CN113574179A - 用于预测胞外囊泡(ev)的促血管生成潜力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于预测胞外囊泡(EV)，优选血液来源的EV的制备物的促血管生成活性的体外方法，其中所述方法基于对转化生长因子β(TGFβ)和微RNA‑130a含量的组合测定。还公开了制备预测具有强促血管生成活性的胞外囊泡(EV)制备物的方法及其EV制备物，其对于缺血性疾病、缺血性损伤和与心血管疾病风险相关的病理状况的治疗性治疗是有效的，或有效地用于伤口愈合。
Description
本发明涉及预测胞外囊泡(extracellular vesicle，EV)制备物的促血管生成活性的方法、其EV制备物及其治疗性应用。
胞外囊泡(EV)是在正常和病理状况两种情况下从几乎所有细胞类型脱落的小囊泡。它们主要包括由细胞质膜出芽产生的微囊泡和通过胞吐作用来源于内体膜区室的外排体。最近的证据表明，EV可充当多种病理生理过程的介质。循环EV水平的提高与血管损伤和高凝性(hypercoagulability)有关，特别是在患有糖尿病和急性冠脉综合征的患者中，表明其在驱动心血管疾病中发挥作用。此外，主要源自血小板和内皮细胞的循环EV水平提高被认为是细胞功能障碍的标志。已广泛报道了EV充当生物活性载体，并参与循环细胞和包括内皮细胞在内的许多细胞类型之间的信息交换。事实上，也提出了源自血小板的EV在动脉粥样硬化的发病机制中发挥作用。
EV主要通过递送蛋白质、活性脂质和胞外RNA来充当生物中介物，通常被称为EV载物(cargo)(Pathan M.,et al.Vesiclepedia 2019:acompendium of RNA,proteins,lipids and metabolites in extracellular vesicles.(2019)Nucleic Acids Res.47:D516-D519)然而，研究最多的EV介导的生物过程依赖于miR转移。miR是在转录之后调节基因表达的一类非编码小RNA。miR在血清/血浆中稳定表达，并且它们独特的表达模式已被提议用作许多临床环境中的疾病指纹。此外，已经表明活化的血小板可以使用EV将功能性miR转移到血管细胞中。这进而调节ICAM-1表达和血管炎性响应。事实上，循环EV载物的变化已显示与糖尿病中的内皮细胞和平滑肌细胞的功能障碍有关。
越来越多的证据表明，EV可充当潜在的治疗、诊断和预后工具。
心血管事件风险提高是患有糖尿病和肥胖症的患者的一个共同特征。在这些临床环境中，受损的血管形成仍然被认为是导致异常血管重塑的一种相关机制。因此，促进受损组织的新生血管形成仍然是改善患者结局所必需的。已经提出了不同的治疗方法来改善具有心血管风险因素的患者的血管重塑。然而，它们未能提供真正的益处，表明仍然需要新的治疗选项。
WO2018069408公开了以强促血管生成活性为特征的血液来源的EV的组合物。此外，WO2018069408教导了一种能够测量EV的促血管生成潜力的测试，其包括测定EV诱导细胞增殖和/或在体外管状结构形成的能力。
本发明基于以下发现：EV载物的组合物代表了关于这些囊泡是否表现出促血管生成活性的一个可靠预测指标。出乎意料的是，本发明人进行的实验研究(在下面的实验部分详细说明)揭示，基于与miR-130a的测量值组合使用的转化生长因子β(TGFβ)的浓度，具有促血管生成活性的EV可与无活性囊泡区分开。事实上，如从ROC分析推导出的，基于上述测量值的组合的测试在灵敏性和特异性两个方面均表现出对EV促血管生成活性的强大预测能力，从而能够准确选择在受促血管生成治疗积极影响的疾病或损伤的治疗性治疗中有效的EV。
因此，本发明的第一方面是预测胞外囊泡(EV)组合物是否具有促血管生成活性的方法，其包括以下步骤：
(a)量化EV组合物中的miR-130a微RNA含量，以及
(b)量化所述EV组合物中的转化生长因子β(TGFβ)含量；
(c)确定miR-130a含量是否高于第一预定值以及TGFβ含量是否高于第二预定值，
其中：
当所述miR-130a含量高于所述第一预定值并且所述TGFβ含量高于所述第二预定值时，则预测所述EV组合物为具有促血管生成活性。
如本文所用，术语“促血管生成活性”是指刺激或增强血管生成和/或内皮细胞增殖。
如下文进一步详细解释的，本发明人对从健康供体和具有心血管风险因素的患者的血液中分离的促血管生成有效和无效EV中的微RNA(miRNA)进行了基于微阵列的表达谱分析，并出乎意料地发现了这些囊泡的促血管生成活性与miR-130a含量之间的显著相关性。进一步的研究表明，与非活性EV相比，具有促血管生成活性的EV含有更高量的TGFβ蛋白。
不希望受任何理论束缚，本发明人认为，miR-130a在促进血管生成过程中所发挥的作用可以通过该分子与参与血管生成过程的数种基因(例如KDR、HOXA5、ROCK1和EPHB6)的相互作用来解释，如本发明人所进行的IPA Ingenuity生物信息学分析所揭示的。此外，作为该分析的结果，在于miR-130a控制下的基因中也发现了TGFβ和TGFBR1，这进一步证实了miR-130a与TGFβ在驱动具有生物活性的EV的促血管生成活性中的合作。
根据本发明，miR-130a核苷酸序列包含以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成：5’-CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU-3’(SEQ ID NO.1)。
