ES2927175T3

ES2927175T3 - Método de producción de micropartículas

Info

Publication number: ES2927175T3
Application number: ES14708317T
Authority: ES
Inventors: John Sinden; Lara Stevanato; Randolph Corteling
Original assignee: Reneuron Ltd
Current assignee: Reneuron Ltd
Priority date: 2013-02-12
Filing date: 2014-02-12
Publication date: 2022-11-03
Anticipated expiration: 2034-02-12
Also published as: CN105142646A; US20160002597A1; WO2014125277A1; EP2956147B1; SG11201506284RA; AU2014217615B2; CA2900897A1; EP2956147A1; JP2016507550A; AU2014217615A1

Abstract

La invención se basa en el descubrimiento de que las células inmortalizadas condicionalmente pueden producir micropartículas. Las células inmortalizadas condicionalmente pueden ser células madre. Los ejemplos muestran la recolección exitosa de micropartículas de células madre neurales inmortalizadas condicionalmente y células CD34+. La inmortalización condicional proporciona un suministro constante de células clonales que producen micropartículas como los exosomas. Las células inmortalizadas condicionalmente son útiles como "células productoras" de micropartículas como los exosomas, que normalmente se recolectan o aíslan de las células inmortalizadas condicionalmente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método de producción de micropartículas

Campo de la invención

Esta invención se refiere al uso de células condicionalmente inmortalizadas para producir micropartículas.

Antecedentes de la invención

Las células madre tienen la capacidad de autorrenovarse y diferenciarse en tipos de células funcionalmente diferentes. Tienen el potencial de ser una herramienta poderosa en el creciente campo de la medicina regenerativa, en particular la terapia regenerativa que requiere reemplazo, regeneración o reparación de tejidos (Banerjee et al., 2011). Sin embargo, existen inconvenientes en el uso de células madre en la terapia: existe la necesidad de un suministro consistente y sustancial de células madre con estabilidad funcional y fenotípica y los altos costes asociados y el retraso causado por la generación, el almacenamiento, el transporte y la manipulación de células; existe un requisito de compatibilidad inmunológica para evitar el rechazo de las células madre por parte del receptor; y existen cuestiones reglamentarias complejas relacionadas con los posibles riesgos de seguridad de la formación de tumores o tejidos ectópicos. Además, a pesar de la eficacia terapéutica del trasplante de células madre, no hay pruebas convincentes de un efecto directo a largo plazo de las células madre trasplantadas, p. ej., a través del injerto y la diferenciación en células reparadoras o de reemplazo.

Las células madre neurales (NSC) son células madre multipotentes que se autorrenuevan que generan neuronas, astrocitos y oligodendrocitos (Kornblum, 2007). El potencial médico de las células madre neurales está bien documentado. El tejido dañado del sistema nervioso central (SNC) tiene una capacidad regenerativa muy limitada, por lo que la pérdida de la función neurológica suele ser crónica y progresiva. Las células madre neurales (NSC) han mostrado resultados prometedores en la terapia basada en células madre de lesiones o enfermedades neurológicas (Einstein et al., 2008). Se ha demostrado que la implantación de células madre neurales (NSC) en el cerebro de animales después de un accidente cerebrovascular es seguida por una recuperación significativa en las pruebas motoras y cognitivas (Stroemer et al., 2009). No se entiende completamente cómo las NSC pueden restaurar la función en los tejidos dañados, pero ahora se reconoce cada vez más que las NSC tienen propiedades de reparación multimodal, que incluyen la diferenciación celular apropiada para el sitio, la actividad proangiogénica y neurotrófica y la inmunomodulación que promueve la reparación de tejidos por el sistema inmunitario nativo y otras células huésped (Miljan & Sinden, 2009, Horie et al., 2011). Es probable que muchos de estos efectos dependan de la señalización transitoria de las células madre neurales implantadas al entorno del huésped, p. ej., las NSC expresan transitoriamente marcadores proinflamatorios cuando se implantan en tejido muscular isquémico dañado que dirige y amplifica la respuesta inmunitaria reguladora y proangiogénica natural para promover la cicatrización y la reparación (Hicks et al., datos no publicados). En el accidente cerebrovascular crónico, las NSC también tienen un efecto neurotrófico sustancial. Por ejemplo, promueven la repoblación del tejido cerebral estriatal dañado por un accidente cerebrovascular con neroblastos positivos para doblecortina derivados del cerebro del huésped. Hassani, O'Reilly, Pearse, Stroemer et al., PLoS One. 2012; 7(11)).

Además, sobre la base de una gran cantidad de efectos restauradores de NSC en modelos animales con accidente cerebrovascular crónico, ReNeuron Limited (Surrey, RU) está llevando a cabo un ensayo clínico con células madre neurales para probar el tratamiento de pacientes discapacitados con accidente cerebrovascular usando sus células madre neurales derivadas de la corteza condicionalmente inmortalizadas "CTX0E03" (Clinicaltrials.gov Identificador: NCT01151124).

Las células madre mesenquimales (MSC) son células madre de linaje restringido que tienen el potencial de diferenciarse únicamente en tipos de células mesenquimales, es decir, de los linajes adipocíticos, condrocíticos y osteocíticos (Pittenger et al., 1999; Ding et al., 2011). Las MSC (también denominadas células estromales mesenquimales y células progenitoras mesenquimales) se derivan de una variedad de fuentes que incluyen la médula ósea, la sangre, el tejido adiposo y otros tejidos somáticos. Sin embargo, el potencial terapéutico de las MSC está más dirigido a la aplicación de sus propiedades proangiogénicas e inmunomoduladoras como células indiferenciadas. La producción de MSC humanas está limitada por la incapacidad de estas células para expandirse en cantidades de forma estable más allá de aproximadamente 15-20 duplicaciones de la población.

El medio acondicionado con células madre mesenquimales (MSC-CM) tiene una eficacia terapéutica similar a la de las propias MSC, lo que sugiere un mecanismo paracrino de la terapia basada en MSC. (Timmers et al., 2007). El documento WO-A-2009/105044 divulga que las partículas conocidas como exosomas, secretadas por las MSC, comprenden al menos una propiedad biológica de las MSC y sugiere el uso de estas partículas de MSC en terapia, mientras que Théry et al., 2011 proporciona una revisión general de los exosomas y otras vesículas secretadas similares. Mientras que algunos de los inconvenientes del uso directo de células madre como agentes terapéuticos se superan mediante el uso de exosomas derivados de células madre mesenquimales (p. ej., almacenamiento, transporte y manipulación), sigue existiendo el problema de proporcionar un suministro constante y sustancial de células madre funcional y fenotípicamente estables para producir los exosomas. Para uso terapéutico, los exosomas preferiblemente deben producirse a gran escala. En ausencia de una línea de células madre, se requiere la reposición de las células a través de la derivación repetida de una fuente de células madre, lo que genera costes recurrentes para la prueba y validación de cada nuevo lote. Además, las enfermedades y trastornos que pueden ser tratados por las MSC pueden ser limitados.

Chen et al. (Journal of Translational Medicine 2011, 9: 47) describe que se ha demostrado que los exosomas o las vesículas bilipídicas secretadas a partir de células madre mesenquimales derivadas de ESC humanas (hESC-MSC) reducen la lesión por isquemia/reperfusión miocárdica en modelos animales. Sin embargo, dado que las hESC-MSC no son infinitamente expansibles, la producción a gran escala de estos exosomas requeriría la reposición de hESC-MSC a través de la derivación de hESC e incurriría en costes recurrentes para probar y validar cada nuevo lote. Chen et al., por lo tanto, tuvieron como objetivo investigar si la inmortalización de MYC de hESC-MSC evitaría esta restricción sin comprometer la producción de exosomas terapéuticamente eficaces. Los resultados demostraron que la transformación de MYC es una estrategia práctica para garantizar un suministro infinito de células para la producción de exosomas en el intervalo de miligramos como agentes terapéuticos o vehículos de administración.

Sigue existiendo la necesidad de mejorar las terapias basadas en células madre.

Sumario de la invención

La invención está definida por las reivindicaciones.

La presente divulgación se basa en el sorprendente hallazgo de que las micropartículas pueden ser convenientemente producidas por células condicionalmente inmortalizadas. Las células condicionalmente inmortalizadas pueden ser células madre. Los ejemplos muestran la recolección exitosa de micropartículas de células madre neurales condicionalmente inmortalizadas y células CD34+. La inmortalización condicional proporciona un suministro constante de células clonales que producen micropartículas tales como los exosomas. Las células condicionalmente inmortalizadas son útiles como "células productoras" de micropartículas tales como exosomas, que típicamente se recolectan o aíslan de las células condicionalmente inmortalizadas.

Un primer aspecto de la invención proporciona el uso de una célula condicionalmente inmortalizadas para producir micropartículas, donde la célula condicionalmente inmortalizadas es:

una célula madre mesenquimal, opcionalmente seleccionada de una célula madre derivada de médula ósea, una célula regenerativa endometrial, una célula progenitora mesenquimal o una célula progenitora adulta multipotente; una célula madre hematopoyética, opcionalmente una célula CD34+ y/o aislada de sangre de cordón umbilical, u opcionalmente una célula CD34+/CXCR4+; una célula madre de sangre de cordón umbilical no hematopoyética; una célula madre embrionaria muy pequeña (VSEL);

una célula madre pluripotente inducida (iPS);

un fibroblasto; o

una célula dendrítica.

La micropartícula que se produce puede ser un exosoma, una microvesícula, una partícula de membrana, una vesícula de membrana, una vesícula similar a un exosoma, una vesícula similar a un ectosoma, un ectosoma o una exovesícula. Típicamente, la micropartícula es un exosoma. En una realización, la célula es una célula madre mesenquimal y la micropartícula es un exosoma.

La inmortalización condicional se puede lograr introduciendo un factor de inmortalización que está inactivo a menos que se suministre a la célula un agente activador. Tal factor de inmortalización puede ser un gen tal como c-MycER. El producto del gen c-mycER es una proteína de fusión que comprende una variante de c-Myc fusionada con el dominio de unión al ligando de un receptor de estrógeno mutante. Las células condicionalmente inmortalizadas se cultivan típicamente en presencia del agente activador. Para las células condicionalmente inmortalizadas con c-MycER, el agente activador es el 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT). En consecuencia, las micropartículas típicamente se aíslan de células condicionalmente inmortalizadas que se encuentran en estado inmortalizado en el momento del aislamiento de las micropartículas.

También se ha encontrado que es posible alterar la producción de micropartículas por células condicionalmente inmortalizadas mediante la adición de componentes al medio de cultivo, mediante el cultivo de células madre en condiciones hipóxicas, o mediante el cocultivo con otros tipos de células, proporcionando así un método mejorado para producir micropartículas de células madre.

Un segundo aspecto de la invención proporciona un método para producir una micropartícula, que comprende aislar una micropartícula de un medio acondicionado de células condicionalmente inmortalizadas, donde la célula es como se define en el primer aspecto. En ciertas realizaciones de este aspecto:

el medio acondicionado con células puede comprender uno o más componentes que inducen la liberación de micropartículas por parte de las células madre en el medio;

las células pueden cultivarse en condiciones hipóxicas;

las células pueden cultivarse conjuntamente con un tipo de célula diferente;

las células pueden cultivarse en un biorreactor de múltiples compartimentos; y/o

las células pueden ser células madre que están parcialmente diferenciadas.

Otro aspecto de la divulgación proporciona un método para producir una micropartícula de células madre, típicamente una micropartícula de células madre neurales o una micropartícula de otro tipo de células madre (como se detalló anteriormente). El método puede comprender cultivar las células madre, típicamente células madre condicionalmente inmortalizadas, en un entorno que permita la diferenciación de las células madre y la recolección de las micropartículas que producen las células. Las micropartículas pueden aislarse de células madre neurales parcialmente diferenciadas. Las células madre pueden cultivarse en condiciones que permitan la eliminación eficiente de los desechos metabólicos. En una realización, un entorno que permite la diferenciación de células madre es el cultivo en un biorreactor de múltiples compartimentos, típicamente durante un período de tiempo prolongado (p. ej., más de siete días). El método puede comprender aislar una micropartícula de un medio acondicionado con células madre. El medio acondicionado con células madre puede comprender uno o más componentes o agentes aditivos que estimulan la liberación de micropartículas por parte de las células madre en el medio. El uno o más componentes pueden seleccionarse de factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), interferón-gamma (IFN-y) y/o factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a). Las micropartículas pueden aislarse del medio acondicionado con células madre donde las células madre se cultivaron en condiciones hipóxicas. Las micropartículas pueden aislarse del medio acondicionado con células madre producido por células madre cultivadas conjuntamente con un tipo de célula diferente, típicamente células endoteliales, para crear el entorno de nicho de NSC.

Otro aspecto de la divulgación proporciona una micropartícula que se puede obtener mediante un aspecto del método de la divulgación.

Otro aspecto de la invención proporciona un método de detección de un agente que altera la producción de una micropartícula por una célula condicionalmente inmortalizada como se define en el primer aspecto, que comprende poner en contacto la célula condicionalmente inmortalizada con un agente candidato y observar si la tasa de producción de micropartículas por la célula condicionalmente inmortalizada puesta en contacto aumenta o disminuye en comparación con un control.

Otro aspecto de la divulgación proporciona un equipo para usar en un método para producir una micropartícula, que comprende: (a) un medio; (b) una célula condicionalmente inmortalizada como se define en el primer aspecto; (c) opcionalmente uno o más de TGF-p, IFN-y y TNF-a; (d) la micropartícula obtenible por el método del segundo aspecto adecuada para su uso como control; (e) opcionalmente, un agente de detección adecuado para la detección específica de las micropartículas producidas; y (f) instrucciones para producir la micropartícula usando el equipo.

Otros aspectos y realizaciones de la invención y la divulgación se definen a continuación y en las reivindicaciones.

La divulgación también se relaciona con el hallazgo de que las células madre neurales contienen micropartículas que son terapéuticamente útiles. Los métodos discutidos en este documento con respecto a la producción de micropartículas a partir de células madre neurales pueden aplicarse a métodos de producción de micropartículas a partir de otros tipos de células descritos para el primer aspecto de la divulgación.

Un aspecto de la divulgación proporciona una micropartícula de células madre neurales. La micropartícula puede ser un exosoma, una microvesícula, una partícula de membrana, una vesícula de membrana, una vesícula similar a un exosoma, una vesícula similar a un ectosoma, un ectosoma o una exovesícula. Típicamente, la micropartícula es un exosoma. La micropartícula puede derivarse de una célula madre neural condicionalmente inmortalizada que ha sido cultivada en un entorno que permite la diferenciación de células madre. La micropartícula puede aislarse de células madre neurales parcialmente diferenciadas. En una realización, un entorno que permite la diferenciación de células madre es un biorreactor de múltiples compartimentos, típicamente en el que las células se cultivan durante más de siete días. La micropartícula puede derivarse de una línea de células madre neurales. En algunas realizaciones, la línea de células madre neurales puede ser la línea de células "CTX0E03", la línea de células "STR0C05", la línea de células "HPC0A07" o la línea de células madre neurales divulgada en Miljan et al., Stem Cells Dev. 2009. En algunas realizaciones, la micropartícula se deriva de una línea de células madre que no requiere suero para mantenerse en cultivo. La micropartícula puede tener un tamaño de entre 30 nm y 1000 nm, o entre 30 y 200 nm, o entre 30 y 100 nm, determinado por microscopía electrónica; y/o una densidad en sacarosa de 1.1-1.2 g/mL. La micropartícula puede comprender ARN. El ARN puede ser ARNm, miARN y/o cualquier otro ARN pequeño. La micropartícula puede comprender uno, dos, tres o cuatro de hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532. La micropartícula puede comprender uno o más lípidos, típicamente seleccionados de ceramida, colesterol, esfingomielina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilcolina. La micropartícula puede comprender una o más tetraspaninas, típicamente CD63, CD81, CD9, CD53, CD82 y/o CD37. La micropartícula puede comprender uno o más de TSG101, Alix, CD109, thy-1 y CD133. La micropartícula puede comprender al menos 10 de las proteínas presentes en la Tabla 19 o la Tabla 21. La micropartícula puede comprender al menos una actividad biológica de una célula madre neural o un medio acondicionado de células madre neurales. Al menos una actividad biológica puede ser una actividad regeneradora de tejido. La micropartícula de la divulgación típicamente se aísla o purifica.

Un aspecto adicional de la divulgación proporciona una micropartícula de células madre neurales para uso en terapia. La terapia puede ser una terapia regenerativa que requiera reemplazo, regeneración o reparación de tejido, p. ej., cuando la terapia requiera angiogénesis, neurogénesis y/o neuroprotección. La terapia puede ser para una enfermedad, trastorno o déficit neurológico. La terapia puede mejorar la recuperación funcional y/o cognitiva. La terapia puede ser de accidente cerebrovascular, enfermedad arterial periférica, neuropatía o cualquier otra enfermedad o trastorno que requiera regeneración tisular, revascularización o acción antiinflamatoria local, incluyendo:

(i) Trastorno, enfermedad o déficit neurológico, tal como enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular o ALS;

(ii) Trastornos de almacenamiento lisosomal;

(iii) Trastornos cardiovasculares, tales como infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca congestiva, enfermedad arterial periférica, úlceras diabéticas, cicatrización de heridas;

(iv) Enfermedades de los pulmones, incluidas fibrosis pulmonar idiopática, síndrome de dificultad respiratoria, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, hipertensión pulmonar idiopática, fibrosis quística y asma;

(v) Trastornos metabólicos o inflamatorios, tales como diabetes (I o II), artritis reumatoide, osteoartritis, lupus, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal o enfermedad de injerto contra huésped;

(vi) Trastornos psiquiátricos, tales como depresión, trastorno bipolar, esquizofrenia o un trastorno del síndrome autista tal como autismo, síndrome de Asperger o síndrome de Rett;

(vii) enfermedades de la retina que causan ceguera, tales como degeneración macular relacionada con la edad, enfermedad de Stargardt, retinopatía diabética, retinitis pigmentosa; y

(viii) Enfermedades desmielinizantes, tales como esclerosis múltiple, parálisis cerebral, mielinolisis pontina central, tabes dorsal, mielitis transversa, enfermedad de Devic, leucoencefalopatía multifocal progresiva, neuritis óptica, leucodistrofias, síndrome de Guillain-Barré, neuropatía periférica anti-MAG y enfermedad de Charcot-Marie-Tooth.

En una realización, la micropartícula es un exosoma y la terapia es de una enfermedad o afección que requiera reemplazo, regeneración o reparación de tejido. En otra realización, la micropartícula es una microvesícula y la terapia es de una enfermedad que requiere angiogénesis o una enfermedad, trastorno o déficit neurológico.

La terapia también puede ser una terapia profiláctica para inducir tolerancia, típicamente inmunotolerancia, en un huésped que posteriormente, concurrente o simultáneamente va a recibir las células madre de las que se deriva la micropartícula. La administración de una o más dosis de micropartículas de la divulgación a un paciente, antes o simultáneamente con la administración de una terapia con células madre, puede usarse para reducir el riesgo de una respuesta inmunitaria adversa, es decir, "rechazo", de la terapia con células madre.

Un aspecto adicional de la divulgación proporciona el uso de una micropartícula de células madre neurales en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad.

Otro aspecto de la divulgación proporciona una composición que comprende una micropartícula de células madre neurales y un excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa micrografías electrónicas de células madre neurales condicionalmente inmortalizadas CTX0E03 que producen micropartículas. Los paneles A-E muestran cuerpos multivesiculares (MVB) intracelulares que contienen exosomas de entre 30 nm y 50 nm de diámetro y el panel F muestra microvesículas >100 nm de diámetro liberadas de las células madre neurales a través de un proceso de gemación en la membrana celular.

La Figura 2 es un esquema de protocolo para la identificación, caracterización y producción de micropartículas a partir de células madre.

La Figura 3 muestra la lectura de la densidad óptica de la tira ELISA de angiogénesis humana realizada en medio acondicionado y no acondicionado con CTX0E03.

La Figura 4A muestra la cantidad de proteína (medida mediante ensayo BCA) extraída de 15 mLde medio que contiene micropartículas purificadas del sistema Integra en comparación con las condiciones de cultivo normales (3 días T175). La Figura 4B muestra la detección por FACS (a 2 pg/mL, 1:250) de (i) CD63 en exosomas de CTX0E03 cultivadas por Integra (panel superior izquierdo) y microvesículas (panel superior derecho) y (ii) CD81 en exosomas de CTX0E03 cultivadas por Integra (panel inferior izquierdo) y microvesículas (panel inferior derecho).

La Figura 5 muestra la cantidad de ARN total aislado medido a 260/280 nm extraído de 15 mL de medio que contiene micropartículas purificadas por filtración del sistema Integra en comparación con las condiciones de cultivo normales (3 días T175).

La Figura 6A muestra los resultados de un ensayo de cierre de heridas/raspado que representa la actividad de migración de fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) cultivados en medio acondicionado con CTX0E03 o tras la adición de exosomas de CTX0E03 purificadas. La Figura 6B muestra los resultados de un ensayo de raspado después de 72 horas, comparando el efecto de 10 pg de exosomas de CTX0E03 con las condiciones basales (sin exosomas). La Figura 6C muestra el % de áreas cicatrizadas para condiciones basales, 2 pg/mL de exosomas, 6 pg/mL de exosomas, 20 pg/mL de exosomas y un control positivo de LSGS (suplemento de bajo crecimiento en suero). El panel superior de la Figura 6C muestra exosomas aislados de células CTX0E03 cultivadas durante 2 semanas en el sistema Integra CELLine y el panel inferior de la Figura 6C muestra exosomas aislados de células CTX0E03 cultivadas durante 6 semanas en el sistema Integra CELLine. La Figura 6D compara las células CTX0E03 con un control negativo (solución salina) en un ensayo in vivo de cicatrización de heridas por inyección.

La Figura 7 muestra la cantidad de exosomas purificados obtenidos por medio de cultivo a partir de cultivos estándar de CTX0E03 (T175) frente al sistema Integra CELLine en el punto temporal de 3 semanas.

La Figura 8A muestra la concentración de exosomas recolectados de dos matraces diferentes después de 1 semana, 2 semanas y 3 semanas del sistema de cultivo Integra CELLine de CTX0E03. La Figura 8B muestra la concentración de exosomas recolectados de un solo matraz de Integra CELLine durante un cultivo continuo de 6 semanas de células CTX0E03.

La Figura 9 muestra el cambio en los niveles de expresión de varios marcadores de ARNm medidos en células CTX0E03 cultivadas durante 3 semanas en el sistema Integra CELLine en comparación con cultivos estándar de CTX0E03 (T175) ("control").

La Figura 10 muestra la sobre y subregulación de varios miARN en exosomas obtenidos de células CTX0E03 cultivadas durante 3 semanas en cultivo en biorreactor Integra y micropartículas obtenidas de cultivos estándar de CTX0E03 (T175), evaluados frente a un nivel de expresión inicial en células CTX0E03 en cultivo estándar (T175).

La Figura 11 representa los perfiles de miARN obtenidos a partir de la secuenciación profunda de miARN de células CTX0E03 ("CTX"), microvesículas ("MV") y exosomas ("EXO") cultivados en condiciones estándar (T175). Las Figuras 11a y 11b muestran los resultados de dos cultivos.

La Figura 12 muestra el efecto de las microvesículas de hNSC sobre la angiogénesis de las HUVEC. La Figura 12A es una fotografía que muestra el claro aumento en la formación de tubos observado cuando se añaden microvesículas (paneles a la derecha) en comparación con las HUVEC basales. Las Figuras 12B y 12C muestran el aumento en la longitud total del tubo proporcionado por las microvesículas de hNSC a varias concentraciones (0.05 |jg, 0.1 |jg, 0.3 |jg - Figura 12B; y 0.6 jg/m L - Figura 12C).

La Figura 13 muestra el efecto de las microvesículas de hNSC sobre el crecimiento de neuritas en células PC-12.

La Figura 14 es un electroferograma que muestra el perfil de contenido de ARN total en células, exosomas y microvesículas de CTX0E03 de acuerdo con lo determinado por el bioanalizador de ARN de Agilent.

La Figura 15 es una presentación esquemática del porcentaje de genes codificantes que superponen completamente el exón y los transcritos no codificantes ubicados con intrones o secuencias intergénicas (producidas ejecutando archivos BAM de NGS contra el conjunto de datos de secuencia de GENCODE).

La Figura 16 representa los miARN novedosos de primer orden transportados preferiblemente en exosomas y MV en comparación con las células productoras CTX0E03.

La Figura 17 muestra los resultados del análisis NanoSight realizado para determinar el tamaño de partícula y la concentración de exosomas de CTX0E03 (Figura 17A) y microvesículas (Figura 17B) cultivadas en el sistema Integra CELLine durante 1, 2, 3, 4, 5 y 6 semanas.

