ES2182818T5 - Sacarificación mejorada de celulosa por clonación y amplificación del gen de beta-glucosidasa de Trichoderma reesei - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

Sacarificación mejorada de celulosa por clonación y amplificación del gen de β-glucosidasa de Trichoderma reesei.

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ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

1. Campo de la invención

[0001] La presente invención se refiere a preparaciones y composiciones de celulasa que presentan una 10 capacidad celulolítica mayor o menor. La invención se refiere además a una secuencia de nucleótidos del gen bgl1 que codifica la β-glucosidasa extracelular de un hongo filamentoso cuya secuencia completa o parcial está marcada para el uso como sonda, en la que el gen bgl1 tiene la secuencia de nucleótidos de la Figura 1, a un vector plasmídico que contiene el gen que codifica la β-glucosidasa extracelular y a cepas transformadas con un mayor número de copias del gen de la β-glucosidasa (bgl1) introducido en el genoma. Más concretamente, la 15 presente invención se refiere a cepas de Trichoderma reesei que presentan mayores niveles de expresión del gen bgl1, lo que da como resultado niveles proteicos aumentados de la β-glucosidasa extracelular que se pueden usar, junto con otras composiciones, para producir un producto de celulasa con una mayor capacidad celulolítica.

2. Estado de la técnica 20

[0002] Las celulasas se conocen en la técnica como las enzimas que hidrolizan celulosa (enlaces β-1,4-glucano), originando de este modo la formación de glucosa, celobiosa, celooligosacáridos y similares. Según señalaron Wood et al., «Methods in Enzymology», 160, 25, páginas 234 y siguientes (1988) y en otros lugares, la celulasa producida por un determinado microorganismo está compuesta por varias clases de enzimas diferentes que 25 incluyen las que se identificaron como exocelobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) («CBH»), endoglucanasas (EC 3.2.1.4) («EG»), β-glucosidasas (EC 3.2.1.21) («BG»). Además, las clasificaciones fúngicas de CBH, EG y BG se pueden ampliar adicionalmente para incluir múltiples componentes en cada clasificación. Por ejemplo, se han aislado múltiples CBH y EG de una diversidad de fuentes bacterianas y fúngicas, incluido Trichoderma reesei que contiene 2 CBH, es decir CBH I y CBH II, y al menos 3 EG, es decir los componentes EG I, EG II y EG III. 30

[0003] El sistema de celulasa completo, que comprende componentes de cada una de las clasificaciones de CBH, EG y BG, es necesario para convertir eficazmente las formas cristalinas de la celulosa en glucosa. Los componentes aislados son bastante menos eficaces, si es que lo son, en la hidrólisis de la celulosa cristalina. Además, se observa una relación sinérgica entre los componentes de la celulasa, especialmente si son de 35 diferentes clasificaciones. Esto quiere decir que la efectividad del sistema de celulasa completo es significativamente mayor que la suma de las contribuciones de los componentes aislados de la misma clasificación. A este respecto, se conoce en la técnica que los componentes EG y los componentes CBH interactúan sinérgicamente para degradar la celulosa con mayor eficacia. Véase, por ejemplo, Wood, Biochem. Soc. Trans., 13, páginas 407-410 (1985). 40

[0004] La especificidad por el sustrato y el modo de acción de los diferentes componentes de la celulasa varían según la clasificación, lo que puede explicar la sinergia entre los componentes combinados. Por ejemplo, el modo de acción actualmente aceptado de la celulasa es que los componentes endoglucanasa hidrolizan los enlaces β-1,4-glucosídicos internos, especialmente en regiones de baja cristalinidad de la celulosa, y los 45 componentes exocelobiohidrolasa hidrolizan la celobiosa por el extremo no reductor de la celulosa. La acción de los componentes endoglucanasa facilita enormemente la acción de las exocelobiohidrolasas creando nuevos extremos de cadena que son reconocidos por los componentes exocelobiohidrolasa.

[0005] Las β-glucosidasas son componentes esenciales del sistema de celulasa y son importantes para la 50 degradación enzimática completa de la celulosa en glucosa. Las enzimas β-glucosidasa pueden catalizar la hidrólisis de alquil- y/o aril-β-D-glucósidos, tales como metil-β-D-glucósido y p-nitrofenil-glucósido, así como de glicósidos que contienen sólo residuos carbohidrato, tales como la celobiosa. La catálisis de la celobiosa mediante la β-glucosidasa es importante porque produce glucosa para el microorganismo y además porque la acumulación de celobiosa inhibe las celobiohidrolasas y las endoglucanasas, reduciendo así la velocidad de 55 hidrólisis de celulosa a glucosa.

[0006] Puesto que las β-glucosidasas pueden catalizar la hidrólisis de numerosos sustratos diferentes, es posible usar esta enzima en una variedad de aplicaciones diferentes. Por ejemplo, algunas β-glucosidasas se pueden usar para liberar aroma de fruta mediante la catálisis de diversos glucósidos presentes en ella. De forma similar, 60 algunas β-glucosidasas pueden hidrolizar el monoterpenil-β-glucósido de uva que, después de la hidrólisis, representa una importante fuente potencial de aroma para vino, según describió Günata et al., «Hydrolysis of Grape Monoterpenyl β-Glucosides by Various β-Glucosidases», J. Agric. Food Chem., vol. 38, páginas 1232-1236 (1990).

[0007] Además, las celulasas se pueden usar junto con levaduras para degradar biomasa a etanol, donde la celulasa degrada la celobiosa a glucosa la cual puede ser fermentada adicionalmente por las levaduras para producir etanol. Esta producción de etanol a partir de fuentes de celulosa fácilmente disponibles puede proporcionar una fuente estable y renovable de combustible. El uso de etanol como combustible presenta muchas ventajas en comparación con los productos combustibles de petróleo, tales como la reducción de la 5 contaminación del aire en las ciudades, de la niebla contaminante y de los niveles de ozono, mejorando así el medio ambiente. Además, el etanol como fuente de combustible reduciría la dependencia de la importación de petróleo del extranjero y los suministros petroquímicos.

[0008] Sin embargo, la etapa limitante más importante en la velocidad de la producción de etanol a partir de 10 biomasa es la cantidad insuficiente de β-glucosidasa presente en el sistema para convertir eficazmente la celobiosa en glucosa. Por lo tanto, sería útil para la producción de etanol una composición de celulasa que contenga una cantidad aumentada de β-glucosidasa.

[0009] Por el contrario, en algunos casos es deseable producir una composición de celulasa que sea deficiente 15 en β-glucosidasa y que, preferentemente, carezca de ella. Tales composiciones resultarían ventajosas en la producción de celobiosa y otros celooligosacáridos.

[0010] Las β-glucosidasas están presentes en una variedad de organismos procarióticos, así como en organismos eucarióticos. Se ha clonado el gen que codifica la β-glucosidasa de varios organismos procarióticos, 20 y el gen es capaz de dirigir la síntesis de cantidades detectables de proteína en E. coli sin la necesidad de extensa ingeniería genética, aunque en algunos casos es necesario acoplarlo con un promotor proporcionado por el vector. Sin embargo, tales organismos no producen las β-glucosidasas en cantidades comercialmente factibles.

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[0011] Además, estos genes procarióticos a menudo no se pueden expresar y detectar después de la transformación del huésped eucariótico. Así, con el fin de usar cepas fúngicas, se tendrían que clonar genes fúngicos por medio de los métodos descritos en la presente memoria o mediante la detección con el gen bgl1 de T. reesei por hibridación de ácidos nucleicos.

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[0012] La contribución y bioquímica del componente β-glucosidasa en la hidrólisis de celulosa se complica por la aparente multiplicidad de formas enzimáticas asociadas con T. reesei y otras fuentes fúngicas (Enari et al., «Purification of Trichoderma reesei and Aspergillus niger β-glucosidase», J. Appl. Biochem., vol. 3, páginas 157-163 (1981); Umile et al., «A constitutive, plasma membrane bound β-glucosidase in Trichoderma reesei», FEMS Microbiology Letters, vol. 34, páginas 291-295 (1986); Jackson et al., «Purification and partial characterization of 35 an extracellular β-glucosidase of Trichoderma reesei using cathodic run, polyacrylamide gel electrophoresis», Biotechnol. Bioeng., vol. 32, páginas 903-909 (1988)). Estos y muchos otros autores informan de enzimas β-glucosidasa cuyo tamaño oscila entre 70 y 80 Kd y el pI entre 7,5 y 8,5. Los datos más recientes sugieren que las formas β-glucosidasa extracelular y asociada a la pared celular son la misma enzima (Hofer et al., «A monoclonal antibody against the alkaline extracellular β-glucosidase from Trichoderma reesei: reactivity with other 40 Trichoderma β-glucosidases», Biochim. Biophys. Acta, vol. 992, páginas 298-306 (1989); Messner y Kubicek, «Evidence for a single, specific β-glucosidase in cell walls from Trichoderma reesei QM9414», Enzyme Microb. Technol., vol. 12, páginas 685-690 (1990)) y que la variación de tamaño y del pI es el resultado de una modificación postraduccional y de los métodos heterogéneos de purificación de la enzima. No se sabe si la especie β-glucosidasa intracelular con un pI de 4,4 y un peso molecular aparente de 98 000 es una β-45 glucosidasa nueva (Inglin et al., «Partial purification and characterization of a new intracellular β-glucosidase of Trichoderma reesei», Biochem. J., vol. 185, páginas 515-519 (1980)) o un fragmento proteolítico de la β-glucosidasa extracelular alcalina asociado con otra proteína (Hofer et al., arriba).

[0013] Puesto que la mayor parte de la actividad β-glucosidasa detectable permanece unida a la pared celular 50 (Kubicek, «Release of carboxymethylcellulase and β-glucosidase from cell walls of Trichoderma reesei», Eur. J. Appl. Biotechnol., vol. 13, páginas 226-231 (1981); Messner y Kubicek, arriba; Messner et al., «Isolation of a β-glucosidase binding and activating polysaccharide from cell walls of Trichoderma reesei», Arch. Microbiol., vol. 154, páginas 150-155 (1990)), se piensa que las preparaciones comerciales de celulasa presentan una capacidad reducida de producir glucosa debido a las concentraciones relativamente bajas de β-glucosidasa en la 55 preparación de celulasa purificada.

[0014] Para superar el problema de que la β-glucosidasa limita la velocidad en la producción de glucosa a partir de celulosa mediante celulasa producida por un hongo filamentoso, la técnica describe la complementación del sistema celulolítico de Trichoderma reesei con la β-glucosidasa de Aspergillus, y los resultados indican un 60 aumento de la velocidad de sacarificación de celulosa a glucosa. Duff, Biotechnol Letters, 7, 185 (1985). También se han alterado las condiciones de cultivo de los hongos para aumentar la actividad β-glucosidasa en Trichoderma reesei, como se ilustra en Sternberg et al., Can. J. Microbiol., 23, 139 (1977) y Tangnu et al., Biotechnol. Bioeng., 23, 1837 (1981), y se ha informado de que cepas mutantes obtenidas por mutación ultravioleta potencian la producción de β-glucosidasa en Trichoderma reesei. Aunque estos métodos antes 65

mencionados aumentan la cantidad de β-glucosidasa en Trichoderma reesei, los métodos carecen de utilidad y, en muchos casos, no son comercialmente factibles.

[0015] Lo ideal sería disponer de una cepa obtenida por ingeniería genética de Trichoderma reesei o de otros hongos filamentosos que produjera una mayor cantidad de β-glucosidasa, no sólo para producir un sistema de 5 celulasa eficaz sino también para usar los niveles mayores de expresión del gen bgl1 para producir un producto de celulasa con una mayor capacidad celulolítica. Una cepa de este tipo se puede producir de forma factible mediante la técnica de transformación.

[0016] Sin embargo, con el fin de transformar cepas mutantes de Trichoderma reesei u otros hongos 10 filamentosos, se ha de caracterizar primero la secuencia de aminoácidos del gen bgl1 de Trichoderma reesei o de otros hongos filamentosos de manera que el gen bgl1 se pueda clonar e introducir en cepas mutantes de Trichoderma reesei o de otros hongos filamentosos.

[0017] Adicionalmente, una vez que se ha identificado el gen bgl1, la información contenida en los fragmentos 15 lineales del gen bgl1 se puede usar para preparar cepas de Trichoderma reesei y de otros hongos filamentosos que produzcan composiciones de celulasa exentas de β-glucosidasa.

[0018] Por consiguiente, esta invención se dirige en parte a la caracterización del gen bgl1 que codifica la β-glucosidasa extracelular o unida a la pared celular de Trichoderma reesei. Esta invención se dirige además a la 20 clonación del gen bgl1 en un vector plasmídico que se puede usar en el proceso de transformación y para introducir el gen bgl1 en el genoma de Trichoderma reesei o de otros hongos filamentosos en múltiples copias, generando de este modo cepas transformadas que producen una composición de celulasa con un aumento significativo de la actividad β-glucosidasa. Además, también se dan a conocer las composiciones de celulasa que poseen una mayor capacidad celulolítica. 25

[0019] Esta invención se dirige adicionalmente, en parte, a copias alteradas del gen bgl1 que pueden cambiar las propiedades de la enzima y que se pueden volver a introducir en el genoma de Trichoderma reesei o de otros hongos filamentosos.

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SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[0020] La secuencia de aminoácidos de la proteína β-glucosidasa extracelular o unida a la pared celular de Trichoderma reesei se ha obtenido ahora con el suficiente detalle para permitir la clonación del gen bgl1 en un vector plasmídico adecuado. Este vector plasmídico se puede usar después para transformar cepas de hongos 35 filamentosos para producir transformantes que presentan múltiples copias del gen bgl1 introducidas en ellos.

[0021] Por consiguiente, en sus aspectos de procedimiento, la presente invención se refiere a un procedimiento para modificar la expresión de la β-glucosidasa extracelular en un hongo filamentoso, que comprende transformar dicho hongo con un vector de expresión que contiene una secuencia de ADN extracelular fúngico 40 que:

(a) es capaz de potenciar la expresión de la β-glucosidasa extracelular a través de la presencia de al menos una copia adicional de un gen de β-glucosidasa fúngico en el que dicho gen de β-glucosidasa extracelular es un gen bgl1 procedente de Trichoderma reesei; o 45

(b) codifica una β-glucosidasa extracelular alterada, es decir, una enzima con una secuencia de aminoácidos que ha sido alterada con respecto a la codificada por el gen bgl1 procedente de Trichoderma reesei por manipulación de dicha secuencia de ADN de bgl1.

