CN110075124B - AMSC-MALAT1-Exo用于制备治疗肝脏疾病的药物中的应用及其制备方法 - Google Patents

AMSC-MALAT1-Exo用于制备治疗肝脏疾病的药物中的应用及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及间充质干细胞来源外泌体的新应用，具体涉及lncRNA MALAT1修饰的脂肪来源间充质干细胞的构建及其外泌体制备，及其在制备肝病治疗生物制剂及肝脏巨噬细胞靶向生物制剂中的应用。本发明的思路是构建MALAT1修饰的AMSC，制备其外泌体，并在细胞水平通过ELISA，WB，流式等实验明确AMSC‑MALAT1‑Exo对巨噬细胞功能表型的调控优势，并通过体内实验明确MALAT1修饰的AMSC来源外泌体对肝脏疾病的疗效及对肝脏巨噬细胞功能表型调控的作用优势。并进一步制备经疗效改进的肝脏巨噬细胞靶向生物制剂或药物。

Description

AMSC-MALAT1-Exo用于制备治疗肝脏疾病的药物中的应用及 其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及间充质干细胞来源外泌体的新应用，具体涉及lncRNA MALAT1修饰的脂肪来源间充质干细胞的构建及其外泌体制备，及其在制备肝病治疗生物制剂及肝脏巨噬细胞靶向生物制剂中的应用。
背景技术
肝脏炎症的发生机制十分复杂，涉及病因、宿主遗传、机体免疫以及临床干预等多方面因素，其中机体的免疫反应在肝脏炎症的发生和发展过程中起决定性作用。各种天然免疫细胞，如单核/巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞在炎症肝脏中募集、活化和增生，提示天然免疫***在肝脏免疫炎症反应中具有十分重要的地位和作用。肝脏巨噬细胞占机体总巨噬细胞80％以上，占肝脏非实质细胞35％，其在肝脏免疫炎症反应中具有十分重要的地位和作用。肝脏炎症损伤时，肝脏巨噬细胞通过识别病原相关模式分子 (pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)和损伤相关模式分子(damage-associatedmolecular patterns，DAMPs)而活化，释放大量前炎症介质(如TNF-α、IFN-γ、ROS、HMGB-1等)介导剧烈的炎症反应。另一方面，巨噬细胞分泌保护性蛋白(如TGF-β1，IL-10)和血管内皮生长因子等，发挥免疫调节、炎症修复、纤维化形成和血管再生的作用。由此可见，巨噬细胞的功能状态可影响肝脏炎症反应的结局，其功能改变会直接影响肝脏疾病的发生发展。
肝脏巨噬细胞根据其起源和功能可以分为不同亚群，它们在肝损伤修复中发挥不同的功能。受到损伤因素刺激后，肝脏定居型巨噬细胞凋亡坏死，骨髓来源单核/巨噬细胞向肝脏浸润。后者表现很强的功能异质性和可塑性，能整合肝脏微环境信号重塑调节其表型。传统的巨噬细胞分型可根据其功能表型分为促炎型巨噬细胞(M1型)和抗炎型巨噬细胞(M2型)，但其并非简单的M1或M2两种极化状态，而是存在一个动态的演变过程。近来研究显示在肝损伤的不同阶段，可以分为ly6Chigh和ly6Clow两个不同功能状态的亚群。 ly6Chigh巨噬细胞表现为促炎促损伤的作用，而ly6Clow巨噬细胞则表现为促纤维降解和促修复作用，因此肝脏中ly6Chigh/ly6Clow比例也可作为评价肝脏巨噬细胞整体功能的重要指标。鉴于肝脏巨噬细胞在保持肝脏自稳态，损伤识别，促进炎症和纤维化，炎性消退和纤维降解，以及慢性肝损伤向肝细胞肝癌的转化过程均具有中枢性作用。因此，对于肝脏炎症、脂肪肝及肝纤维化/肝硬化等多种肝脏疾病的治疗，肝脏巨噬细胞可作为一个有效的治疗靶标。研发针对肝脏疾病的巨噬细胞靶向治疗策略，除阻断单核/巨噬细胞招募外，干预巨噬细胞分化过程、调控其细胞因子分泌亦是两种重要方式。
MSCs来源的exosome(MSCs-Exo)输注已在心血管、肾脏、肺部、神经***等疾病治疗中表现出显著疗效。由于exosome较之MSCs本身，其免疫原性更低，稳定性更好、保存方便，无输注毒性，因此MSCs-Exo 在临床治疗应用中更具优势。并且，我们在前期研究中已证实，脂肪组织来源MSCs(AMSCs)可通过其分泌的exosomes而在肝纤维化中发挥治疗作用。进一步的研究发现经荧光染料DiIC16(3)标记的AMSC-Exo尾静脉输注后，可与肝脏巨噬细胞共定位。提示AMSC-Exo可作为靶向巨噬细胞的肝病治疗策略的有效工具。虽然AMSC-Exo在安全性及稳定性方面更具优势，且已在肝病动物模型中显示出了令人鼓舞的疗效，但同等疗效下其需要量远超AMSCs移植量，达到较好疗效的单只小鼠的AMSC-Exo输注量需要小鼠近1/3的脂肪组织。而由于现今MSC-Exo制备技术所限，满足临床治疗剂量的MSC-Exo尚难大量制备。因此，其临床应用推广尚有赖于通过改造提高其效力。
发明内容
本发明的目的是要提供一种提高AMSC-Exo调控肝脏巨噬细胞功能表型能力的构建方法，具体涉及 MALAT1修饰的AMSC来源外泌体(AMSC-MALAT1-Exo)在制备肝脏巨噬细胞靶向治疗制剂及肝病治疗生物制剂中的用途。
MALAT1修饰的脂肪来源间充质干细胞外泌体在制备治疗肝脏疾病的药物中的应用。
所述肝脏疾病包括肝损伤、肝炎、肝衰竭、脂肪肝、肝硬化、肝纤维化。
所述肝炎包括病毒性肝炎、药物性肝炎、脂肪性肝炎、酒精性肝炎和自身免疫性肝炎。
一种治疗肝脏疾病的生物制剂，包含AMSC-MALAT1-Exo，AMSC-MALAT1-Exo的有效剂量≥1mg/kg。
MALAT1修饰的脂肪来源间充质干细胞外泌体在制备调控巨噬细胞功能表型的药物中的应用。
MALAT1修饰的脂肪来源间充质干细胞外泌体在制备肝脏巨噬细胞靶向生物制剂的应用。
另外，本发明还提供了制备MALAT1修饰的脂肪来源间充质干细胞外泌体的方法。
本发明的思路是构建MALAT1修饰的AMSC，制备其外泌体，并在细胞水平通过ELISA，WB，流式等实验明确AMSC-MALAT1-Exo对巨噬细胞功能表型的调控优势，并通过体内实验明确MALAT1修饰的AMSC来源外泌体对肝脏疾病的疗效及对肝脏巨噬细胞功能表型调控的作用优势。并进一步制备经疗效改进的肝脏巨噬细胞靶向生物制剂或药物。
下面对本发明做进一步的说明：
本发明公开了一种制备MALAT1修饰的脂肪来源间充质干细胞外泌体(AMSC-MALAT1-Exo)的方法，包括如下步骤：
1.脂肪来源的间充质干细胞(AMSC)的制备：
小鼠AMSC(mAMSC)和成人AMSC(hAMSC)按常规方法分离，mAMSC用含5％胎牛血清(MSC适宜胎牛血清)的低糖DMEM培养基(Gibco)培养，hAMSC采用含2％MSC培养无血清替代物(EliteCell,EPA-050) 的MSC培养基培养。AMSCs增殖接近80％融合时，进行消化、传代，3～8代细胞用于后续实验。
