JP3842818B2 - 組換えアデノウイルスゲノムの製造方法 - Google Patents
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Description
遺伝子治療は患部細胞又は臓器に遺伝情報を導入することにより欠陥又は異常(突然変異、異常発現等)を治療する方法である。この遺伝情報は臓器から抽出した細胞にインビトロ導入後、改変した細胞を生物に再導入してもよいし、適当な組織に直接インビボ導入してもよい。後者の場合には種々の方法があり、そのうちで種々のトランスフェクション法はDNAとDEAE−デキストランの複合体(Paganoら,J.Virol.1(1967)891)、DNAと核タンパク質の複合体(Kanedaら,Science 243(1989)375)、DNAと脂質の複合体(Felgnerら,PNAS 84(1987)7413)、リポソームの使用(Fraleyら,J.Biol.Chem.255(1980)10431)等が必要である。より最近では、これらの物理的トランスフェクション法に代わり、ウイルスが遺伝子導入ベクターとして使用されるようになった。この点で、種々のウイルスが特定の細胞集団に感染する能力を試験されている。特に、レトロウイルス(RSV、HMS、MMS等)、HSVウイルス、アデノ随伴ウイルス及びアデノウイルスが検討されている。
これらのウイルスのうち、アデノウイルスは遺伝子治療で使用するのに有利ないくつかの性質をもつ。特に、宿主範囲が非常に広く、休止細胞に感染することができ、感染細胞のゲノムに取込まれず、今日までヒトで重要な疾病に関連付けられていない。そこで、アデノウイルスは目的とする着目遺伝子を筋肉(Ragotら,Nature 361(1993)647)、肝臓(Jaffeら,Nature genetics 1(1992)372)、神経系(Akliら,Nature genetics 3(1993)224)等に導入するのに使用されている。
アデノウイルスは約36kbの寸法の直鎖2本鎖DNAウイルスである。そのゲノムは特に、各末端の逆方向反復(ITR)配列と、パッケージング配列(Psi)と、初期遺伝子と、後期遺伝子を含む(図1参照)。主要な初期遺伝子はE1、E2、E3及びE4領域に含まれる。このうちでE1領域に含まれる遺伝子はウイルス増殖に必要である。主要な後期遺伝子はL1〜L5領域に含まれる。アデノウイルスAd5のゲノムは完全に配列決定されており、データベースでアクセスできる(特にGenebank M73260参照)。同様に、他のアデノウイルスゲノム(Ad2、Ad7、Ad12等)も部分的又は完全に配列決定されている。
アデノウイルスは上記性質と高いウイルス力価が得られることから、既にインビボ遺伝子導入に使用されている。この点で、アデノウイルスに由来する種々のベクターが製造され、種々の遺伝子(β−gal、OTC、α−1AT、サイトカイン等)が組込まれている。これらの構築物の各々でアデノウイルスは遺伝子導入後に複製できないように改変されている。例えば、従来技術に記載されている構築物は、E1領域と場合によりE3領域を欠失し、このレベルに異種DNA配列を挿入したアデノウイルスである(Levreroら,Gene 101(1991)195; Gosh−Choudhuryら,Gene 50(1986)161)。E1領域とE4領域の非必須部分のレベルに欠失を含む構築物(WO94/12649)や、改変ゲノム構成をもつ構築物(FR9413355)も報告されている。
しかし、アデノウイルスの工業及び治療的利用はこれらの組換えウイルスの現行製造方法によりまだ制限されている。
アデノウイルスは実際にコンピテントパッケージング細胞系に組換えウイルスのDNAをトランスフェクトすることにより製造される。トランスフェクションは、組換えウイルスの完全ゲノムをもつ構築物を入手できる場合には単純なトランスフェクションでよいが、多くの場合には組換えウイルスゲノムの種々の部分を付加する複数のDNAフラグメントの同時トランスフェクションを用いる。その場合、組換えウイルスのDNAを生成するためには、パッケージング細胞系で種々の構築物間の1段階以上の相同組換えが必要である。従って、これらの方法のいずれを実施する場合にも、製造しようとする組換えアデノウイルスのゲノムの全体又は一部をもつ適当な構築物を入手する必要がある。
従来技術にはこれらの構築物の種々のインビトロ製造方法が記載されている。最も一般に使用されている方法は、ウイルスDNAを単離した後、慣用分子生物学法(消化、連結等)によりインビトロ改変する方法である。その後、得られた構築物を精製し、パッケージング細胞系にトランスフェクトするために使用する。しかし、この方法は組換えウイルスの各構築又はDNAの全操作にウイルスストックの製造とウイルスDNAの精製が必要である。組換えウイルスのゲノムの一部をもつプラスミドを使用し、ゲノムの欠損部分を付加するウイルスと同時トランスフェクトする方法もある。しかし、上述のように、この方法はパッケージング系で組換えが必要であり、適当な付加ウイルスが必要である。これらの不都合を解消するために、原核プラスミドを利用してトランスフェクションに使用可能なウイルスDNAを製造することが提案されている。