NO327980B1 - Prokaryotisk plasmid, prokaryotisk celle samt fremgangsmate for fremstilling av et adenoviralt genom - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en ny fremgangsmåte for fremstilling av rekombinante adenovirus, prokaryotisk plasmid som er tilpasset for fremstilling av nevnte adenovirus samt prokaryotisk celle som inneholder nevnte plasmid.

Genterapi består i å korrigere en defekt eller en anomali (mutasjon, feilaktig ekspresjon osv.) ved innføring av en genetisk informasjon i den påvirkede celle eller det påvirkede organ. Denne genetiske informasjon kan innføres enten in vitro i en celle som er hentet fra organet og der den modifiserte celle deretter igjen innføres i organismen, eller direkte in vivo i det angjeldende vev. I det andre tilfellet foreligger det forskjellige teknikker, blant hvilke forskjellige transfeksjonsteknikker som involverer komplekser av DNA og DEAE-dekstran (Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891), DNA og nukleærproteiner (Kaneda et al., Science 243 (1989)375), DNA og lipider (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), anvendelsen av liposomer (Fraley et al., J. Biol. Chem. 255

(1980) 10431), osv. I den senere tid er anvendelsen av virus som vektorer for overføring av gener kommet som et lovende alternativ til disse fysiske transfeksjonsteknikker. I denne forbindelse er forskjellige virus testet med henblikk på evnen til å infisere visse cellepopulasjoner. Særlig gjelder dette retrovirus (RSV, HMS, MMS, osv.) HSV viruset, de adeno-assosierte virus og adenovirusene.

Blant nevnte virus oppviser adenovirusene visse interessante egenskaper for anvendelse i genterapi. Særlig har de et stort vertsspektrum, er i stand til å infisere hvilende celler, integrerer seg ikke i genomet i de infiserte celler og assosieres i dag ikke med patologier av betydning i mennesker. Adenovirusene har således vært benyttet for å overføre gener av interesse til muskler (Ragot et al., Nature 361 (1993) 647), til leveren (Jaffe et al., Nature genetics 1 (1992) 372), til nervesystemet (Akli et al, Nature genetics 3 (1993) 224), osv.

Adenovirusene er virus med lineær dobbeltrådet DNA med en størrelse på ca. 36 kb. Deres genom omfatter særlig en repetert invers sekvens, ITR ved hver ende, en enkapsideringssekvens, Psi, tidlige gener og sene gener (jfr. fig. 1). De vesentlige tidligere gener inneholdes i områdene El, E2, E3 og E4. Blant disse er genene som inneholdes i området El nødvendige for den virale propagering. De vesentlige sene gener inneholdes i områdene LI til L5. Genomet av adenovirus Ad5 er helt og holdent sekvensert og tilgjengelig i databaser (se særlig Genebank M73260). Videre er deler av eller sågar helheten av andre adenovirale genomer (Ad2, Ad7, Adl2, osv.) sekvensert. Tatt i betraktning egenskapene til de ovenfor nevnte adenovirus og tatt i betraktning at det er mulig å oppnå meget høye virale mengder, er disse allerede benyttet for overføring av gener in vivo. I denne forbindelse er det fremstilt forskjellige vektorer avledet fra adenovirus, inneholdende forskjellige gener (P-gal, OTC, a-1 AT, cytokiner, osv.). I hver av disse konstrukter er adenoviruset modifisert på en måte som gjør den ute av stand til replikering etter genoverføring. Således er de konstrukter som er beskrevet i den kjente teknikk adenovirus som er deletert for områdene El og eventuelt E3, på nivå med hvilke det er innskutt heterologe DNA sekvenser (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161). Andre konstrukter bærer en delesjon i området El og en ikke essensiell del av området E4 (WO094/12649), eller en modifisert genomisk organisasjon (FR 94 13355).

Imidlertid er den industrielle og terapeutiske eksportering av adenovirusene fremdeles begrenset av dagens metoder for fremstilling av disse rekombinante virus.

Adenovirusene fremstilles ved transfeksjon av DNA av rekombinante virus i en kompetent enkapsideringscellelinje. Det kan dreie seg om en enkelt transfeksjon når et konstrukt som bærer hele genomet av den rekombinante virus er tilgjengelig eller, slik det som oftest er, en kotransfeksjon av flere DNA fragmenter som bidrar med de forskjellige deler av det rekombinante virale genom. I dette tilfellet involverer fremgangsmåten ett eller flere trinn med homolog rekombinering mellom de forskjellige konstrukter i enkapsideringscellelinjen for derved å danne DNA av den rekombinante virus. For å gjennomføre den ene eller andre av disse metoder, er det således nødvendig å ha tilgjengelig egnede konstrukter som bærer hele eller de deler av genomet av den rekombinante adenovirus som man ønsker å produsere.

Det foreligger forskjellige metoder som er beskrevet i litteraturen for fremstilling av disse konstrukter in vitro. Den mest benyttede teknikk består i å isolere viralt DNA for deretter å modifisere dette in vitro ved klassiske metoder innen molekylærbiologien (fermentering, ligering, osv.). De oppnådde konstrukter renses deretter og anvendes for å transfektere inkapsideringslinjen. Imidlertid involverer denne teknikk fremstilling av forråd av virus og rensing av viralt DNA for hvert konstrukt eller for enhver manipulering av DNAet av rekombinantviruset. En annen teknikk er basert på anvendelse av et plasmid som bærer en del av genomet av den rekombinante virus og som kotransfekteres med en virus som bærer den manglende del av genomet. Som antydet ovenfor, involverer imidlertid også denne metode en rekombinasjon i enkapsideringen og tilgjengelighet av et egnet, supplementærvirus. For å bøte på disse mangler har det vært foreslått å benytte prokaryotiske plasmider for å fremstille virale DNA'er som kan benyttes for transfeksjon. Særlig beskriver Bett et al. (PNAS 91

