ES2944736T3 - Proceso para producir azúcares a partir de materiales de carbohidratos - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un proceso para la preparación de un azúcar y/o producto de fermentación a partir de material lignocelulósico.10 (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proceso para producir azúcares a partir de materiales de carbohidratos

Campo

La solicitud se refiere a un proceso para preparar un producto de azúcar a partir de material de carbohidratos mediante hidrólisis enzimática y a un proceso para preparar un producto de fermentación mediante fermentación de azúcares. Antecedentes

El material lignocelulósico se compone principalmente de celulosa, hemicelulosa y lignina y proporciona una plataforma atractiva para generar fuentes de energía alternativas a los combustibles fósiles. El material está disponible en grandes cantidades y se puede convertir en productos valiosos, por ejemplo, azúcares o biocombustibles, tal como el bioetanol. La producción de productos de fermentación a partir de material lignocelulósico se conoce en la técnica y en general incluye los pasos de pretratamiento, hidrólisis, fermentación y opcionalmente recuperación de los productos de fermentación.

Comúnmente, los azúcares producidos se convierten en productos de fermentación valiosos tal como el etanol por microorganismos como la levadura. La fermentación tiene lugar en un paso de proceso separado, preferiblemente anaeróbico, ya sea en el mismo o en un recipiente diferente.

En general, el costo de producción de enzimas es un factor de coste importante en el proceso de producción global de productos de fermentación a partir de material lignocelulósico. Hasta ahora, la reducción de los costos de producción de enzimas se logra mediante la aplicación de productos enzimáticos de una sola o de múltiples fuentes microbianas (ver WO 2008/008793) con una actividad hidrolítica más amplia y/o más alta (específica). Esto conduce a una necesidad enzimática más baja, tasas de conversión más rápidas y/o rendimientos de conversión más altos y, por lo tanto, a costos de producción generales más bajos.

Junto a la optimización de las enzimas, la optimización del diseño de proceso es una herramienta crucial para reducir los costos generales de la producción de productos de azúcar y productos de fermentación. Por ejemplo, la pérdida de azúcar por medio de productos de degradación de azúcar incrementa con la disminución de rendimiento. Dado que los productos de degradación dl azúcar pueden inhibir la fermentación, el diseño de proceso se debe optimizar para disminuir la cantidad de estos productos de degradación de azúcar.

WO2014/191267 describe un proceso para la hidrólisis de biomasa que contiene celulosa que comprende un paso de pretratamiento para la biomasa que contiene celulosa y un paso de sacarificación en la que la biomasa que contiene celulosa pretratada se convierte en glucosa, donde en el paso de sacarificación se añaden celulasas a la biomasa que contiene celulosa pretratada, donde las celulasas comprenden beta-glucosidasa y otra celulasa, donde se añaden menos de 10 mg de celulasa (en proteína) por gramo de celulosa presente en la biomasa que contiene celulosa (en materia seca), y donde la cantidad de beta-glucosidasa es al menos 4 % en peso de las celulasas (en proteína).

Por razones económicas, por lo tanto, es deseable incluir configuraciones de proceso nuevas e innovadoras destinadas a reducir los costos de producción generales en el proceso que implica pretratamiento, hidrólisis y fermentación de material de carbohidratos.

Breve descripción

Un objeto de la solicitud es proporcionar un proceso mejorado para la preparación de un producto de azúcar y/o un producto de fermentación a partir de material de carbohidratos. El proceso se mejora mediante el uso de condiciones de hidrólisis específicas.

Descripción detallada

A lo largo de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las palabras "comprenden" e "incluyen" y variaciones tal como "comprende", "que comprende", "incluye" e "que incluye" se deben interpretar de manera inclusiva. Es decir, estas palabras pretenden transmitir la posible inclusión de otros elementos o números enteros no mencionados específicamente, cuando el contexto lo permita. Los artículos "un" y "una" se usan en la presente para referirse a uno o más de uno (es decir, a uno o al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A manera de ejemplo, "un elemento" puede significar un elemento o más de un elemento.

La invención se refiere a un proceso para la preparación de un producto de azúcar a partir de material de carbohidratos, que comprende los pasos de (a) pretratar el material de carbohidratos, (b) licuar el material de carbohidratos pretratado con una composición enzimática a una temperatura de 60 °C a 65 °C durante 1 a 20 horas para producir un material de carbohidratos licuado, (c) sacarificar el material de carbohidratos licuado con una composición enzimática a una temperatura de 50 °C a 60 °C durante 1 a 120 horas para producir un producto de azúcar, donde se añade oxígeno durante la sacarificación, y (d) opcionalmente, recuperar el producto de azúcar. La expresión “producto de azúcar”, “uno o más azúcares” o “azúcar” se usan indistintamente en la presente. Alternativamente, se puede usar el término "material de carbohidratos hidrolizado" en lugar de estos términos.

Preferiblemente, la invención se refiere a un proceso para la preparación de un producto de azúcar a partir de material de carbohidratos, que comprende los pasos de (a) pretratar el material de carbohidratos en un primer reactor, (b) licuar el material de carbohidratos pretratado con una composición enzimáticas a una temperatura de 60 °C a 65 °C durante 1 a 20 horas para producir un material de carbohidratos licuado en un segundo reactor, (c) sacarificar el material de carbohidratos licuado con una composición enzimática a una temperatura de 50 °C a 60 °C durante 1 a 120 horas para producir un producto de azúcar, donde se añade oxígeno durante la sacarificación, en un tercer reactor, y (d) opcionalmente, recuperar el producto de azúcar. “Reactor" como se usa en la presente también puede significar más de un reactor. Por lo tanto, "un primer reactor" también puede significar una serie de primeros reactores.

La invención se refiere además a un proceso para la preparación de un producto de fermentación a partir de material de carbohidratos, que comprende los pasos de (a) pretratar el material de carbohidratos, (b) licuar el material de carbohidratos pretratado con una composición enzimática a una temperatura de 60 °C a 65 °C durante 1 a 20 horas para producir un material de carbohidratos licuado, (c) sacarificar el material de carbohidratos licuado con una composición enzimática a una temperatura de 50 °C a 60 °C durante 1 a 120 horas para producir un producto de azúcar, donde se añade oxígeno durante la sacarificación, (d) fermentar el producto de azúcar para producir un producto de fermentación, y (e) opcionalmente, recuperar el producto de fermentación.

En la presente también se describe un proceso para la preparación de un producto de fermentación a partir de material de carbohidratos, que comprende los pasos de (a) pretratar el material de carbohidratos en un primer reactor, (b) licuar el material de carbohidratos pretratado con una composición enzimática a una temperatura de 60 °C a 65 °C durante 1 a 20 horas para producir un material de carbohidratos licuado en un segundo reactor, (c) sacarificar el material de carbohidratos licuado con una composición enzimática a una temperatura de 50 °C a 60 °C durante 1 a 120 horas para producir un producto de azúcar, donde se añade oxígeno durante la sacarificación, en un tercer reactor, (d) fermentar el producto de azúcar para producir un producto de fermentación en un cuarto reactor y (e) opcionalmente, recuperar el producto de fermentación.

En una realización de los procesos de la invención, el material de carbohidratos licuado se sacarifica en ausencia de adición de oxígeno después del paso b y antes del paso c. En otras palabras, en la presente también se describe un proceso para la preparación de un producto de azúcar a partir de material de carbohidratos, que comprende los pasos de (a) pretratar el material de carbohidratos, (b) licuar el material de carbohidratos pretratado con una composición enzimática a una temperatura de 60 °C a 65 °C durante 1 a 20 horas para producir un material de carbohidratos licuado, (c) sacarificar el material de carbohidratos licuado con una composición enzimática sin adición de oxígeno para producir un producto de azúcar, (d) sacarificar el material de carbohidratos licuado con una composición enzimática a una temperatura de 50 °C a 60 °C durante 1 a 120 horas con adición de oxígeno para producir un producto de azúcar, y (e) opcionalmente, recuperar el producto de azúcar del paso c y/o el paso d. En la presente también se describe un proceso para la preparación de un producto de fermentación a partir de material de carbohidratos, que comprende los pasos de (a) pretratar el material de carbohidratos, (b) licuar el material de carbohidratos pretratado con una composición enzimática a una temperatura de 60 °C a 65 °C durante 1 a 20 horas para producir un material de carbohidratos licuado, (c) sacarificar el material de carbohidratos licuado con una composición de enzima sin adición de oxígeno para producir un producto de azúcar, (d) sacarificar el material de carbohidratos licuado con una composición de enzima a una temperatura de 50 °C a 60 °C durante 1 a 120 horas con adición de oxígeno para producir un producto de azúcar, (e) fermentar el producto de azúcar del paso c y/o el paso d para producir un producto de fermentación; y (e) opcionalmente, recuperar el producto de fermentación.

En un ejemplo, el material de carbohidratos licuado se sacarifica sin adición de oxígeno a una temperatura de 50 °C a 60 °C durante 1 a 120 horas. En otro ejemplo, el material de carbohidratos licuado se sacarifica sin adición de oxígeno a una temperatura de 52 °C a 58 °C durante 10 a 60 horas.

En una realización, la licuefacción del material de carbohidratos pretratado con una composición enzimática se realiza a una temperatura de 61 °C a 65 °C. En una realización, la licuefacción del material de carbohidratos pretratado con una composición enzimática se realiza a una temperatura de 62 °C a 65 °C.

De acuerdo con la invención, la licuación del material de carbohidratos pretratado con una composición enzimática se realiza durante 1 a 20 horas.

De acuerdo con la invención, el material de carbohidratos licuado se sacarifica con una composición enzimática a una temperatura de 50 °C a 60 °C durante 1 a 120 horas con adición de oxígeno. En una realización, el material de carbohidratos licuado se sacarifica con una composición enzimática a una temperatura de 51 °C a 59 °C con adición de oxígeno. En una realización, el material de carbohidratos licuado se sacarifica con una composición enzimática a una temperatura de 52 °C a 58 °C con adición de oxígeno. En una realización, el material de carbohidratos licuado se sacarifica con una composición enzimática a una temperatura de 53 °C a 57 °C con adición de oxígeno.

En una realización, la licuefacción se realiza en un reactor. En una realización, la licuefacción también se puede realizar en dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o incluso más reactores. Por lo tanto, el término "reactor" no se limita a un solo reactor, sino que puede significar múltiples reactores.

En los procesos como se describe en la presente, el material de carbohidratos pretratado se añade al reactor en el que tiene lugar la licuefacción. Esto se puede hacer por lotes, por lotes alimentados o continuamente. En una realización, se añade una composición enzimática al reactor en el que tiene lugar la licuefacción. Esto se puede hacer por lotes, por lotes alimentados o continuamente. La composición enzimática puede ser una composición acuosa. En una realización, el material de carbohidratos licuado y/o el material de carbohidratos parcialmente licuado se recicla nuevamente al reactor en el que tiene lugar la licuefacción. En una realización, el material de carbohidratos licuado y/o el material de carbohidratos parcialmente licuado se enfría antes de la adición al reactor en el que tiene lugar la licuefacción. En una realización, el material de carbohidratos licuado y/o el material de carbohidratos parcialmente licuado se someten a una separación sólido/líquido antes de la adición al reactor en el que tiene lugar la licuefacción. En una realización, la separación de sólido/líquido se realiza antes del paso de enfriamiento. En una realización, solo se enfría la fracción líquida obtenida después de la separación de sólido/líquido. En una realización, tanto la fracción líquida como la fracción sólida se añaden al reactor en el que tiene lugar la licuefacción.

En un ejemplo, la sacarificación sin adición de oxígeno se realiza en un reactor. En un ejemplo, la sacarificación también se puede realizar en dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o incluso más reactores. Por lo tanto, el término "reactor" no se limita a un solo reactor, sino que puede significar múltiples reactores.

En una realización, la sacarificación con adición de oxígeno se realiza en un reactor. En una realización, la sacarificación también se puede realizar en dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o incluso más reactores. Por lo tanto, el término "reactor" no se limita a un solo reactor, sino que puede significar múltiples reactores.

En una realización, la licuefacción y sacarificación se realizan en diferentes reactores. En una realización, la sacarificación sin adición de oxígeno y la sacarificación con adición de oxígeno se realizan en diferentes reactores.

En la presente también se describe un proceso para la preparación de un producto de azúcar a partir de material de carbohidratos, que comprende los pasos de (a) pretratar el material de carbohidratos en un primer reactor, (b) licuar el material de carbohidratos pretratado con una composición enzimática a una temperatura de 60 °C a 65 °C durante 1 a 20 horas para producir un material de carbohidratos licuado en un segundo reactor, (c) sacarificar el material de carbohidratos licuado con una composición enzimática sin adición de oxígeno para producir un producto de azúcar en un tercer reactor, (d) sacarificar el material de carbohidratos licuado con una composición de enzima a una temperatura de 50 °C a 60 °C durante 1 a 120 horas con adición de oxígeno para producir un producto de azúcar en un cuarto reactor, y (e) opcionalmente, recuperar el producto de azúcar del paso c y/o el paso d. En la presente también se describe un proceso para la preparación de un producto de fermentación a partir de material de carbohidratos, que comprende los pasos de (a) pretratar el material de carbohidratos en un primer reactor, (b) licuar el material de carbohidratos pretratado con una composición de enzima a una temperatura de 60 °C a 65 °C durante 1 a 20 horas para producir un material de carbohidratos licuado en un segundo reactor, (c) sacarificar el material de carbohidratos licuado con una composición de enzima sin adición de oxígeno para producir un producto de azúcar en un tercer reactor, (d) sacarificar el material de carbohidratos licuado con una composición de enzima a una temperatura de 50 °C a 60 °C durante 1 a 120 horas con adición de oxígeno para producir un producto de azúcar en un cuarto reactor, (e) fermentar el producto de azúcar del paso c y/o el paso d para producir un producto de fermentación en un quinto reactor y (e) opcionalmente, recuperar el producto de fermentación.

