CN112921001A - 含高表达nampt蛋白的外泌体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种含高表达NAMPT蛋白的外泌体及其制备方法和应用，属于生物技术领域。本发明通过将体外合成的NAMPT mRNA转染入iPS细胞中的方法获得一种含高表达NAMPT蛋白的外泌体，该外泌体中NAMPT蛋白含量是普通iPS细胞分泌的外泌体中NAMPT蛋白含量的2倍以上，且该含高表达NAMPT蛋白的外泌体相对于普通iPS细胞分泌的外泌体能够显著改善衰老细胞情况，并对神经元有显著的保护作用。

Description

含高表达NAMPT蛋白的外泌体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种含高表达NAMPT蛋白的外泌体及其制备方法和应用。
背景技术
烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamide phosphoribosyltransferase，NAMPT)在体内有两种存在形式，细胞内NAMPT和细胞外NAMPT(eNAMPT)。其中细胞内NAMPT催化烟酰胺与5-磷酸核糖基-1焦磷酸盐缩合生成烟酰胺单核苷酸，是合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)补救途径的一种限速酶，而细胞外NAMPT在细胞内经表达后，随着外泌体(是包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯)排至细胞外，同时具有多种细胞因子的功能。研究表明，NAMPT控制了NAD的生物合成及下游分子NAD依赖的组蛋白去乙酰化酶沉默信息调节因子1(Sirtuin-1,SIRT1)的活性，在细胞增殖、分化、凋亡、肿瘤、衰老和代谢中均有重要作用。
近期研究发现(Yoshida,M.等(2019).Extracellular Vesicle-ContainedeNAMPT Delays Aging and Extends Lifespan in Mice.Cell Metab 30,329-342e325.)，以外泌体方式对老年小鼠补充一种来自于青年小鼠的酶eNAMPT，可以使老年小鼠通过增强eNAMPT的方式提升β-烟酰胺单核苷酸的合成能力，表现出体力活动、睡眠质量、认知功能、葡萄糖代谢和神经功能的显著改善。并有研究表明外泌体可以透过血脑屏障进入大脑，使利用外泌体作为载体递送药物进入大脑成为可能。然而，现有含有NAMPT蛋白的外泌体的获得方式为细胞自分泌，获取量有限；并且人体内外泌体中NAMPT蛋白的含量会随年龄增大而减少。
发明内容
针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明一个方面提供一种含高表达NAMPT蛋白的外泌体，其由高表达NAMPT蛋白的iPS细胞分泌所得，且所述外泌体中的NAMPT蛋白含量为普通的iPS细胞分泌的外泌体中NAMPT蛋白含量的2倍以上；所述高表达NAMPT蛋白的iPS细胞通过将体外合成的NAMPT mRNA转染入iPS细胞获得。
上述的含高表达NAMPT蛋白的外泌体还包含DNA、RNA、蛋白质和脂质等物质。
上述含高表达NAMPT蛋白的外泌体的粒径为30～150nm，表面标志物中CD9占比≥60％，CD63占比≥25％。
本发明另一方面还提供上述的含高表达NAMPT蛋白的外泌体的制备方法，包括以下步骤：
T1：以NAMPT基因的编码序列为模板体外合成NAMPT mRNA；
T2:将T1合成的NAMPT mRNA转染入iPS细胞中，获得高表达NAMPT蛋白的iPS细胞；
T3：培养步骤T2获得的高表达NAMPT蛋白的iPS细胞，获得含高表达NAMPT蛋白的外泌体。
上述方法中，步骤T1中，所述NAMPT基因的编码序列为使用PCR引物扩增获得，其中所述PCR引物的正向引物为序列表中SEQ ID NO:2所示；反向引物为序列表中SEQ ID NO:3所示。
上述方法中，步骤T3的具体操作为：每天换入新鲜的iPS细胞培养液培养高表达NAMPT蛋白的iPS细胞，收集换出的培养液，从换出的培养液中分离纯化获得含高表达NAMPT蛋白的外泌体。