(1994) 8802) konstruktet av et replikativt plasmid i E. Coli som bærer et modifisert, adenoviralt genom (plasmid pBHGlO). Mer spesielt bærer dette plasmidet adenoviralt genom som er deletert i områdene El, E3 og Psi, ringsluttet ved skjøting av ITR sekvensen og som, innskutt i området 180 - 1339 av genomet av adenovirusen, omfatter en del av plasmidet pBR322. Dette plasmid kan replikeres i E. Coli, manipuleres for innskyting av gener av interesse, men oppviser ikke desto mindre fremdeles mangler. Dens anvendelse for fremstilling av virus involverer særlig anvendelsen av minst et andre plasmid som bærer det venstre området av det virale genom. Andre plasmider av denne type som oppviser den samme type av mangler er beskrevet f.eks. av Graham i (EMBOJ. 3(12) (1984) 2917). Disse plasmider nødvendiggjør videre å gjennomføre et rekombinasjonstrinn i enkapsideringscellene.

Særlig nødvendiggjør disse teknologier anvendelsen av forskjellige plasmider for å tillate manipulering av de ulike områder av det adenovirale genom. Videre kan oppnåelsen av den rekombinante virus ikke skje før den homologe rekombinasjon av de genomiske fragmenter som er kotransfektert i enkapsideringscellen. Dette begrenser hvor ofte de rekombinante virus oppnås og den totale prosess er langsom.

Microbiological Reviews, vol. 56, no. 4,1992, side 577-591 er en artikkel som omtaler bakteriofag lambda som en kloningsvektor. Lambda er ikke et plasmid, men en lytisk fag som inneholder et linært genom. Det er verken foreslått eller beskrevet at lambda kan bli anvendt for å klone et adenoviralt genom.

Det foreligger således innen den kjente teknikk et klart behov for å kunne disponere egnede plasmider som er lette å manipulere og som kan amplifiseres in vitro for fremstilling av rekombinante, adenovirale genomer. Det er likeledes viktig at de således fremstilte genomer i praksis er berøvet for områder som stammer fra plasmidet, som er i stand til (i) å indusere en immunrespons, (ii) å kode for resistense proteiner, og (iii) å redusere virusets evne som vektor.

Foreliggende oppfinnelse tar sikte på å bøte på disse mangler. Foreliggende oppfinnelse beskriver således plasmider som oppfyller alle de stilte krav og således tillater en hurtig og effektiv klonal produksjon av rekombinante adenovirus som kan benyttes terapeutisk.

Et første aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører et prokaryotisk plasmid som omfatter et fullstendig adenoviralt genom, som eventuelt kan mangle hele eller deler av El området og/eller hele eller deler av E4 området og/eller hele eller deler av E3 området og/eller hele eller deler av IVa2 området, som ikke er avbrutt av områder av det prokaryotiske plasmid, som er flankert av ett eller flere restriksjonsseter som ikke er til stede i nevnte genom, og som er flankert på høyre og venstre side av ITR sekvenser, hvor ITR'ene i genomet ikke er forbundet, kjennetegnet ved at det omfatter et område som muliggjør replikering i prokaryotiske celler og et område som muliggjør å selektere de prokaryotiske cellene som inneholder nevnte plasmid.

Genomet av en rekombinant adenovirus som er tilstede i plasmidene ifølge oppfinnelsen er fortrinnsvis et komplett genom. Dette er spesielt interessant fordi det tillater å gi avkall på anvendelsen av et andre konstrukt som tilveiebringer en andre del av det virale genom, og derved også trinnet med rekombinasjon i enkapsideringslinjen. En annen fordel ved plasmidene ifølge oppfinnelsen ligger i det faktum at det adenovirale genom ikke er avbrutt av regioner av prokaryotiske plasmid. På grunn av dette inneholder de produserte genomer ikke områder av plasmider med de mangler som er nevnt ovenfor. I plasmidene ifølge oppfinnelsen er videre ITR'ene av det adenovirale genom ikke skjøtet sammen, noe som tillater å oppnå lineære, virale DNA'er som direkte kan anvendes for fremstilling av de rekombinante virus.

Området som tillater seleksjon av prokaryotiske celler inneholdende plasmidet kan særlig bestå av ethvert gen som gir resistens mot et produkt og særlig et antibiotikum. Således kan man nevne gener som gir resistens mot kanamycin (Kan<1>), ampicillin (Amp<1>), tetracyklin (tet<1>) eller spektinomycin, som hyppig benyttes i molekylbiologien (Maniatis et al., 1989). Seleksjonen av plasmider kan skje ved andre gener enn genene som koder for resistensmarkørene mot et antibiotikum. Rent generelt dreier det seg om et gen som gir bakterien en funksjon det ikke lenger har (dette kan tilsvare et gen som er deletert på kromosomet eller gjort inaktivt) idet genet på plasmidet gjenoppretter denne funksjonen. Som eksempel kan det dreie seg om et gen av et tRNA som reetablerer en defekt kromosomfunksjon (Somoes et al., 1991).