2.MALAT1修饰的AMSC的构建：
MALAT1慢病毒表达质粒pLVX-IRES-Zsgreen1-MALAT1感染AMSC。表达质粒包含部分MALAT1目的片段，为SEQ ID NO.1：
atataaagccaaaaattggataaaatagcactgaaaaaatgaggaaattattggtaaccaatttattttaaaagcccatcaatttaatttctggtggtgcagaagtta gaaggtaaagcttgagaagatgagggtgtttacgtagaccagaaccaatttagaagaatacttgaagctagaaggggaagttggttaaaaatcacatcaaaaagct actaaaaggactggtgtaatttaaaaaaaactaaggcagaaggcttttggaagagttagaagaatttggaaggccttaaatatagtagcttagtttgaaaaatgtgaa ggactttcgtaacggaagtaattcaagatcaagagtaattaccaacttaatgtttttgcattggactttgagttaagattattttttaaatcctgaggactagcattaattg acagctgacccaggtgctacacagaagtggattcagtgaatctaggaagacagcagcagacaggattccaggaaccagtgtttgatgaagctaggactgaggagca agcgagcaagcagcagttcgtggtgaagataggaaaagagtccaggagccagtgcgatttggtgaaggaagctaggaagaaggaaggagcgctaacgatttggtg gtgaagctaggaaaaaggattccaggaaggagcgagtgcaatttggtgatgaaggtagcaggcggcttggcttggcaaccacacggaggaggcgagcaggcgttg tgcgtagaggatcctagaccagcatgccagtgtgccaaggccacagggaaagcgagtggttggtaaaaatccgtgaggtcggcaatatgttgtttttctggaacttact tatggtaaccttttatttattttctaatataatgggggagtttcgtactgaggtgtaaagggatttatatggggacgtaggccgatttccgggtgttgtaggtttctctttttcaggcttatactcatgaatcttgtctgaagcttttgagggcagactgccaagtcctggagaaatagtagatggcaagtttgtgggttttttttttttacacgaatttgaggaa aaccaaatgaatttgatagccaaattgagacaatttcagcaaatctgtaagcagtttgtatgtttagttggggtaatgaagtatttcagttttgtgaatagatgacctgttt ttacttcctcaccctgaattcgttttgtaaatgtagagtttggatgtgtaactgaggcgggggggagttttcagtatttttttttgtgggggtgggggcaaaatatgttttca gttctttttcccttaggtctgtctagaatcctaaaggcaaatgactcaaggtgtaacagaaaacaagaaaatccaatatcaggataatcagaccaccacaggtttacag tttatagaaactagagcagttctcacgttgaggtctgtggaagagatgtccattggagaaatggctggtagttactcttttttccccccacccccttaatcagactttaaaa gtgcttaaccccttaaacttgttattttttacttgaagcattttgggatggtcttaacagggaagagagagggtgggggagaaaatgtttttttctaagattttccacagat gctatagtactattgacaaactgggttagagaaggagtgtaccgctgtgctgttggcacgaacaccttcagggactggagctgcttttatccttggagcagataaactc atgccagagaacttaaagtcttagaatggaaaaagtaaagaaatatcaacttccaagttggcaagtaactcccaatgatttagtttttttccccccagtttgaattggga agctgggggaagttaaatatgagccactgggtgtaccagtgcattaatttgggcaaggaaagtgtcataatttgatactgtatctgttttccttcaaagtatagagctttt ggggaaggaaagtattgaactgggggttggtctggcctactgggctgacattaactacaattatgggaaatgcaaaagttgtttggatatggtagtgtgtggttctcttt tggaatttttttcaggtttgaggaggctgtgctgtgtgccaatgtttcgtttgcctcagacaggtatctcttcgttatcagaagagttgcttcatttcatctgggagcagaaa acagcaggcagctgttaacagataagtttaacttgcatctgcagtattgcatgttagggataagtgcttatttttaagagctgtggagttcttaaatatcaaccatgtaca gggctcctgaccccttccctaggggatttcaggattgagaaatttttccatcgagcctttttaaaattgtaggacttgttcctgtgggcttcagtgatgggatagtacactt cactcagaggcatttgcatctttaaataatttcttaaaagcatgagaccttgcagtgagtttatcagcatactcaaaatttttttcctggaatttggagggatgggaggag ggggtggggcttacttgttgtagctttttttttttttacagacttcacagagaatgcagttgtcttgacttcaggtctgtctgttctgttggcaagtaaatgcagtactgttctg atcccgctgctattagaatgcattgtgaaacgactggagtatgattaaaagttgtgttccccaatgcttggagtagtgattgttgaaggaaaaaatccagctgagtgata aaggctgagtgttgaggaaatttctgcagttttaagcagtcgtatttgtgattgaagctgagtac；该片段包含miR-155的sponge序列和突变的miR-17sponge序列。