上述方法中，所述分离纯化的方法选自差速离心法、超滤离心法、密度梯度离心法、沉淀法、磁珠免疫法、PS亲和法、色谱法中的任一种或其组合。
上述的含高表达NAMPT蛋白的外泌体在制备改善衰老细胞情况、改善神经元细胞生长状态与放电协同性、保护神经元或治疗或者改善神经退行性疾病的药物中的应用也属于本发明的内容。
本发明还提供一种改善衰老细胞的药物，其包含上述的含高表达NAMPT蛋白的外泌体。
本发明还提供一种保护神经元的药物，其包含上述的含高表达NAMPT蛋白的外泌体。
基于以上技术方案，本发明通过将体外合成的NAMPT mRNA转染入iPS细胞中的方法可以获得一种含高表达NAMPT蛋白的外泌体。该外泌体为天然膜泡，可以被人皮肤成纤维细胞、脐带间充质干细胞和神经元细胞摄入细胞内，相对于未过表达NAMPT蛋白的iPS细胞(普通的iPS细胞)分泌的外泌体能够显著改善细胞的衰老情况、改善细胞的生长状态，并对神经元有显著的保护作用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明通过将体外合成的NAMPTmRNA转染入iPS细胞中的方法获得的含高表达NAMPT蛋白的外泌体中NAMPT蛋白的含量是普通iPS细胞分泌的外泌体中NAMPT蛋白含量的2倍以上，因此通过本发明的方法可以获得显著高表达NAMPT蛋白的外泌体，并且由于是通过体外培养iPS细胞获得，因此可以大规模生产该高表达NAMPT蛋白的外泌体，可以为制备改善细胞的衰老情况、改善细胞的生长状态以及保护神经元等的药物提供充足的高表达NAMPT蛋白的外泌体来源。
附图说明
图1为外泌体溶液中粒子浓度与粒径大小分布关系图；
图2为纳米流式检测外泌体表面标志物CD9与CD63的直方图；
图3为外泌体溶液的NAMPT蛋白的western blot检测结果，其中A幅为外泌体溶液的NAMPT蛋白的western blot胶图，B幅为外泌体溶液的NAMPT蛋白含量统计柱状图；
图4为外泌体的电镜照片；
图5为人皮肤成纤维细胞(A幅和B幅)、脐带间充质干细胞(C幅和D幅)和神经元细胞(E幅和F幅)摄入外泌体的Hoechst 33342荧光染色照片；
图6为衰老细胞中衰老标志β-Gal的检测图片，其中A幅表示自然衰老的皮肤成纤维细胞(P10)，B幅表示自然衰老的皮肤成纤维细胞(P10)中加入含高表达NAMPT蛋白的外泌体处理，C幅表示向自然衰老的皮肤成纤维细胞中加入普通iPS分泌的外泌体处理；
图7为神经元细胞死亡率统计柱状图。
具体实施方式
针对现有技术中存在的外泌体中NAMPT蛋白表达量较低的缺陷，本发明提供一种含高表达NAMPT蛋白的外泌体及其制备方法和应用。
由于蛋白质在细胞内表达后在体内一般有两种存在形式，细胞内蛋白质和细胞外蛋白质(例如蛋白质在细胞内经表达后，随着外泌体排出至细胞外)，并且排出至细胞外的外泌体所包裹的蛋白质、DNA、RNA和脂质等物质都是随机的，因此如何获得一种含高表达的目的蛋白质的外泌体一直是本领域技术人员所面临的难题。虽然通过mRNA转染或慢病毒感染等方式可以将目的基因转染入宿主细胞内并可以在宿主细胞内高表达，但是经过高表达后的目的蛋白质是成为细胞内蛋白质，还是随着外泌体排出至细胞外成为细胞外蛋白质，其命运和功能均是未知的，也不能毫无疑义获得一种含高表达的目的蛋白质的外泌体。然而，发明人惊讶发现，当采用mRNA转染的方式将体外合成的NAMPT蛋白的mRNA转染入iPS细胞后，在iPS细胞内经过高表达获得的NAMPT蛋白会随着外泌体一起排出细胞外，从而可以获得一种含高表达NAMPT蛋白的外泌体，实施例中显示该外泌体中的NAMPT蛋白含量是普通的iPS细胞分泌的外泌体中的NAMPT蛋白含量的2倍以上。实施例中还进一步证明了获得的含高表达NAMPT蛋白的外泌体在改善衰老细胞情况和保护神经元方面均显著优于普通iPS细胞分泌的外泌体。因此，本发明获得了一种含高表达NAMPT蛋白的外泌体，并且证明了该外泌体在改善衰老细胞情况和保护神经元方面具有更优的效果。
本发明中使用的术语“外泌体”是指含有DNA、RNA、蛋白质和脂质等物质的纳米囊泡，由大多数细胞分泌，分布在人体各种体液中，调节各种细胞进程。