在根据本发明的方法中，对EV组合物中miR-130a的定量优选通过基于核酸的扩增技术进行，更优选通过实时PCR进行。
在一个优选的实施方案中，通过实时PCR在EV组合物中评估的miR-130含量作为循环阈(threshold cycle，Ct)值测量。
通常来说，通过实时PCR进行的核酸定量依赖于将扩增信号(例如荧光)针对对数标尺上的循环数作图。如本文所用，术语“Ct值”是指在核酸扩增反应的指数期期间扩增信号达到高于背景水平的强度所需的PCR循环数。因此，Ct值与样品中最初存在的靶核酸的量成反比，即靶核酸的丰度越大，Ct值就越小。用于确定实时PCR反应中背景水平的方法是良好建立的并且是本领域技术人员已知的。
更具体地，本发明人观察到，在来自健康对象和患者的血清EV(serum EV，sEV)二者中作为Ct值测量的miR130a含量为Ct>30预示着促血管生成无效囊泡(如在体外效力测试中测量的<50％)。
因此，本发明方法中的EV组合物被确定为具有高于预定值的miR130a含量。优选地，本发明方法中的EV组合物被确定为作为Ct值测量的miR130a含量为Ct小于或等于35、更优选Ct小于或等于33、更优选Ct小于或等于30，甚至更优选Ct包括在10至29范围内，例如10、11、12、13、14、15、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29。
在一个优选的实施方案中，本发明的方法中的EV组合物被确定为作为Ct值测量的miR130a含量为Ct<30。
在一个优选的实施方案中，EV中miR-130a含量的量通过应用2-(ΔCt)法作为Ct值来确定，该方法基于允许计算样品的相对倍数基因表达的公式，如Livak KJ and SchmittgenTD,“Analysis of relative gene expression data using real-time quantitativePCR and the 2(-Delta Delta C(T))method”(2001)Methods 25:402–408中所述。如将在以下实施例中详细说明的，为了使用delta-delta Ct法，本发明人已经考虑了对所有受检查基因和持家基因测量的Ct值。由于整个分析是基于不同的持家基因，因此之前对所有持家基因Ct值求取了平均值(Human U&snRNA,RNU43snoRNA,Hm/Ms/RT U1 snRNA)。
在另一个优选的实施方案中，对EV中miR-130a含量的定量是通过使用已知量的miR-130a的标准曲线并借助于该标准曲线来***未知样品中通过实时PCR确定的Ct值来实现的。
虽然参考了实时PCR，但应理解在本发明的范围内可以使用本领域已知的其他核酸扩增方法。这样的方法包括但不限于基于核酸序列的扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)和数字PCR。
通过本发明人的研究，本发明人发现，将TGFβ含量低于预定值、优选低于23pg/1010EV的来自健康对象和患者的sEV二者预测为无促血管生成活性。
因此，本发明方法中的EV组合物被确定为TGFβ含量高于预定值，优选高于包含在20pg/1010EV至50pg/1010EV范围内的值，更优选高于23pg/1010EV至40pg/1010EV范围内的值，甚至更优选高于25pg/1010EV至35pg/1010EV范围内的值，例如25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35pg/1010EV。
在一个优选的实施方案中，本发明方法中的EV组合物被确定为具有至少23pg/1010EV的TGFβ含量。
根据本发明的方法，对EV中TGFβ蛋白的定量可以以任何合适的方式进行，例如蛋白质领域中已知的那些。
优选地，EV的TGFβ含量通过免疫测定来测量。可以采用任何合适的免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、化学发光免疫测定(chemiluminescence immunoassay，CLIA)、荧光免疫测定(fluorescent immunoassay，FIA)、放射免疫测定(radioimmunoassay，RIA)、沉淀免疫测定、粒子免疫测定、竞争性结合测定等。更优选地，本发明方法中采用的免疫测定是ELISA测定。显然，其选择落入本领域普通技术人员的技能范围内的任何类型的免疫测定形式的使用均在本发明的范围内。
在所有上述实施方案中，还优选的是EV来源于人细胞。
根据本发明方法的一个实施方案，EV组合物的促血管生成活性通过体外效力测试来量化，该体外效力测试涉及通过BrdU细胞增殖测定或管生成(tubulogenesis)体外测定，或者通过BrdU细胞增殖测定或管生成体外测定二者来测试EV。
在一个优选实施方案中，效力测试包括以下步骤：
-通过BrdU细胞增殖测定测量EV组合物的活性；
-通过BrdU细胞增殖测定测量阴性对照的活性；
-通过BrdU细胞增殖测定测量阳性对照的活性；
-通过应用以下公式计算所述BrdU细胞增殖测定中所述组合物的活性％：
根据该实施方案，本发明的方法还包括通过包括以下步骤的效力测试来量化所述EV组合物的促血管生成活性的步骤(d)：
-通过BrdU细胞增殖测定测试所述EV组合物以获得组合物值；
-通过BrdU细胞增殖测定测试阴性对照以获得阴性对照值；
-通过BrdU细胞增殖测定测试阳性对照以获得阳性对照值；
-通过应用以下公式计算所述BrdU细胞增殖测定中所述EV组合物的％促血管生成活性：
