ES2705052T5

ES2705052T5 - Micropartículas de células madre y ARNmi

Info

Publication number: ES2705052T5
Application number: ES14706666T
Authority: ES
Inventors: Lara Stevanato; Randolph Corteling; John Sinden
Original assignee: Reneuron Ltd
Current assignee: Reneuron Ltd
Priority date: 2013-02-12
Filing date: 2014-02-12
Publication date: 2022-10-20
Anticipated expiration: 2034-02-12
Also published as: CA2900895A1; EP2956146B1; JP2016513095A; US20150366897A1; AU2014217614A1; EP2956146A1; ES2705052T3; WO2014125276A1; EP2956146B2; GB201302468D0; AU2014217614B2; CN105120879A

Description

DESCRIPCIÓN

Micropartículas de células madre y ARNmi

Campo de la invención

Esta invención se refiere a ARNmi identificados en micropartículas de células madre.

Antecedentes de la invención

Las células madre tienen la capacidad de autorrenovarse y diferenciarse en tipos de células funcionalmente diferentes. Tienen el potencial de ser una herramienta poderosa en el creciente campo de la Medicina Regenerativa, en particular la terapia regenerativa que requiere el reemplazo, la regeneración o la reparación de tejidos (Banerjee et al. 2011). Sin embargo, existen inconvenientes en el uso de células madre en la terapia: existe la necesidad de un suministro constante y sustancial de células madre con estabilidad funcional y fenotípica y los altos costes asociados y el retraso de tiempo causado por la generación, almacenamiento, transporte y manejo de células; existe un requisito de compatibilidad inmunológica para evitar el rechazo de las células madre por parte del receptor; y hay problemas regulatorios complejos relacionados con los posibles riesgos de seguridad de la formación de tejido tumoral o ectópico. Además, a pesar de la eficacia terapéutica del trasplante de células madre, no hay evidencia convincente de un efecto directo a largo plazo de las células madre trasplantadas, por ejemplo, mediante el injerto y la diferenciación en células reparadoras o de reemplazo.

Las células madre neurales (NSC) son células madre multipotentes que se renuevan a sí mismas y generan neuronas, astrocitos y oligodendrocitos (Kornblum, 2007). El potencial médico de las células madre neurales está bien documentado. El tejido dañado del sistema nervioso central (SNC) tiene una capacidad regenerativa muy limitada, por lo que la pérdida de la función neurológica suele ser crónica y progresiva. Las células madre neurales (NSC) han mostrado resultados prometedores en la terapia basada en células madre de lesión o enfermedad neurológica (Einstein et al. 2008). Se ha demostrado que la implantación de células madre neurales (NSC) en los cerebros de los animales después de accidente cerebrovascular es seguida por una recuperación significativa en las pruebas motoras y cognitivas (Stroemer et al. 2009). No se comprende completamente cómo las NSC pueden restaurar la función en tejidos dañados, pero ahora se está reconociendo cada vez más que las NSC tienen propiedades de reparación multimodal, incluida la diferenciación celular apropiada para el sitio, la actividad proangiogénica y neurotrófica y la inmunomodulación que promueve la reparación tisular por el sistema inmunitario nativo y otras células huésped (Miljan & Sinden, 2009, Horie et al., 2011). Es probable que muchos de estos efectos sean dependientes de la señalización transitoria de las células madre neurales implantadas al medio huésped, por ejemplo, las NSC expresan de manera transitoria marcadores proinflamatorios cuando se implantan en el daño del tejido muscular isquémico que dirige y amplifica la respuesta inmunitaria proangiogénica y reguladora natural para promover la curación y la reparación (Hicks et al., datos no publicados). En el cerebro con accidente cerebrovascular crónico, las NSC también tienen un efecto neurotrófico sustancial. Por ejemplo, promueven la repoblación de tejido cerebral estriado con estrías dañadas con neroblastos positivos de doblecortina derivados del cerebro del huésped (Hassani, O'Reilly, Pearse, Stroemer et al, PLoS One. 2012; 7(11)).

Además, sobre la base de un gran cuerpo de efectos restauradores del SNC en modelos animales con accidente cerebrovascular crónico, ReNeuron Limited (Surrey, Reino Unido) está llevando a cabo un ensayo clínico con células madre neurales para probar el tratamiento de pacientes con accidente cerebrovascular discapacitados utilizando sus "CTX0E03" células madre neurales derivadas de la corteza condicionalmente inmortalizadas (Clinicaltrials.gov Identifier: NCT01151124).

Las células madre mesenquimales (MSC) son células madre de linaje restringido que tienen el potencial de diferenciarse solo en tipos de células mesenquimales, a saber, de los linajes adipocítico, condrocítico y osteocítico (Pittenger et al 1999; Ding et al. 2011). Las MSC (también denominadas células estromales mesenquimales y células progenitoras mesenquimales) se derivan de una variedad de fuentes que incluyen médula ósea, sangre, tejido adiposo y otros tejidos somáticos. El potencial terapéutico de las MSC, sin embargo, está más dirigido hacia la aplicación de sus propiedades proangiogénicas y de modulación inmune como células no diferenciadas. La producción de MSC humanas está limitada por la incapacidad de estas células para expandirse en números de manera estable más allá de aproximadamente 15-20 duplicaciones de población.

El medio acondicionado de células madre mesenquimales (MSC-CM) tiene una eficacia terapéutica similar a la de las propias MSC, lo que sugiere un mecanismo paracrino de la terapia basada en MSC (Timmers et al. 2007). El documento WO-A-2009/105044 describe que las partículas conocidas como exosomas, secretadas por las MSC, comprenden al menos una propiedad biológica de las MSC y sugieren el uso de estas partículas de MSC en terapia, mientras que Théry et al. 2011 proporciona una revisión general de los exosomas y otras vesículas secretadas similares. Si bien algunos de los inconvenientes de usar células madre directamente como agentes terapéuticos se superan con el uso de exosomas derivados de células madre mesenquimales (por ejemplo, almacenamiento, transporte y manejo), el problema sigue siendo proporcionar un suministro constante y sustancial de células madre funcional y fenotípicamente estables. Para producir los exosomas. Para uso terapéutico, los exosomas preferiblemente deben producirse a gran escala. En ausencia de una línea de células madre, se requiere la reposición de las células mediante la derivación repetida de una fuente de células madre, lo que incurre en costes recurrentes para la prueba y validación de cada nuevo lote. Además, las enfermedades y trastornos que pueden ser tratados por MSC pueden ser limitados.

Sigue habiendo una necesidad de terapias mejoradas basadas en células madre.

El documento WO-A-2011/149354 describe los ARNmi implicados en la función de la barrera hematoencefálica. La divulgación se refiere al uso de ácidos nucleicos particulares para modular la función de la barrera hematoencefálica y al uso de dichos ácidos nucleicos en el tratamiento de afecciones que implican la función de la barrera hematoencefálica, incluida la esclerosis múltiple, la infección por VIH, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la epilepsia. y así sucesivamente.

Resumen de la invención

La invención proporciona una composición que comprende los cuatro de: hsa-miR-1246 de la SEQ ID No.21, hsamiR-4492 de la SEQ ID NO.34, hsa-miR-4488 de la SEQ ID NO.61 y hsa-miR-4532 de la SEQ ID NO.23. Esta composición es opcionalmente una composición farmacéutica, que comprende un portador, diluyente, vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica es adecuada para su uso en terapia.

La terapia puede ser una terapia regenerativa que requiere el reemplazo de tejido, la regeneración o la reparación, por ejemplo, cuando la terapia requiere angiogénesis, neurogénesis y/o neuroprotección. La terapia puede ser por una enfermedad neurológica, trastorno o déficit. La terapia puede mejorar la recuperación funcional y/o cognitiva. La terapia puede ser de apoplejía, enfermedad arterial periférica, neuropatía o cualquier otra enfermedad o trastorno que requiera la regeneración de tejidos, revascularización o acción antiinflamatoria local, que incluye:

(i) Trastorno, enfermedad o déficit neurológico, como enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular o ELA;

(ii) Trastornos de almacenamiento lisosómico;

(iii) Trastornos cardiovasculares, como infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca congestiva, enfermedad arterial periférica, úlceras diabéticas, cicatrización de heridas;

(iv) Enfermedades de los pulmones, incluidos fibrosis pulmonar idiopática, síndrome de dificultad respiratoria, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, hipertensión pulmonar idiopática, fibrosis quística y asma;

(v) Trastornos metabólicos o inflamatorios, como diabetes (I o II), artritis reumatoide, osteoartritis, lupus, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria del intestino o enfermedad de injerto contra huésped;

(vi) Trastornos psiquiátricos, como depresión, trastorno bipolar, esquizofrenia o un trastorno del síndrome autista como autismo, síndrome de Asperger o síndrome de Rett;

(vii) Enfermedades de la retina causantes de ceguera, como degeneración macular relacionada con la edad, enfermedad de Stargardt, retinopatía diabética, retinitis pigmentaria; y

(viii) Enfermedades desmielinizantes, como esclerosis múltiple, parálisis cerebral, mielinolisis pontina central, tabes dorsalis, mielitis transversa, enfermedad de Devic, leucoencefalopatía multifocal progresiva, neuritis óptica, leucodistrofia, síndrome de Guillain-Barré, neuropatía periférica anti-MAG y enfermedad dental de Marie-Chotot. Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra micrografías electrónicas de células madre neurales condicionadas por CTX0E03 que producen micropartículas. Los paneles A-E muestran cuerpos multivesiculares (MVB) intracelulares que contienen exosomas entre 30 nm y 50 nm de diámetro y el Panel F muestra microvesículas >100 nm de diámetro liberadas por las células madre neurales a través de un proceso de brote en la membrana celular.

La Figura 2 es un protocolo de esquema para la identificación, caracterización y producción de micropartículas a partir de células madre.

La Figura 3 muestra la lectura óptica de la densidad de la tira ELISA de angiogénesis humana realizada en medio condicionado y no acondicionado CTX0E03.

La Figura 4A muestra la cantidad de proteína (medida por el ensayo BCA) extraída de 15 ml de medios que contienen micropartículas purificadas del sistema Integra en comparación con las condiciones de cultivo normales (3 días T175). La Figura 4B muestra la detección de FACS (a 2ug/ml, 1:250) de (i) CD63 en exosomas CTX0E03 cultivados con Integra (panel superior izquierdo) y microvesículas (panel superior derecho) y (ii) CD81 en exosomas CTX0E03 cultivados en Integra (panel inferior izquierdo) y microvesículas (panel inferior derecho).La Figura 5 muestra la cantidad de ARN total aislado medido a 260/280nm extraído de 15 ml de medio que contenía micropartículas purificadas por filtración del sistema Integra en comparación con las condiciones de cultivo normales (3 días T175).

La Figura 6A muestra los resultados de un ensayo de cierre/raspado de herida que representa la actividad de migración de los fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) cultivados en medios condicionados con CTX0E03 o tras la adición de exosomas CTX0E03 purificados. La Figura 6B muestra los resultados de un ensayo de raspado después de 72 horas, comparando el efecto de 10 |jg de exosomas CTX0E03 con condiciones basales (sin exosomas). La Figura 6C muestra el % de áreas curadas para condiciones basales, 2 jg/m l de exosomas, 6 jg/m l de exosomas, 20 jg/m l de exosomas y un control positivo LSGS (suplemento de bajo crecimiento en suero). El panel superior de la Figura 6C muestra exosomas aislados de células CTX0E03 cultivadas durante 2 semanas en el sistema Integra Celline y el panel inferior de la Figura 6C muestra exosomas aislados de células CTX0E03 cultivadas durante 6 semanas en el sistema Integra Celline. La Figura 6D compara las células CTX0E03 con un control negativo (solución salina) en un ensayo de curación de heridas por inyección in vivo.

La Figura 7 muestra la cantidad de exosomas purificados obtenidos por medio de cultivo de los cultivos estándar CTX0E03 (T175) frente al sistema Integra CELLine en el punto temporal de 3 semanas.

La Figura 8A muestra la concentración de exosomas recolectados de dos matraces diferentes después de 1 semana, 2 semanas y 3 semanas de sistema de cultivo CELLINE de CTX0E03 Integra. La Figura 8B muestra la concentración de exosomas recolectados de un solo matraz Integra CELLine durante un cultivo continuo de 6 semanas de células CTX0E03.

La Figura 9 muestra el cambio en los niveles de expresión de diversos marcadores de ARNm medidos en células CTX0E03 cultivadas durante 3 semanas en el sistema Integra CELLine en comparación con los cultivos estándar ("control") CTX0E03 (T175).

La Figura 10 muestra la regulación de multiplicidad hacia arriba y hacia abajo de varios ARNmi en exosomas obtenidos de células CTX0E03 cultivadas durante 3 semanas en cultivo en biorreactor Integra y micropartículas obtenidas de cultivos estándar CTX0E03 (T175), evaluados contra un nivel de expresión de línea de base en células CTX0E03 en cultivo estándar (T175).

La Figura 11 muestra los perfiles de ARNmi obtenidos a partir de la secuenciación profunda de ARNmi de células CTX0E03 ("CTX"), microvesículas ("MV") y exosomas ("EXO") cultivados en condiciones estándar (T175). Las Figuras 11a y 11b muestran los resultados de dos cultivos.

La Figura 12 muestra el efecto de las microvesículas de hNSC en la angiogénesis de HUVEC. La Figura 12A es una fotografía que muestra el claro aumento en la formación de tubos observada cuando se agregan microvesículas (paneles de la derecha) en comparación con las HUVEC basales. Las Figuras 12B y 12C muestran el aumento en la longitud total del tubo provisto por las microvesículas de hNSC a diversas concentraciones (0.05 jg , 0.1 jg , 0.3 jg -Figura 12B; y 0.6jg/ml - Figura 12C).

La Figura 13 muestra el efecto de las microvesículas de hNSC sobre el crecimiento de neuritas en células PC-12.

La Figura 14 es un electroferograma que muestra el perfil de contenido de ARN total en células CTX0E03, exosomas y microvesículas según lo determinado por el bioanalizador de ARN de Agilent.

La Figura 15 es una presentación esquemática del porcentaje de genes codificadores que se superponen completamente con el exón, y los transcriptos no codificadores localizados con intrón o secuencias intergénicas (producidos al ejecutar archivos BAM de NGS contra el conjunto de datos de secuencia GENCODE).

La Figura 16 muestra la clasificación superior de los ARNmi preferidos de forma preferente en exosomas y MV en comparación con las células productoras CTX0E03.

La Figura 17 muestra los resultados del análisis de NanoSight realizado para determinar el tamaño de partícula y la concentración de exosomas CTX0E03 (Figura 17A) y microvesículas (Figura 17B) cultivadas en el sistema Integra Celline durante 1, 2, 3, 4, 5 y 6 semanas.

La Figura 18 muestra los diagramas de Venn que comparan los datos proteómicos de los exosomas y microvesículas CTX0E03 (18A y 18B), y que comparan los exosomas de células madre neurales con los exosomas de células madre mesenquimales (18C y 18D). La Figura 18A ilustra la cantidad de proteínas únicas dentro de los exosomas y microvesículas CTX0E03, aisladas del sistema de cultivo Integra de la semana 2. La Figura 18B compara los procesos biológicos asociados con las proteínas identificadas dentro de los exosomas y microvesículas CTX0E03. La Figura 18C compara el proteoma del exosoma de células madre neurales CTX0E03 con un proteoma del exosoma de células madre mesenquimales, y la Figura 18D compara los procesos biológicos asociados con las proteínas identificadas en los exosomas derivados de MSC con los exosomas derivados de células madre neurales.

La Figura 19 muestra los 30 procesos biológicos que se encuentran asociados con exosomas derivados de NSC y no con exosomas de células madre mesenquimales.

Descripción detallada de la invención

Los presentes inventores han identificado sorprendentemente micropartículas en células madre neurales. Estas micropartículas conservan algunas de las funciones de las células madre neurales de las que se derivan y, por lo general, son terapéuticamente útiles para los mismos tratamientos que las células madre neurales. El Ejemplo 12 (y la Figura 11 relacionada) muestra los resultados de la secuenciación profunda de ARNmi presente en micropartículas producidas por células madre neurales. Este ejemplo muestra que, sorprendentemente, el número de especies de ARNmi diferentes presentes en las micropartículas se reduce enormemente en comparación con el número de especies de ARNmi diferentes presentes en las células; las micropartículas contienen menos de 120 ARNmi diferentes, mientras que las células contienen entre 450 y 700 especies de ARNmi. Las micropartículas contienen una mayoría de hsa-miR-1246.

Los datos en el Ejemplo 12 también muestran que las micropartículas se caracterizan por cuatro especies principales de ARNmi, a saber, hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532.

Micropartículas de células madre neurales

La divulgación proporciona, en un aspecto, micropartículas obtenibles a partir de una célula madre neural. Una micropartícula de células madre neurales es una micropartícula que es producida por una célula madre neural. Típicamente, la micropartícula es secretada por la célula madre neural. Más típicamente, la micropartícula es un exosoma o una microvesícula. Las micropartículas de otras células, como las células madre mesenquimales, son conocidas en la técnica.

Una "micropartícula" es una vesícula extracelular de 30 a 1000 nm de diámetro que se libera de una célula. Está limitada por una bicapa lipídica que encierra moléculas biológicas. El término "micropartícula" es conocido en la técnica y abarca varias especies diferentes de micropartículas, incluyendo una partícula de membrana, vesícula de membrana, microvesícula, vesícula similar a exosoma, exosoma, vesícula similar a ectosoma, ectosoma o exovesícula. Los diferentes tipos de micropartículas se distinguen según el diámetro, el origen subcelular, su densidad en sacarosa, la forma, la velocidad de sedimentación, la composición lipídica, los marcadores de proteínas y el modo de secreción (es decir, siguiendo una señal (inducible) o espontáneamente (constitutiva)).

Cuatro de las micropartículas comunes y sus características distintivas se describen en la Tabla 1, a continuación.

Tabla 1: Diversas micropartículas

Se cree que las micropartículas desempeñan un papel en la comunicación intercelular actuando como vehículos entre un donante y una célula receptora a través de mecanismos directos e indirectos. Los mecanismos directos incluyen la captación de la micropartícula y sus componentes derivados de células donantes (como proteínas, lípidos o ácidos nucleicos) por la célula receptora, teniendo los componentes una actividad biológica en la célula receptora. Los mecanismos indirectos incluyen la interacción de la superficie celular entre la microvesícula y el receptor, y causan la modulación de la señalización intracelular de la célula receptora. Por lo tanto, las micropartículas pueden mediar en la adquisición de una o más propiedades derivadas de la célula donante por parte de la célula receptora. Se ha observado que, a pesar de la eficacia de las terapias con células madre en modelos animales, las células madre no parecen injertarse en el huésped. En consecuencia, el mecanismo por el cual las terapias con células madre son efectivas no está claro. Sin desear estar limitados por la teoría, los inventores creen que las micropartículas secretadas por las células madre neurales desempeñan un papel en la utilidad terapéutica de estas células y, por lo tanto, son terapéuticamente útiles por sí mismas.

Las micropartículas y las células madre de la divulgación están aisladas. El término "aislada" indica que la micropartícula, la población de micropartículas, la célula o la población celular a la que se refiere no se encuentra dentro de su entorno natural. La micropartícula, población de micropartículas, célula o población celular se ha separado sustancialmente del tejido circundante. En algunas realizaciones, la micropartícula, la población de micropartículas, la célula o la población celular están sustancialmente separadas del tejido circundante si la muestra contiene al menos aproximadamente el 75%, en algunas realizaciones al menos aproximadamente el 85%, en algunas realizaciones al menos aproximadamente el 90%, y en algunas realizaciones al menos aproximadamente el 95% de micropartículas y/o células madre. En otras palabras, la muestra está sustancialmente separada del tejido circundante si la muestra contiene menos de aproximadamente el 25%, en algunas realizaciones menos de aproximadamente el 15% y en algunas realizaciones menos de aproximadamente el 5% de materiales distintos de las micropartículas y/o células madre. Tales valores porcentuales se refieren al porcentaje en peso. El término abarca células o micropartículas que se han eliminado del organismo del que se originaron y existen en el cultivo. El término también abarca células o micropartículas que se han extraído del organismo del que se originaron, y posteriormente se reinsertaron en un organismo. El organismo que contiene las células reinsertadas puede ser el mismo organismo del que se extrajeron las células, o puede ser un organismo diferente.

Las células madre neurales producen micropartículas de forma natural mediante una variedad de mecanismos, incluida el brote de la membrana plasmática (para formar vesículas de membrana y microvesículas) y como resultado de la fusión de cuerpos multivesiculares intracelulares (que contienen micropartículas) con la membrana celular y la liberación de las micropartículas en el compartimento extracelular (para secretar exosomas y vesículas de tipo exosoma).

La célula madre neural que produce las micropartículas de la divulgación puede ser una célula madre neural fetal, embrionaria o adulta, tal como se ha descrito en los documentos US5851832, US6777233, US6468794, US5753506 y WO-A-2005121318. El tejido fetal puede ser tejido de la corteza fetal humana. Las células pueden seleccionarse como células madre neurales a partir de la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas (iPS), como ha sido descrito por Yuan et al. (2011) o una célula madre neural inducida directamente producida a partir de células somáticas como los fibroblastos (por ejemplo, mediante la inducción constitutiva de Sox2, Klf4 y c-Myc, a la vez que limita estrictamente la actividad del Oct4 a la fase inicial de la reprogramación como fue establecido recientemente por Their et al, 2012 ). Las células madre embrionarias humanas pueden obtenerse por métodos que preservan la viabilidad del embrión donante, como se conoce en la técnica (por ejemplo, Klimanskaya et al., 2006, y Chung et al.

2008). Tales métodos no destructivos para obtener células madre embrionarias humanas pueden usarse para proporcionar células madre embrionarias a partir de las cuales se pueden obtener micropartículas de la divulgación. Alternativamente, las micropartículas de la divulgación se pueden obtener a partir de células madre adultas, células iPS o células madre neurales inducidas directamente. Por consiguiente, las micropartículas de la divulgación pueden producirse por múltiples métodos que no requieren la destrucción de un embrión humano o el uso de un embrión humano como material de base.