Området som tillater replikering i de prokaryotiske celler som benyttes i plasmidene ifølge oppfinnelsen kan være av en hvilken som helst funksjonell replikasjonsopprinnelse i de valgte celler. Det kan dreie seg om en replikasjonsopprinnelse fra et plasmid av inkompatibilitetsgruppe P (f.eks. = pRK290) som tillater replikasjon i stammene av E. Coli pol A. Mere generelt kan det dreie seg om en hvilken som helst replikasjonsopprinnelse som stammer fra et plasmid som replikerer seg i prokaryotiske celler. Dette plasmid kan være et derivat av pBR322 (Bolivar at al., 1977) et derivat av pUC (Viera et Messing, 1982) eller hvilke som helst andre plasmider som stammer fra den samme inkompatibilitetsgruppe, dvs. f.eks. ColEl eller pMBl. Disse plasmider kan videre velges blant andre inkompatibilitetsgrupper som replikeres i Escherichia coli. Det kan dreie seg om plasmider avledet fra plasmider som f.eks. tilhører inkompatibilitetsgruppene A, B, Fl, Fil, Fm, FIV, Hl, Hl 1, II, 12, J, K, L, N, OF, P, Q, T, U, W, X, Y, Z eller 9. Det kan også benyttes andre plasmider, blant annet plasmider som ikke replikeres i E. Coli, men i andre verter som B. subtilis, Streptomyces, P. putida, P. aeruginosa, Rhizobium meliloti, Agrobacterium tumefaciens, Staphylococcus aureus, Streptomyces pristinaespiralis, Enterococcus faecium eller Clostridium. Fortrinnsvis benytter man replikasjonsopprinnelser som stammer fra plasmider som replikeres i E. coli.

Som antydet ovenfor, er det adenovirale genom som er til stede i plasmidene ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis et komplett eller funksjonelt genom, dvs. som ikke nødvendiggjør at det tilveiebringes andre områder ved rekombinasjon eller ligering for fremstilling av virale forråd i de valgte enkapsideringslinjer.

De repeterte, inverse sekvenser, ITR, utgjør replikasjonsopprinnelsen for adenovirusen. De er lokalisert ved endene av det virale genom (jfr. fig. 1) hvorfra de lett kan isoleres i henhold til klassiske teknikker innen molekylbiologien. Nukleotidsekvensen for ITR sekvensen av de humane adenovirus (særlig serotypene Ad2 og Ad5) er beskrevet i litteraturen, på samme måte som canine adenovirusene (særlig CAV1 og CAV2). Hva angår f.eks. adenovirusene Ad5, tilsvarer den venstre ITR sekvens området som omfatter nukleotidene 1 til 103 i genomet.

Enkapsideringssekvensen (også kalt Psi sekvensen) er nødvendig for enkapsidering av det virale genom. Denne befinner seg i genomet av vill-adenovirus, mellom den venstre ITR og området El, jfr. fig. 2. Den kan isoleres eller syntetiseres ved klassiske teknikker innen molekylærbiologien. Nukleotidsekvensen for enkapsideringssekvensen av humane adenovirus (særlig av serotypen Ad2 og Ad5) er beskrevet i litteraturen på samme måte som canine adenovirusene (særlig CAV1 og CAV2). Hva angår f.eks. adenovirus Ad5, ligger en funksjonell enkapsideirngssekvens mellom nukleotidene 194 og 358 av genomet.

I en spesielt foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er genomet av den benyttede adenovirus berøvet hele eller en del av området El. Området El er i realiteten essensielt for den virale replikasjon og dets inaktivering fører til dannelsen av virus som er defektive når det gjelder replikering, dvs. ute av stand til replikering på autonome måter etter genetisk overføring in vivo. Området El eller et hvilket som helst annet betraktet viralt område, kan gjøres ikke-funksjonelt ved en hvilken som helst av for fagmannen kjent teknikk og særlig ved total suppresjon, substitusjon, partiell delesjon eller addisjon av en eller flere baser i det eller de angjeldende gener. Slike modifikasjoner kan lett realiseres direkte på plasmidene ifølge oppfinnelsen, f.eks. ved hjelp av genspleisingsteknikker. Fortrinnsvis er genomet av det benyttede adenovirus berøvet en del av området El som ligger mellom nukleotidene 454 og 3328 (fragment PvuH-Bgin) eller 382 og 3446 (fragment Hinffl-Sau3A).

I henhold til en spesielt fordelaktig utførelsesform er genomet av den benyttede adenovirus likeledes berøvet hele eller en del av området E3 og/eller E4 og/eller IVa2. Foreliggende søkere har vist at det er mulig å konstruere virus som bærer disse forskjellige typer delesjoner. Disse supplementære delesjoner tillater å øke vektorens sikkerhet og å øke dens kapasitet.

Fortrinnsvis er det adenovirale genomet berøvet en del av området E4 omfattende minst de åpne leserammende ORF3 og ORF6. Det adenovirale genom kan likeledes være modifisert som beskrevet i FR9413355, for å unngå risiko for kontaminering med replikasjonspartikler. Fortrinnsvis inneholder det rekombinante, adenovirale genom i tillegg en nukleinsyre av interesse. Nukleinsyren av interesse kan skytes inn på forskjellige seter i genomet til adenoviruset. Fortrinnsvis blir det skutt inn i områdene El, E3 eller E4. Imidlertid skal det være klart at andre seter kan benyttes. Særlig tillater tilgang til nukleotidsekvensen av genomet fagmannen å identifisere de områder som tillater innskyting av nukleinsyren av interesse.

Nukleinsyren av interesse kan være en hvilken som helst sekvens av det innførte DNA hvis overføring og/eller ekspresjon i målcellen er ønsket.

Særlig kan den omfatte ett eller flere terapeutiske gener og/eller ett eller flere gener som koder for antigeniske peptider.

De terapeutiske gener som således kan overføres er et hvilket som helst gen hvis transkripsjon og eventuelt traduksjon i målcellen gir produkter med en terapeutisk virkning.