La Figura 18 muestra diagramas de Venn que comparan los datos proteómicos de exosomas y microvesículas de CTX0E03 (18A y 18B) y comparan exosomas de células madre neurales con exosomas de células madre mesenquimales (18C y 18D). La Figura 18A ilustra el número de proteínas únicas dentro de los exosomas y microvesículas de CTX0E03, aisladas del sistema de cultivo Integra de la semana 2. La Figura 18B compara los procesos biológicos asociados con las proteínas identificadas dentro de los exosomas y microvesículas de CTX0E03. La Figura 18C compara el proteoma del exosoma de células madre neurales CTX0E03 con un proteoma de exosoma de células madre mesenquimales, y la Figura 18D compara los procesos biológicos asociados con las proteínas identificadas en los exosomas derivados de MSC con los exosomas derivados de células madre neurales.

La Figura 19 muestra los 30 procesos biológicos que se asociaron con exosomas derivados de NSC y no con exosomas de células madre mesenquimales.

La Figura 20 muestra la inmortalización condicional exitosa de células CD34+. (A) es un diagrama de ciclos de qRT-PCR que muestra la presencia de ARNm de c-mycERTAM en células progenitoras CD34+ humanas infectadas con lentivirus derivadas de la sangre del cordón umbilical. (B) es una muestra de control que muestra la detección del marcador de exosoma Alix en inmunoprecipitado. (C) muestra la expresión de Alix en exosomas inmunoprecipitados de células CD34+ y cMycERTam CD34+.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento sorprendente de que las células condicionalmente inmortalizadas pueden producir ventajosamente micropartículas. Las células condicionalmente inmortalizadas pueden ser células madre. Los ejemplos muestran la producción exitosa de micropartículas por células madre neurales condicionalmente inmortalizadas y células CD34+. La inmortalización condicional proporciona un suministro constante de células clónales que producen micropartículas tales como los exosomas. Las células condicionalmente inmortalizadas son útiles como "células productoras" de micropartículas tales como exosomas, que típicamente se recolectan o aíslan de las células condicionalmente inmortalizadas.

Los presentes inventores también han identificado sorprendentemente micropartículas en células madre neurales. Estas micropartículas conservan algunas de las funciones de las células madre neurales de las que se derivan y, por lo general, son terapéuticamente útiles para los mismos tratamientos que las células madre neurales. Las micropartículas tienen ventajas sobre las células madre correspondientes porque son más pequeñas y menos complejas, por lo que son más fáciles de producir, mantener, almacenar y transportar, y tienen el potencial de evitar algunos de los problemas regulatorios que rodean a las células madre. Las micropartículas se pueden producir de forma continua, por aislamiento de medios acondicionados, p. ej., en un biorreactor tal como un biorreactor de múltiples compartimentos, que permite la producción a gran escala y la provisión de una terapia "lista para usar". El biorreactor de múltiples compartimentos es típicamente un biorreactor de dos compartimentos.

Se ha descubierto además que, sorprendentemente, el cultivo de células madre (de cualquier tipo, sin limitarse a las células madre neurales) en un entorno que permite que las células madre comiencen a diferenciarse, aumenta drásticamente el rendimiento de las micropartículas producidas.

Los inventores han observado sorprendentemente que el cultivo de células madre (de cualquier tipo, sin limitarse a las células madre neurales) en un biorreactor de múltiples compartimentos da como resultado una diferenciación parcial de las células madre en células madre en una forma más diferenciada. Esta diferenciación en cultivo no requiere la adición de un agente para inducir la diferenciación. Esta diferenciación típicamente requiere un período de cultivo de al menos una semana, al menos dos semanas o al menos tres semanas. Los cambios en las células madre que se producen en el cultivo en un biorreactor de múltiples compartimentos se reflejan en las micropartículas producidas por las células madre cultivadas. Por lo tanto, mediante el cultivo de células madre en un biorreactor de múltiples compartimentos, es posible inducir la diferenciación de las células. En consecuencia, se pueden producir micropartículas de células madre parcialmente diferenciadas mediante la recolección de micropartículas de células madre cultivadas en un biorreactor de múltiples compartimentos, típicamente durante al menos una semana, al menos dos semanas, al menos tres semanas, al menos cuatro semanas, al menos cinco semanas o al menos seis semanas. Opcionalmente, las células, p. ej., NSC, se han cultivado durante no más de diez semanas. En una realización, la divulgación proporciona un método para producir micropartículas aislando las micropartículas de células madre neurales parcialmente diferenciadas.

Los inventores también han descubierto que es posible inducir la secreción de micropartículas a partir de células madre. Este hallazgo, que tampoco se limita a las células madre neurales y puede usarse para la producción de micropartículas a partir de cualquier célula madre, permite obtener un rendimiento mejorado de micropartículas a partir de un cultivo de células madre. Se han identificado varios agentes que potencian la secreción de micropartículas en diferentes grados, lo que tiene la ventaja adicional de poder controlar la cantidad de micropartículas que se secretan. El cultivo de células madre en condiciones hipóxicas también mejora la producción de micropartículas. Además, se ha descubierto que el cocultivo de una célula madre con un tipo de célula diferente, en particular un tipo de célula endotelial, puede alterar beneficiosamente las micropartículas que produce la célula madre.

En una realización adicional, la divulgación proporciona micropartículas, típicamente exosomas, producidas por células madre libres de suero. El suero es necesario para el cultivo exitoso de muchas líneas de células, pero contiene muchos contaminantes, incluidos sus propios exosomas. Como se describe a continuación, los inventores han producido micropartículas a partir de células madre que no requieren suero para un cultivo exitoso.

Micropartículas

La invención se refiere a la producción de micropartículas a partir de células condicionalmente inmortalizadas, como se indica en la reivindicación 1.

La divulgación proporciona, en un aspecto, micropartículas que se pueden obtener a partir de una célula madre neural condicionalmente inmortalizada, una célula madre mesenquimal o una célula madre hematopoyética. Una micropartícula de células madre neurales es una micropartícula producida por una célula madre neural; una micropartícula de células madre mesenquimales es una micropartícula que es producida por una célula madre mesenquimal; una micropartícula de células madre hematopoyéticas es una micropartícula producida por una célula madre hematopoyética. Típicamente, la micropartícula es secretada por la célula madre. Más típicamente, la micropartícula es un exosoma o una microvesícula. Las micropartículas de algunas células madre (que no están condicionalmente inmortalizadas), como las células madre mesenquimales, son conocidas en la técnica.

Una "micropartícula" es una vesícula extracelular de 30 a 1000 nm de diámetro que se libera de una célula. Está limitada por una bicapa lipídica que encierra moléculas biológicas. El término "micropartícula" es conocido en la técnica y abarca varias especies diferentes de micropartículas, que incluyen una partícula de membrana, una vesícula de membrana, una microvesícula, una vesícula similar a un exosoma, un exosoma, una vesícula similar a un ectosoma, un ectosoma o una exovesícula. Los diferentes tipos de micropartículas se distinguen en función del diámetro, el origen subcelular, su densidad en sacarosa, la forma, la velocidad de sedimentación, la composición lipídica, los marcadores proteicos y el modo de secreción (es decir, siguiendo una señal (inducible) o espontáneamente (constitutiva)). Cuatro de las micropartículas comunes y sus características distintivas se describen en la Tabla 1, a continuación.

Tabla 1: Diversas micropartículas

Se cree que las micropartículas desempeñan un papel en la comunicación intercelular al actuar como vehículos entre una célula donante y receptora a través de mecanismos directos e indirectos. Los mecanismos directos incluyen la absorción de la micropartícula y sus componentes derivados de la célula donante (tales como proteínas, lípidos o ácidos nucleicos) por la célula receptora, teniendo los componentes una actividad biológica en la célula receptora. Los mecanismos indirectos incluyen la interacción microvesícula-superficie celular receptora y causar la modulación de la señalización intracelular de la célula receptora. Por lo tanto, las micropartículas pueden mediar en la adquisición de una o más propiedades derivadas de la célula donante por parte de la célula receptora. Se ha observado que, a pesar de la eficacia de las terapias con células madre en modelos animales, las células madre no parecen injertarse en el huésped. En consecuencia, el mecanismo por el cual las terapias con células madre son efectivas no está claro. Sin desear limitarse a ninguna teoría, los inventores creen que las micropartículas secretadas por las células madre neurales desempeñan un papel en la utilidad terapéutica de estas células y, por lo tanto, son terapéuticamente útiles por sí mismas.

Las micropartículas y las células, p. ej., las células madre, de la divulgación se aíslan. El término "aislado" indica que la micropartícula, población de micropartículas, célula o población celular a la que se refiere no se encuentra dentro de su medio natural. La micropartícula, la población de micropartículas, la célula o la población celular se ha separado sustancialmente del tejido circundante. En algunas realizaciones, la micropartícula, la población de micropartículas, la célula o la población celular se separa sustancialmente del tejido circundante si la muestra contiene al menos aproximadamente el 75 %, en algunas realizaciones al menos aproximadamente el 85 %, en algunas realizaciones al menos aproximadamente el 90 %, y en algunas realizaciones al menos aproximadamente 95 % de micropartículas y/o células madre. En otras palabras, la muestra se separa sustancialmente del tejido circundante si la muestra contiene menos del 25 %, en algunas realizaciones menos del 15 % y en algunas realizaciones menos del 5 % de materiales distintos de las micropartículas y/o células madre. Dichos valores porcentuales se refieren a porcentajes en peso. El término abarca células o micropartículas que se han extraído del organismo del que se originaron y existen en cultivo. El término también abarca células o micropartículas que han sido extraídas del organismo del que se originaron y posteriormente reinsertadas en un organismo. El organismo que contiene las células reinsertadas puede ser el mismo organismo del que se extrajeron las células, o puede ser un organismo diferente.

Las células madre producen naturalmente micropartículas por una variedad de mecanismos, incluyendo la gemación de la membrana plasmática (para formar vesículas de membrana y microvesículas) y como resultado de la fusión de cuerpos multivesiculares intracelulares (que contienen micropartículas) con la membrana celular y la liberación de la micropartículas en el compartimento extracelular (para secretar exosomas y vesículas similares a exosomas).

En una realización, la célula madre neural que produce las micropartículas de la divulgación puede ser una célula madre neural fetal, embrionaria o adulta, tal como se ha descrito en los documentos US5851832, US6777233, US6468794, US5753506 y WO-A-2005121318. El tejido fetal puede ser tejido de corteza fetal humana. Las células pueden seleccionarse como células madre neurales a partir de la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas (iPS), como ha sido descrito por Yuan et al., (2011) o una célula madre neural inducida directamente producida a partir de células somáticas como los fibroblastos (p. ej., mediante la inducción constitutiva de Sox2, Klf4 y c-Myc mientras se limita estrictamente la actividad de Oct4 a la fase inicial de reprogramación, como recientemente por Their et al., 2012). Las células madre embrionarias humanas pueden obtenerse mediante métodos que preservan la viabilidad del embrión donante, como se conoce en la técnica (p. ej., Klimanskaya et al., 2006, y Chung et al., 2008). Dichos métodos no destructivos para obtener células madre embrionarias humanas se pueden usar para proporcionar células madre embrionarias a partir de las cuales se pueden obtener las micropartículas de la divulgación. Alternativamente, las micropartículas de la divulgación se pueden obtener a partir de células madre adultas, células iPS o células madre neurales inducidas directamente. En consecuencia, las micropartículas de la divulgación pueden producirse mediante múltiples métodos que no requieren la destrucción de un embrión humano o el uso de un embrión humano como material de base.

Típicamente, la población celular a partir de la cual se producen las micropartículas es sustancialmente pura. El término "sustancialmente puro" como se usa en el presente documento, se refiere a una población de células que es al menos aproximadamente el 75 %, en algunas realizaciones al menos aproximadamente el 85 %, en algunas realizaciones al menos aproximadamente el 90 % y en algunas realizaciones al menos aproximadamente el 95 % puras, con respecto a otras células que componen una población total de células. Por ejemplo, con respecto a las células madre, por ejemplo poblaciones de células madre neurales, este término significa que hay al menos aproximadamente 75 %, en algunas realizaciones al menos aproximadamente 85 %, en algunas realizaciones al menos aproximadamente 90 %, y en algunas realizaciones al menos aproximadamente 95 % de células madre puras en comparación con otras células que componen una población total de células. En otras palabras, el término "sustancialmente pura" se refiere a una población de células madre de la presente divulgación que contiene menos de aproximadamente el 25 %, en algunas realizaciones menos de aproximadamente el 15 % y en algunas realizaciones menos de aproximadamente el 5 %, del linaje de células comprometidas en la población original no amplificada y aislada antes del posterior cultivo y amplificación.

Una micropartícula de célula madre, p. ej., célula madre neural, comprende al menos una bicapa lipídica que típicamente encierra un medio que comprende lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos pueden ser ácido desoxirribonucleico (ADN) y/o ácido ribonucleico (ARN). El ARN puede ser ARN mensajero (ARNm), microARN (miARN) o cualquier precursor de miARN, tal como pri-miARN, pre-miARN y/o ARN nuclear pequeño (ARNnp).

Una micropartícula de célula madre, p. ej., célula madre neural, retiene al menos una función biológica de la célula madre de la que se deriva. Las funciones biológicas que pueden conservarse incluyen la capacidad de promover la angiogénesis y/o la neurogénesis, la capacidad de efectuar una mejora cognitiva en el cerebro de un paciente que ha sufrido un accidente cerebrovascular o la capacidad de acelerar la recuperación del flujo sanguíneo en la enfermedad arterial periférica. Por ejemplo, se sabe que las células CTX0E03 inhiben la activación de las células T en un ensayo de PBMC y, en una realización, las micropartículas de la divulgación conservan esta capacidad para inhibir la activación de las células T en un ensayo de PBMC. Los ensayos de PBMC son bien conocidos por los expertos y los equipos para realizar el ensayo están disponibles comercialmente.

El Ejemplo 8, la Tabla 2 y la Figura 6 demuestran que los exosomas de células madre CTX0E03 conservan la capacidad de cerrar una herida en un modelo de cicatrización de heridas por "raspado". Los resultados de la Figura 6A muestran que la actividad de migración de fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) cultivados en medio acondicionado con CTX0E03 es casi la misma que la actividad de migración observada al agregar exosomas purificados. Por consiguiente, una función biológica que las micropartículas de la divulgación pueden conservar es la capacidad de estimular la actividad de migración de los fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF).

El Ejemplo 8 también muestra que las microvesículas de la divulgación pueden estimular la angiogénesis de HUVEC primarias y estimular el crecimiento de neuritas de células PC-12. Por consiguiente, una función biológica que las micropartículas de la divulgación pueden retener es la capacidad de estimular la angiogénesis de HUVEC primarias y/o estimular el crecimiento de neuritas de células PC-12.

El análisis proteómico del Ejemplo 13 indica que los exosomas de células madre neurales comprenden funciones biológicas asociadas con la producción, empaquetamiento, función y degradación de material genético. Por consiguiente, en una realización, los exosomas de la divulgación retienen estas funciones, típicamente una o más de la función de ARN polimerasa, la función de degradación de ARN, la función de ribosoma y la función de espliceosoma.

La micropartícula tiene un diámetro de 1000 nm o menos. Típicamente, la micropartícula de la divulgación tendrá un diámetro de 200 nm o menos, p. ej., 100 nm o menos. Como se indica en la Tabla 1 anterior, las microvesículas tienen un diámetro de 100 nm a 1000 nm. Los exosomas se definen típicamente como aquellos que tienen un diámetro de 30 a 100 nm, pero estudios más recientes confirman que los exosomas también pueden tener un diámetro entre 100 nm y 200 nm (p. ej., Katsuda et al., Proteomics 2013 y Katsuda et al., Scientific Reports 2013). En consecuencia, los exosomas suelen tener un diámetro de entre 30 nm y 150 nm. Las partículas de membrana tienen un diámetro de 50 nm a 80 nm y las partículas similares a exosomas tienen un diámetro de 20 nm - 50 nm. El diámetro puede determinarse mediante cualquier técnica adecuada, p. ej., microscopía electrónica o dispersión de luz dinámica. El término micropartícula incluye, pero no se limita a: partícula de membrana, vesícula de membrana, microvesícula, vesícula similar a exosoma, exosoma, vesícula similar a ectosoma, ectosoma o exovesícula.

Los paneles A-E de la Figura 1 muestran la presencia en células madre neurales de MVB que contienen exosomas de entre 30 - 50 nm de diámetro, mientras que el panel F muestra microvesículas > 100 nm de diámetro. La Tabla 20 y la Figura 17 (a continuación) muestran que los exosomas típicos de células madre neurales se midieron para tener un diámetro que oscilaba entre aproximadamente 70 nm y aproximadamente 150 nm, lo que es coherente con el tamaño de los exosomas (de células madre mesenquimales) descritos en la técnica. En consecuencia, los exosomas de la divulgación tienen típicamente un diámetro entre 30 nm y 200 nm, más típicamente entre 50 nm y 150 nm. Como se indicó anteriormente, los exosomas son típicamente positivos para el marcador Alix (UNIPROT acceso No. Q8WUM4).

La Figura 1F y la Tabla 20 muestran el tamaño observado de microvesículas típicas de células madre neurales, con un diámetro modal de aproximadamente 150 nm - 200 nm, o un diámetro medio de aproximadamente 180 nm - 350 nm. En consecuencia, las microvesículas de la divulgación suelen tener un diámetro entre 100 y 1000 nm, más típicamente entre 150 nm y 350 nm.

Algunas micropartículas de la divulgación expresan el marcador de superficie CD133. Otras micropartículas de la divulgación no expresan el marcador de superficie CD133.

"Marcador" se refiere a una molécula biológica cuya presencia, concentración, actividad o estado de fosforilación puede detectarse y usarse para identificar el fenotipo de una célula.

Los exosomas son micropartículas lipídicas derivadas de endosomas de un diámetro típico de 30-100 nm y, a veces, entre 100 nm y 200 nm de diámetro, que se liberan de la célula por exocitosis. La liberación de exosomas ocurre de manera constitutiva o por inducción, de manera regulada y funcionalmente relevante. Durante su biogénesis, los exosomas incorporan una amplia gama de proteínas citosólicas (incluidas las proteínas chaperonas, las integrinas, las proteínas del citoesqueleto y las tetraspaninas) y material genético. En consecuencia, los exosomas se consideran dispositivos de comunicación intercelular para la transferencia de proteínas, lípidos y material genético entre células, en el microambiente de la célula madre y a una distancia considerable. Aunque la divulgación no está sujeta a esta teoría, es posible que los exosomas sean responsables de la eficacia de las células madre neurales. Por lo tanto, se espera que los exosomas de las células madre neurales sean terapéuticamente eficaces.

Micropartículas diseñadas para tener las funciones deseadas

Las micropartículas conservan al menos algunas de las funciones de las células madre que las producen. Por lo tanto, es posible diseñar micropartículas manipulando la célula madre (que puede ser cualquier tipo de célula madre y no se limita a las células madre neurales, aunque las micropartículas de células madre neurales de la divulgación se incluyen expresamente como una realización) para poseer uno o más funciones deseadas, típicamente proteína o miARN. La manipulación será típicamente una modificación genética, para introducir una o más secuencias de ácido nucleico reguladoras, no codificantes o codificantes exógenas en la célula madre. Por ejemplo, si se desea un exosoma que contenga VEGF y/o bFGF, entonces la célula madre productora de exosomas puede transformarse o transfectarse para expresar (niveles altos de) VEGF y/o bFGF, que luego se incorporarían a las micropartículas producidas por esa célula madre. De manera similar, las células iPS se pueden usar para producir micropartículas, y estas células se pueden diseñar para producir las proteínas y los ácidos nucleicos (p. ej., miARN) que se requieren en las micropartículas producidas por las células iPS. Por lo tanto, la divulgación proporciona micropartículas ad hoc, de cualquier tipo de célula madre, que contienen una función que no está presente de forma natural en la célula madre a partir de la cual se produce, es decir, las micropartículas (p. ej., exosomas) contienen una o más secuencias exógenas de proteínas o ácido nucleico, no se producen de forma natural y están modificadas. El uso de células condicionalmente inmortalizadas proporciona ventajosamente la producción continua de estas micropartículas diseñadas.

En una realización, las micropartículas aisladas o purificadas se cargan con uno o más ácidos nucleicos, lípidos, proteínas, fármacos o profármacos exógenos que están destinados a realizar una función deseada en una célula objetivo. Esto no requiere la manipulación de la célula madre y el material exógeno opcionalmente se puede agregar directamente a las micropartículas. Por ejemplo, los ácidos nucleicos exógenos pueden introducirse en las micropartículas mediante electroporación. A continuación, las micropartículas se pueden utilizar como vehículos o portadores para el material exógeno. En una realización, las micropartículas que se han aislado de las células que las produjeron se cargan con ARNpi exógeno, típicamente mediante electroporación, para producir micropartículas que se pueden desplegar para silenciar uno o más genes patológicos. De esta forma, las micropartículas se pueden usar como vehículos para administrar uno o más agentes, típicamente agentes terapéuticos o de diagnóstico, a una célula objetivo. Un ejemplo de esto es un exosoma de células madre neurales que comprende ARNpi exógeno capaz de silenciar uno o más genes patológicos.

Marcadores de micropartículas

La divulgación proporciona una población de micropartículas de células madre neurales aisladas, en donde la población comprende esencialmente solo las micropartículas de la divulgación, es decir, la población de micropartículas es pura. En muchos aspectos, la población de micropartículas comprende al menos aproximadamente 80 % (en otros aspectos, al menos el 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 %, 99.9 % o 100 %) de las micropartículas de la divulgación.

La micropartícula de células madre neurales aislada de la divulgación se caracteriza porque tiene un perfil de expresión distintivo para ciertos marcadores y se distingue de las micropartículas de otros tipos de células. Cuando se describe un marcador en el presente documento, su presencia o ausencia puede usarse para distinguir la micropartícula. Por ejemplo, el término "puede comprender" o "puede expresar" también divulga la realización contraria en la que ese marcador no está presente, p. ej., la frase "la micropartícula puede comprender una o más tetraspaninas, típicamente CD63, CD81, CD9, CD53, CD82 y/o CD37" también describe la realización contraria en la que la micropartícula puede no comprender una o más tetraspaninas, típicamente CD63, CD81, CD9, CD53, CD82 y/o CD37.

Se considera que la micropartícula de células madre, p. ej., células madre neurales, de la divulgación porta un marcador si al menos aproximadamente el 70 % de las micropartículas de la población, p. ej., el 70 % de las partículas de membrana, vesículas de membrana, microvesículas, vesículas similares a exosomas, exosomas, vesículas similares a ectosomas, ectosomas o exovesículas muestran un nivel detectable del marcador. En otros aspectos, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 % o al menos aproximadamente el 95 % o al menos aproximadamente el 97 % o al menos aproximadamente el 98 % o más de la población muestra un nivel detectable del marcador. En ciertos aspectos, al menos aproximadamente el 99% o el 100% de la población muestra un nivel detectable de los marcadores. La cuantificación del marcador puede detectarse mediante el uso de una RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) o mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Debe apreciarse que esta lista se proporciona únicamente a modo de ejemplo y no pretende ser limitativa. Típicamente, se considera que una micropartícula de células madre neurales de la divulgación porta un marcador si al menos aproximadamente el 90 % de las micropartículas de la población muestran un nivel detectable del marcador detectado por FACS.

Se considera que los marcadores descritos en el presente documento están expresados por una célula de la población de la divulgación, si su nivel de expresión, medido por qRT-PCR, tiene un valor de punto de cruce (Cp) inferior o igual a 35 (corte estándar en un arreglo de qRT-PCR). El Cp representa el punto donde la curva de amplificación cruza el umbral de detección, y también puede informarse como umbral de cruce (ct).

En una realización, la divulgación se refiere a micropartículas producidas por una población de células madre neurales caracterizadas porque las células de la población expresan uno o más de los marcadores Nestina, Sox2, GFAP, tubulina pIII, ^dC^x, G^aLC, TUBB3, GDNF e IDO. En otra realización, la micropartícula es un exosoma y la población de exosomas expresa uno o más de DCX (doblecortina - un marcador neuronal temprano), GFAP (proteína ácida fibrilar glial - un marcador de astrocitos), Ga Lc , TUBB3, GDNF e IDO.

Las micropartículas de células madre neurales de la divulgación pueden expresar uno o más marcadores proteicos a un nivel que es menor o mayor que el nivel de expresión de ese marcador en una micropartícula de células madre mesenquimales de la misma especie. Los marcadores de proteína que son expresados por las micropartículas de células CTX0E03 se identifican en el presente documento y más adelante. En algunas realizaciones, las micropartículas pueden expresar un marcador de proteína a un nivel relativo a la tubulina a u otra u otras de tales proteínas de control. En algunas realizaciones, las micropartículas de la divulgación pueden expresar esa proteína a un nivel de al menos un cambio de /-1.2 veces en relación con la proteína de control, típicamente al menos un cambio de /-1.5 en relación con la proteína de control, al menos un cambio de /- 2 veces con respecto a la proteína de control o al menos un cambio de /-3 veces con respecto a la proteína de control. En algunas realizaciones, las micropartículas pueden expresar un marcador de proteína a un nivel de entre 10'2 y 10'6 copias por célula en relación con la tubulina a u otra proteína de control. En algunas realizaciones, las micropartículas de la divulgación pueden expresar esa proteína a un nivel de entre 10'2 y 10'3 copias por célula en relación con la tubulina a u otra proteína de control.