BrdU测定优选使用接种在基质胶(matrigel)中的HMEC细胞。在BrdU细胞增殖测定中，在阳性对照中添加血清(优选10％血清)。阴性对照是与阳性对照相同的培养基，但不添加血清。BrdU测定优选基于10000EV/靶细胞的浓度。
在另一个优选实施方案中，效力测试包括以下步骤：
-通过管生成测定测量EV组合物的活性；
-通过管生成测定测量阴性对照的活性；
-通过管生成测定测量阳性对照的活性；
-通过应用以下公式计算所述管生成测定中所述组合物的活性％：
根据该实施方案，本发明的方法还包括通过包括以下步骤的效力测试来量化所述EV组合物的促血管生成活性的步骤(d)：
-通过管生成测定测试所述EV组合物以获得组合物值；
-通过管生成测定测试阴性对照以获得阴性对照值；
-通过管生成测定测试阳性对照以获得阳性对照值；
-通过应用以下公式计算所述管生成测定中所述EV组合物的％促血管生成活性：
管生成体外测定优选使用HUVEC细胞。在管生成体外测定中，将VEGF、优选10ng/mlVEGF添加至阳性对照。阴性对照是与阳性对照相同的培养基，但不添加VEGF。管生成体外测定优选基于50000EV/靶细胞的浓度。
在一个更优选的实施方案中，使用BrdU细胞增殖测定和管生成体外测定二者来测试相对于阳性对照活性的给定EV组合物的活性，在这种情况下，将来自BrdU细胞增殖测定和管生成测定的平均活性值％进行比较。
根据该实施方案，本发明的方法还包括通过包括上述BrdU细胞增殖测定和管生成体外测定二者的效力测试来量化所述EV组合物的促血管生成活性的步骤(d)。
如果EV测量活性超过阳性对照测量活性的预定百分比，例如>阳性对照测量活性的50％，则受试EV制备物被认为是有活性的。
因此，本发明方法中的EV组合物优选被确定为具有至少50％的促血管生成活性。
此外，上述预测测试适用于筛选从体液的多种制备物中或从细胞培养物的条件培养基中分离的EV，以及鉴定促血管生成活性制备物用于进一步处理。
因此，本发明的第二方面是制备促血管生成胞外囊泡(EV)的制备物的方法，其包括以下步骤：
-从体液的多种制备物中或从细胞培养物的条件培养基中分离EV；
-以预定的EV浓度从分离的EV制备一个或更多个样品；
-用上述方法预测每个EV样品的促血管生成活性；
-选择其中miR-130a含量高于所述第一预定值并且TGFβ高于所述第二预定值的样品；以及任选地
-合并两个或更多个活性EV样品，
从而获得促血管生成EV的制备物。
来自健康供体或具有心血管风险因素的患者的血清或其他血液成分的EV能够在体外和体内诱导促血管生成信号，并且即使当合并sEV时，这种作用也不会消失。
如上所述，通过本发明人的研究，本发明人发现，将被确定为具有分别高于第一和第二预定值的miR-130a和TGFβ含量的EV组合物预测为具有强促血管生成特性。这些特征使它们特别适合用于治疗缺血性疾病、缺血性损伤和与心血管疾病风险相关的病理状况，或用于伤口愈合。
因此，本发明的第三方面是促血管生成胞外囊泡(EV)的制备物，其中所述制备物中通过实时PCR作为Ct值测量的miR-130a含量为Ct小于或等于35，并且TGFβ含量高于包含在20pg/1010EV至50pg/1010EV范围内的值，所述制备物用于受促血管生成治疗积极影响的疾病或损伤的治疗性治疗，或用于伤口愈合。
优选地，本发明的促血管生成EV制备物中的TGFβ含量高于包含在23pg/1010EV至40pg/1010EV范围内，更优选在25pg/1010EV至35pg/1010EV范围内的值，例如25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35pg/1010EV。
在一个优选的实施方案中，本发明的促血管生成EV制备物中的TGFβ含量为>23pg/1010EV。
优选地，本发明促血管生成EV制备物中通过实时PCR作为Ct值测量的miR-130a含量为Ct小于或等于33，更优选Ct小于或等于30，甚至更优选Ct包含在10至29的范围内，例如10、11、12、13、14、15、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29。
在一个优选的实施方案中，本发明的促血管生成EV制备物中通过实时PCR作为Ct值测量的miR-130a含量为Ct<30。
在一个更优选的实施方案中，在根据本发明的促血管生成EV制备物中，通过实时PCR作为Ct值测量的miR-130a含量为Ct<30并且TGFβ含量为>23pg/1010EV。
本发明的第四方面是如上文所限定根据本发明应用的促血管生成胞外囊泡(EV)的制备物，其可通过上述制备方法获得。
用根据本发明的EV制备物治疗的与心血管疾病风险相关的病症优选以血管重塑受损为特征，所述病症更优选为肥胖症、糖尿病、血脂异常或高血压。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的EV制备物适用于治疗选自以下的疾病：急性心肌梗死、急性脑血管疾病、急性和慢性外周动脉疾病、急性肾缺血、肥胖症和糖尿病。
胞外囊泡由许多不同的细胞类型(所谓的供体细胞)产生，并且普遍存在于生物流体以及细胞培养物或组织培养物中。因此，根据本发明，EV组合物可以从任何合适的细胞类型获得，优选从有核哺乳动物细胞获得，更优选从干细胞获得，甚至更优选从成体干细胞获得。
在本说明书的上下文中，表述“成体干细胞”旨在意指从成体组织分离的干细胞，与从胚泡的内细胞群分离的“胚胎干细胞”相反。成体干细胞也被称为“体细胞干细胞”。
