FI90787C - Menetelmä desulfatohirudiinin valmistamiseksi - Google Patents

Description

i 90787

Menetelmå desulfatohirudiinin valmistamiseksi -Forfarande for framstallning av desulfatohirudin 5 Keksinto koskee desulfatohirudiinia koodittavia DNA-sekvensse-jå sisåltaviS yhdistelmSvektoreita ja menetelmåa desulfatohi-rudiinin valmistamiseksi mainitulla yhdistelmåvektorilla transformoitujen isMntasolujen avulla.

10 Terveen nisåkkaan elimiston plasmassa muodostuu dynaaminen tasapaino fibrinolyyttisen systeemin ja koagulaatiosysteemin vålillå, mikå yllapitSå toimintakykyista suoniverkostoa. Veri-suonivammoissa koagulaatiosysteemi saostaa fibriini-matriisin, joka hemostaattisen tilan saavuttamisen jMlkeen hajotetaan 15 taas fibrinolyyttisella systeemilla. Tapauksissa, joissa elimiston fibrinolyyttinen potentiaali on riittMmaton poistamaan verisuonten sisåiset tukokset, esim. kuten on laita tromboem-boliaa tai leikkauksen jalkeisia komplikaatioita sairastavil-la, saattaa olla valttåmatonta tukea elimistoa antamalla trom-20 bolyyttisiå aineita tai antikoacfulantteja.

Sopivina antikoagulaatioterapiayhdisteina on tahan asti kåy-tetty ennen muuta hepariinia, mutta myos 4-hydroksikumariini-ja 1,3-indaanidionijohdannaisia. Vaikka nSillS aineilla saavu-25 tetaan huomattavia tuloksia, on niilla kuitenkin muutamia haittavaikutuksia. Niinpå hepariini ei vaikuta suoraan veren hyytymistapahtumaan, vaan kehittaa epasuorasti koagulaatiota eståvan vaikutuksensa kiihdyttåmalla trombiinin ja tekijån X inhibitiota antitrombiini III:11a.

30

Hepariini vaikuttaa elimistossa edelleen lukuisilla, ei-spesi-fisillå reaktioilla ja neutraloi verihiutaletekijån 4, mika erityisesti vahentSS sen kSyttokelpoisuutta veren hyytymisen hSirioisså, jotka johtuvat hyytymisaktiivisten aineiden, esim.

35 fibrinogeenin lisSåntyneesta kSytostS (Verbrauchs-Koagulopat- hie) tai vastaavasti hajapesåkkeisesså suonensisSisessS hyyty-misessa (disseminierte intravasale Gerinnung (DIC)). Nain ol- 2 len esiintyy vaihtoehtoisten ja spesifisempien, antikoagulaa-tiohoidossa kåytettavien aineiden tarvetta.

Jo kauan on tunnettu luonnollinen verijuotikkaissa (Hirudo 5 medicinalis) esiintyvS antikoagulantti, hirudiini. Hirudiini on 65 aminohaposta muodostuva polypeptidi, jonka primaarira-kenne on tåysin selvitetty (1) ja se sisaltåå rakenteellisina tunnusmerkkeina N-paassa hydrofobisten aminohappojen kasauman ja C-paasså polaaristen aminohappojen kasauman, sulfaattimono-10 esterina esiintyvan tyrosiini-tahteen (Tyr63) ja kolroe disul- fidisiltaa, joiden tarkkaa jSrjestysta ei kyllakåan viela tun-neta.

Hirudiini, jonka Kj-arvo (kompleksi-dissosiaatiovakio) on 15 6 · 10'nM, on vahvin tunnettu trombiini-inhibiittori ja siile on tunnusomaista spesifinen affiniteetti trombiiniin nahden; veren hyytymiseen vaikuttavat muut entsyymit eivåt inhiboidu. Påinvastoin kuin hepariini, hirudiini kohdistaa inhiboivan vaikutuksensa suoraan trombiiniin eikM vaikuta, kuten heparii-20 ni, antitrombiini III:n vMlityksellS. Puhdistetun hirudiinin ainoa, farmakologisesti ymmarrettMva vaikutus on veren hyyty-misen estaminen tai verisuonitukosten ehkMiseminen. Annostet-taessa suonensisMisesti koirille ei edes suurilla annoksilla havaittu mitaan vaikutusta sydSmen lyontitiheyteen, hengityk-25 seen, verenpaineeseen, verihiutaleiden lukumååraSn, fibrino- geeniin tai hemoglobiiniin. Rota11a, sialla ja koiralla suori-tetuissa testeissa osoittautuu hirudiini tehokkaaksi kokeel-lisessa tromboosissa (aikaansaadaan joko salpauksella tai trombiini-injektiolla), endotoksiinisessa shokissa sekå DIC: 30 sså (disseminierter intravasaler Gerinnung). Suorissa vertai-lukokeissa hepariinin kanssa, milloin tahansa niitS suoritet-tiin, hirudiini osoittautui paremmaksi.

Vaikka hirudiini on jo kauan ollut tunnettu, ei hirudiinilla 35 tahån asti ole ollut niin laajaa, terapeuttista kSyttdS, jota odottaisi sen erinomaisten biologisten ominaisuuksien perus-teella. Sen yleista kSyttdM ISSketieteessM on erityisesti ra- il 90787 3 joittanut vaikeasti voitettava haitta, nimittåin sen aarim-måisen rajoitettu saantimahdollisuus. Tahån asti on hirudiini-valmisteet saatu yksinomaan kalliista ja vaikeasti saatavissa olevasta luonnomnateriaalista, lahtemalla verijuotikas-uut-5 teista aikaavievillS ja suuria kustannuksia vaativilla eris-tSmis- ja puhdistamismenetelmilla (vrt. viite 2). 65 aminoha-pon suhteellisen pitkS sekvenssi on myos klassisella peptidi-synteesilla nSyttSnyt taloudelliselta kannalta vShemmSn lupaa-valta.

10

RiittSvien hirudiinimaarien valmistamiseksi, jotka vasta teke-vat mahdolliseksi tietyt kliiniset tutkiroukset niiden terapeutt isest i tehosta ja niiden laajan terapeuttisen kMyton an-tikoagulanttihoidossa, taytyy nain olien saada uusia keinoja.

15 TSh&n sopii erityisesti yhdistelma-DNA-tekniikka. Sen avulla on mahdollista valmistaa erilaisia, fysiologisesti aktiivisia polypeptidejS viljelemMUS vastaavasti geneettisesti modifioi-tuja mikro-organismeja tai nisSkSssoluviljelmia.

20

Taman keksinnon tarkoituksena on geeniteknologian keinoin muo-dostaa ilmentamissysteemi joka tekee mahdolliseksi hirudiini-aktiivisuuden omaavien polypeptidien valmistuksen teollisessa mittakaavassa. Tamå tehtSvS ratkaistaan tassa keksinnossa val- 25 mistamalla yhdistelmSplasmideja, jotka sisaltavat hirudiinin aminohapposekvenssiS koodittavan DNA-sekvenssin, jota tallai-nen ilmentymisenohjaussekvenssi sSMtelee siten, ett& tSHS yhdistelmSvektorilla transformoituneet isåntSsolut tuottavat hirudiini-aktiivisuuden omaavia polypeptidejS.

30

Oli odotettavissa, etta tallaisten DNA-sekvenssien ilmentymi-nen transformoiduissa isantasoluissa (lukuunottamatta trans-formoituja juotikassoluja) ylimåSraisen, sisaisen sulfaattia-siirtSvan entsyymisysteemin puuttuessa johtaisi tuotteeseen, 35 joka eroaa luonnollisesta hirudiinista olennaisesti sulfaat-titShteen puuttuessa tyrosiini-63:sta. Sulfaattitahteen bio-logista funktiota proteiineissa yleensa ja hirudiinissa eri- 4 tyisesti ei ole yksityiskohtaisesti taysin selvitetty; kuiten-kin sulfaattitShteen pitaisi nykyisen tietSmyksen mukaisesti vaikuttaa proteiinin fysiologisiin ominaisuuksiin huomattavas-ti. Niinpa sulfaattitahteellå olisi seuraavat funktiot: 5 (1) positiivinen vaikutus proteiinin biologiseen aktiivisuu-teen; (2) ottaa osaa såateleviin soluprosesseihin (kuten on tunnet-tua reversiibelistå fosforyloinnista); 10 (3) stimuloida eritysta, t.s. sulfatointi toimii leimaajana sekretorisen proteiinin tunnistamiseksi; kaikki tunnetut, sulfatoidut proteiinit ovat sekretorisia tai transmembra-naalisia proteiineja.

15 Yllattavålla tavalla on nyt havaittu, etta vastoin teoreetti-sia odotuksia hirudiinin arvokkaat, biologiset ominaisuudet sailyvat myos silloin, kun Tyr^-tåhteen fenolisen hydroksyy-lin, tunnusomainen sulfaattimonoesteriryhmM poistetaan. Kek-sinnon mukaisten, transforrooitujen mikro-organismien avulla 20 valmistetut hirudiiniyhdisteet, joilta puuttuu sulfaattitahde (•'desulfatohirudiinit") omaavat nimittåin luonnolliseen hiru-diiniin verrattuna sen biologiset ominaisuudet, erityisesti sen antikoaguloivan vaikutuksen, kvalitatiivisesti ja kvanti-tatiivisesti ainakin samanarvoisena.

25

Seuraavassa DNA-sekvensseillS tai geeneillS, jotka kooditta-vat hirudiinin aminohapposekvenssiS, on ymmarrettSva tarkoi-tettavan sellaisia DNA-sekvenssejS tai geeneja, jotka ilmen-tymisella tuottavat hirudiinin kaltaisia polypeptidejå, jotka 30 eroavat luonnollisesta hirudiinista erityisesti sulfaattieste-riryhman puuttuessa tyrosiini-63 : sta (•'desulfatohirudiinit") .

Hirudiinin aminohaoposekvenssiS koodittavien DNA-sekvenssien valmistaminen 35

MenetelmåssS DNA-sekvenssien, jotka koodittavat hirudiinin aminohapposekvenssia, ja niiden fragmenttien valmistamiseksi

II

90787 5 juotikkaan perimå-DNA:sta eristetåån hirudiini-rakennegeeni tai hirudiini-mRNA:sta valmistetaan komplementaarinen kaksi-såikeinen hirudiini-DNA (hirudiini-ds cDNA) tai valmistetaan hirudiinin aminohapposekvenssiå koodittava geeni tai sen frag-5 mentteja kemiallisen ja entsymaattisen menetelman avulla.

Periman hirudiini-DNA ja hirudiini-ds cDNA saadaan esimerkiksi sinansa tunnetuilla menetelmilla. Niinpa periman hirudiini-DNA: ta saadaan esimerkiksi juotikasgeenipankista, joka sisal-10 taS hirudiini-geenin siten, etta juotikas-DNA-fragmentit kloo-nataan mikro-organismiin ja kloonit, jotka sisåltMvat hirudiini-DNA: n, identifioidaan esimerkiksi pesMke-hybridisaatiolla kåyttåen radioaktiivisesti leimattua hirudiini-DNA-spesifista oligodeoksinukleotidia, joka sisåltaå ainakin 15, mieluimmin 15 15-30 deoksinukleotidia. NMin saadut DNA-fragmentit sisaltMvat hirudiini-geenin lisaksi yleensM muita, ei-toivottuja DNA-jak-soja, jotka voidaan lohkaista pois kåsittelemållå sopivilla ekso- tai endonukleaaseilla.

20 Kaksisåikeinen hirudiini-cDNA voidaan valmistaa esimerkiksi siten, etta sopivista, mieluimmin hirudiinin muodostamiseksi indusoiduista juotikassoluista eristetaan mRNA, nain saatu mRNA-seos rikastetaan sinansa tunnetulla tavalla hirudiini-mRNA: n suhteen, tata mRNA:ta kaytetaan templaattina yksisai-25 keisen cDNA:n valmistuksessa, siita syntetisoidaan RNA:sta riippumattoman DNA-polymeraasin avulla ds-cDNA ja tama kloo-nataan sopivaan vektoriin. Kloonit, jotka sisaltSvat hirudii-ni-cDNA:n, identifioidaan esimerkiksi, kuten edella esitet-tiin, pesakehybridisaatiolla kayttaen radioaktiivisesti lei-30 mattua, hirudiini-DNA-spesifistå oligodeoksinukleotidia.

Tålla tavalla valmistettuihin periman hirudiini-DNA:han tai hirudiini-cDNA:han liitetåån mieluimmin 5' - ja 3'-pååhan ke-miallisesti syntetisoidut adapteri-oligodeoksinukleotidit, 35 jotka sisåltåvåt tunnistussekvenssin yhdelle tai useammalle restriktiendonukleaasille (-nukleaaseille) ja siten helpotta-vat liittåmistå sopiviin vektoreihin. Lisaksi hirudiini-DNA:n 6 tai -cDNA:n 5'-påån adapterimolekyylin tåytyy sisåltåå viela luennanaloitussignaali (ATG). Luennanaloitussignaalin tulee sijaita siten, ettå hirudiinin ensimmåisen aminohapon kodoni seuraa sitå vålittomåsti.

5

Koska luonnollisen hirudiini-geenin rakennetta ei tunneta ja hirudiinin aminohapposekvenssiå koodittavan geenin ("desulfa-tohirudiini-geenin") kemiallinen synteesi nykyaikaisilla syn-teesimenetelmillå tarjoaa etuja, erityisesti ajankåytosså, on 10 viixneksi mainittu esitetty tåssa selityksesså.

Desulfatohirudiini-aeenin kemiallinen svnteesi

Menetelmåsså desulfatohirudiinin rakennegeenin tai sen frag-15 menttien valmistamiseksi desulfatohirudiini-geenin koodittavan ja komplementaarisen sSikeen segmentit syntetisoidaan kemial-lisesti ja saadut segmentit muutetaan entsymaattisesti desulfatohirudiinin rakennegeeniksi tai sen fragmenteiksi.

20 Tåssa esitetåån myos kaksisåikeinen DNA, joka koodittaa desul-fatohirudiinia.

Mainitut DNA:t sisåltåvåt desulfatohirudiinin kodonien lisåksi luennanaloitus- ja lopetussignaalit, jotka mahdollistavat il-25 mentymisen sopivissa isåntåsoluissa esimerkiksi E. coli;ssa.

ja lisåksi påisså nukleotidisekvenssejå, jotka soveltuvat vek-toriin liittåmiseen.

Erååsså edullisessa suoritusmuodossa, DNA sisåltåå 5'-pååsså 30 restriktioentsyymillå leikattavissa olevan nukleotidisekvens-sin, jota seuraa luennanaloitussignaali, hirudiinin aminohap-pojen kodonit, jotka mahdollisesti sisåltåvåt yhden tai useam-pia restriktioentsyymien katkaisukohtia, luennanlopetussig-naalin ja 3'-pååsså restriktioentsyymillå katkaistavissa ole-35 van nukleotidisekvenssin. Keksinnon mukaisesti kåyttokelpoisia restriktioentsyymejå ovat esimerkiksi EcoRI, EcoRII, BamHI, Hpall, PstI, HinfI tai Hindlll.

90787 7

Erityisesti on kyseessa kaksisaikeinen DNA, joka muodostuu kaavan (I) mukaisesta nukleotidisekvenssistå ja komplementaa-risesta nukleotidisekvenssistå 5 5' Met (Χ·)„ atg

Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu 10 GTX GTX TAY ACX GAY TGY ACX GAM

Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cyn

QRS GGX CAM AAY YTZ TGY YTZ TGY

15 Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gin

GAM CGX QRS AAY GTX TGY GGX CAM

Gly Asn LYs Cys lie Leu Gly Ser

GGX AAY AAM TGY ATN YTZ GGX QRS

20

Asp Gly Glu Lys Asn Gin Cys Val

GAY GGX GAM AAM AAY CAM TGY GTX

Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro

25 ACX GGX GAM GGX ACX CCX AAM CCX

Gin Ser His Asn Asp Gly Asp Phe

CAM QRS CAY AAY GAY GGX GAY TTY

30 Glu Glu lie Pro Glu Glu Tyr Leu

GAM GAM ATN CCX GAM GAM TAY YTZ

Gin NON 3' CAM TMK (X · ) ο, 35 (I) jossa on esitetty 5'-paasta alkava nukleotidisekvenssi ja selvyyden vuoksi, jokaisen tripletin koodittamat aminohapot 40 on merkitty esiin ja jossa symboleilla on seuraavat merki-tykset: A deoksiadenosyyli T tymidyyli G deoksiguanosyyli 45 C deoksisytidyyli X A, T, C tai G, Y T tai C, 8 Z A, T, C tai G, kun Y = C, tai Z = A tai G, kun Y = T, Q T tai A, R C tai S = A, T, C tai G, kun Q = T, 5 tai R = G ja S = T tai C, kun Q = A, Μ A tai G, L A tai C,

N T, C tai A

K A tai G, kun M = A, 10 tai K = A, kun M = G, ja (X')tt ja (X')m tarkoittavat nukleotidisekvenssejå, joissa n ja i ovat suurempia kuin 3 ja pienempiå kuin 100, erityises-ti suurempia kuin 5 ja pienempiS kuin 15, jotka sekvenssit restriktioentsyymi tunnistaa ja jotka se kykenee katkaisemaan. 15

ErSassa edullisessa suoritusmuodossa DNA-sekvenssi sisaltMa 5'-paassS EcoRIrllå katkaistavissa olevan, keskellå EcoRII:lla katkaistavissa olevan ja 3'-paassM BamHIrlla katkaistavissa olevan nukleotidisekvenssin.

20

Ensi sijassa kyseesså on sellainen kaksisaikeinen DNA, joka sisaltaa E. colin suosimia ja hirudiinin aminohappoja koodit-tavia triplettejå. Tallaisia tripletteja ovat erityisesti glysiinille (Gly) GGT

25 kysteiinille (Cys) TGC

valiinille (Val) GTT

leusiinille (Leu) CTG

seriinille (Ser) TCT

treoniinille (Thr) ACC

30 fenyylialaniinille (Phe) TTC

tyrosiiniIle (Tyr) TAC

metioniinille (Met) ATG

asparagiinihapolle (Asp) GAC

glutamiinihapolle (Glu) GAA

35 lysiinille (Lys) AAA

isoleusiinille (Ile) ATG

histidiinille (His) CAC

90787 9

proliinille (Pro) CCG

glutamiinille (Gin) CAG

asparagiinille (Asn) AAC

5 Edullinen lopetussignaall (NON) on kodoni TAG.

Hirudiinin aminohapposekvenssia koodittavan geenin eras edullinen suoritusmuoto esitettyna edella kuvatulla tavalla on kaavan (II) xnukainen DNA.

10

MetValValTyrThrAepCysThrGluSerGlyGlnAsnLeuCyeLeuCysGluGly

CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGT

GACCTTAAGTACCAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTAGACCAGTCTTGGACACGGACACGCTTCCA

(EcoRl) 15

SerABnValCysGlyGlnGlyAsnLyaCyelleLeuGlySerAepGlyGluLysAsnGlnCyeVal

TCTAACGTTTGCGGTCAGGGTAACAAATGCATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTT

AGAITGCAAACGCCAGTCCCATTGTTTACGTAGGACCCAAGACTGCCACTITTTTTGGTCACGCAA

(EcoRIl)

ThrGlyGluGlyThrProLysProGlnSerHisAsnAspGlyAepPheGluGluIleProGluGlu „ _ ACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCTCACAACGACGGTGACTTCGAAGAAATCCCGGAAGAA J n

TGGCCACTTCCATGGGGCTTTGGCGTCAGAGTGTTGCTGCCACTGAAGCTTCTTTAGGGCCTTCTT

TyrLeuGlnNON

TACCTGCAGTAGGATCCTG

ATGGACGTCATCCTAGGAC

(BamHl) (II).

25 jossa A, T, G, C tarkoittavat samaa kuin kaavassa (I) ja jois-sa ymmårtåmisen helpottamiseksi on merkitty esiin aminohapot, joita kukin tripletti koodittaa, sekå restriktioentsyymien 30 katkaisukohdat.

Voidaan valmistaa myos DNA:n fragmentteja, jotka koodittavat desulfatohirudiinia.

35 Erityisesti voidaan valmistaa desulfatohirudiini-geenin kaksi-såikeisia DNA-fragmentteja, erityisesti sellaisia, joiden paSt voidaan katkaista restriktioentsyymeillS. Hirudiinigeenin tSl- 10 laiset kaksisåikeiset DNA-fragmentit kasittavat erityisesti 30 - 70 emåsparia.

Esimerkkeinå esitettiin kaavan (III) (F,) ja kaavan (IV) (F2) 5 mukaisia DNA-fragmentteja:

MetValValTyrThrAspCysThrGluSerGlyGlnAsnLeuCyeLeuCyeGluGly

CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGT

GACCTTAAGTACCAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTAGACCAGTCTTGGACACGGACACGCTTCCA

(EcoRl) 10

SerAenValCyeGlyGlnGlyAsnLyeCyelleLeuGlySer

TCTAACGTTTGCGGTCAGGGTAACAAATGCATCCTGGGTTCTG

AGATTGCAAACGCCAGTCCCATTGTTTACGTAGGACCCAAGAC

(EcoRII)

Fj (III) 15 IleLeuGlySerAspGlyGluLysABTiGlnCyeValThrGlyGluGlyThrProLysPro CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCG GTAGGACCCAAGACTGCCACTTTTTTTGGTCACGCAATGGCCACTTCCATGGGGCTTTGGC (EcoRII)

GlnSerHieABnAspGlyAspPheGluGluIleProGluGluTyrLeuGlnNON CAGTCTCACAACGACGGTGACTTCGAAGAAATCCCGGAAGAATACCTGCAGTAGGATCCTG 2 0 GTCAGAGTGTTGCTGCCACTGAAGCTTCTTTAGGGCCTTCTTATGGACGTCATCCTAGGAC

(BamHI) f2 (IV)

Voidaan valmistaa myos desulfatohirudiini-geenin yksisåikeisiå DNA-fragmentteja, erityisesti sellaisia, jotka voidaan kemial-25 lisilla ja/tai entsymaattisilla menetelmillå koota taydelli-seksi desulfatohirudiini-geeniksi. Ensi sijassa valmistetaan yksisåikeisiå DNA-fragmentteja, joissa on enemmån kuin 20 nuk-leotidia, erityisesti 20 - 70 nukleotidia.

30 Esimerkeisså on kuvattu yksisåikeisiå ja kaksisåikeisiå DNA-fragmentteja.

DNA:n synteesimenetelmistå on S.A. Narang (3) esittånyt yh-teenvedon. Tunnetuilla synteesimenetelmillå voidaan valmistaa 35 polynukleotideja, joiden pituus on 20 emåstå, tålloin saannot ovat hyviå, puhtausaste on korkea ja valmistusaika on suhteel-lisen lyhyt. Sopivasti suojatut nukleotidit liitetåån toisiin- 90787 11 sa fosfodiesterimenetelmallå (4), viela tehokkaammalla fosfo-triesterimenetelmalla (5) tai fosfiittitriesterimenetelraålla (6). Kiinteafaasi-menetelmH tekee mahdolliseksi oligo- ja po-lynukleotidien yksinkertaisemman synteesin, kun nukleotidiket-5 jut sitoutuvat sopivaan polyxneeriin. Itakura et al. (7) kayt-tMvSt kiinteåfaasi-synteesisså yksittaisten nukleotidien si-jasta fosfotriesteri-menetelmSHS yhteenliitettyjM trinukleo-tideja, jotka siten voidaan lyhyessa ajassa ja hyvilla saan-noilla kondensoida esimerkiksi 31 emåsta sisaltavSksi polynuk-10 leotidiksi. Varsinainen kaksisMikeinen DNA voidaan entsymaat-tisesti rakentaa kemiallisesti valmistetuista, lyhyista seg-menteistå. Khorana et al. (8) kSyttSvat tåhan tarkoitukseen påallekkSin ulottuvia kummankin DNA-saikeen polynukleotidisek-vensseja, jotka emSspariutumisen avulla pysyvat oikeassa jår-15 jestyksessS ja sen jålkeen liittyvat yhteen kemiallisesti DNA-ligaasientsyymilia. ErMs toinen mahdollisuus on inkuboida kul-loinkin kummankin DNA-s&ikeen polynukleotidisekvenssiS, joissa on lyhyet, toistensa yli ulottuvat pSMt, neljSn tarvittavan deoksinukleosidi-trifosfaatin lSsnSollessa ja DNA-polymeraa-20 sin, esim. DNA-polymeraasin I:n polymeraasi I:n Klenow-frag-mentin, T4 DNA-polymeraasin tai AMV:n (linnun myeloblastosis-virus) kaSnteis-transkriptaasin kanssa. TSlloin emaspariutumi-sen seurauksena molemmat polynukleotidisekvenssit pysyvat oikeassa jårjestyksessS ja entsyymi suorittaa taydentamisen 25 tarvittavilla nukleotideilla tåydelliseksi kaksisaikeiseksi DNA:ksi (9). Itakura et al. (10) esittSvat, miten tallM peri-aatteella voidaan saada DNA-polymeraasi l:n (Klenow-fragment-ti) lasnaollessa neljåsta kemiallisesti syntetisoidusta, 39-42 emåksen pituisesta fragmentista rakennetuksi ihmisen leuko-30 syytti-interferonin a2-geenin 132 emasparin pituinen segmentti, jolloin saavutetaan 40 %:n sSasto kemiallisessa synteesissa verrattuna edellå kuvattuun menetelmaan, jossa kaytetSan aino-astaan ligaasia.

35 Tåssa esitetåån menetelmS sellaisten DNA-ketjujen valmistami-seksi, jotka sisåltMvåt desulfatohirudiinin rakennegeenin ja soveltuvat ilmentymiseen isSntHsoluissa ja joiden paåt tekevat 12 mahdolliseksi liittymisen vektoreihin, ja niiden fragmenttien valmistamiseksi siten, ettå a) sopivasti suojattu deoksinukleosidi sidotaan kiinteaån kan-toaineeseen, 5 b) valmistetaan sopivasti suojattuja di-, tri- tai tetranuk-leotideja fosfotriesteri- tai fosfiitti-menetelmallå, c) kantoaineeseen sitoutunut deoksinukleosidi tai oligodeok-10 sinukleotidi liitetSån sopivasti suojattuun mono- tai (koh- dan b mukaan valmistettuun) di-, tri- tai tetranukleotidiin fosfotriesteri- tai fosfiitti-menetelmallå, d) kohdan c) mukaisesti saadut, kantoaineeseen sitoutuneet 15 oligodeoksinukleotidit pituudeltaan noin 20 - noin 70 emåstå, lohkaistaan pois kantoaineesta, mahdollisesti puhdistetaan, vapautetaan suojaryhmistå ja vapaat 5'-pååsså olevat hydrok-siryhmåt fosforyloidaan, 20 el) 2 oligodeoksinukleotidia, kumpikin pituudeltaan noin 20 -noin 70 emåstå koodittavasta ja komplenlentaarisesta sSikeesta sisaltaen ainakin 3, mieluimmin 8-1“, pSallekkain ulottuvaa emasparia, liitetSSn rinnakkain pariksi ja tSydennetSån DNA-polymeraasilla neljån deoksinukleosidi-trifosfaatin lSsnMol-25 lessa kaksisSikeiseksi DNA-segmentiksi (desulfatohirudiini-geenin fragmentit), ja mahdollisesti 2 kaksisaikeistS DNA-segmenttia, joissa on sopivat, kohdan d) mukaisesti fosforyloidut pååt, liitetaan 30 ligaasin avulla desulfatohirudiini-rakennegeeniksi, tai 2 saatua, kaksisåikeistå DNA-segmenttia subkloonattuna sopiviin vektoreihin, jonka jMlkeen fosforyloidaan kohdan d) mukaisesti ja liitetåån ligaasin avulla desulfatohirudiini-35 rakennegeeniksi, tai e2) vaihtoehtoisesti molemmat 2 oligodeoksinukleotidia kooda- li 90787 13 tusta ja komplementaarisesta såikeestå, pituudeltaan esim. 20 - 70 emasta ja sisåltåen kulloinkin, ainakin 3, mieluimmin 8-15 påallekkåin ulottuvaa emåsparia, liitetåån rinnakkain pariksi, taydennetaån DNA-polymeraasilla neljan deoksinukleo-5 sidi-trifosfaatin lasnSollessa ja liitetåån ligaasin avulla desulfatohi rud i i n i-rakennegeeniks i.

Esitetty menetelmå on sinånså tunnettu, kuitenkin vasta olo-suhteiden ja tåsså esitettyjen parannusten sopivat kombinaa-10 tiot tekevat mahdolliseksi hirudiinin aminohapposekvenssiå koodittavien DNA-ketjujen valmistuksen.

