CN112204151A - 从碳水化合物材料产生糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及由木质纤维素材料制备糖和/或发酵产物的方法。

Description

从碳水化合物材料产生糖的方法
技术领域
本申请涉及通过酶水解从碳水化合物材料制备糖产物的方法和通过糖发酵制备发酵产物的方法。
背景技术
木质纤维素材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，并提供用于生成化石燃料的替代能源的有吸引力的平台。该材料可大量获得并可转化成有价值的产物，例如糖或生物燃料，例如生物乙醇。
由木质纤维素材料产生发酵产物在本领域中是已知的并且通常包括预处理、水解、发酵和任选地回收发酵产物的步骤。
通常，产生的糖通过微生物例如酵母转化成有价值的发酵产物，例如乙醇。发酵在相同或不同的容器中以单独的、优选厌氧的工艺步骤进行。
通常，在来自木质纤维素材料的发酵产物的整个产生过程中，酶的生产成本是主要的成本因素。迄今为止，通过施加具有更宽和/或更高的(比)水解活性的来自单一或多种微生物来源的酶产物(参见WO 2008/008793)可实现酶生产成本的降低。这导致较低的酶需求、更快的转化速率和/或更高的转化产率并因此降低总生产成本。
除了酶的优化，工艺设计的优化是降低糖产物和发酵产物生产总成本的关键工具。例如，由于糖降解产物而导致的糖损失随着产率降低而增加。由于糖降解产物会抑制发酵，应优化工艺设计以减少这些糖降解产物的量。
出于经济原因，因此期望在涉及碳水化合物材料的预处理、水解和发酵的过程中包括旨在降低总生产成本的新颖的和创新的工艺配置。
发明内容
本申请的目的是提供一种从碳水化合物材料制备糖产物和/或发酵产物的改进方法。通过使用特定的水解条件改善该方法。
具体实施方式
在整个本发明的说明书和所附权利要求书中，词语“包含”和“包括”以及各种词性变体例如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”和“包括(including)”将被非排他性地解释。也就是说，在上下文允许的情况下，这些词语意在传达可能包含的其他未明确叙述的元素或数字。不定冠词(“a”和“an”)在本文中用于指代该冠词的语法对象的一个或多个(即一个或至少一个)。通过示例，“元素”(“an element”)可以表示一个元素或多于一个元素。
本文描述了一种由碳水化合物材料制备糖产物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)预处理碳水化合物材料，(b)在60℃至65℃的温度下用酶组合物液化预处理的碳水化合物材料1至20小时以产生液化的碳水化合物材料，(c)在50℃至60℃的温度下用酶组合物将液化的碳水化合物材料糖化1至120小时以产生糖产物，其中在糖化期间加入氧，和(d)任选地，回收糖产物。术语“糖产物”、“一种或多种糖”或“糖”在本文可互换使用。可替代地，可以使用术语“水解的碳水化合物材料”代替这些术语。
本文描述了一种由碳水化合物材料制备糖产物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在第一反应器中预处理碳水化合物材料；(b)在第二反应器中在60℃至65℃的温度下用酶组合物液化预处理的碳水化合物材料1至20小时以产生液化的碳水化合物材料，(c)在第三反应器中在50℃至60℃的温度下用酶组合物将液化的碳水化合物材料糖化1至120小时以产生糖产物，其中在糖化期间加入氧，和(d)任选地，回收糖产物。如本文所用，“反应器”还可以表示多于一个反应器。因此，“第一反应器”也可以表示一系列的第一反应器。
本文还描述了一种由碳水化合物材料制备发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)预处理碳水化合物材料，(b)在60℃至65℃的温度下用酶组合物液化预处理的碳水化合物材料1至20小时以产生液化的碳水化合物材料，(c)在50℃至60℃的温度下用酶组合物将液化的碳水化合物材料糖化1至120小时以产生糖产物，其中在糖化期间加入氧，(d)发酵糖产物以产生发酵产物，和(e)任选地，回收发酵产物。
本文还描述了一种由碳水化合物材料制备发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在第一反应器中预处理碳水化合物材料；(b)在第二反应器中在60℃至65℃的温度下用酶组合物液化预处理的碳水化合物材料1至20小时以产生液化的碳水化合物材料，(c)在第三反应器中在50℃至60℃的温度下用酶组合物将液化的碳水化合物材料糖化1至120小时以产生糖产物，其中在糖化期间加入氧，(d)在第四反应器中发酵糖产物以产生发酵产物，和(e)任选地，回收发酵产物。
在本文所述的方法的一些实施方式中，在步骤b之后且在步骤c之前在不加入氧的情况下将液化的碳水化合物材料糖化。换句话说，本文还描述了一种由碳水化合物材料制备糖产物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)预处理碳水化合物材料，(b)在60℃至65℃的温度下用酶组合物液化预处理的碳水化合物材料1至20小时以产生液化的碳水化合物材料，(c)在不加入氧的情况下用酶组合物将液化的碳水化合物材料糖化以产生糖产物，(d)在加入氧的情况下在50℃至60℃的温度下用酶组合物将液化的碳水化合物材料糖化1至120小时以产生糖产物，和(e)任选地，回收步骤c和/或步骤d的糖产物。本文还描述了一种由碳水化合物材料制备发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)预处理碳水化合物材料，(b)在60℃至65℃的温度下用酶组合物液化预处理的碳水化合物材料1至20小时以产生液化的碳水化合物材料，(c)在不加入氧的情况下用酶组合物将液化的碳水化合物材料糖化以产生糖产物，(d)在加入氧的情况下在50℃至60℃的温度下用酶组合物将液化的碳水化合物材料糖化1至120小时以产生糖产物，(e)将步骤c和/或步骤d的糖产物发酵以产生发酵产物；和(e)任选地，回收发酵产物。
在一些实施方式中，在不加入氧的情况下在50℃至60℃的温度下将液化的碳水化合物材料糖化1至120小时。在一些实施方式中，在不加入氧的情况下在52℃至58℃的温度下将液化的碳水化合物材料糖化10至60小时。
在一些实施方式中，用酶组合物液化预处理的碳水化合物材料在61℃至65℃的温度下进行。在一些实施方式中，用酶组合物液化预处理的碳水化合物材料在62℃至65℃的温度下进行。
在一些实施方式中，用酶组合物液化预处理的碳水化合物材料进行1至20小时。
在一些实施方式中，在加入氧的情况下在50℃至60℃的温度下用酶组合物将液化的碳水化合物材料糖化1至120小时。在一些实施方式中，在加入氧的情况下在51℃至59℃的温度下用酶组合物将液化的碳水化合物材料糖化。在一些实施方式中，在加入氧的情况下在52℃至58℃的温度下用酶组合物将液化的碳水化合物材料糖化。在一些实施方式中，在加入氧的情况下在53℃至57℃的温度下用酶组合物将液化的碳水化合物材料糖化。
在一些实施方式中，液化在反应器中进行。在一些实施方式中，液化也可以在两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或甚至更多个反应器中进行。因此，术语“反应器”不限于单个反应器，而是可以表示多个反应器。
在如本文所述的方法中，将预处理的碳水化合物材料加到其中发生液化的反应器中。这可以分批、分批补料或连续方式进行。在一些实施方式中，将酶组合物加到其中发生液化的反应器中。这可以分批、分批补料或连续方式进行。酶组合物可以是水性组合物。在一些实施方式中，将液化的碳水化合物材料和/或部分液化的碳水化合物材料循环回到发生液化的反应器中。在一些实施方式中，在将液化的碳水化合物材料和/或部分液化的碳水化合物材料加到其中发生液化的反应器之前，对其进行冷却。在一些实施方式中，在将液化的碳水化合物材料和/或部分液化的碳水化合物材料加到发生液化的反应器之前，对其进行固/液分离。在一些实施方式中，在冷却步骤之前进行固/液分离。在一些实施方式中，仅将固/液分离后获得的液体级分冷却。在一些实施方式中，将液体级分和固体级分都加到其中发生液化的反应器中。
在一些实施方式中，不加入氧的糖化在反应器中进行。在一些实施方式中，糖化也可以在两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或甚至更多个反应器中进行。因此，术语“反应器”不限于单个反应器，而是可以表示多个反应器。
在一些实施方式中，加入氧的糖化在反应器中进行。在一些实施方式中，糖化也可以在两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或甚至更多个反应器中进行。因此，术语“反应器”不限于单个反应器，而是可以表示多个反应器。
在一些实施方式中，液化和糖化在不同的反应器中进行。在一些实施方式中，不加入氧的糖化和加入氧的糖化在不同的反应器中进行。
本文还描述了一种由碳水化合物材料制备糖产物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在第一反应器中预处理碳水化合物材料；(b)在第二反应器中在60℃至65℃的温度下用酶组合物液化预处理的碳水化合物材料1至20小时以产生液化的碳水化合物材料，(c)在第三反应器中在不加入氧的情况下用酶组合物将糖化的碳水化合物糖化以制备糖产物，(d)在第四反应器中在加入氧的情况下在50℃至60℃的温度下用酶组合物将液化的碳水化合物材料糖化1至120小时，以产生糖产物，和(e)任选地，回收步骤c和/或步骤d的糖产物。本文还描述了一种由碳水化合物材料制备发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在第一反应器中预处理碳水化合物材料；(b)在第二反应器中在60℃至65℃的温度下用酶组合物液化预处理的碳水化合物材料1至20小时以产生液化的碳水化合物材料，(c)在第三反应器中在不加入氧的情况下用酶组合物将糖化的碳水化合物糖化以制备糖产物，(d)第四反应器中在加入氧的情况下在50℃至60℃的温度下用酶组合物将液化的碳水化合物材料糖化1至120小时，以在产生糖产物，(e)在第五反应器中发酵步骤c和/或步骤d的糖产物以产生发酵产物，和(e)任选地，回收发酵产物。
在一些实施方式中，预处理在体积为30-200m3，优选地100-150m3的反应器中进行。在如本文所述的方法的预处理中使用多个反应器的情况下，它们可以具有相同的体积，但是也可以具有不同的体积。
在一些实施方式中，在如本文所述的方法中使用的预处理反应器的高度与直径之比为3:1至12:1。
在一些实施方式中，液化在体积为10-500m3，优选地50-350m3的反应器中进行。在液化中使用多个反应器的情况下，它们可以具有相同的体积，但是也可以具有不同的体积。
在一些实施方式中，进行液化的反应器的高度与直径之比为0.1:1至10:1。
在一些实施方式中，不加入氧的糖化在体积为10-5000m3，优选地50-5000m3的反应器中进行。如果在不加入氧的糖化中使用多个反应器，它们可以具有相同的体积，但也可以具有不同的体积。
在一些实施方式中，其中进行不加入氧的糖化的反应器的高度与直径之比为0.1:1至10:1。
在一些实施方式中，在具有10-5000m3，优选地50-5000m3的体积的反应器中进行加入氧的糖化。如果将多个反应器用于加入氧的糖化，它们可以具有相同的体积，但也可以具有不同的体积。