AMSC细胞铺6孔板，完全培养基培养过夜，当融合度达到50％后备用。随后OPTI-MEM培养基200μl，加入Enhanced Infection Solution 50μl，随后加入10μl MALAT1慢病毒(滴度为108TU/ml，MOI值＝10)，混匀后另加入1.75ml的完全培养基并一起加入到已贴壁的AMSCs，培养8-12h观察细胞状态，如果细胞状态出现不好则立即换液，如果未产生变化则继续培养。24h后换成含5μg/ml polybrene的完全培养基筛选培养 3-4天后荧光显微镜观察ZsGreen1荧光情况，当荧光率达到近100％后则可撤除polybrene。
3.AMSC-MALAT1-Exo分离
上述细胞在无血清MSC培养基中培养48小时，收集上清并离心(4℃,300g，10分钟)；取上清后再次离心(4℃，2000g，10分钟)；再次取上清进行离心(4℃，10,000g，30分钟)。弃沉淀，上清于100,000g离心70分钟；收集沉淀用PBS重悬后，再次离心(100,000g，70分钟)，所得沉淀即为AMSC-MALAT1-Exo。
4.AMSC-MALAT1-Exo鉴定
通过NTA法(Nanoparticle Tracking Analysis)分析其粒径，为117.6±29.8nm。并采用Western Blot 或磁珠法(流式细胞术)检测其表面的外泌体标志物CD63、CD9和CD81。
5.采用荧光定量PCR法鉴定mAMSC中MALAT1的表达：
消化收集细胞后，采用ncRNA试剂盒抽提RNA，然后进行逆转录。逆转录体系：RNA模板-1μg；Random Primer(200μM)-1μl；Oligo(dT)(25μM)-1μl；5×RT buffer-2μl；RTaseMix-2μl；RNase-free水-补至10μl。逆转录反应程序为：42℃60min，70℃10min。
再进行荧光定量PCR检测，PCR体系为：2×SYBR Green Mix-10μl；MALAT1上游引物(gattattttttaaatcctgaggactagcattaa)5μM-0.8μl；MALAT1下游引物(ctagggaaggggtcaggagccctgtacatggttgatattt) 5μM-0.8μl；模板-2ul；dd水-补至20μl。PCR条件为：95℃预变性10min，然后95℃5s，60℃30s，72℃30s， 40个循环。
PCR结果分析：经MALAT1修饰的mAMSC，其MALAT1的表达水平明显高于对照组(图1)
本发明还提供了MALAT1修饰的脂肪来源间充质干细胞外泌体，构建方法为采用MALAT1慢病毒表达质粒pLVX-IRES-Zsgreen1-MALAT1感染AMSC，其中表达质粒包含部分MALAT1目的片段为SEQ ID NO.1。
MALAT1修饰的脂肪来源间充质干细胞外泌体，制备方法如下：
1.脂肪来源的间充质干细胞(AMSC)的制备：
小鼠AMSC(mAMSC)和成人AMSC(hAMSC)按常规方法分离，mAMSC用含5％胎牛血清(MSC适宜胎牛血清)的低糖DMEM培养基(Gibco)培养，hAMSC采用含2％MSC培养无血清替代物(EliteCell,EPA-050) 的MSC培养基培养。AMSCs增殖接近80％融合时，进行消化、传代，3～8代细胞用于后续实验。
2.MALAT1修饰的AMSC的构建：
MALAT1慢病毒表达质粒pLVX-IRES-Zsgreen1-MALAT1感染AMSC。表达质粒包含部分MALAT1目的片段，为SEQ ID NO.1；该片段包含miR-155的sponge序列和突变的miR-17sponge序列。
AMSC细胞铺6孔板，完全培养基培养过夜，当融合度达到50％后备用。随后OPTI-MEM培养基200μl，加入Enhanced Infection Solution 50μl，随后加入10μl MALAT1慢病毒(滴度为108TU/ml，MOI值＝10)，混匀后另加入1.75ml的完全培养基并一起加入到已贴壁的AMSCs，培养8-12h观察细胞状态，如果细胞状态出现不好则立即换液，如果未产生变化则继续培养。24h后换成含5μg/ml polybrene的完全培养基筛选培养 3-4天后荧光显微镜观察ZsGreen1荧光情况，当荧光率达到近100％后则可撤除polybrene。
3.AMSC-MALAT1-Exo分离
上述细胞在无血清MSC培养基中培养48小时，收集上清并离心(4℃,300g，10分钟)；取上清后再次离心(4℃，2000g，10分钟)；再次取上清进行离心(4℃，10,000g，30分钟)。弃沉淀，上清于100,000g离心70分钟；收集沉淀用PBS重悬后，再次离心(100,000g，70分钟)，所得沉淀即为AMSC-MALAT1-Exo。
4.AMSC-MALAT1-Exo鉴定
通过NTA法(Nanoparticle Tracking Analysis)分析其粒径，为117.6±29.8nm。并采用Western Blot 或磁珠法(流式细胞术)检测其表面的外泌体标志物CD63、CD9和CD81。
5.采用荧光定量PCR法鉴定mAMSC中MALAT1的表达：
消化收集细胞后，采用ncRNA试剂盒抽提RNA，然后进行逆转录。逆转录体系：RNA模板-1μg；Random Primer(200μM)-1μl；Oligo(dT)(25μM)-1μl；5×RT buffer-2μl；RTaseMix-2μl；RNase-free水-补至10μl。逆转录反应程序为：42℃60min，70℃10min。
再进行荧光定量PCR检测，PCR体系为：2×SYBR Green Mix-10μl；MALAT1上游引物(gattattttttaaatcctgaggactagcattaa)5μM-0.8μl；MALAT1下游引物(ctagggaaggggtcaggagccctgtacatggttgatattt) 5μM-0.8μl；模板-2ul；dd水-补至20μl。PCR条件为：95℃预变性10min，然后95℃5s，60℃30s，72℃30s， 40个循环。
PCR结果分析：经MALAT1修饰的mAMSC，其MALAT1的表达水平明显高于对照组(图1)