Las micropartículas de células madre neurales de la divulgación pueden expresar uno o más miARN (incluidos los precursores de miARN) a un nivel inferior o superior al nivel de expresión de ese miARN (incluidos los precursores de miARN) en una micropartícula de células madre mesenquimales de la misma especie. Los marcadores de miARN que son expresados por las micropartículas de células CTX0E03 se identifican a continuación. En algunas realizaciones, las micropartículas de la divulgación pueden expresar el miARN marcador a un nivel de al menos un cambio de /-1.5 veces, típicamente al menos un cambio de /- 2 veces o al menos un cambio de /- 3 veces (calculado de acuerdo con el método AAct, que es bien conocido) en relación con U6B o 15a, o cualquier otro gen de referencia de miARN, también denominado como gen de control interno.

Las micropartículas de células madre neurales de la divulgación pueden expresar uno o más ARNm a un nivel que es menor o mayor que el nivel de expresión de ese ARNm en una micropartícula de células madre mesenquimales de la misma especie. En algunas realizaciones, las micropartículas de la divulgación pueden expresar el ARNm marcador a un nivel de al menos un cambio de /- 1.5 veces, típicamente al menos un cambio de /- 2 veces o al menos un cambio de /- 3 veces (calculado de acuerdo con el método AAct) relativo a ATP5B o YWHAZ, o cualquier otro gen de referencia, también denominado gen de control interno.

Los exosomas de la divulgación expresan típicamente integrinas específicas, tetraspaninas, antígenos del MHC de clase I y/o clase II, antígenos de CD y moléculas de adhesión celular en sus superficies, lo que puede facilitar su absorción por tipos de células específicos. Los exosomas contienen una variedad de proteínas del citoesqueleto, GTPasas, clatrina, chaperonas y enzimas metabólicas (pero se excluyen las proteínas mitocondriales, lisosomales y del ER, por lo que el perfil general no se parece al citoplasma). También contienen factores de traducción y empalme de ARNm. Finalmente, los exosomas generalmente contienen varias proteínas tales como HSP70, HSP90 y anexinas que se sabe que desempeñan funciones de señalización pero que no son secretadas por los mecanismos clásicos (ER-Golgi).

La bicapa lipídica de un exosoma suele estar enriquecida con colesterol, esfingomielina y ceramida. Los exosomas también expresan una o más proteínas marcadoras de tetraspanina. Las tetraspaninas incluyen CD81, CD63, CD9, CD53, CD82 y CD37. Los exosomas también pueden incluir factores de crecimiento, citocinas y ARN, en particular miARN. Los exosomas suelen expresar uno o más de los marcadores TSG101, Alix, CD109, thy-1 y CD133. Alix (Uniprot acceso No. Q8WUM4), TSG101 (Uniprot acceso No. Q99816) y las proteínas de tetraspanina CD81 (Uniprot acceso No. P60033) y CD9 (Uniprot acceso No. P21926) son marcadores de exosomas característicos.

Alix es un marcador de vía endosomal. Los exosomas se derivan de endosomas y, en consecuencia, una micropartícula positiva para este marcador se caracteriza como un exosoma. Los exosomas de la divulgación son típicamente positivos para Alix. Las microvesículas de la divulgación son típicamente negativas para Alix.

Proteoma de micropartículas

Las Tablas 18 y 20 enumeran todas las proteínas detectadas por espectrometría de masas en exosomas y microvesículas, respectivamente, aisladas de células CTX0E03 cultivadas durante dos semanas en un biorreactor de múltiples compartimentos Integra CELLine. En una realización, los exosomas de la divulgación comprenden al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 % o al menos el 99.5 % de las proteínas enumeradas en la Tabla 18. De manera similar, las microvesículas de la divulgación típicamente comprenden al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 % o al menos el 99.5 % de las proteínas enumeradas en la Tabla 20. En una realización adicional, el proteoma de una microvesícula o exosoma de la divulgación es al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 % o al menos 99.5 % idéntico al proteoma proporcionado en Tabla 18 (exosoma) o Tabla 20 (microvesícula). Cuando se determina el contenido de proteínas de una micropartícula o un exosoma, típicamente se utiliza la espectrometría de masas, p. ej., el método de LC/MS/MS descrito en el Ejemplo 13.

Las tablas 19 y 21 muestran las 100 proteínas más abundantes detectadas por espectrometría de masas en exosomas y microvesículas, respectivamente, aisladas de células CTX0E03 cultivadas durante dos semanas en un biorreactor múltiples compartimentos Integra CELLine. Típicamente, un exosoma de la divulgación comprende las diez primeras proteínas enumeradas en la Tabla 19, más típicamente las primeras 20, las primeras 30, las primeras 40 o las primeras 50 proteínas enumeradas en la Tabla 19. De manera similar, una micropartícula de la divulgación típicamente comprende las primeras diez proteínas enumeradas en la Tabla 21, más típicamente las primeras 20, las primeras 30, las primeras 40 o las primeras 50 proteínas enumeradas en la Tabla 21. En una realización, un exosoma de la divulgación comprende las 100 proteínas enumeradas en la Tabla 19. En una realización, una microvesícula de la divulgación comprende las 100 proteínas enumeradas en la Tabla 21. Típicamente, las 100 proteínas más abundantes en un exosoma o microvesícula de la divulgación contienen al menos 70 de las proteínas identificadas en la Tabla 19 (exosoma) o la Tabla 21 (micropartícula). Más típicamente, las 100 proteínas más abundantes en un exosoma o microvesícula de la divulgación contienen al menos 80, al menos 90, al menos 95, 96, 97, 98 o 99, o las 100 proteínas identificadas en la Tabla 19 (exosoma) o Tabla 21 (micropartícula).

Contenido de micropartículas de miARN

El ejemplo 12 (y la Figura 11 relacionada) muestra los resultados de la secuenciación profunda de miARN presente en células CTX0E03, microvesículas y exosomas producidos por estas células. Este ejemplo muestra que, sorprendentemente, el número de especies de miARN diferentes presentes en las micropartículas se reduce en gran medida en comparación con el número de especies de miARN diferentes presentes en las células; las micropartículas contienen menos de 120 miARN diferentes, mientras que las células contienen entre 450 y 700 especies de miARN. Las micropartículas contienen una mayoría de hsa-miR-1246.

Los datos del Ejemplo 12 también muestran que las micropartículas se caracterizan por cuatro especies principales de miARN, a saber, hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532. Estos cuatro miARN son los únicos miARN presentes en un recuento superior a 1000 en las micropartículas; estos cuatro miARN están presentes en exceso masivo en comparación con los otros miARN en las micropartículas. Esto contrasta con el perfil de las células, que contienen una cantidad mucho mayor de miARN presentes en niveles altos (recuento superior a 1000) o muy altos (recuento superior a 10000). Aunque no están sujetos a la teoría, los inventores proponen que hsa-miR-1246, hsamiR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532 se trafican selectivamente (o bien se incorporan) en las micropartículas y se cree que desempeñan un papel en la función de las micropartículas.

Típicamente, en una realización, las micropartículas, p. ej., los exosomas, de la divulgación contienen uno, dos, tres o los cuatro hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532. Cada uno de estos marcadores de miARN típicamente están presente en un recuento (determinado opcionalmente usando la técnica de secuencia profunda descrita en el Ejemplo 12) de al menos 1000 por micropartícula. hsa-miR-1246 puede tener opcionalmente un recuento de al menos 2000, 5000, 10,000, 20,000 o 25,000 por micropartícula. Hsa-miR-4492 puede tener opcionalmente un recuento de al menos 2000, 3000, 4000 o 5000 por micropartícula. Hsa-miR-4532 puede tener opcionalmente un recuento de al menos 2000 o 3000 por micropartícula.

En una realización, cada hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y/o hsa-miR-4532 está presente en la micropartícula, p. ej., exosoma, en un recuento más alto que el presente en la célula que produjo la micropartícula. En particular, miR-1246 típicamente tiene un recuento en la micropartícula de al menos el doble del recuento en la célula, más típicamente al menos 4, 5, 6, 7 u 8 veces el recuento en la célula y, opcionalmente, 10, 15 o 20 veces el recuento en la célula.

En una realización, las micropartículas de la divulgación contienen hsa-let-7a-5p, has-miR-92b-3p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-92a-3p, hsa-miR-10a-5p, hsa-100-5p y/o hsa-99b-5p a un recuento más bajo que el presente en la célula que produjo la micropartícula. Típicamente, cada uno de estos miARN tiene un recuento de menos de 1000 en las micropartículas de la divulgación, más típicamente menos de 100, por ejemplo menos de 50. Opcionalmente, las micropartículas de la divulgación contienen hsa-let-7a-5p con un recuento inferior a 50 o inferior a 25.

En una realización, las micropartículas de la divulgación contienen menos de 150 tipos de miARN (es decir, diferentes especies de miARN) cuando se analizan mediante secuenciación profunda, típicamente menos de 120 tipos de miARN.

En una realización, hsa-miR-1246 es el miARN más abundante en las micropartículas de la divulgación (determinado opcionalmente usando la técnica de secuencia profunda descrita en el Ejemplo 12). Típicamente, al menos el 40 % del recuento total de miARN en micropartículas (p. ej., microvesículas y exosomas) de la divulgación es hsa-miR-1246. Típicamente, al menos el 50 % del recuento total de miARN en los exosomas de la divulgación es hsa-miR-1246.

hsa-miR-4492 es típicamente el segundo miARN más abundante en las micropartículas de la divulgación. Típicamente, al menos el 3 % del recuento total de miARN en micropartículas (p. ej., microvesículas y exosomas) de la divulgación es hsa-miR-4492. Más típicamente, al menos el 4 % del recuento total de miARN en micropartículas (p. ej., microvesículas y exosomas) de la divulgación es hsa-miR-4492.

Típicamente, al menos el 2 % del recuento total de miARN en micropartículas (p. ej., microvesículas y exosomas) de la divulgación es hsa-miR-4532.

Típicamente, al menos el 1 % del recuento total de miARN en micropartículas (p. ej., microvesículas y exosomas) de la divulgación es hsa-miR-4488.

En una realización, las micropartículas de la divulgación contienen uno o ambos hsa-miR-4508, hsa-miR-4516 a un nivel de al menos el 0.1 % del contenido total de miARN de la partícula.

Uno o más de hsa-miR-3676-5p, hsa-miR-4485, hsa-miR-4497, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-3195, hsa-miR-3648, hsamiR-663b, hsa-miR-3656, hsa-miR-3687, hsa-miR-4466, hsa-miR-4792, hsa-miR-99b-5p y hsa-miR-1973 pueden estar presentes en las micropartículas de la divulgación.

Típicamente, cada uno de hsa-let-7a-5p y hsa-100-5p está presente en menos del 1 %, más típicamente menos del 0.1 % o menos del 0.05 % del recuento total de miARN en las micropartículas de la divulgación.

En un exosoma típico de la divulgación, al menos el 50 % del recuento total de miARN es hsa-miR-1246 y menos del 0.1 % del recuento total de miARN es hsa-let-7a-5p.

En una realización, al menos el 90 % del recuento total de miARN en micropartículas de la divulgación comprende hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532. Típicamente, al menos el 95 % o el 96 % del recuento total de miARN en las micropartículas de la divulgación comprende hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532. Menos del 10 % del contenido total de miARN de estas micropartículas es un miARN que no es hsamiR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 ni hsa-miR-4532.

Se proporcionan combinaciones de las realizaciones de miARN discutidas anteriormente. Por ejemplo, una micropartícula de la divulgación típicamente contiene hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532 en un recuento de al menos 1000 y contiene cada uno de hsa-let-7a-5p, hsa-miR-92b-3p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-92a-3p, hsa-miR-10a-5p, hsa-100-5p y hsa-99b-5p en un recuento inferior a 100. Típicamente, al menos el 90 % o al menos el 95 % del miARN total en estas micropartículas es hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532.

Una micropartícula (p. ej., microvesícula o exosoma) de la divulgación típicamente tiene hsa-miR-1246 como el miARN más abundante y hsa-miR-4492 es el segundo miARN más abundante. En esta realización, al menos el 40 % del recuento total de miARN en micropartículas (p. ej., microvesículas y exosomas) de la divulgación es hsa-miR-1246 y al menos el 3 % del recuento total de miARN en la micropartícula es hsa-miR-4492. Al menos el 2 % del recuento total de miARN en estas micropartículas es hsa-miR-4532 y al menos el 1 % del recuento total de miARN en estas micropartículas es hsa-miR-4488. Cada uno de hsa-let-7a-5p y hsa-100-5p está presente en menos del 0.1 % del recuento total de miARN en estas micropartículas.

La representación gráfica de los resultados de la secuenciación profunda en los exosomas y las microvesículas como cambio relativo en comparación con las células confirma que hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532 están significativamente sobrerregulados en los exosomas y microvesículas en comparación con las células. Esta comparación también muestra que el miARN hsa-miR-3195 es el miARN más sobrerregulado, tanto en exosomas como en microvesículas. Aunque las lecturas absolutas de hsa-miR-3195 están en el intervalo de

- 40 para exosomas y microvesículas, no se detecta hsa-miR-3195 en las células. En consecuencia, hsa-miR-3195 se encuentra únicamente en los exosomas y microvesículas de la divulgación y, en una realización, un exosoma o microvesícula de la divulgación comprende hsa-miR-3195.

En una realización, las micropartículas de la divulgación comprenden uno o más de los siguientes precursores de miARN:

AC079949.1 (SEQ ID NO: 738) GGCCGCGCCCCGTTTCCCAGGACAAAGGGCACTCCGCACCGGACCCTGGTCCC AGCG;

AP000318.1 (SEQ ID NO: 739) CCCACTCCCTGGCGCCGCTTGTGGAGGGCCCAAGTCCTTCTGATTGAGGCCC AACCCGTGGAAG;

AL161626.1 (SEQ ID NO: 740) CGCCGGGACCGGGGTCCGGGGCGGAGTGCCCTTCCTCCTGGGAAACGGGGT GCGGC;

AC004943.1 (SEQ ID NO: 741)

GCTTCACGTCCCCACCGGCGGCGGCGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGCGGCGGCGGTGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCG GCTC;

y

AL121897.1 (SEQ ID NO: 742)

GCCGCCCCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCCGCTTTCGGCTCGGGCCTCAGGTGAGTCGGAG GGGCCGGGCGCC

En una realización, las micropartículas de la divulgación comprenden uno, dos o tres de los siguientes miARN maduros derivados de los precursores enumerados anteriormente (como se detalla en la parte D del Ejemplo 12):

ggcggagugcccuucuuccugg (derivado de AL161626.1-201) (SEQ ID NO: 743)

gggagggcccaaguccuucugau (derivado de AP000318.1-201) (SEQ ID NO: 744)

gaccaggguccggugcggagug (derivado de AC079949.1-201) (SEQ ID NO: 745)

Estos 5 precursores de miARN y 3 miARN maduros no se han aislado previamente y, por lo tanto, cada secuencia también se proporciona como una nueva secuencia en sí misma. Por consiguiente, en un aspecto, la divulgación proporciona una composición que comprende uno o más de los precursores de miARN AC079949.1, AP000318.1, AL161626.1, AC004943.1 y AL121897.1. En otra realización, la divulgación proporciona una composición que comprende uno o más de los miARN maduros ggcggagugcccuucuuccugg (derivado de AL161626.1-201), ggagggcccaaguccuucugau (derivado de AP000318.1-201) y gaccaggguccggugcggagug (derivado de AC079949.1-201). Opcionalmente, la composición es una composición farmacéutica que comprende uno o más de los precursores de miARN y/o uno o más de los miARN maduros y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Como se indica en el Ejemplo 12, estos miARN y precursores parecen ser transportados selectivamente a los exosomas y microvesículas y, por lo tanto, pueden ser al menos parcialmente responsables de la función de las micropartículas.

El ejemplo 12 también muestra que las micropartículas de células madre neurales comprenden una variedad de especies de ARN no codificantes. En una realización, las micropartículas de la divulgación comprenden uno o más de a Rn ribosómico, ARN nucleolar pequeño, ARN nuclear pequeño, microARN, ARN no codificante intergénico grande y otros ARN misceláneos (p. ej., RMRP, ARN de bóveda, s Rp de metazoario y/o RNY).

El ejemplo 4 muestra los miARN presentes en las micropartículas producidas por las células CTX0E03 y que tienen un Cp por debajo de 35 de acuerdo con lo determinado por una matriz de qRT-PCR. Típicamente, en una realización, las micropartículas de la divulgación contienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 o más, o todos, de los siguientes miARN (identificados de acuerdo con su nombre de acuerdo con Ambros et al., y accesible en www.mirbase.org):

En una realización, las micropartículas de CTX0E03 contienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 o más de los siguientes miARN (que se seleccionan de la lista anterior):

Proteínas detectadas por transferencia de puntos

El Ejemplo 5 muestra las proteínas presentes en las micropartículas producidas por las células CTX0E03, detectadas mediante transferencia de puntos. Típicamente, las micropartículas de la divulgación contienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o todas las siguientes proteínas:

La Galectina-3 y la Trombospondina-1 también se identifican como presentes en exosomas y microvesículas en el Ejemplo 13. TIMP-1 se identifica en el Ejemplo 13 como presente en los exosomas.

El ejemplo 5 también muestra que las micropartículas producidas por las células CTX0E03 también pueden expresar 1, 2, 3, 4 o 5 de las siguientes proteínas:

EGF-R y Csk también se identifican como presentes en exosomas y microvesículas en el Ejemplo 13.

Se sabe que Galectina-3, SPARC, TIMP-1, Trombospondina-1, VEGF, MDC y Endostatina modulan la angiogénesis. Por consiguiente, las micropartículas que contienen una o más de estas proteínas son útiles en el tratamiento de enfermedades o trastornos que requieren la modulación de la angiogénesis.

Se sabe que IL-1a, LECT2, MCP-1 y Csk modulan la inflamación. En consecuencia, las micropartículas que contienen una o más de estas proteínas son útiles en el tratamiento de enfermedades o trastornos que requieren la modulación de la inflamación.

Las micropartículas que contienen uno o más de (i) Galectina-3, SPARC, TIMP-1, Trombospondina-1, VEGF, MDC y Endostatina, y uno o más de (ii) IL-1a, LECT2, MCP-1 y Csk, pueden ser útiles para tratar enfermedades o trastornos que requieren la modulación de la angiogénesis y la inflamación.

Células madre neurales en cultivo de biorreactor de múltiples compartimentos

Como se muestra en el Ejemplo 10 y la Figura 9 a continuación, después de un cultivo en biorreactor de múltiples compartimentos durante tres semanas, las células madre neurales expresan una serie de marcadores a niveles significativamente más altos que las células madre neurales cultivadas de acuerdo con el procedimiento estándar en un matraz T175 de un solo compartimento estándar. En una realización, las micropartículas de la divulgación se aíslan de NSC que se han cultivado, típicamente en un biorreactor de múltiples compartimentos, durante al menos dos semanas, típicamente al menos tres semanas, al menos cuatro semanas, al menos cinco semanas o al menos seis semanas. Opcionalmente, las NSC se han cultivado durante no más de diez semanas, p. ej., entre 2 y 10 semanas, entre 3 y 10 semanas, entre 4 y 10 semanas, entre 5 y 10 semanas o entre 6 y 10 semanas. Las micropartículas también pueden aislarse de los otros tipos de células descritos en el presente documento, incluidas las células madre mesenquimales y las células madre hematopoyéticas, que se han cultivado durante estos períodos en un biorreactor.

Las células madre neurales CTX0E03 cultivadas durante tres semanas en un biorreactor de múltiples compartimentos expresan DCX, GALC, GFAP, TUBB3, GDNF e IDO a un nivel más alto que las células madre neurales cultivadas en un cultivo de células T175 de un solo compartimento estándar. En consecuencia, las células madre neurales que han sido cultivadas en un biorreactor de múltiples compartimentos, típicamente durante una semana o más, diez días o más, dos semanas o más, o al menos tres semanas, cuatro semanas, cinco semanas o más, pueden expresar uno o más de DCX, GALC, GFAP, TUBB3, GDNF e IDO. Las células cultivadas en un biorreactor de dos compartimentos suelen mostrar una mayor expresión de uno o más de DCX, GALC, GFAP, TUBB3, GDNF e IDO en comparación con las células madre cultivadas en condiciones estándar. El nivel de expresión de estos marcadores en las células cultivadas en biorreactores de múltiples compartimentos suele ser significativamente mayor que en las células cultivadas en un matraz de cultivo T175 estándar de un solo compartimento. Por lo general, una célula madre cultivada en un biorreactor de múltiples compartimentos expresa uno o más de DCX1, GALC, GFAP, TUBB3, GDNF o IDO a un nivel al menos 2 veces superior al de las células CTX0E03 cultivadas en un matraz T-175 de acuerdo con el procedimiento estándar de cultivo. En una realización, se obtienen micropartículas, típicamente exosomas, a partir de células madre neurales que muestran una mayor expresión de uno o más de DCX, GALC, GFAP, TUBB3, GDNF e IDO en comparación con las células madre cultivadas en condiciones estándar. Por ejemplo, las micropartículas se pueden obtener a partir de un medio acondicionado recién filtrado recogido de células madre neurales cultivadas en el biorreactor Integra CeLLine.

Los marcadores sobrerregulados incluyen DCX (doblecortina- un marcador neuronal temprano), GFAP (proteína ácida fibrilar glial - un marcador de astrocitos), GALC, TUBB3, GDNF e IDO. Las células CTX0E03 son capaces de diferenciarse en 3 tipos de células diferentes: neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Los altos niveles de DCX y GFAP después de tres semanas en un biorreactor de múltiples compartimentos indican que las células madre cultivadas se han diferenciado parcialmente y han entrado en el linaje neuronal (células DCX+) y/o astrocítico (células GFAP+). Por consiguiente, en una realización, la divulgación proporciona una micropartícula producida por una población de células madre neurales que expresa (i) uno o más marcadores asociados con un linaje neuronal, típicamente DCX y/o (ii) uno o más marcadores asociados con un linaje astrocítico, típicamente GFAP. En otra realización, la divulgación proporciona micropartículas de células madre neurales, típicamente exosomas, que expresan (i) uno o más marcadores asociados con un linaje neuronal, típicamente DCX y/o (ii) uno o más marcadores asociados con un linaje astrocítico, típicamente GFAP. Estas células, o las micropartículas (típicamente exosomas) derivadas de estas células, expresan DCX y/o GFAP a un nivel más alto que las células madre correspondientes en cultivo estándar (T-175). Típicamente, estas células o micropartículas expresan DCX y/o GFAP a un nivel de al menos 2 veces más que las células madre, más típicamente al menos 2.5 veces más que las células madre correspondientes en cultivo estándar, al menos 5 veces más que las células madre correspondientes en cultivo estándar, al menos 7.5 veces más que las células madre correspondientes en cultivo estándar o al menos 10 veces más que las células madre correspondientes en cultivo estándar. Para la expresión de DCX, el cambio de veces en las células o micropartículas en comparación con las células madre correspondientes en cultivo estándar (T-175) puede ser opcionalmente de al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 500 veces o al menos 1000 veces más que las células madre estándar.

Al término "biorreactor" se le debe dar su significado habitual en la técnica, es decir, un aparato utilizado para llevar a cabo un bioproceso. Los biorreactores descritos en el presente documento son adecuados para su uso en cultivos celulares, p. ej., cultivo de células madre. Los biorreactores simples para el cultivo celular son matraces de un solo compartimento, tales como el matraz T-175 de uso común (p. ej., el matraz de cultivo de células BD FalconMC de 175 cm2, 750 mL, poliestireno tratado para cultivo de tejidos, cuello recto, tapón de rosca azul con cierre hermético, código de producto BD 353028). Los biorreactores pueden tener múltiples compartimentos, como se sabe en la técnica. Estos biorreactores de múltiples compartimentos típicamente contienen al menos dos compartimentos separados por una o más membranas o barreras que separan el compartimento que contiene las células de uno o más compartimentos que contienen gas y/o medio de cultivo. Los biorreactores de múltiples compartimentos son bien conocidos en la técnica. Un ejemplo de biorreactor de múltiples compartimentos es el biorreactor Integra CeLLine, que contiene un compartimento de medio y un compartimento de células separados por medio de una membrana semipermeable de 10 kDa; esta membrana permite una difusión continua de nutrientes en el compartimento celular con una eliminación simultánea de cualquier producto de desecho inhibidor. La accesibilidad individual de los compartimentos permite suministrar células con medio fresco sin interferir mecánicamente con el cultivo. Una membrana de silicona forma la base del compartimento celular y proporciona un suministro de oxígeno óptimo y un control de los niveles de dióxido de carbono al proporcionar una vía de difusión corta al compartimento celular. Puede usarse cualquier biorreactor de múltiples compartimentos de acuerdo con la invención. El Ejemplo 11, la Tabla 3 y la Figura 10 muestran que el contenido de miARN de los exosomas producidos por células madre neurales que se han cultivado en un biorreactor de múltiples compartimentos durante tres semanas es diferente del contenido de miARN de las células madre cultivadas en matraces estándar T-175 y de micropartículas producidas por las células madre neurales cultivadas en un matraz de cultivo T175 de un solo compartimento durante tres semanas. En una realización, la divulgación proporciona una micropartícula, típicamente un exosoma, en la que al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete miARN están sobre o subregulados en comparación con las células madre correspondientes cultivadas en matraces estándar T-175, como se calcula mediante la regulación del número de veces (véase el Ejemplo 11). La regulación del número de veces de cada miARN es opcionalmente al menos dos veces hacia arriba o hacia abajo.