本发明中使用的术语“iPS细胞”是成体细胞(例如皮肤细胞、血细胞等)经过重编程(例如通过过表达特定基因，如Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc等)等方法得到的类似胚胎干细胞的多能干细胞，且具有无限增殖特性。iPS细胞拥有与胚胎干细胞相似的分化潜力，能够分化成多种组织和器官。但与胚胎干细胞相比，iPS细胞的获得方法相对简单(如取自皮肤、血液的细胞并重编程得到)，并且避开了伦理问题，理论上每个人都可以得到自体的iPS细胞，由自体的iPS细胞分泌的外泌体比异体来源的外泌体更加安全。
本发明中使用的术语“普通的iPS细胞”是指按照常规的诱导方法(例如重编程)获得iPS细胞后，未经任何其他处理的细胞，其为未过表达NAMPT蛋白的iPS细胞。
本发明将通过以下具体实施方式详细说明本发明内容。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但不应作为对本发明内容的限制。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1：体外合成NAMPT mRNA制备含高表达NAMPT蛋白的外泌体
1.1、目的基因的克隆
1.1.1、引物设计
该步骤为了将人NAMPT基因(全称：nicotinamide phosphoribosyltransferase，基因库中的检索号为NP_005737)的PCR产物的5’端加上T7启动子(TAATACGACTCACTATAGGG，SEQ ID NO:1)，3’端加上多聚A尾，由生工生物工程有限公司合成以下引物对：
Forward Primer(正向引物)：
5’-GCATGATAATACGACTCACTATAGGGAGTCCACCATGGATGAATCCTGCGGCAGAAG-3’(SEQID NO:2)；
Reverse Primer(反向引物)：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTAATGATGTGCTGCTTCC-3’；(SEQ ID NO:3)
该步骤设计得到的引物对用于以下步骤中用于获得5’端带有T7启动子，3’端带有多聚A尾的NAMPT基因PCR产物。
1.1.2、NAMPT基因的克隆
将人NAMPT基因的编码序列从购买的人cDNA文库(购自Thermofisher公司)中PCR扩增出来，利用
Figure BDA0002871753660000051
High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer(购自NEWENGLAND BioLabs，货号M0532S)，按照说明书方法配制PCR体系，如下表1所示，并按照下表2所示的PCR程序进行扩增，获得PCR产物。
表1：NAMPT基因的扩增PCR体系
Figure BDA0002871753660000052
表2：NAMPT基因的扩增PCR程序
Figure BDA0002871753660000053
将PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳，将单一目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，用QIAquick Gel Extraction Kit(胶回收试剂盒)(购自QIAGEN公司，货号28704)按照说明书纯化NAMPT目的产物，得到用于体外合成mRNA的模板(NAMPT DNA)。
1.2、NAMPT mRNA的体外合成与纯化
该步骤中目的基因mRNA的合成过程即是纯化的NAMPT PCR扩增产物进行体外转录(In vitro transcription，IVT)的过程，具体为：
加帽反应：先使用HiScribeTMT7 ARCA(anti-reverse cap analog，抗-反向帽类似物)mRNA试剂盒(购自New England Biolabs)，并按照其使用说明中所提供的试剂，以上述步骤1.1.2中得到的模板NAMPT DNA为原料37℃反应2h，以在体外合成NAMPT mRNA，并同时在mRNA的5’端加上一个7-甲基鸟苷帽结构(即进行ARCA加帽反应)，然后加入2μl DNase I(脱氧核糖核酸酶I，HiScribeTMT7 ARCA mRNA试剂盒中附带的)37℃反应15min，降解模板DNA终止反应，得到5’末端加了一个7-甲基鸟苷帽结构的NAMPT mRNA，mRNA体外合成和ARCA加帽反应的反应体系见下表3。
表3：mRNA体外合成和ARCA加帽反应的反应体系