本发明公开了AMSC-MALAT1-Exo在调控巨噬细胞功能表型以及治疗肝脏疾病中的作用及优势，具备以下作用中的任一项或多项：较之天然AMSC-Exo，AMSC-MALAT1-Exo可更为有效地(1)调控巨噬细胞表型：促进抗炎修复表型，抑制促炎损伤表型；(2)抑制巨噬细胞炎症因子分泌；(3)促进巨噬细胞自噬；(4) 促进巨噬细胞线粒体自噬；(5)减少巨噬细胞程序性坏死(坏死性凋亡)；(6)降低血清ALT、AST水平；(7) 缓解肝脏炎症，减少肝组织坏死程度；(8)治疗肝脏疾病。
优选地，所述肝脏炎症性疾病包括但不限于肝损伤、肝炎、肝衰竭、脂肪肝、肝硬化、肝纤维化。
本发明了还公开了AMSC-MALAT1-Exo在制备肝病治疗生物制剂中的应用，AMSC-MALAT1-Exo制剂的有效剂量可低至1mg/kg。可极大降低exosome治疗所需剂量(降低数十倍)，提升MSC-Exo在肝病临床治疗中的应用潜能。
提供了一种预防和/或治疗肝脏疾病的方法，包括步骤：将含有有效剂量的AMSC-MALAT1-Exo的药物施用于作用对象。
优选地，所述肝脏炎症性疾病包括但不限于急慢性肝损伤、肝炎(包括病毒性肝炎、药物性肝炎、脂肪性肝炎、酒精性肝炎和自身免疫性肝炎)、肝衰竭、肝纤维化/肝硬化等多种肝脏炎症性疾病。
所述方法可以是体内的。也可以体外的，例如仅用于科学研究。
本发明的MALAT1修饰的AMSC来源外泌体的优点有：
1.较之天然AMSC来源外泌体具有更好的巨噬细胞功能表型调控作用；
2.所述的外泌体具有更好的肝脏疾病治疗效果；
3.所述的外泌体可用于制备肝病治疗制剂或药物，其有效剂量大大降低，亦可显著减少用于外泌体制备的AMSC所需量。
附图说明
图1：MALAT1的表达分析：
采用MALAT1特殊引物进行qRT-PCR分析，显示AMSC-MALAT1-Exo及AMSC-MALAT1-Exo处理的巨噬细胞中含高水平MALAT1。**P＜0.01。
图2：AMSC-MALAT1-Exo对巨噬细胞表型的影响：
同剂量的AMSC-MALAT1-Exo较之AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo，能更为显著地上调巨噬细胞M2表型相关分子Arg1和Fizz-1的表达，而下调M1表型相关分子CD86和iNOS的表达。且AMSC-MALAT1-Exo在0.2 μg/mL浓度时即有显著作用。*P＜0.05，**P＜0.01。
图3：AMSC-MALAT1-Exo对巨噬细胞炎症因子分泌的影响：
同剂量的AMSC-MALAT1-Exo较之AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo，能更为显著地降低诱导的巨噬细胞IL-1β、IL-33和HMGB1的分泌。且AMSC-MALAT1-Exo在0.2μg/mL浓度时即有显著作用。*P＜0.05，**P＜0.01。图4：不同序列MALAT1修饰的AMSC-Exo对巨噬细胞炎症因子分泌的影响：
常规MALAT1序列修饰的AMSC-Exo(AMSC-MALAT1*-Exo)，不能有效抑制LPS诱导的巨噬细胞IL-1β分泌。本发明所述的AMSC-MALAT1-Exo较之AMSC-MALAT1*-Exo具有显著优势。*P＜0.05，**P＜0.01。
图5：AMSC-MALAT1-Exo对巨噬细胞自噬的影响：
同剂量的AMSC-MALAT1-Exo较之AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo，能更为显著地促进巨噬细胞自噬，上调 LC3Ⅱ/Ⅰ比例，下调p62水平，上调Atg5水平。且AMSC-MALAT1-Exo在0.2μg/mL浓度时即有显著作用。a —同剂量的AMSC-Ctrl-Exo或天然AMSC-Exo与AMSC-MALAT1-Exo相比有统计学差异；b—与Vehicle组比有统计学差异。
图6：AMSC-MALAT1-Exo对巨噬细胞程序性坏死的影响：
同剂量的AMSC-MALAT1-Exo较之AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo，能更为显著地抑制TNF-α/zVAD诱导的巨噬细胞坏死，下调p-RIP1,p-RIP3,p-MLKL比例。且AMSC-MALAT1-Exo在0.2μg/mL浓度时即有显著作用。a —同剂量的AMSC-Ctrl-Exo或天然AMSC-Exo与AMSC-MALAT1-Exo相比有统计学差异；b—与Vehicle组比有统计学差异。
图7：AMSC-MALAT1-Exo输注促进肝脏巨噬细胞线粒体自噬：
同剂量的AMSC-MALAT1-Exo较之AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo，能更为显著地促进肝脏巨噬细胞线粒体自噬。AMSC-MALAT1-Exo在1mg/kg剂量时仍具有一定作用。a—同剂量的AMSC-Ctrl-Exo或天然AMSC-Exo 与AMSC-MALAT1-Exo相比有统计学差异；b—与Vehicle组比有统计学差异。
图8：AMSC-MALAT1-Exo输注对小鼠模型中肝脏巨噬细胞的调控作用；
同剂量的AMSC-MALAT1-Exo较之AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo，能更为显著地调控肝脏巨噬细胞表型。 AMSC-MALAT1-Exo在1mg/kg剂量时仍具有一定作用。a—同剂量的AMSC-Ctrl-Exo或天然AMSC-Exo与 AMSC-MALAT1-Exo相比有统计学差异；b—与Vehicle组比有统计学差异。
具体实施方式
实施例1 AMSC-MALAT1-Exo可介导MALAT1向巨噬细胞传递
按前述方法进行MALAT1的qRT-PCR分析。如图1左所示，AMSC-MALAT1-Exo中含高水平的MALAT1。
巨噬细胞RAW264.7中分别加入AMSC-MALAT1-Exo、AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo，24h后收集细胞，进行MALAT1水平的qPCR分析。
qPCR结果显示AMSC-MALAT1-Exo较之AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo，能显著上调巨噬细胞的MALAT1水平(图1右)。
实施例2 AMSC-MALAT1-Exo调控巨噬细胞表型
巨噬细胞RAW264.7中分别加入梯度浓度的AMSC-MALAT1-Exo、AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo(0.2μg/mL、4μg/mL、80μg/mL)，同时加入对应体积的PBS作为对照组(Vehicle)，24h后收集细胞，进行巨噬细胞表型相关分子的qPCR分析。