Puede verse en la Figura 6C y el Ejemplo 8 que los exosomas aislados de las NSC muestran una eficacia particularmente sorprendente cuando las NSC se han cultivado durante varias semanas. En consecuencia, en una realización, los exosomas de la divulgación se aíslan de las NSC que se han cultivado, típicamente en un biorreactor de múltiples compartimentos, durante al menos dos semanas, típicamente al menos tres semanas, al menos cuatro semanas, al menos cinco semanas o al menos seis semanas. Opcionalmente, las NSC se han cultivado durante no más de diez semanas, p. ej., entre 2 y 10 semanas, entre 3 y 10 semanas, entre 4 y 10 semanas, entre 5 y 10 semanas o entre 6 y 10 semanas.

En una realización, los exosomas de células madre neurales de la divulgación expresan uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete de los siguientes miARN a un nivel más alto que el expresado en las células madre correspondientes cultivadas en matraces estándar T-175, como el calculado por la regulación del número de veces (donde un asterisco indica un miARN donde se prefiere al menos un aumento de regulación de dos veces):

En una realización, los exosomas de células madre neurales de la divulgación expresan uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de los siguientes miARN a un nivel más bajo que el expresado en las células madre correspondientes cultivadas en matraces estándar T-175, de acuerdo con lo calculado por la regulación del número de veces (donde un asterisco indica un miARN en el que se prefiere una disminución de regulación de al menos dos veces):

hsa-miR-7*

En una realización adicional, los exosomas de NSC de la divulgación comprenden (i) un nivel aumentado de al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete de los miARN indicados anteriormente como aumentados en exosomas en comparación con las células correspondientes en un cultivo estándar y (ii) un nivel disminuido de al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más o más de los miARN indicados anteriormente como disminuidos en exosomas en comparación con las células correspondientes en cultivo estándar. Por ejemplo, un exosoma de células madre neurales puede contener un aumento del numero de veces que se regula en tres o más de los miARN indicados anteriormente como aumentados en los exosomas en comparación con las células correspondientes en un cultivo estándar y una disminución del numero de veces que se regula en tres o más de los miARN indicados anteriormente como disminución en exosomas en comparación con las células correspondientes en cultivo estándar. En otro ejemplo de realización, un exosoma de células madre neurales puede contener un aumento del número de veces que se regula en cinco o más de los miARN indicados anteriormente como aumento en los exosomas en comparación con las células correspondientes en un cultivo estándar y una disminución de la regulación en cinco o más de los miARN indicados anteriormente como disminuidos en exosomas en comparación con las células correspondientes en cultivo estándar.

El término "expresado" se usa para describir la presencia de un marcador dentro de una célula o micropartícula. Para que se considere que se expresa, un marcador debe estar presente en un nivel detectable. Por "nivel detectable" se entiende que el marcador puede detectarse utilizando una de las metodologías de laboratorio estándar, tales como qRT-PCR, o qPCR, transferencia, espectrometría de masas o análisis de FACS. Se considera que un gen está expresado por una célula o micropartícula de la población de la divulgación si la expresión puede detectarse razonablemente en valores de punto de cruce (cp) inferiores o iguales a 35. Los términos "expresar" y "expresión" tienen significados correspondientes. En un nivel de expresión por debajo de este valor de cp, se considera que un marcador no está expresado. La comparación entre el nivel de expresión de un marcador en una célula madre o micropartícula de la divulgación y el nivel de expresión del mismo marcador en otra célula o micropartícula, como por ejemplo una célula madre mesenquimal, puede realizarse preferiblemente comparando los dos tipos de células/micropartículas que han sido aisladas de la misma especie. Preferiblemente, esta especie es un mamífero y, más preferiblemente, esta especie es un ser humano. Tal comparación puede realizarse convenientemente utilizando un experimento de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR).

Tal como se usa en el presente documento, el término "expresión significativa" o sus términos equivalentes "positivo" y "+" cuando se usan con respecto a un marcador se entenderá que, en una población de células o micropartículas, más del 20 %, preferiblemente más del, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o incluso la totalidad de las células de las células/micropartículas expresan dicho marcador.

Como se usa en el presente documento, "negativo" o "-" como se usa con respecto a los marcadores significará que, en una población de células o micropartículas, menos del 20 %, 10 %, preferiblemente menos del 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o ninguna de las células/micropartículas expresa dicho marcador.

La expresión de marcadores de superficie de micropartículas puede determinarse, p. ej., mediante citometría de flujo y/o FACS para un marcador de superficie celular específico utilizando métodos y aparatos convencionales (p. ej., un sistema de FACS Beckman Coulter Epics XL utilizado con anticuerpos disponibles comercialmente y protocolos estándar conocidos en la técnica) para determinar si la señal de un marcador de superficie de micropartículas específico es mayor que una señal de fondo. La señal de fondo se define como la intensidad de la señal generada por un anticuerpo no específico del mismo isotipo que el anticuerpo específico utilizado para detectar cada marcador de superficie. Para que un marcador se considere positivo, la señal específica observada suele ser superior al 20 %, preferiblemente superior al 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 500 %, 1000 %, 5000%, 10000% o superior, mayor en relación con la intensidad de la señal de fondo. Los métodos alternativos para analizar la expresión de marcadores de superficie de micropartículas de interés incluyen análisis visual por microscopía electrónica usando anticuerpos contra marcadores de superficie celular de interés.

La "clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS)" es un método de purificación de células basado en el uso de anticuerpos marcados con fluorescencia. Los anticuerpos se dirigen a un marcador en la superficie celular y, por lo tanto, se unen a las células de interés. A continuación, las células se separan basándose en el pico de emisión fluorescente de las células.

Los marcadores de micropartículas (incluidas las proteínas de superficie e intracelulares) también se pueden analizar mediante diversos métodos conocidos por los expertos en la materia para analizar la expresión de proteínas, incluidos, entre otros, electroforesis en gel seguida de transferencia Western con anticuerpos adecuados, inmunoprecipitación seguida de análisis electroforético y/o microscopía electrónica como se describió anteriormente, con permeabilización de micropartículas para marcadores entre partículas. Por ejemplo, la expresión de una o más tetraspaninas puede ensayarse usando uno o más de los métodos anteriores o cualquier otro método conocido por los expertos en la técnica. Los niveles de ARN también se pueden analizar para evaluar la expresión del marcador, p. ej., qRT-PCR.

Función de las micropartículas

Como se señaló anteriormente, una micropartícula de células madre conserva al menos una función biológica de la célula madre de la que se deriva. Las funciones biológicas que pueden conservarse incluyen la capacidad de promover la angiogénesis, la regeneración de tejidos, la reparación de tejidos y/o la neurogénesis, la capacidad de lograr una mejora cognitiva en el cerebro de un paciente que ha sufrido un accidente cerebrovascular o la capacidad de acelerar la recuperación del flujo sanguíneo en la enfermedad arterial periférica.

Por ejemplo, se sabe que las células CTX0E03 inhiben la activación de las células T en un ensayo de PBMC y, en una realización, las micropartículas de la divulgación conservan esta capacidad para inhibir la activación de las células T en un ensayo de PBMC. Los ensayos de PBMC son bien conocidos por los expertos y los equipos para realizar el ensayo están disponibles comercialmente.

El Ejemplo 8, la Tabla 2 y la Figura 6 demuestran que los exosomas de células madre CTX0E03 conservan la capacidad de cerrar una herida en un modelo de cicatrización de heridas por "raspado". Los resultados muestran que la actividad de migración de fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) cultivados en medios acondicionados con CTX0E03 es casi la misma que la actividad de migración observada al agregar exosomas purificados. Por consiguiente, una función biológica que pueden conservar las micropartículas de la divulgación es la capacidad de estimular la actividad de migración de los fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF). Los ensayos de migración de NHDF son conocidos en la técnica. La estimulación de la migración de NHDF se puede determinar utilizando un ensayo de raspado in vitro (cierre de la herida), p. ej., el ensayo del Ejemplo 8(A). El cierre de la herida se calcula como el área cubierta por las células NHDF en relación con el área inicial de la herida determinada a las 0 horas. La estimulación de la migración de NHDF en este ensayo se define típicamente como un aumento en el cierre de la herida, típicamente un cierre de la herida al menos 1.2 veces mayor, más típicamente al menos 1.5 veces mayor, que el cierre de la herida en condiciones basales (sin las micropartículas) después de 24 horas . Después de 48 horas, el cierre de la herida suele ser al menos 1.2 veces mayor o 1.5 veces mayor, más típicamente al menos 2 veces mayor, que el cierre de la herida en condiciones basales (sin las micropartículas). La estimulación de la migración de NHDF también puede definirse como la causa de un cierre de la herida del 100 %, de acuerdo con lo determinado por el ensayo de raspado, al menos 24 horas antes de que se observe el cierre del 100 % de la herida en condiciones basales.

El Ejemplo 8 también muestra que las microvesículas de la divulgación pueden estimular la angiogénesis de las HUVEC primarias y estimular el crecimiento de neuritas de células PC-12. Por consiguiente, una función biológica que las micropartículas de la divulgación pueden retener es la capacidad de estimular la angiogénesis de HUVEC primarias y/o estimular el crecimiento de neuritas de células PC-12. Los ensayos de angiogénesis y crecimiento de neuritas son conocidos en la técnica. La estimulación de la angiogénesis de las HUVEC primarias puede determinarse usando un ensayo de angiogénesis de 24 horas usando un micro portaobjetos ibidi y detección y análisis Wimtube de la longitud del tubo y los puntos de bifurcación, p. ej., el ensayo del Ejemplo 8 (B). La estimulación de la angiogénesis en este ensayo se define típicamente como un aumento en comparación con la angiogénesis basal, por ejemplo >100 % de angiogénesis basal, típicamente al menos 110 %, al menos 120 % o al menos 140 % de angiogénesis basal (es decir, al menos 1.1 veces, al menos 1.2 veces o al menos 1.4 veces el nivel basal de angiogénesis). La estimulación del crecimiento de neuritas puede determinarse detectando el crecimiento de células PC-12 a través de un inserto de 1 |jm, p. ej., el ensayo del Ejemplo 8(C). La estimulación del crecimiento de neuritas en este ensayo generalmente se define como un aumento en el crecimiento de neuritas en comparación con las condiciones basales (sin micropartículas), o un aumento en el crecimiento de neuritas cuando la micropartícula se combina con NGF en comparación con la adición de NGF solo, de acuerdo con lo cuantificado por un espectrofotómetro.

inmunogenicidad

Las micropartículas de células madre neurales (alogénicas) de la divulgación típicamente no desencadenan una respuesta inmunitaria in vitro o in vivo o desencadenan una respuesta inmunitaria que es sustancialmente más débil que la que se esperaría que se desencadenara tras la inyección de una población de células madre alogénicas en un paciente. En ciertos aspectos de la divulgación, se considera que las micropartículas de células madre neurales no desencadenan una respuesta inmunitaria si al menos aproximadamente el 70 % de las micropartículas no desencadenan una respuesta inmunitaria. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 % o al menos aproximadamente el 95 %, el 99 % o más de las micropartículas no desencadenan una respuesta inmunitaria. Preferiblemente, las micropartículas de la divulgación no desencadenan una respuesta inmunitaria mediada por anticuerpos o no desencadenan una respuesta inmunitaria humoral. Más preferiblemente, las micropartículas de la divulgación no desencadenan una respuesta mediada por anticuerpos ni una respuesta inmunitaria humoral in vitro. Aún más preferiblemente, las micropartículas de la divulgación no desencadenan una respuesta inmunitaria mixta de linfocitos. Un experto en la técnica entenderá que la capacidad de las células de la divulgación para desencadenar una respuesta inmunitaria puede probarse de diversas formas.

Se ha demostrado previamente que las células CTX0E03 trasplantadas en un modelo de roedor con isquemia de extremidades tienen una sobrerregulación más rápida y transitoria de los genes del huésped implicados en la angiogénesis, tal como CCL11, CCL2, CXCL1, CXCL5, IGF1, IL1p, IL6, HGF, HIF1a, bFGF, VEGFA y VEGFC, en comparación con controles tratados con vehículo. El tratamiento con hNSC eleva transitoriamente las respuestas inmunitarias y angiogénicas innatas del huésped y acelera la regeneración de tejidos.

Se ha demostrado previamente que la línea de células CTX0E03, utilizando un ensayo con PBMC humanas, no es inmunogénica. En consecuencia, también se espera que las micropartículas producidas por las células CTX0E03 no sean inmunogénicas. La falta de inmunogenicidad permite que las micropartículas eviten la eliminación por parte del sistema inmunitario del huésped/paciente y, por lo tanto, ejerzan su efecto terapéutico sin una respuesta inmunitaria e inflamatoria perjudicial.

Células madre

La célula madre que produce la micropartícula puede ser una línea de células madre, es decir, un cultivo de células madre que se dividen de forma estable. Una línea de células madre se puede cultivar en grandes cantidades utilizando una única fuente definida. La inmortalización puede surgir de un evento espontáneo o puede lograrse introduciendo información genética exógena en la célula madre que codifica factores de inmortalización, dando como resultado un crecimiento celular ilimitado de la célula madre en condiciones de cultivo adecuadas. Dichos factores genéticos exógenos pueden incluir el gen "myc", que codifica el factor de transcripción Myc. La información genética exógena puede introducirse en la célula madre a través de una variedad de medios adecuados, tales como transfección o transducción. Para la transducción, se puede usar un vehículo viral modificado genéticamente, tal como uno derivado de retrovirus, p. ej., lentivirus.

Se proporcionan ventajas adicionales mediante el uso de una línea de células madre condicionalmente inmortalizadas, en la que la expresión del factor de inmortalización puede regularse sin afectar negativamente a la producción de micropartículas terapéuticamente eficaces. Esto se puede lograr introduciendo un factor de inmortalización que es inactivo a menos que se suministre a la célula un agente activador. Tal factor de inmortalización puede ser un gen tal como c-mycER. El producto génico c-MycER es una proteína de fusión que comprende una variante de c-Myc fusionada con el dominio de unión al ligando de un receptor de estrógeno mutante. C-MycER solo impulsa la proliferación celular en presencia del esteroide sintético 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT) (Littlewood et al., 1995). Este enfoque permite la expansión controlada de, p. ej., células madre neurales in vitro, evitando al mismo tiempo efectos in vivo no deseados sobre la proliferación de células huésped (p. ej., formación de tumores) debido a la presencia de c-Myc o al gen que la codifica en micropartículas derivadas de la línea de células madre neurales. Una célula madre neural adecuada condicionalmente inmortalizada con c-mycER se describe en la patente de los Estados Unidos No.

7416888. Por lo tanto, el uso de una línea de células madre neurales condicionalmente inmortalizadas proporciona una mejora sobre el aislamiento y la producción de micropartículas de células madre existentes. En la técnica se conocen otros métodos de inmortalización condicional.

Las líneas de células condicionalmente inmortalizadas preferidas incluyen las líneas de células madre neurales CTX0E03, STR0C05 y HPC0A07, que se han depositado en la Colección Europea de Cultivos Animales (ECACC), laboratorios de Investigación y Producción de Vacunas, Servicios de Laboratorio de Salud Pública, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP40JG, con acceso No. 04091601 (CTX0E03); acceso No. 04110301 (STR0C05); y acceso No.

04092302 (HPC0A07). La derivación y procedencia de estas células se describe en el documento EP1645626 B1. Las ventajas de estas células son retenidas por micropartículas producidas por estas células.

Las células de la línea de células CTX0E03 pueden cultivarse en las siguientes condiciones de cultivo:

• Albúmina de suero humano al 0.03%

• Transferrina, humana 5 pg/mL

• Dihidrocloruro de putrescina 16.2 pg/mL

• Insulina humana recombinante 5 pg/mL

• Progesterona 60 ng/mL

• L-Glutamina 2 mM

• Selenito de sodio (selenio) 40 ng/mL.

Factor Plus de crecimiento de fibroblastos básico (10 ng/mL), factor de crecimiento epidérmico (20 ng/mL) y 4-hidroxitamoxifeno 100 nM para expansión celular. Las células pueden diferenciarse mediante la eliminación del 4-hidroxitamoxifeno. Por lo general, las células se pueden cultivar al 5 % de CO2/37 °C o bajo condiciones hipóxicas de 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % de O2. Estas líneas de células no requieren suero para ser cultivadas con éxito. El suero es necesario para el cultivo exitoso de muchas líneas de células, pero contiene muchos contaminantes, incluidos sus propios exosomas. Una ventaja adicional de las líneas de células madre neurales CTX0E03, STR0C05 o HPC0A07, o cualquier otra línea de células que no requiera suero, es que se evita la contaminación por suero.

Las células de la línea de células CTX0E03 (y las micropartículas derivadas de estas células) son células multipotentes derivadas originalmente de la corteza fetal humana de 12 semanas. El aislamiento, la fabricación y los protocolos para la línea de células CTX0E03 son descritos en detalle por Sinden, et al., (patente de los Estados Unidos No. 7,416,888 y el documento EP1645626 B1). Las células CTX0E03 no son "células madre embrionarias", es decir, no son células pluripotentes derivadas de la masa celular interna de un blastocisto; el aislamiento de las células originales no resultó

Las células CTX0E03 (y las micropartículas derivadas de estas células) son angiogénicas y, por lo tanto, son útiles en el tratamiento de enfermedades que requieren angiogénesis, tales como la enfermedad arterial periférica. Las células (y las micropartículas derivadas de estas células) también son neurogénicas y, por lo tanto, son útiles en el tratamiento de enfermedades que requieren neurogénesis, tal como el cerebro dañado por isquemia (accidente cerebrovascular). CTX0E03 es una línea de células clonal que contiene una sola copia del transgén c-mycER que se administró por infección retroviral y está condicionalmente regulada por 4-OHT (4-hidroxitamoxifeno). El transgén C-mycER expresa una proteína de fusión que estimula la proliferación celular en presencia de 4-OHT y, por lo tanto, permite una expansión controlada cuando se cultiva en presencia de 4-OHT. Esta línea de células es clonal, se expande rápidamente en cultivo (tiempo de duplicación 50-60 horas) y tiene un cariotipo humano normal (46 XY). Es genéticamente estable y se puede cultivar en grandes cantidades. Las células son seguras y no tumorigénicas. En ausencia de factores de crecimiento y 4-OHT, las células sufren una detención del crecimiento y se diferencian en neuronas y astrocitos. Una vez implantadas en un cerebro dañado por isquemia, estas células migran solo a áreas de tejido dañado.

El desarrollo de la línea de células CTX0E03 ha permitido ampliar la escala de un producto consistente para uso clínico. La producción de células a partir de materiales almacenados permite la generación de células en cantidades para aplicaciones comerciales (Hodges et al., 2007).

Pollock et al., 2006 describe que el trasplante de CTX0E03 en un modelo de accidente cerebrovascular en rata (MCAo) provocó mejoras estadísticamente significativas tanto en la función sensoriomotora como en la asimetría motora gruesa a las 6-12 semanas después del injerto. Estos datos indican que CTX0E03 tiene las características biológicas y de fabricación apropiadas necesarias para el desarrollo como línea de células terapéutica.

Stevanato et al., 2009 confirma que las células CTX0E03 subregularon la expresión del transgén c-mycERTAM tanto in vitro después de la retirada de EGF, bFGF y 4-OHT como in vivo después de la implantación en cerebro de rata MCAo. El silenciamiento del transgén c-mycERTAM in vivo proporciona una característica de seguridad adicional de las células CTX0E03 para una posible aplicación clínica.

Smith et al., 2012 describe la prueba de eficacia preclínica de CTX0E03 en un modelo de rata de accidente cerebrovascular (oclusión transitoria de la arteria cerebral media). Los resultados indican que los implantes de CTX0E03 recuperan sólidamente la disfunción conductual durante un período de 3 meses y que este efecto es específico de su sitio de implantación. La topología de la lesión es potencialmente un factor importante en la recuperación, con un accidente cerebrovascular confinado al cuerpo estriado que muestra un mejor resultado en comparación con un área más grande de daño.

Las líneas de células madre neurales de la retina (p. ej., como se describe en el documento US 7514259) también se pueden utilizar de acuerdo con la divulgación.

El término "medio de cultivo" o "medio" se reconoce en la técnica y se refiere generalmente a cualquier sustancia o preparación utilizada para el cultivo de células vivas. El término "medio", como se usa en referencia a un cultivo celular, incluye los componentes del entorno que rodea a las células. Los medios pueden ser sólidos, líquidos, gaseosos o una mezcla de fases y materiales. Los medios incluyen medios de crecimiento líquidos así como medios líquidos que no sustentan el crecimiento celular. Los medios también incluyen medios gelatinosos tales como matrices de agar, agarosa, gelatina y colágeno. Los ejemplos de medios gaseosos incluyen la fase gaseosa a la que se exponen las células que crecen en una placa de Petri u otro soporte sólido o semisólido. El término "medio" también se refiere a material destinado a ser utilizado en un cultivo celular, incluso si aún no se ha puesto en contacto con las células. En otras palabras, un líquido rico en nutrientes preparado para cultivo bacteriano es un medio. De manera similar, una mezcla de polvo que cuando se mezcla con agua u otro líquido se vuelve adecuada para el cultivo celular puede denominarse "medio en polvo". "Medio definido" se refiere a medios que están hechos de componentes químicamente definidos (generalmente purificados). Los "medios definidos" no contienen extractos biológicos mal caracterizados, tales como el extracto de levadura y el caldo de res. "Medio rico" incluye medios que están diseñados para soportar el crecimiento de la mayoría o todas las formas viables de una especie particular. Los medios enriquecidos suelen incluir extractos biológicos complejos. Un "medio adecuado para el crecimiento de un cultivo de alta densidad" es cualquier medio que permita que un cultivo celular alcance una DO600 de 3 o más cuando otras condiciones (como la temperatura y la tasa de transferencia de oxígeno) permitan dicho crecimiento. El término "medio basal" se refiere a un medio que promueve el crecimiento de muchos tipos de microorganismos que no requieren suplementos nutricionales especiales. La mayoría de los medios basales generalmente comprenden cuatro grupos químicos básicos: aminoácidos, carbohidratos, sales inorgánicas y vitaminas. Un medio basal sirve generalmente como base para un medio más complejo, al que se añaden suplementos como suero, tampones, factores de crecimiento, lípidos y similares. En un aspecto, el medio de crecimiento puede ser un medio complejo con los factores de crecimiento necesarios para soportar el crecimiento y la expansión de las células de la divulgación mientras se mantiene su capacidad de autorrenovación. Los ejemplos de medios basales incluyen, pero no se limitan a, medio basal de Eagle, medio esencial mínimo, medio de Eagle modificado de Dulbecco, medio 199, mezclas nutrientes F-10 de Ham y F-12 de Ham, 5A de McCoy, MEM/F-I 2 de Dulbecco, RPMI 1640, y el medio de Dulbecco modificado de Iscove (Im Dm ).

Composiciones farmacéuticas

La micropartícula de células madre de la divulgación es útil en terapia y, por lo tanto, puede formularse como una composición farmacéutica. Una composición farmacéuticamente aceptable típicamente incluye al menos un portador, diluyente, vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable además de las micropartículas de la divulgación. Un ejemplo de un vehículo adecuado es la solución de lactato de Ringer. Una discusión detallada de tales componentes se proporciona en Genaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy vigésima edición, ISBN: 0683306472.

La frase "farmacéuticamente aceptable" se emplea en el presente documento para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance del buen juicio médico, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin una excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una proporción razonable de beneficio/riesgo.

La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes tamponadores del pH. El portador puede comprender medios de almacenamiento tales como Hypothermosol®, comercialmente disponible a través de BioLife Solutions Inc., EE.UU. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por EW Martin. Dichas composiciones contendrán una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de una micropartícula profiláctica o terapéutica preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehículo para proporcionar la forma adecuada para la administración al sujeto. La formulación debe adaptarse al modo de administración. En una realización preferida, las composiciones farmacéuticas son estériles y se encuentran en una forma adecuada para su administración a un sujeto, preferiblemente un sujeto animal, más preferiblemente un sujeto mamífero y lo más preferiblemente un sujeto humano.

La composición farmacéutica de la divulgación puede estar en una variedad de formas. Estas incluyen, p. ej., formas de dosificación semisólidas y líquidas, tales como preparaciones liofilizadas, soluciones o suspensiones líquidas, soluciones inyectables e infusibles. La composición farmacéutica es preferiblemente inyectable. Una ventaja particular de las micropartículas de la divulgación es su robustez mejorada en comparación con las células madre de las que se obtienen; por lo tanto, las micropartículas pueden someterse a una formulación, tal como la liofilización, que no sería adecuada para las células madre.