En una realización, el pretratamiento se realiza en un reactor que tiene un volumen de 30 - 200 m3, preferentemente de 100 - 150 m3. En caso de que se usen múltiples reactores en el pretratamiento de los procesos como se describe en la presente, pueden tener el mismo volumen, pero también pueden tener un volumen diferente.

En una realización, el reactor de pretratamiento utilizado en los procesos como se describe en la presente tiene una relación de altura a diámetro de 3:1 a 12:1.

En una realización, la licuefacción se realiza en un reactor que tiene un volumen de 10-500 m3, preferentemente de 50­ 350 m3 En caso de que se usen múltiples reactores en la licuefacción, pueden tener el mismo volumen, pero también pueden tener un volumen diferente.

En una realización, el reactor en el que se realiza la licuefacción tiene una relación de altura a diámetro de 0,1:1 a 10:1.

En una realización, la sacarificación sin adición de oxígeno se realiza en un reactor que tiene un volumen de 10 - 5000 m3, preferentemente de 50 - 5000 m3 En caso de que se usen múltiples reactores en la sacarificación sin adición de oxígeno, pueden tener el mismo volumen, pero también pueden tener un volumen diferente.

En una realización, el reactor en el que se realiza la sacarificación sin adición de oxígeno tiene una relación de altura a diámetro de 0,1:1 a 10:1.

En una realización, la sacarificación con adición de oxígeno se realiza en un reactor que tiene un volumen de 10 - 5000 m3, preferentemente de 50 - 5000 m3. En caso de que se usen múltiples reactores en la sacarificación con adición de oxígeno, pueden tener el mismo volumen, pero también pueden tener un volumen diferente.

En una realización, el reactor en el que se realiza la sacarificación con adición de oxígeno tiene una relación de altura a diámetro de 0,1:1 a 10:1.

De acuerdo con la invención, se añade oxígeno al material de carbohidratos licuado durante la sacarificación. En un ejemplo, se añade oxígeno durante al menos una parte de la sacarificación. El oxígeno se puede añadir de forma continua o discontinua durante la sacarificación. En un ejemplo, se añade oxígeno una o más veces durante el proceso para la preparación de un producto de azúcar a partir de material de carbohidratos como se describe en la presente. Se añade oxígeno a los reactores usados en la sacarificación con adición de oxígeno.

El oxígeno se puede añadir de varias formas. Por ejemplo, se puede añadir oxígeno como gas oxígeno, gas enriquecido en oxígeno, tal como aire enriquecido en oxígeno, o aire. El oxígeno también se puede añadir por medio de la generación de oxígeno in situ.

Ejemplos de cómo añadir oxígeno incluyen, pero no se limitan a, adición de oxígeno por medio de rociado, soplado, electrólisis, adición química de oxígeno, llenado de un reactor usado en la sacarificación desde la parte superior (inmersión del hidrolizado licuado en el reactor y consecuentemente introducción de oxígeno en el hidrolizado) y adición de oxígeno al espacio de cabeza de un reactor. Cuando se añade oxígeno al espacio de cabeza del reactor, se puede suministrar suficiente oxígeno necesario para la reacción de hidrólisis. En general, la cantidad de oxígeno añadido al reactor se puede controlar y/o variar. La restricción del oxígeno suministrado es posible añadiendo solo oxígeno durante parte del tiempo de hidrólisis en el reactor. Otra opción es añadir oxígeno a baja concentración, por ejemplo, mediante el uso de una mezcla de aire y aire reciclado (aire que sale del reactor) o "diluyendo" aire con un gas inerte. El incremento de la cantidad de oxígeno añadido se puede lograr mediante la adición de oxígeno durante períodos más largos del tiempo de hidrólisis, mediante la adición de oxígeno a una concentración más alta o mediante la adición de más aire. Otra forma de controlar la concentración de oxígeno es añadir un consumidor de oxígeno y/o un generador de oxígeno. Se puede introducir oxígeno en el material de carbohidratos licuado presente en el reactor. También se puede introducir en el espacio de cabeza del reactor. El oxígeno se puede soplar en el material de carbohidratos licuado presente en el reactor. También se puede soplar en el espacio de cabeza del reactor.

En una realización, se añade oxígeno al reactor usado en la sacarificación antes y/o durante y/o después de la adición del material de carbohidratos licuado al reactor. El oxígeno se puede introducir junto con el material de carbohidratos licuado que entra en el reactor. El oxígeno se puede introducir en la corriente de material que entrará en el reactor o con parte del contenido del reactor que pasa por un bucle externo del reactor. Preferiblemente, se añade oxígeno cuando el material de carbohidratos licuado está presente en el reactor.

En una realización, se añade oxígeno durante la sacarificación para mantener el oxígeno disuelto del 11 % al 80 % del nivel de saturación. En una realización, se añade oxígeno durante la sacarificación para mantener el oxígeno disuelto del 20 % al 60 % del nivel de saturación.

En una realización, las composiciones enzimáticas utilizadas para la licuefacción y sacarificación son las mismas. En otra realización, las composiciones enzimáticas utilizadas para la licuefacción y sacarificación son diferentes. En una realización preferida, las composiciones enzimáticas utilizadas para la sacarificación sin adición de oxígeno y la sacarificación con adición de oxígeno son las mismas.

En una realización, la composición enzimática utilizada en la licuefacción y/o sacarificación es de un hongo, preferentemente un hongo filamentoso. En una realización, las enzimas en la composición enzimática se derivan de un hongo, preferentemente un hongo filamentoso. En una realización, la composición enzimática comprende una enzima fúngica, preferentemente una enzima fúngica filamentosa. “Hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como se define por Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby 's Dictionary of The Fungi, 8a edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido). Los hongos filamentosos incluyen, pero no se limitan a Agaricus, Aspergillus, Aureobasidium, Beauvaria, Cephalosporium, Ceriporiopsis, Chaetomium paecilomyces, Chrysosporium, Claviceps, Cochiobolus, Coprinus, Cryptococcus, Cyathus, Emericella, Endothia, Endothia mucor, Filibasidium, Fusarium, Geosmithia, Gilocladium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Myrothecium, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Panerochaete, Pleurotus, Podospora, Pyricularia, Rasamsonia, Rhizomucor, Rhizopus, Scylatidium, Schizophyllum, Stagonospora, Talaromyces, Thermoascus, Thermomyces, Thielavia, Tolypocladium, Trametes pleurotus, Trichoderma y Trichophyton. En una realización preferida, el hongo es Rasamsonia, Rasamsonia emersonii que la más preferida. En otras palabras, los procesos como se describe en la presente se aplican ventajosamente en combinación con enzimas derivadas de un microorganismo del género Rasamsonia o las enzimas utilizadas en los procesos como se describe en la presente comprenden una enzima Rasamsonia.

Varias cepas de hongos filamentosos son fácilmente accesibles al público en una serie de colecciones de cultivos, tal como la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), y Colección de Cultivos de Patentes del Servicio de Investigación Agrícola, Centro de Investigación Regional del Norte (NRRL).

Preferiblemente, los procesos como se describe en la presente se realizan con enzimas termoestables. Enzima "termoestable" como se usa en la presente significa que la enzima tiene una temperatura óptima de 50 °C o más, 60 °C o más, 70 °C o más, 75 °C o más, 80 °C o más, o incluso 85 °C o más. Se pueden aislar, por ejemplo, de microorganismos termófilos o se pueden diseñar por el experto y sintetizar artificialmente. En una realización, los polinucleótidos que codifican las enzimas termoestables se pueden aislar u obtener de hongos filamentosos termófilos o termotolerantes o aislarse de hongos no termófilos o no termotolerantes, pero se encuentra que son termoestables. Por "hongo termófilo" se entiende un hongo que crece a una temperatura de 50 °C o superior. Por hongo "termotolerante" se entiende un hongo que crece a una temperatura de 45 °C o superior, que tiene un máximo cercano a 50 °C.

Las células fúngicas termófilas o termotolerantes adecuadas pueden ser células de Humicola, Rhizomucor, Myceliophthora, Rasamsonia, Talaromyces, Thermomyces, Thermoascus o Thielavia, preferiblemente células de Rasamsonia. Los hongos termófilos o termotolerantes preferidos son Humicola grisea var. thermoidea, Humicola lanuginosa, Myceliophthora thermophila, Papulaspora thermophilia, Rasamsonia byssochlamydoides, Rasamsonia emersonii, Rasamsonia argillacea, Rasamsonia eburnean, Rasamsonia brevistipitata, Rasamsonia cylindrospora, Rhizomucor pusillus, Rhizomucor miehei, Talaromyces bacillisporus, Talaromyces leycettanus, Talaromyces thermophilus, Thermomyces lenuginosus, Thermoascus crustaceus, Thermoascus thermophilus Thermoascus aurantiacus y Thielavia terrestris.

Rasamsonia es un nuevo género que comprende especies termotolerantes y termófilas de Talaromyces y Geosmithia. Con base en datos fenotípicos, fisiológicos y moleculares, las especies Talaromyces emersonii, Talaromyces byssochlamydoides, Talaromyces eburneus, Geosmithia argillacea y Geosmithia cylindrospora se transfirieron a Rasamsonia gen. nov. Talaromyces emersonii, Penicillium geosmithia emersonii y Rasamsonia emersonii se usan indistintamente en la presente.

En los procesos como se describe en la presente, se usan composiciones enzimáticas. En una realización, las composiciones son estables. "Composiciones enzimáticas estables" como se usa en la presente significa que las composiciones enzimáticas conservan actividad después de 30 horas de tiempo de reacción de hidrólisis, preferiblemente al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 % 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de su actividad inicial después de 30 horas de tiempo de reacción de hidrólisis. En una realización, la composición enzimática retiene la actividad después de 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 horas de tiempo de reacción de hidrólisis.

Las enzimas se pueden preparar por fermentación de un sustrato adecuado con un microorganismo adecuado, por ejemplo, Rasamsonia emersonii o Aspergillus niger, donde las enzimas se producen por el microorganismo. El microorganismo se puede alterar para mejorar o para producir las enzimas. Por ejemplo, el microorganismo se puede mutar mediante procedimientos clásicos de mejora de cepas o mediante técnicas de ADN recombinante. Por lo tanto, los microorganismos mencionados en la presente se pueden usar como tal para producir las enzimas o se pueden alterar para incrementar la producción o para producir enzimas alteradas que podrían incluir enzimas heterólogas, por ejemplo celulasas, por lo tanto enzimas que no se producen originalmente por ese microorganismo. Preferentemente, se utiliza un hongo, más preferentemente un hongo filamentoso para producir las enzimas. Ventajosamente, se utiliza un microorganismo termofílico o termotolerante. Opcionalmente, se usa un sustrato que induce la expresión de las enzimas por el microorganismo productor de enzimas.

Las enzimas se usan para licuar el material de carbohidratos y/o sacarificar el material de carbohidratos (liberar azúcares del material de carbohidratos que comprende polisacáridos). Los principales polisacáridos son celulosas (glucanos) y hemicelulosas (xilanos, heteroxilanos y xiloglucanos). Además, alguna parte de hemicelulosa puede estar presente como glucomananos, por ejemplo, en material lignocelulósico derivado de madera. La hidrólisis enzimática de estos polisacáridos a azúcares solubles, incluidos tanto monómeros como multímeros, por ejemplo glucosa, celobiosa, xilosa, arabinosa, galactosa, fructosa, manosa, ramnosa, ribosa, ácido galacturónico, ácido glucurónico y otras hexosas y pentosas se produce bajo la acción de diferentes enzimas que actúan en concierto. Un producto de azúcar comprende azúcares solubles, que incluyen tanto monómeros como multímeros. En una realización, el producto de azúcar comprende glucosa, galactosa y arabinosa. Ejemplos de otros azúcares son celobiosa, xilosa, arabinosa, galactosa, fructosa, manosa, ramnosa, ribosa, ácido galacturónico, ácido glucorónico y otras hexosas y pentosas. El producto de azúcar se puede usar como tal o se puede procesar adicionalmente, por ejemplo, recuperar y/o purificar.

Además, las pectinas y otras sustancias pécticas tal como arabinanos pueden constituir una proporción considerable de la masa seca de las paredes típicamente celulares de tejidos vegetales no leñosos (aproximadamente un cuarto a la mitad de la masa seca pueden ser pectinas). Además, el material de carbohidratos puede comprender lignina.

Las enzimas que se pueden usar en los procesos como se describe en la presente se describen en más detalle más adelante.

Las monooxigenasas de polisacáridos líticos, las endoglucanasas (EG) y las exo-celobiohidrolasas (CBH) catalizan la hidrólisis de la celulosa insoluble a productos tal como los celoligosacáridos (celobiosa como producto principal), en tanto que las p-glucosidasas (BG) convierten los oligosacáridos, principalmente celobiosa y celotriosa, en glucosa.

Las xilanasas junto con otras enzimas accesorias, por ejemplo, a-L-arabinofuranosidasas, feruloil y acetilxilano esterasas, glucuronidasas y p-xilosidasas catalizan la hidrólisis de la hemicelulosa.