根据一个替代实施方案，根据本发明应用的EV制备物从生物流体或从条件细胞或组织培养基中分离。
优选地，根据本发明应用的EV制备物从血液成分分离，更优选地从全血、血浆或血清(sEV)分离。
在一个实施方案中，促血管生成EV是从健康供体的血液捐赠物制备的。
在另一个实施方案中，促血管生成EV从患者的血液捐赠物，更优选地从具有心血管风险因素的患者制备。
在一个更优选的实施方案中，从具有心血管风险因素的患者的血液制备的促血管生成EV适合于用作治疗同一患者的药物。
此外，在所有上述实施方案中，本发明的制备物可以是药物制备物，其包含如上文所限定的促血管生成EV以及可药用的赋形剂和/或载体和/或稀释剂。载体、载剂或稀释剂以及任何其他赋形剂的选择落入本领域技术人员的技能范围内，尤其要考虑所选的药物剂型、施用途径和施用方案，以及患者的特征和待治疗的疾病。
通过以下实施例将更好地理解本发明，这些实施例仅以举例说明的方式提供并参考附图，其中：
图1示出了通过Nanosight进行的sEV表征的结果。(A)NTA分析的代表性图像，涉及单独的患者组。(B)表示NTA尺寸分布的点图图，具有每个个体对象(健康供体、肥胖症、糖尿病、糖尿病/肥胖症和缺血患者)的平均尺寸值。(C)报告了从来自单独的患者组的血清中回收的EV数量的直方图。D＝糖尿病；O＝肥胖症；OD＝肥胖症/糖尿病；IC＝缺血患者。肥胖症和缺血患者vs健康对象*p<0.05；(单因素ANOVA，随后是多重比较检验)(n＝9名患者/组)。
图2示出了来自健康供体和患者的血清EV的体外和体内促血管生成活性。(A)示出了响应于有效和无效sEV的血管形成的代表性显微照片。每个数字是指从个体对象制备的sEV(上图＝无效sEV；下图＝有效sEV)(每组n＝3，OD除外，同一样品在3次独立实验中使用)。(B)血管形成的体内定量分析结果。对于每种实验条件，在基质胶的10个切片中对血管进行计数。数据示出了未经处理的小鼠(C)(n＝3)或用以下EV制备物处理的小鼠中所计数的血管的平均数：来自健康供体的促血管生成无效sEV(i-sEV)、来自健康供体的促血管生成有效sEV(e-sEV)；来自糖尿病患者的促血管生成无效sEV(D i-sEV)，来自糖尿病患者的促血管生成有效sEV(D e-sEV)；来自肥胖症患者的促血管生成无效sEV(Oi-sEV)，来自肥胖症患者的促血管生成有效sEV(O e-sEV)；来自糖尿病/肥胖症患者的促血管生成无效sEV(OD i-sEV)，来自糖尿病/肥胖症患者的促血管生成有效sEV(OD e-sEV)；来自缺血患者的促血管生成无效sEV(IC i-sEV)，来自缺血患者的促血管生成有效sEV(IC e-sEV)。健康e-sEV vs健康i-sEV，*p<0.05；糖尿病e-sEV vs糖尿病i-sEV，§p<0.05；肥胖症e-sEV vs肥胖症i-sEV，#p<0.05；糖尿病/肥胖症e-sEV vs糖尿病/肥胖症i-sEV，°p<0.05；缺血e-sEV vs缺血i-sEV缺血，+p<0.05；(单因素ANOVA，随后是多重比较检验)。(每组n＝3，OD除外，同一样品在3次独立实验中使用)。(原始放大倍数：×200；比例尺：12μm)。
图3示出了sEV的促血管生成活性与其TGFβ含量相关。该图报告了从每个组(健康供体、糖尿病、肥胖症和缺血患者)的个体对象制备的血清EV样品获得的数据。对于每组患者，上面的曲线是指在sEV中测量的以pg/1010EV计的TGFβ含量，而下面的曲线是指在体外效力测试中测量的％促血管生成活性。虚线表示促血管生成有效和无效sEV的TGFβ>23pg/1010EV的截止值(cut-off)。每个数字对应于个体患者(每组n＝3)。
图4示出了sEV中miRNA表达谱分析的结果。(A)在来自个体患者和健康对象的促血管生成有效(黑圆圈)和无效(白圆圈)sEV中测量的miR-130a的Ct值的分布。结果报告为40-Ct。(B)与miR-130a正相关的途径的网络分析。数据通过DIANAmiRpath分析获得。仅选择包含至少15个基因的途径。
图5(A)miR-130a与mRNA靶标之间的网络分析。线表示IPA软件预测的基因与miR-130a之间的相互作用：间接相互作用(虚线)、直接相互作用(连续线)。方形包括TGFβ和TGFBR。圆圈包括参与血管生成的基因(KDR、EPHB6、ROCK1、HOXA5)。(B)接收者操作特征(Receiving Operating Characteristic，ROC)曲线和相应的曲线下面积(area under thecurve，AUC)，表明miR-130a和TGFβ具有区分促血管生成有效sEV和无效囊泡的预测能力。对于ROC分析，考虑了针对来自所有患者和健康对象的sEV获得的结果。AUC值以及标准误差、p值和阈值报告在ROC曲线下方的表格中。
实施例
1.方法
1.1患者
在本发明人进行的研究中，包含了具有心血管风险因素的三十六名患者和九名性别匹配的健康志愿者。具体地，对9名糖尿病患者(D：n＝9)、9名肥胖症患者(O：n＝9)、9名糖尿病和肥胖症患者(OD：n＝9)、以及9名缺血患者(针对下肢缺血经历手术治疗的患者)(IC：n＝9)进行了检查。所有糖尿病患者均未用胰岛素治疗。所有人实验均按照欧洲指南和政策进行，并得到意大利都灵大学伦理委员会(Ethical Committee of the University ofTurin,Italy)的批准。来自所有患者的血清在入院之后获得(D、O、OD)，并且对于缺血患者(IC)，在手术之前获得。获得所有患者的知情同意。来自健康供体(n＝9)的人血清在获得血库内部审查委员会(internal Review Board of the Blood Bank)知情同意和批准之后由都灵健康科学城血库(Blood Bank of“Cittàdella Salute e della Scienza diTorino”)提供。