Se prefiere que los métodos, medicamentos y composiciones de la divulgación se usen para tratar o reparar tejido dañado y/o para el tratamiento, modulación, profilaxis y/o mejora de uno o más síntomas asociados con trastornos tisulares. Particularmente preferido es el uso de los métodos, medicamentos, composiciones y micropartículas de la divulgación en la terapia regenerativa, típicamente el tratamiento del accidente cerebrovascular, enfermedad arterial periférica o enfermedades de la retina que causan ceguera.

Las composiciones farmacéuticas estarán generalmente en forma acuosa. Las composiciones pueden incluir un conservante y/o un antioxidante.

Para controlar la tonicidad, la composición farmacéutica puede comprender una sal fisiológica, tal como una sal de sodio. Se prefiere el cloruro de sodio (NaCl), que puede estar presente entre 1 y 20 mg/mL. Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro de potasio, dihidrogenofosfato de potasio, fosfato disódico deshidratado, cloruro de magnesio y cloruro de calcio.

Las composiciones pueden incluir uno o más tampones. Los tampones típicos incluyen: un tampón de fosfato; un tampón Tris; un tampón de borato; un tampón de succinato; un tampón de histidina; o un tampón de citrato. Los tampones típicamente se incluirán en una concentración en el intervalo de 5-20 mM. El pH de una composición estará generalmente entre 5 y 8, y más típicamente entre 6 y 8, p. ej., entre 6.5 y 7.5, o entre 7.0 y 7.8.

La composición es preferiblemente estéril. La composición es preferiblemente libre de gluten. La composición es preferiblemente no pirógena.

En una realización típica, las micropartículas se suspenden en una composición que comprende ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico (Trolox®), Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cl-, H2PO4", H^ePES, lactobionato, sacarosa, manitol, glucosa, dextrano-40, adenosina y glutatión. Típicamente, la composición no incluirá un disolvente aprótico dipolar, p. ej., DMSO. Las composiciones adecuadas están disponibles comercialmente, p. ej., HypoThermasol®-FRS. Tales composiciones son ventajosas ya que permiten que las micropartículas se almacenen entre 4 °C y 25 °C durante períodos prolongados (de horas a días) o se conserven a temperaturas criotérmicas, es decir, temperaturas por debajo de -20 °C. Las micropartículas pueden entonces administrarse en esta composición después de la descongelación.

La composición farmacéutica se puede administrar por cualquier vía apropiada, lo que resultará evidente para el experto en la materia dependiendo de la enfermedad o afección a tratar. Las rutas típicas de administración incluyen intravenosa, intraarterial, intramuscular, subcutánea, intracraneal, intranasal o intraperitoneal. Para el tratamiento de un trastorno del cerebro, una opción es administrar las micropartículas intracerebralmente, típicamente en el sitio del daño o la enfermedad.

Las micropartículas se administrarán a una dosis terapéutica o profilácticamente eficaz, que será evidente para el experto en la materia. Debido a la baja o inexistente inmunogenicidad de las micropartículas, es posible administrar dosis repetidas sin inducir una respuesta inmunitaria deletérea.

Usos terapéuticos

Las micropartículas de la divulgación son útiles en el tratamiento o profilaxis de enfermedades. Por consiguiente, la divulgación incluye un método para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno en un paciente usando una micropartícula de la divulgación. El término "paciente" incluye sujetos humanos y otros mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o terapéutico.

Como se indicó anteriormente, las composiciones que comprenden miARN de la divulgación también son útiles en estas terapias y, por lo tanto, las referencias a usos terapéuticos de micropartículas en el presente documento se aplican igualmente a las composiciones que comprenden miARN.

Las micropartículas terapéuticamente útiles de la divulgación tienen actividad regenerativa. Una micropartícula que tiene actividad regenerativa es una micropartícula que es capaz de activar o mejorar los procesos regenerativos, o de inhibir o reducir los procesos degenerativos. Los procesos regenerativos conducen a la renovación, restauración, reparación y/o crecimiento de células y tejidos. Los procesos degenerativos conducen a una pérdida de la integridad y/o función de las células o tejidos. Esto puede ser particularmente útil en el tratamiento de células o tejidos dañados o alterados, como los resultantes de un accidente cerebrovascular, trastornos psiquiátricos, infarto de miocardio, esclerosis lateral amiotrófica y enfermedad arterial periférica.

Las micropartículas de la divulgación son útiles en la regeneración de tejidos. La "regeneración de tejidos" es el proceso de aumentar el número de células en un tejido después de un trauma. El trauma puede ser cualquier cosa que haga que el número de células disminuya. Por ejemplo, un accidente, un trastorno autoinmune o un estado de enfermedad podrían constituir un trauma. La regeneración tisular aumenta el número de células dentro del tejido y permite restablecer las conexiones entre las células del tejido y recuperar la funcionalidad del tejido.

La terapia puede ser una terapia regenerativa que requiera reemplazo, regeneración o reparación de tejidos. La terapia puede ser para una enfermedad, trastorno o déficit neurológico. La terapia puede mejorar la recuperación funcional y/o cognitiva. La terapia puede ser de accidente cerebrovascular, enfermedad arterial periférica, neuropatía o cualquier otra enfermedad o trastorno que requiera regeneración tisular, revascularización o acción antiinflamatoria local, incluyendo:

(i) Trastorno, enfermedad o déficit neurológico, tal como la enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular o ALS;

(ii) Trastornos de almacenamiento lisosomal;

(iv) Enfermedades de los pulmones, incluidas la fibrosis pulmonar idiopática, síndrome de dificultad respiratoria, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, hipertensión pulmonar idiopática, fibrosis quística y asma;

En una realización, las micropartículas y las composiciones que las contienen no se utilizan para la inmunomodulación. En una realización, la terapia no está relacionada con la inmunomodulación.

La divulgación también proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección que comprende administrar una cantidad eficaz de la micropartícula de la divulgación, tratando o previniendo así la enfermedad. Típicamente, la enfermedad o afección es como se identificó anteriormente.

Las micropartículas de la divulgación pueden usarse para tratar las mismas enfermedades que las células madre de las que se obtienen. Se sabe que las células madre neurales son útiles en el tratamiento de enfermedades que incluyen: accidente cerebrovascular, daño cerebral tal como déficit motor, sensorial y/o cognitivo, trastornos psiquiátricos, infarto de miocardio, esclerosis lateral amiotrófica, isquemia de las extremidades, enfermedad arterial periférica. En consecuencia, las micropartículas de la divulgación también son útiles en el tratamiento de accidentes cerebrovasculares, daño cerebral tal como déficit motor, sensorial y/o cognitivo, trastornos psiquiátricos, infarto de miocardio, esclerosis lateral amiotrófica, isquemia de las extremidades, enfermedad arterial periférica.

La Figura 6 y el Ejemplo 8 demuestran que los exosomas obtenidos a partir de células madre neurales estimulan la cicatrización de heridas. Por consiguiente, en una realización, los exosomas de la divulgación se usan para tratar una enfermedad o afección que requiere reemplazo, regeneración o reparación de tejidos. Tales condiciones incluyen úlceras diabéticas y cicatrización de heridas. La Figura 6C muestra que los exosomas aislados de NSC cultivadas durante 6 semanas son más eficaces que los exosomas aislados de NSC cultivadas durante 2 semanas. Por consiguiente, en una realización, los exosomas aislados de NSC (típicamente células CTX0E03) que se han cultivado (típicamente en un biorreactor de múltiples compartimentos) durante al menos 2 semanas, más típicamente al menos 4 semanas o al menos 6 semanas, se usan para tratar una enfermedad o afección que requiere reemplazo, regeneración o reparación de tejidos. Opcionalmente, las NSC se han cultivado durante no más de diez semanas, p. ej., entre 2 y 10 semanas, entre 3 y 10 semanas, entre 4 y 10 semanas, entre 5 y 10 semanas o entre 6 y 10 semanas.

El aumento de la eficacia observado de los exosomas aislados de NSC (células CTX0E03) que se han cultivado (en un biorreactor de múltiples compartimentos) durante 6 semanas se correlaciona con la reducción observada en el tamaño de los exosomas a alrededor de 70 nm de diámetro, que también ocurrió después de cultivar las células durante 6 semanas. En consecuencia, en una realización, los exosomas aislados de NSC (típicamente células CTX0E03) que se han cultivado (típicamente en un biorreactor de múltiples compartimentos) durante al menos 6 semanas se usan para tratar una enfermedad o afección que requiere reemplazo, regeneración o reparación de tejidos. Como se señaló anteriormente, opcionalmente las NSC se han cultivado durante no más de diez semanas, p. ej., entre 6 y 10 semanas. En otra realización, los exosomas aislados de NSC (típicamente células CTX0E03) que tienen un diámetro inferior a 100 nm, típicamente inferior a 80 nm, p. ej., alrededor de 70 nm de diámetro, se usan para tratar una enfermedad o afección que requiere reemplazo, regeneración o reparación de tejido.

Como se muestra en la Figura 12 y se comenta en el Ejemplo 8, las microvesículas obtenidas a partir de células madre neurales estimulan la angiogénesis. Por consiguiente, en una realización, las microvesículas de la divulgación se utilizan para tratar una enfermedad o afección que requiere angiogénesis, típicamente una enfermedad o trastorno que se trata mediante regeneración y/o revascularización de tejido. Las microvesículas de la divulgación se pueden usar en el tratamiento de trastornos cardiovasculares, tales como infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca congestiva, enfermedad arterial periférica, úlceras diabéticas y cicatrización de heridas. La estimulación de la angiogénesis también es terapéuticamente útil en el tratamiento de la isquemia, en particular la isquemia cardiaca y la isquemia de las extremidades. La Figura 12 muestra que las microvesículas recolectadas de NSC cultivadas durante al menos 3 semanas son más eficaces que las microvesículas aisladas de NSC cultivadas durante 1 o 2 semanas. Por consiguiente, en una realización, las microvesículas aisladas de NSC (típicamente células CTX0E03) que se han cultivado (típicamente en un biorreactor de múltiples compartimentos) durante al menos 3 semanas, más típicamente al menos 4 semanas o al menos 6 semanas, se usan para tratar una enfermedad o afección que requiere angiogénesis. Opcionalmente, las NSC se han cultivado durante no más de diez semanas, p. ej., entre 3 y 10 semanas, entre 4 y 10 semanas, entre 5 y 10 semanas o entre 6 y 10 semanas.

Como se muestra en la Figura 13 y se analiza en el Ejemplo 8, las microvesículas obtenidas a partir de células madre neurales estimulan el crecimiento de neuritas. Por consiguiente, en una realización, las microvesículas de la divulgación se usan para tratar una enfermedad, trastorno o déficit neurológico, tal como la enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular, neuropatía o ALS.

En las aplicaciones profilácticas, las composiciones farmacéuticas o los medicamentos se administran a un paciente susceptible o en riesgo de padecer una enfermedad particular en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo o retrasar la aparición de la enfermedad. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones o medicamentos se administran a un paciente que se sospecha o que ya padece dicha enfermedad en una cantidad suficiente para curar, o al menos detener parcialmente, los síntomas de la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para conseguir esto se define como una dosis terapéutica o farmacéuticamente eficaz. Tanto en los regímenes profilácticos como terapéuticos, los agentes se administran típicamente en varias dosis hasta que se logra una respuesta suficiente. Por lo general, se monitorea la respuesta y se administran dosis repetidas si la respuesta comienza a desvanecerse.

Las micropartículas de la divulgación pueden combinarse opcionalmente con una célula madre para proporcionar una terapia de combinación. La célula madre es opcionalmente la célula madre de la que se deriva la micropartícula, p. ej., si la micropartícula es un exosoma de una célula CTX0E03, entonces la célula madre para uso en terapia combinada puede ser una célula CTX0E03. Opcionalmente, una célula madre y una micropartícula pueden (i) administrarse juntas en una única composición farmacéutica, (ii) administrarse al mismo tiempo o simultáneamente pero por separado, o (iii) administrarse por separado y secuencialmente, p. ej., una célula madre seguida de una micropartícula, o micropartícula seguida de célula madre. Cuando la célula madre y la micropartícula se administran por separado y secuencialmente, la duración entre la administración de la célula y la micropartícula puede ser de una hora, un día, una semana, dos semanas o más.

En una realización, una terapia profiláctica induce tolerancia, típicamente inmunotolerancia, en un huésped que va a recibir las células madre de las que se deriva la micropartícula. En una realización, la administración de una o más dosis de micropartículas de la divulgación a un paciente, antes de la administración de una terapia con células madre, puede usarse para reducir el riesgo de una respuesta inmunitaria adversa, es decir, "rechazo", de la terapia con células madre. En otra realización, la tolerancia a las células madre se puede aumentar mediante la administración de células madre junto con micropartículas de la divulgación, como se discutió anteriormente.

Las dosis efectivas de las composiciones de la presente divulgación, para el tratamiento de las condiciones descritas anteriormente, varían dependiendo de muchos factores diferentes, que incluyen la forma de administración, el sitio objetivo, el estado fisiológico del paciente, si el paciente es humano o animal, otros medicamentos administrados, y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Por lo general, el paciente es un ser humano.

Se ha demostrado que la línea de células CTX0E03 es eficaz en el tratamiento de accidentes cerebrovasculares, enfermedades arteriales periféricas, daño cerebral como déficit motor, sensorial y/o cognitivo y trastornos psiquiátricos. Las células se están probando actualmente en un ensayo clínico para el tratamiento de pacientes discapacitados con accidente cerebrovascular (Clinicaltrials.gov Identificador: NCT01151124). El documento WO-A-2012/004611 describe el uso de las células CTX0E03 en el tratamiento de trastornos psiquiátricos que incluyen depresión unipolar y bipolar, esquizofrenia, trastorno obsesivo compulsivo, autismo y trastornos del síndrome autista. En consecuencia, las micropartículas producidas por las células CTX0E03 también pueden tratar el accidente cerebrovascular, la enfermedad arterial periférica, las enfermedades de la retina que causan ceguera (tales como la retinitis pigmentosa), el daño cerebral como el déficit motor, sensorial y/o cognitivo y los trastornos psiquiátricos.

Como se usa en este documento, los términos "tratar", "tratamiento", "que trata" y "terapia" cuando se usan directamente en referencia a un paciente o sujeto se entenderán como la mejora de uno o más síntomas asociados con un trastorno, o la prevención o profilaxis de un trastorno o uno o más síntomas asociados con un trastorno. Los trastornos a tratar incluyen, pero no se limitan a, un trastorno degenerativo, un trastorno que implica la destrucción de tejido, un trastorno neoplásico, un trastorno inflamatorio, una enfermedad autoinmune o una enfermedad inmunológicamente mediada que incluye el rechazo de órganos y tejidos trasplantados. La mejora o prevención de los síntomas resulta de la administración de las micropartículas de la divulgación, o de una composición farmacéutica que comprende estas micropartículas, a un sujeto que necesita dicho tratamiento.

Seguimiento de células y micropartículas administradas in vivo

La presente divulgación proporciona un perfil de marcador distinto para micropartículas producidas por células madre neurales. Por lo tanto, es posible detectar la presencia de estas micropartículas in vivo, analizando una muestra obtenida de un paciente y determinando si el perfil del marcador en la muestra coincide con el de las micropartículas. Si el perfil de la muestra coincide con el perfil de las micropartículas descritas en el presente documento, entonces esto confirma la presencia de las micropartículas. Esto se puede usar para detectar no solo la presencia y/o biodistribución de las propias micropartículas, sino también la presencia de células madre que producen las micropartículas. Esto es particularmente útil cuando se detecta si una célula madre administrada in vivo se ha injertado en el tejido huésped y/o ha migrado, p. ej., en estudios de ADME(T).

La detección de las micropartículas in vivo se puede usar para controlar el curso de un tratamiento en el que se administran micropartículas o células madre a un paciente. Determinar la presencia, ausencia o cantidad de micropartículas o células productoras de micropartículas de la divulgación en un paciente permite modificar el régimen de dosificación en consecuencia, p. ej., para aumentar o disminuir la dosis según sea necesario para proporcionar una cantidad eficaz de micropartículas o células madre in vivo.

Métodos de producción de micropartículas

Las micropartículas se aíslan de medios acondicionados con células, típicamente medios acondicionados con células madre. El "medio acondicionado" (CM) puede ser un medio de cultivo para células madre, que se ha utilizado para cultivar un cultivo masivo de células madre durante al menos aproximadamente 12 horas, al menos aproximadamente 24 horas, al menos aproximadamente 48 horas o al menos aproximadamente 72 horas, típicamente hasta 168 horas (7 días), retirado y esterilizado por cualquier medio adecuado, preferiblemente por filtración, antes de su uso, si es necesario.

Alternativamente, las micropartículas se pueden recolectar de un biorreactor de dos compartimentos que permite que el cultivo celular y, por lo tanto, los medios acondicionados se mantengan durante períodos de tiempo más prolongados, p. ej., al menos 2 semanas, al menos 3 semanas, al menos 4 semanas, al menos 5 semanas, al menos 6 semanas o más. El sistema mantiene las células y las micropartículas secretadas dentro de un pequeño compartimento celular (aproximadamente 15 mL) que está separado de un depósito de medio más grande por una membrana semipermeable de 10 kDa. Esto permite la eliminación eficiente de los productos de desecho metabólicos mientras mantiene de manera efectiva una densidad celular extremadamente alta para maximizar la producción de micropartículas. El ejemplo 9 y las Figuras 7 y 8 demuestran que el uso de un biorreactor de dos compartimentos da como resultado un rendimiento de micropartículas mucho mayor que el que se obtiene cuando se usa un matraz de cultivo celular estándar (matraz T175).

Las micropartículas se pueden separar de otros componentes del medio en función del peso molecular, tamaño, forma, radio hidrodinámico, composición, carga, interacción sustrato-ligando, absorbancia o dispersión de ondas electromagnéticas o actividad biológica. En una realización, los medios acondicionados se filtran usando un filtro de tamaño apropiado para separar las micropartículas deseadas, p. ej., un filtro de corte de peso molecular de 100 K. Opcionalmente, el medio acondicionado con células madre se concentra antes del aislamiento de las micropartículas sometiendo el medio acondicionado con NSC concentrado a cromatografía de exclusión por tamaño. A continuación, las fracciones absorbentes de UV se pueden seleccionar para el aislamiento de las micropartículas de interés.

Se pueden aislar diferentes micropartículas de los medios utilizando diferentes técnicas y parámetros de aislamiento. Por ejemplo, los exosomas tienen una densidad de vesículas de 1.13 - 1.19 g/mL y se pueden aislar mediante centrifugación diferencial y ultracentrifugación en gradiente de sacarosa a razón de 100,000 - 200,000 g. Las microvesículas se pueden aislar por filtración (100 K de corte de peso molecular) y centrifugación diferencial a 18,000 -20,000 g. Las partículas de membrana tienen una densidad de 1.04-01.07 g/mL y las vesículas similares a exosomas tienen una densidad de 1.1 g/mL.

Un método de producción típico comprende: cultivar células madre para producir medios acondicionados; eliminar los desechos celulares por centrifugación a 1500 rpm; aislar las microvesículas (<1000 kDa) por ultrafiltración a través de un filtro de corte de peso molecular de 100 K o aislar los exosomas (30 - 100 nm) por ultracentrifugación a razón de 120,000 g; seguido de la cuantificación utilizando un ensayo de proteína BCA.

Células madre condicionalmente inmortalizadas como células productoras de micropartículas

En un aspecto de la invención, se utilizan células madre condicionalmente inmortalizadas para producir micropartículas tales como microvesículas y/o exosomas. La inmortalización condicional proporciona un suministro constante de células clonales que producen micropartículas como los exosomas. Estas células madre condicionalmente inmortalizadas se seleccionan de: una célula madre mesenquimal, opcionalmente seleccionada de una célula madre derivada de médula ósea, una célula regenerativa endometrial, una célula progenitora mesenquimal o una célula progenitora adulta multipotente; una célula madre hematopoyética, opcionalmente una célula CD34+ y/o aislada de sangre de cordón umbilical, u opcionalmente una célula CD34+/CXCR4+; una célula madre de sangre de cordón umbilical no hematopoyética; una célula madre embrionaria muy pequeña (VSEL); una célula madre pluripotente inducida (iPS); un fibroblasto; o una célula dendrítica.

La célula condicionalmente inmortalizada de la invención puede ser, p. ej., una célula madre hematopoyética o una célula madre mesenquimal. La célula madre condicionalmente inmortalizada puede ser una célula CD34+. Por lo tanto, se proporciona un método para producir micropartículas de células madre, que comprende las etapas de cultivar las células madre condicionalmente inmortalizadas y recolectar las micropartículas que son producidas por las células. La inmortalización condicional de células madre es conocida en la técnica, como se describió anteriormente; en una realización, la inmortalización condicional se logra mediante la introducción de c-mycER, que impulsa la proliferación celular solo en presencia del esteroide sintético 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT).

Los Ejemplos demuestran la producción de exosomas a partir de células madre neurales condicionalmente inmortalizadas y células de sangre de cordón umbilical CD34+. Esta ejemplificación se puede aplicar fácilmente a otros tipos de células, incluidas las células madre mesenquimales.

De acuerdo con la divulgación, cuando una célula madre utilizada para producir micropartículas es una célula madre neural, puede ser cualquiera de las células madre neurales descritas en el presente documento, p. ej., la línea de células condicionalmente inmortalizada CTX0E03 que es clonal, estandarizada, muestra una seguridad clara in vitro e in vivo y puede fabricarse a escala proporcionando así un recurso único para la producción estable de exosomas. Alternativamente, las células madre neurales pueden ser líneas de células madre retinales neurales, opcionalmente como se describe en el documento US 7514259.

Las micropartículas también se pueden producir a partir de células madre iniciadoras de neuroesferas condicionalmente inmortalizadas (NS-IC) que son CD45-, CD34-. Estas células pueden iniciar el cultivo de neuroesferas. Una neuroesfera es un agregado o grupo de células que incluye células madre neurales y progenitores primitivos. Las células NS-IC son conocidas en la técnica, por ejemplo como se describe en el documento EP 1900811 B1 (StemCells Inc.). Las células NS-IC son típicamente a C133+.

En otra realización, las células madre condicionalmente inmortalizadas son células precursoras de oligodendrocitos (OPC). Las OPC son precursores de los oligodendrocitos y, por lo general, también pueden diferenciarse en astrocitos y, opcionalmente, en neuronas. Las OPC típicamente expresan el proteoglicano PDGFRa. Las OPC se describen, p. ej., en el documento WO-A-2010/075500 (StemCells Inc.); estas OPC son PDGFRa+/CD105'y opcionalmente CD133+.

Cuando la célula madre utilizada para producir micropartículas es una célula madre mesenquimal, puede ser opcionalmente una célula madre derivada de tejido adiposo condicionalmente inmortalizada ("ADSC") o una versión condicionalmente inmortalizada de las células madre mesenquimales descritas en el documento WO-A-2009/105044; estas células son CD29+, CD44+, CD49a+/e+, CD105+, CD166+, CD34-, CD45-.

En una realización adicional, las micropartículas son producidas por células madre derivadas de médula ósea humana condicionalmente inmortalizadas que expresan Cd 73, CD90 y CD105 y no expresan CD14, CD19, CD34, CD45 y HLA-DR, donde al menos el 50 % de las células de la población de células expresan proteína ácida fibrilar glial (GFAP) y secretan BDNF. Tales células se describen en el documento EP-A-2620493 (Brainstorm Cell Therapeutics).

En una realización, la célula madre mesenquimal condicionalmente inmortalizada es una célula regenerativa endometrial ("ERC"). Las ERC se conocen en la técnica y típicamente se aíslan de la sangre menstrual. Las ERC típicamente expresan CD9, CD29, CD41a, CD44, CD59, Cd 73, CD90 y CD105. La producción de exosomas a partir de ERC no condicionalmente inmortalizadas se describe, p. ej., en la publicación de patente de los Estados Unidos número US2013/0195899 (Medistem Inc.).

Una realización adicional proporciona micropartículas de células progenitoras adultas multipotentes condicionalmente inmortalizadas ("MAPC"), que típicamente se derivan de la médula ósea. Las MAPC se conocen en la técnica y típicamente expresan Oct3 y telomerasa. Athersys Inc. está desarrollando MAPCS como el producto "Multistem". En una realización, las MAPC son células no germinales no embrionarias multipotentes humanas que pueden diferenciarse en al menos un tipo celular de cada uno de al menos dos de los linajes embrionarios endodérmico, ectodérmico y mesodérmico, expresan telomerasa y, opcionalmente, expresan oct3. Estas MAPC típicamente han sufrido al menos 10 - 40 duplicaciones de células en cultivo (véase, p. ej., la patente de los Estados Unidos No.

8,147,824; Athersys, Inc.). En otra realización, las MAPC son una población de células humanas que expresan CD90 y CD49c y uno o más de sox-9, sox-11, hox-A5 y MSX-1 y, opcionalmente, expresan telomerasa. Estas células muestran típicamente ese perfil de marcador después de haber sufrido 22 duplicaciones de células en cultivo.