Kohdassa a) voidaan kåyttåå monia kiinteitM kantoaineita, kuten erilailla kytkeytyneitå ja turpoavia polystyreeneja, 15 polyakryyliamideja, polyakryyliamidi-kopolymeereja, orgaani-sille aineille, kuten piimaalle, piihappogeelille tai alok-sille levitettyjå polyamideja tai funktionalisoituja silaa-neja. Keksinnon mukaisessa erMassa edullisessa suoritusmuo-dossa kSytetåan kiinteinS kantoaineina ristiinkytkettyja 20 polystyreenejM, jotka kiinnitysryhmien ("spacer"), kuten 2-12 C-atomia sisaltavien, 1-5 polaarisen, kaksiarvoisen funktionaalisen ryhman, kuten iminon, okson, tion, oksi-karbonyylin tai aminokarbonyylin katkaisemien alkyleeniryh-mien valityksellM liitetåSn sinånsa tunnetulla tavalla deoksi-25 nukleosidiin, jonka 5'-OH-ryhmS on sopivasti suojattu. Erityi-sen edullista on saattaa kaavan (V) mukaisen, 5'-asemastaan ja mahdollisesti emåsosastaan suojattu nukleosidi, jossa R1 tar-koittaa hapolla poislohkaistavissa olevaa suojaryhmaa, kuten triaryylimetyylisuojaryhmaa, esimerkiksi 4-metoksitrityyli-30 tai 4,4'—dimetoksitrityyliryhmaa tai trialempialkyylisilyyli-suojaryhmaa, esimerkiksi tert.-butyylidimetyylisilyyliryhmaa ja jossa B tarkoittaa mahdollisesti suojattua emasta, joka on tymyyli, sytosyyli, adenyyli tai guanyyli, reagoimaan meripih-kahappoanhydridin kanssa mahdollisesti emasten, kuten pyridii-35 nin, trietyyliamiinin tai dimetyyliaminopyridiinin lasnaolles-sa, jota seuraa reaktio aminometyloidun polystyreenin kanssa, joka on ristiinkytketty 0,5-2 prosentilla divinyylibentsee- 14 nia karboksyylihappotåhteen aktivoivien reagenssien, mieluim-min N-hydroksisukkinimidin tai p-nitrofenolin ja vettå pois-tavien aineiden kuten karbodi-imidien, esimerkiksi disyklohek-syylikarbodi-imidin avulla (kaavio 1).

5

Reaktio tapahtuu inertisså, ei-proottisessa liuottimessa, esim. pyridiinissa, tetrahydrofuraanissa, dioksaanissa, etik-kahappoetyyliesterisså, kloroformissa, metyleenikloridissa, dimetyyliformamidissa tai dietyyliasetamidissa tai nåiden 10 seoksissa, huoneen låmpotilassa tai hiukan korotetussa tai alennetussa låmpotilassa, esim. noin -10°C - noin 50°C, mie-luimmin huoneen låmpotilassa, reaktio vettåsitovan aineen låsnåollessa myos alhaisemmassa låmpotilassa, esim. noin 0° C:ssa.

15

Kaavio 1 fl % 20 i /° B \ /

U

-OH ---- . „ -OCCH2CH2COOH

R °\ R °\ 8 (v) j N-hydroksisukkinimidi disykloheksyy 1 ikarbodi- imidi S % 2. H2NCH2—y- polystyreeni • a · ]l * ··· R1-o^CH2CH2jjNHCH2—^ polystyreeni (VI) 30

Di-, tri- tai tetranukleotidien valmistuksessa kohdan b) mu-kaisesti (Kaavio 2), saatetaan kaavan (V) mukaiset 5'-asemassa ja mahdollisesti emåsosassa suojatut nukleosidit, joissa R1 ja 35 B tarkoittavat samaa kuin edellå, reagoimaan kaavan (VII) mu-kaisen aktivoidun fosforiesterin kanssa, jossa X1 ja X2 tarkoittavat, toisistaan riippumatta, hydroksia tai siitå johdet- ii 90787 15 tuja suoloja, halogeenia, imidatsolyylia, 1,2,4-triatsol-l-yylia, tetratsolyylia tai 1-bentstriatsolyylioksia ja X2 tar-koittaa lisåksi myos 2-syanoetyylioksia, 2-trihalogeenietyyli-oksia, 2-aryylisulfonyylietyylioksia, 2-alempialkyylitioetyy-5 lioksia, 2-aryylitioetyylioksia tai 2-(4-nitrofenyyli)-etyyli-oksia ja R2 tarkoittaa emMksellM tai nukleofiililla, kuten ammoniumhydroksidilla, tiofenolaatilla tai aryylialdoksimaa-tilla poislohkaistavissa olevaa suojaryhmaa, kuten mahdolli-sesti halogeenilla, nitrolla ja/tai alempialkyylilla substi-10 tuoitua fenyyliM, metyyliS tai mahdollisesti nitrolla substi-tuoitua bentsyyliM, tai metalli-ionilla poislohkaistavissa olevaa suojaryhmSa, kuten 8-kinolyyliS tai 5-kloori-8-kinolyy-liS, mahdollisesti vettS poistavien aineiden tai emasten las-naollessa.

15

Sen jalkeen talla tavalla muodostunut, kaavan (VIII) roukainen yhdiste, jossa R1, X2 ja R2 tarkoittavat samaa kuin edella, ensin saatetaan reagoimaan mahdollisesti 2-substituoidun eta-nolin kanssa, joka muuntaa tShteen X2 ryhmaksi OR3, jossa R3 20 tarkoittaa syanoetyyliM, 2-trihalogeenietyyliS, 2-aryylisulfo-nyylietyyliS,- 2-alempialkyylitioetyylia, 2-aryylitioetyyliM tai 2-(4-nitrofenyyli)-etyyliS, jonka jalkeen suojaryhma Rl lohkaistaan pois ja tållM tavalla valmistettu, kaavan (IX) mukainen yhdiste saatetaan reagoimaan kaavan (VIII) mukaisen 25 toisen yhdisteen kanssa, mahdollisesti vettå poistavien aineiden lSsnåollessa tai emSsten lSsnSollessa, kaavan (X) mukai-seksi dinukleotidiksi (Kaavio 2). Mahdollisesti kaavan (VIII) mukainen yhdiste muutetaan reaktiolla emasten ja veden kanssa toiseksi, kaavan (VIII) mukaiseksi yhdisteeksi, jossa X2 tar-30 koittaa hydroksia tai siitå johdettua suolaa.

Reaktiot tapahtuvat jossain edellåmainituista inerteista liuottimista huoneen IMmpotilassa tai hiukan korotetussa tai alennetussa lampotilassa, esim. huoneen IMmpotilassa.

35

Suojaryhman R1 poislohkaisu suoritetaan esim. happojen, kuten mineraalihappojen, esim. suolahapon tai rikkihapon, karboksyy- 16 lihapon, esim. etikkahapon, trikloorietikkahapon tai muura-haishapon, sulfonihapon, esim. metaani- tai p-tolueenisulfoni-hapon tai erityisesti Lewis-hapon, esim. sinkkikloridin, sink-kibromidin, aluminiumkloridin, dialkyylialuminiumhalogenidin, 5 esim. dibutyyli- tai dietyyliaminiumkloridin tai booritrifluo-ridin avulla, 10°C-50°C:ssa, erityisesti huoneen låmpotilassa. Kaytettaessa dialkyylialuminiumhalogenidia tapahtuu poisloh-kaisu lipofiilisessa liuottimessa, erityisesti tolueenissa ja kaytettaessa jotain muuta mainituista Lewis-hapoista tapahtuu 10 poislohkaisu liuotinseoksessa, joka muodostuu halogeenihiili-vedystå, esim. metyleenikloridista ja alempialkanolista, esim. etanolista tai isopropanolista.

Kaavio 2 15 11 B 1'

Rl0 -OH + X1 -P-X*--♦ R10 -0-Ϊ-Χ* -+ HO -0-?-0R3 N. 0RJ n· OR* n· OR*

v VII VIII IX

20 O f o VIII + IX -» ~°_K x R* 0χ R* 0 0 OR1 25 Kaavan (X) mukaisten dinukleotidien valmistus kasittaa myos kaavan (V) mukaisten nukleosidien, joissa R1 ja B tarkoitta-vat samaa kuin edella, reaktion kaavan (VIIA) mukaisten fos-fiittien kanssa, joissa X1 tarkoittaa halogeenia, erityisesti klooria, X2 tarkoittaa halogeenia, erityisesti klooria tai 30 dialempialkyyliaminoa, erityisesti dimetyyliaminoa tai di-iso-propyyliaminoa tai morfolinoa, piperidinoa tai pyrrolidinoa ja R2 tarkoittaa samaa kuin kaavassa (VII), erityisesti metyyliS, mahdollisesti sopivan emSksen lSsnSollessa (Kaavio 3). Keksin-non mukaisesti saatavat, kaavan (VIIIA) mukaiset yhdisteet 35 saatetaan toisaalta reagoimaan 2-substituoidun etanolin kanssa, joka muuttaa tShteen X2 ryhmåksi OR3, jossa R3 tarkoittaa samaa kuin edella, tåmån jålkeen hapetusaineella, esimerkiksi 90787 17 jodilla emaksen lasnaollessa hapetetaan fosfaatiksi ja suoja-ryhma R1 lohkaistaan pois, jolloin muodostuu kaavan (IX) mukai-nen yhdiste, toisaalta ne saatetaan reagoimaan kaavan (IX) mukaisen yhdisteen kanssa, jonka jålkeen hapetusaineella, esi-5 merkiksi jodilla emMksen lasnMollessa hapetetaan kaavan (X) mukaiseksi yhdisteeksi.

Kaavio 3 10 :i

1. RJOH

R1 -OH ♦ x'-f-x’ -- RI0 -O-P-X· -i· hapetus (IX) \ 6r* 3. R1 poistetaan (V) (VIIA) (VIIIA)

15 I 1. IX

I 2. hapetus (X)

Trinukleotidien valmistamiseksi kaavan (X) mukaisista dinuk-20 leotideista, joissa R1, R2 ja R3 tarkoittavat samaa kuin edellS ja joissa B1 ja B2 tarkoittavat toisistaan riippumatta tymyy-lia, sytosyyliå, adenyyliS tai guanyyliS, lohkaistaan pois suojaryhma R1 ja saatu yhdiste saatetaan reagoimaan kaavan (VIII) mukaisen yhdisteen kanssa, mahdollisesti vetta pois-25 tavien aineiden lasnaollessa tai emåsten lasnSollessa, tai kaavan (VIIIA) mukaisen yhdisteen kanssa, jonka jalkeen suori-tetaan hapetus, jolloin muodostuu kaavan (XI) mukainen yhdiste (Kaavio 4). Suojaryhmån R1 poislohkaisu ja kondensaatio kaavan (XI) mukaisiksi trinukleotideiksi tapahtuu samalla tavalla, 30 kuin on esitetty kaavan (X) mukaisten dinukleotidien valmis-tuksen yhteydesså.

18

Kaavio 4 5 B* x— Hb*· ^]πνχΐΛ • \ *· hapetus ]l3 Bl B2 10 Rln -0-1 -0-1 —O-P-OR3 (XI) R °\ R2 0 0 R26\ 0R2 • \ \ • · 15

Tetranukleotidien valmistamiseksi kaavan (XI) mukaiset trinuk-leotidit 4 saatetaan reagoimaan, kuten edella on esitetty kaavan (X) mukaisille dinukleotideille.

20 Eraassa vaihtoehtoisessa suoritusmuodossa kSytetaan suojaryh-manS R1 4-metoksitrityyliryhmaa, suojaryhmana R2 kloorilla sub-stituoitua fenyyliryhmSS, erityisesti 2-kloorifenyylia ja suo-jaryhmana R3 2-syanoetyyliryhmaa. Kaavan (VII) mukaisessa yh-disteessM tahde X1 ja X2 on 1-bentstriatsolyylioksi-tahde.

25

Kaavan (XI) mukaiset trinukleotidit valmistetaan mieluimmin siten, ettS kaavan (X) mukaisista dinukleotideista lohkaistaan pois suojaryhma R1 ja saatu yhdiste saatetaan reagoimaan kaavan (VIII) mukaisen yhdisteen kanssa, jossa X2 tarkoittaa hydrok-30 syylia tai siita johdettu suola, vetta poistavan aineen lås- naollessa (Kaavio 4). Vetta poistavia aineita ovat esimerkiksi 2,4,6-trimetyyli- tai tri-isopropyylibentseenisulfonyyliklori-di, -imidatsoli, -tetratsoli tai -1,2,4-triatsoli, mahdolli-sesti substituoituna nitrolla. Edullinen vettS poistava aine 35 on l-(2,4,6-trimetyylibentseenisulfonyyli)-3-nitro-l,2,4-tri-atsoli (XII).

90787 19

Mieluimmin kåytetaan nukleosideja, joiden emasosan vapaa aminoryhma on suojattu. Edullisia suojaryhmia ovat bentsoyyli adeniinille, bentsoyyli tai 4-metoksibentsoyyli sytosiinille, isobutyryyli tai difenyyliasetyyli guaniinille. Tymiinia kay-5 tetåan mieluimmin ilman suojaryhmåå.

Oligonukleotidien valmistuksessa kohdan c) mukaisesti kaytetaan sinansa tunnettua laitetta, jossa on puoliautomaattinen tai tåysin automaattinen, mikroprosessoriohjattu liuottimien 10 ja reagenssien syottdsysteemi. Kohdan a) mukaisesti valmiste-tusta, kaavan (VI) mukaisesta yhdisteestM lohkaistaan pois suojaryhmS R1, kuten edellS esitettiin, jonka jalkeen se saate-taan reagoimaan joko kaavan (VIII) tai kaavan (VIIIA) mukaisen yhdisteen kanssa tai kaavan (X) tai (XI) mukaisen yhdisteen 15 kanssa, joista sitS ennen on lohkaistu suojaryhmS R3 pois emak-sillS (2-syanoetyyli-ryhmS, esimerkiksi trialkyyliamiinilla, esim. trietyyliamiinilla jossain edellS mainitussa, inertissa liuottimessa tai liuotinseoksessa 10°C - 40°C:ssa erityisesti huoneen låmpotilassa), mahdollisesti vettå poistavan aineen 20 lasnMollessa tai emåksen lMsnaollessa. Reaktiossa voidaan kaavan (X) mukaisen dinukleotidin tai kaavan (XI ) mukaisen tri-nukleotidin sijasta kayttåå kohdan b) mukaisesti valmistettua tetranukleotidia. KaytettaessS kaavan (VIIIA) mukaista fos-fiittia, suoritetaan lopuksi kasittely hapetusaineella, esi-25 merkiksi jodilla emaksen ISsnaollessa. Talla tavalla valmis-tettu, kaavan (XIII) mukainen yhdiste, jossa R1, R2 ja B tar-koittavat samaa kuin edellS ja n on kokonaisluku 1-4, saate-taan niin monta kertaa reasoimaan kaavan (VI) mukaiselle yh-disteelle esitettyjen reaktiovaiheiden mukaisesti (R‘:n pois-30 lohkaisu, reaktio kaavojen (VIII), (VIIIA), (X), (XI) mukais-ten yhdisteiden tai vastaavan tetranukleotidin kanssa, mahdollisesti jålkikåsittely hapetusaineella), kunnes muodostuu kaavan (XIII) mukainen yhdiste, jossa n on mieluimmin kokonaisluku valillå noin 19- noin 69.

35 20

B

r1 o -0-P -0CCH2CH2CNHCH2—s V-polystyreeni X , RJi\ fl fl 5 \ x \

Jn

XIII

Eraassa edullisessa suoritusmuodossa kåytetSMn suojaryhmana R1 4-metoksitrityylia, ja poislohkaisu suoritetaan sinkkibromi-10 dilla CH- tai NH-happamen yhdisteen, erityisesti 1,2,4-triat-solin tai tetratsolin lasnaollessa.

Esimerkiksi 1,2,4-triatsolin kåytto 4-metoksitrityyli-suoja-ryhmSn poislohkaisussa on uutta ja johtaa yllattMen siihen, 15 etta poislohkaisu tapahtuu nopeasti suurilla saannoilla ilman sivureaktioita. Erityisen edullista on kSyttaa sinkkibromidia ja 1,2,4-triatsolia molaarisen suhteen ollessa 20:1 - 100:1 liuotinseoksessa, joka muodostuu aproottisesta liuottimesta ja alkoholista, esimerkiksi metyleenikloridista ja 2-propanolis-20 ta.

Eraassa edullisessa suoritusmuodossa kaavan (VI) tai kaavan (XIII) mukainen yhdiste, jossa suojaryhxna R1 on lohkaistu pois, saatetaan reagoimaan kaavan (XI) mukaisen trinukleotidin kans-25 sa, jossa suojaryhma R3 on lohkaistu pois vetta poistavan aineen, kuten esimerkiksi 2,4,6-trimetyyli- tai tri-isopropyy-libentseenisulfonyylikloridin, -imidatsolin, -tetratsolin tai -1,2,4-triatsolin lasnaollessa, joka mahdollisesti on substi-tuoitu nitrolla. Erityisen edullinen on 1-(2,4,6-trimetyyli-30 bentseenisulfonyyli)-3-nitro-l,2,4-triatsoli (XII).

Erityisen edullinen yhdistelmå, jossa suojaryhmana R1 kaytetMSn 4-metoksitrityyliryhmSa, ja R*:n poislohkaisuun kSytetSSn sinkkibromidia 1,2,4-triatsolin lasnaollessa ja vetta poistavana 35 aineena kaavan (XIII) mukaisen suojauksesta vapautetun oligo-nukleotidipolystyreeni-hartsin reaktiossa suojauksesta vapautetun kaavan (XI) mukaisen trinukleotidin kanssa kaytetaan

II

90787 21 kaavan (XII) mukaista triatsolia, mahdollistaa sen, etta yl-lattaen voidaan valmistaa myos pitkiå nukleotidiketjuja, jois-sa on noin 40 - noin 70 emåsta, lyhyesså ajassa suurilla saan-noilla ja hyvin puhtaassa muodossa.

5

Oligodeoksinukleotidien poislohkaisuun kantoaineesta ja suoja-ryhmien poistamiseen kohdan c) mukaisesti kaytetaSn sinånså tunnettuja menetelmiå. Erityisen edullinen reagenssi kanto-aineen poislohkaisemiseksi ja edullisen 2-kloorifenyyli-suoja-10 ryhman poistamiseksi on aryylialdoksimaatti, esimerkiksi 1,1,3,3-tetrametyyliguanidinium-2-nitrobentsaldoksimaatti. Reaktio tapahtuu jossain edellå mainituista, inerteistS liuot-timista, johon lisåtåån vMhSn vettå, esim. 95-%:isessa pyri-diinissM, huoneen låmpdtilassa. Lopuksi saatetaan reagoimaan 15 vesipitoisen ammoniakin kanssa huoneen låmpotilassa tai koro-tetussa låmpbtilassa, esim. 20eC - 70°C:ssa, erityisesti 50°C:ssa.

Oligodeoksinukleotidien yhteenliittåmistå vårten tuodaan 5'-20 pååsså olevaan hydroksiryhmåån fosfaattitåhde. Fosfaattitah-teen liittaminen (fosforylointi) tapahtuu sinånså tunnetulla tavalla T4-polynukleotidi-kinaasin avulla ATP:n låsnåollessa.

Valmistetut koodittavan ja komplementaarisen DNA-saikeen oli-25 godeoksinukleotidit sisaltavat påållekkåin ulottuvia sekvens-sejå, joissa on ainakin 3, mieluimmin 8-15 påållekkåin ulot-tuvaa emåsparia. Sekoituksen tuloksena tallaiset oligodeoksi-nukleotidi-parit pysyvåt yhdesså vetysiltasidoksilla.

30 Ulkopuolelle jaåvat yksisaikeiset paat toimivat kohdan el) ja e2) mukaisesti matriisina (templaattina) toisen (komplementaarisen) saikeen rakentamisessa DNA-polymeraasilla, esim. DNA-polymeraasi I:llå, DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmentilla tai T4-DNA-polymeraasilla tai AMV kåånteistranskriptaasilla neljan 35 deoksinukleosiditrifosfaatin (dATP, dCTP, dGTP ja TTP) låsnaollessa. Tåydentåmisesså muodostuvilla kaksisåikeisillå DNA-ketjuilla, jotka ovat erityisesti desulfatohirudiini-geenin 22 fragmentteja (menetelma el) tai taydellisiå desulfatohirudii-ni-geenejå (menetelma e2), on tylpat paat.

Menetemåvaiheen el) mukaisesti saatavat desulfatohirudiinigee-5 nin fragmentit sisaltMvat pSissS nukleotidisekvensseja, jotka restriktioendonukleaasit kykenevSt tunnistamaan ja katkaise-maan.

Riippuen aina nukleotidisekvenssien ja vastaavasti restriktio-10 endonukleaasien valinnasta, muodostuu lohkalstaessa taydelll-sia emåsparillisia (tylppiå) påitå ("blunt ends") tai påitå, joissa on ulkoneva DNA-såie ("staggered ends"). Restriktiotun-nistussekvenssit valitaan siten, etta liitettaessa DNA-frag-mentteja, jotka on kåsitelty tylppia paita muodostavilla rest-15 riktioendonukleaaseilla, DNA-fragmenttien koheesiivisten pSi-den emåspariutuessa ja liitettåesså sitten yhteen niiden ulko-nevia paitS sisSltSvia DNA-sSikeitS, saadaan taydellinen de-sulfatohirudiini-rakennegeeni. Kahden kaksisåikeisen DNA-frag-mentin yhteenliittSminen vaatii yhden 5’-påassa olevan fos-20 faattiryhman donori-fragmentissa ja vapaan 3'-pSåssa olevan hydroksiryhmån akseptori-fragmentissa. Kohdassa el) saadut DNA-fragmentit ovat jo valmiiksi S'-pSistSSn fosforyloituja ja liitetaan yhteen sinMnsS tunnetulla tavalla ligaasin, erityi-sesti T4-DNA-ligaasin avulla.

25

EraSssa suoritusmuodossa valmistetaan kuvatulla tavalla desul-fatohirudiini-geenin kaksi fragmenttia, erityisesti kaavan (III) tai (IV) mukaiset fragmentit Fi ja F2. Fragmentit, jotka voidaan tarvittaessa subkloonata sopivaan vektoriin, sisSlta-30 vat kukin mieluimmin liittymispaissa yhden restriktioendonuk-leaasin, erityisesti EcoRII:n tunnistussekvenssin, minka vuok-si mainitulla restriktioentsyymillå suoritetun lohkaisun ja molempien fragmenttien yhteenliittamisen jalkeen muodostuu oikealla tavalla koodittava desulfatohirudiini-DNA-sekvenssi. 35 Lisåksi osa l sisåltSå ennen luennanaloitussignaalia (ATG) ja osa 2 luennanlopetussignaalin (esim. ATG) jalkeen muita "ter-minaalisia" restriktiokohtia, jotka tekevat mahdolliseksi de-

II

90787 23 sulfatohirudiini-geenin tai desulfatohirudiini-geenifragmentin liittamisen sopivaan vektoriin.

Esimerkiksi desulfatohirudiini-geeni valmistetaan kahdessa, 5 kaavan (III) ja (IV) mukaisessa osassa F, ja F2, jotka mahdol-lisesti subkloonataan ja restriktioentsyymilia EcoRII suorite-tun lohkaisun ja yhteenliittSmisen jSlkeen muodostavat oikean desulfatohirudiini-DNA-sekvenssin, ja joissa F, sisSltSS ennen luennanaloitussignaalia EcoRI-restriktiokohdan.

10

Eraassa edullisessa suoritusmuodossa (menetelma e2) liitetaan kulloinkin kaksi oligodeoksinukleotidia, jotka ovat peråisin koodittavasta tal komplementaarisesta saikeesta, ainakin kol-xnen, mieluimmin 8-15:n komplementaarisen emaksen avulla, tay-15 dennetaån DNA-polymeraasilla, esixn. jollain edellS mainitulla ja HitetaSn yhteen T4 DNA-ligaasilla desulfatohirudiini-raken-negeeniksi.

Hirudiinin aminohapposekvenssia koodittavan aeenin sisaitavien 20 ilmentvmisvektoreiden valmistus

Keksinto koskee erityisesti ilmentymisvektoreita, jotka sisai-tavat desulfatohirudiinia koodittavan DNA-sekvenssin, jota ilmentymisenohjaussekvenssi saatelee siten, etta nailla ilmen-25 tymisvektoreilla transformoitunut isantasolu tuottaa desulfa-tohirudiina.

Taman keksinnon mukaiset ilmentymisvektorit valmistetaan esim. siten, etta vektori-DNA:han, joka sisaitaa ilmentymisenohjaus-30 sekvenssin, liitetaan desulfatohirudiinia koodittava DNA-sek-venssi siten, etta ilmentymisenohjaussekvenssi saatelee mai-nittua DNA-sekvenssia.

Sopivan vektorin valinta riippuu transformointiin kaytettavas-35 ta isantasolusta. Sopivia isantia ovat esimerkiksi mikro-orga-nismit, kuten hiivat, esim. Saccharomvces cerevisiae ja erityisesti bakteerikannat, joihin restriktio- tai muuntoentsyy- 24 mit eivåt vaikuta, ennen muuta kannat Escherichia coli. esim.

E. coli X1776, E. coli HB101, E. coli W3110 Δ102, E. coli HB101/LM1035, E. coli JA221 (30) tai E. coli K12 kanta 294.

5 Edullisia isMntåsoluja ovat mainitut E. coli-kannat. erityi-sesti E. coli HB101, £. coli JA221 ja £. coli W3110A102.

Periaatteessa sopivia ovat kaikki vektorit, jotka replikoivat ja ilmentavat keksinndn mukaisia, heterologisia desulfatohiru-10 diinin aminohapposekvenssiS koodittavia DNA-sekvensseja vali-tussa isånnåssS.

Esimerkkejå vektoreista, jotka ovat sopivia desulfatohirudii-ni-geenin ilmentåmiseen E. coli-kannassa. ovat bakteriofaagit, 15 esim. bakteriofaagi X:n johdannaiset tai plasmidit, kuten eri-tyisesti plasmidi colEl ja sen johdannaiset, esim. pMB9, PSF2124, pBR317 tai pBR322. TSmSn keksinnon mukaiset edulliset vektorit ovat plasimidin pBR322 johdannaisia. Sopivat vektorit sisåltåvat tSydellisen replikonin ja merkkigeenin, mikå tekee 20 mahdolliseksi ilmentymisplasmideilla transformoituneiden mik-ro-organismien valinnan ja identifioimisen fenotyyppisen tun-nusmerkin perusteella. Sopivat markkerigeenit antavat mikro-organismille esim. vastustuskyvyn raskasmetallien, antibioot-tien ja vastaavien suhteen. Edelleen sisaltavat tåman keksin-25 non kannalta edulliset vektorit replikoni- ja merkkigeeni- alueiden lisaksi restriktioendonukleaasien tunnistussekvens-seja niin ettå nåihin kohtiin voidaan liittSS hirudiinin ami-nohapposekvenssiå koodittava DNA-sekvenssi ja mahdollisesti ilmentymisenohjaussekvenssi. Edullinen vektori, plasmidi 30 pBR322, sisåltaa ehjån replikonin, tetrasykliinille ja ampi- silliinille resistenssin antavat merkkigeenit (tetR ja ampR) ja joukon ainoastaan kerran esiintyviå restriktioendonukleaasien, esim. PstI (pilkkoo ampR-geenin kohdalta, tetR-geeni jaa ehyek-si), BamHI, Hindlll, Sall (pilkkovat kaikki tetR-geenin kohdal-35 ta, ampR-geeni jåa ehyeksi), Nrul ja EcoRI.