Det kan dreie seg om et produkt som er homologt vis-a-vis målcellen (dvs. et produkt som særlig uttrykkes i målcellen når denne ikke oppviser noen patologi). I dette tilfellet tillater ekspresjonen f.eks. å bøte på en tilstrekkelig ekspresjon i cellen eller ekspresjon ved et inaktivt eller lite aktivt protein på grunn av en modifikasjon, eller også å overeksprimere proteinet. Det terapeutiske gen kan også kode for en mutant av et cellulært protein, med øket stabilitet, modifisert aktivitet osv. Produktet kan likeledes være heterologt vis-a-vis målcellen. I dette tilfellet kan et uttrykt protein f.eks. komplettere eller tilveiebringe en defekt aktivitet i cellen som tillater den å kjempe mot en patologi.

Blant de terapeutiske produkter kan man særlig nevne enzymer, blodderivater, hormoner, lymfokiner: interleukiner, interferoner, TNF, osv. (W093/19191), vekstfaktorer, neurotransmittere eller deres forløpere eller synteseenzymer, tropiske faktorer: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, osv. apolipoproteiner: ApoAI, ApoATV, ApoE, osv. (WO94/25073) dystrofin eller et minidystrofin (FR 9111947), tumorsuppressorgener: p53, Rapi A, DCC, k-rev, osv.

(W09424297), gener som koder for faktorer som er involvert i koagulering: VII, VIE, IX, drepergener (TK, osv.) osv.

Det terapeutiske gen kan likeledes være et gen eller en antisens sekvens hvis ekspresjon i målcellen tillater å kontrollere ekspresjonen av gener eller transkripsjonen av cellulært mRNA. Slike sekvenser kan f.eks. transkriberes i målcellen til RNA som er komplementær til cellulær mRNA og derved blokkere deres translasjon til protein, i henhold til den teknikk som er beskrevet i EP 140 308.

Som antydet ovenfor, kan nukleinsyren av interesse likeledes omfatte ett eller flere gener som koder for et antigenisk peptid som er i stand til å generere en immunrespons hos mennesker. I en spesiell utførelsesform tillater oppfinnelsen således realisering av vaksiner som muliggjør å immunisere mennesker, særlig mot mikroorganismer eller virus. Det kan særlig dreie seg om antigeniske peptider som er spesifikke mot Epstein Barr virus, HIV virus, hepatitt B virus (EP 185 573), pseudo-hundegalskapsvirus eller også tumor-spesifikke slike (EP 259 212).

Generelt omfatter nukleinsyren av interesse likeledes sekvenser som tillater ekspresjon av det terapeutiske gen og/eller gen som koder for det antigeniske peptid i den infiserte celle. Det kan dreie seg om sekvenser som naturlig er ansvarlig for ekspresjonen av det angjeldende gen når disse sekvenser er i stand til å virke i den infiserte celle. Det kan likeledes dreie seg om sekvenser av annen opprinnelse (ansvarlig for ekspresjonen av andre proteiner eller også syntetiserte slike). Videre kan det dreie seg om promotersekvenser for eukaryotiske elle virale gener. For eksempel kan det dreie seg om promotersekvenser som stammer fra genomet av cellen man ønsker å infisere. På samme måte kan det dreie seg om promotersekvenser fra genomet av en virus, derunder det benyttede adenovirus. I denne forbindelse kan man f.eks. nevne promoterene for genene EIA, MLP, CMV, RSV, osv. Videre kan disse ekspresjonssekvenser være modifisert ved addisjon av sekvenser for aktivering, regulering, osv. Når videre det innskutte gen ikke omfatter ekspresjonssekvenser, kan det være innskutt i genomet til det defekte virus nedstrøms for en slik sekvens. Til slutt kan nukleinsyren av interesse likeledes inneholde, særlig oppstrøms for det terapeutiske gen, en signalsekvens som styrer det syntetiserte, terapeutiske produkt inn i målcellens sekresjonsveier. Denne signalsekvens kan være den naturlige signalsekvens for det terapeutiske produkt, men det kan likeledes dreie seg om en hvilken som helst annen funksjonell signalsekvens, eller også en kunstig signalsekvens.

Plasmidene ifølge oppfinnelsen kan konstrueres under anvendelse av adenovirus av forskjellig opprinnelse. Forskjellige serotyper av adenovirus, hvis struktur og egenskaper varierer noe, er karakterisert. Blant disse serotyper foretrekker man, innenfor rammen av oppfinnelsen, å benytte humanadenovirus av typen 2 eller 5 (Ad2 eller Ad5) eller adenovirus av animalsk opprinnelse (se søknad WO 94/26914). Blant adenovirusene av animalsk opprinnelse som er anvednbare innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse kan nevnes adenovirus av canine, bovin, munn (f.eks.: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovin, porcin, aviar eller også simien (f.eks. SAV) opprinnelse. Fortrinnsvis er adenovirusene av animalsk opprinnelse et canineadenovirus og aller helst et CAV2 adenovirus [f.eks. stamme manhattan eller A26/61 (ATCC VR-800) osv.].

I henhold til en særlig utførelsesform av oppfinnelsen er den benyttede adenovirus en adenovirus av human opprinnelse. I henhold til en annen fordelaktig utførelsesform er adenovirusen en adenovirus av animalsk opprinnelse.

Som antydet ovenfor, er genomet av den rekombinante adenovirus kantet av ett eller flere restriksjonsseter som er fraværende i genomet. Dette eller disse seter tillater på enkel og effektiv måte å skjære ut det rekombinante, adenovirale genom fra plasmidet. Da genomsekvensen av adenovirusen er kjent og tilgjengelig, kan fagmannen ved rutineforsøk selektere de restriksjonsseter som er fraværende i dette genom. Som eksempel kan man nevne setene Pacl. NspV og Swal (for Ad5) eller Snabl (i Ad2). Det er likeledes mulig å gjøre visse seter unike ved å modifisere sekvensen i det adenovirale genomet. Således kan andre enzymer benyttes hvis de tilsvarende restriksjonsseter er undertrykt, modifisert eller deletert i den adenovirale sekvens som er konstruert i E. coli. Setene kan være posisjonert direkte ved siden av endene av det adenovirale genom eller være i en avstand av noen basepar.