特に、Bettら(PNAS 91(1994)8802)は改変アデノウイルスゲノムを含み大腸菌で複製可能なプラスミド(プラスミドpBHG10)の構築について記載している。より詳細には、このプラスミドはE1、E3及びPsi領域を欠失し、ITR配列の結合により環化され、アデノウイルスのゲノムの188〜1339領域のレベルに挿入されたプラスミドpBR322の一部を含むアデノウイルスゲノムをもつ。このプラスミドは着目遺伝子を挿入するように操作することができ大腸菌で複製できるが、まだ不都合がある。このプラスミドをウイルス製造に使用するには、特に少なくともウイルスゲノムの左側領域を付加する第2のプラスミドを併用しなければならない。同様の欠点をもつこの型の他のプラスミドは例えばGraham(EMBOJ.3(12)(1984)2917)に記載されている。これらのプラスミドはパッケージング細胞で組換え段階を実施する必要もある。
特に、これらの技術はアデノウイルスゲノムの種々の領域で操作できるようにするために種々のプラスミドを使用する必要がある。更に、組換えウイルスが得られるのは、パッケージング細胞に同時トランスフェクトしたゲノムフラグメントの相同組換え後に限られる。このため、組換えウイルスの獲得頻度は一層制限され、工程全体に時間がかかる。
従って、従来技術では組換えアデノウイルスゲノムを製造するために容易に操作可能で且つインビトロ増幅可能な適当なプラスミドを入手できることが明らかに必要である。また、こうして製造されたゲノムが、(i)免疫応答を誘発し得、(ii)耐性タンパク質をコードし得、(iii)ベクターとしてのウイルスの能力を低下させ得るプラスミド由来領域を実質的に欠失していることも重要である。
本発明はこれらの不都合を解消することができる。本発明は実際に、これらの全要件を満たし、治療的に使用可能な組換えアデノウイルスを迅速且つ有効にクローニング製造することが可能なプラスミドに関する。
より詳細には、本発明の第1の目的は当該組換えアデノウイルスゲノムには存在しない1種以上の制限部位に挟まれた(即ち、そのような部位を両端に有する)組換えアデノウイルスゲノムを含むプラスミドである。
このようなプラスミドの1例を図2に示す。
本発明によるプラスミドに存在する組換えアデノウイルスゲノムは完全ゲノムであると有利である。こうするとウイルスゲノムの別の部分を付加する第2の構築物を使用する必要がなくなり、パッケージング系で組換え段階を実施する必要がなくなるので特に有利である。本発明によるプラスミドの別の利点は、アデノウイルスゲノムが原核プラスミドの領域により遮断されないという点にある。従って、製造されたゲノムは上述のような欠点をもつプラスミドの領域を含まない。また、本発明によるプラスミドではアデノウイルスゲノムのITR同士が結合していないので、組換えウイルスを製造するために直接使用可能な直鎖ウイルスDNAを獲得することができる。
従って、本発明によるプラスミドは原核細胞で複製を可能にする第1の領域と、アデノウイルスゲノムには存在しない1つ以上の制限部位で挟まれたアデノウイルスゲノムを含む第2の領域を含むと一層好ましい。
本発明によるプラスミドは該プラスミドを含む原核細胞の選択を可能にする領域も含んでいると一層好ましい。この領域は特に、薬剤耐性、特に抗生物質耐性を付与する任意の遺伝子により構成され得る。例として、分子生物学で通常使用されている例えばカナマイシン(Kan r)、アンピシリン(Amp r)、テトラサイクリン(Tet r)又はスペクチノマイシンに対する耐性を付与する遺伝子を挙げることができる(Maniatisら,1989)。プラスミドの選択は抗生物質耐性マーカーをコードする遺伝子以外の遺伝子により実施することができる。一般に、このような遺伝子はある細菌にこの細菌が欠損する機能(これは染色体上で欠失させられたか又は不活性にされた遺伝子に対応し得る)を与え、プラスミド上でこの機能を回復する遺伝子である。例えば、このような遺伝子は欠損染色体機能を回復するトランスファーRNAの遺伝子であり得る(Somoesら,1991)。
本発明のプラスミドで使用される原核細胞で複製を可能にする領域は、選択された細胞で機能的な任意の複製起点であり得る。このような複製起点としては、大腸菌polA株で複製を可能にする不和合性グループPのプラスミド(例=pRK290)に由来する複製起点が挙げられる。より一般的には、原核細胞で複製するプラスミドに由来する任意の複製起点であり得る。このプラスミドはpBR322(Bolivarら,1977)の誘導体、pUC(VieraとMessing,1982)の誘導体、又は同一不和合性グループ即ち例えばColE1もしくはpMB1から誘導される他のプラスミドであり得る。これらのプラスミドは大腸菌で複製する他の不和合性グループで選択することもできる。例えば不和合性グループA、B、FI、FII、FIII、FIV、H1、H11、I1、I2、J、K、L、N、OF、P、Q、T、U、W、X、Y、Z又は9に属するプラスミドから誘導されるプラスミドであり得る。他のプラスミドも使用でき、そのうちではプラスミドが大腸菌で複製せず、B.subtilis、Streptomyces、P.putida、P.aeruginosa、Rhizobium meliloti、Agrobacterium tumefaciens、Staphylococcus aureus、Streptomyces pristinaespiralis、Enterococcus faecium又はClostridium等の他の宿主で複製するものが挙げられる。好適例としては、大腸菌で複製するプラスミドに由来する複製起点を使用する。