Figure BDA0002871753660000061
加尾反应：在加帽反应完成后，在加帽反应体系的基础上按下表4所列获得加尾反应体系，37℃反应45min，以在加帽后的NAMPT mRNA 3’末端加上一个Poly(A)尾(即进行Poly(A)加尾反应)，即得到5’末端加了一个7-甲基鸟苷帽结构、3’末端加了一个Poly(A)尾的NAMPT mRNA。
表4：Poly(A)加尾反应的反应体系
加尾反应体系 50μl
ARCA加帽反应后的反应体系 20μl
10倍Poly(A)聚合酶反应缓冲液 5μl
Poly(A)聚合酶 5μl
无核酸酶水 20μl
目的基因mRNA的纯化：使用MEGAclear试剂盒(购自Thermo Fisher Scientific)按使用说明纯化ARCA加帽反应和加尾反应完成后的反应体系(其中含有5’末端加了一个7-甲基鸟苷帽结构、3’末端加了一个Poly(A)尾的NAMPT mRNA)，得到NAMPT mRNA。
1.3：诱导高表达NAMPT蛋白外泌体及其纯化
1.3.1、iPS细胞的培养
使用Essential 8TMMedium试剂盒(购自thermo fisher，货号：A1517001)，按照该试剂盒的技术手册对iPS细胞进行扩增培养，至对数生长期且状态良好。随后按照TrypLETMSelect试剂盒(购自thermo fisher，货号：12563029)说明书消化成单细胞，然后将其铺在GFR基质胶(购自Corning公司(康宁公司)的
Figure BDA0002871753660000071
Growth FactorReduced(GFR)Basement Membrane Matrix,*LDEV-Free，货号356230)包被的12孔培养板中，6×105细胞/孔，贴壁后覆盖率达到60-70％，37℃，95％空气和5％CO2条件下培养过夜。如果iPS细胞贴壁状况良好，加入0.5μg上述步骤1.2得到的NAMPT mRNA转染iPS细胞。
1.3.2、NAMPT mRNA转染iPS细胞
用NAMPT mRNA转染细胞的具体过程如下：
①将
Figure BDA0002871753660000072
3000转染试剂(L3000001，购自Thermo Fisher Scientific)和Opti-MEMTM培养基(31985062，购自Thermo Fisher Scientific)恢复至室温；
②在96孔板的孔1中加入50μl Opti-MEMTM培养基、0.5μg NAMPT mRNA(实施例1中步骤1.2获得)、1.5μl室温的P3000试剂(
Figure BDA0002871753660000073
3000转染试剂盒中提供)，混匀得到混合液；
③在96孔板的孔2中加入50μl Opti-MEMTM培养基，1.5μl室温的
Figure BDA0002871753660000074
3000转染试剂，混匀得到混合液；
④将步骤②的混合液加入步骤③的混合液，在室温孵育15分钟；
⑤将步骤④孵育后的混合液均匀加入步骤1.3.1和1.3.2中的12孔培养板中，培养板中盛有贴壁良好、传代完成的细胞，混匀后37℃培养。
1.3.3、含高表达NAMPT蛋白的外泌体的纯化
该步骤采用差速离心法(还可以采用超滤离心法、密度梯度离心法、沉淀法、磁珠免疫法、PS亲和法、色谱法等)收集iPS细胞培养上清中的外泌体，差速离心法是最常用的外泌体纯化手段，先以低速离心除去死亡细胞和细胞碎片，再通过高速离心将外泌体颗粒从可溶性分子如游离蛋白质和蛋白质复合物中沉淀并纯化出来。随后用PBS清洗一次外泌体，以减少其中游离的残存蛋白。此外，所有离心步骤必须在4℃下进行，借此来保持蛋白酶、DNase和RNases处于非活性状态。具体方法如下：
对上述步骤1.3.2中转染了NAMPT mRNA的iPS细胞进行培养(使用Essential8TMMedium试剂盒，按照该试剂盒的说明书中提供的方法培养iPS细胞)，每天换入新鲜的iPS细胞培养基，收集换出的培养液，连续收集2天至覆盖率达到95％-100％为止。取收集得到的iPS细胞培养液，2000g离心10min，去除沉淀的死细胞。剩下上清继续提高离心力到15000g，4℃离心20min，去除沉淀的细胞碎片。处理好后的上清继续进行超速离心步骤，以120,000g的离心力，4℃离心70min，得到含有少量杂蛋白的粗制外泌体沉淀。用PBS重悬外泌体沉淀，再次120,000g，4℃离心70min，用适量体积PBS重悬外泌体沉淀，即可得到纯净的外泌体溶液，其中所得沉淀即为纯化后的外泌体颗粒所形成。