Una composición enzimática para su uso en los procesos como se describe en la presente puede comprender al menos dos actividades, aunque típicamente una composición comprenderá más de dos actividades, por ejemplo, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o incluso más actividades. Típicamente, una composición enzimática para su uso en los procesos como se describe en la presente comprende al menos dos celulasas. Las al menos dos celulasas pueden contener las mismas o diferentes actividades. La composición enzimática para su uso en los procesos como se describe en la presente también puede comprender al menos una enzima distinta de una celulasa. Preferentemente, la por lo menos otra enzima tiene una actividad enzimática auxiliar, es decir, una actividad adicional que, directa o indirectamente conduce a la degradación de lignocelulosa. Ejemplos de estas actividades auxiliares se mencionan en la presente e incluyen, pero no se limitan a, hemicelulasas.

Una composición enzimática para su uso en los procesos como se describe en la presente comprende al menos una monooxigenasa lítica de polisacárido (LPMO), una endoglucanasa (EG), una celobiohidrolasa (CBH), una xilanasa, una beta-xilosidasa (BX) y una beta-glucosidasa (BG). Una composición enzimática puede comprender más de una actividad enzimática por clase de actividad. Por ejemplo, una composición puede comprender dos endoglucanasas, por ejemplo, una endoglucanasa que tiene actividad endo-1,3(1,4)-p glucanasa y una endoglucanasa que tiene actividad endo-p-1,4-glucanasa.

Una composición para su uso en los procesos como se describe en la presente se puede derivar de un hongo, tal como un hongo filamentoso, tal como Rasamsonia, tal como Rasamsonia emersonii. En una realización, al menos una de las enzimas se puede derivar de Rasamsonia emersonii. En una realización, la monooxigenasa lítica de polisacárido y/o la beta-xilosidasa se derivan de Rasamsonia emersonii. Si es necesario, la enzima se puede complementar con enzimas adicionales de otras fuentes. Estas enzimas adicionales se pueden derivar de fuentes clásicas y/o se pueden producir por organismos modificados genéticamente.

Además, las enzimas en las composiciones enzimáticas para su uso en los procesos como se describe en la presente pueden funcionar a un pH bajo. Para los fines de esta invención, pH bajo indica un pH de 5,5 o inferior, 5 o inferior, 4,9 o inferior, 4,8 o inferior, 4,7 o inferior, 4,6 o inferior, 4,5 o inferior, 4,4 o inferior, 4,3 o inferior, 4,2 o inferior, 4,1 o inferior, 4,0 o inferior, 3,9 o inferior, 3,8 o inferior, 3,7 o inferior, 3,6 o inferior, 3,5 o inferior.

La composición enzimática para su uso en los procesos como se describe en la presente puede comprender una celulasa y/o una hemicelulasa y/o una pectinasa de Rasamsonia. También pueden comprender una celulasa y/o una hemicelulasa y/o una pectinasa de una fuente distinta de Rasamsonia. Se pueden usar junto con una o más enzimas de Rasamsonia o se pueden usar sin que estén presentes enzimas de Rasamsonia adicionales.

Una composición enzimática para su uso en los procesos como se describe en la presente comprende una monooxigenasa lítica de polisacárido, una endoglucanasa, una celobiohidrolasa I (CBHI), una celobiohidrolasa II (CBHII), una beta-glucosidasa, una endoxilanasa (EX) y una beta-xilosidasa.

Una composición enzimática para su uso en los procesos como se describe en la presente puede comprender un tipo de actividad celulasa y/o actividad hemicelulasa y/o actividad pectinasa proporcionada por una composición como se describe en la presente y un segundo tipo de actividad celulasa y/o actividad hemicelulasa y/o actividad pectinasa proporcionada por una celulasa/hemicelulasa/pectinasa adicional.

En una realización, la composición enzimática utilizada en la sacarificación es un caldo de fermentación completo de un hongo filamentoso, el caldo que comprende una celobiohidrolasa, una beta-glucosidasa, una xilanasa, una beta-xilosidasa y una oxigenasa lítica de monosacárido. Estas enzimas se han descrito en más detalle en la presente.

En una realización, la composición enzimática comprende endoglucanasa. En una realización, la endoglucanasa comprende una endoglucanasa GH5 y/o una endoglucanasa GH7. En una realización, la composición enzimática utilizada en la licuefacción es un caldo de fermentación completo de un hongo filamentoso, el caldo que comprende endoglucanasa. En una realización, la cantidad de endoglucanasa en la composición enzimática utilizada en la licuefacción es de 50 -1000 |jg/gramo de materia seca en el material de carbohidratos pretratado. Las endoglucanasas se han descrito en más detalle en la presente. En una realización, la composición enzimática utilizada para la licuefacción comprende más endoglucanasa que la composición enzimática utilizada para la sacarificación.

Como se usa en la presente, una celulasa es cualquier polipéptido que es capaz de degradar o modificar la celulosa. Un polipéptido que es capaz de degradar celulosa es uno que es capaz de catalizar el proceso de descomposición de celulosa en unidades más pequeñas, ya sea parcialmente, por ejemplo en celodextrinas, o completamente en monómeros de glucosa. Una celulasa como se describe en la presente puede dar lugar a una población mixta de celodextrinas y monómeros de glucosa. Esta degradación tendrá lugar típicamente por medio de una reacción de hidrólisis.

Como se usa en la presente, una hemicelulasa es cualquier polipéptido que es capaz de degradar o modificar la hemicelulosa. Es decir, una hemicelulasa puede ser capaz de degradar o modificar uno o más de xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano, glucomanano y xiloglucano. Un polipéptido que es capaz de degradar una hemicelulosa es uno que es capaz de catalizar el proceso de descomposición de la hemicelulosa en polisacáridos más pequeños, ya sea parcialmente, por ejemplo en oligosacáridos, o completamente en monómeros de azúcar, por ejemplo monómeros de azúcar de hexosa o pentosa. Una hemicelulasa como se describe en la presente puede dar lugar a una población mixta de oligosacáridos y monómeros de azúcar. Esta degradación tendrá lugar típicamente por medio de una reacción de hidrólisis.

Como se usa en la presente, una pectinasa es cualquier polipéptido que es capaz de degradar o modificar la pectina. Un polipéptido que es capaz de degradar la pectina es uno que es capaz de catalizar el proceso de descomposición de la pectina en unidades más pequeñas, ya sea parcialmente, por ejemplo, en oligosacáridos, o completamente en monómeros de azúcar. Una pectinasa como se describe en la presente puede dar lugar a una población mixta de oligosacáridos y monómeros de azúcar. Esta degradación tendrá lugar típicamente por medio de una reacción de hidrólisis.

En consecuencia, una composición enzimática para su uso en los procesos como se describe en la presente puede comprender una o más de las siguientes enzimas, una monooxigenasa lítica de polisacárido (por ejemplo, GH61), una celobiohidrolasa, una endo-p-1,4-glucanasa, una beta-glucosidasa y una p-(1,3)(1,4)-glucanasa. Una composición para su uso en los procesos como se describe en la presente también puede comprender una o más hemicelulasas, por ejemplo, una endoxilanasa, una p-xilosidasa, una a-L-arabionofuranosidasa, una a-D-glucuronidasa, una acetil xilano esterasa, una feruloil esterasa, una cumaroil esterasa, una a-galactosidasa, una p-galactosidasa, una p-mananasa y/o una p-manosidasa. Una composición para su uso en los procesos como se describe en la presente también puede comprender una o más pectinasas, por ejemplo, una endo-poligalacturonasa, una pectina-metil esterasa, una endogalactanasa, una beta-galactosidasa, una pectina-acetil esterasa, una endo-pectina liasa, pectato liasa, alfa-ramnosidasa, una exo-galacturonasa, una expoligalacturonato liasa, una ramnogalacturonano hidrolasa, una ramnogalacturonano liasa, una ramnogalacturonano acetil esterasa, una ramnogalacturonano galacturonohidrolasa y/o una xilogalacturonasa. Además, una o más de las siguientes enzimas, una amilasa, una proteasa, una lipasa, una ligninasa, una hexosiltransferasa, una glucuronidasa, una expansina, una proteína inducida por celulosa o una proteína de integración de celulosa o una proteína similar pueden estar presentes en una composición para su uso en los procesos como se describe en la presente (estas se denominan actividades auxiliares anteriores).

Como se usa en la presente, las monooxigenasas líticas de polisacárido son enzimas que CAZy ha clasificado recientemente en la familia AA9 (Familia de actividad auxiliar 9) o la familia AA10 (Familia de actividad auxiliar 10). Es decir, existen monooxigenasas líticas de polisacárido AA9 y monooxigenasas líticas de polisacárido AA10. Las monooxigenasas líticas de polisacárido son capaces de abrir una estructura de glucano cristalina y mejorar la acción de las celulasas sobre sustratos de lignocelulosa. Son enzimas que tienen actividad potenciadora celulolítica. Las monooxigenasas líticas de polisacáridos también pueden afectar a los celo-oligosacáridos. De acuerdo con la literatura más reciente, (ver Isaksen et al., Journal of Biological Chemistry, vol. 289, núm. 5, págs. 2632-2642), las proteínas denominadas GH61 (familia de glucósidos hidrolasas 61 o a veces denominadas EGIV) son polisacáridos líticos monooxigenados. GH61 se clasificó originalmente como endoglucanasa con base en la medición de la actividad muy débil de endo-1,4-p-d-glucanasa en un miembro de la familia, pero recientemente CAZy lo ha reclasificado en la familia AA9. CBm33 (módulo de unión a carbohidratos de la familia 33) es también una monooxigenasa lítica de polisacárido (ver, Isaksen et al, Journal of Biological Chemistry, vol. 289, núm. 5, págs. 2632-2642). CAZy ha reclasificado recientemente CBm33 en la familia AA10.

En una realización, la monooxigenasa lítica de polisacárido comprende una monooxigenasa lítica de polisacárido AA9. Esto significa que al menos una de las monooxigenasas líticas de polisacárido en la composición enzimática es una monooxigenasa lítica de polisacárido AA9. En una realización, todas las monooxigenasas líticas de polisacárido en la composición enzimática son AA9 monooxigenasas líticas de polisacárido.

En una realización, la composición enzimática comprende una monooxigenasa lítica de polisacárido de Thermoascus, tal como Thermoascus aurantiacus, tal como el descrito en WO 2005/074656 como SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:1 en WO2014/130812 y en WO 2010/065830; o de Thielavia, tal como Thielavia terrestris, tal como el descrito en WO 2005/074647 como SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO:4 en WO2014/130812 y en WO 2008/148131 y WO 2011/035027; o de Aspergillus, tal como Aspergillus fumigatus, tal como el descrito en WO 2010/138754 como S^e Q ID NO:2 o SEQ ID NO: 3 en WO2014/130812; o de Penicillium, tal como Penicillium emersonii, tal como el divulgado como SEQ ID NO:2 en WO 2011/041397 o SEQ ID NO:2 en WO2014/130812. Otras monooxigenasas líticas de polisacárido adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Trichoderma reesei (ver, WO 2007/089290), Myceliophthora thermophila (ver, WO 2009/085935, WO 2009/085859, WO 2009/085864, WO 2009/085868), Penicillium pinophilum (ver, WO 2011/005867), Thermoascus sp. (ver, WO 2011/039319) y Thermoascus crustaceous (ver, WO 2011/041504). Otras enzimas celulolíticas que pueden estar comprendidas en la composición enzimática se describen en WO 98/13465, WO 98/015619, WO 98/015633, WO 99/06574, WO 99/10481, WO 99/025847, WO 99/031255, WO 2002/101078, WO 2003/027306, WO 2003/052054, WO 2003/052055, WO 2003/052056, WO 2003/052057, WO 2003/052118, WO 2004/016760, WO 2004/043980, WO 2004/048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, WO 2007/071820, WO 2008/008070, WO 2008/008793, US 5.457.046, US 5.648.263 y US 5.686.593, por nombrar algunos. En una realización preferida, la monooxigenasa lítica de polisacárido es de Rasamsonia, por ejemplo, Rasamsonia emersonii (ver WO 2012/000892).

Como se usa en la presente, las endoglucanasas son enzimas que son capaces de catalizar la endohidrólisis de enlaces 1,4-p-D-glucosídicos en celulosa, liquenina o p-D-glucanos de cereales. Pertenecen a EC 3.2.1.4 y también pueden ser capaces de hidrolizar enlaces 1,4 en p-D-glucanos que también contienen enlaces 1,3. Las endoglucanasas también se pueden referir como celulasas, avicelasas, p-1,4-endoglucanhidrolasas, p-1,4-glucanasas, carboximetilcelulasas, celudextrinasas, endo-1,4-p-D-glucanasas, endo-1,4-p-D-glucanohidrolasas o endo-1,4-p-glucanasas.

En una realización, la endoglucanasa comprende una endoglucanasa GH5 y/o una endoglucanasa GH7. Esto significa que al menos una de las endoglucanasas en la composición enzimática es una endoglucanasa GH5 o una endoglucanasa GH7. En caso de que haya más endoglucanasas en la composición enzimática, estas endoglucanasas pueden ser endoglucanasas GH5, endoglucanasas GH7 o una combinación de endoglucanasas GH5 y endoglucanasas GH7. En una realización preferida, la endoglucanasa comprende una endoglucanasa GH5.