上述のように、本発明のプラスミドに存在するアデノウイルスゲノムは完全又は機能ゲノム、即ち選択されたパッケージング系でウイルスストックを製造するために組換え又は連結により他の領域を付加する必要のないゲノムであると有利である。
好ましくは、組換えアデノウイルスゲノムは少なくともITR配列とパッケージングを可能にする配列を含む。
逆方向反復配列(ITR)はアデノウイルスの複製起点を構成する。ITRはウイルスゲノムの末端に位置する(図1参照)ため、当業者に公知の慣用分子生物学技術により容易に単離することができる。ヒトアデノウイルス(特に血清型Ad2及びAd5)及びイヌアデノウイルス(特にCAV1及びCAV2)のITR配列のヌクレオチド配列は文献に記載されている。例えばアデノウイルスAd5については、左側ITR配列はゲノムのヌクレオチド1〜103を含む領域に対応する。
パッケージング配列(Psi配列とも呼ぶ)はウイルスゲノムのパッケージングに必要である。この配列は野生型アデノウイルスのゲノムでは左側ITRとE1領域の間に位置する(図1参照)。この配列は慣用分子生物学技術により人工的に単離又は合成することができる。ヒトアデノウイルス(特に血清型Ad2及びAd5)及びイヌアデノウイルス(特にCAV1及びCAV2)のパッケージング配列のヌクレオチド配列は文献に記載されている。例えばアデノウイルスAd5については、ゲノムのヌクレオチド194〜358に機能的パッケージング配列が含まれる。
本発明の好適1態様では、使用するアデノウイルスのゲノムはE1領域の全部又は一部を欠失する。E1領域は実際にウイルス複製に必須であり、この領域が不活化すると、複製欠損ウイルス即ちインビボ遺伝子導入後に自律的に複製することができないウイルスが形成される。E1領域又は他の任意の該当ウイルス領域は当業者に公知の任意の技術、特に完全抑圧、置換、部分欠失、又は該当遺伝子への1個以上の塩基の付加により非機能的にすることができる。このような改変は例えば遺伝子工学技術により本発明のプラスミドで直接容易に実施することができる。使用するアデノウイルスのゲノムはヌクレオチド454〜3328(PvuII−BglIIフラグメント)又は382〜3446(HinfII−Sau3Aフラグメント)に含まれるE1領域の一部を欠失していると有利である。
特に有利な態様によると、使用するアデノウイルスのゲノムはE3及び/又はE4及び/又はIVA2領域の全部又は一部も欠失している。出願人はこれらの種々の欠失をもつウイルスを構築できることを今般立証した。これらの付加欠失により、ベクターの安全性を増すと共にその能力を増すことができる。
好ましくは、アデノウイルスゲノムは少なくとも読取り枠ORF3及びORF6を含むE4領域の一部を欠失している。アデノウイルスゲノムは更に、複製粒子による汚染の危険を避けるように、参考資料として本願の一部とする仏国特許出願第9413355号に記載されているように改変してもよい。
好ましくは、組換えアデノウイルスゲノムは更に着目核酸を含む。着目核酸はアデノウイルスのゲノムの種々の部位に挿入することができる。E1、E3又はE4領域のレベルに挿入すると有利である。但し、他の部位も当然使用できる。特に、ゲノムのヌクレオチド配列が得られるならば、当業者は着目核酸を挿入可能な領域を同定することができる。
着目核酸は標的細胞への導入及び/又は発現が所望される任意の導入DNA配列であり得る。
特に、着目核酸は1種以上の治療遺伝子及び/又は抗原性ペプチドをコードする1種以上の遺伝子を含み得る。
このように導入可能な治療遺伝子は、標的細胞内で転写して場合により翻訳されると治療効果をもつ物質を産生する任意の遺伝子である。
産生される物質は標的細胞に対して同種の物質(則ち標的細胞が疾病をもたない場合に該標的細胞で正常に発現される物質)であり得る。この場合、発現は例えば細胞における不十分な発現や改変によって不活性もしくは僅かに活性にされたタンパク質の発現を緩和したり、このようなタンパク質を過剰発現させることができる。治療遺伝子は更に、強化された安定性、改変された活性等をもつ細胞タンパク質の突然変異体をコードしていてもよい。産生される物質は標的細胞に対して異種でもよい。この場合には、発現されるタンパク質は細胞が疾病に対応できるように例えば細胞の欠損活性を補ったり付加することができる。