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[0022] En otro aspecto, la presente invención se dirige a la secuencia de aminoácidos de la β-glucosidasa extracelular de Trichoderma reesei.

[0023] En otro aspecto más, la presente invención se dirige al uso de un fragmento de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos completa o parcial del gen de la β-glucosidasa extracelular de T. reesei 55 que está marcada para el uso como sonda para identificar y clonar el gen bgl1 equivalente de otros hongos filamentosos β-glucosídicos.

[0024] En uno de sus aspectos de composición, la presente invención se dirige a transformantes nuevos y útiles de Trichoderma reesei, que se pueden usar para producir composiciones de celulasa fúngicas, especialmente 60 composiciones de celulasa fúngicas enriquecidas en β-glucosidasa o carentes de β-glucosidasa. Asimismo se contempla en la presente invención la alteración del gen bgl1 y la introducción del gen bgl1 alterado en T. reesei para producir transformantes que también se pueden usar para producir composiciones de celulasa fúngicas alteradas.

[0025] En otro aspecto de composición, la presente invención se dirige a composiciones de celulasa fúngicas preparadas por medio de las cepas de Trichoderma reesei transformadas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

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[0026]

La Fig. 1 representa la secuencia de nucleótidos y la estructura primaria deducida de aminoácidos del gen bgl1 completo de T. reesei.

La Fig. 2 es una representación esquemática del vector pSASβ-glu. 10

La Fig. 3A es una representación figurativa del vector pSASβGlu bal pyr (36).

La Fig. 3B es una representación figurativa del vector pUCβ-Glu A/R pyr (12).

La Fig. 4 representa una transferencia Northern de ARN total aislado de las cepas transformadas de Trichoderma reesei después de la inducción con soforosa mediante las sondas de cbh2 y un fragmento de 700 pb de ADNc de bgl1. 15

La Fig. 5A representa una autorradiografía de una transferencia Southern de ADN de T. reesei que ilustra la presencia del gen de la β-glucosidasa en T. reesei natural (RL-P37) en comparación con cepas de T. reesei modificadas genéticamente para que no incluyan el gen de la β-glucosidasa (12 y 36).

La Fig. 5B representa una autorradiografía de una transferencia Northern de ARN de T. reesei que ilustra la expresión del gen de la β-glucosidasa en T. reesei natural (RL-P37) en comparación con cepas de T. reesei 20 modificadas genéticamente para que no incluyan el gen de la β-glucosidasa (12 y 36).

La Fig. 5C representa un análisis de las proteínas expresadas por las cepas P37 (natural), 12 y 36 de Trichoderma reesei e ilustra la ausencia de β-glucosidasa en las proteínas expresadas por las cepas 12 y 36 de Trichoderma reesei.

La Fig. 6 representa una autorradiografía de ADN genómico digerido con Hind III de una cepa de T. reesei 25 superproductora (carril 9) y de transformantes pSASβ-Glu (carriles 1-8), transferido e hibridado con la sonda β-Glu de 700 pb.

La Fig. 7 representa una curva que ilustra la hidrólisis de Avicel mediante la dosificación de sustrato:enzima de 80:1 de una composición de β-glucosidasa recombinante enriquecida producida mediante la presente invención. 30

La Fig. 8 representa una curva que ilustra la hidrólisis de PSC mediante la dosificación de sustrato:enzima de 300:1 de una composición de β-glucosidasa recombinante enriquecida producida mediante la presente invención.

La Fig. 9 representa una curva que ilustra la velocidad de hidrólisis de fibras derivadas de un pañal celulósico mediante una composición de β-glucosidasa recombinante enriquecida producida mediante la presente 35 invención.

Las Figs. 10A y 10B son autorradiografías de ADN genómico de Aspergillus nidulans, Neurospora crassa, Humicola grisea digerido con Hind III y Eco RI y transferido e hibridado con un fragmento de ADN que contiene el gen bgl1 de Trichoderma reesei.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FORMAS DE REALIZACIÓN PREFERIDAS DE LA INVENCIÓN 40

[0027] Como se usa en la presente memoria, la expresión «β-glucosidasa extracelular potenciada» o «β-glucosidasa potenciada» significa que se ha introducido en el genoma al menos una copia adicional de un gen que codifica la β-glucosidasa extracelular.

[0028] La expresión «β-glucosidasa alterada» o «gen de la β-glucosidasa alterado» significa que la secuencia de 45 aminoácidos de la proteína expresada se ha alterado añadiendo y/o manipulando la secuencia de ácido nucleico del gen o la secuencia de aminoácidos de la proteína.

[0029] La expresión «por medios recombinantes» señala que se ha transformado un microorganismo con una molécula de ADN creada en un tubo de ensayo ligando entre sí trozos de ADN que normalmente no son contiguos.

[0030] La expresión «celulasa exenta de β-glucosidasa extracelular» se refiere a una composición de celulasa 5 que no contiene enzima β-glucosidasa extracelular funcional. Tales composiciones se preparan preferentemente cultivando un hongo filamentoso en el que se ha delecionado o interrumpido el gen de la β-glucosidasa. Preferentemente, estas composiciones se preparan cultivando un hongo filamentoso en el que se ha delecionado el gen de la β-glucosidasa.

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[0031] La expresión «hongos filamentosos» se refiere a todos y cada uno de los hongos filamentosos reconocidos en la técnica.

[0032] La expresión «hongos filamentosos β-glucosídicos» se refiere a aquellos hongos filamentosos que producen una composición de celulasa que contiene β-glucosidasa. 15

[0033] El término «celooligosacárido» se refiere a aquellos grupos de oligosacáridos que contienen de 2 a 8 unidades de glucosa con enlaces β-1,4. Tales celooligosacáridos incluyen celobiosa (diglucosa con un enlace β-1,4) y provienen, preferentemente, de celulosa.

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[0034] Más específicamente, la presente invención se refiere al aislamiento y la caracterización del gen bgl1 que codifica la proteína extracelular o unida a la pared celular de Trichoderma reesei (denominado algunas veces «T. reesei») y a la secuencia de nucleótidos y aminoácidos específica de este gen. El gen bgl1 se clona en vectores plasmídicos, los cuales se usan posteriormente para producir cepas transformadas de T. reesei y de otros hongos filamentosos con copias adicionales del gen bgl1 insertadas en las mismas. Estos transformantes se 25 usan después para producir composiciones de celulasa que tienen una mayor actividad β-glucosidasa y, de este modo, una degradación celulolítica aumentada.

[0035] La presente invención también contempla la manipulación de la secuencia de aminoácidos en el gen bgl1 mismo. La alteración de los sitios activos de esta enzima puede provocar una variedad de cambios diferentes en 30 la conversión catalítica. Por ejemplo, puesto que la β-glucosidasa presenta tanto una actividad hidrolasa como transferasa, la alteración de la secuencia de aminoácidos puede tener como resultado la eliminación de la actividad hidrolasa y un aumento de la actividad transferasa, y facilitar así la síntesis de oligodextrinas β-1,4. Además, la manipulación de la secuencia de aminoácidos de la β-glucosidasa puede provocar cambios adicionales en el sistema, como unos óptimos de pH diferentes, unos óptimos de temperatura diferentes, una 35 velocidad de recambio catalítico (Vmax) alterada, una afinidad (Km) por celobiosa alterada que conduce a una mayor afinidad por celobiosa o a una menor afinidad por celobiosa dando como resultado una velocidad de reacción más lenta o cero, un perfil de inhibición por producto alterado de manera que niveles más bajos o más altos de glucosa inhibirán la actividad β-glucosidasa, y similares.

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[0036] Además, un fragmento de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos completa del gen de la β-glucosidasa extracelular de T. reesei o una parte de ella también se puede marcar y usar como sonda para identificar y clonar el gen bgl1 equivalente en otros hongos filamentosos.

[0037] En general, la presente invención implica el aislamiento del gen bgl1 de T. reesei mediante la 45 identificación de un fragmento de ADNc de 700 pb del gen, que se usa después como sonda para identificar un único fragmento de T. reesei que contiene el gen bgl1 que seguidamente se clona. Debido a la homología del gen bgl1 entre las especies, se puede emplear una sonda que emplea un fragmento del gen bgl1 de T. reesei para identificar el gen bgl1 en otros microorganismos celulolíticos, y se entiende que la siguiente descripción para T. reesei también se podría aplicar a otros hongos filamentosos β-glucosídicos. 50

[0038] En el caso de T. reesei, este fragmento de 6,0 kb se clona después en un plásmido pUC y se realiza una serie de experimentos de mapeo para confirmar que el gen bgl1 completo está contenido en este fragmento. Después se determina la secuencia de nucleótidos en ambas cadenas, y se puede confirmar la posición de dos intrones mediante el análisis de la secuencia de subclones de ADNc de bgl1 que abarcan las uniones 55 intrón/exón. Después de aislar el gen bgl1, se introducen copias adicionales del gen bgl1 en T. reesei o en otras cepas de hongo filamentoso para aumentar la expresión de la β-glucosidasa.

[0039] El aislamiento del gen bgl1 a partir de T. reesei implica la purificación de la β-glucosidasa extracelular, la degradación química y proteolítica de esta proteína, el aislamiento y la determinación de la secuencia de los 60 fragmentos proteolíticos y el diseño de sondas de ADN oligoméricas sintéticas mediante la secuencia proteica. Las sondas oligoméricas se usan después para identificar un fragmento de ADNc de 700 pb de la β-glucosidasa, que se puede marcar y emplear para identificar posteriormente un fragmento que contiene el gen bgl1 completo dentro del fragmento procedente de ADN genómico digerido de T. reesei.

[0040] Para identificar un posible fragmento de ADNc que se pueda usar como sonda para futuros análisis, en primer lugar se aísla el ARN total de micelios de T. reesei y a partir de él se aísla el ARN poliadenilado. El ARN poliadenilado se usa después para producir una mezcla de ADNc que después se amplifica usando cebadores oligonucleotídicos específicos que amplifican únicamente el fragmento de ADNc específico que codifica el gen bgl1 de T. reesei. 5

[0041] Más específicamente, en primer lugar se aísla el ARN total a partir de una cepa inicial de T. reesei. La cepa inicial empleada en la presente invención puede ser cualquier cepa de T. reesei superproductora de celulasa que se conozca en la técnica. Esta cepa productora de celulasa se crea generalmente a partir de cualquier cepa de T. reesei mediante métodos habituales de mutagénesis y selección conocidos en la técnica. La 10 confirmación de que la cepa seleccionada superproduce las celulasas se puede realizar por medio de métodos de análisis conocidos. Una cepa preferida es RLP37, que es fácilmente accesible.

[0042] Se añade un inóculo micelial de la cepa superproductora de T. reesei crecida en un medio de cultivo apropiado a un medio básico y se incuba durante un periodo de entre 50 y 65 horas a una temperatura de entre 15 25 ºC y 32 ºC, preferentemente a 30 ºC. Se puede sustituir el medio básico fresco durante este periodo de incubación. Después se centrifuga el medio de cultivo, y de él se aíslan los micelios y se lavan. Los micelios se resuspenden después en un tampón para permitir su crecimiento y se añade soforosa 1 mM (un dímero β-1,2 de glucosa) a los micelios para inducir la producción de las enzimas celulasas. La preparación de micelios se incuba después durante un periodo de tiempo adicional, preferentemente durante 18 horas a 30 ºC, antes de recogerla. 20

[0043] El ARN total se puede aislar de la preparación de micelios mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, tales como la lisis con proteinasa K seguida de una extracción con fenol:cloroformo, una extracción con isotiocianato de guanidinio seguida de gradientes de cloruro de cesio, una extracción con hidrocloruro de guanidina y disolventes orgánicos, y similares. Es preferible aislar el ARN total mediante el procedimiento 25 descrito por Timberlake et al. en «Organization of a Gene Cluster Expressed Specifically in the Asexual Spores of A. nidulans», Cell, 26, páginas 29-37 (1981). Los micelios se aíslan del medio de cultivo por filtración. El ARN se extrae después de los micelios mediante la adición de un tampón de extracción, fenol saturado con TE y cloroformo. La fase acuosa se elimina y la fase orgánica se vuelve a extraer con el tampón de extracción solo calentando la mezcla de extracción en un baño de agua a una temperatura de entre aproximadamente 60 ºC y 30 80 ºC, preferentemente a 68 ºC, para liberar el ARN atrapado en los polisomas y en la interfase. Después se combinan todas las fases acuosas extraídas, se centrifugan y se vuelven a extraer con fenol-cloroformo hasta que ya no quede proteína en la interfase. El ARN se precipita adicionalmente con 0,1 volúmenes de acetato sódico 3 M y 2 volúmenes de etanol al 95 % y se sedimenta mediante centrifugación antes de resuspenderlo en agua DEP que contiene un inhibidor de la RNasa. 35

[0044] El ARN total se fracciona después en geles de formaldehído-agarosa al 1 %, se transfiere a membranas NytranTM y se hibrida mediante un fragmento del gen cbh2 de T. reesei para determinar si realmente se han inducido los genes que codifican las enzimas del sistema de celulasa en la preparación de T. reesei mediante la adición de la soforosa. Básicamente, la sonda usada en la presente invención proviene de un clon de CBH II 40 producido mediante métodos conocidos en la técnica. Para más detalles sobre cómo se produjo el clon, véase Chen et al., «Nucleotide Sequence and Deduced Primary Structure of Cellobiohydrolase II from Trichoderma reesei», Bio/technology, vol. 5 (marzo 1987). Se realizó mutagénesis dirigida en el clon de CBH II y se introdujo un sitio Bgl II en el extremo 5' exacto del marco de lectura abierto y un sitio Nhe I en el extremo 3' exacto. El fragmento de restricción entre Bgl II y Nhe I que contenía la secuencia codificante de CBH II se clonó 45 adicionalmente en un fagómido pUC218. El gen CBH II se cortó adicionalmente y se aisló en gel antes de añadir una marca.

[0045] Los resultados de la transferencia Northern del ARN de T. reesei hibridado con la sonda de cbh2 indicaron que el nivel de ARNm específico de cbh2 alcanzó un pico a las 14-18 horas después de la inducción. 50 De estos datos se puede inferir que en este momento se induce el complejo de celulasa completo, que incluye la β-glucosidasa. Después se combina el ARN total de las 14, 18 y 22 horas.