实施例2：外泌体的鉴定和分析
该实施例利用上述实施例1获得的外泌体溶液分别进行粒径分析、western blot和电镜分析鉴定，以确定获得了NAMPT蛋白外泌体，并对其表达量进行定量分析。
2.1、外泌体粒径分析
取20μl(或适量体积)上述实施例1获得的外泌体溶液，用PBS稀释至500μl，放入仪器Zetaview(品牌：Particle Metrix)中，按照仪器技术手册操作，得到外泌体溶液的粒子浓度及大小分布图。
如图1所示，示出了实施例1获得的外泌体溶液的粒子浓度与粒径大小分布的关系图，可见外泌体溶液中粒径大小为80-110nm范围内(尤其是98nm(在30-150nm的范围内))的粒子的浓度最高，符合iPS细胞分泌的外泌体的粒子粒径大小的范围，证明获得了外泌体。
2.2、纳米流式检测外泌体表面标志物
在10μg上述实施例1获得的外泌体溶液中加入1μl抗体(CD9抗体或CD63抗体)。加入抗体后将离心管盖紧，涡旋振荡器混匀1min，再37℃避光孵育30min；向孵育后的外泌体-抗体复合物中加入1mL的1×PBS混匀，按照上述实施例1中步骤1.3.3中的外泌体分离方法再次提取外泌体以去除游离染料；取100μL 1×PBS重悬沉淀物，沉淀即为标记后的外泌体；标记后的外泌体进行纳米流式检测。
结果如图2所示，为纳米流式检测外泌体表面标志物CD9与CD63的直方图，可见标记后的外泌体表面标志物中CD9和CD63阳性颗粒占总颗粒数的比例分别是62.5％和27.2％，证明确实获得了外泌体。当获得的外泌体的纯度越高时，用于纳米流式检测时所获得的外泌体表面标志物中CD9和CD63阳性颗粒占总颗粒数的比例就会越高。
2.3、Western Blot鉴定外泌体及检测NAMPT蛋白的表达量
①按照RIPA裂解液试剂盒(购自Thermo Scientific，货号89901)的说明书对上述实施例1获得的外泌体溶液和普通iPS细胞分泌的外泌体溶液(收集方法为：对iPS细胞进行扩增培养至覆盖率达到70-80％且状态良好时，每天换入新鲜的iPS细胞培养液，收集换出的培养液，连续收集2-3天至细胞覆盖率达到95％-100％为止)进行裂解并提取蛋白质；
②按照BCA蛋白定量试剂盒(购自Thermo Scientific，货号23227)的说明书对得到的外泌体样品分别进行蛋白定量检测；
③使用RIPA裂解液调整样品浓度，使用Sample buffer(购自Thermo Scientific，货号NP0007)混合样品，按照Western blot操作说明书进行SDS-PAGE实验并将蛋白转印至0.22um PVDF膜上；
④7.5％BSA(购自sigma，货号A1933)封闭液室温封闭1小时；
⑤4℃条件下，用NAMPT一抗(购自Adipogen，货号AG-20A-0034)孵育24小时；
⑥孵育完成后，使用TBST洗液(购自Thermo Scientific，货号28360)洗5次，用辣根酶标记山羊抗小鼠二抗(购自中杉金桥，货号ZB-2305)室温孵育1小时；
⑦用TBST洗液洗涤5次，按DAB显色剂试剂盒(购自Thermo Scientific，货号34002)说明书方法显色，曝光。
如图3所示，示出了实施例1获得的外泌体溶液(高表达NAMPT外泌体)和普通iPS细胞分泌的外泌体溶液(普通外泌体)中的NAMPT蛋白的western blot检测结果(A幅)和条带灰度统计结果(B幅)。可见上述实施例1获得的外泌体溶液中NAMPT蛋白的表达量显著高于普通iPS细胞分泌的外泌体中的NAMPT蛋白表达量，由图3中B幅可知，前者是后者的2倍以上，甚至达到4倍以上。
2.4、电镜分析
具体步骤如下：
将2nm的孔径的载样铜网固定于支架上，滴加20μl上述实施例1获得的外泌体溶液，室温静置3分钟。用滤纸从铜网侧边吸干液体，用3％磷钨酸溶液30μl室温环境下负染外泌体5分钟。滤纸吸干负染液，将铜网置于透射电镜的样品室内，观察外泌体的形态并拍照。
如图4所示，为电镜结果照片，可见提取的外泌体具有外泌体典型结构，通常为茶托型或一侧凹陷的半球形。