治療物質としては、特に酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン(例えばインターロイキン、インターフェロン、TNF等)(WO93/19191)、成長因子、神経伝達物質又はその前駆物質もしくは合成酵素、栄養因子(例えばBDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5等)、アポリポタンパク質(例えばApoAI、ApoAIV、ApoE等)(WO94/25073)、ジストロフィン又はミニジストロフィン(FR9111947)、腫瘍抑制遺伝子(例えばp53、Rb、Rap1A、DCC、k−rev等)(WO9424297)、因子VII、VIII、IX等の凝血関連因子をコードする遺伝子、自殺遺伝子(TK等)等を挙げることができる。
治療遺伝子は標的細胞で発現されると遺伝子の発現又は細胞mRNAの転写を制御することが可能なアンチセンス遺伝子又は配列でもよい。このような配列は、例えばヨーロッパ特許第140308号に記載の方法に従って標的細胞で細胞mRNAの相補的RNAに転写され、そのタンパク質翻訳を阻止することができる。
上述のように、着目核酸はヒトで免疫応答を生じることが可能な抗原ペプチドをコードする1種以上の遺伝子も含み得る。従って、この特定実施態様では、本発明は特に微生物又はウイルスに対してヒトを免疫することが可能なワクチンを製造することができる。このようなペプチドとしては特に、エプスタイン−バールウイルス、HIVウイルス、B型肝炎ウイルス(EP185573)、偽狂犬病ウイルスの特異抗原ペプチド、又は腫瘍特異抗原ペプチド(EP259212)が挙げられる。
一般に、着目核酸は感染細胞で治療遺伝子及び/又は抗原ペプチドをコードする遺伝子を発現させることが可能な配列も含む。このような配列は、該配列が感染細胞で機能し得るときに着目遺伝子の発現に天然に関与する配列であり得る。(他のタンパク質又は合成タンパク質の発現に関与する)別の起源の配列でもよい。特に、真核又はウイルス遺伝子のプロモーター配列でもよい。例えば感染させることが所望される細胞のゲノムに由来するプロモーター配列であり得る。更に、使用されるアデノウイルスを含むウイルスのゲノムに由来するプロモーター配列でもよい。この点では、例えばE1A、MLP、CMV、RSV遺伝子等のプロモーターを挙げることができる。更に、活性化、調節等の配列を付加してこれらの発現配列を改変してもよい。また、挿入される遺伝子が発現配列を含まない場合には、このような配列の下流で欠損ウイルスのゲノムに挿入してもよい。最後に、着目核酸は更に、標的細胞の分泌経路に合成治療物質を導くシグナル配列を特に治療遺伝子の上流に含んでいてもよい。このシグナル配列は治療物質の天然シグナル配列でもよいし、他の任意の機能シグナル配列又は人工シグナル配列でもよい。
本発明によるプラスミドは種々の起源のアデノウイルスを使用して構築することができる。実際に、構造と性質が多少異なる種々の血清型のアデノウイルスが特性決定されている。これらの血清型のうちでは、本発明の範囲では2もしくは5型のヒトアデノウイルス(Ad2又はAd5)又は動物起源のアデノウイルス(国際公開第WO94/26914号参照)を使用すると好ましい。本発明の範囲で使用可能な動物起源のアデノウイルスのうちでは、イヌ、ウシ、マウス(例えばMav1,Beardら,Virology,75(1990)81)、ヒツジ、ブタ、トリ又はサル(例えばSAV)起源のアデノウイルスを挙げることができる。好ましくは動物起源のアデノウイルスはイヌアデノウイルス、より好ましくはアデノウイルスCAV2[例えばマンハッタン株又はA26/61(ATCC VR−800)]である。
本発明の特定態様によると、使用するアデノウイルスはヒト起源のアデノウイルスである。別の有利な態様によると、アデノウイルスは動物起源のアデノウイルスである。
上述のように、組換えアデノウイルスゲノムは該ゲノムに不在の1つ以上の制限部位で挟まれていると有利である。この部位により、プラスミドから組換えアデノウイルスゲノムを簡単且つ有効に切り出すことができる。アデノウイルスのゲノム配列は公知であり、入手できるので、当業者はこのゲノムに不在の制限部位を日常実験により選択することができる。例えば、PacI、NspV及びSwaI(Ad5の場合)又はSnabI(Ad2の場合)を挙げることができる。アデノウイルスゲノムの配列を改変することにより所定の部位を単一にすることも可能である。例えば、大腸菌で構築されたアデノウイルス配列で対応する制限部位が抑圧、修飾又は欠失されている場合には他の酵素を使用してもよい。これらの部位はアデノウイルスゲノムの末端に直接配置してもよいし、数塩基対離して配置してもよい。
本発明で特に好適なプラスミドはプラスミドRK2の複製起点と、テトラサイクリン耐性遺伝子と、非機能的領域E1及びE3をもち且つ2つのPacI部位で挟まれた組換えアデノウイルスゲノムを含むプラスミドpXL2638である。着目核酸はアデノウイルスゲノムの種々の部位を挿入することができ、特にE1、E3及びE4領域のレベルに挿入することができる。このためには、特にXbaI部位等の種々の制限部位を使用することができる。
本発明によるプラスミドは種々の方法で構築することができる。1好適方法によると、まず最初にアデノウイルスゲノムのITRをもち且つ適当な制限部位で挟まれたフラグメントを構築する。これらのITRを次に原核プラスミドに導入し、第3段階で組換えアデノウイルスゲノムを連結又は組換えによりITR間で再構築する。所望の組換えアデノウイルスゲノムとプラスミドの相同領域(ITRとフランキング領域を含む)の間の組換えによりゲノムを再構築するのが好ましい。