在一些实施方式中，其中进行加入氧的糖化的反应器的高度与直径之比为0.1:1至10:1。
在一些实施方式中，在糖化期间将氧加到预处理的碳水化合物材料中。在一些实施方式中，在糖化的至少一部分期间加入氧。在糖化期间可以连续或不连续地加入氧。在一些实施方式中，在由本文所述的由碳水化合物材料制备糖产物的方法中，将氧加入一次或多次。将氧加到用于加入氧的糖化的反应器中。
氧可以几种形式加入。例如，可以加入氧气、富氧气体(例如富氧空气)或空气作为所述氧。所述氧也可以通过原位氧产生来加入。
如何加入氧的实例包括但不限于通过喷射、鼓风、电解、氧的化学加入、从顶部填充用于糖化的反应器(将液化的水解产物倒入反应器中且然后将氧引入水解产物)和将氧加到反应器的顶部空间来加入氧。当将氧加到反应器的顶部空间时，可以提供水解反应所需的足够的氧。通常，可以控制和/或改变加到反应器中的氧的量。通过在反应器中的部分水解时间期间仅加入氧，可以限制所供应的氧。另一种选择是加入低浓度的氧，例如通过使用空气和循环空气(离开反应器的空气)的混合物或通过用惰性气体“稀释”空气。通过在更长的水解时间段期间加入氧，通过以更高的浓度加入氧或通过加入更多的空气，可以增加氧的加入量。控制氧浓度的另一种方法是加入氧消耗器和/或氧发生器。可以将氧引入反应器中存在的液化碳水化合物中。也可以将其引入反应器的顶部空间。可以将氧吹入反应器中存在的液化碳水化合物中。也可以将其吹入反应器的顶部空间。
在一些实施方式中，在将液化的碳水化合物材料加到反应器中之前和/或期间和/或之后，将氧加到用于糖化的反应器中。氧可以与进入反应器的液化碳水化合物材料一起引入。可以将氧引入将进入反应器的材料流中或与通过反应器的外部回路的部分反应器内容物一起引入。优选地，当液化的碳水化合物材料存在于反应器中时，加入氧。
在一些实施方式中，在糖化期间加入氧以将溶解的氧保持在饱和水平的11％至80％。在一些实施方式中，在糖化期间加入氧以将溶解的氧保持在饱和水平的20％至60％。
在一些实施方式中，用于液化和糖化的酶组合物是相同的。在另一些实施方式中，用于液化和糖化的酶组合物是不同的。在一些优选的实施方式中，用于不加入氧的糖化和加入氧的糖化的酶组合物是相同的。
在一些实施方式中，用于液化和/或糖化的酶组合物来自真菌，优选丝状真菌。在一些实施方式中，酶组合物中的酶衍生自真菌，优选丝状真菌。在一些实施方式中，酶组合物包含真菌酶，优选丝状真菌酶。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)细分的所有丝状形式(如Hawksworth等人在Ainsworth and Bisby's Dictionary of TheFungi，第8版，1995年，CAB International，大学出版社，英国剑桥中定义)。丝状真菌包括但不限于支顶孢属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、曲霉属、短梗霉属(Aureobasidium)、白僵菌属(Beauvaria)、头孢菌属(Cephalosporium)，拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛壳拟青霉属(Chaetomium paecilomyces)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochiobolus)、鬼伞属(Coprinus)、隐球菌属(Cryptococcus)、黑蛋巢菌属(Cyathus)、裸胞壳属(Emericella)、内座壳属(Endothia)、内座壳毛霉属(Endothiamucor)、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰刀菌属(Fusarium)、白乔史密斯霉属(Geosmithia)、粘帚霉属(Gilocladium)、腐质霉属(Humicola)、巨座壳属(Magnaporthe)、毛霉菌属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、漆斑菌属(Myrothecium)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、原毛平革菌属(Panerochaete)、侧耳属(Pleurotus)、柄孢壳菌属(Podospora)、梨孢属(Pyricularia)、罗萨氏菌(Rasamsonia)、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、柱顶孢霉属(Scylatidium)、裂褶菌属(Schizophyllum)、壳多孢属(Stagonospora)、篮状菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、嗜热丝孢菌属(Thermomyces)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属侧耳属(Trametes pleurotus)、木霉属(Trichoderma)和毛癣菌属(Trichophyton)。在一些优选的实施方式中，真菌是罗萨氏菌，其中最优选的是踝节菌属埃默森蓝状菌(Rasamsonia emersonii)。因此，如本文所述的方法有利地与衍生自罗萨氏菌属的微生物的酶一起施加或用于如本文所述的方法的酶包含罗萨氏菌酶。
在许多培养物收藏中心，公众可容易地获得几种丝状真菌菌株，例如美国典型培养物收藏(ATCC)，德意志Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)，Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH和Agricultural ResearchService Patent Culture Collection，Northern Regional Research Center(NRRL)。
优选地，如本文所述的方法用热稳定酶进行。如本文所用，“热稳定”酶是指该酶具有50℃或更高，60℃或更高，70℃或更高，75℃或更高，80℃或更高，或甚至85℃或更高的最佳温度。它们可以例如从嗜热微生物分离或可以由技术人员设计并人工合成。在一些实施方式中，编码热稳定酶的多核苷酸可以从嗜热或耐热的丝状真菌分离或获得，或从非嗜热或非耐热的真菌分离，但是发现是热稳定的。“嗜热真菌”是指在50℃或更高的温度下生长的真菌。“耐热”真菌是指在45℃或更高，具有接近50℃最大值的温度下生长的真菌。
合适的嗜热或耐热真菌细胞可以是腐质霉属、根毛霉属、毁丝霉属、罗萨氏菌、篮状菌属、嗜热丝孢菌属、热子囊菌属或梭孢壳属细胞，优选罗萨氏菌细胞。优选的嗜热或耐热真菌是灰腐质霉高温变种(Humicola grisea var.thermoidea)、棉毛状腐质霉(Humicola lanuginosa)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、嗜热团丝核菌(Papulaspora thermophilia)、丝衣霉状篮状菌(Rasamsonia byssochlamydoides)、踝节菌属埃默森蓝状菌(Rasamsonia emersonii)、嗜热赭褐白乔史密斯霉(Rasamsoniaargillacea),嗜热象牙白篮状菌(Rasamsonia eburnean),Rasamsonia brevistipitata、嗜热柱孢白乔史密斯霉(Rasamsonia cylindrospora)、微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、杆孢篮状菌(Talaromycesbacillisporus)、Talaromyces leycettanus、嗜热篮状菌(Talaromyces thermophilus)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lenuginosus)、坚脆嗜热子囊菌(Thermoascuscrustaceus)、嗜热栖热菌(Thermoascus thermophilus)、橙色嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)和太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)。
罗萨氏菌是新属，包括耐热性和嗜热性篮状菌属(Talaromyces)和白乔史密斯霉属(Geosmithia)物种。根据表型、生理和分子数据，已经将埃默森篮状菌，丝衣霉状篮状菌，象牙白篮状菌(Talaromyces eburneus)，赭褐白乔史密斯霉(Geosmithia argillacea)和柱孢白乔史密斯霉(Geosmithia cylindrospora)物种转移到罗萨氏菌属。埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)、Penicillium geosmithia emersonii和踝节菌属埃默森蓝状菌(Rasamsonia emersonii)在本文可互换使用。
在如本文所述的方法中，使用酶组合物。在一些实施方式中，组合物是稳定的。如本文所用，“稳定的酶组合物”是指酶组合物在水解反应时间30小时后保持活性，优选地水解反应时间30小时后保持其初始活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方式中，酶组合物在水解反应时间40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500小时后保持活性。
可以通过用合适的微生物例如踝节菌属埃默森蓝状菌或黑曲霉(Aspergillusniger)发酵合适的底物来制备酶，其中酶是由微生物产生的。可以改变微生物以改善或制备酶。例如，可以通过经典的菌株改良方法或通过重组DNA技术来使微生物突变。因此，本文提及的微生物可以原样用于产生酶，或可以被改变以增加产量或产生可以包括异源酶的改变的酶，例如纤维素酶，这种酶最初不能通过该微生物产生。优选地，真菌，更优选地丝状真菌用于产生酶。有利地，使用嗜热或耐热微生物。任选地，使用能够诱导产酶微生物对酶进行表达的底物。
酶用于液化碳水化合物材料和/或糖化碳水化合物材料(从包含多糖的碳水化合物材料释放糖)。主要的多糖是纤维素(葡聚糖)和半纤维素(木聚糖、杂木聚糖和木葡聚糖)。另外，一些半纤维素可以作为葡甘露聚糖(例如在木材衍生的木质纤维素材料中)存在。在不同酶共同作用下，这些多糖被酶水解为可溶性糖，包括单体和多聚体，例如葡萄糖、纤维二糖、木糖、***糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸和其他己糖和戊糖。糖产物包含可溶性糖，包括单体和多聚体。在一些实施方式中，糖产物包含葡萄糖、半乳糖和***糖。其他糖的实例是纤维二糖、木糖、***糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡糖醛酸和其他己糖和戊糖。糖产物可以原样使用或可以进一步处理，例如回收和/或纯化。
另外，果胶和其他果胶物质如***聚糖可能占通常来自非木本植物组织的细胞壁的干物质的相当大比例(干物质的约四分之一至一半可能是果胶)。此外，碳水化合物材料可以包含木质素。
下文将更详细地描述可在如本文所述的方法中使用的酶。