Típicamente, la población de células madre neurales a partir de la cual se producen las micropartículas es sustancialmente pura. El término "sustancialmente pura" como se usa en este documento, se refiere a una población de células madre que es al menos aproximadamente el 75%, en algunas realizaciones al menos aproximadamente el 85%, en algunas realizaciones al menos aproximadamente el 90%, y en algunas realizaciones al menos aproximadamente 95% pura, con respecto a otras células que conforman una población celular total. Por ejemplo, con respecto a las poblaciones de células madre neurales, este término significa que hay al menos aproximadamente el 75%, en algunas realizaciones al menos aproximadamente el 85%, en algunas realizaciones al menos aproximadamente el 90%, y en algunas realizaciones al menos aproximadamente el 95% de células madre neurales puras en comparación con otras células que conforman una población celular total. En otras palabras, el término "sustancialmente pura" se refiere a una población de células madre de la presente divulgación que contiene menos de aproximadamente el 25%, en algunas realizaciones menos de aproximadamente el 15%, y en algunas realizaciones menos de aproximadamente el 5%, de células comprometidas con el linaje en la población original no amplificada y aislada antes de su posterior cultivo y amplificación.

Una micropartícula de células madre neurales comprende al menos una bicapa lipídica que típicamente encierra un medio que comprende lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos pueden ser ácido desoxirribonucleico (ADN) y/o ácido ribonucleico (ARN). El ARN puede ser ARN mensajero (ARNm), microARN (ARNmi) o cualquier precursor de ARNmi, como pri-ARNmi, pre-ARNmi y/o ARN nuclear pequeño (ARNsn).

Una micropartícula de células madre neurales retiene al menos una función biológica de la célula madre de la que se deriva. Las funciones biológicas que pueden conservarse incluyen la capacidad de promover la angiogénesis y/o la neurogénesis, la capacidad de efectuar una mejoría cognitiva en el cerebro de un paciente que ha sufrido un accidente cerebrovascular, o la capacidad de acelerar la recuperación del flujo sanguíneo en la enfermedad arterial periférica. Por ejemplo, se sabe que las células CTX0E03 inhiben la activación de células T en un ensayo de PBMC y, en una realización, las micropartículas de la divulgación retienen esta capacidad para inhibir la activación de células T en un ensayo de PBMC. Los ensayos de PBMC son bien conocidos por los expertos y los kits para realizar el ensayo están disponibles comercialmente. El Ejemplo 8, la Tabla 2 y la Figura 6 demuestran que los exosomas de células madre CTX0E03 conservan la capacidad de cerrar una herida en un modelo de "raspado" de cicatrización de heridas. Los resultados en la Figura 6A muestran que la actividad de migración de los fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) cultivados en medios condicionados con CTX0E03 es casi la misma que la actividad de migración observada en la adición de exosomas purificados. Por consiguiente, una función biológica que pueden conservar las micropartículas de la invención es la capacidad de estimular la actividad de migración de los fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF).

El Ejemplo 8 también muestra que las microvesículas de la divulgación pueden estimular la angiogénesis de HUVEC primarias y estimular el crecimiento de neuritas de células PC-12. Por consiguiente, una función biológica que las micropartículas de la divulgación pueden conservar es la capacidad de estimular la angiogénesis de HUVEC primarias y/o estimular el crecimiento de neuritas de las células PC-12.

El análisis proteómico en el Ejemplo 13 indica que los exosomas de células madre neurales comprenden funciones biológicas asociadas con la producción, el empaquetamiento, la función y la degradación del material genético. Por consiguiente, en una realización, los exosomas de la divulgación conservan estas funciones, típicamente una o más de la función de la ARN polimerasa, la función de degradación del ARN, la función del ribosoma y la función del espliceosoma.

La micropartícula obtenida de la célula madre neural tiene un diámetro de 1000 nm o menos. Típicamente, la micropartícula de la divulgación tendrá un diámetro de 200 nm o menos, por ejemplo, de 100 nm o menos. Como se indicó en la Tabla 1 anterior, las microvesículas tienen un diámetro de 100 nm a 1000 nm. Los exosomas se definen típicamente como que tienen un diámetro de 30-100 nm, pero estudios más recientes confirman que los exosomas también pueden tener un diámetro entre 100 nm y 200 nm (por ejemplo, Katsuda et al, Proteomics 2013 and Katsuda et al, Scientific Reports 2013). Por consiguiente, los exosomas tienen típicamente un diámetro entre 30 nm y 150 nm. Las partículas de membrana tienen un diámetro de 50 nm a 80 nm y las partículas de tipo exosoma tienen un diámetro de 20 nm a 50 nm. El diámetro puede determinarse mediante cualquier técnica adecuada, por ejemplo, microscopía electrónica o dispersión dinámica de la luz. El término micropartícula incluye, pero no se limita a: partícula de membrana, vesícula de membrana, microvesícula, vesícula de tipo exosoma, exosoma, vesícula de tipo ectosoma, ectosoma o exovesícula.

La Figura 1, paneles A-E, muestra la presencia en células madre neurales de MVB que contienen exosomas entre 30 50 nm de diámetro, mientras que el panel F muestra microvesículas >100 nm de diámetro. La Tabla 20 y la Figura 17 (más adelante) muestran que los exosomas de células madre neurales típicos se midieron para tener un diámetro que varía de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 150 nm, lo cual es consistente con el tamaño de los exosomas (de células madre mesenquimales) descrito en la técnica. Por consiguiente, los exosomas de la divulgación tienen típicamente un diámetro entre 30 nm y 200 nm, más típicamente entre 50 nm y 150 nm. Como se señaló anteriormente, los exosomas suelen ser positivos para el marcador Alix (No. de acceso UNIPROT Q8WUM4).

La Figura 1F y la Tabla 20 muestran el tamaño observado de las microvesículas de células madre neurales típicas, con un diámetro de modo de aproximadamente 150 nm-200 nm, o un diámetro medio de aproximadamente 180 nm-350 nm. Por consiguiente, las microvesículas de la divulgación tienen típicamente un diámetro entre 100 y 1000 nm, más típicamente entre 150 nm y 350 nm.

Algunas micropartículas de la divulgación expresan el marcador de superficie CD133. Otras micropartículas de la divulgación no expresan el marcador de superficie CD133.

"Marcador" se refiere a una molécula biológica cuya presencia, concentración, actividad o estado de fosforilación se puede detectar y usar para identificar el fenotipo de una célula.

Los exosomas son micropartículas lipídicas derivadas de endosomas de típicamente 30-100 nm de diámetro y, a veces, entre 100 nm y 200 nm de diámetro, que se liberan de la célula por exocitosis. La liberación de exosomas ocurre constitutivamente o por inducción, de manera regulada y funcionalmente relevante. Durante su biogénesis, los exosomas incorporan una amplia gama de proteínas citosólicas (que incluyen proteínas chaperonas, integrinas, proteínas del citoesqueleto y las tetraspaninas) y material genético. En consecuencia, se considera que los exosomas son dispositivos de comunicación intercelular para la transferencia de proteínas, lípidos y material genético entre las células, en el microambiente de la célula madre y en una distancia considerable. Aunque la divulgación no está limitada por esta teoría, es posible que los exosomas sean responsables de la eficacia de las células madre neurales. Por lo tanto, se espera que los exosomas de las células madre neurales sean terapéuticamente eficaces.

Micropartículas diseñadas para tener las funciones deseadas

Las micropartículas conservan al menos algunas de las funciones de las células madre que las producen. Por lo tanto, es posible diseñar micropartículas manipulando la célula madre (que puede ser de cualquier tipo de célula madre y no está limitada a células madre neurales, aunque las micropartículas de células madre neurales de la divulgación se incluyen expresamente como una realización) para poseer una o más funciones deseadas, típicamente proteínas o ARNmi. La manipulación será típicamente ingeniería genética, para introducir una o más secuencias de ácido nucleico reguladoras, no codificadores o no codificadores exógenos en la célula madre. Por ejemplo, si se desea un exosoma que contenga VEGF y/o bFGF, entonces la célula madre que produce el exosoma puede transformarse o transfectarse para expresar (altos niveles de) VEGF y/o bFGF, que luego se incorporaría en las micropartículas producidas por esa célula madre. De manera similar, las células iPS pueden usarse para producir micropartículas, y estas células pueden diseñarse para producir las proteínas y los ácidos nucleicos (por ejemplo, ARNmi) que se requieren en las micropartículas producidas por las células iPS. Por lo tanto, la invención proporciona micropartículas ad hoc, de cualquier tipo de célula madre, que contienen una función que no está naturalmente presente en la célula madre a partir de la cual se produce, es decir, las micropartículas (por ejemplo, exosomas) contienen una o más secuencias de proteínas o ácidos nucleicos exógenos no son naturales y son manipulados.

En una realización, las micropartículas aisladas o purificadas se cargan con uno o más ácidos nucleicos, lípidos, proteínas, fármacos o profármacos exógenos que están destinados a realizar una función deseada en una célula diana. Esto no requiere la manipulación de la célula madre y, opcionalmente, el material exógeno se puede agregar directamente a las micropartículas. Por ejemplo, pueden introducirse ácidos nucleicos exógenos en las micropartículas por electroporación. Las micropartículas se pueden utilizar como vehículos o portadores para el material exógeno. En una realización, las micropartículas que se han aislado de las células que las produjeron se cargan con ARNsi exógeno, típicamente por electroporación, para producir micropartículas que pueden desplegarse para silenciar uno o más genes patológicos. De esta manera, las micropartículas pueden usarse como vehículos para administrar uno o más agentes, típicamente agentes terapéuticos o de diagnóstico, a una célula diana. Un ejemplo de esto es un exosoma de células madre neurales que comprende ARNsi exógeno capaz de silenciar uno o más genes patológicos.

Marcador de micropartículas

La divulgación proporciona una población de micropartículas de células madre neurales aisladas, en la que la población comprende esencialmente solo micropartículas de la divulgación, es decir, la población de micropartículas es pura. En muchos aspectos, la población de micropartículas comprende al menos aproximadamente el 80% (en otros aspectos, al menos el 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% o 100%) de las micropartículas de la divulgación.

La micropartícula aislada de células madre neurales de la divulgación se caracteriza porque tiene un perfil de expresión distintivo para ciertos marcadores y se distingue de las micropartículas de otros tipos de células. Cuando se describe un marcador en el presente documento, su presencia o ausencia puede usarse para distinguir la micropartícula. Por ejemplo, el término "puede comprender" o "puede expresar" también describe la realización contraria en la que ese marcador no está presente, por ejemplo, la frase "la micropartícula puede comprender una o más tetraspaninas, típicamente CD63, CD81, CD9, CD53, CD82 y/o CD37" también describe la realización contraria en la que la micropartícula no puede comprender una o más tetraspaninas, típicamente CD63, CD81, CD9, CD53, CD82 y/o CD37.

La micropartícula de células madre neurales de la divulgación se considera típicamente que porta un marcador si al menos aproximadamente el 70% de las micropartículas de la población, por ejemplo, el 70% de las partículas de membrana, vesículas de membrana, microvesículas, vesículas de tipo exosoma, exosomas, vesículas de tipo ectosoma, ectosomas o exovesículas muestran un nivel detectable del marcador. En otros aspectos, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 90% o al menos aproximadamente el 95% o al menos aproximadamente el 97% o al menos aproximadamente el 98% o más de la población muestra un nivel detectable del marcador. En ciertos aspectos, al menos aproximadamente el 99% o el 100% de la población muestra un nivel detectable de los marcadores. La cuantificación del marcador se puede detectar mediante el uso de una RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) o mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Debe apreciarse que esta lista se proporciona solo a modo de ejemplo, y no pretende ser limitante. Típicamente, se considera que una micropartícula de células madre neurales de la divulgación lleva un marcador si al menos aproximadamente el 90% de las micropartículas de la población muestran un nivel detectable del marcador según lo detectado por FACS.

Los marcadores descritos en el presente documento se consideran expresados por una celda de la población de la divulgación, si su nivel de expresión, medido por qRT-PCR tiene un valor de punto de cruce (Cp) inferior o igual a 35 (corte estándar en una matriz qRT-PCR). El Cp representa el punto donde la curva de amplificación cruza el umbral de detección y también se puede reportar como umbral de cruce (ct).

En una realización, la divulgación se refiere a micropartículas producidas por una población de células madre neurales caracterizada porque las células de la población expresan uno o más de los marcadores Nestina, Sox2, GFAP, tubulina pIII, DCX, GALC, TUBB3, GDNF e IDO. En otra realización, la micropartícula es un exosoma y la población de exosomas expresa uno o más de DCX (doublecortina - un marcador neuronal temprano), GFAP (proteína ácida fibrilarmente glial - un marcador de astrocitos), GALC, TUBB3, GDNF e IDO.

Las micropartículas de células madre neurales de la divulgación pueden expresar uno o más marcadores de proteínas a un nivel que es más bajo o más alto que el nivel de expresión de ese marcador en una micropartícula de células madre mesenquimales de la misma especie. Los marcadores de proteínas que se expresan mediante las micropartículas de células CTX0E03 se identifican aquí y abajo. En algunas realizaciones, las micropartículas pueden expresar un marcador de proteína a un nivel relativo a a tubulina u otra proteína(s) de control. En algunas realizaciones, las micropartículas de la divulgación pueden expresar esa proteína a un nivel de al menos /-1,2 veces en relación con la proteína de control, típicamente al menos /-1.5 veces en comparación con la proteína de control, al menos /-2 veces el cambio en relación con la proteína de control o al menos /-3 veces el cambio en relación con la proteína de control. En algunas realizaciones, las micropartículas pueden expresar un marcador de proteína a un nivel de entre 10'2 y 10'6 copias por célula en relación con a tubulina u otra proteína de control. En algunas realizaciones, las micropartículas de la divulgación pueden expresar esa proteína a un nivel de entre 10-2 y 10-3 copias por célula en relación con a tubulina u otra proteína de control.

Las micropartículas de células madre neurales de la divulgación pueden expresar uno o más ARNmi (incluidos los precursores de ARNmi) a un nivel que es más bajo o más alto que el nivel de expresión de ese ARNmi (incluidos los precursores de ARNmi) en una micropartícula de células madre mesenquimales de la misma especie. Los marcadores de ARNmi que se expresan mediante las micropartículas de células CTX0E03 se identifican a continuación. En algunas realizaciones, las micropartículas de la divulgación pueden expresar el ARNmi marcador a un nivel de al menos /-1.5 veces el cambio, típicamente al menos /-2 veces el cambio o al menos /-3 veces el cambio (calculado de acuerdo con el método AAct, que es bien conocido) en relación con U6B o 15a, o cualquier otro gen de referencia de ARNmi, también denominado gen de control interno.

Las micropartículas de células madre neurales de la divulgación pueden expresar uno o más ARNm a un nivel que es más bajo o más alto que el nivel de expresión de ese ARNm en una micropartícula de células madre mesenquimales de la misma especie. En algunas realizaciones, las micropartículas de la divulgación pueden expresar el ARNm marcador a un nivel de al menos /-1.5 veces el cambio, típicamente al menos /-2 veces el cambio o al menos /-3 veces el cambio (calculado de acuerdo con el método AAct) en relación con ATP5B o YWHAZ, o cualquier otro gen de referencia, también conocido como un gen de control interno.

Los exosomas de la divulgación expresan típicamente integrinas específicas, tetraspaninas, antígenos MHC Clase I y/o Clase II, antígenos CD y moléculas de adhesión celular en sus superficies, lo que puede facilitar su captación por tipos celulares específicos. Los exosomas contienen una variedad de proteínas citoesqueléticas, GTPasas, clatrina, chaperonas y enzimas metabólicas (pero se excluyen las proteínas mitocondriales, lisosómicas y ER, por lo que el perfil general no se parece al citoplasma). También contienen factores de empalme y traducción de ARNm. Finalmente, los exosomas generalmente contienen varias proteínas como la HSP70, la HSP90 y las anexinas que se sabe que desempeñan funciones de señalización pero que no son segregadas por mecanismos clásicos (ER-Golgi).

La bicapa lipídica de un exosoma está típicamente enriquecida con colesterol, esfingomielina y ceramida. Los exosomas también expresan una o más proteínas marcadoras de tetraspanina. Las tetraspaninas incluyen CD81, CD63, CD9, CD53, CD82 y CD37. Los exosomas también pueden incluir factores de crecimiento, citoquinas y ARN, en particular ARNmi. Los exosomas expresan típicamente uno o más de los marcadores TSG101, Alix, CD109, thy-1 y CD133. Alix (No. de acceso de Uniprot Q8WUM4), TSG101 (No. de acceso de Uniprot Q99816) y las proteínas de tetraspanina CD81 (No. de acceso de Uniprot P60033) y CD9 (No. de acceso de Uniprot P21926) son marcadores característicos del exosoma.

Alix es un marcador de la ruta endosómico. Los exosomas se derivan de un endosoma y, en consecuencia, una micropartícula positiva para este marcador se caracteriza como un exosoma. Los exosomas de la divulgación son generalmente positivos para Alix. Las microvesículas de la divulgación son típicamente negativas para Alix.

Proteoma en micropartículas

Las Tablas 18 y 20 enumeran todas las proteínas detectadas por espectrometría de masas en exosomas y microvesículas, respectivamente, aisladas de células CTX0E03 cultivadas durante dos semanas en un biorreactor de compartimientos múltiples de células Integra. En una realización, los exosomas de la divulgación comprenden al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 99% o al menos el 99.5% de las proteínas enumeradas en la Tabla 18. De manera similar, las microvesículas de la divulgación comprende típicamente al menos el 70% al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 99% o al menos el 99.5% de las proteínas enumeradas en la Tabla 20. En una realización adicional, el proteoma de una microvesícula o el exosoma de la divulgación es al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 99% o al menos el 99.5% idéntico al proteoma proporcionado en la Tabla 18 (exosoma) o en la Tabla 20 (microvesícula). Cuando se determina el contenido de proteína de una micropartícula o exosoma, se usa típicamente la espectrometría de masas, por ejemplo, el método LC/MS/MS descrito en el Ejemplo 13.

Las tablas 19 y 21 muestran las 100 proteínas más abundantes detectadas por espectrometría de masas en exosomas y microvesículas, respectivamente, aisladas de células CTX0E03 cultivadas durante dos semanas en un biorreactor multicompartimento Integra Celline. Típicamente, un exosoma de la divulgación comprende las diez primeras proteínas enumeradas en la Tabla 19, más típicamente las primeras 20, las primeras 30, las primeras 40 o las primeras 50 proteínas enumeradas en la Tabla 19. De manera similar, una micropartícula de la divulgación típicamente comprende las primeras diez proteínas enumeradas en la Tabla 21, más típicamente las primeras 20, las primeras 30, las primeras 40 o las primeras 50 proteínas enumeradas en la Tabla 21. En una realización, un exosoma de la divulgación comprende las 100 proteínas enumeradas en la Tabla 19. En una realización, una microvesícula de la divulgación comprende las 100 proteínas enumeradas en la Tabla 21. Normalmente, las 100 proteínas más abundantes en un exosoma o microvesícula de la divulgación contienen al menos 70 de las proteínas identificadas en la Tabla 19 (exosoma) o la Tabla 21 (micropartícula). Más típicamente, las 100 proteínas más abundantes en un exosoma o microvesícula de la divulgación contienen al menos 80, al menos 90, al menos 95, 96, 97, 98 o 99, o las 100 proteínas identificadas en la Tabla 19 (exosoma) o Tabla 21 (micropartícula).

Contenido de ARNmi en micropartículas

El Ejemplo 12 (y la Figura 11 relacionada) muestra los resultados de la secuenciación profunda de ARNmi presente en las células CTX0E03, microvesículas y exosomas producidos por estas células. Este ejemplo muestra que, sorprendentemente, el número de especies de ARNmi diferentes presentes en las micropartículas se reduce enormemente en comparación con el número de especies de ARNmi diferentes presentes en las células; las micropartículas contienen menos de 120 ARNmi diferentes, mientras que las células contienen entre 450 y 700 especies de ARNmi. Las micropartículas contienen una mayoría de hsa-miR-1246.

Los datos en el Ejemplo 12 también muestran que las micropartículas se caracterizan por cuatro especies principales de ARNmi, a saber, hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532. Estos cuatro ARNmi son los únicos ARNmi presentes en un recuento de lecturas de más de 1000 en las micropartículas; estos cuatro ARNmi están presentes en un exceso masivo en comparación con los otros ARNmi en las micropartículas. Esto contrasta con el perfil en las células, que contienen un número mucho mayor de ARNmi presentes en niveles altos (recuento de lectura mayor que 1000) o muy altos (recuento de lectura mayor que 10000). Aunque no están sujetos a ninguna teoría, los inventores proponen que hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532 son traficadas selectivamente (o incorporadas de otra manera) en las micropartículas y se cree que juegan un papel en la función de las micropartículas.

Típicamente, en una realización las micropartículas, por ejemplo, los exosomas, de la divulgación, contienen uno, dos, tres o los cuatro hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532. Cada uno de estos marcadores de ARNmi está presente típicamente en un recuento de lectura (determinado opcionalmente usando la técnica de secuencia profunda descrita en el Ejemplo 12) de al menos 1000 por micropartícula. El hsa-miR-1246 puede tener opcionalmente un recuento de lectura de al menos 2000, 5000, 10000, 20000 o 25000 por micropartícula. El HsamiR-4492 puede tener opcionalmente un recuento de lectura de al menos 2000, 3000, 4000 o 5000 por micropartícula. El Hsa-miR-4532 puede tener opcionalmente un recuento de lectura de al menos 2000 o 3000 por micropartícula.

En una realización, cada uno de hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y/o hsa-miR-4532 está presente en la micropartícula, por ejemplo. exosoma, en un recuento de lecturas más alto que el presente en la célula que produjo la micropartícula. En particular, miR-1246 típicamente tiene un recuento de lecturas en la micropartícula al menos el doble del recuento en la célula, más típicamente al menos 4, 5, 6, 7 u 8 veces el recuento en la célula, y opcionalmente 10, 15 o 20 veces el recuento en la célula.