Otra realización de células madre mesenquimales que pueden inmortalizarse condicionalmente de acuerdo con la invención son las células progenitoras mesenquimales (MPC). Las MPC expresan SDF-1 (factor 1 derivado del estroma - una potente quimiocina CXCa derivada del estroma). Las MPC típicamente pueden diferenciarse en hueso, grasa y cartílago. Las MPC típicamente se pueden aislar mediante selección para la expresión de SDF-1, p. ej., utilizando un anticuerpo SDF-1. Las MPC típicamente se aíslan de la médula ósea. Las MPC son típicamente positivas para al menos un marcador seleccionado del grupo que consiste en STRO-Ibrillante VCAM-Ibrillante, THY-Ibrillante, CD146brillante y STRO-2brillante. Opcionalmente, las MPC portan al menos dos marcadores seleccionados del grupo de marcadores de superficie específicos para MPC formado por STRO-Ibri, LFA-3, THY-I, VCAM-I, ICAM-I, PECAM-I, P-selectina, L-selectina, CD49a/CD49b/CD29, CD49c/CD29, CD49d/CD29, CD29, CDI 8, CD61, integrina beta-1, 6-19, trombomodulina, CDIO, CD13, SCF, PDGF-R, EGF-R, IGFI-R, NGF-R, FGF-R, Leptina-R, RANKL y CD 146 o cualquier combinación de estos marcadores. La supervivencia y/o proliferación de MPC, o su progenie, puede mejorar mediante la exposición a SDF-I o un análogo del mismo (vease, p. ej., el documento WO2006032075, Angioblast Inc.

[ahora Mesoblast, Inc.]). Las MPC están siendo desarrolladas comercialmente por Mesoblast bajo el nombre de "Revascor".

Otras células madre condicionalmente inmortalizadas de las que se pueden aislar micropartículas, tales como exosomas, incluyen células madre hematopoyéticas, típicamente células madre hematopoyéticas CD34+, opcionalmente aisladas de sangre de cordón umbilical (a menudo denominadas como "células de sangre de cordón umbilical"). El Ejemplo 15 y la Figura 20A-C demuestran que las células progenitoras CD34+ humanas derivadas de la sangre del cordón umbilical se inmortalizaron condicionalmente con éxito con un lentivirus c-mycERTAM y producen exosomas que expresan el marcador característico Alix.

La sangre del cordón umbilical también incluye células madre no hematopoyéticas, que también pueden inmortalizarse condicionalmente y usarse para producir micropartículas.

Las células madre hematopoyéticas también se describen en el documento US 7,794,705 (Amorcyte Inc..). Estas células son células CD34+/CXCR-4+ que tienen actividad quimiotáctica mediada por CXCR-4 y son capaces de formar colonias hematopoyéticas in vitro.

Las micropartículas también pueden ser producidas por células madre embrionarias muy pequeñas condicionalmente inmortalizadas (VSEL) derivadas de un ser humano, que típicamente son CD133+ CXCR4+ CD34+ Lin- CD45' (p. ej., como se describe en el documento WO2010039241, NeoStem Inc.). Las VSEL son opcionalmente Oct-4, SSEA+, Nanog+, o expresan la proteína Oct-4 en núcleos y antígenos SSEA en la superficie.

La célula madre condicionalmente inmortalizada puede ser una célula progenitora adulta multipotente ("MAPC"). Las MAPC son conocidas en la técnica (vease, p. ej., Reading et al., J Immunol. 1 de mayo de 2013; 190 (9): 4542-52).

Las células madre pluripotentes inducidas (iPS) también pueden inmortalizarse condicionalmente y usarse para producir exosomas. Las células iPS son conocidas en la técnica, de acuerdo con lo revisado por Malik y Rao, Methods Mol Biol, 2013; 997-23-33.

Células diferenciadas (no madre) condicionalmente inmortalizadas como células productoras de micropartículas

La inmortalización condicional no se limita a las células madre. Por consiguiente, en otro aspecto de la invención, se utilizan células diferenciadas condicionalmente inmortalizadas (es decir, no madre) para producir micropartículas tales como microvesículas y/o exosomas.

Los fibroblastos pueden inmortalizarse condicionalmente y usarse para producir micropartículas tales como exosomas. Típicamente, el fibroblasto es un fibroblasto dérmico humano.

Las células dendríticas también pueden inmortalizarse condicionalmente y usarse para producir micropartículas tales como exosomas.

Métodos para inducir la secreción de micropartículas.

Los inventores han descubierto que es posible aumentar la producción de micropartículas por células, típicamente células madre. Este hallazgo, que no se limita a las células madre neurales y puede usarse para la producción de micropartículas a partir de cualquier célula (típicamente células madre), permite obtener un rendimiento mejorado de micropartículas a partir de un cultivo de células madre. Este rendimiento mejorado es particularmente ventajoso cuando se combina con el suministro continuo de micropartículas proporcionadas por células condicionalmente inmortalizadas.

Una primera técnica para aumentar la producción de micropartículas por parte de las células (madre) es tratar las células madre con uno o más de TGF-p, IFN-^yo TNF-a, típicamente entre 1 y 25 ng/mL, p. ej., 10 ng/mL, entre 12 y 96 horas antes de retirar los medios acondicionados.

Como se explica en el Ejemplo 2 a continuación, se observó que la frecuencia de aparición de cuerpos multivesiculares (MVB) se alteraba por la presencia de TGF-p, IFN-^yo TNF-a (10 ng/mL). La frecuencia fue más alta en presencia de TGF-p, seguido de IFN-y, seguido de TNF-a. Por lo tanto, agregar uno o más de TGF-p, IFN-y o TNF-a al medio de cultivo de células madre estimulará la producción de micropartículas por parte de las células. A continuación, las micropartículas se pueden recolectar separando las micropartículas de otros componentes como se ha descrito anteriormente.

Una segunda técnica para aumentar la producción de micropartículas por parte de las células madre es cultivar las células en condiciones hipóxicas. El cultivo de células en condiciones hipóxicas es bien conocido por los expertos e implica cultivar las células en una atmósfera que tiene un nivel de O2 inferior al atmosférico, es decir, menos del 21 % de O2. Esto generalmente se logra colocando las células en una incubadora que permite cambiar los niveles de oxígeno. El cultivo hipóxico generalmente implica cultivar en una atmósfera que contiene menos del 10 % de O2, más típicamente 5% o menos de O2, por ejemplo 4 % o menos, 3 % o menos, 2 % o menos, o 1 % o menos de O2.

Los inventores también se han dado cuenta de que el cocultivo de una célula madre con un tipo de célula diferente puede alterar la producción de micropartículas por parte de la célula madre. El tipo de célula diferente puede ser una célula no madre, es decir, un tipo de célula diferenciada terminalmente. Por lo general, el tipo de célula diferente es uno con el que la célula madre interactuaría in vivo. En una realización, las células madre neurales se cocultivan con células epiteliales tales como células endoteliales, típicamente células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC). Se ha observado que in vivo, las NSC y la vasculatura interactúan, con NSC en proliferación que se localizan muy cerca o adyacentes a los vasos sanguíneos. También se ha observado que la activación del receptor de tirosina quinasa y la secreción de proteína señal subregulan cuando las NSC se cocultivan con células endoteliales, lo que nuevamente indica que la vasculatura modula la capacidad de proliferación de las NSC. Sin desear ceñirse a la teoría, los inventores creen que in vivo, existe una interacción fundamental entre las NSC y los microvasos (es decir, las células endoteliales) en el proceso de regeneración tisular, a través de la amplificación de la expresión de citocinas. Las micropartículas, p. ej., exosomas, derivadas de NSC (p. ej., células CTX0E03) cocultivadas con células endoteliales (p. ej., HUVEC) están preparadas para uso terapéutico, porque se han producido en un entorno que imita el entorno in vivo en el que las células madre y las micropartículas están activas.

Por lo tanto, cultivar una célula madre con un tipo de célula diferente puede mejorar la cantidad de micropartículas producidas y/o puede refinar el contenido de las micropartículas, típicamente de modo que las micropartículas producidas por las células madre estén sesgadas hacia un estado activado de reparación tisular. En consecuencia, las micropartículas producidas por células madre que han sido cocultivadas con otras células, p. ej., las NSC cocultivadas con células endoteliales son ventajosas. Estas micropartículas pueden obtenerse por aislamiento de los medios acondicionados de células madre cocultivadas, como se describe en el presente documento.

Sorprendentemente, los presentes inventores se han dado cuenta de que la cantidad de micropartículas producidas por las células madre puede incrementarse enormemente simplemente cultivando células madre en un biorreactor de múltiples compartimentos. Este hallazgo no se limita a las células madre neurales y se aplica en general al cultivo de todas las células madre. En consecuencia, un aspecto de la divulgación proporciona un método para producir micropartículas a partir de células madre que han sido cultivadas en un biorreactor de múltiples compartimentos. Las células de las que se extraen las micropartículas típicamente se han cultivado durante al menos una semana, típicamente al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 días, p. ej., 15 días, 16 días, 17 días, 18 días, 19 días, 20 días, 21 días o más, p. ej., al menos tres semanas, cuatro semanas, cinco semanas, seis semanas o más. Puede verse en la Figura 8 que el aumento en la producción de micropartículas, semana tras semana, no es meramente aditivo sino exponencial. El cultivo prolongado típicamente se ha observado en el biorreactor de dos compartimentos del sistema Integra CELLine (disponible comercialmente a través de Integra Biosciences AG, Zizers, Suiza), pero los resultados no se limitan a este biorreactor de múltiples compartimentos específico; se puede utilizar cualquier biorreactor de múltiples compartimentos. Este método de cultivo se puede utilizar para producir micropartículas a partir de cualquier tipo de célula madre, incluidas, entre otras, células madre neurales y células madre mesenquimales.

Método de detección de un agente que altera la producción de micropartículas.

La invención proporciona un método de detección de un agente que altera la producción de una micropartícula por una célula condicionalmente inmortalizada, típicamente una célula madre condicionalmente inmortalizada. Este método comprende poner en contacto una célula condicionalmente inmortalizada (p. ej., madre) con un agente candidato, típicamente en condiciones adecuadas para la producción de micropartículas, y observar si (i) la tasa de producción de micropartículas por parte de la célula condicionalmente inmortalizada aumenta o disminuye, o (ii) las características (p. ej., tamaño, proteína, contenido de ARNm o miARN) de las micropartículas cambian, en comparación con una célula madre de control que no se pone en contacto con el agente.

Método para detección de la composición de ARN total del medio acondicionado

Después de la centrifugación (5 min a 1500 rpm), las micropartículas se recogen del medio acondicionado mediante filtración (0.02-0.2 pm o corte de peso molecular de 100 K). El ARN total se obtiene mediante extracción basada en trizol seguida de purificación con el mini equipo Qiagen RNaesy. El extracto en agua tiene una absorbancia de 260:280 nm, lo que sugiere que puede ser ARN. El ARN total se retrotranscribe con un protocolo adecuado para ARNm (Superscript II RT, Invitrogen) o miARN (equipo mScript RT, Qiagen). La validación de la presencia de ARNm y miARN se prueba mediante qRT-PCR utilizando cebadores para ATP5B y YWHAZ para ARNm, y U6B y 15a para genes de mantenimiento de miARN, respectivamente. El ARN puede evaluarse mediante un ensayo de análisis de expresión génica genérica tal como una matriz (micro matriz o matriz basada en PCR) y secuenciación.

Equipos

La divulgación proporciona un equipo para usar en un método para producir la micropartícula de la invención. El equipo comprende un medio de cultivo celular, una célula condicionalmente inmortalizada e instrucciones para producir la micropartícula utilizando el equipo. Opcionalmente, el equipo comprende uno o más de factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), interferón gamma (IFN-^y) y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a). El equipo también puede comprender una micropartícula de acuerdo con la invención, para uso como control. La micropartícula de control se liofiliza opcionalmente. El equipo también puede contener opcionalmente un agente de detección adecuado para la detección de las micropartículas producidas, p. ej., un anticuerpo que se une específicamente a una proteína marcadora que puede usarse para identificar la micropartícula.

La invención se describe adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos (ilustrativos)

Ejemplo 1: Preparación de células madre neurales y micropartículas de células madre neurales para su visualización por microscopía electrónica.

Método

Incrustación de células CTX0E03 para microscopía electrónica

• Cultivos 5 x de CTX0E03 al 70 %

• Tratar con /- 4OHT, IFNy, TNFa y TGFp (todos a 10 ng durante 24 horas)

• Separar las células y fijar durante la noche en glutaraldehído al 2.5 % en cacodilato 0.1 M pH 7.4

• Células centrifugadas 300 g

• Osmio tamponado al 2 %, 1.5 horas

• Centrifugar, lavar con agua, durante la noche

• Acetato de uranio al 2 %, 2 horas

• Centrifugar, lavar con agua, 30 minutos

• Gradiente de etanol 20, 35, 50, 70, 80, 90, 100 %, durante el fin de semana.

• 100 % de óxido de propileno (PO), 1 hora

• Centrifugar, resina de Agar LV al 50 % en PO, 1 hora

• Resina LV al 75 %/PO 5 horas

• 100% de resina durante la noche a 60 °C

• Enfriar a temperatura ambiente antes de cortar (60-80 nm), obtención de imágenes de TEM a 200 Kv.

Resultados

La Figura 1A-E muestra las micrografías electrónicas de los cuerpos multivesiculares (MVB) que contienen exosomas de aproximadamente 30 nm - 50 nm de diámetro. La Figura 1F muestra microvesículas de >100 nm de diámetro.

Ejemplo 2: Producción de micropartículas de células madre neurales a partir de una línea de células madre neurales.

Método

Se trataron individualmente 5 matraces subconfluentes que contenían el mismo cultivo de células CTX0E03 con 10 ng/mL de TGF-p, 10 ng/mL de IFNy o 10 ng/mL de TNFa junto con controles de medio de crecimiento completo con o sin la adición de 4OHT. Setenta y dos horas después del tratamiento, las células se recogieron usando TrypZean/EDTA, se lavaron y se fijaron durante la noche en glutaraldehído al 2.5 % en cacodilato 0.1 M pH 7.4 listo para evaluación con microscopía electrónica.

Resultados

Se observó que la frecuencia de aparición de cuerpos multivesiculares (MVB) estaba alterada por la presencia de TGF-p, IFN-^yo TNF-a. La frecuencia fue más alta en presencia de TGF-p, seguido de IFN-^y, seguido de TNF-a.

Conclusión

La producción de micropartículas a partir de células madre neurales puede estimularse mediante la adición de los factores TGF-p, IFN-y o TNF-a. Esto tiene el potencial para una producción más eficiente de micropartículas.

Ejemplo 3: Purificación, cuantificación y caracterización de micropartículas de células madre neurales.

Método

En la Figura 2 se proporciona un protocolo esquemático para producir grandes cantidades de micropartículas. Las etapas principales son la purificación, la cuantificación, la caracterización, las pruebas de eficacia y la fabricación.

(1) Purificación

Las micropartículas se pueden purificar a partir de un medio acondicionado con células madre mediante ultracentrifugación, p. ej., a 100000 x g durante 1-2 horas. Se pueden usar métodos alternativos o adicionales para la purificación, tal como los métodos basados en anticuerpos, p. ej., inmunoprecipitación, purificación con perlas magnéticas, purificación a base de resina, utilizando anticuerpos específicos.

(2) Cuantificación

Las micropartículas purificadas se pueden cuantificar mediante la cuantificación de los niveles de proteína o ácido nucleico total, p. ej., diversos métodos de cuantificación de proteínas mediante PCR o colorimétricos, tal como el ensayo BCA. Como alternativa, se pueden usar otras técnicas de cuantificación, incluida una rejilla de microscopía electrónica o un inmunoensayo que usa anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen específicamente a marcadores específicos de micropartículas (p. ej., ELISA, inmunotransferencia).

(3) Caracterización

Las micropartículas se pueden caracterizar funcional o estructuralmente. El perfilado de ARN/ARNm/miARN y proteínas se puede utilizar usando métodos bien conocidos en la técnica (SDS-PAGE, espectrometría de masas, PCR). Las micropartículas secretadas de forma constitutiva se pueden analizar y comparar con las micropartículas que se han inducido mediante la adición de un agente inductor tal como el factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), el interferón gamma (INF-y) y/o el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a).

(4) Eficacia terapéutica

La eficacia de las micropartículas puede probarse mediante ensayos in vitro e in vivo. Para la evaluación in vitro, pueden añadirse micropartículas de células madre neurales a cultivos de monocitos, PBMC, células endoteliales y/o fibroblastos y evaluarse el efecto de las micropartículas sobre estas células. La administración de micropartículas de células madre neurales a modelos animales adecuados se puede utilizar para evaluar la eficacia in vivo. Se pueden realizar ensayos clínicos para evaluar la seguridad y el resultado de las micropartículas de células madre neurales en sujetos humanos.

(5) Fabricación/escalamiento

Los biorreactores, como el Integra desechable T1000, se pueden utilizar para la fabricación a gran escala de micropartículas de células madre neurales. Las micropartículas purificadas luego se formulan como un producto terapéutico.

Ejemplo 4: Caracterización de miARN en micropartículas de CTX0E03

Métodos

• Tres condiciones: células CTX0E03 en cultivo estándar; micropartículas obtenidas de células CTX0E03 en cultivo estándar; y exosomas purificados derivados de células CTX0E03 en el sistema Integra CELLine (véanse los Ejemplos 7 a 11, a continuación)

• Investigación de la matriz de miARN utilizando el panel de qRT-PCR (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este ensayo proporciona alta precisión y alta sensibilidad, con normalización de datos sensible al método/elección de genes de referencia. No proporciona una secuenciación amplia del genoma.

Resultados:

A) Lista de miARN con un cp < 35 encontrado en (i) células CTX0E03 estándar, (ii) medio acondicionado filtrado (filtro de 0.02 - 0.2 |jm), es decir, micropartículas y (iii) exosomas derivados del sistema Integra CELLine (resultados preliminares de la matriz miScript por qRT-PCR de miARN (Qiagen)).

B) Media aritmética y geométrica de los genes de referencia (mantenimiento)

A

B

Ejemplo 5: Análisis de medio acondicionado con CTX0E03 utilizando una transferencia de puntos de proteína

Métodos

• Medio acondicionado de 24 horas y 72 horas (medio RMM e ITS)

• El medio recogido ha sido 'concentrado' por diálisis y las proteínas biotiniladas (la concentración típica de proteína total parece ser de 0.5 mg/mL). A continuación, los medios se incuban con matrices de proteína humana Raybiotech L507 (concentración de proteína total 0.1 mg/mL). Tras el lavado y la incubación de la matriz con estreptavidina conjugada con HRP, la presencia de proteínas se detecta mediante quimioluminiscencia. La matriz proporciona datos cualitativos (es decir, la proteína está presente, pero no indica su nivel de expresión en comparación con otras proteínas).

Resultados

Ejemplo 6: Análisis de medio acondicionado utilizando tiras de ELISA de angiogénesis humana (Signosis)

Método

Se utilizaron tiras de ELISA de angiogénesis humana (Signosis) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se analizaron medio RMM fresco y medio RMM con CTX0E03 acondicionado durante 24 horas para determinar 8 citocinas de angiogénesis; factor de necrosis tumoral a (TNFa), factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1), VEGFA, interleucina-6 (IL-6), bFGF, factor de crecimiento transformante p 1 (TGFpl), EGF y leptina. Los pocillos individuales de la tira, recubiertos con cada uno de los anticuerpos primarios dirigidos contra las citocinas de angiogénesis específicas, se cargaron con muestras de ensayo. La absorbancia se midió con un espectrofotómetro a 450 nm. Las concentraciones de las citocinas de angiogénesis fueron directamente proporcionales a la intensidad del color de la muestra de prueba.

Los resultados se muestran en la Figura 3.

Ejemplo 7: Integra CELLine - Biorreactor desechable para la producción de micropartículas a partir de células CTX0E03.

La producción y recolección eficientes de micropartículas de una línea de células depende del mantenimiento de condiciones de cultivo óptimas para la mayor densidad de células. Cualquier restricción en el suministro de oxígeno o nutrientes a las células o una acumulación de productos metabólicos de desecho limitará la vida útil del cultivo y, por lo tanto, la producción de micropartículas.

CELLine AD 1000 de dos compartimentos está diseñado para albergar células adherentes adheridas a un inserto de matriz dentro de un compartimento de células pequeño, separado de un depósito de medios más grande por medio de una membrana semipermeable de 10 kDa. Esta membrana permite una difusión continua de nutrientes y la eliminación de productos de desecho, mientras concentra cualquier micropartícula producida por la célula dentro del compartimento celular más pequeño. Debido a la gran capacidad de volumen (1 litro) del compartimento del medio, el sistema tiene el potencial de mantener cultivos de alta densidad durante períodos de tiempo más prolongados sin necesidad de cambiar el medio. La producción de exosomas a partir de cultivos de células tumorales de mesotelioma se describe en Mitchell et al., 2008.

Método

Para obtener un rendimiento óptimo de CELLine AD1000, se colocan 25 mL de medio de crecimiento completo (RMM con factores de crecimiento y 4OHT) en el compartimento del medio del matraz para humedecer previamente la membrana semipermeable. Se deja reposar el matraz durante 5 minutos a temperatura ambiente antes de recubrir la incrustación de la matriz con laminina de ratón añadiendo 15 mL de solución de laminina (20 pg/mL en DMEM/F12) al compartimento de células durante un mínimo de 1 hora a 37 °C. Se retira la solución de laminina y agregan 15 mL de DMEM/F12 tibio al compartimiento de la célula para eliminar el exceso de laminina. Evitar que la matriz se seque, se introducen lentamente aproximadamente 15*10® células CTX0E03 en un total de 15 mL de medio de crecimiento completo. Tener cuidado de eliminar cualquier burbuja de aire del compartimiento de la célula. Se añaden con cuidado otros 460 mL de medio de cultivo completo al compartimento de células antes de incubar el matraz durante la noche en CO2 al 5 % a 37 °C. Al día siguiente, se retira el medio del compartimento celular y se reemplaza con 15 mL de medio de cultivo precalentado.

Cada 7 días se recolectan las micropartículas/medio del compartimento de células. Se centrifuga el medio a 1500 rpm durante 5 minutos para eliminar los restos celulares y se almacena a -80 °C. Se añaden con cuidado otros 15 mL de medio de crecimiento completo precalentado al compartimento de células y 485 mL de medio de crecimiento completo al compartimento del medio y se incuba durante otros 7 días. Las micropartículas se aislaron mediante filtración con corte de peso molecular de 100 K. Se repite según sea necesario.

La Figura 4A muestra la cantidad de proteína extraída de 15 mL de medio que contiene micropartículas purificadas usando el sistema Integra en comparación con las condiciones de cultivo normales (3 días T175). Los miligramos de proteína se midieron mediante el ensayo BCA. La Figura 5 muestra la cantidad correspondiente de ARN total aislado medido a 260/280 nm.

Las caracterizaciones de marcadores indicaron que ambas poblaciones purificadas (microvesículas y exosomas) expresan CD63 y CD81 (determinado por FACS - Figura 4B). Solo los exosomas expresan el marcador endosomal Alix (determinado por transferencia Western, datos no mostrados).

Ejemplo 8: Ensayos de eficacia

(A) Comparación de la función del medio acondicionado con CTX0E03 con la función de exosomas purificados de células CTX0E03 en un ensayo de cicatrización de heridas.

Método - ensayo de cierre de heridas/raspado

• Semilla 0.25*10® NHDF (fibroblastos dérmicos humanos normales) por pocillo de una placa de 12 pocillos y se deja que alcance la confluencia (24 horas)

• Eliminar los factores de crecimiento durante 24 horas

• Retirar las células (raspar) e incubar con exosomas/medio acondicionado

• Área afectada por la imagen durante 48 horas

• Estimar el área usando Imagen J

Resultados

Tabla 2 - Ensayo de raspado/cierre de heridas que representa la actividad de migración de fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) cultivados en medios acondicionados con CTX0E03 o tras la adición de exosomas purificados.

El cierre de la herida se calculó como el área cubierta por las células en relación con el área inicial de la herida, determinada a las 0 h. El cierre de la herida se expresa como el porcentaje del área inicial de la herida en el tiempo 0 h. Estos datos también se muestran, fotográficamente, en la Figura 6A.

La Figura 6B muestra que 10 pg de exosomas de CTX0E03 aumentan significativamente el cierre de heridas (de acuerdo con lo determinado en el ensayo de raspado/migración de HDNF) después de 72 horas, en comparación con las condiciones basales (sin exosomas).

Otros experimentos confirmaron que los exosomas purificados (mediante ultracentrifugación; cuantificados mediante el ensayo de proteína BCA; caracterizados como >99 % positivos para CD63 y CD81 y con un mayor nivel de expresión de Alix en comparación con la fracción correspondiente de micropartículas) en todos los puntos de tiempo (semanas 2 a 6) durante el cultivo continuo (usando biorreactores Integra CELLine en presencia de factores de crecimiento y 4OHT) mejoró significativamente la migración de fibroblastos y la cicatrización de heridas, con una respuesta máxima entre 5-10 pg/mL en comparación con las condiciones basales. La Figura 6C muestra el % de áreas cicatrizadas para condiciones basales, 2 pg/mL de exosomas, 6 pg/mL de exosomas, 20 pg/mL de exosomas y un control positivo con LSGS (suplemento de bajo crecimiento en suero). El panel superior de la Figura 6C muestra exosomas aislados de células CTX0E03 cultivadas durante 2 semanas en el sistema Integra CELLine y el panel inferior de la Figura 6C muestra exosomas aislados de células CTX0E03 cultivadas durante 6 semanas en el sistema Integra CELLine. Estos datos muestran que todas las dosis de todos los exosomas de NSC probados proporcionan una mayor cicatrización en comparación con las condiciones basales, con un % de cicatrización que se acerca al control positivo (LSGS) después de 72 horas.