Desulfatohirudiinin ilmentymisen saatelemiseksi voidaan kayt- 90787 25 tåå useampia ilmentymisenohjaussekvensseja. Erityisesti kåyte-taan transformoitavien isåntåsolujen voimakkaasti ilmentyvien geenien ilmentymisenohjaussekvensseja. Kun yhdistelmåvektorina on pBR322, ja isåntåmikro-organismina E. coli, ovat sopivia 5 esimerkiksi laktoosioperonin, tryptofaanioperonin, arabinoosi-operonin ja vastaavien ilmentymisenohjaussekvenssit (jotka sisåltåvåt mm. promoottorin ja ribosomaalisen sidoskohdan), /3-laktamaasigeenin ilmentymisenohjaussekvenssi, λΝ-faagigeenin tai fd-faagin kerrosproteiinigeenin ja muiden vastaavat sek-10 venssit. /3-laktamaasigeenin (/3-lac-geeni) promoottori sisaltyy jo plasmidiin pBR322, kun taas muut ilmentymiskontrollisek-venssit tåytyy liittaa plasmidiin. Tåmån keksinnon kannalta edullinen ilmentymisenohjaussekvenssi on tryptofaanioperonin (trp po) ilmentymisenohjaussekvenssi. Hiivoissa tapahtuvaan 15 replikaatioon ja ilmentymiseen sopivat vektorit sisSltSvSt hiivaan soveltuvan replikoitumisen aloituskohdan ja selektii-visen geneettisen markkerin hiivoille. Yhdistelmavektorit, jotka sisMltåvMt hiivaan soveltuvan replikoitumisen alkukoh-dan, esim. kromosomaalisen autonomisesti replikoituvan segmen-20 tin (ars), såilyvåt transformoitumisen jålkeen hiivasolussa ekstrakromosomaalisesti ja ne replikoituvat mitoosissa autonomisesti. Edelleen voidaan kayttåS yhdistelmavektoreita, jotka sisSltåvat hiivan homologisia 2M-plasmidi-DNA-sekvenssejå. Tallaiset yhd i stelmavektorit yhtyvat rekombinoitumalla solun 25 sisallå jo esiintyviin 2M-plasmideihin tai ne replikoituvat autonomisesti. 2M-sekvenssit ovat erityisen sopivia plasmi-deille, joilla on suurempi transformointitaajuus ja antavat suuren kopiomåårån. Sopivia merkkigeenejå hiivoille ovat ennen muuta sellaiset, jotka tekevåt isånnån antibioottien suhteen 30 resistentiksi, tai auksotrofisten hiivamutanttien ollessa ky-seesså, geenit, jotka tåydentåvåt isånnån vajavuuksia. Vastaavat geenit antavat vastustuskyvyn, esim. sykloheksimidian-tibiootin suhteen tai ne huolehtivat prototrofiasta auksotro-fisessa hiivamutantissa, esim. URA3. Leu2-. HIS3- tai ennen 35 muuta TRP-aeeni. Hieluimmin hiiva-yhdistelmavektorit sisåltå-våt edelleen replikoitumisen aloituskohdan ja merkkigeenin bakteeri-isånnålle, erityisesti E. colille. jolloin yhdistel- 26 måvektoreiden ja niiden esiasteiden rakentaminen ja kloonaus voi tapahtua bakteeri-isånnåsså. Hiivassa tapahtuvaan ilmen-tymiseen sopivia ilmentymisenohjaussekvenssejå ovat esimerkik-si TRP1-. ADHI-, ADHII-. PH03- tai PH05-geenin ilmentymisenoh-5 jaussekvenssit ja lisåksi glykolyyttiseen hajoamiseen liitty-vat promoottorit, esin. PGK- ja GAPDH-promoottori.

Erityisesti keksinto koskee replikaatioon ja fenotyyppiseen selektioon pystyviå ilmentymisvektoreita, jotka sisaltavat 10 ilmentymisenohjaussekvenssin ja hirudiinin aminohapposekvens-sia koodittavan DNA-sekvenssin, jolloin mainittu DNA-sekvenssi yhdessa transkription aloitussignaalin ja -lopetussignaalin sekS luennanaloitussignaalin ja -lopetussignaalin kanssa on sijoitettu mainittuun ilmentymisplasnidiin mainitun ilroentymi-15 senohjaussekvenssin saatelyn alaisuuteen siten, etta mainitul-la ilmentymisplasmidilla transformoituneet isåntasolut tuot-tavat desulfatohirudiinia.

Jotta saavutettaisiin tehokas ilmentyminen, pitåå desulfatohi-20 rudiinigeenin sijaita oikealla tavalla ("faasissa") ilmentymi-senohjaussekvenssin suhteen. On edullista liittSa ilinentymi-senohjaussekvenssi paå-mRNA-alun ja geenia koodittavan sek-venssin ATG:n valisella alueella, joka luonnostaan kytkeytyy ilmentymisenohjaussekvenssiin (esim. /S-lac-koodisekvenssi kay-25 tettaessa )3-lac-promoottoria), desulfatohirudiinigeeniin, joka nielellåan tuo mukanaan oman luennanaloitussignaalinsa (ATG) ja luennanlopetussignaalinsa (esim. TAG). Nain taataan tehokas transkriptio ja luenta.

30 Esimerkiksi vektori, erityisesti pBR322, leikataan restriktio-endonukleaasilla ja nSin saatuun, mahdollisesti vielå modi-fioituun lineaariseen vektoriin liitetåån vastaavilla tunnis-tuspåillå varustettu ilmentymisenohjaussekvenssi. Ilmentymi-senohjaussekvenssi sisåltåå 3'-pååsså (luennan suunnassa) res-35 triktioendonukleaasin tunnistussekvenssin, niin ettå ilmentymisenohjaussekvenssin jo sisåltåvå vektori voidaan leikata mainitulla restriktioentsyymillå ja sen jålkeen liittåå vek- li 90787 27 toriin sopivilla påillå varustettu desulfatohirudiini-geeni. Talloin muodostuu kahden yhdistelmSplasmidin seos, joista toi-nen sisaitåå geenin oikeassa ja toinen våSrassS suunnassa. On edullista pilkkoa ilmentymisenohjaussekvenssin jo sisåltåvS 5 vektori vielå jollain toisella restriktioendonukleaasilla vek-tori-DNA:n sisållå ja liittåå muodostuvaan vektori-fragment-tiin oikeilla påillå varustettu desulfatohirudiini-geeni.

Kaikki vektoriin kohdistuvat toimenpiteet tapahtuvat mieluim-min siten, etta replikonin ja ainakin yhden merkkigeenin toi-10 minta pysyy koskemattomana.

Erååsså taxnan keksinnon mukaisessa edullisessa suoritusinuodos-sa leikataan pBR322:sta johdettu vektori, joka sisaltaa ilmen-tymisenohjaussekvenssin, erityisesti tryptofaani-operonin (trp 15 po) ilmentymisenohjaussekvenssin, joka 3'-paMssa (paa-mRNA-aloituskohdan ja ensimmaisen ATG:n valissa) sisaltaa tunnis-tuskohdan yhdelle, mielellaån kohesiivisia paita muodostavalle restriktioendonukleaasille, esim. EcoRI:lle, tastå kohdasta mainitulla restriktioendonukleaasilla ja vektori-DNA-osasta 20 toisella restriktioendonukleaasilla, joka muodostaa tylppia tai mieluimmin kohesiivisia påitM, esim. BamHI, jonka jalkeen nain linearisoitu vektori kytketaan vastaavia paita sisal-tavaMn desulfatohirudiinigeeniin (esim. sellaiseen, joka sisaltaa EcoRI-paån ennen ATG-aloituskohtaa ja BamHI-paan luen-25 nanlopetuskodonin jalkeen). Kytkenta tapahtuu tunnetulla ta-valla pariuttamalla komplementaariset (kohesiiviset) paat ja liittMmSlla esim. T4-DNA-ligaasilla.

mRNA:n kautta genomisesta DNA:sta saatu tai synteettisesti 30 valmistettu, vastaavat kohesiiviset (erityisesti EcoRI- ja

BamHI-) paåt omaava desulfatohirudiinigeeni voidaan ennen il-mentymisplasmidiin liitt&mistå myos kloonata vektoriin, esim. pBR322:een, suuremman desulfatohirudiini-geenimaMran valmis-tamiseksi, esimerkiksi sekvenssianalyysiS vårten. Yhdistel-35 mSplasmidin sisaltMmSn kloonin eristSminen suoritetaan esimerkiksi desulfatohirudiini-geenin suhteen spesifisellS, radioak-tiivisesti leimatulla oligodeoksinukleotidikoettimella (katso 28 edella). Desulfatohirudiini-geenin karakterisointi tapahtuu esimerkiksi menetelmållå, jonka ovat esittåneet Maxam ja Gilbert (11) .

5 Eraåsså toisessa keksinnon mukaisessa suoritusmuodossa synte-tisoidaan desulfatohirudiini-geenin kaksi osaa. Osa 1, joka kasittMM geenin 1. osan, sisåltåå ennen ATGrtå ja lopussa kul-loinkin tunnistussekvenssin kohesiivisia paitå muodostaville restriktioendonukleaaseille, esim. ennen ATG:tå, EcoRI:lle ja 10 lopussa EcoRII:lle. Osa 2, joka kåsittåå geenin jålkimmåisen osan, sisaltåa vastaavat tunnistussekvenssit, alussa esim. EcoRIItlle ja luennanlopetussignaalin (esim. TAG:n) jalkeen BamHI:lle. Osat pilkotaan ulompien tunnistussekvenssienså koh-dista (osa 1 esim. EcoRI:lla ja osa 2 vastaavasti BamHIzlla) 15 ja alakloonataan vastaavasti leikattuun vektoriin (esim. pBR3- 22). Osat sisåltåvien kloorien identifioiminen ja osien karak-terisoiminen tapahtuu edellå esitetylla tavalla. Osat leika-taan sen jalkeen vastaavilla restriktioendonukleaaseilla yh-distelmåvektorista (osa 1 esim. EcoRI:llå ja EcoRII:lla ja osa 20 2 esim. EcoRII:lla ja BamHI:llM ja liitetaån yhteen kohesii- visten paidensa, erityisesti EcoRII-paiden kautta, jolloin muodostuu taydellinen desulfatohirudiini-geeni, joka sijoite-taan esitetylla tavalla vektori-DNA:han.

25 Mikro-oraanismien transformaatio

Menetelmassa transformoitujen isantasolujen valmistamiseksi isantasolu transformoidaan ilmentåmisvektorilla, joka sisaltaa hirudiinin aminohapposekvenssiå koodittavan, ilmentymisenoh-30 jaussekvenssin saateleman DNA-sekvenssin.

Sopivia isantasoluja ovat esimerkiksi edella mainitut mikro-organismit, kuten kannat Saccharomvces cerevisiae ja erityisesti Escherichia coli. Transformaatio keksinnon mukaisella 35 ilmentMmisplasmidilla tapahtuu esimerkiksi kirjallisuudessa kuvatulla tavalla, kuten esitetåMn kannoille S. cerevisiae (12) ja E. coli (14). Transformoitujen isSntasolujen eriståmi-

II

90787 29 nen tapahtuu edullisesti selektiivisestå elatusaineesta, johon on lisatty biosidi, jota vastaan ilmentymisplasmidin sisaltava merkkigeeni antaa vastustuskyvyn. Kun, kuten on edullista, ilmentymisplasmidit sisaltåvat ampR-geenin, lisataan elatus-5 aineeseen ampisilliinia. Solut, jotka eivat sisallå ilmenty-misplasmidia, kuolevat tållaisessa elatusaineessa.

Transformoituneiden isåntåsoluien vilielv ia desulfatohiru-diinin talteenotto 10

Transformoituneita isåntåsoluja voidaan kåyttåå desulfatohiru-diinin valmistamiseksi. Desulfatohirudiinin valmistusmenetel-målle on tunnusomaista, ettå transformoituja isåntåsoluja vil-jellåån ja tuote vapautetaan isåntåsoluista ja eristetåån.

15

Desulfatohirudiini-yhdisteillå, joilla on desulfatohirudiinin primåårirakenteesta johdettu rakenne, on ynunårrettåvå tarkoi-tettavan modifioituja desulfatohirudiini-yhdisteitå, jolloin modifiointi muodostuu mieluimmin desulfatohirudiinin primååri-20 rakenteen lyhentyesså esim. 1-10, erityisesti 1-6 aminohap- po-osalla N-pååsså ja/tai 1-6, erityisesti 2 aminohappo-osalla C-pååsså tai desulfatohirudiini-molekyylin modifiointi tapahtuu N-pååsså, esim. N-terminaalinen asetylointi tai roetiony-lointi.

25 Nåin olien keksintd koskee ennen muuta desulfatohirudiinin ja sen suolojen valmistusmenetelmåå, jolle on tunnusomaista, ettå ilmentymisplasmidilla, joka sisåltåå desulfatohirudiinin ami-nohapposekvenssiå koodittavan, ilmentymisenohjaussekvenssin 30 sååtelemån DNA sekvenssin, transformoituneita isåntåsoluja viljellåån nestemåisesså elatusaineessa, joka sisåltåå assimi-loituvia hiili- ja typpilåhteita, ja tuote vapautetaan isåntåsoluista ja eristetåån.

35 Keksinto koskee erityisesti menetelmåå seuraavan kaavan mu-kaisten hirudiiniyhdisteiden valmistamiseksi 30

ValValTyrThrAspCysThrGluSerGlyGlnAsnLeuCysLeuCysGluGlySerAsnValCys

GlyGlnGlyAsnLysCysIleLeuGlySerAspGlyGluLysAsnGlnCysValThrGlyGluGly

ThrProLysProGlnSerHisAsnAspGlyAspPheGluGluIleProGluGluTyrLeuGln 5 ja sen suolojen valmistamiseksi.

Menetelmån mukaisesti saatavassa, desulfatohirudiinissa ovat 10 kysteiini-tåhteet Cys mieluimmin samassa jårjestyksesså kuin luonnollisessa hirudiinissa parittain disulfidi-siltojen kyt-kemånå.

Transformoituneiden isantasolujen viljely tapahtuu sinånså 15 tunnetulla tavalla. Niinpa voidaan transformoituneiden isan- tåmikro-organismien viljelemiseksi kåyttåå erilaisia hiililah-teitå. Esimerkiksi edullisia hiililåhteitå ovat assimiloituvat hiilihydraatit, kuten glukoosi, maltoosi, mannitoli tai lak-toosi tai asetaatti, jota voidaan kåyttåå joko pelkåståån tai 20 sopivina seoksina. Sopivia typpilShteita ovat esimerkiksi ami-nohapot, kuten kasaminohapot, peptidit ja proteiinit ja nåiden hajoamistuotteet, kuten tryptoni, peptoni tai lihauutteet; edelleen hiivauutteet, mallasuute, kuten myos ammoniumsuolat, esim. ammoniumkloridi, -sulfaatti tai -nitraatti, joita voi-25 daan kayttåa pelkaståan tai sopivina seoksina. Epaorgaanisia suoloja joita myos voidaan kåyttåS, ovat esim. natriumin, kaliumin, magnesiumin ja kalsiumin sulfaatit, kloridit, fos-faatit ja karbonaatit.

30 Edelleen ravintoalusta sisåltaå esim. kasvua edistavia ainei-ta, kuten hivenaineita, esim. rautaa, sinkkia, mangaania ja vastaavia ja mieluimmin aineita, jotka saavat aikaan valinta-paineen ja eståvåt sellaisten solujen kasvun, jotka ovat me-nettaneet ilmentamisplasmidin. NiinpM ravintoalustaan lisataån 35 esimerkiksi ampisilliinia, kun ilmentymisplasmidi sisåltaå ampR-geenin. Antibioottisesti tehokkaan aineen tållainen lisåys vaikuttaa myos niin, ettå kontaminoivat, antibiooteille herkåt 90787 31 mikro-organismit kuolevat.

Viljely tapahtuu sinanså tunnetun menetelman mukaisesti. Vil-jelyolosuhteet, kuten låmpotila, ravintoalustan pH-arvo ja 5 kåymisaika, valitaan niin, ettå saadaan maksimaalinen hirudii-nitiitteri. Niinpa E. coli- tai hiivakantaa viljellåån mie-luimmin aerobisissa oloissa pinnanalaisviljelmana ravistellen tai sekoittaen noin 20 - 40°C:n låmpotilassa, mieluimmin noin 30° C:ssa ja pH-arvossa 4-9, mieluimmin pH:ssa 7, noin 4-20 10 tuntia, mieluimmin 8-12 tuntia. Talloin ilmentymistuote ke-raantyy solun sisåån.

Kun solutiheys on saavuttanut riittavan arvon, viljely lopete-taan ja tuote vapautetaan mikro-organismien soluista. Tåtå 15 vårten solut rikotaan, esim. kasittelemalla detergentilla, kuten SDS tai Triton, tai lyysoidaan lysotsyymilla tai samalla tavalla vaikuttavalla entsyymillå. Vaihtoehtoisesti tai lisaksi voidaan kayttMå solujen rikkomiseen mekaanisia voimia, kuten leikkausvoimia (esim. X-puristin, ranskalainen puristin, 20 Dyna-mylly) tai ravistelua lasihelmien tai aluminiumoksidin kanssa tai vuorotellen jaSdyttamista, esim. nestemaisessa ty-pessa, ja sulattamista esim. 30 - 40°C:seen sekå ultraaanta. Muodostunut seos, joka sisaltaå proteiinit, nukleiinihapot ja muut solun aineosat, rikastetaan sentrifugoinnin jalkeen pro-25 teiinin suhteen sinanså tunnetulla tavalla. Niinpa esim. suu-rin osa ei-proteiiniaineosista erotetaan polyetyleeni-imiini-kåsittelyllå ja proteiinit, mukaan luettuna hirudiini-yhdis-teet, saostetaan kyllåståmållå liuos ammoniumsulfaatilla tai muilla suoloilla. Bakteerien proteiinit voidaan saostaa myos 30 hapottamalla etikkahapolla (esim. 0,1 %, pH 4-5). Hirudiini-yhdisteet voidaan rikastaa myos uuttamalla etikkahappoinen, sakan ylåpuolella oleva liuos n-butanolilla. Muita puhdistus-vaiheita ovat esimerkiksi kromatografiset menetelmåt, kuten ioninvaihtokromatografia, geelipermeaatiokromatografia, par-35 titiokromatografia, HPLC, kåånteisfaasi-HPLC ja vastaavat.

Niinpå seosaineosien erottaminen tapahtuu dialyysillå, varauk-sesta riippuen geeli- tai kantoainevapaalla elektroforeesilla, 32 molekyylikoon mukaan sopivalla Sephadex-pylvåålla, affiniteet-tikromatografisesti, kåyttåen esim. vasta-aineilla, erityises-ti monoklonaalisilla vasta-aineilla tai trombiinilla kytkettya sopivaa kantoainetta affiniteettikromatografiassa, tai muilla, 5 erityisesti kirjallisuudesta tunnetuilla menetelmillS.

Ilmentyneiden hirudiiniyhdisteiden eriståminen kåsittåS esi-merkiksi seuraavat vaiheet: 10 Solujen erottaminen viljelyliuoksesta sentrifugoimalla; raakauutteen valmistus rikkomalla solut, esim. kåsittelemållM lyysoivalla entsyymillå ja/tai vuorotellen jaadyttåmallS ja sulattamalla; liukenemattomien aineosien sentrifugoiminen pois; 15 DNA:n saostaminen lisååmalia polyetyleeni-imiinia; proteiinien saostaminen ammoniumsulfaatilla; liuotetun sakan affiniteettikromatografia desulfatohirudiinin monoklonaalisia vasta-aineita sisMltåvåssM pylvåasså tai trom-biini-pylvaassa; nain saadusta liuoksesta suolan poistaminen 20 dialyysillå tai kromatocprafisesti Sephadex G25:llå tai Sepha-dex G10:11M.

Vaihtoehtoisesti voidaan DNA:n erottamisen jålkeen bakteeri-proteiinit saostaa l-%:isella etikkahapolla, happamesta, sakan 25 ylapuolella olevasta liuoksesta uutetaan hirudiiniyhdiste n-butanolilla tai happamelle, sakan ylapuolella olevalle nes-teelle suoritetaan suoraan ioninvaihtokromatografia (esim. dietyyliaminoetyyliselluloosalla DEAE 53). Muut puhdistusvai-heet kåsittavat geelisuodatuksen Sephadex G50:11M (tai G75: 30 11a) ja kåånteisfaasi-HPLC:n. Suolan poistaminen tapahtuu Sep hadex G25:lla.

Hirudiini-aktiivisuuden toteamiseksi voidaan suorittaa testi hirudiinin tai desulfatohirudiinin vasta-aineilla (esim. ka-35 nista tai hybridomasoluista saatavilla monoklonaalisilla vasta-aineilla) , trombiini-testi (15) tai verenhyytymistesti (16).

Il 90787 33

Yhdiste A: RP-HPLC, retentioaika 16,83 min; FPLC; eluutio 390 mM:lla NaCl; UV (vesi): = 275 nm;

Yhdiste B: RP-HPLC: retentioaika 18,43 min; 5 Yhdiste C: RP-HPLC: retentioaika 19,6 min; FPLC; eluutio 420 mM:lla NaCl;

Yhdiste D: RP-HPLC: retentioaika 20,6 min; FPLC: eluutio 460 mM:lla NaCl;

Yhdiste E: RP-HPLC: retentioaika 21,53 min; FPLC: 10 Eluutio 500 mM:lla NaCl; UV (vesi) λ,,*, = 273 nm: ja menetelmaa niiden valmistamiseksi transformoitujen aktiivi-kantojen avulla.

15 Keksinnon mukaisesti valmistettava desulfatohirudiini voi olla ei ainoastaan vapaassa muodossa vaan myos suolojensa muodossa, erityisesti farmaseuttisesti hyvSksyttSvien suolojensa muodossa. Koska se sisaltaa useampia aminohappotahteitM, joissa on vapaat aminoryhmSt, voi keksinndn mukainen yhdiste olla esim.

20 happoadditiosuolojen muodossa. Happoadditiosuoloina tulevat kysymykseen erityisesti fysiologisesti kayttokelpoiset suolat tavallisesti kSytettyjen, terapeuttisesti hyvaksyttåvien hap-pojen kanssa; epåorgaanisista hapoista voidaan mainita halo-geenivetyhapot, kuten kloorivetyhappo, mutta myos rikkihappo 25 tai fosfori- tai pyrofosforihappo; orgaanisista hapoista ovat sopivia ensi sijassa sulfonihapot, kuten bentseeni- tai p-to-lueenisulfonihappo tai alempialkaanisulfonihapot, kuten metaa-nisulfonihappo, seka karboksyylihapot, kuten etikkahappo, mai-tohappo, palmitiinihappo ja steariinihappo, omenahappo, viini-30 happo, askorbiinihappo ja sitruunahappo. Koska desulfohirudii-ni sisaltaa myos aminohappotåhteitå, joissa on vapaita karbok-syyliryhmia, voi se olla myds metallisuolana, erityisesti al-kalimetalli- tai maa-alkalimetallisuolana, esim. natrium-, kalium-, kalsium, tai magnesiumsuolana tai myos ammonium-35 suolana, johdettuna ammoniakista tai fysiologisesti hyvåksyt-tavSsta, orgaanisesta, typpeS sisSltSvasta emaksestS. Koska yhdiste sisSltSM yhtS aikaa vapaita karboksyyliryhmiS ja va- ___.- - τ—: 34 paita aminoryhmia, voi se olla sisaisena suolana.

Riippuen aina tyoskentelytavasta saadaan keksinnon mukaiset yhdisteet vapaassa muodossa, happoadditiosuolojen muodossa tai 5 suoloina emMsten kanssa. Happoadditiosuoloista ja emasten kanssa saaduista suoloista voidaan vapaa yhdiste saada sinSnså tunnetulla tavalla, esimerkiksi sååtSmålia pH-arvo isoelektri-seen pisteeseen. Vapaasta yhdisteestS voidaan puolestaan saada reaktioilla happojen tai emasten kanssa, esim. sellaisten 10 kanssa, jotka muodostavat edella mainittuja suoloja, ja haih-duttamalla tai lyofilisoimalla terapeuttisesti hyvaksyttavia happoadditiosuoloja tai suoloja emasten kanssa.

Desulfatohirudiinin monoklonaaliset vasta-aineet ia tallaisia 15 vasta-aineita sisaltavSt testioakkaukset

Vasta-aineiden ominaisuudella, sitoutua spesifisiin antigee-neihin on kehon ulkopuolella kayttoS kvalitatiivisissa ja kvantitatiivisissa maårityksissM (immunomaaritykset) ja anti-20 geenien puhdistamisessa (immunoaffiniteettikromatografia).

Immunisoitujen elainten seerumi sisåltaå tavallisesti useita erilaisia vasta-aineita, jotka reagoivat saman antigeenin eri kiinnittymiskohtien kanssa erilaisella affiniteetilla, lisaksi kuitenkin myos vasta-aineita muille antigeeneille, jotka hei-25 jastavat yksilon aikaisempia kokemuksia. Vasta-aineiden menes-tyksellinen kåytto antigeenien maarityksessa ja puhdistuksessa vaatii kuitenkin korkeaa spesifisyytta ja toistettavuutta.

Homogeenisia vasta-aineita, jotka tayttavåt nama vaatimukset, 30 on saatu Kohlerin ja Milsteinin (17) esittamallå hybridooma-tekniikalla. Periaatteessa tekniikka perustuu siihen, etta immunisoitujen elainten vasta-aineita erittavåt B-lymfosyytit, esim. pernasta saadut, liitetSSn ("fuusioidaan”) tuumorisolui-hin. Muodostuneissa hybridooma-soluissa yhdistyy kyky lisSSn-35 tyS jakautumalla rajattomasti kykyyn tuottaa ja erittaa vas-ta-ainetta samantyyppisenM. ViljelemSllM selektiivisessa ela-tusaineessa, jossa fuusioitumattomat tuumorisolut kuolevat, 90787 35 mutta hybridooma-solut lisSMntyvat ja sopivilla manipulaa-tioilla voidaan saada klooneja, t.s. solupopulaatioita, jotka polveutuvat yhdestS ainoasta hybridooma-solusta ja ovat ge-neettisesti identtisiS, nåitS voidaan viljella ja solujen 5 tuottamat monoklonaaliset vasta-aineet voidaan eriståå.

Tassa kuvataan mySs desulfatohirudiinin ja hirudiinin mono-klonaalisia vasta-aineita, hybridooma-soluja, jotka tuottavat tållaisia vasta-aineita, ja menetelmS niiden valmistamiseksi.

10 Edullisia ovat hybridooma-solulinjat ja nSiden erittamSt xno-noklonaaliset vasta-aineet, jotka reagoivat spesifisesti desulfatohirudiinin tai hirudiinin kanssa. Desulfatohirudiini ja hirudiinin monoklonaalisten vasta-aineiden valmistusmenetel-målle on tunnusomaista, etta hiiret immunisoidaan desulfatohi-15 rudiinilla tai hirudiinilla, nSin immunisoitujen elainten /3-1-ymfosyytit fuusioidaan myeloomasoluihin, muodostuneet hybridooma-solut kloonataan, jonka jMlkeen viljellaån in vitro tai injektoimalla hiiriin ja viljelmSstM eristetMan vasta-aineet.

20 Tassa kuvataan myos nåitM vasta-aineita sisaltåviM immuno- affiniteettikromatografiapylvaita ja immunomaarityksiin tar-koitettuja testipakkauksia.

Tassa menetelmassa hiiret, esim. Balb/c-hiiret immunisoidaan 25 sinansM tunnetulla tavalla. YllattåvallM tavalla immunisointi onnistuu, vaikka desulfatohirudiini ja hirudiini ovat suhteel-lisen pienia proteiinimolekyylejå. ErMassa edullisessa suori-tusmuodossa desulfatohirudiinia tai hirudiinia injektoidaan noin viikoittain.tai myos pidemmin aikavalein useamman viikon 30 ajan, esimerkiksi 5-12 viikon ajan, kunnes on muodostunut riittåva maara vasta-ainetta tuottavia /3-lymfosyytteja.

Immunisoitujen hiirten Ø-lymbosyyttejå sisaltaviS elimia, esim. pernasoluja, otetaan talteen ja fuusioidaan sellaisten 35 myeloomasolujen kanssa, jotka sisåltåmånsM mutaation vuoksi eivat kasva selektiivisellS elatusaineella. Tållaiset myeloo-masolut ovat tunnettuja ja niita ovat esimerkiksi X63-Ag8, 36 X63-Ag8.5.3, MPC-11, NSl-Ag4/l, MOPC-21 NS/1 tai SP 2/0. Edul-lisessa suoritusmuodossa immunisoidun hiiren pernasolut fuu-sioidaan solulinjan X63-Ag8.6.5.3 myeloomasolujen kanssa.

5 Fuusio suoritetaan sinansa tunnetulla menetelma11a sekoitta-malla jS-lymfosyytit ja myeloomasolut, samalla lisåten solufuu-sioainetta, kuten polyetyleeniglykolia, Sendai-virusta, kal-siumkloridia tai lysolesitiiniå. Mieluimmin fuusioidaan poly-etyleeniglykolin låsnåollessa, esimerkiksi sellaisen, jonka 10 molekyylipaino on 1000 - 4000. Fuusion jålkeen muodostunutta hybridia viljellaan sinansa tunnetun menetelman mukaisesti selektiivisesså elatusaineessa, jota on taydennetty hypoksan-tiinilla, aminopteriinillå ja tymidiinilla (HAT-elatusaine). Fuusioitumattomat myeloomasolut eivat kykene kasvamaan tåsså 15 elatusaineessa ja kuolevat kuten myos normaalit lymfosyytit.

Hybridooma-viljelmien liuokset voidaan sinansa tunnetulla me-netelmallå testata spesifisten vasta-aineiden pitoisuuden suh-teen, esimerkiksi radio-immunomSaritykselia tai agglutinoin-20 nilla. Talloin todetaan yllSttSvallS tavalla, ettå kuvatulla menetelmållS voidaan saada hybridooma-soluja, jotka esittåvåt desulfatohirudiinin tai hirudiinin suhteen spesifisiå vasta-aineita.

25 Ne hybridooma-solut, jotka tuottavat halutun spesifisyyden omaavia vasta-aineita, valitaan fuusiolla tuotetun seoksen erilaisista hybridooma-soluista kloonaamalla. Tassa kaytetSan apuna sinansa tunnettua menetelmåå, jota nimitetaan "rajoi-ttavaksi laimentamiseksi" ("limiting dilution") ja jossa teh-30 dåån viljelmåt lahtien yhdesta ainoasta kasvavasta solusta.