En una realización, las micropartículas de la divulgación contienen hsa-let-7a-5p, has-miR-92b-3p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-92a-3p, hsa-miR-10a 5p, hsa-100-5p y/o hsa-99b-5p en un recuento de lectura más bajo que el presente en la celda que produjo la micropartícula. Típicamente, cada uno de estos ARNmi tiene un recuento de lectura de menos de 1000 en las micropartículas de la divulgación, más típicamente de menos de 100, por ejemplo, menos de 50. Opcionalmente, las micropartículas de la divulgación contienen hsa-let-7a-5p en un recuento de lectura de menos de 50 o menos de 25.

En una realización, las micropartículas de la divulgación contienen menos de 150 tipos de ARNmi (es decir, diferentes especies de ARNmi) cuando se analizan mediante secuenciación profunda, típicamente menos de 120 tipos de ARNmi.

En una realización, hsa-miR-1246 es el ARNmi más abundante en las micropartículas de la invención (determinado opcionalmente usando la técnica de secuencia profunda descrita en el Ejemplo 12). Normalmente, al menos el 40% del recuento total de ARNmi en micropartículas (por ejemplo, microvesículas y exosomas) de la divulgación es hsamiR-1246. Normalmente, al menos el 50% del recuento total de ARNmi en exosomas de la divulgación es hsa-miR-1246.

El hsa-miR-4492 es típicamente el segundo ARNmi más abundante en las micropartículas de la divulgación. Normalmente, al menos el 3% del recuento total de ARNmi en micropartículas (por ejemplo, microvesículas y exosomas) de la divulgación es hsa-miR-4492. Más típicamente, al menos el 4% del recuento total de ARNmi en micropartículas (por ejemplo, microvesículas y exosomas) de la divulgación es hsa-miR-4492.

Típicamente, al menos el 2% del recuento total de ARNmi en micropartículas (por ejemplo, microvesículas y exosomas) de la divulgación es hsa-miR-4532.

Típicamente, al menos el 1% del recuento total de ARNmi en micropartículas (por ejemplo, microvesículas y exosomas) de la divulgación es hsa-miR-4488.

En una realización, las micropartículas de la divulgación contienen una o ambas de hsa-miR-4508, hsa-miR-4516 a un nivel de al menos el 0.1% del contenido total de ARNmi de la partícula.

Uno o más de hsa-miR-3676-5p, hsa-miR-4485, hsa-miR-4497, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-3195, hsa-miR-3648, hsamiR-663b, hsa-miR-3656, hsa-miR-3687, hsa-miR-4466, hsa-miR-4792, hsa-miR-99b-5p y hsa-miR-1973 pueden estar presentes en las micropartículas de la divulgación.

Típicamente, cada uno de hsa-let-7a-5p y hsa-100-5p está presente en menos del 1%, más típicamente menos del 0.1% o menos del 0.05% del recuento total de ARNmi en micropartículas de la divulgación.

En un exosoma típico de la divulgación, al menos el 50% del recuento total de ARNmi es hsa-miR-1246, y menos del 0.1% del recuento total de ARNmi es hsa-let-7a-5p.

En una realización, al menos el 90% del recuento total de ARNmi en micropartículas de la divulgación comprende hsamiR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532. Típicamente, al menos el 95% o el 96% del recuento total de ARNmi en micropartículas de la divulgación comprende hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532. Menos del 10% del contenido total de ARNmi de estas micropartículas es un ARNmi que no es hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532.

Se proporcionan combinaciones de las realizaciones de ARNmi discutidas anteriormente. Por ejemplo, una micropartícula de la divulgación típicamente contiene cada una de hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsamiR-4532 en un recuento de lecturas de al menos 1000 y contiene cada una de hsa-let -7a-5p, hsa-miR-92b-3p, hsamiR-21-5p, hsa-miR-92a-3p, hsa-miR-10a-5p, hsa-100-5p y hsa-99b-5p a un recuento de lectura de menos de 100. Por lo general, al menos el 90% o al menos el 95% del total de ARNmi en estas micropartículas es hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532.

Una micropartícula (por ejemplo, microvesícula o exosoma) de la divulgación tiene típicamente hsa-miR-1246 como el ARNmi más abundante y hsa-miR-4492 es el segundo ARNmi más abundante. En esta realización, al menos el 40% del recuento total de ARNmi en micropartículas (por ejemplo, microvesículas y exosomas) de la divulgación es hsa-miR-1246 y al menos el 3% del recuento total de ARNmi en la micropartícula es hsa-miR- 4492. Al menos el 2% del recuento total de ARNmi en estas micropartículas es hsa-miR-4532 y al menos el 1% del recuento total de ARNmi en estas micropartículas es hsa-miR-4488. Cada uno de hsa-let-7a-5p y hsa-100-5p está presente en menos del 0.1% del conteo total de ARNmi en estas micropartículas.

La representación gráfica de los resultados de la secuenciación profunda en los exosomas y las microvesículas como el cambio de plegamiento relativo en comparación con las células confirma que hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsamiR-4488 y hsa-miR-4532 están significativamente sobrerreguladas en los exosomas y microvesículas en comparación con las células. Esta comparación también muestra que el ARNmi hsa-miR-3195 es el ARNmi que está más sobrerregulado, tanto en exosomas como en microvesículas. Aunque las lecturas absolutas de hsa-miR-3195 están en el rango de -40 para exosomas y microvesículas, no se detecta ningún hsa-miR-3195 en las células. Por consiguiente, hsa-miR-3195 se encuentra únicamente en los exosomas y microvesículas de la divulgación y, en una realización, un exosoma o microvesícula de la divulgación comprende hsa-miR-3195.

En una realización, las micropartículas de la divulgación comprenden uno o más de los siguientes precursores de ARNmi:AC079949.1 (SEQ ID NO:738)

GGCCGCGCCCCGTTTCCCAGGACAAAGGGCACTCCGCACCGGACCCTGGTCCCAGCG;

AP000318.1 (SEQ ID NO: 739)

CCCACTCCCTGGCGCCGCTTGTGGAGGGCCCAAGTCCTTCTGATTGAGGCCCAACCCGTGGAAG;

AL161626.1 (SEQ ID NO:740)

CGCCGGGACCGGGGTCCGGGGCGGAGTGCCCTTCCTCCTGGGAAACGGGGTGCGGC;

AC004943.1 (SEQ ID NO:741)

GCTTCACGTCCCCACCGGCGGCGGCGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGCGGCGGCGGTGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCG GCTC; y

AL121897.1 (SEQ ID NO:742)

GCCGCCCCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCCGCTTTCGGCTCGGGCCTCAGGTGAGTCGGAG GGGCCGGGCGCC

En una realización, las micropartículas de la divulgación comprenden uno, dos o tres de los siguientes ARNmi maduros derivados de los precursores enumerados anteriormente (como se detalla en la parte D del Ejemplo 12)

:ggcggagugcccuucuuccugg (derivado del AL161626.1-201) (SEQ ID NO:743)

ggagggcccaaguccuucugau (derivado del AP000318.1-201) (SEQ ID NO:744)

gaccaggguccggugcggagug (derivado del AC079949.1-201) (SEQ ID NO:745)

Estos 5 precursores de ARNmi y 3 ARNmi maduros no se han aislado previamente y, por lo tanto, cada secuencia también se proporciona como una nueva secuencia per se. Por consiguiente, en un aspecto, la divulgación proporciona una composición que comprende uno o más de los precursores de ARNmi AC079949.1, AP000318.1, AL161626.1, AC004943.1 y AL121897.1. En otra realización, la divulgación proporciona una composición que comprende uno o más de los ARNmi maduros ggcggagugcccuucuuccugg (derivado de AL161626.1-201), ggagggcccaaguccuucugau (derivado de AP000318.1-201) y gaccaggguccggugcggagug (derivado de AC079949.1-201) Opcionalmente, la composición es una composición farmacéutica que comprende uno o más de los precursores de ARNmi y / o uno o más de los ARNmi maduros y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Como se señaló en el Ejemplo 12, estos ARNmi y precursores parecen ser transportados selectivamente en los exosomas y microvesículas, por lo que pueden ser al menos parcialmente responsables de la función de las micropartículas.

El Ejemplo 12 también muestra que las micropartículas de células madre neurales comprenden una variedad de especies de ARN no codificadores. En una realización, las micropartículas de la divulgación comprenden una o más de ARN ribosómico, ARN nucleolar pequeño, ARN nuclear pequeño, microARN, ARN no codificador intergénico grande y otros ARN misceláneos (por ejemplo, RMRP, ARN de bóveda, SRP metazoario y/o RNY).

El Ejemplo 4 muestra los ARNmi presentes en micropartículas producidas por las células CTX0E03 y que tienen un Cp por debajo de 35, según lo determinado por una matriz qRT-PCR. Típicamente, en una realización, las micropartículas de la divulgación contienen 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 o más, o todos, de los siguientes ARNmi (identificados de acuerdo con su nombre de acuerdo con Ambros et al y accesibles en www.mirbase.org):

En una realización, las micropartículas CTX0E03 contienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 o más de los siguientes ARNmi (que se seleccionan de la lista anterior):

Composiciones de ARNmi

La identificación de cuatro especies principales de ARNmi en micropartículas de células madre neurales, a saber, hsamiR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532, proporciona composiciones que comprenden todas las cuatro de estsas ARNmi. Típicamente, la composición no comprende otros ARNmi, es decir, la composición comprende ARNmi que consiste en hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532. La composición es típicamente una composición farmacéutica y comprende un portador, diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, como se describe con detalle a continuación. Los ARNmi de este aspecto de la invención están típicamente aislados, es decir, no comprendidos dentro de una micropartícula. En una realización, la composición consiste en, o consiste esencialmente en, las 4 especies de ARNmi y uno o más vehículos, diluyentes, vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.

hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532 están presentes en exceso en micropartículas de células madre neurales. Por consiguiente, la composición de ARNmi que comprende estos ARNmi proporciona típicamente al menos una actividad biológica de una célula madre neural o un medio acondicionado de células madre neurales. La al menos una actividad biológica es típicamente actividad regenerativa, como se describe a continuación. En una realización, la composición de ARNmi es útil en terapia, típicamente terapia regenerativa, como se describe a continuación.

Proteínas detectadas por una transferencia de puntos

El ejemplo 5 muestra proteínas presentes en micropartículas producidas por las células CTX0E03, según se detectó mediante una transferencia de puntos. Típicamente, las micropartículas de la divulgación contienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o todas las proteínas siguientes:

La galectina-3 y la trombospondina-1 también se identifican como presentes en los exosomas y microvesículas en el Ejemplo 13. El TIMP-1 se identifica en el Ejemplo 13 como presente en los exosomas.

El ejemplo 5 también muestra que las micropartículas producidas por las células CTX0E03 también pueden expresar 1, 2, 3, 4 o 5 de las siguientes proteínas:

EGF-R y Csk también se identifican como presentes en exosomas y microvesículas en el Ejemplo 13.

Se sabe galectina-3, SPARC, TIMP-1, trombospondina-1, VEGF, MDC y endostatina modulan la angiogénesis. Por consiguiente, las micropartículas que contienen una o más de estas proteínas son útiles para tratar enfermedades o trastornos que requieren la modulación de la angiogénesis.

Se sabe que IL-1a, LECT2, MCP-1 y Csk modulan la inflamación. Por consiguiente, las micropartículas que contienen una o más de estas proteínas son útiles en el tratamiento de enfermedades o trastornos que requieren la modulación de la inflamación.

Micropartículas que contienen una o más de (i) Galectina-3, SPARC, TIMP-1, Trombospondina-1, VEGF, MDC y endostatina, y una o más de (ii) IL-1a, LECT2, MCP-1 y Csk, pueden ser útiles para tratar enfermedades o trastornos que requieran modulación de la angiogénesis y la inflamación.

Células madre neurales en cultivo en biorreactores de múltiples compartimentos

Como se muestra en el Ejemplo 10 y la Figura 9 más adelante, después de un cultivo con biorreactor de múltiples compartimientos durante tres semanas, las células madre neurales expresan una cantidad de marcadores en niveles significativamente más altos que las células madre neurales cultivadas de acuerdo con el procedimiento estándar en un matraz de compartimento único estándar T175. En una realización, las micropartículas de la divulgación se aíslan de NSC que se han cultivado, típicamente en un biorreactor de múltiples compartimentos, durante al menos dos semanas, típicamente al menos tres semanas, al menos cuatro semanas, al menos cinco semanas o al menos seis semanas. Opcionalmente, los NSC se han cultivado durante no más de diez semanas, por ejemplo, entre 2 y 10 semanas, entre 3 y 10 semanas, entre 4 y 10 semanas, entre 5 y 10 semanas o entre 6 y 10 semanas.

Las células madre neurales CTX0E03 se cultivaron durante tres semanas en un biorreactor de compartimientos múltiples expreso DCX, GALC, GFAP, TUBB3, GDNF e IDO a un nivel más alto que las células madre neurales cultivadas en un cultivo de células T175 de un solo compartimento estándar. Por consiguiente, las células madre neurales que se han cultivado en un biorreactor de compartimientos múltiples, generalmente durante una semana o más, diez días o más, dos semanas o más, o al menos tres semanas, cuatro semanas, cinco semanas o más, pueden expresar uno o más de DCX, GALC, GFAP, TUBB3, GDNF e IDO. Las células cultivadas en un biorreactor de dos compartimientos típicamente muestran una expresión incrementada de uno o más de DCX, GALC, GFAP, TUBB3, GDNF e IDO en comparación con las células madre cultivadas en condiciones estándar. El nivel de expresión de estos marcadores en las células cultivadas con biorreactores de compartimientos múltiples típicamente es significativamente mayor que en las células cultivadas en un matraz de cultivo T175 estándar de un solo compartimiento. Típicamente, una célula madre cultivada en un biorreactor de múltiples compartimientos expresa uno o más de las células DCX1, GALC, GFAP, TUBB3, GDNF o IDO a un nivel por lo menos 2 veces más alto que en las células CTX0E03 cultivadas en un matraz T-175 según un cultivo estándar procedimiento. En una realización, las micropartículas, típicamente exosomas, se obtienen a partir de células madre neurales que muestran una expresión incrementada de una o más de DCX, GALC, GFAP, TUBB3, GDNF e IDO en comparación con las células madre cultivadas en condiciones estándar. Por ejemplo, se pueden obtener micropartículas a partir de medio acondicionado recién filtrado recogido de células madre neurales cultivadas con biorreactor Integra CeLLine.

Los marcadores regulados al alza incluyen DCX (doblecortina - un marcador neuronal temprano), GFAP (proteína ácida fibrilarmente glial - un marcador de astrocitos), GALC, TUBB3, GDNF e IDO. Las células CTX0E03 pueden diferenciarse en 3 tipos de células diferentes: neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Los altos niveles de DCX y GFAP después de tres semanas en un biorreactor de múltiples compartimientos indican que las células madre cultivadas se han diferenciado parcialmente y han entrado en el linaje neuronal (células DCX+) y/o astrocítica (células GFAP+). Por consiguiente, en una realización, la divulgación proporciona una micropartícula producida por una población de células madre neurales que expresa (i) uno o más marcadores asociados con un linaje neuronal, típicamente DCX y/o (ii) uno o más marcadores asociados con un linaje astrocítico, típicamente GFAP. En otra realización, la divulgación proporciona micropartículas de células madre neurales, típicamente exosomas, que expresan (i) uno o más marcadores asociados con un linaje neuronal, típicamente DCX y/o (ii) uno o más marcadores asociados con un linaje astrocítico, típicamente GFAP. Estas células, o las micropartículas (típicamente exosomas) derivadas de estas células, expresan DCX y/o GFAP a un nivel más alto que las células madre correspondientes en el cultivo estándar (T-175). Típicamente, estas células o micropartículas expresan DCX y/o GFAP a un nivel al menos 2 veces más que las células madre, más típicamente al menos 2.5 veces más que las células madre correspondientes en un cultivo estándar, al menos 5 veces más que la línea de células madre correspondiente en cultivo estándar, al menos 7.5 veces más que las células madre correspondientes en cultivo estándar o al menos 10 veces más que las células madre correspondientes en cultivo estándar. Para la expresión de DCX, el cambio de veces en las células o micropartículas en comparación con las células madre correspondientes en el cultivo estándar (T-175) puede ser opcionalmente al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 500 veces o al menos 1000 veces más que las células madre estándar.

Al término "biorreactor" se le debe dar su significado habitual en la técnica, es decir, un aparato usado para llevar a cabo un bioprocesamiento. Los biorreactores descritos en el presente documento son adecuados para su uso en cultivos de células madre. Los biorreactores simples para cultivo celular son matraces de un solo compartimiento, como el matraz T-175 de uso común (por ejemplo, el matraz de cultivo celular BD Falcon™ de 175 cm2, 750 ml, poliestireno tratado con tejido, cuello recto, tapón de rosca azul con tapón de rosca, código de producto BD 353028). Los biorreactores pueden tener múltiples compartimentos, como se conoce en la técnica. Estos biorreactores de compartimientos múltiples contienen típicamente al menos dos compartimientos separados por una o más membranas o barreras que separan el compartimiento que contiene las células de uno o más compartimientos que contienen gas y/o medio de cultivo. Los biorreactores de múltiples compartimentos son bien conocidos en la técnica. Un ejemplo de un biorreactor de múltiples compartimentos es el biorreactor Integra CeLLine, que contiene un compartimento medio y un compartimento de células separados por medio de una membrana semipermeable de 10 kDa; esta membrana permite una difusión continua de nutrientes en el compartimento celular con la eliminación simultánea de cualquier producto de desecho inhibitorio. La accesibilidad individual de los compartimentos permite suministrar células con medio fresco sin interferir mecánicamente con el cultivo. Una membrana de silicona forma la base del compartimento celular y proporciona un suministro óptimo de oxígeno y un control de los niveles de dióxido de carbono al proporcionar una ruta de difusión corta al compartimento celular. Se puede usar cualquier biorreactor de múltiples compartimientos de acuerdo con la divulgación.

El Ejemplo 11, la Tabla 3 y la Figura 10 muestran que el contenido de ARNmi de los exosomas producidos por las células madre neurales que se han cultivado en un biorreactor de múltiples compartimentos, durante tres semanas, es diferente del contenido de ARNmi de las células madre cultivadas en el estándar Matraces T-175 y de micropartículas producidas por las células madre neurales cultivadas en un matraz de cultivo T175 de un solo compartimiento durante tres semanas. En una realización, la descripción proporciona una micropartícula, típicamente un exosoma, en donde al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete ARNmi están sobre- o subregulados en comparación con las células madre correspondientes cultivadas en matraces T-175 estándar, según se calcula calculado por la Regulación de multiplicidad (véase Ejemplo 11). La Regulación de multiplicidad de cada ARNmi es opcionalmente al menos dos veces hacia arriba o hacia abajo.

Se puede ver en la Figura 6C y en el Ejemplo 8 que los exosomas aislados de las NSC muestran una eficacia particularmente sorprendente cuando las NSC se han cultivado durante varias semanas. Por consiguiente, en una realización, los exosomas de la divulgación se aíslan de NSC que se han cultivado, típicamente en un biorreactor de múltiples compartimentos, durante al menos dos semanas, típicamente al menos tres semanas, al menos cuatro semanas, al menos cinco semanas o al menos seis semanas. Opcionalmente, los NSC se han cultivado durante no más de diez semanas, por ejemplo, entre 2 y 10 semanas, entre 3 y 10 semanas, entre 4 y 10 semanas, entre 5 y 10 semanas o entre 6 y 10 semanas.

En una realización, los exosomas de células madre neurales de la divulgación expresan uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete de los siguientes ARNmi a un nivel más alto que el expresado en las células madre correspondientes cultivadas en el matraz estándar T-175, según lo calculado por Regulación de multiplicidad (donde un asterisco indica un ARNmi donde se prefiere al menos un aumento de regulación doble):

En una realización, los exosomas de células madre neurales de la divulgación expresan uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de los siguientes ARNmi a un nivel inferior al que se expresa en las células madre correspondientes cultivadas en los matraces T-175 estándar, según lo calculado por la Regulación de multiplicidad (donde un asterisco indica un ARNmi donde se prefiere al menos una disminución de la regulación de dos veces):

En una realización adicional, los exosomas NSC de la divulgación comprenden (i) un nivel incrementado de al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete de los ARNmi indicados anteriormente como incrementados en exosomas en comparación con las células correspondientes en el estándar cultivo y (ii) un nivel disminuido de al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, diez o más o más de los ARNmi indicados anteriormente como disminuidos en los exosomas en comparación con las células correspondientes en Cultivo estándar. Por ejemplo, un exosoma de células madre neurales puede contener un aumento de la regulación de la frecuencia en tres o más o más de los ARNmi indicados anteriormente como un aumento en los exosomas en comparación con las células correspondientes en el cultivo estándar y una disminución de la regulación de la frecuencia en tres o más de los ARNmi indicados anteriormente están disminuidos en los exosomas en comparación con las células correspondientes en el cultivo estándar. En otra realización de ejemplo, un exosoma de células madre neuronales puede contener un aumento de la regulación de multiplicidad en cinco o más de los ARNmi indicados anteriormente como un aumento en los exosomas en comparación con las células correspondientes en cultivo estándar y una disminución de la regulación de multiplicidad en cinco o más de los ARNmi indicados anteriormente como disminuidos en los exosomas en comparación con las células correspondientes en el cultivo estándar.

El término "expresado" se usa para describir la presencia de un marcador dentro de una célula o micropartícula. Para ser considerado como expresado, un marcador debe estar presente en un nivel detectable. Por "nivel detectable" se entiende que el marcador puede detectarse utilizando una de las metodologías de laboratorio estándar, como qRT-PCR, o qPCR, transferencia, espectrometría de masas o análisis FACS. Se considera que un gen es expresado por una célula o micropartícula de la población de la divulgación si la expresión se puede detectar razonablemente en un punto de cruce (cp) con valores inferiores o iguales a 35. Los términos "expreso" y "expresión" tienen significados correspondientes. En un nivel de expresión por debajo de este valor de cp, se considera que un marcador no se expresa. La comparación entre el nivel de expresión de un marcador en una célula madre o micropartícula de la divulgación, y el nivel de expresión del mismo marcador en otra célula o micropartícula, tal como, por ejemplo, una célula madre mesenquimal, puede realizarse preferiblemente comparando los dos tipos de células/micropartículas que han sido aisladas de la misma especie. Preferiblemente, esta especie es un mamífero, y más preferiblemente esta especie es humana. Dicha comparación puede realizarse convenientemente usando un experimento de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa (RT-PCR).