裂解多糖单加氧酶、内切葡聚糖酶(EG)和外切纤维二糖水解酶(CBH)催化不溶性纤维素水解为诸如纤维寡糖(纤维二糖为主要产物)的产物，而β-葡萄糖苷酶(BG)将主要为纤维二糖和纤维三糖的寡糖转化成葡萄糖。
木聚糖酶与其他辅助酶，例如α-L-***呋喃糖苷酶、阿魏酰和乙酰木聚糖酯酶、葡糖醛酸苷酶和β-木糖苷酶一起催化半纤维素的水解。
在如本文所述的方法中使用的酶组合物可以包含至少两种活性，尽管通常组合物将包含多于两种活性，例如三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或甚至更多种活性。通常，用于本文所述的方法的酶组合物包含至少两种纤维素酶。至少两种纤维素酶可以包含相同或不同的活性。用于本文所述的方法的酶组合物还可以包含除纤维素酶以外的至少一种酶。优选地，至少一种其他酶具有辅助酶活性，即直接或间接导致木质纤维素降解的附加活性。这种辅助活性的实例在本文中提及且包括但不限于半纤维素酶。
用于本文所述的方法的一种酶组合物至少包含裂解多糖单加氧酶(LPMO)、内切葡聚糖酶(EG)、纤维二糖水解酶(CBH)、木聚糖酶、β-木糖苷酶(BX)和β-葡萄糖苷酶(BG)。酶组合物每个活性种类可以包含多于一种酶活性。例如，组合物可以包含两种内切葡聚糖酶，例如具有内切-1,3(1,4)-β葡聚糖酶活性的内切葡聚糖酶和具有内切-β-1,4-葡聚糖酶活性的内切葡聚糖酶。
用于本文所述的方法中的组合物可衍生自真菌，例如丝状真菌，例如罗萨氏菌，例如踝节菌属埃默森蓝状菌。在一些实施方式中，酶中的至少一种可以衍生自踝节菌属埃默森蓝状菌。在一些实施方式中，所述裂解多糖单加氧酶和/或β-木糖苷酶衍生自踝节菌属埃默森蓝状菌。如果需要，可以用来自其他来源的其他酶补充该酶。这样的其他酶可以衍生自经典来源和/或由转基因生物产生。
另外，用于本文所述的方法的酶组合物中的酶可能能够在低pH下工作。对于本发明的目的，低pH表示5.5或更低，5或更低，4.9或更低，4.8或更低，4.7或更低，4.6或更低，4.5或更低，4.4或更低，4.3或更低，4.2或更低，4.1或更低，4.0或更低，3.9或更低，3.8或更低，3.7或更低，3.6或更低，3.5或更低的pH。
用于本文所述的方法中的酶组合物可以包含来自罗萨氏菌的纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶。它们还可以包含来自非罗萨氏菌的来源的纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶。它们可以与一种或多种罗萨氏菌酶一起使用或它们可以在不具有其他罗萨氏菌酶的情况下使用。
用于本文所述的方法的一种酶组合物包含裂解多糖单加氧酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶I(CBHI)、纤维二糖水解酶II(CBHII)、β-葡萄糖苷酶、内切木聚糖酶(EX)和β-木糖苷酶。
用于本文所述的方法的酶组合物可以包含通过本文所述组合物提供的一种类型的纤维素酶活性和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性以及通过另外的纤维素酶/半纤维素酶/果胶酶提供的第二种类型的纤维素酶活性和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性。
在一些实施方式中，用于糖化的酶组合物是丝状真菌的完整发酵液，所述发酵液包含纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶和裂解单糖加氧酶。这些酶已在本文中更多地描述。
在一些实施方式中，酶组合物包含内切葡聚糖酶。在一些实施方式中，内切葡聚糖酶包含GH5内切葡聚糖酶和/或GH7内切葡聚糖酶。在一些实施方式中，用于液化的酶组合物是丝状真菌的完整发酵液，所述发酵液包含内切葡聚糖酶。在一些实施方式中，用于液化的酶组合物中的内切葡聚糖酶的量在预处理的碳水化合物材料中为50-1000μg/g干物质。内切葡聚糖酶已在本文中更详细地描述。在一些实施方式中，用于液化的酶组合物比用于糖化的酶组合物包含更多的内切葡聚糖酶。
如本文所用，纤维素酶是能够降解或修饰纤维素的任何多肽。能够降解纤维素的多肽是能够催化将纤维素分解成较小单元，例如部分分解成纤维糊精或完全分解成葡萄糖单体的多肽。如本文所述的纤维素酶可以产生纤维糊精和葡萄糖单体的混合群体。这种降解通常将通过水解反应发生。
如本文所用，半纤维素酶是能够降解或修饰半纤维素的任何多肽。也就是说，半纤维素酶可能能够降解或修饰木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、***木聚糖、葡甘露聚糖和木葡聚糖中的一种或多种。能够降解半纤维素的多肽是能够催化将半纤维素分解成较小的多糖，例如部分分解成寡糖或完全分解成糖单体，例如己糖或戊糖单体的多肽。如本文所述的半纤维素酶可以产生寡糖和糖单体的混合群体。这种降解通常将通过水解反应发生。
如本文所用，果胶酶是能够降解或修饰果胶的任何多肽。能够降解果胶的多肽是能够催化将果胶分解成较小单元，例如部分分解成寡糖或完全分解成糖单体的多肽。如本文所述的果胶酶可以产生寡糖和糖单体的混合群体。这种降解通常将通过水解反应发生。
因此，用于本文所述的方法的酶组合物可以包含一种或多种以下酶，即裂解多糖单加氧酶(例如GH61)，纤维二糖水解酶，内切-β-1,4-葡聚糖酶，β-葡萄糖苷酶和β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶。用于本文所述的方法的组合物还可以包含一种或多种半纤维素酶，例如内切木聚糖酶，β-木糖苷酶，α-L-***生物呋喃糖苷酶，α-D-葡糖醛酸糖苷酶，乙酰基木聚糖酯酶，阿魏酸酯酶，香豆酰基酯酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，β-甘露聚糖酶和/或β-甘露糖苷酶。用于本文所述的方法的组合物还可以包含一种或多种果胶酶，例如内切聚半乳糖醛酸酶，果胶-甲基酯酶，内切半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，果胶-乙酰基酯酶，内切果胶裂解酶，果胶酸裂解酶，α-鼠李糖苷酶，外半乳糖醛酸酶，外半乳糖醛酸裂解酶，鼠李糖半乳糖醛酸水解酶，鼠李糖半乳糖醛酸裂解酶，鼠李糖半乳糖醛酸乙酰酯酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶(rhamnogalacturonan galacturonohydrolase)和/或木糖基半乳糖醛酸酶(xylogalacturonase)。另外，在用于本文所述的方法的组合物中可以存在以下一种或多种酶，淀粉酶，蛋白酶，脂肪酶，木质素酶，己糖基转移酶，葡糖醛酸糖苷酶，扩张蛋白，纤维素诱导的蛋白或纤维素整合蛋白等(这些在上文称为辅助活性)。
如本文所用，裂解多糖单加氧酶是最近由CAZy分类为AA9家族(辅助活性家族9)或AA10家族(辅助活性家族10)的酶。因此，存在AA9裂解多糖单加氧酶和AA10裂解多糖单加氧酶。裂解多糖单加氧酶能够打开结晶的葡聚糖结构并增强纤维素酶对木质纤维素底物的作用。它们是具有纤维素分解增强活性的酶。裂解多糖单加氧酶也可能影响纤维寡糖。根据最新文献(参见Isaksen等人，Journal of Biological Chemistry，第289卷，第5期，第2632-2642页)，名为GH61的蛋白质(糖苷水解酶家族61或有时称为EGIV)是裂解多糖单加氧酶。GH61最初是根据一个家族成员中非常弱的内切-1,4-β-d-葡聚糖酶活性的测量而分类为内切葡聚糖酶，但最近被CAZy重新分类为AA9家族。CBM33(家族33的碳水化合物结合模块)也是一种裂解多糖单加氧酶(参见Isaksen等，Journal of Biological Chemistry，第289卷，第5期，第2632-2642页)。CAZy最近将CBM33重新分类为AA10家族。
在一些实施方式中，裂解多糖单加氧酶包含AA9裂解多糖单加氧酶。这表示酶组合物中的至少一种裂解多糖单加氧酶是AA9裂解多糖单加氧酶。在一些实施方式中，酶组合物中的所有裂解多糖单加氧酶均为AA9裂解多糖单加氧酶。
在一些实施方式中，所述酶组合物包含裂解多糖单加氧酶，其来自热子囊菌属(Thermoascus)，例如坚脆嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)，例如在WO 2005/074656中作为SEQ ID NO:2和在WO2014/130812中和在WO 2010/065830中作为SEQ ID NO:1描述的那些；或来自梭孢壳属(Thielavia)，例如太瑞斯梭孢壳霉(Thielaviaterrestris)，例如在WO 2005/074647中作为SEQ ID NO:8或在WO 2014/130812中和在WO2008/148131和WO 2011/035027中作为SEQ ID NO:4描述的那些；或来自曲霉属(Aspergillus)，例如烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，例如在WO 2010/138754中作为SEQID NO:2或在WO2014/130812中作为SEQ ID NO:3描述的那些；或来自青霉属(Penicillium)，例如埃默森青霉菌(Penicillium emersonii)，例如在WO 2011/041397中作为SEQ ID NO:2或在WO2014/130812中作为SEQ ID NO:2公开的那些。其他合适的裂解多糖单加氧酶包括但不限于里氏木霉(参见WO 2007/089290)、嗜热毁丝霉(参见WO 2009/085935、WO 2009/085859、WO 2009/085864、WO 2009/085868)、嗜松青霉(参见WO 2011/005867)、热子囊菌属(参见WO 2011/039319)和坚脆嗜热子囊菌(Thermoascuscrustaceous)(参见WO 2011/041504)。可以包含在酶组合物中的其他纤维素分解酶描述于WO 98/13465、WO 98/015619、WO 98/015633、WO 99/06574、WO 99/10481、WO 99/025847、WO99/031255、WO 2002/101078、WO 2003/027306、WO 2003/052054、WO 2003/052055、WO2003/052056、WO 2003/052057、WO 2003/052118、WO 2004/016760、WO 2004/043980、WO2004/048592、WO 2005/001065、WO 2005/028636、WO 2005/093050、WO 2005/093073、WO2006/074005、WO 2006/117432、WO 2007/071818、WO 2007/071820、WO 2008/008070、WO2008/008793、US 5,457,046、US 5,648,263和US 5,686,593，这里仅举几例。在一些优选的实施方式中，裂解多糖单加氧酶来自罗萨氏菌，例如踝节菌属埃默森蓝状菌(参见WO 2012/000892)。
如本文所用，内切葡聚糖酶是能够催化纤维素、地衣素或谷物β-D-葡聚糖中的1,4-β-D-葡糖苷键的内水解的酶。它们属于EC3.2.1.4并且还能够水解也包含1,3-连接的β-D-葡聚糖中的1,4-连接。内切葡聚糖酶也可称为纤维素酶、阿维拉酶(avicelase)、β-1,4-内切葡聚糖水解酶、β-1,4-葡聚糖酶、羧甲基纤维素酶、纤维素糊精酶、内切-1,4-β-D-葡聚糖酶、内切-1,4-β-D-葡聚糖水解酶或内切-1,4-β-葡聚糖酶。