综上实施例2的鉴定结果表明，本发明确实获得了含高表达NAMPT蛋白的外泌体，该外泌体中的NAMPT蛋白含量是普通iPS细胞分泌的外泌体中的NAMPT蛋白含量的2倍以上，甚至是4倍以上。并且本发明提供的方法(将表达NAMPT蛋白的mRNA转染iPS细胞)可以用于大规模生产该含高表达NAMPT蛋白的外泌体。
实施例3：外泌体的应用
该实施例利用上述实施例1获得的外泌体溶液(高表达NAMPT外泌体)以及普通iPS细胞分泌的外泌体溶液(普通外泌体)进行以下处理，以获得上述实施例1获得的高表达NAMPT蛋白的外泌体在改善衰老细胞情况、保护神经元等中的效果。
3.1、外泌体的摄取
1)按照PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit(购自Sigma公司，货号MINI26)试剂盒的技术手册用PKH26标记外泌体溶液，利用Exosome Spin Columns(MW3000)(购自Invitrogen公司，货号4484449)试剂盒的技术手册去除多余的染料，获得标记的外泌体溶液。
2)按外泌体：细胞为10000：1的数量比例，将标记的外泌体溶液分别加入人皮肤成纤维细胞、脐带间充质干细胞和神经元细胞(国典(北京)医药科技有限公司，人皮肤成纤维细胞培养基是DMEM+15％FBS+NEAA、脐带间充质干细胞培养基是DMEM+10％FBS，神经元细胞培养基是B27+Neurobasal+GlutaMAX，培养条件均为37℃，5％CO2)培养液，置于37℃，95％空气和5％CO2孵箱共孵育24小时，用PBS洗一遍细胞，加入Hoechst 33342(购自Sigma-Aldrich)至终浓度5μg/ml染色细胞核，荧光显微镜下拍照。
结果如图5所示，示出的是实施例1获得的外泌体的细胞摄取情况，其中A幅为不加入外泌体的人皮肤成纤维细胞对照，B幅为加入外泌体的人皮肤成纤维细胞；C幅为不加入外泌体的脐带间充质干细胞对照，D幅为加入外泌体的脐带间充质干细胞；E幅为不加入外泌体的人神经元细胞对照，F幅为加入外泌体的人神经元细胞。图中H为Hoechst 33342信号，指示细胞核；P为PKH26信号，指示外泌体。明显可见，外泌体可以被人皮肤成纤维细胞、脐带间充质干细胞和神经元细胞摄入细胞内。
3.2、改善衰老细胞情况
将实施例1获得的含高表达NAMPT蛋白的外泌体溶液与普通iPS分泌的外泌体溶液，分别加入自然衰老的皮肤成纤维细胞(P10)(国典(北京)医药科技有限公司，培养基为DMEM+10％FBS，培养条件37℃，5％CO2)中处理72h后，按照Senescenceβ-GalactosidaseStaining Kit试剂盒(购买自Cell Signaling Technology公司)说明书操作，检测衰老指标(β-Gal)。
结果如图6所示，其中A幅为自然衰老的皮肤成纤维细胞(P10)的空白对照，B幅为向自然衰老的皮肤成纤维细胞(P10)中加入含高表达NAMPT蛋白的外泌体处理，C幅为向自然衰老的皮肤成纤维细胞(P10)中加入普通iPS分泌的外泌体处理，可见与空白对照和普通iPS分泌的外泌体相比，加入含高表达NAMPT蛋白的外泌体能明显改善细胞衰老情况。
3.3、改善细胞生长状态与放电协同性
将含高表达NAMPT蛋白的外泌体溶液(实施例1)与普通iPS分泌的外泌体溶液加入由阿尔兹海默症(AD)和帕金森氏症(PD)患者的iPS分化得到的神经元细胞(国典(北京)医药科技有限公司，神经元细胞培养基是2％B27+Neurobasal+GlutaMAX，培养条件37℃，5％CO2)中培养。结果表明，与对照(空白对照和普通iPS分泌的外泌体)相比，加入含高表达NAMPT蛋白的外泌体能明显改善细胞生长状态与放电协同性等指标。
3.4、保护神经元
将含高表达NAMPT蛋白的外泌体溶液(实施例1，高表达NAMPT外泌体)与普通iPS分泌的外泌体溶液(普通外泌体)加入人神经元细胞(国典(北京)医药科技有限公司，细胞培养基是B27+Neurobasal+GlutaMAX，购自Invitrogen公司，培养条件37℃，5％CO2)后，进行氧糖剥夺(OGD)实验。
结果如图7所示，可见与空白对照(细胞死亡率51.4％)和普通iPS分泌的外泌体处理(细胞死亡率36.2％)相比，加入含高表达NAMPT蛋白的外泌体处理对神经元有显著保护作用(细胞死亡率降低至21.21％)。