[0046] Después de combinar las fracciones específicas de ARN total, se aísla posteriormente el ARNm poliadenilado del ARN total. La poliadenilación postranscripcional es una característica común de la biogénesis 55 de la mayoría de los ARNm eucarióticos. Los ARNm recién sintetizados presentan tramos largos de poli(A) que tienden a acortarse a medida que los ARNm envejecen. El ARNm poliadenilado recién sintetizado se aísla adicionalmente del ARN total mediante métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen el uso de oligo(dT)-celulosa, poli(U) Sepharose, adsorción a y elución de filtros de poli(U) o filtros de membrana de nitrocelulosa y similares. Se prefiere usar la cromatografía en oligo(dT)-celulosa para aislar el ARNm según el 60 procedimiento descrito por Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Más específicamente, se hacen pasar fracciones de ARN total a través de la resina cromatográfica, y el ARNm se eluye de ella con un tampón de elución. El ARN que se une a la columna está enriquecido en ARN que contienen colas poli(A) y, por lo tanto, elimina contaminantes tales como ARNr y ARNm parcialmente degradados. Es importante que la purificación se lleve a cabo con éxito, de forma que 65

cuando se sintetice el ADNc a partir del ARNm se obtengan mayores rendimientos de copias de ARNm y menos copias falsas de ARN no mensajero.

[0047] El ARN total y el ARN poliadenilado de las preparaciones se fraccionaron adicionalmente en geles de formaldehído al 1 %, se transfirieron a membranas NytranR y se analizaron para confirmar que las enzimas 5 presentes en el complejo de celulasa se inducían como ARNm poliadenilado.

[0048] Después de aislar el ARNm poliadenilado del ARN total, se sintetiza a partir de él ADN complementario, o ADNc. La primera cadena del ADNc se sintetiza mediante la enzima ADN polimerasa dependiente de ARN (transcriptasa inversa) para catalizar la reacción. En la presente invención se puede usar la transcriptasa inversa 10 de aves, que se purifica a partir de partículas de un retrovirus de aves, o la transcriptasa inversa murina, que se aísla de una cepa de E. coli que expresa una copia clonada del gen de la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney. Sin embargo, se prefiere usar la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MLV) para sintetizar la primera cadena de ADNc a partir de la población de ARNm poliadenilado. La cantidad de transcriptasa inversa de M-MLV clonada requerida puede variar en función de la 15 cantidad de ARNm poliadenilado usada en la reacción de síntesis. Normalmente se usan aproximadamente 200 U/l de la transcriptasa inversa por 2 a 10 g de ARNm por reacción.

[0049] En la mezcla de síntesis también está presente un cebador para iniciar la síntesis de ADN. Se puede usar cualquier cebador para la clonación de ADNc, pero se prefiere usar oligo(dT) que contiene de 12 a 18 20 nucleótidos de longitud y que se une al tramo poli(A) en el extremo 3' terminal de las moléculas de ARNm de células eucarióticas. El cebador se añade a la mezcla de reacción en gran exceso molar, de manera que cada molécula de ARNm se une a varias moléculas de oligo(dT)12-18. Se prefiere usar aproximadamente 12,5 g de cebador a una concentración de 0,5 mg/ml.

25

[0050] Además de la enzima y del cebador, normalmente completan la combinación de reacción un tampón y una mezcla de dNTP que contiene dATP, dCTP, dGTP y dTTP, a una concentración final de 500 M cada uno. Para la síntesis de la primera cadena de ADNc se puede usar en la presente invención cualquier tampón que sea compatible con esta síntesis. Se prefiere usar un sistema de tamponamiento que consista en Tris-HCl 250 mM (pH 8,3), KCl 375 mM, MgCl2 15 mM y ditiotreitol 50 mM. En general, aproximadamente 500 l de tampón 30 completan la solución de síntesis.

[0051] Una vez sintetizada la primera cadena, se puede sintetizar la segunda cadena de ADNc mediante una diversidad de métodos conocidos en la técnica, tales como síntesis cebada con horquilla por desnaturalización del complejo ADNc:ARNm, adición del fragmento Klenow de la ADN polimerasa de E. coli o de la transcriptasa 35 inversa y después digestión de la estructura en horquilla con la nucleasa S1 para obtener una molécula de ADNc de cadena doble, el método de Okayama y Berg, el método de Gubler y Hoffman y similares. El método de Okayama y Berg usa la RNasa H de E. coli para cortar el ARNm al azar, y el ARN se sustituye en la reacción de traducción de cortes mediante la catálisis con la ADN polimerasa I de E. coli. En el método de Okayama y Berg se usa ARNm para cebar la síntesis de ADN mediante la ADN polimerasa I de E. coli. 40

[0052] El método preferido para sintetizar la segunda cadena de ADNc es un método modificado del procedimiento de Gubler y Hoffman. Este procedimiento usa la RNasa H, la ADN polimerasa I y la DNA ligasa de E. coli para formar la segunda cadena. En realidad, en la presente invención se pueden usar dos métodos diferentes para proceder con la síntesis de la segunda cadena. El primer procedimiento usa la RNasa H para 45 atacar el híbrido ARN:ADN de una manera aleatoria, produciendo cortes adicionales a los producidos mediante la transcriptasa inversa. Si se introducen demasiados cortes en el ARN en el extremo 5' del mensaje antes de que comience la síntesis de la segunda cadena, se pueden producir fragmentos que son demasiado cortos para permanecer hibridados; de este modo, no podrán servir de cebadores. Además, el oligómero de ARN más 5' que ceba la síntesis de ADN de la segunda cadena continuará degradándose hasta que queden tan solo dos 50 ribonucleótidos en el extremo 5' del ADN de la segunda cadena. Estos son sustratos para la actividad RNasa H de la polimerasa I, y los nucleótidos que quedan serán eliminados. Esto deja el extremo 3' del ADNc de la primera cadena en forma de cadena simple, lo que la convierte en un sustrato para la actividad 3' exonucleasa de la polimerasa I. El resultado es una población de ADNc con extremos romos.

55

[0053] Un método alternativo cuenta con la transcriptasa inversa de M-MLV para producir cortes a entre 10 y 20 bases del extremo 5' del ARN en el híbrido. Se usa después la ADN polimerasa I para la síntesis. En general se usan aproximadamente 500 unidades de ADN polimerasa I a una concentración de 10 U/l. Después de la síntesis de la segunda cadena, se añade la RNasa H tras eliminar la ADN polimerasa I para producir un dúplex formado en su totalidad por ADN, excepto el oligonucleótido 5' de ARN con caperuza superviviente. 60

[0054] La síntesis de la segunda cadena mediante cualquiera de los dos procedimientos antes expuestos tiene lugar habitualmente en presencia de un tampón y una mezcla de dNTP. Se puede usar cualquier sistema de tamponamiento conocido en la técnica para la síntesis del ADNc de la segunda cadena; sin embargo, se prefiere

usar un sistema de tamponamiento que contiene Tris-HCl 188 mM, pH 8,3, KCl 906 mM, (NH4)2SO4 100 mM, MgCl2 46 mM, ditiotreitol 37,5 mM y NAD 1,5 mM. La mezcla de dNTP contiene preferentemente dATP 10 mM, dCTP 10 mM, dGTP 10 mM y dTTP 10 mM.

[0055] La síntesis de la segunda cadena se realiza mediante procedimientos conocidos descritos en la técnica. 5 Los métodos y reactivos preferidos usados para sintetizar el ADNc en la presente invención son los sistemas BRL cDNA Synthesis SystemR (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland) y Librarium System (Invitrogen, San Diego, CA).

[0056] En este punto, después de la síntesis de la segunda cadena, está presente una mezcla de ADNc de la 10 cual una pequeña proporción codifica el gen bgl1. Puesto que la amplificación de únicamente el fragmento específico del gen bgl1 en la mezcla de ADNc es crucial para el aislamiento del gen de la β-glucosidasa, se diseñaron cebadores específicos para amplificar mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) el fragmento de ADNc que codifica el gen bgl1 de T. reesei. Los cebadores usados son cebadores redundantes diseñados para hibridar con el ADNc del gen bgl1 que codifica el extremo N terminal y un fragmento interno de 15 CNBr.

[0057] En general, resulta difícil aislar el gen bgl1 porque la secuencia de aminoácidos de la proteína no contiene suficientes aminoácidos codificados por tripletes de ácido nucleico únicos y, de este modo, cualquier oligonucleótido usado sería demasiado redundante para amplificar específicamente el gen bgl1 en la reacción 20 por PCR. Sin embargo, en esta invención se diseñaron cebadores examinando los aminoácidos de la región diana para la amplificación de la β-glucosidasa madura y eligiendo las regiones, lo que requerirá un grado reducido de redundancia en el código genético. La preferencia codónica en T. reesei para diversos otros genes de celulasa, tales como cbh1, cbh2, egl1 y similares, también se tuvo en cuenta a la hora de diseñar los cebadores oligonucleotídicos. Más específicamente, la preferencia codónica se basa en diversos genes de la 25 cepa T. reesei que muestran un triplete de nucleótidos preferido que codifica diferentes aminoácidos. Mediante el análisis de esta preferencia codónica se puede determinar la preferencia por una secuencia de nucleótidos concreta que codifica un aminoácido. Por ejemplo, los genes cbh1, cbh2 y eg1 de T. reesei prefieren que CCU codifique el aminoácido prolina. Así, al diseñar una sonda oligonucleotídica, la secuencia CUG sería la elección preferida para leucina en lugar de los otros tripletes (CUU, CUC, CUA, UUA y CUG) que codifican leucina. 30

[0058] Además, tras seleccionar una región N terminal y una región interna como cebadores para fines de amplificación, los cebadores se diseñaron insertando una base inosina no específica en la posición de titubeo del cebador para el extremo N terminal y usando una mezcla de dieciséis secuencias cebadoras variables para el cebador interno. Básicamente, la creación de los cebadores redundantes la describen Compton en «Degenerate 35 Primers For DNA Amplification» y Lee et al. en «cDNA Cloning Using Degenerate Primers» en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, publicado por Academic Press (1990).

[0059] Usando los cebadores antes descritos se amplifican después selectivamente por PCR las secuencias de ADNc que codifican la región amino terminal del gen bgl1. El método de amplificación consiste en un ciclo inicial 40 desnaturalizante de aproximadamente 5 a 15 minutos a 95 ºC, seguido de una etapa de apareamiento de 1 a 7 minutos a una temperatura de 35 ºC a 55 ºC y, preferentemente, de 45ºC a 55ºC, y un ciclo de polimerización de 5 a 15 minutos a 65 ºC. Sin embargo, se prefiere usar un ciclo inicial desnaturalizante de 10 minutos, seguido de un apareamiento de 2 minutos a 50 ºC y de un ciclo de polimerización de 10 minutos, preferentemente de 30 minutos, a las temperaturas antes descritas. 45

[0060] El fragmento amplificado se identifica después por electroforesis en gel en forma de un segmento de ADNc de 700 pb. La mezcla amplificada de ADNc se fracciona después adicionalmente en un gel de poliacrilamida para obtener un fragmento de ADNc de 700 pb más purificado para fines de clonación. Después de la elución de los fragmentos de 700 pb del gel, los fragmentos de ADNc de 700 pb se clonan en vectores 50 fagómidos. Se puede usar cualquier vector de clonación para clonar los fragmentos de ADNc del gen bgl1, tales como pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pBR322, pEMBL, pRSA101, pBluescript y similares. Sin embargo, se prefiere usar los vectores de clonación pUC218 y pUC219, que derivan de pUC18 y pUC19 mediante la inserción de la región intergénica de M13. Los vectores de clonación con los fragmentos de ADNc que contienen el gen bgl1 se usan después para transformar la cepa JM101 de E. coli. Después de la transformación se identificaron 55 las colonias positivas que contenían el gen bgl1 y se aisló de ellas el ADN por medio de métodos de extracción con cloroformo:fenol y de precipitación con etanol.

[0061] La secuencia de nucleótidos del fragmento de ADNc de 700 pb subclonado se determina después mediante el método de terminación de cadena con didesoxinucleótidos descrito por Sanger et al., mediante un 60 conjunto de reactivos SequenaseR suministrado por U.S. Biochemicals.

[0062] A partir de esta secuencia de nucleótidos se determinó que el segmento de ADNc de 700 pb subclonado contenía un marco de lectura abierto que codificaba 150 aminoácidos que coincidían con numerosos otros péptidos secuenciados que se obtuvieron después de la degradación proteolítica y con CNBr de la β-glucosidasa 65

purificada de T. reesei. Por lo tanto, se confirmó que las secuencias clonadas codificaban la proteína β-glucosidasa extracelular de T. reesei.

[0063] La clonación de la versión genómica del gen completo de la β-glucosidasa se llevó a cabo después marcando el fragmento de ADNc de 700 pb de bgl1 con 32P por medio de los métodos de marcado de 5 oligonucleótidos descritos por Sambrook et al., arriba. Esta sonda se usa para identificar una banda de 6,0 kb en una transferencia Southern de ADN genómico de T. reesei, digerido con Hind III.

[0064] El ADN genómico de T. reesei se prepara para el análisis de transferencia Southern mediante la desproteinización del ADN genómico, seguida de un tratamiento con la ribonucleasa A. El ADN genómico 10 preparado se corta después con una de entre una diversidad de enzimas de restricción, tales como Eco RI, Hind III y similares, se corre en un gel, se transfiere según la técnica Southern y se hibrida con el fragmento de ADNc de 700 pb marcado del gen bgl1. A partir de este análisis se determinó que Hind III era la enzima de restricción a elegir para clonar el gen bgl1.

15

[0065] A continuación se añade Hind III al ADN genómico de la cepa T. reesei y se extrae de él el ADN. Se corre una muestra de esta digestión en un gel de agarosa y se fracciona por electroforesis. Después, el gel se transfiere mediante la técnica Southern y se hibrida con la sonda de ADNc de 700 pb. Se identificó una banda de 6,0 kb en la transferencia Southern del ADN genómico digerido con Hind III. El ADN genómico restante digerido con Hind III se sometió después a una electroforesis en gel preparativa y se eluyó de este el ADN con un tamaño 20 comprendido en el intervalo de aproximadamente 5,0 kb a 7,0 kb, que se clonó en un vector fagómido y se usó para transformar E. coli JM101 para crear una genoteca. Se puede usar cualquier vector fagómido, como los que se describieron anteriormente, pero se prefiere usar pUC218. Las colonias que se obtuvieron como resultado de la transformación se sometieron después a una hibridación de colonias usando el fragmento de ADNc de 700 pb como sonda para identificar aquellas colonias que contenían el ADN genómico clonado que codifica bgl1. 25 Después se recogen las colonias positivas de la transformación y el ADN se aísla de ellas mediante métodos conocidos en la técnica.