1.2.研究批准
根据意大利国立卫生研究院实验动物护理和使用指南(Italian NationalInstitute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)(协议no：490/2105-PR)进行动物研究。根据欧洲实验动物科学协会联合会指南(Federation ofEuropean Laboratory Animal Science Association Guidelines)和都灵大学伦理委员会饲养小鼠。所有实验均根据相关指南和规定进行。
1.3.血清EV分离
通过静脉穿刺从健康和患者供体获得人血。从每个供体回收总共9ml血清/供体并将其储存在-80℃下。解冻之后，通过以100,000×g超速离心2小时来分离和纯化全部EV，然后以3000g离心以去除碎片。将沉淀物用PBS洗涤一次，并以100.000×g、4℃离心1小时。样品新鲜使用或在-80°下保存之后解冻使用。
1.4纳米粒追踪分析
使用配备有405nm激光器和NTA2.3分析软件的NanoSight LM10***(NanoSightLtd.，Amesbury，UK)通过纳米粒追踪分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)来分析sEV，以确定其尺寸和特征。所有采集均在相机级别设置为14的情况下完成，并且对于每个样品，记录了30秒持续时间的三个视频。将sEV在1ml无囊泡生理溶液(Fresenius Kabi，Runcorn，UK)中稀释(1:1000)。对采集后NTA设置进行优化并使其在样品之间保持恒定，并随后分析每个视频以测量EV尺寸、分布和浓度。
1.5 sEV血管生成测定
原代大血管内皮细胞(endothelial cell，EC)和微血管内皮细胞(HMEC)购自Lonza(Basel,Switzerland)并按照制造商的说明所描述的进行培养。体外血管生成效力测试和体内血管生成测试如先前所述进行(Cavallari C.et al,“Serum-derivedextracellular vesicles(EVs)impact on vascular remodeling and prevent muscledamage in acute hind limb ischemia”(2017)Sci Rep.7(1):8180)。简而言之，在整个体外研究中施用5×104sEV/靶细胞。使用BrdU和体外管生成测定来评价来自单一样品的sEV的促血管生成活性。根据50％的截止值％，所有分析组的EV被分类为促血管生成活性或无活性EV。
体内血管生成如先前所述通过测量血管的生长来评估(Lopatina T.et al,“Platelet-derived growth factor regulates the secretion of extracellularvesicles by adipose mesenchymal stem cells and enhances their angiogenicpotential”(2014)Cell Commun Signal.12:26)。简而言之，将EC(1×106个细胞/注射)与sEV(5×1010EV每1×106EC)一起孵育过夜。然后皮下注射雄性重症联合免疫缺陷(severecombined immunodeficiency，SCID)小鼠(6周龄)。相同数量的未刺激EC用作阴性对照。在第7天回收基质胶栓并固定，并使用三色染色方法对其进行染色。如先前所述确定血管腔面积(Lopatina T.et al,“Platelet-derived growth factor regulates the secretionof extracellular vesicles by adipose mesenchymal stem cells and enhancestheir angiogenic potential”(2014)Cell Commun Signal.12:26)。
1.6 TGFβELISA测定
使用固相夹心酶联免疫吸附测定(ELISA，Invitrogen Multispecies TGF-β1试剂盒，Germany)根据制造商的说明测量从健康对象和患者的血清样品中分离的EV中的TGFβ含量。对包含1×1011EV的样品一式三份地进行实验。测定中获得的有色产物的强度用ELISAiMarkTM微孔板吸光度读取仪(Bio Rad，Switzerland)确定，其在450nm处具有吸光度。EV制备物中存在的TGFβ的浓度以pg/1010EV表示。
1.7 miRNA表达谱
使用miRNome微RNAProfilers QuantiMir(SBI，System Biosciences)，根据制造商推荐的方案，通过对1140个微RNA进行的实时PCR来评估sEV中包含的miRNA(所谓的miRNome)的表达谱。该试剂盒包括在预格式化的板中对人微RNA的测定，其中每个板上有三个内源性参考RNA作为归一化信号(人U6 snRNA、核仁小RNARNU43和Hm/Ms/Rt U1snRNA)。