在一些实施方式中，内切葡聚糖酶包含GH5内切葡聚糖酶和/或GH7内切葡聚糖酶。这表示酶组合物中的至少一种内切葡聚糖酶是GH5内切葡聚糖酶或GH7内切葡聚糖酶。如果酶组合物中存在更多的内切葡聚糖酶，这些内切葡聚糖酶可以是GH5内切葡聚糖酶、GH7内切葡聚糖酶或GH5内切葡聚糖酶和GH7内切葡聚糖酶的组合。在一些优选的实施方式中，内切葡聚糖酶包含GH5内切葡聚糖酶。
在一些实施方式中，酶组合物包含内切葡聚糖酶，其来自木霉属，例如里氏木霉；来自腐质霉属，例如特异腐质霉菌株；来自曲霉属，例如棘孢曲霉或白曲霉；来自欧文氏菌属，例如软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)；来自镰刀菌属，例如尖孢镰刀菌；来自梭孢壳属，例如太瑞斯梭孢壳霉；来自腐质霉属，例如灰腐质霉高温变种或特异腐质霉；来自白丝菌属(Melanocarpus)，例如热白丝菌(Melanocarpus albomyces)；来自脉孢菌属，例如粗糙脉孢菌；来自毁丝霉属，例如嗜热毁丝霉；来自枝鼻菌属(Cladorrhinum)，例如多生枝鼻菌(Cladorrhinum foecundissimum)；和/或来自金孢子菌属，例如鲁克文金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)菌株。在一些优选的实施方式中，内切葡聚糖酶来自罗萨氏菌，例如踝节菌属埃默森蓝状菌菌株(参见WO 01/70998)。在一些实施方式中，甚至可以使用细菌内切葡聚糖酶，包括但不限于嗜酸解纤维内切葡聚糖酶(参见WO 91/05039；WO 93/15186；US 5,275,944；WO 96/02551；US 5,536,655,WO 00/70031,WO 05/093050)；嗜热裂孢菌内切葡聚糖酶III(参见WO 05/093050)；和嗜热裂孢菌内切葡聚糖酶V(参见WO 05/093050)。
如本文所用，β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)是能够催化1,4-β-D-木聚糖水解以从非还原性末端去除连续的D-木糖残基的多肽。β-木糖苷酶也可水解木糖。β-木糖苷酶也可以称为木聚糖1,4-β-木糖苷酶、1,4-β-D-木聚糖木糖水解酶、外切-1,4-β-木糖苷酶或木糖苷酶。
在一些实施方式中，β-木糖苷酶包括GH3β-木糖苷酶。这表示酶组合物中的至少一种β-木糖苷酶是GH3β-木糖苷酶。在一些实施方式中，酶组合物中的所有β-木糖苷酶均为GH3β-木糖苷酶。
在一些实施方式中，所述酶组合物包含来自粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)或里氏木霉(Trichoderma reesei)的β-木糖苷酶。在一些优选的实施方式中，酶组合物包含来自罗萨氏菌，例如踝节菌属埃默森蓝状菌(参见WO2014/118360)的β-木糖苷酶。
如本文所用，内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是能够催化木聚糖中的1,4-β-D-木糖苷键的内水解的任何多肽。该酶也可称为内切-1,4-β-木聚糖酶或1,4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶。可作为代替的备选物是EC 3.2.1.136，一种葡萄糖醛酸***糖基木聚糖内切木聚糖酶，一种能够水解葡萄糖醛酸***糖基木聚糖中的1,4木糖苷键的酶。
在一些实施方式中，内切木聚糖酶包含GH10木聚糖酶。这表示酶组合物中的内切木聚糖酶中的至少一种是GH10木聚糖酶。在一些实施方式中，酶组合物中的所有内切木聚糖酶是GH10木聚糖酶。
在一些实施方式中，所述酶组合物包含棘孢曲霉(参见WO 94/21785)、烟曲霉(参见WO 2006/078256)、嗜松青霉(参见WO 2011/041405)、青霉菌属(参见WO 2010/126772)、太瑞斯梭孢壳霉NRRL 8126(参见WO 2009/079210)、Talaromyces leycettanus、嗜热裂孢菌或囊状长毛盘菌(Trichophaea saccata)GH10(参见WO 2011/057083)的内切木聚糖酶。在一些优选的实施方式中，酶组合物包含来自罗萨氏菌，例如踝节菌属埃默森蓝状菌的内切木聚糖酶(参见WO 02/24926)。
如本文所用，β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)是能够催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基水解并释放β-D-葡萄糖的任何多肽。这样的多肽对β-D-葡糖苷可以具有宽的特异性并且还可以水解以下的一种或多种：β-D-半乳糖苷、α-L-***糖苷、β-D-木糖苷或β-D-岩藻糖苷。该酶也可以称为杏仁酸酶、β-D-葡萄糖苷葡糖水解酶、纤维二糖酶或基因二糖酶。
在一些实施方式中，酶组合物包含β-葡萄糖苷酶，其来自曲霉属，例如米曲霉，如在WO 02/095014中公开的那些或具有WO 2008/057637中公开的具有β-葡萄糖苷酶活性的融合蛋白，或烟曲霉，例如在WO 2005/047499中作为SEQ ID NO:2或在WO 2014/130812中作为SEQ ID NO:5公开的那些，或烟曲霉β-葡萄糖苷酶变体，例如在WO 2012/044915中公开的那些，以及具有以下取代基的那些：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用WO 2014/130812中的SEQ ID NO:5进行编号)或棘孢曲霉，黑曲霉或Aspergillus kawachi。在另一些实施方式中，β-葡萄糖苷酶衍生自青霉属，例如在WO 2007/019442中作为SEQ ID NO:2公开的巴西青霉，或衍生自木霉属，例如里氏木霉，例如US 6,022,725、US 6,982,159、US 7,045,332、US7,005,289、US 2006/0258554US 2004/0102619中描述的那些。在一些实施方式中，甚至可以使用细菌β-葡萄糖苷酶。在另一些实施方式中，β-葡萄糖苷酶衍生自太瑞斯梭孢壳霉(WO2011/035029)或Trichophaea saccata(WO 2007/019442)。在一些优选的实施方式中，酶组合物包含来自罗萨氏菌，例如踝节菌属埃默森蓝状菌的β-葡萄糖苷酶(参见WO 2012/000886)。
如本文所用，纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)是能够催化纤维素或纤维四糖中的1,4-β-D-糖苷键水解，从链的末端释放纤维二糖的任何多肽。该酶也可以称为纤维素酶1,4-β-纤维二糖苷酶，1,4-β-纤维二糖水解酶，1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶，阿维拉酶(avicelase)，外切-1,4-β-D-葡聚糖酶，外切纤维二糖水解酶或外切葡聚糖酶。
在一些实施方式中，所述酶组合物包含纤维二糖水解酶I，其来自曲霉，例如烟曲霉，例如在WO 2011/057140中以SEQ ID NO:6或在WO 2014/130812中以SEQ ID NO:6公开的Cel7A CBH I；来自木霉，例如里氏木霉；来自毛壳菌，例如嗜热毛壳菌；来自篮状菌属，例如Talaromyces leycettanus或来自青霉菌属，例如埃默森青霉菌。在一些优选的实施方式中，酶组合物包含来自罗萨氏菌，例如踝节菌属埃默森蓝状菌的纤维二糖水解酶I(参见WO2010/122141)。
在一些实施方式中，酶组合物包含纤维二糖水解酶II，其来自曲霉，例如烟曲霉，例如在WO 2014/130812中作为SEQ ID NO:7的那些或来自木霉，例如里氏木霉，或来自篮状菌属，例如Talaromyces leycettanus，或来自梭孢壳属，例如太瑞斯梭孢壳霉，例如来自太瑞斯梭孢壳霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。在一些优选的实施方式中，酶组合物包含来自罗萨氏菌，例如踝节菌属埃默森蓝状菌的纤维二糖水解酶II(参见WO 2011/098580)。
在一些实施方式中，酶组合物还包含一种或多种下述酶。
如本文所用，β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)是能够催化包含1,3-和1,4-键的β-D-葡聚糖中的1,4-β-D-葡糖苷键水解的任何多肽。这样的多肽可以作用于地衣素(苔藓素)和谷物β-D-葡聚糖，但不作用于仅包含1,3-或1,4-键的β-D-葡聚糖。该酶也可以称为地衣苷酶、1,3-1,4-β-D-葡聚糖4-葡糖基水解酶、β-葡聚糖酶、内切β-1,3-1,4葡聚糖酶、地衣酶或混合键β-葡聚糖酶。这种类型的酶的替代备选物是EC 3.2.1.6，它被描述为内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶。当其还原基团参与要水解的键合的葡萄糖残基本身在C-3处被取代时，这种类型的酶水解β-D-葡聚糖中的1,3-或1,4-键。其它名称包括内切-1,3-β-葡聚糖酶，昆布多糖酶，1,3-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖3(4)葡聚糖水解酶。底物包括层粘连蛋白，地衣素和谷物β-D-葡聚糖。
如本文所用，α-L-***呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)是能够作用于α-L-***呋喃糖苷，含有(1,2)和/或(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-***聚糖的任何多肽，***木聚糖和***半乳聚糖。该酶也可以称为α-N-***呋喃糖苷酶、***呋喃糖苷酶或***糖苷酶。酶组合物中可以包含的***呋喃糖苷酶的实例包括但不限于来自黑曲霉，特异腐质霉DSM 1800(参见WO 2006/114094和WO 2009/073383)和M.giganteus(参见WO2006/114094)的***呋喃糖苷酶。
如本文所用，α-D-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.139)是能够催化以下形式的反应的任何多肽：α-D-葡糖醛酸苷+H(2)O＝醇+D-葡糖醛酸酸酯。该酶也可以称为α-葡糖醛酸糖苷酶或α-葡糖苷二糖苷酸酶。这些酶还可以水解4-O-甲基化的葡糖酸，其也可以作为取代基存在于木聚糖中。备选物是EC 3.2.1.131：木聚糖α-1,2-葡糖醛酸糖苷酶，其催化α-1,2-(4-O-甲基)葡糖醛酸糖基键的水解。酶组合物中可以包含的α-葡糖醛酸糖苷酶的实例包括但不限于来自棒曲霉、烟曲霉、黑曲霉、土曲霉、特异腐质霉(参见WO 2010/014706)、黄灰青霉(参见WO 2009/068565)和里氏木霉的α-葡糖醛酸糖苷酶。