[0066] El ADN aislado de una colonia positiva de este tipo se digiere después con diversas enzimas de restricción, tanto individualmente como en diferentes combinaciones, y se somete a una electroforesis en gel de 30 agarosa. El patrón de bandas resultante se usa después para construir un mapa de restricción del ADN genómico de 6,0 kb clonado de T. reesei. Las enzimas usadas en la digestión incluyen Eco RI, Sst I, Kpn I, Sma I, Bam HI, Xho 1, Bgl II, Cla I, Xba I, Sal I, Pst I, Sph I, Hind III, Bal I, Pvu II y similares.

[0067] El mismo gel se somete después a un análisis mediante la técnica de transferencia Southern usando el 35 mismo ADNc de 700 pb de bgl1 como sonda para identificar los fragmentos de restricción genómicos que comparten homología con el ADNc de bgl1. Puesto que la posición de estos fragmentos homólogos se puede determinar respecto al mapa de restricción del fragmento genómico de 6,0 kb, y puesto que también el tamaño de la proteína β-glucosidasa (74 kd) indica una longitud aproximada del gen de 2,1 kb (dado que el peso molecular medio de un aminoácido es de 105 daltons, una proteína de 74 kd contiene de media 705 40 aminoácidos, lo que a su vez equivale a 2.115 pb), los experimentos de mapeo confirmaron que el clon genómico Hind III contiene el gen bgl1 completo.

[0068] Los fragmentos de restricción Pvu II y Bal I, cuyo tamaño oscilaba entre 600 pb y 1500 pb, hibridaron con el clon de ADNc de 700 pb de bgl1 y, por tanto, se seleccionaron para la subclonación en fagómidos pUC218. La 45 secuencia de nucleótidos se determinó por medio de los métodos de Sanger et al., descritos anteriormente. Se secuenciaron los subclones Pvu II y Bal I y se alinearon las secuencias solapantes de los subclones hasta que se obtuvo una única secuencia contigua de un total de 3033 pb, dentro de la cual se determinó la secuencia de nucleótidos del gen bgl1 en ambas cadenas y se dedujo la posición de dos pequeños intrones por homología con los intrones de otros genes de hongos filamentosos. También se dedujo la secuencia de aminoácidos, como se 50 expone en la Figura 1.

[0069] En la Figura 1 se expone la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos primaria deducida del gen bgl1 completo de T. reesei. El peso molecular previsto de la proteína β-glucosidasa codificada es de 74.341. Un péptido de 31 aminoácidos precede al extremo amino terminal maduro de la β-glucosidasa, como se 55 deduce de la secuencia del péptido amino terminal. Dentro de este péptido hay tres posibles sitios de reconocimiento para la peptidasa señal, que consisten en Ala-X-Ala.

[0070] La secuencia de aminoácidos primaria de la β-glucosidasa muestra 7 posibles sitios de N-glicosilación en las posiciones 208, 310, 417 y 566, que muestran la secuencia consenso Asn-X-Ser/Thr-X en la que X no es una 60 prolina. Sin embargo, los sitios en las posiciones 45, 566 y 658 presentan un residuo de prolina en la secuencia consenso y pueden o no estar glicosilados.

[0071] No se observa ninguna preferencia codónica poco común en el gen bgl1 cuando se compara con otros genes de celulasa. La región codificante de bgl1 está interrumpida por dos intrones cortos de 70 pb y 64 pb, 65

respectivamente. Ambos intrones tienen un sitio donador de ayuste, un sitio aceptor de ayuste y sitios aceptores de ramificación para el lazo que muestran homología con las señales de ayuste consenso que aparecen en T. reesei y otros hongos filamentosos.

[0072] Puesto que el gen bgl1 de la cepa T. reesei se ha identificado y se puede clonar, la siguiente etapa es 5 producir un transformante que tenga copias adicionales del gen bgl1.

[0073] En primer lugar se ha de elegir un marcador seleccionable para permitir así la detección del hongo filamentoso transformado. Se pueden usar diferentes marcadores seleccionables que incluyen argB de A. nidulans o T. reesei, amdS de A. nidulans, pyr4 de Neurospora crassa, A. nidulans o T. reesei y pyrG de 10 Aspergillus niger. El marcador seleccionable puede proceder de un gen que especifica un nuevo fenotipo, tal como la capacidad de utilizar un metabolito que normalmente no es metabolizado por los hongos filamentosos que se van a transformar o la capacidad de resistir los efectos de choque tóxicos de un agente químico o de un antibiótico. En la presente invención también se contemplan los marcadores genéticos sintéticos que se pueden sintetizar mediante métodos conocidos en la técnica. Los transformantes se pueden seleccionar después en 15 función del marcador seleccionable introducido en ellos. Puesto que T. reesei no contiene el gen amdS, se prefiere usar el gen amdS en T. reesei como marcador seleccionable que codifica la enzima acetamidasa que permite a las células transformadas crecer en acetamida como fuente de nitrógeno. En el caso en que el gen bgl1 está delecionado en T. reesei, se prefiere usar el gen pyrG como marcador seleccionable.

20

[0074] La cepa huésped usada debe ser un mutante de hongo filamentoso que presente un gen o genes no funcionales correspondientes al marcador seleccionable elegido, o que carezca de ellos. Por ejemplo, si se usa el marcador seleccionable de argB, se usa una cepa mutante arg- específica como receptor en el procedimiento de transformación. Otros ejemplos de marcadores seleccionables que se pueden usar en la presente invención incluyen los genes trp, pyr4, pyrG, trp1, oliC31, Bm1, pkiA, niaD, leu y similares. Por lo tanto, la cepa receptora 25 correspondiente debe ser una cepa mutante tal como trp-, pyr-, leu- y similares.

[0075] La cepa mutante proviene de una cepa huésped inicial que es cualquier cepa de hongo filamentoso. Sin embargo, se prefiere usar una cepa mutante superproductora de hongo filamentoso y, concretamente, una cepa superproductora de T. reesei antes descrita, puesto que esta cepa secreta grandes cantidades de proteínas y, 30 concretamente, grandes cantidades de enzimas celulasas. La cepa mutante seleccionada se usa después en el proceso de transformación. La cepa preferida de T. reesei para uso en la deleción del gen bgl1 es RLP37 pyrG69, un auxótrofo de uridina.

[0076] La cepa mutante del hongo filamentoso seleccionado se puede preparar mediante numerosas técnicas 35 conocidas en la técnica, tales como la técnica de enriquecimiento por filtración descrita por Nevalainen en «Genetic improvement of enzyme production in industrially important fungal strains», Technical Research Center of Finland, Publications 26 (1985). Otra técnica para obtener la cepa mutante consiste en identificar los mutantes en diferentes condiciones del medio de cultivo. Por ejemplo, los mutantes arg- se pueden identificar mediante una serie de placas mínimas provistas de diferentes intermedios de la biosíntesis de arginina. Otro ejemplo es la 40 producción de cepas mutantes pyr- sometiendo las cepas a ácido fluoroorótico (FOA). Las cepas con un gen pyr4 intacto crecen en un medio con uridina y son sensibles a ácido fluoroorótico, y, por lo tanto, es posible seleccionar las cepas mutantes pyr4- seleccionando respecto a la resistencia a FOA.

[0077] El marcador seleccionable elegido se clona después en un plásmido adecuado. En la presente invención 45 se puede usar cualquier plásmido para la clonación del marcador seleccionable, tal como pUC18, pBR322 y similares. Sin embargo, se prefiere usar pUC100. El vector se crea por digestión de pUC100 con la enzima de restricción SmaI, y los grupos fosfato 5' se eliminan después por digestión con fosfatasa alcalina de ternero. El vector fragmentado se purifica después mediante electroforesis en gel, a la que sigue una electroelución del trozo de gel aislado. El gen amdS de A. nidulans se aísla en forma de un fragmento de restricción SstI de 2,4 kb 50 después de separar las secuencias del vector mediante procedimientos conocidos, como los descritos por Hynes et al., Mol. Cell. Biol., 3, páginas 1430-1439 (1983). A continuación, el fragmento SstI de amdS de 2,4 kb y el fragmento del vector pUC100 de 2,7 kb se ligan, y la mezcla de ligación se introduce después en la cepa huésped JM101 de E. coli.

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[0078] En la presente invención se puede usar cualquier plásmido para la inserción del gen bgl1, pero se prefiere usar el plásmido pSAS.

[0079] pSASβ-glu se construye mediante la digestión de pSAS con la enzima de restricción Hind III y la purificación del fragmento lineal por electroforesis en gel y electroelución. En este fragmento del vector pSAS 60 tratado con Hind III se liga el fragmento Hind III de 6,0 kb del ADN genómico de T. reesei que contenía toda la región codificante del gen bgl1 junto con las secuencias necesarias para la transcripción y traducción. La Figura 2 ilustra la construcción de pSASβ-glu.

[0080] También es posible construir vectores que contienen al menos una copia adicional del gen bgl1 y construir 65

vectores en los que la secuencia de aminoácidos del gen bgl1 se ha alterado mediante técnicas conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida, métodos de PCR y métodos de mutación química.

[0081] Una vez construido un vector adecuado, este se usa para transformar cepas de hongos filamentosos. Puesto que la permeabilidad de la pared celular en los hongos filamentosos (por ejemplo, T. reesei) es muy baja, 5 la captación de la secuencia de ADN, del gen o del fragmento génico deseados es, en el mejor de los casos, mínima. Para superar este problema, se puede aumentar la permeabilidad de la pared celular, o el ADN se puede disparar directamente en las células mediante un enfoque de pistola genética. En el enfoque de pistola genética, el ADN que se ha de incorporar en las células se aplica sobre esferas de un tamaño del orden de micrómetros, y estas esferas se disparan literalmente en las células dejando el ADN en ellas y dejando un hueco 10 en la membrana celular. La célula después autorrepara la membrana celular mientras que el ADN permanece incorporado en ella. Además de este método antes descrito, existen numerosos métodos para aumentar la permeabilidad de las paredes celulares de los hongos filamentosos en la cepa mutante (es decir, que carece de un gen funcional correspondiente al marcador seleccionable usado) antes del proceso de transformación.

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[0082] Uno de estos métodos implica la adición de altas concentraciones de álcali o de iones alcalinos a las células de hongos filamentosos. En la presente invención se puede usar cualquier ion de metal alcalino o de metal alcalinotérreo; sin embargo, se usa preferentemente CaCl2 o acetato de litio, y más preferentemente se usa acetato de litio. La concentración de álcali o de iones alcalinos puede variar en función del ion usado, y normalmente se usan concentraciones de 0,05 M a 0,4 M. Se prefiere usar una concentración de 20 aproximadamente 0,1 M.

[0083] Otro método que se puede usar para inducir la permeabilidad de la pared celular para potenciar la captación de ADN en hongos filamentosos consiste en resuspender las células en un medio de cultivo suplementado con sorbitol y ADN portador de timo de ternero. Después se añaden esferas de vidrio al medio 25 suplementado y la mezcla se agita en un vórtex a alta velocidad durante aproximadamente 30 segundos. Este tratamiento rompe las paredes celulares, pero puede matar a muchas de las células.

[0084] Otro método más para preparar los hongos filamentosos para la transformación implica la preparación de protoplastos. El micelio fúngico es una fuente de protoplastos, de modo que se puede aislar el micelio de las 30 células. Las preparaciones de protoplastos se protegen después por medio de la presencia de un estabilizador osmótico en el medio de suspensión. Estos estabilizadores incluyen sorbitol, manitol, cloruro sódico, sulfato de magnesio y similares. Normalmente, la concentración de estos estabilizadores varía entre 0,8 M y 1,2 M. Se prefiere usar una solución de aproximadamente 1,2 M de sorbitol en el medio de suspensión.

35

[0085] La captación del ADN por parte de la cepa huésped mutante de hongo filamentoso depende de la concentración de ion calcio. En general se usa en una solución de captación entre aproximadamente 10 mM de CaCl2 y 50 mM de CaCl2. Aparte de la necesidad de iones calcio en la solución de captación, otros componentes incluidos generalmente son un sistema de tamponamiento, tal como tampón TE (Tris 10 mM, pH 7,4; EDTA 1 mM) o tampón MOPS 10 mM, pH 6,0 (ácido morfolinopropano-sulfónico), y polietilenglicol (PEG). El 40 polietilenglicol actúa en la fusión de las membranas celulares, permitiendo así que el contenido del micelio se libere en el citoplasma de la cepa mutante de hongo filamentoso, y el ADN plasmídico se transfiere al núcleo. Esta fusión con frecuencia deja múltiples copias del ADN plasmídico integradas en tándem en el cromosoma del huésped. En general, se usa una alta concentración de PEG en la solución de captación. Se pueden usar en la solución de captación hasta 10 volúmenes de PEG 4000 al 25 %. Sin embargo, es preferible añadir 45 aproximadamente 4 volúmenes a la solución de captación. También se pueden añadir a la solución de captación aditivos tales como dimetilsulfóxido, heparina espermidina, cloruro potásico y similares, que contribuyen a la transformación.

[0086] Normalmente se usa en la transformación una suspensión que contiene las células mutantes de hongo 50 filamentoso que se han sometido a un tratamiento de permeabilización o los protoplastos en una densidad de 108 a 109/ml, preferentemente de 2 x 108/ml. Estos protoplastos o células se añaden a la solución de captación junto con el vector de transformación deseado que contiene un marcador seleccionable y otros genes de interés, para formar una mezcla de transformación.

55

[0087] La mezcla se incuba después a 4 ºC durante un periodo de 10 a 30 minutos. A continuación se añade PEG adicional a la solución de captación para potenciar adicionalmente la captación del gen o de la secuencia de ADN deseados. El PEG se puede añadir en volúmenes de hasta 10 veces el volumen de la mezcla de transformación, preferentemente alrededor de 9 veces. Después de añadir el PEG, la mezcla de transformación se incuba a temperatura ambiente antes de añadir una solución de sorbitol y CaCl2. La suspensión de 60 protoplastos se añade después a alícuotas fundidas de un medio de cultivo. Este medio de cultivo no contiene uridina y solo permite selectivamente el crecimiento de los transformantes. Las colonias siguientes se transfirieron y purificaron en un medio de cultivo agotado de sorbitol.