Como se usa en el presente documento, el término "expresión significativa" o sus términos equivalentes "positivo" y "+" cuando se usa con respecto a un marcador se debe entender que, en una población de células o micropartículas, más del 20%, preferiblemente más del 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 95%, 98%, 99% o incluso todas las células de las células/micropartículas expresan dicho marcador.

Como se usa en el presente documento, "negativo" o "-" como se usa con respecto a los marcadores debe entenderse que, en una población de células o micropartículas, menos del 20%, 10%, preferiblemente menos del 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o ninguna de las células/micropartículas expresan dicho marcador.

La expresión de marcadores de superficie de micropartículas se puede determinar, por ejemplo, por medio de citometría de flujo y/o FACS para un marcador de superficie celular específico usando métodos y aparatos convencionales (por ejemplo, un sistema Beckman Coulter Epics XL FACS usado con anticuerpos disponibles comercialmente y protocolos estándar conocidos en la técnica) para determinar si la señal para un marcador de superficie de micropartículas específico es mayor que una señal de fondo. La señal de fondo se define como la intensidad de señal generada por un anticuerpo no específico del mismo isotipo que el anticuerpo específico utilizado para detectar cada marcador de superficie. Para que un marcador se considere positivo, la señal específica observada es generalmente más del 20%, preferiblemente más fuerte que el 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 500%, 1000%, 5000%, 10000% o superior, mayor en relación con la intensidad de la señal de fondo. Los métodos alternativos para analizar la expresión de marcadores de superficie de micropartículas de interés incluyen el análisis visual mediante microscopía electrónica utilizando anticuerpos contra marcadores de interés de superficie celular.

La "clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS)" es un método de purificación celular basado en el uso de anticuerpos marcados con fluorescencia. Los anticuerpos se dirigen a un marcador en la superficie celular y, por lo tanto, se unen a las células de interés. Las células se separan luego en función del pico de emisión fluorescente de las células.

Los marcadores de micropartículas (incluidas las proteínas superficiales e intracelulares) también pueden analizarse mediante diversos métodos conocidos por los expertos en la técnica para analizar la expresión de proteínas, que incluyen, entre otros, electroforesis en gel seguida de inmunotransferencia Western con anticuerpos adecuados, inmunoprecipitación seguida de electroforética análisis y/o microscopía electrónica como se describió anteriormente, con permeabilización de micropartículas para marcadores intrapartículas. Por ejemplo, la expresión de una o más tetraspaninas puede analizarse utilizando uno o más de los métodos anteriores o cualquier otro método conocido por un experto en la técnica. Los niveles de ARN también pueden analizarse para evaluar la expresión del marcador, por ejemplo, qRT-PCR.

Función de las micropartículas

Como se señaló anteriormente, una micropartícula de células madre neurales retiene al menos una función biológica de la célula madre de la que se deriva. Las funciones biológicas que pueden conservarse incluyen la capacidad de promover la angiogénesis, la regeneración de tejidos, la reparación de tejidos y/o la neurogénesis, la capacidad de efectuar una mejora cognitiva en el cerebro de un paciente que ha sufrido un accidente cerebrovascular o la capacidad de acelerar la recuperación del flujo sanguíneo en la enfermedad arterial periférica.

Por ejemplo, se sabe que las células CTX0E03 inhiben la activación de células T en un ensayo de PBMC y, en una realización, las micropartículas de la divulgación retienen esta capacidad para inhibir la activación de células T en un ensayo de PBMC. Los ensayos de PBMC son bien conocidos por los expertos y los kits para realizar el ensayo están disponibles comercialmente.

El Ejemplo 8, la Tabla 2 y la Figura 6 demuestran que los exosomas de células madre CTX0E03 conservan la capacidad de cerrar una herida en un modelo de "raspado" de la cicatrización de heridas. Los resultados muestran que la actividad de migración de los fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) cultivados en medios condicionados CTX0E03 es casi la misma que la actividad de migración observada en la adición de exosomas purificados. Por consiguiente, una función biológica que pueden conservar las micropartículas de la divulgación es la capacidad de estimular la actividad de migración de los fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF). Los ensayos de migración de NHDF son conocidos en la técnica. La estimulación de la migración de NHDF se puede determinar utilizando un ensayo de raspado in vitro (cierre de la herida), por ejemplo, el ensayo del Ejemplo 8(A). El cierre de la herida se calcula como el área cubierta por las células NHDF en relación con el área de la herida inicial determinada a las 0 horas. La estimulación de la migración de NHDF en este ensayo se define típicamente como un aumento en el cierre de la herida, típicamente un cierre de la herida al menos 1.2x, más típicamente al menos 1.5x más, que el cierre de la herida en condiciones basales (sin las micropartículas) después de 24 horas. Después de 48 horas, el cierre de la herida es típicamente al menos 1.2x mayor o 1.5x mayor, más típicamente al menos 2x mayor que el cierre de la herida en condiciones basales (sin las micropartículas). La estimulación de la migración de NHDF también puede definirse como que causa un cierre de la herida del 100%, según lo determina el ensayo de raspado, al menos 24 horas antes de que se observe el 100% del cierre de la herida en condiciones basales.

El ejemplo 8 también muestra que las microvesículas de la divulgación pueden estimular la angiogénesis de HUVEC primarias y estimular el crecimiento de neuritas de células PC-12. Por consiguiente, una función biológica que las micropartículas de la divulgación pueden conservar es la capacidad de estimular la angiogénesis de HUVEC primarias y/o estimular el crecimiento de neuritas de las células PC-12. Los ensayos de angiogénesis y crecimiento de neuritas son conocidos en la técnica. La estimulación de la angiogénesis de HUVEC primarias se puede determinar usando un ensayo de angiogénesis de 24 horas usando un p-portaobjetos de ibidi y detección y análisis de Wimtube de la longitud del tubo y puntos de bifurcación, por ejemplo el ensayo del Ejemplo 8 (B). La estimulación de la angiogénesis en este ensayo se define típicamente como un aumento en comparación con la angiogénesis basal, por ejemplo >100% de angiogénesis basal, típicamente al menos 110%, al menos 120% o al menos 140% de angiogénesis basal (es decir, al menos 1.1x, al menos 1.2x o al menos 1.4x el nivel basal de angiogénesis). La estimulación del crecimiento de las neuritas se puede determinar detectando el crecimiento de células PC-12 a través de un inserto de 1 pm, por ejemplo, el ensayo del Ejemplo 8(C). La estimulación del crecimiento de neuritas en este ensayo se define típicamente como un aumento en el crecimiento de neuritas en comparación con las condiciones basales (sin micropartículas), o un aumento en el crecimiento de neuritas cuando la micropartícula se combina con NGF en comparación con la adición de NGF solo, según lo cuantificado mediante un espectrofotómetro.

El análisis proteómico en el Ejemplo 13 indica que los exosomas de células madre neurales comprenden funciones biológicas asociadas con la producción, empaquetamiento, función y degradación del material genético. Por consiguiente, en una realización, los exosomas de la divulgación conservan estas funciones, típicamente una o más de la función de la ARN polimerasa, la función de degradación del ARN, la función del ribosoma y la función del espliceosoma.

Inmunogenicidad

Las micropartículas de células madre neurales (alogénicas) de la divulgación típicamente no activan una respuesta inmunitaria in vitro o in vivo ni activan una respuesta inmunitaria que es sustancialmente más débil que la que se esperaría que se activara al inyectar una población de células madre alogénicas en un paciente. En ciertos aspectos de la divulgación, se considera que las micropartículas de células madre neurales no desencadenan una respuesta inmune si al menos aproximadamente el 70% de las micropartículas no desencadenan una respuesta inmune. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 90% o al menos aproximadamente el 95%, 99% o más de las micropartículas no desencadenan una respuesta inmune. Preferiblemente, las micropartículas de la divulgación no desencadenan una respuesta inmune mediada por anticuerpos o no desencadenan una respuesta inmune humoral. Más preferiblemente, las micropartículas de la divulgación no desencadenan una respuesta mediada por anticuerpos o una respuesta inmune humoral in vitro. Aun más preferiblemente, las micropartículas de la divulgación no desencadenan una respuesta inmune de linfocitos mixtos. Un experto en la técnica entenderá que la capacidad de las células de la divulgación para desencadenar una respuesta inmune se puede probar de varias maneras.

Las células CTX0E03 trasplantadas en un modelo en roedor de isquemia de extremidades han demostrado previamente una regulación positiva más rápida y transitoria de los genes del huésped implicados en la angiogénesis, como CCL11, CCL2, CXCL1, CXCL5, IGF1, IL1p, IL6, HGF, HIF1a, bFGF, VEGFA y VEGFC, en comparación con los controles tratados con vehículo. El tratamiento con hNSC eleva de forma transitoria las respuestas inmunes y angiogénicas innatas del huésped y acelera la regeneración de los tejidos.

La línea celular CTX0E03 se ha demostrado previamente, utilizando un ensayo de PBMC humano, que no es inmunogénico. Por consiguiente, también se espera que las micropartículas producidas por las células CTX0E03 no sean inmunogénicas. La falta de inmunogenicidad permite que las micropartículas eviten la eliminación por parte del sistema inmunitario del huésped/paciente y, por lo tanto, ejerzan su efecto terapéutico sin una respuesta inmune e inflamatoria perjudicial.

Células madre neurales

La célula madre neural que produce la micropartícula puede ser una línea de células madre, es decir, un cultivo de células madre que se dividen de forma estable. Una línea de células madre se puede cultivar en grandes cantidades utilizando una única fuente definida. La inmortalización puede surgir de un evento espontáneo o puede lograrse mediante la introducción de información genética exógena en la célula madre que codifica los factores de inmortalización, lo que resulta en un crecimiento celular ilimitado de la célula madre en condiciones de cultivo adecuadas. Tales factores genéticos exógenos pueden incluir el gen "myc", que codifica el factor de transcripción Myc. La información genética exógena se puede introducir en la célula madre a través de una variedad de medios adecuados, como la transfección o la transducción. Para la transducción, se puede usar un vehículo viral diseñado genéticamente, como uno derivado de retrovirus, por ejemplo, lentivirus.

Se pueden obtener ventajas adicionales mediante el uso de una línea de células madre inmortalizadas condicionalmente, en la que la expresión del factor de inmortalización puede regularse sin afectar adversamente la producción de micropartículas terapéuticamente eficaces. Esto se puede lograr mediante la introducción de un factor de inmortalización que está inactivo a menos que la célula reciba un agente activador. Tal factor de inmortalización puede ser un gen tal como c-mycER. El producto del gen c-MycER es una proteína de fusión que comprende una variante de c-Myc fusionada al dominio de unión al ligando de un receptor de estrógeno mutante. C-MycER solo impulsa la proliferación celular en presencia del esteroide sintético 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT) (Littlewood et al.1995). Este enfoque permite la expansión controlada de las células madre neurales in vitro, mientras evita los efectos in vivo no deseados en la proliferación de la célula huésped (por ejemplo, la formación de tumores) debido a la presencia de c-Myc o al gen que lo codifica en micropartículas derivadas de la línea de células madre neurales. Una célula madre neural condicionalmente inmortalizada c-mycER adecuada se describe en la Patente de Estados Unidos 7416888. El uso de una línea de células madre neurales condicionalmente inmortalizada por lo tanto proporciona una mejora sobre el aislamiento y producción de micropartículas de células madre existentes.

Las líneas celulares inmortalizadas condicionalmente preferidas incluyen las líneas de células madre neurales CTX0E03, STR0C05 y HPC0A07, que se han depositado en la European Collection of Animal Cultures (ECACC), Vaccine Research and Production laboratories, Public Health Laboratory Services, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, con No. de acceso 04091601 (CTX0E03); N° de registro No.04110301 (STR0C05); y No. de acceso 04092302 (HPC0A07). La derivación y la procedencia de estas células se describe en el documento EP1645626 B1. Las ventajas de estas células son retenidas por micropartículas producidas por estas células.

Las células de la línea celular CTX0E03 pueden cultivarse en las siguientes condiciones de cultivo:

• Albúmina Sérica Humana 0.03%

• Transferrina Humana 5|jg/ml

• Dihidrocloruro de putrescina 16.2 jg/m l

• Insulina humana recombinante 5 j/m l

• Progesterona 60 ng/ml

• L-Glutamina 2 Mm

• Selenito de sodio (selenio) 40 ng/ml

Más el factor de crecimiento de fibroblastos básico (10 ng/ml), factor de crecimiento epidérmico (20 ng/ml) y 4-hidroxitamoxifeno 100 nM para la expansión celular. Las células se pueden diferenciar mediante la eliminación del 4-hidroxitamoxifeno. Típicamente, las células se pueden cultivar al 5% de CO2/37°C o en condiciones hipóxicas de 5%, 4%, 3%, 2% o 1% de O2. Estas líneas celulares no requieren suero para ser cultivadas con éxito. El suero es necesario para el cultivo exitoso de muchas líneas celulares, pero contiene muchos contaminantes, incluidos sus propios exosomas. Otra ventaja de las líneas de células madre neurales CTX0E03, STR0C05 o HPC0A07, o cualquier otra línea celular que no requiera suero, es que se evita la contaminación por suero.

Las células de la línea celular CTX0E03 (y las micropartículas derivadas de estas células) son células multipotentes derivadas originalmente del córtex fetal humano de 12 semanas. El aislamiento, la fabricación y los protocolos para la línea celular CTX0E03 se describen en detalle por Sinden, et al. (Patente U.S. 7,416,888 y EP1645626 B1). Las células CTX0E03 no son "células madre embrionarias", es decir, no son células pluripotentes derivadas de la masa celular interna de un blastocisto; el aislamiento de las células originales no dio lugar a la destrucción de un embrión.

Las células CTX0E03 (y las micropartículas derivadas de estas células) son angiogénicas y, por lo tanto, son útiles para tratar enfermedades que requieren angiogénesis, como la Enfermedad Arterial Periférica. Las células (y las micropartículas derivadas de estas células) también son neurogénicas y, por lo tanto, son útiles en el tratamiento de enfermedades que requieren neurogénesis, como el cerebro dañado por isquemia (accidente cerebrovascular). CTX0E03 es una línea celular clonal que contiene una sola copia del transgén c-mycER que se administró por infección retroviral y está condicionalmente regulada por 4-OHT (4-hidroxitamoxifeno). El transgén C-mycER expresa una proteína de fusión que estimula la proliferación celular en presencia de 4-OHT y, por lo tanto, permite una expansión controlada cuando se cultiva en presencia de 4-OHT. Esta línea celular es clonal, se expande rápidamente en cultivo (tiempo de duplicación 50-60 horas) y tiene un cariotipo humano normal (46 XY). Es genéticamente estable y se puede cultivar en grandes cantidades. Las células son seguras y no tumorigénicas. En ausencia de factores de crecimiento y 4-OHT, las células se detienen y se diferencian en neuronas y astrocitos. Una vez implantadas en un cerebro dañado por isquemia, estas células migran solo a áreas de daño tisular.

El desarrollo de la línea celular CTX0E03 ha permitido la ampliación de un producto consistente para uso clínico. La producción de células a partir de materiales almacenados permite la generación de células en cantidades para aplicaciones comerciales (Hodges et al, 2007).

Pollock et al 2006 describen que el trasplante de CTX0E03 en un modelo de ictus en ratas (MCAo) causó mejoras estadísticamente significativas tanto en la función sensorimotora como en la asimetría motora gruesa entre las 6 y 12 semanas posteriores al injerto. Estos datos indican que CTX0E03 tiene las características biológicas y de fabricación adecuadas para el desarrollo como una línea celular terapéutica.

Stevanato et al 2009 confirman que las células CTX0E03 regulan a la baja la expresión del transgén c-mycERTAM tanto in vitro después de la retirada de EGF, bFGF y 4-OHT como in vivo después de la implantación en el cerebro de rata MCAo. El silenciamiento del transgén c-mycERTAM in vivo proporciona una característica de seguridad adicional de las células CTX0E03 para una posible aplicación clínica. Smith et al 2012 describen las pruebas de eficacia preclínica de CTX0E03 en un modelo de ictus en rata (oclusión transitoria de la arteria cerebral media). Los resultados indican que los implantes CTX0E03 recuperan de manera robusta la disfunción del comportamiento en un período de tiempo de 3 meses y que este efecto es específico de su sitio de implantación. La topología de la lesión es potencialmente un factor importante en la recuperación, ya que un derrame cerebral confinado al estriado muestra un mejor resultado en comparación con un área de daño más grande.

De acuerdo con la descripción, también se pueden usar líneas de células madre de la retina neural (por ejemplo, como se describe en el documento US 7514259).

El término "medio de cultivo" o "medio" se reconoce en la técnica y se refiere en general a cualquier sustancia o preparación usada para el cultivo de células vivas. El término "medio", como se usa en referencia a un cultivo celular, incluye los componentes del entorno que rodea a las células. Los medios pueden ser sólidos, líquidos, gaseosos o una mezcla de fases y materiales. Los medios incluyen medios de crecimiento líquidos, así como medios líquidos que no sostienen el crecimiento celular. Los medios también incluyen medios gelatinosos tales como agar, agarosa, gelatina y matrices de colágeno. Los medios gaseosos de ejemplos incluyen la fase gaseosa a la que están expuestas las células que crecen en una placa de Petri u otro soporte sólido o semisólido. El término "medio" también se refiere al material destinado a ser utilizado en un cultivo celular, incluso si aún no se ha puesto en contacto con las células. En otras palabras, un líquido rico en nutrientes preparado para el cultivo bacteriano es un medio. De manera similar, una mezcla de polvo que cuando se mezcla con agua u otro líquido se vuelve adecuado para el cultivo celular puede denominarse "medio en polvo". "Medio definido" se refiere a los medios que están hechos de componentes químicamente definidos (generalmente purificados). Los "medios definidos" no contienen extractos biológicos mal caracterizados, como el extracto de levadura y el caldo de res. "Medio rico" incluye medios diseñados para soportar el crecimiento de la mayoría o todas las formas viables de una especie en particular. Los medios ricos a menudo incluyen extractos biológicos complejos. Un "medio adecuado para el crecimiento de un cultivo de alta densidad" es cualquier medio que permita que un cultivo celular alcance una OD600 de 3 o mayor cuando otras condiciones (como la temperatura y la tasa de transferencia de oxígeno) permiten dicho crecimiento. El término "medio basal" se refiere a un medio que promueve el crecimiento de muchos tipos de microorganismos que no requieren ningún suplemento nutricional especial. La mayoría de los medios basales generalmente comprenden cuatro grupos químicos básicos: aminoácidos, carbohidratos, sales inorgánicas y vitaminas. Un medio basal generalmente sirve como base para un medio más complejo, al que se agregan suplementos tales como suero, reguladores, factores de crecimiento, lípidos y similares. En un aspecto, el medio de crecimiento puede ser un medio complejo con los factores de crecimiento necesarios para apoyar el crecimiento y la expansión de las células de la divulgación mientras se mantiene su capacidad de auto renovación. Los ejemplos de medios basales incluyen, pero no se limitan a, medio basal de águilas, medio esencial mínimo, medio de águila modificado de Dulbecco, medio 199, mezclas de nutrientes F-10 de Ham y F-12 de Ham, 5A de McCoy, MEM/FI 2 de Dulbecco, RPMI 1640, y Medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM).

Composiciones farmacéuticas

La micropartícula de células madre neurales de la divulgación, y la composición de ARNmi de la invención, es útil en terapia y, por lo tanto, puede formularse como una composición farmacéutica. Una composición farmacéuticamente aceptable incluye típicamente al menos un portador, diluyente, vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable además de las micropartículas de la divulgación. Un ejemplo de un portador adecuado es la solución de lactato de Ringer. Se proporciona una discusión detallada de dichos componentes en Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" se emplea en el presente documento para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance del buen juicio médico, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, en proporción con una relación razonable riesgo/beneficio.

La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes de regulación del pH. El portador puede comprender medios de almacenamiento tales como Hypothermosol®, disponible comercialmente en BioLife Solutions Inc., Estados Unidos. Ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E W Martin. Dichas composiciones contendrán una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de una micropartícula profiláctica o terapéutica preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehículo para proporcionar la forma para la administración apropiada al sujeto. La formulación debe adecuarse al modo de administración. En una realización preferida, las composiciones farmacéuticas son estériles y en forma adecuada para la administración a un sujeto, preferiblemente un sujeto animal, más preferiblemente un sujeto mamífero, y lo más preferiblemente un sujeto humano.

La composición farmacéutica de la invención puede estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación semisólidas y líquidas, como preparaciones liofilizadas, soluciones o suspensiones líquidas, soluciones inyectables e infusibles. La composición farmacéutica es preferiblemente inyectable. Una ventaja particular de las micropartículas de la divulgación es su robustez mejorada en comparación con las células madre de las que se obtienen; por lo tanto, las micropartículas pueden someterse a una formulación, como la liofilización, que no sería adecuada para las células madre. Esto también es una ventaja de las composiciones de ARNmi de la invención.

Se prefiere que los métodos, medicamentos y composiciones de la invención se usen para tratar o reparar tejido dañado, y/o para el tratamiento, modulación, profilaxis y/o mejora de uno o más síntomas asociados con trastornos tisulares. Particularmente preferido es el uso de los métodos, medicamentos, composiciones y micropartículas de la invención en terapia regenerativa, típicamente el tratamiento de apoplejía, enfermedad arterial periférica o enfermedades de la retina causantes de ceguera.

Las composiciones farmacéuticas estarán generalmente en forma acuosa. Las composiciones pueden incluir un conservante y/o un antioxidante.

Para controlar la tonicidad, la composición farmacéutica puede comprender una sal fisiológica, tal como una sal de sodio. Se prefiere el cloruro de sodio (NaCl), que puede estar presente entre 1 y 20 mg/ml. Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro de potasio, dihidrógeno fosfato de potasio, fosfato de disodio deshidratado, cloruro de magnesio y cloruro de calcio.