如本文所用，乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)是能够催化木聚糖和木糖寡糖脱乙酰化的任何多肽。这样的多肽可以催化来自聚合的木聚糖、乙酰化的木糖、乙酰化的葡萄糖、乙酸α-萘酯或乙酸对硝基苯酯的乙酰基水解，但通常不催化来自三乙酰基甘油水解。这样的多肽通常不作用于乙酰化甘露聚糖或果胶。可以包含在酶组合物中的乙酰木聚糖酯酶的实例包括但不限于乙酰木聚糖酯酶，其来自棘孢曲霉(参见WO 2010/108918)、球毛壳菌、西丽毛壳菌、特异腐质霉DSM 1800(参见WO 2009/073709)、红褐肉座菌(参见WO 2005/001036)、嗜热毁丝霉(Myceliophtera thermophila)(参见WO 2010/014880)、粗糙脉孢菌、颖枯壳针孢和太瑞斯梭孢壳霉NRRL 8126(参见WO 2009/042846)。在一些优选的实施方式中，酶组合物包含来自罗萨氏菌，例如踝节菌属埃默森蓝状菌的乙酰木聚糖酯酶(参见WO2010/000888)。
如本文所用，阿魏酰基酯酶(EC 3.1.1.73)是能够催化以下形式的反应的任何多肽：阿魏糖+H2O＝阿魏酸酯+糖。糖可以例如是寡糖或多糖。它通常可以催化来自酯化糖的4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基(阿魏酰基)基团水解，该糖通常在“天然”底物中是***糖。对硝基苯酚乙酸酯和阿魏酸甲酯通常是较差的底物。该酶也可以称为肉桂酰基酯水解酶、阿魏酸酯酶或羟基肉桂酰基酯酶。它也可以称为半纤维素酶辅助酶，因为它可以帮助木聚糖酶和果胶酶分解植物细胞壁半纤维素和果胶。可以包含在酶组合物中的阿魏酰基酯酶(阿魏酸酯酶)的实例包括但不限于阿魏酰基酯酶，其来自特异腐质霉DSM 1800(参见WO 2009/076122)、费氏新萨托菌(Neosartorya fischeri)、粗糙脉孢菌、黄灰青霉(参见WO 2009/127729)、和太瑞斯梭孢壳霉(参见WO 2010/053838和WO 2010/065448)。
如本文所用，香豆酰基酯酶(EC 3.1.1.73)是能够催化以下形式的反应的任何多肽：香豆酰基糖+H(2)O＝香豆酸酯+糖。糖可以例如是寡糖或多糖。该酶也可以称为反-4-香豆酰基酯酶、反-对香豆酰基酯酶、对香豆酰基酯酶或对香豆酸酯酶。该酶也落入EC3.1.1.73内，因此也可以称为阿魏酸酯酶。
如本文所用，α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)是能够催化α-D-半乳糖苷中的末端非还原性α-D-半乳糖残基水解的任何多肽，所述α-D-半乳糖苷包括半乳糖寡糖，半乳甘露聚糖，半乳聚糖和***半乳聚糖。这样的多肽也可能能够水解α-D-岩藻糖苷。该酶也可以称为蜜二糖酶。
如本文所用，β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)是能够催化β-D-半乳糖苷中的末端非还原性β-D-半乳糖残基水解的任何多肽。这样的多肽也可能能够水解α-L-***糖苷。该酶也可以称为外切-(1->4)-β-D-半乳糖苷酶或乳糖酶。
如本文所用，β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)是能够催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖中的1,4-β-D-甘露糖苷键的随机水解的任何多肽。该酶也可以称为甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶或内切-1,4-甘露聚糖酶。
如本文所用，β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)是能够催化β-D-甘露糖苷中的末端非还原性β-D-甘露糖残基水解的任何多肽。该酶也可以称为甘露聚糖酶或甘露聚糖酶。
如本文所用，内切聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)是能够催化果胶酸酯和其他半乳糖醛酸聚糖中的1,4-α-D-半乳糖苷尿酸键的随机水解的任何多肽。这种酶也可以称为聚半乳糖醛酸酶果胶解聚酶、果胶酶、内切聚半乳糖醛酸酶、果胶酶、果胶水解酶、果胶聚半乳糖醛酸酶、聚-α-1,4-半乳糖醛酸糖苷水解酶、内切半乳糖醛酸酶；内切-D-半乳糖醛酸酶或聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸)糖基水解酶。
如本文所用，果胶甲基酯酶(EC 3.1.1.11)是能够催化反应的任何酶：果胶+n H2O＝n甲醇+果胶酸酯。该酶也可以称为果胶酯酶、果胶脱甲氧基酶、果胶甲氧基酶、果胶甲基酯酶、果胶酶、果胶基酯酶或果胶果胶水解酶。
如本文所用，内切半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)是能够催化***半乳聚糖中的1,4-β-D-半乳糖苷键的内水解的任何酶。该酶也可以称为***半乳糖内切-1,4-β-半乳糖苷酶，内切-1,4-β-半乳糖苷酶，半乳糖酶，***半乳聚糖酶或***半乳聚糖4-β-D-半乳糖苷水解酶。
如本文所用，果胶乙酰基酯酶在本文中定义为具有乙酰基酯酶活性的任何酶，该酶催化在果胶的GalUA残基的羟基处的乙酰基的脱乙酰基。
如本文所用，内切果胶裂解酶(EC 4.2.2.10)是能够催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸甲酯的消除裂解以产生在其非还原端具有4-脱氧-6-O-甲基-α-D-galact-4-enuronosyl基团的寡糖的任何酶。该酶也可以称为果胶裂解酶、果胶反式消除酶；内切果胶裂解酶、聚甲基半乳糖醛酸反式消除酶、果胶甲基反式消除酶、果胶酶、PL、PNL或PMGL或(1→4)-6-O-甲基-α-D-半乳糖醛酸裂解酶。
如本文所用，果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)是能够催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸酶的消除裂解以在其非还原端产生具有-α-D-galact-4-enuronosyl基团的寡糖的任何酶。该酶也可以是已知的聚半乳糖醛酸反式消除酶、果胶酸反式消除酶、聚半乳糖醛酸裂解酶、内切果胶甲基反式消除酶、果胶酸酯反式消除酶、内切半乳糖醛酸反式消除酶、果胶酸裂解酶、果胶裂解酶、α-1,4-D-内切聚半乳糖醛酸裂解酶、PGA裂解酶、PPase-N、内切-α-1,4-聚半乳糖醛酸裂解酶、聚半乳糖醛酸裂解酶、果胶反式消除酶、聚半乳糖醛酸反式消除酶或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸裂解酶。
如本文所用，α鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)是能够催化在α-L-鼠李糖苷或可替代地在鼠李半乳糖醛酸聚糖中末端非还原性α-L-鼠李糖残基水解的任何多肽。该酶也可以称为α-L-鼠李糖苷酶T、α-L-鼠李糖苷酶N或α-L-鼠李糖苷鼠李糖苷水解酶。
如本文所用，外切半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.82)是能够从非还原端水解果胶酸，释放二半乳糖醛酸酯的任何多肽。该酶也可以称为外切聚-α-半乳糖苷酶、外切聚半乳糖苷酶(exopolygalacturonosidase)或外切聚半乳糖苷酶(exopolygalacturanosidase)。
如本文所用，外切半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67)是能够催化(1,4-α-D-半乳糖醛酸)n+H2O＝(1,4-α-D-半乳糖醛酸)n-1+D-半乳糖醛酸酯的任何多肽。该酶也可以称为半乳糖醛1,4-α-半乳糖醛酸酶、外切聚半乳糖醛酸酶、聚(半乳糖醛酸)水解酶、外切-D-半乳糖醛酸酶、外切-D-半乳糖醛酸酶、外切聚-D-半乳糖醛酸酶或聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸)半乳糖醛酸水解酶。
如本文所用，外切聚半乳糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.9)是能够催化从果胶即去酯化的果胶的还原端的4-(4-脱氧-α-D-galact-4-enuronosyl)-D-半乳糖醛酸酯的消除裂解的任何多肽。这种酶可以称为果胶二糖裂解酶、果胶外切酶、外切果胶酸反式消除酶、外切果胶裂解酶、外切聚半乳糖醛酸-反式消除酶、PATE、外切-PATE、外切-PGL或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖还原末端二糖裂解酶。
如本文所用，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶是能够在严格交替的鼠李半乳糖醛酸聚糖结构中以内切方式水解半乳糖醛糖醛酸和鼠李糖吡喃糖基之间的连接的任何多肽，其由二糖[1,2-α-L-鼠李糖酰-(1,4)-α-半乳糖醛糖醛酸]组成。
如本文所用，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶是任何多肽，其是能够通过β-消除在鼠李半乳糖醛酸聚糖中以内切方式裂解α-L-Rhap-(1→4)-α-D-GalpA连接的任何多肽。
如本文所用，鼠李糖半乳糖醛酸乙酰酯酶是催化鼠李半乳糖醛酸聚糖中鼠李糖和半乳糖醛酸残基交替的骨架的去乙酰化的任何多肽。
如本文所用，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶是能够在外切方式从严格交替的鼠李半乳糖醛酸聚糖结构的非还原端水解半乳糖醛酸的任何多肽。
如本文所用，木糖半乳糖醛酸酶是通过以内切方式裂解β-木糖取代的半乳糖醛酸主链作用于木糖半乳糖醛酸的任何多肽。该酶也可以称为木糖半乳糖醛酸水解酶。
如本文所用，α-L-***呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)是能够作用于α-L-***呋喃糖苷、含有(1,2)和/或(1,3)-和/或(1,5)-连接的α-L-***聚糖、***木聚糖和***半乳聚糖的任何多肽。该酶也可以称为α-N-***呋喃糖苷酶、***呋喃糖苷酶或***糖苷酶。
如本文所用，内切***聚糖酶(EC 3.2.1.99)是能够催化1,5-***聚糖中的1,5-α-***呋喃糖苷键的内水解的任何多肽。该酶也可以称为***内切酶，***聚糖内切-1,5-α-L-***糖苷酶，内切-1,5-α-L-***聚糖酶，内切-α-1,5-***糖苷酶；内切***糖苷酶或1,5-α-L-***糖1,5-α-L-***糖基水解酶。
“蛋白酶”包括水解肽键的酶(肽酶)，以及水解肽和其他部分例如糖之间的键的酶(糖肽酶)。许多蛋白酶根据EC 3.4表征且适用于本文所述的方法。蛋白酶的一些特定类型包括半胱氨酸蛋白酶(包括胃蛋白酶、木瓜蛋白酶)和丝氨酸蛋白酶(包括胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和金属内肽酶)。
“脂酶”包括水解脂质、脂肪酸和酰基甘油酯的酶，包括磷酸甘油酯、脂蛋白、二酰基甘油等。在植物中，脂质被用作限制水分流失和病原体感染的结构组分。这些脂质包括衍生自脂肪酸的蜡，以及角质和木栓质。