简而言之，使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，California，USA)使100ng RNA逆转录。所有qRT-PCR反应均在StepOnePlusTM实时PCR***上在以下条件下进行：95℃下15’(PCR初始激活步骤)，随后是3步循环(94℃下15”，55℃下30”，70℃下30”)，持续40个循环。在筛选中，miRNome针对从健康对象血清收集的sEV进行谱分析，这些sEV已通过上述效力测试被评估为具有促血管生成活性(n＝3)和促血管生成无活性(n＝3)。对于每个所分析的sEV样品，推测了miRNA的Ct值。代表来自有效和无效sEV群体二者的不同样品(n＝3)的Ct平均值的Ct相对于内源性参考RNA进行归一化，并转换为2-(ΔCt)值(Livak KJ and Schmittgen TD,“Analysis of relative gene expression datausing real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))method”(2001)Methods 25:402–408)。
使用miScript SYBRGreen PCR试剂盒(Qiagen，Valencia，CA，USA)对来自健康供体和患者的sEV进行miRNA验证。简而言之，使用miScript逆转录试剂盒使从sEV样品中分离的100ng输入RNA逆转录，并将由此获得的cDNA用于检测和量化目的miRNA。如制造商的方案(Qiagen)所述的，使用每个反应3ng cDNA一式三份地运行实验。在所有患者来源的sEV中筛选了以下miRNA：miR-126(SEQ ID NO.2)、miR-21(SEQ ID NO.3)、miR-296-3p(SEQ IDNO.4)、miR-210(SEQ ID NO.5)、miR-130a(SEQ ID NO.1)、miR-27a(SEQ ID NO.6)、miR-29a(SEQ ID NO.7)、miR-191(SEQ ID NO.8)。使用RNU6B和RNU43参考基因作为内部对照对通过qRT-PCR获得的扩增数据进行归一化。显示靶序列和内源性对照的扩增效率大致相等。
1.8 miRNA EV内容物的途径及靶标预测分析
为了进行EV miRNA靶标预测和生物途径富集分析，使用了基于网络的程序DIANAmirPath(Collino F.et al,“Exosome and Microvesicle-Enriched FractionsIsolated from Mesenchymal Stem Cells by Gradient Separation Showed DifferentMolecular Signatures and Functions on Renal Tubular Epithelial Cells”(2017)Stem Cell Rev.(2):226–43)。选择算法microT-CDS来使用默认阈值(microT＝0.8)预测EV来源的miRNA靶标。只有对所有已知的京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes，KEGG)途径显示出P值<0.01的生物途径才被认为是显著富集的。Ingenuity IPA途径分析用于预测miR-130a的靶基因。本发明人在IPA(Qiagen:http://www.qiagen-bioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/)上设置了miRNA靶标过滤器工具以将miR-130a与预测的mRNA靶标相关联。
1.9 ROC分析
被视为参考标准(Reference Standard，RS)的两个研究组“真正的促血管生成活性sEV”/“真正的促血管生成无活性sEV”的主要数据以平均值、标准差(SD)、中位值和95％置信区间表示。为了评价miR-130a和TGFβ的可预测性，使用ROC曲线评价了RS的实现(GrundB and Sabin C.“Analysis of biomarker data:logs,odds ratios,and receiveroperating characteristic curves”(2010)Curr Opin HIV AIDS 5(6):473–9)。基于作为Ct值测量的miR-130a含量和以pg/1010EV计测量的TGFβ含量，将sEV组合物分为以下类别：
1.显示miR-130a Ct值≥30的sEV被认为是促血管生成无效sEV；
2.显示TGFβ含量<23pg/1010EV的sEV被认为是促血管生成无效sEV。
为了基于预测RS中定义的“真正的促血管生成无活性sEV”的上述测量的ROC曲线分析来评价截止值评分的“优度”，分别评价了两种测量中每一种的预测能力，以及通过以“串联(series)”方法组合两种测量评价了预测能力(将对于两种测量均是促血管生成无效的sEV视为“促血管生成无效sEV”，并且将对于两种测量中的至少一种是“非促血管生成无效sEV”的囊泡视为“非促血管生成无效sEV”)。
该分析基于灵敏性(Se)、特异性(Sp)和正似然比(LH+)[“真正的促血管生成无效sEV”与“真正的促血管生成有效sEV”相比被鉴定为“促血管生成无效sEV”的概率]和相对95％置信区间值。
1.10统计分析
使用GraphPad Prism 6.0Demo程序分析数据。除非另有报告，否则将结果表示为平均值±SD或±SEM。使用单因素ANOVA随后是Tukey’s事后或多重比较、学生t检验(对于2个组比较)和Newman-Keuls多重比较检验(在合适的时候)进行统计分析。统计显著性的截止值设置为p<0.05(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。