Las composiciones pueden incluir uno o más reguladores. Los reguladores típicos incluyen: un regulador de fosfato; un regulador Tris; un regulador borato; un regulador de succinato; un regulador de histidina; o un regulador de citrato. Los reguladores se incluirán normalmente en una concentración en el rango de 5-20 mM. El pH de una composición estará generalmente entre 5 y 8, y más típicamente entre 6 y 8, por ejemplo. entre 6.5 y 7.5, o entre 7.0 y 7.8.

La composición es preferiblemente estéril. La composición está preferiblemente libre de gluten. La composición es preferiblemente no pirogénica.

En una realización típica, las micropartículas se suspenden en una composición que comprende ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico (Trolox®), Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cl-, H2PO4, HEPES, lactobionato, sacarosa, manitol, glucosa, dextron-40, adenosina y glutatión.

Típicamente, la composición no incluirá un disolvente aprótico dipolar, por ejemplo, DMSO. Las composiciones adecuadas están disponibles comercialmente, por ejemplo, HypoThermasol®-FRS. Dichas composiciones son ventajosas ya que permiten que las micropartículas se almacenen a una temperatura de 4°C a 25°C durante períodos prolongados (de horas a días) o se conserven a temperaturas criotérmicas, es decir, temperaturas por debajo de -20°C. Las micropartículas pueden entonces administrarse en esta composición después de la descongelación.

La composición farmacéutica puede administrarse por cualquier vía apropiada, que será evidente para el experto en la materia dependiendo de la enfermedad o afección a tratar. Las vías de administración típicas incluyen la administración intravenosa, intraarterial, intramuscular, subcutánea, intracraneal, intranasal o intraperitoneal. Para el tratamiento de un trastorno del cerebro, una opción es administrar las micropartículas o composiciones de ARNmi por vía intracerebral, típicamente al sitio del daño o la enfermedad.

Las micropartículas o composiciones de ARNmi se administrarán a una dosis terapéutica o profilácticamente eficaz, que será evidente para el experto. Debido a la baja o nula inmunogenicidad de las micropartículas, es posible administrar dosis repetidas sin inducir una respuesta inmune perjudicial.

Usos terapéuticos

Las composiciones de ARNmi de la invención son útiles en el tratamiento o la profilaxis de la enfermedad. Por consiguiente, la invención incluye estas composiciones para uso en un método para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno en un paciente que usa una composición de micropartículas o ARNmi de la invención. El término "paciente" incluye seres humanos y otros mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o terapéutico.

Como se indicó anteriormente, las composiciones que comprenden los cuatro ARNmi de la invención también son útiles en estas terapias, y las referencias a los usos terapéuticos de las micropartículas en el presente documento, por lo tanto, se aplican igualmente a las composiciones que comprenden los cuatro ARNmi.

Las micropartículas terapéuticamente útiles de la divulgación tienen actividad regenerativa. Una micropartícula que tiene actividad regenerativa es una micropartícula que es capaz de activar o mejorar los procesos regenerativos, o inhibir o reducir los procesos degenerativos. Los procesos regenerativos conducen a la renovación, restauración, reparación y/o crecimiento de células y tejidos. Los procesos degenerativos conducen a una pérdida de integridad y/o función celular o tisular. Esto puede ser particularmente útil en el tratamiento de células o tejidos dañados o alterados, como los que resultan de apoplejía, trastornos psiquiátricos, infarto de miocardio, esclerosis lateral amiotrófica y enfermedad arterial periférica.

Las micropartículas de la divulgación son útiles en la regeneración de tejidos. La "regeneración tisular" es el proceso de aumentar el número de células en un tejido después de un trauma. El trauma puede ser cualquier cosa que haga que el número de células disminuya. Por ejemplo, un accidente, un trastorno autoinmune o un estado de enfermedad podrían constituir un trauma. La regeneración tisular aumenta el número de células dentro del tejido y permite restablecer las conexiones entre las células del tejido y recuperar la funcionalidad del tejido.

La terapia puede ser una terapia regenerativa que requiere reemplazo de tejido, regeneración o reparación. La terapia puede ser por una enfermedad neurológica, trastorno o déficit. La terapia puede mejorar la recuperación funcional y/o cognitiva. La terapia puede ser de apoplejía, enfermedad arterial periférica, neuropatía o cualquier otra enfermedad o trastorno que requiera la regeneración de tejidos, revascularización o acción antiinflamatoria local, que incluye:

(ii) Trastornos de almacenamiento lisosómico;

(iv) Enfermedades de los pulmones, incluida fibrosis pulmonar idiopática, síndrome de dificultad respiratoria, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, hipertensión pulmonar idiopática, fibrosis quística y asma;

(viii) Enfermedades desmielinizantes, como esclerosis múltiple, parálisis cerebral, mielinolisis pontina central, tabes dorsalis, mielitis transversa, enfermedad de Devic, leucoencefalopatía multifocal progresiva, neuritis óptica, leucodistrofia, síndrome de Guillain-Barré, neuropatía periférica anti-MAG y enfermedad de Charcot-Marie-Tooth.

En una realización, la micropartícula y las composiciones que las contienen no se usan para la modulación inmune. En una realización, la terapia no está relacionada con la inmunomodulación.

La divulgación también proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección que comprende administrar una cantidad eficaz de la micropartícula de la divulgación, tratando así o previniendo la enfermedad. Típicamente, la enfermedad o condición es como se identifica arriba.

Las micropartículas de la divulgación se pueden usar para tratar las mismas enfermedades que las células madre de las que se obtienen. Se sabe que las células madre neurales son útiles en el tratamiento de enfermedades que incluyen: apoplejía, daño cerebral tal como déficit motor, sensorial y/o cognitivo, trastornos psiquiátricos, infarto de miocardio, esclerosis lateral amiotrófica, isquemia de las extremidades, enfermedad arterial periférica. Por consiguiente, las micropartículas de la divulgación también son útiles en el tratamiento de apoplejía, daño cerebral tal como déficit motor, sensorial y/o cognitivo, trastornos psiquiátricos, infarto de miocardio, esclerosis lateral amiotrófica, isquemia de las extremidades, enfermedad arterial periférica.

La figura 6 y el ejemplo 8 demuestran que los exosomas obtenidos de células madre neurales estimulan la cicatrización de heridas. Por consiguiente, en una realización, los exosomas de la divulgación se usan para tratar una enfermedad o afección que requiere el reemplazo, regeneración o reparación de tejidos. Tales condiciones incluyen úlceras diabéticas y cicatrización de heridas. La Figura 6C muestra que los exosomas aislados de NSC cultivados durante 6 semanas son más eficaces que los exosomas aislados de NSCs cultivados durante 2 semanas. Por consiguiente, en una realización, los exosomas aislados de NSCs (típicamente células CTX0E03) que se han cultivado (típicamente en un biorreactor de múltiples compartimientos) durante al menos 2 semanas, más típicamente al menos 4 semanas o al menos 6 semanas, se usan para tratar una enfermedad o afección que requiere reemplazo, regeneración o reparación de tejidos. Opcionalmente, los NSC se han cultivado durante no más de diez semanas, por ejemplo, entre 2 y 10 semanas, entre 3 y 10 semanas, entre 4 y 10 semanas, entre 5 y 10 semanas o entre 6 y 10 semanas.

La mayor eficacia observada de los exosomas aislados de NSC (células CTX0E03) que se han cultivado (en un biorreactor de múltiples compartimientos) durante 6 semanas se correlaciona con la reducción observada en el tamaño de los exosomas a alrededor de 70 nm de diámetro, lo que también ocurrió después del cultivo de las células durante 6 semanas Por consiguiente, en una realización, los exosomas aislados de NSC (típicamente células CTX0E03) que se han cultivado (típicamente en un biorreactor de múltiples compartimientos) se usan para tratar una enfermedad o afección que requiera reemplazo, regeneración o reparación de tejidos. Como se señaló anteriormente, opcionalmente, las NSC se han cultivado durante no más de diez semanas, por ejemplo, entre 6 y 10 semanas. En otra realización, los exosomas aislados de NSCs (típicamente células CTX0E03) que tienen un diámetro menor que 100 nm, típicamente menor que 80 nm, por ejemplo, alrededor de 70 nm de diámetro, se usan para tratar una enfermedad o afección que requiere reemplazo, regeneración o reparación de tejidos.

Como se muestra en la Figura 12 y se analiza en el Ejemplo 8, las microvesículas obtenidas de células madre neurales estimulan la angiogénesis. Por consiguiente, en una realización, las microvesículas de la divulgación se usan para tratar una enfermedad o afección que requiere angiogénesis, típicamente una enfermedad o trastorno que se trata mediante regeneración de tejidos y/o revascularización. Las microvesículas de la divulgación se pueden usar en el tratamiento de trastornos cardiovasculares, tales como infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca congestiva, enfermedad arterial periférica, úlceras diabéticas y cicatrización de heridas. La estimulación de la angiogénesis también es terapéuticamente útil en el tratamiento de la isquemia, en particular la isquemia cardíaca y la isquemia de las extremidades. La Figura 12 muestra que las microvesículas recogidas de NSC cultivadas durante al menos 3 semanas son más eficaces que las microvesículas aisladas de NSC cultivadas durante 1 o 2 semanas. Por consiguiente, en una realización, las microvesículas aisladas de NSC (típicamente células CTX0E03) que se han cultivado (típicamente en un biorreactor de múltiples compartimientos) durante al menos 3 semanas, más típicamente al menos 4 semanas o al menos 6 semanas, se usan para tratar una enfermedad o afección que requiere angiogénesis. Opcionalmente, los NSC se han cultivado durante no más de diez semanas, por ejemplo, entre 3 y 10 semanas, entre 4 y 10 semanas, entre 5 y 10 semanas o entre 6 y 10 semanas.

omo se muestra en la Figura 13 y se analiza en el Ejemplo 8, las microvesículas obtenidas a partir de células madre neurales estimulan el crecimiento de las neuritas. Por consiguiente, en una realización, las microvesículas de la divulgación se usan para tratar una enfermedad neurológica, trastorno o déficit, tal como enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular, neuropatía o ELA.

En aplicaciones profilácticas, las composiciones farmacéuticas o los medicamentos se administran a un paciente susceptible o, por lo demás, en riesgo de contraer una enfermedad particular en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo o retrasar el inicio de la enfermedad. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones o medicamentos se administran a un paciente sospechoso de o que ya padece una enfermedad de este tipo en una cantidad suficiente para curar, o al menos detener parcialmente, los síntomas de la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una dosis terapéuticamente o farmacéuticamente eficaz. Tanto en los regímenes profilácticos como en los terapéuticos, los agentes se administran típicamente en varias dosis hasta que se haya logrado una respuesta suficiente. Normalmente, la respuesta se controla y se administran dosis repetidas si la respuesta comienza a desvanecerse.

Las micropartículas de la divulgación pueden combinarse opcionalmente con una célula madre para proporcionar una terapia de combinación. La célula madre es opcionalmente la célula madre de la cual se deriva la micropartícula, por ejemplo, si la micropartícula es un exosoma de una célula CTX0E03, entonces la célula madre para uso en terapia de combinación puede ser una célula CTX0E03. Una célula madre y una micropartícula pueden ser opcionalmente (i) administradas juntas en una única composición farmacéutica, (ii) administradas de forma contemporánea o simultánea pero por separado, o (iii) administradas por separado y de forma secuencial, por ejemplo célula madre seguida de micropartícula, o micropartícula seguida de célula madre. Cuando la célula madre y la micropartícula se administran por separado y de forma secuencial, la duración entre la administración de la célula y la micropartícula puede ser de una hora, un día, una semana, dos semanas o más.

En una realización, una terapia profiláctica induce tolerancia, típicamente inmunotolerancia, en un huésped que debe recibir las células madre de las que se deriva la micropartícula. En una realización, la administración de una o más dosis de micropartículas de la divulgación a un paciente, antes de la administración de una terapia con células madre, puede usarse para reducir el riesgo de una respuesta inmune adversa, es decir, el "rechazo", de la terapia con células madre. En otra realización, la tolerancia a las células madre se puede aumentar administrando células madre junto con micropartículas de la divulgación, como se discutió anteriormente.

Las dosis efectivas de las composiciones de la presente invención, para el tratamiento de las afecciones descritas anteriormente varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluidos los medios de administración, el sitio objetivo, el estado fisiológico del paciente, si el paciente es humano o un animal, otros medicamentos administrado, y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Por lo general, el paciente es un humano.

La línea celular CTX0E03 ha demostrado ser eficaz en el tratamiento de apoplejía, enfermedad arterial periférica, daño cerebral tal como déficit motor, sensorial y/o cognitivo, y trastornos psiquiátricos. Las células se están probando actualmente en un ensayo clínico para el tratamiento de pacientes con accidente cerebrovascular discapacitados (Clinicaltrials.gov Identifier: NCT01151124). El documento WO-A-2012/004611 describe el uso de las células CTX0E03 en el tratamiento de trastornos psiquiátricos que incluyen depresión unipolar y bipolar, esquizofrenia, trastorno obsesivo compulsivo, autismo y trastornos del síndrome autista. En consecuencia, las micropartículas producidas por las células CTX0E03 también pueden tratar accidentes cerebrovasculares, enfermedades arteriales periféricas, enfermedades de la retina causantes de ceguera (como la retinitis pigmentos), daños cerebrales como déficit motor, sensorial y / o cognitivo, y trastornos psiquiátricos.

Como se usa en el presente documento, los términos "tratar', "tratamiento", "tratando" y "terapia" cuando se usan directamente en referencia a un paciente o sujeto deben entenderse como la mejora de uno o más síntomas asociados con un trastorno, o la prevención o profilaxis de un trastorno o uno o más síntomas asociados con un trastorno. Los trastornos por tratar incluyen, pero no se limitan a, un trastorno degenerativo, un trastorno que implica la destrucción del tejido, un trastorno neoplásico, un trastorno inflamatorio, una enfermedad autoinmune o una enfermedad mediada inmunológicamente que incluye el rechazo de órganos y tejidos trasplantados. La mejora o prevención de los síntomas se debe a la administración de las micropartículas de la divulgación, o de una composición farmacéutica que comprende estas micropartículas, a un sujeto que necesita dicho tratamiento.

Rastreo de células administradas y micropartículas in vivo

La presente descripción proporciona un perfil de marcador distinto para micropartículas producidas por células madre neurales. Por lo tanto, es posible detectar la presencia de estas micropartículas in vivo, analizando una muestra obtenida de un paciente y determinando si el perfil del marcador en la muestra coincide con el de las micropartículas. Si el perfil de la muestra coincide con el perfil de las micropartículas aquí descritas, esto confirma la presencia de las micropartículas. Esto se puede usar para detectar no solo la presencia y/o la biodistribución de las micropartículas en sí, sino también la presencia de células madre que producen las micropartículas. Esto es particularmente útil cuando se detecta si una célula madre administrada in vivo se injertó en el tejido huésped y/o migró, por ejemplo, en estudios ADME(T).

La detección de las micropartículas in vivo se puede usar para controlar el curso de un tratamiento en el que se administran micropartículas o células madre a un paciente. La determinación de la presencia, ausencia o cantidad de micropartículas o células productoras de micropartículas de la divulgación en un paciente permite que el régimen de dosificación se modifique en consecuencia, por ejemplo. para aumentar o disminuir la dosis según sea necesario para proporcionar una cantidad eficaz de micropartículas o células madre in vivo.

Métodos de producción de micropartículas.

Las micropartículas se aíslan de medios acondicionados con células madre. El "medio acondicionado" (CM) puede ser un medio de crecimiento para células madre, que se ha utilizado para cultivar un cultivo en masa de células madre durante al menos aproximadamente 12 horas, al menos aproximadamente 24 horas, al menos aproximadamente 48 horas o al menos aproximadamente 72 horas, típicamente hasta 168 horas (7 días), eliminadas y esterilizadas por cualquier medio adecuado, preferiblemente por filtración, antes de su uso, si es necesario.

Alternativamente, las micropartículas pueden recolectarse de un biorreactor de dos compartimientos que permite que el cultivo celular, y por lo tanto los medios condicionados, se mantengan por períodos de tiempo más largos, por ejemplo, al menos 2 semanas, al menos 3 semanas, al menos 4 semanas, al menos 5 semanas, al menos 6 semanas o más. El sistema mantiene las células y las micropartículas secretadas dentro de un compartimento de células pequeñas (aproximadamente 15 ml) que se separa de un depósito más grande de medio por una membrana semipermeable de 10 kDa. Esto permite la eliminación eficiente de productos de desecho metabólicos mientras se mantiene efectivamente una densidad celular extremadamente alta para maximizar la producción de micropartículas. El Ejemplo 9, y las Figuras 7 y 8, demuestran que el uso de un biorreactor de dos compartimientos da como resultado un rendimiento de micropartículas mucho mayor que el obtenido cuando se usa un matraz de cultivo celular estándar (matraz T175).

Las micropartículas pueden separarse de otros componentes de los medios en función del peso molecular, tamaño, forma, radio hidrodinámico, composición, carga, interacción sustrato-ligando, absorbancia o dispersión de las ondas electromagnéticas o actividad biológica. En una realización, el medio acondicionado se filtra utilizando un filtro de tamaño apropiado para separar la micropartícula deseada, por ejemplo, un filtro MWCO de 100K. Opcionalmente, el medio acondicionado con células madre se concentra antes del aislamiento de las micropartículas sometiendo el medio acondicionado con NSC concentrado a cromatografía de exclusión por tamaño. Las fracciones absorbentes de UV pueden seleccionarse para el aislamiento de las micropartículas de interés.

Se pueden aislar diferentes micropartículas de los medios usando diferentes técnicas y parámetros de aislamiento. Por ejemplo, los exosomas tienen una densidad de vesículas de 1.13-1.19 g/mL y se pueden aislar mediante centrifugación diferencial y ultracentrifugación en gradiente de sacarosa a 100000-200 000 g. Las microvesículas se pueden aislar por filtración (100K MWCO) y centrifugación diferencial a 18000-20000g. Las partículas de membrana tienen una densidad de 1.04-01.07 g/ml y las vesículas de tipo exosoma tienen una densidad de 1.1 g/ml.

Un método de producción típico comprende: cultivar células madre para producir medios acondicionados; eliminar los residuos celulares por centrifugación a 1500 rpm; aislamiento de microvesículas (<1000 kDa) mediante ultrafiltración a través de un filtro de 100K MWCO o aislamiento de exosomas (30-100 nm) mediante ultracentrifugación a 120000 g; seguido de la cuantificación utilizando un ensayo de proteína BCA.

Células madre inmortalizadas condicionalmente como células productoras de micropartículas

En un aspecto de la divulgación, se usan células madre inmortalizadas condicionalmente para producir micropartículas tales como microvesículas y/o exosomas. Estas células madre inmortalizadas condicionalmente son típicamente células madre neurales, pero pueden ser células madre de cualquier tipo, por ejemplo, una célula madre hematopoyética o una célula madre mesenquimal. Por lo tanto, se proporciona un método para producir micropartículas de células madre, que comprende las etapas de cultivar células madre condicionalmente inmortalizadas y recolectar las micropartículas que son producidas por las células. La inmortalización condicional de células madre es conocida en la técnica, como se describió anteriormente. Para evitar dudas, este método no se limita al uso de células madre neurales.

Cuando la célula madre utilizada para producir micropartículas es una célula madre neural, puede ser cualquiera de las células madre neurales descritas en este documento, por ejemplo, la línea celular CTX0E03 condicionalmente inmortalizada que es clonal, estandarizada, muestra una clara seguridad in vitro e in vivo y se puede fabricar a escala, proporcionando así un recurso único para la producción estable de exosomas. Alternativamente, las células madre neurales pueden ser líneas de células madre de la retina neural, opcionalmente como se describe en el documento US 7514259.

Cuando la célula madre utilizada para producir micropartículas es una célula madre mesenquimal, puede ser opcionalmente una célula madre derivada de tejido adiposo inmortalizada condicionalmente ("ADSC") o una versión inmortalizada condicionalmente de las células madre mesenquimales descritas en WO-A-2009/105044; estas células son CD29+, CD44+, CD49a+/e+, CD105+, CD166+, CD34-, CD45-.

Métodos de inducción de la secreción de micropartículas

Los inventores han descubierto que es posible aumentar la producción de micropartículas por las células madre. Este hallazgo, que no se limita a las células madre neurales y se puede usar para la producción de micropartículas a partir de cualquier célula madre, permite obtener un rendimiento mejorado de micropartículas a partir de un cultivo de células madre.

Una primera técnica para aumentar la producción de micropartículas por las células madre es tratar las células madre con una o más de TGF-p, IFN-y o TNF-a, típicamente entre 1 y 25 ng/ml, por ejemplo, 10 ng/ml, entre 12 y 96 horas antes de la eliminación de los medios acondicionados.

Como se explica más adelante en el Ejemplo 2, se observó que la frecuencia de aparición de cuerpos multivesiculares (MVB) se ve alterada por la presencia de TGF-p, IFN-^yo TNF-a (10 ng/ml). La frecuencia fue más alta en presencia de TGF-p, seguido de IFN-^y, seguido de TNF-a. Por lo tanto, agregar uno o más de TGF-p, IFN-^yo TNF-a al medio de cultivo de células madre estimulará la producción de micropartículas por parte de las células. Las micropartículas se pueden recolectar separando las micropartículas de otros componentes como se describió anteriormente.

Una segunda técnica para aumentar la producción de micropartículas por las células madre es cultivar las células en condiciones hipóxicas. El cultivo de células en condiciones hipóxicas es bien conocido por el experto en la materia, e implica cultivar las células en una atmósfera que tiene menos del nivel atmosférico de O2, es decir, menos del 21% de O2. Esto se logra típicamente colocando las células en una incubadora que permite cambiar los niveles de oxígeno. El cultivo hipóxico típicamente implica cultivar en una atmósfera que contenga menos de 10% de O2, más típicamente 5% o menos de O2, por ejemplo 4% o menos, 3% o menos, 2% o menos, o 1% o menos de O2.

