-1 |
| EP1453536A4 (en) | 2001-12-12 | 2009-08-26 | Mayne Pharma Int Pty Ltd | COMPOSITION FOR PRESERVING VIRUSES |
| EP1697534B1 (en) | 2003-12-01 | 2010-06-02 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of using the same |
| DK2002003T3 (en) | 2005-05-27 | 2016-03-21 | Ospedale San Raffaele Srl | Gene vector comprising miRNA |
| EP2147105B1 (en) | 2007-05-02 | 2013-04-24 | Merial Limited | Dna plasmids having improved expression and stability |
| US20110269119A1 (en) * | 2009-10-30 | 2011-11-03 | Synthetic Genomics, Inc. | Encoding text into nucleic acid sequences |
| AU2014338864C1 (en) * | 2013-10-25 | 2020-07-16 | Akamis Bio Limited | Oncolytic adenoviruses armed with heterologous genes |
| US10076562B2 (en) | 2016-04-19 | 2018-09-18 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Methods for treating plague |
| WO2018054822A1 (en) | 2016-09-20 | 2018-03-29 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | New swine influenza vaccine |
| NZ751966A (en) | 2016-09-20 | 2023-03-31 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | New promoters |
| TWI817933B (zh) | 2016-09-20 | 2023-10-11 | 德商百靈佳殷格翰維美迪加股份有限公司 | 新穎ehv***位點orf70 |
| TW201823467A (zh) | 2016-09-20 | 2018-07-01 | 德商百靈佳殷格翰維美迪加股份有限公司 | 犬腺病毒載體 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3532566B2 (ja) * | 1993-06-24 | 2004-05-31 | エル． グラハム，フランク | 遺伝子治療のためのアデノウイルスベクター |
| SK282843B6 (sk) * | 1993-07-13 | 2002-12-03 | Rhone-Poulenc Rorer S. A. | Defektný rekombinantný adenovírus a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom |
| WO1995003400A1 (en) * | 1993-07-23 | 1995-02-02 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Recombinationally targeted cloning in yeast artificial chromosomes |
| FR2726285B1 (fr) * | 1994-10-28 | 1996-11-29 | Centre Nat Rech Scient | Adenovirus depourvus de particules contaminantes viables, preparation et utilisation |
| DK0787200T3 (da) * | 1994-10-28 | 2005-08-15 | Univ Pennsylvania | Forbedret adenovirus og fremgangsmåder til anvendelse heraf |
| FR2727689A1 (fr) * | 1994-12-01 | 1996-06-07 | Transgene Sa | Nouveau procede de preparation d'un vecteur viral |
-
1995
- 1995-02-13 FR FR9501632A patent/FR2730504B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-02-09 CZ CZ19972554A patent/CZ294338B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-02-09 WO PCT/FR1996/000215 patent/WO1996025506A1/fr active IP Right Grant
- 1996-02-09 MX MX9705937A patent/MX9705937A/es unknown
- 1996-02-09 DE DE69637648T patent/DE69637648D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-09 AT AT96903077T patent/ATE405662T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-02-09 SK SK1100-97A patent/SK286965B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1996-02-09 HU HU9800260A patent/HU222808B1/hu active IP Right Grant
- 1996-02-09 EP EP96903077A patent/EP0809704B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-09 BR BRPI9607583A patent/BRPI9607583B8/pt active IP Right Grant
- 1996-02-09 KR KR1019970705534A patent/KR100575521B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-02-09 AU AU47235/96A patent/AU716777B2/en not_active Withdrawn - After Issue
- 1996-02-09 JP JP52470596A patent/JP3842818B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-09 US US08/894,014 patent/US6261807B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-09 CA CA2210956A patent/CA2210956C/fr not_active Expired - Lifetime
- 1996-02-12 IL IL11711596A patent/IL117115A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-02-13 ZA ZA961153A patent/ZA961153B/xx unknown
-
1997
- 1997-08-08 NO NO19973663A patent/NO327980B1/no not_active IP Right Cessation
- 1997-08-12 FI FI973309A patent/FI120046B/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI120046B (fi) | Menetelmä yhdistelmä-DNA-adenovirusgenomin valmistamiseksi | |
| KR100379569B1 (ko) | 개기원의아데노바이러스벡터및유전자치료에서이의사용방법 | |
| KR100403708B1 (ko) | 재조합아데노-수반바이러스(aav)제조방법및이의용도 | |
| US5817492A (en) | Recombinant DNA viral vector for transfecting animal cells | |
| ES2310924T3 (es) | Vectores adenovirales defectivos y utilizacion en terapia genica. | |
| JPH11504502A (ja) | 組換えアデノウイルスの製造用細胞 | |
| JPH11507835A (ja) | 組換えアデノウイルス、ａａｖを作製するためのその使用、相補的細胞系、及び、該アデノウイルスを含む医薬組成物 | |
| WO1996025506A9 (fr) | Procede de preparation de genome d'adenovirus recombinants | |
| JPH10507922A (ja) | 生存汚染粒子を持たないアデノウィルス、その製造および使用 | |
| JP4376454B2 (ja) | アデノウイルスベクター及び相同組換えイベントの低減方法 | |
| KR100484441B1 (ko) | IVa2유전자가불활성화된결손재조합아데노바이러스 | |
| JP5260815B2 (ja) | 組換えアデノウイルスおよびアデノウイルスライブラリーの調製 | |
| AU2002313348B2 (en) | Method for preparing a recombinant adenovirus genome | |
| US7687615B2 (en) | PAV regions for encapsidation and E1 transcriptional control | |
| FR2729674A1 (fr) | Cellules pour la production d'adenovirus recombinants |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 120046 Country of ref document: FI |
|
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: AVENTIS PHARMA S.A. Free format text: AVENTIS PHARMA S.A. |
|
| MA | Patent expired |