Massatuotantoa vårten ne hybridooma-solukloonit, jotka tuottavat halutun spesifisyyden omaavia vasta-aineita, viljellSan joko sinånså tunnetussa elatusaineessa in vitro tai injek-35 toidaan hiiriin solujen lisaSntymiseksi. Edullisessa suoritusmuodossa hybridooma-solut injektoidaan Pristanilla etukSteen kasiteltyihin hiiriin, otetaan talteen askites-neste ja sii-

II

37 90787 tå saostamalla ammoniumsulfaattiliuoksella eristetåån vasta-aine.

Nåiden hybridooma-solujen avulla saatuja desulfatohirudiini-5 ja hirudiini-spesifisiå vasta-aineita voidaan kåyttåå sinånså tunnetulla tavalla immuno-affiniteettikromatografiapylvåiden valmistuksessa. Erååsså edullisessa suoritusmuodossa sopivaan kantoaineeseen (suspendoitu puskuriliuokseen) lisåtåån vasta-aine-liuos, sitoutumattomat osat peståån pois ja kantoaineen 10 vapaat kohdat tukitaan.

Hybridooma-solujen avulla valmistettuja desulfatohirudiini- ja hirudiini-spesifisiå vasta-aineita voidaan kåyttåå sinånså tunnetulla tavalla testipakkauksien valmistamiseksi. Nåmå tes-15 tipakkaukset voivat perustua erilaisiin menetelmiin, esimer-kiksi radio-immunodiffuusioon, latex-agglutinointiin, tåplå-testeihin, kompetitiiviseen tai ,,sandwich,,-radio-immunomååri-tykseen, entsyymi-immunomååritykseen, immunofluoresenssiin tai immunokemiallisiin entsyymitesteihin. Tållaiset pakkaukset 20 voivat tavallisten vasta-aineiden lisåksi sisåltåå erilaista alkuperåå olevia vasta-ainekonjugaatteja entsyymien tai fluo-jresenssikantoaineiden kanssa, lisåksi radioaktiivisella iso-toopilla kuten J12S leimattua desulfatohirudiinia tai hirudii-nia, tai konjugoituna entsyymien, esimerkiksi piparjuuriperok-25 sidaasin tai alkalisen fosfataasin kanssa, myos entsyymisubs-traatteja, sopivia puskureita, geelejå, lateksia, poly-styreeniå tai muita tåyteaineita ja kantoaineita.

Farmaseuttiset valmisteet 30 Tåmån keksinnon mukaisesti saatava desulfatohirudiini omaa arvokkaita farmakologisia ominaisuuksia ja sitå voidaan, kuten juotikkaista uutettua hirudiinia, kåyttåå ennaltaehkåisevåsti tai erityisesti terapeuttisesti.

Keksinnon mukaisesti valmistettavat desulfatohirudiini-yhdis-teet osoittautuvat biologisen aktiivisuutensa suhteen olevan 35 38 ainakin ekvivalentteja luonnolliseen hirudiiniin verrattaessa. Niinpa esimerkiksi desulfatohirudiinin K^arvo on noin ίο" M. Desulfatohirudiini on tåysin spesifinen trombiinille eika osoita minkSanlaista vuorovaikutusta veren hyytymissysteemin 5 muiden proteinaasien kanssa. Aktiivinen toksisuus on lisaksi erittain vahainen; niinpM rotalla annoksella esim. 1 g/kg ei todeta minkaanlaisia toksisia vaikutuksia. Sen lisMksi ei ha-vaita minkaanlaisia hypersensitiivisia tai allergisia reak-tioita.

10

Keksinnon mukaista uutta desulfatohirudiini-yhdistetta voidaan siten kayttaa samalla tavalla kuin luonnollista hirudiinia tromboosien ja tromboembolian hoidossa, mukaanluettuna leik-kausten jaikeisten tromboosien ennaltaehkaisy, niita voidaan 15 kayttaa akuuttiin shokki-hoitoon (esim. septisessa tai polytraumaattisessa shokissa), hyytymisaktiivisten aineiden lisaantyneesta kaytosta johtuvien veren hyytymishairoiden hoidossa, veridialyysissa, verierotuksessa ja "kehon ulkopuoli-sessa verenkierrossa" eli kaytettaessa sydan-keuhkokonetta 20 sydanleikkausten yhteydessM.

Desulfatohirudiinista voidaan valmistaa farmaseuttisia koos-tumuksia, jotka sisåltavåt desulfatohirudiinia tai sen farma-seuttisesti hyvaksyttavaa suolaa, mahdollisesti yhdessa far-25 maseuttisesti hyvaksyttavien kanto- ja/tai apuaineiden kanssa.

Naita koostumuksia voidaan kayttaa erityisesti edella maini-tuissa indikaatioissa, kun ne annostetaan parenteraalisesti, kuten suonensisaisesti, ihonsisaisesti, ihonalaisesti tai 30 lihaksensisaisesti tai pinnallisesti.

Desulfatohirudiinia ja sita sisåltåvia farmaseuttisia koostumuksia voidaan kayttaa ihmis- ja eiainkehojen ennaltaehkaise-vassa ja terapeuttisessa hoidossa, erityisesti edelia maini-35 tuissa sairauksissa, ensi sijassa veren hyytymisen estamiseksi ihmis- ja eiainkehon sisaiia ja ulkopuolella.

li 90787 39

Annostus riippuu ensi sijassa spesifisestå annostusmuodosta ja hoidon tai ennaltaehkåisyn tarkoituksesta. Yksittåisannosten suuruus sekå annostuskaavio voidaan parhaiten måårittåå kul-loisenkin sairaustapauksen yksilollisten vaatimusten perus-5 teella; tåhån tarvittavat menetelmåt relevanttien veriarvojen m&årittåmiseksi ovat alan ammattimiehelle tunnettuja. Taval-lisesti keksinndn mukaisten yhdisteiden injektio terapeutti-sesti tehokkaana måårånå on annosalueella noin 0,005 - noin 0,1 mg/kehon painokilo. Edullinen alue on noin 0,01 - noin 10 0,05 mg/kehon painokilo. Annostus tapahtuu suonensisåisesti, lihaksensisåisesti tai ihonalaisesti injektoimalla. Vastaavas-ti sisåltåvåt parenteraaliseen annostukseen tarkoitetut far-maseuttiset valmisteet yksikkoannosmuodossa, annostustavasta riippuen, annosta kohti noin 0,4 - noin 7,5 mg keksinnon mu-15 kaista yhdistettå. Aktiiviaineen lisMksi nSma farmaseuttiset koostumukset sisåltåvåt tavallisesti vielå puskurin, esim. fosfaattipuskurin, jonka pH-arvon tulee olla noin 3,5-7, ja myos natriumkloridia, mannitolia tai sorbitolia isotonian såå-tåmiseksi. Ne voivat olla pakastekuivatussa tai liuotetussa 20 muodossa, jolloin liuokset voivat sisåltaa edullisesti anti-bakteerisesti vaikuttavan såilontåaineen, esim. 0,2 - 0,3 % 4-hydroksibentsoehappometyyliesteriå tai -etyyliesteria.

Topikaaliseen kåyttodn tarkoitettu valmiste voi olla vesipi-25 toisena liuoksena, lotionina tai geelinå, oljymåisenå liuok-sena tai suspensiona tai rasvaa sisåltåvånå tai erityisesti emulsiosalvana. Vesipitoisen liuoksen muodossa oleva valmiste saadaan esimerkiksi siten, ettå keksinnon mukainen aktiiviaine tai sen terapeuttisesti hyvåksyttåvå suola liuotetaan vesipi-30 toiseen puskuriliuokseen, jonka pH on 4 - 6,5, ja haluttaessa lisåtåån jokin muu aktiiviaine, esim. anti-inflammatorinen aine ja/tai polymeerinen tartunta-aine, esim. polyvinyylipyr-rolidoni ja/tai såilontåaine. Aktiiviaineen pitoisuus nousee noin 0,1 - noin 1,5 mg:aan, mieluimmin 0,25 - 1,0 mg:aan 10 35 ml:ssa liuosta tai 10 g:ssa geeliå.

Oljymåinen annostusmuoto topikaaliseen annostukseen sisåltåå 40 esimerkiksi keksinnon mukaisen aktiiviaineen tai sen terapeut-tisesti hyvaksyttavan suolan suspendoituna oljyyn, mahdolli-sesti saxnalla lisåtåan turvottavia aineita, kuten aluminium-stearaattia ja/tai pinta-aktiivisia aineita (tensidejS), joi-5 den HBL-arvo ("hydrophilic-lipophilic-balance") on alle 10, kuten useampiarvoisten alkoholien rasvahappomonoestereitå, esim. glyseriinimonostearaattia, sorbitaanimonolauraattia, sorbitaanimonostearaattia tai sorbitaanimono-oleaattia. Ras-vapitoinen salva saadaan esim. suspendoimalla keksinndn mu-10 kainen aktiiviaine tai sen suola siveltavaan rasvaperusainee-seen, mahdollisesti samalla lisåtåån tensidiå, jonka HLB-arvo on alle 10. Emulsiosalva saadaan hiertamalla keksinnon mukaisen aktiiviaineen tai sen suolan vesipitoista liuosta pehmeas-sa, siveltavassa rasvaperusaineessa, samalla lisStSan tensi-15 dia, jonka HLB-arvo on alle 10. Kaikki nåma topikaaliset an-nostusmuodot voivat sisSltaa myos sailontaaineita. Aktiiviaineen pitoisuus nousee noin 0,1 - noin 1,5 mgraan, mieluim-min 0,25 - 1,0 mg:aan noin 10 g:ssa perusainetta.

20 Edellå kuvattujen ja niiden kanssa analogisten farmaseuttis-ten koostumusten, jotka on tarkoitettu ihmisen tai nisåkkaan kehon suoraan laakinnalliseen kayttoon, lisaksi esitetaan far-maseuttisia koostumuksia ja valmisteita, joita kaytetaan ela-van ihmisen tai nisakkSSn kehon ulkopuolella laakinnallisessa 25 kåytossa. Tållaisia koostumuksia ja valmisteita kaytetaan ensi sijassa hyytymistå estMvSnå lisåaineena veressa, joka kiertaa kehon ulkopuolella tai jota kasitellaan kehon ulkopuolella (esim. kehon ulkopuolinen verenkierto tai dialyysi keinomu-nuaisessa), sailytetaan tai modifioidaan (esim. veren erot-30 taminen). Koostumukseltaan ovat tallaiset valmisteet, kuten varastointiliuokset tai myos yksikkoannosmuodossa olevat valmisteet samankaltaisia kuin ylla kuvatut injektointivalmis-teet; tarkoituksenmukaisesti sovitetaan aktiiviainemaara tai vastaavasti -pitoisuus kåsiteltåvån veren tilavuuden mukaan, 35 tai tarkemmin sanottuna, sen sisaltaman trombiinimåaran mukaan. Talloin on huomattava, etta keksinnon mukaiset aktiivi-aineet (vapaassa muodossa) inaktivoivat taydellisesti noin 90787 41 5-kertaisen painomååran trombiinia, ovat myos suurempina maa-rina fysiologisesti harmittomia ja erittyvat kiertavåstå ve-resta suurinakin pitoisuuksina hyvin nopeasti, eli ei ole mi-taan vaaraa yliannostuksesta, mybskaan esim. verensiirroissa.

5 Kulloinkin tietyn tarkoituksen mukaan on sopiva annos noin 0,01 - noin 1,0 mg aktiiviainetta/litra verta, jolloin ylara-jan saa viela ylittaa ilman vaaraa.

Erityisesti keksinto koskee esimerkeissa kuvattua menetel-10 maa desulfatohirudiinin valmistamiseksi transformoituneiden • mikro-organismien avulla.

42

Seuraavat esimerkit ja merkinnat kuvaavat keksintoa, ne ei-vat kuitenkaan rajoita keksinnon piiria millåån tapaa.

Kokeellinen osa 5

Esimerkeissa kaytetyilla lyhenteilla on seuraavat merkitykset: TNE liuos, joka sisaltaa 100 xnM NaCl, 50 mM Tris.HCl pH 7,5 ja 5 mM EDTA, 10 SDS natriumdodekyylisulfaatti EDTA ety1eenidiami initetraetikkahappo DTT 1,4-ditiotreitoli (l,4-dimerkapto-2,3-butaanidio- li) BSA naudan seerumialbumiini 15 EtBr etidiumbromidi

Tris tris-(hydroksimetyyli)-aminometaani

Tris.HCl tris'in monohydrokloridi 20 Esimerkki 1: Suoiatun nukleosidi-polvstvreenihartsin valmis- tus mmt-o-t-o-coch2ch2co-nhch2-^ ^-(P)

Seokseen, jossa on 2,57 g (5 mmoolia) 5'-(4-metoksitrityyli-tymidiinia (MMT-O-T-OH) 20 ml:ssa abs. pyridiinia, lisatMan 750 mg meripihkahappoanhydridiS ja 910 mg 4-dimetyyliaminopy-30 ridiinia ja seoksen annetaan seista huoneen ISmpotilassa 16

II

90787 43 tuntia. Pyridiiniliuos haihdutetaan, jonka jalkeen jåannos liuotetaan 200 ml:aan etikkahappoetyyliesteria, ravistellaan kaksi kertaa, kummallakin kertaa 200 ml:11a 0,1 M fosfaatti-puskuria, samalla lisåtåån 10 ml kyllåstettyå keittosuolaliuos-5 ta, pestaån vielå kerran kyllåstetyllå keittosuolaliuoksella, kuivataan, haihdutetaan ja lisåtåån tipoittain heksaania. Saostunut tuote erotetaan ja hierretåån kaksi kertaa eetterin kanssa, sen jålkeen liuotetaan 300 ml:aan etikkahappoetyyliesteria ja ravistellaan 0°C:ssa 180 ml:11a 0,1 M kaliumvety-10 sulfaattia, jonka pH 2,5. Etikkaesteriliuos pestaån kaksi kertaa vedellå, jonka jalkeen se kuivataan natriumsulfaatil-la, suodatetaan, lisataan 0,5 ml pyridiiniå, haihdutetaan ja laimennetaan tipoittain heksaanilla.

Saostunut meripihkahappojohdannainen suodatetaan.

15 1,0 g tåta yhdistetta yhdessa 190 mg:n kanssa N-hydroksi- sukkinimidia liuotetaan 4 ml:aan etikkahappoetyyliesteria ja 2 ml:aan dimetyyliformamidia ja 0°C:ssa lisMtaan 370 mg N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidia. Seosta seisotetaan yon yli jSåkaapissa, jonka jalkeen saostunut N,N1-disykloheksyylikar-20 bamidi suodatetaan pois, suodos laimennetaan etikkahappoetyy-liesterillå, uutetaan kylmalla 0,1 M natriumvetykarbonaatil-la ja vedellS, kuivataan ja haihdutetaan kuiviin tyhjossa. Jaannos kromatografoidaan piihappogeelillS, eluointiaineena etikkahappoetyyliesteri. DC: 0,45 dikloorimetaani-metano- 25 lissS (9:1) .

100 mg tSta N-sukkinimidoyyli-meripihkahappoesteriS hammenne-taan 1 g:n kanssa aminometyyli-polystyreenia (amiinipitoisuus 110 ymoolia/g) 2 ml:ssa dikloorimetaania ja 4 ml:ssa dimetyyliformamidia 20 tunnin ajan. Polymeerihartsi suodatetaan ja 30 pestaån dimetyylformamidilla, metanolilla, dikloorimetaanil-la ja metanolilla. Kuivauksen jalkeen reagoimattomat amino-ryhmåt asetyloidaan siten, ettå hartsia håmmennetaån 6 ml:ssa pyridiiniå 1 ml:n kanssa etikkahappoanhydridiå ja 100 mg:n 44 kanssa 4-dimetyyliaminopyridiiniå 30 minuutin ajan. Polymee-rihartsi peståån dikloorimetaanilla, dimetyyliformamidilla, metanolilla ja dikloorimetaanilla ja kuivataan vakiopainoon. Spektroskooppinen metoksitrityyli (MMT)-mSSritys osoittaa 5 lisSyksen arvoksi 57 ymoolia/g.

Esimerkki 2;

Esimerkin 1 mukaisesti valmistetaan seuraava suojattu nukleo-sidi-polystyreeni-hartsi: MMT-0-Glb-0C0CH2CH2C0NHCH2—^ ^-(P) 10 5’-(4-metoksitrityyli)-N-isobutyryyli-deoksiguanosiinista, lisSyksen arvo 32 ymoolia/g.

Esimerkki 3; Trinukleotidin synteesi

MMT—0--T-0 P—0--CH2CHzCN

K> _._J»_ a) Dinukleotidin synteesi; 7,73 g (15 mmoolia) 5(4-metoksitrityyli)-tymidiinia (MMT-15 O-T-OH) haihdutetaan kaksi kertaa abs. pyridiinin kanssa.

Jåånnos liuotetaan 20 mlraan abs. tetrahydrofuraania ja li-sataån tipoittain 80 mlraan 2-kloorifenyyli-di-(1-bentsotri-atsolyyli)-fosfaatin 0,2 M liuosta tetrahydrofuraanissa, sa-malla hSmmentaen ja kosteudelta suojaten, ja reaktioseosta 20 hammennetaSn 1 tunti huoneen ISmpdtilassa. 2-kloorifenyyli-1-bentsotriatsolyyli-51-(4-metoksitrityyli)-tymidiini-S*-fosfaatin saatu liuos jaetaan kolmeen osaan.

11 90787 45 a) Hydrolyysi trietyyliammonium-2-kloorifenyyli-5'- (4-me-toksitrityyli)-tymidiini-31-fosfaatiksi:

Yhteen kolmasosaan edellå saatua 2-kloorifenyyli-1-bentso-triatsolyyli-5(4-metoksitrityyli)-tymidiini-3'-fosfaatti-5 liuosta lisåtåån, samalla jååhdyttåen, 100 ml 0,5 M trietyy-liammoniumbikarbonaattia. 15 minuutin kuluttua uutetaan di-kloorimetaanilla. Dikloorimetaaniliuos peståan vedella, haih-dutetaan ja siihen lisåtåån tipoittain petrolieetteria.

Saatu sakka imusuodatetaan, pestaan eetteri-petrolieetteril-10 lå 1:1 ja kuivataan tyhjosså.

DC : R^ 0,35 dikloorimetaani-metanoli-vedesså (75:22:3).

β) Esterointi 2-syanoetyyli-2-kloorifenyyli-5'-(4-metoksitrityyli) -tymidiini-3'-fosfaatti ja 4-metoksitrityyli-suojaryhmHn poislohkaisu 15 Yhteen kolmasosaan edelia saatua 2-kloorifenyyli-1-bentsotri-atsolyyli-51 -(4-metoksitrityyli)-tymidiini-fosfaattiliuosta lisåtaan 1,3 ml 2-syanoetanolia ja 2 ml pyridiinia. Seoksen annetaan olla yon yli huoneen lampotilassa. Liuotin tisla-taan pois tyhjossa ja jaannos liuotetaan etikkahappoetyyli-20 esteriin ja ravistellaan toistuvasti 0,1 M fosfaattipuskuril-la pH 7 ja vedella. Orgaaninen faasi kuivataan, haihdutetaan ja lisataån tipoittain heksaaniin. Sakka suodatetaan, liuotetaan 50 ml:aan dikloorimetaani-metanolia 7:3 ja 0°C:ssa lisåtaan liuos, jossa on 3,8 g p-tolueenisulfonihappomono-25 hydraattia 75 ml:ssa dikloorimetaani-metanolia 7:3. Kahden tunnin kuluttua reaktioliuos laimennetaan dikloorimetaanilla ja ravistellaan kylmMlla natriumvetykarbonaattiliuoksella. Orgaaninen faasi erotetaan ja siihen lisataån heksaania. Saostunut 2-syanoetyyli-2-kloorifenyyli-tymidiini-3'-fos-30 faatti kromatografoidaan piihappogeelillå, eluointiaineena dikloorimetaani-metanoli 96:4. DC: R^ 0,45 dikloorimetaani-metanolissa (9:1).

46 γ) Kondensaatio 51-(4-metoksitrityyli)-3'-syanoetyyli)-bis-tymidiini-dinukleotidiksi: 2,2 g 2-syanoetyyli-2-kloorifenyyli-tymidiini-3'-fosfaattia, josta vesi on poistettu haihduttamalla kaksi kertaa abs. py-5 ridiinin kanssa, liuotetaan 20 ml:aan abs. tetrahydrofuraa- nia ja lisataan jaljella olevaan 2-kloorifenyyli-1-bentsotri-atsolyyli-5(4-metoksitrityyli)-tymidiini-3'-fosfaattiliuok-seen. 18 tunnin kuluttua huoneen lampdtilassa, lisåtSan reak-tioliuokseen, samalla jailla jååhdyttåen, 10 ml vettS ja 200 10 ml etikkahappoetyyliesteria. Orgaaninen faasi peståån tois-tuvasti natriumvetykarbonaatilla ja vedella, kuivataan nat-riumsulfaatilla ja haihdutetaan pieneen tilavuuteen. Fosfaat-ti-osa ja 5'- tai 3'-paassa suojattu dinukleotidi saostetaan lisaamalla tipoittain eetteri-heksaania 1:1. DC: 0,48 15 dikloorimetaani-metanolissa (9:1).

b) Trinukleotidin synteesi 1,17 g (1 mmoolia) edella kuvattua, taysin suojattua dinukleo-tidia liuotetaan 30 ml:aan dikloorimetaani-metanolia 7:3 ja tahan lisataan, samalla jailla jåahdyttaen, liuos, jossa 20 on 1,9 g p-tolueenisulfonihappomonohydraattia 20 ml:ssa dikloorimetaani-metanolia 7:3. Kahden tunnin kuluttua lisatMan jååkylmåa natriumvetykarbonaattiliuosta ja uutetaan dikloori-metaanilla. Orgaaninen faasi kuivataan, haihdutetaan ja lisataan tipoittain heksaaniin. Saostunut raaka dinukleotidi, 25 jossa on vapaa 51-hydroksiryhma, kromatografoidaan piihappo-geelillå eluointiaineena 2-8-prosenttinen metanolin gradient-ti dikloorimetaanissa. DC: 0,33 dikloorimetaani-metanolis sa (9:1) .

850 mg tata 5'-hydroksi-dinukleotidia ja 1,06 g trietyyli-30. ammonium-2-kloorifenyyli-5'-(4-metoksitrityyli)-tymidiini-3'-fosfaattia (vrt. kohta a) a)) haihdutetaan kaksi kertaa

II

90787 47 pyridiinin kanssa, sen jSlkeen liuotetaan 10 ml:aan abs. py-ridiinia ja lisåtSån 560 mg 1 -mesityleenisulfonyyli-3-nitro- 1,2,4-triatsolia (MSNT). Kahden tunnin kuluttua lisStSan 2 ml jaakylmaå vettS ja siitS tunnin kuluttua uutetaan dikloori-5 metaanilla. Orgaaninen faasi pestSan kyllastetyllS natriumve-tykarbonaatilla ja vedella, kuivataan, haihdutetaan ja lisa-taån eetteria. Saostunut trinukleotidi puhdistetaan kromato-grafoimalla piihappogeelillS. 0,45 dikloorimetaanimetano- lissa (9:1) .

10 Esimerkki 4;

Esimerkin 3 mukaisesti valmistetaan seuraavat, suojatut tri-nukleotidit, joiden yleinen kaava on

MOT—0—S1—0— '—0—B!—0—P—0—B1—0—P-OCHjCHjCN

l<*"> l.f> \*/ ·/ ,·· ci ci ci 12 3 12 3 joka lyhennetSan B B B . Nukleosideille B , B , B kaytetaan seuraavia lyhenteitå: A = N-bentsoyyli-deoksiadenosiini C = N-bentsoyyli-deoksisytidiini G = N-isobutyryyli-deoksiguanosiini T = tymidiini 48

Yhdiste Rf1 Yhdiste Rfa* TTT 0,45 ATG 0,48 TTC 0,55 ACT 0,53 TCT 0,46 ACC 0,48 TAC 0,56 ATT 0,55 TGC 0,44 ACA 0,53 TAG 0,60 AAC 0,46 TGT 0,42 AAA 0,51 TGA 0,44 AGT 0,45 CTT 0,53 AGG 0,38 CTG 0,46 GTT 0,45 CCT 0,45 GTC 0,44 CCC 0,59 GTG 0,35 CCG 0,47 GCA 0,49 CCA 0,51 GCG 0,48 CAT 0,55 GAT 0,44 CAC 0,51 GAC 0,48 CGC 0,46 GAG 0,48 CGA 0,38 GAA 0,50 CAG 0,44 GGC 0,42 CGG 0,38 GGT 0,46 CGT 0,49 GGG 0,35 GGA 0,44

Ohutkerroskromatogrammi piihappogeelilla, eluointiaineena dikloorimetaani-metanoli 9:1.

90787 49

Esimerkkl 5: 67 emSksen pituisen DNA-jakson syntetisointi, alkaen DNA-såikeen emSksesta n;p 96 emakseen n:o 162 (96/67) a) Trinukleotidin 2-syaanietyylisuojaryhman poislohkaisu 5 10 ymoolia trinukleotidia esimerkistM 3 tai 4 liuotetaan, samalla kosteudelta suojaten, 60 yl:aan pyridiini-asetonit-riili-trietyyliamiinia 1:1:1. Yhden tunnin kuluttua huoneen låmpStilassa lisStaMn tipoittain 0,7 ml peroksidivapaata eet-teriå ja sakka sentrifugoidaan pois. Raaka trietyyliammonium-10 suola liuotetaan 50 yl:aan pyridiinia ja saostetaan viela kerran 0,5 ml:11a eetteria, sentrifugoidaan ja kuivataan 15 tuntia suurtyhjossS.

b) Osittain suojatun trinukleotidin liittaminen polystyree-nihartsiin sidottuun oligonukleotidiketjuun: 15 Kaikki toimenpiteet suoritetaan kosteudelta suojaten 220 yl:n reaktioastiassa ja mikroprosessoriohjattua liuotin- ja rea-genssilisMysta kayttaen. 13 mg (0,74 ymoolia) tymiini-poly-styreenihartsia (esimerkki 1) laitetaan reaktioastiaan ja suoritetaan seuraavat toimenpiteet: 20 1. metyleenikloridia, 2 ml/min., 4 min.

2. metyleenikloridi-isopropanolia (85:15), 2 ml/min., 2 min.

3. sinkkibromidia 1 M ja 1,2,4-triatsolia 0,02 M metyleeni-kloridi-isopropanolissa (85:15), 2 ml/min., 2-3,5 min.

4. metyleenikloridi-isopropanolia (85:15), 2 ml/min., 4 min.

25 5. trietyyliammoniumasetaattia 0,5 M DMF:sså, 2 ml/min., 5 min.

6. molekyyliseulalla kuivattua pyridiiniå, 2 ml/min., 3 min.

7. tetrahydrofuraania (peroksidivapaata, molekyyliseulalla kuivattua), 2 ml/min., 3 min.

8. typpivirta, 10 min.

30 9. injektoidaan 10 ymoolia trinukleotidia GTC (trimetyyli- 50 ammoniumsuola vaiheesta a) ) ja 8,9 nig (30 ymoolia) 1-mesityleenisulfonyyli-3-nitro-1,2,4-triatsolia (MSNT) liuotettuna 150 yl:aan pyridiinia 10.45°C, 20 min.

5 11.pyridiinia, 2 ml/min., 4 min.

12. asetanhydridiS 5 % ja 4-dimetyyliaminopyridiiniå 2,5 % pyridiinissa, 2 ml/min., 4 min.

13. pyridiinia, 2 ml/min., 4 min.

14. pyridiini-isopropanolia (1:1), 2 ml/min., 3 min.

10 Kaikki 14 vaihetta toistetaan 21 kertaa, jolloin 9. vaiheessa GTC:n sijasta lisataan kulloinkin seuraavat trinukleotidit trietyyliammoniumsuolojensa muodossa (vaihe a)) annetussa jarjestyksesså: GCA, ACC, GAA, CCC, TAC, AGG, TGA, CGG, TAC, CGT, CCA, AAA, AAA, TGA, CGG, TGA, TTC, GGG, CCT, CAT. Kes-15 kimaarainen yhteenliittymissaanto on 97%. Lopputuotteella on seuraava rakenne:

HMT-CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAG

TCT-polystyreeni c) DNA-fragmentin irrottaminen kantoaineesta ja suojaryh-mien poislohkaisu: 40,0 mg (noin 0,60 ymoolia) DNA-synteesihartsia 96/67 20 pidetaan 66 mg:n (0,40 mmoolia) kanssa o-nitrobentsaldok- siimia ja 50 yl:n (0,40 mmoolia) kanssa 1,1,3,3-tetrametyy-liguanidiinia 400 yl:ssa 95-%:sta pyridiinia 3 tunnin ajan 50°C:ssa ja 12 tunnin ajan huoneen lampotilassa. Pyridiini poistetaan typella, jonka jalkeen jaånnokseen lisatåan 1,6 25 ml vesipitoista ammoniakkia (33 %) ja pidetSan suljetussa astiassa 24 tuntia 50°C:ssa.