より詳細には、ゲノムの再構築は相同組換え事象を選択するようにpolA株を使用することにより大腸菌で実施することができる。当然のことながら、組換え事象の選択を可能にする系の不在下でこれらの構築を実施することもできる。実際に、このような組換え事象はミニ調製、マーカーの喪失もしくは獲得、又は獲得もしくは喪失された結合に特異的な放射性プローブを用いてスクリーニングすることができる。更に、大腸菌で相同組換え事象を選択することが可能な他の方法もある。これらの方法のうちでは、複製に感熱性のプラスミドの使用(Hamiltonら,1989)、非複製環状分子の使用(例えばSlaterとMaurer,1993に記載)、使用されるベクターが複製しない株の使用(MillerとMekalanos,1988,Zeefら,1994)等が挙げられる。これらの全方法は、pBR322から誘導されるプラスミド、その多数の誘導体、PolAに依存して複製する他のプラスミド、又は大腸菌で複製しないプラスミドによる形質転換とpolA株に代用することができる。
本発明の別の目的は、上記のようなプラスミドを含む任意の原核細胞に関する。このような細胞としては、特に組換えDNAを導入可能なベクター系が存在する任意の細菌が挙げられる。例えば大腸菌、Salmonella typhimurium、Bacillus subtilis、Pseudomonas putida、Pseudomonas aeruginosa、Agrobacterium tumefaciens、Rhizobium meliloti又はStreptomyces属の細菌が挙げられる。これらの細胞は当業者に公知の技術により形質転換により得ると有利である。形質転換は特にCaCl2形質転換法(DagertとEhrlich,1979)、Hanahanら(1983)により開発された方法又は該方法から派生した全方法(Maniatisら,1989)、及び電気形質転換(Wirthら,1989)により実施することができる。後記一般分子生物学技術も参照されたい。
本発明の別の目的は、組換えアデノウイルスゲノムの製造方法である。この方法によると、上記のような原核細胞を培養した後、第2段階でプラスミドを回収する。十分な量のプラスミドを産生させるために十分長い時間培養を行うと有利である。プラスミドは当業者に公知の任意のプラスミドDNA製造技術により回収することができる。例えば、透明溶菌液の調製後、塩化セシウム勾配中で遠心分離することにより回収できる(Maniatisら,1989)。例えばトリトンX−100(Ausubelら,1987)を使用したり、染色体DNAとタンパク質の大部分からプラスミドDNAの溶菌分離段階後にアニオン交換カラムを使用する他の溶菌法などの他の技術を使用してもよい。こうして回収したプラスミドを次いで精製し、ウイルスゲノムの両端部位に対応する制限酵素の存在下で処理する。こうして、組換えウイルスのクローニング製造に直接使用可能な直鎖状組換えアデノウイルスゲノムを単一段階で生成することができる。
この点では、組換えウイルスを製造するための第1の方法は、本発明のプラスミドから製造したウイルスゲノムをコンピテントパッケージング細胞系、即ち欠損ウイルスの相補に必要な全機能をトランス位にもつ細胞系にトランスフェクトする方法である。これらの機能を細胞のゲノムに組み込み、組換えの危険を減らすと共に、細胞系に高い安定性を付与することが好ましい。
第2のアプローチは、製造した組換えゲノムと1種以上のヘルパーウイルス又はプラスミドのDNAを適当な細胞系に同時トランスフェクトする方法である。この方法によると、組換えアデノウイルスの全欠損機能を相補することが可能なコンピテント細胞系を入手する必要がない。これらの機能の一部は実際にヘルパーウイルスにより相補される。このヘルパーウイルスはそれ自体欠損ウイルスである。
使用可能な細胞系のうちでは、特にヒト胎児腎293系(Grahamら,J.Gen.Virol.36(1977)59)を挙げることができる。この系は特にヒトアデノウイルスAd5のゲノムの左側部分(12%)をそのゲノムに組み込んでいる。上述の方法により得られたプラスミドの消化産物を用いると、アデノウイルスゲノムの精製段階を必要とせずにトランスフェクションを直接実施できるという利点がある。
本発明は前記方法により製造された1種以上の組換えアデノウイルスを含む任意の医薬組成物にも関する。本発明の医薬組成物は局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経皮等の経路で投与するように調合することができる。
好ましくは、医薬組成物は注射用調合物に医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する。キャリヤーとしては、特に滅菌等張塩類溶液(リン酸の一ナトリウム塩、二ナトリウム塩、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等、又はこれらの塩の混合物)、又は場合に応じて滅菌水もしくは生理的血清を加えると注射可能な溶質を構成できる乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物が挙げられる。