En una realización, la composición enzimática comprende una endoglucanasa de Trichoderma, tal como Trichoderma reesei; de Humicola, tal como una cepa de Humicola insolens; de Aspergillus, tal como Aspergillus aculeatus o Aspergillus kawachii; de Erwinia, tal como Erwinia carotovara; de Fusarium, tal como Fusarium oxysporum; de Thielavia, tal como Thielavia terrestris; de Humicola, tal como Humicola grisea var. thermoidea o Humicola insolens; de Melanocarpus, tal como Melanocarpus albomyces; de Neurospora, tal como Neurospora crassa; de Myceliophora, tal como Myceliophora thermophila; de Cladorhum, tal como Cladorhumhumus foundecum; y/o de Chysporium, tal como una cepa de Chysnowosense. En una realización preferida, la endoglucanasa es de Rasamsonia, tal como una cepa de Rasamsonia emersonii (ver WO 01/70998). En una realización, se puede usar incluso una endoglucanasa bacteriana que incluye, pero no se limita a, endoglucanasa de Acidothermus cellulolyticus (ver, WO 91/05039; WO 93/15186; US 5.275.944; WO 96/02551; US 5.536.655, WO 00/70031, WO 05/093050); endoglucanasa III de Thermobifida fusca (ver, WO 05/093050); y endoglucanasa V de Thermobifida fusca (ver, WO 05/093050).

Como se usa en la presente, las beta-xilosidasas (EC 3.2.1.37) son polipéptidos que son capaces de catalizar la hidrólisis de 1,4-p-D-xilanos, para eliminar residuos sucesivos de D-xilosa de los extremos no reductores. Las beta-xilosidasas también pueden hidrolizar la xilobiosa. La beta-xilosidasa también se puede referir como xilano 1,4-p-xilosidasa, 1,4-p-D-xilano xilohidrolasa, exo-1,4-p-xilosidasa o xilobiasa.

En una realización, la beta-xilosidasa comprende una beta-xilosidasa GH3. Esto significa que al menos una de las betaxilosidasas en la composición enzimática es una beta-xilosidasa GH3. En una realización, todas las beta-xilosidasas en la composición enzimática son beta-xilosidasas GH3.

En una realización, la composición enzimática comprende una beta-xilosidasa de Neurospora crassa, Aspergillus fumigatus o Trichoderma reesei. En una realización preferida, la composición enzimática comprende una beta-xilosidasa de Rasamsonia, tal como Rasamsonia emersonii (ver WO 2014/118360).

Como se usa en la presente, una endoxilanasa (EC 3.2.1.8) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la endohidrólisis de los enlaces 1,4-p-D-xilosídicos en los xilanos. Esta enzima también se puede referir como endo-1,4-pxilanasa o 1,4-p-D-xilan xilanohidrolasa. Una alternativa es EC 3.2.1.136, una glucuronoarabinoxilano endoxilanasa, una enzima que es capaz de hidrolizar enlaces 1,4 xilosídicos en glucuronoarabinoxilanos.

En una realización, la endoxilanasa comprende una xilanasa GH10. Esto significa que al menos una de las endoxilanasas en la composición enzimática es una xilanasa GH10. En una realización, todas las endoxilanasas en la composición enzimática son xilanasas GH10.

En una realización, la composición enzimática comprende una endoxilanasa de Aspergillus aculeatus (ver WO 94/21785), Aspergillus fumigatus (ver WO 2006/078256), Penicillium pinophilum (ver WO 2011/041405), Penicillium sp. (ver w O 2010/126772), Thielavia terrestris NRRL 8126 (ver WO 2009/079210), Talaromyces leycettanus, Thermobifida fusca o Trichophaea saccata GH10 (ver WO 2011/057083). En una realización preferida, la composición enzimática comprende una endoxilanasa de Rasamsonia, tal como Rasamsonia emersonii (ver WO 02/24926).

Como se usa en la presente, una beta-glucosidasa (EC 3.2.1.21) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de residuos de p-D-glucosa no reductores, terminales, con liberación de p-D-glucosa. Este polipéptido puede tener una amplia especificidad por los p-D-glucósidos y también puede hidrolizar uno o más de los siguientes: un p-D-galactósido, un a-L-arabinósido, un p-D-xilósido o un p-D-fucósido. Esta enzima también se puede referir como amigdalina beta-glucosidasa, p-D-glucósido glucohidrolasa, celobiosa o gentiobiosa.

En una realización, la composición enzimática comprende una beta-glucosidasa de Aspergillus, tal como Aspergillus oryzae, tal como el descrito en WO 02/095014 o la proteína de fusión que tiene actividad beta-glucosidasa descrita en WO 2008/057637, o Aspergillus fumigatus, tal como el descrito como SEQ ID NO:2 en WO 2005/047499 o SEQ ID NO:5 en WO 2014/130812 o una variante de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus, tal como uno descrito en WO 2012/044915, tal como uno con las siguientes sustituciones: F100D, S283G, N456E, F512Y (usando SEQ ID NO: 5 en WO 2014/130812 para numeración), o Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger o Aspergillus kawachi. En otra realización, la beta-glucosidasa se deriva de Penicillium, tal como Penicillium brasilianum divulgado como SEQ ID NO:2 en WO 2007/019442, o de Trichoderma, tal como Trichoderma reesei, tal como los descritos en US 6.022.725, US 6.982.159, US 7.045.332, US 7.005.289, US 2006/0258554 US 2004/0102619. En una realización, se puede usar incluso una betaglucosidasa bacteriana. En otra realización, la beta-glucosidasa se deriva de Thielavia terrestris (WO 2011/035029) o Trichophaea saccata (WO 2007/019442). En una realización preferida, la composición enzimática comprende una betaglucosidasa de Rasamsonia, tal como Rasamsonia emersonii (ver WO 2012/000886).

Como se usa en la presente, una celobiohidrolasa (EC 3.2.1.91) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de los enlaces 1,4-p-D-glucosídicos en la celulosa o la celobiotetraosa, liberando la celobiosa de los extremos de las cadenas. Esta enzima también se puede referir como celulasa 1,4-p-celobiosidasa, 1,4-p-celobiohidrolasa, 1,4-p-D-glucano celobiohidrolasa, avicelasa, exo-1,4-p-D-glucanasa, exocelobiohidrolasa o exoglucanasa.

En una realización, la composición enzimática comprende una celobiohidrolasa I de Aspergillus, tal como Aspergillus fumigatus, tal como Cel7A CBH I divulgado en SEQ ID NO:6 en WO 2011/057140 o SEQ ID NO:6 en WO 2014/130812; de Trichoderma, tal como Trichoderma reesei; de Chaetomium, tal como Chaetomium thermophilum; de Talaromyces, tal como Talaromyces leycettanus o de Penicillium, tal como Penicillium emersonii. En una realización preferida, la composición enzimática comprende una celobiohidrolasa I de Rasamsonia, tal como Rasamsonia emersonii (ver WO 2010/122141).

En una realización, la composición enzimática comprende una celobiohidrolasa II de Aspergillus, tal como Aspergillus fumigatus, tal como el de SEQ ID NO:7 en WO 2014/130812 o de Trichoderma, tal como Trichoderma reesei, o de Tallaromyces, tal como Tallaromyces leycettanus, o de Thielavia, tal como Thielavia terrestris, tal como celobiohidrolasa II CEL6A de Thielavia terrestris. En una realización preferida, la composición enzimática comprende una celobiohidrolasa II de Rasamsonia, tal como Rasamsonia emersonii (ver WO 2011/098580).

En una realización la composición enzimática también puede comprender una o más de las enzimas mencionadas más adelante.

Como se usa en la presente, una p-(1,3)(1,4)-glucanasa (EC 3.2.1.73) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de los enlaces 1,4-p-D-glucosídicos en los p-D-glucanos que contienen los enlaces 1,3 y 1,4. Este polipéptido puede actuar sobre la liquenina y los p-D-glucanos de cereales, pero no sobre los p-D-glucanos que contienen solo enlaces 1,3 o 1,4. Esta enzima también se puede referir como liqueninasa, 1,3-1,4-p-D-glucano 4-glucanohidrolasa, pglucanasa, endo-p-1,3-1,4-glucanasa, liquenasa o enlace mixto p-glucanasa. Una alternativa para este tipo de enzima es EC 3.2.1.6, que se describe como endo-1,3(4)-beta-glucanasa. Este tipo de enzima hidroliza los enlaces 1,3 o 1,4 en la beta-D-glucosa cuando el residuo de glucosa cuyo grupo reductor está involucrado en el enlace que se va a hidrolizar está sustituido en C-3. Los nombres alternativos incluyen endo-1,3-beta-glucanasa, laminarinasa, 1,3-(1,3;1,4)-beta-D-glucano 3 (4) glucanohidrolasa. Los sustratos incluyen laminarina, liquenina y beta-D-glucanos de cereales.

Como se usa en la presente, una a-L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) es cualquier polipéptido que es capaz de actuar sobre los a-L-arabinofuranosidos, los a-L-arabinanos que contienen los enlaces (1,2) y/o (1,3) y/o (1,5), los arabinoxilanos y los arabinogalactanos. Esta enzima también se puede referir como a-N-arabinofuranosidasa, arabinofuranosidasa o arabinosidasa. Ejemplos de arabinofuranosidasas que pueden estar comprendidas en la composición enzimática incluyen, pero no se limitan a, arabinofuranosidasas de Aspergillus niger, Humicola insolens DSM 1800 (ver, WO 2006/114094 y WO 2009/073383) y M. giganteus (ver, documento WO 2006/114094).

Como se usa en la presente, una a-D-glucuronidasa (EC 3.2.1.139) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar una reacción de la siguiente forma: alfa-D-glucuronósido H(2)O = un alcohol D-glucuronato. Esta enzima también se puede referir como alfa-glucuronidasa o alfa-glucosiduronasa. Estas enzimas también pueden hidrolizar ácido glucorónico 4-O-metilado, que también puede estar presente como sustituyente en xilanos. Una alternativa es EC 3.2.1.131: xilano alfa-1,2-glucuronosidasa, que cataliza la hidrólisis de enlaces alfa-1,2-(4-O-metil)glucuronosilo. Ejemplos de alfaglucuronidasas que pueden estar comprendidas en la composición enzimática incluyen, pero no se limitan a, alfaglucuronidasas de Aspergillus clavatus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Humicola insolens (ver, WO 2010/014706), Penicillium aurantiogriseum (ver, WO 2009/068565) y Trichoderma reesei.

Como se usa en la presente, una acetil xilano esterasa (EC 3.1.1.72) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la desacetilación de xilanos y xilo-oligosacáridos. Este polipéptido puede catalizar la hidrólisis de grupos acetilo a partir de xilano polimérico, xilosa acetilada, glucosa acetilada, acetato de alfa-naftilo o acetato de p-nitrofenilo pero, típicamente, no a partir de triacetilglicerol. Un polipéptido de este tipo típicamente no actúa sobre manano o pectina acetilados. Ejemplos de acetilxilano esterasas que pueden estar comprendidas en la composición enzimática incluyen, pero no se limitan a, acetilxilano esterasas de Aspergillus aculeatus (ver WO 2010/108918), Chaetomium globosum, Chaetomium gracile, Humicola insolens DSM 1800 (ver WO 2009/073709), Hypocrea jecorina (ver WO 2005/001036), Myceliophtera thermophila (ver WO 2010/014880), Neurospora crassa, Phaeosphaeria nodorum y Thielavia terrestris NRRL 8126 (ver WO 2009/042846). En una realización preferida, la composición enzimática comprende una acetil xilano esterasa de Rasamsonia, tal como Rasamsonia emersonii (ver WO 2010/000888)

Como se usa en la presente, una feruloil esterasa (EC 3.1.1.73) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar una reacción de la forma: feruloil-sacárido H²O = ferular sacárido. El sacárido puede ser, por ejemplo, un oligosacárido o un polisacárido. Típicamente puede catalizar la hidrólisis del grupo 4-hidroxi-3-metoxicinamoilo (feruloilo) a partir de un azúcar esterificado, que en general es arabinosa en sustratos "naturales". El acetato de p-nitrofenol y el ferulato de metilo son típicamente sustratos más pobres. Esta enzima también se puede referir como cinamoil éster hidrolasa, ácido ferúlico esterasa o hidroxicinamoil esterasa. También se puede referir como una enzima accesoria de la hemicelulasa, ya que puede ayudar a las xilanasas y pectinasas a romper la hemicelulosa de la pared celular de la planta y la pectina. Ejemplos de feruloilo esterasas (ácido ferúlico esterasas) que pueden estar comprendidas en la composición enzimática incluyen, pero no se limitan a, feruloilo esterasas de Humicola insolens DSM 1800 (ver WO 2009/076122), Neosartorya fischeri, Neurospora crassa, Penicillium aurantiogriseum (ver WO 2009/127729), y Thielavia terrestris (ver W ^o 2010/053838 y WO 2010/065448).

Como se usa en la presente, una cumeroil esterasa (EC 3.1.1.73) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar una reacción de la forma: cumeroil-sacárido H(2)O = cumeroil-sacárido. El sacárido puede ser, por ejemplo, un oligosacárido o un polisacárido. Esta enzima también se puede referir como trans-4-cumaroil esterasa, trans-p-cumaroil esterasa, pcumaroil esterasa o ácido p-cumárico esterasa. Esta enzima también cae dentro de EC 3.1.1.73, por lo que también se puede referir como una feruloilo esterasa.

Como se usa en la presente, una a-galactosidasa (EC 3.2.1.22) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de los residuos de a-D-galactosa no reductores en los a-D-galactosidos, incluidos los oligosacáridos de la galactosa, los galactomananos, los galactanos y los arabinogalactanos. Este polipéptido también puede ser capaz de hidrolizar a-D-fucósidos. Esta enzima también se puede referir como melibiase.