“木质素酶”包括可以水解或分解木质素聚合物结构的酶。可以分解木质素的酶包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶和阿魏酸酯酶，以及本领域已知的可解聚或另外分解木质素聚合物的所述的其他酶。还包括能够水解半纤维素糖(特别是***糖)和木质素之间形成的键的酶。木质素酶包括但不限于以下酶的集合：木质素过氧化物酶(EC1.11.1.14)、锰过氧化物酶(EC 1.11.1.13)、漆酶(EC 1.10.3.2)和阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)。
“己糖基转移酶”(2.4.1-)包括能够催化例如纤维素和/或纤维素降解产物的转移酶反应，但是也能够催化水解反应的酶。可以使用的己糖基转移酶的实例是β-葡聚糖转移酶。这样的酶可能能够催化(1,3)(1,4)葡聚糖和/或纤维素和/或纤维素降解产物的降解。
“葡糖醛酸糖苷酶”包括催化葡糖醛酸糖苷例如β-葡糖醛酸糖苷水解以产生醇的酶。许多葡糖醛酸糖苷酶已经被表征并且可能适合使用，例如β-葡糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.31)、透明质酸-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.36)、葡糖醛酸糖基-二磺氨基葡萄糖胺葡糖醛酸糖苷酶(3.2.1.5.56)、甘草酸β-葡糖醛酸糖苷酶(3.2.1.128)或α-D-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.139)。
扩张蛋白牵涉植物细胞生长期间细胞壁结构的松弛。已经提出扩张蛋白来破坏纤维素和不具有水解活性的其他细胞壁多糖之间的氢键合。以这种方式，它们被认为允许纤维素纤维的滑动和细胞壁的扩大。膨胀素(swollenin)，一种扩张蛋白样蛋白，包含N端碳水化合物结合模块家族1结构域(CBD)和C端扩张蛋白样结构域。如本文所述，扩张蛋白样蛋白或膨胀素样蛋白可以包含这些结构域中的一个或两个和/或可破坏细胞壁的结构(例如破坏纤维素结构)，任选地不产生可检测量的还原糖。
纤维素诱导的蛋白质，例如cip1或cip2基因或类似基因的多肽产物(参见Foreman等人,J.Biol.Chem.278(34),31988-31997,2003)，是一种纤维素/纤维素小体整合蛋白，例如cipA或cipC基因的多肽产物，或支架蛋白或支架蛋白样蛋白。支架蛋白和纤维素整合蛋白是多功能整合亚基，其可以将纤维素分解亚基组织成多酶复合物。这通过两个互补的结构域类别的相互作用完成，即支架蛋白上的内聚结构域和每个酶单位上的锚定素(dockerin)蛋白结构域。支架蛋白亚基还带有纤维素结合模块(CBM)，该模块可介导纤维素小体与其底物的附着。支架蛋白或纤维素整合蛋白可以包含一个或两个这样的结构域。
过氧化氢酶；术语“过氧化氢酶”(“catalase”)是指催化两种过氧化氢向氧和两种水的转化的过氧化氢:过氧化氢氧化还原酶(EC 1.11.1.6或EC 1.11.1.21)。过氧化氢酶活性可以通过基于以下反应在240nm处监测过氧化氢的分解来确定：2H2O2→2H2O+O2。该反应在25℃下在pH 7.0的50mM磷酸盐中用10.3mM底物(H2O2)和每毫升约100单位的酶进行。在16-24秒内用分光光度法监测吸光度，这应当相当于吸光度从0.45降低到0.4。一个过氧化氢酶活性单位可以表示为在pH 7.0和25℃下每分钟降解的一微摩尔H2O2。
如本文所用，术语“淀粉酶”是指水解淀粉中，即直链淀粉和支链淀粉二者中的α-1,4-葡糖苷键的酶，例如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、葡聚糖1,4-α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.3)、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶(EC 3.2.1.60)、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖苷酶(EC 3.2.1.98)、葡聚糖1,4-α-麦芽三糖水解酶(EC 3.2.1.116)和葡聚糖1,4-α-麦芽三糖水解酶(EC 3.2.1.133)以及水解作为支链淀粉中的分支点的α-1,6-糖苷键的酶，如支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)和极限右旋糖苷酶(EC 3.2.1.142)。
用于本文所述的方法的组合物可以由来自以下的酶构成：(1)商业供应商；(2)表达酶的克隆基因；(3)发酵液(例如由微生物菌株在培养基中生长产生的发酵液，其中菌株将蛋白质和酶分泌到培养基中；(4)如(3)中生长的菌株的细胞裂解物；和/或(5)表达酶的植物材料。本发明的组合物中的不同酶可以从不同来源获得。
酶可以在微生物、酵母、真菌、细菌或植物中外源产生，然后分离并加到例如木质纤维素材料中。可替代地，可以在使用(预处理的)木质纤维素材料(例如玉米秸秆或小麦秸秆)的发酵中产生酶以向产生酶的生物体提供营养。以这种方式，产生酶的植物本身可以用作木质纤维素材料，并被加到木质纤维素材料中。
在本文所述的用途和方法中，上述组合物的组分可以同时(即，本身作为单一组合物)或分开或顺序提供。
在一些实施方式中，酶组合物是真菌的完整发酵液，优选是丝状真菌的完整发酵液，更优选是罗萨氏菌的完整发酵液。完整发酵液可以由非重组和/或重组丝状真菌的发酵制备。在一些实施方式中，丝状真菌是重组丝状真菌，其包含可以与丝状真菌同源或异源的一个或多个基因。在一些实施方式中，丝状真菌是重组丝状真菌，其包含可以与丝状真菌同源或异源的一个或多个基因，其中所述一个或多个基因编码可以降解纤维素底物的酶。完整发酵液可以包含前文描述的任何多肽或其任何组合。
优选地，酶组合物是其中细胞被杀死的完整发酵液。完整发酵液可以包含有机酸(用于杀死细胞)、杀死的细胞和/或细胞碎片以及培养基。
通常，丝状真菌在适合于产生能够水解纤维素底物的酶的细胞培养基中培养。使用本领域已知的方法，在包含碳源和氮源以及无机盐的合适的营养培养基中进行培养。适用于生长和纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶产生的合适的培养基、温度范围和其他条件是本领域已知的。完整发酵液可通过使丝状真菌生长至固定相并在碳受限条件下保持丝状真菌一段足以表达一种或多种纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶的时间来制备。一旦酶例如纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶被丝状真菌分泌到发酵培养基中，可以使用完整发酵液。本发明的完整发酵液可以包含丝状真菌。在一些实施方式中，完整发酵液包含发酵结束时衍生的发酵材料的未分级的内容物。通常，完整发酵液包含在丝状真菌生长至饱和，在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成(特别是纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶的表达)后存在的用过的培养基和细胞碎片。在一些实施方式中，完整发酵液包含用过的细胞培养基、细胞外酶和丝状真菌。在一些实施方式中，可以使用本领域已知的方法裂解、渗透或杀死存在于完整发酵液中的丝状真菌，以产生细胞被杀死的完整发酵液。在一些实施方式中，完整发酵液是细胞被杀死的完整发酵液，其中含有丝状真菌细胞的完整发酵液被裂解或杀死。在一些实施方式中，通过化学和/或pH处理裂解丝状真菌来杀死细胞以产生丝状真菌发酵的细胞被杀死的完整发酵液。在一些实施方式中，通过化学和/或pH处理裂解丝状真菌来杀死细胞，并将细胞被杀死的发酵混合物的pH调节至合适的pH。在一些实施方式中，完整发酵液包含含有至少一种1-5个碳有机酸和/或其盐的第一有机酸组分和含有至少6个或更多个碳有机酸和/或其盐的第二有机酸组分。在一些实施方式中，第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐或其任意组合，且第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷甲酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐或其任何组合。
如本文所用，术语“完整发酵液”是指通过细胞发酵产生的制剂，其不经历回收和/或纯化或仅经历最小程度的回收和/或纯化。例如，当微生物培养物生长至饱和，在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成(例如，通过宿主细胞表达酶)并分泌到细胞培养基中时，产生完整的发酵液。通常，完整发酵液是未分级的并且包含用过的细胞培养基、细胞外酶和微生物，优选为无活力的细胞。
如果需要，可以将完整发酵液分级并且可以使用一种或多种分级的内容物。例如，可以从完整发酵液中除去被杀死的细胞和/或细胞碎片以提供不含这些组分的组合物。
完整发酵液可以进一步包含防腐剂和/或抗微生物剂。这样的防腐剂和/或试剂是本领域已知的。
如本文所述的完整发酵液通常是液体，但是可以包含不溶性组分，例如杀死的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或不溶性酶。在一些实施方式中，可以除去不溶性组分以提供澄清的完整发酵液。
在一些实施方式中，完整发酵液可以补充有一种或多种不被被丝状真菌内源性表达或仅被丝状真菌以相对较低的水平表达的酶活性，以改善纤维素底物的降解，例如降解成可发酵的糖如葡萄糖或木糖。可以将一种或多种补充酶作为补充物加到完整发酵液中并且这些酶可以是另外的完整发酵液的组分，或可以被纯化，或被最低程度地回收和/或纯化。
在一些实施方式中，完整发酵液包含过表达一种或多种酶以改善纤维素底物降解的重组丝状真菌的发酵的完整发酵液。可替代地，完整发酵液可以包含非重组丝状真菌的完整发酵液和过表达一种或多种酶以改善纤维素底物降解的重组丝状真菌的发酵的完整发酵液的混合物。在一些实施方式中，完整发酵液包含过表达β-葡萄糖苷酶或内切葡聚糖酶的丝状真菌的发酵的完整发酵液。可替代地，用于本发明方法的完整发酵液和反应性组合物可以包含非重组丝状真菌的发酵的完整发酵液和过表达β-葡萄糖苷酶或内切葡聚糖酶的重组丝状真菌的发酵的完整发酵液的混合物。
如本文所用的碳水化合物材料包括含有任何淀粉和/或蔗糖和/或纤维素的材料。优选地，如本文所用的碳水化合物材料包括木质纤维素和/或半纤维素材料。最优选地，如本文所用的碳水化合物材料是木质纤维素材料。适用于本文所述的方法的碳水化合物材料包括生物质，例如原始生物质和/或非原始生物质例如农业生物质、商业有机物、建筑和拆除碎片、市政固体废物、废纸和庭院废物。生物质的常见形式包括树木、灌木和草、小麦、黑麦、燕麦、小麦秸秆、甘蔗、甘蔗秸秆、甘蔗渣、柳枝稷、芒属植物、能源甘蔗、木薯、糖蜜、大麦、玉米、玉米秸秆、玉米纤维、玉米皮、玉米芯、油菜籽茎、大豆茎、甜高粱、玉米粒(包括来自谷粒中的纤维)、蒸馏酒糟(DDGS)、来自谷物例如玉米、小麦和大麦碾磨(包括湿磨和干磨)后的产物和副产物(通常称为“麸皮或纤维”)，以及市政固体废物、废纸和庭院废物。生物质还可以是但不限于草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸以及纸浆和造纸厂残余物。“农业生物质”包括树枝、灌木、甘蔗、玉米和玉米皮、能源作物、森林、水果、花卉、谷物、草、草类作物、树叶、树皮、针、原木、根、树苗、短周期木本作物、矮树、改种草、树、蔬菜、果皮、藤、甜菜、甜菜浆、小麦苗、燕麦壳以及软硬木材(不包括具有有害材料的木材)。另外，农业生物质包括从包括农业和林业活动的农业过程中产生的有机废物，特别是包括林业木材废物。农业生物质可以是单独的任何前述形式，或是其任何组合或混合物。