[0088] En este estadio, los transformantes estables se pueden distinguir de los transformantes inestables por su 65

mayor tasa de crecimiento y por la formación de colonias circulares con un contorno liso en lugar de irregular en el medio de cultivo sólido. En algunos casos se puede realizar además un ensayo adicional de estabilidad cultivando los transformantes en un medio sólido no selectivo, recogiendo las esporas de este medio de cultivo y determinando el porcentaje de estas esporas que germinarán y crecerán seguidamente en un medio selectivo.

5

[0089] Con el fin de asegurar que la transformación ha tenido lugar mediante los métodos antes descritos, se lleva a cabo un análisis adicional de los transformantes, tal como una transferencia Southern y una autorradiografía. Con el uso de los mismos procedimientos básicos antes expuestos, se puede delecionar el gen bgl1 completo de un vector y transformar en cepas de hongo filamentoso, o el gen bgl1 se puede alterar y transformar en cepas de hongo filamentoso. 10

[0090] Una vez confirmado que las cepas transformadas contienen al menos una copia adicional del gen bgl1 o de un gen bgl1 alterado, las cepas se cultivan adicionalmente en condiciones que permiten la propagación de estos transformantes. Después, los transformantes se pueden aislar de los medios de cultivo y usar en una diversidad de aplicaciones que se describen más adelante. De forma alternativa, los transformantes se pueden 15 fermentar adicionalmente, y se puede aislar una composición de celulasa fúngica recombinante del medio de cultivo. Puesto que, por ejemplo, los transformantes producidos mediante la presente invención pueden expresar una β-glucosidasa extracelular potenciada o alterada en el medio de fermentación, las composiciones de celulasa fúngica se pueden aislar del medio. Normalmente, el procedimiento de aislamiento implica la centrifugación del medio de cultivo o de fermentación que contiene los transformantes y la filtración del 20 sobrenadante mediante ultrafiltración para obtener una composición de celulasa fúngica producida por recombinación. De forma opcional, se puede añadir adicionalmente un agente antimicrobiano a la composición antes de usarla en la diversidad de aplicaciones descritas más adelante. Los ejemplos de agentes antimicrobianos que se pueden añadir son azida sódica, benzoato sódico y similares.

25

[0091] Para confirmar que los transformantes producidos mediante el procedimiento de la presente invención presentaban una actividad aumentada sobre la celobiosa se realizó el siguiente experimento. En este experimento se hicieron reaccionar 50 mg de celobiosa suspendida en 1,0 ml de tampón fosfato (pH 5,0) con el producto de fermentación producido por el transformante (65,5 mg/ml de proteína), usando un producto de fermentación de una cepa normal no mutante de T. reesei como control (135,0 mg/ml de proteína). Los 30 resultados de la actividad sobre la celobiosa en condiciones de velocidad inicial se exponen en la siguiente Tabla I:

TABLA I

Producto

Proteína (mg/ml) Actividad sobre celobiosa mol de glucosa

mg de proteína

Control

135,0 6

Producto producido mediante la presente invención

65,5 33

35

[0092] Los resultados de este experimento indican que el producto de fermentación producido por los transformantes de la presente invención presentan una actividad específica sobre el sustrato, la celobiosa, más de cinco veces mayor que la cepa control no mutante de T. reesei.

[0093] Más aún, las Figuras 7 y 8 confirman que la hidrólisis se ve potenciada para los sustratos Avicel y PSC 40 (observación: PSC es una celulosa hinchada en ácido fosfórico obtenida mediante el tratamiento de Avicel con ácido fosfórico) usando enzima/ sustrato al 1,0 %. En el experimento, el PSC o Avicel se suspendió en 2 ml de tampón acetato sódico 50 mM, pH 4,8, y se incubó a 40º en condiciones no agitadas durante hasta 24 horas. El azúcar reductor soluble se midió mediante el método de Nelson y Somogyi. Estas figuras demuestran, además, que el producto de fermentación de β-glucosidasa recombinante potenciada, producido a partir de los 45 transformantes de acuerdo con la presente invención, presenta una mayor velocidad y extensión de la actividad hidrolítica sobre los diversos sustratos que el control convencional Cyt-123 (como media, un 20 % más de actividad). El control Cyt-123 es el producto obtenido a partir de una cepa superproductora de celulasa de T. reesei sometida a fermentación a escala industrial.

50

[0094] Los transformantes enriquecidos se pueden usar en una diversidad de aplicaciones diferentes. Por ejemplo, algunas β-glucosidasas se pueden aislar posteriormente del medio de cultivo que contiene los transformantes potenciados y añadir a las uvas durante la producción de vino para potenciar el posible aroma del producto vinícola acabado. Otra aplicación más puede consistir en usar la β-glucosidasa en frutas para potenciar su aroma. De forma alternativa, el producto de fermentación recombinante aislado que contiene la β-glucosidasa 55 potenciada se puede usar directamente en aditivos alimentarios o en el procesamiento del vino para potenciar el sabor y el aroma.

[0095] Puesto que la velocidad de hidrólisis de los productos celulósicos aumenta cuando se usan los transformantes con al menos una copia adicional del gen bgl1 insertada en el genoma, los productos que contienen celulosa o heteroglicanos se pueden degradar a una velocidad mayor y en una mayor medida. Los productos hechos de celulosa, tales como papel, algodón, pañales celulósicos y similares, se pueden degradar más eficientemente en un vertedero. La Figura 9 ilustra el uso de una preparación con β-glucosidasa aumentada, 5 aislada del medio de fermentación que contiene los transformantes con al menos una copia adicional del gen bgl1 insertada en el genoma, en comparación con un patrón Cyt-123 no potenciado (definido anteriormente) en un producto de pañal celulósico. Este experimento de hidrólisis se realizó usando 0,4 mg del patrón y del producto de fermentación por 100 mg de sustrato (el pañal celulósico). El experimento se llevó a cabo a 50 ºC durante un periodo de cinco horas, y la concentración de glucosa se midió por duplicado a diferentes intervalos 10 de tiempo. Esta curva ilustra una velocidad de hidrólisis mayor para el producto producido por el producto de fermentación procedente del transformante con copias adicionales de bgl1 que para el patrón. También se determinó que aproximadamente un 14 % de las fibras procedentes del pañal eran insolubles en la solución acuosa. Por lo tanto, el producto de fermentación obtenido a partir de los transformantes, o los transformantes solos, se puede usar en las composiciones para ayudar a degradar por licuefacción una diversidad de productos 15 celulósicos que se añaden a vertederos excesivamente llenos.

[0096] La sacarificación y fermentación simultáneas es un proceso en el que la celulosa presente en la biomasa se convierte en glucosa y, al mismo tiempo y en el mismo reactor, las cepas de levadura convierten la glucosa en etanol. Las cepas de levadura que se conocen para el uso en este tipo de procesos incluyen B. clausenii, S. 20 cerevisiae, Cellulolyticus acidothermophilium, C. brassicae, C. lustinaniae, S. uvarum, Schizosaccharomyces pombe y similares. El etanol obtenido en este proceso se puede usar posteriormente como potenciador de octano, o directamente como combustible en lugar de gasolina, lo que resulta ventajoso ya que el etanol como fuente de combustible es menos perjudicial para el medio ambiente que los productos derivados del petróleo. Se sabe que el uso de etanol mejora la calidad del aire, y posiblemente reduzca los niveles locales de ozono y la 25 niebla contaminante. Más aún, el uso de etanol en lugar de gasolina puede tener una importancia estratégica al amortiguar el impacto de los cambios repentinos en la energía no renovable y en los suministros petroquímicos.

[0097] El etanol se puede producir mediante procesos de sacarificación y fermentación a partir de biomasa celulósica, tal como árboles, plantas herbáceas, desechos sólidos municipales y residuos agrícolas y forestales. 30 Sin embargo, un problema importante que se encuentra en este proceso es la falta de β-glucosidasa en el sistema para convertir la celobiosa en glucosa. Se sabe que la celobiosa actúa como inhibidor de las celobiohidrolasas y endoglucanasas, y de este modo reduce la velocidad de hidrólisis para todo el sistema de celulasa. Por lo tanto, el uso de una mayor actividad β-glucosidasa para convertir la celobiosa rápidamente en glucosa potenciaría enormemente la producción de etanol. Para ilustrar este punto, se comparó la capacidad de 35 la citolasa 123 y del producto de fermentación producido por los transformantes (normalizado respecto a citolasa sobre la base de proteína total) de acuerdo con la presente invención en condiciones de fermentación para hidrolizar fracciones de papel brutas, compuestas por 50 a 60 % de materiales celulósicos, procedentes de una fracción fibrosa (RDF) de desechos sólidos municipales (MSW). Tales suspensiones se encontraban en tampón acetato sódico 50 mM, pH 4,8 a 5,0, y se equilibraron a 30 ºC. Se añadió después a los matraces 40 Saccharomyces cerevisiae al 4 % y se recogieron muestras periódicamente cada 80 horas. A continuación se midió el rendimiento de la producción de etanol. La siguiente Tabla II ilustra que es posible aumentar la producción de etanol mediante la preparación con β-glucosidasa aumentada de la presente invención, usando preparaciones de desechos sólidos municipales como fuente de celulosa.

45

TABLA II

Dosificación

Gramos/litro de etanol

mg de proteína gramo de celulosa

Citolasa 123 Prep. β-Glu alta

10

2,1 5,0

20

5,3 7,2

30

6,9 8,8

40

8,0 9,3

50

8,5 9,3

60

8,5 9,3

[0098] En la Tabla II se puede observar claramente que la preparación con β-glucosidasa potenciada preparada de acuerdo con la presente invención potencia la producción de etanol en comparación con un control de citolasa 50 123, especialmente a bajas concentraciones de proteína.

[0099] Las composiciones de detergente de esta invención pueden emplear, además de la composición de celulasa, un tensioactivo, incluidos los tensioactivos aniónicos, no iónicos y anfolíticos, una hidrolasa, cargas, blanqueadores, agentes de azulado y tintes fluorescentes, inhibidores de la aglutinación, solubilizadores, 55

tensioactivos catiónicos y similares. Todos estos componentes son conocidos en la técnica de detergentes. Para una discusión más a fondo, véanse la solicitud de Estados Unidos n. º de serie 07/593.919, titulada «Trichoderma reesei Containing Deleted Cellulase Genes and Detergent Compositions Containing Cellulases Derived Therefrom», y la solicitud de Estados Unidos n. º de serie 07/770.049, presentada el 4 de octubre de 1991 y titulada «Trichoderma reesei Containing Deleted and/or enriched Cellulase and other enzyme Genes and 5 Cellulase Compositions Derived Therefrom», que se incorporan ambas en la presente memoria como referencia en su totalidad.

[0100] Las composiciones de detergente contienen niveles aumentados de β-glucosidasa o una β-glucosidasa alterada. A este respecto, realmente depende del tipo de producto que uno desee usar en las composiciones de 10 detergente para proporcionar los efectos apropiados.

[0101] Preferentemente, las composiciones de celulasa se emplean en cantidades de aproximadamente 0,00005 por ciento en peso a aproximadamente 5 por ciento en peso respecto a la composición de detergente total. Más preferentemente, las composiciones de celulasa se emplean en cantidades de aproximadamente 0,01 por ciento 15 en peso a aproximadamente 5 por ciento en peso respecto a la composición de detergente total y, aún más preferentemente, de aproximadamente 0,05 por ciento en peso a aproximadamente 2 por ciento en peso respecto a la composición de detergente total.

[0102] Además, la presente invención también contempla el uso de la secuencia de nucleótidos de la β-20 glucosidasa de T. reesei para diseñar diferentes sondas para la identificación del gen de la β-glucosidasa extracelular en otros hongos filamentosos. A este respecto, se puede usar la secuencia de nucleótidos completa del gen bgl1, o una parte de ella, que en cada caso está marcada para el uso como sonda y se usa para identificar y clonar los genes equivalentes de otros hongos filamentosos. Las fuentes de hongos filamentosos incluyen los hongos de los géneros Trichoderma, Aspergillus, Neurospora, Humicola, Penicillium y similares. Más 25 concretamente, las especies preferidas incluyen Trichoderma reesei, Trichoderma viridae, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Neurospora crassa, Humicola grisea, Humicola insolens, Penicillium pinophilum, Penicillium oxalicum, Aspergillus phoenicis, Trichoderma koningii y similares. Debido a la homología del gen bgl1 entre especies, son fáciles de identificar y clonar los genes equivalentes de hongos filamentosos. Las Figuras 10A y 10B son indicativas de esto e ilustran una autorradiografía del ADN de A. nidulans y N. crassa (Figura 10A) y de 30 H. grisea (Figura 10B) digerido con Hind III y Eco RI, que después se transfirió e hibridó con un fragmento de ADN Hind III de 6,0 kb de bgl1 marcado con P32 que contiene el gen bgl1 de T. reesei. Estas autorradiografías ilustran claramente que se puede usar un fragmento de ADN que contiene el gen bgl1 de T. reesei para identificar el gen bgl1 extracelular en otros hongos.

35

[0103] Por tanto, el gen bgl1 de otros hongos filamentosos se puede clonar mediante los métodos antes descritos, usando el gen bgl1 de T. reesei marcado con P32 como sonda. Una vez que se han clonado los genes de otros hongos filamentosos, éstos se pueden usar para transformar los hongos filamentosos de los que procede el gen, u otros hongos filamentosos, para superproducir la β-glucosidasa mediante los métodos antes descritos. 40

[0104] Los siguientes ejemplos específicos se proporcionan con el fin de ilustrar adicionalmente la presente invención y sus ventajas, entendiéndose que estos pretenden ser únicamente ilustrativos y de ningún modo limitantes.