Como se usa en la presente, una p-galactosidasa (EC 3.2.1.23) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de los residuos de p-D-galactosa no reductores terminales en los p-D-galactósidos. Un polipéptido de este tipo también puede ser capaz de hidrolizar a-L-arabinósidos. Esta enzima también se puede referir como exo-(1->4)-p-D-galactanasa o lactasa.

Como se usa en la presente, una p-mananasa (EC 3.2.1.78) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis aleatoria de los enlaces 1,4-p-D-manosídicos en los mananos, galactomananos y glucomananos. Esta enzima también se puede referir como manano endo-1,4-p-manosidasa o endo-1,4-mananasa.

Como se usa en la presente, una p-manosida (EC 3.2.1.25) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de los residuos de p-D-manosida no reductores. Esta enzima también se puede referir como mananasa o manasa.

Como se usa en la presente, una endo-poligalacturonasa (EC 3.2.1.15) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis aleatoria de los enlaces 1,4-alfa-D-galacturonicos en el pectato y otros galacturonanos. Esta enzima también se puede referir como poligalacturonasa, pectinasa, endopoligalacturonasa, pectolasa, pectina hidrolasa, pectina poligalacturonasa, poli-a-1,4-galacturonida glicanohidrolasa, endogalacturonasa; endo-D-galacturonasa o poli(1,4-a-D-galacturonida) glicanohidrolasa.

Como se usa en la presente, una pectina metil esterasa (EC 3.1.1.11) es cualquier enzima que es capaz de catalizar la reacción: pectina n H²O = n metanol pectato. La enzima también se puede conocer como pectinesterasa, pectina demetoxilasa, pectina metoxilasa, pectina metilesterasa, pectasa, pectinoesterasa o pectina pectilhidrolasa.

Como se usa en la presente, una endo-galactanasa (EC 3.2.1.89) es cualquier enzima capaz de catalizar la endohidrólisis de los enlaces 1,4-p-D-galactosídicos en los arabinogalactanos. La enzima también se puede conocer como arabinogalactano endo-1,4-p-galactosidasa, endo-1,4-p-galactanasa, galactanasa, arabinogalactanasa o arabinogalactano 4-p-D-galactanohidrolasa.

Como se usa en la presente, una pectina acetil esterasa se define en la presente como cualquier enzima que tiene una actividad acetil esterasa que cataliza la desacetilación de los grupos acetilo en los grupos hidroxilo de los residuos de GalUA de la pectina.

Como se usa en la presente, una endopectina liasa (EC 4.2.2.10) es cualquier enzima capaz de catalizar la escisión eliminatoria del éster metílico de (1 ^ 4 ) -a-D-galacturonano para dar oligosacáridos con grupos 4-desoxi-6-O-metil-a-D-galact-4-enuronosilo en sus extremos no reductores. La enzima también se puede conocer como pectina liasa, pectina trans-eliminasa; endo-pectina liasa, polimetilgalacturónico transeliminasa, pectina metiltranseliminasa, pectoliasa, PL, PNL o PMGL o (1 ^4)-6-O -metil-a-D-galacturonano liasa.

Como se usa en la presente, una pectato liasa (EC 4.2.2.2) es cualquier enzima capaz de catalizar la escisión eliminatoria de (1 ^4)-a-D-galacturonano para dar oligosacáridos con grupos 4-desoxi-a-D-galact-4-enuronosilo en sus extremos no reductores. La enzima también puede ser transeliminasa poligalacturónica conocida, ácido péctico transeliminasa, poligalacturonato liasa, endopectina metiltranseliminasa, pectato transeliminasa, endogalacturonato transeliminasa, ácido péctico liasa, péctico liasa, a-1,4-D-endopoligalacturónico liasa, PGA liasa, PPasa-N, ácido endo-a-1,4-poligalacturónico liasa, ácido poligalacturónico liasa, pectina trans-eliminasa, ácido poligalacturónico trans-eliminasa o (1 ^4)-a-D galacturonano liasa.

Como se usa en la presente, una alfa ramnosida (EC 3.2.1.40) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de los residuos de a-L-ramnosida no reductores terminales en las a-L-ramnosidas o, alternativamente, en el ramnogalacturonano. Esta enzima también se puede conocer como a-L-ramnosidasa T, a-L-ramnosidasa N o a-L-ramnosida ramnohidrolasa.

Como se usa en la presente, la exo-galacturonasa (EC 3.2.1.82) es cualquier polipéptido capaz de hidrolizar el ácido péctico desde el extremo no reductor, liberando el digalacturonato. La enzima también se puede conocer como exo-polia-galacturonosidasa, exopoligalacturonosidasa o exopoligalacturanosidasa.

Como se usa en la presente, la exo-galacturonasa (EC 3.2.1.67) es cualquier polipéptido capaz de catalizar: (1,4-a-D-galacturónido)ⁿ + H²O = (1,4-a-D-galacturónido)„-1 D-galacturónido. La enzima también se puede conocer como galacturano 1,4-a-galacturonidasa, exopoligalacturonasa, poli(galacturonato) hidrolasa, exo-D-galacturonasa, exo-D-galacturonanasa, exopoli-D-galacturonasa o poli(1,4-a-D-galacturonida) galacturonohidrolasa.

Como se usa en la presente, la exopoligalacturonato liasa (EC 4.2.2.9) es cualquier polipéptido capaz de catalizar la escisión eliminatoria de 4-(4-desoxi-a-D-galact-4-enuronosil)-D-galacturonato del extremo reductor del pectato, es decir, la pectina desesterificada. Esta enzima se puede conocer como pectato disacárido-liasa, pectato exo-liasa, ácido exopéctico transeliminasa, exopectato liasa, ácido exopoligalacturónico-trans-eliminasa, PATE, exo-PATE, exo-PGL o (1 ^4)-a-D-galacturonano disacárido terminal reductor liasa.

Como se usa en la presente, la ramnogalacturon hidrolasa es cualquier polipéptido que es capaz de hidrolizar el enlace entre el ácido galacturónico y el ramnopiranosilo de una manera endo en estructuras de ramnogalacturon estrictamente alternas, que consisten en el disacárido [ácido (1,2-alfa-L-ramnoil-(1,4)-alfa-galactosilurónico].

Como se usa en la presente, la ramnogalacturonano liasa es cualquier polipéptido que es cualquier polipéptido que es capaz de escindir los enlaces a-L-Rhap-(1 ^ 4 ) -a-D-Galp A de una manera endo en ramnogalacturonano por eliminación beta.

Como se usa en la presente, la ramnogalacturonano acetil esterasa es cualquier polipéptido que cataliza la desacetilación de la cadena principal de los residuos de ramnosa y ácido galacturónico alternos en el ramnogalacturonano.

Como se usa en la presente, la ramnogalacturonano galacturonohidrolasa es cualquier polipéptido que es capaz de hidrolizar el ácido galacturónico desde el extremo no reductor de las estructuras de ramnogalacturonano estrictamente alternas de una manera exo.

Como se usa en la presente, la xilogalacturonasa es cualquier polipéptido que actúa sobre el xilogalacturonano al escindir la cadena principal del ácido galacturónico sustituido con p-xilosa de una manera endo. Esta enzima también se puede conocer como xylogalacturonan hidrolasa.

Como se usa en la presente, una a-L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) es cualquier polipéptido que es capaz de actuar sobre los a-L-arabinofuranosidos, los a-L-arabinanos que contienen los enlaces (1,2) y/o (1,3) y/o (1,5), los arabinoxilanos y los arabinogalactanos. Esta enzima también se puede referir como a-N-arabinofuranosidasa, arabinofuranosidasa o arabinosidasa.

Como se usa en la presente, la endo-arabinanasa (EC 3.2.1.99) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la endohidrólisis de los enlaces 1,5-a-arabinofuranosídicos en los 1,5-arabinanos. La enzima también se puede conocer como endo-arabinasa, arabinano endo-1,5-a-L-arabinosidasa, endo-1,5-a-L-arabinanasa, endo-a-1,5-arabanasa; endoarabanasa o 1,5-a-L-arabinano 1,5-a-L-arabinanohidrolasa.

"Proteasa" incluye enzimas que hidrolizan enlaces peptídicos (peptidasas), así como enzimas que hidrolizan enlaces entre péptidos y otras porciones, tal como azúcares (glicopeptidasas). Muchas proteasas se caracterizan según EC 3.4 y son adecuadas para su uso en los procesos como se describe en la presente. Algunos tipos específicos de proteasas incluyen, cisteína proteasas que incluyen pepsina, papaína y serina proteasas que incluyen quimotripsinas, carboxi peptidasas y metaloendopeptidasas.

“Lipasa" incluye enzimas que hidrolizan lípidos, ácidos grasos y acilglicéridos, que incluyen fosfoglicéridos, lipoproteínas, diacilgliceroles y similares. En las plantas, los lípidos se utilizan como componentes estructurales para limitar la pérdida de agua y la infección por patógenos. Estos lípidos incluyen ceras derivadas de ácidos grasos, así como cutina y suberina.

“Ligninasa" incluye enzimas que pueden hidrolizar o romper la estructura de los polímeros de lignina. Las enzimas que pueden descomponer la lignina incluyen lignina peroxidasas, manganeso peroxidasas, lacasas y feruloil esterasas, y otras enzimas descritas en la técnica que se sabe que despolimerizan o rompen de otro modo los polímeros de lignina. También se incluyen enzimas capaces de hidrolizar enlaces formados entre azúcares hemicelulósicos (notablemente arabinosa) y lignina. Las ligninasas incluyen pero no se limitan al siguiente grupo de enzimas: lignina peroxidasas (EC 1.11.1.14), peroxidasas de manganeso (EC 1.11.1.13), lacasas (EC 1.10.3.2) y feruloil esterasas (EC 3.1.1.73).

"Hexosiltransferasa" (2.4.1-) incluye enzimas que son capaces de catalizar una reacción de transferasa, pero que también pueden catalizar una reacción de hidrólisis, por ejemplo, de celulosa y/o productos de degradación de celulosa. Un ejemplo de una hexosiltransferasa que se puede usar es una p-glucanosiltransferasa. Esta enzima puede ser capaz de catalizar la degradación de (1,3)(1,4)glucano y/o celulosa y/o un producto de degradación de celulosa.

"Glucuronidasa" incluye enzimas que catalizan la hidrólisis de un glucuronósido, por ejemplo p-glucuronósido para producir un alcohol. Muchas glucuronidasas se han caracterizado y pueden ser adecuadas para su uso, por ejemplo, pglucuronidasa (EC 3.2.1.31), hialurono-glucuronidasa (EC 3.2.1.36), glucuronosil-disulfoglucosamina glucuronidasa (3.2.1.56), glicirricinato p-glucuronidasa (3.2.1.128) o a-D-glucuronidasa (EC 3.2.1.139).

Las expansinas están implicadas en el aflojamiento de la estructura de pared celular durante el crecimiento de células vegetales. Se ha propuesto que las expansinas interrumpen el enlace de hidrógeno entre la celulosa y otros polisacáridos de la pared celular sin tener actividad hidrolítica. De esta manera, se cree que permiten el deslizamiento de fibras de celulosa y el agrandamiento de la pared celular. La hinchenina, una proteína de tipo expansina, contiene un dominio de familia 1 del módulo de unión a carbohidratos (CBD) N-terminal y un dominio de tipo expansina C-terminal. Como se describe en la presente, una proteína de tipo expansina o proteína de tipo hinchenina puede comprender uno o ambos de estos dominios y/o puede alterar la estructura de las paredes celulares (tal como alterar la estructura de celulosa), opcionalmente sin producir cantidades detectables de azúcares reductores.

Una proteína inducida por celulosa, por ejemplo el producto polipeptídico del gen cip1 o cip2 o genes similares (ver, Foreman et al., J. Biol. Chem. 278(34), 31988-31997, 2003), una proteína de integración de celulosa/celulosoma, por ejemplo, el producto polipeptídico del gen cipA o cipC, o una escafoldina o una proteína de tipo escafoldina. Las escafoldinas y las proteínas de integración de celulosa son subunidades de integración multifuncionales que pueden organizar subunidades celulolíticas en un complejo multienzimático. Esto se logra mediante la interacción de dos clases complementarias de dominio, es decir, un dominio de cohesión en escafoldina y un dominio de dockerina en cada unidad enzimática. La subunidad de escafoldina también lleva un módulo de unión a celulosa (CBM) que media la unión del celulosoma a su sustrato. Una escafoldina o proteína de integración de celulosa puede comprender uno o ambos de estos dominios.

Una catalasa; el término "catalasa" significa un peróxido de hidrógeno: peróxido de hidrógeno oxidorreductasa (EC 1.11.1.6 o EC 1.11.1.21) que cataliza la conversión de dos peróxidos de hidrógeno en oxígeno y dos aguas. La actividad de catalasa se puede determinar mediante el monitoreo de la degradación del peróxido de hidrógeno a 240 nm con base en la siguiente reacción: 2HzOz ^ 2H²O Oz. La reacción se lleva a cabo en fosfato 50 mM pH 7,0 a 25 °C con sustrato 10,3 mM (H²O²) y aproximadamente 100 unidades de enzima por ml. La absorbancia se monitorea espectrofotométricamente en 16-24 segundos, lo que debería corresponder a una reducción de absorbancia de 0,45 a 0,4. Una unidad de actividad catalasa se puede expresar como un micromol de H²O² degradado por minuto a pH 7,0 y 25 °C.