在一些实施方式中，碳水化合物材料在液化之前被预处理。预处理方法是本领域已知的并且包括但不限于加热，机械处理，化学修饰，生物修饰及其任何组合。通常进行预处理以增强对碳水化合物材料的可及性，以便增强对在碳水化合物材料中半纤维素和/或溶解半纤维素和/或纤维素和/或木质素的酶水解和/或水解。在一些实施方式中，预处理包括用蒸汽***、热水处理或用稀酸或稀碱处理来处理碳水化合物材料。预处理方法的实例包括但不限于蒸汽处理(例如，在100-260℃下，在7-45bar的压力下，在中性pH下处理1-10分钟)，稀酸处理(例如用0.1–5％H2SO4和/或SO2和/或HNO3和/或HCl，在存在或不存在蒸汽的情况下，在120-200℃下，在2-15bar的压力下，在酸性pH下处理2-30分钟)，有机溶剂处理(例如用1–1.5％H2SO4，在有机溶剂和蒸汽存在下，在160-200℃下，在7-30bar的压力下，在酸性pH下处理30-60分钟)，石灰处理(例如用0.1-2％NaOH/Ca(OH)2在水/蒸汽的存在下在60-160℃下，在1-10bar的压力下，在碱性pH下处理60-4800分钟)，ARP处理(例如用5-15％NH3，在150-180℃下，在9-17bar的压力下，在碱性pH下处理10-90分钟)，AFEX处理(例如用>15％NH3，在60-140℃下，在8-20bar的压力下，在碱性pH下处理5-30分钟)。在一些实施方式中，预处理在不存在氧的情况下进行。
碳水化合物材料可以被洗涤。在一些实施方式中，可以在预处理之后洗涤碳水化合物材料。洗涤步骤可用于去除可充当发酵和/或水解步骤的抑制剂的水溶性化合物。洗涤步骤可以以技术人员已知的方式进行。除了洗涤，还存在其他解毒方法。碳水化合物材料也可以通过这些方法中的任何一种(或任何组合)进行解毒，这些方法包括但不限于固/液分离，真空蒸发，萃取，吸附，中和，超施石灰(overliming)，加入还原剂，加入解毒酶如漆酶或过氧化物酶，加入能够解毒水解产物的微生物。
如本文所述的方法中使用的酶组合物可以极其有效地水解碳水化合物材料，例如玉米秸秆、小麦秸秆、甘蔗秸秆和/或甘蔗渣，然后可以将其进一步转化成产物，例如乙醇、沼气、丁醇、塑料、有机酸、溶剂、动物饲料补充剂、药物、维生素、氨基酸、酶或化学原料。另外、来自水解后的过程的中间产物，例如乳酸作为沼气产生中的中间体，可以用作其他材料的基础。
在一些实施方式中，加入的酶的量(本文也称为酶剂量或酶负载)是低的。在一些实施方式中，酶的量为0.1-10mg蛋白质/g干物质。蛋白质根据如本文所述的TCA-缩二脲分析来测量。
在一些实施方式中，使用具有15至25％(w/w)的干物质重量的预处理的碳水化合物材料进行液化。
在一些实施方式中，发酵在反应器中进行。在一些实施方式中，发酵还可以在两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或甚至更多个反应器中进行。因此，术语“反应器”不限于单个反应器，而是可以表示多个反应器。
在一些实施方式中，发酵在体积为1至5000m3的反应器中进行。在如本文所述的方法的发酵中使用多个反应器的情况下，它们可以具有相同的体积，但是也可以具有不同的体积。
在一些实施方式中，其中进行发酵的反应器的高度与直径之比为2:1至8:1。
在一些实施方式中，发酵通过产醇微生物进行以产生醇。通过产醇微生物发酵以产生醇可以在其中进行水解的同一反应器中进行。优选地，由产醇微生物发酵以产生醇在单独的反应器中进行。
在一些实施方式中，发酵通过酵母进行。在一些实施方式中，产醇微生物是酵母。在一些实施方式中，产醇微生物能够发酵至少C5糖和至少C6糖。在一些实施方式中，用能够转化至少一种C5糖的酵母进行发酵。在一些实施方式中，用能够转化至少一种C5糖的酵母进行发酵。在一些实施方式中，如本文所述的糖产物包含葡萄糖、半乳糖和***糖。在一些实施方式中，如本文所述的糖产物包含乙酸，优选0.3％(w/w)或更高。在一些实施方式中，如本文所述的糖产物包含甘油。在一些实施方式中，如本文所述的糖产物包含乙酸、甘油和C6糖和/或C5糖。在一些实施方式中，用于发酵的微生物将乙酸、甘油和C6糖和/或C5糖发酵成发酵产物。在一些实施方式中，用于发酵的酵母将乙酸、甘油和C6糖和/或C5糖发酵成发酵产物。在一些实施方式中，用于发酵的酵母将乙酸、甘油和C6糖和/或C5糖发酵成乙醇。在一些实施方式中，如本文所述的糖产物包含Mn2+。
在另一方面，本申请包括本文所述的方法，其中将微生物用于发酵包含糖(例如葡萄糖、L-***糖、半乳糖和/或木糖)的碳源。碳源可以包括任何包含L-***糖、半乳糖、木糖或葡萄糖单元的碳水化合物低聚物或聚合物，例如木质纤维素、木聚糖、纤维素、淀粉、***聚糖等。为了从此类碳水化合物中释放木糖或葡萄糖单元，可以将合适的糖酶(例如木聚糖酶，葡聚糖酶，淀粉酶等)加到发酵培养基中或可以由修饰的宿主细胞产生。在后一种情况下，可以对修饰的宿主细胞进行基因工程改造以产生和***这种糖酶。使用低聚或聚合形式的葡萄糖源的另一个优点是它能够在发酵期间保持较低的游离葡萄糖浓度，例如通过使用限速量的糖酶。这继而将防止对非葡萄糖的糖(如木糖)的代谢和运输所需的***的抑制作用。在一些实施方式中，修饰的宿主细胞发酵L-***糖(任选地木糖)和葡萄糖两者，优选同时发酵，在这种情况下，优选使用对葡萄糖抑制不敏感的修饰的宿主细胞以防止双段(diauxic)生长。除了作为碳源的L-***糖源、任选的木糖(和葡萄糖)外，发酵培养基还将进一步包含修饰的宿主细胞生长所需的适当成分。
发酵过程可以是有氧发酵或厌氧发酵过程。厌氧发酵过程在本文中定义为在不存在氧或基本上不消耗氧的情况下进行的发酵过程，优选消耗小于5、2.5或1mmol/L/h，更优选0mmol/L/h(即，氧消耗是不可检测的)，并且其中有机分子同时用作电子供体和电子受体。在没有氧的情况下，糖酵解和生物质形成中产生的NADH不能经氧化磷酸化过程被氧化。为了解决这个问题，许多微生物使用丙酮酸或其衍生物之一作为电子和氢受体，从而再生NAD+。因此，在优选的厌氧发酵过程中，丙酮酸被用作电子(和氢受体)并被还原为发酵产物，例如乙醇、乳酸、3-羟基丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、富马酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、甘油、丁醇、β-内酰胺抗生素和头孢菌素。在一些优选的实施方式中，发酵过程是厌氧的。厌氧过程是有利的，因为它比有氧过程便宜：需要较少的专用设备。此外，厌氧过程有望比有氧过程提供更高的产物产率。在有氧条件下，通常生物质产量要高于在厌氧条件下。结果，通常在有氧条件下，预期产物产率低于在厌氧条件下。
在另一些实施方式中，发酵过程是在氧受限条件下。更优选地，发酵过程是有氧的并且在氧受限条件下。氧受限的发酵过程是其中氧消耗受到氧从气体到液体的转移所限制的过程。氧受限的程度通过流入气流的量和组成以及所用发酵设备的实际混合/传质性质确定。优选地，在氧受限条件下的方法中，氧消耗速率为至少5.5mmol/L/h、更优选至少6mmol/L/h、并且甚至更优选至少7mmol/L/h。在一些实施方式中，发酵是厌氧的。
发酵过程优选在对所用微生物最合适的温度下进行。因此，对于大多数酵母或真菌细胞，发酵过程在小于42℃，优选小于38℃或更低的温度下进行。对于酵母或丝状真菌宿主细胞，发酵过程优选在低于35、33、30或28℃的温度下和在高于20、22或25℃的温度下进行。在一些实施方式中，发酵在25℃至35℃之间进行。
在一些实施方式中，用发酵微生物进行发酵。在本发明的一些实施方式中，用C5发酵微生物进行C5糖的醇(例如乙醇)发酵。在本发明的一些实施方式中，用C5发酵微生物或商业C6发酵微生物进行C6糖的醇(例如乙醇)发酵。适用于乙醇产生的市售酵母包括但不限于BIOFERMTM AFT和XR(NABC—North American Bioproducts Corporation,GA,USA)、ETHANOL REDTM酵母(Fermentis/Lesaffre,USA)、FALITM(Fleischmann's Yeast,USA)、FERMIOLTM(DSM Specialties)、GERT STRANDTM(Gert Strand AB,Sweden)，和SUPERSTARTTM和THERMOSACCTM新鲜酵母(Ethanol Technology,WI,USA)。
在一些实施方式中，产醇微生物是能够发酵至少一种C5糖的微生物。优选地，它也能够发酵至少一种C6糖。在一些实施方式中，本申请描述了一种由木质纤维素材料制备乙醇的方法，包括以下步骤：(a)进行如上所述的由木质纤维素材料制备糖产物的方法，(b)将糖产物发酵以产生乙醇；(c)任选地，回收乙醇。可以用能够发酵至少一种C5糖的酵母发酵。
发酵中使用的微生物可以是原核或真核生物。所使用的微生物可以是基因工程微生物。合适的微生物的实例是酵母，例如酵母属，例如酿酒酵母，巴斯德酵母或葡萄汁酵母，汉逊酵母，伊萨酵母(Issatchenkia)，例如东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)，毕赤酵母(Pichia)，例如树干毕赤酵母(Pichia stipites)或巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)，克鲁维酵母属，例如脆壁克鲁维酵母，念珠酵母，例如伪热带念珠菌或嗜酸假丝酵母，管囊酵母属，例如嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)或细菌，例如乳杆菌，例如乳酸乳杆菌，芽孢杆菌，发酵单胞菌属，例如运动发酵单胞菌，梭菌属，例如Clostridiumphytofermentans，埃希菌属，例如大肠杆菌，克雷伯氏菌，例如产酸克雷伯菌。在一些实施方式中，能够发酵至少一种C5糖的微生物是酵母。在一些实施方式中，酵母属于酵母属，优选属于酿酒酵母物种。酵母，例如在如本文所述的方法中使用的酿酒酵母能够转化己糖(C6)糖和戊糖(C5)糖。酵母，例如在如本文所述的方法中使用的酿酒酵母可以厌氧发酵至少一种C6糖和至少一种C5糖。在一些实施方式中，如本文所述的酵母除厌氧葡萄糖外还能够使用L-***糖和木糖。在一些实施方式中，酵母能够将L-***糖转化成L-核糖和/或木酮糖5-磷酸酯和/或期望的发酵产物，例如乙醇。能够从L-***糖产生乙醇的生物体，例如酿酒酵母菌株，可以通过修饰宿主酵母来制备，所述宿主酵母引入了来自合适来源的araA(L-***糖异构酶)、araB(L-核酮糖乙醛酸酯(L-ribuloglyoxalate))和araD(L-核酮糖-5-P4-差向异构酶)基因。可以将此类基因引入宿主细胞中以使其能够使用***糖。在WO2003/095627中描述这种方法。可以使用来自植物乳杆菌的araA、araB和araD基因并在WO2008/041840中公开。可以使用来自枯草芽孢杆菌的araA基因以及来自大肠杆菌的araB和araD基因并在EP1499708中公开。在另一些实施方式中，如WO 2009011591中公开的，araA、araB和araD基因可以源自棒形杆菌属，节杆菌属和/或革兰氏杆菌属中的至少一种，尤其是密歇根棒形杆菌(Clavibacter michiganensis)、金黄节杆菌(Arthrobacteraurescens)和/或凡赛堤革兰氏菌(Gramella forsetii)中的一种。在一些实施方式中，酵母还可以包含一个或多个拷贝的木糖异构酶基因和/或一个或多个拷贝的木糖还原酶和/或木糖醇脱氢酶。