Los inventores también han advertido que el cocultivo de una célula madre con un tipo de célula diferente puede alterar la producción de micropartículas por parte de la célula madre. El tipo de célula diferente puede ser una célula no madre, es decir, un tipo de célula diferenciado terminalmente. Normalmente, el tipo de célula diferente es uno con el que la célula madre interactuaría in vivo. En una realización, las células madre neurales se cultivan conjuntamente con células epiteliales, tales como células endoteliales, típicamente células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC). Se ha observado que in vivo, las NSC y la vasculatura interactúan, con NSCs proliferantes que se localizan cerca o adyacentes a los vasos sanguíneos. También se ha observado que la activación de la tirosina quinasa del receptor y la secreción de la proteína señal se regula al alza cuando las NSC se cultivan conjuntamente con células endoteliales, lo que nuevamente indica que la vasculatura modula la capacidad de proliferación de las NSC. Sin desear estar limitados por la teoría, los inventores creen que in vivo, existe una interacción fundamental entre las NSC y los microvasos (es decir, las células endoteliales) en el proceso de regeneración tisular, mediante la amplificación de la expresión de citoquinas. Micropartículas, por ejemplo, Los exosomas, derivados de NSC (por ejemplo, células CTX0E03) cocultivadas con células endoteliales (por ejemplo, HUVEC) se preparan para su uso terapéutico, porque se han producido en un entorno que imita el entorno in vivo en el que las células madre y las micropartículas son activos.

Por lo tanto, cultivar una célula madre con un tipo de célula diferente puede mejorar la cantidad de micropartículas producidas y/o puede refinar el contenido de las micropartículas, típicamente de manera que las micropartículas producidas por las células madre se desvíen hacia un estado activado de reparación tisular. Por consiguiente, las micropartículas producidas por células madre que han sido cocultivadas con otras células, Por ejemplo, las NSC cocultivadas con células endoteliales, son ventajosas. Estas micropartículas pueden obtenerse por aislamiento de los medios condicionados de células madre cocultivadas, como se describe en el presente documento.

Sorprendentemente, los presentes inventores han advertido que la cantidad de micropartículas producidas por las células madre puede incrementarse en gran medida simplemente cultivando células madre en un biorreactor de múltiples compartimentos. Este hallazgo no se limita a las células madre neurales y se aplica generalmente al cultivo de todas las células madre. Por consiguiente, un aspecto de la divulgación proporciona un método para producir micropartículas a partir de células madre que se han cultivado en un biorreactor de múltiples compartimentos. Las células de las que se recogen las micropartículas se han cultivado típicamente durante al menos una semana, típicamente al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 días, por ejemplo 15 días, 16 días, 17 días, 18 días. 19 días, 20 días, 21 días o más, por ejemplo, al menos tres semanas, cuatro semanas, cinco semanas, seis semanas o más. Se puede ver en la Figura 8 que el aumento en la producción de micropartículas, semana a semana, no es meramente aditivo sino exponencial. El cultivo prolongado generalmente se ha observado en el biorreactor de dos compartimientos del sistema Integra Celline (disponible comercialmente en Integra Biosciences AG, Zizers, Suiza) pero los hallazgos no se limitan a este biorreactor específico de múltiples compartimentos; se puede usar cualquier biorreactor de múltiples compartimientos. Este método de cultivo se puede usar para producir micropartículas de cualquier tipo de células madre, incluidas, entre otras, células madre neurales y células madre mesenquimales.

Método de selección de un agente que altera la producción de micropartículas

La descripción proporciona un método de selección de un agente que altera la producción de una micropartícula por una célula madre. Este método comprende poner en contacto una célula madre con un agente candidato, típicamente en condiciones adecuadas para la producción de micropartículas, y observar si (i) la tasa de producción de micropartículas por las células madre contactadas aumenta o disminuye, o (ii) las características (por ejemplo, tamaño, el contenido de proteínas, ARNm o ARNmi) de las micropartículas cambia, en comparación con una célula madre de control que no se pone en contacto con el agente.

Método para seleccionar la composición total de ARN del medio acondicionado

Después de la centrifugación (5 min a 1500 rpm), las micropartículas se recogen del medio acondicionado a través de filtración (0.02-0.2 pm, o 100K MWCO). El ARN total se obtiene utilizando una extracción basada en trizol seguida de purificación utilizando el mini kit Qiagen RNaesy. El extracto en agua tiene una absorbancia a 260:280 nm, lo que sugiere que puede ser ARN. El ARN total se retranscribe con un protocolo adecuado para ARNm (Superscript II Rt , Invitrogen) o ARNmi (kit mScript RT, Qiagen). La validación de la presencia de ARNm y ARNmi se ha comprobado mediante qRT-PCR utilizando cebadores para ATP5B y YWHA^zpara ARNm, y U6B y 15a para genes de mantenimiento de ARNmi, respectivamente. El ARN puede evaluarse mediante un análisis genérico de la expresión génica, como un arreglo (microarreglo o arreglo basado en PCR) y secuenciación.

La invención se describe adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Preparación de células madre neurales y micropartículas de células madre neurales para visualización por microscopía electrónica.

Método

Incrustación de células CTX0E03 para microscopía electrónica

• 5 cultivos x 70% CTX0E03

• Tratar con /- 4OHT, IFNy, TNFa y TGFp (todos a 10 ng durante 24 horas)

• Separar las células y fijarlas durante la noche en glutaraldehído al 2.5% en cacodilato 0.1 M, pH 7.4

• Células giradas hacia abajo 300 g

• osmio regulado 2%, 1.5 horas.

• Giro, agua de lavado, toda la noche.

• Acetato de uranio 2%, 2 horas.

• Giro, agua de lavado, 30 minutos.

• Gradiente de etanol 20, 35, 50, 70, 80, 90, 100%, durante el fin de semana.

• 100% de óxido de propileno (PO), 1 hora

• Giro, 50% de resina Agar LV en PO, 1 hora

• 75% resina LV/PO 5hrs.

• 100% resina durante la noche a 60°C.

• Enfriar a temperatura ambiente antes de cortar (60-80nm), TEM en imágenes a 200Kv.

Resultados

La figura 1A-E muestra las micrografías electrónicas de los cuerpos multivesiculares (MVB) que contienen exosomas de aproximadamente 30 nm a 50 nm de diámetro. La figura 1F muestra microvesículas >100 nm de diámetro.

Ejemplo 2: Producción de micropartículas de células madre neurales a partir de una línea de células madre neurales. Método

Se trataron individualmente 5 matraces subconfluentes que contenían el mismo cultivo de células CTX0E03 con 10 ng/ml de TGF-p, 10 ng/ml de IFN^yo 10 ng/ml de TNFa junto con controles de medio de crecimiento completo con o sin la adición de 4OHT. 72 horas después del tratamiento, las células se recolectaron utilizando Trypzean/EDTA, se lavaron y se fijaron durante la noche en glutaraldehído al 2.5% en cacodilato 0.1 M, pH 7.4, listo para la evaluación por microscopía electrónica.

Resultados

Se observó que la frecuencia de aparición de cuerpos multivesiculares (MVB) se ve alterada por la presencia de TGF-p, IFN-y o TNF-a. La frecuencia fue más alta en presencia de TGF-p, seguido de IFN-y, seguido de TNF-a.

Conclusión

La producción de micropartículas a partir de células madre neurales se puede estimular mediante la adición de los factores TGF-p, IFN-y o TNF-a. Esto tiene el potencial para una producción más eficiente de micropartículas.

Ejemplo 3: Purificación, cuantificación y caracterización de micropartículas de células madre neurales.

Método

En la Figura 2 se proporciona un esquema general para producir grandes cantidades de micropartículas. Los pasos principales son la purificación, cuantificación, caracterización, pruebas de eficacia y fabricación.

(1) Purificación

Las micropartículas pueden purificarse a partir de un medio acondicionado con células madre mediante ultracentrifugación, por ejemplo, a 100000 x g durante 1-2 horas. Se pueden usar métodos alternativos o adicionales para la purificación, tales como los métodos basados en anticuerpos, por ejemplo, inmunoprecipitación, purificación con perlas magnéticas, purificación basada en resina, utilizando anticuerpos específicos.

(2) Cuantificación

Las micropartículas purificadas se pueden cuantificar mediante la cuantificación de los niveles totales de ácido nucleico o proteína, por ejemplo, diversos métodos de cuantificación de proteínas por PCR o colorimétricos, como el ensayo BCA. Se pueden usar alternativamente otras técnicas de cuantificación, que incluyen una rejilla de microscopía electrónica o un ensayo inmune que usa anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen específicamente a marcadores específicos de micropartículas (por ejemplo, ELISA, inmunotransferencia).

(3) Caracterización

Las micropartículas pueden caracterizarse funcional o estructuralmente. El ARN/ARNm/ARNmi y el perfil de proteínas se pueden usar usando métodos bien conocidos en la técnica (SDS-PAGE, espectrometría de masas, PCR). Las micropartículas secretadas constitutivamente pueden probarse y compararse con micropartículas que se han inducido mediante la adición de un agente inductor como el factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), interferón gamma (INF-y) y/o factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a).

(4) Eficacia terapéutica

La eficacia de las micropartículas se puede probar mediante ensayos in vitro e in vivo. Para la evaluación in vitro, se pueden agregar micropartículas de células madre neurales a cultivos de monocitos, PBMC, células endoteliales y/o fibroblastos y se puede evaluar el efecto de las micropartículas en estas células. La administración de micropartículas de células madre neurales a modelos animales adecuados puede usarse para evaluar la eficacia in vivo. Se pueden realizar ensayos clínicos para evaluar la seguridad y el resultado de las micropartículas de células madre neurales en sujetos humanos.

(5) Fabricación/Escalamiento

Los biorreactores, como el T1000 Integra desechable, se pueden utilizar para la fabricación a gran escala de micropartículas de células madre neurales. Las micropartículas purificadas se formulan como un producto terapéutico. Ejemplo 4: Caracterización de ARNmi en micropartículas de CTX0E03

Métodos

• 3 condiciones: células CTX0E03 en cultivo estándar; micropartículas obtenidas de células CTX0E03 en cultivo estándar; y exosomas purificados derivados de células CTX0E03 en el sistema Integra CELLine (véase Ejemplos 7 a 11, a continuación)

• Investigación de la matriz de ARNmi utilizando el panel qRT-PCR (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este ensayo proporciona alta precisión y alta sensibilidad, con normalización de datos sensible al método/elección de genes de referencia. No proporciona secuenciación amplia del genoma.

Resultados:

A) Lista de ARNmi con un cp < 35 encontrado en (i) células CTX0E03 estándar, (ii) medio condicionado filtrado (filtro de 0.02-0.2 pm), es decir, micropartículas y (iii) exosomas derivados del sistema Integra CELLine (arreglo preliminar ARNmi qRT-PCR miscript (Qiagen) resultados).

B) Media aritmética y geométrica de los genes de referencia (limpieza)

A

B

Ejemplo 5: CTX0E03 análisis de medio condicionado usando una transferencia de punto de proteína

Métodos

• Medio acondicionado 24 horas y 72 horas condicionado (RMM y medio ITS)

• Los medios recolectados se 'concentraron' mediante diálisis y las proteínas se biotinilaron (la concentración de proteína total típica parece ser de 0.5 mg/ml). El medio se incuba luego con las matrices de proteínas humanas Raybiotech L507 (concentración de proteína total 0.1 mg/ml). Después del lavado y la incubación de la matriz con estreptavidina conjugada con HRP, la presencia de proteínas se detecta mediante quimioluminiscencia. La matriz proporciona datos cualitativos (es decir, la proteína está presente, pero no hay indicación de su nivel de expresión en comparación con otras proteínas).

Resultados

Ejemplo 6: Análisis de medio condicionado utilizando tiras ELISA para angiogénesis humana (Signosis)

Método

Se utilizaron tiras ELISA para angiogénesis humana (Signosis) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El medio RMM fresco y el medio CTX0E03 RMM acondicionado durante 24 horas se analizaron para detectar 8 citoquinas de angiogénesis; factor de necrosis tumoral a (TNFa), factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF-1), VEGFA, interleucina-6 (IL-6), bFGF, factor de crecimiento transformante p1 (TGFp1), EGF y leptina. Los pozos individuales de la tira, recubiertos con cada uno de los anticuerpos primarios dirigidos contra las citoquinas de angiogénesis específicas, se cargaron con muestras de ensayo. La absorbancia se midió con un espectrofotómetro a 450 nm. Las concentraciones de las citoquinas de la angiogénesis fueron directamente proporcionales a la intensidad del color de la muestra de prueba.

Los resultados se muestran en la Figura 3.

Ejemplo 7: Integra CELLINE - Biorreactor desechable para la producción de micropartículas a partir de células CTX0E03.

La producción y recolección eficiente de micropartículas a partir de una línea celular se basa en el mantenimiento de condiciones de cultivo óptimas para la mayor densidad de células. Cualquier restricción en el oxígeno o los nutrientes suministrados a las células o una acumulación de productos metabólicos de desecho limitará la vida útil del cultivo y, por lo tanto, la producción de micropartículas.

La CELLine AD 1000 de dos compartimentos está diseñada para alojar células adherentes unidas a una matriz de inserción dentro de un compartimento de células pequeñas, separadas de un depósito de medios más grande por medio de una membrana semipermeable de 10 kDa. Esta membrana permite una difusión continua de nutrientes y la eliminación de productos de desecho, mientras concentra cualquier micropartícula producida por la célula dentro del compartimiento de la célula más pequeña. Debido a la gran capacidad de volumen (1 litro) del compartimiento de medios, el sistema tiene el potencial de mantener cultivos de alta densidad durante largos períodos de tiempo sin la necesidad de un cambio de medios. La producción de exosomas a partir de cultivos de células tumorales de mesotelioma se describe en Mitchell et al, 2008.

Método

Para obtener un rendimiento óptimo de la CELLine AD1000, se colocan 25 ml de medio de crecimiento completo (RMM con factores de crecimiento y 4OHT) en el compartimento del medio del matraz para preparar previamente la membrana semipermeable. Se deja reposar el matraz durante 5 minutos a temperatura ambiente antes de recubrir la matriz con laminina de ratón agregando 15 ml de solución de laminina (20 pg/ml en DMEM/F12) al compartimiento de la celda durante un mínimo de 1 hora a 37°C. Se retira la solución de laminina y se agregan 15 ml de DMEM/F12 caliente al compartimiento de la celda para eliminar cualquier exceso de laminina. Evitando que la matriz se seque, lentamente se introducen aproximadamente 15x106 células CTX0E03 en un total de 15 ml de medio de crecimiento completo. Tenga cuidado de eliminar las burbujas de aire del compartimiento de la celda. Se agregan cuidadosamente otros 460 ml de medio de crecimiento completo al compartimiento celular antes de incubar el matraz durante la noche en CO2 al 5% a 37°C. Al día siguiente, se retira el medio del compartimiento de la celda y se reemplaza con 15 ml de medio de crecimiento precalentado.

Cada 7 días se recogen las micropartículas/medio del compartimento celular. Centrifugar el medio a 1500 rpm durante 5 minutos para eliminar los residuos celulares y almacenar a -80°C. Con cuidado, se agregan otros 15 ml de medio de crecimiento completo precalentado en el compartimento celular y 485 ml de medio de crecimiento completo en el compartimento del medio y se incuba durante otros 7 días. Las micropartículas se aislaron mediante filtración con MWCO de 100K. Repetir según sea necesario.

La Figura 4A muestra la cantidad de proteína extraída de 15 ml de medio que contiene micropartículas purificadas utilizando el sistema Integra en comparación con las condiciones de cultivo normales (3 días T175). Miligramos de proteína medidos por ensayo BCA. La Figura 5 muestra la cantidad correspondiente de ARN total aislado medido a 260/280nm.

Las caracterizaciones de los marcadores indicaron que ambas poblaciones purificadas (microvesículas y exosomas) expresan CD63 y CD81 (determinado por FACS - Figura 4B). Solo los exosomas expresan el marcador endosomal Alix (determinado por inmunoprecipitación Western, datos no mostrados).

Ejemplo 8: Ensayos de eficacia

(A) Comparación de la función de los medios condicionados con CTX0E03 con la función de exosomas purificados de células CTX0E03 en un ensayo de cicatrización de heridas.

Método - Cierre de herida/ensayo de raspado.

• Sembrar 0.25x106 NHDF (fibroblastos dérmicos humanos normales) por pozo de una placa de 12 pozos y dejar que confluyan (24 horas)

• Eliminar los factores de crecimiento durante 24 horas

• Retirar las células (raspado) e incubar con exosomas/medios acondicionados

• imagen de área afectada en 48 horas

• Estimar el área usando Image J

Resultados

Tabla 2 - Ensayo de cierre/raspado de la herida que representa la actividad de migración de los fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) cultivados en medios condicionados con CTX0E03 o tras la adición de exosomas purificados.

El cierre de la herida se calculó como el área cubierta por las células en relación con el área de la herida inicial, según lo determinado a las 0 h. El cierre de la herida se expresa como el porcentaje del área de la herida inicial en el tiempo 0 h. Estos datos también se muestran, fotográficamente, en la Figura 6A.

La Figura 6B muestra que 10 |jg de exosomas CTX0E03 aumentan significativamente el cierre de la herida (según se determina en el ensayo de raspado/migración de HDNF) después de 72 horas, en comparación con las condiciones basales (sin exosomas).

Otros experimentos confirmaron que los exosomas se purificaron (mediante ultracentrifugación; cuantificados por el ensayo de proteína BCA; caracterizados como > 99% positivos para CD63 y CD81 y que tienen un mayor nivel de expresión de Alix en comparación con la fracción de micropartículas correspondiente) de todos los puntos de tiempo (semanas 2-6) durante el cultivo continuo (utilizando biorreactores Integra CELLine en presencia de factores de crecimiento y 4OHT) la migración de fibroblastos y la cicatrización de las heridas aumentaron significativamente, con una respuesta máxima entre 5-10 jg/m l en comparación con las condiciones basales. La Figura 6C muestra el % de áreas curadas para condiciones basales, 2 jg/m l de exosomas, 6 jg/m l de exosomas, 20 jg/m l de exosomas y un control positivo LSGS (suplemento de bajo crecimiento de suero). El panel superior de la Figura 6C muestra exosomas aislados de células CTX0E03 cultivadas durante 2 semanas en el sistema Integra Celline, y el panel inferior de la Figura 6C muestra exosomas aislados de células CTX0E03 cultivadas durante 6 semanas en el sistema Integra Celline. Estos datos muestran que todas las dosis de todos los exosomas NSC probados proporcionan una curación mayor en comparación con las condiciones basales, con el % de curación que se acerca al control positivo (LSGS) después de 72 horas.

Los datos en la Figura 6C también muestran que los exosomas aislados de NSC cultivados durante 6 semanas causan una curación más rápida (que los exosomas de 2 semanas), con el % de curación acercándose al 100% después de solo 48 horas, para todas las dosis.

La Figura 6D muestra los resultados de un ensayo de inyección de heridas in vivo en un ratón, lo que confirma que las células CTX0E03 estimularon la cicatrización de heridas hasta un grado estadísticamente significativo in vivo. Este es un bioensayo in vivo simple que se puede usar para confirmar la eficacia de las micropartículas in vivo.

Conclusión. Los exosomas liberados de la línea de células madre neurales CTX0E03 mejoran la migración de los fibroblastos en un modelo in vitro de curación de heridas, lo que sugiere que los exosomas pueden contribuir a los mecanismos por los cuales las hNSC promueven la reparación. Los exosomas aislados de células cultivadas durante 6 semanas muestran una mejor eficacia de curación de heridas in vitro, en comparación con los exosomas aislados de células cultivadas durante 2 semanas.

(B) Estimulación de la angiogénesis

Se llevó a cabo un ensayo de 24 horas para detectar la angiogénesis en HUVEC primarias utilizando un portaobjetos Ibidi |j y un análisis y detección de Wimtube automatizados (de longitud de tubo y puntos de bifurcación). Las microvesículas recogidas de los matraces Integra a las 1, 2, 3, 4 y 6 semanas se agregaron a las HUVEC y la angiogénesis en comparación con las HUVEC basales (sin adición). Se utilizó LSGS (suplemento de bajo crecimiento de suero) como control positivo. Los resultados, representados en la Figura 12, muestran que las microvesículas de células madre neurales aumentan la angiogénesis. Además, estos datos muestran que las microvesículas recogidas después de al menos 3 semanas de cultivo proporcionan un mayor aumento de la angiogénesis (es decir, después de 3 semanas, 4 semanas y 6 semanas de cultivo en un biorreactor de células Integra), que proporcionan las microvesículas cultivadas durante 1 o 2 semanas. Las microvesículas cultivadas durante al menos 3 semanas estimularon la angiogénesis a un nivel estadísticamente significativo, y un nivel que se aproxima al del control positivo. El mayor incremento en la angiogénesis se muestra en las microvesículas recolectadas después de 4 semanas; estas microvesículas estimularon la angiogénesis en la misma cantidad que el control positivo.

Estos datos indican que las microvesículas de hNSC estimulan la angiogénesis.

(C) Estimulación del crecimiento de neuritas

El crecimiento de neuritas se determinó utilizando células PC-12 a través de un inserto de 1 jm . Después de 72 horas, los cuerpos celulares de PC-12 se retiraron y las neuritas se tiñeron en la parte inferior del inserto. Luego se extrajo la tinción y se cuantificó en un espectrofotómetro. Las microvesículas recogidas de los matraces Integra a las 2 semanas se agregaron a las células a 0.03 jg , 0.3 jg y 3 jg , cada una con 100 ng/ml de NGF (factor de crecimiento nervioso). El crecimiento de neuritas se comparó con las células basales (sin adición). Se usaron 100 ng/ml de NGF como control. Como se muestra en la Figura 13, la adición de 3 jg de microvesículas de hNSC causó un aumento notable en el crecimiento de las neuritas, en comparación con la adición de NGF solo.

Estos datos indican que las microvesículas de hNSC estimulan el crecimiento de las neuritas.

Ejemplo 9: Producción de exosomas utilizando el sistema Integra CELLine.

Se cultivaron células CTX0E03 usando el sistema Integra CELLine y se purificaron los exosomas como se describe en el Ejemplo 7. La concentración de exosomas se purificó del medio usando el sistema CELLine en el punto de tiempo de 3 semanas, y como control un sistema estándar T175 como rutinariamente utilizado en la técnica, y se cuantificó (utilizando un ensayo de BCA para estimar el contenido de proteínas). La figura 7 muestra que la producción de exosomas utilizando el sistema Integra CELLine aumenta varias veces, en comparación con el uso de cultivos convencionales (matraces T175).