El término "amilasa" como se usa en la presente significa enzimas que hidrolizan los enlaces alfa-1,4-glucosídicos en el almidón, tanto en amilosa como en amilopectina, tal como alfa-amilasa (EC 3.2.1.1), beta-amilasa (EC 3.2.1.2), glucano 1,4-alfa-glucosidasa (EC 3.2.1.3), glucano 1,4-alfa-maltotetraohidrolasa (EC 3.2.1.60), glucano 1,4-alfa-maltohexaosidasa (EC 3.2.1.98), glucano 1,4-alfa-maltotriohidrolasa (EC 3.2.1.116) y glucano 1,4-alfa-maltohidrolasa (EC 3.2.1.133) y enzimas que hidrolizan los enlaces alfa-1,6-glucosídicos, que son los puntos de ramificación en la amilopectina, tal como pululanasa (EC 3.2.1.41) y dextinasa (EC 3.2.1.142).

Una composición para su uso en los procesos como se describe en la presente puede estar compuesta por enzimas de (1) proveedores comerciales; (2) genes clonados que expresan enzimas; (3) caldo (tal como el que resulta del crecimiento de una cepa microbiana en medios, donde las cepas secretan proteínas y enzimas en los medios; (4) lisados celulares de cepas cultivadas como en (3); y/o (5) material vegetal que expresa enzimas. Diferentes enzimas en una composición de la invención se pueden obtener de diferentes fuentes.

Las enzimas se pueden producir de forma exógena en microorganismos, levaduras, hongos, bacterias o plantas, luego se aíslan y se añaden, por ejemplo, a material lignocelulósico. Alternativamente, la enzima se puede producir en una fermentación que usa material lignocelulósico (pretratado) (tal como rastrojo de maíz o paja de trigo) para proporcionar nutrición a un organismo que produce una enzima(s). De esta manera, las plantas que producen las enzimas pueden servir ellas mismas como material lignocelulósico y añadirse al material lignocelulósico.

En los usos y procesos descritos en la presente, los componentes de las composiciones descritas anteriormente se pueden proporcionar de forma concomitante (es decir, como una única composición per se) o por separado o secuencialmente.

En una realización, la composición enzimática es un caldo de fermentación completo de un hongo, preferentemente un caldo de fermentación completo de un hongo filamentoso, más preferentemente un caldo de fermentación completo de Rasamsonia. El caldo de fermentación completo se puede preparar a partir de la fermentación de hongos filamentosos no recombinantes y/o recombinantes. En una realización el hongo filamentoso puede ser un hongo filamentoso recombinante que comprende uno o más genes que pueden ser homólogos o heterólogos al hongo filamentoso. En una realización, el hongo filamentoso es un hongo filamentoso recombinante que comprende uno o más genes que pueden ser homólogos o heterólogos al hongo filamentoso donde el uno o más genes codifican enzimas que pueden degradar un sustrato celulósico. El caldo de fermentación completo puede comprender cualquiera de los polipéptidos descritos anteriormente o cualquier combinación de los mismos.

Preferiblemente, la composición enzimática es un caldo de fermentación completo donde se destruyen las células. El caldo de fermentación completo puede contener ácido(s) orgánico(s) (usado(s) para matar las células), células muertas y/o residuos celulares, y medio de cultivo.

En general, los hongos filamentosos se cultivan en un medio de cultivo celular adecuado para la producción de enzimas capaces de hidrolizar un sustrato celulósico. El cultivo tiene lugar en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios de cultivo adecuados, los intervalos de temperatura y otras condiciones adecuadas para el crecimiento y la producción de celulasa y/o hemicelulasa y/o pectinasa se conocen en la técnica. El caldo de fermentación completo se puede preparar al cultivar los hongos filamentosos hasta la fase estacionaria y manteniendo los hongos filamentosos en condiciones de carbono limitantes durante un período de tiempo suficiente para expresar la una o más celulasas y/o hemicelulasas y/o pectinasas. Una vez que las enzimas, tal como celulasas y/o hemicelulasas y/o pectinasas, se secretan por los hongos filamentosos en el medio de fermentación, se puede usar el caldo de fermentación completo. El caldo de fermentación completo de la presente invención puede comprender hongos filamentosos. En algunas realizaciones, el caldo de fermentación completo comprende el contenido no fraccionado de los materiales de fermentación derivados al final de la fermentación. Típicamente, el caldo de fermentación completo comprende el medio de cultivo gastado y los residuos celulares presentes después de que los hongos filamentosos se cultivan hasta la saturación, se incuban en condiciones limitantes de carbono para permitir la síntesis de proteínas (particularmente, expresión de celulasas y/o hemicelulasas y/o pectinasas). En algunas realizaciones, el caldo de fermentación completo comprende el medio de cultivo celular gastado, las enzimas extracelulares y los hongos filamentosos. En algunas realizaciones, los hongos filamentosos presentes en el caldo de fermentación completo se pueden lisar, permeabilizar o destruir usando métodos conocidos en la técnica para producir un caldo de fermentación completo de células muertas. En una realización, el caldo de fermentación completo es un caldo de fermentación completo con células muertas, donde el caldo de fermentación completo que contiene las células de hongos filamentosos se lisan o matan. En algunas realizaciones, las células se destruyen mediante lisis de los hongos filamentosos mediante tratamiento químico y/o pH para generar el caldo completo de células muertas de una fermentación de los hongos filamentosos. En algunas realizaciones, las células se destruyen mediante la lisis de los hongos filamentosos mediante el tratamiento químico y/o de pH y el ajuste del pH de la mezcla de fermentación de células muertas a un pH adecuado. En una realización, el caldo de fermentación completo comprende un primer componente de ácido orgánico que comprende al menos un ácido orgánico de 1-5 carbonos y/o una sal del mismo y un segundo componente de ácido orgánico que comprende al menos 6 o más ácidos orgánicos de carbono y/o una sal del mismo. En una realización, el primer componente de ácido orgánico es ácido acético, ácido fórmico, ácido propiónico, una sal de los mismos o cualquier combinación de los mismos y el segundo componente de ácido orgánico es ácido benzoico, ácido ciclohexanocarboxílico, ácido 4-metilvalérico, ácido fenilacético, una sal de los mismos o cualquier combinación de los mismos.

El término “caldo de fermentación completo”, como se usa en la presente, se refiere a una preparación producida por fermentación celular que no experimenta o experimenta una recuperación y/o purificación mínima. Por ejemplo, los caldos de fermentación completos se producen cuando los cultivos microbianos se cultivan hasta la saturación, se incuban en condiciones limitantes de carbono para permitir la síntesis de proteínas (por ejemplo, la expresión de enzimas por las células huésped) y la secreción en el medio de cultivo celular. Típicamente, el caldo de fermentación completo no está fraccionado y comprende medio de cultivo celuar gastado, enzimas extracelulares y células microbianas, preferiblemente no viables.

Si es necesario, se puede fraccionar el caldo de fermentación completo y se pueden usar uno o más de los contenidos fraccionados. Por ejemplo, las células muertas y/o los residuos celulares se pueden eliminar de un caldo de fermentación completo para proporcionar una composición que esté libre de estos componentes.

El caldo de fermentación completo puede comprender además un agente conservante y/o antimicrobiano. Estos conservantes y/o agentes se conocen en la técnica.

El caldo de fermentación completo como se describe en la presente es típicamente un líquido, pero puede contener componentes insolubles, tal como células muertas, residuos celulares, componentes de medios de cultivo y/o enzimas insolubles. En algunas realizaciones, los componentes insolubles se pueden eliminar para proporcionar un caldo de fermentación completo clarificado.

En una realización, el caldo de fermentación completo se puede complementar con una o más actividades enzimáticas que no se expresan endógenamente, o se expresan a un nivel relativamente bajo por los hongos filamentosos, para mejorar la degradación del sustrato celulósico, por ejemplo, a azúcares fermentables tal como glucosa o xilosa. Las enzimas complementarias se pueden añadir como un complemento al caldo de fermentación completo y las enzimas pueden ser un componente de un caldo de fermentación completo separado, o pueden purificarse, o recuperarse mínimamente y/o purificarse.

En una realización, el caldo de fermentación completo comprende un caldo de fermentación completo de una fermentación de un hongo filamentoso recombinante que sobreexpresa una o más enzimas para mejorar la degradación del sustrato celulósico. Alternativamente, el caldo de fermentación completo puede comprender una mezcla de un caldo de fermentación completo de una fermentación de un hongo filamentoso no recombinante y un hongo filamentoso recombinante que sobreexpresa una o más enzimas para mejorar la degradación del sustrato celulósico. En una realización, el caldo de fermentación completo comprende un caldo de fermentación completo de una fermentación de un hongo filamentoso que sobreexpresa beta-glucosidasa o endoglucanasa. Como alternativa, el caldo de fermentación completo para su uso en los presentes métodos y composiciones reactivas puede comprender una mezcla de un caldo de fermentación completo de una fermentación de un hongo filamentoso no recombinante y un caldo de fermentación completo de una fermentación de un hongo filamentoso recombinante que sobreexpresa una beta-glucosidasa o endoglucanasa.

El material carbohidrato, tal como se usa en la presente, incluye cualquier material que contenga almidón y/o sacarosa y/o celulosa. Preferiblemente, el material de carbohidratos como se usa en la presente incluye material lignocelulósico y/o hemicelulósico. Lo más preferiblemente, el material de carbohidratos como se usa en la presente es material lignocelulósico. El material de carbohidratos adecuado para su uso en los procesos como se describe en la presente incluye biomasa, por ejemplo, biomasa virgen y/o biomasa no virgen tal como biomasa agrícola, productos orgánicos comerciales, desechos de construcción y demolición, desechos sólidos municipales, desechos de papel y desechos de jardín. Las formas comunes de biomasa incluyen árboles, arbustos y hierbas, trigo, centeno, avena, paja de trigo, caña de azúcar, paja de caña, bagazo de caña de azúcar, pasto varilla, miscanthus, caña de energía, mandioca, melaza, cebada, maíz, rastrojo de maíz, fibra de maíz, cáscaras de maíz, mazorcas de maíz, tallos de canola, tallos de soja, sorgo dulce, grano de maíz que incluye fibra de granos, granos secos de destilería (DDGS), productos y subproductos de la molienda de granos tal como maíz, trigo y cebada (incluyendo molienda húmeda y molienda seca) a menudo llamados "salvado o fibra", así como desechos sólidos municipales, papel de desecho y desechos de jardín. La biomasa también puede ser, pero no se limita a, material herbáceo, residuos agrícolas, residuos forestales, residuos sólidos municipales, papel de desecho y residuos de fábricas de pulpa y papel. La "biomasa agrícola" incluye ramas, arbustos, cañas, cáscaras de maíz y maíz, cultivos energéticos, bosques, frutas, flores, granos, hierbas, cultivos herbáceos, hojas, corteza, agujas, troncos, raíces, árboles jóvenes, cultivos leñosos de rotación corta, arbustos, pasto varilla, árboles, verduras, cáscaras de frutas, vides, remolacha azucarera, pulpa de remolacha azucarera, harinilla de trigo, cáscaras de avena y maderas duras y blandas (sin incluir maderas con materiales nocivos). Además, la biomasa agrícola incluye materiales de desechos orgánicos generados a partir de procesos agrícolas, incluidas las actividades agrícolas y forestales, específicamente los desechos de madera forestal. La biomasa agrícola puede ser cualquiera de las mencionadas anteriormente individualmente o en cualquier combinación o mezcla de las mismas.

De acuerdo con la invención, el material de carbohidratos se pretrata antes de la licuación. Los métodos de pretratamiento son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, calor, modificación mecánica, química, modificación biológica y cualquier combinación de las mismas. El pretratamiento se realiza típicamente con el fin de mejorar la accesibilidad del material de carbohidratos a la hidrólisis enzimática y/o hidrolizar la hemicelulosa y/o solubilizar la hemicelulosa y/o celulosa y/o lignina, en el material de carbohidratos. En una realización, el pretratamiento comprende tratar el material de carbohidratos con explosión por vapor, tratamiento con agua caliente o tratamiento con ácido diluido o base diluida. Ejemplos de métodos de pretratamiento incluyen, pero no se limitan a, tratamiento con vapor (por ejemplo, tratamiento a 100-260 °C, a una presión de 7-45 bar, a pH neutro, durante 1-10 minutos), tratamiento con ácido diluido (por ejemplo, tratamiento con H²SO⁴ al 0,1 - 5 % y/o SOz y/o HNOs y/o HCl, en presencia o ausencia de vapor, a 120 - 200 °C, a una presión de 200-1500 kPa (2 - 15 bar), a pH ácido, durante 2-30 minutos), tratamiento con organosolventes (por ejemplo, tratamiento con 1 - H²SO⁴ al 1,5 % en presencia de disolvente orgánico y vapor, a 160 - 200 °C, a una presión de 700 -3000 kPa (7-30 bar), a pH ácido, durante 30 - 60 minutos), tratamiento con cal (por ejemplo, tratamiento con NaOH/Ca(OH)² al 0,1 - 2 % en presencia de agua/vapor a 60-160 °C, a una presión de 100 - 1000 kPa (1-10 bar), a pH alcalino, durante 60 - 4800 minutos), tratamiento con ARP (por ejemplo, tratamiento con NH³ al 5 - 15 %, a 150 - 180 °C, a una presión de 900 - 1700 kPa (9 - 17 bar), a pH alcalino, durante 10-90 minutos), tratamiento con AFEX (por ejemplo, tratamiento con NH³ > 15 %, a 60 - 140 °C, a una presión de 800-2000 kPa (8-20 bar), a pH alcalino, durante 5-30 minutos). En una realización, el pretratamiento se realiza en ausencia de oxígeno.