Los datos de la Figura 6C también muestran que los exosomas aislados de las NSC cultivadas durante 6 semanas causan una cicatrización más rápida (que los exosomas de 2 semanas), con un % cicatrizado acercándose al 100 % después de solo 48 horas, para todas las dosis.

La Figura 6D muestra los resultados de un ensayo in vivo de herida por inyección en un ratón, que confirma que las células CTX0E03 estimularon la cicatrización de heridas en un grado estadísticamente significativo en vivo. Este es un sencillo bioensayo in vivo que se puede utilizar para confirmar la eficacia de las micropartículas in vivo.

Conclusión. Los exosomas liberados de la línea de células madre neurales humanas CTX0E03 mejoran la migración de fibroblastos en un modelo in vitro de cicatrización de heridas, lo que sugiere que los exosomas pueden contribuir a los mecanismos por los cuales las hNSC promueven la reparación. Los exosomas aislados de células cultivadas durante 6 semanas muestran una mayor eficacia en la cicatrización de heridas in vitro, en comparación con exosomas aislados de células cultivadas durante 2 semanas.

(B) Estimulación de la angiogénesis

Se llevó a cabo un ensayo de 24 horas para detectar la angiogénesis en las HUVEC primarias utilizando un microportaobjetos Ibidi y detección y análisis automatizados de Wimtube (de la longitud del tubo y los puntos de bifurcación). Las microvesículas recolectadas de matraces Integra a las 1, 2, 3, 4 y 6 semanas se agregaron a las HUVEC y la angiogénesis se comparó con las HUVEC basales (sin adición). Se usó LSGS (suplemento de crecimiento sérico bajo) como control positivo. Los resultados, representados en la Figura 12, muestran que las microvesículas de células madre neurales aumentan la angiogénesis. Además, estos datos muestran que las microvesículas recolectadas después de al menos 3 semanas de cultivo (es decir, después de 3 semanas, 4 semanas y 6 semanas de cultivo en un biorreactor Integra CELLine) proporcionan un mayor aumento en la angiogénesis que las microvesículas cultivadas durante 1 o 2 semanas. Las microvesículas cultivadas durante al menos 3 semanas estimularon la angiogénesis hasta un nivel estadísticamente significativo y un nivel que se aproxima al del control positivo. Se muestra que el mayor aumento en la angiogénesis lo proporcionan las microvesículas recolectadas después de 4 semanas; estas microvesículas estimularon la angiogénesis en la misma cantidad que el control positivo.

Estos datos indican que las microvesículas de hNSC estimulan la angiogénesis.

(C) Estimulación del crecimiento de neuritas

El crecimiento de neuritas se determinó usando células PC-12 a través de un inserto de 1 pm. Después de 72 horas, se retiraron los cuerpos de células PC-12 y se tiñeron las neuritas en la parte inferior del inserto. A continuación, se extrajo la mancha y se cuantificó en un espectrofotómetro. Las microvesículas recolectadas de matraces Integra a las 2 semanas se añadieron a las células a razón de 0.03 pg, 0.3 pg y 3 pg, cada una con 100 ng/mL de NGF (factor de crecimiento nervioso). El crecimiento de neuritas se comparó con las células basales (sin adición). Se usaron 100 ng/mL de NGF como control. Como se muestra en la Figura 13, la adición de 3 pg de microvesículas de hNSC provocó un aumento notable en el crecimiento de neuritas, en comparación con la adición de NGF solo.

Estos datos indican que las microvesículas de hNSC estimulan el crecimiento de neuritas.

Ejemplo 9: Producción de exosomas utilizando el sistema Integra CELLine.

Las células CTX0E03 se cultivaron usando el sistema Integra CELLine y los exosomas se purificaron como se describe en el Ejemplo 7. Se cuantificó la concentración de exosomas purificados del medio usando el sistema CELLine en el punto de tiempo de 3 semanas y como control un sistema T175 estándar como se usa rutinariamente en la técnica (usando un ensayo BCA para estimar el contenido de proteína). La Figura 7 muestra que la producción de exosomas con el sistema Integra CELLine aumenta varias veces, en comparación con el cultivo convencional (matraces T175).

Usando el sistema Integra CELLine, las células CTX0E03 se cultivaron durante un período de 3 semanas y el medio se recolectó en las semanas 1,2 y 3 para la purificación y cuantificación de los exosomas, como se describe en el Ejemplo 7. La Figura 8A muestra que la producción de micropartículas aumenta exponencialmente durante el período de cultivo de 3 semanas, lo que permite una producción eficiente y a gran escala de micropartículas. La concentración de exosomas recolectados de un solo matraz Integra CELLine luego se controló durante 1 a 6 semanas de cultivo continuo de CTX0E03, con los resultados que se muestran a continuación y se representan en la Figura 8B:

Estos resultados muestran que la producción de exosomas aumenta sorprendentemente cuando las células madre se cultivan en un biorreactor de múltiples compartimentos durante semanas, típicamente al menos tres semanas.

Ejemplo 10: Caracterización del fenotipo de células obtenidas de Integra CELLine y el sistema de cultivo estándar (T175).

Las células CTX0E03 se cultivaron usando el biorreactor Integra CELLine y cultivo estándar, como se describe en el Ejemplo 7. La expresión de los marcadores de proteínas DCXy GFAP se confirmó usando anticuerpos específicos de marcadores y microscopía de fluorescencia.

La expresión de los marcadores DCX, GALC, GFAP, TUBB3, GDNF e IDO se detectó mediante qRT-PCR en muestras obtenidas de las células. La expresión del marcador se comparó entre las micropartículas obtenidas del cultivo estándar (T175) y los exosomas obtenidos del sistema Integra CELLine cultivado durante 3 semanas, evaluado frente a una línea base del nivel de expresión en células CTX0E03 en cultivo estándar (T175).

Los inventores observaron una notable diferencia en la expresión de marcadores de las células obtenidas del sistema Integra CELLine en comparación con las células de control obtenidas del estándar. Los marcadores de células parcialmente diferenciadas aumentaron varias veces en células cultivadas en el sistema Integra CELLine, en comparación con las células de control obtenidas de cultivos estándar (Figura 9). Los cambios particularmente llamativos son el aumento de la expresión de los marcadores DCX1 (doblecortina - un marcador de entrada en el linaje neural), GFAP (proteína ácida fibrilar glial - un marcador de entrada en el linaje astrocítico), GDNF (factor neurotrófico derivado de células gliales) e IDO (indolamina 2,3-dioxigenasa). Esto indica que en las células madre neurales cultivadas en un biorreactor de dos compartimentos se diferencian parcialmente en células de linaje neural (DCX+) o astrocítico (GFAP+). La expresión de DCX y GFAP en las células cultivadas con Integra se confirmó mediante microscopía de fluorescencia, lo que demuestra que las células CTX0E03 cultivadas con el biorreactor Integra CELLine tienen un fenotipo neuronal más diferenciado que las células CTX0E03 estándar.

Ejemplo 11: Caracterización de perfiles de expresión de miARN de exosomas obtenidos de cultivos Integra CELLine y micropartículas obtenidas de cultivos estándar (T175).

Las células CTX0E03 se cultivaron durante tres semanas utilizando el cultivo Integra CELLine y en el cultivo estándar en matraces T-175 de un solo compartimento. Los exosomas se purificaron del cultivo Integra y las micropartículas se purificaron del cultivo T-175 estándar como se describe en el Ejemplo 7. Los niveles de expresión relativos de varios miARN expresados en los exosomas y las micropartículas obtenidas del cultivo estándar o del sistema Integra CELLine se determinaron con una matriz de miARN utilizando el panel qRT-PCR (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se convirtieron en niveles de sobre y subregulación en comparación con un grupo de control de línea de células CTX0E03 estándar (véase la Tabla 3 y la Figura 10). Estos datos muestran un perfil de expresión diferencial de miARN entre los exosomas obtenidos del sistema de cultivo Integra CELLine durante 3 semanas, las micropartículas y las células obtenidas del cultivo estándar de un solo matraz.

Tabla 3: Veces que se regulan los miARN en micropartículas obtenidas de cultivo estándar o exosomas del sistema Inte ra CELLine, en relación con el control células CTX0E03.

Los valores se calcularon a partir de datos sin procesar utilizando las siguientes ecuaciones:

ACT (muestra/control) = CT promedio (GOI) - CT promedio (HKG)

Veces que se expresa (muestra/control) = 2'(ACT pr°medi°)

Veces que cambia = ^{. Veces que se expresa (m uestra)}

Veces que se expresa (control)

Si (veces que cambia) > 1 entonces (veces que se regula) = (veces que cambia) Si (veces que cambia) < 1 entonces (veces que se regula) = -( - v-e-c--e-s-- q-u - e cambia ) Donde:

CT = umbral de ciclo

GOI = gen de interés (miARN investigado)

HKG = genes de mantenimiento (miARN de referencia utilizados para normalizar los datos)

Ejemplo 12: Análisis de miARN total

Las células pueden transportar el ARN en micropartículas determinadas para su liberación en el espacio extracelular. Esto permite el transporte de mensajes codificados genéticamente entre las células. En el presente documento nos referimos colectivamente al ARN extracelular como 'ARN transportador'. Nuestro objetivo fue analizar exhaustivamente las especies de ARN no codificantes liberadas por las células madre neurales (NSC) CTX0E03 utilizando la secuenciación de próxima generación. Los ARN no codificantes se dividen en dos categorías (pequeños y largos). Los biotipos de ARN no codificantes pequeños incluyen ARN ribosómico (ARNr), nucleolar pequeño (ARNnp), ARN nuclear pequeño (ARNnp), microARN (miARN), otros A ^rN misceláneos (^aRⁿmisc, p. ej., RMRP, ARN de bóveda, SRP de metazoos y RNY) y los biotipos de ARN no codificante largo incluyen ARN no codificantes largos (ARNncl) y ARN no codificantes intergénicos grandes (ARNncig).

En el presente documento, se caracterizaron los ARN transportadores, incluidos los ARN no codificantes pequeños y largos, liberados de exosomas y microvesículas (MV) derivados de NSC y comparados con los contenidos de ARN de las NSC productoras.

A) Contenido total de ARN en células, exosomas y microvesículas identificado por el bioanalizador de ARN de Agilent El ARN tanto en los exosomas como en las microvesículas consiste principalmente en pequeñas especies de ARN, como se muestra en la Fig. 14. La mayoría de los nucleótidos (nt) fue <200 como se muestra en la escala molecular. B) Composición del ARN

Se generaron bibliotecas de secuenciación de ARN pequeño para investigar la composición del ARN transportador y celular mediante secuenciación profunda (secuenciación de próxima generación). Los resultados se muestran en la Figura 15.

C) Secuenciación profunda de la expresión de miARN de células CTX0E03, microvesículas y exosomas, de cultivos estándar (T175).

La secuenciación profunda se basa en la preparación de una biblioteca de ADNc seguida de la secuenciación y proporciona información sobre la secuencia total leída de diferentes miARN en las microvesículas y los exosomas. Estos datos de secuencia profunda complementan los datos de matriz de qRT-PCR que se muestran arriba y proporcionan un análisis completo del perfil de miARN de las células y micropartículas. A diferencia del análisis de matrices de qRT-PCR, la secuenciación profunda no se limita a la identificación de secuencias presentes en la matriz de sondas y, por lo tanto, no es necesario conocer de antemano las secuencias que se identificarán. La secuenciación profunda también proporciona lectura directa y la capacidad de secuenciar secuencias muy cortas. Sin embargo, la secuenciación profunda no es adecuada para la detección de transcritos con baja expresión.

Método

La presencia de una variedad de miARN en las células parentales y sus exosomas (30-100 pm) y microvesículas (100 1000 pm), purificados por centrifugación diferencial, se identificó mediante secuenciación profunda, luego de la construcción de 1 biblioteca de miARN etiquetada para cada muestra.

Además, se diseñaron y usaron cebadores específicos para miARN altamente transportados (p. ej., hsa-miR-1246) en PCR de transcripción inversa en tiempo real (qRT-PCR) para rastrear exosomas/microvesículas después de implantación in vivo.

La secuenciación profunda fue realizada por GATC Biotech (Alemania) y requirió la preparación de una biblioteca de miARN etiquetada para cada muestra, seguida de secuenciación y escaneo de miRBase:

• Construcción de bibliotecas de miARN etiquetadas (22 a 30 nt)

° Las bibliotecas de secuenciación se generaron mediante la ligación del adaptador de ARN específico a los extremos 3' y 5' de cada muestra, seguido de transcripción inversa, amplificación y purificación de bibliotecas de ARN pequeño (intervalo de tamaño de la fracción contenida de ARN pequeño de 22 - 30 nt).

• Secuenciación en un Illumina HiSeq 2000 (lectura única)

° La secuenciación se realizó usando Illumina HiSeq 2000 (lectura única). El análisis de un grupo podría incluir hasta 45,000,000 de lecturas individuales, y cada longitud de lectura es de hasta 50 bases. La calidad de la secuenciación se controló mediante archivos FastQ (secuencias y puntuaciones de calidad).

• La identificación de los miARN conocidos se realizó de la siguiente manera:

° Los adaptadores de ARN se recortaron de las secuencias resultantes y se limpiaron los datos sin procesar. Los datos sin procesar se agruparon y para cada grupo se proporcionó una cantidad de lecturas. Los miARN se identificaron mediante escaneo miRBase (Ssearch).

Resultados

Muchos miARN de microvesículas y exosomas se enriquecieron en relación con las células, lo que indica que las células clasifican especialmente los miARN para su liberación extracelular. Además, los contenidos de miARN fueron similares tanto en los exosomas como en las microvesículas, lo que indica un aparato común de absorción selectiva de miARN en las microvesículas excretadas. Sin pretender ceñirse a la teoría, esto puede indicar que el contenido de miARN en las microvesículas y los exosomas secretados se puede utilizar como huella digital para identificar los subtipos de hNSC.

Por lo tanto, el análisis de secuenciación profunda identificó un conjunto único de miARN tanto en los exosomas como en las microvesículas de hNSC que no se habían informado anteriormente. El contenido de miARN en las vesículas excretadas es similar, pero mostró una absorción preferencial de miARN en comparación con hNSC. Estos hallazgos podrían respaldar los efectos biológicos mediados por miARN transportador no descritos previamente para hNSC.

Los resultados se detallan en las Tablas 4 a 9, a continuación. Los datos también se representan en la Figura 11, que muestra claramente los perfiles de miARN significativamente diferentes presentes en las microvesículas y los exosomas, en comparación con las células. En resumen, estos datos muestran un aumento masivo en la cantidad (recuento) de hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532 en microvesículas y exosomas en comparación con las células. También se observan grandes aumentos en hsa-miR-4508, hsa-miR-4516, has-miR-3676-5p y hsa-miR-4485. Se observan disminuciones masivas en las cantidades (recuento) de ciertos miARN, incluidos hsa-let-7a-5p, has-miR-92b-3p, has-miR-21-5p. hsa-miR-92a-3p, hsa-miR-10a-5p, hsa-100-5p y hsa-99b-5p.

La presencia de cada uno de hsa-miR-1246, hsa-miR-4488, hsa-miR-4492, hsa-miR-4508, hsa-miR-4516 y hsa-miR-4532 en los exosomas fue validada por qRT-PCR (datos no mostrados).

La representación gráfica de los resultados de la secuenciación profunda en los exosomas y las microvesículas como veces que cambia en forma relativa en comparación con las células confirma que hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsamiR-4488 y hsa-miR-4532 están significativamente sobrerregulados en los exosomas y microvesículas en comparación con las células. Esta comparación también muestra que miARN hsa-miR-3195 es el miARN más sobrerregulado, tanto en exosomas como en microvesículas. Aunque las lecturas absolutas de hsa-miR-3195 están en el intervalo de -40 para exosomas y microvesículas, no hay presencia de hsa-miR-3195 en las células.

Como se señaló en el Ejemplo 11 anterior, los contenidos de miARN en exosomas, micropartículas y células parentales también se probaron y validaron usando análisis de matriz por PCR. Los siguientes miARN se encontraron presentes mediante qRT-PCR: hsa-let-7g-5p, hsa-miR-101-3p, hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-128, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-134, hsa-miR-137, hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-182-5p, hsa-miR-185-5p, hsa-miR-18b-5p, hsa -miR-192-5p, hsa-miR-194-5p, hsa-miR-195-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-20b-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-21 -5p, hsa-miR-218-5p,hsa-miR-219-5p,hsa-miR-222-3p, hsa-miR-22-3p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-24-3p ,hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-301a-3p, hsamiR-302a-3p,hsa-miR-302c-3p,hsa-miR-345-5p, hsa-miR-378a-3p, hsa -miR-7-5p, hsa-miR-92a-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-9-5p, hsa-miR-96-5p y hsa-miR-99a-5p.

Tabla 4: Células EH

Tabla 5: Células EI

Tabla 6: Microvesículas EI

Tabla 7: Exosomas IE

Tabla 8: Microvesículas EH

Tabla 9: Exosomas EH

D) Identificación de ARN codificantes y no codificantes de primer orden mediante análisis GENCODE realizado en exosomas, MV y células productoras

Tabla 10: Número total de lecturas de secuencia identificadas mediante el uso de GENCODE en cada muestra analizada

Mediante el análisis de la base de datos GENCODE de los resultados de la secuencia, se identificaron siete supuestas secuencias de miARN novedosas en exosomas (EXO), microvesículas (MV) y células productoras, como se muestra en la Tabla 11. (Nota: Las lecturas de MV CTX0E0307EI están tergiversadas debido a la menor cantidad de material de partida - véase la Tabla 10). Estos datos se muestran gráficamente en la Figura 16, que muestra que estas secuencias se transportan preferiblemente en exosomas y microvesículas en comparación con las células.

Tabla 11: Identificación de secuencias putativas de miARN nuevos usando GENCODE en exomas (EXO), microvesículas (MV) y células productoras. Las lecturas de CTX0E0307EIMV están tergiversadas debido a la menor cantidad de material de partida (Tabla 1). Las ID de los transcritos se toman de la base de datos Ensembl (www.ensembl.org).

Validación de nuevos miARN

AC079949.1-201 (SEQ ID NO: 738)

G en : A C 07994 9.1 E N S G 00000239776

^{>12 adn} : ^{cromosoma cromosoma :} GRCh37 : 12 : 127650616 : 127650672 : 1

GGCCGCGCCCCGTTTCCCAGGACAAAGGGCACTCCGCACCGGACCCTGGTCCCAGCG

Para miARN maduro putativo AC079949.1-201, se identificó gaccaggguccggugcggagug (SEQ ID NO: 745) como el posible miARN maduro del tallo 5' usando http://mirna.imbb.forth.gr/MatureBayes.htmL, una herramienta para encontrar miARN maduro dentro de una secuencia precursora de miARN usando un clasificador Naive Bays. Su validación de presencia se realizó utilizando la secuencia del cebador AGGGTCCGGTGCGGAGT (SEQ ID ⁿO:746). Esta secuencia se ingresó en mirbase (http://www.mirbase.org/) y se encontró el siguiente miARN con secuencia similar: Bos taurus miR-2887-1 (acceso No. MIMAT0013845).

bta-miR-2887: 9-20 (SEQ ID NO: 747)

AC 079949 (5) 2 g g g u c c g g u g c g 13

I I I I I I I I I I I

b t a - m i R - 2887 9 g g g u c c g g u g c g 20

La presencia de este nuevo miARN se probó mediante qRT-PCR en miARN retrotranscrito de exosomas purificados. Se realizó el mismo análisis usando el tallo 3' de AC079949, secuencia TGCGGAGTGCCCTTTGTCCT (SEQ ID NO:748), pero en este caso no se identificó miARN similar en mirbase.

AP000318.1-201 (SEQ ID NO: 739)

Gen : AP000318.1 ENSG00000266007

>21 ^adn : ^{cromosoma cromosoma} : GRCh37:21: 35677430 :35677493 :1

CCCACTCCCTGGCGCCGCTTGTGGAGGGCCCAAGTCCTTCTGATTGAGGCCCAACCCGTGGAAG

Para miARN maduro putativo AP000318.1-201, se identificó ggagggcccaaguccuucugau (SEQ ID NO: 744) como el posible miARN maduro del tallo 5'. Su validación de presencia se realizó utilizando la secuencia del cebador GGAGGGCCCAAGTCCTTCTGAT (SEQ ID NO:749). Se identificó el tallo-bucle de miR-55 de Caenorhabditis remanei como miARN similar. La validación del cebador se llevó a cabo de nuevo mediante qRT-PCR.

crm-miR-55-5p: 4-17 (SEQ ID NO: 750)

A P 000318.1 20 c c c a a g u c c u u c u g 7

l i l i l í I I I I I

crm-miR-55-5p 4 cccaagugcuucug 17

AL161626.1-201 (SEQ ID NO: 740)

Gen : AL161626.1 ENSG00000241781

>9 ^adn : ^{cromosoma cromosoma} :GRCh37 : 9: 79186731: 79186787 :1

CGCCGGGACCGGGGTCCGGGGCGGAGTGCCCTTCCTCCTGGGAAACGGGGTGCGGC

Para miARN maduro putativo AL161626.1-201, se identificó ggcggagugcccuucuuccugg (SEQ ID NO: 743) como el posible miARN maduro del tallo 5'. Su validación de presencia se realizó utilizando la secuencia del cebador CGGAGTGCCCTTCTTCCT (SEQ ID NO:751). Se identificaron el tallo-bucle de miR164c de zea mays y el tallo-bucle de miR164f de Achypodium distachyon como miARN similares. La validación del cebador se llevó a cabo de nuevo mediante qRT-PCR.

zma-miR164c-3p: 4-15 (SEQ ID NO: 752)

A L161626.1 5 g u g c c c u u c u u c 16

11111111111

z m a - m i R l 64 c - 3 p 4 g u g c c c u u c u u c 15

AC004943.1 (SEQ ID NO: 741)

Gen : AC004943.1 ENSG00000265573

>16 ^adn : ^{cromosoma cromosoma} :GRCh37: 16: 72821592 : 72821672 :-1

GCTTCACGTCCCCACCGGCGGCGGCGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGCGGCGGCGGTGGCGG

CGGCGGCGGCGGCGGCGGCTC AL121897.1 (SEQ ID NO: 742)

Gen : AL121897.1 ENSG00000264308

>20 ^adn : ^{cromosoma cromosoma} :GRCh37 : 20 : 30865503 : 30865591:1

GCCGCCCCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCCGCTTTCGGCTCGGG

CCTCAGGTGAGTCGGAGGGGCCGGGCGCC ARN misceláneo (ARN misc), incluido putativo nuevo

ARN misc es la abreviatura de ARN misceláneo, un término general para una serie de ARN pequeño misceláneo. La función de transcripción miscelánea no está definida por otras claves de ARN.

Listado de ARN misceláneos previamente conocidos y novedosos identificados utilizando el conjunto de datos de secuencia de GENCODE:

Tabla 12: Identificación de miARN misc, que incluye secuencias de miARN misc nuevos putativos, usando GENCODE en exomas (EXO), microvesículas (MV) y células productoras. (Las lecturas de MV CTX0E0307EI están tergiversadas debido a la menor cantidad de material de partida - Tabla 10). Las ID de los transcritos se toman de la base de datos Ensembl (www.ensembl.org).

Entre el ARN misc, se encontraron las siguientes secuencias preferiblemente transportadas hacia abajo o hacia arriba en exosomas y MV: RPHI, RMRP y VTARN1-1 transportados hacia arriba y Y_A^rN.725-201 e Y_A^rN.125-201 hacia abajo respectivamente. RPHI es un componente H1 del ARN de la ribonucleasa P. El gen RMRP codifica el componente de ARN del ARN mitocondrial, que procesa endorribonucleasa que escinde el ARN mitocondrial en un sitio de cebado de replicación de ADN mitocondrial. Este ARN también interactúa con la subunidad catalítica de la transcriptasa inversa de la telomerasa para formar un complejo de ribonucleoproteína distinto que tiene actividad de ARN polimerasa dependiente de ARN y produce ARN de doble cadena que puede procesarse en ARN de interferencia pequeño. VTARN1-1 es el componente 1 de ARN de bóveda. Las bóvedas son ribonucleoproteínas citoplasmáticas grandes y están compuestas por una proteína de bóveda principal, MVP, 2 proteínas de bóveda menores, TEP1 y PARP4, y un componente de ARN no traducido, VTARN1-1. Y_ARN.725-201 y Y_ARN.125-201 son nuevos A ^rN misc y su función no está definida.