Usando el sistema Integra CELLine, las células CTX0E03 se cultivaron durante un período de 3 semanas y el medio se recolectó en la semana 1, 2 y 3 para la purificación y cuantificación de los exosomas, como se describe en el Ejemplo 7. La Figura 8A muestra que la producción de micropartículas aumenta exponencialmente durante el período de cultivo de 3 semanas, lo que permite la producción eficiente y en gran escala de micropartículas. La concentración de exosomas recolectados de un único matraz Integra CELLine se controló luego durante 1-6 semanas de cultivo continuo de CTX0E03, con los resultados que se muestran a continuación y se muestran en la Figura 8B:

Estos resultados muestran que la producción de exosomas se mejora sorprendentemente cuando las células madre se cultivan en un biorreactor de múltiples compartimentos durante semanas, generalmente al menos tres semanas.

Ejemplo 10: Caracterización del fenotipo de células obtenidas del sistema de cultivo Integra CELLINE y el estándar (T175).

Las células CTX0E03 se cultivaron utilizando el biorreactor Integra CELLine y el cultivo estándar, como se describe en el Ejemplo 7. La expresión de los marcadores de proteínas DCX y GFAP se confirmó utilizando anticuerpos específicos del marcador y microscopía de fluorescencia.

La expresión de los marcadores DCX, GALC, GFAP, TUBB3, GDNF e IDO se detectó mediante qRT-PCR en muestras obtenidas de las células. La expresión del marcador se comparó entre las micropartículas obtenidas a partir del cultivo estándar (T175) y los exosomas obtenidos del sistema Integra CELLine cultivado durante 3 semanas, evaluado contra una línea de base del nivel de expresión en células CTX0E03 en un cultivo estándar (T175).

Los inventores observaron una notable diferencia en la expresión del marcador de células obtenidas del sistema Integra CELLine en comparación con las células de control obtenidas del estándar. Los marcadores de células parcialmente diferenciadas aumentaron varias veces en las células cultivadas en el sistema Integra CELLine, en comparación con las células de control obtenidas de cultivos estándar (Figura 9). Los cambios particularmente notables son la expresión aumentada de los marcadores DCX1 (doblecortina - un marcador para la entrada en el linaje neural), GFAP (proteína ácida fibrilarmente glial - un marcador para la entrada en el linaje astrocítico), GDNF (factor neurotrófico derivado de células gliales) e IDO (indoleamina 2,3-dioxigenasa). Esto indica que en las células madre neurales cultivadas en un biorreactor de dos compartimentos se diferencian parcialmente en células de linaje neural (DCX+) o astrocítico (GFAP+). La expresión de DCX y GFAP en las células cultivadas con Integra se confirmó mediante microscopía de fluorescencia, lo que demuestra que las células CTX0E03 cultivadas utilizando el biorreactor CELELL de Integra tienen un fenotipo neuronal más diferenciado que las células estándar CTX0E03.

Ejemplo 11: Caracterización de los perfiles de expresión de ARNmi de exosomas obtenidos a partir de cultivos Integra CELLine y micropartículas obtenidas de cultivos estándar (T175).

Las células CTX0E03 se cultivaron durante tres semanas utilizando el cultivo Integra CELLine y en el cultivo estándar en matraces T-175 de un solo compartimiento. Los exosomas se purificaron a partir del cultivo de Integra y las micropartículas se purificaron del cultivo de T-175 estándar como se describe en el Ejemplo 7. Se determinaron los niveles de expresión relativos de varios ARNmi expresados en los exosomas y micropartículas obtenidos del cultivo estándar o del sistema Integra CELLine con una matriz de ARNmi que usa el panel qRT-PCR (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se convierte en niveles de sobre y subregulación en comparación con un grupo de control de línea celular CTX0E03 estándar (consúltese la Tabla 3 y la Figura 10). Estos datos muestran un perfil de expresión de ARNmi diferencial entre los exosomas obtenidos del sistema de cultivo Integra CELLine durante 3 semanas, las micropartículas y las células obtenidas del cultivo estándar de un solo matraz.

Tabla 3: Regulación de multiplicidad de ARNmi en micropartículas obtenidas de cultivo estándar o exosomas del sistema Integra CELLine, en relación con el control (células CTX0E03).

Los valores se calcularon a partir de datos sin procesar utilizando las siguientes ecuaciones:

ACT (muestra/control) = Promedio CT (GOI) - Promedio CT (HKG)

Expresión multiplicidad (muestra/control) = 2-(Promedi° ACT)

Expresión m u ltip lic idad (m u e s tra )

Cambio multiplicidad =

Expresión m u ltip lic idad (contro l)

Si (cambio multiplicidad) > 1 entonces (regulación multiplicidad) = (cambio multiplicidad)

, i .

Si (cambio multiplicidad) < 1 entonces (regulación multiplicidad) = —(------—------- -p —j-^-)

En donde:

CT = umbral de ciclo

GOI = gen de interés (ARNmi investigado)

HKG = genes de mantenimiento (ARNmi de referencia utilizados para normalizar los datos)

Ejemplo 12: Análisis de ARNmi total

Las células pueden transportar ARN a micropartículas determinadas para su liberación en el espacio extracelular. Esto permite la transmisión de mensajes codificados genéticamente entre células. Aquí se hace referencia colectivamente al ARN extracelular como 'ARN lanzadera'. El objetivo fue analizar de forma exhaustiva las especies de ARN no codificadores liberadas por las células madre neurales CTX0E03 (NSC) utilizando la secuenciación de próxima generación.

Los ARN no codificadores se dividen en dos categorías (pequeñas y largas). Los biotipos de ARN no codificadores pequeños incluyen ARN ribosómico (ARNr), nucleolar pequeño (ARNsno), ARN nuclear pequeño (ARNsn), microARN (ARNmi), otros varios ARN (ARN misceláneo, por ejemplo, RMRP, ARN de bóveda, metazoa SRP y RNY), y los biotipos de ARN no codificadores largos incluyen ARN no codificadores largos (IncRNA) y ARN intergénicos no codificadores grandes (ARNlincs).

Aquí, se caracterizaron los ARN lanzadera, incluidos los ARN no codificadores pequeños y largos, liberados a partir de exosomas y microvesículas (MV) derivados de NSC y comparados con los contenidos de ARN de las NSC productoras.

A) Contenido total de ARN en células, exosomas y microvesículas identificado por el bioanalizador de ARN de Agilent El ARN tanto en exosomas como en microvesículas consiste principalmente en pequeñas especies de ARN como se muestra en la Fig. 14. La mayoría de los nucleótidos (nt) fue <200 como se muestra contra la escala molecular. B) composición de ARN

Se generaron pequeñas bibliotecas de secuenciación de ARN para investigar la composición de ARN lanzadera y celular mediante secuenciación profunda (secuenciación de próxima generación). Los resultados se muestran en la Figura 15.

C) Secuenciación profunda de la expresión de ARNmi de células CTX0E03, microvesículas y exosomas de cultivos estándar (T175).

La secuenciación profunda se basa en la preparación de una biblioteca de cADN mediante secuenciación y proporciona información con respecto a la secuencia total leída de diferentes ARNmi en las microvesículas y exosomas. Estos datos de secuencia profunda complementan los datos de la matriz qRT-PCR que se muestran arriba y proporcionan un análisis completo del perfil de ARNmi de las células y micropartículas. A diferencia del análisis de la matriz qRT-PCR, la secuenciación profunda no se limita a la identificación de las secuencias presentes en la matriz de la sonda y, por lo tanto, las secuencias por identificar no necesitan ser conocidas de antemano. La secuenciación profunda también proporciona lectura directa y la capacidad de secuenciar secuencias muy cortas. Sin embargo, la secuenciación profunda no es adecuada para la detección de transcripciones con baja expresión.

Método

La presencia de una variedad de ARNmi en las células parentales y sus exosomas (30-100 pm) y microvesículas (100 1000 pm), se purificó por centrifugación diferencial, se identificó mediante una secuenciación profunda, luego de la construcción de 1 biblioteca de ARNmi etiquetada para cada muestra.

Además, se diseñaron cebadores específicos para ARNmi altamente transportados (por ejemplo, hsa-miR-1246) y se utilizaron en la PCR de transcripción reversa en tiempo real (qRT-PCR) para rastrear los exosomas/microvesículas después de la implantación in vivo.

La secuenciación profunda fue realizada por GATC Biotech (Alemania) y requirió la preparación de una biblioteca de ARNmi etiquetada para cada muestra seguida de secuenciación, y exploración con miRBase:

• Construcción de bibliotecas ARNmi etiquetadas (22 a 30 nt)

°Se generaron bibliotecas de secuenciación mediante la ligación de un adaptador de ARN específico en ambos extremos 3' y 5' para cada muestra, seguida de transcripción reversa, amplificación y purificación de bibliotecas de ARN pequeño (rango de tamaño de la fracción de ARN pequeña contenida 22-30 nt).

• Secuenciación en un Illumina HiSeq 2000 (lectura única)

° La secuenciación se realizó utilizando Illumina HiSeq 2000 (lectura única). El análisis de un grupo podría incluir hasta 45 000000 en lectura única, y cada longitud de lectura es de hasta 50 bases. La secuenciación se controló mediante el uso de archivos FastQ (secuencias y puntuaciones de calidad).

• La identificación de los ARNmi conocidos se realizó de la siguiente manera:

° Los adaptadores de ARN se recortaron de las secuencias resultantes y se limpiaron los datos sin procesar. Los datos sin procesar se agruparon y para cada grupo se proporcionaron varias lecturas. Los ARNmi se identificaron mediante exploración miRBase (Ssearch).

Resultados

Muchas microvesículas y exosomas de ARNmi se enriquecieron en relación con las células, lo que indica que las células clasifican especialmente los ARNmi para la liberación extracelular. Además, los contenidos de ARNmi fueron similares tanto en exosomas como en microvesículas, lo que indica un aparato común de captación selectiva de ARNmi en microvesículas excretadas. Sin desear estar limitado por la teoría, esto puede indicar que el contenido de ARNmi en las microvesículas y exosomas secretados se puede usar como una huella dactilar para identificar los subtipos de hNSC.

El análisis de secuenciación profunda, por lo tanto, identificó un conjunto único de ARNmi tanto en exosomas de hNSC como en microvesículas no informados previamente. El contenido de ARNmi en las vesículas excretadas es similar, pero mostró una captación de ARNmi preferencial en comparación con hNSC. Estos hallazgos podrían respaldar los efectos biológicos mediados por el ARNmi lanzadera no descrito previamente para hNSC.

Los resultados se detallan en las Tablas 4 a 9, a continuación. Los datos también se representan en la Figura 11, que muestra claramente los perfiles de ARNmi significativamente diferentes presentes en las microvesículas y exosomas, en comparación con las células. En resumen, estos datos muestran un aumento masivo en la cantidad (recuentos de lectura) de hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532 en microvesículas y exosomas en comparación con las células. También se observan grandes aumentos en hsa-miR-4508, hsa-miR-4516, has-miR-3676-5p y hsa-miR-4485. Se observan disminuciones masivas en las cantidades (recuentos de lectura) de ciertos ARNmi, incluyendo hsa-let-7a-5p, has-miR-92b-3p, has-miR-21-5p. hsa-miR-92a-3p, hsa-miR-10a-5p, hsa-100-5p y hsa-99b-5p.

La presencia de cada uno de hsa-miR-1246, hsa-miR-4488, hsa-miR-4492, hsa-miR-4508, hsa-miR-4516 y hsa-miR-4532 en los exosomas fue validada por qRT -PCR (datos no mostrados).

Al representar gráficamente los resultados de la secuenciación profunda en los exosomas y las microvesículas como un cambio relativo en comparación con las células, se confirma que hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532 están significativamente sobrerreguladas significativamente en los exosomas y microvesículas en comparación con las células. Esta comparación también muestra que el ARNmi hsa-miR-3195 es el ARNmi que está más sobrerregulado, tanto en exosomas como en microvesículas. Aunque las lecturas absolutas de hsa-miR-3195 están en el rango de -40 para exosomas y microvesículas, no hay hsa-miR-3195 presente en las células.

Como se señaló en el Ejemplo 11 anterior, los contenidos de ARNmi en exosomas, micropartículas y células parentales también se analizaron y validaron usando análisis de matriz de PCR. Los siguientes ARNmi se encontraron presentes por qRT-PCR: hsa-let-7g-5p, hsa-miR-101-3p, hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-128, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-134, hsa-miR-137, hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-181a-5p,hsa-miR-182-5p, hsa-miR-185-5p, hsa-miR-18b-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-194-5p, hsa-miR-195-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-20b-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-218-5p,hsa-miR-219-5p,hsa-miR-222-3p, hsa-miR-22-3p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-24-3p,hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-301a-3p, hsa-miR-302a-3p,hsa-miR-302c-3p,hsa-miR-345-5p, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-7-5p, hsa-miR-92a-3p, hsa-miR-93-5p,hsamiR-9-5p,hsa-miR-96-5p, and hsa-miR-99a-5p.

Tabla 4: Células EH

Tabla 5: Células EI

Tabla 6: Microvesículas EI

Tabla 7: Exosomas EI

Tabla 8: Microvesículas EH

Tabla 9: Exosomas EH

D) Identificación de los ARN codificadores y no codificadores de clasificación superior mediante el análisis GENCODE realizado en exosomas, MV y células productoras

Tabla 10: Número total de lecturas de secuencia identificadas mediante el uso de GENCODE en cada muestra analizada

Usando el análisis de la base de datos GENCODE de los resultados de la secuencia, se identificaron siete secuencias de ARNmi novedosas putativas en exosomas (EXO), microvesículas (MV) y células productoras, como se muestra en la Tabla 11. (nb CTX0E0307EI Las lecturas de MV están mal representadas debido a la menor cantidad de material de partida - ver Tabla 10). Estos datos se muestran gráficamente en la Figura 16, que muestra que estas secuencias se transportan preferentemente en exosomas y microvesículas en comparación con las células.

Tabla 11. Identificación de secuencias de ARNmi novedosas putativas usando GENCODE en exosomas (EXO), microvesículas (MV) y células productoras. Las lecturas CTX0E0307EI MV están representadas erróneamente debido a la cantidad más baja de material de partida (tabla 1). Las ID de transcriptos son tomadas de la base de datos Ensembl (www.ensembl.org).

Validación ARNmi novedosos

AC079949.1-201 (SEQ ID NO:738)

Gen: AC079949.1 ENSG00000239776 >12 adn:cromosoma cromosoma:GRCh37:12:127650616:127650672:1 GGCCGCGCCCCGTTTCCCAGGACAAAGGGCACTCCGCACCGGCCCCTGGTCCCAGCG

Para AC079949.1-201 ARNmi maduro putativo, gaccaggguccggugcggagug (SEQ ID NO: 745) se identificó como el posible ARNmi de tallo 5' usando http://ARNmi.imbb.forth.gr/MatureBayes.html, una herramienta para encontrar ARNmi maduro dentro de una secuencia precursora de ARNmi usando un clasificador Naive Bays. Su validación de presencia se realizó utilizando la secuencia del cebador AGGGTCCGGTGCGGAGT (SEQ ID NO: 746). Esta secuencia se ingresó en mirbase (http://www.mirbase.org/) y se encontró el siguiente ARNmi con una secuencia similar: Bos taurus miR-2887-1 (No. de acceso MIMAT0013845).

bta-miR-2887:9-20 (SEQ ID NO:747)

AC 07 994 9 (5) 2 ggguccggugcg 13

I I I I I I I I I I I I

bta-miR-2 887 9 ggguccggugcg 20

La presencia de este nuevo ARNmi se probó mediante qRT-PCR en ARNmi retro transcrito de exosomas purificados. El mismo análisis se realizó utilizando el tallo 3' de AC079949, secuencia TGCGGAGTGCCCTTTGTCCT (SEQ ID NO: 748), pero en este caso no se identificó un ARNmi similar en mirbase.

AP000318.1-201 (SEQ ID NO:739)

Gen: AP000318.1 ENSG00000266007 >21 adn:cromosoma cromosoma:GRCh37:21:35677430:35677493:1 CCCACTCCCTGGCGCCGCTTGTGGAGGGCCCAAGTCCTTCTGATTGAGGCCCAACCCGTGGAAG

Para el ARNmi maduro putativo AP000318.1-201, se identificó ggagggcccaaguccuucugau (SEQ ID NO: 744) como el posible ARNmi del tallo 5'. Su validación de presencia se realizó utilizando la secuencia del cebador GGAGGGCCCAAGTCCTTCTGAT (SEQ ID NO: 749). Caenorhabditis remanei miR-55 tallo-bucle fue identificado como ARNmi similar.

La validación del cebador se llevó a cabo de nuevo mediante qRT-PCR. crm-miR-55-5p:4-17 (SEQ ID NO:750) AP000318.1 20 cccaaguccuucug 7

I I I II I I lililí

crm-miR-55-5p 4 cccaagugcuucug 17

AL161626.1-201 (SEQ ID NO:740)

Gen: AL161626.1 ENSG00000241781 >9 adn:cromosoma cromosoma:GRCh37:9:79186731:79186787:1 CGCCGGGACCGGGGTCCGGGGCGGAGTGCCCTTCCTCCTGGGAAACGGGGTGCGGC

Para el ARNmi maduro putativo AL161626.1-201, se identificó ggcggagugcccuucuuccugg (SEQ ID NO: 743) como el posible ARNmi maduro del tallo 5'. Su validación de presencia se realizó utilizando la secuencia del cebador CGGAGTGCCCTTCTTCCT (SEQ ID NO: 751). Zea mays miR164c tallo-bucle y Achypodium distachyon miR164f tallo-bucle fueron identificados como ARNmi similares. La validación del cebador se llevó a cabo de nuevo mediante qRT-PCR.

zma-miR164c-3p:4-15 (SEQ ID NO:752)

AL161626.1 5 gugcccuucuuc 16

I I I I I I II I II I

zma-miRl64c-3p 4 gugcccuucuuc 15

AC004943.1 (SEQ ID NO:741)

Gen: AC004943.1 ENSG00000265573 >16 adn:cromosoma cromosoma:GRCh37:16:72821592:72821672:-1

GCTTCACGTCCCCACCGGCGGCGGCGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGCGGCGGCGGTGGCGG CGGCGGCGGCGGCGGCGGCTC

AL121897.1 (SEQ ID NO:742)

Gen: AL121897.1 ENSG00000264308 >20 adn:cromosoma cromosoma:GRCh37:20:30865503:30865591:1

GCCGCCCCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCCGCTTTCGGCTCGGG CCTCAGGTGAGTCGGAGGGGCCGGGCGCC ^ARN

misceláneo (misc_RNA), incluido el novedoso putativo

Misc_RNA es la abreviatura de RNA misceláneo, un término general para una serie de ARN pequeños misceláneos. La característica de transcripción miscelánea no está definida por otras claves de ARN.

Lista de los mejores ARN misceláneos previamente conocidos y novedosos identificados utilizando el conjunto de datos de secuencia GENCODE:

Tabla 12: Identificación de ARN misc, incluyendo ARNmisc novedoso putativo, secuencias utilizando GENCODE en exosomas (EXO), microvesículas (MV) y células productoras. (Lecturas de CTX0E03 07EI MV están mal representadas debido a la menor cantidad de material de partida - Tabla 10). Los ID transcritos son tomados de la base de datos Ensembl (www.ensembl.org).

Entre los misc_RNA, las siguientes secuencias se encontraron preferencialmente lanzadas hacia abajo o hacia arriba en exosomas y MV: RPHI, RMRP y VTRNA1-1 aumentaron y Y_RNA.725-201, y Y_RNA.125-201 respectivamente. RPHI es un componente de ARN de ribonucleasa P H1. El gen RMRP codifica el componente de ARN de endoribonucleasa de procesamiento del ARN mitocondrial, que escinde el ARN mitocondrial en un sitio de cebado de la replicación del ADN mitocondrial. Este ARN también interactúa con la subunidad catalítica de la transcriptasa reversa de la telomerasa para formar un complejo de ribonucleoproteína distinto que tiene actividad de ARN polimerasa dependiente de ARN y produce ARN bicatenarios que pueden procesarse en ARN pequeño de interferencia. VTRNA1-1 es el componente 1 del ARN de bóveda. Las bóvedas son grandes ribonucleoproteínas citoplásmicas y están compuestas por una proteína principal de bóveda, MVP, 2 proteínas de bóveda menor, TEP1 y PARP4, y un componente de ARN no traducido, VTRNA1-1. Y_RNA.725-201, y Y_RNA.125-201 son ARN misceláneos nuevos y su función no está definida.

ARN misceláneo de metazoa

El ARN de partículas de reconocimiento de señal, también conocido como ARN 7SL, 6S, ffs o 4.5S, es el componente de ARN del complejo de ribonucleoproteínas de partículas de reconocimiento de señal (SRP). La SRP es una ribonucleoproteína universalmente conservada que dirige el tráfico de proteínas dentro de la célula y permite que se secreten. El ARN de SRP, junto con una o más proteínas de SRP, contribuye a la unión y liberación del péptido señal. Los componentes de ARN y proteínas de este complejo están altamente conservados, pero varían entre los diferentes reinos de la vida.

Lista de los mejores ARN misceláneos de Metazoa identificados con el conjunto de datos de secuencia GENCODE:

Tabla 13: Identificación de señal de reconocimiento de partícula de secuencias de ARN (ARN misc) utilizando GENCODE en exosomas (EXO), microvesículas (MV) y células productoras. Los ID transcritos son tomados de la base de datos Ensembl (www.ensembl.org).

ARNr (ARN ribosómico)

El ARN ribosómico (ARNr) forma parte del orgánulo sintetizador de proteínas conocido como ribosoma y se exporta al citoplasma para ayudar a traducir la información en ARN mensajero (ARNm) en proteína. Los componentes del ARNr ribosoma eucariótico (80S) son: unidad grande (ARNr 5S, 5.8S y 28S) unidad pequeña (ARNr 18S). Tanto el ARNr 28S como el 5.8S se incorporan selectivamente en exosomas y Mv .