相同浓度条件下，AMSC-MALAT1-Exo较之AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo，能更为显著地上调巨噬细胞M2 表型相关分子Arg1和Fizz-1的表达，而下调M1表型相关分子CD86和iNOS的表达。AMSC-MALAT1-Exo在 0.2μg/mL浓度时即可显著影响M1/2表型相关分子表达，而AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo在80μg/mL浓度时才能明显调控M1/2表型相关分子的表达(图2)。
实施例3 AMSC-MALAT1-Exo调控巨噬细胞炎症因子分泌
巨噬细胞RAW264.7中分别加入梯度浓度的AMSC-MALAT1-Exo、AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo处理(0.2 μg/mL、4μg/mL、80μg/mL)24h，同时加入对应体积的PBS作为对照组(Vehicle)；再以LPS(100ng/mL) 刺激12h，然后采用ELISA检测细胞上清IL-1β、IL-33和HMGB1水平。
相同浓度条件下，AMSC-MALAT1-Exo较之AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo，能更为显著地降低LPS所诱导的巨噬细胞炎症因子IL-1β、IL-33和HMGB1的分泌。AMSC-MALAT1-Exo在0.2μg/mL浓度时即可显著抑制巨噬细胞炎症因子分泌，其抑制效果与80μg/mL浓度的AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo相当(图3)。
并且，常规MALAT1序列修饰的AMSC-Exo(AMSC-MALAT1*-Exo)，并不能有效抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症因子(如IL-1β)分泌，显示本发明的MALAT1序列具有特异性，经该MALAT1序列修饰的AMSC-MALAT1-Exo 在调控巨噬细胞功能中具有特别的优势(图4)。
实施例4 AMSC-MALAT1-Exo促进巨噬细胞自噬
巨噬细胞RAW264.7中分别加入梯度浓度的AMSC-MALAT1-Exo、AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo(0.2μg/mL、 4μg/mL、80μg/mL)处理24h，然后收集细胞，进行细胞自噬相关分子的Western Blot检测，WB条带采用 ChemiScope Western Blot Imaging System(ClinxScience Instruments Co.,Ltd)扫描后，再用Image J软件(Rawak Software,Inc.Germany)进行灰度比值分析。
相同浓度条件下，AMSC-MALAT1-Exo较之AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo，能更为显著地促进巨噬细胞自噬，具体表现为上调LC3Ⅱ/Ⅰ比例，下调p62水平，上调Atg5水平。AMSC-MALAT1-Exo在0.2μg/mL浓度时即可显著提高巨噬细胞自噬水平，其效果与80μg/mL浓度的AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo相当(图5)。
实施例5 AMSC-MALAT1-Exo抑制TNF-α/zVAD诱导的巨噬细胞程序性坏死
U937细胞经PMA诱导成巨噬细胞后，分别加入梯度浓度的AMSC-MALAT1-Exo、AMSC-Ctrl-Exo和天然 AMSC-Exo(0.2μg/mL、4μg/mL、80μg/mL)预处理24h，再以TNF-α/zVAD诱导细胞坏死。作用2h后收集细胞，进行细胞坏死相关分子的Western Blot检测，WB条带采用ChemiScope Western Blot Imaging System (Clinx Science Instruments Co.,Ltd)扫描后，再用Image J软件(Rawak Software,Inc.Germany)进行灰度比值分析。并在作用6h后收集细胞，进行PI流式检测。
相同浓度条件下，AMSC-MALAT1-Exo较之AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo，能更为显著地抑制TNF-α/zVAD 诱导的巨噬细胞坏死，具体表现为降低PI阳性的细胞比例，下调p-RIP1,p-RIP3,p-MLKL比例。 AMSC-MALAT1-Exo在0.2μg/mL浓度时即可显著抑制巨噬细胞程序性坏死，其效果与80μg/mL浓度的 AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo相当(图6)。
实施例6 AMSC-MALAT1-Exo对小鼠肝炎模型具有更好的疗效
梯度剂量(1mg/kg、5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg)的AMSC-MALAT1-Exo、AMSC-Ctrl-Exo、天然AMSC-Exo 分别尾静脉输注C57小鼠，并尾静脉注射对应体积的PBS作为对照组(Vehicle)，隔天注射，共注射3次。第3次注射3h后小鼠腹腔注射LPS/GalN(10μg/kg的LPS+500mg/kg的D-GalN)建立急性肝损伤模型。造模6h后，处死小鼠并收集血清、肝组织等进行肝功能、肝脏病理、炎症因子及免疫荧光检测等。血清ALT、 AST检测分别采用FUJI DRI-CHEM Slide GFP/ALT-PIII和GOT/AST-PIII试剂盒，用DRI-CHEM 4000ie(FUJIFILM)测定。肝脏病理采用HE检测。血清炎症因子采用相应ELISA试剂盒进行检测。肝脏巨噬细胞通过肝组织单细胞悬液经流式分选CD45+F4/80+的细胞所得，然后常规抽提RNA，qPCR分析iNOS和Arg1表达水平；同时采用Western blot分析线粒体自噬及程序性坏死相关分子表达水平；并通过流式分析ly6Chigh/ly6Clow比例，再以Vehicle组的比例设为1，计算出相对水平。