Erotetusta, nestemMisestS faasista poistetaan ammoniakki tyhjossa ja pestaan 3 kertaa, joka kerta 3 ml:11a peroksidi-vapaata dietyylieetteriå. Pienempimolekyyliset aineosat 30 erotetaan Biogel P6-pylvSSllS (100-200 mesh, 3 x 66 cm, 0,01

II

90787 51 molaarinen trimetyyliammoniumvetykarbonaatti pH 7,5, 1,5 ml/ min.), jonka jSlkeen eristetåån 285 OD:tS (260 nm) DNA.

YhteensS 60 OD:t3 erotetaan HPLC-pylvSMssa (PRP-1/Hamilton, 250 x 4,6 nm). Gradientti (liuos A: 0,05 M trietyyliammonium-5 asetaatti pH 7,0; liuos B: liuos Arasetonitriili 1:1): 30 % B:ta A:ssa —> 60 % B:ta A:ssa 20 minuutissa 50°C:ssa ja 2 ml/min. Lipofiilinen paapiikki (retentioaika noin 14 mi-nuuttia) yhdistetaMn, konsentroidaan DE52-selluloosa - (Whatman) pylvåasså, eluoidaan ja saostetaan etanolilla. 4-metoksitrityy-10 lisuojaryhman poislohkaisemiseksi sakka liuotetaan 50 yl:aan etikkahappo/vettå (4:1) ja pidetaan 45 minuuttia huoneen låm-pbtilassa. Reaktiotuote lyofilisoidaan, saostetaan etanolilla ja puhdistamista vårten erotetaan elektroforeettisesti 8-prosenttisella polyakryyliamidigeelilla (7 M karbamidi).

15 Haluttuja DNA-kokoja vastaava kaista leikataan irti ja tuote elektroeluoidaan konsentroidaan DE52 selluloosalla ja DNA 96/67, jonka rakenne on 5' -CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGAAGCTACCCCGAAACCG CAGTCT-3' saostetaan etanolilla.

Esimerkki 6: Esimerkin 5 mukaisesti valmistetaan seuraavat 20 DNA-fragmentit (5'-3'): 1/58 CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGT 46/64 komplementaarinen CAGAACCCAGGATGCATTTGTTACCCTGACCGCAAACGTTAGAACCTTCGCACAGGCACAGGTT 154/64 komplementaarinen

CAGGATCCTACTGCAGGTATTCTTCCGGGATTTCTTCGAAGTCACCGTCGTTGTGAGACTGCGG

52

Esinterkki 7: Fragmenttien 1/58/ 46/64 komplementaarinen, 96/67 ja 154/64 komplementaarinen, fosforylointi

Fosforylointi ja radioaktiivinen leimaaminen 5'-paissS tapah-22 tuu (γ- P) ATP:lis ja polynukleotidi-kinaasilla (Boeh-5 ringer) kuten esitetåan viitteessa (18).

Esimerkki 8: Polymerointi kaksoissaikeeksi II (desulfatohiru-diinigeenin osa F^ 50 pmoolia fragmenttia 96/67, kinasoitu, ja 50 pmoolia frag-menttia 154/64, kinasoitu, liuotetaan 24 plraan vettS, liuos 10 kuumennetaan 3 minuutin kuluessa 90°C:seen ja jaahdytetSan 5 minuutin kuluessa 12°C:seen. LisataSn 4 pi endo-R-puskuria (0,1-molaarinen Tris.HCl, pH 7,5, 66 mM MgCl2, 66 mM 8-mer-kaptoetanolia, 0,6 M NaCl), 10 yl deoksinukleosiditrifosfaat- -3 tiseosta (dATP, dCTP, dGTP, TTP, jokainen 2 *10 molaarinen, 15 pH sSSdetSSn NH^tlla arvoon 7,0) ja 2 1 (10 yksikkoa) DNA- polymeraasia I, Klenow-fragmentti (Boehringer), jonka jålkeen inkuboidaan 30 minuutin ajan 12°C:ssa. Reaktio pysaytetaan kuumentamalla 3 minuutin kuluessa 90°C:seen ja seosta saily-tetaan jatkotyoskentelya vårten -80°C:ssa.

20 Vastaavalla tavalla fragmentit 1/58, kinasoitu, ja 46/64, kinasoitu, saatetaan reagoimaan kaksoissMikeeksi I (desulfato-hirudiini-geenin osa F^).

KaksoissSikeiden I ja II rakenteet ovat seuraavat:

Kaksoissaie I

CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGTTC

GACCTTAAGTACCAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTAGACCAGTCTTGGACACGGACACGCTTCCAAG

TAACGTTTGCGGTCAGGGTAACAAATGCATCCTGGGTTCTG

ATTGCAAACGCCAGTCCCATTGTTTACGTAGGACCCAAGAC

li 90787 53

Kaksoissåie II

CATCCTGCGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCTC

GTAGGACCCAAGACTGCCACTTTTTTTGGTCACGCAATGGCCACTTCCATGGGGCTTTGGCGTCAGAG

ACAACGACGGTGACTTCGAAGAAATCCCGGAAGAATACCTGCAGTAGGATCCTG

TGTTGCTGCCACTGAAGCTTCTTTAGGGCCTTCTTATGGACGTCATCCTAGGAC

Desulfatohirudiini-geenin osien ja F2 valmistus on esitet-ty seuraavassa kaaviossa I: 54

Kaavio I; Desulfatohirudiini-geenin ja F^-F2~DNA:n osien ja F2 valmistus 1/58 96/67 --46/64. ---154/64 ♦ 1T4- polynukleotidi- T4- polynukleotidi- kinaasi kinaasi pariutuminen , r pariutuminen ui ii iT_ 111111 j--

IDNA-polymeraasi I IDNA- polymeraasi I

j(Klenov), dNTP:t j(Klenow), dNTP:t , ! I, I II I H » I H 1 I I I I H I I ΪΤΓιΤΓ I I I III I I I I H I III H I I Π I I I ΜΗ t t t t

£coRI EcoRII EcoRII BamHI

osa F^ osa Fj |(alakloonaus) I (alakloonaus)

|ecoR11 4.EC0RII

M ! 111 i 111M I I I I I I I l'l I HI I I II H I I I I II I I iTTTT

t T

RcoRI EcoRII EcoRII BamHI

1 pariutuminen T^-DNA- ligaas i

-, , I I I I I n 1 I.......I I I I I I i I II I H II I I I I I......I I I I H II I I

t t t

EcoRI EcoRII BamHI

Fj-F2_DNA (desulfatohirudiini-geeni)

II

90787 55

Esimerkkl 9; Fragmenttien 1/58, 46/64, kinasoitu, 96/67 kinasoitu ja 154/64 polymerointi ja liittåminen; desulfatohirudiini-geenin valmistus

50 pmoolia kutakin fragmenttia 1/58, 46/64, kinasoitu, 96/67 5 kinasoitu ja 154/64 liuotetaan 48 yl:aan vetta, liuos kuumen-netaan 3 minuutin kuluessa 90°C:seen ja jaåhdytetaån 5 minuu-tin sisallå 12°C:seen. Lisåtåån 8 yl Endo-R-puskuria (vrt. esiroerkki 8). 20 yl deoksinukleosiditrifosfaatti-seosta (dATP, dCTP, dGTF, TTP, jokainen 0,002 moolinen, pH såådetty 10 NH^tlla arvoon 7,0) ja 2 yl (10 yksikkSå) DNA-polymeraasia I, Klenow-fragmentti (Boehringer), jonka jålkeen inkuboidaan 30 min. 12°C:ssa. Reaktio pysåytetaan kuumentamalla 3 minuutin kuluessa 90°C:seen ja DNA eristetåån, fenoli/kloroformi-uuton jålkeen.etanolisaostuksella. Muodostunut DNA-seos liuotetaan 15 100 pl:aan ligaasipuskuria (66 mM Tris.HCl pH 7,5, 6,6 mM

MgCl2· 10 mM ditiotreitolia, 5 mM ATP), lisåtåån 50 yksikkoå (2 yl) T^DNA-ligaasia (Biolabs) ja inkuboidaan 20 tunnin ajan 20 C:ssa. Reaktio pysåytetåån kuximentamalla 5 minuutin kuluessa 70°C:seen ja fenoli/kloroformi-uuton jålkeen DNA 20 eristetåån etanolisaostuksella. Seos erotetaan 8-%:isessa polyakryyliamidigeelisså (denaturoitu) elektroforeesilla, jonka jålkeen liitåntåtuote jossa on 217 emåsparia elektro-eluoidaan, konsentroidaan DE52-selluloosapylvååseen ja eluoin-nin jålkeen eristetåån etanolisaostuksella.

25 Desulfatohirudiini-geenillå on seuraava rakenne:

CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGT

GACCTTAAGTACCAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTAGACCAGTCTTGGACACGGACACGCTTCCA

TCTAACGTTTGCGGTCAGGGTAACAAATGCATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTT

AGATTGCAAACGCCAGTCCCATTGTTTACGTAGGACCCAAGACTGCCACTTTTTTTGGTCACGCAA

ACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCTCACAACGACGGTGACTTCGAAGAAATCCCGGAAGAA

TGGCCACTTCCATGGGGC1TTGGCGTCAGAGTGTTGCTGCCACTGAAGCTTCTTTAGGGCCTTCTT

TACCTGCAGTAGGATCCTG

ATGGACGTCATCCTAGGAC

56

Desulfatohirudiiinigeenin valmistus neljSsta fragmentista on esitetty seuraavassa kaaviossa II:

Kaavio 6: Hirudiinigeenin valmistus neljSsta synteettisestS fragmentista___ 1/58 96/67 . A6/64 154/64 |TA"£olynukleotidikinaasi J, pariutuminen TTiTT_11 ι ΤΤ TTTTT___ IDNA-polymeraasi I (Klenow) jdNIPs TTTmiimiimimnimit TiTTi iimnmnmimmnmi I T^- DNA- ligaas i

ΤΤΠI 11 I I I I I 11 I 1111 11 1111111111111M111111111111 m 1111 III 1111III

t t

EcoU Γ,-Fz-DNA Ba"HI

(desulfatohirudiini-geeni)

II

90787 57

Esimerkki 10: Desulfatohirudiinigeenin F^DNA:n sisaltSvån plasmidin pML 300 valmistus (Kuvio 1) a) Linearisoidun vektorin pBR322/EcoRI/PvuII valmistus 5 yg pBR322 plasmidi-DNA:ta pilkotaan 5 yksikolla PvuII re-5 striktioendonukleaasia (Biolabs) 200 ml:ssa liuosta, jossa on 100 yg/ml gelatiinia, 1 tunnin ajan 37°C:ssa. Sen jalkeen liuos såådetåSn pitoisuuteen 100 mM Tris.HCl (pH 7,5) 50 mM NaCl, ja DNA pilkotaan 30 yksikdlla EcoRI-restriktioendonuk-leaasia (Biolabs) 2 tuntia 37°C:ssa. Sen jSlkeen liuos saade-10 taan pitoisuuteen 50 mM Tris.HCl pH 8 ja DNA-konsentraation ollessa 10 yg/yl, inkuboidaan 2 yksikon kanssa vasikan sisS-elinten alkalista fosfataasia (Boehringer) 30 minuutin ajan 37°C:ssa. Entsyymi inaktivoidaan kuumentamalla liuosta 60 minuutin ajan 65°C:ssa. Sen jålkeen liuos sSSdetaan TNE-pitoi-15 suuteen, uutetaan 1 tilavuudella fenolia ja kloroformia ja pilkottu DNA saostetaan 2 tilavuudella alkoholia -20°C:ssa yon kuluessa.

pBR322 DNS:sta irti leikattu vektori (pBR322/EcoRI/PvuII, 2297 emasparia) erotetaan geelielektroforeesilla 1-%:isessa, 20 matalalla sulavassa agaroosissa (Biorad), joka on valmistettu Tris-asetaatti-EDTA-puskuriin pH 8, pienesta DNA-fragmentista (2067 emasparia). Sen jalkeen kun DNA on varjåtty agaroosigee-lilla EtBr:lla, geelin kohdat, jotka sisSltavat pBR322/EcoRII/ PvuII vektorin (=2297 emasparia) DNA-kaistat, leikataan irti 25 geelista ja nesteytetåån 65°C:ssa 19 minuutin ajan. TShan DNA-liuokseen lisatSan 20 tilavuutta TNE:tS, DNA puhdistetaan Mueller et al.:n (19) esittamalla tavalla DE-52-kromatogra-fisesti, uutetaan fenoli/kloroformilla ja DNA saostetaan -20°C:ssa ydn yli alkoholilla. DNA-sakka liuotetaan 50 yl:aan 30 liuosta, jossa on 0,01 M Tris.HCl (pH 8), 0,1 mM EDTA, ja sailytetSSn -20°C:ssa kunnes sitM kSytetSSn. Saadaan 1,4 yg (=3,2 pmoolia pSitå). DNA:ta.

58 b) F^-DNA/EcoRII:n valmistus 24 ng (=1,3 pmoolia pSitå) kemiallisesti syntetisoitua -DNA:ta (katso esimerkki 8) pilkotaan 5 yksikSHS EcoRI-re-striktioendonukleaasia (Biolabs) 50 yl:ssa liuosta, jossa on 5 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl ja 100 yg/ml gelatiinia, 30 minuutin ajan 37°C:ssa. Sen jSlkeen liuokseen lisataan 0,06 yg (=0,14 pmoolia påitå) linearisoitua vektoria pBR322/ EcoRI/PvuII (esimerkki 10a). Sen jalkeen entsyymi inaktivoi-daan kuumentamalla 65°C:seen 10 minuutin kuluttua, liuos såå-10 detaån TNE-pitoisuuteen ja uutetaan fenoli/kloroformilla. DNA saostetaan alkoholilla. Saostunutta DNA:ta såilytetaan alko-holissa -20°C:ssa, kunnes tyoskentelya jatketaan.

c) pBR322/EcoRI/PvuII-vektori-DNA:n liittaminen F^-DNA/EcoRI: een ja plasmidin pML300 rakentaminen_ 15 Esimerkisså 10b) saatu DNA-sakka, joka sisaltaa molemmat mai-nitut DNA-jaksot, liuotetaan 20 yl:aan liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, 100 yg/ml gelatiinia, ja kåsitellMSn 25 yksikdlla/yl DNA-ligaasia (Biolabs) 15 C:ssa 3 tunnin ajan. Talla tavalla muo-20 dostuu rekombinoidun plasmidin pML300 liuos, joka sisaltaa F .j -DNA: n.

d) E.colin HB101-solujen transformointi plasmidilla pML300

Transformoinnissa tarvittavat, kalsiumilla esikasitellyt E.co-li HB101-solut valmistetaan kuten Mandel et al. ovat esittM-25 neet (14).

Kohdassa c) saatua liuosta, joka sisaltaa yhdistelmåplasmidin pML300, kuumennetaan 10 minuutissa 65°C:seen T^-DNA-ligaasin inaktivoimiseksi, jonka jalkeen jaahdytetSSn 37°C:seen. 10 yl tåtå reaktioseosta lisåtaån 150 yl:aan kalsiumilla kasitelty-

II

90787 59 jS E-coli HB101-soluja 10 mM:ssa MgCl2 ja 10 mM:ssa Tris.

HC1 (pH 7,5), kokonaistilavuuden ollessa 200 μΐ.

Sen jaikeen tata seosta jaahdytetaan jaissa 30 minuutin ajan, kuumennetaan 2 minuutissa 42°C:seen, jonka jaikeen annetaan 5 seista 50 minuutin ajan 1 ml:ssa L-kasvualustaa (vrt. esimerk-ki 18 37°C:ssa. Taman jaikeen seos levitetaan 0,2 ml:n eris- sa 5 agarmaljoille (McConkey-agar, Difco), jotka sisaitavat 60 pg/ml ampisilliinia (Serva). Sen jaikeen agarmaljoja pide-taan 37°C:ssa 16-18 tuntia. Saadaan 484 transformoituneiden 10 E.coli HB101-solujen ampisilliini-resistenttia pesaketta.

e) F^-DNA:ta sisaitavien pesakkeiden seulonta 470 transformoitunutta pesaketta (esimerkki 10d) painetaa- nitroselluloosasuodattimille B85 (Schleicher ja Schiill) .

Menetelmaila, jonka ovat esittaneet Grunstein ja Hogness (20), 15 pesakkeet lyysoidaan ja niiden denaturoitunut DNA kiinnitetaån suodattimelle. Sen jaikeen tapahtuu suodattimen esihybridi-

sointi 20 ml:ssa (per suodatin) liuosta, jossa on 4 x SET

=liuos, jossa on 30 mM Tris.HCl (pH 8) 150 mM NaCl, 1 mM

EDTA , 0,1 % (paino/tilavuus) Ficoll 400 (Pharmacia) 0,5 % 20 SDS, 50 vig/ml denaturoitua vasikan kateenkorva-DNA, 4 tuntia 64°C:ssa. Taman jaikeen nitroselluloosasuodattimet kasitel- laan 20 mlrssa (per suodin) liuosta, jossa on 5 x SET (paino/ til.), Ficoll 400:aa; 0,2 % SDS:a ja 50 yg/ml denaturoitua o 32 vasikan kateenkorva-DNA:ta, 16 tunnin ajan 64°C:ssa P-ra- 3 4 25 dioaktiivisesti leimatulla koettimella (noin 10 -10 Cerencov cpm per suodatin). Koettimena kaytetaan komplementaarista oli-gonukleotidia 46/64 (vrt. esimerkki 6).

Sen jaikeen suodattimet pestaan kaksi kertaa huoneen lampoti-lassa liuoksessa, jossa on 2 x SET ja 0,2 % SDS, jonka jai-30 keen kaksi kertaa liuoksessa, jossa on 2 x SET ja 0,5 % SDS, 60°C:ssa (ensin 30 min. sitten 60 min ajan). Taman jaikeen suo- 60 dattimet kuivataan 3 MM paperin (Whatman) vSlissS ja -80°C: ssa 1-2 påivSn ajan siirretåSn rontgenfilmille (Fuji), kayt-tåen vahvistusfoliota (Intensifying screen, Ilford).

Saadussa autoradiogrammissa nåkyy 71 positiivista pesSketta 5 (kloonia), joita voidaan kayttaa jatkotyoskentelysså, yhdelle niista annetaan nimi pML300.

Esimerkki 11: Desulfatohirudiinigeenin F2-DNA:n sisSltSvån plasmidin pML305 valmistus (Kuvio 2) ._ a) Linearisoidun vektorin pBR322 /BamHl/NruI valmistus 10 5 yg pBR322-plasmidi-DNA:ta pilkotaan 30 yksikolla BamHI- restriktioendonukleaasia 30 minuutin ajan liuoksessa, jossa on 100 mM NaCl, 6 mM Tris.HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl2 ja 100 yg/ml gelatiinia. Sen jalkeen lisataån liuos, jossa on 15 yksikkSS PvuII-restriltioendonukleaasia, ja leikataan 2 tun-15 tia 37°C:ssa.

Reaktioseos kuumennetaan 10 minuutin kuluessa 70°C:seen ent-syyznin inaktivoimiseksi. Sen jalkeen molemmat DNA-fragmentit erotetaan toisistaan geelielektroforeesilla 1-%:isessa mata-lalla sulavassa agaroosissa, joka on valmistettu Tris-asetaat-20 ti-EDTA-puskuriin pH 8 (katso esimerkki 10a).

pBR322 BamHI/PvuII vektorin DNA-jaksot (= 2672 emasparia) leikataan irti, nesteytetåån ja Mueller et al.:n (19) esit-tamalla tavalla puhdistetaan DE-52-kromatografisesti. Saadaan 0,75 yg (=1,5 pmoolia paitå) DNA:ta.

25 b) F2-DNA/BamHI:n valmistus 25 yg (=1,3 pmoolia påitM) kemiallisesti syntetisoitua F2~ DNA:ta (esimerkki 8) pilkotaan 16 yksikQlla BamHI-restriktio-

II

90787 61 endonukleaasia (Biolabs) 20 yl:ssa liuosta, jossa on 150 mM NaCl, 6 mM Tris.HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl2 ja 100 yg/ml gela-tiinia, 30 minuutin ajan 37°C:ssa. Sen jålkeen lisataan line-arisoidun vektorin pBR322/BamHI/PvuII (esimerkki 11a) 60 ng: 5 n liuos (= 96 nmoolia paita), koko liuos såådetåån TNE-pitoi-suuteen ja uutetaan fenoli/kloroformilla ja DNA saostetaan 2 tilavuudella alkoholia. Saostunutta DNA:ta såilytetåån al-koholissa -20°C:ssa, jatkotyoskentelyå vårten.

c) pBR322/BamHI/PvuII-vektori-DNA:n liittåminen F2~DNA/ 10 BamHIzeen ja plasmidin pML305 rakentaminen_

Esimerkisså 11b) saatu DNA-sakka, joka sisaltaa molemmat mainitut DNA-rakenneosat, liuotetaan 20 yl:aan liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, 100 yg/ml gelatiinia, ja kasitellaan 15 yksikolla/ 15 yl T^ DNA-ligaasia (Biolabs) 15°C:ssa 3 tuntia. Tallå tavalla muodostuu liuokseen yhdistelmaplasmidia pML305, joka sisål-tåå F2-DNA:n.

d) E.coli HB101-solujen transformointi plasmidilla pML 305

Kalsiumilla kåsiteltyjen E. coll HB101-solujen transformoin-20 ti tapahtuu esimerkissa 10d) esitetyllå tavalla. Kåytetåån 10 yl esimerkissa 12c) saatua reaktioseosta. Saadaan 313 ampis illiini-resistenttiå pesåkettå.

e) F2~DNA:ta sisåltåvien pesåkkeiden seulonta 65 transformoitunutta pesåkettå (esimerkki 11d) testataan 25 F2-DNA:n suhteen, esimerkisså 10e) esitetyllå tavalla. Ra-dioaktiivisena koettimena kåytetåån komplementaarista oligo-nukleotidia 154/64 (vrt. esimerkki 6). Autoradiogrammi sisål-tåå 2 positiivista pesåkettå, joista toiselle annetaan nimi pML305.

62

Esimerkki 12; Kloonien pML300 ja pML305 karakterisointi

YhdistelmSplasmidien pML300 ja pML305 DNA:t eristetaan mene-telmSHS, jonka on esittSnyt Ish-Horowitz .(21). F^-DNA- ja F2“DNA-inserttien nukleotidisekvenssit mååritetåan menetel-5 mållå, jonka ovat esittåneet Maxam ja Gilbert (11). Tata vårten kulloinkin 10 yg pML300:n plasmidi-DNA:ta pilkotaan EcoRI-restriktioendonukleaasilla ja 10 yg pML305:n plasmidi-DNA:ta pilkotaan BamHI-restriktioendonukleaasilla ja linearisoidut DNA:t eristetaan geelieluutiolla agaroosigeelista (vrt. esi-10 merkki 10a)). Sen jalkeen eristetyt DNA:t pilkotaan alkali-sella fosfataasilla ja kromatografoidaan DE-52:lla (vrt.

esimerkki 11a). Sitten DNA:t 5'-paissa leimataan radioaktii-32 visesti (γ- p)ATP:lla (spesifinen aktiivisuus > 5000 Ci/ mmoolia, Amersham) ja T^-polynukleotidi-kinaasilla (P-L-Bio-15 chemicals).

Sen jålkeen radioaktiivisesti leimatut DNA:t pilkotaan eråål-la toisella restriktioendonukleaasilla (EcoRII). Muodostuneet DNA-fragmentit eristetaan geelieluutiolla agaroosista. pML 300:n ollessa kyseessa EcoRII-EcoRI* fragmentista (noin 109 20 emåsparia F^-DNA:n nukleotidisekvenssi, pML305:n ollessa kyseessa maaritetaan F2~DNA EcoRII-BamHI*-fragmentissa (noin 122 emasparia). (* tarkoittaa DNA-paata, joka on leimattu radioaktiivisesti).

F^-DNA:lie ja Fj-DNAille maaritetyt nukleotidisekvenssit 25 ovat identtiset esimerkissa 8 esitettyjen kanssa.

II

90787 63

Esimerkki 13; Ilmentymisplasmidin pML310 valroistus a) Linearisoidun vektorin pHRil48/EcoRI/BamHI, joka sisaltåa trp-promoottori-operaattorin, rakentaminen (kuvio 3 ja kuvio 4)__ 5 A. Plasmidin pi 59 rakentaminen

10 g plasmidia pBRH. (22) pilkotaan 50 yksikolla EcoRI:tM

** o (Biolabs) 60 minuutin ajan 37 C:ssa ja pilkottu seos fraktioi-daan fenoliuuton jalkeen, sakkaroosi-tiheysgradientilla (5-23%) liuoksessa, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 8,0), 1 mM 10 EDTA TST41-roottorissa (Kontron AG). Sentrifugointi kestaa 14 tuntia 40 000 rpm ja 15°C. 0,3 ml:n fraktiot kerataån ISCO-gradienttikeråajålla 1 ml/min. Fraktiot, jotka sisalta-vat pienemmån fragmentin, yhdistetaan, liuos såadetaan TNE-pitoisuuteen ja saostetaan 2 tilavuudella etanolia -20°C:ssa. 15 DNA liuotetaan Eppendorf-sentrifuugissa sentrifugoinnin jål-keen 100 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris. HC1 pH 7,5, 0,5 mM EDTA. 5 yg naita DNA-fragmentteja pilkotaan 5 yksikolla Bglll (Biolabs) 60 minuutin ajan 37°C:ssa. Reaktioseos uutetaan fenolilla ja kloroformilla ja DNA:ta inkuboidaan 20 2 tilavuuden kanssa etanolia -80°C:ssa 10 minuutin ajan ja DNA keratåan sentrifugoimalla ja liuotetaan uudestaan 50 yl: aan liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 8,0). Otetaan 2 yl tMta liuosta (0,2 yg DNA) ja DNA-konsentraatiossa 10 ng/yl inkuboidaan 50 mM:ssa Tris-HCl (pH 8,0) 1 yksikon kanssa 25 vasikan sisaelinten alkalista fosfataasia (Boehringer) 30 minuuttia 37°C:ssa. Entsyyrai inaktivoidaan kuumentamalla 60 minuuttia 65°C:ssa. Otetaan 0,04 yg DNA:ta ja 5'-paata inkuboidaan 10 yCi:llS (γ zp)ATP:ta (>5000 Ci/mmol. Amersham) ja 5 yksikolla T^ polynukleotidi-kinaasia (P-L Biochemicals)

30 20 yl:n reaktiotilavuudessa, jossa on 50 mM Tris-HCl (pH

9,5), 10 mM MgCl2 ja 5 mM DTT, 30 minuuttia 37 C:ssa. Radio-aktiivinen koetin sekoitetaan leimaamattoman koettimen kanssa (katso edella) ja DNA-fragmentit fraktioidaan 5-23 % 64 sakkaroosi-tiheysgradientilla liuoksessa, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, TST60-roottorissa. Sentrifu-gointi keståå 5 tuntia 60 000 rpm ja 15 C. Kootaan 0,2 ml:n fraktiot. Jokaisen fraktion radioaktiivisuus mååritetåån mit-5 taamalla Cerencov-såteily ja siten identifioidaan fraktiot. Halutut fraktiot, jotka sisaltavat pienen DNA-fragmentin, yh-distetaan, DNA saostetaan 2 tilavuudella etanolia ja sentri-fugoinnin jålkeen liuotetaan uudestaan 20 yl:aan liuosta, jos-sa on 10 mM Tris-HCl pH 7,5 ja 0,5 mM EDTA.

32 10 P-leimattu EcoRI-Bglll-DNA-fragmentti pilkotaan osittain 0,2 yksikollå Taql (Biolabs) 50 yl:n tilavuudessa 10 minuutin ajan 37°C:ssa. Reaktioseos såådetåån pitoisuuteen 0,2 % SDS, 10 % glyserolia, 10 mM EDTA, 0,05 % bromifenoli-sinistå ja DNA-fragmentit erotetaan 6-%:sella polyakryyliamidigeelillå, 15 joka on valmistettu Tris-boraatti-EDTA-liuokseen (23). Auto-radiogrammista identifioidaan halutut EcoRI-TaqI:n sisaltavat kaistat (suurempi osafragmentti). Tåmå fragmentti (L, katso kuvio 3) uutetaan geelistå ja puhdistetaan (19) ja liuotetaan 10 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA.

20 Akseptori-plasmidina kåytetåån pBR322, joka on pilkottu Clal: llå ja EcoRI:lla, 2 yg pBR322 pilkotaan 4 yksikollå Clal:ta (Biolabs) 20 yl:n reaktiotilavuudessa 60 minuutin ajan 37°C: ssa. Proteiini uutetaan fenolilla ja sen jålkeen DNA saostetaan 2 tilavuudella etanolia -80°C:ssa 10 minuutin kuluessa. 25 DNA kerataan sentrifugoimalla ja sen jålkeen pilkotaan 10 yksikollå EcoRIrtå (Biolabs) 30 minuutin ajan 37°C:ssa 20 yl:n reaktiotilavuudessa. Tåmån jålkeen liuokseen lisåtåån 2 tilavuutta 0,1 M Tris.HCl (pH 8,7) ja inkuboidaan 1 yksi-kbn kanssa vasikan sisåelinten alkalista fosfataasia (Boeh-30 ringer) 30 minuutin ajan 37°C:ssa. Fosfataasi inaktivoidaan sen jålkeen inkuboimalla 65°C:ssa 60 minuutin ajan.