Lista de ARNr de clasificación superior identificada utilizando el conjunto de datos de secuencia GENCODE:

Tabla 14: Identificación de secuencias de ARNr utilizando GENCODE en exosomas (EXO), microvesículas (MV) y células productoras. Los ID transcritos son tomados de la base de datos Ensembl (www.ensembl.org).

ARN nucleolar pequeño:ARNsno

Los ARN nucleares pequeños (ARNsno) son una clase de moléculas pequeñas de ARN que guían principalmente modificaciones químicas de otros ARN, principalmente ARN ribosómicos, ARN de transferencia y ARN pequeños nucleares. Hay dos clases principales de ARNsno, los ARNsno caja C/D que están asociados con la mutilación, y los ARNsno caja H/ACA que están asociados con la pseudouridilación.

Lista de ARNsno de clasificación superior identificada utilizando el conjunto de datos de secuencia GENCODE:

Tabla 15: Identificación de secuencias de ARNsno utilizando GENCODE en exosomas (EXO), microvesículas (MV) y células productoras. Los ID transcritos son tomados de la base de datos Ensembl (www.ensembl.org).

ARN nuclear pequeño (ARNsn)

El ácido ribonucleico nuclear pequeño (ARNsn), también conocido comúnmente como U-RNA, es una clase de moléculas de ARN pequeñas que forman el espliceosoma principal que se denominan U1, U2, U4, U5 y U6, y participan en varias interacciones ARN-ARN y ARN-proteína. Su función principal es el procesamiento de pre-ARNm (ARNhn) en el núcleo. También se ha demostrado que ayudan en la regulación de los factores de transcripción (ARN 7SK) o ARN polimerasa II (ARN B2), y en el mantenimiento de los telómeros.

Lista de ARNsn de clasificación superior identificada utilizando el conjunto de datos de secuencia GENCODE:

Tabla 16A: Identificación de secuencias de ARNpn utilizando GENCODE en exosomas (EXO), microvesículas (MV) y células productoras. Los ID transcritos son tomados de la base de datos Ensembl (www.ensembl.org).

ARNlinc y ARNlinc novedoso

Los ARN grandes no codificadores intergénicos (ARNlincs) están surgiendo como reguladores clave de diversos procesos celulares. Determinar la función de los ARNlinc individuales sigue siendo un desafío. Los ARN largos no codificadores (ARNnc largos, IncRNA) son transcriptos no codificadores de proteínas de más de 200 nucleótidos. Lista de los mejores ARNlinc previamente conocidos y nuevos identificados utilizando el conjunto de datos de secuencia GENCODE:

Tabla 16B: Identificación de secuencias de ARNIinc utilizando GENCODE en exosomas (EXO), microvesículas (MV) y células productoras. Los ID transcritos son tomados de la base de datos Ensembl (www.ensembl.org).

El ARNlinc de GAS5 se expresa en gran medida en el productor celular en comparación con los exosomas y microvesículas (reducidos en ambos exosomas y MV).

ARNm

También se identificó el ARNm de secuenciación codificador.

Tabla 17: Identificación de secuencias de ARNm utilizando GENCODE en exosomas (EXO), microvesículas (MV) y células productoras. Los ID transcritos son tomados de la base de datos Ensembl (www.ensembl.org).

Ejemplo 12: Conclusión El principal alcance del análisis de secuencia profunda fue identificar sus componentes de ARNmi en vesículas derivadas de células madre neurales (exosomas y microvesículas). Este análisis identificó un nuevo conjunto de ARNmi conocidos y nuevos que se transportan preferentemente tanto en exosomas como en MV. Entre los ARNmi identificados ya incluidos en la base de datos mirbase se encuentran hsa-miR-1246, hsa-miR-4488, hsa-miR-4492, hsa-miR-4508, hsa-miR-4516, hsa-miR-4532, y entre los novedosos los ARNmi fueron AC079949.1, AP000318.1, AL161626.1, AC004943.1, AL121897.1. Los ARNmi dirigidos de alto rango, incluidos los nuevos, fueron validados por qRT-PCR en exosomas.

La distribución de tamaño del ARN lanzadera, como se muestra aquí, se encuentra principalmente en el rango de 20 a 200 nt y las células liberan otras especies de ARN en el espacio extracelular. Mediante la secuenciación profunda y el análisis de conjuntos de secuencias GENCODE, se encuentra una mayor complejidad y diversidad de las transcripciones de ARN no codificadores. Se extendió este análisis con una evaluación detallada y esto condujo al descubrimiento de lanzadera preferencialmente hacia arriba (definida como log2 cambio de multiplicidad > 2) y hacia abajo (definida como log2 cambio de multiplicidad <-2) de otros ARN no codificadores en ambos exosomas y microvesículas. Se encontraron ARN no codificadores diferentemente desplazados en casi todos los subtipos de ARN no codificadores, ARN ribosómico (ARNr), nucleolar pequeño (ARNsno), ARN nuclear pequeño (ARNsn), microRNA (ARNmi), otros ARN varios (ARNm_ARN, por ejemplo, Rm Rp , ARN de bóveda, metazoa s Rp y r Ny ), y ARN intergénicos no codificadores grandes (ARNlincs).

La distribución desigual de las especies de ARN detectadas sobre el ARN celular y lanzadera, combinada con la evidencia creciente de su papel en la regulación de genes, sugiere fuertemente que las células liberan específicamente estos ARN para modificar la función de las células diana.

Ejemplo 13: Análisis proteómico

Métodos

Los exosomas y las fracciones de microvesículas se prepararon a partir de un cultivo de células CTX0E03 Integra (semana 2), mediante ultracentrifugación diferencial. Los exosomas y las microvesículas se rompieron en el regulador RIPA modificado (Tris HCl 50 mM, pH 8.0, NaCl 150 mM, SDS al 1%, Triton X100 al 0.1%, DTT 10 mM, 1x inhibidor de proteasa completa (Roche) e 1x inhibidor de fosfatasa PhosStop (Roche) y se sometieron a cizallamiento manual con una jeringa de tuberculina de 1 ml y una aguja de calibre 25. Las muestras se volvieron a cuantificar después de la interrupción utilizando el fluorómetro Qubit (Invitrogen). Se cargaron 20 pg de cada muestra en un gel de SDS-PAGE al 4-12% (Novex, Invitrogen). El gel se escindió en cuarenta segmentos por carril y las secciones de gel se procesaron utilizando un robot (ProGest, DigiLab) con el siguiente protocolo:

a) lavar con bicarbonato de amonio 25 mM seguido de acetonitrilo;

b) reducir con ditiotreitol 10 mM a 60°C seguido de alquilación con yodoacetamida 50 mM a temperatura ambiente;

c) digerir con tripsina (Promega) a 37°C durante 4 h;

d) detener con ácido fórmico;

e) el sobrenadante se analizó por espectrometría de masas directamente sin procesamiento adicional.

Espectrometría de masas

Cada digestión de gel se analizó mediante nano LC/MS/MS con un sistema de HPLC Waters NanoAcquity conectado a un ThermoFisher Q Exactive. Los péptidos se cargaron en una columna de captura y se eluyeron en una columna analítica de 75 pm a 350 nL/min; ambas columnas se empaquetaron con resina de Jupiter Proteo (Phenomenex). El espectrómetro de masas funcionó en modo dependiente de los datos, con MS y MS/MS realizado en el Orbitrap a una resolución de 70000 FWHM y 17.500 FWHM, respectivamente.

Exosomas

Se identificaron 2572 proteínas mediante espectrometría de masas en exosomas purificados por ultracentrifugación. Los exosomas se aislaron de las etapas iniciales de un cultivo Integra (semana 2). Los nombres de los genes y los correspondientes números de acceso SWISSPROT (entre paréntesis) de todas las proteínas 2572 se enumeran en la Tabla 18 (en orden alfabético del nombre del gen) y las 100 proteínas más abundantes se enumeran en la Tabla 19, en orden de disminución de la abundancia. Los marcadores de exosoma característicos CD9, CD81 y Alix (también conocidos como PDCD6IP) están presentes en las 100 proteínas más abundantes.

Tabla 18: Nombres de genes y números de acceso SWISSPROT de todas las proteínas 2572 identificadas en los exosomas CTX0E03 (enumerados en orden alfabético del nombre del gen).

Tabla 19: 100 proteínas más abundantes (nombre y número de acceso SwissProt) observadas en los exosomas CTX0E03

Microvesículas

Se identificaron 2940 proteínas mediante espectrometría de masas en microvesículas aisladas de las etapas iniciales de un cultivo Integra (semana 2) y se purificaron por centrifugación a 10 000 x g. Los nombres de los genes y los correspondientes números de acceso SWISSPROT (entre paréntesis) de todas las proteínas 2940 se enumeran en la Tabla 20 (en orden alfabético del nombre del gen) y las 100 proteínas más abundantes se enumeran en la Tabla 21, en orden de disminución de la abundancia.

Tabla 20: Nombres de genes y números de acceso SWISSPROT de todas las proteínas 2940 identificadas en las microvesículas CTX0E03 (enumeradas en orden alfabético del nombre del gen).

Tabla 21: 100 proteínas más abundantes (nombre y número de acceso SwissProt) en microvesículas CTX0E03

Discusión de los datos proteómicos

CD63 (también conocido como MLA1 y TSPAN30), TSG101 (también conocido como subunidad TSG101 del complejo ESCRT-I), CD109 (también conocido como proteína de unión TGF-beta-1 de 150 kDa) y thy-1 (también conocido como CD90) se detectaron tanto en exosomas como en microvesículas.

También se detectaron otras tetraspaninas: se detectó tetraspanina-4, -5, -6, -9 y 14 en la fracción de exosoma; se detectaron tetraspaninas-6 y -14 en las microvesículas.

Se detectó CD133 (también conocido como AC133, Prominina-1, PROM1, PROML1 y MSTP061) en los exosomas pero no en las microvesículas.

No se detectaron CD53 (también conocido como MOX44 y TSPAN25), CD82 (también conocido como KAI1, SAR2, ST6 y TSPAN27), CD37 (también conocido como TSPAN26) y ligando CD40 (también conocido como CD40LG, CD40L y TNFSF5) en los exosomas o en las microvesículas.

La nestina, GFAP y la cadena beta-3 de tubulina (también conocida como TUBB3) se detectaron tanto en las fracciones de exosoma como en las de microvesículas, siendo la cadena beta-3 de tubulina particularmente prominente dentro de las 100 proteínas principales en ambas fracciones. No se detectaron Sox2, DCX, GALC, ^gDⁿF e IDO.No se detectaron

selectinas y TNFRI (también conocido como receptor 1 de TNF, TNFRSF1A, TNFAR y TNFR1). No se detectaron La integrina alfa-2, -3, -4, -5, -6, -7, -V y la integrina beta-1, -4 y -8 se detectaron tanto en las fracciones de exosoma como en las de microvesícula. La integrina beta-3 y -5 se detectaron solo en las microvesículas.

Se detectaron antígenos MHC de clase I (por ejemplo, HLA_A1, HLA-A2 y HLA-B27) tanto en los exosomas como en las microvesículas.

Se detectaron moléculas de adhesión celular (por ejemplo, CADM1, CADM4, ICAM1, JAM3, L1CAM, NCAM) tanto en los exosomas como en las microvesículas.

Se detectaron proteínas citoesqueléticas (por ejemplo, actina, vimentina, queratinas, cateninas, distroglucano, polipéptido neurofilamento, proteína asociada a microtúbulos, tubulina, desmoplaquina, plectina, plakofilina, septina, espectrina, talina, vinculina y zyxina) en ambas fracciones, exosoma y microvesícula.

Se detectaron GTPasas, clatrina, chaperonas, proteínas de choque térmico (por ejemplo, Hsp90, Hsp70), factores de empalme, factores de traducción, anexinas y factores de crecimiento (por ejemplo, TGF-beta) tanto en el exosoma como en las microvesículas.

Se detectaron galectina-3, TIMP-1, trombospondente-1, receptor de EGF y CSK tanto en los exosomas como en las microvesículas.

La Figura 18 compara los datos proteómicos de los exosomas y microvesículas. La Figura 18A ilustra el número de proteínas únicas dentro de cada población de micropartículas, aisladas del sistema de cultivo Integra de la semana 2. La Figura 18B compara los procesos biológicos asociados con las proteínas identificadas dentro de cada población de micropartículas, aisladas del sistema Integra de la semana 2. Las proteínas identificadas dentro de los exosomas y microvesículas están asociadas con procesos biológicos muy similares.

Las proteínas asociadas con el metabolismo de la biotina solo se encontraron en exosomas y las proteínas involucradas en la biosíntesis de triptófano y el metabolismo del ácido taurina/alfa-linolénico solo se identificaron en las microvesículas.

La Figura 18C compara el proteoma CTX0E03 con el proteoma de exosoma de células madre mesenquimales descrito en Lai et al 2012, en el que se identificaron un total de 857 proteínas en exosomas liberados de células madre mesenquimales.

La Figura 18D compara los procesos biológicos asociados con las proteínas identificadas dentro de los exosomas derivados de MSC (Lim 2012) con los exosomas derivados de células madre neurales de la invención. Los tres procesos biológicos que se encuentran asociados solo con los exosomas derivados de MSC son (en orden decreciente de importancia): asma; biosíntesis de fenilalanina, tirosina y triptófano; e inmunodeficiencia primaria. Los treinta procesos biológicos que se encuentran asociados solo con los exosomas derivados de células madre neurales se muestran en la Figura 19; la función biológica más significativa identificada se relaciona con la ARN polimerasa.

Una comparación adicional de los 197 procesos biológicos compartidos tanto por exosomas derivados de MSC como por exosomas derivados de NSC muestra que los exosomas de NSC contienen notablemente más procesos involucrados en la degradación del ARN, el ribosoma y los espliceosomas, en comparación con los exosomas de MSC.

La comparación anterior indica una cantidad de diferencias significativas entre los exosomas derivados de NSC y los exosomas derivados de MSC (como se caracteriza por Lim et al 2012). Las 4 diferencias biológicas más significativas identificadas como presentes en los exosomas NSC en comparación con muy bajas/ausentes en las identificadas por el grupo de Lim, todas involucran proteínas asociadas con la producción, empaquetamiento, función y degradación del material genético, es decir, ARN polimerasa, degradación del ARN, ribosomas y empalmosomas.

Ejemplo 14: Distribución de tamaño de micropartículas

Se ejecutó el análisis de NanoSight para determinar el tamaño de partícula y la concentración de microvesículas ("mv1" a "mv6") y exosomas ("exo1" a "exo6") aislados de células CTX0E03 cultivadas en el sistema Integra Celline para 1, 2, 3, 4, 5 y 6 semanas. Todos los resultados se basan en 5 mediciones repetidas.

La distribución del tamaño de partícula se midió usando un análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). NTA detecta el movimiento de partículas en solución y lo relaciona con el tamaño de partícula. Se calculó el modo y el tamaño de partícula mediano para todas las muestras. Las muestras de exosomas se analizaron utilizando la configuración de cámara más sensible para capturar las vesículas más pequeñas. Las muestras de microvesículas se analizaron utilizando ajustes de cámara menos sensibles para evitar la sobreexposición de las vesículas más grandes. Como resultado, algunas vesículas más pequeñas no se detectaron en las muestras. Aunque las vesículas más pequeñas estaban presentes en las muestras de VM, éstas representan un pequeño porcentaje de la muestra en términos de masa.

Una proporción de Exo1 se marcó con un colorante fluorescente específico de la membrana (CellMask™) y una combinación de análisis NTA con el etiquetado CellMask™ confirmó que los eventos detectados por NTA corresponden a vesículas de membrana (datos no mostrados).Los resultados se muestran en la Tabla 22 más adelante, y en la Figura 17.

Los exosomas muestran una disminución de tamaño en la semana seis, desde un modo de aproximadamente 110 nm hasta aproximadamente 70 nm, o desde una mediana de aproximadamente 130 nm hasta aproximadamente 75 nm. El rango de tamaño total, de 70 nm a 150 nm, es consistente con el tamaño de los exosomas de otros tipos de células, descritos en la técnica. La reducción observada en el tamaño de los exosomas a alrededor de 70 nm de diámetro después de cultivar las células durante 6 semanas se correlaciona con la mayor eficacia de los exosomas aislados de células CTX0E03 que se han cultivado en un biorreactor de múltiples compartimentos durante 6 semanas, como se indica en el Ejemplo 8 y la figura 6.

También se observa que la concentración de microvesículas y exosomas disminuye a lo largo del período de seis semanas de la Figura 17, lo que refleja ampliamente la eficacia mejorada observada a lo largo del tiempo.

Las microvesículas son, como se esperaba, más grandes, con un diámetro de modo de aproximadamente 150 nm a 200 nm, o un diámetro medio de aproximadamente 180 nm a 350 nm.

Tabla 22: Distribución de tamaños de microvesículas y exosomas CTX0E03. O

REFERENCIAS

Ambros et al RNA 2003. 9: 277-279

Banerjee, S., Williamson, D., Habib, N., Gordon, M., Chataway, J. (2011) Age and Ageing 40:7-13

Chung et al.,Cell Stem Cell, 2, 113-117, 2008

Ding, D. C., Shyu, W. C., Lin S. Z. (2011) Cell Transplant 20: 5-14

Einstein, O., Ben-Hur, T. (2008) Arch Neurol 65:452-456

Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472

Hassani Z, O'Reilly J, Pearse Y, Stroemer P, Tang E, Sinden J, Price J, Thuret S. "Human neural progenitor cell engraftment increases neurogenesis and microglial recruitment in the brain of rats with stroke." PLoS One.

2012;7(11):e50444. doi: 10.1371/journal.pone.0050444. Epub 2012 Nov 21.

Hodges et al. Cell Transplant. 2007;16(2):101-15

Horie, N., Pereira, N.P., Niizuma, K. Sun, G. et al. (2011) Stem Cells 29:274-285.

Katsuda, Kosaka, Takeshita, Ochiya. Proteomics 2013, 00, 1-17

Katsuda, Tsuchiya, Kosaka, Yoshioka, Takagaki, Oki, Takeshita, Sakai, Kuroda, Ochiya. Scientific Reports 2013, 3:1197, p1-11.

Klimanskaya et al., 2006, Nature 444:481-485

Kornblum, Stroke 2007, 38:810-816

Lai et al "Proteolytic Potential of the MSC Exosome Proteome: Implications for an Exosome-Mediated Delivery of Therapeutic Proteasome". International Journal of Proteomics (2012) Article ID 971907, 14 pages.

Littlewood, T. D., Hancock, D. C., Danielian, P. S. et al. (1995) Nucleic Acid Research 23:1686-1690.

Miljan, E.A. & Sinden, J.D. (2009) Current Opinion in Molecular Therapeutics 4:394-403

Miljan EA, Hines SJ, Pande P, Corteling RL, Hicks C, Zbarsky V, Umachandran, M, Sowinski P, Richardson S, Tang E, Wieruszew M, Patel S, Stroemer P, Sinden JD. Implantation of c-mycER TAM immortalized human mesencephalicderived clonal cell lines ameliorates behavior dysfunction in a rat model of Parkinson's disease. Stem Cells Dev. 2009 Mar;18(2):307-19

Mitchell et al Journal of Immunological Methods 335 (2008) 98-105

Pollock et al, Exp Neurol. 2006 May;199(1):143-55.

Mark F Pittenger; Alastair M Mackay; Stephen C Beck; Rama K Jaiswal; et al Science; Apr 2, 1999; 284, 5411 Smith, E. J., Stroemer, R.P., Gorenkova, N., Nakajima, M. et al. (2012) Stem Cells 30:785-796.

Stevenato, L., Corteling, R., Stroemer, P., Hope, A. et al. (2009) BMC Neuroscience 10:86

Stroemer, P., Patel, S., Hope, A., Oliveira, C., Pollock, K., Sinden, J. (2009) Neurorehabil Neural Repair 23: 895-909. Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. et al. (2009) Nature Reviews Immunology 9: 581-593

Their et al, "Direct Conversion of Fibroblasts into Stably Expandable Neural Stem Cells". Cell Stem Cell. 2012 Mar 20. Timmers, L., Lim, S. K., Arslan, F., Armstrong, J. S. et al. (2007) Stem Cell Res 1: 129-137

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende los cuatro de: hsa-miR-1246 de la SEQ ID NO.21, hsa-miR-4492 de la SEQ ID NO. 34, hsa-miR-4488 de la SEQ ID NO.61, y hsa-miR-4532 de la SEQ ID NO.23.

2. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, que es una composición farmacéutica que comprende un portador, diluyente, vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

3. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para uso en terapia.

4. Una composición para uso en terapia de acuerdo con la reivindicación 3, en la que la terapia es una terapia regenerativa.

5. Una composición para uso en terapia de acuerdo con la reivindicación 3, en la que la terapia es para un

(i) Trastorno neurológico, enfermedad o déficit, como Parkinson, Alzheimer, apoplejía o ALS;

(ii) Trastorno de almacenamiento lisosómico;

(iv) Enfermedades del pulmón, incluida fibrosis pulmonar idiopática, síndrome de distensión respiratoria, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, hipertensión pulmonar idiopática, fibrosis quística y asma;

(v) Trastorno metabólico o inflamatorio, como diabetes (I o II), artritis reumatoide, osteoartritis, lupus, enfermedad de Crohn, enfermedad de colon irritable o enfermedad de injerto contra huésped;

(vi) Trastorno psiquiátrico, como: depresión, bipolar, esquizofrenia o un trastorno del síndrome autista como el autismo, el síndrome de Asperger o el síndrome de Rett;

(vii) Enfermedad de la retina causante de la ceguera, como degeneración macular relacionada con la edad, enfermedad de Stargardt, retinopatía diabética o retinitis pigmentaria;

y

(viii) Enfermedad desmielinizante, como esclerosis múltiple, mielinolisis pontina central, tabes dorsalis, mielitis transversa, enfermedad de Devic, leucoencefalopatía multifocal progresiva, neuritis óptica, leucodistrofias, síndrome de Guillain-Barré, neuropatía periférica anti-MAG y enfermedad de Charcot-Marie-Tooth.

6. Una composición para uso en terapia de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en la que la terapia mejora la recuperación funcional y/o cognitiva.

7. Una composición para uso en terapia de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en la que la terapia es de apoplejía, enfermedad arterial periférica o de la retina causantes de ceguera.