注射に使用するウイルスの用量は種々のパラメーター、特に使用する投与方法、該当疾病、発現させようとする遺伝子、又は所望の治療期間に応じて適応できる。一般に、本発明による組換えアデノウイルスは104〜1014pfu、好ましくは106〜1010pfuの用量で調合及び投与される。pfu(「プラーク形成単位」)なる用語はウイルス溶液の感染能に対応し、適当な細胞培養物の感染により測定され、一般に15日後の感染細胞のプラーク数を表す。ウイルス溶液のpfu力価の測定方法は文献に詳細に記載されている。
挿入する異種DNA配列に応じて、遺伝病(ジストロフィー、嚢胞性線維症等)、神経変性病(アルツハイマー病、パーキンソン病、ALS等)、癌、凝血障害又はリポタンパク異常血症に結び付けられる疾病、ウイルス感染に結び付けられる疾病(肝炎、AIDS等)等を含む多数の疾病の治療又は予防に本発明のアデノウイルスを使用することができる。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は単なる例示であってこれによって発明を制限するものではない。
図面の説明
図1:アデノウイルスAd5の遺伝子地図。
図2:pXL2626及びpXL2627の制限地図。Ampr:アンピシリン耐性遺伝子;pMB1 Ori:pMB1の複製起点;Tetr:テトラサイクリン耐性遺伝子;RK2 Ori:プラスミドRK2の複製起点。プラスミドの地図の円部分は2ITRに対して示す0.8kbと同一縮尺ではない。
図3:プラスミドpXL2638の構築。この構築は実施例1〜2に記載するようにSF800(大腸菌polA)で相同組換えにより実施する。Ampr:アンピシリン耐性遺伝子;pMB1 Ori:pMB1の複製起点;Tetr:テトラサイクリン耐性遺伝子;RK2 Ori:プラスミドRK2の複製起点。プラスミドの地図の円部分はアデノウイルス配列と同一縮尺ではない。
一般クローニング・分子生物学技術
塩化セシウム−臭化エチジウム勾配によるプラスミドDNAの遠心分離、制限酵素消化、ゲル電気泳動、大腸菌の形質転換、核酸の沈降等のような慣用分子生物学法は文献に記載されている(Maniatisら,1989)。
酵素はNew−England Biolabs(Beverly,MA)の製品を用いた。連結にあたっては、DNAフラグメントを0.8→1.5%アガロースゲルで寸法に従って分離し、GeneClean(BIO101,LaJolla CA)により精製し、ファージT4のDNAリガーゼの存在下、緩衝液Tris−HCl(pH7.4)50mM,MgCl210mM,DTT 10mM,ATP 2mM中で14℃で一晩インキュベートする。
連結したDNAを使用して、コンピテントにした大腸菌TG1株[D(lac proA,B),supE,thi,hsdD5/ F traD36,proA +,B +,lacIq,lacZDM15](Maniatisら,1982)又は大腸菌polA株SF800(Heffronら,1977)を形質転換させる。PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)による増幅もManiatisら,1989に従い、MgCl2濃度8mM、変性温度95℃、ハイブリダイゼーション温度55℃、伸長温度72℃とし、このサイクルをPE9600 Thermalcycler(Perkin Elmer,Norwalk CO)で25回繰り返すことにより実施した。
オリゴヌクレオチドは、自動DNA合成器Applied Biosystemモデル394(Applied Biosystem,Foster City CA)を製造業者の指示に従って使用し、シアノエチル基によりβ保護したホスホラミダイト化学(Sinhaら,1984,Giles 1985)を使用することにより合成する。
配列決定は蛍光プライマーを使用して連鎖終結法により2本鎖鋳型上で実施した。製造業者の指示に従ってApplied Biosystem(Applied Biosystem,Foster City CA)で配列決定キットTaq Dye Primer Kitを使用した。
実施例1:大腸菌で複製する不和合性グループPのプラスミドにおける、固有制限部位で挟まれた5型ヒトアデノウイルスゲノムのクローニング
実施例1−1:本実施例は末端(ITR)をPacI部位で挟むようにアデノウイルスゲノムの末端をPCRにより増幅する方法に関する。
後で十分な組換え頻度が得られるように、約400bpの増幅済みフラグメントを選択した。
次の3種のオリゴヌクレオチドを選択した。
オリゴ1はITRの末端に対応するので2つの増幅に共通である。
最初の6個のヌクレオチドは二次構造の形成を避ける尾部を構成する。続く6個のヌクレオチドは中間クローニング段階に使用される制限部位EcoRIを構成する。続く8個のヌクレオチドはAd5のゲノムに欠失するPacI部位を生成する(アデノウイルスAd5の配列はGenebankから入手でき、1文字表記ではADRCOMPGENである)。
続く27個のヌクレオチドはAd5のゲノムの1〜27位の左側末端に対応する。