El material de carbohidratos se puede lavar. En una realización, el material de carbohidratos se puede lavar después del pretratamiento. El paso de lavado se puede usar para eliminar compuestos solubles en agua que pueden actuar como inhibidores para el paso de fermentación y/o hidrólisis. El paso de lavado se puede llevar a cabo de manera conocida por la persona experta en la técnica. Además del lavado, existen otros métodos de desintoxicación. El material de carbohidratos también se puede desintoxicar mediante cualquiera (o cualquier combinación) de estos métodos que incluyen, pero no se limitan a, separación sólido/líquido, evaporación al vacío, extracción, adsorción, neutralización, sobreencalado, adición de agentes reductores, adición de enzimas desintoxicantes tal como lacasas o peroxidasas, adición de microorganismos capaces de desintoxicación de hidrolizados.

La composición enzimática utilizada en el proceso como se describe en la presente puede hidrolizar de manera extremadamente efectiva el material de carbohidratos, por ejemplo, rastrojo de maíz, paja de trigo, paja de caña y/o bagazo de caña de azúcar, que luego se puede convertir en un producto, tal como etanol, biogás, butanol, un plástico, un ácido orgánico, un disolvente, un suplemento de alimenticio animal, un producto farmacéutico, una vitamina, un aminoácido, una enzima o una materia prima química. Adicionalmente, los productos intermedios de un proceso después de la hidrólisis, por ejemplo ácido láctico como intermedio en la producción de biogás, se pueden usar como bloque de construcción para otros materiales.

En una realización, la cantidad de enzima añadida (en la presente también llamada dosis de enzima o carga de enzima) es baja. En una realización, la cantidad de enzima es 0,1 - 10 mg de proteína /g de materia seca. La proteína se mide de acuerdo con el análisis de TCA-Biuret como se describe en la presente.

En una realización, la licuefacción se lleva a cabo utilizando material de carbohidratos pretratado que tiene un peso de materia seca de 15 a 25 % (p/p).

En una realización, la fermentación se realiza en un reactor. En una realización, la fermentación también se puede realizar en dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o incluso más reactores. Por lo tanto, el término "reactor" no se limita a un solo reactor, sino que puede significar múltiples reactores.

En una realización, la fermentación se realiza en un reactor que tiene un volumen de 1 - 5000 m3. En caso de que se usen múltiples reactores en la fermentación de los procesos como se describe en la presente, pueden tener el mismo volumen, pero también pueden tener un volumen diferente.

En una realización, el reactor en el que se realiza la fermentación tiene una relación de altura a diámetro de 2:1 a 8:1.

En una realización, la fermentación se realiza mediante un microorganismo productor de alcohol para producir alcohol. La fermentación por un microorganismo productor de alcohol para producir alcohol se puede realizar en el mismo reactor donde se realiza la hidrólisis. Preferiblemente, la fermentación por un microorganismo productor de alcohol para producir alcohol se realiza en un reactor separado.

En una realización, la fermentación se realiza mediante una levadura. En una realización, el microorganismo productor de alcohol es una levadura. En una realización, el microorganismo productor de alcohol es capaz de fermentar al menos un azúcar C5 y al menos un azúcar C₆. En una realización, la fermentación se realiza con una levadura que es capaz de convertir al menos un azúcar C5. En una realización, el producto de azúcar como se describe en la presente comprende glucosa, galactosa y arabinosa. En una realización, el producto de azúcar como se describe en la presente comprende ácido acético, preferentemente 0,3 % (p/p) o más. En una realización, el producto de azúcar como se describe en la presente comprende glicerol. En una realización, el producto de azúcar como se describe en la presente comprende ácido acético, glicerol y un azúcar C₆ y/o un azúcar C5. En una realización, el microorganismo utilizado para la fermentación fermenta ácido acético, glicerol y un azúcar C₆ y/o un azúcar C5 a un producto de fermentación. En una realización, la levadura utilizada para la fermentación fermenta ácido acético, glicerol y un azúcar C₆ y/o un azúcar C5 a un producto de fermentación. En una realización, la levadura utilizada para la fermentación fermenta ácido acético, glicerol y un azúcar C₆ y/o un azúcar C5 a etanol. En una realización, el producto de azúcar como se describe en la presente comprende Mn2+.

En un aspecto adicional, la solicitud incluye un proceso como se describe en la presente en el que se usa un microorganismo para la fermentación de una fuente de carbono que comprende azúcar(es), por ejemplo, glucosa, L-arabinosa, galactosa y/o xilosa. La fuente de carbono puede incluir cualquier oligo o polímero de carbohidrato que comprenda unidades de L-arabinosa, galactosa, xilosa o glucosa, tal como, por ejemplo, lignocelulosa, xilanos, celulosa, almidón, arabinano y similares. Para la liberación de unidades de xilosa o glucosa a partir de estos carbohidratos, se pueden añadir carbohidrasas apropiadas (tales como xilanasas, glucanasas, amilasas y similares) al medio de fermentación o se pueden producir por la célula huésped modificada. En este último caso, la célula huésped modificada se puede modificar por ingeniería genética para producir y excretar estas carbohidrasas. Una ventaja adicional de usar fuentes oligo o poliméricas de glucosa es que permite mantener una concentración baja(menor) de glucosa libre durante la fermentación, por ejemplo, al usar cantidades limitantes de velocidad de las carbohidrasas. Esto, a su vez, evitará la represión de los sistemas necesarios para el metabolismo y el transporte de azúcares que no son glucosa, tal como la xilosa. En una realización, la célula huésped modificada fermenta tanto la L-arabinosa (opcionalmente xilosa) como la glucosa, preferentemente de manera simultánea, en cuyo caso preferentemente se usa una célula huésped modificada que es insensible a la represión de glucosa para evitar el crecimiento diauxico. Además de una fuente de L-arabinosa, opcionalmente xilosa (y glucosa) como fuente de carbono, el medio de fermentación comprenderá además el ingrediente apropiado requerido para el crecimiento de la célula huésped modificada.

El proceso de fermentación puede ser un proceso de fermentación aeróbico o anaeróbico. Un proceso de fermentación anaeróbica se define en la presente como un proceso de fermentación ejecutado en ausencia de oxígeno o en el que sustancialmente no se consume oxígeno, preferiblemente se consume menos de 5, 2,5 o 1 mmol/L/h, más preferiblemente se consume 0 mmol/L/h (es decir, el consumo de oxígeno no es detectable), y donde las moléculas orgánicas sirven tanto como donantes de electrones como aceptores de electrones. En ausencia de oxígeno, el NADH producido en la glucólisis y la formación de biomasa no se puede oxidar por fosforilación oxidativa. Para resolver este problema, muchos microorganismos usan piruvato o uno de sus derivados como aceptor de electrones e hidrógeno, regenerando así NAD+.

Por lo tanto, en un proceso de fermentación anaeróbica preferido, el piruvato se usa como un electrón (y aceptor de hidrógeno) y se reduce a productos de fermentación tal como etanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, un aminoácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, butanol, un antibiótico p-lactámico y una cefalosporina. En una realización preferida, el proceso de fermentación es anaeróbico. Un proceso anaeróbico es ventajoso, ya que es más barato que los procesos aeróbicos: se necesita menos equipo especial. Además, se espera que los procesos anaeróbicos proporcionen un mayor rendimiento de producto que los procesos aeróbicos. En condiciones aeróbicas, en general el rendimiento de biomasa es mayor que en condiciones anaeróbicas. Como consecuencia, normalmente en condiciones aeróbicas, el rendimiento de producto esperado es menor que en condiciones anaeróbicas.

En otra realización, el proceso de fermentación se encuentra en condiciones de oxígeno limitado. Más preferentemente, el proceso de fermentación es aeróbico y en condiciones de oxígeno limitado. Un proceso de fermentación de oxígeno limitado es un proceso en el cual el consumo de oxígeno está limitado por la transferencia de oxígeno del gas al líquido. El grado de limitación de oxígeno se determina por la cantidad y composición del flujo de gas entrante, así como las propiedades reales de mezcla/transferencia de masa del equipo de fermentación utilizado. Preferiblemente, en un procedimiento en condiciones de oxígeno limitado, la velocidad de consumo de oxígeno es al menos 5,5, más preferiblemente al menos 6 e incluso más preferiblemente al menos 7 mmol/l/h. En una realización, la fermentación es anaeróbica.

El proceso de fermentación se ejecuta preferiblemente a una temperatura que es óptima para el microorganismo utilizado. Por lo tanto, para la mayoría de las levaduras o células fúngicas, el proceso de fermentación se realiza a una temperatura que es inferior a 42 °C, preferentemente 38 °C o inferior. Para células huésped de levadura u hongos filamentosos, el proceso de fermentación se realiza preferiblemente a una temperatura que es inferior a 35, 33, 30 o 28 °C y a una temperatura que es superior a 20, 22 o 25 °C. En una realización, la fermentación se realiza entre 25 °C y 35 °C.

En una realización, las fermentaciones se realizan con un microorganismo fermentador. En una realización de la invención, las fermentaciones con alcohol (por ejemplo, etanol) de azúcares C5 se llevan a cabo con un microorganismo fermentador C5. En una realización de la invención, las fermentaciones de alcohol (por ejemplo, etanol) de azúcares C₆ se llevan a cabo con un microorganismo fermentador C5 o un microorganismo fermentador C₆ comercial. La levadura disponible comercialmente adecuada para la producción de etanol incluye, pero no se limita a, BIOFERM MR AFT y XR (NABC-North American Bioproducts Corporation, GA, EE. UU.), levaduraMR ROJA DE ETANOL (Fermentis/Lesaffre, EE. UU.), FALIMR (Fleischmann 's Yeast, EE. UU.), FERMIOLMR (DSM Specialties), GERT STRANDMR (Gert Strand AB, Suecia) y SUPERSTARTMR y THERMOSACCMR Fresh Levadura (Ethanol Technology, Wl, EE.UU.)

En una realización, el microorganismo productor de alcohol es un microorganismo que es capaz de fermentar al menos un azúcar C5. Con preferencia, también es capaz de fermentar al menos un azúcar C₆. En una realización, la solicitud describe un proceso para la preparación de etanol a partir de material lignocelulósico, que comprende los pasos de (a) realizar un proceso para la preparación de un producto de azúcar a partir de material lignocelulósico como se describió anteriormente, (b) fermentación del producto de azúcar para producir etanol; y (c) opcionalmente, recuperación del etanol. La fermentación se puede realizar con una levadura que es capaz de fermentar al menos un azúcar C5.

El microorganismo usado en la fermentación puede ser un organismo procariota o eucariota. El microorganismo usado puede ser un microorganismo modificado por ingeniería genética. Ejemplos de microorganismos adecuados son levaduras, por ejemplo Saccharomyces, por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus o Saccharomyces uvarum, Hansenula, Issatchenkia, por ejemplo Issatchenkia orientalis, Pichia, por ejemplo Pichia stipites o Pichia pastoris, Kluyveromyces, por ejemplo Kluyveromyces fagilis, Candida, por ejemplo Candida pseudotropicalis o Candida acidothermophilum, Pachysolen, por ejemplo Pachysolen tannophilus o bacterias, por ejemplo Lactobacillus, por ejemplo Lactobacillus lactis, Geobacillus, Zymomonas, por ejemplo Zymomonas mobilis, Clostridium, por ejemplo Clostridium phytofermentans, Escherichia, por ejemplo E. coli, Klebsiella, por ejemplo Klebsiella oxytoca. En una realización, el microorganismo que es capaz de fermentar al menos un azúcar C5 es una levadura. En una realización, la levadura pertenece al género Saccharomyces, preferentemente de la especie Saccharomyces cerevisiae. La levadura, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, utilizada en los procesos como se describe en la presente es capaz de convertir azúcares de hexosa (C₆) y azúcares de pentosa (C5). La levadura, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, utilizada en los procesos como se describe en la presente puede fermentar anaeróbicamente al menos un azúcar C₆ y al menos un azúcar C5. En una realización, la levadura como se describe en la presente es capaz de usar L-arabinosa y xilosa además de glucosa anaeróbicamente. En una realización, la levadura es capaz de convertir L-arabinosa en L-ribulosa y/o xilulosa 5-fosfato y/o en un producto de fermentación deseado, por ejemplo, en etanol. Se pueden producir organismos, por ejemplo cepas de Saccharomyces cerevisiae, capaces de producir etanol a partir de L-arabinosa al modificar una levadura huésped introduciendo los genes araA (L-arabinosa isomerasa), araB (L-ribuloglioxalato) y araD (L-ribulosa-5-P4-epimerasa) a partir de una fuente adecuada. Estos genes se pueden introducir en una célula huésped con el fin de que sea capaz de usar arabinosa. Este enfoque se describe en el documento WO2003/095627. Los genes araA, araB y araD de Lactobacillus plantarum se pueden utilizar y se divulgan en WO2008/041840. El gen araA de Bacillus subtilis y los genes araB y araD de Escherichia coli se pueden utilizar y se divulgan en EP1499708. En otra realización, los genes araA, araB y araD pueden derivar de al menos uno del género Clavibacter, Arthrobacter y/o Gramella, en particular uno de Clavibacter michiganensis, Arthrobacter aurescens y/o Gramella forsetii, como se divulga en WO 2009011591. En una realización, la levadura también puede comprender una o más copias del gen de xilosa isomerasa y/o una o más copias de xilosa reductasa y/o xilitol deshidrogenasa.