Et særlig foretrukket plasmid innenfor rammen av oppfinnelsen er plasmidet pXL2638 som omfatter replikasjonsopprinnelsen av plasmid RK2, genet for resistens mot tetracyklin, et genom av rekombinant adenovirus som har områdene El og E3 ikke-funksjonelle og kantet av 2 Pac I seter. En nukleinsyre av interesse kan skytes inn på forskjellige seter i det adenovirale genom og særlig i områdene El, E3 og E4. Forskjellige restriksjonsseter kan benyttes for dette formål, særlig setet Xbal.

Plasmidene ifølge oppfinnelsen kan konstrueres på forskjellige måter. I henhold til en foretrukket metode konstruerer man i et første trinn fragmenter som bærer ITR'ene av det adenovirale genom, kantet av ett eller flere egnede restriksjonsseter. Disse ITR'er innføres deretter i et prokaryotisk plasmid og så, i et tredje trinn, rekonstrueres det rekombinante, adenovirale genom mellom ITRene, enten ved ligering eller ved rekombinering. På foretrukket måte konstrueres genomet ved rekombinasjon mellom det ønskede, rekombinante, adenovirale genomet og homologe områder (omfattende ITRene og de flankerende områder) av plasmidet.

Mere spesielt kan genomet re-konstrueres i E. coli under anvendelse av en stamme polA for å selektere evenementene av den homologe rekombinasjon. Det er klart at disse konstrukter også kan effektueres i fravær av systemer som tillater å selektere rekombinasjonsevenementene. Således kan slike rekombinasjonsevenementer screenes etter ved miniprep, tap eller ervervelse av en markør eller også screening ved hjelp av radioaktive prober som er spesifikke for forbindelser som oppnås eller tapes. Videre finnes det andre teknikker som tillater å selektere homologe

rekombinasjonsevenementer hos E. coli. Blant disse skal nevnes anvendelsen av termofølsomme plasmider for deres replikering (Hamilton et al., 1989), anvendelsen av

ikke replikative, sirkulære molekyler (beskrevet f.eks. av Slater et Maurer, 1993), anvendelsen av stammer der den benyttede vektor ikke replikerer seg (Miller et Mekalanos, 1988, Zeef et al., 1994) osv. Alle disse systemer kan benyttes i stedet for polA stammer og transformasjon med et plasmid avledet fra pBR322, eller dets tallrike derivater, eller fra andre plasmider som er avhengig av polA for replikasjon, eller også plasmider som ikke replikeres i Escherichia coli.

Et andre aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører enhver prokaryotisk celle som inneholder et plasmid som definert ovenfor. Det kan særlig dreie seg om en hvilken som helst bakterie for hvilken det foreligger et vektorsystem hvor den rekombinante DNA kan innføres. Det skal f.eks. nevnes Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Agrobacterium tumefaciens, Rhizobium meliloti eller bakterier av slekten Streptomyces. Disse celler oppnås fortrinnsvis ved transformering i henhold til teknikker kjent av fagmannen. Transformeringen kan særlig skje ved transformeringsteknikken med CaCtø (Dagert et Ehrlich, 1979) eller den som benyttes av Hanahan et al. (1983) eller en hvilken som helst annen teknikk som er avledet fra denne (Maniatis et al., 1989) samt ved elektro-transformering (Wirth et al., 1989). Det skal likeledes vises til de generelle molekylærbiologiske teknikker som er nevnt nedenfor.

Et tredje aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av rekombinante, adenovirale genomer. I henhold til denne fremgangsmåte blir prokaryotiske celler som beskrevet ovenfor dyrket og deretter, i et andre trinn, blir plasmidene gjenvunnet. Fortrinnsvis realiseres kulturen i et tidsrom tilstrekkelig til å gi egnede mengder av plasmid. Plasmidet kan gjenvinnes på en hvilken som helst måte som er kjent for fagmannen for fremstilling av plasmidisk DNA. Således kan det gjenvinnes ved fremstilling av et klart lysat fulgt av sentrifugering i en cesiumkloirdgradient (Maniatis et al., 1989). Det kan benyttes andre teknikker som anvender andre metoder for lysering under anvendelse av f.eks. triton X-100 (Ausubel et al., 1987) eller også en anion-byttekolonne etter lyseringstrinnet og separeringen av plasmidiske DNA vis-a-vis hovedandelen av kromosomisk DNA og proteiner. De således oppnådde plasmider kan deretter renses og behandles i nærvær av det tilsvarende restriksjonsenzym på setene som kanter det virale genom. Dette tillater ett enkelt trinn for å generere et lineært rekombinant adenovirus-genom som direkte kan anvendes for klonal produksjon av rekombinante virus.

En eller flere rekombinante adenovirus, fremstilt i henhold til denne prosess, kan inngå i farmasøytyiske preparater. Slike farmasøytiske preparater kan formuleres med henblikk på administrering adetopisk, oral, parenteral, intranasal, intravenøs, intramuskulær, subkutan, intraokkulær, transdermal eller annen vei.