45 Ejemplo 1 Aislamiento del ARN total de Trichoderma reesei

[0105] Un cultivo de Trichoderma reesei superproductor de celulasas se indujo específicamente para la celulasa 50 mediante soforosa, un diglucósido β,1-2, como lo describe Gritzali, 1977. La cepa inicial de Trichoderma reesei es una cepa superproductora de celulasa (RL-P37) desarrollada por mutagénesis mediante los métodos descritos por Sheir-Neiss, G. y Montenecourt, B.S., Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 20 (1984), páginas 46-53. Se añadió un inóculo micelial de T. reesei procedente de un cultivo en agar de dextrosa de patata (Difco) a 50 ml de medio básico de Trichoderma que contenía 1,40 gramos/litro de (NH4)2·SO4, 2,0 gramos/litro de KH2PO4, 0,30 55 gramos/litro de MgSO4, 0,30 gramos/litro de urea, 7,50 gramos/litro de BactoPeptona, 5,0 ml/litro de Tween - 80 al 10 %, 1,0 ml/litro de elementos traza-EFG, pH 5,4, y que se filtró a través de un filtro de 0,2 micrómetros en un matraz con deflectores de 250 ml. Este cultivo se incubó a 30 ºC durante 48 horas con aireación vigorosa. Se tomaron alícuotas de cinco mililitros del cultivo y se añadieron a 25 ml de medio básico fresco en siete matraces de 250 ml. Estas se cultivaron seguidamente durante 24 horas a 30 ºC. Todos los cultivos se centrifugaron en 60 una centrífuga clínica de sobremesa a 2400 x g durante 10 minutos. Los sedimentos miceliales se lavaron tres veces en 50 ml de tampón KHPO4 17 mM (pH 6,0). Por último, los micelios se suspendieron en seis matraces que contenían 50 ml de tampón KHPO4 17 mM con la adición de soforosa 1 mM y en un matraz control que no contenía soforosa. Los matraces se incubaron durante 18 horas a 30 ºC antes de la recogida por filtración a través de Miracloth (Calbiochem). El exceso de medio se eliminó y la estera micelial se colocó directamente en 65

nitrógeno líquido y se puede almacenar a -70 ºC durante hasta un mes. Las hifas congeladas se molieron después en un molinillo de café eléctrico que se enfrió previamente con unos trozos de hielo seco, hasta que se obtuvo un polvo fino. El polvo se añadió después a aproximadamente 20 ml de un tampón de extracción que contenía 9,6 gramos de ácido p-aminosalicílico disuelto en 80 ml de agua tratada con DEP, 1,6 gramos de ácido triisopropilnaftalenosulfónico disuelto en 80 ml de agua tratada con DEP, 24,2 gramos de Tris-HCl, 14,6 gramos 5 de NaCl, 19,09 gramos de EDTA, que se diluyó a un volumen total de 200 ml con agua tratada con DEP y el pH se ajustó a 8,5 con NaOH. Después de añadir el tampón de extracción, se añadieron también 0,5 volúmenes de fenol saturado con TE y la mezcla de extracción se colocó en hielo. A continuación se añadió un cuarto de volumen de cloroformo a la mezcla de extracción y la mezcla se agitó durante dos minutos. Después se separaron las fases mediante centrifugación a 2500 rpm. La fase acuosa se eliminó y se colocó en un tubo de 10 centrífuga que contenía unas gotas de fenol en el fondo de dicho tubo. El tubo se colocó en hielo. La fase orgánica se volvió a extraer después con 2,0 ml de tampón de extracción y se colocó durante 5 minutos en un baño de agua a 68 ºC para liberar el ARN atrapado en los polisomas y en la interfase de la mezcla de extracción. La mezcla extraída se centrifugó, y la fase acuosa se eliminó y combinó con la otra fracción acuosa.

15

[0106] A continuación se extrajeron todas las fracciones acuosas 4 a 5 veces con fenol-cloroformo (1:1 v/v) hasta que ya no se veía proteína en la interfase. Después se añadieron a los extractos orgánicos 0,1 volumen de acetato sódico 3 M, pH 5,2 (hecho con agua DEP y esterilizado en autoclave) y 2,5 volúmenes de 95 % y los extractos se congelaron a -20 ºC durante 2 a 3 horas. De forma alternativa, se precipitó el ARN mediante acetato de litio 2 M. El ARN se sedimentó después por centrifugación a 12 000 rpm durante 20 minutos. El ARN 20 sedimentado se resuspendió después en agua DEP con un inhibidor de la RNasa a una concentración final de 1 unidad por l. Para determinar si los genes que codifican las enzimas se estaban induciendo, se analizó el ARN total.

Análisis de la preparación de ARN total 25

[0107] Para confirmar si los genes que codifican las enzimas del complejo de celulasa se estaban induciendo, se analizó el ARN total mediante la técnica de transferencia Northern descrita por Sambrook et al., arriba, usando un fragmento P32 del gen cbh2 de T. reesei como sonda. El clon cbh2 se aisló por medio de los métodos descritos por Chen et al. en «Nucleotide Sequence and Deduced Primary Structure of Cellobio-hydrolase II from 30 Trichoderma reesei», Biotechnology, vol. 5 (marzo 1987), incorporado en la presente memoria como referencia. Se realizó una mutagénesis dirigida (Sambrook et al., arriba) en el clon cbh2 y se introdujo un sitio Bgl II en el extremo 5' exacto del marco de lectura abierto y un sitio Nhe I en el extremo 3' exacto. La secuencia codificante de Bgl II/Nhe I se clonó después en un fagómido pUC218. Para usarlo como sonda, el fragmento cbh2 se digirió con Bgl II/Nhe I y se aisló mediante electroforesis en gel. Los resultados indicaron que el nivel de ARNm 35 específico de cbh2 alcanzó un pico 14 a 18 horas después de la inducción. A continuación se combinó el ARN total de 14, 18 y 22 horas.

Ejemplo 2 40 Purificación de ARNm poliadenilado

[0108] A continuación se aisló el ARNm de la fracción combinada de ARN total antes expuesta mediante cromatografía en oligo(dT) celulosa. La oligo(dT) celulosa (tipo 3 de Collaborative Research, Lexington, MA) se equilibró primero con tampón de unión a oligo(dT) que contenía Tris-HCl 0,01 M, pH 7,5, NaCl 0,5 M y EDTA 1 45 mM, y después se añadieron alícuotas de 25 a 300 mg a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Se añadió ARN disuelto en 1 ml de tampón de unión y se dejó que se uniera durante 15 minutos con agitación suave. Las suspensiones se centrifugaron a 1500 g durante 3 a 5 min, se lavaron 3 a 5 veces con 1 ml de tampón de unión y después se lavaron 3 veces con 400 l de tampón de elución que contenía Tris-HCl 0,01 M, pH 7,5, y EDTA 1 mM. Los eluatos se combinaron, se reajustaron a NaCl 0,5 M, se volvieron a unir y se volvieron a eluir con tres 50 lavados de tampón de elución. Los últimos tres lavados con tampón de elución se combinaron y el ARNm se recuperó mediante precipitación con etanol.

Análisis del ARN total y del ARNm poliadenilado

55

[0109] El ARN total y el ARN poliadenilado se fraccionaron en geles de agarosa-formaldehído al 1 % mediante 10 g de ARN para cada carril, se transfirieron a membranas NytranR y se analizaron mediante el método de transferencia Northern descrito por Thomas en «Hybridization of denatured RNA and Small DNA fragments transferred to Nitrocellulose», Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 77 (1980), páginas 5201-5205.

60

[0110] Brevemente, este procedimiento implica la desnaturalización del ARN (hasta 10 g/8 l de reacción) por incubación en glioxal 1 M/ Me2SO al 50 % (v/v)/ tampón fosfato sódico 10 mM, pH 7,0, a 50 ºC durante 1 h. La mezcla de reacción se enfrió en hielo y se añadieron 2 l de tampón de muestra que contenía glicerol al 50 % (v/v), tampón fosfato sódico 10 mM a 7,0 y azul de bromofenol. Las muestras se sometieron a electroforesis en

geles horizontales de formaldehído-agarosa al 1 % en tampón fosfato 10 mM, pH 7,0, a 90 v durante 6 horas.

[0111] El ARN glioxilado se transfirió de los geles de agarosa a nitrocelulosa por medio de NaCl 3 M/ citrato trisódico 0,3 M (20X NaCl/cit). Tras la electroforesis, el gel se colocó sobre dos hojas de papel Whatman 3 MM saturado con 20X NaCl/cit. La membrana NytranR se humedeció con agua, se equilibró con 20X NaCl/cit y se 5 colocó sobre el gel. El gel se cubrió después con dos hojas de papel Whatman 3 MM, una capa de 5 a 7 cm de toallitas de papel, una placa de vidrio y un peso. La transferencia del ARN se completó en un plazo de 12 a 15 horas. Las transferencias se secaron después bajo una lámpara y se cocieron al vacío durante 2 h a 80 ºC.

[0112] Las membranas se hibridaron con una sonda de cbh2 para verificar que la mezcla de ARNm poliadenilado 10 contenía ARNm de cbh2 y que, por deducción, se indujeron realmente los genes que codifican las enzimas del complejo de celulasa.

Ejemplo 3 15 Síntesis de ADNc

A. Síntesis de la primera cadena

[0113] La síntesis de ADNc se realizó mediante el sistema BRL cDNA Synthesis SystemR (Bethesda Research 20 Laboratories, Md.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A un tubo estéril tratado con DEPC en hielo se añadieron 10 l de tampón primera cadena 5X que contenía Tris-HCl 250 mM, pH 8,3, KCl 375 mM, MgCl2 15 mM, DTT 50 mM, 2,5 l de mezcla de dNTP 10 mM (dATP 10 mM, dCTP 10 mM, dGTP 10 mM, dTTP 10 mM), 5 l de oligo(dT)12-18 (0,5 mg/ml), 10 l de ARNm a 0,5 mg/ml y 20 l de agua tratada con pirocarbamato de dietilo (DEPC) para crear una composición final que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 8,3), KCl 75 mM, MgCl2 3 mM, 25 ditiotreitol 10 mM, dATP, dCTP, dGTP y dTTP 500 M cada uno, 50 g/ml de oligo(dT)12-18, 100 g/ml de ARN poliadenilado y 10 000 U/ml de transcriptasa inversa de M-MLV clonada. Asimismo se llevó a cabo simultáneamente un ciclo de control mediante 10 l de un ARN control de 2,3 kb (0,5 mg/ml) en lugar del ARNm.

[0114] La reacción se inició por adición de 2,5 l de la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de 30 Molony (M-MLV) (100 unidades/l) al tubo de ARNm y al ARN control. Las muestras se mezclaron. Todos los tubos de reacción se incubaron a 37 ºC durante una hora y después se colocaron en hielo.

[0115] Se corrió una pequeña alícuota de la mezcla de reacción en un gel para confirmar su presencia y su cantidad. El rendimiento obtenido fue de aproximadamente 2 a 6 g. 35

B. Síntesis de la segunda cadena

[0116] Al tubo de control en hielo se añadieron, tras la síntesis de la primera cadena, 230,6 l de agua tratada con DEPC, 6 l de mezcla de dNTP 10 mM, 32 l de tampón segunda cadena 10X que contenía Tris-HCl 188 40 mM, pH 8,3, KCl 906 mM, (NH4)2SO4 100 mM, MgCl2 46 mM, ditiotreitol 37,5 mM, NAD 1,5 mM, 8 l de ADN polimerasa I de E. coli (10 g/l), 1,4 l de RNasa H de E. coli y 1 l de ADN ligasa de E. coli (100 unidades).

[0117] A la muestra de la síntesis de la primera cadena se añadieron en hielo 289,5 l de agua tratada con DEPC, 7,5 l de mezcla de dNTP 10 mM, 40 l de tampón segunda cadena 10X, 10 l de ADN polimerasa I de 45 E. coli, 1,75 l de RNasa H de E. coli y 1,25 de ADN ligasa de E. coli, para crear una composición final que contenía Tris-HCl 25 mM (pH 8,3), KCl 100 mM, (NH4)2SO4 10 mM, MgCl2 5 mM, dATP, dCTP, dGTP y dTTP 250 M cada uno, NAD 0,15 mM, ditiotreitol 5 mM, 250 U/ml de ADN polimerasa I, 8,5 U/ml de RNasa H y 30 U/ml de ADN ligasa. Tanto el tubo de control como el tubo de muestra se agitaron suavemente con vórtex y se incubaron durante 2 horas a 16 ºC. Tras la incubación, ambos tubos se colocaron en hielo. 50

[0118] El tubo de muestra se extrajo después con 415 l de fenol y se precipitó con etanol. El sedimento se disolvió en 200 l de tampón TE estéril (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, Na2EDTA 1 mM) y se volvió a precipitar en acetato de amonio 7,5 M con etanol.

55

[0119] Posteriormente se analizó una alícuota de la muestra mediante electroforesis en gel para comprobar la pureza. El rendimiento de la síntesis fue de aproximadamente 4,0 g.

[0120] La muestra de control que queda se extrajo posteriormente con fenol y se precipitó con etanol tal y como se describió anteriormente para la muestra. Tras disolver el sedimento en 200 l de tampón TE estéril, precipitar 60 de nuevo la muestra en acetato de amonio con etanol y volver a disolver el sedimento seco en 20 l de tampón TE estéril, se analizaron posteriormente 2 l de la solución mediante electroforesis en gel para comprobar la pureza.

Ejemplo 4 Amplificación de las secuencias de ADNc de bgl1

[0121] La amplificación de los fragmentos de ADNc que codifican una parte del gen de la β-glucosidasa de T. 5 reesei, bgl1, se realizó por medio del método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con la TaqR polimerasa y un termociclador Cetus Thermal CyclerR de Perkin Elmer.

[0122] La mezcla de reacción se obtuvo mezclando 76 l de agua desionizada, 10 l de una mezcla 10X de tampón que contenía (NH4)2SO4 166 mM, Tris-HCl 670 mM, pH 8,8, MgCl2 67 mM, EDTA 67 M, β-10 mercaptoetanol 10 mM, 10 l de dimetilsulfóxido y 1,7 mg/ml de BSA diluida a un volumen total de 1,0 ml con agua desionizada, 8 l de 2 dTNP (cada uno), 1 l de cebador oligonucleotídico 5', 1 l de cebador oligonucleotídico interno 3', 1,0 g de ADNc diluido en 3 l de agua desionizada y 1 g de TaqR polimerasa.

[0123] El método de amplificación consiste en un ciclo de desnaturalización inicial a 95 ºC durante 10 minutos, 15 seguido de una etapa de apareamiento de dos minutos a 50 ºC y un ciclo de polimerización de 10 minutos a 65 ºC, durante 30 ciclos adicionales.

A. Cebadores oligonucleotídicos

20

[0124] Los cebadores oligonucleotídicos usados para amplificar el fragmento de ADNc que codifica el gen bgl1 de T. reesei se diseñaron en función de la redundancia del código genético para los aminoácidos seleccionados para una región N terminal del gen bgl1 y para un oligonucleótido interno. El cebador oligonucleotídico 5' consistía en la secuencia:

25

5' GCI GTI CCT CCT GCI GG 3'

en la que I = inosina.