La levadura puede comprender una o más modificaciones genéticas para permitir que la levadura fermente xilosa. Ejemplos de modificaciones genéticas son la introducción de uno o más genes xylA, genXYL1 y genXYL2 y/o gen XKS1; deleción del gen de la aldosa reductasa (GRE3); sobreexpresión de los genes PPP TAL1, TKL1, RPE1 y RKI1 para permitir el incremento del flujo a través de la vía de pentosa fosfato en la célula. Ejemplos de levaduras modificadas por ingeniería genética se describen en EP1468093 y/o WO2006/009434.

Un ejemplo de una levadura comercial adecuada es RN1016 que es una cepa de Saccharomyces cerevisiae fermentadora de xilosa y glucosa de DSM, Países Bajos.

En una realización, el proceso de fermentación para la producción de etanol es anaeróbico. Anaeróbico ya se ha definido anteriormente en la presente. En otra realización, el proceso de fermentación para la producción de etanol es aeróbico. En otra realización, el proceso de fermentación para la producción de etanol se encuentra en condiciones de oxígeno limitado, por ejemplo, aeróbicas y en condiciones de oxígeno limitado. Las condiciones de oxígeno limitado ya se han definido anteriormente en la presente.

Como alternativa, a los procesos de fermentación descritos anteriormente, se pueden usar al menos dos células distintas, lo que significa que este proceso es un proceso de cofermentación. Todas las realizaciones de los procesos de fermentación como se describió anteriormente también son realizaciones de este proceso de cofermentación: identidad del producto de fermentación, identidad de la fuente de L-arabinosa y la fuente de xilosa, condiciones de fermentación (condiciones aeróbicas o anaeróbicas, condiciones limitadas de oxígeno, temperatura a la que se lleva a cabo el proceso, productividad de etanol, rendimiento de etanol).

Los productos de fermentación que se pueden producir mediante los procesos de la invención pueden ser cualquier sustancia derivada de la fermentación. Incluyen, pero no se limitan a, alcohol (tal como arabinitol, butanol, etanol, glicerol, metanol, 1,3-propanodiol, sorbitol, y xilitol); ácido orgánico (tal como ácido acético, ácido acetónico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido acrílico, ácido cítrico, ácido 2,5-diceto-D-glucónico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glucónico, ácido glucurónico, ácido glutárico, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido itacónico, ácido láctico, ácido maleico, ácido málico, ácido malónico, ácido oxálico, ácido oxaloacético, ácido propiónico, ácido succínico, y ácido xilónico); cetonas (tal como acetona); aminoácidos (tal como ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, lisina, serina, triptófano, y treonina); alcanos (tal como pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, undecano, y dodecano), cicloalcanos (tal como ciclopentano, ciclohexano, cicloheptano, y ciclooctano), alquenos (tal como penteno, hexeno, hepteno, y octeno); y gases (tal como metano, hidrógeno (H²), dióxido de carbono (CO²), y monóxido de carbono (CO)). El producto de fermentación también puede ser una proteína, una vitamina, un producto farmacéutico, un suplemento alimenticio animal, una sustancia química de especialidad, una materia prima química, un plástico, un disolvente, etileno, una enzima, tal como una proteasa, una celulasa, una amilasa, una glucanasa, una lactasa, una lipasa, una liasa, una oxidorreductasa, una transferasa o una xilanasa. En una realización preferida, se prepara un alcohol en los procesos de fermentación como se describe en la presente. En una realización preferida, se prepara etanol en los procesos de fermentación como se describe en la presente.

Los procesos como se describe en la presente pueden comprender la recuperación de todo tipo de productos elaborados durante los procesos, incluidos los productos de fermentación tales como el etanol. Un producto de fermentación se puede separar del caldo de fermentación de manera conocida por la persona experta. Ejemplos de técnicas para recuperación incluyen, pero no se limitan a, cromatografía, procedimientos electroforéticos, solubilidad diferencial, destilación o extracción. Para cada producto de fermentación, el experto en la técnica podrá seleccionar una técnica de separación adecuada. Por ejemplo, el etanol se puede separar de un caldo de fermentación de levadura por destilación, por ejemplo destilación al vapor/destilación al vacío de manera convencional.

En una realización, los procesos como se describe en la presente también producen energía, calor, electricidad y/o vapor.

Ejemplos

Ejemplo 1

El efecto de la licuefacción y la temperatura de sacarificación sobre la producción de glucosa

El efecto de la temperatura durante la licuefacción y sacarificación del material lignocelulósico se muestra en este ejemplo.

Los experimentos se realizaron en reactores agitados, de pH controlado y de temperatura controlada con un volumen de trabajo de 1 l. Cada experimento se realizó con 2,5 mg de proteína/gramo de materia seca de material lignocelulósico pretratado de un cóctel de celulasa de Rasamsonia emersonii más 0,2 mg de proteína/g de materia seca de material lignocelulósico pretratado de una beta-glucosidasa de Rasamsonia emersonii.

La concentración de proteína se determinó usando el método de Biuret. Las muestras se diluyeron en base al peso con agua y se centrifugaron durante 5 minutos a >14000xg. Se hicieron diluciones de albúmina de suero bovino (BSA) (0,5, 1,2, 5, 10 y 15 mg/ml) para generar una curva de calibración. De cada muestra de proteína diluida (de la BSA y el cóctel), se transfirieron 200 |jl del sobrenadante a un tubo de reacción de 1,5 ml. Se añadieron 800 |jl de reactivo BioQuant Biuret y se mezclaron completamente. De la misma muestra de proteína diluida, se añadieron 500 j l al tubo de reacción que contenía un filtro de 10KD. Se transfirieron 200 j l del efluente a un tubo de reacción de 1,5 ml, se añadieron 800 j l de reactivo BioQuant Biuret y se mezclaron a fondo. Después, todas las mezclas (muestras de proteínas diluidas antes y después de la filtración de 10KD mezcladas con BioQuant) se incubaron a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. La absorción de las mezclas se midió a 546 nm con una muestra de agua usada como una medición en blanco. Se usaron diluciones del cóctel que dieron un valor de absorción a 546 nm dentro del intervalo de la línea de calibración para calcular la concentración de proteína total de las muestras a través de la línea de calibración de BSA.

Se produjo cóctel de celulasa de Rasamsonia emersonii de acuerdo con los métodos descritos en WO2011/000949. Se utilizó beta-glucosidasa de Rasamsonia emersonii como se describe en W02012/000890 en los experimentos. Las adiciones enzimáticas se realizaron al inicio de la licuefacción.

El rastrojo de maíz pretratado con ácido (aCS) se preparó incubando el rastrojo de maíz durante 6,7 minutos a 186 °C. Antes del tratamiento térmico, el rastrojo de maíz se impregnó con H²SO⁴ durante 10 minutos para ajustar el pH a 2,3 durante el pretratamiento. La cantidad de glucano en el material lignocelulósico pretratado se midió de acuerdo con el método descrito por Carvalho de Souza et al. (Carbohydrate Polymers, 95 (013) 657-663). Las reacciones de hidrólisis se realizaron con rastrojo de maíz pretratado con ácido (aCS) a una concentración final de 17 % (p/p) de materia seca. La solución de materia prima se preparó mediante dilución de una solución de materia prima concentrada con agua. Posteriormente, el pH se ajustó a pH 4,5 con una solución de NH⁴OH al 10 % (p/p).

En primer lugar, el material lignocelulósico pretratado se sometió a licuefacción durante 6 horas. Durante este período, el espacio de cabeza de los reactores se enjuagó con nitrógeno. Después, el material lignocelulósico licuado se sometió a sacarificación durante 114 horas, en tanto que el espacio de cabeza de los reactores se enjuagó con aire a una velocidad de 0,1 l/minuto. Durante la sacarificación, el nivel de oxígeno disuelto (DO) en la mezcla de reacción se mantuvo a 20 % del nivel de saturación de oxígeno ajustando la velocidad del agitador. Los experimentos se llevaron a cabo con las temperaturas de licuefacción y sacarificación como se muestra en la tabla 1.

Después de la sacarificación, las muestras se tomaron para su análisis. Las muestras se enfriaron en hielo, se centrifugaron durante 10 minutos a 3220xg e inmediatamente se diluyeron 50 j l de cada sobrenadante en 1450 j l de agua de grado I. El sobrenadante diluido se filtró posteriormente en un filtro de 0,45 μm y los filtrados se analizaron para determinar el contenido de azúcar como se describe más adelante.

Las concentraciones de azúcar de las muestras diluidas se midieron utilizando una HPLC equipada con un Aminex HPX-87P de acuerdo con el informe técnico NREL NREL/TP-510-42623. Los resultados se muestran en la tabla 1.

Los datos demuestran que los niveles de glucosa más altos se obtuvieron cuando la temperatura de licuefacción es de 60 °C a 65 °C y la temperatura de sacarificación es de 50 °C a 60 °C.

Ejemplo 2

El efecto de la licuefacción y la temperatura de sacarificación sobre la producción de glucosa

El experimento se realizó como se describe en el ejemplo 1 con la condición de que el nivel de glucosa se midiera en muestras que se tomaron después de 54,5 horas. Los resultados se muestran en la tabla 2.

Los datos demuestran que los niveles de glucosa más altos se obtuvieron cuando la temperatura de licuefacción es de 60 °C a 65 °C y la temperatura de sacarificación es de 50 °C a 60 °C.

Ejemplo 3

El efecto de la licuefacción y la temperatura de sacarificación sobre la producción de glucosa

El experimento se realizó como se describe en el ejemplo 1 con la condición de que cada experimento se realizó con el cóctel de celulasa Ctec2 (mezcla enzimática SAE0020 de Novozymes) que se adquirió de Sigma-Aldrich. Ctec2 es un cóctel de enzimas de Trichoderma reesei que contiene celulasas, 13-glucosidasas y hemicelulasa. Además, en este experimento, el nivel de oxígeno disuelto (DO) en la mezcla de reacción durante la sacarificación se mantuvo a aproximadamente el 40 % del nivel de saturación de oxígeno. Además, en este experimento, la solución de materia prima se preparó mediante dilución de una solución de materia prima concentrada con agua. Posteriormente, el pH se ajustó a pH 5,0 con una solución de NH⁴OH al 10 % (p/p). Las temperaturas de licuefacción y sacarificación usadas y los resultados se muestran en la tabla 3.

Los datos demuestran que con un cóctel de celulasa de Trichoderma reesei los niveles de glucosa más altos se obtuvieron cuando la temperatura de licuefacción es de 60 °C a 65 °C y la temperatura de sacarificación es de 50 °C a 60 °C.

T l 1: Pr i n l v ri m r r li f i n rifi i n 12 h r .

T l 2: Pr i n l v ri m r r li f i n rifi i n 4 h r .

T l : Pr i n l v ri m r r li f i n rifi i n 12 h r .

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Proceso para la preparación de un producto de azúcar a partir de material de carbohidratos, que comprende los siguientes pasos:

a) pretratar el material de carbohidratos,

b) licuar el material de carbohidratos pretratado con una composición enzimática a una temperatura de 60 °C a 65 °C durante 1 a 20 horas para producir un material de carbohidratos licuado,

c) sacarificar el material de carbohidratos licuado con una composición enzimática a una temperatura de 50 °C a 60 °C durante 1 a 120 horas para producir un producto de azúcar, donde se añade oxígeno durante la sacarificación, y d) opcionalmente, recuperar el producto de azúcar.

2. Proceso para la preparación de un producto de fermentación a partir de material de carbohidratos, que comprende los siguientes pasos:

a) pretratar el material de carbohidratos,

b) licuar el material de carbohidratos pretratado con una composición enzimática a una temperatura de 60 °C a 65 °C durante 1 a 20 horas para producir un material de carbohidratos licuado,

c) sacarificar el material de carbohidratos licuado con una composición enzimática a una temperatura de 50 °C a 60 °C durante 1 a 120 horas para producir un producto de azúcar, donde se añade oxígeno durante la sacarificación, d) fermentar el producto de azúcar para producir un producto de fermentación; y

e) opcionalmente, recuperar el producto de fermentación.

3. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde después del paso b y antes del paso c, el material de carbohidratos licuado se sacarifica en ausencia de adición de oxígeno.

4. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la composición enzimática comprende endoglucanasa.

5. Proceso de acuerdo con la reivindicación 4, donde la endoglucanasa comprende una endoglucanasa GH5 y/o una endoglucanasa GH7.

6. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde las composiciones enzimáticas utilizadas para la licuefacción y sacarificación son las mismas.

7. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde las composiciones enzimáticas utilizadas para la licuefacción y sacarificación son diferentes.

8. Proceso de acuerdo con la reivindicación 7, donde la composición enzimática utilizada para la licuefacción comprende más endoglucanasa que la composición enzimática utilizada para la sacarificación.

9. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la composición enzimática utilizada en la sacarificación es un caldo de fermentación completo de un hongo filamentoso, el caldo que comprende una celobiohidrolasa, una beta-glucosidasa, una xilanasa, una beta-xilosidasa y una oxigenasa lítica de monosacárido.

10. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la licuefacción se realiza en un material de carbohidratos pretratado con un peso de materia seca de 15 a 25 % (p/p).

11. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, donde la fermentación se realiza con una levadura que es capaz de convertir al menos un azúcar C5.

12. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde la licuefacción y sacarificación se realizan en diferentes reactores.

13. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde el paso c comprende a una temperatura de 52 °C a 58 °C.

14. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 13, donde el material de carbohidratos licuado se sacarifica en ausencia de adición de oxígeno a una temperatura de 55 °C a 65 °C durante 1 a 120 horas.

15. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, donde el pretratamiento se realiza en ausencia de oxígeno.

16. Proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, donde se añade oxígeno durante la sacarificación para mantener el oxígeno disuelto al 11 % hasta 80 % del nivel de saturación.