Et slikt farmasøytisk preparat kan inneholde farmasøytisk akseptable bærere for en injiserbar formulering. Det kan særlig dreie seg om sterile, isotoniske salt-oppløsninger (mono- eller dinatriumfosfat, natrium-, kalium-, kalsium- eller magnesiumklorid, osv. eller blandinger av slike salter), eller tørkede og særlig lyofiliserte preparater som ved tilsetning av sterilisert vann eller fysiologiske serum tillater konstituering av injiserbare preparater.

Dosene av virus som benyttes for injeksjon kan tilpasses som funksjon av forskjellige parametre og særlig som funksjon av den benyttede administreringsmåte, den angjeldende patologi, genet som skal uttrykkes eller også den tilsiktede behandlings varighet. Rent generelt kan de rekombinante adenovirus ifølge oppfinnelsen bli formulert og administrert i form av doser som ligger mellom 10^ og 10^ pfu og fortrinnsvis fra 10^ til 1010 pfu. Uttrykket pfu ("plaque forming unit") tilsvarer infeksjonskraften for en virusoppløsning og bestemmes ved infeksjon av en egnet cellekultur og måling, generelt etter 15 dager, av antallet infiserte celleområder. Bestemmelsesteknikkene for pfu veriden av en viral oppløsning er godt dokumentert i litteraturen.

I henhold til den innskutte, heterologe DNA sekvens kan adenovirusene ifølge oppfinnelsen benyttes for terapi eller prevensjon av tallrike patologier inkludert genetiske sykdommer (dystrofi, systisk fibrose osv.), nevrogenerative sykdommer (Alzheimer, Parkinson, ALS, osv.), cansere, patologier forbundet med mangler ved koagulering eller dyslipoproteinemier, patologier forbundet med virale infeksjoner (hepatitter, AIDS, osv.) osv.

Oppfinnelsen skal beskrives nærmere under henvisning til de følgende, illustrerende eksempler.

FIGURFORKLARING

Figur 1: Genetisk organisering av adenovirusene Ad5.

Figur 2: Restriksjonskart for pXL2626 og pXL2627.

Amp<r>: Resistensgenet mot ampicillin; pMBl Ori, replikasjonsopprinnelse av

pMBl;

Tet<r>, resistensgen mot tetracyklin; RK2 Ori, replikasjonsopprinnelse for plasmid RK2. De sirkulære deler av plasmidkartene er ikke i samme målestokk som den på 0,8 kb indikert for de 2 ITR'er.

Figur 3: Konstrukt av plasmid pXL2638.

Denne konstruksjon utføres som beskrevet i eksempel 1-2 ved homolog rekombinasjon i SF800 (E. coli polA).

Amp<r>: resistensgen mot ampicillin;

pMBl Ori, replikasjonsopprinnelse av pMBl;

Tet<r>, resistensgen mot tetracyklin;

RK2 Ori, replikasjonsopprinnelse for plasmid RK2.

De sirkulære partier av plasmidkartene og de adenovirale sekvenser er ikke i samme målestokk.

Generelle molekylærbiologiske og klonings teknikker.

De klassiske metoder i molekylærbiologien som sentrifugering av plasmidisk DNA i en cesiumklorid-etidiumbromidgradient, fermentering med restriksjonsenzymer, elektroforese på gel, transformasjon i E. coli, presipitering av nukleinsyrer osv., er beskrevet i litteraturen (Maniatis et al., 1989).

Enzymene leveres av New-England Biolabs (Beverly, MA).

For ligeringene, blir DNA fragmentene separert i henhold til størrelse på 0,8 til 1,5% agarosegel, renset med GeneClean (BIO101, LaJolla CA) og innkubert natten over ved 14°C i en buffer Tris-HCl pH 7,4 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, i nærvær av DNA ligase av fagen T4.

De ligerte DNA benyttes for å transformere den kompetentgjorte stamme E. coli TG1 [D (lac proA, B), supE, thi, hsdD5/F traD36, proA<+>, B<+>, lacW, lacZDM15] (Maniatis et al., 1982) eller også stammen E. coli polA SF800 (Heffron et al., 1977). PCR amplifiseringen (Polymerase Chain Reaction), gjennomføres likeledes i henhold til Maniatis et al., 1989, med følgende spesifikasjoner:

- Konsentrasjonen av MgCtø bragt til 8 mM.

- Denatureringstemperatur 95°C, hybridiseringstemperatur 55°C, forlengelsestemperatur 72°C. Denne syklus repeteres 25 ganger i PE9600 Thermalcycler (Perkin Eimer, Norwalk Co).

Oligonukleotidene syntetiseres under anvendelse av fosforamiditt kjemi, beskyttet i B med en cyanoetylgruppe (se Sinha et al., 1984, Giles 1985) med en automatisk DNA Applied Biosystem modell 394 syntetisør (Applied Biosystem, Foster City CA) ifølge fabrikantens anbefalinger. Sekvenseringen gjennomføres på dobbelttrådtemplater ved hjelp av kjedetermineirngsmetoden under anvendelse av fluorescens elementer. Det ble anvendt et Taq Dye Primer Kit fra Applied Biosystem (Applied Biosystem, Foster City CA) i henhold til fabrikantens spesifikasjoner.

Eksempel 1: Kloning av et adenoviralt genom, human adenovirus type 5, kantet av unike restriksjonsseter på et plasmid fra inkompatibilitetsgruppe P som replikeres i E. coli.

Eksempel 1-1: Dette eksempel viser hvordan endene av det adenovirale genom kan amplifiseres ved PCR for å flankere endene (ITR) med et PacI sete.

For å oppnå tilfredsstillende rekombinasjonsfrekvenser ble det valgt fragmenter på ca. 400 bp som ble amplifisert.

Det ble valgt tre oligonukleotider:

Oligo 1 er felles for de to amplifiseringer fordi den tilsvarer endene av ITR.