[0125] El cebador oligonucleotídico 3' interno consistía en una mezcla de 16 x 21 oligonucleótidos. Esta mezcla 30 se basaba en diferentes derivaciones de las secuencias siguientes:

5' GTT G/ATT ICC G/ATT G/AAA G/ATC TGT 3'

Ejemplo 5 35 Subclonación de los fragmentos generados por PCR

[0126] Se fraccionaron 90 l de cada mezcla de reacción en geles de poliacrilamida al 4 % en TBE 1X, la banda principal se escindió y se eluyó del trozo de gel tal y como lo describió Sambrook et al., arriba. El fragmento de 40 ADN eluido se precipitó en etanol y se resuspendió en 15 l de tampón TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM). Cada fragmento de ADN de 1 a 2 g se trató después con ATP 0,5 mM y polinucleótido quinasa de T4 para fosforilar el extremo 5' de cada fragmento siguiendo los procedimientos de Sambrook et al., arriba. Se generaron extremos romos añadiendo 3 l de tampón polimerasa de T4 10X (Tris-acetato 330 mM a pH 7,9, acetato de potasio 660 mM, acetato de magnesio 100 mM, 1 l de dNTPs 2,5 mM, 1 l de ADN polimerasa de T4 y 5 l de agua 45 destilada). La mezcla de reacción de extremos romos se incubó después a 37 ºC durante 60 minutos. La reacción se detuvo mediante la adición de EDTA a una concentración final de EDTA 1 mM, y la muestra se calentó posteriormente durante 10 minutos a 65 ºC.

[0127] Los fragmentos de ADN de extremos romos se ligaron a continuación con pUC218 desfosforilado y 50 cortado con SmaI que había sido infectado con M13X07 tal y como lo describió Sambrook et al., arriba. Los vectores de clonación pUC218 y pUC219 se derivaron de pUC118 y pUC119 por inserción de los poliligadores Bgl II, Cla I y Xho I como lo describió Korman et al. en «Cloning, Characterization, and expression of two -amylase genes from Aspergillus niger var. Awamori», Current Genetics, vol. 17, páginas 203-212, (1990).

55

[0128] Se usó después el fagómido antes descrito para transformar la cepa JM101 de E. coli tal y como lo describió Yarnisch et al. en «Improved M13 phage cloning vectors and host strains:nucleotide sequence of the M13mp18 y pUC19 Vectors», Gene, vol. 1197, páginas 103-119 (1985).

Ejemplo 6 60 Aislamiento del fragmento de ADNc subclonado

[0129] La cepa transformada se inoculó en 1,5 ml de caldo 2YT en un tubo que había sido inoculado

previamente con 15 l de JM101 saturado de E. coli. El cultivo se creció durante 8 horas a 37 ºC sometido a agitación.

[0130] La mezcla de cultivo se centrifugó después a 6000 rpm durante 5 minutos y el sobrenadante se vertió en otro tubo. Al sobrenadante se añadieron 300 l de NaCl 2,5 M, PEG al 20 %, y la solución se mezcló. La mezcla 5 se incubó a continuación a temperatura ambiente durante 15 minutos.

[0131] La solución se centrifugó después durante 5 minutos en una microcentrífuga y el sobrenadante se eliminó por aspiración. La solución se agitó de nuevo en un vórtex y el sobrenadante se volvió a eliminar por aspiración.

10

[0132] Se añadieron al tubo 100 l de fenol equilibrado y el tubo se agitó en un vórtex. Se añadieron 100 l de cloroformo y el tubo se volvió a agitar en un vórtex. El tubo se calentó a 55 ºC durante 5 minutos, se mezcló y se centrifugó otros 5 minutos.

[0133] A continuación se recogieron con pipeta 160 l del sobrenadante y se transfirieron a un tubo transparente. 15 Se añadieron al sobrenadante 20 l de NaOAc 1 N, pH 4,5, y 400 l de EtOH al 95 %, y la solución se mezcló y congeló en hielo seco durante 5 minutos. El tubo se centrifugó después durante otros 15 minutos y el sobrenadante se eliminó por aspiración.

[0134] Se añadieron al tubo 1000 l de etanol al 70 %, y el tubo se centrifugó durante otros 2 minutos y se volvió 20 a aspirar. La mezcla se centrifugó una vez más al vacío durante 4 minutos y el sedimento se resuspendió en 15 l de tampón TE.

Ejemplo 7

25

Determinación de la secuencia de nucleótidos del fragmento de ADNc de 700 pb

[0135] La secuencia de nucleótidos del fragmento de ADNc de 700 pb se determinó usando el método didesoxi de secuenciación de ADN descrito por Sanger et al., «DNA Sequencing with chain terminating inhibitors», Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 74 (1977), página 5463, por medio del conjunto de reactivos SequenaseR (U.S. 30 Biochemicals).

Ejemplo 8 Análisis del gen bgl1 35

A. Análisis de secuencia

[0136] Se realizó una secuenciación de nucleótidos mediante el método de terminación de cadena con didesoxinucleótidos de Sanger et al. (1977) por medio del conjunto de reactivos SequenaseR (U.S. 40 Biochemicals).

B. Secuenciación de aminoácidos

[0137] Una muestra de 2,5 nmoles de la preparación de β-glucosidasa reducida y carboximetilada, purificada 45 (según Chirico y Brown, European Journal of Biochem., vol. 165, páginas 333 en adelante) se sometió a una secuenciación del extremo N terminal en un secuenciador multifásico patentado.

[0138] A una muestra de β-glucosidasa se añadió la Endo-Lys C proteasa a un 1 % de proteína total y la mezcla se incubó durante 1 hora a 37 ºC, o la muestra de proteína se sometió a un tratamiento con bromuro de 50 cianógeno. Se añadió un volumen igual de solución A de HPLC (TEA al 0,05 %/TFA al 0,05 % en agua) para detener la reacción. Los fragmentos de CNBr y Endo-Lys C resultantes se separaron por cromatografía en una columna Brownlee C-4 por medio de un gradiente lineal de 0-100 % de solución B de HPLC (TEA al 0,05 %/TFA al 0,05 % en n-propanol) a una velocidad de 1 % por minuto. Se recogieron varios picos para la secuenciación de aminoácidos, y los datos se indican en la Fig. 1. 55

Ejemplo 9 Identificación del gen bgl1 de T. reesei

60

[0139] El fragmento de ADNc de 700 pb de bgl1 se marcó después con 32P por medio de los métodos descritos por Sambrook et al., arriba.

[0140] El ADN genómico de T. reesei se preparó mediante filtración de un cultivo de 24 a 36 horas de T. reesei a

través de Miracloth y congelación de los micelios obtenidos a partir del medio de cultivo. Los micelios congelados se molieron después a polvo fino, y a los micelios en polvo se añadieron 22 ml de TE y 4 ml de SDS al 20 % y se mezclaron. Se añadieron a la mezcla 10 ml de fenol y cloroformo antes de centrifugarla y eliminar la fase acuosa. Se añadieron al extracto orgánico 200 l de proteinasa K a 5 mg/ml y la mezcla se incubó durante 20 minutos a 55 ºC. El ADN se extrajo posteriormente mediante métodos conocidos en la técnica, por medio de una extracción 5 con cloroformo/fenol seguida de una precipitación con etanol. El ADN aislado se trató después con 1 g de ribonucleasa A calentada (100 ºC durante 15 minutos) por 20 g de ADN genómico en tampón TE a 37 ºC durante 30 minutos y luego se enfrió a temperatura ambiente. El ADN genómico de T. reesei se cortó con una única o una combinación de varias enzimas de restricción, tales como Eco RI, Hind III y similares, se realizó una transferencia Southern y se hibridó con el fragmento de ADNc de 700 pb marcado con P32 del gen bgl1 como 10 sonda. A partir de este análisis se determinó que Hind III era la enzima de restricción a elegir para localizar el gen de la β-glucosidasa.

[0141] Se añadieron al ADN 10 a 20 unidades de Hind III por miligramo de ADN genómico y después se extrajo el ADN con fenol-cloroformo para eliminar las proteínas. El ADN tratado se precipitó después con alcohol y se 15 resuspendió en tampón TE a 2 gramos/litro.

[0142] Se cargaron en un gel de agarosa al 1 % muestras de 4 l procedentes de la digestión del ADN genómico con Hind III y se fraccionaron por electroforesis. El gel se sometió después a una transferencia Southern y se hibridó con la sonda de ADNc de 700 pb marcada con P32. Se identificó una banda de 6,0 kb en la transferencia 20 Southern del ADN genómico de T. reesei, digerido con Hind III.

[0143] El ADN genómico Hind III restante se sometió a continuación a una electroforesis en gel preparativa y los fragmentos de 5 kb a 7 kb se electroeluyeron del gel de agarosa y se clonaron en pUC218 digerido con Hind III. Los plásmidos resultantes se usaron para transformar JM101 de E. coli para crear una genoteca. A continuación, 25 la genoteca se cribó mediante hibridación de colonias usando el ADNc de 700 pb de bgl1 marcado con P32 como sonda para identificar aquellas colonias que contenían el ADN que codifica el gen bgl1.

[0144] Se recogieron las colonias positivas de la transformación y se aisló de ellas el ADN mediante extracción con fenol:cloroformo y precipitación con etanol, descrito por Sambrook et al., arriba. 30

[0145] El ADN aislado de las colonias positivas se digirió tanto con una única como con diferentes combinaciones de las siguientes enzimas de restricción: Hind III, Eco RI, Sst 1, Kpn I, Bam HI, Xho 1, Bgl II, Cla I, Xba I, Sal I, Pst I, Sph I, Bal I y Pvu II. Las digestiones se sometieron a una electroforesis en gel de agarosa y el patrón de bandas resultante se usó para construir un mapa de restricción del ADN genómico de 6,0 kb 35 clonado. El mismo gel de agarosa se sometió a una transferencia Southern y se hibridó con el ADNc de 700 pb de bgl1 marcado con P32 para identificar cuál de los fragmentos de restricción genómicos compartía homología con el ADNc de bgl1. Los experimentos de mapeo confirmaron que el gen bgl1 completo está contenido en el clon genómico Hind III. Los fragmentos de restricción Pvu II y Bal I, cuyo tamaño oscilaba entre 600 pb y 1500 pb, hibridaron con el clon de ADN de 700 pb de bgl1 y se eligieron para la subclonación en el fagómido pUC218. 40 Después de clonar estos fragmentos en el fagómido, los subclones Pvu II y Bal I se secuenciaron por medio del método de terminación de cadena con didesoxinucleótidos de Sanger et al. (1977). En esta secuenciación se determinó que las secuencias solapantes de los subclones se alineaban con una única secuencia contigua de un total de 3033 pb, en la que se determinó la secuencia de nucleótidos en ambas cadenas.

45

Ejemplo 10 Construcción de pSASβ-glu

[0146] El vector de partida para la construcción de pSASβ-glu fue el plásmido pSAS. El pSAS se construyó de la 50 siguiente manera. Se digirió pUC100 (un vector plasmídico disponible en el mercado) con la enzima de restricción SmaI y los grupos fosfato 5' se eliminaron a continuación por digestión con fosfatasa alcalina de intestino de ternero. El fragmento de vector lineal se purificó del vector no digerido y de la proteína mediante electroforesis en gel de agarosa, seguida del aislamiento del ADN del vector lineal a partir del trozo de gel aislado mediante electroelución. Se aisló el gen amdS en forma de un fragmento de restricción SstI de 2,4 kb 55 después de la separación de las secuencias del vector (contenido en - Hynes, M.J., Corrick, C.M. y King, J.A., «Isolation of genomic clones containing the amdS gene of Aspergillus nidulans and their use in the analysis of structural and regulatory mutations», Mol. Cell. Biol., vol. 3 (1983), páginas 1430-1439). A continuación se ligaron el fragmento SstI de 2,4 kb de amdS y el fragmento de 2,7 kb del vector pUC100 (Sambrook et al., arriba) y la mezcla de ligación se transformó y propagó en la cepa huésped JM101 de E. coli. 60

[0147] El pSASβ-glu se construyó por digestión de pSAS con la enzima de restricción Hind III y por purificación del fragmento lineal como se describió anteriormente. En este fragmento del vector pSAS tratado con Hind III se ligó un fragmento Hind III de 6,0 kb del ADN genómico de T. reesei que contenía toda la región codificante del gen bgl1 junto con las secuencias necesarias para la transcripción y traducción de los genes. 65

Ejemplo de referencia 11 Preparación del vector de deleción BGL1

[0148] El vector de sustitución de genes pUCβ-Glu A/R pyr, ilustrado en la Figura 3B, se construyó clonando un 5 fragmento Hind III genómico de 6,0 kb, que se sabía que contenía el gen bgl1 completo, en el poliligador de pUC218 que se había cortado con Hind III y cuyos extremos se habían desfosforilado con fosfatasa alcalina de intestino de ternero. La región codificante para el gen bgl1 se eliminó después de este plásmido digiriendo el plásmido con ApaI y Eco RV en sitios de restricción ApaI y Eco RV únicos, situados muy en los extremos 5' y 3' del marco de lectura abierto de bgl1, y aislando el ADN plasmídico lineal. Los extremos de los sitios de 10 restricción se hicieron romos con la ADN polimerasa de T4. Este plásmido se ligó después con un fragmento de restricción Hind III/Bam HI aislado de 2412 pb que contenía el gen pyrG de Asperaillus niger (Hartingsreldt et al., Mol. Gen. Genet. 206: 71-75 (1987)), en el que los extremos de restricción se hicieron romos mediante el tratamiento con la ADN polimerasa de T4 para crear el pUCβGlu A/R pyr (Fig. 3B).