オリゴ1の配列:
オリゴ1と併用するオリゴ3は左側末端に384bpのフラグメントを増幅することができる。オリゴ3は6ヌクレオチドの尾部を含む。続く18個のヌクレオチドはPstI、KpnI及びSpeI部位を生成する。続く24個のヌクレオチドはAd5で選択される361〜385位の配列の逆方向に相補的な配列に対応する。
オリゴ3の配列:
左側末端の増幅に選択される鋳型はプラスミドpCLAIである。プラスミドpCLAIはpIC19Hにクローニングした454bpのEcoRI−XbaIフラグメントとしての左側末端を含む。
オリゴ1と併用するオリゴ2は右側末端に418bpのフラグメントを増幅することができる。オリゴ2は6ヌクレオチドの尾部を含む。続く6個のヌクレオチドはPstI部位を生成する。続く24個のヌクレオチドはAd5で選択される35517〜35540位の配列に対応する。
オリゴ2の配列:
右側末端の増幅に選択される鋳型はプラスミドpY23である。プラスミドpY23はpIC19Hの和合性XbaI−BamHI部位にクローニングした470bpのAvrII−BclIフラグメントとしての右側末端を含む。
PCR産物をアガロースゲルに載せた。所望寸法のフラグメントをEcoRI及びPstIで消化し、精製し、EcoRI及びPstIで消化したpUC19の存在下で連結した。得られた2個の組換えプラスミドの左側末端をpXL2623及び右側末端をpXL2624と命名した。インサートに突然変異が存在しないことを配列決定により確認した。これらのプラスミドのEcoRI−PstIフラグメントを上述のように精製した。2個のフラグメントをEcoRIで直鎖化したpUC19中で連結させた。得られた組換えプラスミドはAd5の末端を逆向きに含み、これをpXL2626と呼ぶ(図2)。
実施例1−2:PacI部位により挟まれたアデノウイルスゲノムΔE1,ΔE3を含むプラスミドの大腸菌における構築。
アデノウイルスゲノムを受容するために利用したベクターは不和合性グループPに属すると思われるpRK290(Dittaら,1980)である。このベクターは大腸菌polA株で複製する。
採用した組み込みストラテジーは大腸菌SF800株におけるプラスミドpXL2627及びpFG144の間の相同組換えである(Grahamら,1986)。
プラスミドpFG144はAd5の完全ゲノムのE1及びE3領域に2つの欠失を含む。該プラスミドはpMX2から誘導され、アンピシリン耐性遺伝子と、大腸菌SF800株で複製できないようにする複製起点pMB1を含む。
まず最初にpXL2626の構築について上述したプロトコールに従い、Ad5のゲノムの相互に逆向きの末端をpRK290の固有EcoRI部位にクローニングした。大腸菌SF800株をコンピテントにし、pXL2627により形質転換させた。培養物をテトラサイクリンの存在下でLB培地にプレーティングした。その後、テトラサイクリン耐性クローンからの細胞をコンピテントにし、プラスミドpFG144により形質転換させた後、テトラサイクリン及びアンピシリンの存在下でLB培地にプレーティングした。このプラスミドは大腸菌SF800株では複製しないので、2種のプラスミド間で相同組換えが行われる場合にしかテトラサイクリン及びアンピシリン耐性は獲得できない。実際に、これらの2種のプラスミドはAd5のゲノムの418bp右側末端と384bp左側末端を共有する。この第1回の組換えによるプラスミドは2組の末端をもつ(図2)。従って、プラスミドの内側で第2の乗換えが生じ得る。この場合には、可能な2つの事象のうちで一方のみが所望の構築を生じ、他方はAd5のゲノムの完全欠失とアンピシリン耐性遺伝子の喪失をもたらす。テトラサイクリン及びアンピシリンを補充したLB培地で60世代に相当する連続希釈培養によりこの第2の組換えを助長した。単離したクローンのDNAをサザンブロットにより分析した。次のオリゴヌクレオチドプローブを合成した。
塩基1〜9はAd5の配列上の377〜385位の左側領域に対応する。塩基28〜36は35517〜35525位の右側領域の配列に対応する。エンドヌクレアーゼPacIとClaI又はPacIとNdeIで消化すると所望のプラスミド構造を示した。このような事象に対応し、図3に示すプラスミド構造をもつクローンを選択した。これをpXL2628と命名した。
pXL2628をXbaIで消化し、再連結した後、コンピテント大腸菌TG1細胞で形質転換させた。クローンTetR及びAmpSを選択した。その制限プロフィルはpMX2に対応する領域を欠失していることを示す。このクローンをpXL2638と命名した。
pXL2638をPacIで消化すると、34kbのフラグメントとしてAd5のゲノムが遊離する。このフラグメントは、アデノウイルスのE1機能にトランス相補する哺乳動物細胞のトランスフェクション実験にそのまま使用できる。
実施例2:組換えアデノウイルスの製造
複数の遺伝子を被験哺乳動物細胞で発現させるのに適した調節シグナルと共にこれらの遺伝子を含むフラグメントを挿入するか、アデノウイルスのゲノムの所定のフラグメントを欠失させるか、又はこれらの2つの事象の併用により、まず第1段階で組換えアデノウイルスクローンを大腸菌で構築し、その後、産生細胞のトランスフェクション後にこのような組換えウイルスのストックが得られる。