De seks første nukleotider utgjør en hale som unngår dannelsen av sekundærstrukturer. De seks følgende nukleotider utgjør et restriksjonssete EcoRI som benyttes for de mellomliggende kloningstrinn. De åtte derpå følgende nukleotider skaper Pacl setet som er fraværende i genomet av Ad5 (sekvensen til adenovirus Ad5 er tilgjengelig fra Genebank, mnemonisk ADRCOMPGEN). De 27 følgende nukleotider tilsvarer den venstre enden av genomet av Ad5, posisjonene 1 til 27.

Sekvens for oligo 1:

Oligo 3 som benyttes sammen med oligo 1 resulterer i amplifisering av et fragment på 384 bp ved den venstre ende. Det omfatter en hale på seks nukleotider. De atten

følgende nukleotider gir setene Pstl, Kpnl og Spel. De 24 derpå følgende nukleotider tilsvarer de inverskomplementære av den valgte Ad5 sekvens mellom posisjonene 361 og 385.

Sekvens for oligo 3:

Matrisen som velges for forsterkning av den venstre ende, er pCLAI. Plasmidet pCLAI inneholder den venstre ende i form av et fragment EcoRI- Xbal på 454 bp, klonet inn i pIC19H.

Oligo 2 som benyttet sammen med oligo 1 resulterer i amplifisering av et fragment på 418 bp ved den høyre ende. Det omfatter en hale på seks nukleotider. De derpå følgende seks nukleotider gir et Pstl sete. De 24 følgende nukleotider tilsvarer den valgte Ad5 sekvens mellom posisjonene 35517 og 35540.

Sekvens av oligo 2:

Templatet som velges for amplifisering av den høyre ende er plasmidet pY23. Plasmidet pY23 inneholder den høyre ende i form av et fragment Avrll-Bcll på 470 bp, klonet til de kompatible seter Xbal- BamHI av pIC119H.

PCR produktene påsettes en agarosegel. Fragmentene med den ventede størrelse fordøyes med EcoRI og Pstl, renses og ligeres i nærvær av pUC19 som ble fordøyd med EcoRI og Pstl. De to oppnådde, rekombinante plasmider kalles pXL2623 for den venstre ende og pXL2624 for den høyre ende. Fraværet av mutasjoner i innskuddet verifiseres ved sekvensering. Fragmentet EcoRI-Pstl av disse plasmider renses som beskrevet ovenfor. De to fragmenter anvendes sammen for ligering i pUC19 som ble linearisert med EcoRI. Det rekombinante plasmid som oppnås kalles pXL2626 og det inneholder endene av Ad5 "anførtes" (fig. 2).

Eksempel 1-2: Konstruksjon, i E. coli, av et plasmid inneholdende det adenovirale genom AE1, AE2, kantet av setene Pacl.

Vektoren anvendt for å motta det adenovirale genom er pRK290 (Ditta et al., 1980), som tilhører inkompatibilitetsgruppe P. Denne vektor replikerer i stammer av E. coli pol A.

Den valgte integreringsstrategi er homolog rekombinasjon i stammen E. coli SF800 mellom pXL2627 og plasmidet pFG144 (Graham et al., 1986).

Plasmidet pFG144 inneholder totaliteten av genomet av Ad5 minus to delesjoner i områdene El og E3. Den stammer fra pMX2 og har genet for ampicillinresistens samt en replikasjonsopprinnelse pMBl som ikke tillater replikering i stammen E. coli SF800.

I et første trinn blir de "anførtes" ender av Ad5 genomet klonet inn i det unike EcoRI setet av pRK 290 i henhold til den protokoll som allerede er beskrevet for konstrukt av pXL2626. Cellene av stammen E.coli SF800 gjøres kompetente og transformeres med pXL2627. Kulturene bres ut på LB medium i nærvær av tetracyklin. I sin tur blir celler fra en tetracyklinresistent klon gjort inkompetente, transformert med plasmid pFG144 og deretter spredd på LB medium i nærvær av ampicillin og tetracyklin. Forutsatt at plasmidet ikke replikerer seg i E. coli SF800, vil ervervelsen av tetracyklin- og ampicillinresistens kun skje ved et homologt rekombineringsevenement mellom de to plasmider. Disse har nemlig felles de høyre ender, 418 bp, og venstre ender 384 bp, av Ad5 genomet. Plasmidene fra dette første rekombineringsevenement har to sett ender (fig. 2). En andre overkryssing internt i plasmidet kan så skje. I dette tilfelle fører, blant de to mulige evenementer, kun ett til den ønskede konstrukt mens det andre medfører den fullstendige delesjon av Ad5 genomet og tap av genet for ampicillinresistens. Denne andre rekombinasjon favoriseres ved en serie fortynningskulturer som representerer 60 generasjoner, i LB medium supplert med tetracyklin og ampicillin. DNA'et av de isolerte kloner underkastes en Southern Blot analyse. Man syntetiserer den følgende oligonukleotidprobe:

Basene 1 til 9 tilsvarer det venstre området av posisjon 377 til 385 på sekvensen av Ad5. Basene 28 til 36 tilsvarer sekvensen av det høyre området mellom posisjonen 35517 og 35525. Fermenteringer med endonukleasene PacI og Clal eller også PacI og Ndel. viser strukturen til det ventede plasmid. En klon tilsvarende et slikt evenement og med en plasmidstruktur som beskrevet i figur 3, plukkes ut. Denne kalles pXL2628.

pXL2628 fordøyes med XbaL religeres og transformeres deretter i kompetente E. coli TG1 celler. En klon Tet^ og Amp<S> hentes ut. Dennes restriksjonsprofil viser at området som tilsvarer pMX2 er deletert. Denne klon kalles pXL2638.