2.结果
2.1血清EV的表征
在本发明人进行的研究中，检查了来源于健康个体的sEV的9个样品和来源于患者组群的sEV的36个样品的数量和尺寸。sEV尺寸的分布在健康个体和患者之间没有显示出任何显著差异(图1A和B)。观察到的平均粒径为约138nm。患者中的sEV数量高于健康对象(图1C)。在肥胖症和缺血患者中检测到显著更高的sEV水平(图1C)。
2.2来源于患者的血清EV的促血管生成活性
为了在体外评价来源于不同患者组的sEV的血管生成活性，如上文实施例1.3中所述进行了效力测试。显示出平均值超过50％的sEV组合物被认为是促血管生成活性的。
血管生成效力测试的结果在体内使用来自不同患者组的促血管生成有效和无效sEV进行验证(图2A-B)。
2.3 sEV中TGFβ含量及其血管生成潜力
为了研究sEV中的TGFβ含量是否可以导致其血管生成潜力，本发明人对从健康对象和患者(糖尿病、肥胖症、糖尿病/肥胖症和缺血患者)的血清样品中分离的EV进行了ELISA测定。如图3所示，sEV组合物中所测量的TGFβ含量与患者组群以及健康供体中这些囊泡的促血管生成潜力显著相关。基于以下观察结果：TGFβ含量<23pg/1010EV的EV更有可能是促血管生成无活性的，确定了区分促血管生成有效EV和无效囊泡的截止值，其对应于23pg/1010EV的TGFβ浓度。
2.4 sEV的miRNome谱
本发明人对来自健康供体(每个供体3个样品)的促血管生成有效和无效sEV进行的miRNome分析导致鉴定了表达差异最大的8种血管-miRNA：miR-126、miR-21、miR-296-3p、miR-210、miR-130a、miR-27a、miR-29a、miR-191。特别地，在具有促血管生成能力的sEV中，miR-126、miR-130a、miR-27a和296-3p上调，而miR-21、miR-29a、miR-191和miR-210下调。
为了研究所观察到的EV中miRNA表达水平的差异是否与其功能活性相关，本发明人通过对来源于个体健康供体和患者的sEV中所选miRNA的表达与通过体外效力测试测量的这些囊泡的促血管生成活性水平进行比较，进行了研究。通过实时PCR进行表达分析(截止Ct值30)。如图4A所示，在来自个体对象(健康供体和患者)的EV中所测量的miR-130a的Ct值分布与对这些EV样品进行的血管生成效力测试的结果显著相关。特别地，观察到作为Ct值测量的miR130a含量为Ct>30的EV具有更高的是促血管生成无效的可能性。
令人感兴趣的是，本发明人还发现来源于患者的sEV中miR-210富集，如先前在Shalaby SM.et al,“Serum miRNA-499and miRNA-210:Apotential role in earlydiagnosis of acute coronary syndrome”IUBMB Life.2016；68(8):673–82中所述的。然而，在sEV的miR-210含量与这些囊泡的促血管生成活性之间没有检测到显著相关性。
通过选择涉及至少15个基因的途径，使用miR-130a询问DIANAmirpath分析。再次，尤其检测到参与TGFβ途径的基因的显著富集(图4B)。
通过IPA预测miR-130a靶基因的网络鉴定了与血管生成过程密切相关的数个基因，例如KDR、HOXA5、ROCK1、EPHB6(图5A)。此外，在miR-130a相互作用物中发现了TGFβ和TGFBR1基因。总的来说，上述结果还支持了TGFβ信号传导途径在sEV介导的作用机制中的贡献。
2.5 sEV中的miR-130a和TGFβ含量代表了鉴定“真正的促血管生成无效”sEV的有
价值的预测标志物。
本发明人进行了接受者操作特征(ROC)分析以评估sEV中的miR-130a和TGFβ含量是否具有区分显示出促血管生成能力的sEV和无效囊泡的预测能力。从图5B所示的ROC曲线推断，miR-130a和TGFβ二者都是通过RS鉴定的“真正的促血管生成无效sEV”的良好预测度量，其显示出统计学上显著的AUC值。
两种测量都显示出良好的灵敏性，以将通过RS鉴定的“真正的促血管生成无效sEV”鉴定为“促血管生成无效的”。这是尤其明显的并通过以下进一步强调：对于miR-130a(Se＝0.94，IC 95％，0.73至0.99)和对于TGFβ(Se＝0.88，IC 95％，0.66至0.97)，LH+＝1.88、IC 95％、1.49至2.27。然而，检测到两种测量的低特异性值(miR-130a：Sp＝0.50；TGFβSp＝0.64)。
通过“串联”地组合两种测量，即在两种测量中将那些被定义为“促血管生成无效”的sEV视为“促血管生成无效”，检测到良好的灵敏性水平和提高的特异性值(Sp＝0.75；Se＝0.82)。下表1中报告的LH+值进一步支持了这些结果。
表1
“串联”地组合miR-130a和TGFβ1的测试。“串联”地组合两种测量获得的值的列表(将在miR-130a和TGFβ1测量二者中被定义为“促血管生成无效”的sEV视为“促血管生成无效”)。
Claims (23)
1.预测胞外囊泡(EV)组合物是否具有促血管生成活性的方法，其包括以下步骤：
(a)量化所述EV组合物中的miR-130a微RNA含量，以及
(b)量化所述EV组合物中的转化生长因子β(TGFβ)含量；
(c)确定miR-130a含量是否高于第一预定值以及TGFβ含量是否高于第二预定值，