相同常规剂量条件下(25mg/kg、50mg/kg)，AMSC-MALAT1-Exo对小鼠急性肝损伤的疗效显著优于 AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo，表现为：更有效地降低血清ALT、AST水平；缓解肝脏炎症，减少肝组织坏死灶；降低血清IL-1β、IL-33和HMGB1水平(表1)；促进肝脏巨噬细胞线粒体自噬(上调PARKIN和PINK1 水平)(图7)；抑制细胞程序性坏死(下调p-RIP1,p-RIP3,p-MLKL水平)；下调巨噬细胞iNOS表达水平，上调Arg1表达水平；下调巨噬细胞ly6Chigh/ly6Clow比例(图8)。
并且在低剂量条件下(1mg/kg、5mg/kg)，AMSC-Ctrl-Exo和天然AMSC-Exo几无疗效，而AMSC-MALAT1-Exo 仍能部分改善肝功能、肝脏病理。
表1
pg/mL IL-1β IL-33 HMGB1
正常对照 2.9±1.4 3.8±1.6 1571.3±149.6
Vehicle组 98.3±10.4 65.5±8.9 6446.2±664.6
AMSC-Exo(1mg/kg)治疗组 89.5±14.7<sup>a</sup> 62.4±7.8<sup>a</sup> 6340.6±546.5<sup>a</sup>
AMSC-Ctrl-Exo(1mg/kg)治疗组 98.7±15.5<sup>a</sup> 65.3±5.1<sup>a</sup> 6401.3±616.3<sup>a</sup>
AMSC-MALAT1-Exo(1mg/kg)治疗组 49.4±8.4<sup>b</sup> 54.4±5.7<sup>b</sup> 5255.7±436.1<sup>b</sup>
AMSC-Exo(5mg/kg)治疗组 79.3±6.7<sup>a</sup> 58.3±6.9<sup>a</sup> 6098.6±515.5<sup>a</sup>
AMSC-Ctrl-Exo(5mg/kg)治疗组 80.6±11.1<sup>a</sup> 61.8±8.5<sup>a</sup> 6109.2±526.7<sup>a</sup>
AMSC-MALAT1-Exo(5mg/kg)治疗组 39.7±4.2<sup>b</sup> 45.3±4.1<sup>b</sup> 4203.5±431.5<sup>b</sup>
AMSC-Exo(25mg/kg)治疗组 55.5±5.5<sup>a,b</sup> 50.4±6.5<sup>a,b</sup> 4900.6±379.3<sup>a,b</sup>
AMSC-Ctrl-Exo(25mg/kg)治疗组 59.1±10.2<sup>a,b</sup> 51.2±7.5<sup>a,b</sup> 5004.2±401.1<sup>a,b</sup>
AMSC-MALAT1-Exo(25mg/kg)治疗组 29.3±2.3<sup>b</sup> 17.6±3.2<sup>b</sup> 3164.2±216.5<sup>b</sup>
AMSC-Exo(50mg/kg)治疗组 39.3±6.4<sup>a,b</sup> 41.8±4.1<sup>a,b</sup> 4212.4±306.9<sup>a,b</sup>
AMSC-Ctrl-Exo(50mg/kg)治疗组 42.9±4.6<sup>a,b</sup> 40.1±6.1<sup>a,b</sup> 4256.8±259.8<sup>a,b</sup>
AMSC-MALAT1-Exo(50mg/kg)治疗组 23.1±3.1<sup>b</sup> 15.8±2.5<sup>b</sup> 2133.3±196.5<sup>b</sup>
注：数值为MEAN±SE；a—同剂量的AMSC-Ctrl-Exo或天然AMSC-Exo与AMSC-MALAT1-Exo相比有统计学差异；b—与Vehicle组比有统计学差异。
序列表
<110> 浙江大学
<120> AMSC-MALAT1-Exo用于制备治疗肝脏疾病的药物中的应用及其制备方法
<130> 21-2019-0401
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2820
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atataaagcc aaaaattgga taaaatagca ctgaaaaaat gaggaaatta ttggtaacca 60
atttatttta aaagcccatc aatttaattt ctggtggtgc agaagttaga aggtaaagct 120
tgagaagatg agggtgttta cgtagaccag aaccaattta gaagaatact tgaagctaga 180
aggggaagtt ggttaaaaat cacatcaaaa agctactaaa aggactggtg taatttaaaa 240
aaaactaagg cagaaggctt ttggaagagt tagaagaatt tggaaggcct taaatatagt 300
agcttagttt gaaaaatgtg aaggactttc gtaacggaag taattcaaga tcaagagtaa 360
ttaccaactt aatgtttttg cattggactt tgagttaaga ttatttttta aatcctgagg 420
actagcatta attgacagct gacccaggtg ctacacagaa gtggattcag tgaatctagg 480
aagacagcag cagacaggat tccaggaacc agtgtttgat gaagctagga ctgaggagca 540
agcgagcaag cagcagttcg tggtgaagat aggaaaagag tccaggagcc agtgcgattt 600
ggtgaaggaa gctaggaaga aggaaggagc gctaacgatt tggtggtgaa gctaggaaaa 660
aggattccag gaaggagcga gtgcaatttg gtgatgaagg tagcaggcgg cttggcttgg 720
caaccacacg gaggaggcga gcaggcgttg tgcgtagagg atcctagacc agcatgccag 780
tgtgccaagg ccacagggaa agcgagtggt tggtaaaaat ccgtgaggtc ggcaatatgt 840
tgtttttctg gaacttactt atggtaacct tttatttatt ttctaatata atgggggagt 900
ttcgtactga ggtgtaaagg gatttatatg gggacgtagg ccgatttccg ggtgttgtag 960