Fermentering med PacI av pXL2638 frigir Ad5 genomet i form av et fragment på 34 kb. Dette fragment kan benyttes som det er i eksperimenter hvor det anvednes for å transfektere mammalske celler som er transkomplementære for El funksjonene av adenoviruset.

Eksempel 2: Fremstilling av rekombinante adenovirus.

Kloner av rekombinante adenovirus kan konstrueres i et første trinn i Escherichia coli ved innskudd av fragmenter inneholdende et antall gener med egnede reguleringssignaler for å uttrykke genene i de studerte mammalske celler, eller delesjon av visse fragmenter av adenovirusgenomet, eller også kombinasjonen av de to evenementer, og deretter, etter transfeksjon av produksjonscellene, kan det oppnås et forråd av et slikt rekombinant virus.

Plasmidene pXL 2638 renses fra en kultur av transformerte, kompetente E. Coli TG1 celler. Det adenovirale genomet frigjøres ved fermentering i nærvær av enzymet PacI. Fermenteringsproduktet benyttes direkte for å fremstille de rekombinante adenovirus. For dette formål blir cellene av linje 293 transfektert med fermenteringsproduktet av pXL2638 i nærvær av kalsiumfosfat. De fremstilte, rekombinante adenovirus selekteres deretter ved plakkrensing. Etter isolering blir den rekombinante adenovirus amplifisert i cellelinje 293, noe som fører til en kultursupernatant inneholdende den ikke rensede, rekombinante adenovirus med en titer på ca. 10^ pfu/ml.

De virale partikler blir deretter renset ved sentrifugering i en cesiurnkloridgradient i henhold til kjente teknikker (se særlig Graham et al., Virology 52 (1973) 456). Adenoviruset kan oppbevares ved -80°C i 20% glycerol.

Bibliografiske referanser:

Ausubel et al., 1987. "Current protocols in molecular biology" 1987-1988. John Willey and Sons, New York.

Bolivar et al., 1977. "Gene" 2:95.

Dagert et al., 1979. "Gene" 6,23 - 28.

Ditta et al., 1980. "Plasmid" 13,149 - 154.

Ghosh-Choudhurry et al. 1986. "Gene" 50,161 -171.

Hamilton et al., 1989, "J. Bacteriol" 171: 4617 - 4622.

Hanahan, D. 1983. "J. Mol. Biol." 166:557.

Heffron et al., 1977. "Proe. Nati. Acad. Sei." USA, 74, 702 - 706.

Maniatis T., et al. 1982. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor laboratory, New York.

Miller, et al., 1988 "J. Bacteriol." 170: 2575 - 2583.

Simoes, et al. 1991. "New York Acad. Sei." 646: 254-258.

Sinna N.D, et al. 1984. "Nucl. Acids Res., " 12, 4539 - 4557.

Slater, et al. 1993. "J. Bacteriol" 175: 4260 - 4262.

Viera, et al., 1982. "Gene", 19,259 - 268.

Wirth, et al. 1989. "Mol. Gen. Genet.," 216,175 - 177.

Zeef, et al. 1994 "EMBO J." 13: 5113-5120.

Claims (14)

1. Prokaryotisk plasmid som omfatter et fullstendig adenoviralt genom, som eventuelt kan mangle hele eller deler av El området og/eller hele eller deler av E4 området og/eller hele eller deler av E3 området og/eller hele eller deler av IVa2 området, som ikke er avbrutt av områder av det prokaryotiske plasmid, som er flankert av ett eller flere restriksjonsseter som ikke er til stede i nevnte genom, og som er flankert på høyre og venstre side av ITR sekvenser, hvor ITR'ene i genomet ikke er forbundet, karakterisert ved at det omfatter et område som muliggjør replikering i prokaryotiske celler og et område som muliggjør å selektere de prokaryotiske cellene som inneholder nevnte plasmid.

2. Plasmid ifølge krav 1, karakterisert ved at området som tillater replikasjon omfatter en replikasjonsopprinnelse som er funksjonell i prokaryotiske celler.

3. Plasmid ifølge krav 2, karakterisert ved at replikasjonsopprinnelsen stammer fra et bakterieplasmid valgt blant RK2, pBR322 og pUC.

4. Plasmid ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det adenovirale genom er berøvet en del av El området som omfatter restene 454 til 3328 eller 382 til 3446.

5. Plasmid ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det adenovirale genom er berøvet hele eller en del av området E4 som minst omfatter de(n) åpne leserammen(e) ORF3 og/eller ORF6.

6. Plasmid ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det adenovirale genom er av human eller animalsk opprinnelse.

7. Plasmid ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det adenovirale genom er et humant-adenoviralgenom av type 2 eller 5.

8. Plasmid ifølge krav 7, karakterisert ved at det adenovirale genom er et canine-CAV2-adenoviralt genom som er valgt fra CAV2 serotype.

9. Plasmid ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det rekombinante adenovirale genom er avledet fra et Ad5 adenovirus og er flankert av PacI, NspV eller Swal seter.

10. Plasmid ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det adenovirale genom omfatter en nukleinsyre av interesse.

11. Prokaryotisk celle, karakterisert ved at den inneholder et plasmid ifølge et av kravene 1 til 10.

12. Fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant adenoviralt genom, karakterisert ved at den omfatter dyrking av prokaryotiske celler ifølge krav 11 og gjenvinning av plasmidene..

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at plasmidene, i et ytterligere trinn, blir behandlet på en slik måte at det adenovirale genom skjæres ut.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at plasmidene behandles i nærvær av restriksonsenzymer som samsvarer med restriksjonssetene som flankerer det adenovirale genomet.