15

Ejemplo 12 Aislamiento de protoplastos

[0149] El micelio se obtuvo inoculando 100 ml de YEG (extracto de levadura al 0,5 %, glucosa al 2 %) en un 20 matraz de 500 ml con aproximadamente 5x107 células de T. reesei. El matraz se incubó después a 37 ºC con agitación durante aproximadamente 16 horas. El micelio se recogió por centrifugación a 2.750 x g. El micelio recogido se lavó posteriormente en una solución de sorbitol 1,2 M y se resuspendió en 40 ml de NovozymR, que es el nombre comercial de Novo Biolabs, Danbury, Ct., para un sistema enzimático de múltiples componentes que contiene 1,3-alfa-glucanasa, 1,3-beta-glucanasa, laminarinasa, xilanasa, quitinasa y proteasa, solución que 25 contiene 5 mg/ml de NovozymR 234; 5 mg/ml de MgSO4·7H2O; 0,5 mg/ml de albúmina de suero bovino; sorbitol 1,2 M. Los protoplastos se liberaron de restos celulares por filtración a través de Miracloth (Calbiochem Corp.) y se recogieron por centrifugación a 2.000 x g. Los protoplastos se lavaron tres veces en sorbitol 1,2 M y una vez en sorbitol 1,2 M, CaCl2 50 mM, se centrifugaron y se resuspendieron. Los protoplastos se resuspendieron finalmente a una densidad de 2 x 108 protoplastos por ml de sorbitol 1,2 M, CaCl2 50 mM. 30

Ejemplo 13 Transformación de protoplastos fúngicos con pSASβ-glu

35

[0150] Se añadieron 200 l de la suspensión de protoplastos preparada en el ejemplo 12 a 20 l (20 g) de pSASβ-glu en tampón TE (Tris 10 mM, pH 7,4; EDTA 1 mM) y 50 l de una solución de polietilenglicol (PEG) que contenía PEG 4000 al 25 %, KCl 0,6 M y CaCl2 50 mM. Esta mezcla se incubó en hielo durante 20 minutos. Tras este periodo de incubación, se añadieron 2,0 ml de la solución de PEG identificada anteriormente, la solución se mezcló adicionalmente y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de esta segunda 40 incubación se añadieron 4,0 ml de una solución que contenía sorbitol 1,2 M y CaCl2 50 mM, y esta solución se mezcló adicionalmente. La solución de protoplastos se añadió inmediatamente a alícuotas fundidas de medio N de Vogel (3 gramos de citrato sódico, 5 gramos de KH2PO4, 2 gramos de NH4NO3, 0,2 gramos de MgSO4·7H2O, 0,1 gramos de CaCl2·2H2O, 5 g de -biotina, 5 mg de ácido cítrico, 5 mg de ZnSO4·7H2O, 1 mg de Fe(NH4)2·6H2O, 0,25 mg de CuSO4·5H2O, 50 g de MnSO4·4H que contiene adicionalmente glucosa al 1 %, 45 sorbitol 1,2 M y agarosa al 1 %). La mezcla de protoplastos/ medio se vertió después sobre un medio sólido que contenía el mismo medio de Vogel que se indicó anteriormente pero que contenía adicionalmente acetamida como fuente de nitrógeno. Puesto que T. reesei no contiene un equivalente funcional del gen amdS, crecerán en este medio solo los transformantes. Estas colonias se transfirieron y purificaron seguidamente en un medio N de Vogel sólido que contenía como aditivo un 1 % de glucosa. La cepa transformada con el gen bgl1 insertado se 50 denomina A83pSASβGlu.

[0151] Los transformantes estables se pueden distinguir de los transformantes inestables por su mayor tasa de crecimiento y por la formación de colonias circulares con un contorno liso en lugar de irregular en el medio de cultivo sólido. En algunos casos se puede realizar además un ensayo adicional de estabilidad cultivando los 55 transformantes en un medio sólido no selectivo, recogiendo las esporas de este medio de cultivo y determinando el porcentaje de estas esporas que germinarán y crecerán seguidamente en un medio selectivo.

[0152] La Figura 6 es una autorradiografía de una transferencia Southern en la que se usa el fragmento de 700 pb marcado con P32 como sonda, de los diferentes transformantes con más copias del gen bgl1 (carriles 1 a 8), 60 usando genómico de T. reesei de una cepa superproductora digerida con Hind III como control (carril 9). Esta autorradiografía muestra claramente que los transformantes contenían una cantidad aumentada del gen bgl1 en comparación con el control.

[0153] La Figura 4 es una autorradiografía de una transferencia Northern de ARN aislado de una de las cepas transformadas (carril A) producidas por la presente invención después de la inducción con soforosa, que ilustra un aumento correspondiente de los niveles de mensaje de bgl1 en comparación con la cepa parental de T. reesei (carril B).

5

[0154] Aparte del análisis visual de los transformantes, el análisis cuantitativo también se completó cortando las bandas apropiadas de la membrana NytranR y contando el marcaje radioactivo presente en ellas en un contador de centelleo. Este experimento se llevó a cabo para obtener un cálculo más preciso de las cantidades relativas de mensaje, como se muestra en la siguiente Tabla III:

10

TABLA III

CPM

Cepa de Trichoderma reesei parental Cepa de Trichoderma reesei transformada

CPM mensaje β-glu

14,4 25,4

CPM CBHII

227,1 95,2

CPM β-glu/CBHII

0,0634 0,2668

[0155] La Tabla III ilustra que el transformante producido mediante el procedimiento de la presente invención presenta ARNm de β-glucosidasa adicional y, por tanto, un aumento de la enzima β-glucosidasa que da como 15 resultado un aumento de la actividad específica.

Ejemplo de referencia 14

Transformación de protoplastos fúngicos con pUCβGlu A/R pyr4 20

[0156] Los mutantes de T. reesei que carecen de la secuencia codificante para el gen de la β-glucosidasa extracelular, bgl1, se obtuvieron mediante un acontecimiento dirigido de sustitución de genes. El plásmido pUCβGlu A/R pyr se digirió con Hind III para obtener un fragmento Hind III lineal en el que las secuencias codificantes de bgl1 se sustituyeron por el gen pyrG de Aspergillus niger. Los protoplastos se transformaron con 25 el fragmento de ADN lineal que contenía las secuencias flanqueantes de bgl1 y pyr4 mediante los métodos de los ejemplos 12 y 13. Los transformantes de la deleción se denominaron 12 y 36. Tras la transformación, la solución de protoplastos se añadió a alícuotas fundidas del medio N de Vogel que contenía adicionalmente glucosa al 1 %, sorbitol 1,2 M y agarosa al 1 %. La mezcla de protoplastos/ medio se vertió después sobre un medio sólido que contenía el mismo medio N de Vogel. El medio carecía de uridina y, por lo tanto, solo las 30 colonias transformadas eran capaces de crecer como resultado de la complementación de la mutación pyr4 de la cepa RL-P37 de T. reesei con el gen pyr4 natural insertado en el fragmento de ADN. Los transformantes estables se seleccionaron después mediante el método mencionado en el ejemplo 13.

Ejemplo de referencia 15 35

Análisis de los transformantes

[0157] Los transformantes se analizaron en cuanto a la presencia o ausencia del gen bgl1 por medio de la sonda de ADNc de 700 pb antes mencionada. Los transformantes se digirieron mediante Hind III. El ADN genómico 40 total de los transformantes seleccionados se digirió con la enzima de restricción Hind III, se corrió en un gel de agarosa al 1 %, se transfirió a una membrana NytranR y se hibridó con el ADNc de 700 pb marcado con P32, antes mencionado, y se visualizó mediante autorradiografía en una película de rayos X. Los resultados de este análisis, expuestos en la Figura 5A, ilustran que los transformantes (12 y 36) no contenían una banda correspondiente al gen bgl1, mientras que la cepa natural (RL-P37, es decir, P-37) sí la contenía. 45

[0158] El ARNm se aisló de los transformantes del ejemplo 14 y se analizó en una transferencia Northern, como en el ejemplo 2. Como se indica en la Figura 5B, el análisis mediante la técnica de transferencia Northern por medio de la sonda ApaI/EcoRV de 2,2 kb de bgl1 marcada con P32, indicó que el ARNm específico de bgl1 estaba presente en RL-P37 pyrG69 de T. reesei y ausente en los transformantes 12 y 36. 50

[0159] Las proteínas se recuperaron como en el ejemplo 8 anterior y después se analizaron en cuanto a la presencia de β-glucosidasa mediante el uso de anticuerpos policlonales (de conejos expuestos a β-glucosidasa pura) marcados con peroxidasa de rábano picante para permitir la detección. Los anticuerpos se usaron para identificar la β-glucosidasa pura (100 ng -- columna A; 1000 ng -- columna B); celulasa producida por T. reesei 55 natural (columna C); y celulasa producida por una cepa de T. reesei genéticamente modificada para delecionar el gen de la β-glucosidasa (columna D). Los resultados de este análisis se exponen en la Figura 5C y muestran que la columna D es la única que no contenía la β-glucosidasa.

[0160] Aunque la invención se ha descrito en relación con varias formas de realización preferidas, el experto en la técnica apreciará que se pueden realizar diversas modificaciones, sustituciones, omisiones y cambios sin apartarse de su alcance. Por consiguiente, se pretende que el alcance de la presente invención esté limitado únicamente por el alcance de las reivindicaciones siguientes, incluidos sus equivalentes.

Claims (24)

1. REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento para modificar la expresión de la β-glucosidasa extracelular en un hongo filamentoso, que comprende transformar dicho hongo con un vector de expresión que contiene una secuencia de ADN fúngico que:

   5

   (a) es capaz de potenciar la expresión de la β-glucosidasa extracelular a través de la presencia de al menos una copia adicional de un gen de β-glucosidasa extracelular fúngico en el que dicho gen de β-glucosidasa extracelular es un gen bgl1 procedente de Trichoderma reesei; o

   (b) codifica una β-glucosidasa extracelular alterada, es decir, una enzima con una secuencia de 10 aminoácidos que ha sido alterada con respecto a la codificada por el gen bgl1 procedente de Trichoderma reesei por manipulación de dicha secuencia de ADN de bgl1.
2. 2. Procedimiento para potenciar la expresión de la β-glucosidasa extracelular de acuerdo con la reivindicación 1(a), en el que dicho vector de expresión comprende toda la secuencia codificante de un gen 15 de β-glucosidasa extracelular fúngico y las secuencias necesarias para la transcripción y traducción del gen de la β-glucosidasa.
3. 3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho hongo filamentoso se selecciona de los géneros Trichoderma, Aspergillus, Neurospora, Humicola y Penicillium. 20
4. 4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho hongo filamentoso es Trichoderma reesei, Trichoderma viridae, Trichoderma koningii, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus wentii, Aspergillus oryzae, Aspergillus phoenicis, Neurospora crassa, Humicola grisea, Penicillium pinophilum o Penicillium oxalicum. 25
5. 5. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que dicho gen bgl1 comprende los aminoácidos codificados por la secuencia de nucleótidos de 311 a 2679 de la Figura 1.
6. 6. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende 30 adicionalmente la etapa de aislamiento de los transformantes que presentan una expresión modificada de la β-glucosidasa.
7. 7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende adicionalmente las etapas de:

   35

   (a) cultivar dichos transformantes en condiciones que permiten el crecimiento de dichos transformantes; y

   (b) aislar una composición de celulasa fúngica recombinante producida por dichos transformantes.

   40
8. 8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicha composición de celulasa fúngica recombinante se aísla mediante:

   (a) centrifugación de dicho medio de cultivo que contiene dichos transformantes para formar un sobrenadante y un sedimento; y 45

   (b) filtración de dicho sobrenadante para obtener una composición de celulasa fúngica recombinante.
9. 9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que se añade un agente antimicrobiano a dicha composición de celulasa fúngica recombinante después de la filtración. 50
10. 10. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, que comprende adicionalmente la etapa de purificación de un producto de expresión de dicha composición de celulasa fúngica recombinante aislada.

    55
11. 11. Composición de celulasa fúngica procedente de un hongo filamentoso que comprende una β-glucosidasa extracelular alterada recombinante producida mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 únicamente en la medida en que dependan de la reivindicación 1(b).
12. 12. Método para producir glucosa a partir de materiales celulósicos o heteroglicanos, que comprende el uso de 60 una composición de celulasa fúngica recombinante que presenta una actividad β-glucosidasa aumentada

    producida mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 únicamente en la medida en que dependan de la reivindicación 1(a).
13. 13. Método para degradar los materiales celulósicos presentes en desechos, biomasa o lodo que comprende el uso de una composición de celulasa fúngica recombinante que presenta una actividad β-glucosidasa 5 aumentada producida mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 únicamente en la medida en que dependan de la reivindicación 1(a).
14. 14. Método para degradar celulosa a glucosa que comprende el uso de una composición de celulasa fúngica recombinante que presenta una actividad β-glucosidasa aumentada producida mediante el procedimiento de 10 una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 únicamente en la medida en que dependan de la reivindicación 1(a).
15. 15. Método para usar la composición de celulasa fúngica recombinante que presenta una actividad β-glucosidasa aumentada producida mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 7 15 a 9 únicamente en la medida en que dependan de la reivindicación 1(a), o la β-glucosidasa purificada producida mediante el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11 en aditivos alimentarios para potenciar el sabor y el aroma.
16. 16. Composición de detergente que comprende una cantidad limpiadora eficaz de un tensioactivo y al menos 20 0,0001 por ciento en peso de una composición de celulasa fúngica recombinante que presenta una actividad β-glucosidasa aumentada producida mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 únicamente en la medida en que dependan de la reivindicación 1(a).
17. 17. Método para usar la composición de celulasa que presenta una actividad β-glucosidasa aumentada 25 producida mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 únicamente en la medida en que dependan de la reivindicación 1(a), en el que dicho método comprende la adición de dicha composición de celulasa fúngica recombinante a levadura y biomasa para formar una mezcla y el cultivo de dicha mezcla a una temperatura suficiente y durante un periodo de tiempo suficiente para producir etanol.

    30
18. 18. Transformantes producidos mediante el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6 únicamente en la medida en que dependa de la reivindicación 1(a).
19. 19. Método para usar los transformantes que presentan una actividad β-glucosidasa extracelular aumentada de la reivindicación 18 únicamente en la medida en que dependa de la reivindicación 1(a), comprendiendo 35 dicho método la adición de dichos transformantes a levadura y biomasa para formar una mezcla y el cultivo de dicha mezcla a una temperatura suficiente y durante un periodo de tiempo suficiente para producir etanol.
20. 20. Método de acuerdo con la reivindicación 17 o la reivindicación 19, en el que dicha levadura es B. clausenii, S. cerevisiae, Cellulolyticus acidothermophilium, C. brassicae, C. lustinaniae, S. uvarum o 40 Schizosaccharomyces pombe.
21. 21. Secuencia de nucleótidos de un gen bgl1 cuya secuencia completa o parcial está marcada para el uso como sonda en la que el gen bgl1 tiene la secuencia de nucleótidos de la Figura 1.

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22. 22. Método para usar una sonda que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 21, para identificar un gen de la β-glucosidasa de un hongo filamentoso.
23. 23. Método de acuerdo con la reivindicación 22 en el que dicha sonda proviene de Trichoderma reesei.

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24. 24. Método de acuerdo con la reivindicación 22 o la reivindicación 23 en el que se pueden usar una o más sondas para identificar dicho gen de la β-glucosidasa de un hongo filamentoso.