综上实施例3结果表明，相对于普通iPS细胞分泌的外泌体，本发明制备的含高表达NAMPT蛋白的外泌体可以显著改善衰老细胞情况，以及对神经元具有显著保护作用，因此本发明提供的含高表达NAMPT蛋白的外泌体可以有效用于制备改善衰老细胞情况以及保护神经元的药物。
3.5、对模型小鼠的症状(AD和PD)有显著缓解
将含高表达NAMPT蛋白的外泌体溶液(实施例1)与普通iPS分泌的外泌体溶液分别注射入AD和PD模型小鼠(购自The Jackson Laboratory美国杰克逊实验室)体内，对模型小鼠进行连续观察。结果表明，与对照(空白对照和普通iPS分泌的外泌体)小鼠相比，加入含高表达NAMPT蛋白的外泌体对模型小鼠的症状有显著缓解。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 国典（北京）医药科技有限公司
<120> 含高表达NAMPT蛋白的外泌体及其制备方法和应用
<150> 201911388118.5
<151> 2019-12-30
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
taatacgact cactataggg 20
<210> 2
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcatgataat acgactcact atagggagtc caccatggat gaatcctgcg gcagaag 57
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttttttttt tttttttttt tttttttttt ctaatgatgt gctgcttcc 49

Claims (10)

1.一种含高表达NAMPT蛋白的外泌体，其特征在于，由高表达NAMPT蛋白的iPS细胞分泌所得，且所述外泌体中的NAMPT蛋白含量为普通的iPS细胞分泌的外泌体中NAMPT蛋白含量的2倍以上；所述高表达NAMPT蛋白的iPS细胞通过将体外合成的NAMPT mRNA转染入iPS细胞获得。
2.根据权利要求1所述的含高表达NAMPT蛋白的外泌体，其特征在于，还包含DNA、RNA、蛋白质和脂质等物质。
3.根据权利要求1或2所述的含高表达NAMPT蛋白的外泌体，其特征在于，所述含高表达NAMPT蛋白的外泌体的粒径为30～150nm，表面标志物中CD9占比≥60％，CD63占比≥25％。
4.权利要求1-3中任一项所述的含高表达NAMPT蛋白的外泌体的制备方法，包括以下步骤：
T1：以NAMPT基因的编码序列为模板体外合成NAMPT mRNA；
T2:将T1合成的NAMPT mRNA转染入iPS细胞中，获得高表达NAMPT蛋白的iPS细胞；
T3：培养步骤T2获得的高表达NAMPT蛋白的iPS细胞，获得含高表达NAMPT蛋白的外泌体。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤T1中，所述NAMPT基因的编码序列为使用PCR引物扩增获得，其中所述PCR引物的正向引物为序列表中SEQ ID NO:2所示；反向引物为序列表中SEQ ID NO:3所示。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，步骤T3的具体操作为：每天换入新鲜的iPS细胞培养液培养高表达NAMPT蛋白的iPS细胞，收集换出的培养液，从换出的培养液中分离纯化获得含高表达NAMPT蛋白的外泌体。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述分离纯化的方法选自差速离心法、超滤离心法、密度梯度离心法、沉淀法、磁珠免疫法、PS亲和法、色谱法中的任一种或其组合。
8.权利要求1-3中任一项所述的含高表达NAMPT蛋白的外泌体在制备改善衰老细胞情况、改善神经元细胞生长状态与放电协同性、保护神经元或治疗或者改善神经退行性疾病的药物中的应用。
9.一种改善衰老细胞的药物，其包含权利要求1-3中任一项所述的含高表达NAMPT蛋白的外泌体。
10.一种保护神经元的药物，其包含权利要求1-3中任一项所述的含高表达NAMPT蛋白的外泌体。
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