gtttctcttt ttcaggctta tactcatgaa tcttgtctga agcttttgag ggcagactgc 1020
caagtcctgg agaaatagta gatggcaagt ttgtgggttt ttttttttta cacgaatttg 1080
aggaaaacca aatgaatttg atagccaaat tgagacaatt tcagcaaatc tgtaagcagt 1140
ttgtatgttt agttggggta atgaagtatt tcagttttgt gaatagatga cctgttttta 1200
cttcctcacc ctgaattcgt tttgtaaatg tagagtttgg atgtgtaact gaggcggggg 1260
ggagttttca gtattttttt ttgtgggggt gggggcaaaa tatgttttca gttctttttc 1320
ccttaggtct gtctagaatc ctaaaggcaa atgactcaag gtgtaacaga aaacaagaaa 1380
atccaatatc aggataatca gaccaccaca ggtttacagt ttatagaaac tagagcagtt 1440
ctcacgttga ggtctgtgga agagatgtcc attggagaaa tggctggtag ttactctttt 1500
ttccccccac ccccttaatc agactttaaa agtgcttaac cccttaaact tgttattttt 1560
tacttgaagc attttgggat ggtcttaaca gggaagagag agggtggggg agaaaatgtt 1620
tttttctaag attttccaca gatgctatag tactattgac aaactgggtt agagaaggag 1680
tgtaccgctg tgctgttggc acgaacacct tcagggactg gagctgcttt tatccttgga 1740
gcagataaac tcatgccaga gaacttaaag tcttagaatg gaaaaagtaa agaaatatca 1800
acttccaagt tggcaagtaa ctcccaatga tttagttttt ttccccccag tttgaattgg 1860
gaagctgggg gaagttaaat atgagccact gggtgtacca gtgcattaat ttgggcaagg 1920
aaagtgtcat aatttgatac tgtatctgtt ttccttcaaa gtatagagct tttggggaag 1980
gaaagtattg aactgggggt tggtctggcc tactgggctg acattaacta caattatggg 2040
aaatgcaaaa gttgtttgga tatggtagtg tgtggttctc ttttggaatt tttttcaggt 2100
ttgaggaggc tgtgctgtgt gccaatgttt cgtttgcctc agacaggtat ctcttcgtta 2160
tcagaagagt tgcttcattt catctgggag cagaaaacag caggcagctg ttaacagata 2220
agtttaactt gcatctgcag tattgcatgt tagggataag tgcttatttt taagagctgt 2280
ggagttctta aatatcaacc atgtacaggg ctcctgaccc cttccctagg ggatttcagg 2340
attgagaaat ttttccatcg agccttttta aaattgtagg acttgttcct gtgggcttca 2400
gtgatgggat agtacacttc actcagaggc atttgcatct ttaaataatt tcttaaaagc 2460
atgagacctt gcagtgagtt tatcagcata ctcaaaattt ttttcctgga atttggaggg 2520
atgggaggag ggggtggggc ttacttgttg tagctttttt tttttttaca gacttcacag 2580
agaatgcagt tgtcttgact tcaggtctgt ctgttctgtt ggcaagtaaa tgcagtactg 2640
ttctgatccc gctgctatta gaatgcattg tgaaacgact ggagtatgat taaaagttgt 2700
gttccccaat gcttggagta gtgattgttg aaggaaaaaa tccagctgag tgataaaggc 2760
tgagtgttga ggaaatttct gcagttttaa gcagtcgtat ttgtgattga agctgagtac 2820

Claims (9)

1.MALAT1修饰的脂肪来源间充质干细胞外泌体在制备治疗肝脏疾病的药物中的应用，所述MALAT1修饰的脂肪来源间充质干细胞外泌体的构建方法为采用MALAT1慢病毒表达质粒pLVX-IRES-Zsgreen1-MALAT1感染AMSC，其中表达质粒包含部分MALAT1目的片段为SEQID NO.1。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肝脏疾病包括肝损伤、肝炎。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述肝炎包括病毒性肝炎、药物性肝炎、脂肪性肝炎、酒精性肝炎和自身免疫性肝炎。
4.一种治疗肝脏疾病的生物制剂，其特征在于：包含MALAT1修饰的脂肪来源间充质干细胞外泌体，有效剂量≥1mg/kg，所述MALAT1修饰的脂肪来源间充质干细胞外泌体的构建方法为采用MALAT1慢病毒表达质粒pLVX-IRES-Zsgreen1-MALAT1感染AMSC，其中表达质粒包含部分MALAT1目的片段为SEQ ID NO.1。
5.MALAT1修饰的脂肪来源间充质干细胞外泌体在制备肝脏巨噬细胞靶向生物制剂的应用，所述MALAT1修饰的脂肪来源间充质干细胞外泌体的构建方法为采用MALAT1慢病毒表达质粒pLVX-IRES-Zsgreen1-MALAT1感染AMSC，其中表达质粒包含部分MALAT1目的片段为SEQ ID NO.1。
6.一种制备MALAT1修饰的脂肪来源间充质干细胞外泌体的方法，包括如下步骤：
1） 脂肪来源的间充质干细胞的制备：