酵母可以包含一种或多种遗传修饰以使酵母发酵木糖。遗传修饰的实例是引入一个或多个xylA-基因、XYL1基因和XYL2基因和/或XKS1-基因；醛糖还原酶(GRE3)基因的缺失；PPP-基因TAL1、TKL1、RPE1和RKI1的过表达以使得通过细胞中的戊糖磷酸途径的通量增加。基因工程酵母的实例在EP1468093和/或WO2006/009434中描述。
合适的商业酵母的实例是RN1016，其是来自荷兰DSM的木糖和葡萄糖发酵酿酒酵母株。
在一些实施方式中，用于产生乙醇的发酵过程是厌氧的。厌氧已经在本文前面定义。在另一些实施方式中，用于产生乙醇的发酵过程是有氧的。在另一些实施方式中，用于产生乙醇的发酵过程是在氧受限条件下，例如在有氧且在氧受限条件下。氧受限条件已经在本文前面定义。
可替代地，对于上述发酵过程，可以使用至少两种不同的细胞，这表示该过程是共发酵过程。如上所述的发酵过程的所有实施方式也是该共发酵过程的实施方式：发酵产物的种类，L-***糖源和木糖源的种类，发酵条件(有氧或厌氧条件，氧受限条件，进行该过程的温度，乙醇的生产率，乙醇的产率)。
可以通过本发明的方法产生的发酵产物可以是衍生自发酵的任何物质。它们包括但不限于醇(例如***糖醇，丁醇，乙醇，甘油，甲醇，1,3-丙二醇，山梨糖醇和木糖醇)；有机酸(如乙酸，丙酮酸，己二酸，抗坏血酸，丙烯酸，柠檬酸，2,5-二酮-D-葡萄糖酸，甲酸，富马酸，葡糖二酸，葡糖酸，葡糖醛酸，戊二酸，3-羟基丙酸，衣康酸，乳酸，马来酸，苹果酸，丙二酸，草酸，草酰乙酸，丙酸，琥珀酸和木糖酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如天冬氨酸，谷氨酸，甘氨酸，赖氨酸，丝氨酸，色氨酸和苏氨酸)；烷烃(例如戊烷，己烷，庚烷，辛烷，壬烷，癸烷，十一烷和十二烷)，环烷烃(例如环戊烷，环己烷，环庚烷和环辛烷)，烯烃(例如戊烯，己烯，庚烯和辛烯)；和气体(例如甲烷，氢气(H2)，二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))。发酵产物还可以是蛋白质、维生素、药物、动物饲料补充剂、特种化学品、化学原料、塑料、溶剂、乙烯、酶、例如蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂肪酶、裂解酶、氧化还原酶、转移酶或木聚糖酶。在一些优选的实施方式中，在如本文所述的发酵过程中制备醇。在一些优选的实施方式中，在如本文所述的发酵过程中制备乙醇。
本文所述的方法可包括回收在该过程期间制备的所有种类的产物，包括发酵产物例如乙醇。可以技术人员已知的方式将发酵产物与发酵液分离。回收技术的实例包括但不限于色谱法、电泳程序、溶解度分级、蒸馏或萃取。对于每种发酵产物，技术人员将因此能够选择适当的分离技术。例如，可以常规方式通过蒸馏，例如蒸汽蒸馏/真空蒸馏，将乙醇与酵母发酵液分离。
在一些实施方式中，如本文所述的方法还产生能量、热、电和/或蒸汽。
实施例
实施例1
液化和糖化温度对葡萄糖生产的影响
在该实施例中显示木质纤维素材料的液化和糖化期间的温度影响。
实验在具有1升的工作体积的搅拌的、pH受控的和温度受控的反应器中进行。每个实验均用2.5mg蛋白质/克干物质的预处理的木质纤维素材料的踝节菌属埃默森蓝状菌纤维素酶混合物(cocktail)加0.2mg蛋白质/g干物质的预处理木质纤维素材料的踝节菌属埃默森蓝状菌β-葡萄糖苷酶进行。
使用Biuret方法确定蛋白质浓度。样品用水按重量稀释并在>14000xg下离心5分钟。制备牛血清白蛋白(BSA)稀释液(0.5、1、2、5、10和15mg/ml)以生成校准曲线。在每种稀释的蛋白质样品(BSA和混合物的)中，将200μl上清液转移到1.5ml反应管中。加入800μlBioQuant Biuret试剂并充分混合。从相同的稀释蛋白质样品，取500μl加到装有10KD过滤器的反应管中。将200μl流出液转移到1.5ml的反应管中，加入800μl BioQuant Biuret试剂并充分混合。接下来，将所有混合物(在10KD过滤之前和之后与BioQuant混合的稀释蛋白质样品)在室温下孵育至少30分钟。混合物的吸收在546nm处测量，其中水样品用作空白。使用在校准线范围内在546nm处具有吸收值的混合物稀释液以经由BSA校准线计算样品的总蛋白浓度。
踝节菌属埃默森蓝状菌纤维素酶混合物(cocktail)由根据WO2011/000949中所述的方法产生。在实验中使用如WO2012/000890中所述的踝节菌属埃默森蓝状菌β-葡萄糖苷酶。在液化开始时加入酶。
通过在186℃下孵育玉米秸秆6.7分钟制备酸预处理的玉米秸秆(aCS)。在热处理之前，玉米秸秆用H2SO4浸渍10分钟以在预处理期间将pH设置为2.3。预处理的木质纤维素材料中葡聚糖的量按照Carvalho de Souza等人描述的方法测量(Carbohydrate Polymers,95(013)657-663)。水解反应用酸预处理的玉米秸秆(aCS)在17％(w/w)干物质的最终浓度下进行。经由用水稀释浓缩的原料溶液来制备原料溶液。随后，用10％(w/w)NH4OH将pH调节至pH 4.5。
首先，将预处理的木质纤维素材料液化6小时。在此时间段期间，反应器的顶部空间用氮气冲洗。接下来，将液化的木质纤维素材料糖化114小时，同时在0.1升/分钟的速度下用空气冲洗反应器的顶部空间。在糖化期间，通过调节搅拌器速度将反应混合物中的溶解氧(DO)水平保持在氧饱和水平的20％。以如表1所示的液化和糖化温度进行实验。
在糖化后，取样进行分析。将样品在冰上冷却，在3220xg下离心10分钟且将每种上清液立即取50μl在1450μl I级水中进行稀释。随后将稀释的上清液在0.45μm过滤器上过滤并如下所述分析滤液的糖含量。
根据NREL技术报告NREL/TP-510-42623，使用配备有Aminex HPX-87P的HPLC测量稀释样品的糖浓度。结果在表1中显示。
数据表明当液化温度为60℃至65℃且糖化温度为50℃至60℃时，获得最高的葡萄糖水平。
实施例2
液化和糖化温度对葡萄糖生产的影响
如实施例1中所述进行实验，但须在54.5小时后在采集的样品上测量葡萄糖水平。结果在表2中显示。
数据表明当液化温度为60℃至65℃且糖化温度为50℃至60℃时，获得最高的葡萄糖水平。
实施例3
液化和糖化温度对葡萄糖生产的影响
如实施例1中所述进行实验，但条件是每个实验均用从Sigma-Aldrich获得的纤维素酶混合物Ctec2(来自Novozymes的酶共混物SAE0020)进行。Ctec2是含有纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和半纤维素酶的里氏木霉酶混合物。此外，在该实验中，糖化期间的反应混合物中的溶解氧(DO)水平保持在大约氧饱和度水平的40％。另外，在该实验中，经由用水稀释浓缩的原料溶液来制备原料溶液。随后，用10％(w/w)NH4OH溶液将pH调节至pH 5.0。所用的液化和糖化温度及其结果在表3中显示。
数据表明当液化温度为60℃至65℃且糖化温度为50℃至60℃时，用里氏木霉纤维素酶混合物获得最高的葡萄糖水平。
表1：120小时后在各种液化和糖化温度下的葡萄糖生产。
Figure BDA0002803961530000391
表2：54.5小时后在各种液化和糖化温度下的葡萄糖生产。
Figure BDA0002803961530000392
表3：120小时后在各种液化和糖化温度下的葡萄糖生产。
Figure BDA0002803961530000393

Claims (16)

1.由碳水化合物材料制备糖产物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)预处理所述碳水化合物材料，
b)在60℃至65℃的温度下用酶组合物液化预处理的碳水化合物材料1至20小时以产生液化的碳水化合物材料，
c)在50℃至60℃的温度下用酶组合物将所述液化的碳水化合物材料糖化1至120小时以产生糖产物，其中在糖化期间加入氧，和
d)任选地，回收所述糖产物。
2.由碳水化合物材料制备发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)预处理所述碳水化合物材料，
b)在60℃至65℃的温度下用酶组合物将所述预处理的木质纤维素材料液化1至20小时以产生液化的碳水化合物材料，
c)在50℃至60℃的温度下用酶组合物将所述液化的碳水化合物材料糖化1至120小时以产生糖产物，其中在糖化期间加入氧，
d)发酵所述糖产物以产生发酵产物；和
e)任选地，回收所述发酵产物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤b之后且在步骤c之前，在不加入氧的情况下将所述液化的碳水化合物材料糖化。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述酶组合物包含内切葡聚糖酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述内切葡聚糖酶包含GH5内切葡聚糖酶和/或GH7内切葡聚糖酶。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中用于液化和糖化的酶组合物是相同的。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中用于液化和糖化的酶组合物是不同的。
8.根据权利要求7所述的方法，其中用于液化的酶组合物比用于糖化的酶组合物包含更多的内切葡聚糖酶。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中用于糖化的酶组合物是丝状真菌的完整发酵液，所述发酵液包含纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶和裂解单糖加氧酶。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述液化在具有15至25％(w/w)的干物质重量的预处理的碳水化合物材料上进行。
11.根据权利要求2至10中任一项所述的方法，其中所述发酵用能够转化至少一种C5糖的酵母进行。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中液化和糖化在不同的反应器中进行。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中步骤c包括在52℃至58℃的温度下。
14.根据权利要求3至13中任一项所述的方法，其中所述液化的碳水化合物材料在不加入氧的情况下在55℃至65℃的温度下糖化1至120小时。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述预处理在不存在氧的情况下进行。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中在糖化期间加入氧以将溶解的氧保持在饱和水平的11％至80％。
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