100 ng akseptori-plasmidia inkuboidaan 2 tunnin ajan 5 yl:n 90787 65 kanssa fragmenttia L-DNA 15 yl:n reaktiotilavuudessa, jossa on 10 mM MgCl2, 20 mM Tris.HCl (pH 7,8), 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, ja 30 yksikkSS reaktiotilavuuden yl:aa kohti DNA-ligaasia (Biolabs).

5 5 yl tata liuosta lisåtaån seokseen, jossa on 150 yl kalsium- kloridilla kasiteltyjS E. coli HB101-soluja (14) liuoksessa, jossa on 10 mM MgCl2, 10 mM CaCl2 ja 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) kokonaistilavuuden ollessa 200 yl. Seosta jåahdytetSan 20 mi-nuuttia jåissa, kuumennetaan 1 minuutissa 42°C:seen ja in-10 kuboidaan 10 minuuttia 20°C:ssa. Lisataan 1 ml tryptoni-kasvu-alustaa(tryptoni-kasvualusta sisaltaa 10 g Bacto-Tryptonia (Difco); 1 g hiivauutetta (Difco); 1 g glukoosia; 8 g NaCl ja 294 mg CaCl2.2 H20 1 litrassa tislattua vetta) ja seosta inkuboidaan 30 minuuttia 37°C:ssa, samalla ravistaen 300 15 kierr./min . Seos levitetaan kahdelle agarmaljalle (McConkey Agar, Difco; 0,6 ml/malja), johon on lisatty 50 yg/ml:a am-pisilliinia (Sigma). LevyjS inkuboidaan 12-17 tuntia 37°C:ssa.

10 erilaisen pesakkeen plasmidi-DNA eristetSån seuraavalla tavalla: 20 Pesakkeilla siirrostetaan 10 ml tryptoni-kasvualustaa, joka on taydennetty 50 yg:lla/ml ampisilliinia, kuten edellS, 25 ml:n erlenmeyerkolvissa. Viljelmia ravistellaan 15-18 tuntia 37°C:ssa ja 300 kierr./min. Solut erotetaan sentri-fugoimalla (Sorval, HS-4 roottori, 10 min. 4000 kierr./min., 25 4°C). Saadaan noin 0,1 g soluja ja nama suspendoidaan uudes- taan 1 ml:aan 50 mM Tris.HCl (pH 8,0). Lisataan 0,25 ml lysotsyymiliuosta (10 mg/ml 50 mM:ssa Tris.HCl (pH 8,0); lysotsyymia myy Sigma) ja inkuboidaan 10 minuuttia 0°C:ssa, jonka jalkeen lisStaSn 0,15 ml 0,5 mM EDTA (pH 7,5). Edel-30 leen 10 minuutin kuluttua 0°C:ssa lisStaSn 60 yl 2-%;ista Triton X-100 (Merck). 30 minuutin kuluttua 0°C:ssa sentri-fugoidaan koetin 30 minuuttia 15 000 kierr./min ja 4°C:ssa 6 6

Sorval SA-600 roottorissa. Supernatantti deproteinoidaan 1 tilavuudella fenolia (kyllåstetty TNEthen). Faasit erotetaan sentrifugoimalla (Sorval HB-4 roottori) 10 minuutin ajan 5000 kierr./min ja 4°C:ssa. Ylempi faasi uutetaan kaksi ker-5 taa 1 tilavuudella kloroformia. Haiman RNAasi A:ta (sigma; 10 mg/ml TNE:sså 10 min. kuumennetaan etukåteen 85°C:ssa) lisataån loppukonsentraatioon 25 yg/ml ja seosta inkuboidaan 40 minuuttia 37°C:ssa. Sen jålkeen liuos saadetaån pitoisuu-teen 1 M NaCl ja 10 % polyetyleeniglykoli 6000 (Fluka, kåsi-10 tellåån autoklaavissa 20 min., 120°C:ssa) ja inkuboidaan 2 tuntia -10°C:ssa. Sakka keråtåån Sorval HB-4 roottorissa (20 min. 10000 kierr./min., 0°C:ssa) ja liuotetaan uudestaan 100 yl:aan TNE:tå. DNA-liuos uutetaan 1 tilavuudella fenolia ja DNA saostetaan 2 tilavuudella etanolia 10 min. -80°C:ssa. 15 Sakka keråtåån sentrifugoimalla Eppendorf-sentrifuugissa ja DNA liuotetaan uudestaan 20 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) ja 0,5 mM EDTA. 10 ml:n viljelmåstå saadaan 8-10 yg plasmidi-DNA:ta.

Plasmidi-DNA:t analysoidaan, kun on pilkottu seuraavilla re-20 striktioentsyymeilla:

Kulloinkin 0,5 yg plasmidi-DNA:ta pilkotaan Hpal:lla (Biolabs) seka Hpalrlla (Biolabs) ja EcoRIsllM (Biolabs), Clal: 11a (Biolabs) entsyymivalmistajan antamien standardimenetel-mien mukaan. DNA:t fraktioidaan 1-%:lla agaroosigeelillå, jo-25 ka on valmistettu liuokseen, jossa on 40 mM Tris-asetaattia (pH 7,8), 1 mM EDTA ja 0,5 yg/ml etidiumbromidia. Halutut plasmidit sisaltavat Hpal-kohdan ja tuottavat 3-kertaisen katkaisun jålkeen suuren DNA-fragmentin lisåksi 2 pienempåå fragmenttia, jotka ovat suurempia kuin pBR322:n pieni EcoRI-30 Clal-fragmentti. Yhdelle nåistå plasmideista annetaan nimi p159 (katso kuvio 3).

Il 90787 67 B. Plasmidin pHRi145 rakentaminen 2 yg p159-DNA:ta pilkotaan 10 yksikSlla EcoRIita (Biolabs) 30 minuutin ajan 37°C:ssa. DNA uutetaan fenolilla, saoste-taan etanolilla ja sentrifugoinnin jalkeen liuotetaan 10 yl: 5 aan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,5), 0,5 mM EDTA. EcoRI:lla katkaistu DNA kasitellaan edelleen 5 yksikolla DNA-polymeraasia (Klenow-fragmentti) (Boehringer) liuoksessa, jossa on 10 mM MgCl2» 10 mM β-merkaptoetanolia, 50 mM NaCl, 0,1 mM dATP (P & L Biochemicals), 0,1 mM dTTP (P&L Biochemi-10 cals) 15 minuutin ajan 12°C:ssa. Sen jalkeen polymeraasi inaktivoidaan inkuboimalla 85°C:ssa 5 minuutin ajan. Reaktio-seos laimennetaan 10-kertaisesti liuoksella, jossa on 20 mM Tris.HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP (Sigma), ja inkuboidaan 30 yksikSn kanssa T^ DNA-ligaasia per yl reak-15 tioseosta 1 tunti 15°C:ssa.

50 ng DNA:ta levitetaan McConkey-agar-maljoille, joissa on transformoitua E.colia (kuten edella on esitetty) ja 50 yg/ ml ampisilliinia.

Eristetåån 10 erilaista pesåketta kuten edella esitettiin.

20 Plasmidi-DNA:t analysoidaan liittåmållå EcoRIiteen. Halutut plasmidit ovat EcoRI-resistenttejS. Analyysi suoritetaan edella esitetyllå tavalla. Yhtå halutuista plasmideista nimitetaan HRi145 (kuvio 3).

C. Plasmidin pHRi148 rakentaminen 25 2 yg pHRil45-DNA:ta kSsitellaMn 5 yksikolla ClaI:tS (Boehrin ger) 60 minuutin ajan 37°C:ssa, jonka jalkeen proteiini pois-tetaan uuttamalla fenolilla. DNA-saostetaan etanolilla, jonka jalkeen se liuotetaan 20 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,5 mM EDTA. UlostyontyvSt pMMt tMydenne-30 tåån edella esitetyllå tavalla, DNA-polymeraasi I:lia (Kle- 68 now-fragmentti) , paitsi ettS dATP ja dTTP korvataan dCTP: 11S (P&L Biochemicals) ja dGTP:llS (P&L Biochemicals). Polymeraasi inaktivoidaan inkuboimalla 85°C:ssa 5 minuutin ajan. Reaktioseokseen lisStaSn 2 tilavuutta 0,1 M Tris.HCl 5 (pH 8,7) ja inkuboidaan 0,5 yksikon kanssa vasikan fosfataa-sia (Boehringer) 30 minuutin ajan 37°C:ssa. Reaktioseokses-ta poistetaan proteiini fenoliuutolla. DNA-saostetaan eta-nolilla ja liuotetaan 8 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris. HC1 (pH 7,5) 0,5 mM EDTA.

10 Kemiallisesti syntetisoitu DNA-sidoksenmuodostaja jonka kaa-va on 5'-GAATTCCATGGTACCATGGAATTC-3' fosforyloidaan 5'-paSssa siten, ettå 8 pmoolia sidoksenmuo- 32 ™ 1

dostajaa inkuboidaan 5 yCi:n kanssa(γ- ^p)ATP (5500 Ci.mmol Amersham) 8 yl:n reaktiotilavuudessa, joka sisSltaa 0,1 mM 15 rATP (Sigma), 50 mM Tris.HCl (pH 9,5), 10 mM MgCl2, 5 mM

DTT ja 2 yksikkoa T^ polynukleotidi-kinaasia (P&L Biochemi-vals), 30 minuutin ajan 37°C:ssa. Reaktio pysåytetåån jaah-dyttamalla -80°C:ssa.

Sen jalkeen radioaktiivisesti leimattu sidoksenmuodostaja 20 kSsitellSan 1 vg:lla Claltta ja fosfataasilla ja liitetaan pHRi145-DNA:han (katso edellM ) 20 pl:n reaktiotilavuudes sa, joka sisSltaa 0,5 mM rATP (Sigma), 10 mM DTT (Calbiochem) , 20 mM Tris.HCl (pH 7,8), 1 mM MgCl2, ja 800 yksikkoa T4 DNA-ligaasia (Biolabs). Inkubointi suoritetaan 15°C:ssa 2 tun-25 nin ajan. Ligaasi inaktivoidaan inkuboimalla 85°C:ssa 10 minuutin ajan. Sen jSlkeen lisataSn 2 tilavuutta vetta, saa-detSSn keittosuolaliuoksella pitoisuuteen 10 mM ja lisataan 30 minuutin kuluessa 37°C:ssa 20 yksikkoS KpnI:tM (Biolabs). Uutetaan fenolilla ja kloroformilla, jonka jalkeen seos frak-30 tioidaan 0,9-%:sella matalalla sulavalla agaroosigeelillS (Biorad), joka on valmistettu liuokseen, jossa on 40 mM Tris.asetaatti (pH 7,8), 1 mM EDTA ja 0,5 yg/ml etidium-

II

90787 69 bromidia. UV-såteilytyksellå nåhtåvisså oleva kaista, jolla on sama liikkuvuus kuin samansuuruisella merkki-DNA:lla, lei- kataan irti leikkausveitsellå. Geelipalaa sulatetaan 5 mi- o o nuuttia 65 C:ssa, ;jonka jålkeen se jååhdytetåån 37 C:seen.

5 Saadaan noin 20 yl:n tilavuus. Otetaan 5 yl tåtå liuosta ja inkuboidaan 12 tunnin ajan 15°C:ssa 400 yksikbn kanssa T^- ligaasia (Biolabs) 10 yl:n reaktiotilavuudessa, joka saade-

taan pitoisuuteen 0,5 mM ATP, 10 mM DTT, 10 mM MgCl2, 20 mM

Tris.HCl (pH 7,8). Ligaasi-seokseen (kiinteytyy 15°C:ssa) 10 lisåtåån 1/10 tilavuutta liuosta, jossa on 100 mM Tris.HCl (pH 7,5), 100 mM CaC^ ja 100 mM MgCl2/ ja inkuboidaan 65°C: ssa 5 minuutin ajan. Sen jålkeen liuos kaytetaån kalsiumilla kasiteltyjen .(kuten edella on esitetty) E.coli HB101-solu- jen transformointiin. Kaytetaån McConkey-agarmaljoja, joihin 15 on lisåtty 50 yg/ml ampisilliinia.

Eristetåån 10 eri pesåkkeen plasmidi-DNA:t, kuten edella on esitetty, ja DNA:lle suoritetaan seuraavat restriktioentsyy-mianalyysit: Kaytetaån aina 0,5 yg plasmidi-DNA:ta, joka peråkkåin pilkotaan Kpnl:llå (Biolabs), Ncolrllå (Biolabs) 20 ja EcoRI:llå (Biolabs) entsyymivalmistajan suositusten mu-kaan. Pilkkomistuotteet fraktioidaan 1-%:isella agaroosi-geelillå, joka on valmistettu liuokseen, jossa on 40 mM Tris.asetaattia (pH 7,8) , 1 mM EDTA, 0,5 yg/ml etidiumbro-midia. Kaikilla plasmideilla esiintyy kulloinkin yksi nåistå 25 entsyymipilkkoniiskohdista, kuten halutaankin. Yhdelle anne-taan nimi HRi148.

Plasmidi HRi148 sisåltåå tryptofaani-promoottori-operaatto-rin ja ribosomaalisen sidoskohdan aina ATG:hen asti. Hiru-diini kuten myos muut heterologiset geenit voidaan liittåå 30 suoraan plasmidissa kerran esiintyvåån EcoRI-, Ncol-, Kpnl-kohtaan. Lisåksi tåmå rakenne tekee mahdolliseksi heterolo-gisten geenien suoran liittåmisen ja ilmentymisen, ilman ettå translaation aloittamiseksi tarvittavan ATG:n tåytyy esiintyå vastaavassa geenisså. Tåmå voidaan helposti tehdå 70 pilkkomalla NcoI:llå ja tåydentamSlla ulkonevat pMåt DNA-po-lymeraasilla I, kuten on esitetty, tai pilkkomalla Kpnlrlla ja poistamalla ulkonevat paat nukleaasilla S1. Plasmidi HRi148 on siten laaja-alainen kåyttdkelpoinen ilmentymisplasmidi.

5 D. Linearisoidun vektorin pHRi148/EcoRI/BamKI valmistus 5 yg pHRi148:n plasmidi-DNA:ta pilkotaan restriktioendonuk-leaaseilla EcoRI ja BamHI. Poisleikattu vektori pHRi148/ EcoRI/BamHI eristetaan tiheysgradienttisentrifugoimalla.

b) F^-DNA/EcoRI/EcoRII:n ja F2-DNA/BamHI/EcoRII:n valmistus 10 i -DNA/EcoRI/EcoRII:n valmistus 5 yg pML300:n plasmidi-DNA:ta pilkotaan ensin 10 yksikolla EcoRI-restriktioendonukleaasia 50 yl:ssa liuosta, jossa on 100 mM Tris.HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl ja 100 yg/ml gelatiinia, I tunnin ajan 37°C:ssa. Osa (0,5 yg) tåsta linearisoidusta 15 plasmidi-DNA/EcoRI:sta eristetaan geelieluutiolla agaroosi- geelista (vrt. esimerkki 10a) ja leimataan radioaktiivisesti (γ- P)ATP:llå (vrt. esimerkki 12). Sen jalkeen paaosa plas-midi-DNA/EcoRI:sta sekoitetaan tSman radioaktiivisesti leima-tun DNA:n kanssa, pilkotaan EcoRII-restriktioendonukleaasil-20 la ja EcoRII-EcoRI* DNA-fragmentti (109 emasparia) erotetaan geelieelektroforeesilla 8-%:isella polyakryyliamidilla. 200 yg F^-DNA/EcoRI*/EcoRIl:ta eristetaan geelieluutiolla.

II F2-DNA/BamHI/EcoRII:n valmistus 5 yg pML305:n plasmidi-DNA:ta pilkotaan 10 yksikolla BamHI-25 restriktioendonukleaasia. Osa (0,5 yg) tåstå linearisoidusta plasmidi-DNA/BamHI:sta eristetåån geelieluutiolla agaroosi-geelistS (vrt. esimerkki 10a) ja leimataan radioaktiivisesti li 32 71 90787 (γ- p)ATP:llå (vrt. esimerkki 12). Sen jålkeen paaosa plas-midi-DNA/BamHI:stå sekoitetaan tåmån radioaktiivisesti lei-matun DNA:n kanssa, pilkotaan EcoRII-restriltioendonukleaa-silla ja EcoRII-BamHI*-DNA-fragmentti (122 emasparia) erote-5 taan geelielektroforeesilla 8-%:isella polyakryyliamidilla.

250 yg F2~DNA/BamHI*/EcoRII:ta eristetaan.

c) F^-DNA:n liittaminen F2~DNA:han ja ilrnentymisplasmi-din pML310 rakentaminen 10 ng (= 473 nmoolia paitS) F^-DNA/EcoRI/EcoRII ja 9 ng 10 (=495 nmoolia påitS) F2_DNA/NamHI/EcoRII kasitellaån 20 yl:n tilavuudessa T^-DNA-ligaasilla, kuten edella esimerkissa 10c) kuvataan. Sen jålkeen seos uutetaan fenoli/kloroformilla ja DNA saostetaan alkoholilla. Sen jalkeen DNA-sakka liuotetaan esimerkissa 10c) esitetyllM tavalla ja pilkotaan EcoRI- ja 15 BamHI-restriktioendonukleaaseilla. Sitten liuos saadetaan TNE-pitoisuuteen ja lisataan 30 ng (= 50 nmoolia paitå) vektori-DNA pHR148/EcoRI/BamHI (vrt. esimerkki 13aD). Sen jalkeen liuos uutetaan fenoli/kloroformilla ja DNA saostetaan alkoholilla. Saostunut DNA-seos kasitellaån, kuten 20 esimerkissa 10c) on esitetty, T^-DNA-ligaasilla (Biolabs). Tållå tavalla muodostuu liuokseen yhdistelmåplasmidi, joka sisåltåå F^-F2~DNA:n (desulfatohirudiinigeenin) inserttinå.

d) E.coli HB101-solujen transformointi plasmidilla pML310

Kalsiumilla kåsiteltyjen E.coli HB101-solujen transformoin-25 ti tapahtuu esimerkisså 10d) kuvatulla tavalla. Kåytetåån 10 yl esimerkisså 13c) saatua reaktioseosta. Saadaan 420 ampisilliini-resistenttiå pesåkettå.

e) F^-Fj-DNAsn sisåltåvien pesåkkeiden seulonta 18 transformoituneesta pesåkkeestå (esimerkki 13d) testa- 72 taan niiden -F2~DNA-pitoisuus, kuten esimerkissa 10e) kuva-taan- Radioaktiivisena koettimena kSytetSan esimerkeissM 5 ja 6 kuvattujen oligodeoksinukleotidien seosta. Autoradio-grammi sisSltaS 12 positiivista pesMketta, joista viidelle 5 annetaan nimet pML310, pML311, pML312, pML313, pML314.

Esimerkki 14: Kloonin pML310 karakterisointi F1-F2“DNA-sekvenssin karakterisointi yhdistelmaplasmidissa pML310 tapahtuu sekvensoimalla F^-F2_DNA menetelmalla, jonka ovat esittaneet Maxam ja Gilbert (11), kuten esimerkissa 12 10 kuvataan. Testataan 10 yg plasmidi-DNA:ta. F^-F2~DNA:n nuk-leotidisekvenssi on identtinen kuvatun synteettisen desulfa-tohirudiinigeenin kanssa.

Esimerkki 15: Ilmentymisplasmidin pML315 valmistus a. F^-DNA:n liittaminen F2~DNA:han ja ilmentymisplasmi- 1 5 din pML315 rakentaminen 24 yg (= 1,3 pmoolia paita) tai 26 vg (= 1,3 pmoolia paita) kemiallisesti syntetisoitua F^- tai F2~DNA:ta (katso esimerkki 8 ja kaavio I) pilkotaan 5 yksikdlla EcoRII-restriltio-endonukleaasia (Biolabs) 20 yl:n tilavuudessa, jossa on 50 20 mM Tris.HCl (pH 8), 5 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 100 yg/ ml gelatiinia, 30 minuutin ajan 37°C:ssa. Sen jalkeen seos uutetaan fenoli/kloroformilla ja DNA saostetaan alkoholilla. DNA-sakka liuotetaan esimerkissa 10c) esitetylla tavalla ja kasitellaån T^-DNA-ligaasilla kolmen tunnin ajan 15°C:ssa.

25 Sen jalkeen seos uutetaan fenoli/kloroformilla ja saostetaan esimerkissa 10b) esitetylla tavalla. DNA-sakka liuotetaan (vrt, esimerkki 10c) ja pilkotaan EcoRI- ja BamHI-restrik-tioendonukleaaseilla 30 minuutin ajan 37°C:ssa. Sen jalkeen lisåtåån 70 ng (= 0,1 pmoolia paita) linearisoidun vektorin 30 pHRil48/EcoRI/BamHI-liuosta (esimerkki 13aD), koko liuos 90787 73 såådetaån TNE-pitoisuuteen ja uutetaan fenoli/kloroformilla ja DNA saostetaan 2 tilavuudella alkoholia.

Saatu DNA-sakka, joka sisaltaå molemmat DNA-rakenneosat (FΊ-F2~DNA/EcoRI/BamHI ja pHRil48/EcoRI/BamEI), liuotetaan 5 20 yl:aan liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 7/8), 10 mM

MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, 100 yg/ml gelatiinia, ja kåsi-tellåån 15 yksikollå/yl T^-DNA-ligaasia (Biolabs) 15°C:ssa 3 tuntia. Talla tavalla muodostuu liuokseen yhdistelmaplasmi-di pML315, joka sisåltåå F^-F2~DNA:n (=desulfatohirudiinigee-10 nin).

b) E.coli HB101-solujen transformointi plasmidilla pML315

Kalsiumilla kasiteltyjen E.coli HB101-solujen transformoin-tiin kSytetaan 10 yl plasmidin pML315 sisåltavåa seosta (esi-merkki 15a). Saadaan noin 236 ampisilliini-resistenttia pesS-15 ketta.

c) F^-F2-DNA:n sisaltavien pesakkeiden seulonta

Transformoiduista pesakkeista (esimerkki 15b) testataan F^~F2~DNA:n esiintyminen, kuten esimerkissM 13e) esitetåån.

Saadaan 5 positiivista pesakettå, joita merkitaan pML315-20 pML319.

Esimerkki 16: Ilmentymisplasmidin pML320 valmistus

a. Synteettisen F^-F2~DNA:n liittaminen vektori-DNA

pHRil48/EcoRI/BamHI:hin.

20 yg taysin synteettisesti valmistettua desulfatohirudiini-2? geenia (F1-F2'-DNA, vrt. esimerkki 9) pilkotaan 20 ylrssa liuosta, jossa on 100 mM Tris.HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl ja 74 100 yg/ml gelatiinia, restriktioentsyymillS EcoRI ja sen jalkeen BamHI:lla. Liuos saadetåån TNE-pitoisuuteen, jonka jålkeen lisatåan 30 yg (= 50 nmoolia paitS) vektori-DNA pHR i148/EcoRI/BamHI:ta (vrt. esimerkki 13aD). Liuos uutetaan fe-5 noli/kloroformilla ja DNA saostetaan alkoholilla. DNA-sakka kåsitellåan, kuten esimerkissa 10c) esitetaan,Τ^-DNA-ligaa-silla (Biolabs). TallH tavalla liuoksessa muodostuu yhdis-telmaplasmidi (pML320), joka sisaltaa F^-F2~DNA:n (Hirudii-nigeenin) inserttina.

10 b. E. coli HBIOI-solujen transformointi plasmidilla pML320

Kalsiumilla kasiteltyjen E. coli HB101-solujen transformointi tapahtuu kuten esimerkissa 10d) esitetaan. KaytetSån 10 yl esimerkissa 16a) saatua reaktioseosta. Saadaan 173 ampisil-liiniresistenttia pesaketta.

15 c. F^-F2~DNA:n sisåltavien pesåkkeiden seulonta 11 transformoidusta pesakkeesta (esimerkki 16b) testataan, esimerkissa 10e) esitetylla tavalla, niiden F^-F2~DNA-pitoi-suus. Radioaktiivisena koettimena kaytetaan esimerkeissa 5 ja 6 kuvattujen oligodeoksinukleotidien seosta. Autoradio-20 grammi sisaltaa 14 positiivista pesaketta. Viidelle niista annetaan nimi pML320, pML321, pML322, pML323 ja pML324.

Esimerkki 17: Kloonien pML315 ja pML320 karakterisointi F^-F2"sekvenssien karakterisointi plasmideissa pML315 ja pML320 tapahtuu F^-F2~DNA:n sekvenssoinnilla menetelman mu-25 kaan, jonka ovat esittaneet Maxam ja Gilbert (11), kuten esi-merkisså 12 kuvataan. Molempien plasmidien DNA-inserttien nukleotidisekvenssit ovat identtiset synteettisen hirudiini-geenin kanssa.

90787 75

Esimerkki 18: Hirudiiniaktiivisuuden omaavien polypeptidien synteesi E^coli-soluilla, joissa on yhdistel-mahiru^diinigeenin sisaltavia plasmideja_ a. Hirudiiniaktiivisuuden omaavien polypeptidien synteesi 5 Jokaisesta 15 kloonista, joka sisaltåa yhdistelmadesulfato-hirudiini-geenin, nimittain E. coll HB101 pML 310, E. coll HB101 pHL 311, E. coli HB101 pML 312, E. coll HB101 pML 313, E. coli HB101 pML 314, E. coll HB101 pML 315, E. coll HB101 pML 316, E. coli HB101 pML 317, E. coli HB101 pML 318,, E. coli HB101 pML 319, E. coli HB101 pML 320, E. coll HB101 pML 321, E. coll HB101 pML 322, E. coli HB101 pML 323, E. coli HB101 pML 324 testataan kyky tuottaa hirudiiniaktiivisuutta.

Tata vårten edella mainittuja klooneja viljellaan 5 ml:ssa L-elatusainetta yon yli (16 tuntia) 37°C:ssa ja 250 kierr./ 10 min. L-elatusaineella on seuraava koostumus:

Bacto-tryptonia 10 g

Bacto-hiivauutetta 5 g

NaCl 5 g glukoosia 5 g 15 ampisilliinia 0,1 g 1 ml tata yon yli kasvatettua viljelmaa siirretåån seuraava-na paivåna 25 mlraan M9-elatusainetta. M9-elatusaineella on seuraava koostumus: 76 Νβ2ΗΡ04·7Η*0 13,25 g KHjPO^ 3,0 g

NaCl 0.5 g NHy Cl 1,0 g

CaCl2*2H20 0,015 g

MgSO^·7H20 0,25 g kasaminohappoja 2·5 2 vitamiinia B-| 0,0099 g glukoosia 5,0 g ampisilliinia 8 ..... o

Viljellaån 37 C:ssa ja 250 kierr./min. niin kauan, kunnes bakteerisuspension absorbanssi (°D623^ on noin 0,9-1,0. Sen jalkeen solut otetaan talteen (5 ml kasvavaa viljelmaa) ja bakteerit suspendoidaan uudestaan 0,5 ml:aan liuosta, jossa 5 on 50 mM Tris.HCl (pH 8) ja 30 mM NaCl. Taman jalkeen sus-pensio saadetaån pitoisuuteen 1 mg/ml lysotsyymia (Boehringer) ja laitetaan jaihin 30 minuutin ajaksi. Bakteerit rikotaan jaadyttamålla suspensio vuorotellen enstemaisessa typessa ja sulattamalla 37°C:ssa. Tama toimenpide toistetaan 5 ker-10 taa, sen jalkeen seosta sentrifugoidaan 30 minuuttia 16 000 kierr./min. /4°C:ssa. Supernatantista tutkitaan desulfatohi-rudiinipitoisuus siten, etta lisataan vasta-ainetta (vrt. esimerkki 18), supernatantti testataan HPLC:lla tai mitataan trombiini-inhibitio (15).

15 Saatiin seuraavat tulokset:

II

90787 77

Bakteeriuute Desulfatohirudiinin muodostus E. coll HB101 pML 310 4 E. coll HB101 pML 311 4 E. coll HB101 pML 312 + E. coli HB101 pML 313 + E. coll HB101 pML 31A 4 E. coll HB101 pML 315 4 E. coll HB101 pML 316 4 E. coll HB101 pML 317 4 E. coll HB101 pML 318 4 E. coll HB101 pML 319 4 E. coll HB101 pML 320 4 E. coll HB101 pML 321 4 E. coli HB101 pML 322 4 E. coli HB101 pML 323 4 E. coll HB101 pML 324 4 E. coli HB101 pHRl 148 (kontrolli) E. coll HB101 PBR322 (kontrolli) E. coli HB101 (kontrolli)

Esimerkki 19: Hirudiiniaktiivisuuden toteaminen

Noin 5-10 pi nåytetta, joka sisåltåå hirudiiniaktiivisuuden omaavia polypeptidejå (vrt. esimerkki 18) lisatåan tipoittain 2 nitroselluloosapaperille (1 cm ) (NZ) (BIORAD) ja kuivataan 5 30 minuuttia huoneen lampotilassa. Tåmån jSlkeen nitrosellu- loosapaperia inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa 3-%:isessa seeru-mialbumiiniliuoksessa, jossa on 0,1 M Tris.HCl (pH 8) ja 0,9 % NaCl.