プラスミドpXL2638は、形質転換コンピテント大腸菌TG1細胞の培養物から精製される。アデノウイルスゲノムは酵素PacIの存在下で消化することにより遊離される。消化産物は組換えアデノウイルスを製造するために直接使用される。このためには、リン酸カルシウムの存在下でpXL2638の消化産物を293系細胞にトランスフェクトする。その後、産生された組換えアデノウイルスを薄膜精製により選択する。単離後、組換えアデノウイルスを293細胞系で増幅し、約1010pfu/mlの力価をもつ未精製組換えアデノウイルスを含む培養上清を得る。
次に、公知技術(特にGrahamら,Virology 52(1973)456参照)に従い、ウイルス粒子を塩化セシウム勾配で遠心分離により精製する。アデノウイルスは20%グリセロール中で−80℃で保存することができる。
配 列 表
配列番号:1
配列の長さ:47
配列の型:ヌクレオチド
鎖の数:1本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
配列
配列番号:2
配列の長さ:37
配列の型:ヌクレオチド
鎖の数:1本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
配列
配列番号:3
配列の長さ:48
配列の型:ヌクレオチド
鎖の数:1本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
配列
配列番号:4
配列の長さ:37
配列の型:ヌクレオチド
鎖の数:1本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
配列
Claims (21)
- 組換えアデノウイルスゲノムには存在しない1つ以上の制限部位に挟まれた組換えアデノウイルスゲノムを含む原核プラスミドであって、該組換えアデノウイルスゲノムはITR配列とパッケージング配列のそれぞれを含み、且つ該アデノウイルスゲノムは原核プラスミドの配列により遮断されていないことを特徴とする、前記原核プラスミド。
- 原核細胞における複製を可能にする第1の領域と、請求項1に記載の組換えアデノウイルスゲノムを含む第2の領域を含むことを特徴とする原核プラスミド。
- 複製を可能にする領域が、原核細胞で機能的な複製起点を含むことを特徴とする請求項1又は2に記載のプラスミド。
- 複製起点がRK2、pBR322及びpUCから選択される細菌プラスミドに由来することを特徴とする請求項3に記載のプラスミド。
- 複製を可能にする第1の領域が、前記プラスミドを含む原核細胞の選択を可能にする領域も含むことを特徴とする請求項2から4のいずれか一項に記載のプラスミド。
- アデノウイルスゲノムがE1領域の全部又は一部を欠失していることを特徴とする請求項1乃至5のいずれか一項に記載のプラスミド。
- アデノウイルスゲノムが、残基454〜3328又は382〜3446に対応するE1領域の一部を欠失していることを特徴とする請求項6に記載のプラスミド。
- アデノウイルスゲノムがE4及び/又はE3及び/又はIva2領域の全部又は一部を欠失していることを特徴とする請求項1乃至7のいずれか一項に記載のプラスミド。
- アデノウイルスゲノムが少なくとも読取り枠ORF3及び/又はORF6を含むE4領域の一部を欠失していることを特徴とする請求項8に記載のプラスミド。
- アデノウイルスゲノムがヒト又は動物に由来することを特徴とする請求項1乃至9のいずれか一項に記載のプラスミド。
- アデノウイルスゲノムが2又は5型のヒトアデノウイルスゲノムであることを特徴とする請求項10に記載のプラスミド。
- アデノウイルスゲノムが血清型CAV2から選択されるイヌアデノウイルスゲノムであることを特徴とする請求項10に記載のプラスミド。
- 組換えアデノウイルスゲノムがアデノウイルスAd5に由来し、PacI、NspV又はSwaI部位で挟まれていることを特徴とする請求項1乃至12のいずれか一項に記載のプラスミド。
- 組換えアデノウイルスゲノムが着目核酸を含むことを特徴とする請求項1乃至13のいずれか一項に記載のプラスミド。
- 請求項1乃至14のいずれか一項に記載のプラスミドを含む原核細胞。
- 請求項15に記載の原核細胞を培養し、プラスミドを回収することを含む組換えアデノウイルスゲノムの製造方法。
- 付加段階でアデノウイルスゲノムを切り出すようにプラスミドを処理することを特徴とする請求項16に記載の方法。
- アデノウイルスゲノムの両端部位に対応する制限酵素の存在下でプラスミドを処理することを特徴とする請求項17に記載の方法。
- 請求項16乃至18のいずれか一項に記載の方法により製造されたアデノウイルスゲノムをパッケージング細胞系にトランスフェクトし、産生されたアデノウイルスを回収することを特徴とする組換えアデノウイルスの製造方法。
- 細胞系が293系であることを特徴とする請求項19に記載の方法。
- 請求項16に記載の方法により製造された1種以上の組換えアデノウイルスを含む医薬組成物。
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