其中：
当所述miR-130a含量高于所述第一预定值并且所述TGFβ含量高于所述第二预定值时，则预测所述EV组合物为具有促血管生成活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中通过实时聚合酶链反应(实时PCR)将所述miR-130a含量量化为Ct值，并且其中所述miR-130a含量与所述Ct值之间存在负相关。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一预定值是＜30的Ct值。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述TGFβ含量通过免疫测定，优选地通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来测量。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第二预定值是23pg/1010EV的TGFβ量。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其还包括通过效力测试来量化所述EV组合物的促血管生成活性的步骤(d)，其包括以下步骤：
-通过BrdU细胞增殖测定测试所述EV组合物以获得组合物值；
-通过BrdU细胞增殖测定测试阴性对照以获得阴性对照值；
-通过BrdU细胞增殖测定测试阳性对照以获得阳性对照值；
-通过应用以下公式计算所述BrdU细胞增殖测定中所述EV组合物的％促血管生成活性：
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其还包括通过效力测试来量化所述EV组合物的促血管生成活性的步骤(d)，其包括以下步骤：
-通过管生成测定测试所述EV组合物以获得组合物值；
-通过管生成测定测试阴性对照以获得阴性对照值；
-通过管生成测定测试阳性对照以获得阳性对照值；
-通过应用以下公式计算所述管生成测定中所述EV组合物的％促血管生成活性：
8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其还包括通过包括根据权利要求6所述的BrdU细胞增殖测定和根据权利要求7所述的管生成体外测定二者的效力测试来量化所述EV组合物的促血管生成活性的步骤(d)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述EV组合物被确定为具有至少50％的促血管生成活性。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述EV来自人细胞。
11.制备促血管生成胞外囊泡(EV)的制备物的方法，其包括以下步骤：
-从体液的多种制备物中或从细胞培养物的条件培养基中分离EV；
-以预定的EV浓度从所分离的EV制备一个或更多个样品；
-用根据权利要求1至10中任一项所述的方法预测每个EV样品的促血管生成活性；
-选择其中miR-130a含量高于所述第一预定值并且TGFβ高于所述第二预定值的样品；以及任选地
-合并两个或更多个活性EV样品，
从而获得促血管生成EV的制备物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中通过实时PCR将所述miR-130a含量量化为Ct值并且所述第一预定值是＜30的Ct值。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述第二预定值是23pg/1010EV的TGFβ量。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其中所述EV制备物被确定为具有至少50％的促血管生成活性。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的方法，其中所述EV来自人细胞。
16.可通过根据权利要求11至15中任一项所述的方法获得的促血管生成胞外囊泡(EV)的制备物，其中所述制备物中通过实时PCR作为Ct值测量的miR-130a含量为Ct＜30，并且所述制备物中的TGFβ含量为>23pg/1010EV，所述制备物用于受促血管生成治疗积极影响的疾病或损伤的治疗性治疗，或用于伤口愈合。
17.促血管生成胞外囊泡(EV)的制备物，其通过实时PCR作为Ct值测量的miR-130a含量为Ct<30和/或TGFβ含量为>23pg/1010EV，其用于受促血管生成治疗积极影响的疾病或损伤的治疗性治疗，或用于伤口愈合。
18.根据权利要求16或17所述的制备物，其中所述EV制备物具有至少50％的促血管生成活性。
19.根据权利要求16至18中任一项所述应用的制备物，其中所述EV来源于生物流体或者条件细胞或组织培养基。
20.根据权利要求19所述应用的制备物，其中所述生物流体是全血、血浆或血清。
21.根据权利要求20所述应用的制备物，其中所述EV由健康供体的血清或具有心血管风险因素之患者的血清制备。
22.根据权利要求16至21中任一项所述应用的制备物，其中所述疾病或损伤是血管疾病或损伤，或与心血管疾病之风险相关的病症。
23.根据权利要求16至22中任一项所述应用的制备物，其中所述疾病或损伤选自急性心肌梗死、急性脑血管疾病、急性和慢性外周动脉疾病、急性肾缺血、肥胖症和糖尿病。
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