Tamån jalkeen NZ peståSn liuoksessa, jossa on 0,01 M Tris.

10 HC1 (pH 8) ja 0,9% NaCl, 30 minuutin ajan. Talloin liuos vaihdetaan viisi kertaa. Sen jSlkeen pesty NZ kasitellaån 78 2 tunnin ajan 25°C:ssa 3-%:isessa seerumialbumiiniliuokses-sa, jossa on 0,01 M Tris.HCl (pH 8), 0,9% NaCl ja 2 yg/ml hirudiinin vasta-ainetta (kaniineista valmistettua tai mono-klonaalista vasta-ainetta). Sen jalkeen NZ pestSån kuten edel-5 la esitettiin.

Taman jalkeen NZ kasitellaan 2-3 tunnin ajan 25°C:ssa 3%: isella seerumialbumiiniliuoksella, jossa on 0,01 M Tris.HCl 125 (pH 8) ja 0,9% NaCl ja joka sisaltaa 0,2yCi/ml I-proteii-nia A (spesifinen aktiivisuus 89,8 yCi/mg) NEN). Sen jalkeen 10 NZ pestaån taas edella esitetylla tavalla, kuivataan ja γ-las-kimessa (Multi Gramma, 1260 gammalaskija, LKB; Wallace) maa-ritetaan sitoutunut radioaktiivisuus, joka on nitroselluloo-sapaperissa olevan hirudiiniaktiivisuuden omaavan polypepti-din mitta.

15 Vaihtoehtoisessa menetelmassa suoritetaan edella esitetylle naytteelle SDS-polyakryyliamidigeeli-elektroforeesi (PAGE) (vrt. (24)). PAGE-elektroferogrammi siirretaan sahkoimulla (Elektro-Blotting) nitroselluloosapaperiin. Sen jalkeen NZ kasitellaan edella kuvatulla tavalla ja/tai autoradiografoi-20 daan yon yli rontgenfilmi (Fuji) ne NZ:n kohdat, jotka si- saltavat hirudiiniaktiivisuuden omaavia polypeptideita, naky-vat filmillå mustina taplinå.

Esimerkki 20: Desulfatohirudiinin eristaminen ja puhdistami- nen trombiinipylvåan avulla 25 a. Polypeptidiliuoksen valmistaminen trombiinipylvasta vårten 150 ml kasvustoa (saatu esimerkin 18 mukaisesti) jaahdyte-taan 4°C:seen ja solut erotetaan sentrifugoimalla (5000 kierr./min. 15 min., Sorvall RC 3B). Kirkas supernatantti 30 ei sisSlla hirudiiniaktiivisuutta.

90787 79

Sen jålkeen solut suspendoidaan 12 mltaan lyysointipuskuria )50 mM Tris.HCl pH 8, 30 mM NaCl). Tåhån seokseen lisataan 15 mg lysotsyymiå (Boehringer) ja tåtå seosta pidetåån sen jalkeen 30 min, 4°C:ssa. Sitten solut rikotaan jåådyttåmål-5 la 4 kertaa nestemåisesså typesså ja taas sulatetaan 37°C: ssa. Sen jalkeen sentrifugoidaan 30 min, 16 000 kierr./min., 4°C. Supernatantti sisåltåå hirudiiniaktiivisuuden. Sen jalkeen supernatanttiin (15 ml) liuotetaan 7,7 g kiinteåå ammo-niumsulfaattia. Samean seoksen annetaan seista 4°C:ssa 30 10 minuutin ajan, jonka jalkeen sentrifugoidaan (katso edellå). Kostea sedimentti liuotetaan 1 ml:aan 0,05 mM Tris.HCl pH 8 puskuria ja saadaan haluttu polypeptidiliuos.

b. Hirudiinin puhdistus trombiinipylvååsså

Trombiinipylvås (pakatun kolonnin tilavuus 4 ml) tasapaino-15 tetaan 0,05 M Tris.HCl-puskurilla pH 8. Edellå saatu polypeptidiliuos laitetaan 5 ml:n annoksina 4°C:ssa pylvååseen liuottimen valutusnopeuden ollessa 7 ml/tunti. Sen jålkeen peståån 25 ml:lla 0,05 M Tris.HCl (pH 8). Ensimmåiset frak-tiot sisåltåvåt adsorboitumattomia polypeptideja, jotka hei-20 tetåån pois. Sen jålkeen pylvås peståån 10 ml:lla 1,5 Μ bentsamidiinia (Merck) (vrt. (25)) 0,05 M:ssa Tris.HCl (pH 8) ja saaduista fraktioista testataan hirudiiniaktiivisuus trom-biinitestillå (15) . Fraktiot, jotka sisåltåvåt polypeptidit, mååritetåån mittaamalla OD_on . Fraktiot 25 ja 26 sisåltå- 2oUnm 25 våt hirudiiniaktiivisuuden; niitå såilytetåån -20°C;ssa tai jååhauteessa, kunnes tyoskentelyå jatketaan. Hirudiiniaktiivisuus nousee fraktiossa 25 20 yg:aan/ml ja fraktiossa 26 52 .pg:aan/ml. Sitten fraktiot dialysoidaan tai suola pois-tetaan Sephadex-G25 (Pharmacia) -pylvååsså.

30 Tuotteen SDS-polyakryyliamidigeeli-elektroforeesi antaa tu-lokseksi molekyylipainon noin 7000-80000 daltonia ja tåmån kokonaislukukertoja (oligomeerit).

80 c. Trombiinipylvaan valmistus

Affi-Gel 10 (Bio Rad) pestSan valmistajan ohjeiden mukaises-ti kylmallå, tislatulla vedella ja kytkentapuskurilla pH 8,5 (0,1 M NaHC0^/Na2C02-liuos). Geelin 50-%:nen suspensio kyt-5 kentåpuskurissa (4 ml) siirretåan muoviputkeen, sekoitetaan yhta suuren måårån kanssa trombiiniliuosta (120 mg 4 ml:ssa kytkentapuskuria) (Calbiochem) ja pyoritetaan yon yli 4°C: ssa. Sen jalkeen geeli pestaan kytkentapuskurilla. Viela ak-tiivisten kohtien sulkemiseksi geeli kåsitellåån 0,1 ml:11a 10 1 M etanoliamiini-HCl-liuosta (pH 8,0) per geeli 3 tunnin ajan 4°C:ssa, jonka jalkeen pestaan fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, joka sisaltaa 10 mM natriumatsidia per gee-li-ml ja tamån jalkeen pidetaan 4°C:ssa. Kytkeytymisaste maaritetaan mittaamalla ekstinktio 280 nmrssa ja arvoksi saa-15 daan 15-30 mg hirudiinia/geeli-ml.

4 ml muodostunutta trombiinigeelia kaytetaan valmistettaessa affiniteettipylvas.

Esimerkki 21:

Erilaisten E. coli-kantojen transformointi plasmidilla pML310 20 _ja transformoituneiden isantasolujen viljely_

Esimerkissa 10d) esitetyllå tavalla kannat E. coli JA221, E, coli LM1035 ja E. coli W3110A102 transformoidaan plasmidilla pML310. Transformoiduista pesåkkeista testataan -F2~DNA:n esiintyminen, kuten esimerkissa 10e) kuvataan. Saa-25 daan kulloinkin 5, 3 tai 5 positiivista pesaketta, joita merkitaån seuraavalla tavalla: li 90787 81 E. coli .JA221 /pML310/l E. coll JA221/pML310/2 E. coli JA221/pML310/3 E. coli JA221/pML310/4 E. coli JA221/pML3l0/5 E. coll LM 1035/pML310/l E. coli LM 1035/pML310/2 E. coli LM 1035/pML310/3 E. coli W31l0A102/pML310/l E. coli w3110A102/pML310/2 E. coli W3110A102/pML310/3 E. coli W3110A102/pML310/4 E. coli W3110A102/pML310/5

Mainittuja klooneja viljellåån modifioidulla M9-elatusai-neella, jonka koostumus on seuraava:

Na2HP04.7H20 9,0 g KH2P04 3,0 g

NaCl 0,5 g NH4C1 3,5 g

CaCl2.2H20 0,015 g

MgS04.7H20 0,25 g kasaminohappoja 7,0 g hiivauutetta 5,0 g vitamiinia 0,0099 g rauta-III-sitraattia 0,006 g MOPS (3-morfolinopropaani-1-sulfonihappoa) 34,0 g glukoosia 20,0 g ampisilliinia 0,1 g

Viljellåån 37°C:ssa ja 180 kierr./min. niin kauan, ettå bak-teerisuspension absorbanssi (ODg2^) on noin 1. Sen jålkeen solut poistetaan (5 ml kasvatettua viljelmaa) ja bakteerit suspendoidaan uudestaan 0,5 ml:aan liuosta, jossa on 50 mM

82

Tris.HCl (pH 8) ja 30 mM NaCl. Tåmån jålkeen suspension pitoi-suus såådetåån 1 mg/ml lysotsyymiå (Boehringer) ja pidetåån 30 minuuttia jåisså. Bakteerit rikotaan jåådyttåmållå suspen-sio nestemåisesså typesså ja sulattamalla 37°C:ssa vuorotellen. 5 Tåmå vaihe toistetaan 5-kertaa. Sen jalkeen seosta sentrifugoi-daan 30 minuuttia 16 000 kierr./min. 4°C:ssa.

Kaikki kloonit tutkitaan hirudiiniaktiivisuuden omaavien poly-peptidien muodostumisen suhteen, mittaamalla niisså trombii-ni-inhibitio (15). Kaikissa bakteeriuutteissa todetaan hiru-10 diiniaktiivisuutta (300-600 ng/ml viljelyliuosta).. Esimerkiksi maåritetåån seuraavat hirudiiniaktiivisuudet:

Kanta Hirudiini-aktiivisuus (vig/1 viljelyliuosta) E. coli LM1035/pML310/1 300 E. coli JA 221/pML310/1 500 15 E. coli W3110Δ102/pML310/1 600

Esimerkki 22: Transformoituneen kannan E. coli W3110A102/ pML310/l fermentointi 5000 litran kåymisastias-_sa ja viljelmån jatkokåsittely_

Esimerkisså 21 kuvatulla tavalla, viljellåån 5000 litran 20 kåymisastiassa E. coli W3110Δ102/pML310/1-soluja 3000 litras-sa modifioitua M9-ela_tusainetta, kunnes suspension absor-banssi (OD^j) on. saavuttanut arvon noin 10-13.

Kasvusto (pH 7,4) jååhdytetåån 10°C:seen ja solut keråtaån Alfa-Laval BRPX-207 keråyslaitteella. Kirkas supernatantti 25 ei sisållå hirudiiniaktiivisuutta ja se heitetåån pois.

Lietteenpoiston aikana poistetaan lietettå jatkuvasti osit-tain lietetilasta lyysipuskurilla A (50 mM Tris.HCl, 30 mM NaCl, pH såådetåån HCl:llå arvoon 8,0) ja lopuksi sentrifuu-gin såilion sisålto (7 1) tyonnetåån ulos liettåmållå tåysin 30 lyysipuskurilla A. Saatu solumassa såådetåån puskurilla A ti- li 90787 S3 lavuuteen 375 1 ja pH arvoon 7,6. Jååhdytetåån 5-10°C:seen, jonka jålkeen suspensio lasketaan Dyno-myllyn (tyyppi KD5) lMpi, mylly on varustettu 4,2 litralla lasihelmiS, joiden halkaisija on 0,5 - 0,75 mm. TSlloin solut rikkoutuvat. Nain 5 saatu suspensio såadetåån etikkahapolla etikkahappopitoisuu- teen, joka on 2 % (til./til.) ja hammennetaan yon yli 10°C: ssa. Suspensiosta, jonka pH on 3,9, poistetaan liete edella kuvatulla menetelmallå. Kirkas supernatantti, 300 litraa, konsentroidaan 35 litraan tiputuskalvohaihduttimessa (tunti- 10 kapasiteetti 60 litraa vetta). Hieman samea konsentraatti sentrifugoidaan ja nain saatu kirkas supernatantti diasuoda- tetaan ultrasuodatuslaitteessa DDS = Lab 35, joka on varus- 2 tettu GR 81 PP-membraanilla (pinta 2,5 m )2 % etikkahappoa tai 0,02 M Tris-HCl-puskuria (pH 7,5) vastaan. Lopputilavuus 15 on 31 litraa.

2 litran era tåtS kirkasta proteiiniliuosta laitetaan Sepha-dex G 50 F-pylvaMseen (KS 370 Pharmacia), jonka pakatun kolon-nin tilavuus on 96 litraa, pylvas on tasapainoitettu 2 % etikkahapolla. 15 litraa eluaattia sisaltaa paafraktiot, se haih-20 dutetaan ultrasuodatuksella ja sen jalkeen diasuodatetaan vetta vastaan. Nain saatu, kirkas, vesipitoinen liuos lyofili-soidaan. Tyoskentelya voidaan jatkaa seuraavissa esimerkeisså kuvatulla tavalla.

Esimerkki 23; Kannan E. coli W3110Δ102/pML310/1 viljely 25 laboratoriomittakaavassa_

Kantaa E. coli W3110Δ102/pML310/1 inkuboidaan 37°C:ssa ja 200 kierr./min 24 tuntia ravistelukolvissa. Elatusaineella on seuraava koostumus (g/1):

Na2HP04.7H20 9,0 g KH2P04 3,0

NaCl 0,5

CaCl2 0,015

MgS04.7H20 0,25 84 rauta-(III)-sitraatti 0,006 MOPS 40 NH4C1 3,5 kasaminohapot 7,0 hiivauute 5,0

Cerelose (glukoosi) 20 ampisilliini 0,1

Elatusaineen pH-arvo on 6,54. Viljelyn kuluessa absorbanssi (ODgosnjj,) kohoaa arvoon 14,9.

Solut (50 ml kasvatettua viljelmaa) erotetaan ja suspendoi-daan uudestaan 5 ml:aan liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl 5 (pH 8,0) ja 30 mM NaCl. Taman jalkeen suspensiota ravistel- laan 5 g:n kanssa jååhdytettyja lasihelmia (halkaisija 0,5 mm) tai lisaamalla lysotsyymia (Boehringer), loppukonsentraatio 1 mg/ml, ravistellaan suurella intensiteetilla 30-45 minuu-tin aikavålein Multi-Tube Vortexer-laitteessa. 0,5 ml:aan 10 seosta lisataan 0,5 ml 2 % etikkahappoa ja seosta sentrifu-goidaan 20 minuuttia 4°C:ssa 12 000 kierr./min. supernatan-tista testataan hirudiiniaktiivisuus (trombiini-inhibitio). Trombiini-inhibitiotesti suoritetaan seuraavalla tavalla:

Testi perustuu siihen, etta maåritetaan p-nitroaniliinin 15 entsymaattinen lohkaisu kromotsyymi-TH-substraatista (tosyy-liglysyyli-propyyli-arginiini-4-nitroanidili-asetaatti). Muodostunut p-nitroaniliini mitataan kolorimetrisesti 405 nm:ssa (Dynatechen Micro-Elisa Auto Reader, Kloten). Testi suoritetaan mikrotitrauslevyilla, joissa on tasaiset pohjat 20 (Costar, Serocluster, luettelon:o 3590). Reaktioaika on 2 tuntia 37°C:ssa låmpokaapissa. Testia vårten 20 yl maari-tettavåå liuosta laimennetaan 30 yl:lla tayttopuskuria (0,2 M Tris.HCl pH 7,5, 1 M NaCl, 100 yg/ml naudan seerumialbu-miinia) ja lisataan 20 yl entsyymiliuosta (10 mg ihmisplas- 25 masta saatua lyofilisoitua trombiinia (Boehringer) liuotet-tuna 1 mlraan kahdesti tislattua vetta ja laimennettuna noin ll 90787 85 1:4000 edella mainitulla tåyttopuskurilla) ja 150 yl substraat-tiliuosta (20 ng kromotsyylmi TH:ta (Boehringer) liuotettuna 4 ml:aan kahdesti tislattua vettå ja laimennettuna 1:15 edel-lå mainitulla tåyttSpuskurilla). Kaikki liuokset mitataan 5 sokea-liuosta vastaan, joka muodostuu 70 yl:sta tayttopus- kuria (kts. edella) ja 150 yl:sta substraattiliuosta, ja ent-syymikontrolliliuosta vastaan, joka muodostuu 50 ylrsta tåyttopuskuria, 20 yl:sta entsyymiliuosta ja 150 yl:sta substraattiliuosta. Entsyymikontrolliliuoksen OD405nm“ arvo 10 2 tunnin jalkeen 37°C:ssa antaa tulokseksi 100 %:n aktii- visuuden ja arvon tulisi olla noin 0,8 - 0,2. Naytteen trom-biini-inhibitio (prosenteissa) lasketaan seuraavan kaavan mukaisesti 100 x navtteen OD.nt.

%-trombiini-inhibitio = 100 ---—- entsyymikontrolliliuoksen OD405nm 15 Edella esitetyn liuoksen trombiini-inhibitio on 49,7 % / 20 yl.

Esimerkki 24: Puhdistusmenetelmå hirudiiniyhdisteiden rikas- tamiseksi kasvustoista_

Esimerkissa 22 esitetylla tavalla viljellaan kantaa E.coli W3110Δ102/pML310/1 kåymisastiassa. Sen jalkeen solut erote-20 taan, sentrifugoidaan alas ja konsentroitu supernatantti etikkahappokåsittelyn jalkeen ultrasuodatetaan ja dialysoi-daan. Tålla tavalla saadut liuokset voidaan puhdistaa esi-merkiksi ioninvaihtokromatografisesti.

a) Anioninvaihtokromatografia MONO Q-pylvååsså (Pharmacia) 25 trOmbiinia inhiboivien fraktioiden saamiseksi_ 8,5 ml proteiiniliuosta (20 mM Tris.HCl pH 7,5/150 mM NaCl) laitetaan Mono Q-pylvååseen valmistajan Pharmacian kromato-grafiasysteemin avulla <"fast protein liquid chromatography" FPLC) ja eluoidaan seuraavissa olosuhteissa.

86

Kokeelliset olot: pylvås: Mono Q/ 4,6 nun x 150 mm; puskuri A: 20 mM Tris.HCl pH 7,5; puskuri B: 20 mM Tris.HCl/1 M NaCl. Lineaarinen suolagradientti: A. 9 ml:n kuluessa eluoidaan 15-%.:isella puskurilla B, 10,7 ml:n kuluessa B:n osuus ko-5 hoaa 70%:iin. AUFS 1,0 280 nmrssa, 1 ml fraktiot.

Eluointitilavuudessa (fraktiot 1-10) erotetaan perakkåin eluoituvien hirudiiniyhdisteiden suurempi proteiinihuippu. Fraktiot 17-23 osoittavat tfombiini-testisså trombiini-in-hibitiota, joka on valillå 20-100 %, jolloin paafraktio 10 (fraktiot 20 ja 21), jotka omaavat 92-prosenttisen inhibition, eluoidaan 500 mM:n NaCl-konsentraatiossa.

b) Anioninvaihtokromatografia DEAE-selluloosapylvaassa hiru- diiniyhdisteiden rikastamiseksi_ 10 ml:Ile dialysaattia suoritetaan anionivaihtokromatogra-15 fia DE 53 -pylvaassa (valmistaja Whatman) pH-arvossa 7,5 (kromatografointiolosuhteet: pylvas 1 x 5 cm (10 ml). Elu-ointipuskuri A: 20 mM ammoniumasetaatti, 100 mM NaCl, pH 7,5. Eluointipuskuri B: 20 mM ammoniumasetaatti, 1 M NaCl, pH 4,0. Lineaarinen suolagradientti, aina 4 pylvåstilaviiut-20 ta puskuria A vast. B). Hirudiiniyhdisteet eluoidaan pitoi-suuteen 0,4 M NaCl. Osoitus suoritetaan trombiini-inhibitio-testilla.

c) Suolan poisto P-6 DG "Desalting Gel"-pylvaassa (valmista- ja Bio-Rad)_ 25 110 ml dialysaattia (20 mM Tris.HCl, pH 7,5, konsentroitua proteiiniliuosta 2,6 litrasta supernatanttia) erotetaan samalla tavalla kuin esimerkissS 24b) on esitetty DE-53-pylvaassa. Hirudiiniyhdisteet eluoituvat fraktioissa 46-52 (150 ml), ne erotetaan erilaisista, nopeammin eluoituvista 30 ei-aktiivisista proteiinihuipuista ja konsentroidaan pyoro-

II

90787 87 haihduttimessa noin 12 ml:aan. Nain saatu, kirkas proteiini-liuos laitetaan Biogel P-6 DG-pylvaaseen ja eluoidaan vedel-la.

Kokeelliset olosuhteet: Pylvas 2,5 x 9 cm, stationaårinen 5 faasi 45 ml Biogel P-6- DG Desalting Gel; lapivirtausnopeus 1,15 ml/min, 4,6 ml:n fraktiot. Suolapitoisuus voidaan testa-ta mittaamalla johtokyky tai testaamalla hopeanitraatin avul-la (AgCl-saostus). PMSosa aktiivisuudesta eluoituu fraktiois-sa 7 - 10, joka voidaan todeta trombiini-inhibitio-testillå.

10 Fraktiot 8-10 yhdistetåan (13,5 ml),konsentroidaan pyorohaih-duttimessa 1 ml:aan ja kirkas liuos laitetaan Sephadex G 50-fine-pylvaaseen (Pharmacia), jonka pakatun kolonnin tilavuus on 160 ml, pylvas on tasapainotettu 1-prosenttisella etikka-hapolla.

15 d) Geelisuodatus Sephadex G 50 fine-pylvaalla (valmistaja: Pharmacia)_

Kokeelliset olosuhteet: pylvas: Sephadex G50 fine (31 g), 2,5 cm x 64 cm, tilavuus 310 ml; liuotin: 1 % etikkahappo; lapivirtausnopeus 43 ml/tunti, 3,8 ml:n fraktiot. AUFS: 20 0,1 282 nmrssa. Paperinsyotto 3,0 cm/tunti. Eluoitu aktiivi- suus testataan trombiini-inhibitiotestilla. 50 ml:ssa (fraktiot 39-52) saadut paafraktiot eluoituvat nopeammin kuin ei-aktiiviset sivutuotteet. (Fraktiot 53-80). Aktiivisten frak-tioiden trombiini-inhibitio kohoaa 80-100-prosentin inhibi-25 tioon.

e) Kationinvaihtokromatografia CM-selluloosalla aktiivisten lysaattien etukateen rikastamiseksi 10 ml dialysaattia (20 mM Tris.HCl, konsentraatti (1:20) 200 ml:sta supernatanttia, pH saadetty arvoon 2,0 3 ml:11a 4 N HCl:aa) erotetaan kationinvaihtajalla (CM-selluloosa). Hirudiiniyhdisteet eluoituvat fraktioissa 4-8 saadussa elu- 88 ointitilavuudessa. Testaus tapahtuu trombiini-inhibitiotes-tilla. Fraktiot 5 ja 6 inhiboivat 89-prosenttisesti, vasta-ten 88 % per 20 yl eluaattia.

Kokeelliset olosuhteet: pylvas 1,5 x 8 cm, stationåårifaasi 5 19 ml CM-selluloosaa (los MZ-3146). Lapivirtausnopeus: 43 ml/tunti, 3,8 ml:n fraktiot. Lineaarinen suolagradientti pus-kuri A. 20 mM NH OAc, pH såådetty arvoon 2 4N HCl:llå, puskur i B: 200 mM NH^OAc, pH 6,5, aina 5 pylvastilavuutta, AUFS 1,0 282 nm:ssa.

10 Esimerkki 25; Transformoituneen kannan E. coli W3110A102/ pML310/l fermentointi ja kasvuston jatkokasittely

Esimerkissa 22 esitetyllå tavalla viljellaan kåymisastiassa kantaa E. coli W3110Δ102/pML310/1 8 litrassa elatusainetta L 5 tunnin ajan, jolloin suspension absorbanssi (00^3) saa~ 15 vuttaa arvon noin 5.

Kasvustosta (pH 7,2) alassentrifugoidut solut jaahdytetåan 10°C:seen, rikotaan lysotsyymikasittelyllå ja toistuvasti (4x) vuorotellen jaadyttamålla nestemaisessS typesså ja sulat-tamalla noin 30°C:seen. Nain saatu suspensio (2,5 1 ) lai-20 mennetaan 1,5%:sella etikkahapolla (2,4 1) ja håmmennetåan 4°C:ssa 30 min. Saostuneet bakteeriproteiinit ja muut solun aineosat sentrifugoidaan 30 min. 4°C:ssa 900 kierr./min. Kir-kas supernatantti 3,2 1 konsentroidaan pyorShaihduttimessa (valm. Biichi) 320 ml:aan. Konsentraatti dialysoidaan yon yli 25 4°C:ssa 20 mM Tris.HCl-puskuria pH 7,5 vastaan ja heikosti samea dialysaatti sentrifugoidaan kauan. Lopputilavuus on 300 ml. Kirkas proteiiniliuos (0,02 M Tris.HCl pH 7) laite-taan dietyyliaminoetyyli-selluloosa-(DE 53 valm . Whatman) (20 g) pylvaaseen, jonka pakatun kolonnin tilavuus 20 ml, 30 pylvas on tasapainotettu puskurilla A (puskuri A: 20 mM am-moniumasetaatti/100 mM NaCl, pH 7,5). Ensin pestaan 1 pyl-vastilavuudella (45 ml) vakiovirtauksessa (43 ml/h) ja sen 90787 89 jalkeen lineaarisella suolagradientilla, eluoiden kulloinkin viidella pylvåstilavuudella puskuria A ja vastaavasti pusku-ria B (puskuri B: 20 mM ammoniumasetaatti/4 M NaCl, pH 5,0).

100 ml:aan eluaattia sisaltyvåt trombiini-inhibitiotestissS 5 aktiiviset pSSfraktiot (fraktiot 24-26), dialysoidaan yon yli 4°C:ssa 20 mM Tris.HCl-puskuria pH 7,5 vastaan ja sen jalkeen konsentroidaan pyorohaihduttimessa 35°C:ssa 5 ml:n lopputilavuuteen.

Nain saatu, kirkas vesipitoinen liuos laitetaan Sephadex 10 G-50 fine-pylvMåseen (Pharmacia), jonka pakatun kolonnin ti- lavuus on 160 ml, pylvas (2,5 x 64 cm Biorad) on tasapainoi-tettu 5 % etikkahapolla. 50 mlraan eluaattia sisaltyvå (fraktiot 5-7, virtausnopeus 50 ml/h, 25 min./fraktiot) paaaktii-visuus haihdutetaan pySrohaihduttimessa, jonka jalkeen suori-15 tetaan kSanteisfaasi-HPLC-erotus. Era (500 μΐ) yksittåistS fraktiota konsentroidaan "speed vac"-konsentraattorissa (valm. Savant) 1:10 ja kaanteisfaasi-HPLC-analyysilla tutki-taan sen sisaltamat desulfatohirudiini-yhdisteet. Liuokset sisaltåvat desulfatohirudiiniyhdisteita. Fraktio 6 (18 ml) 20 sisaltåå prosentuaalisesti våhaisimman måårån sivutuotteita ja se puhdistetaan edelleen puolipreparatiivisella kaanteis-faasi-HPLC:11a.

Kokeelliset olosuhteet: Vydac 218 TP 510 RP-HPLC-pylvas, 10 x 250 mm; fraktion 6 erien maarat (200 pi 1:10 konsentroi-25 tua) erotusta kohti; AUFS 0,5 220 nm:ssa; ISpivirtausnopeus: 2 ml/min. Eluentti: A: 0,1 % trifluorietikkahappo, B: ase-tonitriili/vesi 8:2 + 0,07 % trifluorietikkahappo, 1 min.

16% B, sen jalkeen 40 minuutin kuluessa B:n osuus nousee 64%:iin. Nåin saadut fraktiot laimennetaan 1:1 vedella ja 30 lyofilisoidaan. Jaannos muodostuu puhtaista desulfatohiru-diiniyhdisteista.