分离后的mAMSC用含5%胎牛血清的低糖DMEM培养基培养，分离后的hAMSC采用含2% MSC培养无血清替代物的MSC培养基培养；AMSCs增殖接近80%融合时，进行消化、传代，3~8代细胞用于后续实验；
2） MALAT1修饰的AMSC的构建：
MALAT1慢病毒表达质粒pLVX-IRES-Zsgreen1-MALAT1感染AMSC，表达质粒包含部分MALAT1目的片段为SEQ ID NO.1；
AMSC细胞铺6孔板，完全培养基培养过夜，当融合度达到50%后备用；随后OPTI-MEM培养基200 μl，加入Enhanced Infection Solution 50 μl， 随后加入10 μl MALAT1慢病毒，混匀后另加入1.75ml的完全培养基并一起加入到已贴壁的AMSCs，培养8-12h观察细胞状态，如果细胞状态出现不好则立即换液，如果未产生变化则继续培养；24h后换成含5 μg/mlpolybrene的完全培养基筛选培养3-4天后荧光显微镜观察ZsGreen1荧光情况，当荧光率达到近100%后则可撤除polybrene；
3） AMSC-MALAT1-Exo分离
上述细胞在无血清MSC培养基中培养48小时，收集上清并离心；取上清后再次离心；再次取上清进行离心；弃沉淀，上清于100,000g离心70分钟；收集沉淀用PBS重悬后，再次离心，所得沉淀即为AMSC-MALAT1-Exo。
7.根据权利要求6所述的方法，其中部分MALAT1目的片段SEQ ID NO.1包含miR-155 的sponge序列和 突变的miR-17 sponge序列。
8.MALAT1修饰的脂肪来源间充质干细胞外泌体，其特征在于：构建方法为采用MALAT1慢病毒表达质粒pLVX-IRES-Zsgreen1-MALAT1感染AMSC，其中表达质粒包含部分MALAT1目的片段为SEQ ID NO.1。
9.MALAT1修饰的脂肪来源间充质干细胞外泌体，其特征在于：由权利要求6所述的方法制备。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108728408B (zh) * 2018-05-28 2021-08-24 天津博雅秀岩生物技术有限公司 犬胎膜间充质干细胞及制备方法和使用的培养基
CN111575248A (zh) * 2020-06-01 2020-08-25 艾一生命科技(广东)有限公司 一种慢病毒、重组间充质干细胞及其构建方法和应用
CN114058621B (zh) * 2021-12-03 2023-06-16 温州医科大学 一种lncRNA基因修饰细胞分泌的外泌体及应用
CN114381433B (zh) * 2021-12-31 2024-05-10 浙江大学 Fam60a修饰的间充质干细胞及其制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014125277A1 (en) * 2013-02-12 2014-08-21 Reneuron Limited Method of producing microparticles
CN107488740A (zh) * 2017-10-24 2017-12-19 南阳师范学院 检测胃癌预后情况的LncRNA组合及含有该组合的试剂盒
CN109161598A (zh) * 2018-11-29 2019-01-08 上海晟燃生物科技有限公司 ***癌早期诊断或预后评估标志物lncRNA malat1及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014125277A1 (en) * 2013-02-12 2014-08-21 Reneuron Limited Method of producing microparticles
CN107488740A (zh) * 2017-10-24 2017-12-19 南阳师范学院 检测胃癌预后情况的LncRNA组合及含有该组合的试剂盒
CN109161598A (zh) * 2018-11-29 2019-01-08 上海晟燃生物科技有限公司 ***癌早期诊断或预后评估标志物lncRNA malat1及其应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AMSC-derived exosomes alleviate lipopolysaccharide/D-galactosamine-induced acute liver failure by miR-17-mediated reduction of TXNIP/NLRP3 inflammasome activation in macrophages;Yanning Liu等;《EBioMedicine》;20180906;第36卷;第140-150页 *
Exosomal miRNAs in hepatocellular carcinoma development and clinical responses;Shuangshuang Li等;《Journal of Hematology & Oncology》;20180411;第11卷(第54期);第1-9页 *
GenBank登录号：FJ209305.1;NCBI;《NCBI GenBank》;20081202;第1-7072位 *
Knockdown of long non-coding RNA MALAT1 inhibits growth and motility of human hepatoma cells via modulation of miR-195;Dingli Liu等;《Journal of Cellular Biochemistry》;20170918;第119卷(第2期);第1368-1380页 *
Tumor-suppressive function of long noncoding RNA MALAT1 in glioma cells by suppressing miR-155 expression and activating FBXW7 function;Shuanzhu Cao等;《Am J Cancer Res》;20161115;第6卷(第11期);第2561-2574页 *
乙型病毒性肝炎患者血浆中相关非编码RNA的动态表达及其意义;王悦;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20180315(第03期);第E061-22页 *

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