ARN misceláneo de metazoos

El ARN de partículas de reconocimiento de señales, también conocido como ARN 7SL, 6S, ffs o 4.5S, es el componente de ARN del complejo de ribonucleoproteínas de partículas de reconocimiento de señales (SRP). SRP es una ribonucleoproteína universalmente conservada que dirige el tráfico de proteínas dentro de la célula y permite que se secreten. El ARN de SRP, junto con una o más proteínas de SRP, contribuye a la unión y liberación del péptido señal. Los componentes de ARN y proteínas de este complejo están muy conservados, pero varían entre los diferentes reinos de la vida.

Listado de ARN misc de metazoos de alto rango identificados utilizando el conjunto de datos de secuencia GENCODE:

Tabla 13: Identificación de las secuencias de ARN de partículas de reconocimiento de señal (ARN misc) usando GENCODE en exomas (EXO), microvesículas (MV) y células productoras. Las ID de los transcritos se toman de la base de datos Ensembl (www.ensembl.org).

ARNR (ARN ribosómico)

El ARN ribosómico (ARNr) forma parte del orgánulo sintetizador de proteínas conocido como ribosoma y que se exporta al citoplasma para ayudar a traducir la información del ARN mensajero (ARNm) en proteína. Los componentes del ARNr del ribosoma eucariota (80S) son: unidad grande (ARNr 5S, 5.8S y 28S), unidad pequeña (ARNr 18S). Tanto el ARNr 28S como el 5.8S se transportan hacia arriba selectivamente en exosomas y MV.

Listado de ARNr de alto rango identificados utilizando el conjunto de datos de secuencia de GENCODE:

Tabla 14: Identificación de las secuencias de ARNr usando GENCODE en exornas (EXO), microvesículas (MV) y células productoras. Las ID de los transcritos se toman de la base de datos Ensembl (www.ensembl.org).

ARN nucleolar pequeño: ARNnup

Los ARN nucleolares pequeños (ARNnup) son una clase de moléculas de ARN pequeñas que guían principalmente las modificaciones químicas de otros ARN, principalmente los ARN ribosómicos, los ARN de transferencia y los ARN nucleares pequeños. Hay dos clases principales de ARNnup, los ARNnup de caja C/D que están asociados con la metilación, y los ARNnup de caja H/ACA que están asociados con pseudouridilación.

Listado de ARNnup de alto rango identificados utilizando el conjunto de datos de secuencia de GENCODE:

Tabla 15: Identificación de secuencias de ARNnup usando GENCODE en exomas (EXO), microvesículas (MV) y células productoras. Las ID de los transcritos se toman de la base de datos Ensembl (www.ensembl.org).

ARN nuclear pequeño (ARNnp)

El ácido ribonucleico nuclear pequeño (ARNnp), también conocido comúnmente como U-ARN, es una clase de moléculas de ARN pequeño que forman el espliceosoma principal, se denominan U1, U2, U4, U5 y U6, y participan en varias interacciones ARN-ARN y ARN-proteína. Su función principal es el procesamiento de pre-ARNm (ARNnh) en el núcleo. También se ha demostrado que ayudan en la regulación de los factores de transcripción (ARN 7SK) o la ARN polimerasa II (ARN B2) y en el mantenimiento de los telómeros.

Listado de ARNnp de alto rango identificados utilizando el conjunto de datos de secuencia de GENCODE:

Tabla 16A: Identificación de secuencias de ARNnp usando GENCODE en exomas (EXO), microvesículas (MV) y células productoras. Las ID de los transcritos se toman de la base de datos Ensembl (www.ensembl.org).

ARNncig y ARNncig nuevo

Los ARN no codificantes intergénicos grandes (ARNncig) están emergiendo como reguladores clave de diversos procesos celulares. Determinar la función de los ARNncig individuales sigue siendo un desafío. Los ARN no codificantes largos (ARNnc largos, ARNncl) son transcritos no codificantes de proteínas de más de 200 nucleótidos. Listado de ARNncig de alto rango previamente conocidos y nuevos identificados utilizando el conjunto de datos de secuencia de GENCODE:

Tabla 16B: Identificación de secuencias de ARNncig y ARNncig nuevas putativas usando GENCODE en exornas (EXO), microvesículas (MV) y células productoras. Las ID de los transcritos se toman de la base de datos Ensembl (www.ensembl.org).

El ARNncig de GAS5 se expresa mucho en las células productoras en comparación con los exosomas y las microvesículas (transportado hacia abajo tanto en los exosomas como en las MV).

ARNm

También se identificaron ARNm de secuenciación codificante.

Tabla 17: Identificación de secuencias de ARNm usando GENCODE en exomas (EXO), microvesículas (MV) y células productoras. Las ID de los transcritos se toman de la base de datos Ensembl (www.ensembl.org).

Ejemplo 12: Conclusión

El objetivo principal del análisis de secuencia profunda fue identificar sus componentes de miARN en vesículas derivadas de células madre neurales (exosomas y microvesículas). Este análisis identificó un nuevo conjunto de miARN conocidos y nuevos que se transportan preferiblemente tanto a los exosomas como al MV. Entre los miARN identificados ya incluidos en la base de datos mirbase estaban hsa-miR-1246, hsa-miR-4488, hsa-miR-4492, hsa-miR-4508, hsa-miR-4516, hsa-miR-4532, y entre los nuevos miARN estaban AC079949.1, AP000318.1, AL161626.1, AC004943.1, AL121897.1. Los miARN transferidos de alto rango, incluidos los nuevos, se validaron mediante qRT-PCR en exosomas.

La distribución por tamaño del ARN transportador, como se muestra en el presente documento, está principalmente en el intervalo de 20 a 200 nt y las células liberan otras especies de ARN en el espacio extracelular. Mediante secuenciación profunda y análisis de conjuntos de secuencias GENCODE, se encontró una mayor complejidad y diversidad de transcritos de ARN no codificantes. Se extendió este análisis con una evaluación detallada y esto condujo al descubrimiento del transporte preferiblemente hacia arriba (definido como el log2 de las veces que cambia > 2) y hacia abajo (definido como log2 de las veces que cambia < -2) de otros ARN no codificantes tanto en exosomas como en microvesículas. Se encontró ARN no codificante transportado diferencialmente en casi todos los subtipos de ARN no codificante, ARN ribosómico (ARNr), nucleolar pequeño (ARNnup), ARN nuclear pequeño (ARNnp), microARN (miARN), otros ARN misceláneos (Ar N misc, p. ej., RMRP, ARN de bóveda SRP de metazoos y RNY) y ARN no codificantes intergénicos grandes (ARNncig).

La distribución desigual de las especies de ARN detectadas sobre el ARN celular y transportador, combinada con la creciente evidencia de su papel en la regulación génica, sugiere fuertemente que las células liberan específicamente estos ARN para modificar la función de las células objetivo.

Ejemplo 13: Análisis proteómico

Métodos

Se prepararon fracciones de exosomas y microvesículas a partir de un cultivo Integra de células CTX0E03 (semana 2), usando ultracentrifugación diferencial. Los exosomas y las microvesículas se rompieron en tampón RIPA modificado (Tris HCl 50 mM, pH 8.0, NaCl 150 mM, SDS al 1 %, Triton X100 al 0.1 %, DTT 10 mM, inhibidor de proteasa completo 1x (Roche) y inhibidor de fosfatasa PhosStop 1x (Roche)) y se sometieron a corte manual utilizando una jeringa de tuberculina de 1 mL y una aguja de calibre 25. Las muestras se volvieron a cuantificar después de la interrupción utilizando el fluorómetro Qubit (Invitrogen). Se cargaron 20 |jg de cada muestra en un gel SDS-PAGE al 4-12 % (Novex, Invitrogen). El gel se cortó en cuarenta segmentos por carril y los cortes de gel se procesaron utilizando un robot (ProGest, DigiLab) con el siguiente protocolo:

a) lavar con bicarbonato de amonio 25 mM seguido de acetonitrilo;

b) reducir con ditiotreitol 10 mM a 60 °C seguido de alquilación con yodoacetamida 50 mM a temperatura ambiente; c) digerir con tripsina (Promega) a 37 °C durante 4 h;

d) inactivar con ácido fórmico;

e) el sobrenadante se analizó por espectrometría de masas directamente sin procesamiento adicional.

Espectrometría de masas

Cada gel digerido se analizó mediante LC/MS/MS nano con un sistema de HPLC NanoAcquity de Waters conectado a un ThermoFisher Q Exactive. Los péptidos se cargaron en una columna de captura y se eluyeron en una columna analítica de 75 jm a razón de 350 nL/min; ambas columnas se rellenaron con resina Jupiter Proteo (Phenomenex). El espectrómetro de masas se hizo funcionar en modo dependiente de datos, con MS y MS/MS realizados en el Orbitrap a una resolución de 70,000 FWHM y 17,500 FWHM, respectivamente.

Exosomas

Se identificaron 2572 proteínas por espectrometría de masas en exosomas purificados por ultracentrifugación. Los exosomas se aislaron de las etapas iniciales de un cultivo Integra (semana 2). Los nombres de los genes y los correspondientes números de acceso de SWISSPROT (entre paréntesis) de todas las 2572 proteínas se enumeran en la Tabla 18 (en orden alfabético del nombre del gen) y las 100 proteínas más abundantes se enumeran en la Tabla 19, en orden decreciente de abundancia. Los marcadores de exosomas característicos CD9, CD81 y Alix (también conocidos como PDCD6IP) están presentes en las 100 proteínas más abundantes.

Tabla 18: Nombres de los genes y números de acceso de SWISSPROT de todas las 2572 proteínas identificadas en los exosomas de CTX0E03 (enumerados en orden alfabético del nombre del gen).

Tabla 19: Las 100 proteínas más abundantes (nombre y número de acceso de SwissProt) observadas en los exosomas de CTX0E03

Microvesículas

Se identificaron 2940 proteínas por espectrometría de masas en microvesículas aisladas de las etapas iniciales de un cultivo Integra (semana 2) y purificadas por centrifugación a 10,000 x g. Los nombres de los genes y los números de acceso SWISSPROT correspondientes (entre paréntesis) de las 2940 proteínas se enumeran en la Tabla 20 (en orden alfabético del nombre del gen) y las 100 proteínas más abundantes se enumeran en la Tabla 21, en orden de abundancia decreciente.

Tabla 20: Nombres de genes y números de acceso de SWISSPROT de las 2940 proteínas identificadas en las microvesículas CTX0E03 (enumeradas en orden alfabético del nombre del gen).

Tabla 21: Las 100 proteínas más abundantes (nombre y número de acceso del SwissProt) en microvesículas

CTX0E03

Discusión de datos proteómicos

CD63 (también conocido como MLA1 y TSPAN30), TSG101 (también conocido como subunidad TSG101 del complejo ESCRT-I), CD109 (también conocido como proteína de unión a TGF-beta-1 de 150 kDa) y thy-1 (también conocido como CD90) se detectaron tanto en exosomas como en microvesículas.

También se detectaron otras tetraspaninas: se detectaron tetraspanina-4, -5, -6, -9 y 14 se detectaron en la fracción del exosoma; se detectaron tetraspaninas-6 y -14 en las microvesículas.

CD133 (también conocido como AC133, Prominin-1, PROM1, PROML1 y MSTP061) se detectó en los exosomas pero no en las microvesículas.

CD53 (también conocido como MOX44 y TSPAN25), CD82 (también conocido como KAI1, SAR2, ST6 y TSPAN27), CD37 (también conocido como TSPAN26) y el ligando CD40 (también conocido como CD40LG, CD40L y TNFSF5) no se detectaron en los exosomas o las microvesículas.

Se detectaron nestina, GFAP y la cadena beta-3 de tubulina (también conocida como TUBB3) tanto en las fracciones de exosomas y microvesículas, siendo particularmente prominente con la cadena beta-3 de tubulina dentro de las 100 proteínas principales en ambas fracciones. No se detectaron Sox2, DCX, GALC, GDNF e IDO.

No se detectaron selectinas ni TNFRI (también conocidos como receptor 1 de TNF, TNFRSF1A, TNFAR y TNFR1).

Se detectaron las integrinas alfa-2, -3, -4, -5, -6, -7, -V y la integrina beta-1, -4 y -8 tanto en fracciones de exosomas como de microvesículas. Las integrinas beta-3 y -5 se detectaron solo en las microvesículas.

Se detectaron antígenos del MHC de clase I (p. ej., HLA_A1, HLA-A2 y HLA-B27) tanto en los exosomas como en las microvesículas.

Se detectaron moléculas de adhesión celular (p. ej., CADM1, CADM4, ICAM1, JAM3, L1CAM, NCAM) tanto en los exosomas como en las microvesículas.

Se detectaron proteínas del citoesqueleto (p. ej., actina, vimentina, queratinas, cateninas, distroglucano, polipéptido de neurofilamento, proteína asociada a microtúbulos, tubulina, desmoplactina, plectina, placofilina, septina, espectrina, talina, vinculina y zyxina) en las fracciones de exosomas y microvesículas. Se detectaron GTPasas, clatrina, chaperonas, proteínas de choque térmico (p. ej., Hsp90, Hsp70), factores de empalme, factores de traducción, anexinas y factores de crecimiento (p. ej., TGF-beta) tanto en los exosomas como en las microvesículas.

Se detectaron Galectina-3, TIMP-1, trombospondina-1, receptor de EGF y CSK tanto en los exosomas como en las microvesículas.

La Figura 18 compara los datos proteómicos de los exosomas y las microvesículas. La Figura 18A ilustra el número de proteínas únicas dentro de cada población de micropartículas, aisladas del sistema de cultivo Integra de la semana 2. La Figura 18B compara los procesos biológicos asociados con las proteínas identificadas dentro de cada población de micropartículas, aisladas del sistema Integra de la semana 2. Las proteínas identificadas dentro de exosomas y microvesículas están asociadas con procesos biológicos muy similares.

Las proteínas asociadas con el metabolismo de la biotina solo se encontraron en los exosomas y las proteínas involucradas en la biosíntesis del triptófano y el metabolismo de taurina/ácido alfa-linolénico solo se identificaron en las microvesículas.

La Figura 18C compara el proteoma de CTX0E03 con el proteoma del exosoma de células madre mesenquimales divulgado en Lai et al., 2012, en el que se identificaron un total de 857 proteínas en exosomas liberados de células madre mesenquimales.

La Figura 18D compara los procesos biológicos asociados con las proteínas identificadas dentro de los exosomas derivados de MSC (Lim 2012) con los exosomas derivados de células madre neurales de la divulgación. Los tres procesos biológicos que se asociaron solo con los exosomas derivados de MSC son (en orden de importancia decreciente): asma; biosíntesis de fenilalanina, tirosina y triptófano; e inmunodeficiencia primaria. Los treinta procesos biológicos que se encontraron asociados solo con los exosomas derivados de células madre neurales se muestran en la Figura 19; la función biológica más significativa identificada se relaciona con la ARN polimerasa.

Una comparación adicional de los 197 procesos biológicos compartidos por los exosomas derivados de MSC y los exosomas derivados de NSC muestra que los exosomas de NSC contienen notablemente más procesos involucrados en la degradación del ARN, el ribosoma y los espliceosomas, en comparación con los exosomas de MSC.

La comparación anterior indica una serie de diferencias significativas entre los exosomas derivados de NSC y los exosomas derivados de MSC (como los caracteriza Lim et al., 2012). Las 4 diferencias biológicas más significativas identificadas como presentes en los exosomas de NSC en comparación con los muy bajos/ausentes identificados por el grupo de Lim, todas involucran proteínas asociadas con la producción, el empaquetamiento, la función y la degradación del material genético, es decir, ARN polimerasa, degradación del ARN, ribosomas y espliceosomas.

Ejemplo 14: Distribución de tamaño de micropartículas

Se realizó un análisis NanoSight para determinar el tamaño de partícula y la concentración de microvesículas ("mv1" a "mv6") y exosomas ("exo1" a "exo6") aisladas de células CTX0E03 cultivadas en el sistema Integra CELLine durante 1, 2, 3, 4, 5 y 6 semanas. Todos los resultados se basan en 5 mediciones repetidas.

La distribución del tamaño de las partículas se midió utilizando el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). NTA detecta el movimiento de partículas en solución y lo relaciona con el tamaño de partícula. Se calculó el modo y la mediana del tamaño de partícula para todas las muestras. Las muestras de exosomas se analizaron utilizando los ajustes de cámara más sensibles para capturar las vesículas más pequeñas. Las muestras de microvesículas se analizaron utilizando configuraciones de cámara menos sensibles para evitar la sobreexposición de las vesículas más grandes. Como resultado, no se detectaron algunas vesículas más pequeñas en las muestras. Aunque estaban presentes vesículas más pequeñas en las muestras de MV, estas representan un pequeño porcentaje de la muestra en términos de masa.

Una proporción de Exo1 se marcó con un colorante fluorescente específico de membrana (CellMaskMC) y una combinación de análisis NTA con el etiquetado con CellMaskMC confirmó que los eventos detectados por NTA corresponden a vesículas de membrana (datos no mostrados).

Los resultados se muestran en la Tabla 22 a continuación y en la Figura 17.

Los exosomas muestran una caída de tamaño en la sexta semana, de un modo de aproximadamente 110 nm a aproximadamente 70 nm, o de una mediana de aproximadamente 130 nm a aproximadamente 75 nm. El intervalo de tamaño general, de 70 nm a 150 nm, es consistente con el tamaño de los exosomas de otros tipos de células, descritos en la técnica. La reducción observada en el tamaño de los exosomas a alrededor de 70 nm de diámetro después de cultivar las células durante 6 semanas se correlaciona con el aumento de la eficacia de los exosomas aislados de células CTX0E03 que se han cultivado en un biorreactor de múltiples compartimentos durante 6 semanas, como se indica en el Ejemplo 8 y la Figura 6.

También se observa que la concentración de microvesículas y exosomas disminuye durante el período de seis semanas de la Figura 17, reflejando ampliamente la eficacia mejorada observada con el tiempo.

Las microvesículas son, como se esperaba, más grandes, con un diámetro modal de aproximadamente 150 nm - 200 nm, o un diámetro medio de aproximadamente 180 nm - 350 nm.

Tabla 22: Distribución de tamaños de microvesículas exosomas de CTX0E03.

Ejemplo 15: Exosomas producidos por células progenitoras CD34+ humanas derivadas de la sangre de cordón umbilical condicionalmente inmortalizadas con un lentivirus c-mycERTAM.

Las células progenitoras CD34+ humanas derivadas de la sangre del cordón umbilical se inmortalizaron condicionalmente con un lentivirus c-mycERTAM. qRT-PCR confirmó la presencia de ARNm de c-mycERTAM en progenitores de CD34+ humanos infectados con lentivirus derivados de sangre del cordón umbilical (como se muestra en la Figura 20A).

A continuación, se realizó un análisis de transferencia Western de los exosomas de los sobrenadantes de cultivos celulares. El análisis de las muestras se realizó como se especifica a continuación:

1. Concentración de exosomas de dos muestras de sobrenadante celular, 1 mL de volumen cada una, utilizando inmunoperlas de captura de exosomas;

2. Análisis SDS-PAGE y transferencia Western para la expresión de proteínas comunes asociadas a exosomas (Alix y HSP70), incluido el control de normalización y la muestra de referencia con expresión conocida de los marcadores analizados y contenido de proteína conocido.

Material analizado:

Las alícuotas del sobrenadante del cultivo celular contenían tres viales de 1.5 mL aislados de CD34 y

células c-mycERTAM CD34 condicionalmente inmortalizadas, almacenadas a -80 °C hasta su procesamiento. Descripción de la actividad:

Los exosomas se capturan y concentran a partir de sobrenadantes previamente aclarados mediante incubación con inmunoperlas de captura de exosomas ON a 4 °C.

Después de la recuperación de las inmunoperlas, el sobrenadante restante se ultracentrifugó durante 2 horas a 120.000 x g para precipitar los exosomas residuales (si los hubiera) y comprobar la eficacia de la inmunocaptura.

Los sedimentos totales de IP y UC, correspondientes cada uno a 1 mL de las muestras de sobrenadante originales, se lisaron y cargaron en gel y se analizaron por transferencia Western para Alix (una proteína involucrada en la concentración y clasificación de proteínas de carga a nivel del cuerpo multivesicular y la incorporación en vesículas de IL), expresadas de forma ubicua en todos los exosomas) y HSP70 (chaperona molecular que facilita el ensamblaje de complejos de multiproteína, participan en la translocación de polipéptidos a través de las membranas celulares, expresadas en exosomas de la mayoría de las células humanas similares a las epiteliales).

Los sobrenadantes concentrados eran demasiado densos y, por lo tanto, no eran adecuados para el análisis de transferencia Western.

Resultados generales del análisis:

Muestra de control: Primero se aplicó el protocolo a una muestra de control, sobrenadante derivado de un cultivo de células humanas, lo que demuestra que 1 mL de muestra es suficiente para obtener una señal de alta expresión.

Se recolectó sobrenadante de la muestra de control de un cultivo celular de 72 horas al 80 % de confluencia, de manera que 1 mL de medio acondicionado correspondía a 1,1 * 106 células con un rendimiento total de 8.3 |jg de concentración total de proteína de exosomas/mL de sobrenadante.

Como referencia para estimar la densidad de la banda, se cargaron tres concentraciones diferentes de exosomas purificados del mismo sobrenadante de cultivo de células humanas.

Como se esperaba, la muestra inmunoprecipitada (de 1 mL de sobrenadante) produce una señal comparable a la de 5 - 10 jg de exosomas purificados. Este resultado se muestra en la Figura 20B.

Muestra: sobrenadante de cultivo celular

CD34

cmycERTAM CD34

Los exosomas de los sobrenadantes de la muestra se concentraron con éxito usando inmunoperlas de captura de exosomas (basadas en la unión de tetraspaninas como marcadores exosómicos comunes).

Las muestras cargadas después de la inmunoprecipitación (IP) muestran la expresión de Alix correspondiente a un rendimiento total de menos de 1 jg de exosomas, mientras que no se pueden apreciar diferencias claras entre dos muestras: tanto las células CD34+ como las c-MycERTam CD34+ producen exosomas. Se debe utilizar un método diferente para una comparación cuantitativa precisa. Las muestras parecen negativas para la expresión de HSP70 (posiblemente debido al tipo de tejido/célula). Estos resultados se muestran en la Figura 20C.

Se ha demostrado previamente que las inmunoperlas usadas precipitan los exosomas totales del sobrenadante celular, como lo confirma la ausencia de señal después de la ultracentrifugación (UC) de los sobrenadantes residuales. Lo mismo se confirmó también para la muestra analizada.

Referencias

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de una célula condicionalmente inmortalizada para producir micropartículas, donde la célula condicionalmente inmortalizada es:

(i) una célula madre mesenquimal, opcionalmente seleccionada de una célula madre derivada de médula ósea, una célula regenerativa endometrial, una célula progenitora mesenquimal, una célula madre derivada de tejido adiposo o una célula progenitora adulta multipotente;

(ii) una célula madre hematopoyética, opcionalmente una célula CD34+ y/o aislada de sangre de cordón umbilical, u opcionalmente una célula CD34+/CXCR4+;

(iii) una célula madre de sangre de cordón umbilical no hematopoyética;

(iv) una célula madre embrionaria muy pequeña (VSEL);

(v) una célula madre pluripotente inducida (iPS);

(vi) un fibroblasto; o

(vii) una célula dendrítica.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde la célula comprende c-mycER.

3. El uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde la micropartícula es un exosoma, una microvesícula, una partícula de membrana, una vesícula de membrana, una vesícula similar a un exosoma, una vesícula similar a un ectosoma, un ectosoma o una exovesícula.

4. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la célula es como se define en la reivindicación 1(i), 1(ii), 1(iii), 1(iv) o 1(v) y procede de una línea de células madre.

5. El uso de la reivindicación 4, donde la línea de células madre se cultiva en un medio sin suero.

6. El uso de cualquier reivindicación anterior, donde la micropartícula tiene:

(a) un tamaño de entre 30 nm y 1000 nm, o entre 30 y 200 nm, o entre 30 y 100 nm, determinado por microscopía electrónica; o

(b) una densidad en sacarosa de 1.1-1.2 g/mL.

7. El uso de cualquier reivindicación anterior, donde la micropartícula comprende ARN.

8. El uso de la reivindicación 7, donde el ARN es ARNm y/o miARN.

9. Un método para producir una micropartícula, que comprende aislar una micropartícula de un medio acondicionado de células condicionalmente inmortalizadas, donde la célula es como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

10. Un método para producir una micropartícula de acuerdo con la reivindicación 9, donde:

(i) el medio acondicionado con células comprende uno o más del factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), interferón gamma (INF-y) y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), que inducen la liberación de micropartículas por las células madre en el medio;

(ii) las células se cultivaron en condiciones hipóxicas;

(iii) las células se cocultivaron con un tipo de célula diferente;

(iv) las células se cultivaron en un biorreactor de múltiples compartimentos; y/o

(v) las células eran células madre parcialmente diferenciadas.

11. Un método de detección de un agente que altera la tasa de producción de una micropartícula por una célula condicionalmente inmortalizada, que comprende poner en contacto una célula condicionalmente inmortalizada como se define en la reivindicación 1 con un agente candidato y observar si la tasa de producción de micropartículas por la célula madre contactada aumenta o disminuye en comparación con un control.