Esimerkki 26: Kannan E. coli W3110Δ102/pML310/1 fermentoin-nista saadun tuoteseoksen analyysi_ 90

Esimerkin 25 mukaisesti saadut, trombiini-inhibitiotestisså aktiiviset fraktiot tutkitaan HPLC-analyysilla, kahdessa eri olosuhteessa.

a) Kokeelliset olosuhteet n:o 1: 5 Nucleosil (MN) C18, 5 pm RP-HPLC-pylvas, 4,6 x 120 mm; 50 pi hirudiini-yhdisteita erotusta kohti, Att. 6 214 nm:ssa; lapi-virtausnopeus 1,2 ml/min; eluentti: A: 0,1 % trifluorietikka-happo, B: asetonitriili/vesi 8:2 + 0,07 & trifluorietikkahap-po, 2 min- 16 % B, sen jalkeen 30 minuutin kuluessa B:n osuus 10 nousee 64%:iin. Vastapaine: 107 baaria.

Yhden minuutin aikavålein kerataan fraktiot (yhteensa 30), jotka tutkitaan trombiini-inhibitiotestillS ja vasta-aine-testilla (vrt. esimerkki 19). Fraktiot 12-15 osoittautuvat aktiivisiksi. Lisaksi maaritetaån fraktion 14 aktiivisen hi-15 rudiiniyhdisteen aminohappokoostumus, N-paa ja C-paa. Tama fraktio (n:o 14) on verrattavissa desulfatohirudiiniin, joka, kuten esimerkissa 28 kuvataan, saadaan saattamalla verijuo-tikkaista saatu luonnollinen hirudiini reagoimaan aryylisul-fataasi-entsyymin kanssa. Tulokset on esitetty seuraavassa 20 Taulukossa 1:

Taulukko 1: . Retentioaika Troribiini- Vasta-aine- fraktio (min) inhibitio (¾) testi Δ (cpm)

Fr 12 11,75 + 35 +

Fr 13 12,50 ++ +

Fr 14 12,80 ++ 79 + 13850

Fr 15 13,14 + 27 + 12440 kontrolli - - 9-250 tesulfato- ut ,, 86 , urudiim i! 90787 91

Kontrollikannan E. coli Κ3110Δ102 ("Kontrolli") fraktiot eivSt ole aktiivisia trombiini-inhibitiotestissS eivStka vasta-ainetestissa. Tallaiset fraktiot saadaan viljelemMUS transformoitumatonta kantaa E. coli W3110A102 samoissa olo-5 suhteissa, kuin esimerkisså 22 esitetaån ja kåsittelemållå kasvusto edelleen esimerkin 25 mukaisesti.

b.) Kokeelliset olosuhteet n:o 2: RP-HPLC-pylvås, Vydac 218 TP 5415 4,6 x 150 mn; 100 pi (1:10 kons.) , fraktiota 6 (vrt. esimerkki 25) erotusta kohti; 10 AUFS 0,1 214 nmrssa; låpivirtausnopeus 1,2 ml/min; eluentti: A. 0,1 % trifluorietikkahappo, B: asetonitriili/vesi 8:2+ 0,07 % trifluorietikkahappo. Gradientti: 2 min 16 % B, sen jSlkeen 3 minuutin kuluessa B:n osuus nousee 20%:iin, sen jMlkeen 15 minuutin kuluessa B:n osuus nousee 25%:iin, jonka 15 jalkeen 27 minuutin kuluessa B:n osuus nousee 64%:iin. Vasta-paine 160 baaria.

Seuraavassa taulukossa 2 on esitetty trombiini-inhibitiotes-tissa ja vasta-ainetestissa aktiiviset fraktiot. Taulukossa on lisaksi esitetty konsentraatiot NaCl:lle mM:ssa, jotka 20 vaaditaan fraktioiden eluoimiseksi Mono Q-pylvaastå (anioni-vaihtokromatografia) (vrt. esimerkki 24a), seka eraiden fraktioiden pitkaaaltoiset UV-absorptiovyot (UV ^ ks)). Kaikil- la fraktioilla on lisåksi positiivinen reaktio anti-hirudiini-vasta-aineella (virt. esimerkki 30) .

92

Taulukko 2:

Reten- Tranbiinl-^vasta-alne FPLC UV(X ) saanto fraktio tioai- inhibitxK J1 2 3 4 5 6 7®"8 μ g testiA/cpm M "*cl n:° <.!„.)

RP-HPLC

1 15,63 97,8 ± 2 16Ί96 350 223s,274 4 2 16,83 91,9 t 2 14*157 390 275 1.6 3 18,43 79,9 l 2 9*257 1 4 19,6 81,7 ± 5 11*877 420 1.5 5 20,6 50,4 l 5 7'647 460 1.5 6 21,53 66,1 i 5 9*584 500 273 1.5 kontrolli - O 508 PBS- 66 puskuri

Desulfato- 15A5 97,3 ± 2 15*400 350 274 ca. 4 lirudiini

Esimerkki 27:

Kannan E. coli W311 0Δ1 02/pML3'l 0/1 fermentoimalla saatujen desulfatohirudiiniyhdisteiden karakterisointi

II

Hirudiiniyhdiste fraktiosta 14 (vrt. esimerkki 26, "Ko-5 keelliset olosuhteet n:o 1" Taulukko 1) tai fraktiosta 1 2 (vrt. esimerkki 26 "Kokeelliset olosuhteet n:o 2, Taulukko 2), 3 karakterisoidaan seuraavalla tavalla: 4 a) Aminohappokoostumuksen maarittaminen 5

Noin 2,5 pg hirudiiniyhdistetta hydrolysoidaan 6 N HClslla 6 10 110°C:ssa 24 tunnin ajan, jonka jalkeen analysoidaan Chang et 7 al:n esittåmSllå menetelmallS (DABS-Cl-menetelmS) (Viite 31).

8

Hydrolysaatti sisaltaa seuraavan koostumuksen.

90787 93

Aminohappo Hydrolysaatti Aminohappo Hydrolysaatti

Asp 9,8 (9) Ile 1.8 (2)

Thr A,2 (A) Leu 3.9 (A)

Ser Α,Α (A) Tyr 1,5 (2)

Glu 12,6 (13) Phe 1 (1)

Pro 3,7 (3) Hie 1,1 (1)

Gly 9,3 (9) Lye 3,A (3)

Val 3,5 (A) Met O (0) kystiini 2,2 (3) yhteensS (65) b) Osittaiset sekvenssianalyysit 5 yg (750 pmoolia) hirudiiniyhdistettå tutkitaan klassisella sekvenssianalyysilla Edmanin mukaisesti ja N-terminaaliset fenyylitiohydantoiini (PTH)-aminohapot mååritetaån RP-HPLC:lla.

5 Tulos: sykli 1 5 10 aminohappo Val Val Tyr Thr Asp n.b.Thr Glu Ser Gly sykli 11 15 aminohappo Gin Asn Leu n.b. Leu n.b. Glu 10 (n.b. ei maaritetty).

Tutkitun, biosynteettiset hirudiiniyhdisteen N-terminaalinen sekvenssi on taten identtinen luonnollisen hirudiinin kanssa (viite 1).

c) C-terminaalisten aminohappojen maarittaminen karboksipep-tidaasi Y-hajotuksella 94 C-terminaalisten aminohappojen ajasta riippuva hajottaminen karboksipeptidaasilla Y tuottaa C-pSån 60 65 - ile - Pro - Glu - Glu - Tyr - Leu - Gin

Aminohappojen måårittåminen tapahtuu aminohappoanalysaatto- 6 3 5 rilla. Talloin osoittautuu, etta Tyr ei ole sulfatoitunut (desulfatohirudiini!).

Transformoituneen E. coli W3110Δ102/pML310/1-kannan fermen-toinnin paatuotteessa on kysymys desulfatohirudiinista , minka myos rakennetiedot ja vertailu luonnon hirudiinista saa-10 tuun desulfatohirudiiniin osoittavat.

II Muiden kåymistuotteiden rakennetta ei viela ole tåysin selvitetty. Fraktioissa 2-6 (vrt. taulukko 2) esiintyy maa-riteltyja yhdisteitå, jotka HPLC- ja FPLC-arvojen sekå UV-absorptiomaksimien perusteella on riittavasti måaritelty.

On varmaa, etta naissa yhdisteisså esiintyy desulfatohiru-15 diinin kaltaisia yhdisteitå, jotka eroavat desulfatohirudii nista rakenteellisen mikroheterogeenisyytenså vuoksi (esim. eri tavalla kytketyneet S-S-sillat) tai modifikaatioilla N-tai C-paissa (esim. N-terminaalinen metionyyli-tahde tai N-terminaali on asyloitu, kuten formyloitu tai asetyloitu).

20 Myos kantojen E. coli LM1035/pML310/1, E. coli JA221/pML 310/1 ja E. coli HB101/pML310 fermentoinnissa voidaan desulfatohirudiini identifioida paatuotteena.

Esimerkki 28: Desulfatohirudiinin valmistus luonnollisesta hirudiinista vertailua vårten 25 Luonnollinen hirudiini liuotetaan pitoisuuteen 2 mg/ml pus- kuria (0,1 M ammoniumasetaatti, pH 5,5). 20 pg:aan hirudiinia (10 yl liuosta) lisataan 100 yl aryylisulfataasin, josta suo-

II

90787 95 la on poistettu, (Boehringer)-liuosta, joka sisSltaa 16 yg aryylisulfataasia. Inkuboidaan 25°C:ssa ja reaktiota seura-taan HPLC-analyyseillå. 6 tunnin inkuboinnin jSlkeen yli 90% hirudiinista on desulfatoitunut. Muodostuneen desulfatohi--5 rudiinin retentioaika laskettuna esimerkissa 26 ("Kokeelli-set olosuhteet a":) kuvatuissa olosuhteissa on 12,8 min ja esimerkissa 26 ("Kokeelliset olosuhteet b”) kuvatuissa olosuhteissa 15,45 min.

Aminohappokoostumus, sekvenssianalyysi Edman-hajotuksella ja 10 C-terminaalisten aminohappojen maarittaminen karboksipepti-daasi- Y-hajotuksella antaa tulokseksi desulfatohirudiinil-le odotetut arvot.

Esimerkki 29; Desulfatohirudiiniyhdisteiden ilmentyminen hiivassa (S. cerevisiae) .

15 Vieraan proteiinin ilmentyminen hiivassa vaatii tietyn ilmen-tymissysteemin. Sen tulee sisaltaa vahva hiivapromoottori, mieluimmin indusoitavissa oleva hiivapromoottori ja sopivat transkription lopetussignaalit plasmidivektorille, jolla hiivasolut voidaan transformoida. Vektori sisaltaa myos DNA-20 sekvenssit, mieluimmin hiiva 2y-sekvenssit, jotka takaavat kromosomien ulkopuolisen replikaation ja suuren kopiomaårån. Sen tulee lisSksi sisaltaa valintamerkki hiivalle, mieluimmin hiiva LEU2-geenille ja pBR322 DNA-sekvenssit, joissa on luennanaloituskohta ja valintamerkki, mieluimmin ampisillii-25 ni-resistenssigeeni, kaytettavaksi E. colissa. Tållaisina vektoreina sopivia ovat muun muassa sukkulavektorit, jotka lisaantyvat E. colissa ja hiivassa.

Ilmentymissysteemi, joka tayttaS nama vaatimukset, on ku-vattu eurooppalaisessa patenttihakemuksessa n:o 100,561 ja 30 esimerkein osoitettu tehokas ilmentyminen hiivassa. Vieraat geenit ilmentyvSt hiivassa indusoitavissa olevan hapanfosfa-taasin PH05-promoottorin kontrolloimina.

96 PH05-promoottori, vieras geeni ja PH05-transkription lope-tuskohta ovat integroituneet sarjaan hiiva-vektorissa pJDB207, joka sisaltåå mybs hiiva-2y plasmidin DNA-sekvens-sit, hiiva-LEU2-geenin, ampisilliini-resistenssigeenin ja 5 E. coli luennanaloituskohdan.

Ilmentymisplasmidi pJDB207R/PHO5-HIR valmistetaan seuraaval-la tavalla: a) pJDB207-vektorin fragmentin eriståminen 6 yg plasmidia pJDB207R/IF (a-3) (EP 100,561) pilkotaan tåy-10 dellisesti restriktioendonukleaasilla BamHI. Muodostuneet DNA-fragment.it (6,85 ke ja 1,15 ke) saostetaan etanolilla ja otetaan 400 yl:aan liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl pH 8. Lisåtåån 4,5 yksikkoa vasikan suoli-fosfataasia (Boehringer, Mannheim). Seosta inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa, jonka jål-15 keen fosfataasi inaktivoidaan 65°C:ssa 1,5 tuntia. Liuos saadetaan pitoisuuteen 150 mM NaCl ja sen jålkeen laitetaan DE52 (Whatman) anionvaihtopylvååseen (100 yl tilavuus), joka pylvas etukåteen on tasapainotettu liuoksella, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA. Pestaån kerran sa-20 malla puskurilla, jonka jålkeen DNA eluoidaan 400 yl:lla liuosta, jossa on 1,5 M NaCl, 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, ja saostetaan etanolilla. Suuri 6,85 ke:n BamHI-frag-mentti erotetaan pienesta fragmentista 1,2-%:sella agaroosi-geelillå. Tris-boraatti-EDTA-puskurissa, pH 8,3.

25 b) 534 bp PH05 promoottori-fragmenttien eriståminen 6 yg plasmidia p31/R (EP 100,561) pilkotaan restriktioendo-nukleaaseilla EcoRI ja BamHI. Muodostuneet 3 DNA-fragmenttia erotetaan 1,2-%:isella agaroosigeelillå. Tris-boraatti-EDTA-puskurissa pH 8,3. 534 bp BamHI-EcoRI-fragmentti eristetåån. 30 Se sisåltåå PH05-promoottorin mukaan luettuna transkriptio-aloituskohdat.

il 90787 97 c) Hirudiinia koodittavan sekvenssin sisSltavSn 206 bp DNA-fragmentin eristMminen 9 pg plasmidia pML310 (vrt. esimerkki 13c) pilkotaan tSydel-lisesti restriktioentsyymeilla BamHI ja EcoRI. Muodostuneet 5 kaksi DNA-fragmenttia erotetaan 1,2-%:isella agaroosigeelillå. Tris-boraatti-EDTA-puskurissa pH 8,3. 206 bp EcoRI-BamHI-fragmentti eristetaan.

g) DNA-fragmenttien liittaminen

Agaroosigeelipaloista saadaan elektroeluoimalla kolme koh-10 dissa a-c mainittua (katso edellå) DNA-fragmenttia, ne puh-distetaan DE52 (Whatman) anioninvaihtajassa, saostetaan eta-nolilla ja suspendoidaan uudestaan veteen.

0,1 pmoolia (0,45 pg) 6,85 ke BamHI vektori-fragmenttia, 0,3 pmoolia (0,1 pg) 534 bp BamHI-EcoRI PHQ5-promoottori-15 fragmenttia ja 0,25 pmoolia (34 ng) pML310:n 206 bp EcoRI-

BamHI-fragmenttia liitetaan 15°C:ssa 16 tunnin ajan 15 pl:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 20 mM DTT, 1 mM ATP, 600 yksikolla DNA-ligaasia (Biolabs).

g 24 transformoitunutta amp -pesaketta kasvatetaan erikseen 20 LB-elatusaineessa, joka sisaltaa 100 pg/ml ampisilliinia. Plasmidi-DNA eristetaan menetelmallM, jonka ovat esittaneet Holmes et al. (32) ja analysoidaan Hindlll/EcoRI kaksoisleik-kauksella. Noin 600 emassuuruisen EcoRI-HindIII-fragmentin esiintyminen osoittaa, etta kyseesså olevassa kloonissa PH05 25 promopttori-hirudiini-DNA-fragmentti on vektorissa oikeassa suunnassa transkriptiolopetussignaalin suhteen. Kuten oli odotettua noin 50%:ssa klooneista ovat inertit oikeassa suunnassa. YhtS naista klooneista nimitetaSn pJDB207R/PHO5-HIR.

e) Saccharomyces cerevisiae GRF18;n transformointi 30 Saccharomyces cerevisiae kanta GRF18 (a, his3-11 , his3-15, 98 p leu2-3, leu2-112, can ) transformoidaan plasmidilla pJDB207R/ PH05-HIR menetelmSllå, jonka ovat esittåneet Hinnen et al.

(12). Transformoituneet hiivasolut valitaan agarmaljoilla, jolssa on hiiva-minimialustaa ilman leusiinia. Transformoitu 5 hiivapesake eristetaan ja merkitåån Saccharomyces cerevisiae GRF.18/pJDB207R/PH05-HIR.

f) S. cerevisiae GRF18/pJDB207R/PHQ5-HIR:n kasvatus S. cerevisiae GRF18/pJDB207R/PHQ5-HIR soluja kasvatetaan 20 ml:ssa hiivaminimialustaa (Difco hiiva typpialusta, ilman 10 aminohappoja, johon on lisatty 2 % glukoosia ja 20 mg/1 L-histidiinia) 30°C:ssa ravistellen, kunnes solutiheys on 3 x 7 10 solua/ml. Solut pestaan 0,9-%:isessa NaCl:sså, jonka jål-keen niita kaytetaan ympattaessa 50 ml: matala-P^-minimi-alustaviljelmia. Matala-P^-minimialusta vastaa koostumuksel-15 taan Difco-hiiva-typpi-emas-alustaa (ilman aminohappoja), se sisaltaa kuitenkin 0,03 g/1 KH2PO^, 1 g/1 KCl, 10 g/1 L-as-paragiinia (NH^JjSO^in, 2 % glukoosin ja 1 g/1 L-histidiinin sijasta. Viljelmaa ympåtaån, kunnes solutiheys on 4 x 10^ solua/ml ja ravistellaan 30°C:ssa 24 tuntia 200 kierr./min.

20 g. S. cerevisiae GRF18/pJDB207R/PHQ5-HIR:n fermentoinnilla saadun tuoteseoksen analyysi

Solut erotetaan (vrt. esimerkki 29f) tavalliseen tapaan (vrt. esim. eurooppalainen patenttihakemus n:o 100,561). 1,5% etik-kahapolla kasitelty supernatantti sentrifugoidaan ja kulloin-25 kin 2 ml kirkasta liuosta kuivataan "Speed Vac" konsentraatto-rissa ja suurtyhjossa. Naytteet liuotetaan yksittain 100 μΐ: aan vettS ja niille suoritetaan HPLC-analyysi (olosuhteet kuten esimerkissa 26a). Yksittåisten fraktioiden trombiini-inhibitio testataan. Fraktio, jonka retentioaika on 12,8 min, 30 omaa 89,6 % trombiini-inhibition. Aminohappokoostumuksen pe-rusteella se on desulfatohirudiini.

II

90787 99

Esimerkki 30; Monoklonaalisia anti-hirudiini-vasta-aineita sisSltavat testipakkaukset hirudiinin maSrit-tSmiseksi, kompetitiivinen radio-immunomaaritys a. Monoklonaalisten anti-hirudiini-vasta-aineiden valinistus 5 A) Hiirten immunisointi

Lyofilisoidussa muodossa olevaa puhdasta hirudiinia (3 mg) liuotetaan pieneen maåraån 0,1-%:ista etikkahappoa, jonka jal-keen taytetSan 3 ml:aan fosfaattipuskuroidulla keittosuola-liuoksella. pH såådetaån arvoon 7,2. Erat tata antigeeniliuos-10 ta sekoitetaan yhta suurien maarien kanssa taydellista Freun-din apuainetta tai fosfaattipuskuroit.ua suolaliuosta.

Naaras-Balb/c-hiirille (8 viikon ikaisla, hankittu Sisselnin elainfarmilta, SveitsistM) injektoidaan suonensisaisesti 100 pig hirudiinia liuoksena puskuroidussa suolaliuoksessa.

15 Nelja paivåa myohenunin otetaan perna fuusiota vårten.

B) Hydridomien valmistus ja vasta-ainetesti

Hybridomasolujen valmistus tapahtuu fuusioimalla saadut per- nasolut myeloomasolulinjan X63-Ag8.6.5.3 (26) kanssa. Talloin 8 7 kaytetSSn 10 pernasolua ja 10 myeloomasolua. Fusio suori-20 tetaan kuten viitteessa (27) esitetaan.

Anti-hirudiini-aktiivisuus maaritetSan hybridomaliuoksissa radioimmunomaarityksen avulla (RIA, (28)).

C) Anti-hirudiini-vasta-aineen eristSminen ja puhdistaminen askites-nesteesta 25 Balb/c hiiret kSsitellåMn etukMteen intraperitoneaalisesti

0,4 ml :11a Pristania (Carl Roth). Viikon kuluttua injektoidaan intraperitoneaalisesti 2 - 5 x 10^ kloonattua hybridoma-so-lua. Jokaiselta hiirelta otetaan toistuvasti askites-nestettS

1 00 ja jååhdytetåån -80°C:ssa. Keråtyt nesteet yhdistetåån ja sentrifugoidaan 30 min 4°C:ssa 16 000 kierr./min. Rasva pois-tetaan imemållå ja jaljelle jaavaan Debri-vapaaseen superna-tanttiin lisataan tipoittain hitaasti, samalla jaahdyttaen 5 0°C:ssa, 0,9 tilavuusekvivalenttia kyllastettyå ammoniumsul-faattiliuosta. Saatu raaka immunoglobuliinifraktio jaetaan kayttaen 0,1 m Tris.HCl (pH 8,2) Sephacryl G 2000 (Pharmacia) pylvasta valmistajan ohjeiden mukaisesti. Aktiiviset fraktiot yhdistetåån ja konsentroidaan Amicon XM50-suodattimella 10 (Amicon).

b. Testipakkaus kompetitiivista radio-immunomååritystå vårten

Esimerkin 30 aC) mukaisesti valmistettu anti-hirudiinivasta-aineliuos laimennetaan fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PSB-liuos) konsentraatioon 1 yg/100 yl. 100 μΐ tatå liuosta 15 inkuboidaan 2 tunnin ajan 37°C:ssa muoviputkissa tai muovi-silla mikrotitrauslevyilla, jolloin vasta-aine adsorboituu epåspesifisesti muovipinnalle. Muovipinnalla olevien, vielå vapaiden aktiivisten kohtien tayttåmiseksi, kåsitellåan naudan-seerumialbumiini-liuoksella f-BSA-liuos) .

20 Nåyteliuoksen tai standardiliuoksen laimennussarjaan BSA- liuoksessa lisataan aina 50 yl liuosta, joka on tunnetulla 125 tavalla (29) radioaktiivisella -jodilla leimattua hiru-diinia, jonka aktiivisuus 10 000 cpm / 50 yl, jonka jålkeen inkuboidaan muovipinnoilla 2 tuntia 37°C:ssa ja 12 tuntia 25 4°C:ssa. Putket tai mikrotitrauslevyt peståån fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella ja radioaktiivisuus mitataan. Hirudiinin pitoisuus nåyteliuoksessa mååritetåån standardiliuoksen avulla valmistetusta vertailukåyråstå.

Testipakkaus kuvattua radio-immunotestia vårten sisåltåå: 30 2 ml anti-hirudiini-vasta-aineliuosta esimerkistå 30aC), pi toisuus 1-10 mg/ml.

90787 101 100 ml fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS-liuos) 100 ml 0,3 % naudan suuremialbumiinia ja 0,1 % natriumatsi-dia PBS-liuoksessa (BSA-liuos) 2 ml radioaktiivista hirudiiniliuosta, jonka aktiivisuus on 5 200 000 cpm/ml 2 ml standardiliuosta, joka sisaltaa 100 ng/ml hirudiinia 1 ml:n muoviputket tai muoviset mikrolevyt

Esimerkki 31; Parenteraaliseen annostukseen tarkoitettu

farmaseuttinen valmiste, joka sisSltaa desul-1 0 fatohlrudiiniyhdistettM

Liuos, joka esimerkin 27 mukaisesti sisaltåå desulfatohiru-diiniyhdistetta, diasyloidaan 0,9-prosenttisista NaCl-liuos-ta vastaan. Liuoksen pitoisuus sSadetSMn laimentamalla samal-la NaCl-liuoksella 0,2 mg:aan/ml tai 2 mg:aan/ml. Tama liuos 15 steriloidaan ultrasuodattamalla (membraaneissa 0,22 pm:n huo-koset) .

Steriloidut liuokset ovat suoraan kayttokelpoisia, esim. las-kimonsisåiseen annostukseen. Samalla tavalla valmistetaan parenteraalisesti annostettavat liuokset, jotka sisåltåvat 20 esimerkin 27 mukaisten desulfatohirudiini-yhdisteiden seok-sia.

102

Kirjallisuusviitteet; 1. J. Dodt et al., FEBS Lettere 165, 180 (1984) 2. P. Walsroann et al., Pharmazie 36, 653 (1981) 3. S.A. Narang, Tetrahedron 39, 3 (1983) 4. K.L. Agarwal et al., Angew. Chem. 84^, 489 (1972) 5. C.B. Reese, Tetrahedron 34, 3143 (1972) 6. R.L. Letsinger ja W.B. Lunsford, J. Am. Chem. Soc. 98, 3655 (1976) 7. K. Itakura et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 706 (1981) 8. H.G. Khorana et al., J. Biol. Chem. 251, 565 (1976) 9. S.A. Narang et al.. Anal. Blochem. 121, 356 (1982) 10. K. Itakura et al., J. Biol. Chem. 257, 9226 (1982) 11. A.M. Maxam ja W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Scl. USA 7jUt 560 (1977) ; katso myos Meth. Enzym. 65, 499 (1980) 12. A. Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Scl. USA 75, 1929 (1978) 13. Anagnostopoulos et al., J. Bacteriol. ΙΠ, 741 (1961) 14. M. Mandel et al., J. Mol. Biol. 53, 159 (1970) 15. H.U. Bergmeyer (Hrsgb.), Methods of Enzymatic Analysis, Vol. II, 3. painos S. 314-316, Verlag Chemie, Weinheim 1983.

16. F. Markvardt et al., Thromb. Haemostasis 42, 226 (1982) 17. Kohler ja Milstein, Nature 256, 495 (1975) 18. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (ed. T. Maniatis et al.), Cold Spring Harbor Lab., 1982, S. 125 19. W. Muller et al., J. Mol. Biol. 124, 343 (1978) 20. M. Grunstein ja D.S. Hogneas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961 (1979) 21. Ish-Horowitz, in loc. cit. 18), S. 368 22. DE-OS 3 111 405 (Genentech) 23. A.C. Peacock et al.. Biochemistry 6, 1818 (1967) 24. U.K. Laemmli, Nature 227, 680 (1970) 25. P. Walsmann, Pharmazie 36, 860 (1981) 26. J.F. Kearney et al., J. Immunol. 123, 1548 (1979) 27. S. Alkan et al.. Mol. Immunol. 20, 203 (1983) 28. T. Chard, An Introduction to Radioimmunoassay and related Techniques, North-Holland Publ. Comp., Amsterdam 1978

II

90787 103 29. A.E. Bolton ja W.M. Hunter. Biochem. J. 1JI3, 529 (1973) 30. J. Clarke ja J. Carbon, J. Mol. Biol. 120, 517 (1978) 31. J.Y. Chang et al., Methods In Enzymology, 91, 41 (1983) 32. D.S. Holmes et al.. Anal. Biochem. 114, 193 (1981)

Claims (4)

1. Ilmentymisvektori, tunnettu siitS, ettå se sisMltåa desulfatohirudiinia, jonka aminohapposekvenssi on ValValTyrThrAspCysThrGluSerGlyGlnAsnLeuCysLeuCysGluGlySerAsnValCys GlyGlnGlyAsnLysCysIleLeuGlySerAspGlyGluLysAsnGlnCysValThrGlyGluGly ThrProLysProGlnSerHisAsnAspGlyAspPheGluGluIleProGluGluTyrLeuGln koodittavan DNA-sekvenssin, jota E. colin tai hiivan ilmentymisenohjaussekvenssi såatelee siten, etta tålla ilmentymisplasmidilla transformoituneet E. coli- tai hiivasolut tuottavat desulfatohirudiinia.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen ilmentymisvektori, tunnettu siita, etta ilmentymisenohjaussekvenssi on E. colin tryptofaanioperonin tai hiiva-PH05-geenin ilmentymisenohjaussekvenssi.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen ilmentymisvektori, tunnettu siita, etta se soveltuu desulfatohiru-diinin ilmentamiseen jossakin Saccharomvces cerevisiae-kannassa.

4. Menetelma desulftohirudiinin, jonka aminohapposekvenssi on ValValTyrThrAspCysThrGluSerGlyGInAsnLeuCysLeuCysGluGlySerAsnValCys GlyGlnGlyAsnLysCysIleLeuGlySerAspGlyGluLysAsnGlnCysValThrGlyGluGly ThrProLysProGlnSecHisAsnAspGlyAspPheGluGluIleProGluGluTyrLeuGln ja sen suolojen valmistamiseksi, tunnettu siita, etta patenttivaatimuksen 1 mukaisella ilmentymisplasmi-dilla transformoituja Ej. coli- tai hiivasoluja viljellaan nestemåisessS elatusaineessa, joka sisåltåå assimiloitu-via hiili- ja typpilMhteita, ja desulfatohirudiini eris-tetåan, ja saatu suola muutetaan haluttaessa vapaaksi polypeptidiksi tai saatu polypeptidi suolakseen. II 90787 1 05 Pat.ent.krav: