ES2918501T3

ES2918501T3 - Receptores de antígenos quiméricos de mesotelina humana y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2918501T3
Application number: ES14871351T
Authority: ES
Inventors: Gregory Beatty; Boris Engels; Neeraja Idamakanti; Carl H June; Andreas Loew; Huijuan Song; Qilong Wu
Original assignee: Novartis AG; University of Pennsylvania Penn
Current assignee: Novartis AG; University of Pennsylvania Penn
Priority date: 2013-12-19
Filing date: 2014-12-19
Publication date: 2022-07-18
Anticipated expiration: 2034-12-19
Also published as: JP2022046476A; EP3083964A1; AU2021203547A1; JP2021035948A; CA3225456A1; TW201529850A; EP3083964A4; CA2931684C; RU2016129125A; CA2931684A1; US20200407460A1; CN106459989B; WO2015090230A1; MX2016008076A; SG11201604815RA; JP6987945B2; AU2023200884A1; EP3083964B1; CN116478927A; JP6779785B2

Abstract

Proporcionados son composiciones y métodos para tratar enfermedades asociadas con la expresión de mesotelina. También se proporcionan un receptor de antígeno quimérico (CAR) específico de la mesotelina, vectores que codifican las mismas y células T recombinantes que comprenden el automóvil de mesotelina. Además, se proporcionan métodos para administrar una célula T genéticamente modificada que expresa un automóvil que comprende un dominio de unión a mesotelina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Receptores de antígenos quiméricos de mesotelina humana y usos de los mismos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere en general al uso de células T diseñadas para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) como se define en el presente documento para tratar una enfermedad asociada con la expresión de mesotelina.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La mesotelina fue identificada originalmente por Pastan y sus colegas como un antígeno asociado a los tumores debido a su limitada expresión en los tejidos normales y su sobreexpresión en los tumores. Chang K, et al., Cancer Res.

1992;52(1):181-186 y Chang K, et al. ProcNatlAcadSciUSA. 1996;93(1): 136-140. El gen de la mesotelina codifica una proteína precursora de 71-kDa que se procesa para dar lugar a la proteína de 40-kDa, la mesotelina, que está anclada en la membrana celular por un enlace de glucosilfosfatidil inositol (GPI) y un fragmento aminoterminal de 31-kDa, denominado factor potenciador de megacariocitos (MPF). Ambos fragmentos contienen sitios de N-glicosilación. En el suero de pacientes con adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) se ha encontrado una variante de empalme soluble del fragmento carboxilo-terminal de 40-kDa denominada "mesotelina soluble/relacionada con el MPF". Johnston, F, et al. Clinical Cancer Research. 2009;15(21):6511. La mesotelina se está estudiando actualmente tanto como objetivo terapéutico como marcador biológico de la actividad de la enfermedad y de la respuesta terapéutica. Argani P, et al. Clin Cancer Res. 2001;7(12):3862-3868.

La mesotelina es un antígeno de diferenciación que también está presente en los tejidos normales. Utilizando el anticuerpo K1 antihumana mesotelina de ratón que fue desarrollado por el grupo Pastan, se ha demostrado una fuerte reactividad de K1 dentro de las células mesoteliales que recubren las cavidades peritoneal, pleural y pericárdica, aunque a niveles más bajos que los que se suelen observar en los tejidos malignos. Chang K, et al., Cancer Res.

1992;52(1):181-186. Se ha detectado una débil reactividad K1 en el epitelio de las trompas de Falopio, en el epitelio basal traqueal y en el epitelio de las amígdalas. La mesotelina también se ha encontrado en todas las capas de la córnea. Jirsova K, et al. Experimental eye research. 2010;91(5):623-629. Sin embargo, no se ha detectado reactividad de K1 en la mayoría de los tejidos normales, incluyendo el hígado, los riñones, el bazo, la médula ósea, los ganglios linfáticos, el timo, el músculo cardíaco, la lengua, el músculo esquelético, la piel, la corteza cerebral, el cerebelo y la médula espinal, el nervio periférico, la hipófisis, los suprarrenales, la glándula salival, la glándula mamaria, la tiroides, la paratiroides, los testículos, la próstata, el epidídimo, el epitelio cervical, la parénquima pulmonar, el esófago, el epitelio del intestino delgado, el epitelio del colon, el epitelio de la vejiga, el epitelio de la vesícula biliar. Chang K, et al., Cancer Res. 1992;52(1):181-186.

La mesotelina se sobre expresa en la gran mayoría de los adenocarcinomas pancreáticos primarios, con una expresión rara y débil en el tejido pancreático benigno. Argani P, et al. Clin Cancer Res. 2001;7(12):3862-3868. El mesotelioma pleural maligno (MPM) epitelial expresa universalmente la mesotelina, mientras que el MPM sarcomatoide no expresa la mesotelina. La mayoría de los carcinomas ováricos epiteliales serosos, y los carcinomas peritoneales primarios relacionados, expresan mesotelina.

La mesotelina es un objetivo de la respuesta inmunitaria natural en el cáncer de ovario, y se ha propuesto que sea un objetivo para la inmunoterapia del cáncer. Bracci L, et al. Clin Cancer Res. 2007;13(2 Pt 1):644-653 Moschella F, et al. Cancer Res. 2011;71(10):3528-3539; Gross G, et al. FASEB J. 1992;6(15):3370-3378 Sadelain M, et al. NatRevCancer. 2003;3(1):35-45 Muul LM, et al. Blood. 2003;101(7):2563-2569 Yee C, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99(25):16168-16173. La presencia de CTLs específicos de mesotelina en pacientes con cáncer de páncreas se correlaciona con la supervivencia global. Thomas a M, et al. J Exp Med. 2004;200:297-306. Además, Pastan y sus colaboradores han utilizado fragmentos de anticuerpos solubles de un anticuerpo antimesotelina conjugado con inmunotoxinas para tratar a pacientes de cáncer con tumores positivos a la mesotelina. Este enfoque ha demostrado una seguridad adecuada y cierta actividad clínica en el cáncer de páncreas. Hassan R, et al. Cancer Immun.

2007;7:20 y Hassan R, et al. Clin Cancer Res. 2007; 13(17): 5144-5149. En el cáncer de ovario, esta estrategia terapéutica produjo una respuesta menor según los criterios RECIST y una enfermedad estable en un segundo paciente que también tuvo una resolución completa de su ascitis.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR), en el que el CAR comprende: i) un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende un dominio de unión a la anti-mesotelina humana, ii) un dominio transmembrana, y iii) un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio estimulante, y en el que dicho dominio de unión a la anti mesotelina comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 49, o una secuencia con 95-99 % de identidad con SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 49, opcionalmente en el que el dominio de unión a la antimesotelina es un scFv.

El dominio de unión a la antimesotelina puede comprender la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 43 o la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 49. La secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de unión a la antimesotelina puede comprender la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 91 o SEQ ID NO: 97, o una secuencia con 95-99 % de identidad con una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 91 o SEQ ID NO: 97.

De acuerdo con la invención, en la molécula de ácido nucleico aislada como se ha descrito anteriormente,

a) el CAR codificado puede incluir un dominio transmembrana que comprende un dominio transmembrana de una proteína seleccionada del grupo que consiste en la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154;

b) el dominio transmembrana codificado puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; c) el dominio transmembrana codificado puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprenda al menos una, dos o tres modificaciones, pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6;

d) el dominio transmembrana codificado puede comprender una secuencia de aminoácidos con 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6; o

e) la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio transmembrana puede comprender la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 17, o una secuencia con 95-99 % de identidad con una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 17.

El dominio de unión a la antimesotelina codificado puede estar conectado al dominio transmembrana por una región bisagra, en la que

a) la región bisagra codificada puede comprender una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, o la región bisagra codificada puede comprender una secuencia con 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, o

b) la región bisagra codificada puede comprender una secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 13, o la región bisagra codificada puede comprender una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia con 95-99 % de identidad con una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:13.

La molécula de ácido nucleico aislada de la invención puede comprender además una secuencia que codifica un dominio costimulador, en la que

a) el dominio coestimulador codificado puede ser un dominio de señalización funcional derivado de una proteína seleccionada del grupo que consiste en OX40, CD2, CD27, CD28, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) y 4-1BB (CD137);

b) el dominio costimulador codificado puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7; c) el dominio costimulador codificado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos una, dos o tres modificaciones, pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7;

d) el dominio costimulador codificado puede comprender una secuencia con 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7;

e) la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio costimulador puede comprender la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:18; o

f) la secuencia que codifica el dominio costimulador puede comprender una secuencia con 95-99 % de identidad con una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:18.

De acuerdo con la invención, en la molécula de ácido nucleico aislada como se ha descrito anteriormente, el dominio de señalización intracelular codificado puede comprender un dominio de señalización funcional de 4-1BB y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta, opcionalmente en el que el dominio de señalización intracelular codificado puede comprender

(i) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10;

(ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones, pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7 y una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9 o de SEQ ID NO:10;

(iii) una secuencia de aminoácidos con 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID ⁿO:7 y una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10;

(iv) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7 y la secuencia de SEQ ID NO:9 o de SEQ ID NO:10, en la que las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica; o

(v) la secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de SEQ ID NO: 18, o una secuencia con un 95-99% de identidad con la misma, y la secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de SEQ ID NO:20 o SEQ ID NO:21, o una secuencia con 95-99 % de identidad con la misma.

La molécula de ácido nucleico aislada de la invención puede comprender además una secuencia líder en la que la secuencia líder comprende opcionalmente una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona una molécula aislada de receptor de antígeno quimérico (CAR) codificada por la molécula de ácido nucleico de la invención como se ha descrito anteriormente, opcionalmente en la que, el CAR comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67, o SEQ ID NO: 73. De acuerdo con un tercer aspecto de la invención, se proporciona una molécula aislada de receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende: i) un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que incluye un dominio de unión a la anti-mesotelina humana, ii) un dominio transmembrana, y iii) un dominio de señalización intracelular, en el que el dominio de unión a la antimesotelina (por ejemplo, un scFv) comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 49, o una secuencia con 95-99 % de identidad con SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 49, opcionalmente en el que el dominio de unión a la antimesotelina es un scFv.

En este aspecto de la invención, el dominio de unión de antimesotelina humana (por ejemplo, un scFv) puede comprender la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 43 o la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 49. El dominio transmembrana puede comprender

(i) un dominio transmembrana de una proteína seleccionada del grupo que consiste en la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154;

(ii) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;

(iii) una secuencia de aminoácidos que tenga al menos una, dos o tres modificaciones, pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; o

(iv) una secuencia de aminoácidos con 95-99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

Además, de acuerdo con este aspecto de la invención, el dominio de unión a la antimesotelina humana puede estar conectado al dominio transmembrana por una región bisagra, en la que la región bisagra comprende SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:36, o una secuencia con 95-99 % de identidad con la misma.

De acuerdo con este aspecto de la invención, en la molécula de CAR aislada descrita, el dominio de señalización intracelular puede comprender un dominio costimulador, en el que el dominio costimulador comprende

a) un dominio de señalización funcional de una proteína seleccionada del grupo que consiste en OX40, CD2, CD27, CD28, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), CD278 (ICOS) y 4-1BB (CD137);

b) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7;

c) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones, pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; o

d) una secuencia de aminoácidos con 95-99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.

El dominio de señalización intracelular puede comprender un dominio de señalización funcional de 4-1BB y un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. Por ejemplo, el dominio de señalización intracelular puede comprender (i) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9;

(ii) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10;

(iii) una secuencia de aminoácidos que tenga al menos una, dos o tres modificaciones, pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10;

(iv) una secuencia de aminoácidos con 95-99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID ⁿO:7 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO: 10; o

(v) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, en la que las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una sola cadena polipeptídica.

De acuerdo con este aspecto de la invención, la molécula de CAR aislada puede comprender además una secuencia líder, en la que la secuencia líder comprende opcionalmente la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o una secuencia con 95-99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1

De acuerdo con un cuarto aspecto de la invención, se proporciona un dominio de unión a la antimesotelina humana, que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 49, o una secuencia con 95-99 % de identidad con SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 49, opcionalmente en el que el dominio de unión a la antimesotelina es un scFv. El dominio de unión a la antimesotelina humana de este aspecto puede comprender la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 43 o la secuencia de aminoácidos establecida en s Eq ID NO: 49.

De acuerdo con un quinto aspecto de la invención, se proporciona un vector que comprende la molécula de ácido nucleico del primer aspecto de la invención, en el que el vector se selecciona del grupo que consiste en un ADN, un ARN, un plásmido, un vector lentivirus, un vector adenoviral o un vector retroviral.

De acuerdo con un sexto aspecto de la invención, se proporciona una célula efectora inmunitaria que comprende el vector del quinto aspecto de la invención.

De acuerdo con el séptimo aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento in vitro de fabricación de una célula efectora inmunitaria que comprende transducir una célula efectora inmunitaria con un vector del quinto aspecto de la invención

De acuerdo con un octavo aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento in vitro para generar una población de células con ARN diseñado que comprende introducir un ARN transcrito in vitro o un ARN sintético en una célula, donde el ARN comprende una molécula de ácido nucleico del primer aspecto de la invención.

De acuerdo con un noveno aspecto de la invención, se proporciona una célula que comprende una molécula de ácido nucleico del primer aspecto de la invención para su uso en un procedimiento para proporcionar una inmunidad anticancerosa en un mamífero, comprendiendo dicho procedimiento administrar al mamífero una cantidad eficaz de la célula.

De acuerdo con un décimo aspecto de la invención, se proporciona una célula que comprende una molécula de ácido nucleico del primer aspecto de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento de un mamífero que tiene una enfermedad asociada con la expresión de mesotelina, en el que la enfermedad se selecciona entre una enfermedad proliferativa tal como un cáncer o una neoplasia, o una condición precancerosa, comprendiendo el procedimiento administrar al mamífero una cantidad eficaz de la célula.

De acuerdo con un undécimo aspecto de la invención, se proporciona la molécula de ácido nucleico aislada del primer aspecto de la invención, la molécula de CAR aislada del segundo aspecto o del tercer aspecto de la invención, el dominio de unión a la antimesotelina del cuarto aspecto de la invención, el vector del quinto aspecto de la invención o la célula del sexto aspecto de la invención para su uso como medicamento. Dichos medicamentos pueden utilizarse en el tratamiento de una enfermedad asociada con la expresión de la mesotelina, en la que la enfermedad se selecciona entre una enfermedad proliferativa, tal como un cáncer o una neoplasia, o una condición precancerosa. El cáncer puede estar asociado con la expresión de mesotelina seleccionada del grupo que consiste en mesotelioma, mesotelioma pleural maligno, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células escamosas o cáncer de pulmón de células grandes, cáncer de páncreas, adenocarcinoma ductal pancreático, cáncer de páncreas metastásico, cáncer de ovario, cáncer colorrectal y cáncer de vejiga, o cualquier combinación de los mismos.

La célula del sexto aspecto de la invención, puede expresar además un agente que inhibe una molécula que inhibe la función de las células T, en el que el agente comprende:

un primer polipéptido que comprende una molécula inhibidora, en el que la molécula inhibidora es PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 o Tg FR beta, o un fragmento del mismo; y

un segundo polipéptido que proporciona una señal positiva a la célula, en la que el segundo polipéptido proporciona un dominio de señalización intracelular, en el que además el dominio de señalización intracelular comprende un dominio coestimulador (por ejemplo, 41BB, CD27 o CD28), y/o un dominio de señalización primario (por ejemplo, el dominio de señalización CD3 zeta).

En la célula de uso de los aspectos décimo o undécimo de la invención, el ácido nucleico puede introducirse en células T o células NK utilizando la transcripción in vitro, y el sujeto recibe una administración inicial de las células que comprenden el ácido nucleico, y una o más administraciones posteriores de células que comprenden el ácido nucleico, en la que la una o más administraciones posteriores se administran menos de 15 días, por ejemplo, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 días después de la administración anterior.

La divulgación presenta, por ejemplo, procedimientos para proporcionar una respuesta inmunitaria en pacientes mediante la administración de una célula efectora inmunitaria que está diseñada para expresar un Receptor de Antígeno Quimérico (CAR) que comprende un anticuerpo (por ejemplo, scFv) que se dirige específicamente a la mesotelina. En particular, la divulgación se refiere al uso de una célula efectora inmune tal como, por ejemplo, una célula T o una célula NK, diseñada para expresar un CAR que incluye un anticuerpo como fragmento de unión a antígeno del mismo para tratar un cáncer asociado con la expresión de mesotelina (o MSLN). En particular, la divulgación se refiere a la transferencia celular adoptiva que puede ser particularmente adecuada para pacientes con cánceres que expresan mesotelina, tal como, por ejemplo, mesotelioma (por ejemplo, mesotelioma pleural maligno, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células escamosas o cáncer de pulmón de células grandes)), cáncer de páncreas (por ejemplo, adenocarcinoma ductal pancreático, metastásico pancreático), cáncer de ovario, cáncer colorrectal y cáncer de vejiga, o cualquier combinación de los mismos.

En consecuencia, en un aspecto, la divulgación se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR), en el que el CAR comprende un dominio de unión a la anti-mesotelina (por ejemplo, un dominio de unión a la anti-mesotelina humana), un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio estimulador. En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina codificado comprende una o más (por ejemplo, las tres) región determinante complementaria de cadena ligera 1 (LC CDR1), región determinante complementaria de cadena ligera 2 (LC CDR2), y región determinante complementaria de cadena ligera 3 (LC CDR3) de un dominio de unión a la antimesotelina humana descrito en el presente documento, y una o más (por ejemplo, las tres) región determinante complementaria de la cadena pesada 1 (HC CDR1), región determinante complementaria de la cadena pesada 2 (HC CDR2), y región determinante complementaria de la cadena pesada 3 (HC CDR3) de un dominio de unión a la antimesotelina humana descrito en el presente documento. En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina humana codificado comprende, o consiste en, una región variable de cadena ligera descrita en el presente documento (por ejemplo, en la Tabla 2, 4 o 5) y/o una región variable de cadena pesada descrita en el presente documento (por ejemplo, en la Tabla 2, 4 o 5). En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina codificado es un scFv que comprende o consiste en una cadena ligera y una cadena pesada de una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2. En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina (por ejemplo, un scFV) comprende o consiste en: una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena ligera proporcionada en la Tabla 2, o una secuencia con 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2; y/o una región variable de la cadena pesada que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada proporcionada en la Tabla 2, o una secuencia con 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2. En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina humana comprende, o consiste en, una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, y SEQ ID NO: 62, o una secuencia con 95-99 % de identidad. En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de unión a la anti-mesotelina humana comprende, o consiste en, una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 87; SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, y SEQ ID NO: 110, o una secuencia con 95-99% de identificación de la misma.

En una realización, el ácido nucleico aislado comprende además una secuencia que codifica un dominio transmembrana, por ejemplo, un dominio transmembrana descrito en el presente documento. En una realización, el dominio transmembrana codificado comprende, o consiste en, un dominio transmembrana de una proteína seleccionada de la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154. En una realización, el dominio transmembrana codificado comprende, o consiste, en una secuencia de SEQ ID NO: 12. En una realización, el dominio transmembrana comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, o una secuencia con 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

En una realización, el CAR codificado incluye un dominio de unión a la anti-mesotelina, por ejemplo, un dominio de unión a la anti-mesotelina descrito en el presente documento, conectado al dominio transmembrana por una región bisagra, por ejemplo, una región bisagra descrita en el presente documento. En una realización, la región de bisagra comprende, o consiste en, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8.

En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende además una secuencia que codifica un dominio costimulador, por ejemplo, un dominio costimulador descrito en el presente documento. En una realización, el dominio coestimulador es un dominio de señalización funcional obtenido de una proteína seleccionada del grupo que consiste en OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) y 4-1BB (CD137). En una realización, el dominio costimulador codificado comprende, o consiste en, una secuencia de SEQ ID NO:14. En una realización, el dominio coestimulador comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, o una secuencia con 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

En una realización, el ácido nucleico aislado comprende una secuencia que codifica un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular descrito en el presente documento. En una realización, el ácido nucleico aislado codifica un dominio de señalización funcional de 4-1BB y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En una realización, el dominio de señalización intracelular codificado comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7 y/o la secuencia de SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7 y/o una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO: 10, o una secuencia con 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7 y/o una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO: 10. En una realización, el dominio de señalización intracelular codificado comprende, o consiste, en la secuencia de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, en la que las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una sola cadena polipeptídica.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un constructo CAR que comprende una secuencia líder, por ejemplo, de SEQ ID NO: 1; un dominio de unión a la antimesotelina descrito en el presente documento, por ejemplo, que tenga una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2, o una secuencia con 95-99 % de identificación de la misma; una región de bisagra, por ejemplo, de SEQ ID NO: 2; un dominio transmembrana, por ejemplo, con una secuencia de SEQ ID NO: 6; un dominio costimulador, por ejemplo, un dominio costimulador 4-1BB que tiene una secuencia de SEQ ID NO:7; y un dominio de señalización primaria, por ejemplo, el dominio estimulador CD3 zeta que tiene una secuencia de SEQ ID NO:9 o 10. En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende (por ejemplo, consiste en) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2. En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende (consiste en) un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2, o una secuencia con 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a una molécula polipeptídica aislada codificada por la secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico descrito en el presente documento.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a una molécula polipeptídica aislada que comprende, o consiste en, una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la Tabla 2, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada proporcionada en la Tabla 2, o una secuencia con 95-99% de identidad con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2. En una realización, el polipéptido aislado comprende una o más (por ejemplo, las tres) región determinante complementaria de la cadena ligera 1 (LC CDR1), región determinante complementaria de la cadena ligera 2 (LC CDR2), y región determinante complementaria de la cadena ligera 3 (LC CDR3) de un dominio de unión a la antimesotelina humana descrito en el presente documento, y una o más (por ejemplo, las tres) región determinante complementaria de la cadena pesada 1 (HC CDR1), región determinante complementaria de la cadena pesada 2 (HC CDR2), y región determinante complementaria de la cadena pesada 3 (HC CDR3) de un dominio de unión a la antimesotelina humana descrito en el presente documento.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a una molécula aislada de receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un dominio de unión a la antimesotelina descrito en el presente documento, por ejemplo, un dominio de unión a la antimesotelina humana descrito en el presente documento, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio estimulador.

En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina no compite por la unión a la mesotelina humana con un dominio de unión a antígeno que comprende una secuencia que comprende SEQ ID NO: 279.

En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina compite por la unión a la mesotelina humana con un dominio de unión a antígeno que comprende una LC CDR1, una LC CDR2 y LC CDR3 de una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de antimesotelina seleccionada de SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 49 y una HC CDR1, una HC CDR2, y una HC CDR3 de una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de antimesotelina seleccionada de SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 49. En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina compite por la unión a la mesotelina humana con un dominio de unión a antígeno que comprende SEQ ID NO:43 o SEQ ID NO:49.

En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina se une a un epítopo de la mesotelina humana diferente del epítopo de la mesotelina humana al que se dirige el dominio de unión a antígeno que comprende una secuencia que comprende SEQ ID NO: 279. En una realización, el epítopo comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre los aminoácidos 314-315, 317-318, 346-349 y 369-375 de SEQ ID NO: 278, o cualquier combinación de las mismas. En una realización, el epítopo comprende uno o más aminoácidos seleccionados entre los aminoácidos 314 315, 317-318, 346-349 y 369-375 de SEQ ID NO: 278, o cualquier combinación de las mismas.

En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina descrito en el presente documento no se une al N-terminal de la mesotelina como se muestra en SEQ ID NO: 278. En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina se une al C-terminal de la mesotelina humana. En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 450-588 de SEQ ID NO: 278. En una realización, el epítopo unido por el dominio de unión a la antimesotelina comprende una secuencia seleccionada entre los aminoácidos 485-490, 498-507, 532 537 y 545-572 de SEQ ID NO: 278, o una combinación de las mismas. En una realización, el epítopo unido por el dominio de unión a la antimesotelina comprende uno o más aminoácidos seleccionados entre los aminoácidos 485 490, 498-507, 532-537 y 545-572 de SEQ ID NO: 278, o cualquier combinación de las mismas. En estas realizaciones, SEQ ID NO: 278 representa los aminoácidos 296-588 de la mesotelina humana, por ejemplo, el primer aminoácido de SEQ ID NO: 278 es el aminoácido 296 y el último aminoácido de SEQ ID NO: 278 es el aminoácido 588.

En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina comprende una o más (por ejemplo, las tres) región determinante complementaria de la cadena ligera 1 (LC CDR1), región determinante complementaria de la cadena ligera 2 (LC CDR2), y región determinante complementaria de la cadena ligera 3 (LC CDR3) de un dominio de unión a la antimesotelina humana descrito en el presente documento, y una o más (por ejemplo, las tres) región determinante complementaria de la cadena pesada 1 (HC CDR1), región determinante complementaria de la cadena pesada 2 (HC CDR2), y región determinante complementaria de la cadena pesada 3 (HC CDR3) de un dominio de unión a la anti mesotelina humana descrito en el presente documento. En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina humana comprende, o consiste en, una región variable de cadena ligera descrita en el presente documento (por ejemplo, en la Tabla 2) y/o una región variable de cadena pesada descrita en el presente documento (por ejemplo, en la Tabla 2). En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina es un scFv que comprende, o consiste en, una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada de una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2. En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina (por ejemplo, un scFV) comprende, o consiste en: una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera proporcionada en la Tabla 2, o una secuencia con 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2; y/o una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada proporcionada en la Tabla 2, o una secuencia con 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2. En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina humana comprende, o consiste en, una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, y SEQ ID NO: 62, o una secuencia con 95-99 % de identidad.

En una realización, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de una proteína seleccionada del grupo que consiste en la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154. En una realización, el dominio transmembrana comprende un dominio transmembrana descrito en el presente documento, por ejemplo, que tiene una secuencia de s Eq ID NO:6, una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, o una secuencia con 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6.

En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina está conectado al dominio transmembrana por una región bisagra. En una realización, la región bisagra comprende una región bisagra descrita en el presente documento, por ejemplo, una región bisagra de SEQ ID NO:2.

En una realización, la molécula de CAR aislada comprende además un dominio costimulador, por ejemplo, un dominio costimulador descrito en el presente documento. En una realización, el dominio coestimulador es un dominio de señalización funcional obtenido de una proteína seleccionada del grupo que consiste en OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) y 4-1BB (CD137) o una variante funcional de la misma. En una realización, el dominio coestimulador comprende, o consiste en, una secuencia de SEQ ID NO:7. En una realización, el dominio coestimulador comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7, o una secuencia con 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7.

En una realización, la molécula de CAR aislada comprende un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular descrito en el presente documento. En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de 4-1BB y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende, o consiste, en la secuencia de SEQ ID NO: 7 y/o la secuencia de SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7 y/o una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO: 10, o una secuencia con 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7 y/o una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO: 10. En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende, o consiste, en la secuencia de SEQ ID NO: 9 y la secuencia de SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, en la que las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una sola cadena polipeptídica.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a una molécula de CAR aislada que comprende una secuencia líder, por ejemplo, de SEQ ID NO: 1; un dominio de unión a la antimesotelina descrito en el presente documento, por ejemplo, con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2, o una secuencia con 95-99 % de identidad de la misma; una región bisagra, por ejemplo, de SEQ ID NO:2; un dominio transmembrana, por ejemplo, que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 6; un dominio costimulador, por ejemplo, un dominio costimulador 4-1B^bque tiene una secuencia de SEQ ID NO:7; y un dominio de señalización primaria, por ejemplo, el dominio estimulador CD3 zeta que tiene una secuencia de SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO: 10. En una realización, la molécula de CAR aislada comprende (por ejemplo, consiste en) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2. En una realización, la molécula de CAR aislada comprende (consiste en) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2, o una secuencia con 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2. En una realización, la molécula de CAR aislada comprende, o consiste en, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, y SEQ ID NO: 86.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico descrita en el presente documento. En una realización, la secuencia de ácido nucleico codifica una molécula de CAR, por ejemplo, una molécula de CAR descrita en el presente documento. En una realización, el vector se selecciona del grupo que consiste en un ADN, un ARN, un plásmido, un vector lentivirus, un vector adenoviral o un vector retroviral.

En una realización, el vector es un vector lentivirus, por ejemplo, un vector lentivirus descrito en el presente documento. En una realización, el vector comprende además un promotor. En una realización, el promotor es un promotor EF-1a. En una realización, el promotor EF-1a comprende una secuencia de SEQ ID NO: 11.

En una realización, el vector es un vector transcrito in vitro, por ejemplo, un vector que transcribe ARN de una molécula de ácido nucleico descrita en el presente documento. En una realización, el ARN se transcribe a partir de un vector de transcripción in vitro, en el que el vector es pD-A.antimeso BD OF.2bg.150A, en el que el antimeso BD es un dominio de unión a la antimesotelina descrito en el presente documento. En una realización, la secuencia de ácido nucleico en el vector comprende además una cola de poli(A), por ejemplo, una cola de poli A descrita en el presente documento, por ejemplo, que comprende unas 150 bases de adenosina (SEQ ID NO: 271). En una realización, la secuencia de ácido nucleico en el vector comprende además una 3'UTR, por ejemplo, una 3'UTR descrita en el presente documento, por ejemplo, que comprende al menos una repetición de una 3'UTR derivada de la beta-globulina humana.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a una célula que comprende el vector. La célula puede ser, por ejemplo, una célula descrita en el presente documento. En una realización, la célula es una célula T humana, por ejemplo, una célula T descrita en el presente documento, o una célula NK humana, por ejemplo, una célula NK humana descrita en el presente documento. En una realización, la célula T humana es una célula T CD8+. En una realización, la célula es una célula T autóloga. En una realización, la célula es una célula T alogénica. En una realización, la célula es una célula T y la célula T es deficiente en diaglicerol quinasa (DGK). En una realización, la célula es una célula T y la célula T es deficiente en Ikaros. En una realización, la célula es una célula T y la célula T es deficiente tanto en DGK como en Ikaros.

En un aspecto, la célula que expresa CAR descrita en el presente documento puede comprender además un segundo CAR, por ejemplo, un segundo CAR que incluye un dominio de unión a antígeno diferente, por ejemplo, al mismo objetivo (mesotelina) o a un objetivo diferente (por ejemplo, un objetivo distinto de la mesotelina en las células del estroma, por ejemplo, FAP; un objetivo distinto de la mesotelina en las células del cáncer de próstata, por ejemplo, receptor de andrógenos, OR51E2, PSMA, PSCA, PDGRF-p, TARP, GloboH, MAD-CT-1, o MAD-CT-2; un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de ovario, por ejemplo, Tn, PRSS21, CD171, Lewis Y, receptor a de folato, claudin6, GloboH, o proteína espermática 17; por ejemplo, un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de pulmón, por ejemplo, VEGF, HER3, IGF-1R, EGFR, DLL4, o Trop-2). En una realización, la célula que expresa ^cA^rcomprende un primer CAR que se dirige a un primer antígeno e incluye un dominio de señalización intracelular que tiene un dominio de señalización coestimuladora, pero no un dominio de señalización primario, y un segundo CAR que se dirige a un segundo antígeno diferente e incluye un dominio de señalización intracelular que tiene un dominio de señalización primario pero no un dominio de señalización coestimuladora. En una realización, la célula que expresa el CAR comprende un primer mesotelina CAR que incluye un dominio de unión a la mesotelina, un dominio transmembrana y un dominio coestimulador y un segundo CAR que se dirige a un antígeno distinto de la mesotelina (por ejemplo, un antígeno expresado en células del estroma, células de cáncer de pulmón, células de cáncer de próstata o células de cáncer de ovario) e incluye un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización primario. En otra realización, la célula que expresa el CAR comprende un primer mesotelina CAR que incluye un dominio de unión a la mesotelina, un dominio transmembrana y un dominio de señalización primario y un segundo CAR que se dirige a un antígeno distinto de la mesotelina (por ejemplo, un antígeno expresado en células del estroma, células de cáncer de pulmón, células de cáncer de próstata o células de cáncer de ovario) e incluye un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización coestimulador.

En una realización, la célula que expresa CAR comprende un mesotelina CAR descrito en el presente documento y un CAR inhibidor. En una realización, el CAR inhibidor comprende un dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno que se encuentra en las células normales, pero no en las células cancerosas, por ejemplo, células normales que también expresan mesotelina. En una realización, el CAR inhibidor comprende el dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un dominio intracelular de una molécula inhibidora. Por ejemplo, el dominio intracelular del CAR inhibidor puede ser un dominio intracelular de PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 y TGFR beta.

En otra realización, la célula que expresa CAR descrita en el presente documento puede expresar además otro agente, por ejemplo, un agente que mejora la actividad o la aptitud de una célula que expresa ^cA^r, por ejemplo, un agente descrito en el presente documento. Por ejemplo, en una realización, el agente puede ser un agente que inhibe una molécula que modula o regula, por ejemplo, la función de las células T. En algunas formas de realización, la molécula que modula o regula la función de las células T es una molécula inhibidora. Algunos ejemplos de moléculas inhibidoras incluyen PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 y TGFR beta. En las realizaciones, un agente, por ejemplo, un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un ARNcd, por ejemplo, un ARNpi o ARNhc; o por ejemplo, una proteína o sistema inhibidor, por ejemplo, una repetición palindrómica corta agrupada y regularmente interespaciada (CRISPR), una nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción (TALEN), o una endonucleasa de dedo de zinc (ZFN), por ejemplo, como se describe en el presente documento, pueden utilizarse para inhibir la expresión de una molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T en la célula que expresa el CAR. En una realización, el agente es un ARNhc, por ejemplo, un ARNhc descrito en el presente documento. En una realización, el agente que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T se inhibe dentro de una célula que expresa CAR. Por ejemplo, una molécula de ARNcd que inhibe la expresión de una molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T está vinculada al ácido nucleico que codifica un componente, por ejemplo, todos los componentes, del CAR

En una realización, el agente que inhibe una molécula inhibidora comprende un primer polipéptido, por ejemplo, una molécula inhibidora, asociada con un segundo polipéptido que proporciona una señal positiva a la célula, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular descrito en el presente documento. En una realización, el agente comprende un primer polipéptido, por ejemplo, de una molécula inhibidora tal como PD1, PD-L1, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, CTLA4, , VISTA, CD160, BTLA, LAIR1, TIM3, 2B4, TGFR beta y TIGIT, o un fragmento de cualquiera de ellos (por ejemplo, al menos una porción del dominio extracelular de cualquiera de ellos), y un segundo polipéptido que es un dominio de señalización intracelular descrito en el presente documento (por ejemplo, que comprende un dominio coestimulador (por ejemplo, 41BB, CD27 o CD28, por ejemplo, como se describe en el presente documento) y/o un dominio de señalización primario (por ejemplo, un dominio de señalización CD3 zeta descrito en el presente documento)). En una realización, el agente comprende un primer polipéptido de PD1 0 un fragmento del mismo (por ejemplo, al menos una porción del dominio extracelular de PD1), y un segundo polipéptido de un dominio de señalización intracelular descrito en el presente documento (por ejemplo, un dominio de señalización CD28 descrito en el presente documento y/o un dominio de señalización CD3 zeta descrito en el presente documento).

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un procedimiento de fabricación de una célula que comprende transducir una célula descrita en el presente documento, por ejemplo, una célula T o una célula NK, con un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una molécula de CAR, por ejemplo, una molécula de CAR descrita en el presente documento. En una realización, el vector es un vector lentiviral descrito en el presente documento.

La presente divulgación también proporciona un procedimiento para generar una población de células diseñadas de ARN, por ejemplo, las células descritas en el presente documento, por ejemplo, células T o células NK, que expresan transitoriamente ARN exógeno. El procedimiento comprende introducir un ARN transcrito in vitro o un ARN sintético en una célula, donde el ARN comprende un ácido nucleico que codifica una molécula de CAR descrita en el presente documento.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un procedimiento para proporcionar inmunidad antitumoral en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una célula que comprende una molécula de CAR, por ejemplo, una célula que expresa una molécula de CAR descrita en el presente documento, una célula descrita en el presente documento. En una realización, la célula es una célula T autóloga o una célula NK. En una realización, la célula es una célula T alogénica o una célula NK. En una realización, el sujeto es un humano.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a un procedimiento para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad asociada con la expresión de mesotelina (por ejemplo, una enfermedad proliferativa, una condición precancerosa y una indicación no relacionada con el cáncer asociada con la expresión de mesotelina) que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una célula que comprende una molécula de CAR, por ejemplo, como se describe en el presente documento.

En una realización, la enfermedad asociada con la mesotelina es el cáncer, por ejemplo, un cáncer descrito en el presente documento. En una realización, la enfermedad asociada con la mesotelina se selecciona del grupo que consiste en: mesotelioma (por ejemplo, mesotelioma pleural maligno), cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células escamosas o cáncer de pulmón de células grandes), cáncer de páncreas (por ejemplo, adenocarcinoma ductal pancreático), cáncer de ovario, cáncer colorrectal y cáncer de vejiga o cualquier combinación de los mismos. En una realización, la enfermedad es cáncer de páncreas, por ejemplo, adenocarcinoma ductal pancreático (PDA) metastásico, por ejemplo, en un sujeto que ha progresado con al menos una terapia estándar anterior. En una realización, la enfermedad es un mesotelioma (por ejemplo, mesotelioma pleural maligno), por ejemplo, en un sujeto que ha progresado con al menos una terapia estándar anterior. En una realización, la enfermedad es cáncer de ovario, por ejemplo, cáncer de ovario epitelial seroso, por ejemplo, en un sujeto que ha progresado después de al menos un régimen previo de terapia estándar.

En una realización, la célula que expresa mesotelina CAR, por ejemplo, célula T o célula NK, se administra a un sujeto que ha recibido una dosis previa de melfalán.

En una realización, las células que expresan una molécula de CAR, por ejemplo, una molécula de CAR descrita en el presente documento, se administran en combinación con un agente que mejora la actividad o la aptitud de una célula que expresa una molécula de CAR, por ejemplo, un agente descrito en el presente documento.

En una realización, las células que expresan una molécula de CAR, por ejemplo, una molécula de CAR descrita en el presente documento, se administran en combinación con una dosis baja y potenciadora de la inmunidad de un inhibidor de mTOR. Aunque no se desea estar limitado por la teoría, se cree que el tratamiento con una dosis baja, que mejora el sistema inmunitario (por ejemplo, una dosis que es insuficiente para suprimir completamente el sistema inmunitario pero suficiente para mejorar la función inmunitaria) se acompaña de una disminución de las células T positivas a PD-1 o de un aumento de las células negativas a PD-1. Los linfocitos T positivos a PD-1 , pero no los linfocitos T negativos a PD-1 , pueden agotarse por compromiso con células que expresan un ligando PD-1, por ejemplo, PD-L1 o PD-L2.

En una realización, este enfoque puede utilizarse para optimizar el rendimiento de las células CAR descritas en el presente documento en el sujeto. Aunque no se quiere limitar a la teoría, se cree que, en una realización, se mejora el rendimiento de las células efectoras inmunitarias endógenas y no modificadas, por ejemplo, las células T. Aunque no se desea estar limitado por la teoría, se cree que, en una realización, se mejora el rendimiento de una célula que expresa mesotelina CAR. En otras realizaciones, las células, por ejemplo, las células T o las células NK, que tienen, o serán diseñadas para expresar un CAR, pueden ser tratadas ex vivo por contacto con una cantidad de un inhibidor de mTOR que aumenta el número de células efectoras inmunitarias PD1 negativas, por ejemplo, las células T o aumenta la proporción de células efectoras inmunitarias PD1 negativas, por ejemplo, las células T/ células efectoras inmunitarias ^pD1 positivas, por ejemplo, las células T.

En una realización, la administración de una dosis baja, potenciadora de la inmunidad, de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico, por ejemplo, RAD001, o un inhibidor catalítico, se inicia antes de la administración de una célula que expresa CAR descrita en el presente documento, por ejemplo, células T o células NK. En una realización, las células CAR se administran después de un tiempo suficiente, o una dosis suficiente, de un inhibidor de mTOR, de manera que el nivel de células efectoras inmunitarias negativas de PD1, por ejemplo, células T, o la proporción de células efectoras inmunitarias negativas de PD1, por ejemplo, células T/ células efectoras inmunitarias positivas de PD1, por ejemplo, células T, se ha incrementado, al menos transitoriamente.

En una realización, la célula, por ejemplo, la célula T o la célula NK, que se va a diseñar para que exprese un CAR, se cosecha después de un tiempo suficiente, o después de una dosificación suficiente de un inhibidor de mTOR que mejora la inmunidad, de manera que el nivel de células efectoras inmunitarias negativas de PD1, por ejemplo, las células T, o la proporción de células efectoras inmunitarias negativas para PD1, por ejemplo, células T/células efectoras inmunitarias positivas para PD1, por ejemplo, células T, en el sujeto o cosechadas del sujeto ha aumentado, al menos transitoriamente.

En una realización, las células que expresan una molécula de CAR, por ejemplo, una molécula de CAR descrita en el presente documento, se administran en combinación con un agente que mejora uno o más efectos secundarios asociados con la administración de una célula que expresa una molécula de CAR, por ejemplo, un agente descrito en el presente documento.

En una realización, las células que expresan una molécula de CAR, por ejemplo, una molécula de CAR descrita en el presente documento, se administran en combinación con un agente que trata la enfermedad asociada con la expresión de mesotelina, por ejemplo, un agente descrito en el presente documento.

En una realización, las células que expresan una molécula de CAR, por ejemplo, una molécula de CAR descrita en el presente documento, se administran a una dosis y/o esquema de dosificación descrito en el presente documento.

En una realización, las células que expresan una molécula de CAR, por ejemplo, una molécula de CAR descrita en el presente documento, se administran como tratamiento de primera línea para la enfermedad, por ejemplo, el cáncer, por ejemplo, el cáncer descrito en el presente documento. En otra realización, las células que expresan una molécula de CAR, por ejemplo, una molécula de CAR descrita en el presente documento, se administran como tratamiento de segunda, tercera o cuarta línea para la enfermedad, por ejemplo, el cáncer, por ejemplo, el cáncer descrito en el presente documento.

En una realización, se administra una población de células descrita en el presente documento.

En una realización, la molécula de CAR se introduce en células T o células NK, por ejemplo, utilizando la transcripción in vitro, y el sujeto (por ejemplo, humano) recibe una administración inicial de células que comprenden una molécula de CAR, y una o más administraciones posteriores de células que comprenden una molécula de CAR, en la que la una o más administraciones posteriores se administran menos de 15 días, por ejemplo, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, o 2 días después de la administración anterior. En una realización, se administra más de una administración de células que comprenden una molécula de CAR al sujeto (por ejemplo, humano) por semana, por ejemplo, se administran 2, 3 o 4 administraciones de células que comprenden una molécula de CAR por semana. En una realización, el sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) recibe más de una administración de células que comprenden una molécula de CAR por semana (por ejemplo, 2, 3 o 4 administraciones por semana) (también denominado en el presente documento como ciclo), seguido de una semana de no administración de células que comprenden una molécula de CAR, y luego se administra al sujeto una o más administraciones adicionales de células que comprenden una molécula de CAR (por ejemplo, más de una administración de las células que comprenden una molécula de CAR por semana). En otra realización, el sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) recibe más de un ciclo de células que comprenden una molécula de CAR, y el tiempo entre cada ciclo es inferior a 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o 3 días. En una realización, las células que comprenden una molécula de CAR se administran en días alternos durante 3 administraciones por semana. En una realización, las células que comprenden una molécula de CAR se administran durante al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más semanas.

En un aspecto, la divulgación incluye una población de células autólogas o alógenas que se transfectan o transducen con un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de mesotelina-CAR, por ejemplo, como se describe en el presente documento. En una realización, el vector es un vector retroviral. En una realización, el vector es un vector lentiviral autoinactivable como se describe en otra parte en el presente documento. En una realización, el vector se entrega (por ejemplo, por transfección o electroporación) a una célula, por ejemplo, una célula T o una célula NK, en la que el vector comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de mesotelina CAR como se describe en el presente documento, que se transcribe como una molécula de ARNm, y la molécula de mesotelina CAR se traduce a partir de la molécula de ARN y se expresa en la superficie de la célula.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una población de células que expresan CAR, por ejemplo, células CART. En algunas realizaciones, la población de células que expresan CAR comprende una mezcla de células que expresan diferentes CAR. Por ejemplo, en una realización, la población de células CART puede incluir una primera célula que expresa un CAR que tiene un dominio de unión a la antimesotelina descrito en el presente documento, y una segunda célula que expresa un CAR que tiene un dominio de unión a la antimesotelina diferente, por ejemplo, un dominio de unión a la antimesotelina descrito en el presente documento que difiere del dominio de unión a la anti mesotelina en el CAR expresado por la primera célula. Como otro ejemplo, la población de células que expresan CAR puede incluir una primera célula que exprese un CAR que incluya un dominio de unión a la antimesotelina, por ejemplo, como se describe en el presente documento, y una segunda célula que exprese un CAR que incluya un dominio de unión a antígeno a un objetivo distinto de la mesotelina (por ejemplo, un objetivo distinto de la mesotelina en las células del estroma, por ejemplo, FAP; un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de próstata, por ejemplo, receptor de andrógenos, OR51E2, PSMA, PSCA, PDGRF-p, TARP, GloboH, MAD-CT-1 o MAD-CT-2; un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de ovario, por ejemplo, Tn, PRSS21, CD171, Lewis Y, receptor a de folato , claudin6, GloboH, o proteína espermática 17; por ejemplo, un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de pulmón, por ejemplo, VEGF, HER3, IGF-1R, e Gf R, DLL4, o Trop-2). En una realización, la población de células que expresan CAR incluye, por ejemplo, una primera célula que expresa un CAR que incluye un dominio de señalización intracelular primario, y una segunda célula que expresa un CAR que incluye un dominio de señalización secundario.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una población de células en la que al menos una célula de la población expresa un CAR que tiene un dominio de unión a mesotelina descrito en el presente documento, y una segunda célula que expresa otro agente, por ejemplo, un agente que mejora la actividad o la función de una célula que expresa el CAR. Por ejemplo, en una realización, el agente puede ser un agente que inhibe una molécula que modula o regula, por ejemplo, la función de las células T. En algunas realizaciones, la molécula que modula o regula la función de las células T es una molécula inhibidora, por ejemplo, un agente descrito en el presente documento. Algunos ejemplos de moléculas inhibidoras incluyen PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 y TGFR beta. En las realizaciones, un agente, por ejemplo, un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un ARNcd, por ejemplo, un ARNpi o ARNhc; o por ejemplo, una proteína o sistema inhibidor, por ejemplo, una repetición palindrómica corta agrupada y regularmente interespaciada (CRISPR), una nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción (TALEN), o una endonucleasa de dedo de zinc (ZFN), por ejemplo, como se describe en el presente documento, pueden utilizarse para inhibir la expresión de una molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T en la célula que expresa el CAR. En una realización, el agente es un ARNhc, por ejemplo, un ARNhc descrito en el presente documento. En una realización, el agente que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T se inhibe dentro de una célula que expresa CAR. Por ejemplo, una molécula de ARNcd que inhibe la expresión de una molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T está vinculada al ácido nucleico que codifica un componente, por ejemplo, todos los componentes, del CAR.

En una realización, el agente que inhibe una molécula inhibidora comprende un primer polipéptido, por ejemplo, una molécula inhibidora, asociada con un segundo polipéptido que proporciona una señal positiva a la célula, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular descrito en el presente documento. En una realización, el agente comprende un primer polipéptido, por ejemplo, de una molécula inhibidora tal como PD1, PD-L1, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, CTLA4, , VISTA, CD160, BTLA, LAIR1, TIM3, 2B4, TGFR beta y TIGIT, o un fragmento de cualquiera de ellos (por ejemplo, al menos una porción de un dominio extracelular de cualquiera de ellos), y un segundo polipéptido que es un dominio de señalización intracelular descrito en el presente documento (por ejemplo, que comprende un dominio coestimulador (por ejemplo, 41BB, CD27 o CD28, por ejemplo, como se describe en el presente documento) y/o un dominio de señalización primario (por ejemplo, un dominio de señalización CD3 zeta descrito en el presente documento). En una realización, el agente comprende un primer polipéptido de PD1 o un fragmento del mismo (por ejemplo, al menos una porción del dominio extracelular de PD1), y un segundo polipéptido de un dominio de señalización intracelular descrito en el presente documento (por ejemplo, un dominio de señalización CD28 descrito en el presente documento y/o un dominio de señalización CD3 zeta descrito en el presente documento).

En una realización, la molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de mesotelina CAR, por ejemplo, como se describe en el presente, se expresa como una molécula de ARNm. En una realización, las células modificadas genéticamente que expresan mesotelina CAR, por ejemplo, células T o células NK, pueden generarse transfectando o electroporando una molécula de ARN que codifica los CAR deseados (por ejemplo, sin una secuencia vectorial) en la célula. En una realización, una molécula de mesotelina CAR se traduce a partir de la molécula de ARN una vez incorporada y expresada en la superficie de la célula recombinante.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a la molécula de ácido nucleico aislada que codifica una molécula de CAR, por ejemplo, una molécula de CAR descrita en el presente documento, un vector que comprende una molécula de CAR descrita en el presente documento, y/o una célula que comprende una molécula de CAR descrita en el presente documento para su uso como medicamento.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una molécula de CAR descrita en el presente documento, una molécula de CAR descrita en el presente documento, un vector que comprende una molécula de CAR descrita en el presente documento, y/o una célula que comprende una molécula de CAR descrita en el presente documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad que exprese mesotelina, por ejemplo, como se describe en el presente documento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1 es un esquema del plásmido pD-A.anti-meso BD.OF.BBZ.2bg.150A. La figura divulga "150A" como SEQ ID NO: 271.

La FIG. 2 representa la fabricación de células y los programas de tratamiento que pueden utilizarse. (A) Las células autólogas se obtienen mediante aféresis leucocitaria y las células T se enriquecen mediante expansión con perlas magnéticas recubiertas con mAb antiCD3/CD28. Las células se expanden durante 8 a 12 días. En el último día de cultivo, se retiran las perlas utilizando un campo magnético y se lavan las células, se electroporan con el constructo de ARNm meso CAR humano y se criopreservan en medio infusible. (B) Se representan tres programas de infusión de tratamiento. En el Esquema 1, los pacientes reciben 1*108 células CART humanas portadoras de meso por infusión intravenosa (i.v.) el día 0, seguido de 1*109 células CART humanas portadoras de meso una semana después. La seguridad puede controlarse durante un mínimo de un mes antes de que los pacientes sean elegibles para la Lista 2. En el Esquema 2, los pacientes reciben 1*108 células CART humanas portadoras de meso mediante infusión i.v. tres veces por semana durante una semana, seguida de una semana de descanso, y luego 1*109 células CART humanas portadoras de meso administradas tres veces por semana durante una semana. En el esquema 3, los pacientes reciben 3*108/m2 de células CART humanas portadoras de meso por infusión i.v. tres veces por semana durante tres semanas, seguidas de la inyección intratumoral en una lesión primaria de 2*108 células CART humanas portadoras de meso en los días 35 y 57.

La FIG. 3A y 3B son representaciones gráficas de la citotoxicidad ensayada en la célula T del donante 2 (donante sano) transducida con el CAR SS1 de ratón o los CAR antiMSLN M1 a M12 de la divulgación y cultivada con células K562 de control que no expresan MSLN como se muestra en la FIG. 3A, o células K562 transducidas para expresar MSLN (K562-Meso) como se muestra en la FIG. 3B.

La FIG. 4A y 4b son gráficos que muestran la secreción de IFNy de los CART SS1 y CD19 de ratón y de los CART antiMSLN al ser estimulados por células MSLN+. La FIG. 4A muestra la reactividad a la línea celular transducida K562-Meso y a su línea parental K562 negativa a MSLN. La FIG. 4B muestra la reactividad hacia las células cancerosas que expresan naturalmente MSLN; la línea de cáncer de ovario Ovcar8 y las líneas de cáncer de páncreas SW1990 y Panc0203.

La FIG. 5 muestra un diseño de ensayo clínico para los mesotelina CART realizados mediante la transducción de un constructo CAR con un vector lentiviral.

La FIG. 6A, 6B, 6C y 6D muestran la actividad antitumoral de las células CART-meso.

La FIG. 7A, 7B y 7C muestran la persistencia in vivo de las células CARTmeso y el tráfico hacia las zonas tumorales primarias y metastásicas.

La FIG. 8 muestra las citocinas y quimiocinas en el suero tras la infusión de células CARTmeso.

La FIG. 9A y 9B muestran la inducción de anticuerpos antitumorales por parte de las células CARTmeso. El suero se obtuvo del paciente con MPM (FIG. 9A) y el paciente con cáncer de páncreas (FIG. 9B).

La FIG. 10 muestra el crecimiento del tumor en ratones NSG inyectados con células tumorales de EMMESO. Después de que los tumores crecieran hasta un tamaño de ~ 200 mm3, se inyectaron células T mesoCAR a través de la vena de la cola y se midieron durante 39 días después de la inyección.

La FIG. 11A y 11B muestran la expresión de mesoCAR por análisis de citometría de flujo en el momento de la inyección (FIG. 11A) o después de 40 días en el momento de la recolección de los tumores de xenoinjerto. La FIG.12 muestra la capacidad funcional de las células T mesoCAR con respecto a la destrucción in vitro cuando se aíslan del flanco de los ratones NSG después de 39 días, o se conservan criogénicamente después de la transducción.

La FIG. 13 muestra la expresión de las enzimas inhibidoras DGK y SHP1 en los TIL aislados del tumor de flanco EMESO en comparación con los TIL en reposo nocturno.

La FIG. 14A, 14B, 14C, 14D, 14E y 14F muestran el efecto del tratamiento con inhibidores (anti-PDL1, inhibidor de DGK y SSG) de los mecanismos inhibidores que regulan la función de mesoCART en la destrucción de las células tumorales (FIG. 14A, 14C y 14E) y la secreción de citoquinas IFNgamma (FIG.

14B, 14C y 14F).

La FIG. 15a , 15B, 15C y 15D muestran la secreción de citoquinas de un pequeño panel de CART-MSLN humanas tras la estimulación con diversas líneas celulares tumorales. La FIG. 15A muestra la secreción de IFNgamma. La FIG. 15B muestra el TNF. La FIG. 15C muestra la IL-2. La FIG. 15D muestra la IL-4.

La FIG. 16A y 16B muestran los resultados del ensayo de destrucción de CART-MSLN-5, CART-MSLN-11, CART-MSLN17 y CART-MSLN-SS1 murino contra las células tumorales de Ovcar3 (FIG. 16A) y U87mg (FIG.

16B) .

La FIG. 17A y 17B muestran los resultados del ensayo de destrucción del panel de CART-MSLN contra las células tumorales de Ovcar3.

La FIG. 18 muestra la actividad antitumoral de un primer conjunto de CART-MSLN (incluyendo M5, M11, M17 y M21) en el modelo de xenoinjerto Ovcar8.

La FIG. 19 muestra la actividad antitumoral de un segundo conjunto de CART-MSLN (incluyendo M12, M14, M16 y M23) en el modelo de xenoinjerto Ovcar8.

La FIG. 20A, 20B y 20C representan la pérdida de fucncionalidad de las células T mesoCAR en el microambiente tumoral (TIL) a lo largo del tiempo en comparación con las células T mesoCAR frescas o descongeladas. A) Ensayo de citotoxicidad; B) Ensayo de liberación de IFNy; y C) Análisis de transferencia western de la señalización de ERK (vía fosforilación).

La FIG. 21 representa el efecto de la deleción de DGK en la citotoxicidad de las células T mesoCAR. El porcentaje de destrucción de las células objetivo se evalúa en diferentes proporciones efectoras: objetivo. La FIG. 22 representa el efecto de la deleción de DGK en la producción y liberación de IFNy de las células T mesoCAR. La concentración de IFN^yse evalúa en diferentes proporciones efectoras: objetivo.

La FIG. 23 representa el efecto de la deleción de DGK en la señalización de ERK, o la activación de las células T, las células T mesoCAR. B: albúmina, M: mesotelina, 3/28: Células estimuladas CD3/CD28. La FIG. 24 representa el efecto de la deleción de DGK en la sensibilidad al TGFp de las células T mesoCAR con respecto a la actividad citotóxica.

La FIG. 25A y 25B representan el efecto de la supresión de DGK en la eficacia terapéutica de las células T mesoCAR en un modelo de ratón con tumor. A) El efecto sobre la actividad antitumoral se muestra mediante el volumen del tumor a lo largo del tiempo. B) Persistencia y proliferación de las células infiltradas en el tumor. La FIG. 26A, 26B, 26C, 26D, 26E y 26F muestran la producción de citoquinas y la liberación de mediadores citotóxicos en células T que expresan CAR con niveles reducidos de Ikaros. La FIG.26A muestra la expresión de Ikaros en las células T CAR de tipo silvestre y de Ikzfl+/-, medida por citometría de flujo (panel izquierdo) y transferencia western (panel derecho). Tras la estimulación con perlas recubiertas con mesotelina, PMA/Ionomicina (PMA/I) o perlas recubiertas de BSA (control), el porcentaje de células que producen IFN-^y(FIG. 26B), TNF-a (FIG. 26C), e IL-2 (FIG. 26D), el mediador citotóxico granzima B (FIG. 26^e), y la expresión de CD107a (FIG. 26F).

La FIG. 27A, 27B y 27C muestran la producción de citoquinas y la liberación de mediadores citotóxicos en células T que expresan CAR con un alelo negativo dominante de Ikaros (IkDN). Tras la estimulación con perlas recubiertas con mesotelina, PMA/Ionomicina (PMA/I) o perlas recubiertas de BSA (control), el porcentaje de células que producen IFN-y (FIG. 27A), iL-2 (FiG. 27B), y la expresión de CD107a (FIG. 27C). La FIG. 28A, 28B, 28C, 28D y 28E muestra que la depleción de Ikaros no aumentó la activación y señalización de las células T CAR tras la estimulación del antígeno. Los niveles de CD69 (FIG. 28A), CD25 (FIG. 28B), y 4-1BB (FIG. 28C) se determinaron por citometría de flujo en los puntos temporales indicados en las células T Ikzfl+/-CAR. En la FIG. 28D, se examinaron las vías de señalización RAS/ERK en células de tipo silvestre (WT) y en células Ikaros dominantemente negativas (IkDN) tras la estimulación del TCR con anticuerpos CD3/CD28. Los niveles de proteínas de señalización del TCR fosforiladas, tal como PLCy fosforilada, Lck fosforilada, JNK fosforilada, Akt fosforilada, ERK fosforilada, IKKa fosforilada y iKBa se evaluaron mediante transferencia western. En la FIG. 28E, las células WT e IkDN transducidas con mesoCAR se estimularon con BSA o con perlas recubiertas con mesotelina, y se examinaron las vías de señalización corriente abajo mediante transferencia western evaluando los niveles de ERK fosforilada y PLCy fosforilada.

La FIG. 29A, 29B, 29C, 29D y 29E muestra que la reducción de Ikaros en las células T CAR aumenta la respuesta contra las células objetivo AE17 o AE17 que expresan mesotelina (AE17 meso)n vitro. La FIG.

29A representa la producción de IFN^yen células WT y Ikzfl+/-meso CART en las proporciones indicadas de células efectoras: objetivo. La citolisis de los meso ^cA ^rque expresan WT e Ikzfl+/-(FIG. 29B) e IkDN (FIG.

29C) se midió en las proporciones indicadas de células efectoras: objetivo. La producción de IFN^y(FIG. 29D) y citolisis (FIG. 29E) de WT e Ikzfl+/-transducidas con FAP-CAR se midió en las proporciones indicadas de células efectoras: objetivo, donde las células objetivo eran células 3T3 que expresaban FAP.

La FIG. 30A, 30B y 30C muestran la eficacia de las células T CAR con depleción de Ikaros contra tumores establecidos in vivo. Se administraron células T CAR a ratones portadores de tumores AE17 con expresión de mesotelina. Se midió el volumen del tumor después de la administración con WT y Ikzfl+/- que expresan mesoCAR (FIG. 30A) o IkDN (FIG. 30B). Se midió el volumen del tumor tras la administración de FAP-CAR-que expresan WT e Ikzfl+/-(FIG. 30C).

La FIG. 31A, 31B, 31C, 31D, 31E y 31F muestran la mayor persistencia y resistencia de las células T CAR Ikzfl+/- en el microambiente tumoral inmunosupresor en comparación con las células T CAR WT. El porcentaje de células WT o Ikzfl+/- que expresan c Ar (GFP positivas) se detectó por citometría de flujo a partir de la cosecha del bazo (FIG. 31A) y los tumores (FIG. 3 lB). La capacidad funcional de las células T CAR cosechadas 3 días después de la infusión en el bazo o en los tumores se evaluó midiendo la producción de IFNy tras la estimulación con anticuerpos CD3/CD28 (FIG. 31C) o PMA/Ionomicina (PMA/I) (FIG. 31D). Las células T reguladoras (expresión de CD4+FoxP3+) y los macrófagos (expresión de CD206) se evaluaron midiendo la expresión de los marcadores Treg o macrófagos en las células T CAR recogidas 9 días después de la infusión en el bazo o en los tumores.

La FIG. 32A y 32B muestra que las células T con niveles reducidos de Ikaros son menos sensibles a los factores inhibidores solubles TGFp y adenosina. Se comprobó la capacidad de las células WT, Ikzfl+/-e IkDN que expresan MesoCAR para producir IFNy (FIG. 32A) y la citotoxicidad (FIG. 32B) en respuesta al TGF-p o a la adenosina.

La FIG. 33A y 33B son gráficos que muestran un aumento de los títulos a las cepas de la vacuna contra la gripe en comparación con el placebo. En la FIG. 33A, se muestra el aumento por encima de la línea de base en los títulos medios geométricos de la gripe a cada una de las 3 cepas de la vacuna contra la gripe (H1N1 A/California/ 07/2009, H3N2 A/Victoria/210/2009, B/Brisbane/60/ 2008) en relación con el aumento en la cohorte de placebo 4 semanas después de la vacunación para cada una de las cohortes de dosificación de RAD001 en la población por intención de tratar. La línea negra en negrilla indica el aumento de 1,2 veces en los títulos en relación con el placebo que se requiere para cumplir con 2 de las 3 cepas de la vacuna contra la gripe para cumplir con el criterio de valoración principal del estudio. La estrella "*" indica que el aumento del título del GMT en relación con el placebo es superior a 1 con una probabilidad posterior de al menos 80 %. La FIG. 33B es un gráfico de los mismos datos que en la FIG. 33A para el subconjunto de sujetos con títulos gripe de línea de base <= 1:40.

La FIG. 34 muestra un gráfico de dispersión de la concentración de RAD001 frente al aumento del pliegue de la media geométrica del título de cada cepa de la vacuna antigripal 4 semanas después de la vacunación. Las concentraciones de RAD001 (1 hora después de la dosis) se midieron después de que los sujetos hubieran recibido la dosis durante 4 semanas. Todos los sujetos que tenían mediciones farmacocinéticas se incluyeron en el conjunto de análisis. En el eje y se muestra el aumento de veces de la media geométrica de los títulos a las 4 semanas después de la vacunación en relación con la línea de base.

La FIG. 35 es una representación gráfica que muestra el aumento de los títulos a las cepas de gripe heterólogas en comparación con el placebo. Se muestra el aumento por encima de la línea de base en los títulos medios geométricos de la gripe a 2 cepas heterólogas de la gripe (cepa A/H1N1 A/Nueva Jersey/8/76 y cepa A/H3N2 A/Victoria/361/11) no contenidas en la vacuna contra la gripe en relación con el aumento en la cohorte de placebo 4 semanas después de la vacunación para cada una de las cohortes de dosificación de RAD001 en la población por intención de tratar. * indica que el aumento del título en relación con el placebo es superior a 1 con una probabilidad posterior de al menos 80 %.

La FIG. 36A y 36B son representaciones gráficas de los niveles de IgG e IgM antes y después de la vacunación contra la gripe. Se midieron los niveles de IgG e IgM antigripe A/H1N1/California/07/2009 en el suero obtenido de los sujetos antes y 4 semanas después de la vacunación contra la gripe. No se detectaron diferencias significativas en el cambio de los niveles de IgG e IgM antigripe H1N1 entre las cohortes de RAD001 y de placebo desde la línea de base hasta las 4 semanas posteriores a la vacunación (todos los valores p > 0,05 mediante la prueba de suma de intervalos de Kruskal-Wallis).

La FIG. 37A, 37B y 37C son representaciones gráficas de la disminución del porcentaje de células T CD4 y CD8 positivas a PD-1 y del aumento de células T CD4 negativas a PD-1 tras el tratamiento con RAD001. El porcentaje de células T CD4, CD8 positivas a PD-1 y CD4 negativas a PD-1 se determinó mediante un análisis FACS de muestras de PBMC en la línea de base, después de 6 semanas de tratamiento con el fármaco del estudio (Semana 6) y 6 semanas después de la interrupción del fármaco del estudio y 4 semanas después de la vacunación contra la gripe (Semana 12). La FIG. 37A muestra que hubo una disminución significativa (-37,1 - 28,5 %) de las células T CD4 positivas a PD-1 en la semana 12 en las cohortes que recibieron RAD001 a niveles de dosis de 0,5 mg/día (n=25), 5 mg/semana (n=29) y 20 mg/semana (n=30) en comparación con la cohorte de placebo (n=25) con p=0,002 (0,02), p=0,003 (q=0,03) y p= 0,01 (q=0,05) respectivamente. La FIG. 37B muestra que hubo una disminución significativa (-43,3 --38,5%) de las células T CD8 positivas a PD-1 en la semana 12 en las cohortes que recibieron RAD001 (n=109) en los niveles de dosis 0,5 mg/día (n=25), 5mg/semana (n=29) y 20 mg/semana (n=30) en comparación con la cohorte de placebo (n=25) con p=0,01 (0,05), p=0,007 (q=0,04) y p= 0,01 (q=0,05) respectivamente. La FIG. 37C muestra que hubo un aumento significativo (3,0 - 4,9%) en las células T CD4 negativas a PD-1 en la semana 12 en las cohortes que recibieron RAD001 (n=109) en los niveles de dosis de 0,5 mg/día (n=25), 5 mg/semana (n=29) y 20 mg/semana (n=30) en comparación con la cohorte de placebo (n=25) con p=0,0007 (0,02), p=0,03 (q=0,08) respectivamente.

La FIG. 38A y 38B son representaciones gráficas de la disminución del porcentaje de células T CD4 y CD8 positivas a PD-1 y del aumento de células T CD4 negativas a PD-1 tras el tratamiento con RAD001, ajustado por las diferencias en la expresión de PD-1 en la línea de base. El porcentaje de células T CD4, CD8 positivas a PD-1 y CD4 negativas a PD-1 se determinó mediante un análisis FACS de muestras de PBMC en la línea de base, después de 6 semanas de tratamiento con el fármaco del estudio (Semana 6) y 6 semanas después de la interrupción del fármaco del estudio y 4 semanas después de la vacunación contra la gripe (Semana 12). La FIG. 38A muestra una disminución significativa del 30,2 % en las células T CD4 PD-1+ en la semana 6 en la cohorte de RAD agrupada (n=84) en comparación con la cohorte de placebo (n=25) con p=0,03 (q=0,13). La disminución de las células T CD4 positivas a PD-1 en la semana 12 en el RAD agrupado en comparación con la cohorte de placebo es 32,7 % con p=0,05 (q=0,19). La FIG. 38B muestra una disminución significativa de 37,4% en las células T CD8 positivas a PD-1 en la semana 6 en la cohorte combinada de RAD001 (n=84) en comparación con la cohorte de placebo (n=25) con p=0,008 (q=0,07). La disminución de las células T CD8 positivas a PD-1 en la semana 12 en el conjunto de RAD001 en comparación con la cohorte de placebo es 41,4 % con p=0,066 (q=0,21). La FIG. 38A y 38B representan los datos de la FIG. 37A, 37B y 37C, pero con los diferentes grupos de dosificaciones de RAD001 de la FIG. 37A, 37B y 37C agrupados en el único grupo tratado con RAD001 en la FIG. 38A y 38B.

La FIG. 39 representa el aumento del ejercicio y la energía en sujetos de edad avanzada en respuesta al RAD001.

La FIG. 40A y 40B representan el efecto previsto de RAD001 sobre la actividad de P70 S6K en las células. La FIG. 40A representa la inhibición de la quinasa P70 S6 con dosis más altas de RAD001 semanales y diarias; la FIG. 40B representa la inhibición de la quinasa P70 S6 con dosis más bajas de RAD001 semanal.

La FIG. 41A, 41B y 41C son sensogramas SPR de Biacore T200 para los scFvs SS1 (FIG. 41A), M5 (FIG.

41B), y M11 (FIG. 41C).

La FIG. 42A, 42B y 42C son sensogramas SPR de unión de epítopos para los scFv antimesotelina humana en comparación con el scFv SS1 murino. Se observó una unión competitiva para los scFv M12, M14, M16, M17, M21 y M23 (FIG. 42A). ScFv M5 (FIG. 42B) y M11 (FIG. 42C) se unen a un epítopo diferente del SS1. La FIG. 43 es un gráfico que representa el crecimiento del tumor después de diversos tratamientos con mesotelina CAR T en el modelo de tumor OVCAR8. Volumen tumoral medio /- SEM hasta el día 62 después de la implantación del tumor. Las células T se administraron los días 14 y 19. Círculos pequeños: ratones tratados con 100 ul de PBS por la vena lateral de la cola; cuadrados negros: ratones tratados con células T de control del isotipo; triángulos grises: ratones tratados con una dosis de células T CAR SS1; triángulos invertidos: ratones tratados con una dosis doble de células T CAR SS1; diamantes: ratones tratados con una dosis única de células T CAR M5; círculos grandes: ratones tratados con una dosis doble de células T CAR M5; cuadrados grises: ratones tratados con una dosis única de células T CAR M11; y triángulos negros: ratones tratados con una dosis doble de células T CAR M11.

La FIG. 44 es una representación esquemática de la cobertura del péptido mesotelina humana en el análisis de espectrometría de masas por intercambio de deuterio de hidrógeno. Cada barra negra representa un péptido.

La FIG. 45A y 45B son representaciones gráficas que muestran la diferencia en la captación de deuterio de la mesotelina humana cuando está en complejo con SS1 (barras negras) y M5 (barras grises). La diferencia en la captación de deuterio tras la unión del anticuerpo (representada en el eje y) se representa para cada fragmento de péptido detectado (representado en el eje x), con péptidos en los aminoácidos 297-464 en la FIG. 45A y los péptidos de los aminoácidos 458-586 de la FIG. 45B. Todas las diferencias son relativas a la captación de deuterio de la mesotelina no unida (control). * denotan las regiones de significación estadística utilizando la prueba de Tukey para los péptidos con una diferencia inferior a 0,75 Da.

La FIG. 46 es una representación esquemática que muestra la secuencia primaria del antígeno mesotelina humana (aminoácidos 296-588) y las regiones protegidas por SS1 y M5. Las barras negras designan los aminoácidos protegidos cuando se complejan con SS1 (aminoácidos 314-315, 317-318, 346-349 y 369-375). Las barras grises designan los aminoácidos protegidos cuando se complejan con M5 (aminoácidos 485-490, 498-507, 532-537 y 545-572). La FIG. 47 muestra un mapa genérico con diferentes configuraciones de constructos que codifican un CAR con un ARNhc para la coexpresión del CAR y un ARNhc. Las Fig. 47A-47D muestran las diversas configuraciones en un solo vector, por ejemplo, donde el ARNhc regulado por U6 está corriente arriba o corriente abajo de los elementos codificadores de CAR regulados por EF1 alfa. En los constructos ejemplares representadas en la Fig. 47A y 47B, la transcripción se produce a través de los promotores u 6 y EF1 alfa en la misma dirección. En los constructos ejemplares representadas en la Fig. 47C y 47D, la transcripción se produce a través de los promotores U6 y EF1 alfa en diferentes direcciones. En la Figura 47E, el ARNhc (y el correspondiente promotor U6) está en un primer vector, y el CAR (y el correspondiente promotor EF1 alfa) está en un segundo vector (Fig. 16E).

La FIG. 48 representa las estructuras de dos configuraciones RCAR ejemplares. Los miembros de unión al antígeno comprenden un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de conmutación. Los miembros de unión intracelular comprenden un dominio de conmutación, un dominio de señalización coestimuladora y un dominio de señalización primaria. Las dos configuraciones demuestran que el primer y segundo dominios de conmutación descritos en el presente documento pueden estar en diferentes orientaciones con respecto al miembro de unión al antígeno y al miembro de unión intracelular. En el presente documento se describen otras configuraciones de RCAR.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Definiciones

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por una persona con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenece la divulgación.

Los términos "un" y "una" se refieren a uno o a más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

El término "aproximadamente" cuando se refiere a un valor medible como una cantidad, una duración temporal, y similares, se entiende que abarca variaciones de ±20 % o en algunos casos ±10 %, o en algunos casos ±5 %, o en algunos casos ±1 %, o en algunos casos ±0,1 % del valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas para realizar los procedimientos divulgados.

El término "Receptor Antigénico Quimérico" o alternativamente "CAR" se refiere a un conjunto de polipéptidos, típicamente dos en las realizaciones más sencillas, que cuando se encuentran en una célula efectora inmune, proporcionan a la célula especificidad para una célula objetivo, típicamente una célula cancerosa, y con generación de señales intracelulares. En algunas realizaciones, un CAR comprende al menos un dominio de unión a antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización citoplásmica (también denominado en el presente documento "un dominio de señalización intracelular") que comprende un dominio de señalización funcional derivado de una molécula estimuladora y/o una molécula coestimuladora como se define a continuación. En algunos aspectos, el conjunto de polipéptidos es contiguos entre sí. En algunas realizaciones, el conjunto de polipéptidos incluye un interruptor de dimerización que, en presencia de una molécula de dimerización, puede acoplar los polipéptidos entre sí, por ejemplo, puede acoplar un dominio de unión a antígeno a un dominio de señalización intracelular. En un aspecto, la molécula estimuladora es la cadena zeta asociada al complejo receptor de células T. En un aspecto, el dominio de señalización citoplasmática comprende además uno o más dominios de señalización funcionales derivados de al menos una molécula coestimuladora como se define a continuación. En un aspecto, la molécula coestimuladora se elige entre las moléculas coestimuladoras descritas en el presente documento, por ejemplo, 4-1BB (es decir, CD137), CD27 y/o CD28. En un aspecto, el CAR comprende una proteína de fusión quimérica que comprende un dominio de unión al antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización funcional derivado de una molécula estimuladora. En un aspecto, el CAR comprende una proteína de fusión quimérica que comprende un dominio de unión al antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización funcional derivado de una molécula coestimuladora y un dominio de señalización funcional derivado de una molécula estimuladora. En un aspecto, el CAR comprende una proteína de fusión quimérica que comprende un dominio de unión al antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende dos dominios de señalización funcional derivados de una o más moléculas coestimuladoras y un dominio de señalización funcional derivado de una molécula estimuladora. En un aspecto, el CAR comprende una proteína de fusión quimérica que comprende un dominio de unión al antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende al menos dos dominios de señalización funcional derivados de una o más moléculas coestimuladoras y un dominio de señalización funcional derivado de una molécula estimuladora. En un aspecto, el CAR comprende una secuencia líder opcional en el amino-terminal (N-ter) de la proteína de fusión CAR. En un aspecto, el CAR comprende además una secuencia líder en el N-terminal del dominio de unión a antígeno extracelular, en el que la secuencia líder se escinde opcionalmente del dominio de unión a antígeno (por ejemplo, un scFv) durante el procesamiento celular y la localización del CAR a la membrana celular.

El término "dominio de señalización" se refiere a la porción funcional de una proteína que actúa transmitiendo información dentro de la célula para regular la actividad celular a través de vías de señalización definidas, generando segundos mensajeros o funcionando como efectores al responder a dichos mensajeros.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "mesotelina" se refiere a la proteína de 40-kDa, mesotelina, que está anclada en la membrana celular por un enlace de glucosilfosfatidil inositol (GPI) y un fragmento desprendido amino-terminal de 31 kDa, llamado factor potenciador de megcariocito (MPF). Ambos fragmentos contienen sitios de N-glicosilación. El término también se refiere a una variante de empalme soluble del fragmento carboxilo-terminal de 40 kDa, también llamada "mesotelina soluble/relacionada con MPF". Preferentemente, el término se refiere a una mesotelina humana del número de acceso del GenBank AAH03512.1, y a porciones naturalmente escindidas de la misma, por ejemplo, tal como se expresa en la membrana de una célula, por ejemplo, de una célula cancerosa.

El término "anticuerpo", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a una proteína o secuencia polipeptídica derivada de una molécula de inmunoglobulina que se une específicamente a un antígeno. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales, de cadena múltiple o única, o inmunoglobulinas intactas, y pueden proceder de fuentes naturales o de fuentes recombinantes. Los anticuerpos pueden ser tetrámeros de moléculas de inmunoglobulina.

El término "fragmento de anticuerpo" se refiere a por lo menos una porción de un anticuerpo, que retiene la capacidad de interactuar específicamente con (por ejemplo, por unión, impedimento estérico, estabilización/desestabilización, distribución espacial) un epítopo de un antígeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan Fab, Fab', F(ab')2, Fv , fragmentos de Fv, fragmentos de anticuerpos scFv, Fvs enlazados por disulfuro (sdFv), un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CHI, anticuerpos lineales, anticuerpos de dominio único tales como sdAb (ya sea VL o VH), dominios VHH de camélidos, anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos tales como un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por una brida disulfuro en la región bisagra, y un CDR aislado u otros fragmentos de unión a epítopos de un anticuerpo. Un fragmento de unión a antígeno también puede incorporarse a anticuerpos de dominio único, maxicuerpos, minicuerpos, nanocuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (véase, por ejemplo, Hollinger y Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005). Los fragmentos de unión a antígenos también pueden injertarse en andamios con base en polipéptidos tales como la fibronectina tipo III (Fn3) (véase Patente de EE. UU. No.: 6,703,199que describe minicuerpos de polipéptidos de fibronectina).

El término "scFv" se refiere a una proteína de fusión que comprende al menos un fragmento de anticuerpo que comprende una región variable de una cadena ligera y al menos un fragmento de anticuerpo que comprende una región variable de una cadena pesada, en la que las regiones variables de la cadena ligera y pesada están unidas de forma contigua, por ejemplo, a través de un enlazador sintético, por ejemplo, un enlazador polipeptídico corto y flexible, y que puede expresarse como un polipéptido de cadena única, y en la que el scFv conserva la especificidad del anticuerpo intacto del que se deriva. A menos que se especifique, tal como se utiliza en el presente documento, un scFv puede tener las regiones variables VL y VH en cualquier orden, por ejemplo, con respecto a los extremos Nterminal y C-terminal del polipéptido, el scFv puede comprender VL-enlazador-VH o puede comprender VH-enlazador-VL.

La porción del CAR de la divulgación que comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo del mismo puede existir en una variedad de formas en las que el dominio de unión al antígeno se expresa como parte de una cadena polipeptídica contigua incluyendo, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo de dominio único (sdAb), un anticuerpo de cadena única (scFv) un anticuerpo humanizado o un anticuerpo biespecífico (Harlow et al., 1999, In: Uso de anticuerpos: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, En: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 Bird et al., 1988, Science 242:423-426). En un aspecto, el dominio de unión a antígeno de una composición de CAR de la divulgación comprende un fragmento de anticuerpo. En otro aspecto, el CAR comprende un fragmento de anticuerpo que comprende un scFv.

El término "cadena pesada del anticuerpo" se refiere al mayor de los dos tipos de cadenas polipeptídicas presentes en las moléculas de anticuerpos en sus conformaciones naturales, y que normalmente determina la clase a la que pertenece el anticuerpo.

El término "cadena ligera de anticuerpos" se refiere al más pequeño de los dos tipos de cadenas polipeptídicas presentes en las moléculas de anticuerpos en sus conformaciones naturales. Las cadenas ligeras kappa (k) y lambda (A) se refieren a los dos principales isotipos de cadenas ligeras de anticuerpos.

El término "anticuerpo recombinante" se refiere a un anticuerpo que se genera utilizando tecnología de ADN recombinante, tal como, por ejemplo, un anticuerpo expresado por un sistema de expresión de bacteriófagos o de levadura. El término también debe interpretarse como un anticuerpo que ha sido generado por la síntesis de una molécula de ADN que codifica el anticuerpo y cuya molécula de ADN expresa una proteína de anticuerpo, o una secuencia de aminoácidos que especifica el anticuerpo, en la que el ADN o la secuencia de aminoácidos se ha obtenido utilizando la tecnología de ADN recombinante o de secuencia de aminoácidos que está disponible y es bien conocida en la técnica.

El término "antígeno" o "Ag" se refiere a una molécula que provoca una respuesta inmunitaria. Esta respuesta inmunitaria puede implicar la producción de anticuerpos, la activación de células específicas inmunológicamente competentes, o ambas. El artesano experto entenderá que cualquier macromolécula, incluyendo prácticamente todas las proteínas o péptidos, puede servir como antígeno. Además, los antígenos pueden derivarse de ADN recombinante o genómico. Un artesano experto entenderá que cualquier ADN que comprenda una secuencia de nucleótidos o una secuencia parcial de nucleótidos que codifique una proteína que provoque una respuesta inmunitaria codifica, por lo tanto, un "antígeno" tal como se utiliza este término en el presente documento. Además, un experto en la técnica entenderá que un antígeno no necesita estar codificado únicamente por una secuencia de nucleótidos de longitud completa de un gen. Es evidente que la presente divulgación incluye, pero no se limita a, el uso de secuencias parciales de nucleótidos de más de un gen y que estas secuencias de nucleótidos están dispuestas en diversas combinaciones para codificar polipéptidos que provocan la respuesta inmunitaria deseada. Además, un artesano experto entenderá que no es necesario que un antígeno esté codificado por un "gen" en absoluto. Es evidente que un antígeno puede generarse sintetizado o puede derivarse de una muestra biológica, o puede ser una macromolécula además de un polipéptido. Dicha muestra biológica puede incluir, pero no se limita a una muestra de tejido, una muestra de tumor, una célula o un fluido con otros componentes biológicos.

El término "competir" se refiere a la capacidad de un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo, de interferir con unión directa o indirectamente de otro dominio de unión a antígeno, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno proporcionado en el presente documento, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo proporcionado en el presente documento, al objetivo, por ejemplo, la mesotelina. El grado en que un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo, es capaz de interferir con la unión de otro dominio de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo, al objetivo, y por lo tanto si puede decirse que compite, puede determinarse utilizando un ensayo de unión por competencia. En algunas realizaciones, un ensayo de unión por competencia es un ensayo de competencia cuantitativo. Por ejemplo, un ensayo de competencia cuantitativo particularmente adecuado utiliza un enfoque con base en la resonancia de plasmón de superficie (SPR) para medir la unión, por ejemplo, la competencia, entre un anticuerpo o fragmento del mismo y otro anticuerpo o fragmento del mismo para la unión a un objetivo inmovilizado. En el Ejemplo 2 del presente documento se describe un ensayo de competencia ejemplar con base en SPR. Otro ensayo de competencia cuantitativa adecuado utiliza un enfoque con base en FACS para medir la competencia entre un anticuerpo marcado (por ejemplo, marcado con His, biotinilado o marcado radioactivamente, entre otros) o un fragmento del mismo y otro anticuerpo o fragmento del mismo para unirse al objetivo.

El término "efecto anticanceroso" se refiere a un efecto biológico que puede manifestarse por diversos medios, incluyendo, pero sin limitarse a , por ejemplo, una disminución del volumen del tumor, una disminución del número de células cancerosas, una disminución del número de metástasis, un aumento de la esperanza de vida, una disminución de la proliferación de las células cancerosas, una disminución de la supervivencia de las células cancerosas o una mejora de diversos síntomas fisiológicos asociados a la condición cancerosa. Un "efecto anticáncer" también puede manifestarse por la capacidad de los péptidos, polinucleótidos, células y anticuerpos en la prevención de la aparición del cáncer en primer lugar. El término "efecto antitumoral" se refiere a un efecto biológico que puede manifestarse por diversos medios, incluyendo, pero no limitándose a, por ejemplo, una disminución del volumen del tumor, una disminución del número de células tumorales, una disminución de la proliferación de las células tumorales o una disminución de la supervivencia de las células tumorales.

El término "autólogo" se refiere a cualquier material derivado del mismo individuo al que posteriormente se le va a reintroducir.

El término "alogénico" se refiere a cualquier material derivado de un animal diferente de la misma especie que el individuo al que se introduce el material. Se dice que dos o más individuos son alogénicos entre sí cuando los genes de uno o más loci no son idénticos. En algunos aspectos, el material alogénico de individuos de la misma especie puede ser lo suficientemente diferente genéticamente como para interactuar antigénicamente.

El término "xenogénico" se refiere a un injerto derivado de un animal de una especie diferente.

El término "cáncer" se refiere a una enfermedad caracterizada por el crecimiento incontrolado de células aberrantes. Las células cancerosas pueden propagarse localmente o a través del torrente sanguíneo y el sistema linfático a otras partes del cuerpo. En el presente documento se describen ejemplos de diversos tipos de cáncer e incluyen, pero no se limitan a, el mesotelioma, el cáncer de mama, el cáncer de próstata, el cáncer de ovario, el cáncer de cuello uterino, el cáncer de piel, el cáncer de páncreas, el cáncer colorrectal, el cáncer renal, el cáncer de hígado, el cáncer cerebral, el linfoma, la leucemia, el cáncer de pulmón y otros similares.

La frase "enfermedad asociada con la expresión de mesotelina" incluye, pero no se limita a, una enfermedad asociada con la expresión de mesotelina o una condición asociada con células que expresan mesotelina incluyendo, por ejemplo, enfermedades proliferativas tal como un cáncer o una malignidad o una condición precancerosa tal como una hiperplasia mesotelial; o una indicación no relacionada con el cáncer asociada con células que expresan mesotelina. Los ejemplos de diversos tipos de cáncer que expresan mesotelina incluyen, pero no se limitan a, el mesotelioma, el cáncer de pulmón, el cáncer de ovario, el cáncer de páncreas y similares.

El término "modificaciones conservadoras de la secuencia" se refiere a las modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Estas modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y supresiones de aminoácidos. Las modificaciones pueden introducirse en un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la divulgación mediante técnicas estándar conocidas en la técnica, tal como la mutagénesis dirigida por sitio y la mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos son aquellas en las que el residuo de aminoácido se sustituye por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Así, uno o más residuos de aminoácidos dentro de un CAR de la invención pueden ser sustituidos por otros residuos de aminoácidos de la misma familia de cadenas laterales y el CAR alterado puede ser probado, por ejemplo, para la capacidad de unirse a la mesotelina utilizando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.

El término "estimulación" se refiere a una respuesta primaria inducida por la unión de una molécula estimuladora (por ejemplo, un complejo TCR/CD3 o CAR) con su ligando afín (o antígeno tumoral en el caso de un CAR), mediando así un evento de transducción de señales, tal como, pero sin limitarse a, la transducción de señales a través del complejo TCR/CD3 o la transducción de señales a través del receptor NK apropiado o los dominios de señalización del Ca R. La estimulación puede mediar una expresión alterada de ciertas moléculas.

El término "molécula estimuladora" se refiere a una molécula expresada por una célula inmunitaria (por ejemplo, célula T, célula NK, célula B) que proporciona la(s) secuencia(s) de señalización citoplásmica que regula(n) la activación de la célula inmunitaria de forma estimuladora para al menos algún aspecto de la vía de señalización de la célula inmunitaria. En un aspecto, la señal es una señal primaria que se inicia, por ejemplo, por la unión de un complejo TCR/CD3 con una molécula MHC cargada con un péptido, y que conduce a la mediación de una respuesta de células T, incluyendo, pero sin limitarse a, la proliferación, la activación, la diferenciación, y similares. Una secuencia de señalización citoplasmática primaria (también denominada "dominio de señalización primaria") que actúa de forma estimulante puede contener un motivo de señalización que se conoce como motivo de activación con base en tirosina inmunorreceptora o ITAM. Los ejemplos de una secuencia de señalización citoplasmática que contiene ITAM que es de uso particular en la divulgación incluyen, pero no se limitan a, los derivados de CD3 zeta, FcR gamma común (FCER1G), Fc gamma RIIa" FcR beta (Fc Epsilon R1b), CD3 gamma, CD3 delta , CD3 epsilon, CD79a, CD79b, DAP10 y DAP12. En un CAR específico de la divulgación, el dominio de señalización intracelular en uno o más CARS de la divulgación comprende una secuencia de señalización intracelular, por ejemplo, una secuencia de señalización primaria de CD3-zeta. En un CAR específico de la divulgación, la secuencia de señalización primaria de CD3-zeta es la secuencia proporcionada como SEQ ID NO:9, o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, primate y similares. En un CAR específico de la divulgación, la secuencia de señalización primaria de CD3-zeta es la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 10, o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, primate y similares.

El término "célula presentadora de antígeno" o "APC" se refiere a una célula del sistema inmunitario, tal como una célula accesoria (por ejemplo, una célula B, una célula dendrítica, y similares) que muestra un antígeno extraño complejado con complejos mayores de histocompatibilidad (MHC) en su superficie. Las células T pueden reconocer estos complejos mediante sus receptores de células T (TCR). Las APC procesan los antígenos y los presentan a las células T.

Un "dominio de señalización intracelular", tal como se utiliza el término en el presente documento, se refiere a una porción intracelular de una molécula. El dominio de señalización intracelular genera una señal que promueve una función de efector inmunitario de la célula que contiene CAR, por ejemplo, una célula CART. Los ejemplos de la función efectora inmunitaria, por ejemplo, en una célula CART, incluyen la actividad citolítica y la actividad de ayuda, incluyendo la secreción de citocinas.

En una realización, el dominio de señalización intracelular puede comprender un dominio de señalización intracelular primario. Los dominios de señalización intracelular primaria ejemplares incluyen los derivados de las moléculas responsables de la estimulación primaria, o la simulación dependiente de antígenos. En una realización, el dominio de señalización intracelular puede comprender un dominio intracelular coestimulador. Los dominios de señalización intracelular coestimuladora ejemplares incluyen los derivados de las moléculas responsables de las señales coestimuladoras, o de la estimulación independiente del antígeno. Por ejemplo, en el caso de un CART, un dominio de señalización intracelular primario puede comprender una secuencia citoplásmica de un receptor de células T, y un dominio de señalización intracelular coestimuladora puede comprender una secuencia citoplásmica de un correceptor o una molécula coestimuladora.

Un dominio de señalización intracelular primario puede comprender un motivo de señalización que se conoce como motivo de activación con base en tirosina inmunorreceptora o ITAM. Los ejemplos de ITAM que contienen secuencias de señalización citoplasmática primaria incluyen, pero no se limitan a, los derivados de CD3 zeta, FcR gamma común (FCER1G), Fc gamma RIIa" FcR beta (Fc Epsilon R1b), CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon, CD79a, CD79b, DAP10 y DAP12.

El término "zeta" o alternativamente "cadena zeta", "CD3-zeta" o "TCR-zeta" se define como la proteína proporcionada como GenBan Acc. No. BAG36664.1, o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, primate y similares, y un "dominio estimulante zeta" o alternativamente un "dominio estimulante CD3-zeta" o un "dominio estimulante TCR-zeta" se define como los residuos de aminoácidos del dominio citoplásmico de la cadena zeta, o derivados funcionales de los mismos, que son suficientes para transmitir funcionalmente una señal inicial necesaria para la activación de las células T. En un aspecto, el dominio citoplasmático de zeta comprende los residuos 52 a 164 del GenBank Acc. BAG36664.1 o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, primate y similares, que son ortólogos funcionales del mismo. En un aspecto, el "dominio estimulador zeta" o un "dominio estimulador CD3-zeta" es la secuencia proporcionada como SEQ ID NO:9. En un aspecto, el "dominio estimulador zeta" o un "dominio estimulador CD3-zeta" es la secuencia proporcionada como SEQ ID NO: 10.

El término "molécula coestimuladora" se refiere a un socio de unión afín en una célula T que se une específicamente con un ligando coestimulador, mediando así una respuesta coestimuladora por parte de la célula T, tal como, por ejemplo, la proliferación. Las moléculas coestimuladoras son moléculas de la superficie celular distintas de los receptores de antígenos o sus ligandos que contribuyen a una respuesta inmunitaria eficaz. Las moléculas coestimuladoras incluyen, entre otras, una molécula MHC de clase I, BTLA y un receptor de ligando Toll, así como OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) y 4-1BB (CD137). Otros ejemplos de tales moléculas coestimuladoras incluyen CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8alpha, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alpha, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, La T, GADS, SLP-76, PAG/Cbp y un ligando que se une específicamente con c D83

Un dominio de señalización intracelular costimulador puede ser una porción intracelular de una molécula coestimuladora. Una molécula coestimuladora puede estar representada en las siguientes familias de proteínas: Proteínas receptoras del TNF, proteínas similares a las inmunoglobulinas, receptores de citoquinas, integrinas, moléculas de activación linfocítica de señalización (proteínas SLAM) y receptores de células NK activadoras. Ejemplos de tales moléculas incluyen CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, ICAM1, antígeno-1 asociado a la función de los linfocitos (LFA-1), CD2, CDS, CD7, CD287, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, y un ligando que se une específicamente con CD83, y similares.

El dominio de señalización intracelular puede comprender toda la porción intracelular, o todo el dominio de señalización intracelular nativo, de la molécula de la que se deriva, o un fragmento funcional o derivado del mismo.

El término "4-1BB" se refiere a un miembro de la superfamilia TNFR con una secuencia de aminoácidos proporcionada como GenBank Acc. No. AAA62478.2, o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, primate y similares. En un aspecto, un "dominio costimulador 4-1BB" se define como los residuos aminoácidos 214-255 del GenBank Acc. No. AAA62478.2, o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, primate y similares. En un aspecto, el "dominio costimulador 4-1BB" es la secuencia proporcionada como SEQ ID NO:7 o los residuos equivalentes de una especie no humana, por ejemplo, ratón, roedor, mono, primate y similares.

Una "célula presentadora de antígenos", tal como se utiliza en el presente documento, significa una célula del sistema inmunitario tal como una célula accesoria (por ejemplo, una célula B, una célula dendrítica y similares) que muestra antígenos extraños complejados con complejos mayores de histocompatibilidad (MHC) en sus superficies. Las células T pueden reconocer estos complejos mediante sus receptores de células T (TCR). Las APC procesan los antígenos y los presentan a las células T.

El término "codificación" se refiere a la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un polinucleótido, tal como un gen, un ADNc o un ARNm, de servir como plantillas para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procedimientos biológicos que tienen una secuencia definida de nucleótidos (es decir, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia definida de aminoácidos y las propiedades biológicas resultantes. Así, un gen, ADNc o ARN, codifica una proteína si la transcripción y traducción del ARNm correspondiente a ese gen produce la proteína en una célula u otro sistema biológico. Tanto la cadena codificante, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la del ARNm y que suele proporcionarse en listados de secuencias, como la cadena no codificante, utilizada como plantilla para la transcripción de un gen o ADNc, pueden denominarse como codificantes de la proteína u otro producto de ese gen o ADNc.

A menos que se especifique lo contrario, una "secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas unas de otras y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. La secuencia de nucleótidos de la frase que codifica una proteína o un ARN también puede incluir intrones hasta el punto de que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína puede contener en alguna versión un intrón o intrones.

Los términos "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se utilizan indistintamente en el presente documento, y se refieren a una cantidad de un compuesto, formulación, material o composición, como se describe en el presente documento, eficaz para lograr un resultado biológico particular. El término "endógeno" se refiere a cualquier material procedente o producido dentro de un organismo, célula, tejido o sistema.

El término "exógeno" se refiere a cualquier material introducido o producido fuera de un organismo, célula, tejido o sistema.

El término "expresión" se refiere a la transcripción y/o traducción de una secuencia de nucleótidos particular impulsada por su promotor.

El término "vector de transferencia" se refiere a una composición de materia que comprende un ácido nucleico aislado y que puede utilizarse para entregar el ácido nucleico aislado al interior de una célula. Se conocen numerosos vectores en la técnica, incluyendo, pero no limitándose a, polinucleótidos lineales, polinucleótidos asociados a compuestos iónicos o anfifílicos, plásmidos y virus. Así, el término "vector de transferencia" incluye un plásmido de replicación autónoma o un virus. El término también debe interpretarse para incluir además compuestos no plasmídicos y no virales que facilitan la transferencia del ácido nucleico a las células, tales como, por ejemplo, un compuesto de polilisina, un liposoma y similares. Los ejemplos de vectores de transferencia viral incluyen, pero no se limitan a, vectores adenovirales, vectores de virus adeno-asociados, vectores retrovirales, vectores lentivirales y similares.

El término "vector de expresión" se refiere a un vector que comprende un polinucleótido recombinante que incluye secuencias de control de la expresión enlazadas operativamente a una secuencia de nucleótidos que debe expresarse. Un vector de expresión comprende suficientes elementos de acción cis para la expresión; otros elementos para la expresión pueden ser suministrados por la célula anfitriona o en un sistema de expresión in vitro. Los vectores de expresión incluyen todos los conocidos en la técnica, incluyendo cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudos o contenidos en liposomas) y virus (por ejemplo, lentivirus, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados) que incorporan el polinucleótido recombinante.

El término "lentivirus" se refiere a un género de la familia Retroviridae. Los lentivirus son únicos entre los retrovirus por su capacidad de infectar células que no se dividen; pueden entregar una cantidad significativa de información genética en el ADN de la célula huésped, por lo que son uno de los procedimientos más eficientes de un vector de entrega de genes. El VIH, el VIS y el VIS son ejemplos de lentivirus. El término "vector lentiviral" se refiere a un vector derivado de al menos una porción del genoma de un lentivirus, incluyendo especialmente un vector lentiviral autoinactivable tal como el proporcionado en Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009). Otros ejemplos de vectores lentivirus que pueden utilizarse en la clínica incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, la tecnología de administración de genes LENTIVFCTOR® de Oxford BioMedica, el sistema de vectores LENTIMAX™ de Lentigen y similares. También existen tipos no clínicos de vectores lentivirales que serían conocidos por los expertos en la técnica.

El término "homólogo" o "identidad" se refiere a la identidad de secuencia de subunidad entre dos moléculas poliméricas, por ejemplo, entre dos moléculas de ácido nucleico, tal como dos moléculas de ADN o dos moléculas de ARN, o entre dos moléculas polipeptídicas. Cuando una posición de la subunidad en ambas moléculas está ocupada por la misma subunidad monomérica; por ejemplo, si una posición en cada una de dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces son homólogas o idénticas en esa posición. La homología entre dos secuencias es una función directa del número de posiciones coincidentes u homólogas; por ejemplo, si la mitad (por ejemplo, cinco posiciones en un polímero de diez subunidades de longitud) de las posiciones en dos secuencias son homólogas, las dos secuencias son 50 % homólogas; si 90 % de las posiciones (por ejemplo, 9 de 10), son coincidentes u homólogas, las dos secuencias son 90 % homólogas.

El término "humanizado" se refiere a aquellas formas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) que son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión a antígeno de los anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados y sus fragmentos son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor o fragmento de anticuerpo) en las que los residuos de una región determinante complementaria (CDR) del receptor se sustituyen por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como el ratón, la rata o el conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región marco (Fv) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los correspondientes residuos no humanos. Además, un fragmento de anticuerpo/anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias CDR o marco importadas. Estas modificaciones pueden refinar y optimizar aún más el rendimiento del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado o su fragmento comprenderá una porción significativa de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado o el fragmento de anticuerpo también puede comprender al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986 Reichmann y et al., Nature, 332: 323-329, 1988 Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992.

El término "totalmente humano" se refiere a una inmunoglobulina, tal como un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, donde la molécula completa es de origen humano o consiste en una secuencia de aminoácidos idéntica a una forma humana del anticuerpo o la inmunoglobulina.

El término "aislado" significa alterado o retirado del estado natural. Por ejemplo, un ácido nucleico o un péptido presente de forma natural en un animal vivo no está "aislado", pero el mismo ácido nucleico o péptido separado parcial o totalmente de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado" Un ácido nucleico o una proteína aislados pueden existir en forma sustancialmente purificada, o pueden existir en un entorno no nativo tal como, por ejemplo, una célula anfitriona.

En el contexto de la presente invención, se utilizan las siguientes abreviaturas para las bases de ácidos nucleicos que se dan comúnmente. "A" se refiere a la adenosina, "C" a la citosina, "G" a la guanosina, "T" a la timidina y "U" a la uridina.

El término "operablemente vinculado" o "control transcripcional" se refiere a la vinculación funcional entre una secuencia reguladora y una secuencia de ácido nucleico heteróloga que resulta en la expresión de esta última. Por ejemplo, una primera secuencia de ácido nucleico está operativamente unida a una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está vinculado operativamente a una secuencia codificante si el promotor afecta a la transcripción o expresión de la secuencia codificante. Las secuencias de ADN enlazadas de forma operativa pueden ser contiguas entre sí y, cuando sea necesario para unir dos regiones codificadoras de proteínas, se encuentran en el mismo marco de lectura.

El término administración "parenteral" de una composición inmunogénica incluye, por ejemplo, técnicas de inyección subcutánea (s.c.), intravenosa (i.v.), intramuscular (i.m.) o intraesternal, intratumoral o de infusión.

El término "ácido nucleico" o "polinucleótido" se refiere a los ácidos desoxirribonucleicos (ADN) o a los ácidos ribonucleicos (ARN) y a sus polímeros, ya sea en forma de cadena simple o doble. A menos que se limite específicamente, el término abarca los ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de los nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y se metabolizan de manera similar a los nucleótidos naturales. A menos que se indique lo contrario, una secuencia particular de ácido nucleico también abarca implícitamente variantes modificadas de forma conservadora de las mismas (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados), alelos, ortólogos, SNP y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. En concreto, las sustituciones degeneradas de codones pueden lograrse generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o de todos) se sustituye por residuos de base mixta y/o desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem.

260:2605-2608 (1985); y Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

Los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente y se refieren a un compuesto formado por residuos de aminoácidos unidos covalentemente por enlaces peptídicos. Una proteína o un péptido debe contener al menos dos aminoácidos, y no se establece ninguna limitación en cuanto al número máximo de aminoácidos que pueden componer la secuencia de una proteína o un péptido. Los polipéptidos incluyen cualquier péptido o proteína que comprenda dos o más aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término se refiere tanto a las cadenas cortas, que también se denominan comúnmente en la técnica como péptidos, oligopéptidos y oligómeros, por ejemplo, como a las cadenas más largas, que generalmente se denominan en la técnica como proteínas, de las que hay muchos tipos. "Los polipéptidos" incluyen, por ejemplo, fragmentos biológicamente activos, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros. Un polipéptido incluye un péptido natural, un péptido recombinante, un péptido recombinante o una combinación de los mismos.

El término "promotor" se refiere a una secuencia de ADN reconocida por la maquinaria sintética de la célula, o la maquinaria sintética introducida, necesaria para iniciar la transcripción específica de una secuencia de polinucleótidos.

El término "secuencia promotora/reguladora" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se requiere para la expresión de un producto génico vinculado operativamente a la secuencia promotora/reguladora. En algunos casos, esta secuencia puede ser la secuencia promotora principal y en otros casos, esta secuencia puede incluir también una secuencia potenciadora y otros elementos reguladores que se requieren para la expresión del producto génico. La secuencia promotora/reguladora puede, por ejemplo, ser una que exprese el producto génico de forma específica para un tejido.

El término promotor "constitutivo" se refiere a una secuencia de nucleótidos que, cuando se vincula operativamente con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, hace que el producto génico se produzca en una célula bajo la mayoría o todas las condiciones fisiológicas de la misma.

El término promotor "inducible" se refiere a una secuencia de nucleótidos que, cuando está vinculada operativamente con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, hace que el producto génico se produzca en una célula sustancialmente sólo cuando un inductor que corresponde al promotor está presente en la célula.

El término promotor "específico de tejido" se refiere a una secuencia de nucleótidos que, cuando se enlaza de forma operativa con un polinucleótido que codifica o especifica un gen, hace que el producto génico se produzca en una célula sustancialmente sólo si ésta es una célula del tipo de tejido correspondiente al promotor.

El término "enlazador polipeptídico flexible", tal como se utiliza en el contexto de un scFv, se refiere a un enlazador peptídico que consiste en aminoácidos tales como residuos de glicina y/o serina utilizados solos o en combinación, para enlazar regiones variables de cadena pesada y variables de cadena ligera. En una realización, el enlazador polipeptídico flexible es un enlazador Gly/Ser y comprende la secuencia de aminoácidos (Gly-Gly-Gly-Ser)n (SEQ ID NO: 38), donde n es un número entero positivo igual o mayor que 1. Por ejemplo, n=1, n=2, n=3. n=4, n=5 y n=6, n=7, n=8, n=9 y n=10. En una realización, los enlazadores polipeptídicos flexibles incluyen, pero no se limitan a, (Gly4 Ser)4 (SEQ ID NO: 27)o (Gly4 Ser)3 (SEQ ID NO: 28). En otra realización, los enlazadores incluyen múltiples repeticiones de (Gly2Ser), (GlySer) o (Gly3Ser) (SEQ ID NO: 29). También se incluyen en el ámbito de la divulgación los enlazadores descritos en el documento WO2012/138475).

Tal y como se utiliza en el presente documento, un capuchón 5' (también denominado capuchón de ARN, capuchón de 7-metilguanosina de ARN o capuchón m7G de ARN) es un nucleótido de guanina modificado que se ha añadido al extremo "frontal" o 5' de un ARN mensajero eucariótico poco después del inicio de la transcripción. El capuchón 5' consiste en un grupo terminal que se une al primer nucleótido transcrito. Su presencia es fundamental para el reconocimiento por parte del ribosoma y la protección frente a las RNasas. La adición de capuchón está acoplada a la transcripción y se produce de forma cotranscripcional, de manera que cada una influye en la otra. Poco después del inicio de la transcripción, el extremo 5' del ARNm que se está sintetizando es unido por un complejo de captación asociado con ARN polimerasa. Este complejo enzimático cataliza las reacciones químicas necesarias para la cobertura del ARNm. La síntesis procede como una reacción bioquímica de múltiples pasos. La fracción de cobertura puede modificarse para modular la funcionalidad del ARNm, tal como su estabilidad o la eficiencia de la traducción.

Tal y como se utiliza en el presente documento, "ARN transcrito in vitro" se refiere al ARN, preferentemente ARNm, que ha sido sintetizado in vitro. Generalmente, el ARN transcrito in vitro se genera a partir de un vector de transcripción in vitro. El vector de transcripción in vitro comprende una plantilla que se utiliza para generar el ARN transcrito in vitro.

Tal y como se utiliza en el presente documento, una "poli(A)" es una serie de adenosinas unidas por poliadenilación al ARNm. En la realización preferida de un constructo para la expresión transitoria, el poliA está entre 50 y 5.000 (SEQ ID NO: 30), preferentemente mayor que 64, más preferentemente mayor que 100, y lo más preferentemente mayor que 300 o 400. Las secuencias de poli(A) pueden modificarse química o enzimáticamente para modular la funcionalidad del ARNm, tal como la localización, la estabilidad o la eficiencia de la traducción.

Tal y como se utiliza en el presente documento, la "poliadenilación" se refiere a la unión covalente de una fracción de poliadenilo, o su variante modificada, a una molécula de ARN mensajero. En los organismos eucariotas, la mayoría de las moléculas de ARN mensajero (ARNm) están poliadeniladas en el extremo 3'. La cola 3' de poli(A) es una larga secuencia de nucleótidos de adenina (a menudo varios centenares) que se añade al pre-ARNm mediante la acción de una enzima, la poliadenilato polimerasa. En los eucariotas superiores, la cola de poli(A) se añade a los transcritos que contienen una secuencia específica, la señal de poliadenilación. La cola de poli(A) y la proteína unida a esta ayudan a proteger el ARNm de la degradación por las exonucleasas. La poliadenilación también es importante para la terminación de la transcripción, la exportación del ARNm del núcleo y la traducción. La poliadenilación se produce en el núcleo inmediatamente después de la transcripción del ADN en ARN, pero también puede producirse posteriormente en el citoplasma. Una vez finalizada la transcripción, la cadena de ARNm se escinde mediante la acción de un complejo de endonucleasas asociado con la ARN polimerasa. El sitio de escisión suele caracterizarse por la presencia de la secuencia de bases AAUAAA cerca del sitio de escisión. Una vez que el ARNm se ha escindido, se añaden residuos de adenosina al extremo 3' libre en el lugar de la escisión.

Tal como se utiliza en el presente documento, "transitorio" se refiere a la expresión de un transgén no integrado durante un período de horas, días o semanas, en el que el período de tiempo de expresión es menor que el período de tiempo de expresión del gen si está integrado en el genoma o contenido dentro de un replicón plasmídico estable en la célula huésped.

Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "tratar", "tratamiento" y "que trata" se refieren a la reducción o mejora de la progresión, gravedad y/o duración de un trastorno proliferativo, o a la mejora de uno o más síntomas (preferentemente, uno o más síntomas discernibles) de un trastorno proliferativo resultante de la administración de una o más terapias (por ejemplo, uno o más agentes terapéuticos tal como un CAR de la divulgación). En determinadas realizaciones, los términos "tratar", "tratamiento" y "que trata" se refieren a la mejora de al menos un parámetro físico medible de un trastorno proliferativo, tal como el crecimiento de un tumor, no necesariamente perceptible por el paciente. En otras realizaciones, los términos "tratar", "tratamiento" y "que trata" se refieren a la inhibición de la progresión de un trastorno proliferativo, ya sea físicamente mediante, por ejemplo, la estabilización de un síntoma discernible, fisiológicamente mediante, por ejemplo, la estabilización de un parámetro físico, o ambos. En otras realizaciones los términos "tratar", "tratamiento" y "que trata" se refieren a la reducción o estabilización del tamaño del tumor o del recuento de células cancerosas.

El término "vía de transducción de señales" se refiere a la relación bioquímica entre una variedad de moléculas de transducción de señales que desempeñan un papel en la transmisión de una señal de una porción de una célula a otra porción de una célula. La frase "receptor de superficie celular" incluye moléculas y complejos de moléculas capaces de recibir una señal y transmitirla a través de la membrana de una célula.

El término "sujeto" pretende incluir organismos vivos en los que se puede provocar una respuesta inmunitaria (por ejemplo, mamíferos, humanos).

El término célula "sustancialmente purificada" se refiere a una célula que está esencialmente libre de otros tipos de células. Una célula sustancialmente purificada también se refiere a una célula que ha sido separada de otros tipos de células con las que normalmente está asociada en su estado natural. En algunos casos, una población de células sustancialmente purificadas se refiere a una población homogénea de células. En otros casos, este término se refiere simplemente a las células que han sido separadas de las células con las que están asociadas de forma natural en su estado natural. En algunos aspectos, las células se cultivan in vitro. En otros aspectos, las células no se cultivan in vitro.

El término "terapéutico", tal como se utiliza en el presente documento, significa un tratamiento. Un efecto terapéutico se obtiene mediante la reducción, supresión, remisión o erradicación de un estado de enfermedad.

El término "profilaxis", tal como se utiliza en el presente documento, significa la prevención o el tratamiento protector de una enfermedad o estado de enfermedad.

Los términos "antígeno asociado al cáncer" o "antígeno tumoral" se refieren indistintamente a una molécula (típicamente una proteína, un carbohidrato o un lípido) que se expresa en la superficie de una célula cancerosa, ya sea en su totalidad o como un fragmento (por ejemplo, MHC/péptido), y que es útil para la orientación preferente de un agente farmacológico hacia la célula cancerosa. En algunas realizaciones, un antígeno tumoral es un marcador expresado tanto por células normales como por células cancerosas, por ejemplo, un marcador de linaje, por ejemplo, CD19 en células B. En algunas realizaciones, un antígeno tumoral es una molécula de la superficie celular que está sobreexpresada en una célula cancerosa en comparación con una célula normal, por ejemplo, una sobreexpresión de 1 vez, una sobreexpresión de 2 veces, una sobreexpresión de 3 veces o más en comparación con una célula normal. En algunos casos, un antígeno tumoral es una molécula de la superficie celular que se sintetiza de forma inapropiada en la célula cancerosa, por ejemplo, una molécula que contiene supresiones, adiciones o mutaciones en comparación con la molécula expresada en una célula normal. En algunas realizaciones, un antígeno tumoral se expresará exclusivamente en la superficie celular de una célula cancerosa, en su totalidad o como un fragmento (por ejemplo, MHC/péptido), y no se sintetizará o expresará en la superficie de una célula normal. En algunas realizaciones, los CAR de la presente divulgación incluyen CAR que comprenden un dominio de unión a antígeno (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo) que se une a un péptido presentado por el MHC. Normalmente, los péptidos derivados de proteínas endógenas llenan los bolsillos de las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I, y son reconocidos por los receptores de células T (TCR) en los linfocitos T CD8 . Los complejos MHC de clase I se expresan de forma constitutiva en todas las células nucleadas. En el cáncer, los complejos péptidos/MHC específicos del virus y/o del tumor representan una clase única de objetivos de la superficie celular para la inmunoterapia. Se han descrito anticuerpos similares al TCR dirigidos a péptidos derivados de antígenos virales o tumorales en el contexto del antígeno leucocitario humano (HLA)-A1 o HLA-A2 (véase, por ejemplo, Sastry et al., J Virol. 2011 85(5): 1935-1942; Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16):4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21) :1601-1608 ; Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176) :176ra33 ; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100). Por ejemplo, el anticuerpo similar al TCR puede identificarse a partir del cribado de una biblioteca, tal como una biblioteca de scFv humana visualizada por fagos.

El término "transfectado" o "transformado" o "transducido" se refiere a un procedimiento por el que se transfiere o introduce ácido nucleico exógeno en la célula anfitriona. Una célula "transfectada" o "transformada" o "transducida" es aquella que ha sido transfectada, transformada o transducida con ácido nucleico exógeno. La célula incluye la célula primaria del sujeto y su progenie.

El término "se une específicamente" se refiere a un anticuerpo, o a un ligando, que reconoce y se une a una proteína asociada de unión (por ejemplo, antígeno tumoral) presente en una muestra, pero cuyo anticuerpo o ligando no reconoce ni se une sustancialmente a otras moléculas de la muestra.

"Receptor de antígeno quimérico regulable (RCAR)", tal como se utiliza este término en el presente documento, se refiere a un conjunto de polipéptidos, típicamente dos en las realizaciones más sencillas, que cuando están en una célula RCARX, proporcionan a la célula RCARX especificidad para una célula objetivo, típicamente una célula cancerosa, y con generación de señales intracelulares regulables o proliferación, que pueden optimizar una propiedad de efector inmunitario de la célula RCARX. Una célula RCARX se basa, al menos en parte, en un dominio de unión a antígeno para proporcionar especificidad a una célula objetivo que comprende el antígeno unido por el dominio de unión a antígeno. En una realización, un RCAR incluye un interruptor de dimerización que, en presencia de una molécula de dimerización, puede acoplar un dominio de señalización intracelular al dominio de unión a antígeno.

El "anclaje de membrana" o "dominio de anclaje de membrana", tal y como se utiliza este término en el presente documento, se refiere a un polipéptido o una fracción, por ejemplo, un grupo miristoilo, suficiente para anclar un dominio extracelular o intracelular a la membrana plasmática.

"Dominio de conmutación", tal como se utiliza este término en el presente documento, por ejemplo, cuando se refiere a un RCAR, se refiere a una entidad, típicamente una entidad con base en un polipéptido, que, en presencia de una molécula de dimerización, se asocia con otro dominio de conmutación. La asociación da lugar a un acoplamiento funcional de una primera entidad vinculada, por ejemplo, fusionada a un primer dominio de conmutación, y una segunda entidad vinculada, por ejemplo, fusionada a un segundo dominio de conmutación. Un primer y un segundo dominio de conmutación se denominan colectivamente interruptor de dimerización. En las realizaciones, el primer y el segundo dominio de conmutación son iguales entre sí, por ejemplo, son polipéptidos que tienen la misma secuencia primaria de aminoácidos, y se denominan colectivamente como un interruptor de homodimerización. En las realizaciones, el primer y el segundo dominio de conmutación son diferentes entre sí, por ejemplo, son polipéptidos que tienen diferentes secuencias primarias de aminoácidos, y se denominan colectivamente como un interruptor de heterodimerización. En las realizaciones, el interruptor es intracelular. En las realizaciones, el interruptor es extracelular. En las realizaciones, el dominio de conmutación es una entidad con base en un polipéptido, por ejemplo, FKBP o FRB, y la molécula de dimerización es una molécula pequeña, por ejemplo, un rapálogo. En algunas realizaciones, el dominio de conmutación es una entidad con base en un polipéptido, por ejemplo, un scFv que se une a un péptido myc, y la molécula de dimerización es un polipéptido, un fragmento del mismo, o un multímero de un polipéptido, por ejemplo, un ligando myc o multímeros de un ligando myc que se unen a uno o más scFvs myc. En algunas realizaciones, el dominio de conmutación es una entidad basada en un polipéptido, por ejemplo, el receptor myc, y la molécula de dimerización es un anticuerpo o fragmentos del mismo, por ejemplo, el anticuerpo myc.

La "molécula de dimerización", tal como se utiliza este término en el presente documento, por ejemplo, cuando se refiere a un RCAR, se refiere a una molécula que promueve la asociación de un primer dominio de conmutación con un segundo dominio de conmutación. En las realizaciones, la molécula de dimerización no se da de forma natural en el sujeto, o no se da en concentraciones que den lugar a una dimerización significativa. En algunas realizaciones, la molécula de dimerización es una molécula pequeña, por ejemplo, rapamicina o un rapálogo, por ejemplo, RAD001.

El término "bioequivalente" se refiere a una cantidad de un agente distinto del compuesto de referencia ( por ejemplo, RAD001), necesaria para producir un efecto equivalente al producido por la dosis de referencia o la cantidad de referencia del compuesto de referencia ( por ejemplo, RAD001). En una realización, el efecto es el nivel de inhibición de mTOR, por ejemplo, medido por la inhibición de la quinasa P70 S6, por ejemplo, evaluado en un ensayo in vivo o in vitro, por ejemplo, medido por un ensayo descrito en el presente documento, por ejemplo, el ensayo de Boulay, o la medición de los niveles de ^s6 fosforilada por transferencia western. En una realización, el efecto es la alteración de la proporción de células T positivas a PD-1/negativas a PD-1 , medida por la clasificación celular. En una realización, una cantidad o dosis bioequivalente de un inhibidor de mTOR es la cantidad o dosis que logra el mismo nivel de inhibición de la cinasa P70 S6 que la dosis o cantidad de referencia de un compuesto de referencia. En una realización, una cantidad o dosis bioequivalente de un inhibidor de mTOR es la cantidad o dosis que logra el mismo nivel de alteración en la proporción de células T positivas a PD-1/negativas a PD-1 que la dosis o cantidad de referencia de un compuesto de referencia.

El término "dosis baja, que mejora la inmunidad", cuando se utiliza en conjunción con un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico de mTOR, por ejemplo, RAD001 o rapamicina, o un inhibidor catalítico de mTOR, se refiere a una dosis de inhibidor de mTOR que inhibe parcialmente, pero no totalmente, la actividad de mTOR, por ejemplo, según la medición de la inhibición de la actividad de la quinasa P70 S6. En el presente documento se discuten procedimientos para evaluar la actividad de mTOR, por ejemplo, mediante la inhibición de la quinasa P70 S6. La dosis es insuficiente para dar lugar a una supresión inmunitaria completa, pero es suficiente para potenciar la respuesta inmunitaria. En una realización, la dosis baja de inhibidor de mTOR, que mejora la inmunidad, da como resultado una disminución del número de células T positivas a PD-1 y/o un aumento del número de células T negativas a PD-1, o un aumento de la proporción de células T negativas a PD-1/células T positivas a PD-1. En una realización, la dosis baja de inhibidor de mTOR, que mejora la inmunidad, da como resultado un aumento en el número de células T ingenuas. En una realización, la dosis baja de inhibidor de mTOR, que mejora el sistema inmunitario, da lugar a uno o más de los siguientes resultados:

un aumento en la expresión de uno o más de los siguientes marcadores: CD62Lalto, CD127alto, CD27+, y BCL2, por ejemplo, en células T de memoria, por ejemplo, precursores de células T de memoria;

una disminución de la expresión de KLRG1, por ejemplo, en las células T de memoria, por ejemplo, en los precursores de células T de memoria; y

un aumento del número de precursores de células T de memoria, por ejemplo, células con alguna de las siguientes características o una combinación de las siguientes características: aumento de CD62Lalto, aumento de CD127alto, aumento de CD27+, disminución de KLRG1 y aumento de BCL2;

en el que se produce cualquiera de los cambios descritos anteriormente, por ejemplo, al menos de forma transitoria, por ejemplo, en comparación con un sujeto no tratado.

Intervalos: a lo largo de esta divulgación, diversos aspectos de la invención pueden presentarse en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalos es meramente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la invención. En consecuencia, debe considerarse que la descripción de un intervalo ha divulgado específicamente todos los posibles subintervalos, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, se debe considerar que la descripción de un intervalo como el de 1 a 6 tiene subintervalos específicamente divulgados como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,3 y 6. Como otro ejemplo, un intervalo tal como 95-99 % de identidad, incluye algo con 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99% de identidad, e incluye subintervalos tales como 96-99 %, 96-98 %, 96-97 %, 97-99 %, 97-98 % y 98-99 % de identidad. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.

Descripción

Se proporcionan en el presente documento composiciones de materia y procedimientos de uso para el tratamiento de una enfermedad tal como el cáncer utilizando receptores de antígenos quiméricos (CAR) antimesotelina, por ejemplo, mesotelina CAR humana.

En un aspecto, la divulgación proporciona una serie de receptores de antígenos quiméricos que comprenden un anticuerpo o fragmento de anticuerpo diseñado para la unión específica a una proteína mesotelina. En un aspecto, la divulgación proporciona una célula (por ejemplo, célula T o célula NK) diseñada para expresar un CAR, por ejemplo, en la que la célula T CAR ("CART") presenta una propiedad anticancerígena. En un aspecto, una célula se transforma con el CAR y el CAR se expresa en la superficie celular. En algunas realizaciones, la célula (por ejemplo, célula T o célula NK) se transduce con un vector viral que codifica un CAR. En algunas realizaciones, el vector viral es un vector retroviral. En algunas realizaciones, el vector viral es un vector lentiviral. En algunas de estas realizaciones, la célula puede expresar de forma estable el CAR. En otra realización, la célula (por ejemplo, célula T o célula NK) se transfecta con un ácido nucleico, por ejemplo, ARNm, ADNc, ADN, que codifica un c Ar . En algunas de estas realizaciones, la célula puede expresar transitoriamente el CAR.

En un aspecto, la porción de unión a la proteína mesotelina del CAR es un fragmento de anticuerpo scFv. En un aspecto, dichos fragmentos de anticuerpos son funcionales en el sentido de que conservan la afinidad de unión equivalente, es decir, se unen al mismo antígeno con una afinidad comparable, como el anticuerpo IgG del que se deriva. En un aspecto, dichos fragmentos de anticuerpos son funcionales en el sentido de que proporcionan una respuesta biológica que puede incluir, pero no se limita a, la activación de una respuesta inmunitaria, la inhibición del origen de la transducción de señales de su antígeno objetivo, la inhibición de la actividad de la quinasa, y similares, como comprenderá una persona experta. En un aspecto, el dominio de unión a antígeno de mesotelina del CAR es un fragmento de anticuerpo scFv que es humano o humanizado en comparación con la secuencia murina del scFv del que deriva. En una realización, el fragmento de anticuerpo humano antimesotelina scFv comprende una región variable de cadena ligera y/o una región variable de cadena pesada proporcionada en la Tabla 2, o una secuencia con identidad sustancial con la misma, por ejemplo, 95-99 % de identidad.

En algunos aspectos, los anticuerpos de la divulgación se incorporan a un receptor de antígeno quimérico (CAR). En un aspecto, el CAR comprende la secuencia polipeptídica proporcionada en el presente documento como SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID N 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48,

49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID N 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID N 60, SEQ ID NO: 61, y SEQ ID NO: 62, o una secuencia con 95-99 % de identificación de la misma.

En un aspecto, la porción scFv humana de un CAR está codificada por un transgén cuya secuencia ha sido optimizada en codones para su expresión en una célula de mamífero. En un aspecto, el constructo completa de CAR de la divulgación está codificada por un transgén cuya secuencia completa ha sido optimizada en codones para su expresión en una célula de mamífero. La optimización de codones se refiere al descubrimiento de que la frecuencia de aparición de codones sinónimos (es decir, codones que codifican el mismo aminoácido) en el ADN codificante está sesgada en diferentes especies. Esta degeneración de codones permite que un polipéptido idéntico sea codificado por una variedad de secuencias de nucleótidos. Una variedad de procedimientos de optimización de codones es conocida en la técnica, e incluye, por ejemplo, los procedimientos divulgados en al menos Números de patente de EE. UU 5,786,464 y 6,114,148.

En un aspecto, la molécula mesotelina CAR humana comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 39

En un aspecto, la molécula mesotelina CAR humana comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 40

En un aspecto, la molécula mesotelina CAR humana comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 41

En un aspecto, la molécula mesotelina CAR humana comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 42

En un aspecto, la molécula mesotelina CAR humana comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 43

En un aspecto, la molécula mesotelina CAR humana comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 44

En un aspecto, la molécula mesotelina CAR humana comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 45

En un aspecto, la molécula mesotelina CAR humana comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 46

En un aspecto, la molécula mesotelina CAR humana comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 47

En un aspecto, la molécula mesotelina CAR humana comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 48

En un aspecto, la molécula mesotelina CAR humana comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 49

En un aspecto, la molécula mesotelina CAR humana comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 50

En un aspecto, la molécula mesotelina CAR humana comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 51

En un aspecto, la molécula mesotelina CAR humana comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 52

En un aspecto, la molécula mesotelina CAR humana comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 53

En un aspecto, la molécula mesotelina CAR humana comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 54

En un aspecto, la molécula mesotelina CAR humana comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 55

En un aspecto, la molécula mesotelina CAR humana comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 56

En un aspecto, la molécula mesotelina CAR humana comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 57

En un aspecto, la molécula mesotelina CAR humana comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 58

En un aspecto, la molécula mesotelina CAR humana comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 59

En un aspecto, la molécula mesotelina CAR humana comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 60

En un aspecto, la molécula mesotelina CAR humana comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 61

En un aspecto, la molécula mesotelina CAR humana comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 62.

En un aspecto, los CAR divulgados en el presente documento combinan un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo específico con una molécula de señalización intracelular. Por ejemplo, en algunos aspectos, la molécula de señalización intracelular incluye, pero no se limita a, la cadena CD3-zeta, los módulos de señalización 4-1BB y CD28 y sus combinaciones. En un aspecto, el dominio de unión a antígeno se une a la mesotelina. En un aspecto, el mesotelina CAR comprende la secuencia proporcionada en la Tabla 2.

En un aspecto, el mesotelina CAR comprende un CAR seleccionado de la secuencia proporcionada en uno o más de los SEQ ID NOS: 63-86. En un aspecto, el mesotelina CAR comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 63. En un aspecto, el mesotelina CAR comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 64. En un aspecto, el mesotelina CAR comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 65. En un aspecto, el mesotelina CAR comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 66. En un aspecto, el mesotelina CAR comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 67. En un aspecto, el mesotelina CAR comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 68. En un aspecto, el mesotelina CAR comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 69. En un aspecto, el mesotelina CAR comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 70. En un aspecto, el mesotelina c Ar comprende la secuencia proporcionada en SEQ iD NO: 71. En un aspecto, el mesotelina CAR comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 72. En un aspecto, el mesotelina CAR comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 73. En un aspecto, el mesotelina CAR comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 74. En un aspecto, el mesotelina CAR comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 75. En un aspecto, el mesotelina CAR comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 76. En un aspecto, el mesotelina c A^rcomprende la secuencia proporcionada en SEQ iD NO: 77. En un aspecto, el mesotelina CAR comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 78. En un aspecto, el mesotelina CAR comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 79. En un aspecto, el mesotelina CAR comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 80. En un aspecto, el mesotelina CAR comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 81. En un aspecto, el mesotelina CAR comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 82. En un aspecto, el mesotelina CAR comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 83. En un aspecto, el mesotelina CAR comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 84. En un aspecto, el mesotelina CAR comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 85. En un aspecto, el mesotelina CAR comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 86.

Además, la presente divulgación proporciona composiciones de mesotelina CAR y su uso en medicamentos o procedimientos para tratar, entre otras enfermedades, el cáncer o cualquier enfermedad maligna o autoinmune que implique células o tejidos que expresen mesotelina.

En un aspecto, la divulgación proporciona una célula (por ejemplo, célula T o célula NK) diseñada para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR), en el que la célula T CAR ("CART") exhibe una propiedad antitumoral. Un antígeno preferido es la mesotelina. En un aspecto, el dominio de unión a antígeno del CAR comprende un fragmento de anticuerpo humano antimesotelina. En un aspecto, el dominio de unión a antígeno del CAR comprende un fragmento de anticuerpo humano antimesotelina que comprende un scFv. En consecuencia, la divulgación proporciona un mesotelina CAR que comprende un dominio de unión a la mesotelina humana y está diseñado en una célula T o célula NK y procedimientos de su uso para la terapia adoptiva.

En un aspecto, la mesotelina CAR comprende al menos un dominio de señalización intracelular seleccionado del grupo que consiste en un dominio de señalización CD137 (4-1BB), un dominio de señalización CD28, un dominio de señalización CD3zeta, y cualquier combinación de los mismos. En un aspecto, el mesotelina CAR comprende al menos un dominio de señalización intracelular de una o más moléculas coestimuladoras distintas de una CD137 (4-1BB) o CD28, un dominio de señalización CD3zeta, y cualquier combinación de las mismas.

Receptor de Antígeno Quimérico (CAR)

La presente divulgación abarca un constructo de ácido nucleico recombinante que comprende secuencias que codifican un CAR, en el que el CAR comprende un anticuerpo que se une específicamente a la mesotelina, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo humano que se une específicamente a la mesotelina. En un aspecto, la mesotelina es mesotelina humana, y la secuencia del fragmento de anticuerpo es contigua a, y en el mismo marco de lectura que una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de señalización intracelular. El dominio de señalización intracelular puede comprender un dominio de señalización coestimuladora y/o un dominio de señalización primario, por ejemplo, una cadena zeta. El dominio de señalización coestimuladora se refiere a una porción del CAR que comprende al menos una porción del dominio intracelular de una molécula coestimuladora.

En aspectos específicos, un constructo de CAR de la divulgación comprende un dominio scFv seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 39-62, en el que el scFv puede ir precedido de una secuencia líder opcional como la proporcionada en SEQ ID NO: 1, y seguido de una secuencia de bisagra opcional como la proporcionada en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:5, una región transmembrana como la proporcionada en SEQ ID NO:6, un dominio de señalización intracelular que incluye SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:8 y una secuencia CD3 zeta que incluye SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO: 10, en la que los dominios son contiguos y están en el mismo marco de lectura para formar una única proteína de fusión. También se incluye en la divulgación una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 87; SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, y SEQ ID NO: 110, o una secuencia con 95-99 % de identificación de la misma. También se incluye en la divulgación una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de cada uno de los fragmentos de scFv seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:

44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO:

51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO:

58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, y SEQ ID NO: 62, o una secuencia con 95-99 % de identificación de la misma, y cada uno de los dominios de SEQ ID NOS: 1, 2 y 6-9, más la proteína de fusión de mesotelina CAR codificada de la divulgación. En un aspecto, un constructo ejemplar de mesotelina CAR comprende una secuencia líder opcional, un dominio de unión a mesotelina extracelular, una bisagra, un dominio transmembrana y un dominio estimulante intracelular. En un aspecto, el constructo de mesotelina CAR comprende una secuencia líder opcional, un dominio de unión a mesotelina, una bisagra, un dominio transmembrana, un dominio coestimulador intracelular y un dominio estimulador intracelular. Los constructos específicos de mesotelina CAR que contienen dominios scFv humanos se proporcionan como SEQ ID NOs: 87-110.

Las secuencias CAR de longitud completa también se proporcionan en el presente documento como SEQ ID NO: 63;

SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID

NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, o SEQ ID NO: 86. Una secuencia líder ejemplar se proporciona como SEQ ID NO: 1. Una secuencia ejemplar de bisagra/espaciador se proporciona como SEQ iD NO: 2 o Se Q ID NO:3 o SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:5.

Una secuencia de dominio transmembrana ejemplar se proporciona como SEQ ID NO:6. Una secuencia ejemplar del dominio de señalización intracelular de la proteína 4-1BB se proporciona como SEQ ID NO: 7. Una secuencia ejemplar del dominio de señalización intracelular de CD27 se proporciona como SEQ ID NO:8. Una secuencia ejemplar del dominio CD3zeta se proporciona como SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO:10.

En un aspecto, la presente divulgación abarca un constructo de ácido nucleico recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un CAR, en la que la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de unión a la antimesotelina, por ejemplo, descrito en el presente documento, que es contiguo y está en el mismo marco de lectura que una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de señalización intracelular. En un aspecto, el dominio de unión a la antimesotina es seleccionado de uno o más de las

SEQ ID NOS: 87-110. En un aspecto, el dominio de unión a la antimesotelina comprende SEQ ID NO: 87. En un aspecto, el dominio de unión a la antimesotelina comprende SEQ ID NO: 88. En un aspecto, el dominio de unión a la antimesotelina comprende SEQ ID NO: 89. En un aspecto, el dominio de unión a la antimesotelina comprende SEQ

ID NO: 90. En un aspecto, el dominio de unión a la antimesotelina comprende SEQ ID NO: 91. En un aspecto, el dominio de unión a la antimesotelina comprende SEQ ID NO: 92. En un aspecto, el dominio de unión a la antimesotelina comprende SEQ ID NO: 93. En un aspecto, el dominio de unión a la antimesotelina comprende SEQ

ID NO: 94. En un aspecto, el dominio de unión a la antimesotelina comprende SEQ ID NO: 95. En un aspecto, el dominio de unión a la antimesotelina comprende SEQ ID NO: 96. En un aspecto, el dominio de unión a la antimesotelina comprende SEQ ID NO: 97. En un aspecto, el dominio de unión a la antimesotelina comprende SEQ

ID NO: 98. En un aspecto, el dominio de unión a la antimesotelina comprende SEQ ID NO: 99. En un aspecto, el dominio de unión a la antimesotelina comprende SEQ ID NO: 100. En un aspecto, el dominio de unión a la antimesotelina comprende SEQ ID NO: 101. En un aspecto, el dominio de unión a la antimesotelina comprende SEQ

ID NO: 102. En un aspecto, el dominio de unión a la antimesotelina comprende SEQ ID NO: 103. En un aspecto, el dominio de unión a la antimesotelina comprende SEQ ID NO: 104. En un aspecto, el dominio de unión a la antimesotelina comprende SEQ ID NO: 105. En un aspecto, el dominio de unión a la antimesotelina comprende SEQ

ID NO: 106. En un aspecto, el dominio de unión a la antimesotelina comprende SEQ ID NO: 107. En un aspecto, el dominio de unión a la antimesotelina comprende SEQ ID NO: 108. En un aspecto, el dominio de unión a la antimesotelina comprende SEQ ID NO: 109. En un aspecto, el dominio de unión a la antimesotelina comprende SEQ

ID NO: 110. En un aspecto, la presente divulgación abarca una constructo de ADN recombinante que comprende un transgén que codifica un CAR, en el que el transgén comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de unión a la antimesotelina descrito en el presente documento, por ejemplo, un dominio de unión a la antimesotelina humana seleccionado entre uno o más de las SEQ ID NOS:87-110, en el que la secuencia es contigua y está en el mismo marco de lectura que la secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de señalización intracelular. Un dominio de señalización intracelular ejemplar que puede utilizarse en la CAR incluye, pero no se limita a, uno o más dominios de señalización intracelular de, por ejemplo, CD3-zeta, CD28, 4-1BB, y similares. En algunos casos, el CAR puede comprender cualquier combinación de CD3-zeta, CD28, 4-1BB y similares. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo CAR de la divulgación se selecciona de una o más de las SEQ ID NOS: 111-134. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo de CAR es SEQ ID NO: 111. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo de CAR es SEQ ID NO: 112. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo de CAR es SEQ ID NO: 113. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo de CAR es

SEQ ID NO: 114. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo de CAR es SEQ ID NO: 115. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo de CAR es SEQ ID NO: 116. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo de CAR es SEQ ID NO: 117. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo de CAR es SEQ ID NO: 118. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo de CAR es

SEQ ID NO: 119. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo de CAR es SEQ ID NO: 120. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo de CAR es SEQ ID NO: 121. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo de CAR es SEQ ID NO: 122. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo de CAR es SEQ ID NO: 123. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo de CAR es SEQ ID NO: 124. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo de CAR es SEQ ID NO: 125. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo de CAR es SEQ ID NO: 126. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo de CAR es SEQ ID NO: 127. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo de CAR es SEQ ID NO: 128. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo de CAR es SEQ ID NO: 129. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo de CAR es SEQ ID NO: 130. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo de CAR es SEQ ID NO: 131. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo de CAR es SEQ ID NO: 132. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo de CAR es SEQ ID NO: 133. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de un constructo de CAR es SEQ ID NO: 134.

Las secuencias de ácido nucleico que codifican las moléculas deseadas pueden obtenerse mediante procedimientos recombinantes conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, mediante el cribado de bibliotecas de células que expresan el gen, derivando el gen de un vector que se sabe que lo incluye, o aislando directamente de células y tejidos que lo contienen, utilizando técnicas estándar. Alternativamente, el ácido nucleico de interés puede ser producido sintéticamente, en lugar de ser clonado.

La presente divulgación incluye constructos de vectores retrovirales y lentivirales que expresan un CAR que puede ser transducido directamente en una célula. La presente divulgación también incluye un constructo de ARN que puede transfectarse directamente en una célula. Un procedimiento para generar ARNm para su uso en la transfección implica la transcripción in vitro (IVT) de una plantilla con cebadores especialmente diseñados, seguida de la adición de poliA, para producir un constructo que contenga la secuencia no traducida ("UTR") 3' y 5', un capuchón 5' y/o un sitio de entrada del ribosoma interno (IRES), el ácido nucleico que se va a expresar, y una cola de poliA, normalmente de 50 2.000 bases de longitud (SEQ ID NO: 35). El ARN así producido puede transfectar eficazmente diferentes tipos de células. En una realización, la plantilla incluye secuencias para el CAR. En una realización, un vector de ARN CAR se transduce en una célula T por electroporación.

Dominio de unión a antígenos

En un aspecto, el CAR de la divulgación comprende un elemento de unión específico objetivo, también denominado dominio de unión al antígeno. La elección del dominio de unión al antígeno depende del tipo y número de antígenos que definen la superficie de una célula objetivo. Por ejemplo, el dominio de unión a antígeno puede elegirse para reconocer un antígeno que actúa como marcador de la superficie celular en las células objetivo asociadas a un estado de enfermedad concreto.

En un aspecto, la respuesta de las células efectoras inmunitarias mediada por CAR puede dirigirse a las células que expresan un antígeno de interés, donde el CAR comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente al antígeno de interés. En un aspecto, la porción del CAR que comprende el dominio de unión a antígeno comprende un dominio de unión a antígeno que se dirige a la mesotelina. En un aspecto, el dominio de unión a antígeno se dirige a la mesotelina humana.

El dominio de unión al antígeno puede ser cualquier dominio que se una al antígeno, incluyendo pero no limitado a un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado y un fragmento funcional del mismo, incluyendo, pero sin limitarse a, un anticuerpo de un solo dominio, tal como un dominio variable de cadena pesada (VH), un dominio variable de cadena ligera (VL) y un dominio variable (VHH) de un nanoanticuerpo derivado de camélidos, y a un andamiaje alternativo conocido en la técnica para funcionar como un dominio de unión a antígeno, tal como un dominio de fibronectina recombinante, y similares. En algunos casos, es beneficioso que el dominio de unión a antígeno se derive de la misma especie en la que se utilizará finalmente el CAR. Por ejemplo, para su uso en humanos, puede ser beneficioso que el dominio de unión a antígeno del CAR comprenda residuos humanos o humanizados para el dominio de unión a antígeno de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Así, en un aspecto, el dominio de unión a antígeno comprende un anticuerpo humano o un fragmento de anticuerpo.

En una realización, el dominio de unión a la anti-mesotelina no compite, o compite poco, por la unión a la mesotelina humana con un dominio de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 279, por ejemplo, SS1 scFv murino, por ejemplo, en un ensayo de competencia descrito en el presente documento.

La secuencia de aminoácidos del SS1 scFv murino se proporciona a continuación (SEQ ID NO: 279)

QV Q LQ Q SG PE LE KP G AS V K IS CKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNGASSYNQKFRGKATLT

VDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSP

A IM SA S PGEKVTMTCSAS SSVSY M H W Y Q QK SG TSPKRW IY D TSKL A SG V PG RFSG SGSG NSY SLT ISSV EA

EDDATYYCQQWSGYPLTFGAGTKLEI

En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina compite por la unión a la mesotelina humana con un dominio de unión a antígeno que comprende una LC CDR1, una LC CDR2 y LC CDR3 de una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de antimesotelina seleccionada de SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 49 y una HC CDR1, una HC CDR2, y una HC CDR3 de una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de antimesotelina seleccionada de SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 49, por ejemplo, en un ensayo de competencia descrito en el presente documento. En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina compite por la unión a la mesotelina humana con un dominio de unión a antígeno que comprende una LC CDR1 seleccionada de SEQ ID NO: 203 o SEQ ID NO: 209, una LC CDR2 seleccionada de S^eQ ID NO: 227 o SEQ ID NO: 233, y una LC CDR3 seleccionada de SEQ ID NO: 251 o SEQ ID NO: 257; y una HC CDR1 seleccionada de SEQ ID NO: 138 o SEQ ID NO: 144, una HC CDR2 seleccionada de SEQ ID NO: 156 o SEQ ID NO: 162, y una HC CDR3 seleccionada de SEQ ID NO: 179 o SEQ ID NO: 185, por ejemplo, en un ensayo de competencia descrito en el presente documento.

En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina compite por la unión a la mesotelina humana con un dominio de unión a antígeno que comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 49, por ejemplo, en un ensayo de competencia descrito en el presente documento.

En las realizaciones, el ensayo de competencia es un ensayo con base en SPR. Brevemente, el antígeno, por ejemplo, la mesotelina humana, se inmoviliza en una superficie. Mediante un sistema de microflujo, se inyecta un anticuerpo de referencia sobre la capa de antígeno. Tras la unión del anticuerpo de referencia al antígeno, se detecta un aumento de la señal, típicamente expresado en unidades de respuesta (RU), por ejemplo, la señal de referencia. Después de un tiempo deseado, se inyecta un anticuerpo de prueba sobre la capa de antígeno. Si el anticuerpo de prueba se une a una región o epítopo diferente del antígeno, se detecta un aumento adicional de la señal, por ejemplo un aumento de5 % o más, 10 % o más, 15 % o más, 20 % o más, 25 % o más, 30 % o más, 35 % o más, 40 % o más, 45 % o más, 50 % o más, 55 % o más, 60% o más, 65 % o más, 70 % o más, 75 % o más, 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más, o 95 % o más de aumento de la señal, por ejemplo, RU, en comparación con la señal más alta detectada tras la unión del anticuerpo de referencia, por ejemplo, la señal de referencia. Si el anticuerpo de prueba se une a la misma región o epítopo del antígeno, entonces se detectará poco o ningún aumento de la señal, por ejemplo, RU por ejemplo, menos de20 %, menos del 15 %, menos de 10 %, menos de 5 %, menos de 4 %, menos de 3 %, menos de 2 % o menos de 1 % de aumento de la señal, por ejemplo, RU, en comparación con la señal más alta detectada al unirse el anticuerpo de referencia, por ejemplo, la señal de referencia. Cuando se utiliza este ensayo de competencia con base en SPR, se dice que un anticuerpo compite con el anticuerpo de referencia cuando se detecta menos de 20 %, menos de 15 %, menos de 10 menos de 5 %, menos de 4 %, menos de 3 %, menos de 2 % o menos de 1 % de aumento en la señal, por ejemplo, RU, cuando se compara con la señal de referencia detectada al unirse el anticuerpo de referencia al antígeno. Se dice que un anticuerpo no compite, o compite poco, con un anticuerpo de referencia cuando se detecta un aumento de la señal de 5 % o más, de 10 % o más, de 15 % o más, de 20 % o más, de 25 % o más, de 30 % o más, de 35 % o más, de 40 % o más, de 45 % o más, de 50 % o más, de 55 % o más, de 60 % o más, de 65 % o más, de 70 % o más, de 75 % o más, de 80 % o más, de 85 % o más, de 90 % o más, o de 95 % o más, por ejemplo, RU, en comparación con la señal de referencia detectada al unirse el anticuerpo de referencia al antígeno.

La identificación del epítopo unido por los dominios de unión a antígeno descritos en el presente documento puede determinarse mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden generar estructuras cristalinas que contengan el dominio de unión a antígeno unido a, o en complejo con, el antígeno. En otro ejemplo, se pueden realizar ensayos, por ejemplo, un ensayo de protección, para identificar las regiones del antígeno que contribuyen al epítopo, o para identificar el epítopo. Un ensayo de protección ejemplar, un ensayo de espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio (HDX), se describe más adelante en el Ejemplo 18. La espectrometría de masas HDX se llevó a cabo para identificar los epítopos putativos en la MSLN humana, por ejemplo, hMSLN296-588, por ejemplo, SEQ ID NO: 278, para SS1 murino, por ejemplo, SEQ ID NO: 279, y el scFv M5 descrito en el presente documento, por ejemplo, SEQ ID NO: 43. hMSLN296-588, por ejemplo, SEQ ID NO: 278, representa los aminoácidos 296-588 de la mesotelina humana, por ejemplo, el primer aminoácido de SEQ ID NO: 278 es el aminoácido 296 y el último aminoácido de SEQ ID NO: 278 es el aminoácido 588. La secuencia de aminoácidos de la mesotelina humana, aminoácidos 296-588, se proporciona a continuación: (SEQ ID NO: 278)

EVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQG

YPESVIQHLGYLFLKMSPEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQAPRRPLPQVATLIDRFVKGRG

QLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSE

YFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPV

RDWILRQRQDDLDTLGLGLQG

Los resultados del ensayo de espectrometría de masas HDX indicaron que uno o más aminoácidos de 314-315, 317 318, 346-349 y 369-375 de hMSLN296-588, por ejemplo, SEQ ID NO: 278 contribuyen al epítopo reconocido por el SS1. Los resultados del ensayo de espectrometría de masas HDX indicaron que uno o más aminoácidos de 485-490, 498 507, 532-537 o 545-572 de hMSLN296-588, por ejemplo, SEQ ID NO: 278, contribuyen al epítopo reconocido por un dominio de unión a antígeno de antimesotelina descrito en el presente documento, por ejemplo, M5 scFv, por ejemplo, SEQ ID NO: 43.

En una realización, el dominio de unión a la mesotelina descrito en el presente documento se une a un epítopo diferente de la mesotelina humana, por ejemplo, SEQ ID NO: 278, que el epítopo de la mesotelina humana al que se dirige el dominio de unión a antígeno que comprende una secuencia que incluye en SEQ ID NO: 279, por ejemplo, SS1 murino.

En una realización, el epítopo reconocido por SS1 comprende una secuencia seleccionada de los aminoácidos 314 315, 317-318, 346-349, o 369-375 de hMSLN296-588, por ejemplo, SEQ ID NO: 278, o cualquier combinación de las mismas. En una realización, el epítopo reconocido por SS1 comprende uno o más aminoácidos seleccionados entre los aminoácidos 314-315, 317-318, 346-349 o 369-375 de hMSLN296-588, por ejemplo, SEQ ID NO: 278.

En una realización, el dominio de unión a la anti-mesotelina descrito en el presente documento se une al terminal C de la mesotelina humana. En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina descrito en el presente documento se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 450-588 de SEQ ID NO: 278, por ejemplo, en el que el epítopo, en parte o en su totalidad, puede encontrarse dentro de los aminoácidos 450-588, dentro de los aminoácidos 480-580, o dentro de los aminoácidos 485-572 de SEQ ID NO: 278. En una realización, el epítopo reconocido por un dominio de unión a la antimesotelina descrito en el presente documento comprende una secuencia seleccionada de los aminoácidos 485-490, 498-507, 532-537, o 545-572 de hMSLN296-588, por ejemplo, SEQ ID NO: 278, o cualquier combinación de las mismas. En una realización, el epítopo reconocido por un dominio de unión a la antimesotelina descrito en el presente documento comprende uno o más aminoácidos seleccionados de 485-490, 498-507, 532-537, o 545-572 de hMSLN296-588, por ejemplo, SEQ ID NO: 278, o cualquier combinación de las mismas.

En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina comprende una o más (por ejemplo, las tres) región determinantes complementarias de la cadena ligera 1 (LC CDR1), región determinante complementaria de la cadena ligera 2 (LC CDR2), y región determinante complementaria de la cadena ligera 3 (LC CDR3) de un dominio de unión a la anti-mesotelina humana seleccionado de SEQ ID NOS: 39-62 y una o más (por ejemplo, las tres) región determinante complementaria de la cadena pesada 1 (HC CDR1), región determinante complementaria de la cadena pesada 2 (HC CDR2) y región determinante complementaria de la cadena pesada 3 (HC CDR3) de un dominio humano de unión a la antimesotelina seleccionado de SEQ ID NOS: 39-62. En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina humana comprende una región variable de cadena ligera descrita en el presente documento (por ejemplo, en la Tabla 2) y/o una región variable de cadena pesada descrita en el presente documento (por ejemplo, en la Tabla 2). En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina es un scFv que comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada de una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2. En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina (por ejemplo, un scFV) comprende: una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena ligera proporcionada en la Tabla 2, o una secuencia con 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2; y/o una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada proporcionada en la Tabla 2, o una secuencia con 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2.

En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina humana comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 39-62, o una secuencia con 95-99 % de identificación de la misma. En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de unión a la antimesotelina humana comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 87-110, o una secuencia con 95-99 % de identificación de la misma. En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina humana es un scFv, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento, por ejemplo, en la Tabla 2 o 3, se une a una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento, por ejemplo, en la Tabla 2 o 3, a través de un enlazador, por ejemplo, un enlazador descrito en el presente documento. En una realización, el dominio humanizado de unión a la antimesotelina incluye un enlazador (Gly4-Ser)n (SEQ ID NO: 26), en el que n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, preferentemente 3 o 4. La región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada de un scFv pueden estar, por ejemplo, en cualquiera de las siguientes orientaciones: región variable de la cadena ligera-enlazador-región variable de la cadena pesada o región variable de la cadena pesada-enlazador-región variable de la cadena ligera.

En un aspecto, la porción de dominio de unión a antígeno comprende una o más secuencias seleccionadas de SEQ ID NOS:39-62. En un aspecto, el CAR se selecciona de una o más secuencias seleccionadas de SEQ ID NOS: 63-86.

En un aspecto, los anticuerpos de la divulgación pueden existir en una variedad de otras formas incluyendo, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, fragmentos Fv, fragmentos de anticuerpos scFv, Fvs disulfidaenlazados (sdFv), un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CHI, anticuerpos lineales, anticuerpos de un solo dominio, tales como sdAb (ya sea VL o VH), dominios VHH de camélidos, anticuerpos multiespecíficos formados por fragmentos de anticuerpos, tal como un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por una brida disulfuro en la región bisagra, y una CDR aislada u otros fragmentos de unión a epítopos de un anticuerpo. En un aspecto, el fragmento de anticuerpo proporcionado en el presente documento es un scFv. En algunos casos, un scFv humano también puede derivarse de una biblioteca de visualización de levadura.

Una biblioteca de visualización es una colección de entidades; cada entidad incluye un componente polipeptídico accesible y un componente recuperable que codifica o identifica el componente polipeptídico. El componente polipeptídico es variado para que estén representadas diferentes secuencias de aminoácidos. El componente polipeptídico puede tener cualquier longitud, por ejemplo, desde tres aminoácidos hasta más de 300 aminoácidos. Una entidad de biblioteca de visualización puede incluir más de un componente polipeptídico, por ejemplo, las dos cadenas polipeptídicas de un Fab. En una realización ejemplar, se puede utilizar una biblioteca de visualización para identificar un dominio de unión a la antimesotelina. En una selección, el componente polipeptídico de cada miembro de la biblioteca se sondea con mesotelina, o un fragmento de la misma, y si el componente polipeptídico se une a la mesotelina, se identifica el miembro de la biblioteca de visualización, normalmente por retención en un soporte.

Los miembros de la biblioteca de visualización retenidos se recuperan del soporte y se analizan. El análisis puede incluir la amplificación y una posterior selección bajo condiciones similares o diferentes. Por ejemplo, se pueden alternar selecciones positivas y negativas. El análisis también puede incluir la determinación de la secuencia de aminoácidos del componente polipeptídico, es decir, el dominio de unión a la antimesotelina, y la purificación del componente polipeptídico para su caracterización detallada.

Se puede utilizar una variedad de formatos para las bibliotecas de visualización. Entre los ejemplos se encuentra la visualización de fagos. En la visualización de fagos, el componente proteico suele estar enlazado covalentemente a la proteína de la cubierta del bacteriófago. El enlace resulta de la traducción de un ácido nucleico que codifica el componente proteico fusionado con la proteína de cubierta. El enlace puede incluir un enlace peptídico flexible, un sitio de proteasa o un aminoácido incorporado como resultado de la supresión de un codón de parada. La visualización de fagos se describe, por ejemplo, en los documentos EE. UU. 5.223.409 Smith (1985) Science 228:1315-1317 WO 92/18619 WO 91/17271 WO 92/20791 WO 92/15679 WO 93/01288 WO 92/01047 WO 92/09690 WO 90/02809 de Haard et al. (1999) J. Biol Chem 274:18218-30 Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4:1-20; Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2:371-8 y Hoet et al. (2005) Nat Biotechnol. 23(3)344-8. Los bacteriófagos que muestran el componente proteico pueden cultivarse y cosecharse utilizando procedimientos estándar de preparación de fagos, por ejemplo, la precipitación con PEG de los medios de crecimiento. Tras la selección de fagos de visualización individuales, el ácido nucleico que codifica los componentes proteicos seleccionados puede aislarse de las células infectadas con los fagos seleccionados o de los propios fagos, tras su amplificación. Se pueden recoger colonias o placas individuales, aislar el ácido nucleico y secuenciarlo.

Otros formatos de visualización incluyen la visualización con base en células (véase, por ejemplo, el documento WO 03/029456), fusiones de ácidos proteínicos (véase, por ejemplo, el documento US 6,207,446), la visualización de ribosomas (véase, por ejemplo, el documento Mattheakis et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022 y Hanes et al. (2000) Nat Biotechnol. 18:1287-92 Hanes et al. (2000) Methods Enzymol. 328:404-30y Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods. 231(1-2): 119-35), y E. coli periplasmic display JImmunol Methods. 2005 Nov 22;PMID: 16337958).

Además del uso de bibliotecas de visualización, se pueden utilizar otros procedimientos para obtener un dominio de unión a la antimesotelina. Por ejemplo, la mesotelina o un fragmento de la misma puede utilizarse como antígeno en un animal no humano, por ejemplo, un roedor.

En una realización, el animal no humano incluye al menos una parte de un gen de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, es posible diseñar cepas de ratón deficientes en la producción de anticuerpos de ratón con grandes fragmentos de los loci de Ig humanos. Mediante la tecnología del hibridoma, se pueden producir y seleccionar anticuerpos monoclonales (Mabs) específicos de antígeno derivados de los genes con la especificidad deseada. Véase, por ejemplo, XENOMOUSE™, Green et al., 1994, Nat. Gen. 7:13-21; el documento U.S. 2003-0070185, el documento WO 96/34096, publicado el 31 de octubre de 1996y la solicitud PCT No PCT/US96/05928, presentada el 29 de abril de 1996.

En algunos casos, los scFvs pueden prepararse según un procedimiento conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Bird et a/., (1988) Science 242:423-426 y Huston et a/., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Las moléculas de ScFv pueden producirse uniendo las regiones VH y VL, por ejemplo, utilizando enlazadores polipeptídicos flexibles. Las moléculas scFv pueden comprender un enlazador (por ejemplo, un enlazador Ser-Gly) con una longitud y/o composición de aminoácidos optimizada. La longitud del enlazador puede afectar en gran medida al modo en que se pliegan e interactúan las regiones variables de un scFv. De hecho, si se emplea un enlazador polipeptídico corto (por ejemplo, entre 5-10 aminoácidos, se evita el plegado intracadena). El plegado entre cadenas también es necesario para unir las dos regiones variables y formar un sitio funcional de unión al epítopo. Para ejemplos de la orientación y el tamaño de los enlaces, véase, por ejemplo Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A.

90:6444-6448, Publicación de la Solicitud de Patente de EE. UU. No.

2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794y Publicación PCT Nos. WO2006/020258 y WO2007/024715.

Un scFv puede comprender un enlazador de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más residuos de aminoácidos entre sus regiones VL y VH. La secuencia enlazadora puede comprender cualquier aminoácido de origen natural. En algunas realizaciones, la secuencia enlazadora comprende los aminoácidos glicina y serina. En otra realización, la secuencia enlazadora comprende conjuntos de repeticiones de glicina y serina tal como (Gly4Ser)n, donde n es un número entero positivo igual o mayor que 1. (SEQ ID NO: 135). En una realización, el enlazador puede ser (Gly4Ser)4 (SEQ ID NO: 27) o (Gly4Ser)3 (S^eQ ID NO: 28). La variación de la longitud del enlazador puede mantener o mejorar la actividad, dando lugar a una eficacia superior en los estudios de actividad.

Estabilidad y Mutaciones

La estabilidad de un dominio de unión a la antimesotelina, por ejemplo, moléculas scFv (por ejemplo, scFv solubles), puede evaluarse en referencia a las propiedades biofísicas (por ejemplo, estabilidad térmica) de una molécula scFv de control convencional o de un anticuerpo de longitud completa. En una realización, el scFv humano tiene una estabilidad térmica que es mayor que aproximadamente 0,1, aproximadamente 0,25, aproximadamente 0,5, aproximadamente 0,75, aproximadamente 1, aproximadamente 1,25, aproximadamente 1,5, aproximadamente 1,75, aproximadamente 2, aproximadamente 2,5, aproximadamente 3, aproximadamente 3,5, aproximadamente 4, aproximadamente 4,5, aproximadamente 5, aproximadamente 5,5, aproximadamente 6, aproximadamente 6.5, aproximadamente 7, aproximadamente 7,5, aproximadamente 8, aproximadamente 8,5, aproximadamente 9, aproximadamente 9,5, aproximadamente 10 grados, aproximadamente 11 grados, aproximadamente 12 grados, aproximadamente 13 grados, aproximadamente 14 grados o aproximadamente 15 grados Celsius que una molécula de unión de control (por ejemplo, una molécula scFv convencional) en los ensayos descritos.

La estabilidad térmica mejorada del dominio de unión a la mesotelina, por ejemplo, el scFv, se confiere posteriormente a todo el constructo de mesotelina CAR, lo que conduce a la mejora de las propiedades terapéuticas del constructo de mesotelina CAR. La estabilidad térmica del dominio de unión a la antimesotelina, por ejemplo, scFv, puede mejorarse en al menos aproximadamente 2°C o 3°C en comparación con un anticuerpo convencional. En una realización, el dominio de unión a la anti-mesotelina, por ejemplo, scFv, tiene una estabilidad térmica mejorada de 1 °C en comparación con un anticuerpo convencional. En otra realización, el dominio de unión a la antimesotelina, por ejemplo, scFv, tiene una estabilidad térmica mejorada de 2 °C en comparación con un anticuerpo convencional. En otra realización, el dominio de unión a la antimesotelina, por ejemplo, scFv, tiene una estabilidad térmica mejorada de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 °C en comparación con un anticuerpo convencional. Se pueden hacer comparaciones, por ejemplo, entre las moléculas de scFv divulgadas en el presente documento y las moléculas de scFv o los fragmentos Fab de un anticuerpo del que se derivaron los scFv VH y VL. La estabilidad térmica puede medirse mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una realización, se puede medir la Tm. Los procedimientos para medir la Tm y otros procedimientos para determinar la estabilidad de las proteínas se describen con más detalle a continuación.

Las mutaciones en el scFv (que surgen a través de la mutagénesis directa del scFv soluble) alteran la estabilidad del scFv y mejoran la estabilidad general del scFv y del constructo de CART. La estabilidad del scFv humanizado se compara con el scFv murino utilizando medidas tales como la Tm, la desnaturalización por temperatura y la agregación por temperatura.

En una realización, el dominio de unión a la anti-mesotelina, por ejemplo, scFv, comprende al menos una mutación tal que el dominio de unión a la antimesotelina mutado, por ejemplo, scFv, confiere una estabilidad mejorada al constructo de antimesotelina. En otra realización, el dominio de unión a la antimesotelina, por ejemplo, scFv, comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 mutaciones tales que el dominio de unión a la antimesotelina mutado, por ejemplo, scFv, confiere una estabilidad mejorada al constructo de antimesotelina. La capacidad de unión de los scFv mutantes puede determinarse usando los ensayos descritos en los Ejemplos.

Afinidad de Unión

Una amplia variedad de procedimientos para determinar la afinidad de unión es conocida en la técnica. Un procedimiento ejemplar para determinar la afinidad de unión emplea la resonancia de plasmón superficial. La resonancia de plasmón superficial es un fenómeno óptico que permite analizar en tiempo real las interacciones biespecíficas mediante la detección de alteraciones en las concentraciones de proteínas dentro de una matriz de biosensores, por ejemplo, utilizando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, N.J.). Para más descripciones, véase Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26 Jonsson, U., i (1991) Biotechniques 11:620-627 Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131y Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.

En un aspecto, la porción de una composición de CAR de la divulgación que comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo comprende secuencias de aminoácidos que son homólogas a las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento, y en la que el anticuerpo o el fragmento del mismo conserva las propiedades funcionales deseadas de los fragmentos de anticuerpos antimesotelina de la divulgación. En un aspecto específico, la composición de CAR de la divulgación comprende un fragmento de anticuerpo. En otro aspecto, dicho fragmento de anticuerpo comprende un scFv.

En diversos aspectos, la porción que comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de la composición de CAR de la divulgación se diseña modificando uno o más aminoácidos dentro de una o ambas regiones variables (es decir, VH y/o VL), por ejemplo dentro de una o más regiones CDR y/o dentro de una o más regiones marco. En un aspecto específico, la composición de CAR de la divulgación comprende un fragmento de anticuerpo. En otro aspecto, dicho fragmento de anticuerpo comprende un scFv.

Un experto en la técnica entenderá que el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de la divulgación puede modificarse de forma que varíe la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, respecto al tipo salvaje), pero no la actividad deseada. Por ejemplo, se pueden realizar en la proteína sustituciones adicionales de nucleótidos que conduzcan a sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos "no esenciales". Por ejemplo, un residuo de aminoácido no esencial en una molécula puede ser sustituido por otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. En otra realización, una cadena de aminoácidos puede ser sustituida por una cadena estructuralmente similar que difiere en el orden y/o la composición de los miembros de la familia de cadenas laterales, es decir, puede realizarse una sustitución conservadora, en la que un residuo de aminoácido se sustituye por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar.

En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares, incluyendo cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

El porcentaje de identidad en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, se refiere a dos o más secuencias que son iguales. Dos secuencias son "sustancialmente idénticas" si dos secuencias tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (es decir, 60 % de identidad, opcionalmente 70 %, 71 %. 72 %. 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %,81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad en una región especificada o, cuando no se especifica, en toda la secuencia), cuando se comparan y se alinean para obtener la máxima correspondencia en una ventana de comparación, o en una región designada según se mide utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante alineación manual e inspección visual. Opcionalmente, la identidad existe sobre una región que tiene al menos aproximadamente 50 nucleótidos (o 10 aminoácidos) de longitud, o más preferentemente sobre una región que tiene de 100 a 500 o 1-000 o más nucleótidos (o 20, 50, 200 o más aminoácidos) de longitud.

Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de prueba y de referencia en un ordenador, se designan las coordenadas de la subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencia. Se pueden utilizar los parámetros predeterminados del programa o designar parámetros alternativos. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidades de las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, con base en los parámetros del programa. Los procedimientos de alineación de secuencias para su comparación son bien conocidos en la técnica. La alineación óptima de las secuencias para su comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, (1970) Adv. Appl. Math.

2:482c, mediante el algoritmo de alineación homológica de Needleman y Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443por el procedimiento de búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444por implementaciones informáticas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o por alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology).

Dos ejemplos de algoritmos adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402y Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410respectivamente. El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos también puede determinarse utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17) que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de brecha de 12 y una penalización de brecha de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse mediante el procedimiento Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453) que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en www.gcg.com), utilizando una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y un peso de brecha de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.

En un aspecto, la presente divulgación contempla modificaciones de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o fragmento de partida (por ejemplo, scFv) que generan moléculas funcionalmente equivalentes. Por ejemplo, el VH o VL de un dominio de unión a la anti-mesotelina, por ejemplo, scFv comprendido en el CAR puede ser modificado para retener al menos aproximadamente 70 %, 71 %. 72 %. 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %,81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de la región marco inicial VH o VL del dominio de unión a la antimesotelina, por ejemplo, scFv. La presente divulgación contempla modificaciones de todo el constructo de CAR, por ejemplo, modificaciones en una o más secuencias de aminoácidos de los diversos dominios del constructo de CAR para generar moléculas funcionalmente equivalentes. El constructo de CAR puede ser modificado para retener al menos aproximadamente 70 %, 71 %. 72 %. 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % identidad de la constructo CAR de partida.

Dominio transmembrana

Con respecto al dominio transmembrana, en diversas realizaciones, un CAR puede ser diseñado para comprender un dominio transmembrana que se une al dominio extracelular del CAR. Un dominio transmembrana puede incluir uno o más aminoácidos adicionales adyacentes a la región transmembrana, por ejemplo, uno o más aminoácidos asociados con la región extracelular de la proteína de la que se derivó la transmembrana (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 hasta 15 aminoácidos de la región extracelular) y/o uno o más aminoácidos adicionales asociados a la región intracelular de la proteína de la que deriva la transmembrana (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 hasta 15 aminoácidos de la región intracelular). En un aspecto, se utiliza el dominio transmembrana que es uno que está asociado con uno de los otros dominios del CAR , por ejemplo, en una realización, el dominio transmembrana puede ser de la misma proteína que el dominio de señalización, el dominio costimulador o el dominio bisagra del que se deriva. En otro aspecto, el dominio transmembrana no se deriva de la misma proteína de la que se deriva cualquier otro dominio del CAR. En algunos casos, el dominio transmembrana puede seleccionarse o modificarse mediante la sustitución de aminoácidos para evitar la unión de dichos dominios a los dominios transmembrana de las mismas o diferentes proteínas de membrana de superficie, por ejemplo, para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor. En un aspecto, el dominio transmembrana es capaz de homodimerizarse con otro CAR en la superficie celular de una célula que expresa el CAR. En otro aspecto, la secuencia de aminoácidos del dominio transmembrana puede modificarse o sustituirse para minimizar las interacciones con los dominios de unión del compañero de unión nativo presente en la misma célula que expresa el CAR.

El dominio transmembrana puede proceder de una fuente natural o recombinante. Cuando la fuente es natural, el dominio puede derivarse de cualquier proteína de membrana o transmembrana. En un aspecto, el dominio transmembrana es capaz de señalar los dominios intracelulares cuando el CAR se ha unido a un objetivo. Un dominio transmembrana de uso particular en esta divulgación puede incluir al menos los dominios transmembrana de, por ejemplo, la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8 (por ejemplo, CD8 alfa, CD8 beta), CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. En algunas realizaciones, un dominio transmembrana puede incluir al menos las regiones transmembrana de, por ejemplo KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD 162), LTBR, PAG/Cbp, NKG2D, y NKG2C.

En algunos casos, el dominio transmembrana puede estar unido a la región extracelular del CAR, por ejemplo, el dominio de unión a antígeno del CAR, a través de una bisagra, por ejemplo, una bisagra de una proteína humana. Por ejemplo, en una realización, la bisagra puede ser una bisagra de Ig (inmunoglobulina) humana (por ejemplo, una bisagra IgG4, una bisagra IgD), un enlazador GS (por ejemplo, un enlazador GS descrito en el presente documento), una bisagra KIR2DS2 o una bisagra CD8a. En una realización, la bisagra o espaciador comprende (por ejemplo, consiste en) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2. En un aspecto, el dominio transmembrana comprende (por ejemplo, consiste en) un dominio transmembrana de SEQ ID NO: 6.

En un aspecto, la bisagra o espaciador comprende una bisagra IgG4. Por ejemplo, en una realización, la bisagra o espaciador comprende una bisagra de la secuencia de aminoácidos como la siguiente

ESK Y G PPC PPC PA PE FL G G PSY FL FPPK PK D T L M ISR T PE Y T C V Y V D Y SQ E D PE Y Q FN W Y

V D G V E V H N A K TK PR E EQ FN S T Y R W S V LT V L H Q D W L N G KE Y K C K V SNK G LP S SIEKTIS

K A K G Q PR E PQ V Y T L PPSQ E E M T K N Q V SL T C L V K G FY PSD IA V E W E SN G Q PE N N Y K T T PP

V L D SD G SF F L Y SR L T V D K SR W Q E G N V F SC SV M H E A L H N H Y T Q K SL SL SL G K M (SEQ ID

NO:3).

En algunas realizaciones, la bisagra o espaciador comprende una bisagra codificada por una secuencia de nucleótidos como la siguiente

G AG AG CAA G TA C G G C C CTC CC TG C CC C C CTTG C C C TG C C C CC G A G TTC C TG G G C G G A

C C CA G C G TG TTCC T G TT CC C C CC C A A G C CC A A G G A C AC C C TG A TG AT C AG CC G G AC C

C C C G A G G TG A C C TG TG TG G TG G TG G A C G TG TC C C AG G A G G A C CC C G A G G TCC A G TT

C A A C TG G TA C G TG G A C G G C G TG G A G G TG C A C A A C G C C A A G A C C A A G C C C C G G G A G

G A G C A G TTC AA TA G C A C C TA C C G G G TG G TG T C C G TG C TG A C C G TG C T G C A C C A G G A

C TG G C T G A A C G G C A A G G A A T A C A A G T G T A A G G T G T C C A A C A A G G G C C T G C C C A G C A

G C A TC G A G A A A A C C A TC A G C A A G G C C A A G G G C C A G C C T C G G G A G C C C C A G G T G TA C

A C C C T G C C C C C T A G C C A A G A G G A G A T G A C C A A G A A C C A G G T G TC C C TG A C C T G C C T

G G TG A A G G G C TT C TA C C C C A G C G A C A T C G C C G T G G A G T G G G A G A G C A A C G G C C A G C

C C G A G A A C A A C T A C A A G A C C A C C C C C C C TG T G C TG G A C A G C G A C G G C A G C T TC TT C

C T G T A C A G C C G G C TG A C C G T G G A C A A G A G C C G G T G G C A G G A G G G C A A C G TC T TTA G

C T G C T C C G T G A TG C A C G A G G C C C T G C A C A A C C A C TA C A C C C A G A A G A G C C T G A G C C

TG TC C C T G G G C A A G A TG (SEQ ID NO: 14).

En un aspecto, la bisagra o espaciador comprende una bisagra de IgD. Por ejemplo, en una realización, la bisagra o espaciador comprende una bisagra de la secuencia de aminoácidos

R W PESPK A Q A S S V PT AQPQ A E G SL A K A T T A P A TT R N T GRGGEEKK KEK EKEEQEERETK

T PE C P SH T Q PL G V Y L L T P A V Q D L W L R D K A T F T C F W G SD L K D A H L T W E V A G K V PT G G V

E E G L L E R H SN G SQ SQ H SR LT LPR SL W N A G T SV TC T LN H PSL PPQ R L M A LR E PA A Q A PV K

L SL N L L A SSD PPE A A SW LLC E V SG FSPPN IL LM W L ED Q R EV N TSG FA PA R PPPQ PG ST TF

W A W S V L R V P A PP SPQP A T Y T C W SH ED SR T L L N A SR SL E V S Y V T D H (SEQ ID NO :4).

En algunas realizaciones, la bisagra o espaciador comprende una bisagra codificada por una secuencia de nucleótidos de

A G G T G G C C CG AA A G T C C C A A G G C C C A G G C A TC TA G T G TT C C T A C T G C A C A G C C C C A

G G C A G A A G G C A G C C T A G C C A A A G C T A C T A C T G C A C C T G C C A C T A C G C G C A A T A C T G

G C C G T G G C G G G G A G G A G A A G A A A A A G G A G A A A G A G A A A G A A G A A C A G G A A G A G A

G G G A G A C C A A G A C C C C TG A A TG T C C A TC C C A TA C C C A G C C G C TG G G C G TC TA TC TC T

T G A C T C C C G C A G TA C A G G A C TTG TG G C T TA G A G A TA A G G C C A C C TT TA C A T G TT TC G

TC G TG G G C TCT G A C C T G A A G G A TG C C C A T TT G A C T TG G G A G G TT G C C G G A A A G G TA C

C C A C A G G G G G G G T TG A G G A A G G G TT G C TG G A G C G C C A TT C C A A TG G C T C T C A G A G C

C A G C A C T C A A G A C T C A C C C TT C C G A G A TC C C TG T G G A A C G C C G G G A C C T C T G TC A C A

T G T A C T C T A A A T C A T C C T A G C C T G C C C C C A C A G C G T C T G A TG G C C C TT A G A G A G C C A

G C C G C C C A G G C A C C A G TTA A G C TT A G C C T G A A T C TG C TC G C C A G TA G T G A TC C C C C A

G A G G C C G C C A G C TG G C T C T TA TG C G A A G T G TC C G G C TT TA G C C C G C C C A A C A TC T TG

C T C A T G T G G C TG G A G G A C C A G C G A G A A G TG A A C A C C A G C G G C T TC G C TC C A G C C C G

G C C C C C A C C C C A G C C G G G TTC TA C CA C A TTC TG G G C C TG G AG TG TCTTA A G G G TC CC

A G C A C C A C C T A G C C C C C A G C C A G C C A C A T A C A C C T G T G T T G T G T C C C A T G A A G A T A G

C A G G A C C C TG C T A A A T G C TTC TA G G A G TC TG G A G G TT TC C TA C G TG A C TG A C C A TT

(SEQ ID NO: 15).

En un aspecto, el dominio transmembrana puede ser recombinante, en cuyo caso comprenderá residuos predominantemente hidrófobos tales como la leucina y la valina. En un aspecto, un triplete de fenilalanina, triptófano y valina puede encontrarse en cada extremo de un dominio transmembrana recombinante.

Opcionalmente, un oligo o polipéptido enlazador corto, de entre 2 y 10 aminoácidos de longitud puede formar el enlace entre el dominio transmembrana y la región de señalización citoplasmática del CAR. Un doblete de glicina-serina proporciona un enlazador especialmente adecuado. Por ejemplo, en un aspecto, el enlazador comprende la secuencia de aminoácidos de GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 5). En algunas realizaciones, el enlazador está codificado por una secuencia de nucleótidos de GGTGGCGAGGTTCTGGAGGGAGTCC (SEQ ID NO:16)

En un aspecto, la bisagra o espaciador comprende una bisagra KIR2DS2 y porciones de la misma.

Dominio citoplasmático

El dominio o región citoplasmática del CAR incluye un dominio de señalización intracelular. Un dominio de señalización intracelular es generalmente responsable de la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmune en la que se ha introducido el CAR. El término "función efectora" se refiere a una función especializada de una célula. La función efectora de una célula T, por ejemplo, puede ser la actividad citolítica o la actividad de ayuda, incluyendo la secreción de citoquinas. Así, el término "dominio de señalización intracelular" se refiere a la porción de una proteína que transduce la señal de la función efectora y dirige a la célula para que realice una función especializada. Aunque normalmente se puede emplear todo el dominio de señalización intracelular, en muchos casos no es necesario utilizar toda la cadena. En la medida en que se utilice una porción truncada del dominio de señalización intracelular, dicha porción truncada puede utilizarse en lugar de la cadena intacta siempre que transduce la señal de la función efectora. El término dominio de señalización intracelular se refiere, por lo tanto, a cualquier porción truncada del dominio de señalización intracelular suficiente para transducir la señal de la función efectora.

Los ejemplos de dominios de señalización intracelular para su uso en el CAR de la divulgación incluyen las secuencias citoplásmicas del receptor de células T (TCR) y los correceptores que actúan de forma concertada para iniciar la transducción de señales tras el acoplamiento del receptor de antígeno, así como cualquier derivado o variante de estas secuencias y cualquier secuencia recombinante que tenga la misma capacidad funcional.

Se sabe que las señales generadas a través del TCR por sí solas son insuficientes para la activación completa de la célula T y que también se requiere una señal secundaria y/o coestimuladora. Así, puede decirse que la activación de las células T está mediada por dos clases distintas de secuencias de señalización citoplasmática: las que inician la activación primaria dependiente del antígeno a través del TCR (dominios de señalización intracelular primaria) y las que actúan de forma independiente del antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora (dominio citoplasmático secundario, por ejemplo, un dominio costimulador).

Un dominio de señalización citoplasmática primaria regula la activación primaria del complejo TCR, ya sea de manera estimulante o inhibitoria. Los dominios primarios de señalización intracelular que actúan de forma estimulante pueden contener motivos de señalización que se conocen como motivos de activación con base en tirosinas de inmunoreceptores o ITAM.

Los ejemplos de ITAM que contienen dominios de señalización intracelular primarios que son de uso particular en la divulgación incluyen los de CD3 zeta, FcR gamma común (FCER1G), Fc gamma RIIa" FcR beta (Fc Epsilon R1b), CD3 gamma, CD3 delta , CD3 epsilon, CD79a, CD79b, DAP10 y DAP12. En una realización, un CAR de la divulgación comprende un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización primario de CD3-zeta.

En una realización, un dominio de señalización primario comprende un dominio ITAM modificado, por ejemplo, un dominio ITAM mutado que tiene una actividad alterada (por ejemplo, aumentada o disminuida) en comparación con el dominio ITAM nativo. En una realización, un dominio de señalización primario comprende un dominio de señalización intracelular primario que contiene ITAM modificado, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario que contiene ITAM optimizado y/o truncado. En una realización, un dominio de señalización primario comprende uno, dos, tres, cuatro o más motivos ITAM.

Otros ejemplos de moléculas que contienen un dominio de señalización intracelular primario que son de uso particular en la divulgación incluyen los de DAP10, DAP12 y CD32.

El dominio intracelular del CAR puede comprender el dominio de señalización CD3-zeta por sí mismo o puede combinarse con cualquier otro dominio de señalización intracelular deseado que sea útil en el contexto de un CAR de la divulgación. Por ejemplo, el dominio de señalización intracelular del CAR puede comprender una porción de la cadena CD3 zeta y un dominio de señalización coestimuladora. El dominio de señalización coestimuladora se refiere a una porción del CAR que comprende el dominio intracelular de una molécula coestimuladora. Una molécula coestimuladora es una molécula de la superficie celular distinta de un receptor de antígeno o de sus ligandos que es necesaria para una respuesta eficaz de los linfocitos a un antígeno. Ejemplos de tales moléculas son CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1 (también conocida como PD1), ICOS, antígeno-1 asociado a la función de los linfocitos (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, y un ligando que se une específicamente con CD83, y similares. Por ejemplo, se ha demostrado que la coestimulación de CD27 mejora la expansión, la función efectora y la supervivencia de las células de CART humanas in vitro y aumenta la persistencia de las células T humanas y la actividad antitumoral in vivo (Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706). Otros ejemplos de tales moléculas coestimuladoras incluyen CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8alpha, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alpha, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD 103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), NKG2D, CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, y PAG/Cbp.

Los dominios de señalización intracelular dentro de la porción citoplasmática del CAR de la divulgación pueden estar unidos entre sí en un orden aleatorio o específico. Opcionalmente, un oligo o polipéptido enlazador corto, por ejemplo, entre 2 y 10 aminoácidos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos) de longitud puede formar el enlace entre los dominios de señalización intracelular. En una realización, se puede utilizar un doblete de glicina-serina como enlazador adecuado. En una realización, un solo aminoácido, por ejemplo, una alanina, una glicina, puede ser utilizado como un enlazador adecuado.

En un aspecto, el dominio de señalización intracelular está diseñado para comprender dos o más, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o más, dominios de señalización coestimuladora. En una realización, los dos o más, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o más, dominios de señalización coestimuladora, están separados por una molécula enlazadora, por ejemplo, una molécula enlazadora descrita en el presente documento. En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende dos dominios de señalización coestimuladora. En algunas realizaciones, la molécula enlazadora es un residuo de glicina. En algunas realizaciones, el enlazador es un residuo de alanina.

En un aspecto, el dominio de señalización intracelular está diseñado para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD28. En un aspecto, el dominio de señalización intracelular está diseñado para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de 4-1BB. En un aspecto, el dominio de señalización de 4-1BB es un dominio de señalización de SEQ ID NO: 16. En un aspecto, el dominio de señalización de CD3-zeta es un dominio de señalización de SEQ ID NO: 17.

En un aspecto, el dominio de señalización intracelular está diseñado para comprender el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD27. En un aspecto, el dominio de señalización de CD27 comprende una secuencia de aminoácidos de QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP (SEQ ID NO:8). En un aspecto, el dominio de señalización de CD27 está codificado por una secuencia de ácido nucleico de

A G G A G T A A G A G G A G C A G G C T C C T G C A C A G T G A C T A C A T G A A C A T G A C T C C C C G C C G

C C CC G G G C CC A C CC G C A A G C AT TA C C AG CC C TA TG CC C C AC C A C G C G A CT TC G C A G C

CTATCG CTCC (SEQ ID NO: 19).

En un aspecto, la célula que expresa CAR descrita en el presente documento puede comprender además un segundo CAR, por ejemplo, un segundo CAR que incluye un dominio de unión a antígeno diferente, por ejemplo, al mismo objetivo (mesotelina) o a un objetivo diferente (por ejemplo, un objetivo distinto de la mesotelina en las células del cáncer de próstata, por ejemplo, FAP; un objetivo distinto de la mesotelina en las células del cáncer de próstata, por ejemplo, receptor de andrógenos, OR51E2, PSMA, PSCA, PDGRF-P, TARP, GloboH, MAD-CT-1, o MAD-CT-2; un objetivo distinta de la mesotelina en células de cáncer de ovario, por ejemplo, Tn, PRSS21, CD171, Lewis Y, receptor a de folato , claudin6, GloboH o proteína de esperma 17; un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de pulmón, por ejemplo, VEGF, HER3, IGF-1R, EGFR, DLL4 o Trop-2). En una realización, la célula que expresa CAR comprende un primer CAR que se dirige a un primer antígeno e incluye un dominio de señalización intracelular que tiene un dominio de señalización coestimuladora pero no un dominio de señalización primario, y un segundo CAR que se dirige a un segundo antígeno diferente e incluye un dominio de señalización intracelular que tiene un dominio de señalización primario pero no un dominio de señalización coestimuladora. La colocación de un dominio de señalización coestimuladora, por ejemplo, 4-1BB, CD28, CD27 u OX-40, en el primer CAR, y el dominio de señalización primario, por ejemplo, CD3 zeta, en el segundo CAR puede limitar la actividad del CAR a las células donde se expresan ambos objetivos. En una realización, la célula que expresa el CAR comprende un primer mesotelina CAR que incluye un dominio de unión a la mesotelina, un dominio transmembrana y un dominio coestimulador y un segundo CAR que se dirige a un antígeno distinto de la mesotelina (por ejemplo, un objetivo distinto de la mesotelina en las células del estroma, por ejemplo, FAP; un objetivo distinto de la mesotelina en las células del cáncer de próstata, por ejemplo, receptor de andrógenos, OR51E2, PSMA, PSCA, PDGRF-P, TARP, GloboH, MAD-CT-1, o MAD-CT-2; un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de ovario, por ejemplo, Tn, PRSS21, CD171, Lewis Y, receptor de folato a, claudin6, GloboH, o proteína de esperma 17, por ejemplo, un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de pulmón, por ejemplo, VEGF, HER3, IGF-1R, EGFR, DLL4 o Trop-2) e incluye un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización primaria. En otra realización, la célula que expresa el CAR comprende un primer mesotelina CAR que incluye un dominio de unión a la a mesotelina, un dominio transmembrana y un dominio de señalización primario y un segundo CAR que se dirige a un antígeno distinto de la mesotelina (por ejemplo, un objetivo distinto a la mesotelina en las células del estroma, por ejemplo, FAP; un objetivo distinto de la mesotelina en las células del cáncer de próstata, por ejemplo, receptor de andrógenos, OR51E2, PSMA, PSCA, PDGRF-p, TARP, GloboH, MAD-CT-1, o MAD-CT-2; un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de ovario, por ejemplo, Tn, PRSS21, CD171, Lewis Y, receptor de folato a, claudin6, GloboH, o proteína de esperma 17, por ejemplo, un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de pulmón, por ejemplo, VEGF, HER3, IGF-1R, EGFR, DLL4 o Trop-2) e incluye un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización coestimuladora.

En una realización, la célula que expresa CAR comprende un mesotelina CAR descrito en el presente documento y un CAR inhibidor. En una realización, el CAR inhibidor comprende un dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno que se encuentra en las células normales pero no en las células cancerosas, por ejemplo, células normales que también expresan mesotelina. En una realización, el CAR inhibidor comprende el dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un dominio intracelular de una molécula inhibidora. Por ejemplo, el dominio intracelular del CAR inhibidor puede ser un dominio intracelular de PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 y TGFR beta.

En una realización, cuando la célula que expresa CAR comprende dos o más CARs diferentes, los dominios de unión a antígeno de los diferentes CAR pueden ser tales que los dominios de unión a antígeno no interactúan entre sí. Por ejemplo, una célula que expresa un primer y un segundo CAR puede tener un dominio de unión a antígeno del primer CAR, por ejemplo, como un fragmento, por ejemplo, un scFv, que no forma una asociación con el dominio de unión a antígeno del segundo CAR, por ejemplo, el dominio de unión a antígeno del segundo CAR es un VHH

En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno comprende una molécula de unión a antígeno de dominio único (SDAB) e incluye moléculas cuyas regiones determinantes complementarias forman parte de un polipéptido de dominio único. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, dominios variables de cadena pesada, moléculas de unión naturalmente desprovistas de cadenas ligeras, dominios únicos derivados de anticuerpos convencionales de 4 cadenas, dominios diseñados y andamios de dominio único distintos de los derivados de anticuerpos. Las moléculas SDAB pueden ser cualquiera de la técnica, o cualquier futura molécula de dominio único. Las moléculas SDAB pueden derivarse de cualquier especie, incluyendo, pero sin limitarse a, el ratón, el ser humano, el camello, la llama, la lamprea, el pez, el tiburón, la cabra, el conejo y el bovino. Este término también incluye las moléculas de anticuerpos de dominio único de origen natural procedentes de especies distintas de los camélidos y los tiburones.

En un aspecto, una molécula SDAB puede derivarse de una región variable de la inmunoglobulina que se encuentra en los peces, tal como, por ejemplo, la que se deriva del isotipo de inmunoglobulina conocido como Receptor de Antígeno Nuevo (NAR) que se encuentra en el suero del tiburón. Los procedimientos de producción de moléculas de dominio único derivadas de una región variable de NAR ("IgNARs") se describen en WO 03/014161 y en Streltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909.

De acuerdo con otro aspecto, una molécula SDAB es una molécula de unión a antígeno de un solo dominio de origen natural conocida como cadena pesada desprovista de cadenas ligeras. Tales moléculas de dominio único se divulgan en el documento WO 9404678 y Hamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448por ejemplo. Por razones de claridad, este dominio variable derivado de una molécula de cadena pesada naturalmente desprovista de cadena ligera se conoce en el presente documento como VHH o nanocuerpo para distinguirlo del VH convencional de las inmunoglobulinas de cuatro cadenas. Dicha molécula VHH puede provenir de las especies de Camelidae, por ejemplo en el camello, la llama, el dromedario, la alpaca y el guanaco. Otras especies, además de Camelidae, pueden producir moléculas de cadena pesada desprovistas naturalmente de cadena ligera; tales VHH están dentro del alcance de la divulgación.

Las moléculas de SDAB pueden ser recombinantes, injertadas con CDR, humanizadas, cameladas, desinmunizadas y/o generadas in vitro (por ejemplo, seleccionadas por visualización de fagos).

También se ha descubierto, que las células que tienen una pluralidad de receptores quiméricos incrustados en la membrana que comprenden un dominio de unión a antígeno que las interacciones entre el dominio de unión a antígeno de los receptores pueden ser indeseables, por ejemplo, porque inhibe la capacidad de uno o más de los dominios de unión a antígeno para unirse a su antígeno cognado. En consecuencia, se divulgan en el presente documentos las células que tienen un primer y un segundo receptor quimérico de membrana no natural que comprende dominios de unión a antígeno que minimizan tales interacciones. También se divulgan en el presente documento los ácidos nucleicos que codifican un primer y un segundo receptor quimérico de membrana no natural que comprenden un dominio de unión a antígeno que minimiza dichas interacciones, así como procedimientos para fabricar y utilizar dichas células y ácidos nucleicos. En una realización, el dominio de unión a antígeno de uno de los primeros y segundos receptores quiméricos de membrana no naturales, comprende un scFv, y el otro comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón.

En algunas realizaciones, la divulgación reivindicada comprende un primer y segundo CAR, en el que el dominio de unión a antígeno de uno de los primeros y segundos CAR no comprende un dominio ligero variable y un dominio pesado variable. En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno de uno de los primeros y segundos CAR es un scFv, y el otro no es un scFv. En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno de uno de los primeros y segundos CAR comprende un dominio VH único, por ejemplo, un dominio VH único de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH único derivado de una secuencia humana o de ratón. En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno de uno de los primeros y segundos CAR comprende un nanocuerpo. En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno de uno de los primeros y segundos CAR comprende un dominio VHH de camélido.

En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno de uno de los primeros y segundos CAR comprende un scFv, y el otro comprende un dominio VH simple, por ejemplo, un dominio V^hsimple de camélido, tiburón o lamprea, o un dominio VH simple derivado de una secuencia humana o de ratón. En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno de uno de los primeros y segundos CAR comprende un scFv, y el otro comprende un nanocuerpo. En algunas realizaciones, el dominio de unión a antígeno de uno de los primeros y segundos CAR comprende un scFv, y el otro comprende un dominio VHH de camélido.

En algunas realizaciones, cuando está presente en la superficie de una célula, la unión del dominio de unión a antígeno del primer CAR a su antígeno cognado no se reduce sustancialmente por la presencia del segundo CAR. En algunas realizaciones, la unión del dominio de unión a antígeno del primer CAR a su antígeno cognado en presencia del segundo CAR es 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99% de la unión del dominio de unión a antígeno del primer CAR a su antígeno cognado en ausencia del segundo CAR.

En algunas realizaciones, cuando están presentes en la superficie de una célula, los dominios de unión a antígeno del primer y segundo CAR se asocian entre sí menos que si ambos fueran dominios de unión a antígeno scFv. En algunas realizaciones, los dominios de unión a antígeno del primer y segundo CAR se asocian entre sí en 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % menos que si ambos fueran dominios de unión a antígeno scFv.

En otro aspecto, la célula que expresa CAR descrita en el presente documento puede expresar además otro agente, por ejemplo, un agente que mejora la actividad o la aptitud de una célula que expresa CAR. Por ejemplo, en una realización, el agente puede ser un agente que inhibe una molécula que modula o regula, por ejemplo, la función de las células T. En algunas realizaciones, la molécula que modula o regula la función de las células T es una molécula inhibidora. Las moléculas inhibidoras, por ejemplo, PD1, pueden, en algunas realizaciones, disminuir la capacidad de una célula que expresa CAR para montar una respuesta inmune efectora. Algunos ejemplos de moléculas inhibidoras incluyen PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 y TGFR beta. En las realizaciones, un agente, por ejemplo, un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un ARNcd, por ejemplo, un ARNpi o ARNhc; o por ejemplo, una proteína o sistema inhibidor, por ejemplo, una repetición palindrómica corta agrupada y regularmente interespaciada (CRISPR), una nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción (TALEN), o una endonucleasa de dedo de zinc (ZFN), por ejemplo, como se describe en el presente documento, pueden utilizarse para inhibir la expresión de una molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T en la célula que expresa el CAR. En una realización, el agente es un ARNhc, por ejemplo, un ARNhc descrito en el presente documento. En una realización, el agente que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T se inhibe dentro de una célula que expresa CAR. Por ejemplo, una molécula de ARNcd que inhibe la expresión de una molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T está vinculada al ácido nucleico que codifica un componente, por ejemplo, todos los componentes, del CAR.

En una realización, el agente que inhibe una molécula inhibidora comprende un primer polipéptido, por ejemplo, una molécula inhibidora, asociada con un segundo polipéptido que proporciona una señal positiva a la célula, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular descrito en el presente documento. En una realización, el agente comprende un primer polipéptido, por ejemplo, de una molécula inhibidora tal como PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 y TGFR beta T, o un fragmento de cualquiera de ellos (por ejemplo, al menos una porción de un dominio extracelular de cualquiera de ellos), y un segundo polipéptido que es un dominio de señalización intracelular descrito en el presente documento (por ejemplo, que comprende un dominio coestimulador (por ejemplo, 41BB, CD27 o CD28, por ejemplo, como se describe en el presente documento) y/o un dominio de señalización primario (por ejemplo, un dominio de señalización CD3 zeta descrito en el presente documento). En una realización, el agente comprende un primer polipéptido de PD1 o un fragmento del mismo (por ejemplo, al menos una porción de un dominio extracelular de PD1), y un segundo polipéptido de un dominio de señalización intracelular descrito en el presente documento (por ejemplo, un dominio de señalización CD28 descrito en el presente documento y/o un dominio de señalización CD3 zeta descrito en el presente documento). PD1 es un miembro inhibidor de la familia de receptores CD28 que también incluye a CD28, CTLA-4, ICOS y BTLA. PD-1 se expresa en las células B activadas, las células T y las células mieloides (Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75). Se ha demostrado que dos ligandos de PD1, PD-L1 y PD-L2, regulan a la baja la activación de las células T al unirse a PD1 (Freeman et a. 2000 J Exp Med 192:1027-34 Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8 Carter et al.

2002 Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1 es abundante en los cánceres humanos (Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7 Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314 Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094). La supresión inmunitaria puede revertirse inhibiendo la interacción local de PD1 con PD-L1.

En una realización, el agente comprende el dominio extracelular (ECD) de una molécula inhibidora, por ejemplo, la Muerte Programada 1 (PD1), puede fusionarse con un dominio transmembrana y dominios de señalización intracelular tales como 41BB y CD3 zeta (también referido en el presente documento como un PD1 CAR). En una realización, el PD1 CAR, cuando se utiliza en combinación con un mesotelina CAR descrito en el presente documento, mejora la persistencia de la célula T. En una realización, el CAR es un PD1 CAR, que comprende el dominio extracelular de PD1 indicado como subrayado en SEQ ID NO: 24 y una secuencia señal en los aminoácidos 1-21 de SEQ ID NO:24. En una realización, el PD1 CAR comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:24.

M alpvtalllplalllhaarppgw fldspdrpw npptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnw vrm spsnqtdkl

aafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhm swrarrndsgtvlcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvt

ttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfm rpvqttqeed

gcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpem ggkprrknpqeglynelqkdkm aea

yseigm kgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhm qalppr (SE Q ID N O :24).

En una realización, el PD1 CAR sin la secuencia de señal N-terminal comprende la secuencia de aminoácidos proporcionada a continuación (SEQ ID NO:22).

pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnw yrm spsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtq

lpngrdfhm swrarrndsgtvlcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslr

peacrpaaggavhtrgldfacdiyiw aplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfm rpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkf

srsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpem ggkprrknpqeglynelqkdkm aeayseigm kgerrrgkghdgl

yqglstatkdtydalhm qalppr (SEQ ID N O :22).

En una realización, el agente comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el PD1 CAR con la secuencia de señal N-terminal, por ejemplo, el PD1 CAR descrito en el presente documento. En una realización, la secuencia de ácido nucleico para el PD1 ^cA ^r, se muestra a continuación, con el PD1 ECD subrayado en SEQ ID NO: 23 atggccctccctgtcactgccctgcttctccccctcgcactcctgctccacgccgctagaccacccggatggtttctggactc

tccggatcgcccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggcgataatgcgaccttcacgtgctcgttctccaa

cacctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgtcaaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggtcgcaa

ccgggacaggattgtcggttccgcgtgactcaactgccgaatggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaacgactcc

gggacctacctgtgcggagccatctcgctggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgaccgagcgca

gagctgaggtgccaactgcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtcacgaccactccggcgccgcgc

ccaccgactccggccccaactatcgcgagccagcccctgtcgctgaggccggaagcatgccgccctgccgccggaggtgctgtgcatac

ccggggattggacttcgcatgcgacatctacatttgggctcctctcgccggaacttgtggcgtgctccttctgtccctggtcatcaccctgtact

gcaagcggggtcggaaaaagcttctgtacattttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcaaaccacccaggaggaggacggttgctcct

gccggttccccgaagaggaagaaggaggttgcgagctgcgcgtgaagttctcccggagcgccgacgcccccgcctataagcagggcca

gaaccagctgtacaacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgctggacaagcggcgcggccgggaccccgaaatggg

cgggaagcctagaagaaagaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctactccgaaattggg

atgaagggagagcggcggaggggaaaggggcacgacggcctgtaccaaggactgtccaccgccaccaaggacacatacgatgccct

gcacatgcaggcccttccccctcgc (SEQ ID NO: 23).

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una población de células que expresan CAR, por ejemplo, células CART. En algunas realizaciones, la población de células que expresan CAR comprende una mezcla de células que expresan diferentes CAR. Por ejemplo, en una realización, la población de células CART puede incluir una primera célula que exprese un CAR que tenga un dominio de unión a la anti-CD 19 descrito en el presente documento, y una segunda célula que exprese un CAR que tenga un dominio de unión a la anti-CD 19 diferente, por ejemplo, un dominio de unión a la antimesotelina descrito en el presente documento que difiera del dominio de unión a la anti-mesotelina en el CAR expresado por la primera célula. Como otro ejemplo, la población de células que expresan CAR puede incluir una primera célula que expresa un CAR que incluye un dominio de unión a la anti mesotelina, por ejemplo, como se describe en el presente documento, y una segunda célula que expresa un CAR que incluye un dominio de unión a antígeno a un objetivo distinto ala mesotelina (por ejemplo, un objetivo distinto a la mesotelina en células del cáncer de próstata, por ejemplo, FAP; un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de próstata, por ejemplo, receptor de andrógenos, OR5lE2, P^sMA, PSCA, PDGRF-P, TARP, GloboH, MAD-CT-1 o MAD-CT-2; un objetivo distinto a la mesotelina en células de cáncer de ovario, por ejemplo, Tn, PRSS21, CD171, Lewis Y, receptor de folato a, claudin6, GloboH o proteína de esperma 17; un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de pulmón, por ejemplo, VEGF, ^hE^r3, IGF-1R, E^gFR, DLL4 o Trop-2). En una realización, la población de células que expresan CAR incluye, por ejemplo, una primera célula que expresa un CAR que incluye un dominio de señalización intracelular primario, y una segunda célula que expresa un CAR que incluye un dominio de señalización secundario.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una población de células en la que al menos una célula de la población expresa un CAR que tiene un dominio de unión a la antimesotelina descrito en el presente documento, y una segunda célula que expresa otro agente, por ejemplo, un agente que mejora la actividad o la función de una célula que expresa el CAR. Por ejemplo, en una realización, el agente puede ser un agente que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T. En algunas realizaciones, la molécula que modula o regula la función de las células T es una molécula inhibidora, por ejemplo, un agente descrito en el presente documento. Las moléculas inhibidoras, por ejemplo, pueden, en algunas realizaciones, disminuir la capacidad de una célula que expresa CAR para montar una respuesta efectoras inmune. Algunos ejemplos de moléculas inhibidoras incluyen PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 y TGFR beta. En una realización, el agente que inhibe una molécula inhibidora comprende un primer polipéptido, por ejemplo, una molécula inhibidora, asociada con un segundo polipéptido que proporciona una señal positiva a la célula, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular descrito en el presente documento. En una realización, el agente comprende un primer polipéptido, por ejemplo, de una molécula inhibidora como PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 y TGFR beta, o un fragmento de cualquiera de ellos (por ejemplo, al menos una porción de un dominio extracelular de cualquiera de ellos), y un segundo polipéptido que es un dominio de señalización intracelular descrito en el presente documento (por ejemplo, que comprende un dominio coestimulador (por ejemplo, 41BB, CD27 o CD28, por ejemplo, como se describe en el presente documento) y/o un dominio de señalización primario (por ejemplo, un dominio de señalización CD3 zeta descrito en el presente documento). En una realización, el agente comprende un primer polipéptido de PD1 o un fragmento del mismo (por ejemplo, al menos una porción del dominio extracelular de PD1), y un segundo polipéptido de un dominio de señalización intracelular descrito en el presente documento (por ejemplo, un dominio de señalización CD28 descrito en el presente documento y/o un dominio de señalización CD3 zeta descrito en el presente documento).

En un aspecto, la presente divulgación proporciona procedimientos que comprenden la administración de una población de células que expresan CAR, por ejemplo, células CART, por ejemplo, una mezcla de células que expresan diferentes CAR, en combinación con otro agente, por ejemplo, un inhibidor de quinasa, tal como un inhibidor de quinasa descrito en el presente documento. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona procedimientos que comprenden la administración de una población de células en la que al menos una célula de la población expresa un CAR que tiene un dominio de unión a la antimesotelina como se describe en el presente documento, y una segunda célula que expresa otro agente, por ejemplo, un agente que mejora la actividad o la aptitud de una célula que expresa CAR, en combinación con otro agente, por ejemplo, un inhibidor de la quinasa, tal como un inhibidor de la quinasa descrito en el presente documento.

Receptores de Antígenos Quiméricos Regulables

En algunas realizaciones, un CAR regulable (RCAR) donde la actividad del CAR puede ser controlada es deseable para optimizar la seguridad y la eficacia de una terapia CAR. Hay muchas formas de regular las actividades de los CAR. Por ejemplo, la apoptosis inducible utilizando, por ejemplo, una caspasa fusionada a un dominio de dimerización (véase, por ejemplo, Di et al., N Egnl. J. Med. 2011 Nov. 3; 365(18):1673-1683), puede utilizarse como interruptor de seguridad en la terapia CAR de la presente divulgación. En un aspecto, un RCAR comprende un conjunto de polipéptidos, típicamente dos en las realizaciones más sencillas, en el que los componentes de un CAR estándar descrito en el presente documento, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno y un dominio de señalización intracelular, están repartidos en polipéptidos o miembros separados. En algunas realizaciones, el conjunto de polipéptidos incluye un interruptor de dimerización que, en presencia de una molécula de dimerización, puede acoplar los polipéptidos entre sí, por ejemplo, puede acoplar un dominio de unión a antígeno a un dominio de señalización intracelular.

En un aspecto, un RCAR comprende dos polipéptidos o miembros: 1) un miembro de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario descrito en el presente documento, y un primer dominio de conmutación; 2) un miembro de unión a antígeno que comprende un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, que se dirige a la mesotelina como se describe en el presente documento, y un segundo dominio de conmutación. Opcionalmente, el RCAR comprende un dominio transmembrana descrito en el presente documento. En una realización, un dominio transmembrana puede estar dispuesto en el miembro de señalización intracelular, en el miembro de unión a antígeno, o en ambos. (A menos que se indique lo contrario, cuando se describen en el presente documento miembros o elementos de un RCAR, el orden puede ser el previsto, pero también se incluyen otros órdenes. En otras palabras, en una realización, el orden es el establecido en el texto, pero en otras realizaciones, el orden puede ser diferente. Por ejemplo, el orden de los elementos en un lado de una región transmembrana puede ser diferente al del ejemplo, por ejemplo, la colocación de un dominio de conmutación en relación con un dominio de señalización intracelular puede ser diferente, por ejemplo, invertido).

En una realización, el primer y segundo dominios de conmutación pueden formar un interruptor de dimerización intracelular o extracelular. En una realización, el interruptor de dimerización puede ser un interruptor de homodimerización, por ejemplo, donde el primer y el segundo dominio de conmutación son el mismo, o un interruptor de heterodimerización, por ejemplo, donde el primer y el segundo dominio de conmutación son diferentes entre sí.

En las realizaciones, un RCAR puede comprender un "interruptor múltiple" Un interruptor múltiple puede comprender dominios de interruptor de heterodimerización o dominios de conmutación de homodimerización. Un interruptor múltiple comprende una pluralidad de, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, dominios de conmutación, independientemente, en un primer miembro, por ejemplo, un miembro de unión a antígeno, y un segundo miembro, por ejemplo, un miembro de señalización intracelular. En una realización, el primer miembro puede comprender una pluralidad de primeros dominios de conmutación, por ejemplo, dominios de conmutación con base en FKBP, y el segundo miembro puede comprender una pluralidad de segundos dominios de conmutación, por ejemplo, dominios de conmutación con base en FRB. En una realización, el primer miembro puede comprender un primer y un segundo dominio de conmutación, por ejemplo, un dominio de conmutación con base en FKBP y un dominio de conmutación con base en FRB, y el segundo miembro puede comprender un primer y un segundo dominio de conmutación, por ejemplo, un dominio de conmutación con base en FKBP y un dominio de conmutación con base en FRB.

En una realización, el miembro de señalización intracelular comprende uno o más dominios de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario y uno o más dominios de señalización coestimuladora.

En una realización, el miembro de unión a antígeno puede comprender uno o más dominios de señalización intracelular, por ejemplo, uno o más dominios de señalización coestimuladora. En una realización, el miembro de unión a antígeno comprende una pluralidad, por ejemplo, 2 o 3 dominios de señalización coestimuladora descritos en el presente documento, por ejemplo, seleccionados entre 41BB, CD28, CD27, ICOS y OX40, y en las realizaciones, ningún dominio de señalización intracelular primario. En una realización, el miembro de unión a antígeno comprende los siguientes dominios de señalización coestimuladora, desde la dirección extracelular a la intracelular: 41BB-CD27; 41BB-CD27; CD27-41BB; 41BB-CD28; CD28-41BB; OX40-CD28; CD28-OX40; CD28-41BB; o 41BB-CD28. En tales realizaciones, el miembro de unión intracelular comprende un dominio CD3zeta. En una de dichas realizaciones, el RCAR comprende (1) un miembro de unión a antígeno que comprende, un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, descrito en el presente documento, un dominio transmembrana, y dos dominios costimuladores y un primer dominio de conmutación; y (2) un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio transmembrana o un dominio de sujeción a la membrana y al menos un dominio de señalización intracelular primario, y un segundo dominio de conmutación.

Una realización proporciona los RCAR en los que el miembro de unión a antígeno no está atado a la superficie de la célula CAR. Esto permite que una célula que tiene un miembro de señalización intracelular sea convenientemente emparejada con uno o más dominios de unión a antígeno, sin transformar la célula con una secuencia que codifique el miembro de unión a antígeno. En tales realizaciones, el RCAR comprende: 1) un miembro de señalización intracelular que comprende: un primer dominio de conmutación, un dominio transmembrana, un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular primario, y un primer dominio de conmutación; y 2) un miembro de unión a antígeno que comprende: un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, descrito en el presente documento, y un segundo dominio de conmutación, en el que el miembro de unión a antígeno no comprende un dominio transmembrana o un dominio de sujeción a la membrana, y, opcionalmente, no comprende un dominio de señalización intracelular. En algunas realizaciones, el RCAR puede comprender además 3) un segundo miembro de unión a antígeno que comprende: un segundo dominio de unión a antígeno, por ejemplo, un segundo dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno diferente al unido por el dominio de unión a antígeno; y un segundo dominio de conmutación.

También se proporcionan en el presente documento los RCAR en los que el miembro de unión a antígeno comprende la activación biespecífica y la capacidad de focalización. En esta realización, el miembro de unión a antígeno puede comprender una pluralidad, por ejemplo, 2, 3, 4 o 5 dominios de unión a antígeno, por ejemplo, scFvs, en los que cada dominio de unión a antígeno se une a un antígeno objetivo, por ejemplo, diferentes antígenos o el mismo antígeno, por ejemplo, el mismo o diferentes epítopos en el mismo antígeno. En una realización, la pluralidad de dominios de unión a antígeno está en tándem, y opcionalmente, una región de enlace o bisagra está dispuesta entre cada uno de los dominios de unión a antígeno. En el presente documento se describen enlazadores y regiones de bisagra adecuados.

Una realización proporciona los RCAR que tienen una configuración que permite la conmutación de la proliferación. En esta realización, el RCAR comprende: 1) un miembro de señalización intracelular que comprende: opcionalmente, un dominio transmembrana o un dominio de fijación a la membrana; uno o más dominios de señalización coestimuladores, por ejemplo, seleccionados entre 41BB, CD28, CD27, ICOS y OX40, y un dominio de conmutación; y 2) un miembro de unión a antígeno que comprende: un dominio de unión a antígeno, por ejemplo, descrito en el presente documento, un dominio transmembrana, y un dominio primario de señalización intracelular, por ejemplo, un dominio CD3zeta, en el que el miembro de unión a antígeno no comprende un dominio de conmutación, o no comprende un dominio de conmutación que dimerice con un dominio de conmutación en el miembro de señalización intracelular. En una realización, el miembro de unión a antígeno no comprende un dominio de señalización coestimuladora. En una realización, el miembro de señalización intracelular comprende un dominio de conmutación de un interruptor de homodimerización. En una realización, el miembro de señalización intracelular comprende un primer dominio de conmutación de un interruptor de heterodimerización y el RCAR comprende un segundo miembro de señalización intracelular que comprende un segundo dominio de conmutación del interruptor de heterodimerización. En tales realizaciones, el segundo miembro de señalización intracelular comprende los mismos dominios de señalización intracelular que el miembro de señalización intracelular. En una realización, el interruptor de dimerización es intracelular. En una realización, el interruptor de dimerización es extracelular.

En cualquiera de las configuraciones RCAR descritas aquí, el primer y segundo dominios de conmutación comprenden un conmutador con base en FKBP/FRB como se describe aquí.

También se proporcionan aquí células que comprenden un RCAR descrito aquí. Cualquier célula diseñada para expresar un Rc Ar puede utilizarse como célula RCARX. En una realización, la célula RCARX es una célula T, y se denomina célula RCART. En una realización, la célula RCARX es una célula NK, y se denomina célula RCARN.

También se proporcionan aquí ácidos nucleicos y vectores que comprenden secuencias de codificación de RCAR. La secuencia que codifica varios elementos de un RCAR puede estar dispuesta en la misma molécula de ácido nucleico, por ejemplo, el mismo plásmido o vector, por ejemplo, vector viral, por ejemplo, vector lentiviral. En una realización, (i) la secuencia que codifica un miembro de unión a antígeno y (ii) la secuencia que codifica un miembro de señalización intracelular puede estar presentes en el mismo ácido nucleico, por ejemplo, vector. La producción de las proteínas correspondientes puede lograrse, por ejemplo, mediante el uso de promotores separados, o mediante el uso de un producto de transcripción bicistrónico (que puede dar lugar a la producción de dos proteínas por escisión de un único producto de traducción o por la traducción de dos productos proteicos separados). En una realización, una secuencia que codifica un péptido escindible, por ejemplo, una secuencia P2A o F2A, está dispuesta entre (i) y (ii). En una realización, una secuencia que codifica un IRES, por ejemplo, un IRES de EMCV o EV71, se dispone entre (i) y (ii). En estas realizaciones, (i) y (ii) se transcriben como un único ARN. En una realización, un primer promotor está vinculado de forma operable a (i) y un segundo promotor está vinculado de forma operable a (ii), de forma que (i) y (ii) se transcriben como ARNm separados.

Alternativamente, la secuencia que codifica varios elementos de un RCAR puede estar dispuesta en las diferentes moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, diferentes plásmidos o vectores, por ejemplo, vector viral, por ejemplo, vector lentiviral. Por ejemplo, la (i) secuencia que codifica un miembro de unión a antígeno puede estar presente en un primer ácido nucleico, por ejemplo, un primer vector, y la (ii) secuencia que codifica un miembro de señalización intracelular puede estar presente en el segundo ácido nucleico, por ejemplo, el segundo vector.

Interruptores de dimerización

Los interruptores de dimerización pueden ser no covalentes o covalentes. En un interruptor de dimerización no covalente, la molécula de dimerización promueve una interacción no covalente entre los dominios de conmutación. En un interruptor de dimerización covalente, la molécula de dimerización promueve una interacción covalente entre los dominios de conmutación.

En una realización, el RCAR comprende un interruptor de dimerización con base en FKBP/FRAP o FKBP/FRB. La FKBP12 (FKBP, o proteína de unión a FK506) es una proteína citoplasmática abundante que sirve de objetivo intracelular inicial para el producto natural inmunosupresor, la rapamicina. La rapamicina se une a FKBP y al gran homólogo de PI3K FRAP (RAFT, mTOR). FRB es una porción de 93 aminoácidos de FRAP, que es suficiente para unir el complejo FKBPrapamicina (Chen, J., Zheng, X. F., Brown, E. J. & Schreiber, S. L. (1995) Identificación de un dominio de unión a la 12-rapamicina de FKBP de 11-kDa dentro de la proteína asociada a la 12-rapamicina de FKBP de 289-kDa y caracterización de un residuo de serina crítico. Proc Natl Acad Sci USA 92: 4947-51.)

En realizaciones, un interruptor con base en FKBP/FRAP, por ejemplo, un FKBP/FRB, puede utilizar una molécula de dimerización, por ejemplo, rapamicina o un análogo de rapamicina.

La secuencia de aminoácidos de la FKBP es la siguiente:

En realizaciones, un dominio de conmutación de FKBP puede comprender un fragmento de unión a FRB de FKBP, por ejemplo, la porción subrayada de SEQ ID NO: 382, que es:

La secuencia de aminoácidos de la FRB es la siguiente:

ILWHEMWHEG LEEASRLYFG ERNVKGMFEV LEPLHAMMER GPQTLKETSF NQAYGRDLME AQEWCRKYMK

SGNVKDLTQA WDLYYHVFRR ISK (SEQ ID NO: 384)

"Interruptor con base en FKBP/FRAP, por ejemplo, un FKPP/FRB", tal como se utiliza dicho término en el presente documento, se refiere a un interruptor de dimerización que comprende: un primer dominio de conmutación, comprende un fragmento de unión a FRB o un análogo de FKBP, por ejemplo, RAD001, y tiene al menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, o 99% de identidad con, o difiere en no más de 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, o 1 residuos de aminoácidos de, la secuencia FKBP de SEQ ID NO: 382 o 383; y un segundo dominio de conmutación, que comprende un fragmento de unión a FKBP o un análogo de FRB, y tiene al menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con, o difiere en no más de 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 residuo de aminoácido de la secuencia FRB de SEQ ID NO: 384. En una realización, un RCAR descrito en el presente documento comprende un dominio de conmutación que comprende residuos de aminoácidos divulgados en SEQ ID NO: 382 (o SEQ ID NO:383), y un dominio de conmutación comprende residuos de aminoácidos divulgados en SEQ ID NO: 384.

En realizaciones, el interruptor de dimerización FKBP/FRB comprende un dominio de conmutación FRB modificado que exhibe una afinidad alterada, por ejemplo, aumentada, por la molécula de dimerización, por ejemplo, rapamicina o un rapálogo, por ejemplo, RAD001. En una realización, el dominio de conmutación FRB modificado comprende una o más mutaciones, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, seleccionadas de entre las mutaciones en las posiciones de aminoácido L2031, E2032, S2035, R2036, F2039, G2040, T2098, W2101, D2102, Y2105 y F2108, donde el aminoácido de tipo silvestre está mutado a cualquier otro aminoácido de origen natural. En una realización, un FRB mutante comprende una mutación en E2032, donde E2032 está mutado a fenilalanina (E2032F), metionina (E2032M), arginina (E2032R), valina (E2032V), tirosina (E2032Y), isoleucina (E2032I), por ejemplo, SEQ ID NO: 385, o leucina (E2032L), por ejemplo, SEQ ID n O: 386. En una realización, un FRB mutante comprende una mutación en T2098, donde T2098 está mutado a fenilalanina (T2098F) o leucina (T2098L), por ejemplo, SEQ ID NO:387. En una realización, un FRB mutante comprende una mutación en E2032 y en T2098, donde E2032 está mutado a cualquier aminoácido, y donde T2098 está mutado a cualquier aminoácido, por ejemplo, SEQ ID NO: 388. En una realización, un FRB mutante comprende una mutación E2032I y una T2098L, por ejemplo, SEQ ID NO: 389. En una realización, un FRB mutante comprende una mutación E2032L y una T2098L, por ejemplo, SEQ ID NO: 340.

Tabla 15. Ejemplo de FRB mutante que tiene mayor afinidad por una molécula de dimerización.

Otros interruptores de dimerización adecuados incluyen un interruptor de dimerización con base en GyrB-GyrB, un interruptor de dimerización con base en giberelina, un interruptor de dimerización etiqueta/agregante y un interruptor de dimerización halo-tag/snap-tag. Siguiendo la orientación proporcionada en el presente documento, tales interruptores y moléculas de dimerización pertinentes serán evidentes para alguien con conocimientos ordinarios. Molécula de dimerización

La asociación entre los dominios de conmutación es promovida por la molécula de dimerización. En presencia de la molécula de dimerización, la interacción o asociación entre los dominios de conmutación permite la transducción de señales entre un polipéptido asociado, por ejemplo, fusionado a un primer dominio de conmutación, y un polipéptido asociado, por ejemplo, fusionado a un segundo dominio de conmutación. En presencia de niveles no limitantes de la molécula de dimerización, la transducción de la señal se incrementa en 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 5, 10, 50, 100 veces, por ejemplo, como se mide en un sistema descrito en el presente documento.

La rapamicina y los análogos de la rapamicina (a veces denominados rapálogos), por ejemplo, RAD001, pueden utilizarse como moléculas de dimerización en un interruptor de dimerización con base en Fk Bp/FRB descrito en el presente documento. En una realización, la molécula de dimerización puede seleccionarse entre rapamicina (sirolimus), RAD001 (everolimus), zotarolimus, temsirolimus, AP-23573 (ridaforolimus), biolimus y AP21967. Otros análogos de la rapamicina adecuados para su uso con interruptores de dimerización con base en FKBP/FRB se describen con más detalle en la sección titulada "Terapias combinadas", o en la subsección titulada "Inhibidores ejemplares de mTOR".

Transfección de ARN

En el presente documento se describen procedimientos para producir un RNA CAR transcrito in vitro. La presente divulgación también incluye una constructo de ARN codificante de CAR que puede transfectarse directamente en una célula. Un procedimiento para generar ARNm para su uso en la transfección puede implicar la transcripción in vitro (IVT) de una plantilla con cebadores especialmente diseñados, seguida de la adición de poliA, para producir una constructo que contenga la secuencia no traducida ("UTR") 3' y 5', un capuchón 5' y/o un sitio de entrada del ribosoma interno (IRES), el ácido nucleico que se va a expresar y una cola de poliA, típicamente de 50-2.000 bases de longitud (SEQ ID NO:35). El ARN así producido puede transfectar eficazmente diferentes tipos de células. En un aspecto, la plantilla incluye secuencias para el CAR.

En un aspecto, la mesotelina CAR está codificada por un ARN mensajero (ARNm). En un aspecto, el ARNm que codifica la mesotelina CAR se introduce en una célula T para la producción de una célula CART.

En una realización, el ARN transcrito in vitro CAR puede introducirse en una célula como una forma de transfección transitoria. El ARN se produce por transcripción in vitro utilizando una plantilla generada por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El ADN de interés procedente de cualquier fuente puede convertirse directamente mediante PCR en un molde para la síntesis in vitro de ARNm utilizando los cebadores adecuados y la ARN polimerasa. La fuente de ADN puede ser, por ejemplo, ADN genómico, ADN de plásmido, ADN de fago, ADNc, secuencia de ADN sintético o cualquier otra fuente de ADN apropiada. La plantilla deseada para la transcripción in vitro es un CAR de la presente divulgación. Por ejemplo, la plantilla para el ARN CAR comprende una región extracelular que comprende un dominio variable de cadena única de un anticuerpo antitumoral; una región bisagra, un dominio transmembrana (por ejemplo, un dominio transmembrana de CD8a); y una región citoplásmica que incluye un dominio de señalización intracelular, por ejemplo, que comprende el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de 4-1BB.

En una realización, el ADN que se utilizará para la PCR contiene un marco de lectura abierto. El ADN puede proceder de una secuencia de ADN de origen natural del genoma de un organismo. En una realización, el ácido nucleico puede incluir algunas o todas las regiones no traducidas (UTR) 5' y/o 3'. El ácido nucleico puede incluir exones e intrones. En una realización, el ADN que se utilizará para la PCR es una secuencia de ácido nucleico humano. En otra realización, el ADN que se utilizará para la PCR es una secuencia de ácido nucleico humano que incluye los UTR 5' y 3'. El ADN puede ser alternativamente una secuencia de ADN artificial que no se expresa normalmente en un organismo natural. Una secuencia de ADN artificial ejemplar es la que contiene porciones de genes que se ligan para formar un marco de lectura abierto que codifica una proteína de fusión. Las porciones de ADN que se ligan pueden ser de un solo organismo o de más de un organismo.

La PCR se utiliza para generar una plantilla para la transcripción in vitro del ARNm que se utiliza para la transfección. Los procedimientos para realizar la PCR son bien conocidos en la técnica. Los cebadores que se utilizan en la PCR están diseñados para tener regiones que son sustancialmente complementarias a las regiones del ADN que se utilizará como plantilla para la PCR. El término "sustancialmente complementario" se refiere a secuencias de nucleótidos en las que la mayoría o todas las bases de la secuencia del cebador son complementarias, o una o más bases son no complementarias, o no coinciden. Las secuencias sustancialmente complementarias son capaces de fusionarse o hibridarse con el objetivo de ADN previsto en las condiciones de fusión utilizadas para la PCR. Los cebadores pueden ser diseñados para ser sustancialmente complementarios a cualquier porción de la plantilla de ADN. Por ejemplo, los cebadores pueden diseñarse para amplificar la porción de un ácido nucleico que normalmente se transcribe en las células (el marco de lectura abierto), incluyendo las UTR 5' y 3'. Los cebadores también pueden diseñarse para amplificar una porción de un ácido nucleico que codifica un dominio particular de interés. En una realización, los cebadores están diseñados para amplificar la región codificante de un ADNc humano, incluyendo todas o partes de las UTR 5' y 3'. Los cebadores útiles para la PCR pueden generarse por procedimientos sintéticos bien conocidos en la técnica. los "cebadores directos" son cebadores que contienen una región de nucleótidos que son sustancialmente complementarios a los nucleótidos de la plantilla de ADN que están antes de la secuencia de ADN que se va a amplificar. El término "corriente arriba" se refiere a una ubicación 5' a la secuencia de ADN que se va a amplificar en relación con la cadena codificante. los "cebadores inversos" son cebadores que contienen una región de nucleótidos que son sustancialmente complementarios a una plantilla de ADN de doble cadena que se encuentra corriente abajo de la secuencia de ADN que se va a amplificar. El término "corriente abajo" se refiere a una ubicación 3' de la secuencia de ADN que se va a amplificar en relación con la cadena codificante.

Cualquier ADN polimerasa útil para la PCR puede ser utilizada en los procedimientos divulgados en el presente documento. Los reactivos y la polimerasa están disponibles comercialmente en varias fuentes.

También se pueden utilizar estructuras químicas con la capacidad de promover la estabilidad y/o la eficiencia de la traducción. El ARN tiene preferentemente las UTR 5' y 3'. En una realización, la UTR 5' tiene entre uno y 3.000 nucleótidos de longitud. La longitud de las secuencias UTR 5' y 3' que se añaden a la región codificante puede alterarse por diferentes procedimientos, incluyendo, pero sin limitarse a , el diseño de cebadores para la PCR que se acoplan a diferentes regiones de las UTR. Utilizando este enfoque, un experto en la técnica puede modificar las longitudes de las UTR 5' y 3' necesarias para lograr una eficiencia de traducción óptima tras la transfección del ARN transcrito.

Las UTR 5' y 3' pueden ser las UTR 5' y 3' endógenas y naturales del ácido nucleico de interés. Alternativamente, las secuencias UTR que no son endógenas al ácido nucleico de interés pueden añadirse incorporando las secuencias UTR en los cebadores directos e inversos o mediante cualquier otra modificación de la plantilla. El uso de secuencias UTR que no son endógenas al ácido nucleico de interés puede ser útil para modificar la estabilidad y/o la eficiencia de traducción del ARN. Por ejemplo, se sabe que los elementos ricos en Au en las secuencias UTR 3' pueden disminuir la estabilidad del ARNm. Por lo tanto, las UTR 3' pueden ser seleccionadas o diseñadas para aumentar la estabilidad del ARN transcrito con base en las propiedades de las UTR que son bien conocidas en la técnica.

En una realización, la UTR 5' puede contener la secuencia Kozak del ácido nucleico endógeno. Alternativamente, cuando se añade por PCR una UTR 5' que no es endógena al ácido nucleico de interés, como se ha descrito anteriormente, se puede rediseñar una secuencia Kozak consenso añadiendo la secuencia UTR 5'. Las secuencias de Kozak pueden aumentar la eficiencia de la traducción de algunos transcritos de ARN, pero no parece ser necesario para que todos los ARN permitan una traducción eficiente. El requisito de las secuencias Kozak para muchos ARNm es conocido en la técnica. En otras realizaciones, la UTR 5' puede ser la UTR 5' de un virus de ARN cuyo genoma de ARN es estable en las células. En otras realizaciones se pueden utilizar diversos análogos de nucleótidos en la UTR 3' o 5' para impedir la degradación por exonucleasa del ARNm.

Para permitir la síntesis de ARN a partir de una plantilla de ADN sin necesidad de clonación de genes, se debe unir un promotor de transcripción a la plantilla de ADN corriente arriba de la secuencia que se va a transcribir. Cuando una secuencia que funciona como promotor de una ARN polimerasa se añade al extremo 5' del cebador directo, el promotor de la ARN polimerasa se incorpora al producto de la PCR corriente arriba del marco de lectura abierto que se va a transcribir. En una realización preferida, el promotor es un promotor de la polimerasa T7, como se describe en otra parte del presente documento. Otros promotores útiles incluyen, pero no se limitan a, los promotores de la ARN polimerasa T3 y SP6. Las secuencias de nucleótidos de consenso para los promotores T7, T3 y SP6 son conocidas en la técnica.

En una realización preferida, el ARNm tiene un tapón en el extremo 5' y una cola 3' de poli(A) que determinan la unión al ribosoma, la iniciación de la traducción y la estabilidad del ARNm en la célula. En una plantilla de ADN circular, por ejemplo, el ADN plasmídico, la ARN polimerasa produce un producto concatérico largo que no es adecuado para la expresión en las células eucariotas. La transcripción del ADN plasmídico linealizado al final de la UTR 3' da lugar a un ARNm de tamaño normal que no es eficaz en la transfección eucariótica, incluso si se poliadenila después de la transcripción.

En una plantilla de ADN lineal, la ARN polimerasa del fago T7 puede extender el extremo 3' de la transcripción más allá de la última base de la plantilla (Schenborn y Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985) Nacheva y Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem, 270:1485-65 (2003).

El procedimiento convencional de integración de tramos poliA/T en una plantilla de ADN es la clonación molecular. Sin embargo, la secuencia poliA/T integrada en el ADN plasmídico puede causar inestabilidad en el plásmido, por lo que las plantillas de ADN plasmídico obtenidas de células bacterianas suelen estar muy contaminadas con deleciones y otras aberraciones. Esto hace que los procedimientos de clonación no sólo sean laboriosos y lentos, sino que a menudo no son fiables. Por ello, es muy deseable un procedimiento que permita la construcción de plantillas de ADN con el tramo 3' de poliA/T sin necesidad de clonación.

El segmento poliA/T de la plantilla de ADN transcripcional puede producirse durante la PCR utilizando un cebador inverso que contenga una cola poliT, tal como la cola 100T (SEQ ID NO: 31) (el tamaño puede ser 50-5.000 T (SEQ ID NO: 32)), o después de la PCR por cualquier otro procedimiento, incluyendo, pero sin limitarse a, la ligadura de ADN o la recombinación in vitro. Las colas de poli(A) también proporcionan estabilidad a los ARN y reducen su degradación. En general, la longitud de una cola de poli(A) se correlaciona positivamente con la estabilidad del ARN transcrito. En una realización, la cola de poli(A) tiene entre 100 y 5.000 adenosinas (SEQ ID NO: 33).

Las colas de poli(A) de los ARN pueden extenderse aún más después de la transcripción in vitro con el uso de una polimerasa de poli(A), como la polimerasa de E. coli (E-PAP). En una realización, el aumento de la longitud de una cola de poli(A) de 100 nucleótidos a entre 300 y 400 nucleótidos (SEQ ID NO: 34) da lugar a un aumento de aproximadamente el doble de la eficiencia de traducción del ARN. Además, la unión de diferentes grupos químicos al extremo 3' puede aumentar la estabilidad del ARNm. Dicha fijación puede contener nucleótidos modificados/artificiales, aptámeros y otros compuestos. Por ejemplo, los análogos del ATP pueden incorporarse a la cola del poli(A) utilizando la poli(A) polimerasa. Los análogos del ATP pueden aumentar aún más la estabilidad del ARN.

Los capuchones 5' también proporcionan estabilidad a las moléculas de ARN. En una realización preferida, los ARN producidos por los procedimientos divulgados en el presente documento incluyen un capuchón 5'. El capuchón 5' se proporciona mediante técnicas conocidas en la técnica y descritas en el presente documento (Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001) Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001) Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).

Los ARN producidos por los procedimientos divulgados en el presente documento también pueden contener una secuencia de sitio de entrada al ribosoma interno (IRES). La secuencia IRES puede ser cualquier secuencia viral, cromosómica o diseñada artificialmente que inicie la unión del ribosoma independiente del tapón al ARNm y facilite el inicio de la traducción. Puede incluirse cualquier soluto adecuado para la electroporación celular, que puede contener factores que faciliten la permeabilidad y la viabilidad celular, tales como azúcares, péptidos, lípidos, proteínas, antioxidantes y tensioactivos.

El ARN puede introducirse en las células objetivo utilizando cualquiera de los diferentes procedimientos, por ejemplo, los procedimientos disponibles en el mercado que incluyen, pero no se limitan a, la electroporación (Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Colonia, Alemania)), (ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.) o el

Gene Pulser II (BioRad, Denver, Colo.), el Multiporator (Eppendort, Hamburgo, Alemania), la transfección mediada por liposomas catiónicos mediante lipofección, la encapsulación de polímeros, la transfección mediada por péptidos, o los sistemas de entrega de partículas biolíticas tales como las "pistolas de genes" (véase, por ejemplo, Nishikawa, et al.

Hum Gene Ther, 12(8):861-70 (2001).

Constructos de ácido nucleico que codifican un CAR

La presente divulgación proporciona transgenes CAR que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican uno o más constructos CAR de la divulgación. En un aspecto, el transgén CAR se proporciona como un transcrito de

ARN mensajero. En un aspecto, el transgén CAR se proporciona como un constructo de ADN.

En consecuencia, en un aspecto, la divulgación se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR), en el que el CAR comprende un dominio de unión a la anti-mesotelina (por ejemplo, un dominio de unión a la anti-mesotelina humana), un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio estimulador. En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina es un dominio de unión a la antimesotelina descrito en el presente documento, por ejemplo, un dominio de unión a la antimesotelina que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 87-111, o una secuencia con 95-99 % de identificación de la misma. En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende además una secuencia que codifica un dominio costimulador. En una realización, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de una proteína seleccionada del grupo que consiste en la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154. En una realización, el dominio transmembrana comprende una secuencia de SEQ ID NO: 6, o una secuencia con 95-99 % de identidad. En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina está conectado al dominio transmembrana por una región de bisagra, por ejemplo, una bisagra descrita en el presente documento. En una realización, la región de bisagra comprende SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3 o SEQ

ID n O:4 o SEQ ID NO:5, o una secuencia con 95-99 % de identidad de la misma. En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende además una secuencia que codifica un dominio costimulador. En una realización, el dominio coestimulador es un dominio de señalización funcional de una proteína seleccionada del grupo que consiste en OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) y 4-1BB (CD137). Otros ejemplos de tales moléculas coestimuladoras incluyen CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8alpha, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alpha, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD 162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, y PAG/Cbp. En una realización, el dominio coestimulador comprende una secuencia de SEQ ID NO:7, o una secuencia con 95-99 % de identidad con la misma. En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de 4-1BB y un dominio de señalización funcional de CD3 zeta. En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8, o una secuencia con 95-99 % de identidad, y la secuencia de SEQ ID NO: 9 o SEQ

ID NO: 10, o una secuencia con 95-99 % de identidad de la misma, en la que las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una única cadena polipeptídica. En otro aspecto, la divulgación se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un constructo CAR que comprende una secuencia líder de , un dominio scFv que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 39; O: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, O: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, O: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, : 61, y SEQ ID NO: 62, (o una secuencia con 95-99% de identificación de la misma), una región bisagra de S

SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:5 (o una secuencia con

95-99 % de identidad de la misma), un dominio transmembrana que tenga una secuencia de SEQ ID NO: 6 (o una secuencia con 95-99 % de identidad con la misma), un dominio costimulador 4-1BB que tiene una secuencia de SEQ

ID NO:7 (o una secuencia con 95-99 % de identidad con la misma) o un dominio costimulador CD27 que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 8 (o una secuencia con 95-99 % de identidad con la misma), y un dominio estimulador de

CD3 zeta con una secuencia de SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO: 10 (o una secuencia con 95-99 % de identidad).

En otro aspecto, la divulgación se refiere a una molécula polipeptídica aislada codificada por la molécula de ácido nucleico. En una realización, la molécula polipeptídica aislada comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ

ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ

ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ

ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, y SEQ ID NO: 86, o una secuencia con 95-99 % de identidad.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una molécula de receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un dominio de unión a la antimesotelina, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio estimulador, y en el que el ácido nucleico que codifica el dominio de unión a la antimesotelina comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 111; SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, o una secuencia con 95-99 % de identificación de la misma.

En una realización, la molécula de CAR codificada comprende además una secuencia que codifica un dominio costimulador. En una realización, el dominio coestimulador es un dominio de señalización funcional de una proteína seleccionada del grupo que consiste en OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18) y 4-1BB (CD137). En una realización, el dominio coestimulador comprende una secuencia de SEQ ID NO:7. En una realización, el dominio transmembrana es un dominio transmembrana de una proteína seleccionada del grupo que consiste en la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154. En una realización, el dominio transmembrana comprende una secuencia de SEQ ID NO:6. En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de 4-1BB y un dominio de señalización funcional de zeta. En una realización, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de SEQ ID NO: 9, en la que las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una sola cadena polipeptídica. En una realización, el dominio de unión a la antimesotelina está conectado al dominio transmembrana por una región bisagra. En una realización, la región de bisagra comprende SEQ ID NO:2. En una realización, la región de bisagra comprende el SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 5.

En otro aspecto, la divulgación se refiere a una molécula de CAR aislada que comprende una secuencia líder de SEQ ID NO: 1, un dominio scFv que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 39-62, o una secuencia con 95-99 % de identificación de la misma, una región bisagra de SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, un dominio transmembrana que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 6, un dominio costimulador 4-1BB que tiene una secuencia de SEQ ID NO:7 o un dominio costimulador CD27 que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 8, y un dominio estimulador de CD3 zeta que tiene una secuencia de SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO: 10. En una realización, la molécula de CAR codificada comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 63-86, o una secuencia con 95-99 % de identificación de la misma.

La presente divulgación proporciona además vectores que comprenden transgenes CAR. En un aspecto, un vector CAR puede transducirse directamente en una célula, por ejemplo, una célula T o una célula NK. En un aspecto, el vector es un vector de clonación o de expresión, por ejemplo, un vector que incluye, pero no se limita a, uno o más plásmidosfpor ejemplo, plásmidos de expresión, vectores de clonación, minicírculos, minivectores, cromosomas de doble minuto), constructos de vectores retrovirales y lentivirales. En un aspecto, el vector es capaz de expresar el constructo CAR en células T de mamíferos o células NK. En un aspecto, la célula T de mamífero es una célula T humana o una célula NK humana.

La presente divulgación también incluye una constructo de ARN codificante de CAR que puede ser transfectada directamente en una célula, por ejemplo, una célula T o una célula NK. Un procedimiento para generar ARNm para su uso en la transfección implica la transcripción in vitro (IVT) de una plantilla con cebadores especialmente diseñados, seguida de la adición de poliA, para producir una constructo que contenga la secuencia no traducida 3' y 5' ("UTR") , un capuchón 5' y/o un sitio de entrada del ribosoma interno (IRES), el gen que se va a expresar y una cola de poliA, normalmente de 50-2.000 bases de longitud. El ARN así producido puede transfectar eficazmente diferentes tipos de células. En un aspecto, la plantilla incluye secuencias para el CAR

En un aspecto, el transgén de mesotelina CAR está codificado por un ARN mensajero (ARNm). En un aspecto, el ARNm que codifica el transgén de mesotelina CAR se introduce en una célula T para la producción de una célula CART, o una célula NK.

Vectores

La presente divulgación también proporciona vectores en los que se inserta un ADN de la presente divulgación. Los vectores derivados de retrovirus, tales como el lentivirus, son herramientas adecuadas para lograr la transferencia de genes a largo plazo, ya que permiten la integración estable y a largo plazo de un transgén y su propagación en células hijas. Los vectores lentivirales tienen la ventaja añadida sobre los vectores derivados de oncorretrovirus, tales como los virus de la leucemia murina, de que pueden transducir células no proliferantes, tales como los hepatocitos. También tienen la ventaja añadida de su baja inmunogenicidad.

En una realización, el vector que comprende el ácido nucleico que codifica CAR deseado de la divulgación es un ADN, un ARN, un plásmido, un vector adenoviral, un vector lentivirus o un vector retroviral.

En otra realización, el vector que comprende el ácido nucleico que codifica CAR deseado de la divulgación es un vector adenoviral (A5/35). En otra realización, la expresión de los ácidos nucleicos que codifican los CAR puede llevarse a cabo utilizando transposones tales como sleeping beauty, CRISPR, CAS9 y nucleasas de dedos de zinc. Véase, por ejemplo June et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716.

En resumen, la expresión de ácidos nucleicos naturales o sintéticos que codifican los CAR se logra típicamente enlazando operativamente un ácido nucleico que codifica el polipéptido CAR o porciones del mismo a un promotor, e incorporando el constructo en un vector de expresión. Los vectores pueden ser adecuados para la replicación y la integración de eucariotas. Los vectores de clonación típicos contienen terminadores de transcripción y traducción, secuencias de iniciación y promotores útiles para regular la expresión de la secuencia de ácido nucleico deseada.

Los constructos de expresión de la presente divulgación también pueden utilizarse para la inmunización de ácidos nucleicos y la terapia génica, utilizando protocolos estándar de entrega de genes. Los procedimientos de administración de genes son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo Pat. de EE. UU. Nos.

5,399,346, 5,580,859, 5,589,466. En otra realización, la divulgación proporciona un vector de terapia génica.

El ácido nucleico puede clonarse en varios tipos de vectores. Por ejemplo, el ácido nucleico puede clonarse en un vector que incluya, pero no se limite a, un plásmido, un fagémido, un derivado de fago, un virus animal y un cósmido. Los vectores de especial interés son los de expresión, vectores de replicación, vectores de generación de sondas y vectores de secuenciación.

Además, el vector de expresión puede proporcionarse a una célula en forma de vector viral. La tecnología de vectores virales es bien conocida en la técnica y se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volúmenes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, NY), y en otros manuales de virología y biología molecular. Los virus que son útiles como vectores incluyen, pero no se limitan a, retrovirus, adenovirus, virus adeno asociados, virus del herpes y lentivirus. En general, un vector adecuado contiene un origen de replicación funcional en al menos un organismo, una secuencia promotora, sitios de endonucleasas de restricción convenientes, y uno o más marcadores seleccionables, (por ejemplo, WO 01/96584 WO 01/29058y Pat. de EE. UU. No. 6,326,193).

Se han desarrollado varios sistemas con base en virus para la transferencia de genes a células de mamíferos. Por ejemplo, los retrovirus proporcionan una plataforma conveniente para los sistemas de entrega de genes. Un gen seleccionado puede insertarse en un vector y empaquetarse en partículas retrovirales mediante técnicas conocidas en la técnica. A continuación, el virus recombinante puede aislarse y administrarse a las células del sujeto, ya sea in vivo o ex vivo. Se conocen varios sistemas retrovirales en la técnica. En algunas realizaciones, se utilizan vectores de adenovirus. Se conocen varios vectores de adenovirus en la técnica. En una realización, se utilizan vectores lentivirus.

Elementos promotores adicionales, por ejemplo, potenciadores, regulan la frecuencia de la iniciación transcripcional. Por lo general, se encuentran en la región de 30-110 pb corriente arriba del sitio de inicio, aunque se ha demostrado que varios promotores contienen también elementos funcionales corriente abajo del sitio de inicio. El espaciado entre los elementos promotores suele ser flexible, de modo que la función del promotor se mantiene cuando los elementos se invierten o se mueven unos respecto a otros. En el promotor de la timidina quinasa (tk), el espacio entre los elementos del promotor puede aumentarse hasta 50 pb antes de que la actividad comience a disminuir. Dependiendo del promotor, parece que los elementos individuales pueden funcionar de forma cooperativa o independiente para activar la transcripción. Los promotores ejemplares incluyen el gen IE del CMV, el EF-1a, la ubiquitina C o los promotores de la fosfogliceroquinasa (PGK).

Un ejemplo de promotor capaz de expresar un transgén CAR en una célula T de mamífero es el promotor EF1alfa (EF1a o EF1a). El promotor nativo EFla impulsa la expresión de la subunidad alfa del complejo del factor de elongación-1, que es responsable de la entrega enzimática de los aminoacil ARNt al ribosoma. El promotor EFla se ha utilizado ampliamente en plásmidos de expresión de mamíferos y ha demostrado ser eficaz para impulsar la expresión de c Ar a partir de transgenes clonados en un vector lentiviral. Véase, por ejemplo Milone et al., Mol. Ther.

17(8): 1453-1464 (2009). En un aspecto, el promotor EFla comprende la secuencia proporcionada tal como SEQ ID NO:11.

Otro ejemplo de promotor es la secuencia promotora temprana inmediata del citomegalovirus (CMV). Esta secuencia promotora es una secuencia promotora constitutiva fuerte, capaz de impulsar altos niveles de expresión de cualquier secuencia polinucleotídica unida operativamente a la misma. Sin embargo, también pueden utilizarse otras secuencias promotoras constitutivas, incluyendo, pero no limitado a, el promotor temprano del virus simio 40 (SV40), el virus del tumor mamario de ratón (MMTV), el promotor de la repetición terminal larga (LTR) del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el promotor del MoMuLV, un promotor del virus de la leucemia aviar, un promotor temprano inmediato del virus de Epstein-Barr, un promotor del virus del sarcoma de Rous, así como promotores de genes humanos tales como, por ejemplo, el promotor de la actina, el promotor de la miosina, el promotor del factor la de elongación, el promotor de la hemoglobina y el promotor de la creatina quinasa. Además, la divulgación no debe limitarse al uso de promotores constitutivos. Los promotores inducibles también se contemplan como parte de la divulgación. El uso de un promotor inducible proporciona un interruptor molecular capaz de activar la expresión de la secuencia polinucleotídica a la que está vinculado operativamente cuando se desea dicha expresión, o de desactivar la expresión cuando no se desea. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen, pero no se limitan a un promotor de metalotioneína, un promotor de glucocorticoides, un promotor de progesterona y un promotor de tetraciclina.

Para evaluar la expresión de un polipéptido CAR o de porciones del mismo, el vector de expresión que se introducirá en una célula también puede contener un gen marcador seleccionable o un gen informador, o ambos, para facilitar la identificación y selección de las células expresantes de la población de células que se pretende transfectar o infectar mediante vectores virales. En otros aspectos, el marcador seleccionable puede ser transportado en una pieza separada de ADN y utilizado en un procedimiento de cotransfección. Tanto los marcadores seleccionables como los genes informadores pueden estar flanqueados por secuencias reguladoras adecuadas para permitir la expresión en las células huésped. Los marcadores seleccionables útiles incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a los antibióticos, tales como neo y similares.

Los genes reporteros se utilizan para identificar células potencialmente transfectadas y para evaluar la funcionalidad de las secuencias reguladoras. En general, un gen reportero es un gen que no está presente en el organismo o tejido receptor ni se expresa en él y que codifica un polipéptido cuya expresión se manifiesta por alguna propiedad fácilmente detectable, por ejemplo, la actividad enzimática. La expresión del gen reportero se evalúa en un momento adecuado después de la introducción del ADN en las células receptoras. Los genes informadores adecuados pueden incluir genes que codifican la luciferasa, la beta-galactosidasa, la cloranfenicol acetil transferasa, la fosfatasa alcalina secretada o el gen de la proteína verde fluorescente (por ejemplo, Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Los sistemas de expresión adecuados son bien conocidos y pueden prepararse mediante técnicas conocidas u obtenerse comercialmente. En general, se identifica como promotor el constructo con la mínima región flanqueante 5' que muestra el mayor nivel de expresión del gen reportero. Estas regiones promotoras pueden vincularse a un gen reportero y utilizarse para evaluar la capacidad de los agentes de modular la transcripción impulsada por el promotor.

En una realización, el vector puede comprender además un ácido nucleico que codifica un segundo CAR. En una realización, el segundo CAR incluye un dominio de unión a antígeno a, por ejemplo, un objetivo distinto de la mesotelina en las células del estroma, por ejemplo, FAP; un objetivo distinto de la mesotelina en las células del cáncer de próstata, por ejemplo, receptor de andrógenos, OR51E2, PSMA, PSCA, PDGRF-p, TARP, GloboH, MAD-CT-1, o MAD-CT-2; un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de ovario, por ejemplo, Tn, PRSS21, CD171, Lewis Y, receptor de folato a, claudin6, GloboH, o proteína espermática 17; por ejemplo, un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de pulmón, por ejemplo, VEGF, HER3, IGF-1R, EGFR, DLL4, o Trop-2. En una realización, el vector comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un primer CAR que se dirige a un primer antígeno e incluye un dominio de señalización intracelular que tiene un dominio de señalización coestimuladora pero no un dominio de señalización primario, y un ácido nucleico que codifica un segundo CAR que se dirige a un segundo antígeno diferente e incluye un dominio de señalización intracelular que tiene un dominio de señalización primario pero no un dominio de señalización coestimuladora. En una realización, el vector comprende un ácido nucleico que codifica un primer mesotelina CAR que incluye un dominio de unión a la mesotelina, un dominio transmembrana y un dominio coestimulador y un ácido nucleico que codifica un segundo CAR que se dirige a un antígeno distinto de la mesotelina (por ejemplo, un objetivo distinto de la mesotelina en las células del estroma, por ejemplo, FAP; un objetivo distinto de la mesotelina en las células del cáncer de próstata, por ejemplo, receptor de andrógenos, OR51E2, PSMA, PSCA, PDGRF-p, TARP, GloboH, MAD-CT-1, o MAD-CT-2; un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de ovario, por ejemplo, Tn, PRSS21, CD171, Lewis Y, receptor de folato a, claudin6, GloboH, o proteína espermática 17; por ejemplo, un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de pulmón, por ejemplo, VEGF, HER3, IGF-1R, EGFR, DLL4 o Trop-2) e incluye un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización primario. En otra realización, el vector comprende un ácido nucleico que codifica un primer mesotelina CAR que incluye un dominio de unión a mesotelina, un dominio transmembrana y un dominio de señalización primario y un ácido nucleico que codifica un segundo CAR que se dirige a un antígeno distinto de la mesotelina (por ejemplo, un objetivo distinto de la mesotelina en las células del estroma, por ejemplo, FAP; un objetivo distinto de la mesotelina en las células del cáncer de próstata, por ejemplo, receptor de andrógenos, OR51E2, PSMA, PSCA, PDGRF-p, TARP, GloboH, MAD-CT-1, o MAD-CT-2; un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de ovario, por ejemplo, Tn, PRSS21, CD171, Lewis Y, receptor a de folato , claudin6, GloboH, o proteína espermática 17; por ejemplo, un objetivo distinto de la mesotelina en células de cáncer de pulmón, por ejemplo, VEGF, HER3, IGF-1R, EGFr , DLL4 o Trop-2) e incluye un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización coestimuladora.

En una realización, el vector comprende un ácido nucleico que codifica un mesotelina CAR descrito en el presente documento y un ácido nucleico que codifica un CAR inhibidor. En una realización, el CAR inhibidor comprende un dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno que se encuentra en las células normales pero no en las células cancerosas, por ejemplo, células normales que también expresan CLL. En una realización, el CAR inhibidor comprende el dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un dominio intracelular de una molécula inhibidora. Por ejemplo, el dominio intracelular del CAR inhibidor puede ser un dominio intracelular de PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 y TGFR beta.

En una realización, el vector comprende un ácido nucleico que codifica un mesotelina CAR descrito en el presente documento y un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un ARNcd, por ejemplo, un ARNpi o ARNhc, por ejemplo, como se describe en el presente documento.

Los procedimientos de introducción y expresión de genes en una célula son conocidos en la técnica. En el contexto de un vector de expresión, el vector puede introducirse fácilmente en una célula anfitriona, por ejemplo, una célula de mamífero, de bacteria, de levadura o de insecto por cualquier procedimiento de la técnica. Por ejemplo, el vector de expresión puede transferirse a una célula anfitriona por medios físicos, químicos o biológicos.

Los procedimientos físicos para introducir un polinucleótido en una célula anfitriona incluyen la precipitación de fosfato de calcio, la lipofección, el bombardeo de partículas, la microinyección, la electroporación y similares. Los procedimientos para producir células que comprenden vectores y/o ácidos nucleicos exógenos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volúmenes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, NY). Un procedimiento preferido para la introducción de un polinucleótido en una célula anfitriona es la lipofección, por ejemplo, utilizando Lipofectamine (Life Technologies).

Los procedimientos biológicos para introducir un polinucleótido de interés en una célula anfitriona incluyen el uso de vectores de ADN y ARN. Los vectores virales, y especialmente los retrovirales, se han convertido en el procedimiento más utilizado para insertar genes en células de mamíferos, por ejemplo, humanas. Otros vectores virales pueden derivarse de lentivirus, poxvirus, virus del herpes simple I, adenovirus y virus adeno-asociados, y similares. Véase, por ejemplo, Pat. de EE. UU. Nos. 5,350,674 and 5,585,362.

Los medios químicos para introducir un polinucleótido en una célula huésped incluyen sistemas de dispersión coloidal, tales como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas con base en lípidos, incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal ejemplar para su uso como vehículo de administración in vitro e in vivo es un liposoma (por ejemplo, una vesícula de membrana artificial). Existen otros procedimientos de administración de ácidos nucleicos dirigidos al estado de la técnica, tal como la administración de polinucleótidos con nanopartículas dirigidas u otro sistema de administración adecuado de tamaño submicrónico.

En el caso de que se utilice un sistema de entrega no viral, un vehículo de entrega ejemplar es un liposoma. Se contempla el uso de formulaciones lipídicas para la introducción de los ácidos nucleicos en una célula huésped (in vitro, ex vivo o in vivo). En otro aspecto, el ácido nucleico puede estar asociado a un lípido. El ácido nucleico asociado a un lípido puede estar encapsulado en el interior acuoso de un liposoma, intercalado dentro de la bicapa lipídica de un liposoma, unido a un liposoma mediante una molécula de enlace que esté asociada tanto al liposoma como al oligonucleótido, atrapado en un liposoma, complejado con un liposoma, dispersado en una solución que contenga un lípido, mezclado con un lípido, combinado con un lípido, contenido como una suspensión en un lípido, contenido o complejado con una micela, o asociado de otro modo con un lípido. Las composiciones asociadas a lípidos, lípidos/ADN o lípidos/vectores de expresión no están limitadas a ninguna estructura particular en solución. Por ejemplo, pueden estar presentes en una estructura de bicapa, como micelas, o con una estructura "colapsada". También pueden estar simplemente intercalados en una solución, formando posiblemente agregados que no son uniformes en tamaño o forma. Los lípidos son sustancias grasas que pueden ser naturales o sintéticas. Por ejemplo, los lípidos incluyen las gotas de grasa que se producen naturalmente en el citoplasma, así como la clase de compuestos que contienen hidrocarburos alifáticos de cadena larga y sus derivados, tales como los ácidos grasos, los alcoholes, las aminas, los aminoalcoholes y los aldehídos.

Los lípidos adecuados para su uso pueden obtenerse de fuentes comerciales. Por ejemplo, la fosfatidilcolina de dimetilo ("DMPC") puede obtenerse de Sigma, St. Louis, MO; el fosfato de dimetilo ("DCP") puede obtenerse de K & K Laboratories (Plainview, NY); el colesterol ("Choi") puede obtenerse de Calbiochem-Behring; el fosfatidilglicerol de dimetilo ("DMPG") y otros lípidos pueden obtenerse de Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL.). Las soluciones madre de lípidos en cloroformo o cloroformo/metanol pueden almacenarse a aproximadamente -20 °C. El cloroformo se utiliza como único disolvente, ya que se evapora más fácilmente que el metanol. "Liposoma" es un término genérico que abarca una variedad de vehículos lipídicos mono y multilamelares formados por la generación de bicapas o agregados lipídicos cerrados. Los liposomas se caracterizan por tener estructuras vesiculares con una membrana bicapa de fosfolípidos y un medio acuoso interior. Los liposomas multilamelares tienen múltiples capas lipídicas separadas por un medio acuoso. Se forman espontáneamente cuando los fosfolípidos se suspenden en un exceso de solución acuosa. Los componentes lipídicos se autorreorganizan antes de la formación de estructuras cerradas y atrapan agua y solutos disueltos entre las bicapas lipídicas (Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). Sin embargo, también se incluyen las composiciones que tienen estructuras diferentes en solución a la estructura vesicular normal. Por ejemplo, los lípidos pueden adoptar una estructura micelar o simplemente existir como agregados no uniformes de moléculas lipídicas. También se contemplan los complejos lipofectamina-ácido nucleico.

Independientemente del procedimiento utilizado para introducir ácidos nucleicos exógenos en una célula huésped o exponer de otro modo una célula al inhibidor de la presente divulgación, con el fin de confirmar la presencia de la secuencia de ADN recombinante en la célula anfitirona, pueden realizarse diversos ensayos. Dichos ensayos incluyen, por ejemplo, ensayos "biológicos moleculares" bien conocidos por los expertos en la técnica, tales como transferencia Southern y Northern , RT-PCR y PCR; ensayos "bioquímicos", tales como la detección de la presencia o ausencia de un péptido particular, por ejemplo, por medios inmunológicos (ELISAs y transferencias Western ) o por ensayos descritos en el presente documento para identificar agentes que caen dentro del alcance de la divulgación.

La presente divulgación proporciona además un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica CAR. En un aspecto, un vector CAR puede transducirse directamente en una célula, por ejemplo, una célula T o una célula NK. En un aspecto, el vector es un vector de clonación o de expresión, por ejemplo, un vector que incluye, pero no se limita a, uno o más plásmidosfpor ejemplo, plásmidos de expresión, vectores de clonación, minicírculos, minivectores, cromosomas de doble minuto), constructos de vectores retrovirales y lentivirales. En un aspecto, el vector es capaz de expresar el constructo CAR en células T de mamíferos. En un aspecto, la célula T de mamífero es una célula T humana. En un aspecto, la célula de mamífero es una célula NK humana.

Fuentes de Células

Antes de la expansión y la modificación genética, se obtiene una fuente de células (por ejemplo, células T o células NK) de un sujeto. El término "sujeto" incluye a los organismos vivos en los que se puede provocar una respuesta inmunitaria (por ejemplo, los mamíferos). Algunos ejemplos de sujetos son los seres humanos, los perros, los gatos, los ratones, las ratas y sus especies transgénicas. Las células T pueden obtenerse de diversas fuentes, tales como las células mononucleares de la sangre periférica, la médula ósea, el tejido de los ganglios linfáticos, la sangre del cordón umbilical, el tejido del timo, el tejido de un foco de infección, la ascitis, el derrame pleural, el tejido del bazo y los tumores. En ciertos aspectos de la presente divulgación, puede utilizarse cualquier número de líneas de células T disponibles en la técnica. En ciertos aspectos de la presente divulgación, las células T pueden obtenerse a partir de una unidad de sangre recogida de un sujeto utilizando cualquier número de técnicas conocidas por el artesano experto, tales como la separación de Ficoll™. En un aspecto preferido, las células de la sangre circulante de un individuo se obtienen por aféresis. El producto de aféresis suele contener linfocitos, incluyendo células T, monocitos, granulocitos, células B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y plaquetas. En un aspecto, las células recogidas por aféresis pueden lavarse para eliminar la fracción de plasma y colocar las células en un tampón o medio apropiado para los pasos de procesamiento posteriores. En un aspecto de la divulgación, las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS). En un aspecto alternativo, la solución de lavado carece de calcio y puede carecer de magnesio o puede carecer de muchos o de todos los cationes divalentes. Los pasos iniciales de activación en ausencia de calcio pueden conducir a una activación magnificada. Como aquellos expertos en la técnica apreciarán fácilmente, el paso de lavado puede llevarse a cabo mediante procedimientos conocidos en la técnica, tal como el uso de una centrífuga semiautomática de "flujo continuo" (por ejemplo, el procesador celular Cobe 2991, el Baxter CytoMate o el Haemonetics Cell Saver 5) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tras el lavado, las células pueden resuspenderse en una variedad de tampones biocompatibles, tal como, por ejemplo, PBS sin Ca ni Mg, PlasmaLyte A u otra solución salina con o sin tampón. Alternativamente, los componentes indeseables de la muestra de aféresis pueden ser eliminados y las células resuspendidas directamente en medios de cultivo.

En un aspecto, las células T se aíslan de los linfocitos de la sangre periférica lisando los glóbulos rojos y agotando los monocitos, por ejemplo, por centrifugación a través de un gradiente PERCOLLTM o por elutriación centrífuga a contracorriente. Una subpoblación específica de células T, tales como las células T CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ y CD45RO+, puede aislarse aún más mediante técnicas de selección positiva o negativa. Por ejemplo, en un aspecto, las células T se aíslan por incubación con perlas conjugadas anti-CD3/anti-CD28 (por ejemplo, 3x28), como DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T, durante un periodo de tiempo suficiente para la selección positiva de las células T deseadas. En un aspecto, el período de tiempo es de unos 30 minutos. En otro aspecto, el período de tiempo oscila entre 30 minutos y 36 horas o más, y todos los valores enteros intermedios. En otro aspecto, el período de tiempo es de al menos 1,2, 3, 4, 5 o 6 horas. En otro aspecto preferido, el período de tiempo es de 10 a 24 horas. En un aspecto, el período de incubación es de 24 horas. Para el aislamiento de células T de pacientes con leucemia, el uso de tiempos de incubación más largos, como 24 horas, puede aumentar el rendimiento celular. Se pueden utilizar tiempos de incubación más largos para aislar células T en cualquier situación en la que haya pocas células T en comparación con otros tipos de células, tal como en el aislamiento de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) a partir de tejido tumoral o de individuos inmunodeprimidos. Además, el uso de tiempos de incubación más largos puede aumentar la eficacia de la captura de células T CD8+. Por lo tanto, simplemente acortando o alargando el tiempo que se permite a las células T unirse a las perlas CD3/CD28 y/o aumentando o disminuyendo la proporción de perlas con respecto a las células T (como se describe más adelante), se pueden seleccionar preferentemente subpoblaciones de células T a favor o en contra al inicio del cultivo o en otros momentos del procedimiento. Además, al aumentar o disminuir la proporción de anticuerpos anti-CD3 y/o anti-CD28 en las perlas u otra superficie, se pueden seleccionar preferentemente subpoblaciones de células T a favor o en contra al inicio del cultivo o en otros momentos deseados. El artesano experto reconocería que también se pueden utilizar rondas múltiples de selección en el contexto de esta divulgación. En ciertos aspectos, puede ser deseable realizar el procedimiento de selección y utilizar las células "no seleccionadas" en el procedimiento de activación y expansión. las células "no seleccionadas" también pueden ser sometidas a nuevas rondas de selección.

El enriquecimiento de una población de células T por selección negativa puede lograrse con una combinación de anticuerpos dirigidos a marcadores de superficie únicos para las células seleccionadas negativamente. Un procedimiento es la clasificación y/o selección de células mediante inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que utiliza un cóctel de anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de la superficie celular presentes en las células seleccionadas negativamente. Por ejemplo, para enriquecer las células CD4+ por selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales suele incluir anticuerpos contra CD 14, CD20, CD11b, CD 16, HLA-DR y CD8. En ciertos aspectos, puede ser deseable enriquecer o seleccionar positivamente las células T reguladoras que típicamente expresan CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ y FoxP3+. Alternativamente, en ciertos aspectos, las células reguladoras T se agotan mediante perlas conjugadas anti-C25 u otro procedimiento similar de selección.

En una realización, puede seleccionarse una población de células T que exprese una o más de las siguientes moléculas: IFN-y, TNFa, IL-17A, IL-2, IL-3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, granzima B y perforina, u otras moléculas apropiadas, por ejemplo, otras citocinas. Los procedimientos de cribado de la expresión celular pueden determinarse, por ejemplo, mediante los procedimientos descritos en Publicación PCT No: WO 2013/126712.

En una realización, una población de células T es deficiente en diaglicerol quinasa (DGK). Las células deficientes en DGK incluyen células que no expresan el ARN o la proteína DGK, o que tienen una actividad de DGK reducida o inhibida. Las células deficientes en DGK pueden generarse mediante enfoques genéticos, por ejemplo, administrando agentes de interferencia de ARN, por ejemplo, ARNpi, ARNhc, ANRmic, para reducir o impedir la expresión de DGK. Alternativamente, se pueden generar células deficientes en DGK mediante el tratamiento con los inhibidores de DGK descritos en el presente documento.

En una realización, una población de células T es deficiente en Ikaros. Las células deficientes en Ikaros incluyen células que no expresan el ARN o la proteína de Ikaros, o tienen una actividad de Ikaros reducida o inhibida, las células deficientes de Ikaros pueden generarse mediante enfoques genéticos, por ejemplo, administrando agentes de interferencia de ARN, por ejemplo, ARNpi, ARNhc, ARNmi, para reducir o impedir la expresión de Ikaros. Alternativamente, se pueden generar células deficientes en Ikaros mediante el tratamiento con inhibidores de Ikaros, por ejemplo, lenalidomida.

En las realizaciones, una población de células T es deficiente en DGK e Ikaros, por ejemplo, no expresa DGK e Ikaros, o tiene una actividad reducida o inhibida de DGK e Ikaros. Dichas células deficientes en DGK e Ikaros pueden generarse mediante cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento.

Para el aislamiento de una población deseada de células por selección positiva o negativa, se puede variar la concentración de células y la superficie (por ejemplo, partículas como perlas). En ciertos aspectos, puede ser deseable disminuir significativamente el volumen en el que se mezclan las perlas y las células (por ejemplo, aumentar la concentración de células), para asegurar el máximo contacto de las células y las perlas. Por ejemplo, en un aspecto, se utiliza una concentración de 2 mil millones de células/ml. En un aspecto, se utiliza una concentración de mil millones de células/ml. En otro aspecto, se utilizan más de 100 millones de células/ml. En otro aspecto, se utiliza una concentración de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 millones de células/ml. En un aspecto más, se utiliza una concentración de células de 75, 80, 85, 90, 95 o 100 millones de células/ml. En otros aspectos, pueden utilizarse concentraciones de 125 o 150 millones de células/ml. El uso de concentraciones elevadas puede dar lugar a un mayor rendimiento celular, a la activación de las células y a su expansión. Además, el uso de altas concentraciones celulares permite una captura más eficiente de células que pueden expresar débilmente los antígenos objetivo de interés, tales como las células T CD28-negativas, o de muestras en las que hay muchas células tumorales presentes (por ejemplo, sangre leucémica, tejido tumoral, etc.). Estas poblaciones de células pueden tener valor terapéutico y sería deseable obtenerlas. Por ejemplo, el uso de una alta concentración de células permite una selección más eficiente de las células T CD8+ que normalmente tienen una expresión más débil de CD28.

En un aspecto relacionado, puede ser deseable utilizar concentraciones más bajas de células. Al diluir significativamente la mezcla de células T y la superficie (por ejemplo, partículas tales como perlas), se minimizan las interacciones entre las partículas y las células. Esto selecciona las células que expresan altas cantidades de antígenos deseados para ser unidos a las partículas. Por ejemplo, las células T CD4+ expresan niveles más altos de CD28 y se capturan de manera más eficiente que las células T CD8+ en concentraciones diluidas. En un aspecto, la concentración de células utilizada es de 5 * 10e6/ml. En otros aspectos, la concentración utilizada puede ser de aproximadamente 1 * 105/ml a 1 * 106/ml, y cualquier valor entero intermedio.

En otros aspectos, las células pueden ser incubadas en un rotador por períodos de tiempo variables a velocidades variables ya sea a 2-10 °C o a temperatura ambiente.

Las células T para la estimulación también pueden ser congeladas después de un paso de lavado. Sin querer ceñirse a la teoría, el paso de congelación y posterior descongelación proporciona un producto más uniforme al eliminar los granulocitos y, en cierta medida, los monocitos de la población celular. Tras el paso de lavado que elimina el plasma y las plaquetas, las células pueden suspenderse en una solución de congelación. Aunque muchas soluciones y parámetros de congelación son conocidos en la técnica y serán útiles en este contexto, un procedimiento consiste en utilizar PBS que contiene 20 % de DMSO y 8 % de albúmina de suero humano, o medios de cultivo que contienen 10 % de dextrano 40 y 5 % de dextrosa, 20 % de albúmina de suero humano y 7,5 % de DMSO, o 31,25 % de Plasmalyte-A, 31,25 % Dextrosa 5 %, 0,45 % de NaCl, 10 % Dextrán 40 y 5 % de Dextrosa, 20 % de Albúmina de suero humano y 7,5% DMSO u otros medios de congelación celular adecuados que contengan, por ejemplo, Hespan y PlasmaLyte A, las células se congelan entonces a -80 °C a una velocidad de 1° por minuto y se almacenan en la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido. Pueden utilizarse otros procedimientos de congelación controlada, así como la congelación no controlada inmediatamente a -20 °C o en nitrógeno líquido.

En ciertos aspectos, las células criopreservadas se descongelan y se lavan como se describe en el presente documento y se dejan reposar durante una hora a temperatura ambiente antes de la activación mediante los procedimientos de la presente divulgación.

También se contempla en el contexto de la divulgación la recogida de muestras de sangre o producto de aféresis de un sujeto en un periodo de tiempo anterior a cuando las células expandidas como se describe en el presente documento podrían ser necesarias. Como tal, la fuente de las células que se van a expandir puede ser recogida en cualquier momento necesario, y las células deseadas, tales como las células T, aisladas y congeladas para su posterior uso en la terapia de células T para cualquier número de enfermedades o condiciones que se beneficiarían de la terapia de células T, tal como las descritas en este documento. En un aspecto, se toma una muestra de sangre o una aféresis de un sujeto generalmente sano. En ciertos aspectos, se toma una muestra de sangre o una aféresis de un sujeto generalmente sano que está en riesgo de desarrollar una enfermedad, pero que aún no ha desarrollado una enfermedad, y se aíslan las células de interés y se congelan para su uso posterior. En ciertos aspectos, las células T pueden expandirse, congelarse y utilizarse posteriormente. En ciertos aspectos, las muestras se recogen de un paciente poco después del diagnóstico de una enfermedad particular como se describe en el presente documento, pero antes de cualquier tratamiento. En otro aspecto, las células se aíslan a partir de una muestra de sangre o una aféresis de un sujeto antes de cualquier número de modalidades de tratamiento relevantes, incluyendo pero no limitándose al tratamiento con agentes tales como natalizumab, efalizumab, agentes antivirales, quimioterapia, radiación agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos tales como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3, citoxan, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228 e irradiación. Estos fármacos inhiben la fosfatasa dependiente del calcio, la calcineurina (ciclosporina y FK506) o inhiben la quinasa p70S6, importante para la señalización inducida por el factor de crecimiento (rapamicina). (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991 Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991 Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993). En otro aspecto, las células se aíslan para un paciente y se congelan para su uso posterior junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después) un trasplante de médula ósea o de células madre, una terapia ablativa de células T utilizando agentes quimioterapéuticos tales como la fludarabina, la radioterapia de haz externo (XRT), la ciclofosfamida o anticuerpos tales como OKT3 o CAMPATH. En un aspecto, las células se aíslan antes y pueden ser congeladas para su uso posterior para el tratamiento después de la terapia ablativa de células B, tal como los agentes que reaccionan con ^cD20, por ejemplo, Rituxan.

En otro aspecto de la presente divulgación, las células T se obtienen de un paciente directamente después de un tratamiento que deja al sujeto con células T funcionales. A este respecto, se ha observado que tras ciertos tratamientos contra el cáncer, en particular los tratamientos con fármacos que dañan el sistema inmunitario, poco después del tratamiento, durante el período en que los pacientes normalmente se estarían recuperando del mismo, la calidad de las células T obtenidas puede ser óptima o mejorada para su capacidad de expansión ex vivo. Asimismo, tras la manipulación ex vivo mediante los procedimientos descritos en el presente documento, estas células pueden estar en un estado preferente para mejorar el injerto y la expansión in vivo. Por lo tanto, se contempla dentro del contexto de la divulgación recoger células sanguíneas, incluyendo células T, células dendríticas u otras células del linaje hematopoyético, durante esta fase de recuperación. Además, en ciertos aspectos, la movilización (por ejemplo, la movilización con GM-CSF) y los regímenes de acondicionamiento pueden utilizarse para crear una condición en un sujeto en la que se favorezca la repoblación, la recirculación, la regeneración y/o la expansión de determinados tipos de células, especialmente durante una ventana de tiempo definida tras la terapia. Algunos tipos de células ilustrativas incluyen las células T, las células B, las células dendríticas y otras células del sistema inmunitario.

En una realización, las células NK se obtienen del sujeto. En otra realización, las células NK son una línea celular NK, por ejemplo, la línea celular NK-92 (Conkwest).

CAR alogénico

En las realizaciones descritas en el presente documento, la célula efectora inmunitaria puede ser una célula efectora inmunitaria alogénica, por ejemplo, una célula T o una célula NK. Por ejemplo, la célula puede ser una célula T alogénica, por ejemplo, una célula T alogénica que carece de expresión de un receptor de células T (TCR) funcional y/o de un antígeno leucocitario humano (HLA), por ejemplo, HLA clase I y/o HLA clase II.

Una célula T que carece de un TCR funcional puede ser, por ejemplo, diseñada de manera que no exprese ningún TCR funcional en su superficie, diseñada de manera que no exprese una o más subunidades que comprenden un TCR funcional o diseñada de manera que produzca muy poco TCR funcional en su superficie. Alternativamente, la célula T puede expresar un TCR sustancialmente deteriorado, por ejemplo, mediante la expresión de formas mutadas o truncadas de una o más de las subunidades del TCR. El término "^tC^rsustancialmente deteriorado" significa que este TCR no provocará una reacción inmunitaria adversa en un anfitrión.

Una célula T descrita en el presente documento puede ser, por ejemplo, diseñada de manera que no exprese un HLA funcional en su superficie. Por ejemplo, una célula T descrita en el presente documento, puede ser diseñada de tal manera que la expresión de la superficie celular HLA, por ejemplo, HLA clase 1 y/o HLA clase II, sea regulada a la baja.

En algunas realizaciones, la célula T puede carecer de un TCR funcional y un HLA funcional, por ejemplo, HLA clase I y/o HLA clase II.

Las células T modificadas que carecen de la expresión de un TCR y/o HLA funcional pueden obtenerse por cualquier medio adecuado, incluyendo un desactivación o derribo de una o más subunidad del TCR o del HLA. Por ejemplo, la célula T puede incluir un derribo del TCR y/o del HLA utilizando ARNpi, ARNhc, repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR), nucleasas efectoras similares al activador de la transcripción (TALEN) o endonucleasas de dedos de zinc (ZFN).

En algunas realizaciones, la célula alogénica puede ser una célula que no expresa o expresa a niveles bajos una molécula inhibidora, por ejemplo, por cualquier procedimiento descrito en el presente documento. Por ejemplo, la célula puede ser una célula que no exprese o que exprese en niveles bajos una molécula inhibidora, por ejemplo, que pueda disminuir la capacidad de una célula que exprese CAR para montar una respuesta de efector inmune . Algunos ejemplos de moléculas inhibidoras incluyen PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CeAc AM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 y TGFR beta. La inhibición de una molécula inhibidora, por ejemplo, mediante la inhibición a nivel de ADN, ARN o proteínas, puede optimizar el rendimiento de una célula que exprese CAR. En las realizaciones, se puede utilizar un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un ANRcd, por ejemplo, un ARNpi o ARNhc, repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR), una nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción (TALEN) o una endonucleasa con dedos de zinc (ZFN), por ejemplo, como se describe en el presente documento.

ARNpi y ARNhc para inhibir el TCR o el HLA

En algunas realizaciones, la expresión del TCR y/o la expresión del HLA puede inhibirse utilizando ARNsi o ARNhc que se dirige a un ácido nucleico que codifica un TCR y/o HLA en una célula T.

La expresión de ARNsi y ARNhc en células T puede lograrse utilizando cualquier sistema de expresión convencional, por ejemplo, tal como un sistema de expresión lentiviral.

Se describen ARNhc ejemplares que regulan la expresión de componentes del TCR, por ejemplo, en Publicación de EE. UU. No: 2012/0321667. Se describen ejemplos de ARNpi y ARNhc que regulan la expresión de los genes HLA de clase I y/o HLA de clase II, por ejemplo, en la publicación de U.S. No: ^uS 2007/0036773.

CRISPR para inhibir TCR o HLA

"CRISPR" o "CRISPR para TCR y/o HLA" o "CRISPR para inhibir TCR y/o HLA", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a un conjunto de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas, o a un sistema que comprende dicho conjunto de repeticiones. "Cas", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una proteína asociada a CRISPR. Un sistema "CRISPR/Cas" se refiere a un sistema derivado de CRISPR y Cas que puede utilizarse para silenciar o mutar un gen TCR y/o HLA.

Los sistemas CRISPR/Cas de origen natural se encuentran en aproximadamente 40 % de los genomas de eubacterias secuenciados y en 90 % de las arqueas secuenciadas. Grissa et al. (2007) BMC Bioinformatics 8: 172. Este sistema es un tipo de sistema inmunitario procariota que confiere resistencia a elementos genéticos extraños, tales como plásmidos y fagos, y proporciona una forma de inmunidad adquirida. Barrangou et al. (2007) Science 315: 1709 1712 Marragini et al. (2008) Science 322: 1843-1845.

El sistema CRISPR/Cas ha sido modificado para su uso en la edición de genes (silenciando, mejorando o cambiando genes específicos) en eucariotas tales como ratones o primates. Wiedenheft et al. (2012) Nature 482: 331-8. Esto se consigue introduciendo en la célula eucariota un plásmido que contiene un CRISPR específicamente diseñado y uno o más Cas adecuados.

La secuencia CRISPR, a veces llamada locus CRISPR, comprende repeticiones alternas y espaciadores. En un CRISPR de origen natural, los espaciadores suelen comprender secuencias ajenas a la bacteria, tales como un plásmido o una secuencia de fago; en el sistema CRISPR/Cas de TCR y/o HLA, los espaciadores se derivan de la secuencia del gen TCR o HLA.

El ARN del locus CRISPR se expresa constitutivamente y es procesado por las proteínas Cas en pequeños ARN. Estos comprenden un espaciador flanqueado por una secuencia repetida. Los ARN guían a otras proteínas Cas para silenciar elementos genéticos exógenos a nivel de ARN o ADN. Horvath et al. (2010) Science 327: 167-170; Makarova et al. (2006) Biology Direct 1: 7. Los espaciadores sirven así de plantillas para las moléculas de ARN, de forma análoga a los ARNpi. Pennisi (2013) Ciencia 341: 833-836.

Como éstas se dan de forma natural en muchos tipos diferentes de bacterias, las disposiciones exactas del CRISPR y la estructura, función y número de genes Cas y su producto difieren un poco de una especie a otra. Haft et al. (2005) PLoS Comput. Biol. 1: e60 Kunin et al. (2007) Genome Biol. 8: R61 Mojica et al. (2005) J. Mol. Evol. 60: 174 182; Bolotin et al. (2005) Microbiol. 151: 2551-2561 Pourcel et al. (2005) Microbiol. 151: 653-663y Stern et al. (2010) Trends. Genet. 28: 335-340. Por ejemplo, las proteínas Cse (subtipo Cas, E. coli) (por ejemplo, CasA) forman un complejo funcional, Cascade, que procesa los transcritos de CRISPR ARN en unidades de repetición de espaciadores que Cascade retiene. Brouns et al. (2008) Science 321: 960-964. En otros procariotas, Cas6 procesa el transcrito CRISPR. La inactivación de fagos con base en CRISPR en E. coli requiere Cascade y Cas3, pero no Cas1 o Cas2. Las proteínas Cmr (módulo Cas RAMP) en Pyrococcus furiosus y otros procariotas forman un complejo funcional con pequeños CRISPR ARN que reconoce y escinde ARNs objetivo complementarios. Un sistema CRISPR más sencillo se basa en la proteína Cas9, que es una nucleasa con dos sitios de corte activos, uno para cada cadena de la doble hélice. La combinación de Cas9 y el ARN del locus CRISPR modificado puede utilizarse en un sistema de edición de genes. Pennisi (2013) Science 341: 833-836.

El sistema CRISPR/Cas puede así ser utilizado para editar un gen TCR y/o HLA (añadiendo o eliminando un par de bases), o introduciendo una parada prematura que disminuye así la expresión de un TCR y/o HLA. El sistema CRISPR/Cas puede utilizarse alternativamente como ARN de interferencia, desactivando el TCR y/o el gen HLA de forma reversible. En una célula de mamífero, por ejemplo, el ARN puede guiar a la proteína Cas hacia un promotor de TCR y/o de HLA, bloqueando estéricamente las ^aRⁿpolimerasas.

Se pueden generar sistemas CRISPR/Cas artificiales que inhiban TCR y/o HLA, utilizando tecnología conocida en la técnica, por ejemplo, la descrita en la Publicación de EE. UU. No. 20140068797, y Cong (2013) Science 339: 819-823. También pueden generarse otros sistemas CRISPR/Cas artificiales conocidos en la técnica que inhiban TCR y/o HLA, por ejemplo, el descrito enTsai (2014) Nature Biotechnol, 32:6 569-576, Patente de EE. UU. No.: 8,871,4458,865,4068,795,965 8,771,945y 8,697,359.

TALEN para inhibir TCR y/o HLA

"TALEN" o "TALEN para HLA y/o TCR" o "TALEN para inhibir HLA y/o TCR" se refiere a una nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción, una nucleasa artificial que puede utilizarse para editar el gen HLA y/o TCR.

Los TALEN se producen artificialmente fusionando un dominio de unión al ADN del efector TAL con un dominio de escisión del ADN. Los efectos similares a los activadores de la transcripción (TALE) pueden ser diseñados para unirse a cualquier secuencia de ADN deseada, incluyendo una porción del gen HLA o TCR. Combinando una TALE de ingeniería con un dominio de corte de ADN, se puede producir una enzima de restricción que sea específica para cualquier secuencia de ADN deseada, incluyendo una secuencia HLA o TCR. A continuación, pueden introducirse en una célula, donde pueden utilizarse para la edición del genoma. Boch (2011) Nature Biotech. 29: 135-6y Boch et al. (2009) Science 326: 1509-12 Moscou et al. (2009) Science 326: 3501.

Los TALE son proteínas secretadas por las bacterias Xanthomonas. El dominio de unión al ADN contiene una secuencia repetida de 33-34 aminoácidos altamente conservada, con la excepción de los aminoácidos 12 y 13. Estas dos posiciones son muy variables, mostrando una fuerte correlación con el reconocimiento de nucleótidos específicos. De este modo, pueden diseñarse para que se unan a la secuencia de ADN deseada.

Para producir un TALEN, se fusiona una proteína TALE con una nucleasa (N), que es una endonucleasa FokI de tipo silvestre o mutada. Se han realizado varias mutaciones en FokI para su uso en TALEN; éstas, por ejemplo, mejoran la especificidad o la actividad de escisión. Cermak et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39: e82 Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8 Hockemeyer et al. (2011) Nature Biotech. 29: 731-734 Wood et al. (2011) Science 333: 307 Doyon et al. (2010) Nature Methods 8: 74-79; Szczepek et al. (2007) Nature Biotech. 25: 786-793y Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 200: 96.

El dominio FokI funciona como un dímero, requiriendo dos constructos con dominios de unión al ADN únicos para sitios en el genoma objetivo con la orientación y el espaciado adecuados. Tanto el número de residuos de aminoácidos entre el dominio de unión al ADN de TALE y el escisión de FokI como el número de bases entre los dos sitios individuales de unión de TALEN parecen ser parámetros importantes para lograr altos niveles de actividad. Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8.

Un TALEN HLA o TCR puede ser utilizado dentro de una célula para producir una rotura de doble cadena (DSB). Se puede introducir una mutación en el lugar de la rotura si los mecanismos de reparación reparan incorrectamente la rotura mediante la unión de extremos no homólogos. Por ejemplo, una reparación incorrecta puede introducir una mutación de cambio de marco. Alternativamente, se puede introducir ADN extraño en la célula junto con el TALEN; dependiendo de las secuencias del ADN extraño y de la secuencia cromosómica, este procedimiento puede utilizarse para corregir un defecto en el gen HLA o TCR o introducir dicho defecto en un gen HLA o TCR wt, disminuyendo así la expresión de HLA o TCR.

Los TALEN específicos para secuencias en HLA o TCR pueden ser construidos usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluyendo diversos esquemas usando componentes modulares. Zhang et al. (2011) Nature Biotech. 29: 149-53 Geibler et al. (2011) PLoS ONE 6: e19509.

Nucleasa de dedo de zinc para inhibir HLA y/o TCR

"ZFN" o "nucleasa de dedo de zinc" o "ZFN para HLA y/o TCR" o "ZFN para inhibir HLA y/o TCR" se refieren a una nucleasa de dedo de zinc, una nucleasa artificial que puede utilizarse para editar el gen HLA y/o TCR.

Al igual que un TALEN, un ZFN comprende un dominio de nucleasa FokI (o un derivado del mismo) fusionado a un dominio de unión al ADN. En el caso de un ZFN, el dominio de unión al ADN comprende uno o más dedos de zinc. Carroll et al. (2011) Genetics Society of America 188: 773-782y Kim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160.

Un dedo de zinc es un pequeño motivo estructural proteico estabilizado por uno o más iones de zinc. Un dedo de zinc puede comprender, por ejemplo, Cys2His2, y puede reconocer una secuencia de aproximadamente 3 pb. Pueden combinarse diversos dedos de zinc de especificidad conocida para producir polipéptidos de dedos múltiples que reconozcan secuencias de aproximadamente 6, 9, 12, 15 o 18 pb . Existen diversas técnicas de selección y ensamblaje modular para generar dedos de zinc (y combinaciones de los mismos) que reconozcan secuencias específicas, que incluyen la visualización de fagos, los sistemas de levadura de un híbrido, los sistemas bacterianos de un híbrido y de dos híbridos, y las células de mamíferos.

Al igual que un TALEN, un ZFN debe dimerizarse para escindir el ADN. Por lo tanto, se requiere un par de ZFN para dirigirse a sitios de ADN no palindrómico. Los dos ZFN individuales deben unirse a cadenas opuestas del ADN con sus nucleasas debidamente espaciadas. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10570-5.

También como un TALEN, un ZFN puede crear una rotura de doble cadena en el ADN, que puede crear una mutación de cambio de marco si se repara incorrectamente, lo que lleva a una disminución de la expresión y la cantidad de HLA y/o TCR en una célula. Los ZFN también pueden utilizarse con la recombinación homóloga para mutar en el gen HLA o TCR.

Los ZFN específicos para secuencias en HLA Y/O TCR pueden ser construidos usando cualquier procedimiento conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, Provasi (2011) Nature Med. 18: 807-815 Torikai (2013) Blood 122: 1341 1349 Cathomen et al. (2008) Mol. Ther. 16: 1200-7y Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 400: 96 Publicación de Patente de EE. UU. 2011/0158957 Publicación de Patente de EE. UU. 2012/0060230.

Activación y Expansión de las Células

Las células pueden ser activadas y expandidas generalmente usando procedimientos como los descritos, por ejemplo, en Patentes de EE.UU.

6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,2 32,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041;y Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. No.

20060121005.

En general, las células T de la divulgación pueden expandirse por contacto con una superficie que tenga adherido un agente que estimule una señal asociada al complejo CD3/TCR y un ligando que estimule una molécula coestimuladora en la superficie de las células T. En particular, las poblaciones de células T pueden estimularse como se describe en el presente documento, tal como por ejemplo por contacto con un anticuerpo anti-CD3, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado en una superficie, o por contacto con un activador de la proteína quinasa C (por ejemplo, brioestatina) junto con un ionóforo de calcio. Para la coestimulación de una molécula accesoria en la superficie de las células T, se utiliza un ligando que se une a la molécula accesoria. Por ejemplo, una población de células T puede ponerse en contacto con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, bajo condiciones adecuadas para estimular la proliferación de las células T. Para estimular la proliferación de células T CD4+ o células T CD8+, un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28. Entre los ejemplos de un anticuerpo anti-CD28 se incluyen 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besangon, Francia), así como otros procedimientos comúnmente conocidos en la técnica (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998 Haanen et al., J. Exp. Med.

190(9):13191328, 1999 Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999).

En ciertos aspectos, la señal estimuladora primaria y la señal coestimuladora para la célula T pueden ser proporcionadas por diferentes protocolos. Por ejemplo, los agentes que proporcionan cada señal pueden estar en solución o acoplados a una superficie. Cuando se acoplan a una superficie, los agentes pueden estar acoplados a la misma superficie (es decir, en formación "cis") o a superficies separadas (es decir, en formación "trans"). Alternativamente, un agente puede estar acoplado a una superficie y el otro agente en solución. En un aspecto, el agente que proporciona la señal coestimuladora está unido a una superficie celular y el agente que proporciona la señal de activación primaria está en solución o acoplado a una superficie. En ciertos aspectos, ambos agentes pueden estar en solución. En un aspecto, los agentes pueden estar en forma soluble, y luego entrecruzados a una superficie, tal como una célula que exprese receptores Fc o un anticuerpo u otro agente de unión que se unirá a los agentes. A este respecto, véase por ejemplo la Publicación de la Solicitud de Patente de EE.UU. Nos.

20040101519 y 20060034810 para células presentadoras de antígeno artificiales (aAPCs) que se contemplan para su uso en la activación y expansión de células T en la presente divulgación.

En un aspecto, los dos agentes se inmovilizan en perlas, ya sea en la misma perla, es decir, "cis", o en perlas separadas, es decir, "trans" A modo de ejemplo, el agente que proporciona la señal de activación primaria es un anticuerpo anti-CD3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y el agente que proporciona la señal coestimuladora es un anticuerpo anti-CD28 o un fragmento de unión a antígeno del mismo; y ambos agentes se coinmovilizan a la misma perla en cantidades moleculares equivalentes. En un aspecto, se utiliza una proporción 1:1 de cada anticuerpo unido a las perlas para la expansión de células T CD4+ y el crecimiento de células T. En ciertos aspectos de la presente divulgación, se utiliza una proporción de anticuerpos anti CD3:CD28 unidos a las perlas tal que se observa un aumento de la expansión de células T en comparación con la expansión observada utilizando una proporción de 1:1. En un aspecto particular, se observa un aumento de aproximadamente 1 a 3 veces en comparación con la expansión observada utilizando una proporción de 1:1. En un aspecto, la proporción de anticuerpos c D3:CD28 unidos a las perlas oscila entre 100:1 y 1:100 y todos los valores enteros entre ellos. En un aspecto de la presente divulgación, se une más anticuerpo anti-CD28 a las partículas que anticuerpo anti-CD3, es decir, la proporción de CD3:CD28 es inferior a uno. En ciertos aspectos de la invención, la relación entre el anticuerpo anti CD28 y el anticuerpo anti CD3 unido a las perlas es superior a 2:1. En un aspecto particular, se utiliza una proporción 1:100 de anticuerpos CD3:CD28 unidos a las perlas. En un aspecto, se utiliza una proporción 1:75 de CD3:CD28 de anticuerpo unido a las perlas. En otro aspecto, se utiliza una proporción 1:50 de anticuerpos CD3:CD28 unidos a las perlas. En un aspecto, se utiliza una proporción 1:30 de anticuerpos CD3:CD28 unidos a las perlas. En un aspecto preferido, se utiliza una proporción 1:10 de anticuerpos CD3:CD28 unidos a las perlas. En un aspecto, se utiliza una proporción 1:3 de anticuerpos CD3:CD28 unidos a las perlas. En un aspecto más, se utiliza una proporción 3:1 de anticuerpos CD3:CD28 unidos a las perlas.

Para estimular las células T u otras células objetivo pueden utilizarse proporciones de partículas a células de 1:500 a 500:1 y cualquier valor entero intermedio. Como aquellos expertos en la técnica pueden apreciar fácilmente, la proporción de partículas con respecto a las células puede depender del tamaño de las partículas en relación con la célula objetivo. Por ejemplo, las perlas de tamaño pequeño sólo podrían unir unas pocas células, mientras que las perlas más grandes podrían unir muchas. En ciertos aspectos, la proporción entre células y partículas oscila entre 1:100 y 100:1 y cualquier valor entero intermedio y, en otros aspectos, la proporción comprende entre 1:9 y 9:1 y cualquier valor entero intermedio, también puede utilizarse para estimular las células T. La proporción de partículas acopladas a anti-CD3 y anti-CD28 con respecto a las células T que dan lugar a la estimulación de células T puede variar como se ha indicado anteriormente, sin embargo, ciertos valores preferidos incluyen 1:100, 1:50, 140, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1,4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, y 15:1 con una proporción preferida de al menos 1:1 partículas por célula T. En un aspecto, se utiliza una proporción de partículas a células de 1:1 o menos. En un aspecto particular, una proporción preferida de partículas: células es de 1:5. En otros aspectos, la proporción entre partículas y células puede variar en función del día de estimulación. Por ejemplo, en un aspecto, la proporción de partículas con respecto a las células es de 1:1 a 10:1 el primer día y se añaden partículas adicionales a las células cada día o cada dos días a partir de entonces durante un máximo de 10 días, en proporciones finales de 1:1 a 1:10 (con base en los recuentos de células el día de la adición). En un aspecto particular, la proporción entre partículas y células es de 1:1 el primer día de estimulación y se ajusta a 1:5 el tercer y quinto día de estimulación. En un aspecto, las partículas se añaden diariamente o cada dos días hasta una proporción final de 1:1 el primer día, y de 1:5 el tercer y quinto día de estimulación. En un aspecto, la proporción entre partículas y células es de 2:1 el primer día de estimulación y se ajusta a 1:10 el tercer y quinto día de estimulación. En un aspecto, las partículas se añaden diariamente o cada dos días hasta una proporción final de 1:1 el primer día, y de 1:10 el tercer y quinto día de estimulación. Un experto en la técnica apreciará que una variedad de otras proporciones puede ser adecuada para su uso en la presente divulgación. En particular, las proporciones variarán en función del tamaño de las partículas y del tamaño y tipo de células. En un aspecto, las proporciones más típicas de uso son del orden de 1:1,2:1 y 3:1 el primer día.

En otros aspectos de la presente divulgación, las células, tales como las células T, se combinan con perlas recubiertas de agente, las perlas y las células se separan posteriormente, y luego las células se cultivan. En un aspecto alternativo, antes del cultivo, las perlas recubiertas con agente y las células no se separan, sino que se cultivan juntas. En otro aspecto, las microesferas y las células se concentran primero mediante la aplicación de una fuerza, tal como por ejemplo una fuerza magnética, lo que da lugar a un aumento de la ligadura de los marcadores de la superficie celular, induciendo así la estimulación celular.

A modo de ejemplo, las proteínas de la superficie celular pueden ligarse permitiendo que las perlas paramagnéticas a las que se unen anti-CD3 y anti-CD28 (perlas 3x28) entren en contacto con las células T. En un aspecto, las células (por ejemplo,104 a 109 células T) y las microesferas (por ejemplo, las microesferas paramagnéticas DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T en una proporción de 1:1) se combinan en un tampón, por ejemplo PBS (sin cationes divalentes tales como, calcio y magnesio). Una vez más, los expertos en la técnica pueden apreciar fácilmente que se puede utilizar cualquier concentración de células. Por ejemplo, la célula objetivo puede ser muy rara en la muestra y comprender sólo 0,01 % de la muestra o toda la muestra (es decir, 100 %) puede comprender la célula objetivo de interés. En consecuencia, cualquier número de célula está dentro del contexto de la presente divulgación. En ciertos aspectos, puede ser deseable disminuir significativamente el volumen en el que se mezclan las partículas y las células (es decir, aumentar la concentración de células), para asegurar el máximo contacto de las células y las partículas. Por ejemplo, en un aspecto, se utiliza una concentración de aproximadamente 2 mil millones de células/ml. En un aspecto, se utilizan más de 100 millones de células/ml. En otro aspecto, se utiliza una concentración de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 millones de células/ml. En un aspecto más, se utiliza una concentración de células de 75, 80, 85, 90, 95 o 100 millones de células/ml. En otros aspectos, pueden utilizarse concentraciones de 125 o 150 millones de células/ml. El uso de concentraciones elevadas puede dar lugar a un mayor rendimiento celular, a la activación de las células y a su expansión. Además, el uso de altas concentraciones celulares permite una captura más eficiente de las células que pueden expresar débilmente los antígenos objetivo de interés, tal como las células T CD28-negativas. Estas poblaciones de células pueden tener valor terapéutico y sería deseable obtenerlas en ciertos aspectos. Por ejemplo, el uso de una alta concentración de células permite una selección más eficiente de las células T CD8+ que normalmente tienen una expresión más débil de CD28.

En un aspecto de la presente divulgación, la mezcla puede ser cultivada durante varias horas (unas 3 horas) hasta aproximadamente 14 días o cualquier valor entero horario entre ambos. En un aspecto, la mezcla puede cultivarse durante 21 días. En un aspecto de la divulgación, las perlas y las células T se cultivan juntas durante aproximadamente ocho días. En un aspecto, las perlas y las células T se cultivan juntas durante 2-3 días. También se pueden desear varios ciclos de estimulación, de manera que el tiempo de cultivo de las células T puede ser de 60 días o más. Las condiciones apropiadas para el cultivo de células T incluyen un medio apropiado (por ejemplo, Medio Esencial Mínimo o Medio RPMI 1640 o, X-vivo 15, (Lonza)) que puede contener factores necesarios para la proliferación y viabilidad, incluyendo suero (por ejemplo, suero fetal bovino o humano), interleucina-2 (IL-2), insulina, FN-^y, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFp y TNF-a o cualquier otro aditivo para el crecimiento de las células conocido por la persona experta. Otros aditivos para el crecimiento de las células incluyen, pero no se limitan a, tensioactivos, plasmanato y agentes reductores tales como la N-acetil-cisteína y el 2-mercaptoetanol. Los medios pueden incluir RPMl 1640, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15 y X-Vivo 20, Optimizer, con aminoácidos añadidos, piruvato sódico y vitaminas, ya sea sin suero o complementado con una cantidad adecuada de suero (o plasma) o un conjunto definido de hormonas, y/o una cantidad de citoquina(s) suficiente para el crecimiento y la expansión de las células T. Los antibióticos, por ejemplo, la penicilina y la estreptomicina, se incluyen sólo en los cultivos experimentales, no en los cultivos de células que se van a infundir en un sujeto. Las células objetivo se mantienen bajo las condiciones necesarias para apoyar el crecimiento, por ejemplo, una temperatura adecuada (por ejemplo, 37° C) y una atmósfera (por ejemplo, aire más 5% de CO2).

Las células T que han sido expuestas a tiempos de estimulación variados pueden presentar características diferentes. Por ejemplo, los productos típicos de células mononucleares de sangre periférica o de aféresis tienen una población de células T auxiliares (TH, CD4+) mayor que la población de células T citotóxicas o supresoras (TC, CD8+). La expansión ex vivo de las células T mediante la estimulación de los receptores CD3 y CD28 produce una población de células T que antes de los días 8-9 aproximadamente está formada predominantemente por células TH, mientras que después de los días 8-9 aproximadamente, la población de células T comprende una población cada vez mayor de células TC. En consecuencia, dependiendo del propósito del tratamiento, puede ser ventajoso infundir a un sujeto con una población de células T compuesta predominantemente por células TH. Del mismo modo, si se ha aislado un subconjunto de células TC específicas de antígeno, puede ser beneficioso ampliar este subconjunto en mayor medida.

Además de los marcadores CD4 y CD8, otros marcadores fenotípicos varían significativamente, pero en gran parte, de forma reproducible durante el curso del procedimiento de expansión celular. Por lo tanto, esta reproducibilidad permite la capacidad de adaptar un producto de células T activadas para fines específicos.

Una vez que se construye un mesotelina CAR, se pueden utilizar diversos ensayos para evaluar la actividad de la molécula, tal como por ejemplo, pero sin limitarse a, la capacidad de expandir las células T tras la estimulación del antígeno, mantener la expansión de las células T en ausencia de reestimulación, y las actividades anticancerígenas en modelos in vitro y animales apropiados. Los ensayos para evaluar los efectos de un mesotelina CAR se describen con más detalle a continuación

El análisis de transferencia Western de la expresión CAR en células T primarias puede utilizarse para detectar la presencia de monómeros y dímeros. Véase, por ejemplo Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Muy brevemente, las células T (mezcla 1:1 de células T CD4+ y CD8+) que expresan los CAR se expanden in vitro durante más de 10 días, seguido de lisis y SDS-PAGE bajo condiciones reductoras. Los CAR que contienen el dominio citoplasmático del TCR-Z de longitud completa y la cadena endógena del TCR-Z se detectan mediante transferencia western utilizando un anticuerpo contra la cadena del TCR-Z. Los mismos subconjuntos de células T se utilizan para el análisis de SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras para permitir la evaluación de la formación de dímeros covalentes.

La expansión in vitro de las células T CAR+ tras la estimulación del antígeno puede medirse por citometría de flujo. Por ejemplo, se estimula una mezcla de células T CD4+ y CD8+ con aAPCs aCD3/aCD28 seguida de la transducción con vectores lentivirales que expresan GFP bajo el control de los promotores que se van a analizar. Los promotores ejemplares incluyen el gen IE del CMV, el EF-1a, la ubiquitina C o los promotores de la fosfogliceroquinasa (PGK). La fluorescencia de GFP se evalúa el día 6 de cultivo en los subconjuntos de células T CD4+ y/o CD8+ mediante citometría de flujo. Véase, por ejemplo Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Alternativamente, se estimula una mezcla de células T CD4+ y CD8+ con perlas magnéticas recubiertas de aCD3/aCD28 el día 0, y se transduce con CAR el día 1 utilizando un vector lentiviral bicistrónico que expresa CAR junto con eGFP utilizando una secuencia de omisión ribosomal 2A. Los cultivos se reestimulan, por ejemplo, con células K562 que expresan hCD32 y 4-1BBL en presencia de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 (K562-BBL-3/28) tras el lavado. La IL-2 exógena se añade a los cultivos cada dos días a 100 Ul/ml. Las células T GFP+ se enumeran mediante citometría de flujo utilizando un recuento con base en microesferas. Véase, por ejemplo Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009).

También se puede medir la expansión sostenida de células T CAR+ en ausencia de reestimulación. Véase, por ejemplo Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Brevemente, el volumen medio de células T (fl) se mide en el día 8 de cultivo utilizando un contador de partículas Coulter Multisizer III tras la estimulación con perlas magnéticas recubiertas de aCD3/aCD28 en el día 0, y la transducción con el CAR indicado en el día 1.

La evaluación de la proliferación celular y la producción de citoquinas se ha descrito previamente, porejemplo, en Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Brevemente, la evaluación de la proliferación mediada por CAR se realiza en placas de microtitulación mezclando células T lavadas con células objetivo, tal como K562-Meso, Ovcar3, Ovcar8, SW1990, Panc02.03 que expresan mesotelina o CD32 y CD137 (KT32-BBL) para una proporción final de células T: células objetivo de 1:1. Los anticuerpos monoclonales anti-CD3 (clon OKT3) y anti-CD28 (clon 9.3) se añaden a los cultivos con células KT32-BBL para que sirvan de control positivo para estimular la proliferación de células T, ya que estas señales favorecen la expansión de células T CD8+ a largo plazo ex vivo. Las células T se enumeran en los cultivos utilizando las perlas fluorescentes CountBright™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) y la citometría de flujo como describe el fabricante. Las células T CAR+ se identifican mediante la expresión de GFP utilizando células T diseñadas con vectores lentivirales que expresan CAR enlazados a eGFP-2A. Para las células T CAR+ que no expresan GFP, las células T CAR+ se detectan con la proteína mesotelina recombinante biotinilada y un conjugado secundario de avidina-PE. La expresión de CD4+ y CD8+ en las células T también se detecta simultáneamente con anticuerpos monoclonales específicos (BD Biosciences). Las mediciones de citocinas se realizan en sobrenadantes recogidos 24 horas después de la reestimulación utilizando el kit de matriz de perlas citométricas de citocinas TH1/TH2 humanas (BD Biosciences, San Diego, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La fluorescencia se evalúa utilizando un citómetro de flujo FACScalibur y los datos se analizan de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La citotoxicidad puede evaluarse mediante los procedimientos descritos en el presente documento, por ejemplo, en los ejemplos, o mediante un ensayo estándar de liberación de 51Cr. Véase, por ejemplo Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Brevemente, las células objetivo (por ejemplo, células BHK o CHO que expresan mesotelina) se cargan con 51Cr (como NaCrO4, New England Nuclear, Boston, MA) a 37 °C durante 2 horas con agitación frecuente, se lavan dos veces en RPMI completo y se colocan en placas de microtitulación. Las células T efectoras se mezclan con las células objetivo en los pocillos en RPMI completo en proporciones variables de células efectoras: células objetivo (E:T). También se preparan pocillos adicionales que contienen sólo medio (liberación espontánea, SR) o una solución al 1% de detergente Triton-X 100 (liberación total, TR). Tras 4 horas de incubación a 37 °C, se recoge el sobrenadante de cada pocillo. El 51Cr liberado se mide entonces con un contador de partículas gamma (Packard Instrument Co., Waltham, MA). Cada condición se realiza al menos por triplicado, y el porcentaje de lisis se calcula mediante la fórmula: % Lisis = (ER- SR) / (TR - SR), donde ER representa el promedio de 51Cr liberado para cada condición experimental. También pueden utilizarse ensayos de citotoxicidad alternativos, tal como los ensayos de citotoxicidad con base en el flujo.

La luciferasa roja del escarabajo clic y la luciferasa verde del escarabajo clic pueden utilizarse para seguir simultáneamente la progresión del tumor y el tráfico de células T, ya que cada una utiliza el mismo sustrato de luciferina pero emite luz en los extremos opuestos del espectro de luz visible.

Otros ensayos, incluyendo los descritos en la sección de ejemplos del presente documento, así como los conocidos en la técnica, también pueden utilizarse para evaluar las constructos de mesotelina CAR de la divulgación.

Aplicación Terapéutica para las Enfermedades y Trastornos que Expresan Mesotelina

La presente divulgación proporciona composiciones y procedimientos para tratar enfermedades y trastornos asociados con la mesotelina. Un ejemplo de enfermedad o trastorno asociado con la mesotelina es el mesotelioma.

El mesotelioma maligno es un tipo de cáncer que se produce en la fina capa de células que recubre los órganos internos del cuerpo, conocida como mesotelio. Existen tres tipos reconocidos de mesotelioma. El mesotelioma pleural (por ejemplo, el mesotelioma pleural maligno o MPM) es la forma más común de la enfermedad, representando aproximadamente el 70 % de los casos, y se produce en el revestimiento del pulmón conocido como pleura. El mesotelioma peritoneal se produce en el revestimiento de la cavidad abdominal, conocido como peritoneo. El mesotelioma pericárdico se origina en el pericardio, que recubre el corazón.

Un sujeto puede estar en riesgo de desarrollar un mesotelioma si estuvo expuesto al asbesto. La exposición al amianto y la inhalación de partículas de amianto pueden causar mesotelioma. En la mayoría de los casos, los síntomas del mesotelioma no aparecen en un sujeto expuesto al amianto hasta muchos años después de la exposición.

Los síntomas del mesotelioma pleural incluyen, por ejemplo, dolor lumbar o dolor torácico lateral, y dificultad para respirar. Otros síntomas son la dificultad para tragar, la tos persistente, la fiebre, la pérdida de peso o la fatiga. Otros síntomas que experimentan algunos pacientes son debilidad muscular, pérdida de la capacidad sensorial, tos con sangre, hinchazón de la cara y los brazos y ronquera. En las primeras fases de la enfermedad, tal como el mesotelioma en etapa 1, los síntomas pueden ser leves. Los pacientes suelen referir dolor en una zona del pecho que parece no desaparecer nunca, pérdida de peso y fiebre.

El mesotelioma peritoneal se origina en el abdomen y, como resultado, los síntomas suelen incluir dolor abdominal, pérdida de peso, náuseas y vómitos. También puede producirse una acumulación de líquido en el abdomen como consecuencia del cáncer. El mesotelioma peritoneal se origina en el abdomen y suele extenderse a otros órganos de la zona, incluyendo el hígado, el bazo o el intestino. El dolor abdominal severo es la queja más común que los pacientes experimentan por primera vez. También puede haber un nivel de incomodidad con la acumulación de líquido en el abdomen. Otros síntomas del mesotelioma peritoneal pueden ser dificultad para defecar, náuseas y vómitos, fiebre y pies hinchados.

El mesotelioma pericárdico es la forma menos común de mesotelioma. El mesotelioma pericárdico, como su nombre indica, afecta al corazón. Este raro tipo de mesotelioma invade el pericardio, el saco que rodea el corazón. A medida que el cáncer avanza, el corazón no es capaz de suministrar oxígeno de forma tan eficiente al cuerpo, lo que provoca un mayor deterioro de la salud a un ritmo cada vez más rápido. Los síntomas más comunes asociados al mesotelioma pericárdico se asemejan a los de un ataque al corazón: náuseas, dolor en el pecho y dificultad para respirar.

Los sujetos que se benefician del tratamiento de acuerdo con la divulgación incluyen sujetos con un mesotelioma, o sujetos que se sospecha que tienen un mesotelioma, por ejemplo, como se evidencia por la presencia de uno o más de los síntomas descritos en el presente documento y/o la exposición al asbesto. En determinadas realizaciones, el mesotelioma es un mesotelioma pleural (por ejemplo, un mesotelioma pleural maligno). En otros aspectos, se puede tratar al sujeto que tiene una condición precancerosa tal como, por ejemplo, placas pleurales, mesotelioma benigno o hiperplasia mesotelial.

Otro ejemplo de enfermedad o trastorno asociado a la mesotelina es el cáncer de páncreas. Los cánceres de páncreas que pueden tratarse con los procedimientos descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, los cánceres de páncreas exocrino y endocrino. Los cánceres pancreáticos exocrinos incluyen, entre otros, adenocarcinomas, carcinomas de células acinares, carcinomas adenoescamosos, carcinomas coloides, carcinomas indiferenciados con células gigantes similares a las de los osteoclastos, carcinomas hepatoides, neoplasias papilomucinosas intraductales, neoplasias quísticas mucinosas, pancreatoblastomas, cistadenomas serosos, carcinomas de células en anillo de sello, tumores sólidos y pseudopapilares, carcinomas ductales pancreáticos y carcinomas indiferenciados. En algunas realizaciones, el cáncer de páncreas exocrino es un carcinoma ductal pancreático. Los cánceres endocrinos de páncreas incluyen, pero no se limitan a, los insulinomas y los glucagonomas.

En algunas realizaciones, el cáncer de páncreas es cualquiera de los cánceres de páncreas en fase inicial, cáncer de páncreas no metastásico, cáncer de páncreas primario, cáncer de páncreas resecado, cáncer de páncreas avanzado, cáncer de páncreas localmente avanzado, cáncer de páncreas metastásico, cáncer de páncreas no resecable, cáncer de páncreas en remisión, cáncer de páncreas recurrente, cáncer de páncreas en un entorno adyuvante o cáncer de páncreas en un entorno neoadyuvante. En algunas realizaciones, el cáncer de páncreas es un cáncer de páncreas localmente avanzado, un cáncer de páncreas irresecable o un carcinoma ductal pancreático metastásico. En algunas realizaciones, el cáncer de páncreas es resistente a la terapia con base en gemcitabina. En algunas realizaciones, el cáncer de páncreas es refractario a la terapia con base en gemcitabina.

En otros aspectos, el trastorno asociado a la expresión de mesotelina es el cáncer de ovario. El cáncer de ovario se clasifica de acuerdo con la histología del tumor. El tumor epitelial estromal de superficie, también conocido como carcinoma epitelial de ovario, es el tipo más común de cáncer de ovario. Incluye el tumor seroso (incluyendo el cistadenocarcinoma papilar seroso), el tumor endometrioide y el cistadenocarcinoma mucinoso.

Los procedimientos descritos en el presente documento pueden utilizarse para tratar diversas etapas del cáncer de ovario, por ejemplo, la etapa I, la etapa II, la etapa III o la etapa IV. La generación de etapas puede realizarse, por ejemplo, cuando se extirpa el cáncer de ovario. El cáncer de ovario se clasifica de la siguiente manera:

El cáncer en etapa I se limita a uno o ambos ovarios. El cáncer está en etapa II si uno o ambos ovarios están afectados y se han extendido al útero y/o a las trompas de Falopio o a otros lugares de la pelvis. El cáncer se encuentra en la etapa III si uno o ambos ovarios están afectados y se han extendido a los ganglios linfáticos o a otros lugares fuera de la pelvis, pero todavía están dentro de la cavidad abdominal, tal como la superficie del intestino o el hígado. El cáncer está en etapa IV si uno o ambos ovarios están afectados y el cáncer se ha extendido fuera del abdomen o al interior del hígado.

En algunas realizaciones, el cáncer de ovario es resistente a uno o más agentes quimioterapéuticos. En algunas realizaciones, el cáncer de ovario es refractario a uno o más agentes quimioterapéuticos.

Otros tipos de cáncer que pueden tratarse con las composiciones de CAR descritas en el presente documento incluyen, por ejemplo, el cáncer cerebral, el cáncer de vejiga, el cáncer de mama, el cáncer de cuello uterino, el cáncer colorrectal, el cáncer de hígado, el cáncer de riñón, el linfoma, la leucemia, el cáncer de pulmón (por ejemplo, adenocarcinoma de pulmón), melanoma, melanoma metastásico, mesotelioma, neuroblastoma, el cáncer de ovario, el cáncer de próstata, el cáncer de páncreas, el cáncer renal, el cáncer de piel, timoma, sarcoma, el linfoma no Hodgkin, el linfoma de Hodgkin, el cáncer de útero y cualquier combinación de los mismos.

La presente divulgación proporciona procedimientos para inhibir la proliferación o reducir una población de células que expresan mesotelina, comprendiendo los procedimientos el contacto de una población de células que comprenden una célula que expresa mesotelina con una célula que expresa mesotelina CAR de la divulgación que se une a la célula que expresa mesotelina. En una realización específica, la divulgación proporciona procedimientos para inhibir la proliferación o reducir la población de células cancerosas que expresan mesotelina, comprendiendo los procedimientos el contacto de la población de células cancerosas que expresan mesotelina con una célula que expresa mesotelina CAR de la divulgación que se une a la célula que expresa mesotelina. En otra realización, la divulgación proporciona procedimientos para inhibir la proliferación o reducir la población de células cancerosas que expresan mesotelina, comprendiendo los procedimientos el contacto de la población de células cancerosas que expresan mesotelina con una célula que expresa mesotelina CAR de la divulgación que se une a la célula que expresa mesotelina. En ciertas realizaciones, la célula que expresa mesotelina CAR de la divulgación reduce la cantidad, el número, la cantidad o el porcentaje de células y/o células cancerosas en al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 95 %, o al menos aproximadamente 99 % en un sujeto con o modelo animal de mesotelioma u otro cáncer asociado con células que expresan mesotelina en relación con un control negativo. En un aspecto, el sujeto es un humano.

La divulgación también proporciona procedimientos para prevenir, tratar y/o manejar un trastorno asociado con células que expresan mesotelina (por ejemplo, mesotelioma), comprendiendo los procedimientos administrar a un sujeto necesitado una célula que expresa CAR de mesotelioma de la divulgación que se une a la célula que expresa mesotelina. En un aspecto, el sujeto es un humano.

La divulgación proporciona procedimientos para prevenir la recaída del cáncer asociado con células que expresan mesotelina, comprendiendo los procedimientos administrar a un sujeto que lo necesita una célula que expresa mesotelina CAR de la divulgación que se une a la célula que expresa mesotelina. En otra realización, los procedimientos comprenden administrar al sujeto que lo necesita una cantidad efectiva de una célula que expresa mesotelina CAR de la divulgación que se une a la célula que expresa mesotelina en combinación con una cantidad efectiva de otra terapia.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un vector que comprende una secuencia que codifica una mesotelina CAR operablemente enlazado a un promotor para su expresión en células efectoras inmunitarias de mamíferos. En un aspecto, la divulgación proporciona una célula efectora inmune recombinante que expresa la mesotelina CAR para su uso en el tratamiento de tumores que expresan mesotelina. En un aspecto, la célula que expresa la mesotelina CAR de la divulgación es capaz de ponerse en contacto con una célula tumoral con al menos un mesotelina CAR de la divulgación expresado en su superficie, de manera que la célula que expresa la mesotelina CAR se activa en respuesta al antígeno y la célula que expresa la CAR se dirige a la célula cancerosa y se inhibe el crecimiento del cáncer.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un procedimiento para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa que expresa mesotelina, que comprende el contacto de la célula tumoral con una célula que expresa mesotelina CAR de, de manera que la célula que expresa CAR se activa en respuesta al antígeno y se dirige a la célula cancerosa, en la que se inhibe el crecimiento del cáncer. En un aspecto, el CART activado se dirige a la célula cancerosa y la destruye.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un procedimiento para tratar el cáncer en un sujeto. El procedimiento comprende la administración al sujeto de una célula que expresa mesotelina CAR, de manera que se trata el cáncer en el sujeto. Un ejemplo de un cáncer que es tratable por la célula que expresa mesotelina CAR de la divulgación es un cáncer asociado con la expresión de mesotelina. En un aspecto, el cáncer asociado con la expresión de mesotelina se selecciona entre el mesotelioma, el cáncer de páncreas, el cáncer de ovario y el cáncer de pulmón.

La divulgación incluye un tipo de terapia celular en la que las células efectoras inmunitarias, por ejemplo, las células T o las células NK, se modifican genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) y la célula que expresa el CAR se infunde a un receptor que lo necesita. La célula infundida es capaz de destruir las células tumorales del receptor. A diferencia de las terapias con anticuerpos, las células inmunitarias efectoras modificadas con CAR son capaces de replicarse in vivo, lo que da lugar a una persistencia a largo plazo que puede conducir a un control sostenido del tumor. En diversos aspectos, las células administradas al paciente, o su progenie, persisten en el paciente durante al menos cuatro meses, cinco meses, seis meses, siete meses, ocho meses, nueve meses, diez meses, once meses, doce meses, trece meses, catorce meses, quince meses, dieciséis meses, diecisiete meses, dieciocho meses, diecinueve meses, veinte meses, veintiún meses, veintidós meses, veintitrés meses, dos años, tres años, cuatro años o cinco años después de la administración de la célula al paciente.

La divulgación también incluye un tipo de terapia celular en la que las células efectoras inmunitarias se modifican, por ejemplo, mediante ARN transcrito in vitro, para expresar transitoriamente un receptor de antígeno quimérico (CAR) y la célula que expresa el CAR se infunde a un receptor que lo necesita. La célula infundida es capaz de destruir las células cancerosas del receptor. Así, en diversos aspectos, las células administradas al paciente están presentes durante menos de un mes, por ejemplo, tres semanas, dos semanas, una semana, después de la administración de la célula al paciente.

Sin querer estar limitado por ninguna teoría en particular, la respuesta inmunitaria anticancerosa provocada por las células efectoras inmunitarias modificadas con CAR puede ser una respuesta inmunitaria activa o pasiva, o alternativamente puede deberse a una respuesta inmunitaria directa o indirecta. En un aspecto, las células T transducidas con CAR presentan una secreción específica de citoquinas proinflamatorias y una potente actividad citolítica en respuesta a las células cancerosas humanas que expresan mesotelina, y median en la muerte de los transeúntes y en la regresión de un tumor humano establecido. Por ejemplo, las células tumorales sin antígeno dentro de un campo heterogéneo de tumor con expresión de mesotelina pueden ser susceptibles de ser destruidas indirectamente por las células T redirigidas por la mesotelina que ha reaccionado previamente contra las células cancerosas adyacentes con antígeno positivo.

En un aspecto, las células efectoras inmunitarias modificadas con CAR totalmente humanas de la divulgación pueden ser un tipo de vacuna para inmunización ex vivo y/o terapia in vivo en un mamífero. En un aspecto, el mamífero es un humano.

Con respecto a la inmunización ex vivo, al menos una de las siguientes acciones ocurre in vitro antes de administrar la célula a un mamífero: i) expansión de las células, ii) introducción de un ácido nucleico que codifica un CAR a las células o iii) criopreservación de las células.

Los procedimientos ex vivo son bien conocidos en la técnica y se discuten más ampliamente a continuación. Brevemente, las células se aíslan de un mamífero (por ejemplo, un humano) y se modifican genéticamente (es decir, se transducen o transfectan in vitro) con un vector que expresa un CAR divulgado en el presente documento. La célula modificada con CAR puede administrarse a un receptor mamífero para proporcionar un beneficio terapéutico. El receptor mamífero puede ser un humano y la célula modificada con ^cA ^rpuede ser autóloga con respecto al receptor. Alternativamente, las células pueden ser alogénicas, singénicas o xenogénicas con respecto al receptor.

El procedimiento para la expansión ex vivo de células madre y progenitoras hematopoyéticas se describe en Pat. de EE. UU No. 5,199,942puede aplicarse a las células de la presente divulgación. Se conocen otros procedimientos adecuados en la técnica, por lo que la presente divulgación no se limita a ningún procedimiento particular de expansión ex vivo de las células. Brevemente, el cultivo y la expansión ex vivo de células T comprende: (1) recoger células madre y progenitoras hematopoyéticas CD34+ de un mamífero a partir de una cosecha de sangre periférica o de explantes de médula ósea; y (2) expandir dichas células ex vivo. Además de los factores de crecimiento celular descritos en Pat. de EE.UU. No. 5,199,942en el caso de las células de la familia de la diabetes, se pueden utilizar otros factores, tales como flt3-L, IL-1, IL-3 y ligando c-kit, para el cultivo y la expansión de las células.

Además de utilizar una vacuna con base en células en términos de inmunización ex vivo, la presente divulgación también proporciona composiciones y procedimientos para la inmunización in vivo para provocar una respuesta inmune dirigida contra un antígeno en un paciente.

En general, las células activadas y expandidas como se describe en el presente documento pueden utilizarse en el tratamiento y la prevención de enfermedades que surgen en individuos que están inmunocomprometidos. En particular, las células efectoras inmunes modificadas con CAR de la divulgación se utilizan en el tratamiento de enfermedades, trastornos y condiciones asociadas con la expresión de mesotelina. En ciertos aspectos, las células de la divulgación se utilizan en el tratamiento de pacientes con riesgo de desarrollar enfermedades, trastornos y condiciones asociadas con la expresión de mesotelina. Así, la divulgación proporciona procedimientos para el tratamiento o la prevención de enfermedades, trastornos y condiciones asociadas con la expresión de mesotelina que comprenden la administración a un sujeto que lo necesita, de una cantidad terapéuticamente eficaz de las células T modificadas con CAR de la divulgación.

Las células T modificadas con CAR de la presente divulgación pueden administrarse solas o como una composición farmacéutica en combinación con diluyentes y/o con otros componentes como IL-2 u otras citocinas o poblaciones celulares.

La presente divulgación también proporciona procedimientos para inhibir la proliferación o reducir una población de células que expresan mesotelina, comprendiendo los procedimientos el contacto de una población de células que comprenden una célula que expresa mesotelina con una célula que expresa mesotelina CAR (, por ejemplo, un CART de mesotelina también referido como "CART-MSLN") de la divulgación que se une a la célula que expresa mesotelina. En un aspecto específico, la divulgación proporciona procedimientos para inhibir la proliferación o reducir la población de células cancerosas que expresan mesotelina, comprendiendo los procedimientos el contacto de la población de células cancerosas que expresan mesotelina con una célula que expresa mesotelina CAR de la divulgación que se une a la célula que expresa mesotelina. En un aspecto, la presente divulgación proporciona procedimientos para inhibir la proliferación o reducir la población de células cancerosas que expresan mesotelina, comprendiendo los procedimientos el contacto de la población de células cancerosas que expresan mesotelina con una célula que expresa mesotelina CAR de la divulgación que se une a la célula que expresa mesotelina. En ciertos aspectos, la célula que expresa mesotelina CAR de la divulgación reduce la cantidad, el número, la cantidad o el porcentaje de células y/o células cancerosas en al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 95 %, o al menos aproximadamente 99 % en un sujeto con o modelo animal para mesotelioma u otro cáncer asociado con células que expresan mesotelina en relación con un control negativo. En un aspecto, el sujeto es un humano.

La presente divulgación también proporciona procedimientos para prevenir, tratar y/o manejar una enfermedad asociada con células que expresan mesotelina (por ejemplo, mesotelioma), comprendiendo los procedimientos administrar a un sujeto necesitado una célula que expresa mesotelina CAR de la divulgación que se une a la célula que expresa mesotelina. En un aspecto, el sujeto es un humano.

La presente divulgación proporciona procedimientos para prevenir la recaída del cáncer asociado con células que expresan mesotelina, comprendiendo los procedimientos administrar a un sujeto que lo necesita una célula que expresa mesotelina CAR de la divulgación que se une a la célula que expresa mesotelina. En un aspecto, los procedimientos comprenden administrar al sujeto que lo necesita una cantidad efectiva de una célula que expresa mesotelina CAR de la divulgación que se une a la célula que expresa mesotelina en combinación con una cantidad efectiva de otra terapia.

Terapias combinadas

Una célula que expresa CAR descrita en el presente documento puede utilizarse en combinación con otros agentes y terapias conocidos. Administrado "en combinación", como se utiliza en el presente documento, significa que dos (o más) tratamientos diferentes se administran al sujeto durante el curso de la afección del sujeto con el trastorno, por ejemplo, los dos o más tratamientos se administran después de que el sujeto haya sido diagnosticado con el trastorno y antes de que el trastorno haya sido curado o eliminado o el tratamiento haya cesado por otras razones. En algunas realizaciones, la entrega de un tratamiento todavía está ocurriendo cuando la entrega del segundo comienza, de modo que hay superposición en términos de administración. Esto se denomina a veces "administración simultáneo" o "concurrente". En otras realizaciones, la administración de un tratamiento termina antes de que comience la entrega del otro tratamiento. En algunas realizaciones de cualquiera de los casos, el tratamiento es más eficaz debido a la administración combinada. Por ejemplo, el segundo tratamiento es más eficaz, por ejemplo, se observa un efecto equivalente con menos cantidad del segundo tratamiento, o el segundo tratamiento reduce los síntomas en mayor medida, de lo que se observaría si el segundo tratamiento se administrara en ausencia del primer tratamiento, o la situación análoga se observa con el primer tratamiento. En algunas realizaciones, la administración es tal que la reducción de un síntoma u otro parámetro relacionado con el trastorno es mayor que la que se observaría con un tratamiento administrado en ausencia del otro. El efecto de los dos tratamientos puede ser parcialmente aditivo, totalmente aditivo o mayor que aditivo. La administración puede ser tal que un efecto del primer tratamiento administrado es todavía detectable cuando se administra el segundo.

Una célula que expresa CAR descrita en el presente documento y el al menos un agente terapéutico adicional pueden ser administrados simultáneamente, en la misma o en composiciones separadas, o secuencialmente. Para la administración secuencial, la célula que expresa CAR descrita en el presente documento puede administrarse en primer lugar, y el agente adicional puede administrarse en segundo lugar, o el orden de administración puede invertirse.

En otros aspectos, una célula que expresa CAR descrita en el presente documento puede utilizarse en un régimen de tratamiento en combinación con cirugía, quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos, u otros agentes inmunoablativos tales como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias de anticuerpos, citoxina, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, citoquinas e irradiación. vacuna peptídica, tal como la descrita en Izumoto et al.

2008 J Neurosurg 108:963-971.

En una realización, una célula que expresa CAR descrita en el presente documento puede utilizarse en combinación con un agente quimioterapéutico. Los agentes quimioterapéuticos ejemplares incluyen una antraciclina (por ejemplo, doxorrubicina (por ejemplo, doxorrubicina liposomal)), un alcaloide de vinca (por ejemplo, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina), un agente alquilante (por ejemplo, ciclofosfamida, decarbazina, melfalán, ifosfamida, temozolomida), un anticuerpo de células inmunitarias (por ejemplo, alemtuzamab, gemtuzumab, rituximab, tositumomab), un antimetabolito (incluyendo, por ejemplo, antagonistas del ácido fólico, análogos de la pirimidina, análogos de la purina e inhibidores de la adenosina deaminasa (por ejemplo, fludarabina)), un inhibidor de mTOR, un agonista de la proteína relacionada con TNFR inducido por glucocorticoides (GITR), un inhibidor del proteasoma (por ejemplo, aclacinomicina A, gliotoxina o bortezomib), un inmunomodulador tal como la talidomida o un derivado de la talidomida (por ejemplo, lenalidomida).

Los agentes quimioterapéuticos generales considerados para su uso en terapias combinadas incluyen anastrozol (Arimidex®), bicalutamida (Casodex®), sulfato de bleomicina (Blenoxane®), busulfán (Myleran®) busulfán inyectable (Busulfex®), capecitabina (Xeloda®), N4-pentoxicarbonil-5-deoxi-5-fluorocitidina, carboplatino (Paraplatin®), carmustina (BiCNU®), clorambucil (Leukeran®), cisplatino (Platinol®), cladribina (Leustatin®), ciclofosfamida (Cytoxan® o Neosar®), citarabina, arabinósido de citosina (Cytosar-U®), inyección liposomal de citarabina (DepoCyt®), dacarbazina (DTIC-Dome®), dactinomicina (Actinomycin D, Cosmegan), clorhidrato de daunorrubicina (Cerubidine®), inyección liposomal de citrato de daunorrubicina (DaunoXome®), dexametasona, docetaxel (Taxotere®), clorhidrato de doxorrubicina (Adriamycin®, Rubex®), etopósido (Vepesid®), fosfato de fludarabina (Fludara®), 5-fluorouracilo (Adrucil®, Efudex®), flutamida (Eulexin®), tezacitibina, Gemcitabina (difluorodeoxicitidina), hidroxiurea (Hydrea®), Idarubicina (Idamycin®), ifosfamida (IFEX®), irinotecán (Camptosar®), L-asparaginasa (ELSPAR®), leucovorina cálcica, melfalán (Alkeran®), 6-mercaptopurina (Purinethol®), metotrexato (Folex®), mitoxantrona (Novantrone®), mylotarg, paclitaxel (Taxol®), phoenix (Yttrium90/MX-DTPA), pentostatina, polifeprosan 20 con implante de carmustina (Gliadel®), citrato de tamoxifeno (Nolvadex®), teniposida (Vumon®), 6-tioguanina, tiotepa, tirapazamina (Tirazone®), clorhidrato de topotecán inyectable (Hycamptin®), vinblastina (Velban®), vincristina (Oncovin®) y vinorelbina (Navelbine®).

Los agentes alquilantes ejemplares incluyen, sin limitación, mostazas nitrogenadas, derivados de etilenimina, alquilsulfonatos, nitrosoureas y triazenos): mostaza de uracilo (Aminouracil Mustard®, Chlorethaminacil®, Demethyldopan®, Desmethyldopan®, Haemanthamine®, Nordopan®, Uracil nitrogen mustard®, Uracillost®, Uracilmostaza®, Uramustin®, Uramustine®), clormetina (Mustargen®), ciclofosfamida (Cytoxan®, Neosar®, Clafen®, Endoxan®, Procytox®, Revimmune™), ifosfamida (Mitoxana®) melfalán (Alkeran®), clorambucil (Leukeran®), pipobromán (Amedel®, Vercyte®), trietilenemelamina (Hemel®, Hexalen®, Hexastat®), trietilentiofosforamina, Temozolomida (Temodar®), tiotepa (Thioplex®), busulfán (Busilvex®, Myleran®), carmustina (BiCNU®), lomustina (CeeNU®), estreptozocina (Zanosar®) y dacarbazina (DTIC-Dome®). Otros agentes alquilantes ejemplares incluyen, sin limitación, oxaliplatino (Eloxatin®); temozolomida (Temodar® y Temodal®); dactinomicina (también conocida como actinomicina-D, Cosmegen®); melfalán (también conocido como L-PAM, L-sarcolysin y mostaza de fenilalanina, Alkeran®); altretamina (también conocida como hexametilmelamina (HMM), Hexalen®); carmustina (BiCNU®); bendamustina (Treanda®); busulfán (Busulfex® y Myleran®); carboplatino (Paraplatin®); lomustina (también conocida como CCNU, CeeNU®); cisplatino (también conocido como CDDP, Platinol® y Platinol®-AQ); clorambucil (Leukeran®); ciclofosfamida (Cytoxan® y Neosar®); dacarbazina (también conocida como DTIC, DIC e imidazol carboxamida, DTIC-Dome®); altretamina (también conocida como hexametilmelamina (HMM), Hexalen®); Ifosfamida (Ifex®); prednumustina; procarbazina (Matulane®); mecloretamina (también conocida como mostaza nitrogenada, mustina y clorhidrato de mecloretamina, Mustargen®); estreptozocina (Zanosar®); tiotepa (también conocida como tiofosfoamida, TESPA y TSPA, Thioplex®); ciclofosfamida (Endoxan®, Cytoxan®, Neosar®, Procytox®, Revimmune®); y bendamustina HCl (Treanda®).

Los inhibidores de mTOR ejemplares incluyen, por ejemplo temsirolimus; ridaforolimus (formalmente conocido como deferolimus, (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2 [(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R, 23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-dihidroxi-19,30-dimetoxi-15,17,21,23,29,35-hexametil-2,3,10,14,20-pentaoxo-11,36-dioxa-4-azatricyclo[30.3.1.049] hexatriaconta-16,24,26,28-tetraen-12-il]propil]-2-metoxiciclohexil dimetilfosfinato, también conocido como AP23573 y MK8669, y descrito en Publicación PCT No. WO 03/064383); everolimus (Afinitor® o RAD001); rapamicina (AY22989, Sirolimus®); simapimod (CAS 164301-51-3); emsirolimus, (5-{2,4-Bis[(3S)-3-metilmorfolina-4-il]pirido[2,3-d]pirimidina-7-il}-2-metoxifenil)metanol (AZD8055); 2-Amino-8-/frans-4-(2-hidroxietoxi)ciclohexil]-6-(6-metoxi-3-piridinil)-4-metilpirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (PF04691502, CAS 1013101-36-4); y N2-[1,4-dioxo-4-[[4-(4-oxo-8-fenil-4H-1-benzop/ran-2-//)morfol¡n¡o-4-¡l]metox¡]but¡l]-L-arg¡n¡lgl¡cil-L-a-aspart¡1L-ser¡na-, sal interior (SF1126, CAS 936487-67 1), y XL765.

Los inmunomoduladores ejemplares incluyen, por ejemplo, afutuzumab (disponible en Roche®); pegfilgrastim (Neulasta®); lenalidomida (CC-5013, Revlimid®); talidomida (Thalomid®), actimid (CC4047); e IrX-2 (mezcla de citoquinas humanas que incluye interleucina 1, interleucina 2 e interferón y, CAS 951209-71-5disponible en IRX Therapeutics).

Las antraciclinas ejemplares incluyen, por ejemplo doxorrubicina (Adriamycin® y Rubex®); bleomicina (lenoxane®); daunorrubicina (clorhidrato de dauorubicina, daunomicina y clorhidrato de rubidomicina, Cerubidine®); daunorrubicina liposomal (citrato de daunorrubicina liposomal, DaunoXome®); mitoxantrona (DHAD, Novantrone®); epirubicina (Ellence™); idarubicina (Idamycin®, Idamycin PFS®); mitomicina C (Mutamycin®); geldanamicina; herbimicina; ravidomicina; y desacetilravidomicina.

Los alcaloides de vinca ejemplares incluyen, por ejemplo, tartrato de vinorelbina (Navelbine®), vincristina (Oncovin®) y vindesina (Eldisine®)); vinblastina (también conocida como sulfato de vinblastina, vincaleukoblastina y VLB, Alkaban-AQ® y Velban®); y vinorelbina (Navelbine®).

Los inhibidores del proteosoma ejemplares incluyen bortezomib (Velcade®) carfilzomib (PX-171-007,('S)-4-Metil-N-((S)-1-((('S)-4-metil-1-(('R)-2-metiloxiran-2-il)-1-oxopentan-2-il)amino)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il)-2-(('S)-2-(2-morfolinoacetamido)-4-fenilbutanamido)-pentanamida); marizomib (NPI-0052); citrato de ixazomib (MLN-9708); delanzomib (CEP-18770); y 0-mef//-W-[(2-metil-5-tiazolil)carbonil]-L-seril-N-[(1S)-2-[(2R)-2-metil-2-oxiranil]-2-oxo-1-(fenilmetil)etil]-L-serinamida (ONX-0912).

En una realización, una célula que expresa CAR descrita en el presente documento se administra a un sujeto en combinación con una molécula dirigida al GITR y/o que modula las funciones del GITR, tales como un agonista del GITR y/o un anticuerpo del GITR que agota las células T reguladoras (Tregs). En una realización, las moléculas de unión a GITR y/o las moléculas que modulan las funciones de GITR (por ejemplo, agonistas de GITR y/o anticuerpos GITR reductores de Treg) se administran antes de la célula que expresa CAR. Por ejemplo, en una realización, el agonista GITR puede administrarse antes de la aféresis de las células. Los agonistas de GITR ejemplares incluyen, por ejemplo, proteínas de fusión de GITR y anticuerpos anti-GITR (por ejemplo, anticuerpos bivalentes anti-GITR) tales como, por ejemplo, una proteína de fusión de GITR descrita en Patente de EE.UU. No.: 6,111,090, Patente Europea No.: 090505B1, Patente de EE.UU. n°: 8,586,023, Publicación PCT Nos.: WO 2010/003118 y 2011/090754o un anticuerpo anti-GITR descrito, por ejemplo, en Patente de EE. UU No: 7,025,962, Patente Europea No.: 1947183B1, Patente de EE. UU No: 7,812,135, Patente de EE.UU. No.: 8,388,967, Patente de EE.UU. No.: 8,591,886, Patente Europea No.: EP 1866339, Publicación PCT No.: WO 2011/028683, Publicación PCT No. :WO 2013/039954, Publicación PCT No.: W02005/007190, Publicación PCT No.: WO 2007/133822, Publicación PCT No.: WO2005/055808, Publicación PCT No.: WO 99/40196, Publicación PCT No.: WO 2001/03720, Publicación PCT No.: WO99/20758, Publicación PCT No.: WO2006/083289, Publicación PCT No.: WO 2005/115451, Patente de EE.UU. No.: 7,618,632y Publicación PCT No.: WO 2011/051726.

En una realización, una célula que expresa CAR descrita en el presente documento se administra a un sujeto en combinación con un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor de mTOR descrito en el presente documento, por ejemplo, un rapálogo tal como everolimus. En una realización, el inhibidor de mTOR se administra antes de la célula que expresa CAR. Por ejemplo, en una realización, el inhibidor de mTOR puede administrarse antes de la aféresis de las células.

En una realización, una célula que expresa CAR descrita en el presente documento se administra a un sujeto en combinación con un agonista GITR, por ejemplo, un agonista GITR descrito en el presente documento. En una realización, el agonista del GITR se administra antes de la célula que expresa CAR. Por ejemplo, en una realización, el agonista GITR puede administrarse antes de la aféresis de las células.

En una realización, una célula que expresa CAR descrita en el presente documento se administra a un sujeto en combinación con un inhibidor de la proteína tirosina fosfatasa, por ejemplo, un inhibidor de la proteína tirosina fosfatasa descrito en el presente documento. En una realización, el inhibidor de la proteína tirosina fosfatasa es un inhibidor de SHP-1, por ejemplo, un inhibidor de SHP-1 descrito en el presente documento, tal como, por ejemplo, estibogluconato de sodio. En una realización, el inhibidor de la proteína tirosina fosfatasa es un inhibidor de SHP-2, por ejemplo, un inhibidor de SHP-2 descrito en el presente documento.

En una realización, una célula que expresa CAR descrita en el presente documento puede utilizarse en combinación con un inhibidor de quinasa. En una realización, el inhibidor de quinasa es un inhibidor de CDK4, por ejemplo, un inhibidor de CDK4 descrito en el presente documento, por ejemplo, un inhibidor de CDK4/6, tal como, por ejemplo 6-Acetil-8-ciclopentil-5-metil-2-(5-piperazin-1-il-piridin-2-ilamino)-8H-pirido[2,3-d]pirimidin-7-ona, clorhidrato (también denominado palbociclib o PD0332991). En una realización, el inhibidor de la quinasa es un inhibidor de BTK, por ejemplo, un inhibidor de BTK descrito en el presente documento, tal como, por ejemplo, ibrutinib. En una realización, el inhibidor de la quinasa es un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor de mTOR descrito en el presente documento, tal como, por ejemplo, rapamicina, un análogo de rapamicina, OSI-027. El inhibidor de mTOR puede ser, por ejemplo, un inhibidor de mTORC1 y/o un inhibidor de mTORC2, por ejemplo, un inhibidor de mTORC1 y/o un inhibidor de mTORC2 descritos en el presente documento. En una realización, el inhibidor de la quinasa es un inhibidor de MNK, por ejemplo, un inhibidor de MNK descrito en el presente documento, tal como, por ejemplo, 4-amino-5-(4-fluoroanilino)-pirazolo [3,4-d] pirimidina. El inhibidor de MNK puede ser, por ejemplo, un inhibidor de MNK1a, MNK1b, MNK2a y/o MNK2b. En una realización, el inhibidor de la quinasa es un inhibidor dual PI3K/mTOR descrito en el presente documento, tal como, por ejemplo, PF-04695102. En una realización, el inhibidor de quinasa es un inhibidor de DGK, por ejemplo, un inhibidor de DGK descrito en el presente documento, tal como, por ejemplo, DGKinh1 (D5919) o DGKinh2 (D5794).

En una realización, el inhibidor de la quinasa es un inhibidor de CDK4 seleccionado entre aloisina A; flavopiridol o HMR-1275, 2-(2-clorofenil)-5,7-dihidroxi-8-[(3S,4R)-3-hidroxi-1-metil-4-piperidinil]-4-cromenona; crizotinib (PF-02341066; 2-(2-clorofeniel)-5,7-dihidroxi-8-[(2R,3S)-2-(hidroximetil)-1-metil-3-pirrolidinil]-4H-7-6enzop/ran-4-ona, clorhidrato (P276-00); 1-metil-5-[[2-[5-(trifluorometil)-1H-imidazol-2-il]-4-piridinil]oxi]-N-[4-(trifluorometil)fenil]-1H benzimidazol-2-amina (RAF265); indisulam (E7070); roscovitina (CYC202); palbociclib (PD0332991); dinaciclib (SCH727965); N-[5-[[(5-terf-duf//oxazo/-2-//)metil]thio]tiazol-2-yl]piperidina-4-carboxamida (BMS 387032); ácido 4-[[9-cloro-7-(2,6-difluorofenil)-5H-p/r/m/do[5,4-d][2]benzazepin-2-il]amino]-benzóico (MLN8054); 5-[3-(4,6-difluoro-1H-benzimidazol-2-il)-1H-indazol-5-il]-N-etil-4-metil-3-piridinemetanamina (AG-024322); ácido N-(piperidin-4-il)amida 4-(2,6-didorobenzoilamino)-1H-pirazol-3-carboxílico (AT7519); 4-[2-metil-1-(1-metiletil)-1H-imidazol-5-il]-N-[4-(metilsulfonil)fenil]- 2-pirimidinamina (AZD5438); y XL281 (BMS908662).

En una realización, el inhibidor de la cinasa es un inhibidor de CDK4, por ejemplo, palbociclib (PD0332991), y el palbociclib se administra a una dosis de aproximadamente 50 mg, 60 mg, 70 mg, 75 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 105 mg, 110 mg, 115 mg, 120 mg, 125 mg, 130 mg, 135 mg (por ejemplo, 75 mg, 100 mg o 125 mg) diariamente durante un periodo de tiempo, por ejemplo, diariamente durante 14-21 días de un ciclo de 28 días, o diariamente durante 7-12 días de un ciclo de 21 días. En una realización, se administran 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más ciclos de palbociclib.

En una realización, el inhibidor de la quinasa es un inhibidor de BTK seleccionado entre ibrutinib (PCI-32765); GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; y LFM-A13. En una realización preferida, el inhibidor de BTK no reduce ni inhibe la actividad quinasa de la quinasa inducible por interleucina-2 (ITK), y se selecciona entre GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; y LFM-A13.

En una realización, el inhibidor de la quinasa es un inhibidor de BTK, por ejemplo, ibrutinib (PCI-32765), y ibrutinib se administra a una dosis de aproximadamente 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 420 mg, 440 mg, 460 mg, 480 mg, 500 mg, 520 mg, 540 mg, 560 mg, 580 mg, 600 mg (por ejemplo, 250 mg, 420 mg o 560 mg) diariamente durante un período de tiempo, por ejemplo, diariamente durante un ciclo de 21 días, o diariamente durante un ciclo de 28 días. En una realización, se administran 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más ciclos de ibrutinib.

En una realización, el inhibidor de la quinasa es un inhibidor de mTOR seleccionado entre temsirolimus ridaforolimus (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2 [(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R, 23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-dihidroxi-19,30-dimetoxi-15,17,21,23,29,35-hexametil-2,3,10,14,20-pentaoxo-11,36-dioxa-4-azatridclo[30.3.1.049] hexatriaconta-16,24,26,28-tetraen-12-il]propil]-2-metoxiciclohexil dimetilfosfinato, también conocido como Ap23573 y MK8669; everolimus (RAD001) rapamicina (AY22989); simapimod; (5-{2,4-bis[(3S)-3-metilmorfolina-4-il]pirido[2,3-d]pirimidina-7-il}-2-metoxifenil)metanol (AZD8055); 2-amino-8-/frans-4-(2-hidroxietoxi)ciclohexil]-6-(6-metooxi-3-piridinil)-4-metilpirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (PF04691502); y W2-[1,4-dioxo-4-[[4-(4-oxo-8-fenil-4H-1-benzopirano-2-il)morfolino-4-il]metoxi]butil]-L-arginilglicina-L-a-aspartilL-serina-(SEQ ID NO: 272), sal interior (SF1126); y XL765.

En una realización, el inhibidor de la quinasa es un inhibidor de mTOR, por ejemplo, rapamicina, y la rapamicina se administra a una dosis de aproximadamente 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg (por ejemplo, 6 mg) diariamente durante un período de tiempo, por ejemplo, diariamente durante un ciclo de 21 días, o diariamente durante un ciclo de 28 días. En una realización, se administran 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más ciclos de rapamicina. En una realización, el inhibidor de la quinasa es un inhibidor de mTOR, por ejemplo, everolimus y el everolimus se administra a una dosis de aproximadamente 2 mg, 2,5 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg (por ejemplo, 10 mg) diariamente durante un período de tiempo, por ejemplo, diariamente durante un ciclo de 28 días. En una realización, se administran 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más ciclos de everolimus.

En una realización, el inhibidor de la quinasa es un inhibidor de MNK seleccionado de CGP052088; 4-amino-3-(pfluorofenilamino)-pirazolo [3,4-d] pirimidina (CGP57380); cercosporamida; ETC-1780445-2; y 4-amino-5-(4-fluoroanilino)-pirazolo [3,4-d] pirimidina.

En una realización, el inhibidor de quinasa es un inhibidor dual de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) y mTOR seleccionado de 2-Amino-8-/frans-4-(2-hidroxietoxi)ciclohexil]-6-(6-metoxi-3-piridinil)-4-metil-pirimidina-7(8H)-ona (PF-04691502); W-[4-[[4-(Dimetilamino)-1-piperidinil]carbonil]fenil]-W-[4-(4,6-di-4-morfolinil-1,3,5-triazin-2-il)fenil]urea (PF-05212384, PKI-587); 2-metil-2-{4-[3-metil-2-oxo-8-(quinolin-3-il)-2,3-dh/dro-1H-/m/dazo[4,5-c]quinolin-1-il]fenyl}propanonitrilo (BEZ-235); apitolisib (^gD^c-0980, RG7422); 2,4-Difluoro-N-{2-(metiloxy)-5-[4-(4-piridazinil)-6-quinolinil]-3-piridinil}benzenosulfonamida (GSK2126458); 8-(6-metoxipiridin-3-il)-3-metil-1-(4-(piperazin-1-il)-3-(trifluorometil)fenil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2(3H)-ona Ácido maleico (NVP-BGt 226);3-[4-(4-Morfolinilpirido[3',2':4,5]furo[3,2-d]pirimidin-2-il]fenol(PI-103); 5-(9-isopropil-8-metil-2-morfolino-9H-purin-6-yl)pirimidin-2-amina (VS-5584, SB2343); y N-[2-[(3,5-Dimetoxifenil)amino]quinoxalina-3-il]-4-[(4-metil-3-metoxifenil)carbonil]aminofenilsulfonamida (XL765).

También puede utilizarse fármacos que inhiben ya sea la fosfatasa dependiente del calcio calcineurina (ciclosporina y FK506) o inhiben la quinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por el factor de crecimiento (rapamicina). (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991 Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993) . En otro aspecto, las composiciones celulares de la presente divulgación pueden administrarse a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después) un trasplante de médula ósea, una terapia ablativa de células T con agentes quimioterapéuticos como la fludarabina, la radioterapia de haz externo (XRT), la ciclofosfamida, y/o anticuerpos tales como OKT3 o CAMPATH. En un aspecto, las composiciones celulares de la presente divulgación se administran tras una terapia ablativa de células B, tal como los agentes que reaccionan con CD20, por ejemplo, Rituxan. Por ejemplo, en una realización, los sujetos pueden someterse a un tratamiento estándar con altas dosis de quimioterapia seguido de un trasplante de células madre de sangre periférica. En ciertas realizaciones, tras el trasplante, los sujetos reciben una infusión de las células inmunitarias expandidas de la presente divulgación. En una realización adicional, las células expandidas se administran antes o después de la cirugía.

En una realización, se puede administrar al sujeto un agente que reduce o mejora un efecto secundario asociado con la administración de una célula que expresa CAR. Los efectos secundarios asociados con la administración de una célula que exprese CAR incluyen, pero no se limitan a, CRS y la linfohistiocitosis hemofagocítica (HLH), también denominada Síndrome de Activación de Macrófagos (MAS). Los síntomas del CRS incluyen fiebres altas, náuseas, hipotensión transitoria, hipoxia, etc. El CRS puede incluir signos y síntomas clínicos constitucionales tales como fiebre, fatiga, anorexia, mialgias, artralgias, náuseas, vómitos y dolor de cabeza. El CRS puede incluir signos y síntomas clínicos en la piel, tal como la erupción. El CRS puede incluir signos y síntomas gastrointestinales clínicos tales como náuseas, vómitos y diarrea. El CRS puede incluir signos y síntomas respiratorios clínicos tales como taquipnea e hipoxemia. El CRS puede incluir signos y síntomas clínicos cardiovasculares tales como taquicardia, aumento de la presión del pulso, hipotensión, aumento del gasto cardíaco (temprano) y potencialmente disminución del gasto cardíaco (tardío). El CRS puede incluir signos y síntomas clínicos de coagulación, tales como elevación del dímero d, hipofibrinogenemia con o sin hemorragia. El CRS puede incluir signos y síntomas renales clínicos tales como la azotemia. El CRS puede incluir signos y síntomas clínicos hepáticos tales como la transaminitis y la hiperbilirrubinemia. El CRS puede incluir signos y síntomas neurológicos clínicos tales como cefalea, cambios en el estado mental, confusión, delirio, dificultad para encontrar palabras o afasia franca, alucinaciones, temblor, timetría, alteración de la marcha y convulsiones.

En consecuencia, los procedimientos descritos en el presente documento pueden comprender la administración de una célula que expresa CAR descrita en el presente documento a un sujeto y la administración adicional de uno o más agentes para manejar los niveles elevados de un factor soluble resultante del tratamiento con una célula que expresa CAR. En una realización, el factor soluble elevado en el sujeto es uno o más de IFN-y, TNFa, IL-2 e lL-6. En una realización, el factor elevado en el sujeto es uno o más de lL-1, GM-CSF, IL-10, IL-8, IL-5 y fraktalkina. Por lo tanto, un agente administrado para tratar este efecto secundario puede ser un agente que neutralice uno o más de estos factores solubles. En una realización, el agente que neutraliza una o más de estas formas solubles es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Los ejemplos de tales agentes incluyen, pero no se limitan a un esteroide (por ejemplo, corticosteroide), un inhibidor de TNFa, y un inhibidor de IL-6. Un ejemplo de inhibidor del TNFa es una molécula de anticuerpo anti-TNFa tal como, infliximab, adalimumab, certolizumab pegol y golimumab. Otro ejemplo de inhibidor del TNFa es una proteína de fusión tal como el entanercept. Los inhibidores de moléculas pequeñas del TNFa incluyen, pero no se limitan a, los derivados de xantina (por ejemplo, pentoxifilina) y bupropión. Un ejemplo de inhibidor de IL-6 es una molécula de anticuerpo anti-Il-6 o una molécula de anticuerpo antireceptor de IL-6, tal como tocilizumab (toc), sarilumab, elsilimomab, CNTO 328, ALD518/BMS-945429, CNTO 136, CPSI-2364, CDP6038, VX30, ARGX-109, FE301 y FM101. En una realización, la molécula de anticuerpo anti-IL-6 es tocilizumab. Un ejemplo de inhibidor con base en IL-1R es la anakinra.

En alguna realización, el sujeto es administrado un corticosteroide, tal como, por ejemplo, metilprednisolona, hidrocortisona, entre otros.

En algunas realizaciones, se administra al sujeto un vasopresor, tal como, por ejemplo, norepinefrina, dopamina, fenilefrina, epinefrina, vasopresina o una combinación de las mismas.

En una realización, se puede administrar al sujeto un agente antipirético. En una realización, se puede administrar al sujeto un agente analgésico.

En una realización, se puede administrar al sujeto un agente que aumenta la actividad o la aptitud de una célula que expresa CAR. Por ejemplo, en una realización, el agente puede ser un agente que inhibe una molécula que modula o regula, por ejemplo, la función de las células T. En algunas realizaciones, la molécula que modula o regula la función de las células T es una molécula inhibidora. Las moléculas inhibidoras, por ejemplo, la Muerte Programada 1 (PD1), pueden, en algunas realizaciones, disminuir la capacidad de una célula que expresa CAR para montar una respuesta inmune efector. Algunos ejemplos de moléculas inhibidoras incluyen PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por ejemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 y TGFR beta. La inhibición de una molécula que modula o regula, por ejemplo, la función de las células T, por ejemplo, mediante la inhibición a nivel de ADN, ARN o proteínas, puede optimizar el rendimiento de una célula que expresa CAR. En las realizaciones, un agente, por ejemplo, un ácido nucleico inhibidor, por ejemplo, un ARNcd, por ejemplo, un ARNpi o ARNhc; o por ejemplo, una proteína o sistema inhibidor, por ejemplo, una repetición palindrómica corta agrupada y regularmente interespaciada (CRISPR), una nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción (TALEN), o una endonucleasa de dedo de zinc (ZFN), por ejemplo, como se describe en el presente documento, pueden utilizarse para inhibir la expresión de una molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T en la célula que expresa el CAR. En una realización, el agente es un ARNhc. En una realización, el agente que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T se inhibe dentro de una célula que expresa c A r . En estas realizaciones, una molécula de ARNcd que inhibe la expresión de una molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T está vinculada al ácido nucleico que codifica un componente, por ejemplo, todos los componentes, del CAR. En una realización, una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNcd que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T está operablemente enlazada a un promotor, por ejemplo, un promotor derivado de H1 o U6, de manera que la molécula de ARNcd que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T se expresa, por ejemplo, se expresa dentro de una célula que expresa CAR. Véase, por ejemplo Tiscornia G., "Development of Lentiviral Vectors Expressing siRNA", capítulo 3, en Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA (eds. Friedmann y Rossi). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EE. UU., 2007 Brummelkamp TR, et al. (2002) Science 296: 550-553; Miyagishi M, et al. (2002) Nat. Biotechnol. 19: 497-500. En una realización, la molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNd que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T está presente en el mismo vector, por ejemplo, un vector lentiviral, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un componente, por ejemplo, todos los componentes, del CAR. En dicha realización, la molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNcd que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T se sitúa en el vector, por ejemplo, el vector lentiviral, 5'- o 3'- al ácido nucleico que codifica un componente, por ejemplo, todos los componentes, del CAR. La molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNcd que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T puede transcribirse en la misma o diferente dirección que el ácido nucleico que codifica un componente, por ejemplo, todos los componentes, del CAR. En una realización, la molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNcd que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T está presente en un vector distinto del vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un componente, por ejemplo, todos los componentes, del CAR. En una realización, la molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNcd que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T se expresa transitoriamente dentro de una célula que expresa CAR. En una realización, la molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARNcd que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T se integra de forma estable en el genoma de una célula que expresa CAR. La Figura 47 muestra ejemplos de vectores para expresar un componente, por ejemplo, todos los componentes, del CAR con una molécula de ARNcd que inhibe la expresión de la molécula que modula o regula, por ejemplo, la función de las células T.

A continuación se proporcionan ejemplos de moléculas de ARNcd útiles para inhibir la expresión de una molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T, en la que la molécula que modula o regula, por ejemplo, inhibe, la función de las células T es PD-1.

En la Tabla 16 se presentan los nombres de los agentes de ARNi de PDCD1 (PD1) (derivados de su posición en la secuencia del gen PDCD1 de ratón NM_008798.2), junto con los SEQ ID NOs: 280-327 representando la secuencia de ADN. Tanto las secuencias en sentido (S) como en antisentido (AS) se presentan como secuencias de 19mer y 21mer en esta tabla. También hay que tener en cuenta que la posición (PoS, por ejemplo, 176) se deriva del número de posición en la secuencia del gen PDCD1 del ratón NM_008798.2. Las SEQ ID NOs se indican en grupos de 12 que se corresponden con los "sentido 19" SEQ ID NOs: 280-291; "sentido 21" SEQ ID NOs: 292-303; "antisentido 21" SEQ ID NOs: 304-315; "antisentido 19" SEQ ID NOs: 316-327.

En la Tabla 17 se presentan los nombres de los agentes de ARNi de PDCD1 (PD1) (derivados de su posición en la secuencia del gen PDCD1 humano, junto con las SEQ ID NOs. 323-370 representando la secuencia de ADN. Tanto las secuencias en sentido (S) como en antisentido (AS) se presentan como secuencias 19mer y 21 mer. Las SEQ ID NOs se indican en grupos de 12 que se corresponden con los "sentido 19" SEQ ID NOs: 328-339; "sentido 21" SEQ ID NOs: 340-351; "antisentido 21" SEQ ID NOs: 352-363; "antisentido 19" SEQ ID NOs: 364-375.

 En una realización, el inhibidor de una señal inhibidora puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a una molécula inhibidora. Por ejemplo, el agente puede ser un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a PD1, PD-L1, PD-L2 o CTLA4 (por ejemplo, ipilimumab (también denominado MDX-010 y MDX-101, y comercializado como Yervoy®; Bristol-Myers Squibb; Tremelimumab (anticuerpo monoclonal IgG2 disponible en Pfizer, antes conocido como ticilimumab, CP-675.206). En una realización, el agente es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a TIM3. En una realización, el agente es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a LAG3.

PD-1 es un miembro inhibidor de la familia de receptores CD28 que también incluye CD28, CTLA-4, ICOS y BTLA. PD-1 se expresa en las células B activadas, las células T y las células mieloides (Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75). Se ha demostrado que dos ligandos de PD-1, PD-L1 y PD-L2, regulan a la baja la activación de las células T al unirse a PD-1 (Freeman et a. 2000 J Exp Med 192:1027-34 Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8 Carter et al.

2002 Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1 es abundante en los cánceres humanos (Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314 Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094). La supresión inmunitaria puede revertirse inhibiendo la interacción local de PD-1 con PD-L1. Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y otros inhibidores de PD-1, PD-L1 y PD-L2 están disponibles en la técnica y pueden utilizarse en combinación con un CAR de la presente divulgación descrito en el presente documento. Por ejemplo, nivolumab (también denominado BMS-936558 o MDX1106; Bristol-Myers Squibb) es un anticuerpo monoclonal IgG4 totalmente humano que bloquea específicamente PD-1. Nivolumab (clon 5C4) y otros anticuerpos monoclonales humanos que se unen específicamente a PD-1 se divulgan en el documento US 8,008,449 y el documentoWO2006/121168. Pidilizumab (CT-011; Cure Tech) es un anticuerpo monoclonal IgGlk humanizado que se une a PD-1. Pidilizumab y otros anticuerpos monoclonales humanizados anti-PD-1 se divulgan en el documento WO2009/101611. Pembrolizumab (antes conocido como lambrolizumab, y también denominado MK03475; Merck) es un anticuerpo monoclonal IgG4 humanizado que se une al PD-1. Pembrolizumab y otros anticuerpos anti-PD-1 humanizados se divulgan en el documento US 8,354,509 y el documento WO2009/114335. MEDI4736 (Medimmune) es un anticuerpo monoclonal humano que se une a PDL1, e inhibe la interacción del ligando con PD1. MDPL3280A (Genentech / Roche) es un anticuerpo monoclonal IgG1 humano optimizado para Fc que se une a PD-L1. MDPL3280A y otros anticuerpos monoclonales humanos contra el PD-L1 se divulgan en Patente de EE. UU No: 7,943,743 y Publicación de EE.Uu . No: 20120039906. Otros agentes de unión anti-PD-Ll incluyen YW243.55.S70 (las regiones variables de la cadena pesada y ligera se muestran en las SEQ ID NOs 20 y 21 en el documento WO2010/077634) y MDX-1 105 (también denominado BMS-936559, y, por ejemplo, agentes de unión a la anti-PD-L1 divulgados en el documento WO2007/005874). AMP-224 (B7-DCIg; Amplimmune; por ejemplo, divulgado en el documento WO2010/027827 y el documento WO2011/066342), es un receptor soluble de fusión Fc de PD-L2 que bloquea la interacción entre PD-1 y B7-H1. Otros anticuerpos anti-PD-1 incluyen el AMP 514 (Amplimmune), entre otros, por ejemplo, los anticuerpos anti-PD-1 divulgados en el documento US 8.609.089, el documento US 2010028330y/o el documento US 20120114649.

TIM3 (inmunoglobulina-3 de células T) también regula negativamente la función de las células T, particularmente en las células T CD4+ ayudantes 1 secretoras de IFN y las células T CD8+ citotóxicas 1, y desempeña un papel crítico en el agotamiento de las células T. La inhibición de la interacción entre TIM3 y sus ligandos, por ejemplo, galectina-9 (Gal9), fosfotidilserina (PS) y HMGB1, puede aumentar la respuesta inmunitaria. Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y otros inhibidores de TIM3 y sus ligandos están disponibles en la técnica y pueden utilizarse en combinación con un CD19 CAR descrito en el presente documento. Por ejemplo, los anticuerpos, los fragmentos de anticuerpos, las moléculas pequeñas o los inhibidores peptídicos dirigidos a TIM3 se unen al dominio IgV de TIM3 para inhibir la interacción con sus ligandos. Los anticuerpos y péptidos que inhiben TIM3 se divulgan en el documento WO2013/006490 y en el documento US20100247521. Otros anticuerpos anti-TIM3 incluyen versiones humanizadas de RMT3-23 (divulgadas en Ngiow et al., 2011, Cancer Res, 71:3540-3551), y el clon 8B.2C12 (divulgado en Monney et al., 2002, Nature, 415:536-541). Los anticuerpos biespecíficos que inhiben TIM3 y PD-1 se divulgan en el documento US20130156774.

En otras realizaciones, el agente que mejora la actividad de una célula que expresa CAR es un inhibidor de CEACAM (por ejemplo, inhibidor de CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5). En una realización, el inhibidor de CEACAM es una molécula de anticuerpo anti-CEACAM. Algunos ejemplos de anticuerpos anti-CEACAM-1 se describen en el documento WO 2010/125571, el documento WO 2013/082366, el documento WO 2014/059251 y el documento WO 2014/022332, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal 34B1,26H7 y 5F4; o una forma recombinante del mismo, como se describe en, por ejemplo ,el documento US 2004/0047858, el documento US 7,132,255 y el documento WO 99/052552. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-CEACAM se une a CEACAM-5 como se describe en, por ejemplo, Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529 (DOI:10:1371/journal.pone.0021146), o reacciona de forma cruzada con CEACAM-1 y CEACAM-5 como se describe en, por ejemplo , el documento WO 2013/054331 y el documento US 2014/0271618.

Sin querer estar limitado por la teoría, se cree que las moléculas de adhesión celular al antígeno carcinoembrionario (CEACAM), tales como CEACAM-1 y CEACAM-5, median, al menos en parte, la inhibición de una respuesta inmunitaria antitumoral(Véase, por ejemplo, Markel et al. J Immunol. 2002 Mar 15;168(6):2803-10 Markel et al. J Immunol. 2006 Nov 1;177(9):6062-71 Markel et al. Immunology. 2009 Feb;126(2): 186-200 Markel et al. Cancer Immunol Immunother. 2010 Feb;59(2):215-30 Ortenberg et al. Mol Cancer Ther. 2012 Jun;11(6): 1300-10; Stern et al.

J Immunol. 2005 Jun 1;174(11):6692-701 Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529). Por ejemplo, se ha descrito que CEACAM-1 es un ligando heterófilo para TIM-3 y que desempeña un papel en la tolerancia y el agotamiento de las células T mediado por TIM-3(véase, por ejemplo, el documento WO 2014/022332 Huang, et al. (2014) Nature doi:10.1038/nature13848). En las realizaciones, se ha demostrado que el bloqueo conjunto de CEACAM-1 y TIM-3 mejora una respuesta inmunitaria antitumoral en modelos de cáncer colorrectal de xenoinjerto (véase, por ejemplo, el documento WO 2014/022332; Huang, et al. (2014), supra). En otras realizaciones, el cobloqueo de CEACAM-1 y PD-1 reduce la tolerancia de las células T como se describe, por ejemplo, en el documento WO 2014/059251. Por lo tanto, los inhibidores de CEACAM pueden utilizarse con los otros inmunomoduladores descritos en el presente documento(por ejemplo, inhibidores anti-PD-1 y/o anti-TIM-3) para mejorar una respuesta inmunitaria contra un cáncer, por ejemplo, un melanoma, un cáncer de pulmón (por ejemplo, NSCLC), un cáncer de vejiga, un cáncer de colon un cáncer de ovario, y otros cánceres como se describe en el presente documento

LAG3 (gen de activación de linfocitos-3 o CD223) es una molécula de superficie celular expresada en las células T y B activadas que ha demostrado desempeñar un papel en el agotamiento de las células T CD8+. Los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y otros inhibidores de LAG3 y sus ligandos están disponibles en la técnica y pueden utilizarse en combinación con un CD19 CAR descrito en el presente documento. Por ejemplo, BMS-986016 (Bristol-Myers Squib) es un anticuerpo monoclonal dirigido a LAG3. IMP701 (Immutep) es un anticuerpo antagonista de LAG3 y IMP731 (Immutep y GlaxoSmithKline) es un anticuerpo depletor de LAG3. Otros inhibidores de LAG3 incluyen IMP321 (Immutep), que es una proteína de fusión recombinante de una porción soluble de LAG3 e Ig que se une a las moléculas m Hc de clase II y activa las células presentadoras de antígeno (APC). Otros anticuerpos se divulgan, por ejemplo, en el documento WO2010/019570.

En algunas realizaciones, el agente que aumenta la actividad de una célula que expresa CAR puede ser, por ejemplo, una proteína de fusión que comprende un primer dominio y un segundo dominio, en el que el primer dominio es una molécula inhibidora, o un fragmento de la misma, y el segundo dominio es un polipéptido que se asocia con una señal positiva, por ejemplo, un polipéptido que comprende un dominio de señalización antracelular como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el polipéptido que se asocia con una señal positiva puede incluir un dominio costimulador de CD28, CD27, ICOS, por ejemplo, un dominio de señalización intracelular de CD28, CD27 y/o ICOS, y/o un dominio de señalización primario, por ejemplo, de CD3 zeta, por ejemplo, descrito en el presente documento. En una realización, la proteína de fusión es expresada por la misma célula que expresó el CAR. En otra realización, la proteína de fusión es expresada por una célula, por ejemplo, una célula T que no expresa una mesotelina CAR.

En una realización, el agente que mejora la actividad de una célula que expresa CAR descrita en el presente documento es miR-17-92.

Combinación con una dosis baja de un inhibidor de mTOR

En una realización, las células que expresan una molécula de CAR, por ejemplo, una molécula de CAR descrita en el presente documento, se administran en combinación con una dosis baja y potenciadora de la inmunidad de un inhibidor de mTOR.

En una realización, una dosis de un inhibidor de mTOR se asocia con, o proporciona, una inhibición de mTOR de al menos 5 pero no más de 90 %, al menos 10 pero no más de 90 %, al menos 15 pero no más de 90 %, al menos 20 pero no más de 90 %, al menos 30 pero no más de 90 %, al menos 40 pero no más de 90 %, al menos 50 pero no más de 90 %, al menos 60 pero no más de 90 %, o al menos 70 pero no más de 90 %.

En una realización, una dosis de un inhibidor de mTOR se asocia con, o proporciona, una inhibición de mTOR de al menos 5 pero no más de 80 %, al menos 10 pero no más de 80 %, al menos 15 pero no más de 80 %, al menos 20 pero no más de 80 %, al menos 30 pero no más de 80 %, al menos 40 pero no más de 80 %, al menos 50 pero no más de 80 %, o al menos 60 pero no más de 80 %.

En una realización, una dosis de un inhibidor de mTOR se asocia con, o proporciona, una inhibición de mTOR de al menos 5 pero no más de 70 %, al menos 10 pero no más de 70 %, al menos 15 pero no más de 70 %, al menos 20 pero no más de 70 %, al menos 30 pero no más de 70 %, al menos 40 pero no más de 70 %, o al menos 50 pero no más de 70 %.

En una realización, una dosis de un inhibidor de mTOR se asocia con, o proporciona, una inhibición de mTOR de al menos 5 pero no más de 60 %, al menos 10 pero no más de 60 %, al menos 15 pero no más de 60 %, al menos 20 pero no más de 60 %, al menos 30 pero no más de 60 %, o al menos 40 pero no más de 60 %.

En una realización, una dosis de un inhibidor de mTOR se asocia con, o proporciona, una inhibición de mTOR de al menos 5 pero no más de 50 %, al menos 10 pero no más de 50 %, al menos 15, pero no más de 50 %, al menos 20 pero no más de 50 %, al menos 30 pero no más de 50 %, o al menos 40 pero no más de 50 %.

En una realización, una dosis de un inhibidor de mTOR se asocia con, o proporciona, una inhibición de mTOR de al menos 5 pero no más de 40 %, al menos 10 pero no más de 40 %, al menos 15 pero no más de 40 %, al menos 20 pero no más de 40 %, al menos 30 pero no más de 40 %, o al menos 35 pero no más de 40 %.

En una realización, una dosis de un inhibidor de mTOR se asocia con, o proporciona, una inhibición de mTOR de al menos 5 pero no más de 30 %, al menos 10 pero no más de 30 %, al menos 15, pero no más de 30 %, al menos 20 pero no más de 30 %, o al menos 25 pero no más de 30 %.

En una realización, una dosis de un inhibidor de mTOR se asocia con, o proporciona, una inhibición de mTOR de al menos 1, 2, 3, 4 o 5 pero no más de 20 %, al menos 1, 2, 3, 4 o 5 pero no más de 30 %, al menos 1, 2, 3, 4 o 5, pero no más de 35, al menos 1,2, 3, 4 o 5 pero no más de 40 %, o al menos 1,2, 3, 4 o 5 pero no más de 45 %.

En una realización, una dosis de un inhibidor de mTOR se asocia con, o proporciona, una inhibición de mTOR de al menos 1,2, 3, 4 o 5 pero no más de 90 %.

Como se discute en el presente documento, la extensión de la inhibición de mTOR puede ser expresada como la extensión de la inhibición de P70 S6, por ejemplo, la extensión de la inhibición de mTOR puede ser determinada por el nivel de disminución de la actividad de P70 S6, por ejemplo, por la disminución de la fosforilación de un sustrato de P70 S6. El nivel de inhibición de mTOR puede evaluarse mediante un procedimiento descrito en el presente documento, por ejemplo, mediante el ensayo de Boulay.

EJEMPLOS DE INHIBIDORES DE MTOR

Como se usa en el presente documento, el término "inhibidor de mTOR" se refiere a un compuesto o ligando, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que inhibe la quinasa mTOR en una célula. En una realización un inhibidor de mTOR es un inhibidor alostérico. En una realización un inhibidor de mTOR es un inhibidor catalítico.

Los inhibidores alostéricos de mTOR incluyen el compuesto tricíclico neutro rapamicina (sirolimus), compuestos relacionados con la rapamicina, es decir, compuestos que tienen similitud estructural y funcional con la rapamicina, incluyendo, por ejemplo, derivados de la rapamicina, análogos de la rapamicina (también denominados rapálogos) y otros compuestos macrólidos que inhiben la actividad de mTOR.

La rapamicina es un antibiótico macrólido conocido producido por Streptomyces hygroscopicus que tiene la estructura mostrada en la Fórmula A

Véase, por ejemplo McAlpine, J.B., et al., J. Antibiotics (1991) 44: 688 Schreiber, S.L., et al., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113: 7433 Patente de EE. UU. No. 3,929,992. Hay diversos esquemas de numeración propuestos para la rapamicina. Para evitar confusiones, cuando se nombran análogos específicos de la rapamicina en el presente documento, los nombres se dan con referencia a la rapamicina utilizando el esquema de numeración de la fórmula A.

Los análogos de rapamicina útiles en la divulgación son, por ejemplo, análogos O-sustituidos en los que el grupo hidroxilo en el anillo de ciclohexilo de la rapamicina se sustituye por OR1 en el que R1 es hidroxialquilo, hidroxialcoxialquilo, acilaminoalquilo o aminoalquilo; por ejemplo, RAD001, también conocido como, everolimus como se describe en el documento US 5,665,772 y el documento WO94/09010. Otros análogos de la rapamicina adecuados son los sustituidos en la posición 26 o 28. El análogo de rapamicina puede ser un epímero de un análogo mencionado anteriormente, en particular un epímero de un análogo sustituido en la posición 40, 28 o 26, y opcionalmente puede ser hidrogenado adicionalmente, por ejemplo, como se describe en el documento US 6,015,815, el documentoWO95/14023 y el documentoWO99/15530por ejemplo, ABT578, también conocido como zotarolimus, o un análogo de la rapamicina descrito en el documento US 7,091,213, el documento WO98/02441 y el documento WO01/14387por ejemplo, AP23573, también conocido como ridaforolimus.

Ejemplos de análogos de rapamicina adecuados para su uso en la presente divulgación del documento US 5,665,772 incluyen, pero no se limitan a, 40-O-bencil-rapamicina, 40-O-(4'-hidroximetil)bencil-rapamicina, 40-O-[4'-(1,2-dihidroxietií)]bencil-rapamicina 40-O-alil-rapamicina, 40-O-[3'-(2,2-dimetiM,3-dioxolan-4(S)-yl)-prop-2-en-1-il]-rapamicina, (2'E,4'S)-40-O-(4',5'-dihidroxipent-2'-en-1'-il)-rapamicina, 40-O-(2-hidroxi)etoxicarbonilmetil-rapamicina, 40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina, 40-0-(3-hidroxi)propil-rapamicina, 40-O-(6-hidroxi)hexil-rapamicina, 40-O-[2-(2-hidroxi)etoxi]etil-rapamicina, 40-O-[(3S)-2,2-dimetildioxolan-3-il]metil-rapamicina, 40-O-[(2S)-2,3-dihidroxiprop-1-il]-rapamicina, 40-O-(2-acetoxi)etil-rapamicina, 40-O-(2-nicotinoiloxi)etil-rapamicina, 40-O-[2-(N-morfolino)acetoxi]etilrapamicina, 40-O-(2-N-imidazolilacetoxi)etil-rapamicina, 40-O-[2-(N-metil-N'-piperazinil)acetoxi]etil-rapamicina, 39-O-desmetil-39,40-O,O-etileno-rapamicina, (26R)-26-dibidro-40-O-(2-hidroxi)etil-rapamicina, 40-O-(2-aminoetil)-rapamicina, 40-O-(2-acetaminoetil)-rapamicina, 40-O-(2-nicotinamidoetil)-rapamicina, 40-O-(2-(N-metil-imidazo-2'-ilcarbetoxamido)-rapamicina, 40-O-(2-etoxicarbonilaminoetilo)-rapamicina, 40-O-(2-tolilsulfonamidoetilo)-rapamicina y 40-O-[2-(4',5',2',3'-triazol-1'-il)-etil] -rapamicina.

Otros análogos de rapamicina útiles en la presente divulgación son análogos en los que el grupo hidroxilo en el anillo de ciclohexilo de la rapamicina y/o el grupo hidroxi en la posición 28 se sustituye por un grupo hidroxiester son conocidos, por ejemplo, los análogos de rapamicina que se encuentran en el documento US RE44,768por ejemplo, el temsirolimus.

Otros análogos de rapamicina útiles en la presente divulgación incluyen aquellos en los que el grupo metoxi en la posición 16 se sustituye por otro sustituyente, preferentemente (opcionalmente hidroxisustituido) alquiloxi, bencilo, ortometoxibencilo o clorobencilo y/o en los que el grupo mextoxi en la posición 39 se suprime junto con el carbono 39, de modo que el anillo de ciclohexilo de la rapamicina se convierte en un anillo de ciclopentilo que carece del grupo metoxi en la posición 39; por ejemplo, como se describe en el documento WO95/16691 y WO96/41807. Los análogos pueden modificarse aún más, de manera que el hidroxi en la posición 40 de la rapamicina se alquila y/o se reduce el 32-carbonilo.

Análogos de la rapamicina del documento WO95/16691 incluyen, pero no se limitan a, 16-demetoxi-16-(pent-2-quinilo)-rapamicina, 16-demetoxi-16-(pero-2-quinilo)-rapamicina, 16-demetoxi-16-(propargilo)-rapamicina, 16-demetoxi-16-(4-hidroxi-but-2-quinilo)-rapamicina, 16-demetoxi-16-benciloxi-40-O-(2-hidroxietil)-rapamicina, 16-demetoxi-16-benciloxi-rapamicina, 16-demetoxi-16-ortoxibencil-rapamicina, 16-demetoxi-40-O-(2-metoxietil)-16-pent-2-ynil)oxi-rapamicina, 39-demetoxi-40-desoxi-39-formil-42-nor-rapamicina, 39-demetoxi-40-desoxi-39-hidroximetil-42-nor-rapamicina, 39-demetoxi-40-desoxi-39-carboxi-42-nor-rapamicina, 39-demetoxi-40-desoxi-39-(4-metil-piperazin-1-yl)carbonil-42-nor-rapamicina, 39-demetoxi-40-desoxi-39-(morfolina-4-il)carbonilo-42-nor-rapamicina, 39-demetoxi-40-desoxi-39-[N-metil, N-(2-piridina-2-il-etil)]carbamoil-42-nor-rapamicina y 39-demetoxi-40-desoxi-39-(ptoluenesulfonilhidrazonometíl)-42-nor-rapamicina.

Análogos de la rapamicina del documento WO96/41807 incluyen, pero no se limitan a, 32-deoxo-rapamicina, 16-O-pent-2-inil-32-deoxo-rapamicina, 16-0-pent-2-inil-32-deoxo-40-O-(2-hidroxietil)-rapamicina 16-O-pent-2-inil-32-(S)-dihidro-40-O-(2-hidroxietil)-rapamicina, 32(S)-dihidro-40-O-(2-metoxi)etil-rapamicina y 32(S)-dihidro-40-O-(2-hidroxietil)-rapamicina.

Otro análogo de la rapamicina adecuado es el umirolimus, descrito en el documento US2005/0101624.

RAD001, también conocido como everolimus (Afinitor®), tiene el nombre químico de (1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-dihidroxi-12-{(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-hidroxietoxi)-3-metoxiciclohexil]-1-metiletil}-19,30-dimetoxi-15,17,21,23,29,35-hexametil-1 1,36-dioxa-4-azatriciclo[30.3.1.04,9]hexatriaconta-16,24,26,28-tetraeno-2,3,10,14,20-pentaona

Otros ejemplos de inhibidores alostéricos de mTOR incluyen sirolimus (rapamicina, AY-22989), 40-[3-hidroxi-2-(hidroximetil)-2-metilpropanoato]-rapamicina (también llamado temsirolimus o CCI-779) y ridaforolimus (AP-23573/MK-8669). Otros ejemplos de inhibidores alostéricos de mTor son zotarolimus (ABT578) y umirolimus.

Alternativa o adicionalmente, se han encontrado inhibidores de mTOR catalíticos y competitivos por ATP que se dirigen al dominio de la cinasa mTOR directamente y se dirigen tanto a mTORC1 como a mTORC2. También son inhibidores más eficaces de mTORC1 que los inhibidores alostéricos de mTOR como la rapamicina, debido a que modulan las salidas de mTORC1 resistentes a la rapamicina, tal como la fosforilación de 4EBP1-T37/46 y la traducción dependiente del capuchón.

Los inhibidores catalíticos incluyen: BEZ235 o 2-metil-2-[4-(3-metil-2-oxo-8-quinolin-3-il-2,3-dihidro-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il)-fenil]-propionitrilo, o la forma de sal monotosilato. la síntesis de BEZ235 se describe en el documento WO2006/122806; cCG168 (también conocido como AZD-8055, Chresta, C.M., et al., Cancer Res, 2010, 70(1), 288-298) cuyo nombre químico es {5-[2,4-bis-((S)-3-metilmorfolina-4-il)-pirido[2,3d]pirimidin-7-il]-2-metoxifenil}-metanol; 3-[2,4-bis[(3S)-3-metilmorfolina-4-il]pirido[2,3-d]pirimidin-7-il]-N-metilbenzamida ( el documento WO09104019); 3 -(2-aminobenzo[d] oxazol-5 -il)-1 -isopropil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-amina (e l documento WO10051043 y el documento WO2013023184); A N-(3-(N-(3-((3,5-dimetoxifenil)amino)quinoxalina-2-il)sulfamoil)fenil)-3-metoxi-4-metilbenzamida (e l documentoWO07044729 y el documento WO12006552); PKI-587 (Venkatesan, A.M., J. Med.Chem., 2010, 53, 2636-2645) cuyo nombre químico es H4-[4-(dimetilamino)piperidina-1-carbonil]fenil]-3-[4-(4,6-dimorfolino-1,3,5-triazin-2-il)fenil]urea; GSK-2126458 (ACS Med. Chem. Lett., 2010, 1, 39-43) cuyo nombre químico es 2,4-difluoro-N-{2-metoxi-5-[4-(4-piridazinil)-6-quinolinil]-3-piridinil}benzenosulfonamida; 5-(9-isopropil-8-metil-2-morfolino-9H-purin-6-il)pirimidin-2-amina (el documento WO10114484); (E)-N-(8-(6-amino-5-(trifluorometil)piridin-3-il)-1-(6-(2-cianopropan-2-il)piridin-3-il)-3-metil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2(3H)-ilideno)cianamida (el documento WO12007926).

Otros ejemplos de inhibidores catalíticos de mTOR incluyen 8-(6-metoxi-piridina-3-il)-3-metil-1-(4-piperazin-1-il-3-trifluorometil-fenil)-1,3-dihidro-imidazo[4,5-c]quinolin-2-ona ( el documento WO2006/122806) y Ku-0063794 (García-Martínez JM, et al.,Biochem J., 2009, 421(1), 29-42. Ku-0063794 es un inhibidor específico del objetivo de rapamicina en mamíferos (mTOR) WYE-354 es otro ejemplo de inhibidor catalítico de mTor (Yu K, et al. (2009). Biochemical, Cellular, and In vivo Activity of Novel ATP-Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target of Rapamycin. Cancer Res. 69(15): 6232-6240).

Los inhibidores de mTOR útiles de acuerdo con la presente divulgación también incluyen profármacos, derivados, sales farmacéuticamente aceptables o análogos de los mismos de cualquiera de los anteriores.

Los inhibidores de mTOR, tales como RAD001, pueden formularse para su administración con base en procedimientos bien establecidos en la técnica, con base en las dosis particulares descritas en el presente documento. En particular, la Pat. de EE. UU. 6,004,973 proporciona ejemplos de formulaciones utilizables con los inhibidores de mTOR descritos en el presente documento.

EVALUACIÓN DE LA INHIBICIÓN DE MTOR

mTOR fosforila la quinasa P70 S6, activando así la quinasa P70 S6 y permitiéndole fosforilar su sustrato. El grado de inhibición de mTOR puede expresarse como el grado de inhibición de P70 S6 quinasa, por ejemplo, el grado de inhibición de mTOR puede determinarse por el nivel de disminución de la actividad de la P70 S6 quinasa, por ejemplo, por la disminución de la fosforilación de un sustrato de P70 S6 quinasa. Se puede determinar el nivel de inhibición de mTOR, midiendo la actividad de P70 S6 quinasa (la capacidad de la P70 S6 quinasa para fosforilar un sustrato), en ausencia de inhibidor, por ejemplo, antes de la administración del inhibidor, y en presencia del inhibidor, o después de la administración del inhibidor. El nivel de inhibición de P70 S6 quinasa da el nivel de inhibición de mTOR. Así, si P70 S6 quinasa se inhibe en 40 % la actividad de mTOR, medida por la actividad de la P70 S6 quinasa, se inhibe en 40 %. El grado o nivel de inhibición al que se hace referencia en el presente documento es el nivel medio de inhibición durante el intervalo de dosificación. A modo de ejemplo, si el inhibidor se administra una vez por semana, el nivel de inhibición viene dado por el nivel medio de inhibición en ese intervalo, es decir, una semana.

Boulay et al., Cancer Res, 2004, 64:252-61en el artículo de la revista "The Cancer Res", se enseña un ensayo que puede utilizarse para evaluar el nivel de inhibición de mTOR (denominado en el presente documento como el ensayo de Boulay). En una realización, el ensayo se basa en la medición de la actividad de P70 S6 quinasa de muestras biológicas antes y después de la administración de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, RAD001. Las muestras pueden tomarse en momentos preseleccionados después del tratamiento con un inhibidor de mTOR, por ejemplo, 24, 48 y 72 horas después del tratamiento. Pueden utilizarse muestras biológicas, por ejemplo, de piel o de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Se preparan extractos de proteínas totales a partir de las muestras. P70 S6 quinasa se aísla de los extractos de proteínas por inmunoprecipitación utilizando un anticuerpo que reconoce específicamente la P70 S6 quinasa. La actividad de la quinasa P70 S6 aislada puede medirse en un ensayo de quinasa in vitro. La quinasa aislada puede incubarse con sustratos de la subunidad ribosomal 40S (que es un sustrato endógeno de la P70 S6 quinasa) y gamma-32P bajo condiciones que permitan la fosforilación del sustrato. A continuación, la mezcla de reacción puede resolverse en un gel de SDS-PAGE, y la señal 32P puede analizarse mediante un PhosphorImager. Una señal 32P correspondiente al tamaño de la subunidad ribosomal 40S indica sustrato fosforilado y la actividad de P70 S6 quinasa. Los aumentos y disminuciones de la actividad quinasa pueden calcularse cuantificando el área y la intensidad de la señal de 32P del sustrato fosforilado (por ejemplo, utilizando ImageQuant, Molecular Dynamics), asignando valores unitarios arbitrarios a la señal cuantificada y comparando los valores de después de la administración con los valores de antes de la administración o con un valor de referencia. Por ejemplo, el porcentaje de inhibición de la actividad de quinasa puede calcularse con la siguiente fórmula: 1-(valor obtenido después de la administración/valor obtenido antes de la administración) X 100. Como se ha descrito anteriormente, el grado o nivel de inhibición al que se hace referencia en el presente documento es el nivel medio de inhibición durante el intervalo de dosificación.

Los procedimientos para la evaluación de la actividad de la quinasa, por ejemplo, la actividad de la P70 S6 quinasa, también se proporcionan en el documento US 7,727,950.

El nivel de inhibición de mTOR también puede evaluarse mediante un cambio en la proporción de células T PD1 negativas a PD1 positivas. Las células T de la sangre periférica pueden ser identificadas como PD1 negativas o positivas por procedimientos conocidos en la técnica.

Inhibidores de mTOR en dosis bajas

Los procedimientos descritos en el presente documento utilizan inhibidores de mTOR en dosis bajas, que mejoran la inmunidad, dosis de inhibidores de mTOR, por ejemplo, inhibidores alostéricos de mTOR, incluyendo rapálogos tales como RAD001. Por el contrario, los niveles de inhibidores que inhiben totalmente o casi totalmente la vía mTOR son inmunosupresores y se utilizan, por ejemplo, para prevenir el rechazo de trasplantes de órganos. Además, las dosis elevadas de rapálogos que inhiben por completo mTOR también inhiben el crecimiento de las células tumorales y se utilizan para tratar una variedad de cánceres (Véase, por ejemplo, Antineoplastic effects of mammalian target of rapamycine inhibitors. Salvadori M. World J Transplant. 2012 Oct 24;2(5):74-83; Current and Future Treatment Strategies for Patients with Advanced Hepatocellular Carcinoma: Role of mTOR Inhibition. Finn RS. Liver Cancer. 2012 Nov;1(3-4):247-256; Emerging Signaling Pathways in Hepatocellular Carcinoma. Moeini A, Cornella H, Villanueva A. Cáncer de hígado. 2012 Sep;1(2):83-93; Targeted cancer therapy - Are the days of systemic chemotherapy numbered? Joo WD, Visintin I, Mor G. Maturitas. 2013 Sep 20.; Role of natural and adaptive immunity in renal cell carcinoma response to VEGFR-TKIs and mTOR inhibitor. Santoni M, Berardi R, Amantini C, Burattini L, Santini D, Santoni G, Cascinu S. Int J Cancer. 2013 Oct 2).

La presente divulgación se basa, al menos en parte, en el sorprendente hallazgo de que las dosis de inhibidores de mTOR muy por debajo de las utilizadas en los entornos clínicos actuales tenían un efecto superior en el aumento de una respuesta inmunitaria en un sujeto y en el aumento de la proporción de células T negativas a PD-1 / células T positivas a PD-1. Resultó sorprendente que dosis bajas de inhibidores de mTOR, que producen sólo una inhibición parcial de la actividad de mTOR, fueran capaces de mejorar eficazmente las respuestas inmunitarias en sujetos humanos y de aumentar la proporción de células T negativas a PD-1 / células T positivas a PD-1 .

Alternativamente, o además, sin querer estar limitado por ninguna teoría, se cree que una dosis baja, de mejora inmunológica, de un inhibidor de mTOR puede aumentar el número de células T ingenuas, por ejemplo, al menos transitoriamente, por ejemplo, en comparación con un sujeto no tratado. Alternativa o adicionalmente, de nuevo sin querer estar limitado por la teoría, se cree que el tratamiento con un inhibidor de mTOR después de una cantidad suficiente de tiempo o una dosificación suficiente resulta en uno o más de los siguientes:

y en el que cualquiera de los cambios descritos anteriormente se produce, por ejemplo, al menos de forma transitoria, por ejemplo, en comparación con un sujeto no tratado (Araki, K et al. (2009) Nature 460:108-112). Los precursores de células T de memoria son células T de memoria que se encuentran en una fase temprana del programa de diferenciación. Por ejemplo, las células T de memoria tienen una o más de las siguientes características: aumento de CD62Lalto, aumento de CD127alto, aumento de CD27+, disminución de KLRG1, y/o aumento de BCL2.

En una realización, la divulgación se refiere a una composición, o forma de dosificación, de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico de mTOR, por ejemplo, un rapálogo, rapamicina o RAD001, o un inhibidor catalítico de mTOR, que, cuando se administra en un régimen de dosificación seleccionado, por ejemplo, una vez al día o una vez a la semana, se asocia con: un nivel de inhibición de mTOR que no se asocia con una supresión inmunitaria completa o significativa, sino que se asocia con una mejora de la respuesta inmunitaria.

Un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico de mTOR, por ejemplo, un rapalog, rapamicina o RAD001, o un inhibidor catalítico de mTOR, puede proporcionarse en una formulación de liberación sostenida. Cualquiera de las composiciones o formas farmacéuticas unitarias descritas en el presente documento puede proporcionarse en una formulación de liberación sostenida. En algunas realizaciones, una formulación de liberación sostenida tendrá una menor biodisponibilidad que una formulación de liberación inmediata. Por ejemplo, en las realizaciones, para lograr un efecto terapéutico similar al de una forlación de liberación inmediata, una formulación de liberación sostenida tendrá de 2 a 5, de 2,5 a 3,5, o 3 veces la cantidad de inhibidor proporcionada en la formulación de liberación inmediata.

En una realización, se proporcionan formas de liberación inmediata, por ejemplo, de RAD001, típicamente utilizadas para una administración por semana, que tienen de 0,1 a 20, 0,5 a 10, 2,5 a 7,5, 3 a 6, o aproximadamente 5, mgs por forma de dosificación unitaria. Para las administraciones de una vez por semana, estas formulaciones de liberación inmediata corresponden a formas de liberación sostenida, que tienen, respectivamente, de 0,3 a 60, de 1,5 a 30, de 7,5 a 22,5, de 9 a 18, o aproximadamente 15 mgs de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico de mTOR, por ejemplo, rapamicina o RAD001. En las realizaciones, ambas formas se administran una vez a la semana.

En una realización, las formas de liberación inmediata, por ejemplo de RAD001, utilizadas típicamente para una administración al día, que tienen de 0,005 a 1,5, de 0,01 a 1,5, de 0,1 a 1,5, de 0,2 a 1,5, de 0,3 a 1,5, de 0,4 a 1,5, de 0,5 a 1,5, de 0,6 a 1,5, de 0,7 a 1,5, de 0,8 a 1,5, de 1,0 a 1,5, de 0,3 a 0,6, o de aproximadamente 0,5 mgs por forma de dosificación unitaria. Para las administraciones de una vez al día, estas formas de liberación inmediata corresponden a formas de liberación sostenida, teniendo, respectivamente, 0,015 a 4,5, 0,03 a 4,5, 0,3 a 4.5, 0,6 a 4,5, 0,9 a 4,5, 1,2 a 4,5, 1,5 a 4,5, 1,8 a 4,5, 2,1 a 4,5, 2,4 a 4,5, 3,0 a 4,5, 0,9 a 1,8, o aproximadamente 1,5 mgs de un inhibidor de mTOR, por ejemplo un inhibidor alostérico de mTOR, por ejemplo, rapamicina o RAD001. Para las administraciones de una vez por semana, estas formas de liberación inmediata corresponden a formas de liberación sostenida, que tienen, respectivamente, 0,1 a 30, de 0,2 a 30, de 2 a 30, de 4 a 30, de 6 a 30, de 8 a 30, de 10 a 30, de 1,2 a 30, de 14 a 30, de 16 a 30, de 20 a 30, de 6 a 12, o aproximadamente 10 mgs de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico de mTOR, por ejemplo, rapamicina o RAD001.

En una realización, se proporcionan formas de liberación inmediata, por ejemplo, de RAD001, típicamente utilizadas para una administración por día, que tienen 0,01 a 1,0 mgs por forma de dosificación unitaria. Para administraciones una vez al día, estas formas de liberación inmediata corresponden a formas de liberación sostenida, que tienen, respectivamente, 0,03 a 3 mg de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico de mTOR, por ejemplo, rapamicina o RAD001. Para administraciones una vez por semana, estas formas de liberación inmediata corresponden a formas de liberación sostenida, que tienen, respectivamente, de 0,2 a 20 mg de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico de mTOR, por ejemplo, rapamicina o RAD001.

En una realización, se proporcionan formas de liberación inmediata, por ejemplo, de RAD001, típicamente utilizadas para una administración por semana, que tienen de 0,5 a 5,0 mgs por forma de dosificación unitaria. Para las administraciones de una vez por semana, estas formas de liberación inmediata corresponden a formas de liberación sostenida, que tienen, respectivamente, de 1,5 a 15 mgs de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico de mTOR, por ejemplo, rapamicina o RAD001.

Como se ha descrito anteriormente, un objetivo de la vía mTOR es la quinasa P70 S6. Por lo tanto, las dosis de inhibidores de mTOR que son útiles en los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento son aquellas que son suficientes para lograr no más de 80 % de inhibición de la actividad de la P70 S6 quinasa en relación con la actividad de la P70 S6 quinasa en ausencia de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, como se mide por un ensayo descrito en el presente documento, por ejemplo, el ensayo de Boulay. En otro aspecto, la divulgación proporciona una cantidad de un inhibidor de mTOR suficiente para lograr una inhibición no superior a 38 % de la actividad de la P70 S6 quinasa en relación con la actividad de la P70 S6 quinasa en ausencia de un inhibidor de mTOR.

En un aspecto, la dosis de inhibidor de mTOR útil en los procedimientos y composiciones de la divulgación es suficiente para lograr, por ejemplo, cuando se administra a un sujeto humano, 90 /-5 % (es decir 85-95 %), 89+/-5 %, 88+/-5 %, 87+/-5 %, 86+/-5 %, 85+/-5 %, 84+/-5 %, 83+/-5 %, 82+/-5 %, 81+/-5 %, 80+/-5 %, 79+/-5 %, 78+/-5 %, 77+/-5 %, 76+/-5 %, 75+/-5 %, 74+/-5 %, 73+/-5 %, 72 /-5 %, 71 /-5 %, 70 /-5 %, 69 /-5 %, 68 /-5 %, 67 /-5 %, 66 /-5 %, 65 /-5 %, 64 /-5 %, 63 /-5 %, 62 /-5 %, 61 /-5 %, 60 /-5 %, 59 /-5 %, 58 /-5 %, 57 /-5 %, 56 /-5 %, 55 /-5 %, 54 /-5 %, 54 /-5 %, 53 /-5 %, 52 /-5 %, 51 /-5 %, 50 /-5 %, 49 /-5 %, 48 /-5 %, 47 /-5 %, 46 /-5 %, 45 /-5 %, 44 /-5 %, 43 /-5 %, 42 /-5 %, 41 /-5 %, 40 /-5 %, 39 /-5 %, 38 /-5 %, 37 /-5 %, 36 /-5 %, 35 /-5 %, 34 /-5 %, 33 /-5 %, 32 /-5 %, 31 /-5 %, 30 /-5 %, 29 /-5 %, 28 /-5 %, 27 /-5 %, 26 /-5 %, 25 /-5 %, 24 /-5 %, 23 /-5 %, 22 /-5 %, 21 /-5 %, 20 /-5 %, 19 /-5 %, 18 /-5 %, 17 /-5 %, 16 /-5 %, 15 /-5 %, 14 /-5 %, 13 /-5 %, 12 /-5 %, 11 /-5 %, o 10 /-5 %, la inhibición de la actividad de la P70 S6 quinasa , por ejemplo, como se mide mediante un ensayo descrito en el presente documento, por ejemplo, el ensayo de Boulay.

La actividad de la quinasa P70 S6 en un sujeto puede medirse utilizando procedimientos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, de acuerdo con los procedimientos descritos en la Pat, de EE.UU 7,727,950por ejemplo, el análisis de inmunotranerencia de los niveles de fosfoP70 S6K y/o de fosfoP70 S6 o por ensayos de actividad quinasa in vitro.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "aproximadamente" en referencia a una dosis de inhibidor de mTOR se refiere a una variabilidad de hasta /-10 % en la cantidad de inhibidor de mTOR, pero puede incluir ninguna variabilidad alrededor de la dosis indicada.

En algunas realizaciones, la divulgación proporciona procedimientos que comprenden la administración a un sujeto de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico, por ejemplo, el RAD001, a una dosificación dentro de un nivel de depresión objetivo. En algunas realizaciones, el nivel mínimo es significativamente inferior a los niveles mínimos asociados con los regímenes de dosificación utilizados en pacientes con trasplantes de órganos y con cáncer. En una realización, el inhibidor de mTOR, por ejemplo, RAD001, o rapamicina, se administra para dar lugar a un nivel mínimo que es menos de ^ , 1/4, 1/10, o 1/20 del nivel mínimo que da lugar a la inmunosupresión o a un efecto anticanceroso. En una realización, el inhibidor de mTOR, por ejemplo, RAD001, o rapamicina, se administra para dar lugar a un nivel mínimo que es menos de A, 1/4, 1/10, o 1/20 del nivel mínimo proporcionado en el prospecto aprobado por la FDA para su uso en la inmunosupresión o en las indicaciones contra el cáncer.

En una realización, un procedimiento divulgado en el presente documento comprende la administración a un sujeto de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico, por ejemplo, RAD001, a una dosificación que proporciona un nivel mínimo objetivo de 0,1 a 10 ng/ml, 0,1 a 5 ng/ml, 0,1 a 3ng/ml, 0,1 a 2 ng/ml, o 0,1 a 1 ng/ml.

En una realización, un procedimiento divulgado en el presente documento comprende la administración a un sujeto de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico, por ejemplo, RAD001, a una dosificación que proporciona un nivel mínimo objetivo de 0,2 a 10 ng/ml, 0,2 a 5 ng/ml, 0,2 a 3ng/ml, 0,2 a 2 ng/ml, o 0,2 a 1 ng/ml.

En una realización, un procedimiento divulgado en el presente documento comprende la administración a un sujeto de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico, por ejemplo, RAD001, a una dosis que proporciona un nivel mínimo objetivo de 0,3 a 10 ng/ml, 0,3 a 5 ng/ml, 0,3 a 3ng/ml, 0,3 a 2 ng/ml, o 0,3 a 1 ng/ml.

En una realización, un procedimiento divulgado en el presente documento comprende la administración a un sujeto de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico, por ejemplo, RAD001, a una dosis que proporciona un nivel mínimo objetivo de 0,4 a 10 ng/ml, 0,4 a 5 ng/ml, 0,4 a 3ng/ml, 0,4 a 2 ng/ml, o 0,4 a 1 ng/ml.

En una realización, un procedimiento divulgado en el presente documento comprende la administración a un sujeto de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico, por ejemplo, RAD001, a una dosificación que proporciona un nivel mínimo objetivo de 0,5 a 10 ng/ml, 0,5 a 5 ng/ml, 0,5 a 3ng/ml, 0,5 a 2 ng/ml, o 0,5 a 1 ng/ml.

En una realización, un procedimiento divulgado en el presente documento comprende la administración a un sujeto de un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor alostérico, por ejemplo, RAD001, a una dosis que proporciona un nivel mínimo objetivo de 1 a 10 ng/ml, 1 a 5 ng/ml, 1 a 3ng/ml, o 1 a 2 ng/ml.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "nivel mínimo" se refiere a la concentración de un fármaco en el plasma justo antes de la siguiente dosis, o a la mínima concepción del fármaco entre dos dosis.

En algunas realizaciones, un nivel mínimo objetivo de RAD001 se encuentra en un intervalo de entre aproximadamente 0,1 y 4,9 ng/ml. En una realización, el nivel mínimo objetivo des inferior a 3 ng/ml, por ejemplo, está entre 0,3 o menos y 3 ng/ml. En una realización, el nivel mínimo objetivo des inferior a 3 ng/ml, por ejemplo, está entre 0,3 o menos y 1 ng/ml.

En otro aspecto, la divulgación puede utilizar un inhibidor de mTOR distinto de RAD001 en una cantidad que se asocia con un nivel mínimo objetivo que es bioequivalente al nivel mínimo objetivo especificado para RAD001. En una realización, el nivel mínimo objetivo para un inhibidor de mTOR distinto de RAD001 es un nivel que proporciona el mismo nivel de inhibición de mTOR (por ejemplo, según se mide con un procedimiento descrito en el presente documento, por ejemplo, la inhibición de P70 S6) que un nivel mínimo de RAD001 descrito en el presente documento.

Composiciones farmacéuticas: Inhibidores de mTOR

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden un inhibidor de mTOR, por ejemplo, un inhibidor de mTOR como se describe en el presente documento, formulado para su uso en combinación con las células CAR descritas en el presente documento.

En algunas realizaciones, el inhibidor de mTOR se formula para su administración en combinación con un adicional, por ejemplo, como se describe en el presente documento.

En general, los compuestos de la divulgación se administrarán en cantidades terapéuticamente efectivas como se ha descrito anteriormente a través de cualquiera de los modos habituales y aceptables conocidos en la técnica, ya sea individualmente o en combinación con uno o más agentes terapéuticos.

Las formulaciones farmacéuticas pueden prepararse utilizando procedimientos convencionales de disolución y mezcla. Por ejemplo, la sustancia farmacológica a granel (por ejemplo, un inhibidor de mTOR o una forma estabilizada del compuesto (por ejemplo, un complejo con un derivado de ciclodextrina u otro agente de complejación conocido) se disuelve en un disolvente adecuado en presencia de uno o más de los excipientes descritos en el presente documento. El inhibidor de mTOR suele formularse en formas farmacéuticas de dosificación para proporcionar una dosificación fácilmente controlable del fármaco y ofrecer al paciente un producto elegante y fácilmente manejable.

Los compuestos de la divulgación pueden administrarse como composiciones farmacéuticas por cualquier vía convencional, en particular por vía enteral, por ejemplo, por vía oral, por ejemplo, en forma de comprimidos o cápsulas, o por vía parenteral, por ejemplo, en forma de soluciones o suspensiones inyectables, por vía tópica, por ejemplo, en forma de lociones, geles, ungüentos o cremas, o en forma de supositorios o nasales. Cuando un inhibidor de mTOR se administra en combinación con (simultáneamente o por separado) otro agente como el descrito en el presente documento, en un aspecto, ambos componentes pueden administrarse por la misma vía (por ejemplo, por vía parenteral). Alternativamente, se puede administrar otro agente por una vía diferente a la del inhibidor de mTOR. Por ejemplo, un inhibidor de mTOR puede administrarse por vía oral y el otro agente puede administrarse por vía parenteral.

LIBERACIÓN SOSTENIDA

Los inhibidores de mTOR, por ejemplo, los inhibidores alostéricos de mTOR o los inhibidores catalíticos de mTOR, divulgados en el presente documento pueden proporcionarse como formulaciones farmacéuticas en forma de formas de dosificación sólidas orales que comprenden un inhibidor de mTOR divulgado en el presente documento, por ejemplo rapamicina o RAD001, que satisfacen los requisitos de estabilidad del producto y/o tienen propiedades farmacocinéticas favorables con respecto a los comprimidos de liberación inmediata (RI), tal como la reducción de las concentraciones plasmáticas máximas promedio, la reducción de la variabilidad inter e intrapaciente en el grado de absorción del fármaco y en la concentración plasmática máxima, la reducción de la proporción Cmáx / Cmín y/o la reducción de los efectos alimentarios. Las formulaciones farmacéuticas proporcionadas pueden permitir un ajuste más preciso de la dosis y/o reducir la frecuencia de los acontecimientos adversos, proporcionando así tratamientos más seguros para los pacientes con un inhibidor de mTOR divulgado en el presente documento, por ejemplo, rapamicina o RAD001.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona formulaciones estables de liberación prolongada de un inhibidor de mTOR divulgado en el presente documento, por ejemplo, rapamicina o RAD001, que son sistemas multiparticulados y pueden tener capas y recubrimientos funcionales.

El término "formulación multiparticulada de liberación prolongada, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una formulación que permite la liberación de un inhibidor de mTOR divulgado en el presente documento, por ejemplo, rapamicina o RAD001, durante un período de tiempo prolongado, por ejemplo, durante al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 horas. La formulación de liberación prolongada puede contener matrices y recubrimientos hechos de excipientes especiales, por ejemplo, como se describe en el presente documento, que se formulan de manera que el ingrediente activo esté disponible durante un período de tiempo prolongado después de la ingestión.

El término "liberación prolongada" puede utilizarse indistintamente con los términos "liberación sostenida" (SR) o "liberación prolongada". El término "liberación prolongada" se refiere a una formulación farmacéutica que no libera el principio activo inmediatamente después de la administración oral, sino a lo largo de un período prolongado, de acuerdo con la definición en la monografía de farmacopeas de Ph. Eur. (7a edición) para comprimidos y cápsulas y el capítulo general<1151>de</1151>la USP<1151>para formas farmacéuticas.</1151> El término "Liberación Inmediata" (RI), tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a una formulación farmacéutica que libera 85 % del principio activo en menos de 60 minutos, de acuerdo con la definición de "Guía para la industria: "Dissolution Testing of Immediate Release Solid Oral Dosage Forms" (FDA CDER, 1997). En algunas realizaciones, el término "liberación inmediata" significa la liberación del everolismo de los comprimidos dentro del tiempo de 30 minutos, por ejemplo, según se mide en el ensayo de disolución descrito en el presente documento.

Las formulaciones estables de liberación prolongada de un inhibidor de mTOR divulgado en el presente documento, por ejemplo rapamicina o RAD001, pueden caracterizarse mediante un perfil de liberación in vitro utilizando ensayos conocidos en la técnica, tal como un ensayo de disolución como el descrito en el presente documento: un recipiente de disolución lleno de 900 ml de tampón fosfato con pH 6,8 que contiene dodecil sulfato de sodio al 0,2% a 37°C y la disolución se realiza utilizando un procedimiento de paletas a 75 rpm de acuerdo con USP de acuerdo con la monografía de ensayos 711 de USP, y la monografñia de ensayos de Ph.Eur. 2.9.3. respectivamente.

En algunas realizaciones, las formulaciones estables de liberación prolongada de un inhibidor de mTOR divulgado en el presente documento, por ejemplo, rapamicina o RAD001, liberan el inhibidor de mTOR en el ensayo de liberación in vitro de acuerdo con las siguientes especificaciones de liberación:

0,5 h: <45 %, o <40, por ejemplo, <30 %

1 h: 20-80 %, por ejemplo, 30-60 %

2h : >50 %, o >70 %, por ejemplo, >75 %

3h : >60 %, o >65 %, por ejemplo, >85 %, por ejemplo, >90 %.

En algunas realizaciones, las formulaciones estables de liberación prolongada de un inhibidor de mTOR divulgado en el presente documento, por ejemplo, rapamicina o RAD001, liberan 50 % del inhibidor de mTOR no antes de 45, 60, 75, 90, 105 min o 120 min en el ensayo de disolución in vitro.

Composiciones y tratamientos farmacéuticos

Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden comprender una célula que expresa CAR, por ejemplo, una pluralidad de células que expresan CAR, como se describe en el presente documento, en combinación con uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables. Dichas composiciones pueden incluir tampones, tales como la solución salina neutra, la solución salina fosfatada y similares; hidratos de carbono, tale como la glucosa, la manosa, la sacarosa o los dextranos, el manitol; proteínas; polipéptidos o aminoácidos, tales como la glicina; antioxidantes; agentes quelantes, tales como EDTA o el glutatión; adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio); y conservantes. Las composiciones de la presente divulgación están en un aspecto formuladas para la administración intravenosa.

Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden administrarse de forma adecuada a la enfermedad que se va a tratar (o prevenir). La cantidad y la frecuencia de administración se determinarán en función de factores tales como el estado del paciente y el tipo y la gravedad de la enfermedad del mismo, aunque las dosificaciones adecuadas pueden determinarse mediante ensayos clínicos.

En una realización, la composición farmacéutica está sustancialmente libre de, por ejemplo, no hay niveles detectables de un contaminante, por ejemplo seleccionado del grupo que consiste en endotoxina, micoplasma, lentivirus competente para la replicación (RCL), p24, ácido nucleico VSV-G, gag del VIH, perlas recubiertas residuales anti-CD3/anti-CD28, anticuerpos de ratón, suero humano agrupado, albúmina de suero bovino, suero bovino, componentes de medios de cultivo, componentes de células o plásmidos de empaquetamiento de vectores, una bacteria y un hongo. En una realización, la bacteria es al menos una seleccionada del grupo que consiste en Alcaligenes faecalis, Candida albicans, Escherichia coli, Haemophilus influenza, Neisseria meningitides, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia y Streptococcus pyogenes grupo A.

Cuando se indica "una cantidad inmunológicamente eficaz", "una cantidad eficaz contra el cáncer", "una cantidad eficaz que inhibe el cáncer" o "una cantidad terapéutica", el médico puede determinar la cantidad precisa de las composiciones de la presente divulgación que debe administrarse teniendo en cuenta las diferencias individuales en cuanto a la edad, el peso, el tamaño del tumor, la extensión de la infección o la metástasis y el estado del paciente (sujeto). En general, puede afirmarse que una composición farmacéutica que comprende las células efectoras inmunitarias descritas en el presente documento puede administrarse a una dosis de 104 a 109 células/kg de peso corporal, en algunos casos de 105 a 106 células/kg de peso corporal, incluyendo todos los valores enteros dentro de esos intervalos. Las composiciones de células efectoras inmunitarias también pueden administrarse varias veces a estas dosificaciones. Las células pueden administrarse mediante técnicas de infusión comúnmente conocidas en inmunoterapia (véase, por ejemplo, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988).

En ciertos aspectos, se puede desear administrar células efectoras inmunitarias activadas a un sujeto y posteriormente volver a extraer sangre (o realizar una aféresis), activar las células de la misma de acuerdo con la presente divulgación y reinfundir al paciente con estas células activadas y expandidas. Este procedimiento puede llevarse a cabo varias veces cada pocas semanas. En ciertos aspectos, las células pueden activarse a partir de extracciones de sangre de entre 10 cc a 400 cc. En ciertos aspectos, las células se activan a partir de extracciones de sangre de 20 cc, 30 cc, 40 cc, 50 cc, 60 cc, 70 cc, 80 cc, 90 cc o 100 cc.

La administración de las composiciones del sujeto puede llevarse a cabo de cualquier manera conveniente, incluyendo la inhalación de aerosoles, la inyección, la ingestión, la transfusión, la implantación o el trasplante. Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse a un paciente por vía transarterial, subcutánea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, por inyección intravenosa (i.v.) o intraperitoneal. En un aspecto, las composiciones de células T de la presente divulgación se administran a un paciente por inyección intradérmica o subcutánea. En un aspecto, las composiciones de células efectoras inmunitarias de la presente divulgación se administran por inyección i.v. Las composiciones de células efectoras inmunitarias pueden inyectarse directamente en un tumor, un ganglio linfático o un lugar de infección.

En un aspecto ejemplar particular, los sujetos pueden someterse a leucaféresis, en la que los leucocitos se recogen, se enriquecen o se agotan ex vivo para seleccionar y/o aislar las células de interés, por ejemplo, las células T. Estos aislados de células T pueden expandirse por procedimientos conocidos en la técnica y tratarse de manera que puedan introducirse uno o más constructos CAR de la divulgación, creando así una célula T CAR de la divulgación. Los sujetos que lo necesiten podrán someterse posteriormente a un tratamiento estándar con altas dosis de quimioterapia seguido de un trasplante de células madre de sangre periférica. En ciertos aspectos, tras el trasplante o simultáneamente al trasplante, los sujetos reciben una infusión de las células T CAR expandidas de la presente divulgación. En un aspecto adicional, las células expandidas se administran antes o después de la cirugía.

La dosificación de los tratamientos anteriores que se administrará a un paciente variará en función de la naturaleza precisa de la condición que se está tratando y del receptor del tratamiento. El escalado de las dosificaciones para la administración en humanos puede realizarse de acuerdo con las prácticas aceptadas en la técnica. La dosis de CAMPATH, por ejemplo, estará generalmente en el intervalo de 1 a aproximadamente 100 mg para un paciente adulto, generalmente administrado diariamente durante un período de entre 1 y 30 días. La dosis diaria preferida es de 1 a 10 mg al día, aunque en algunos casos pueden utilizarse dosis mayores, de hasta 40 mg al día (descritas en Pat. de U.S. No. 6,120,766).

En una realización, el CAR se introduce en las células efectoras inmunitarias, por ejemplo, utilizando la transcripción in vitro, y el sujeto (por ejemplo, humano) recibe una administración inicial de células que expresan CAR de la divulgación, y una o más administraciones subsiguientes de las células que expresan CAR de la divulgación, en las que la una o más administraciones subsiguientes se administran menos de 15 días, por ejemplo, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 días después de la administración anterior. En una realización, se administra más de una administración de las células que expresan CAR de la divulgación al sujeto (por ejemplo, humano) por semana, por ejemplo, se administran 2, 3 o 4 administraciones de las células que expresan CAR de la divulgación por semana. En una realización, el sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) recibe más de una administración de las células que expresan CAR por semana (por ejemplo, 2, 3 o 4 administraciones por semana) (también denominado en el presente documento como ciclo), seguido de una semana sin administración de células que expresan CAR y, a continuación, se administran al sujeto una o más administraciones adicionales de las células que expresan CAR (por ejemplo, más de una administración de las células que expresan CAR por semana). En otra realización, el sujeto (por ejemplo, el sujeto humano) recibe más de un ciclo de células que expresan CAR, y el tiempo entre cada ciclo es inferior a 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o 3 días. En una realización, las células que expresan ^cA^rse administran en días alternos durante 3 administraciones por semana. En una realización, las células que expresan CAR de la divulgación se administran durante al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más semanas.

En un aspecto, las células que expresan mesotelina CAR se generan utilizando vectores virales lentivirales, tales como el lentivirus. Las células que expresan CAR generadas de esta manera tendrán una expresión estable de CAR.

En un aspecto, las células que expresan CAR expresan transitoriamente vectores CAR durante 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 días después de la transducción. La expresión transitoria de los CAR puede realizarse mediante la administración de vectores de ARN CAR. En un aspecto, el CAR RNA se transduce en la célula T por electroporación.

En una realización, la dosis y/o el programa de dosificación es el proporcionado en la Figura 6.

Un problema potencial que puede surgir en los pacientes que son tratados usando células que expresan transitoriamente CAR (particularmente con células que expresan scFv murinos) es la anafilaxia después de múltiples tratamientos.

Sin estar limitado por esta teoría, se cree que tal respuesta anafiláctica podría ser causada por un paciente que desarrolla una respuesta humoral anti-CAR, es decir, anticuerpos anti-CAR que tienen un isotipo anti-IgE. Se cree que las células productoras de anticuerpos de un paciente sufren una conmutación de clase del isotipo IgG (que no causa anafilaxia) al isotipo IgE cuando hay una pausa de diez a catorce días en la exposición al antígeno.

Si un paciente tiene un alto riesgo de generar una respuesta de anticuerpos anti-CAR durante el curso de la terapia CAR transitoria (tal como las generadas por transducciones de ARN), las pausas de infusión de células que expresan CAR no deben durar más de diez a catorce días.

El uso de los CAR con scFvs humanos (en lugar de murinos) puede reducir la probabilidad e intensidad de que un paciente tenga una respuesta anti-CAR.

Tabla 5. Secuencias de aminoácidos de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera (LC) de los scFv humanos anti-mesotelina

EJEMPLOS

La invención se describe con más detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos experimentales. Estos ejemplos se ofrecen a título ilustrativo y no pretenden ser limitativos, a menos que se especifique lo contrario. Por lo tanto, la invención no debe ser interpretada como limitada a los siguientes ejemplos, sino que debe ser interpretada para abarcar cualquier y todas las variaciones que se hacen evidentes como resultado de la enseñanza proporcionada en el presente documento.

Ejemplo 1: Generación de constructos CAR

Los ScFv que se utilizarán en el constructo CAR final se derivaron de las panorámicas de las bibliotecas de scFV humanos.

Las secuencias de aminoácidos de los fragmentos de scFv humanos se proporcionan arriba en la Tabla 2 y las secuencias de ácido nucleico de los fragmentos de scFv humanos se proporcionan arriba en la Tabla 3. Los constructos CAR completos se generaron utilizando los fragmentos scFv de la Tabla 2 con secuencias adicionales, SEQ ID NOs: 1-2, 6-7, 9-10, 12-13, 17-18, 20-21 y 36-37, que se muestran a continuación, para generar constructos CAR completos.

• Líder (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 1) MALPVTALLLPLALLLHAARP

• Líder (secuencia de ácido nucleico) (SEQ ID NO: 12)

ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGC CGCTCGGCCC

Bisagra CD8 (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 2) TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD

Bisagra CD8 (secuencia de ácido nucleico) (SEQ ID NO: 13)

ACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCC

AGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGT

GCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATCD8 transmembrana (secuencia de aminoácido) (SEQ IDNO:6)

IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC

CD8 transmembrana (secuencia de ácido nucleico) (SEQ ID NO: 17)

ATCT ACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGT ACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACT CGTGATCACTCTTTACTGT4-1BB Dominio intracclular (secuencia de aminoácido) (SEQ ID NO:7)

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

Dominio intracelular 4-1BB (secuencia de ácido nucleico) (SEQ ID NO: 18)

AAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGC CTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGA GGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCD3 Dominio zeta (secuencia de aminoácido) (SEQ ID NO:9)

RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRK NPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDAL HMQALPPR

CD3 zeta (secuencia de ácido nucleico) (SEQ ID NO: 20)

CGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAG

AACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGC

TGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGA

AAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCA

GAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGC

CACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACG

CTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGGCD3 Dominio zeta (secuencia de aminoácido; Secuencia NM 000734.3 de Referencia NCBI) (SEQ ID NO: 10)

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRK NPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDAL HMQALPPR

• CD3 zeta (secuencia de ácido nucleico; secuencia de referencia del NCBI NM_000734.3); (SEQ ID NO:21)

AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAG AACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTT TGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGA AGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGG AGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGC ACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGC CCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC

• Bisagra de IgG4 (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO:36)

ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQ FNWYYDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRW S YLTVLHQD WLN GKEYKCKV SNK GLP S SIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPS QEEMTKN Q V S LTCLVKGF YPSDI AVE WE SN GQPENNYKTTPP VLD SDGSFFLY SRLTVDKSRWQEGNYF S CS YMHEALHNHY TQKSLSLSLGKM

• Bisagra de IgG4 (secuencia de nucleótidos) (SEQ ID NO:37)

GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGG CGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATC AGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACC CCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAA GACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTG CTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGG TGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCA AGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGA GATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCC AGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTAC

AAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCC GGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTC CGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTG TCCCTGGGCAAGATG

Todos estos clones contenían un cambio de residuo Q/K en el dominio de señal del dominio costimulador derivado de la cadena CD3zeta.

Los fragmentos de CAR scFv se clonaron entonces en vectores lentivirales para crear una constructo CAR de longitud completa en un marco de codificación único, y utilizando el promotor EF1 alfa para la expresión (SEQ ID NO: 11).

Promotor de EF1 alfa

CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGC A A TTG AAC CG G TG CC TAG AG AAG G TG G C G C G G G G TAAAC TG G G AAAG TG ATG TC G TG TAC TG G C TC CG CC TTTTTC C C G AG G G TG G G G G AG AA CC G TA TATAAG TG C AG TAG TC G C C G TG AACG TTC TTTTTC G C AAC G G G TTTG C CG CC AG AA C A C A G G TA AG TG C C G TG TG TG G TTC CC G C G G G C CTG G C C TC TTTAC G G G TTATG G CC C TTG CG TG C C TTG AATTAC T TCCACCTG GCTGCAGTACG TGATTCTTG ATCCCGAG CTTCG GG TTGG AAGTGGG TGG GAGAG TTCGAG GCCTTGCGC TTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGC A C C TTC G C G C C TG TC TC G C TG C TT TC G A TA A G TC TC TA G C C A TTT A A A A TTT TTG A TG A C C TG C TG C G A C G C T TTT T TTC TG G C AAG ATAG TC TTG TAAATG C G G G CC AAG ATCTG C ACAC TG G TATTTC G G TTTTTG G G G CC G C G G G C G G C G A CGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGT AGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTG GCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGAC GCGG CGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCAT G TG AC TC CAC G G AG TAC C G G G CG CC G TCC AG G CAC C TC G ATTAG TTCTCG AG C TTTTG G AG TAC G TCG TC TTTAG G T TG G G G GGAG GGG TTTTATG CG ATGG AGTTTCCCCACACTG AGTG GGTGGAG ACTGAAGTTAGG CCAGCTTGGCACTT G A T G T A A T T C TC C T TG G A A TTT G C C C TTT TTG A G TT TG G A TC TTG G TT C A T TC TC A A G C C T C A G A C A G TG G TTC A A A G T T T T T T T C T T C C A T T T C A G G T G T C G T G^a(SEQ ID N O : 11 ) .

Gly/Ser (SEQ ID NO:25)

GGGGS

Gly/Ser (SEQ ID NO:26): Esta secuencia puede abarcar de 1 a 6 unidades de repetición "Gly Gly Gly S er" GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS

Gly/Ser (SEQ ID NO:27)

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

Gly/Ser (SEQ ID NO:28)

GGGGSGGGGSGGGGS

G ly/Ser (SEQ ID NO:29)

GGGS

PoliA (SEQ ID NO:30)

Esta secuencia puede abarcar entre 50-5.000 adeninas.

a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 60 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 120 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 180 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 240 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 300 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 360 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 420 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 480 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 540 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 600 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 660 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 720 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 780 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 840 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 900 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 960 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1020 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1080 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1140 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1200 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1260 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1320 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1380 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1440 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1500 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1560 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1620 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1680 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1740 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1800 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1860 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1920 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1980 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2040 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2100 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2160 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2220 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2280 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2340 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2400 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2460 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2520 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2580 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2640 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2700 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2760 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2820 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2880 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2940 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3000 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3060 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3120 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3180 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3240 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3300 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3360 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3420 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3480 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3540 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3600 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3660 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3720 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3780 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3840 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3900 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3960 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4020 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4080 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4140 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4200 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4260 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4320 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4380 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4440 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4500 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4560 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4620 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4680 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4740 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4800 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4860 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4920 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4980 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 5000

PoliA (SEQ ID NO:31)

t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 60 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 100

PoliA (SEQ ID NO:32)

Esta secuencia puede abarcar entre 50-5.000 timinas.

t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 60 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 120 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 180 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 240 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 300 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 360 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 420 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 480 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 540 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 600 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 660 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 720 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 780 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 840 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 900 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 960 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 1020 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 1080 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 1140 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 1200 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 1260 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 1320 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 1380 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 1440 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 1500 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 1560 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 1620 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 1680 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 1740 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 1800 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 1860 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 1920 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 1980 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 2040 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 2100 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 2160 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 2220 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 2280 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 2340 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 2400 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 2460 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 2520 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 2580 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 2640 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 2700 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 2760 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 2820 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 2880 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 2940 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 3000 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 3060 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 3120 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 3180 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 3240 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 3300 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 3360 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 3420 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 3480 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 3540 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 3600 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 3660 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 3720 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 3780 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 3840 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 3900 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 3960 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 4020 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 4080 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 4140 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 4200 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 4260 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 4320 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 4380 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 4440 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 4500 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 4560 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 4620 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 4680 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 4740 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 4800 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 4860 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 4920 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 4980 t t t t t t t t t t t t t t t t t t t t 5000

PoliA (SEQ ID NO:33)

Esta secuencia puede abarcar entre 100-5.000 adeninas.

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 120 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 180 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 240 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 300 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 360 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 420 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 480 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 540 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 600 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 660 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 720 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 780 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 840 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 900 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 960 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1020 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1080 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1140 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1200 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1260 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1320 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1380 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1440 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1500 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1560 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1620 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1680 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1740 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1800 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1860 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1920 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1980 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2040 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2100 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2160 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2220 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2280 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2340 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2400 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2460 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2520 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2580 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2640 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2700 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2760 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2820 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2880 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2940 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3000 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3060 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3120 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3180 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3240 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3300 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3360 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3420 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3480 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3540 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3600 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3660 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3720 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3780 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3840 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3900 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 3960 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4020 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4080 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4140

a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4200 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4260 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4320 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4380 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4440 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4500 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4560 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4620 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4680 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4740 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4800 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4860 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4920 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 4980 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 5000

PoliA (SEQ ID NO:34)

a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 60 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 120 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 180 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 240 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 300 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 360 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 400

PoliA (SEQ ID NO:35)

a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 60 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 120 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 180 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 240 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 300 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 360 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 420 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 480 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 540 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 600 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 660 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 720 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 780 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 840 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 900 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 960 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1020 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1080 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1140 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1200 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1260 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1320 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1380 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1440 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1500 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1560 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1620 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1680 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1740 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1800 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1860 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1920 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 1980 a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a 2000

Gly/Ser (SEQ ID NO:38): Esta secuencia puede abarcar de 1-10 unidades de repetición "Gly Gly Gly S er" GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS

Ejemplo 2: Expresión y caracterización de constructos scFv antimesotelina humana para terapia CAR

Se realizaron análisis adicionales para caracterizar los constructos scFv antimesotelina humana, por ejemplo, análisis de espectrometría de masas, cromatografía de exclusión de tamaño y resonancia de plasmón superficial (SPR). La afinidad de unión y la unión del epítopo (en comparación con el epítopo SS1) en el dominio extracelular de la mesotelina se determinó mediante SPR. A continuación se describen los ensayos y resultados de este análisis.

Expresión de candidatos scFv y Mesotelina humana biotinilada

Para evaluar las características de unión y biofísicas de los scFv antimesotelina humana identificados por el paneo de fagos, se produjeron transitoriamente constructos de scFv y se purificaron a partir de células HEK293F junto con el dominio extracelular de mesotelina humana (MSLN ECD humano). También se produjo SS1 scFv, que es un scFv murino antimesotelina, como referencia. Los scFv antimesotelina humana ensayados fueron M5, M11, M12, M14, M16, M17, M21 y M23 (véase la Tabla 14). Los plásmidos que codifican los aminoácidos para las constructos scFv de M5 (SEQ ID NO: 43), M11 (SEQ ID NO: 49), M12 (SEQ ID NO: 50), M14 (SEQ ID NO: 52), M16 (SEQ ID NO: 54), M17 (SEQ ID NO: 55), M21 (SEQ ID NO: 59), M23 (SEQ ID NO: 61) y SS1 (SEQ ID NO: 275) y MSLN ECD humano (SEQ ID NO: 276) fueron sintetizados externamente. Los ScFv se produjeron con una etiqueta 7x u 8xHis en el C-terminal de los constructos. Las constructos de scFv humano (M5, M11, M12, M14, M16, M17, M21 y M23) tenían una secuencia enlazadora corta que comprendía la secuencia g S que enlazaba el C-terminal del scFv con el N-terminal de una etiqueta 8xHis, por ejemplo, Gs HHHHHHHH (SEQ ID NO: 277). La mesotelina humana ECD se produjo con una etiqueta Avi C-terminal (SEQ ID NO: 276) y fue biotinilado selectivamente in vitro con la enzima BirA de Avidity, LLC. La expresión transitoria y la purificación en células HEK293F se realizaron con la metodología estándar. Para los scFvs, se transfectaron brevemente 100 ml de células HEK293F a 3*106 células/ml con 100 ^g de plásmido y 300 ^g de polietilenimina. Las células se incubaron a 37°C con 8% de CO2 y se rotaron a 80 rpm. Después de seis días, las células se cosecharon por centrifugación a 3.500 g durante 20 minutos. El sobrenadante se purificó uniendo el scFv a 200 ^l de perlas de agarosa Ni-NTA (Qiagen) durante la noche a 4 °C. La proteína se eludió con 200 ^l de imidazol 300mM, y se dializó contra solución salina tamponada con fosfato.

La secuencia del SS1 scFv con la etiqueta His se proporciona a continuación

QVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSS

STAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPAIMSASPGEK

VTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSGYP

LTFGAGTKLEIEFGSHHHHHHH (SEQ ID NO: 275 )

La secuencia del ECD de mesotelina humana con la etiqueta Avi C-terminal se proporciona a continuación

DAAQPAASEVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQG

YPESVIQHLGYLFLKMSPEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPG

YLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQN

VSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLG LQGTRGSHHHHHHEFRHDSGLNDIFEAQKIEWHE (SEQ ID NO: 276 )

Análisis por Espectrometría de Masas

Para confirmar la identidad, los scFvs purificados se analizaron con cromatografía líquida de alto rendimiento acoplada a espectrometría de masas (HPLC-MS). Se inyectó 1 ^g de cada una en una columna Poros R1/10 de 2,1 mm * 100 mm (Life Technologies) calentada a 60 °C. La separación se realizó en una Waters BioAcquity UPLC. La fase móvil A era ácido fórmico al 0,1 %; la fase móvil B era ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo al 25%, isopropanol al 75%. Los scFvs se eludieron a 0,5 ml/min utilizando un gradiente de 25-50 % de fase móvil B en 15 minutos. La detección por espectrometría de masas se llevó a cabo con un instrumento Waters Xevo-Tof que funcionaba en modo de iones positivos por electroaerosol y que escaneaba de 600 a 4.000 m/z con una rampa de voltaje del cono de 20 a 50 V. Los espectros de masas resultantes se promediaron a lo largo de la anchura del pico y se deconvolucionaron utilizando el algoritmo MaxEnt1 de Waters para determinar las masas de los scFvs expresados.

Análisis de Cromatografía de Exclusión por Tamaño

Se realizó una cromatografía de exclusión por tamaño para determinar los estados de oligomerización de los scFvs expresados. Se inyectaron 25 ^g de cada uno en una columna TSKGel Super SW3000 de 4,6 mm * 300 mm (Tosoh Bioscience) calentada a 35 °C. Los scFvs se eludieron a 0,3 ml/min en 750 mM de arginina, 1 mM de EDTA, 20 mM de fosfato sódico, 250 mM de cloruro sódico, pH 7,2; la absorbancia UV se monitorizó a 280 nm.

Resonancia de Plasmón de Superficie (SPR)

La afinidad de unión de los scFvs purificados se midió en un sistema Biacore T200. Brevemente, la mesotelina humana recombinante biotinilada ECD fue inmovilizada en la superficie de un chip sensor de estreptavidina (SA) a una densidad de 150 RU. El scFv purificado se inyectó sobre el chip bajo un flujo constante en diluciones seriadas de tres veces. Las tasas de asociación y disociación del complejo proteico se controlaron durante 270 y 400 segundos, respectivamente. La doble referencia se realizó contra una célula de flujo inmovilizada en blanco y un tampón en blanxo. La afinidad se determinó con un modelo de unión Langmuir 1:1 cuando fue posible, para aquellos scFVs en los que no fue posible un ajuste preciso debido a las rápidas tasas de encendido y apagado, se utilizó el modelo de estado estacionario.

Para determinar el epítopo de unión relativo de cada uno de los scFvs en comparación con el SS1, 50 nM de SS1 fueron capturados por el ECD de mesotelina biotinilado inmovilizado en un chip sensor de estreptavidina a un tiempo de contacto de 180 segundos resultando en una densidad relativa de 70 RU. El scFv purificado a 100 nM (M5, M11, M12, M14, M16, M17, M21 o M23) se inyectó inmediatamente sobre el chip para minimizar la disociación del complejo SS1/mesotelina. La unión del scFv secundario se monitorizó durante 270 segundos.

Resultados

Las masas observadas para los scFvs, determinadas por HPLC-MS, fueron consistentes con los valores teóricos con base en las secuencias de aminoácidos. Los scFv expresados oscilaron entre 43 % de monómeros >98 % de monómero con base en la cromatografía de exclusión por tamaño analítica. Los scFvs seleccionados representaban una amplia gama de afinidades, desde 0,9 nM hasta 114 nM, en comparación con el scFV de control SS1 que tenía una afinidad aparente de 0,1 nM por la mesotelina ECD (Tabla 14). En la Figura 41A, B y C se muestran sensogramas SPR representativos para SS1, M5 y M11, respectivamente.

La agrupación relativa de epítopos (Figura 42) sugiere que M12, M14, M16, M17, M21, M23 son ligantes competitivos con SS1 a la mesotelina humana mientras que M5 y M11 parecen ligarse a un epítopo único, como se juzga por el aumento de la respuesta en el ensayo tras su inyección.

Tabla 14. Características de los scFv anti-Mesotelina humana

Ejemplo 3: Análisis y actividad in vitro de scFv humanos con los CART

Los fragmentos variables de cadena única para anticuerpos anti-MSLN se clonaron en vectores lentivirales de expresión CAR con la cadena CD3zeta y la molécula coestimuladora 4-1BB y los constructos óptimos se seleccionan con base en la cantidad y calidad de las respuestas de las células T efectoras de las células T transducidas por MSLN CAR ("CART-MSLN" o "células T CART-MSLN") en respuesta a objetivos que expresan MSLN ("MSLN+"). Las respuestas de las células T efectoras incluyen, pero no se limitan a, la expansión celular, la proliferación, la duplicación, la producción de citoquinas y la destrucción de las células objetivo o la actividad citolítica (desgranulación).

Generación de CART-MSLN

Los vectores de transferencia lentivirales que codifican scFv humanos se utilizan para producir el material genómico empaquetado en las partículas lentivirales psuedotípicas VSVg. El ADN del vector de transferencia lentiviral se mezcla con los tres componentes de empaquetamiento de VSVg, gag/pol y rev en combinación con el reactivo lipofectamina para transfectarlos juntos en células Lenti-X 293T (Clontech).

Después de 30 horas, el medio fue recogido, filtrado y almacenado a -80 C. Los CART-MSLN terapéuticos se generaron partiendo de la sangre de un donante normal afersado cuyas células T ingenuas se obtienen por selección negativa para células T, linfocitos CD4+ y CD8+. Estas células se activan con perlas CD3x28 (Dynabeads® Human T-Expander CD3/CD28, Invitrogen) en una proporción de 13 en RPMI1640, 10 % de suero fetal de ternera inactivado por calor (FCS), 2 mM de L-glutamina, 1x de penicilina/estreptomicina, 100 pM de aminoácidos no esenciales, 1 mM de NaPiruvato, 10 mM de Hepes y 55 pM de 2-mercaptoetanol) a 37°C, 5% de CO2, las células T se cultivaron a 1*10® células T en 0,5 ml de medio por pocillo de una placa de 24 pocillos. Después de 24 horas, las células T son voladas y se añaden 0,5 ml de sobrenadante viral no concentrado, o volúmenes más pequeños de sobrenadante viral concentrado. Las células T comienzan a dividirse siguiendo un patrón de crecimiento logarítmico, que se controla midiendo los recuentos de células por ml, y las células T se diluyen en medio fresco cada dos días. A medida que las células T comienzan a descansar después de aproximadamente 10 días, el crecimiento logarítmico disminuye. La combinación de la ralentización de la tasa de crecimiento y el tamaño de las células T que se acercan a los ~300 fl determina el estado de las células T que deben ser criopreservadas para su posterior análisis.

Antes de la criopreservación, se determinó el porcentaje de células transducidas (que expresan el CAR específico de mesotelina en la superficie celular) y su intensidad de fluorescencia relativa de dicha expresión mediante análisis de citometría de flujo en un FACS-CantoII o FACS Fortessa. La comparación de los histogramas de la intensidad fluorescente relativa de ese FACS mostró el porcentaje de células T transducidas. La transducción del virus muestra niveles de expresión comparables que se correlacionan con la eficacia de la transducción, el porcentaje de células transducidas. Los resultados indican que no hay ningún efecto negativo detectable del CAR-MSLN portador de scFv humano en la capacidad de las células para expandirse normalmente cuando se compara con las células T no transducidas ("UTD") y el CART-MSLN SS1.

Evaluación de la actividad citolítica y la secreción de citoquinas de las células T redirigidas por CART-MSLN.

Para evaluar las capacidades funcionales de las células T CART-MSLN para destruir y secretar citoquinas, se descongelaron las células y se dejaron recuperar durante la noche. Además del scFv humano que lleva CART-MSLN, el CART-MSLN que lleva el scFv murino "SS1" (véase el documentoWO2013/040577) se utilizó como control. El control SS1 scFV con CART-MSLN (también denominado SS1 CART-MSLN) se utilizó en todos los ensayos para comparar la variación del ensayo y/o actuar como control. Las células CART con scFv SS1, así como todos los demás scFv humanos con MSLN-CAR^t, se produjeron en condiciones de fabricación de grado de investigación (es decir, no de grado clínico). Se utilizó CD19-BBz o Iso1-BBz como CAR no objetivo para el efecto CART de fondo.

La destrucción de células T se dirigió hacia K562, una línea celular de leucemia mielógena crónica. Se generaron células K652 MSLN+ (K562-Meso) mediante transducción. Se utilizó como control el K5652 que no expresa MSLN. Para el ensayo de citotoxicidad con base en el flujo, las células objetivo se tiñen con éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CSFE) para cuantificar su presencia. Las actividades citolíticas de CART-MSLN se midieron en una titulación de proporciones efectoras: células objetivo de 10:1, 3:1 y 1:1, donde los efectores se definieron como células T que expresaban el receptor quimérico anti-MSLN. Los ensayos se iniciaron mezclando un número adecuado de células T con un número constante de células objetivo. Después de 20 horas, se centrifugaron las placas y se extrajo el volumen total de cada mezcla. Se lavó la pella de células restante en cada pozo y se tiñeron las células con el marcador vivo/muerto 7AAD. Tras el último lavado, las células transformadas en pellas se volvieron a suspender en un volumen específico con un número predeterminado de perlas de recuento. Los datos de tinción celular se recogieron mediante citometría de flujo CantolI y se analizaron con el software FloJo, utilizando perlas para cuantificar los resultados.

Parcelas de ensayos de destrucción basados en flujo de 20 horas utilizando proporciones tituladas de Efector a Objetivo (E:T) con células efectoras CART-MSLN dirigidas a K562 marcadas con CSFE (FIG. 3A. Controles de MSLN no expresivos) y K562-Meso (FIG. 3B, células K562 transducidas para expresar MSLN). Comparando estas curvas de destrucción, titulando la cantidad de células efectoras se observa que se destruyen las células que expresan MSLN. Las células T del mismo donante y que fueron transducidas con células CAR-MSLN portadoras de scFv humanos o con células CAR-MSLN SS1 fueron capaces de destruir selectivamente objetivos MSLN+. Las actividades citolíticas de todas las células CART-MSLN son similares y comparables a las CART-MSLN murinas SS1. Demuestran que todas las células CART-MSLN se vuelven reactivas a la mesotelina tras la transducción y adquieren la capacidad de destruir a las células objetivo que expresan altos niveles de mesotelina. Para medir la producción de citoquinas de los scFv humanos portadores de CART-MSLN, las células se descongelaron y se dejaron recuperar durante la noche. Además del CART-MSLN humanizado, se utilizó el CART-MSLN SS1 (scFv murino) con fines comparativos. Se utilizó CD19-BBz CART como control sin objetivo para el efecto de las células CART de fondo. Se utilizó el SS1 CART-MSLN en todos los ensayos para comparar la variación del ensayo. Las células T se dirigieron hacia K562, una línea celular de leucemia mielógena crónica (tanto MSLN+ como MSLN), la línea celular de cáncer de ovario Ovcar8, que expresa MLSN, y las líneas de cáncer de páncreas SW1990 y Panc0203. Al analizar la expresión de MSLN por citometría de flujo, detectamos una expresión 10 veces menor de MSLN en Ovcar8 en comparación con las células K562 MSLN+; SW1990 expresó 10 veces menos que Ovcar8. La expresión de MSLN en Panc0203 no fue detectable por citometría de flujo, pero fue positiva por análisis de ARN. Además, se utilizó PMA/Ionomicina para evaluar el potencial de las células T para responder a las señales inmunológicas endógenas. El ensayo sólo prueba una proporción efector: objetivo de 1:1. El ensayo se realiza durante 24 horas después de la mezcla de las células, cuando se retira el medio para el análisis de citoquinas utilizando el kit IFN-y CBA-Flex para la detección de citoquinas humanas.

Se analizaron los niveles de fondo de la citoquina producida por las células CART-MSLN después de la exposición a las células K562 de control que no expresan MSLN. La secreción potencial de citoquinas a partir de la estimulación de las células T con PMA/Ionomicina indica que las poblaciones celulares tienen un potencial ligeramente variable para secretar citoquinas. Las diferencias se trataron normalizando la liberación específica de IFNy sobre la liberación máxima (PMA/Ionomicina).

Los datos muestran que la mayoría de los scFv humanos con CART-MSLN y el CART-MSLN murino SS1 produjeron IFNy cuando se cultivaron con K562 que sobre expresaban MSLN. Cuando se cultivaron con células cancerosas que expresaban endógenamente MSLN (a niveles más bajos), sólo unos pocos CART respondieron (M5, 11, 14, 15, 16, 17 y SS1), mientras que los dos CART M5 y M11 mostraron niveles superiores de IFNy. Los niveles endógenos más bajos de MSLN podrían reflejar mejor los niveles naturalmente expresados de mesotelina en las células tumorales, aquellos CART que tienen esos scFV podrían tener una respuesta terapéutica mejorada que los CART que tienen la constructo SS1.

Ejemplo 4: Ensayo clínico de los CART generados por lentivirales

Los pacientes se seleccionarán entre aquellos que tengan cánceres que expresen mesotelina, tal como el cáncer epitelial de ovario grave, el mesotelioma plural maligno o el cáncer de páncreas.

La fabricación y las pruebas de liberación de las células CART-MSLN serán realizadas por el Clinical Cell and Vaccine Production (CVPF) de la University of Pennsylvania. El producto CART-MSLN se fabricará a partir del producto de aféresis de los pacientes.

Se llevará a cabo un procedimiento de aféresis de aproximadamente 10 litros en el centro de University of Pennsylvania Apheresis (4 semanas antes de la primera dosis de células T CAR). Las PBMC de un paciente se obtienen para las células T CAR durante este procedimiento. A partir de una sola leucaféresis, se pretende recoger al menos 5 x 109 glóbulos blancos para fabricar células T CAR. También se obtienen y criopreservan los leucocitos de la sangre de referencia para los requisitos de revisión de la FDA y para la investigación. Se espera que el producto de células T modificado con mesotelina esté listo para su lanzamiento aproximadamente 4 semanas después.

Los CART generados por lentivirales se hicieron como se describe en el Ejemplo 2 utilizando células aisladas de cada paciente, es decir, células T autólogas. Los CART-MSLN hechos a partir de las células T de cada paciente expresan scFvs humanos (incluyendo M5 y M11), o SS1.

Al final de los cultivos celulares, las células se criopreservan en criomedios infusibles en bolsas. La dosis es de 1-5*107 células T CAR para la Cohorte 1, y de 1-5*108 células transducidas CAR para las cohortes 2 y 3, calculadas como un intervalo de 2-50 % de células transducidas en el total de células. Las bolsas que contienen productos de células T CAR modificadas autólogas se almacenarán en un congelador controlado y vigilado en el CVPF del Hospital de la University of Pennsylvania. Las bolsas de infusión se guardarán en el congelador hasta que se necesiten.

Cada dosis será empacada y criopreservada en 1 bolsa de infusión en un volumen dependiente del número total de células, una función de la eficiencia de transducción; el volumen mínimo será de 10 mL por bolsa. Cada bolsa contendrá una alícuota (cuyo volumen dependerá de la dosis total de células) de criomedia.

Los sujetos de la cohorte 1 (N=3-6) recibirán una única dosis plana intravenosa de células CART-MSLN autólogas de 1-5*107 en el día 0. Los sujetos de la cohorte 2 (N=3-6) recibirán una única dosis plana intravenosa de células CART-MSLN autólogas 1-5*108 el día 0. Los sujetos de la cohorte 1 y 2 no recibirán ninguna quimioterapia linfodependiente antes de las células CART-MSLN. La cohorte 3 (N=6) recibirá 1,5 gramos/m2 de ciclofosfamida por vía intravenosa dos días antes de una dosis única plana intravenosa de 1-5*108 células CART-MSLN autólogas.

Se prevé que los pacientes que reciben ciclofosfamida pueden experimentar náuseas y vómitos como efecto secundario del tratamiento. La profilaxis antiemética premedicación para las náuseas puede administrarse antes de la infusión de quimioterapia de acuerdo con las normas institucionales. La elección del agente específico se dejará a la discreción del investigador, aunque los corticosteroides no deben utilizarse debido a sus efectos inmunosupresores.

Los efectos secundarios tras las infusiones de células T pueden incluir fiebre transitoria, escalofríos, rigores, mialgias/artralgias, dolor de cabeza, fatiga y/o náuseas. Los sujetos serán premedicados con acetaminofén 650 mg por vía oral y clorhidrato de difenhidramina por vía oral o intravenosa antes de la infusión de células T CAR. Si el Benadryl está contraindicado, se administrará un bloqueador H2, tal como la ranitidina. Estos medicamentos pueden repetirse cada seis horas según sea necesario. Se puede prescribir un tratamiento con antiinflamatorios no esteroideos si el paciente sigue teniendo fiebre que no se alivia con el paracetamol. Se recomienda que los pacientes no reciban corticosteroides sistémicos como hidrocortisona, prednisona, prednisolona (Solu-Medrol) o dexametasona (Decadron). Si se requieren corticosteroides para una reacción infusional aguda, se recomienda una dosis inicial de hidrocortisona de 100 mg.

• El coordinador del estudio o el personal del CVPF transportarán una bolsa de células CART-MSLN en hielo seco desde el CVPF hasta la cabecera del sujeto en CTRC.

• Las células T transfectadas serán descongeladas por un miembro del personal de la CVPF en un baño de agua a 37 °C junto a la cama del sujeto. La bolsa se masajeará suavemente hasta que las células se acaben de descongelar. Si el producto de células T CAR parece tener una bolsa dañada o con fugas, o parece estar en peligro, no debe infundirse y debe devolverse a la CVPF como se especifica a continuación.

• Las células se infundirán al sujeto mientras están frías con aproximadamente 10-15 minutos después de la descongelación. Las células T transfectadas se infundirán rápidamente por vía intravenosa a través de un equipo de sangre de tipo Y sin látex de calibre 18 con llave de paso de 3 vías. No hay filtro de leucocitos en la infusión. La dosificación se realizará mediante infusión por gravedad. Si la velocidad de infusión por gravedad es demasiado lenta, el producto farmacológico de las células T transfectadas puede aspirarse en una jeringa a través de la llave de paso e infundirse manualmente a la velocidad requerida. No debe quedar ningún grumo congelado en la bolsa.

• Antes de la infusión, dos personas verificarán de forma independiente la información de la etiqueta de cada bolsa en presencia del sujeto y confirmarán que la información coincide correctamente con el participante.

• Los pacientes serán monitorizados durante y después de la infusión de las células T transfectadas. Se obtendrán y registrarán la temperatura, la presión arterial, la frecuencia cardíaca, la frecuencia respiratoria y la oximetría de pulso inmediatamente antes de la dosis y cada 15 minutos durante las 2 horas siguientes a la finalización de la infusión.

• El equipo médico de emergencia (es decir, un carro de paradas) debe estar disponible para una situación de emergencia durante la infusión en caso de que el sujeto tenga una respuesta alérgica, o una crisis hipotensiva grave, o cualquier otra reacción a la infusión.

• Si no se presentan síntomas y los signos vitales del sujeto permanecen normales 2 horas después de la infusión, el sujeto será dado de alta a su casa con instrucciones de regresar al hospital si se presenta algún síntoma. Si la medición de los signos vitales no es estable, se seguirá obteniendo aproximadamente cada 15 minutos hasta que los signos vitales del sujeto se estabilicen o el médico dé de alta al paciente. Se pedirá al sujeto que no salga hasta que el médico considere que es seguro que lo haga.

• Dentro de los 60 minutos (± 5 minutos) siguientes a la finalización de la dosificación de células T CAR transducidas, se obtendrá una muestra de sangre para una determinación de línea de base del número de células T CAR transducidas y de los niveles de citoquinas.

• Se indicará a los sujetos que vuelvan al CTRC o al Centro Perelman en 24 horas después de la primera infusión para realizar análisis de sangre y un examen de seguimiento de acuerdo con el SOE.

Para los CART que llevan scFv las dosis de células pueden repetirse según sea necesario.

Se aplicarán estadísticas descriptivas para determinar la persistencia relativa y el tráfico a la sangre (y opcionalmente al tumor) de las células CART-MSLN. Se presentarán gráficamente los datos relativos al número de células T CAR en sangre, los niveles de HAMA y el seguimiento de los niveles de biomarcadores solubles. Se determinarán las correlaciones con las medidas radiográficas y otras medidas estándar de la carga tumoral. Se calcularán los intervalos de confianza del 95 % para las proporciones y las medias.

Se recogerán y evaluarán los acontecimientos adversos de todos los pacientes durante los períodos de notificación de EA especificados en el protocolo. La gravedad de los EA se clasificará según los criterios comunes de toxicidad (v4) del National Cancer Institute (NCI). Se describirán todos los acontecimientos adversos y se elaborarán intervalos de confianza exactos del 95 % para las tasas de acontecimientos adversos, tanto en general como dentro de las categorías principales. Los datos se monitorizarán continuamente para detectar indicios de toxicidad excesiva. Los resultados serán tabulados y resumidos.

Las tasas de respuestas clínicas se resumirán en intervalos de confianza exactos del 95 %. Las distribuciones de la supervivencia libre de progresión y global y la duración de la respuesta clínica se presentarán gráficamente mediante curvas de Kaplan-Meier. Se presentarán las tasas de supervivencia a dos años. Las pruebas preliminares de eficacia se determinarán mediante el seguimiento de las tasas de respuesta tumoral en aquellos sujetos con enfermedad medible. La respuesta del tumor se evaluará mediante imágenes radiográficas (es decir, imágenes de TC) y biomarcadores séricos en el día 28 y en los meses 3 y 6 después de la infusión.

• Las respuestas radiográficas se medirán según los Criterios de Evaluación de la Respuesta en Tumores Sólidos (RECIST 1.1), los criterios RECIST modificados para el mesotelioma pleural y los Criterios de Respuesta Inmune (iRRC).

• Las respuestas de los biomarcadores séricos se evaluarán según las normas de cada enfermedad; además, se medirá el SMRP de todos los sujetos. Por ejemplo, los sujetos con cáncer de páncreas tendrán un seguimiento de los niveles de CA19-9, CEA y proteína sérica relacionada con la mesotelina [SMRP]) tras la administración de células T CAR. A los sujetos con cáncer de ovario se les controlarán los niveles séricos de CA125, y también de SMRP. A los sujetos con mesotelioma se les medirán los niveles séricos de SMRP. En todos los casos, los biomarcadores séricos no se utilizarán como única medida de la respuesta tumoral, dado que las células CART-MSLN pueden afectar a los ensayos utilizados en estas mediciones de biomarcadores.

• Los datos se analizarán de forma descriptiva para las tasas de respuesta global, la supervivencia sin progresión y la supervivencia global.

Se evaluarán la SLP y la SG hasta 2 años después de la infusión o hasta que los sujetos inicien una terapia relacionada con el cáncer.

Se llevarán a cabo evaluaciones de seguridad, incluyendo la monitorización sanguínea de los niveles de citoquinas. Los sujetos se inscribirán en serie. Las infusiones se escalonarán para permitir 28 días de evaluación de la seguridad entre los sujetos inscritos en cada cohorte.

Ejemplo 5: Ensayo clínico para los CART generados por ARN

Las células T autólogas son diseñadas para expresar un constructo SS1 CAR extracelular que reconoce la mesotelina, junto con el dominio transmembrana, además de los dominios de señalización 4-1BB y CD3zeta humanos descritos anteriormente. Véase, por ejemplo el documento WO2013/040577Ejemplo 1.

Producción de Ácidos Nucleicos que contienen CAR

Los SS1-CARs se construyen como sigue. Las CAR que contienen scFv antimesotelina humana también se construyen con procedimientos similares.

Se utilizaron dos plásmidos diferentes para clonar el fragmento ss1.bbz. El fragmento scFv de mesotelina (ss1) fue clonado por primera vez por el laboratorio del Programa de Investigación Traslacional (TRP) a partir del constructo previamente publicado del Dr. Pastan (Chowdhury et al., 1998). La bisagra humana de CD8a y el dominio transmembrana junto con la secuencia 41BB y CD3Z se clonaron por PCR a partir del plásmido pELNS.CD19-BB-Z descrito anteriormente (Milone et al., 2009). En el presente documento se describen las secuencias de los dominios de bisagra, transmembrana y de señalización intracelular. El fragmento ss1.bbz se clonó primero en el vector pGEM.GFP.64A (proporcionado por Eli Gilboa y descrito en Boczkowsk, D et al., 2000). Este vector fue modificado mediante la adición de dos repeticiones de beta globina 3'UTR y 150bp de la secuencia poliA (SEQ ID NO: 271) (sustituyendo la secuencia 64 polyi(SEQ ID NO: 273) en pGEM.GFP.64A) para mejorar la expresión del transgén (Holtkamp 2006). El plásmido que cumple con las GMP para uso clínico se obtuvo subclonando el fragmento ss1.bbz.2bgUTR.150A de pGEM en el vector pDrive. El vector de clonación pDrive (Qiagen) está diseñado para una clonación altamente eficiente de los productos de la PCR a través de la hibridación UA. Permite la selección de clones recombinantes tanto con ampicilina como con kanamicina, y viene con sitios de cebadores de secuenciación universal, y promotores T7 y SP6 para la transcripción in vitro . Primero, ss1.bbz.2bgUTR. 150A fue cortada del vector pGEM por Hind III y Ndel (Fill-in blunt) y subclonada en pDrive cortada por Kpnl y NotI (Fill-in blunt). Se confirmó la secuencia del inserto con la orientación correcta para generar pDrive.ss1.bbz.2bgUTR.150A. El gen de resistencia a la ampicilina en los vectores pDrive se eliminó mediante una doble digestión con Ahdl y BciVI. Para eliminar posibles proteínas aberrantes traducidas a partir de marcos de lectura abiertos (ORF) internos dentro de los CAR o Rf , todos los ORF internos que tenían un tamaño superior a 60 pb fueron mutados por PCR de mutagénesis, mientras que el ORF del CAR ss1 se mantuvo intacto. El plásmido resultante se designó pD-A.ss1.bbz.OF.2bg.150A, como se muestra en la Figura 1.

La producción de ácidos nucleicos CAR para su introducción en células T autólogas se preparó como sigue. El constructo final pD-A.ss1.bbz.OF.2bg.150A se introdujo en células E Coli químicamente competentes OneShot TOP10 (Invitrogen) según CVPF SOP 1188. Se generaron hasta 10 mg de ADN plasmídico preparado como un lote utilizando el kit de aislamiento de ADN QIAfilter Giga según el SOP 1191, a partir de dos 1,25 litros de medio LB que contenía 100 |jg/ml de kanamicina. Se linealizó 1 mg de ADN a la vez con la enzima de restricción Spel durante una noche a 37 °C. La linealización se confirmó mediante electroforesis en gel antes de la purificación a gran escala utilizando el kit Qiagen Plasmid Maxi.

El ARN se transcribió a partir de los plásmidos utilizando el sistema mScript ARNm y se aisló utilizando el kit RNeasy Maxi (Qiagen). El ARN transcrito in vitro se criopreservó en alícuotas de 0,5 mL a una concentración de 1 mg/mL. La calidad y la cantidad del ARN se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % tras 15 minutos de desnaturalización a 70 °C en tampón de desnaturalización de ARNm (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se cuantificaron mediante espectrofotometría UV (OD260/280).

Fabricación de productos de células T CAR.

Se realiza un procedimiento de aféresis de 7 a 12 litros unas 4 semanas antes de la primera dosis de células T CAR. Las PBMC se obtienen para las células T CAR durante este procedimiento. A partir de una sola leucaféresis, se pretende recoger al menos 5 x 109 glóbulos blancos para fabricar células T CAR.

Las células T CD3+ se enriquecen a partir de un producto de leucaféresis mediante la depleción de monocitos a través de la elutriación centrífuga a contracorriente en el CaridianBCT Elutra, que emplea un conjunto desechable de sistema cerrado de un solo uso. En el día 0, se inicia el procedimiento de fabricación de células T con la activación con perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos monoclonales anti-CD3/CD28, y se inicia la expansión en una bolsa de cultivo de tejidos estática. En el día 5, las células se transferirán a un biorreactor WAVE si es necesario para una expansión adicional. Al final del cultivo, las células se despojan de las perlas magnéticas, se lavan y se concentran utilizando el sistema Cell Saver de Haemonetics. Las células postcosecha se incuban durante la noche a 37 °C para su electroporación a la mañana siguiente. Las células se lavan y se resuspenden en Tampón de Electroporación (Maxcyte) y se cargan en el ensamblaje de procesamiento Maxcyte. Las células se electroporan con el ARN ss1, se dejan recuperar durante 4 horas y se formulan en medios de criopreservación infusibles.

Embalaje

Se suministrarán 1x108 o 1x109 ±20 % células T CAR modificadas en bolsas de infusión intravenosa mantenidas en hielo húmedo. Cada bolsa contendrá una alícuota (volumen dependiente de la dosis) de criomedia que contiene los siguientes reactivos de grado infusible (% v/v): 31.25 plasmalyte-A, 31,25 dextrosa (5 %), 0,45 NaCl, hasta 7,50 DMSO, 1,00 dextrano 40 y 5,00 albúmina de suero humano. Las bolsas se pueden congelar a -135 °C.

Estabilidad del Producto de Células T CAR

Las células T CAR ss1 se criopreservarán 4 horas después de la electroporación, y se descongelarán y administrarán en un plazo de tres meses después de la fabricación de las células T. Se ha demostrado que la expresión de scFv de mesotelina de las células T CAR ss1 criopreservadas aproximadamente 30 días a <-130 °C fue del 97,4 %, casi idéntica al momento de la criopreservación (96,9%), y otros productos de células T criopreservadas son estables durante al menos 6 meses. La viabilidad después de la descongelación, con base en los recuentos de azul de tripán, fue del 75,2 % frente al 98,7 %. Los datos de expresión sugieren que el producto final es estable durante el almacenamiento para el ensayo, y que el vial centinela para las dosis adicionales debería cumplir los criterios de liberación del 70 % de viabilidad y >20 % de expresión de CAR. Se descongelarán viales adicionales de células T ss1 CAR a los 3, 6, 9 y 12 meses después de la criopreservación, y se comprobará la viabilidad y la expresión del transgén para generar más datos sobre la estabilidad del producto.

Procedimiento y resultados del ensayo clínico: Se realiza un ensayo clínico de fase I de células T autólogas redirigidas por mesotelina administradas a pacientes con mesotelioma pleural maligno. Se pueden utilizar procedimientos similares para un estudio de tratamiento de pacientes con cáncer de páncreas.

Dosificaciones

Los pacientes de la cohorte 1 (n=3) recibirán una única infusión de 1*108 utilizando una dosificación plana de células T ^cA^rde ARN antimeso el día 0 y una infusión de 1*109 células T CAR de ARN el día 7, siempre que los pacientes cumplan con las evaluaciones de seguridad especificadas en el protocolo antes de la infusión del día 7.

Los pacientes de la cohorte 2 (n=6) recibirán 2 ciclos de células T CAR modificadas. Un ciclo consiste en 3 infusiones en días alternos (lunes, miércoles y viernes). El ciclo 1 consiste en 3 dosis de 1*108 células T CAR dosificadas en MWF (día 0, 2, 4); el ciclo 2 consiste en 3 dosis de 1*109 células T CAR dosificadas en MWF (día 7, 9, 11).

La dosis objetivo por infusión es de 1* 108 células (una dosis para la Cohorte 1 y dosis de la semana 1 para la Cohorte 2) y 1* 109±20% células (una dosis para la Cohorte 1 y dosis de la semana 2 para la Cohorte 2). La dosis mínima aceptable es de 1*108. Si la expansión celular total es inferior a la dosis celular total aceptable, el paciente puede someterse a una segunda aféresis en un intento de expandir más células y cumplir la dosis total objetivo. Si hay contraindicaciones para la segunda aféresis o si la segunda aféresis y la expansión no producen la dosis mínima aceptable, la dosis se considerará un fallo de fabricación. Para los pacientes de la Cohorte 1, se fabricarán/congelarán tantas células T electroporadas con mesotelina CAR como sea posible para reducir la probabilidad de que los sujetos se sometan a una segunda leucaféresis en el caso de que sigan el régimen de la Cohorte 1 ampliada.

La desescalada de dosis se producirá si más de un paciente desarrolla una DLT de la infusión de células T CAR modificadas. En caso de DLT, se desescalá la dosis en 10 veces. Así, si la toxicidad se produce durante el ciclo 1 con 108 células T CAR, entonces todas las infusiones (dosis 1 a 6) se reducirían a 107células T CAR. En caso de toxicidad inmanejable con 107 células T CAR, el ensayo se detendría.

Un problema potencial que puede surgir en pacientes tratados con células T CAR de expresión transitoria (particularmente con los CART con scFv murinos) es la anafilaxia después de múltiples tratamientos.

Sin estar limitado por esta teoría, se cree que tal respuesta anafiláctica podría ser causada por un paciente que desarrolla una respuesta humoral anti-CAR, es decir, anticuerpos anti-CAR que tienen un isotipo anti-IgE. Se cree que las células productoras de anticuerpos de un paciente sufren una conmutación de clase del isotipo IgG (que no causa anafilaxia) al isotipo IgE cuando hay una pausa de diez a catorce días en la exposición al antígeno. Por lo tanto, para los CART transitorios (tal como los generados por electroporación de ARN), las pausas de infusión de los CART deben durar más de diez a catorce días.

Además, el uso de los CAR con scFvs humanos (en lugar de murinos) podría reducir la probabilidad e intensidad de que un paciente tenga una respuesta antiCAR.

Procedimiento del Estudio

El estudio consiste en 1) una fase de cribado, 2) una fase de intervención que consiste en aféresis, infusión de células T CAR, evaluación de efectos secundarios y biopsia tumoral opcional, y 3) visitas de seguimiento.

Evaluación de la Línea de Base y de Cribado

Un investigador debe explicar al sujeto la naturaleza del protocolo del estudio y los riesgos asociados al mismo en detalle. El sujeto debe firmar y fechar el consentimiento informado por escrito antes de participar en el estudio. El procedimiento de consentimiento informado y la fecha se registrarán en la historia clínica del sujeto y en el CRF. Se debe obtener el consentimiento informado antes de realizar los procedimientos del protocolo. Si un procedimiento necesario para el cribado se realizó antes de firmar el consentimiento informado y el procedimiento cumple los plazos del protocolo, este procedimiento puede utilizarse para la evaluación de cribado.

Los procedimientos de cribado (no requeridos para determinar la elegibilidad) se completarán dentro de las 6 semanas siguientes a la primera dosis de células T CAR (a menos que se indique lo contrario en el SOE). En el caso de que se necesite una segunda aféresis para expandir células T adicionales y alcanzar la dosis de células objetivo, esta ventana de tiempo no cubrirá todos los procedimientos. Por lo tanto, en esta situación específica, se permite un período de 6 a 8 semanas para realizar las exploraciones de referencia.

Los procedimientos de detección incluyen:

■ Consentimiento informado

■ Confirmar un estado de rendimiento ECOG < 1

■ Determinación de la eficacia de la fabricación (para los 2 primeros pacientes): se envía una muestra de sangre al CVPF para determinar la viabilidad de la fabricación de células T. En aproximadamente 1 semana, el CVPF devolverá un resultado sobre si las PBMC de los sujetos pueden ser adecuadas para el procedimiento de fabricación de células T CAR a gran escala. Los resultados deben conocerse antes de realizar cualquier procedimiento adicional del estudio.

■ Historial médico completo

■ Examen físico que incluye signos vitales, altura, peso y saturación de oxígeno

■ Revisión de los medicamentos concomitantes

■ Hematología (WBC con diferencial, RBC, Hct, Hgb y plaquetas)

■ PT y PTT

■ Química (sodio, potasio, cloruro, bicarbonato, nitrógeno ureico, creatinina, glucosa, proteínas totales, albúmina, calcio, fosfatasa alcalina, bilirrubina total, ALT, AST)

■ Pantallas virales: VIH, VHC, VHB y serología para CMV

■ Panel de autoanticuerpos: ANA, ESR

■ Análisis de orina

■ Electrocardiograma (ECG) de 12 derivaciones

■ Suero pHCG embarazo (mujeres en edad fértil)

■ Espirometría y DLCO

■ Evaluación del tumor TAC de tórax con contraste, otras evaluaciones radiográficas según indicación clínica. La exploración PET/CT es opcional.

■ Confirmación patológica de mesotelioma epitelial o mixto (bifásico) y tinción para mesotelina por parte del patólogo específico del protocolo.

Leucaféresis

Se llevará a cabo un procedimiento de aféresis de 7 a 12 litros en el centro de University of Pennsylvania Apheresis (4 semanas antes de la primera dosis de células T CAR). Las PBMC se obtienen para las células T CAR durante este procedimiento. A partir de una sola leucaféresis, se pretende recoger al menos 5 x 109 glóbulos blancos para fabricar células T CAR. Si la cosecha no tiene éxito, los pacientes tendrán la opción de someterse a una segunda leucaféresis. También se obtienen y criopreservan los leucocitos de la sangre de referencia para los requisitos de revisión de la FDA y para la investigación. Se espera que el producto de células T modificado con mesotelina esté listo para su lanzamiento aproximadamente 4 semanas después. Todos los pacientes se someterán al examen estándar de leucaféresis antes del procedimiento.

Evaluación Previa a la Infusión (Día de Estudio -3, antes de la primera dosis)

Esta evaluación de seguridad incluye el examen físico (por ejemplo, signos vitales, peso, etc.), la revisión de los medicamentos concomitantes, el estado de rendimiento, la química, el hemograma con diferencial, la prueba de embarazo (orina), el análisis de orina, el electrocardiograma, la RXC y las muestras de sangre de investigación.

Administración de células T CAR

Antes de cada infusión de células T CAR, los pacientes se someterán a una PE limitada orientada a los problemas, a la revisión de los acontecimientos adversos, al estado de rendimiento ECOG, al hemograma, a la química y al análisis de orina. Los sujetos volverán al HUP 1 día después de la infusión de células T CAR (D1, D3, D8 y D10) para someterse a una EP limitada orientada a los problemas, a la revisión de los acontecimientos adversos, a la medicación concomitante, al estado de rendimiento ECOG, al hemograma y a la química. El día 7, los pacientes de la Cohorte 1 también se someterán a un electrocardiograma. En el día 14, los pacientes de la Cohorte 2 también se someterán a una RXC y a un electrocardiograma.

Las células T CAR se administrarán como se ha descrito anteriormente. Se evaluarán las constantes vitales de los sujetos y se realizará una oximetría de pulso antes de la dosificación, al final de la infusión y cada 15 minutos a partir de entonces durante 2 horas y hasta que éstas se estabilicen.

Evaluación posterior a la infusión

Los niveles de citoquinas en sangre se monitorizarán a 1h, 4h, 1 día y 3 días después de la primera infusión y a 1h, 4h, 1 día y 3 días, 7 días y 14 días después de la segunda infusión para los pacientes de la Cohorte 1. Se recogerá sangre para el análisis del injerto (citometría de flujo y RT-PCR) durante los 21 días siguientes a la primera infusión.

Para los pacientes de la Cohorte 2 (y de la Cohorte 1 ampliada), los niveles de citoquinas se monitorizarán a 1h después de cada infusión y en puntos de tiempo adicionales según el SOE. Los datos primarios de seguridad y de injerto se recogen durante los 35 días siguientes a la primera administración de células T CAR (día 0).

1 día después de la infusión de células T CAR, se extrae sangre para realizar citometría de flujo y RT-PCR con el fin de evaluar las células T CAR circulantes. Se procesarán muestras de sangre periférica para aislar: a) células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para evaluar el fenotipo y la función de las células inmunitarias, b) ARN para cuantificar la persistencia y la distribución a corto plazo de las células T CAR infundidas y c) suero para cuantificar y evaluar el subconjunto de células inmunitarias y los factores inmunitarios y de crecimiento solubles, evaluar el desarrollo de respuestas inmunitarias de las células antiinfundidas y realizar análisis de protoarreglo para evaluar el desarrollo de respuestas inmunitarias humorales antitumorales a través de la propagación de epítopos inmunitarios.

Los sujetos serán evaluados en el mes 2 y 3 (Cohorte 1), y en los meses 2, 3 y 6 después de la última infusión de células T CAR (Cohorte 2 y Cohorte 1 ampliada) para la evaluación de la seguridad, como se describió anteriormente.

Biopsia tumoral y miniaféresis

Para la Cohorte 2 y la Cohorte 1 ampliada: Si el tumor es visible o accesible mediante biopsia guiada por imagen, los sujetos elegibles se someterán a una biopsia directa del tumor o a una biopsia guiada por imagen para evaluar la presencia de células T CAR y la expresión de mesotelina. Se programará en el Día 14 después de la infusión de células T para los sujetos de la Cohorte 2. Se medirá la frecuencia de los linfocitos totales que infiltran el tumor y los subconjuntos de células T, así como la expresión de marcadores moleculares de la respuesta antitumoral de las células T. Estos se compararán con los valores de referencia de las muestras tumorales quirúrgicas almacenadas, si están disponibles. Los sujetos tendrán la opción de rechazar la biopsia del tumor. El líquido intracavitario también puede presentarse como biopsia.

Se realiza una miniaféresis (2L) con fines de investigación y para fines de "mirar hacia atrás" de la FDA para archivar las células T CAR para el análisis de seguridad en el día 21 posterior a la infusión. Se puede recoger una muestra de sangre en lugar de la leucaféresis.

Evaluación de la respuesta del tumor

La respuesta tumoral se evaluará en el Día 35 y el Mes 2 para la Cohorte 1 y en el Día 35, Meses 2 y 6 después de la última infusión de células T CAR para la Cohorte 2 (y la Cohorte 1 Ampliada), o hasta que el paciente requiera una terapia MPM alternativa. La evaluación del tumor se realizará mediante TAC con contraste de tórax y otros procedimientos según la indicación clínica.

El ejemplo anterior puede realizarse con los CART de scFv portadores de humanos, utilizando por ejemplo los scFvs de los constructos CAR M5, M11, M14, M15, M16 y M17.

Ejemplo 6: CART-MSLN Induce la Actividad Antitumoral en las Neoplasias Sólidas

Este ejemplo presenta dos informes de casos de ensayos clínicos en curso que indican que la transferencia adoptiva de células T CAR de ARNm (las PBMC fueron electroporadas con el constructo mesotelina CAR) que se dirigen a la mesotelina (CART-MSLN) es factible y segura sin evidencia manifiesta de toxicidad fuera del tumor en el objetivo contra los tejidos normales. Estos casos también demuestran que CART-MSLN puede infiltrarse y tener actividad antitumoral en tumores malignos sólidos, tale como el mesotelioma plural maligno (MPM) y el cáncer de páncreas.

El sujeto 17510-105 tenía MPM y recibió 3 infusiones de CARTmeso. El sujeto 21211-101 tenía cáncer de páncreas metastásico (PDA) y se le administraron 8 dosis de CARTmeso por infusión intravenosa y 2 inyecciones intratumorales. Ambos pacientes eran de edad avanzada y tenían un cáncer refractario a la quimioterapia con una gran carga tumoral en el momento de la inscripción.

Actividad clínica antitumoral de las células meso CART

En ambos casos se evaluó la respuesta del tumor mediante generación de imágenes por tomografía computarizada (TC). Además, el paciente con PDA fue evaluado por la avidez de [18F]2-fluoro-2-desoxi-D-glucosa (FDG) en imágenes de tomografía por emisión de positrones/tomografía computarizada (PET/CT) antes y después de las infusiones (FIG. 6) El paciente con MPM tenía la enfermedad estable después de recibir infusiones de CARTmeso, sin embargo, desarrolló una respuesta parcial confirmada después de recibir una infusión de células de CARTmeso en el Programa 2 (FIG. 6A). El paciente con PDA tenía la enfermedad estable después de 3 semanas de terapia intravenosa con CARTmeso. Mediante imágenes FDG PET/Ct, se observó una disminución del valor máximo de captación estandarizado (SUVmáx) en todas las localizaciones de la enfermedad. Para profundizar en esta respuesta metabólica, se determinaron los cambios en el producto volumétrico medio (MVPmedia) para cada lugar de la enfermedad (FIG. 6B, 6C y 6D). Sólo se observó una disminución de la de MVPmedia en las lesiones peritoneales. Para comprender mejor el impacto de la terapia celular CARTmeso en la carga tumoral peritoneal, se analizó el líquido de ascitis mediante citometría de flujo. El análisis del líquido ascítico en los días 3 y 15 tras el inicio de la terapia reveló una disminución del 40 % en la concentración de células tumorales que coexpresaban mesotelina y c-met. (FIG.

6D). En general, estos resultados sugieren un papel de las infusiones de células CARTmeso en la inducción de un efecto antitumoral en estos pacientes.

También se evaluaron los marcadores tumorales serológicos en ambos pacientes. Se midieron los niveles de péptido relacionado con la mesotelina (SMRP) y CA19-9 en suero antes y después de las infusiones de células CARTmeso. En el caso del paciente con MPM, los niveles de SMRP disminuyeron después de recibir la primera infusión del Programa 2, coincidiendo con la reducción de la carga tumoral observada en las imágenes de TC. En el caso del paciente con PDA, los niveles de CA19-9 aumentaron lentamente en el transcurso del tratamiento, pero se mantuvieron estables durante un mes. Tras la finalización de las inyecciones intratumorales de células CARTmeso, los niveles de CA19-9 aumentaron en consonancia con la progresión de la enfermedad.

Persistencia y tráfico in vivo de células CARTmeso

Se desarrolló un ensayo qPCR para detectar y cuantificar la persistencia de las células CARTmeso en los pacientes tras la infusión. El análisis de las muestras de sangre periférica, ascitis y tumor de los dos pacientes se presenta en la FIG. 7. El transgén CARTmeso se detectó en ambos pacientes inmediatamente después de cada infusión. De acuerdo con la naturaleza biodegradable del transgén CARTmeso, se observó que los niveles disminuían progresivamente en días sucesivos.

El tráfico de las células CARTmeso en los tejidos tumorales se evaluó en el paciente con PDA mediante la recogida de ascitis en un punto de tiempo serial y mediante una biopsia del tumor.

Inducción de la propagación del epítopo humoral tras la infusión de células CARTmeso

Se probó la hipótesis de que las células CARTmeso, si son capaces de reconocer y lisar células tumorales primarias in vivo, podrían provocar una respuesta inmunitaria antitumoral sistémica. Se realizó un análisis serológico de alto rendimiento para medir la inducción de respuestas de anticuerpos a los antígenos para detectar el desarrollo de una respuesta inmune policlonal que puede haber ocurrido como resultado de la destrucción del tumor y la propagación del epítopo. Estos análisis se llevaron a cabo mediante una interrogación imparcial de las respuestas de igG inducidas por el tratamiento de casi 10.000 proteínas humanas independientes. En el paciente con PDA, se detectaron nuevas respuestas de anticuerpos en el día 44 a más de 100 proteínas. Del mismo modo, se observaron elevadas respuestas de anticuerpos a un subconjunto de proteínas en el paciente con MPM. En general, estas respuestas inmunes de anticuerpos observadas en ambos pacientes son consistentes con la destrucción del tumor mediada por células T CAR que conduce a la liberación de autoproteínas que se presentan de forma cruzada en un procedimiento clásico de propagación de epítopos.

También se examinó el suero de ambos pacientes antes y después del tratamiento para la inducción de respuestas inmunitarias antitumorales mediante inmunotransferencia utilizando proteínas purificadas asociadas al tumor o lisados de proteínas de líneas celulares humanas de MPM o PDA. Las respuestas inmunitarias antitumorales se definieron por la presencia de nuevas bandas o el aumento de la intensidad de las bandas preexistentes en las inmunotransferencias (FIG. 9). En ambos pacientes, se observaron alteraciones en el patrón de anticuerpos durante el tratamiento, por ejemplo, aumentos en los anticuerpos que detectan proteínas presentes en las líneas celulares tumorales alogénicas. Estos resultados, junto con el análisis del protoarreglo, sugieren que la infusión de células CARTmeso indujo una respuesta inmunitaria humoral antitumoral.

Ejemplo 7: Tratamiento combinado para mejorar la función de CART en tumores sólidos

La inmunoterapia que utiliza linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) transferidos adoptivamente está limitada por la inactivación funcional de las células T dentro del microambiente del tumor sólido. En este estudio, se inyectaron por vía intravenosa células T humanas que expresaban meso CAR en ratones inmunodeficientes portadores de tumores de flanco de mesotelioma humano de gran tamaño y con expresión de mesotelina. El análisis de las células T meso-CAR aisladas (mesoCART) mostró una rápida pérdida de funciones efectoras que parecía ser multifactorial. Los resultados de estos experimentos demuestran que los inhibidores de los mecanismos que causan la pérdida de la función efectora de mesoCART pueden ser útiles en una terapia combinada para mejorar la eficacia del tratamiento con mesoCART in vivo.

Materiales y Procedimientos

Generación de mesoCAR y preparación del vector lentivirus. Los constructos lentivirales que contienen mesotelina CAR ss1 se prepararon como se ha descrito anteriormente. Los constructos mesotelina CAR humana y las células T que los expresan también pueden generarse utilizando los procedimientos descritos anteriormente.

Líneas celulares. Se utilizó una línea celular de mesotelioma humano derivada del tumor de un paciente - EMP (parental)-. Dado que EMP no tenía una expresión de línea de base del antígeno de mesotelina asociado al tumor (TAA) , se transfectó con un lentivirus para expresar de forma estable la mesotelina humana (la línea celular transducida se denominó EMMESO). Las células también fueron transducidas para expresar de forma estable la luciferasa de luciérnaga (denominada EMPffluc, EMMESOffluc).

Ensayos de Efectores de células T. Las células T efectoras se cocultivaron con células tumorales que expresaban luciferasa de luciérnaga en diferentes proporciones durante un periodo de tiempo determinado. Al final del periodo de incubación del cocultivo, se guardó el sobrenadante para determinar los niveles de IFN mediante ELISA (Biolegend #430106), se lavaron los pocillos y se lisaron las células tumorales restantes con tampón de lisis celular IX durante 30 minutos. La actividad de la luciferasa en los lisados se analizó utilizando el Sistema de Ensayo de Luciferasa en un Sistema de Detección Múltiple GloMax (Promega) Los resultados se presentan como porcentaje de destrucción con base en la actividad de la luciferasa en pocillos con tumor, pero sin células T. (% de destrucción = 100-((RLU del pocillo con cocultivo de células efectoras y objetivo)/(RLU del pocillo con células objetivo)*100)). La proporción entre efectores y objetivos representa el total de células T por célula objetivo.

Animales. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el correspondiente Institutional Animal Care and Use Committee. Los ratones NOD/scid/IL2rY-/-(NSG) fueron criados en la Animal Services Unit del Wistar Institute and Children's Hospital of Philadelphia. Se utilizaron ratones hembra para los experimentos de 10 a 16 semanas de edad.

Experimentos de Xenoinjerto In Vivo. Se inyectaron 5 x 106 células tumorales EMMESO en los flancos de ratones NSG en una solución de medio X-Vivo (Lonza) y Matrigel (BD Biosciences). Una vez establecidos los tumores (100 200 mm3), los ratones fueron asignados aleatoriamente a uno de los tres grupos de tratamiento intravenoso (colavenosa): 1) 20 x 106 células T no transducidas (NT) (células T activadas con Dynabead®), 2) 20 * 106 células T mesoCAR (células T activadas con Dynabead® transducidas con mesoCAR) 3) solución salina. Los tumores se midieron con calibradores y el volumen tumoral se calculó mediante la fórmula (n/6)*(longitud)*(anchura)2. Los grupos contenían 10 ratones cada uno. Los experimentos in vivo se repitieron tres veces.

Resultados

Hipofunción observada en los CART infiltrados en el tumor

La línea celular de mesotelioma humano que expresa mesotelina, EMMESO, se inyectó en los flancos de ratones NSG y se dejó crecer hasta un tamaño de entre 100 y 200 mm3 En ese momento, los ratones portadores de tumores recibieron una inyección intravenosa de 20 millones de células T (la expresión de mesoCAR era aproximadamente 50% (datos no mostrados)). Se observó una ralentización significativa del crecimiento tumoral tras un retraso de 14 días (FIG. 10), sin embargo, a diferencia de nuestra experiencia con otra línea celular de mesotelioma (Carpenito et al., Proc Natl Acad Sci USA, 106(9):3360-65 (2009), Zhao et al., Cancer Res, 70(22):9053-61 (2010).) no se observó ninguna regresión tumoral ni curación. La inyección de células T no transducidas tuvo efectos antitumorales mínimos en comparación con el control tratado con solución salina (FIG. 10), lo que indica que la reducción en el crecimiento tumoral observada en animales tratados con células T que expresan mesoCAR fue el resultado de mesoCAR.

Se realizaron diversos análisis para comprender por qué no se observaron regresiones tumorales después del tratamiento con CART. Se examinaron los tumores de EMMESCO y se encontró que los mesoCART estaban presentes en gran número, sin embargo, las células T presentes se habían vuelto hipofuncionales. Dado que el nivel de expresión de CAR en losCAR TIL era igual o mayor que el de las células antes de la inyección (FIG. 11A y 11B), se comparó su actividad funcional. Se aislaron y analizaron las mesoCAR TIL de los tumores EMMESO 40 días después de la inyección (todos los estudios se iniciaron inmediatamente después del aislamiento) y se compararon con el mismo lote de células T mesoCAR que se había utilizado para la inyección original y se había congelado ("crio mesoCAR"). Estas células se estudiaron después de descongelarlas e incubarlas en 37oC/5 %CO2 durante 18 horas. Cuando se añadieron células T crio-mesoCAR y los mesoCAR TIL de flanco a células EMMESO cultivadas que expresaban luciferasa de luciérnaga (EMMESOffluc) en una proporción de 20:1 durante 18 horas, las células T criomesoCAR fueron altamente eficientes en la destrucción de las células tumorales (>95 %), mientras que los mesoCAR TIL destruyeron sólo aproximadamente 10 % de las células tumorales durante este mismo período de tiempo (FIG.

11C, p<0,001).

Análisis adicionales también demostraron que las células T mesoCAR no produjeron citoquinas, tales como IL-2 e IFNg, después de la exposición al antígeno o a PMA/Ionomicina. Por el contrario, las células T crio-meso CAR produjeron citoquinas. Las células T mesoCAR también demostraron una reducción de la señalización, por la reducción o ausencia de la expresión de fósforo-ERK mediante inmunotransferencia 20 minutos después de la exposición a las perlas recubiertas conanti-CD3/CD28. Por el contrario, las células T crio-meso CAR conservaron la expresión de fósforo-ERK tras la exposición a las perlas.

Los mesoCAR TIL humanos expresan mayores niveles de receptores inhibidores

A continuación, se evaluó la expresión de cuatro receptores inhibitorios (IR) que se han descrito previamente en los TIL hipofuncionales aislados de humanos mediante citometría de flujo en: i) las células T mesoCAR criogénicas que se utilizaron para la inyección, ii) los mesoCAR TIL recién aisladas del Día 39 de EMMESO, y iii) los mesoCAR TIL "recuperados" que se habían extraído del tumor durante 24 horas (Tabla 6). Los CAR TIL expresaron altos niveles de receptores inhibidores. Estos niveles eran en general mucho más bajos tras 24 horas de recuperación fuera del microambiente tumoral. En el caso de los CD4 CAR TIL, PD-1 pasó del 73 % al 53 %, LAG-3 pasó del 63 % al 3 % y TIM3 pasó del 24 % al 1 %. la expresión de 2B4 era elevada y permanecía elevada después del reposo (67 % a 88 %). En el caso de los CD8 CAR TIL, PD-1 pasó del 26 % al 21 %, LAG-3 pasó del 48 % al 13 % y TIM3 pasó del 56 % al 1 %. La expresión de 2B4 era elevada y permanecía elevada después del reposo (96 % a 98 %).

T l . Ex r i n l r r inhi i r IR n l TIL 71 1

Tres de estas IR fueron también evaluadas en las células T humanas que pudieron ser aisladas del bazo de los ratones EMMESO. Curiosamente, los niveles de expresión de PD-1, TIM3 y lAG3 eran todos más bajos en las células T esplénicas en comparación con los TIL (Tabla 7), soportando un papel clave para el microambiente del tumor en la regulación de los IR.

Tabla 7. m r i n l x r i n l r r l inhi i r n l TIL n l l l lénicas

Los mesoCAR TIL humanos expresan mayores niveles de enzimas inhibidoras intracelulares.

Los niveles de expresión de dos inhibidores intrínsecos de la función de las células T que han sido implicados en la disfunción de los TIL, SHP-1 y DGK, se examinaron mediante inmunotransferencia (FIG. 12). Los niveles de ambas isoformas de DGK (alfa y zeta), así como la forma fosforilada de SHP1 (pSHP1), fueron significativamente elevados en los mesoCAR TIL recién aislados del tumor del flanco de EMMESO en comparación con los TIL en reposo nocturno. Esto también se confirmó en el caso de la DGK mediante citometría de flujo, donde el 23 % de los TIL frescos de EMMESO expresaban DGK. La expresión fue indetectable tras el reposo nocturno.

Bloqueo de los inhibidores en las células T mesoCAR humanas mejora su función de destrucción ex vivo.

Dados estos datos de expresión, se estudió la potencial importancia funcional de vías inhibidoras específicas en los mesoCAR TIL introduciendo agentes bloqueadores disponibles durante los ensayos de destrucción ex vivo y de liberación de citoquinas. La adición de un anticuerpo anti-PDLl restauró significativamente la actividad de destrucción y la capacidad de secretar IFN por parte de los mesoCAR TIL (FIG. 13A y 13B). La dosis relativamente alta de 10ug/ml de anticuerpo anti-PDLl se basó en investigaciones publicadas anteriormente sobre la inmunoterapia del cáncer. La adición de un inhibidor de la DGK de tipo I o de tipo II aumentó significativamente la capacidad de destrucción (FIG.

13C), pero sin aumentar significativamente la secreción de IFN inducida por el tumor (FIG. 13D). La adición del inhibidor de SHP1, el estibogluconato de sodio (SSG), inhibió ligeramente la capacidad de destrucción de las células T crio-mesoCAR, pero aumentó significativamente la de los mesoCAR TIL (FIG. 13E), así como el aumento significativo de la secreción de IFN inducida por el tumor (FIG. 13F) de los mesoCAR TIL . Se realizaron curvas dosisrespuesta para ambos inhibidores de DGK y para SSG, y se utilizaron las dosis más altas que no indujeron la destrucción directa de las células tumorales.

En conjunto, los resultados de estos experimentos demuestran que la hipofunción de los CART in vivo es reversible. En concreto, la modulación de los mecanismos inhibidores que reducen la función de CART puede aumentar la función efectora y, por tanto, puede aumentar la eficacia terapéutica. Los inhibidores de los receptores inhibidores, tales como PD-1, LAG3 y TIM3, pueden ser útiles en la terapia de combinación con los CART para aumentar la eficacia.

Ejemplo 8: Caracterización del meso CAR humano

Generación de CART-MSLN humanos

Las PBMC de un sujeto normal fueron aisladas de una muestra de sangre. Las PBMC fueron transducidas con constructos lentivirus que contenían los CAR de mesotelina humana descritos en el presente documento. La transducción y el cultivo de las células para producir CART-MSLN se describen en los ejemplos anteriores. Los CART producidos expresan mesotelina CAr S con constructos scFv incluyendo M1, M2, M3, M4, M5, M6, M7, M8, M9, M10, M11, M12, M13, M14, M15, M16, M17, M18, M19, M20, M21, M22, M23 y M24. También se generaron CART de control, incluyendo CART que expresan CARss1 (scFv murino antimesotelina) (para el control positivo), y CART anti-CD19 (para el control negativo).

Ensayo de citoquinas

Se evaluó la producción de citoquinas tras la estimulación por parte de las células tumorales. Los CART que expresan M5, M11, M17, M21, ss1 y CAR19 se mezclaron con diferentes líneas celulares tumorales en una proporción de 1:1 de efector a diana, y se sembraron a 50.000 células por pocillo. Las líneas celulares tumorales fueron K562-meso (línea celular de LMC que expresa mesotelina), Ovcar3 (cáncer de ovario), Ovcar8 (cáncer de ovario) y SW1990 (adenocarcinoma de páncreas). Después de 24 horas, se realizó un análisis CBA para determinar la expresión y/o secreción de citoquinas de IFN^y, TNF, IL-2 e IL-4.

Como se muestra en la FIG. 15A, CART-MSLN21 (M21) conduce a la activación más fuerte por K562-Meso. CART MSLN5 y CART-MSLN11 fueron estimulados por SW1990 para producir IFNy. La producción/secreción de IL-2 fue similar para los CART-MSLN probados (FIG. 15C). Como se muestra en la FlG. 15D, apenas hubo producción de IL-4. Otros estudios también mostraron muy poca producción de IL-10.

Ensayo de destrucción

También se evaluó in vitro la capacidad del CART-MSLN para dirigirse a las células tumorales y destruirlas . Se utilizó un ensayo con base en la luciferasa, con líneas celulares tumorales que expresan reporteros de luciferasa. Las células objetivo (células tumorales) se colocaron a 20.000 objetivos/pocillo. Se añadieron CART-MSLN en distintas proporciones efector: objetivo, de 10:1, 5:1, 2,5:1 y 1:1. Las células se cultivaron durante 20 horas y se detectó la luminiscencia de cada pocillo para determinar el porcentaje de células objetivo destruidas. Se utilizaron como células objetivo las líneas celulares Ovcar3 (cáncer de ovario) y U87mg (glioblastoma) que expresan luciferasa.

Como se muestra en la FIG. 16A, los CART que expresan M5, M11, M17 y ss1 tuvieron un rendimiento similar en la destrucción de las células tumorales objetivo. No se observó ninguna destrucción para CART-MSLN21. Por el contrario, no se observó la destrucción de ninguno de los constructos CART para las células de glioblastoma (FIG.

16B). Se obtuvieron resultados similares para el panel de los meso CAR humanos, donde M11, M5, M17 y SS1 tuvieron la mayor destrucción específica de células Ovcar3 (FIG. 17A y 17B).

Modelo de ratón in vivo

La actividad antitumoral de CART-MSLN se evaluó in vivo en un modelo de xenoinjerto Ovcar8. Se implantaron 10*10® células Ovcar8 por vía subcutánea el día 0 en ratones NSG. En el día 14, se administraron por vía intravenosa 2x10® células CART (CART que expresan M5, M11, M17, M21, SSI y CD19, o células no transducidas; 10*10® células T totales) en una dosis de 100 pl. Los ratones y los tumores fueron monitorizados durante aproximadamente 40 días después de la implantación de las células tumorales.

Los resultados de este experimento muestran que los CART que expresan M5 y M11 exhiben una fuerte actividad antitumoral en este modelo (FIG. 18). En comparación con el grupo tratado de forma simulada, los ratones tratados con M5 y M11 mostraron una reducción tumoral estadísticamente significativa (p<0,05).

Se realizó un segundo experimento de xenoinjerto in vivo para evaluar la actividad antitumoral de un segundo conjunto de células CART-MSLN. Se inyectaron 10*10® células OVCAR8-mcherry en ratones NSG. Una vez que los tumores alcanzaron 150-250 mm2, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en grupos de tratamiento. Se inyectaron CART que expresaban M12, M14, M1®, M23, ss1, CD19 o células no tratadas a una dosis de 10*106 células T en 100 pl. Aproximadamente 40 % de las células T expresaban CAR, y por lo tanto, a la dosificación administrada, se entregaron aproximadamente 4*10® células CART a cada animal. Los resultados de este experimento muestran que los CART que expresan el anti-MSLN humano (M12, M14, M1® y M23) no tuvieron efecto sobre el crecimiento del tumor (FIG. 19). Estos resultados, junto con los resultados del primer conjunto de CART-MSLN evaluados, indican que M5 y M11 tienen una actividad antitumoral específica en comparación con los otros CART-MSLN probados, y por lo tanto demuestran su potencial para una mayor investigación para la terapia del cáncer. Además, CART-SS1 no mostró ninguna actividad antitumoral en el primer experimento de xenoinjerto ni en el segundo, lo que indica además que M5 y M11 que contienen CART-MSLN son más eficaces para reducir el crecimiento del tumor.

Ejemplo 9: La inhibición de DGK aumenta la eficacia de CART

Estudios anteriores, por ejemplo, los experimentos discutidos en el Ejemplo ®, han sugerido que las células T CAR pierden eficacia con el tiempo in vivo (por ejemplo, en el microambiente del tumor). Específicamente, las células T mesoCAR que se inyectaron en un modelo de ratón con tumor se aislaron de los tumores después de la infusión de células T (por ejemplo, 39 días después, en lo sucesivo denominados linfocitos infiltrantes de tumores, TIL) y se evaluó su actividad funcional en comparación con las células T mesoCAR recién descongeladas. Los resultados mostraron que en los ensayos de destrucción ex vivo y de liberación de IFNy, las células T mesoCAR aisladas del tumor tenían una capacidad reducida para destruir las células tumorales (FIG. 20A), reducción de la producción de IFNg (FIG. 20B), y la reducción de la señalización de ERK (como se muestra por la fosforilación en el análisis de transferencia western, FIG. 20C) en respuesta al antígeno o a los estímulos CD3/CD28 (lo que indica una menor activación de las células T.

Los mecanismos inhibitorios que posiblemente explican la disminución de la actividad de las células T CAR in vivo a lo largo del tiempo incluyen: factores solubles (TGFb, PGE2, adenosina, IL10, ligandos RAGE, etc.), contacto célula a célula (PD-1, lAG3, CTLA4, TIM3, CD1®0, etc.), y los sistemas de retroalimentación negativa intracelular inducidos por la activación intrínseca (diaglicerol quinasas: isoformas a y Z, Egrs (2 y 3), SHP-1, NFAT2, BLIMP-1, Itch, GRAIL, Cbl-b, Ikaros, etc.). La activación de las células T puede inducir factores tales como la DGK. La DGK, a su vez, inhibe la señalización del DAG mediante su fosforilación. Esto limita la activación inducida por el DAG de la vía RAS-ERK-AP1 que conduce a la activación de las células T. Estudios anteriores han demostrado que los ratones deficientes en DGKa o DGKZ dan lugar a células T CD4 que demuestran una mayor transducción de señales y parecen más resistentes a los estímulos inductores de anergia.

Ensayos de Citotoxicidad y Liberación de Citoquinas In Vitro

Para investigar el efecto de la inhibición de DGK en la eficacia de las células CART, se utilizaron ratones transgénicos con deleciones en los genes DGKa, DGKZ, o ambos. Se aislaron células T esplénicas de ratones de tipo silvestre y deficientes en DGK, y se transdujeron para que expresaran mesoCAR (SS1 BBZ) mediante retrovirus. El MIGR1 CAR se utilizó como control.

Se realizó un ensayo de citotoxicidad utilizando procedimientos similares a los descritos en los Ejemplos anteriores. Se incubaron células expresando mesoCAR de tipo silvestre y deficiente en DGK (KO) en diversas proporciones efectoras: objetivo y se cuantificó la citotoxicidad (% de células objetivo destruidas) (FIG. 21). Como se muestra en la Figura 21, la supresión de las DGK mejoró notablemente la función efectora de las células T CAR, especialmente a bajas proporciones efectoras: objetivo.

De manera similar, se examinó la liberación de IFN^yen respuesta a las células objetivo en proporciones variables de efector: objetivo después de 18 horas. Como se muestra en la Figura 22, se descubrió que la deleción de las DGK mejoraba notablemente la función efectora de las células T mesoCAR, especialmente en proporciones bajas efectoras: objetivo.

El análisis de transferencia Western de las células T mesoCAR deficientes en DGK en comparación con las células T mesoCAR de tipo silvestre mostró una mayor fosforilación de ERK (FIG. 23), lo que indica que la presencia de DGK suprime la señalización de ERK, mientras que la supresión de DGK resulta en un aumento de la señalización de ERK. El aumento de la señalización de ERK en el fondo suprimido de DGK sugiere que la inhibición de DGK da lugar a la activación de la vía Ras-ERK-API y, por lo tanto, a la activación de las células T.

Estudios recientes han demostrado que el TGFp modula la funcionalidad de las células T CD8 infiltrantes de tumores a través de la interferencia con la transducción de señales RAS/ERK, las mismas moléculas de señalización por las que la deficiencia de DGK confiere efectos aumentados a las células T. Se examinó la sensibilidad de las células T mesoCAR deficientes en DGK al TGFp. Células T mesoCAR WT y DGK-deficientes fueron incubadas con células tumorales AE17 que expresan mesotelina o - 10ng/ml de TGFp durante 18 horas. Se midió la citotoxicidad y la producción de IFNg de estas células T. Como se muestra en la Figura 24, el TGFp inhibió la destrucción en 50 % en las células T CAR WT (flechas). Sin embargo, esta inhibición inducida por el TGFp no se observó en las células T CAR con deleción de DGK, lo que demuestra que las células deficientes en DGK no son sensibles a la modulación del TGFp, y son más resistentes a los estímulos inhibidores tales como TGFp, lo que puede contribuir al aumento de la actividad de las células T.

Eficacia terapéutica de la inhibición de mesoCAR y DGK in vivo

A continuación, se examinó la eficacia terapéutica de las células T mesoCAR en el contexto de la inhibición o deficiencia de DGK. Se inyectaron células tumorales AE17meso (células de mesotelioma) por vía subcutánea en ratones C57BL/6. Cuando los tumores alcanzaron 100 mm3 (aproximadamente una semana después), se inyectaron 10 millones de células T mesoCAR por vía intravenosa a través de la vena de la cola. A continuación, se realizó un seguimiento de los volúmenes tumorales durante al menos 18 días.

Las células T mesoCAR deficientes en DGK demostraron una actividad antitumoral mejorada y prolongada en comparación con las células mesoCAR de tipo silvestre (WT) y las no tratadas (FIG. 25A). En concreto, cada una de las tres células T mesoCAR deficientes en DGK demostró inhibir el crecimiento tumoral en volumen en comparación con las células WT y las no tratadas hasta 18 días después de la inyección. También se demostró que las células deficientes en DGKz que expresan mesoCAR persisten y proliferan mejor que las células T meso CAR de tipo silvestre en ratones (FIG. 25B).

Estos resultados tomados en conjunto muestran que la inhibición de DGK en combinación con el tratamiento de células T mesoCAR puede mejorar la activación de células T mesoCAR y la actividad antitumoral en la terapia.

Ejemplo 10: La inhibición de Ikaros aumenta la capacidad antitumoral de las células CAR-T

Uno de los principales obstáculos en la terapia de células T CAR es la regulación al alza de los reguladores negativos intrínsecos de la señalización de las células T, tal como la diacilglicerol quinasa (DGK). Como se describe en el Ejemplo 9, se ha demostrado que las células T CAR pierden eficacia in vivo con el tiempo. Se ha demostrado que la inhibición de los reguladores negativos de la función de las células T, tal como la DGK, mejora la actividad y la función de las células T que expresan CAR.

Otro importante regulador negativo de la función de las células T es el factor de transcripción Ikaros. A diferencia de las DGK, que actúan principalmente en la señalización proximal del TCR, Ikaros es una proteína de unión al ADN con dedos de zinc que regula negativamente la expresión génica mediante el reclutamiento de complejos de remodelación de la cromatina, tal como Sin3A, CtBP y HDAC. Ikaros desempeña un papel en la regulación de la producción de citoquinas y la función citolítica en las células T CD4+ y las células CD8+,

En este ejemplo, se examinó la eficacia antitumoral de las células T CAR transducidas retroviralmente con expresión reducida de Ikaros in vitro e in vivo.

Materiales y Procedimientos

Líneas celulares. Las células de mesotelioma AE17 de ratón fueron descritas en Jackman et al., J Immunol.

2003;171:5051-63). La mesotelina humana se introdujo en las células AE17 mediante transducción lentiviral. Las células 3T3Balb/C se adquirieron en la American Type Culture Collection. Las células 3T3BALB/C que expresan FAP de ratón (3T3.FAP) fueron creadas por transducción lentiviral de la línea parental FAP- 3T3 con FAP murino.

Animales. Los ratones C57BL/6 libres de patógenos se compraron a Charles River Laboratories Inc. (Wilmington, MA). Los ratones Ikaros DN+/- contienen un alelo Ikaros de tipo silvestre y un alelo Ikaros con una deleción de un dominio de unión al ADN (Winandy et al., Cell. 1995; 83:289-99). Los ratones Ikzf1+/-tienen un alelo de Ikaros de tipo silvestre y un alelo con deleción del exón 7 (Avitahl et al., Immunity. 1999; 10:333-43). Los animales utilizados para todos los experimentos eran ratones hembra de entre 6 y 12 semanas de edad y estaban alojados en instalaciones libres de patógenos.

Aislamiento, Transducción y Expansión de Linfocitos T Primarios de Ratón. Las células T esplénicas murinas primarias se aislaron utilizando el kit de "Selección Negativa de Células T Pan" como sugiere el fabricante (Miltenyi Biotec), y se activaron en placas de 24 pocillos (4*10® células/pocillo en 2 mL de RPMI-1640 suplementado con 100 U/mL de IL-2) pre-recubiertas con -CD3 (1 pg/mL) y -CD28 (2 pg/mL). Después de 48 horas, las células (1*10® células/pocillo) se mezclaron con el retrovirus (1 mL de sobrenadante viral crudo) en una placa de 24 pocillos recubierta con Retronectina (50 pg/mL; Clontech) y se centrifugó, sin frenar, a temperatura ambiente durante 45 minutos a 1.200 g. Tras la incubación de una noche, las células se expandieron con 50 U/mL de IL-2 durante 48 horas más.

Perlas recubiertas con antígeno o anticuerpo. La proteína recombinante del dominio extracelular de la mesotelina, la albúmina de suero bovino (Fisher Scientific) o los anticuerpos anti-CD3/anti-CD28 (eBioscience) se entrecruzaron químicamente a Dynabeads de 4,5 pm tosilactivadas (Invitrogen, #140-13) según las instrucciones del fabricante.

Inmunotransferencia Las células T transducidas con antimesotelina-CAR se incubaron con perlas recubiertas con anticuerpos BSA, mesotelina o anti-CD3 (en una proporción de 2:1 de perlas a células T) durante 5 y 20 minutos. A continuación, se prepararon lisados celulares totales y se sometieron a inmunotransferencia para detectar ERK fosforilada, AKT fosforilada, IKK fosforilada, JNK fosforilada, Lck fosforilada, PKC fosforilada, PLC fosforilada o ZAP70 fosforilada. Todos los anticuerpos anti-fosfoproteína se compraron a Cell Signaling, a excepción del anti-fosfotolck, que se compró a Sigma Aldrich. Se adquirió un anticuerpo de cabra antiratón reactivo al extremo C de Ikaros (SC-9861) y un anticuerpo de cabra antiactina (SC-1615) de Santa Cruz. se determinaron los niveles de expresión de pactina para normalizar las diferencias de carga.

Citotoxicidad y IFN ELISA. Las células AE17, AE17.meso, 3T3 y 3T3.FAP fueron transducidas con luciferasa como se describe (Moon et al., Clinical Cancer Research. 2011; 17:4719-30). Las células T y las células objetivo se cocultivaron en las proporciones indicadas, por triplicado, en placas de fondo redondo de 9® pocillos. Después de 18 horas, se recogieron los sobrenadantes del cultivo para el análisis del IFN mediante un ELISA (IFN de ratón, BDOpEIA). La citotoxicidad de las células T transducidas se determinó detectando la actividad de luciferasa restante del lisado celular mediante un ensayo descrito anteriormente (Riese et al., Cancer Res. 2013; 73:3566-77).

Transferencia de células T CAR a ratones portadores de tumores establecidos. Se inyectaron ratones por vía subcutánea con 2 * 106 células tumorales AE17.meso en el flanco dorso-lateral de ratones C57BL/6. Los ratones portadores de tumores grandes establecidos (100-150 mm3) fueron asignados aleatoriamente a recibir células T CAR de tipo silvestre, células T CAR deficientes en Ikaros o permanecieron sin tratar (mínimo, cinco ratones por grupo, cada experimento se repitió al menos una vez). Se administraron 1*107 células T a través de la vena de la cola. El tamaño del tumor se midió con balanzas electrónicas y calibradores, respectivamente.

Para la evaluación de la actividad de las células T en el Día 9, el bazo y los tumores se procesaron en suspensiones de células individuales como se describió anteriormente (Moon et al., Clinical Cancer Research. 2014; 20(16):4262-73) . Los esplenocitos y las suspensiones de células individuales tumorales se reestimularon con anticuerpos solubles anti-CD3/CD28 (1,0 pg/ml) o con éster de forbol/ionomicina (PMA/I: 30ng/ml, 1uM) durante 4-6 horas en presencia de Golgi Stop (BD Biosciences, 0,66pl/ml) y luego cosechado para el análisis de citometría de flujo.

Ensayos de citometría de flujo. Los anticuerpos conjugados con fluorocromo contra IFN-^yde antiratón (XMG1), el CD25 de antiratón (PC61), la IL-2 de antiratón (JES6-1A12), el CD8 de antiratón (53-6.7), el CD44 de antiratón (IM7) y el CD4 de antiratón (GK1.5) se adquirieron de Biolegend. La tinción Aqua Live/Dead (L34957) se adquirió en Invitrogen. El anticuerpo fluorocromo contra la granzima B de ratón (NGZB) y FoxP3 (FJK-16s) se adquirió en eBioscience. Los anticuerpos fluorocromos contra el TNF-a de ratón (MP6-XT22) y contra el CD69 de ratón (H1.2F3) se adquirieron en BD Biosciences. Para la tinción intracelular de citoquinas, las células se trataron con Golgi Stop (BD Biosciences, 0,66 pg/ml) durante 4-6 horas. Tras la recolección, las células se fijaron con paraformaldehído al 1 % durante 30 minutos, se centrifugaron y se lavaron una vez con tampón FACS. A continuación, las células se lavaron con BD Perm Wash (BD Biosciences) 2 veces y luego se tiñeron con anticuerpos de citoquinas durante 45 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron 2 veces en BD Perm Wash y luego se resuspendieron en tampón FACS. Para la tinción de los factores de transcripción, las células se tiñeron en superficie con anticuerpos primarios marcados con fluorocromo durante 20 minutos en hielo. Tras el lavado en tampón FACS, las células se fijaron con tampón Fix/Perm de eBioscience. Tras la fijación, las células se permeabilizaron y se tiñeron con APC antiratón FoxP3. Para la tinción de Ikaros, se utilizó conejo antiratón Ikaros (Abcam, ab26083, 1:2000) tras la fijación y permeabilización con el kit FoxP3 de eBioscience. Tras la tinción con el anticuerpo Ikaros, se lavaron las células y se tiñeron con un anticuerpo secundario anti-conejo marcado con PE (1:2.000). Una vez finalizadas las tinciones, las células se procesaron en un CyanADP (Beckman Coulter) para su análisis por citometría de flujo.

Análisis Estadístico. Todas las pruebas estadísticas se realizaron con GraphPad Prism. Se realizó un ANOVA de dos vías con pruebas post-hoc, con * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0,001, y **** p<0.0001. Los datos se presentan como media /- SEM.

Resultados

Producción de citoquinas y la liberación de mediadores citolíticos en las células T que expresan CAR con niveles reducidos de Ikaros están aumentadas

Dado que los linfocitos T citolíticos (CTL) con Ikaros reducido tienen una función efectora mejorada in vitro e in vivo (O'Brien, et al., J Immunol. 2014; 192:5118-29), se realizaron experimentos para comprobar si el agotamiento de Ikaros podía mejorar la eficacia de la terapia T CAR. Las células T aisladas de ratones C57BL/6 de tipo silvestre y de ratones con deficiencia de Ikaros(/kzf1+/-) en el fondo C57BL/6 fueron transducidas retroviralmente para expresar un mesotelina CAR. Tras la activación ex vivo , la transducción y la expansión en IL2, se confirmó que, en comparación con las células T CAR de tipo silvestre (WT), las células T CAR /kzf1+/-seguían expresando menos proteína Ikaros mediante citometría de flujo y transferencia western (Fig. 26A).

Dado que Ikaros es un represor transcripcional para los loci de genes de multicitinas (Thomas et al., J Immunol. 2007; 179:7305-15 Bandyopadhyay et al., Blood. 2006; 109:2878-2886 Thomas et al., J of Biological Chemistry. 2010; 285:2545-53y O'Brien et al., J Immunol. 2014; 192:5118-29), a continuación se examinó si la reducción de Ikaros daba lugar a la producción de citoquinas autocrinas por parte de las células T CAR y también si las células T CAR con deficiencia de Ikaros respondían mejor que sus homólogas WT a su antígeno objetivo. Tanto las células T CAR WT como las /kzf1+/-fueron estimuladas con perlas recubiertas con BSA-(control) o mesotelina (el antígeno CAR) en una proporción de 2:1 de perlas: células T durante 6 horas , y se analizó su capacidad de producir IFNy, TNFp e IL2 mediante citometría de flujo. En la línea de base (estimulación con BSA), hubo un aumento de ~3 veces en las células T CAR /kzf1+/-productoras de IFN en comparación con las células T CAR WT (4,35% vs 1,4%, Fig.26B), pero no hubo diferencias significativas en el % de células productoras de IL2 (Fig. 26D). Tras la estimulación con perlas recubiertas con mesotelina, se produjo un aumento espectacular del % de células T CAR /kzf1+/-productoras de citocinas IFN-^y(25 %), mientras que la respuesta fue modesta en las células T CAR WT (7 %). También se observó un aumento de la producción de TNFa (Fig. 26C). Para investigar si este aumento en la producción de citoquinas era generalizado a través de diferentes estímulos o se limitaba al antígeno CAR, tanto las células T WT como las /kzf+/-CAR fueron tratadas con PMA e ionomicina durante 6 horas. En este caso, se observaron más células productoras de IFN y, TNF-p e IL-2 en las células T /kzf1+/-CAR en comparación con sus homólogas WT (Figs. 26B-26D). Estos datos soportan la hipótesis de que Ikaros es uno de los factores limitantes que suprimen la producción de citoquinas de las células T, o de las células T CAR.

Se demostró que un importante mediador citotóxico, la granzima B, estaba regulado al alza en las células OT-I deficientes en Ikaros activadas por CD3/CD28, lo que aumentó su actividad citolítica contra las células tumorales EL4 que expresaban OVA (O'Brien et al., J Immunol. 2014; 192:5118-29). Se planteó la hipótesis de que la producción de granzima B también aumentaría en las células T /kzf+/-portadoras de CAR. Tanto las células T CAR WT como las /kzf1+/-fueron estimuladas con perlas recubiertas de BSA (línea de base) o de mesotelina (antígeno CAR) a una proporción de 2:1 de perlas: células T durante 6 horas. Se utilizó PMA/ionomicina como control positivo para el ensayo. De forma similar a los datos anteriores, el nivel de granzima B fue mayor en las células T CAR /kzf+/-que en las células T CAR WT en la línea de base (estimulación con BSA; Fig. 26E). Tras la estimulación con perlas recubiertas con mesotelina o PMA/Ionomicina, el nivel de granzima B aumentó tanto en las células T WT como en las /kzf+/-CAR, pero la producción fue mucho mayor en las células T /kzf+/CAR(Fig. 26E). Para determinar si también había una diferencia en la degranulación de las células T CAR con Ikaros reducido, se evaluó la expresión de CD107a tras la estimulación del antígeno. Las células T transducidas de tipo silvestre tenían niveles moderados de expresión de CD107a tras la reestimulación con antígeno, sin embargo, las células T con Ikaros reducido demostraron una mayor regulación al alza de CD107a (Fig. 26F). Así, en respuesta a la reestimulación, los CTL con Ikaros reducido desgranulan más y liberan más mediadores citotóxicos en comparación con sus homólogos de tipo silvestre.

Agotamiento de Ikaros con un alelo negativo dominante mejora la función de las células T CAR

Además de las células con niveles más bajos de Ikaros, se estudiaron las células T de ratones que expresaban un alelo dominante-negativo de Ikaros (IkDN). Los ratones transgénicos que expresan IkDN tienen un desarrollo linfoide normal pero tienen células T periféricas con una actividad de unión al ADN de Ikaros reducida en 90 % (Thomas et al., J Immunol. 2007; 179:7305-15y Winandy et al., Cell. 1995; 83:289-99). Células T aisladas de bazos de ratones WT e IkDN fueron activadas con anticuerpos anti-CD3/CD28 unidos a placas, transducidas con mesotelina CAR, seguidas de expansión con IL2. La desactivación de Ikaros en las células T CAR IkDN se confirmó por Western. Las células T CAR WT e IkDN se volvieron a desafiar con perlas recubiertas ya sea con BSA o con mesotelina en una proporción de 2:1 de perla: célula T durante 6 horas, y se analizó su capacidad de producir IFN e IL2, así como de desgranular en respuesta al antígeno CAR. De forma similar a los datos anteriores de Ikzf1+/-, se observó cierta producción autocrina de IFNy en la línea de base (Fig. 27A), pero no con IL2 (estimulación con BSA; Fig. 27B). Al ligar el CAR con su antígeno objetivo, la mesotelina, las células T IkDN produjeron más IFN^yque las células T WT (estimulación de la mesotelina; Fig. 27A). La desgranulación, medida por la regulación al alza de CD107a, también fue similar en las células T CAR de tipo silvestre y de IkDN (Fig. 27D).

Agotamiento de Ikaros no aumentó la activación y la señalización de las células T CAR tras la estimulación del antígeno

Dado que la depleción en Ikaros aumentó la liberación de citoquinas e incrementó los niveles de Granzima B y la expresión de CDl07a de las células T CAR, se exploraron posibles mecanismos. Es plausible que estos cambios en la función efectora puedan deberse a diferencias en la activación de las células T de tipo silvestre y las transducidas con Ikzf1+/. Así, los niveles de CD69, CD25 y 4-1BB (marcadores de activación de células T) se midieron por citometría de flujo tras estimular con perlas recubiertas con mesotelina durante 6 y 24 horas. El CD69, un marcador de activación temprana fue regulado al alza en la misma medida tanto por las células de tipo silvestre como por las de Ikzf1+/-(Fig. 28A). Con una estimulación más prolongada, las células T de tipo silvestre y las que expresan Ikzf1+/-CAR siguieron expresando niveles similares de CD69, pero las células T transducidas con lkzf1+/-mostraron una mayor expresión de CD25 (Fig. 28B). Sin embargo, esto puede no indicar directamente una diferencia en la activación de las células T, ya que el aumento de la IL-2 por parte de las células Ikzf1+/-(Fig. 28D) puede actuar en un bucle de avance positivo sobre CD25, el IL-2Ra (Depper et al., Proc Natl Acad of Sci USA. 1985; 82:4230-4; and Nakajima et al., Immunity. 1997; 7:691-701). el 4-1BB, un miembro de la superfamilia de receptores del TNF, también se expresa en las células T activadas (Vinay et al., Seminars in Immunology. 1998; 10:481-9) y se expresó a niveles similares en las células T transducidas con CAR de tipo silvestre y Ikzf1+/- tras la estimulación con antígeno (Fig. 28C). Por tanto, las diferencias funcionales entre nuestras células T transducidas con WT e Ikzf1+/no se debieron a diferencias en la activación de las células T.

Los experimentos descritos en el Ejemplo 9 y Riese et al., Cancer Research. 2013; 73:3566-77demuestran que el agotamiento de la enzima diacilglicerol quinasa (DGK) en las células T CAR dio lugar a un aumento de la señalización RAS/ERK, que se correlacionó bien con una mayor activación de las células T CAR. Se examinaron algunas vías de señalización en células T WT y deficientes en Ikaros tras la estimulación del TCR con anticuerpos CD3/CD28. Se prepararon lisados de células T estimuladas y se sometieron a inmunotransferencia para detectar diversas fosfoproteínas implicadas en la señalización proximal (PLC y Lck) y distal (ERK1/2, JNK, AKT e IKKa) del TCR. En las células T deficientes en Ikaros se produjo una activación de línea de base constitutiva de bajo nivel de algunas proteínas de señalización del TCR, incluyendo Lck, ERK y AKT (Fig. 28D). Con la estimulación de TCR/CD28, todas las proteínas estudiadas se fosforilaron al mismo nivel al comparar las células T WT y las deficientes en Ikaros, con la excepción de la fosfo-IKK, que fue ligeramente mayor en las células T deficientes en Ikaros 20 minutos después de la estimulación. Para determinar si la vía NFB estaba potenciada en las células T con un nivel reducido de Ikaros, se reprodujo la misma transferencia para IB, el objetivo descendente de IKK. No hubo diferencias en la degradación de IB entre las células T WT y las células T agotadas en Ikaros. Para estudiar la señalización CAR, tanto las células T transducidas con mesotelina WT como IkDN fueron reestimuladas con perlas recubiertas con mesotelina. De forma similar a los datos con la estimulación de CD3/CD28, no se encontraron diferencias en la fosforilación de PLC y ERK (Fig. 28E). En conjunto, estos datos indican que el agotamiento de Ikaros no altera la señalización mediada por TCR/CAR.

Reducción de Ikaros en las células T CAR aumenta su respuesta contra las células objetivo.

Dada la mayor producción de factores efectores por parte de las células T CAR con Ikaros reducido, se probó su eficacia contra sus células tumorales objetivo in v itro . Las células T de tipo silvestre, Ikzf1+/-e IkDN que expresan mesoCAR se mezclaron en diferentes proporciones con la línea celular tumoral parental, AE17 o la línea celular que expresa mesotelina, AE17meso. Cuando se mezclaron con la línea celular parental, tanto las células T de tipo silvestre como las de Ikzf1+/- y las de IkDN no produjeron IFN-^yni lisaron células en respuesta a AE17 (Figs. 29A, 29B y 29C). Por el contrario, cuando se reaccionó con AE17meso, la producción de IFN-y y la citolisis por parte de las células T de tipo silvestre aumentó a medida que se incrementaba la proporción E:T (Figs. 29B y 29C). Sin embargo, tanto las células T Ikzf1+/-como las IkDN produjeron una cantidad significativamente mayor de IFN-^yy tuvieron una lisis tumoral significativamente mayor que las células T de tipo silvestre, incluso con la proporción E:T más baja, 1,3:1 (Figs. 29B y 29C).

Para estudiar la generalización de este efecto, se examinaron las células T que expresaban un constructo CAR diferente, dirigido a la proteína de activación de fibroblastos (FAP-CAR) y que tiene el mismo dominio de señalización intracelular que el mesotelina CAR utilizado anteriormente. Se comparó la eficacia de las células T esplénicas FAP-CAR transducidas de forma comparable a partir de ratones WT C57BL/6 con las de ratones Ikzf1+/-. Las células T FAP-CARIkzf1+/- fueron más eficientes en la lisis de células 3T3.FAP (Fig. 29D) y en la secreción de más IFN (Fig. 29E) que las células T FAP CAR WT, con retención de la especificidad in vitro.

Agotamiento de Ikaros mejora la eficacia de las células T CAR contra tumores establecidos

A continuación se examinó la capacidad de las células T específicas de mesotelina con Ikaros reducido(Ikzf1+/-e IkDN) para controlar el crecimiento de tumores AE17meso establecidos en ratones. Se inyectaron dos millones de células tumorales AE17meso en los flancos de ratones C57BL/6 sinérgicos y se permitió que se formaran grandes tumores establecidos (~100-150 mm3). Diez millones de células T CAR preparadas a partir de ratones WT o deficientes en Ikaros(Ikzf1+/-e IkDN) se transfirieron entonces de forma adoptiva a esos ratones portadores de tumores, y se siguieron las mediciones del tumor. Las células T mesoCAR transducidas de tipo silvestre indujeron una leve inhibición del crecimiento tumoral, mientras que las células T mesoCAR transducidas de tipo Ikzfl+/- e IkDN inhibieron significativamente más el crecimiento de los tumores AE17meso (Figs. 30A y 30B).

También se estudió si la reducción de Ikaros podría mejorar el potencial terapéutico de las células T FAP-CAR. Los ratones con tumores AE17meso establecidos (100-150 mm3) fueron transferidos adoptivamente con 10 millones de células T CAR anti-FAP de tipo silvestre o transducidas con Ikzf1+/. Los ratones que recibieron células transducidas de tipo silvestre proporcionaron un retraso tumoral mínimo y los tumores AE17meso continuaron creciendo (Fig. 30C). En cambio, las células T transducidas con Ikzfl+fueron capaces de retrasar significativamente el crecimiento del tumor.

Células T CARIkzf1+/- persisten más tiempo y son más resistentes al microambiente tumoral inmunosupresor que las células T CAR WT

Dada la eficacia mejorada de las células T CAR inhibidas por Ikaros, se exploraron los posibles mecanismos utilizando las células T Ikzf1+/- mesoCAR. Para seguir investigando cómo actúan estas células T mesoCAR en un microambiente tumoral inmunosupresor in vivo, se cosecharon tumores a los 3 y 9 días de la transferencia adoptiva y se evaluó su número y funcionalidad. Estos dos puntos de tiempo permitieron caracterizar su actividad en puntos de tiempo tempranos y tardíos durante la respuesta inmune antitumoral.

En el Día 3 después de la, se observó una frecuencia similar de células T de tipo silvestre e Ikzf1+/mesoCAR tanto en los bazos (Fig. 31A) como en los tumores (Fig. 31B). Estos niveles similares indican que tanto las células T de tipo silvestre como las de Ikzf1+/- mesoCAR trafican inicialmente igual de bien hacia el tumor. Al evaluar el punto de tiempo del Día 9, el número de células T mesoCAR de tipo silvestre Ikzf1+/mesoCAR disminuyó en el bazo. Sin embargo, cuando se examinaron los tumores en este punto temporal, hubo un aumento significativo en el número de células T Ikzfl +/- mesoCAR en comparación con las células T Wt mesoCAR (Fig. 31B). Estos datos muestran que las células T Ikzf1+/- mesoCAR persisten o proliferan mejor que las células T WT mesoCAR en el microambiente inmunosupresor.

Los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) se vuelven hipofuncionales en respuesta a sus antígenos afines dentro del microambiente tumoral inmunosupresor, y es un fenómeno clave asociado a la progresión tumoral (Prinz et al., J Immunol. 2012; 188:5990-6000y Kerkar et al., Cancer Res. 2012; 72:3125-30). Aunque había más células T Ikzf1+/-mesoCAR en los tumores en el Día 9, todavía podían verse afectadas negativamente por el microambiente tumoral. Para evaluar la funcionalidad, se utilizaron anticuerpos CD3/CD28 para estimular los TILS aislados de células T de tipo silvestre e Ikzf1+/- mesoCAR en el Día 9 después de la transferencia y se caracterizaron las diferencias en la producción de mediadores líticos. En el Día 9 después de la transferencia, las células T mesoCAR de tipo silvestre en el bazo continuaban produciendo algunos niveles moderados de IFN (Fig. 31C). Como era de esperar, las células T de tipo silvestre aisladas de los tumores produjeron mucha menos cantidad de esta citoquina en comparación con las células T de tipo silvestre aisladas del bazo. Esto indica que los TIL de tipo silvestre comienzan a ser hipofuncionales en el Día 9 después de la transferencia. Por el contrario, las células T Ikzf1+/-mesoCAR esplénicas continuaron produciendo más IFN- en la línea de base y en la estimulación (Fig. 31C). En comparación con los TIL de tipo silvestre, los TIL Ikzf1+/- produjeron mayores cantidades de IFNy. Estos datos indican que los TIL Ikzf1+/- podrían ser menos sensibles al microambiente tumoral inmunosupresor.

Evitando el defecto proximal de la señalización del TCR que a menudo se observa en los TIL (Prinz, PU et al., J. Immunol. 2012; 188:5990-6000) puede lograrse mediante el uso de PMA/Ionomicina (PMA/I) (Prinz et al., J Immunol.

2012; 188:5990-6000). Las células T de tipo silvestre y Ikzfl +/- mesoCAR se volvieron a estimular con PMA/I para determinar si las células de tipo silvestre e Ikzf1+/TIL insensibles a la estimulación del TCR seguían siendo capaces de producir citocinas en respuesta a otros estímulos. En el Día 9 de transferencia posterior, los TIL de tipo silvestre demostraron una caída notable en la producción de IFN-y (Fig. 31C), y esto fue parcialmente restaurado a través de la estimulación con PMA/I (Fig. 31D). Sin embargo, la estimulación de las células T Ikzf1+/-mesoCAR aisladas en el bazo y en el tumor siguió dando lugar a un aumento de los niveles de IFN-^yen comparación con las células transferidas de tipo silvestre. Al evitar cualquier defecto en la señalización del TCR mediante la estimulación con PMA/I, estos resultados demuestran que la producción de IFNy difiere a nivel de la cromatina y probablemente se deba a la función diferencial de Ikaros.

A la luz del aumento de la actividad antitumoral por parte de las células T /kzf1+/-transferidas, también se examinaron los impactos en la composición del microambiente tumoral inmunosupresor y se evaluó el número de células T reguladoras (Treg) y de células supresoras derivadas de los mieloides (MDSC) en el día 9. En el Día 9 de transferencia posterior, se observaron niveles similares de las Treg en los anfitriones que recibieron células T de tipo silvestre o Ikzf1+/- mesoCAR (Fig. 31E). Se determinó la presencia de macrófagos Ly6G-/CD11b+/CD206+, que suelen caracterizarse como macrófagos M2 inmunosupresores y protumorigénicos. En los grupos tratados el Día 9, la expresión de CD206 fue similar en los 3 grupos (no tratados, tipo silvestre y Ikzf1+/-) (Fig. 31F).

Células T con Ikaros reducido son menos sensibles a los factores inhibidores solubles TGF y adenosina

Para caracterizar aún más la interacción del microambiente tumoral inmunosupresor con las células T mesoCAR, se utilizó un sistema de cultivo in vitro . Factores inhibidores solubles tales como IDO, IL-10, Adenosina y TGF-p (Wang et al., Oncoimmunology. 2013; 2:e26492) han demostrado contribuir a la inhibición de los linfocitos tumorales infiltrados. Se probaron los efectos de determinados factores inhibidores in vitro en las células T CAR deficientes en Ikaros para determinar si el entorno inmunosupresor podía afectar a su función lítica. Las células T CAR de tipo silvestre tuvieron una reducción del 50% en su capacidad de producir IFN-y y tuvieron una reducción en su función lítica en presencia de TGF-p y Adenosina (Fig. 32). Las células T CAR con niveles reducidos de Ikaros(Ikzf1+/-e IkDN) siguieron produciendo más iFn y que sus contrapartes de tipo silvestre en ausencia de inhibidores y sólo se inhibieron marginalmente en presencia de TGF p y adenosina (Fig. 32A). Se observó una mayor función lítica en las células T Ikzf1+/-e IkDN CAR en comparación con las células T de tipo silvestre (Fig. 32B). Estos datos demuestran que las células T con Ikaros reducido son menos sensibles a la inhibición de TGFp y adenosina.

Discusión

En este ejemplo, se ha identificado un nuevo enfoque para permitir que las células T que expresan CAR sobrevivan y mejoren sus funciones efectoras en el entorno tumoral: la inactivación del represor transcripcional Ikaros, que se sabe que inhibe un conjunto diverso de genes implicados en la función de las células T, por ejemplo, los genes de citoquinas (IL2 e IFNy), los mediadores citolíticos (granzima B) y los factores de transcripción T-box clave que influyen en la diferenciación de las células T (R-Bet y Eomes).

Un hallazgo importante de los experimentos descritos anteriormente es que las células T CAR que eran deficientes en la función de Ikaros eran significativamente mejores que las células T CAR de tipo silvestre en la restricción del crecimiento del tumor (Fig. 30). Estos resultados se observaron en múltiples modelos tumorales y utilizando dos constructos CAR diferentes. Debido al elevado número de genes que Ikaros regula, es plausible que Ikaros pueda regular muchas vías que normalmente son sensibles a la inmunosupresión. El aumento de la producción de IFN-g mediante la disminución del nivel de Ikaros en las células T CAR puede dar lugar a la regulación al alza de la expresión del MHC de clase I en el tumor, y por lo tanto, mejorar su inmunogenicidad, mejorar la actividad antiangiogénica, e impulsar la producción mediada por STAT1 de las células Th1. Un posible efecto del aumento del IFN^ypodría haber sido una alternancia del fenotipo de los macrófagos dentro de los tumores, sin embargo, no se observaron diferencias en el número total de macrófagos, ni en la proporción de macrófagos tipo M2 (medidos por la expresión de CD206). El aumento de la producción de IL-2 podría haber incrementado también la formación de células Treg CD4, sin embargo, no se observaron diferencias al comparar los tumores tratados con células T CAR WT con las células T CAR deficientes en Ikaros.

Se observó un aumento del número de linfocitos infiltrados en el tumor nueve días después de la inyección. No es probable que esto se deba a un mayor tráfico, ya que el número de TIL WT frente a los deficientes en Ikaros era similar en el Día 3. En cambio, estos resultados sugieren que los TIL deficientes en Ikaros mostraron un aumento de la proliferación o una disminución de la muerte celular inducida por el antígeno (AICD). Los estudios in vitro sugieren que la AICD fue similar entre los dos tipos de células T, lo que hace más probable que la diferencia se deba a una mayor proliferación. Esto sería coherente con el aumento de IL-2 producida por estas células. Además de una mayor persistencia, los TIL deficientes en Ikaros parecían ser menos hipofuncionales. Cuando las células T CAR infiltradas en el tumor fueron reestimuladas con anticuerpos anti-CD3 o PMA e ionomicina, los TIL CAR con deficiencia de Ikaros fueron capaces de producir más IFN^yque sus homólogas de tipo silvestre (Fig. 31C y 31D).

Los estudios in vitro permitieron realizar estudios adicionales de los fundamentos mecánicos de la mayor eficacia antitumoral observada in vivo. En consonancia con las funciones inhibidoras conocidas de Ikaros, la supresión de un alelo de Ikaros (/kzf+/-) o la sustitución de uno de sus alelos por un constructo dominantemente negativo de Ikaros (IkDN) dio lugar a células T que tenían un aumento en la producción de IFN^yautocrino y granzima B de línea de base (Fig. 26), pero, lo que es más importante, mostraron un aumento marcado de la secreción de citoquinas y de la liberación de gránulos tras la estimulación de TCR o CAR in vitro. Esto se acompañó de una mayor destrucción de células tumorales in vitro. Para comprobar si las células T CAR deficientes en Ikaros tienen un umbral de activación más bajo que las células T CAR WT, se recubrieron las Dynabeads con una proteína de mesotelina 10 veces menor y se demostró que las células T CAR /kzf+/-podían seguir respondiendo al antígeno de mesotelina a baja densidad para producir IFNy y TNF-a, pero las células T CAR WT no. Las células T CAR inhabilitadas por Ikaros también fueron más resistentes a la inhibición por factores inmunosupresores conocidos tales como TGF-p y adenosina (Fig. 32). Esto puede deberse al hecho de que los genes de las citoquinas (es decir, IL2 e IFN^yy los efectores de las células T (es decir, la granzima B) son más accesibles para la transcripción en las células T deficientes en Ikaros tras la activación del TCR/CAR. Esto parece ayudar a compensar la activación subóptima de las células T dentro del microambiente tumoral inmunosupresor.

En estudios anteriores, por ejemplo, el Ejemplo 9, se ha observado un fenotipo similar (es decir, aumento de la citolisis y de la producción de IFN) en las células T CAR a través de la depleción de DGKs, enzimas que metabolizan el segundo mensajero diacilglicerol y limitan la activación de RAS/^eR^k. Sin embargo, con la deleción de DGK se observaron cambios claros en la vía de señalización CAR/TCR. En concreto, la activación de RAS/ERK aumentó de forma espectacular tras la activación de TCR y CAR. Esto dio lugar a una mayor activación, medida por el aumento de la regulación hacia arriba de CD69, pero también a la producción de moléculas efectoras tales como TRAIL, FasL e IFN^y. La perforina y la granzima B fueron similares entre las células T CAR WT y las deficientes en DGK. Un fenotipo muy diferente en este estudio con células T CAR deficientes en Ikaros. A diferencia de las células T CAR deficientes en DGK, las células T CAR deficientes en Ikaros tuvieron una activación CAR/TCR similar, como lo demuestra la regulación al alza de CD69 y CD25 (Fig. 28), y una señalización CAR/TCR similar, medida por la fosforilación de múltiples moléculas de señalización TCR (Fig. 34) y la señalización de calcio. A diferencia de las células T deficientes en DGK, las células T CAR agotadas en Ikaros tenían mayores niveles de granzima B e IFN en la línea de base (Figs.

26 y 27), así como la activación constitutiva de bajo nivel de algunas cascadas de señalización del TCR como ERK y Akt (Fig. 28). Esta activación de línea de base puede deberse a la inducción de T-bet (Thomas et al., J of Biol Chemistry. 2010; 285:2545-53), que coopera con otros factores de transcripción como Eomes para transactivar la expresión de genes de IFN y granzima B (Pearce et al., Science. 2003; 302:1041-3y Intelkofer et al., Nat Immunol.

2005; 6:1236-44).

Estos hallazgos plantean la posibilidad de que la selección terapéutica de Ikaros en células T humanas transducidas (en ensayos clínicos) podría ser beneficiosa utilizando enfoques genéticos o bioquímicos. Los enfoques genéticos podrían imitar estos resultados en los ratones e incluir la desactivación de Ikaros en las células T CAR utilizando ARNhc o el uso de un constructo negativo dominante para competir con Ikaros endógeno. Otra opción sería utilizar un inhibidor farmacológico para reducir los niveles de Ikaros de forma transitoria. Informes recientes han indicado que el fármaco inmunomodulador Lenalidomida se dirige a Ikaros para su degradación mediada por ubiquitina por el complejo E3 ligasa CRL4CRBN (Gandhi et al., Br J Haematol. 2013; 164:811-21 Kronke et al, Science. 2014; 343:301-5y Sakamaki et al., Leukemia. 2013; 28:329-37). Las células T humanas estimuladas con CD3 tratadas con lenalidomida producen más IL-2 (Gandhi et al., Br J Haematol. 2013; 164:811-21), un rasgo clave de las células T con niveles reducidos de Ikaros. En estudios preliminares, las PBMC humanas transducidas con mesotelina-CAR estimuladas con TCR/CD28 in vitro produjeron más IL-2 e IFN^ydespués del pretratamiento con lenalidomida. Así, la combinación de la terapia de células T CAR con la administración in vivo de lenalidomida puede proporcionar una estrategia terapéutica para revertir la hipofunción de las células T mediante la inhibición de Ikaros.

En conclusión, este ejemplo demuestra por primera vez que la orientación de un represor transcripcional puede mejorar la inmunidad antitumoral mediada por CAR. Los mecanismos implican un aumento de la función de las citoquinas y de los efectores sin alteraciones en la transducción de señales. La traducción de este enfoque a la clínica puede llevarse a cabo mediante el uso de ARNhc, un constructo negativo dominante o un inhibidor farmacológico (como la Lenalidomida) para atacar a Ikaros en las células T que expresan CAR.

Ejemplo 11: Meso-CART en el cáncer de ovario humano

En este ejemplo, se determinó la seguridad de la infusión intravenosa de células T autólogas transducidas para expresar un mesotelina CAR en un paciente humano con cáncer de ovario recurrente avanzado.

Se modeló un protocolo de tratamiento de un solo paciente a partir de un estudio de Fase I planificado (como se describe en el Ejemplo 3) para evaluar la seguridad y viabilidad de la infusión de células T autólogas que expresan mesotelina CAR (mesoCART). Las células T del paciente fueron transducidas para expresar un CAR que comprendía un fragmento variable de cadena única (scFv) extracelular antimesotelina fusionado con los dominios de señalización 4-1BB y TCRzeta. Se infundieron en el paciente 3*107 células T mesoCAR/m2, para un total de 4,65 * 107 células T meso CAR. No se administró linfodepleción con quimioterapia antes de la infusión.

La infusión de mesoCART no tuvo efectos tóxicos agudos. El paciente experimentó derrames pleurales bilaterales de grado 3, disnea, fiebre, hipotensión y aspiración. No se produjeron toxicidades clínicas debidas a efectos fuera del tumor/en el objetivo de las células meso CART, tales como pericarditis o peritonitis. La paciente fue tratada con tocilizumab (anti-IL6) el Día 21 después de la infusión por sospecha de síndrome de liberación de citoquinas (CRS), con base en fiebres inexplicables, hipotensión que requería presores, niveles séricos elevados de ferritina (>7.000 ng/ml) y PCR (>160 mg/L).

Las células T mesoCAR fueron detectables en muestras de sangre periférica, así como en muestras tumorales de hígado y peritoneo, con números más altos en el líquido pericárdico y pleural. La evaluación de las citoquinas mostró un marcado aumento de IL-6 en el fluido pleural (un aumento de más de 80 veces con respecto a la línea de base), que alcanzó su punto máximo el Día 22-23. La evaluación de la sangre también reveló una elevación de los niveles de IL-6 en la sangre (un aumento de 15 veces con respecto a la línea de base en el Día 22). No se detectó ninguna elevación de los niveles de TNFa o IFN^y.

Los resultados preliminares mostraron que las imágenes de TC de abdomen y pelvis realizadas el Día 21 mostraron una carcinomatosis peritoneal mínimamente mejorada en comparación con una imagen de TC realizada dos semanas antes. En concreto, un tumor disminuyó de 3,4 x 3,1 cm a 3,0 x 2,6 cm. La citología del fluido pleural del lado izquierdo mostró malignidad en el Día 8 después de la infusión, pero en el Día 21 y en el Día 26 no había evidencia de malignidad.

Estos resultados mostraron que la infusión de células meso CART sin linfodepleción era factible y segura. No hubo evidencias de toxicidad con la infusión, ni de pericarditis o peritonitis potencialmente mortales. Además, había pruebas clínicas de la eficacia del tratamiento, tal como lo demuestra la desaparición de los derrames pleurales malignos.

Ejemplo 12: Expresión transitoria de los CAR con diferentes dominios de señalización intracelular

En este ejemplo, se examina el uso de distintos dominios costimuladores en la arquitectura del CAR y sus efectos en la longevidad celular, la diferenciación de la memoria y las características del metabolismo celular.

Se desarrolló un novedoso sistema de estimulación de células T in vitro para estudiar las consecuencias de una única ronda de estimulación específica de CAR y analizar la señalización a través de diversos endodominios de señalización de CAR. El ARNm transcrito in vitro que codifica constructos SS1-CAR antimesotelina con diferentes dominios de señalización intracelular de CD3zeta, CD28:z y 4-1BB:z se electroporó en células T humanas primarias en reposo. Con este procedimiento se consiguieron poblaciones de células T positivas para CAR superiores al 90 %. Tras verificar la expresión de CAR, las células T fueron estimuladas con mesotelina recombinante inmovilizada en perlas y luego cultivadas. Dado que el ARN se expresa transitoriamente, el CAR desaparece de la superficie celular después de una ronda de estimulación, lo que permite el análisis inequívoco de la señalización a través del CAR solamente (es decir, sin la señalización posterior de eventos adicionales de unión a la mesotelina). Este enfoque obvió el requisito de estimulación a través del receptor endógeno de células T y permitió por primera vez un análisis de las consecuencias de la señalización a través del antígeno sustituto de las células T CAR. Estos experimentos se realizaron con células T primarias de sangre periférica, células T ingenuas clasificadas y células de sangre de cordón umbilical.

Los distintos constructos de CAR (SS-1 con CD3zeta, SS1 con CD28:z, y SS1 con 4-1BB:z) se expresaron a niveles equivalentes en la superficie de las células T. Se demostró que todos los dominios de señalización tienen capacidades citolíticas comparables y específicas cuando se cultivan con células objetivo que expresan mesotelina.

Las células T primarias estimuladas mediante los CAR que contienen 4-1BBz mostraron perfiles de supervivencia y expansión superiores en comparación con los CAR con base en CD28. Tanto los CAR con base en 4-1BB como en c D28 mostraron más de 5 duplicaciones de población. Sin embargo, las células T CAR con base en 4-1BB proliferaron durante más tiempo in vitro. El análisis fenotípico de las células T CAR con base en 4-1BB reveló que se generó una mayor población de células con marcadores de superficie de memoria central. Por el contrario, los CAR con base en CD28 se diferenciaron rápidamente a un grupo de células T CAR de memoria efectoras.

Los CAR que contienen CD28z produjeron una proporción significativamente mayor de células efectoras de memoria, con un modesto aumento de la expresión de las moléculas inhibidoras PD-1, TIM3 y LAG3 en relación con sus contraparte 4-1BBz. Estos resultados fueron consistentes tanto si se utilizaron poblaciones de partida de células T de sangre periférica a granel, como si se utilizaron células T de sangre periférica ingenuas (CD45RO-CD95-CD62L+CCR7+) o células T de sangre de cordón umbilical.

El perfil metabólico de las células T CAR estimuladas con mesotelina utilizando el ensayo Sea-Horse (Seahorse Biosciences) en cultivo reveló un aumento sustancial de la oxidación de lípidos en las células estimuladas con 4-1BBz-CAR en comparación con sus contrapartes CD28z. Además, los estudios de microarreglos han revelado una firma génica única en las células que se recuperan tras la estimulación a través de los diferentes dominios de señalización CAR.

En conjunto, estos resultados demuestran que las células T CAR presentan una supervivencia y función diferencial dependiendo de los dominios costimuladores. Este sistema también permite una rápida caracterización y análisis funcional de nuevos diseños de CAR.

Ejemplo 13: Efectos de la inhibición de mTOR en la inmunosenescencia de los ancianos

Una de las vías más claramente relacionadas con el envejecimiento es la vía mTOR. Se ha demostrado que el inhibidor de mTOR, rapamicina, prolonga la vida de los ratones y mejora diversas afecciones relacionadas con el envejecimiento en ratones viejos (Harrison, DE et al. (2009) Nature 460:392-395 Wilkinson JE et al. (2012) Aging Cell 11:675-682y Flynn, JM et al. (2013) Aging Cell 12:851-862). Por lo tanto, estos hallazgos indican que los inhibidores de mTOR pueden tener efectos beneficiosos sobre el envejecimiento y las afecciones relacionadas con el envejecimiento en los seres humanos.

Un fenotipo relacionado con la edad que puede estudiarse en un plazo corto de ensayos clínicos es la inmunosenescencia. La inmunosenescencia es el declive de la función inmunitaria que se produce en las personas mayores, lo que conlleva una mayor susceptibilidad a las infecciones y una menor respuesta a la vacunación, incluyendo la vacunación de la gripe. El declive de la función inmunitaria con la edad se debe a una acumulación de defectos inmunitarios, incluyendo la disminución de la capacidad de las células madre hematopoyéticas (HSC) para generar linfocitos ingenuos, y un aumento del número de linfocitos positivos a PD-1 agotados que tienen respuestas defectuosas a la estimulación antigénica (Boraschi, D et al. (2013) Sci. Transl. Med.5:185ps8; Lages, CS et al. (2010) Aging Cell 9:785-798y Shimatani, K et al., (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:15807-15812). Los estudios realizados en ratones de edad avanzada demostraron que 6 semanas de tratamiento con el inhibidor de mTOR, rapamicina, rejuvenecieron la función de HSC, lo que condujo a un aumento de la producción de linfocitos ingenuos, una mejor respuesta a la vacunación contra la gripe y una prolongación de la vida útil (Chen, C et al. (2009) Sci. Signal.

2:ra75).

Para evaluar los efectos de la inhibición de mTOR en los fenotipos humanos relacionados con el envejecimiento y si el inhibidor de mTOR RAD001 mejora la inmunosenescencia, se evaluó la respuesta a la vacuna contra la gripe en voluntarios de edad avanzada que recibieron RAD001 o placebo. Los resultados presentados en el presente documento sugieren que RAD001 mejoró la respuesta a la vacuna contra la gripe en voluntarios de edad avanzada a dosis que fueron bien toleradas. RAD001 también redujo el porcentaje de linfocitos T CD4 y CD8 positivos a la muerte programada (PD)-1 que se acumulan con la edad. Estos resultados muestran que la inhibición de mTOR tiene efectos beneficiosos sobre la inmunosenescencia en voluntarios de edad avanzada.

Como se describe en el presente documento, un tratamiento de 6 semanas con el inhibidor de mTOR RAD001, un análogo de la rapamicina mejoró la respuesta a la vacunación contra la gripe en voluntarios humanos de edad avanzada.

Procedimientos

Población del estudio

Se inscribieron voluntarios de edad avanzada >= 65 años sin enfermedades médicas subyacentes inestables en 9 centros de Nueva Zelanda y Australia. Los criterios de exclusión en el momento del cribado incluían hemoglobina < 9.0 g/dl, recuento de glóbulos blancos <3.500/mm3, recuento de neutrófilos <2.000/mm3 o recuento de plaquetas <125.000/mm3, diabetes no controlada, cardiopatía isquémica inestable, enfermedad pulmonar subyacente clínicamente significativa, antecedentes de una inmunodeficiencia o de recibir un tratamiento inmunosupresor, antecedentes de coagulopatía o enfermedad que requiera anticoagulación a largo plazo, tasa de filtración glomerular estimada < 30 ml/min, presencia de hipercolesterolemia grave no controlada (>350 mg/dl, 9,1 mmol/L) o hipertrigliceridemia (>500 mg/dl, 5,6 mmol/l).

Los datos demográficos iniciales entre los brazos de tratamiento fueron similares (Tabla 8). De los 218 sujetos inscritos, 211 completaron el estudio. Siete sujetos se retiraron del estudio. Cinco sujetos se retiraron debido a eventos adversos (AE), un sujeto retiró el consentimiento y un sujeto abandonó el estudio como resultado de una violación del protocolo.

Tabla 8: Características Demo ráficas Línea de Base de los Pacientes del Estudio

Diseño y Realización del Estudio

Entre diciembre de 2011 y abril de 2012, se inscribieron 218 voluntarios de edad avanzada en un ensayo aleatorizado, ciego a los observadores y controlado con placebo. Los sujetos fueron asignados aleatoriamente a los brazos de tratamiento utilizando un sistema de aleatorización automatizado validado con una proporción de RAD001 a placebo de 5:2 en cada brazo de tratamiento. Los brazos de tratamiento fueron:

RAD001 0,5 mg diarios o placebo

RAD001 5 mg semanales o placebo

RAD001 20 mg semanales o placebo

El ensayo fue ciego para el observador porque el placebo en las cohortes de RAD001 de 0,5 mg diarios y 20 mg semanales difería ligeramente de los comprimidos de RAD001 en esas cohortes. El personal del estudio que evaluó a los sujetos no vio la medicación del estudio y, por lo tanto, fue totalmente ciego. La duración del tratamiento para todas las cohortes fue de 6 semanas durante las cuales los sujetos se sometieron a evaluaciones de seguridad en la clínica cada 2 semanas. Después de que los sujetos recibieran la dosis durante 4 semanas, se midieron los niveles de RAD001 en estado estable antes de la dosis y una hora después de la dosis. Después de completar el curso de 6 semanas del fármaco del estudio, los sujetos recibieron un descanso de 2 semanas sin fármacos para revertir cualquier posible inmunosupresión inducida por RAD001, y luego se les administró una vacuna contra la gripe estacional 2012 (Agrippal®, Novartis Vaccines and Diagnostics, Siena, Italia) que contenía las cepas H1N1 A/California/ 07/2009, H3N2 A/Victoria/210/2009, B/Brisbane/60/ 2008. Cuatro semanas después de la vacunación contra la gripe, se recogió el suero de los sujetos para medir los títulos de la gripe. Los títulos de anticuerpos contra las 3 cepas de la vacuna antigripal, así como contra 2 cepas heterólogas (la cepa A/H1N1 A/New Jersy/8/76 y la cepa A/H3N2 A/Victoria/361/11) se midieron mediante un ensayo estándar de inhibición de la hemaglutinación (Kendal, AP et al. (1982) Concepts and procedures for laboratory-based influenza surveillance. Atlanta: Centers for Disease Control and Prevention B17-B35). Los niveles de IgG e IgM específicos para el virus A/H1N1/California/07/2009 se midieron en muestras de suero tomadas antes y 4 semanas después de la vacunación contra la gripe, como se ha descrito anteriormente (Spensieri, F. et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:14330-14335). Los resultados se expresaron como intensidad de fluorescencia.

Todos los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito. El estudio se llevó a cabo de acuerdo con los principios de las buenas prácticas clínicas y fue aprobado por los comités éticos y las agencias reguladoras correspondientes.

Seguridad

La evaluación de los eventos adversos y la extracción de sangre para las evaluaciones de seguridad hematológicas y bioquímicas se realizaron durante las visitas del estudio. La información sobre los acontecimientos adversos también se recogió en los diarios que los sujetos rellenaron en casa durante las 6 semanas que estuvieron con el fármaco del estudio. Los datos sobre todos los acontecimientos adversos se recogieron desde el momento del consentimiento informado hasta 30 días después de la última visita del estudio. Los investigadores clasificaron los acontecimientos como leves, moderados o graves.

Análisis Estadístico

El análisis primario de las medias geométricas de los títulos se realizó utilizando un modelo de regresión bayesiano normal con priores no informativos. Este modelo se ajustó a cada título de anticuerpos en la escala logarítmica. El resultado primario en cada modelo fue la medición del Día 84. La medición del Día 63 se incluyó en el vector de resultados. El modelo se ajustó utilizando SAS 9.2 proc mixto con la declaración previa. La estructura de covarianza de la matriz se consideró como no estructurada (opción tipo=UN). Se utilizó un prior plano. Para el análisis secundario de las tasas de seroconversión se utilizó la regresión logística.

La población por intención que se iba a tratar se definió como todos los sujetos que recibieron al menos una dosis completa del fármaco del estudio y que no tuvieron desviaciones importantes del protocolo que afectaran a los datos de eficacia. 199 del total de 218 sujetos inscritos en el estudio estaban en la población de intención de tratar.

Inmunofenotipo

Las células mononucleares de la sangre periférica se aislaron de la sangre total recogida en 3 momentos: en la línea de base; después de 6 semanas de tratamiento con el fármaco del estudio; y al final del estudio cuando los sujetos habían dejado de tomar el fármaco del estudio durante 6 semanas y 4 semanas después de la vacunación contra la gripe. Se analizaron 76 subconjuntos de PBMC mediante citometría de flujo utilizando paneles de inmunofenotipado de 8 colores en el Human Immune Monitoring Center en la Stanford University, CA, Ee . UU., como se ha descrito anteriormente (Maecker, HT et al. (2012) Nat Rev Immunol. 12:191-200). Se analizaron 76 subconjuntos de PBMC mediante citometría de flujo utilizando paneles de inmunofenotipado liofilizados de 8 colores (BD Lyoplate, BD Biosciences, San Diego, CA). Se incluyeron en el análisis las muestras de PBMC con una viabilidad >80 % y un rendimiento de 2*106 células o superior.

Se calcularon los cambios relativos de los inmunofenotipos desde el inicio hasta la Semana 6 del tratamiento con el fármaco del estudio y desde el inicio hasta el final del estudio (Semana 12) para cada una de las cohortes de dosificación de RAD001. Se llevó a cabo la prueba T de Student para examinar si el cambio relativo de los inmunofenotipos desde la línea de base hasta los dos puntos temporales de muestreo de sangre era significativamente diferente de cero, respectivamente, dentro de cada grupo de dosificación después de ajustar el efecto del placebo. No se realizó la imputación de datos perdidos en el análisis del efecto del tratamiento. Por lo tanto, si a un paciente le faltan datos del fenotipo en la línea de base, este paciente no se incluyó en el análisis para este fenotipo. Si a un paciente le faltaban datos del fenotipo a las 6 o 12 semanas, este paciente no contribuyó al análisis de este fenotipo para el punto de tiempo afectado.

Se realizaron 608 pruebas en 76 fenotipos bajo 3 grupos de dosificación para comparar el efecto del tratamiento contra el efecto del placebo. Se aplicó una metodología de control de la tasa de falsos descubrimientos (FDR) estratificada para controlar la aparición de falsos positivos asociados a las pruebas múltiples y, al mismo tiempo, proporcionar una potencia considerablemente mayor. Se tomó el grupo de tipo de célula como factor de estratificación y se realizó el cálculo del FDR (valor q) dentro de cada estrato, respectivamente. Todas las hipótesis nulas se rechazaron a un nivel de significación de 0,05 con el correspondiente valor q < 0,1. La estrategia de ajuste de pruebas múltiples con rechazo al nivel de significación de 0,05 y la correspondiente q<0,1 garantizó que menos del 10 % de los resultados fueran falsos.

En un segundo análisis, los cambios de inmunofenotipo entre los grupos de tratamiento y placebo combinados, donde se combinaron los tres grupos de dosificación de RAD001. Para determinar qué cambios en el inmunofenotipo diferían entre los grupos tratados y los de placebo, se calcularon las proporciones de recuento de células dentro del paciente para cada fenotipo medido entre el inicio y la Semana 6 del tratamiento con el fármaco del estudio y entre la línea de base y el final del estudio (semana 12). Los cocientes se transformaron en logaritmos y se analizaron mediante un análisis de covarianza en cada punto temporal para detectar una diferencia entre los grupos de tratamiento y de placebo agrupados. se realizaron 152 pruebas en 76 fenotipos para comparar el efecto combinado del tratamiento con el efecto del placebo. La metodología de control de la tasa de falsos descubrimientos (FDR) estratificada se aplicó para controlar la aparición de falsos positivos asociados a las pruebas múltiples y, sin embargo, proporcionar una potencia considerablemente mayor (Benjamini, Y. et al. (1995) J. Roy. Statist. 57:289-300y Sun, L. et al. (2006) Genet. Epidemiol. 30:519-530). Se tomó el grupo de tipo de célula como factor de estratificación y se realizó el cálculo del FDR (valor q) dentro de cada estrato, respectivamente. Se rechazaron todas las hipótesis nulas con un nivel de significancia de 0,05 y un valor q inferior a 20%. Esto puede interpretarse como el rechazo de sólo las hipótesis con valores P inferiores a 0,05 y menos del 20 % de probabilidad de que cada resultado significativo observado se deba a una prueba múltiple.

Resultados

En general, RAD001 fue bien tolerado, en particular los regímenes de dosificación de 0,5 mg diarios y 5 mg semanales. No se produjo ninguna muerte durante el estudio. Tres sujetos experimentaron cuatro acontecimientos adversos graves (SAE) que se evaluaron como no relacionados con RAD001. Los 4 SAE fueron hemorragia retiniana del ojo izquierdo con ceguera posterior en un sujeto con recuentos plaquetarios normales que había completado un ciclo de 6 semanas de 5 mg semanales de RAD001 6 semanas antes; dolor de espalda grave en un sujeto tratado con placebo y gastroenteritis grave en un sujeto tratado con placebo. En la Tabla 9 se ofrece una lista de acontecimientos adversos (AE) relacionados con el tratamiento con una incidencia >2 % en cualquier grupo de tratamiento. El AE más frecuente relacionado con RAD001 fue la úlcera bucal que, en la mayoría de los casos, fue de gravedad leve. En general, los sujetos que recibieron RAD001 tuvieron una incidencia similar de AE graves que los tratados con placebo. Sólo se evaluó un AE grave relacionado con las úlceras bucales de RAD001 en un sujeto tratado con 20 mg semanales de RAD001.

Tabla 9: Incidencia de los AE relacionados con el tratamiento >2% en cualquier grupo de tratamiento por término ___________________________________________ preferido___________________________________________

RAD001 0,5 RAD001 5 mg RAD001 20 mg Placebo, Total N=218 mg diarios semanal N=53 n semanal N=53 n agrupado

N=53 n (%) n (%)

(%) (%) N=59 n (%)

Total de los AE 35 46 109 21 211

Pacientes con

_AE22 (41,5 %) 20 (37,7 %) 27 (50,9 %) 12 (20,3 %) 81 (37,2 %)

Ulceración de la

_boca6(11,3 %) 2 (3,8 %) 9(17,0 %) 3 (5,1 %) 20 (9,2 %)

Dolor de cabeza 0 2 (3,8 %) 9 (17,0 %) 1(1,7 %) 12 (5,5 %) (continuación)

RAD001 0,5 RAD001 5 mg RAD001 20 mg Placebo,

mg diarios semanal N=53 n semanal N=53 n agrupado Total N=218 n N=53 n (%) (%) (%) N=59 n (%) (%)

Aumento del

colesterol en 2 (3,8 %) 2 (3,8 %) 2 (3,8 %) 0 6 (2,8 %) sangre

Diarrea 1(1.9 %) 4 (7,5 %) 1 (1,9 %) 0 6 (2,8 %) Dispepsia 0 3 (5,7 %) 2 (3,8 %) 1 (1,7 %) 6 (2,8 %) Fatiga 0 2 (3,8 %) 4 (7,5 %) 0 6 (2,8 %)

Aumento de las

lipoproteínas de 2 (3,8 %) 1(1.9 %) 2 (3,8 %) 0 5 (2,3%) baja densidad

Ulceración de la

_lengua3 (5,7 %) 1 (1,9 %) 0 1 (1,7 %) 5 (2,3 %) Insomnio 1(1.9 %) 2 (3,8 %) 1 (1,9 %) 0 4 (1,8 %) Boca seca 0 0 2 (3,8 %) 1 (1,7 %) 3 (1,4 %) Neutropenia 0 0 3 (5,7 %) 0 3 (1,4 %) Dolor oral 0 2 (3,8 %) 1 (1,9 %) 0 3 (1,4 %) Prurito 0 2 (3,8 %) 1 (1,9 %) 0 3 (1,4 %) Conjuntivitis 0 2 (3,8 %) 0 0 2 (0,9 %) Eritema 0 2 (3,8 %) 0 0 2 (0,9 %)

Molestias en las

_extremidades0 2 (3,8 %) 0 0 2 (0,9 %)

Inflamación de la

_mucosa0 0 2 (3,8 %) 0 2 (0,9 %)

Parestesia oral 2 (3,8 %) 0 0 0 2 (0,9 %)

Estomatitis 0 0 2 (3,8 %) 0 2 (0,9 %)

Trombocitopenia 0 0 2 (3,8 %) 0 2 (0,9 %)

Infección de las

_{vías urinarias}0 0 2 (3,8 %) 0 2 (0,9 %)

La capacidad de RAD001 de mejorar la función inmunitaria en voluntarios de edad avanzada se evaluó midiendo la respuesta serológica a la vacuna contra la gripe estacional de 2012. Los títulos medios geométricos de inhibición de la hemaglutinación (IH) para cada una de las 3 cepas de la vacuna antigripal al inicio y 4 semanas después de la vacunación antigripal se presentan en la Tabla 10. La variable principal de análisis fue la relación HI GMT (4 semanas después de la vacunación / línea de base). El estudio tenía la potencia necesaria para poder demostrar que en al menos 2 de cada 3 cepas de la vacuna antigripal había 1) un aumento de la GMT > 1,2 veces en relación con el placebo; y 2) una probabilidad posterior no inferior al 80 % de que la proporción GMT corregida por el placebo fuera superior a 1. Se eligió este criterio de valoración porque un aumento de 1,2 veces en la proporción ^gM^tde la gripe inducido por el adyuvante de la vacuna MF-59 se asoció con una disminución de la enfermedad de la gripe (lob, A et al. (2005) Epidemiol Infect 133:687-693).

Tabla 10

antigripal

En la población con intención de tratar (ITT), las cohortes de dosis bajas de RAD001 (0,5 mg diarios o 5 mg semanales), pero no la cohorte de dosis más altas (20 mg semanales), cumplieron el criterio de valoración principal del estudio (Figura 33A). Esto demuestra que existe un mecanismo inmunomodulador distinto de RAD001 a las dosis más bajas, y que a la dosis más alta pueden entrar en juego los conocidos efectos inmunosupresores de la inhibición de mTOR. Además, los resultados sugieren una tendencia a la mejora de la función inmunitaria en los ancianos tras el tratamiento con dosis bajas de RAD001 para mejorar la inmunidad.

En un análisis de subgrupos, el subconjunto de sujetos con títulos iniciales bajos de gripe (< 1:40) experimentó un mayor aumento de los títulos asociado a RAD001 que la población ITT (Figura 33B). Estos datos demuestran que RAD001 es especialmente eficaz para mejorar la respuesta a la vacuna antigripal de los sujetos que no tenían títulos protectores (>1:40) en la línea de base del estudio y que, por lo tanto, presentaban un mayor riesgo de contraer la enfermedad.

Los gráficos de dispersión de la concentración de RAD001 frente al aumento del título de cada cepa de vacuna antigripal muestran una relación inversa de exposición/respuesta (Figura 34). La modelización y la simulación con base en la fosforilación de la quinasa S6 (S6K) mediada por mTOR predicen que el régimen de dosificación semanal de 20 mg inhibe la actividad de S6K mediada por mTOR casi por completo, el régimen de dosificación semanal de 5 mg inhibe la actividad de S6K en más del 50 %, y el régimen de dosificación diaria de 0,5 mg inhibe la fosforilación de S6K en aproximadamente 38 % durante el intervalo de dosificación (Tanaka, C et al. (2008) J. Clin. Oncol 26:1596-1602). Por lo tanto, la inhibición parcial de mTOR, por ejemplo, la fosforilación de S6K mediada por mTOR, con una dosis baja de RAD001, que mejora el sistema inmunitario, puede ser tan eficaz, si no más, que la inhibición casi completa de mTOR con una dosis alta de RAD001 para mejorar la respuesta inmunitaria de los ancianos.

También se evaluaron las tasas de seroconversión 4 semanas después de la vacunación contra la gripe. La seroconversión se definió como el cambio de un título negativo previo a la vacunación (es decir, un título de IH <1:10) a un título de IH posterior a la vacunación > 1:40 o un aumento de al menos 4 veces con respecto a un título de IH no negativo (> 1:10) previo a la vacunación. En la población por intención de tratar, las tasas de seroconversión para las cepas H3N2 y B aumentaron en el RAD001 en comparación con las cohortes de placebo, aunque los aumentos no alcanzaron significación estadística (Tabla 11). En la subpoblación de sujetos con títulos iniciales de gripe <= 1:40, el tratamiento con RAD001 también aumentó las tasas de seroconversión a las cepas H3N2 y B, y estos resultados alcanzaron significación estadística para la cepa B en la cohorte de dosificación de 0,5 mg diarios. Estos datos muestran además que RAD001 mejoró la respuesta serológica a la vacunación contra la gripe en los ancianos.

T l 11: P r n n r nv r i n l ri 4 m n l v n i n

Las actuales vacunas contra la gripe estacional a menudo proporcionan una protección inadecuada contra las cepas de gripe que surgen continuamente y que se presentan como variantes de virus que ya circulaban. Sin embargo, los ratones vacunados contra la gripe en presencia del inhibidor mTOR rapamicina, en comparación con el placebo, desarrollaron una respuesta serológica más amplia a la gripe. La respuesta serológica más amplia incluía anticuerpos contra epítopos conservados expresados por múltiples subtipos de gripe que proporcionaban protección contra la infección con cepas heterólogas de gripe no contenidas en la vacuna (Keating, R et al. (2013) Nat Immunology 14:2166-2178). Para determinar si RAD001 ampliaba la respuesta serológica a la gripe en los voluntarios de edad avanzada, se midieron los títulos de IH a 2 cepas heterólogas de la gripe no contenidas en la vacuna antigripal (cepa A/H1N1/Nueva Jersey/8/76 y cepa A/H3N2/Victoria/361/11). El aumento de la proporciones HI GMT para las cepas heterólogas fue mayor en las cohortes de RAD001 en comparación con las de placebo (Figura 35). Además, las tasas de seroconversión para las cepas heterólogas fueron mayores en el RAD001 en comparación con las cohortes de placebo. El aumento de las tasas de seroconversión en las cohortes de dosificaciones semanales de 5 y 20 mg de RAD001 fue estadísticamente significativo para la cepa heteróloga H3N2 (Tabla 12). La tasa de seroconversión de H3N2 para las cohortes agrupadas de rAd 001 fue 39 % frente 20 % de la cohorte de placebo (p=0,007). Los resultados presentados en el presente documento sugieren que la inhibición de mTOR amplía la respuesta serológica de los voluntarios de edad avanzada a la vacunación contra la gripe, y aumenta los títulos de anticuerpos a las cepas heterólogas de la gripe no contenidas en la vacuna contra la gripe estacional.

La respuesta serológica ampliada a las cepas heterólogas de la gripe en ratones tratados con rapamicina se ha asociado con una inhibición del cambio de clase en las células B y a un aumento de los niveles de IgM antigripal (Keating, R. et al. (2013) Nat Immunol 14:2166-2178). Sin embargo, es posible que la inhibición del cambio de clase no esté implicada en la respuesta serológica ampliada en los seres humanos tratados con RAD001, ya que los niveles de IgM e IgG antigripales después de la vacunación no difirieron entre las cohortes tratadas con RAD001 y con placebo (Figura 36).

Tabla 12: Porcentaje de sujetos que seroconvierten a cepas heterólogas de la gripe 4 semanas después de la

Para abordar el mecanismo por el cual RAD001 mejoró la función inmunitaria en voluntarios de edad avanzada, se realizó la inmunofenotipificación de muestras de p Bm C obtenidas de sujetos al inicio, después de 6 semanas de tratamiento con el fármaco del estudio y 4 semanas después de la vacunación contra la gripe (6 semanas después de la interrupción del fármaco del estudio). Aunque el porcentaje de la mayoría de los subconjuntos de PBMC no difirió entre las cohortes de RAD001 y de placebo, el porcentaje de células CD4 y CD8 positivas a PD-1 fue menor en las cohortes de RAD001 en comparación con las de placebo (Figura 37). Las células CD4 y CD8 positivas a PD-1 se acumulan con la edad y tienen respuestas defectuosas a la estimulación de antígenos debido a que PD-1 inhibe la proliferación de células T inducida por el receptor de células T, la producción de citoquinas y la función citolítica (Lages, CS et al. (2010) Aging Cell 9:785-798). Hubo un aumento del porcentaje de células T positivas a PD-1 a lo largo del tiempo en la cohorte de placebo. En la semana 12 (4 semanas después de la vacunación) este aumento puede deberse a la vacunación contra la gripe, ya que se ha demostrado que el virus de la gripe aumenta las células T positivas a PD-1 (Erikson, JJ et al. (2012) JCI 122:2967-2982). Sin embargo, el porcentaje de células T CD4 positivas a PD-1 disminuyó con respecto al valor inicial en la semana 6 y 12 en todas las cohortes de RAD001 (Figura 37A). El porcentaje de células CD8 positivas a PD-1 también disminuyó con respecto al valor inicial tanto en la semana 6 como en la 12 en las dos cohortes de dosis más bajas de RAD001 (Figura 37B). Se evaluó el porcentaje de células T CD4 negativas a PD-1 y aumentó en las cohortes de RAD001 en comparación con las cohortes de placebo (Figura 37C).

En un análisis estadístico más estricto, en el que se agruparon los resultados de las cohortes del RAD001 y se ajustaron en función de las diferencias en la expresión inicial de PD-1, se produjo una disminución estadísticamente significativa del 30,2 % en las células T CD4 positivas a PD-1 en la semana 6 en la cohorte agrupada del RAD (n=84) en comparación con la cohorte del placebo (n=25) con p=0,03 (q=0,13) (Figura 38A). La disminución de las células T CD4 positivas a PD-1 en la semana 12 en el RAD agrupado en comparación con la cohorte de placebo es 32,7 % con p=0,05 (q=0,19). La Figura 38B muestra una disminución estadísticamente significativa del 37,4% en las células T CD8 positivas a PD-1 en la semana 6 en la cohorte agrupada de RAD001 (n=84) en comparación con la cohorte de placebo (n=25) con p=0,008 (q=0,07). La disminución de las células T CD8 positivas a PD-1 en la semana 12 en el RAD001 agrupado en comparación con la cohorte de placebo es 41,4 % con p=0,066 (q=0,21). Por lo tanto, los resultados de las Figuras 37 y 38 sugieren conjuntamente que la disminución asociada a RAD001 del porcentaje de células T CD4 y CD8 positivas a PD-1 puede contribuir a mejorar la función inmunitaria.

Conclusión

En conclusión, los datos presentados en el presente documento muestran que el inhibidor de mTOR RAD001 mejora el declive relacionado con la edad en la función inmunológica de los ancianos humanos, evaluado por la respuesta a la vacunación contra la gripe, y que esta mejora se obtiene con un equilibrio aceptable de riesgo/beneficio. En un estudio con ratones ancianos, el tratamiento de 6 semanas con el inhibidor de mTOR rapamicina no sólo mejoró la respuesta a la vacunación contra la gripe, sino que también prolongó la vida útil, lo que sugiere que la mejora de la inmunosenescencia puede ser un marcador de un efecto más amplio sobre los fenotipos relacionados con el envejecimiento.

Dado que la dosis de RAD001 se interrumpió 2 semanas antes de la vacunación, los efectos de mejora inmunológica de RAD001 pueden estar mediados por cambios en una población celular relevante que persiste tras la interrupción del tratamiento farmacológico. Los resultados presentados en el presente documento muestran que RAD001 disminuyó el porcentaje de células T CD4 y CD8 positivas a PD-1 agotadas en comparación con el placebo. La expresión de PD-1 es inducida por la señalización del TCR y permanece elevada en el entorno de la estimulación persistente de antígenos, incluyendo la infección viral crónica. Aunque no se quiere ceñirse a la teoría, es posible que RAD001 redujera la activación inmunitaria crónica en los voluntarios de edad avanzada y, por tanto, provocara una disminución de la expresión de PD-1. El RAD001 también puede inhibir directamente la expresión de PD-1, como se ha señalado para la inmunofilina ciclosporina A (Oestreich, KJ et al. (2008) J Immunol. 181:4832-4839). Es probable que una reducción inducida por RAD001 en el porcentaje de células T positivas a PD-1 mejore la calidad de las respuestas de las células T. Esto es coherente con estudios anteriores que muestran que la inhibición de mTOR mejoró la calidad de la respuesta de las células T CD8 de memoria a la vacunación en ratones y primates (Araki, K et al. (2009) Nature 460:108-112). En ratones envejecidos, la inhibición de mTOR también ha demostrado que aumenta el número de células madre hematopoyéticas, lo que conlleva un aumento de la producción de linfocitos ingenuos (Chen, C et al. (2009) Sci Signal 2:ra75). Aunque en este ejemplo no se detectaron diferencias significativas en los porcentajes de linfocitos ingenuos en las cohortes de RAD001 frente a las de placebo, se puede seguir investigando este posible mecanismo.

El mecanismo por el que RAD001 amplió la respuesta serológica a las cepas heterólogas de la gripe puede investigarse más a fondo. También se ha demostrado que la rapamicina inhibe el cambio de clase en las células B tras la vacunación contra la gripe. Como resultado, se generó un repertorio único de anticuerpos antigripales que promovió la protección cruzada contra la infección letal con subtipos del virus de la gripe no contenidos en la vacuna antigripal (Keating, R et al. (2013) Nat Immunol. 14:2166-2178). Los resultados descritos en el presente documento no mostraron que RAD001 alterara la conmutación de clase de células B en los sujetos ancianos que habían suspendido RAD001 2 semanas antes de la vacunación contra la gripe. Aunque el mecanismo subyacente requiere una mayor elucidación, el aumento de la respuesta serológica a las cepas heterólogas de la gripe descrito en el presente puede conferir una mayor protección contra la enfermedad de la gripe en los años en que hay una mala correspondencia entre la vacuna estacional y las cepas de la gripe que circulan en la comunidad.

El efecto del RAD001 en los títulos de anticuerpos contra la gripe fue comparable al efecto del adyuvante de la vacuna MF59 que está aprobado para mejorar la respuesta de los ancianos a la vacunación contra la gripe (Podda, A (2001) Vaccine 19:2673-2680). Por lo tanto, la potenciación de la respuesta de anticuerpos a la vacunación contra la gripe impulsada por RAD001 puede traducirse en un beneficio clínico, como se ha demostrado con la vacuna antigripal adyuvada con MF59 en los ancianos (lob, A et al. (2005) Epidemiol Infect. 133:687-693). Sin embargo, RAD001 también se utiliza para suprimir la respuesta inmunitaria de los pacientes con trasplantes de órganos. Estos resultados aparentemente paradójicos plantean la posibilidad de que los efectos inmunomoduladores de los inhibidores de mTOR puedan ser dependientes de la dosis y/o del antígeno (Ferrer, IR et al. (2010) J Immunol. 185:2004-2008). Se observó en el presente documento una tendencia hacia una relación inversa entre la exposición al RAD001 y la respuesta a la vacunación. Es posible que la inhibición completa de mTOR suprima la función inmunitaria a través del mecanismo normal de la ciclofilina-rapamicina, mientras que la inhibición parcial de mTOR, al menos en los ancianos, mejora la función inmunitaria debido a una inhibición distinta del fenotipo relacionado con el envejecimiento. Es interesante observar que la actividad de mTOR aumenta en diversos tejidos, incluyendo las células madre hematopoyéticas, en modelos animales que envejecen (Chen C. et al. (2009) Sci Signal 2:ra75 y Barns, M. et al. (2014) Int J Biochem Cell Biol. 53:174-185). Por lo tanto, la reducción de la actividad de mTOR a los niveles observados en los tejidos jóvenes, en lugar de una supresión más completa de la actividad de mTOR, puede ser un beneficio clínico en las indicaciones de envejecimiento.

El perfil de seguridad de los inhibidores de mTOR, tal como RAD001, en el tratamiento de las indicaciones relacionadas con el envejecimiento ha sido motivo de preocupación. La toxicidad del RAD001 a las dosis utilizadas en indicaciones oncológicas o de trasplante de órganos incluye tasas de estomatitis, diarrea, náuseas, citopenias, hiperlipidemia e hiperglucemia que serían inaceptables para muchas indicaciones relacionadas con el envejecimiento. Sin embargo, estos AE están relacionados con los niveles mínimos de RAD001 en sangre. Por lo tanto, los regímenes de dosificación de RAD001 utilizados en este estudio se eligieron para minimizar los niveles mínimos. Los niveles promedio de RAD001 en las cohortes de 0,5 mg diarios, 5 mg semanales y 20 mg semanales fueron de 0,9 ng/ml, por debajo de 0,3 ng/ml (el límite inferior de cuantificación) y 0,7 ng/ml, respectivamente. Estos niveles mínimos son significativamente más bajos que los niveles mínimos asociados con los regímenes de dosificación utilizados en pacientes con trasplantes de órganos y con cáncer. Además, el curso limitado de 6 semanas de tratamiento disminuyó el riesgo de eventos adversos. Estos resultados sugieren que los regímenes de dosificación utilizados en este estudio pueden tener un riesgo/beneficio aceptable para algunas condiciones de los ancianos. No obstante, un número significativo de sujetos en los experimentos descritos en el presente documento desarrollaron úlceras bucales incluso con dosis tan bajas como 0,5 mg diarios. Por lo tanto, el perfil de seguridad de la dosis baja de RAD001, que refuerza el sistema inmunitario, justifica la realización de más estudios. El desarrollo de inhibidores de mTOR con perfiles de seguridad más limpios que los rapálogos actualmente disponibles puede proporcionar mejores opciones terapéuticas en el futuro para las afecciones asociadas al envejecimiento.

Ejemplo 14: Mejora de la Respuesta Inmunitaria a la Vacuna en Sujetos de Edad Avanzada

La función inmunitaria disminuye en los ancianos, lo que provoca un aumento de la incidencia de las infecciones y una disminución de la respuesta a la vacunación. Como primer paso para determinar si la inhibición de mTOR tiene efectos antienvejecimiento en los seres humanos, se llevó a cabo un ensayo aleatorio controlado con placebo para determinar si el inhibidor de mTOR RAD001 invierte la disminución de la función inmunitaria relacionada con el envejecimiento, evaluada por la respuesta a la vacunación en voluntarios de edad avanzada. En todos los casos, se obtuvieron los consentimientos de patente adecuados y el estudio fue aprobado por las autoridades sanitarias nacionales.

En el estudio se utilizaron los siguientes 3 regímenes de dosificación de RAD001:

20 mg semanales (nivel mínimo: 0,7 ng/ml)

5 mg semanales (el nivel mínimo estaba por debajo de los límites de detección)

0,5 mg diarios (nivel mínimo: 0,9 ng/ml)

Estos regímenes de dosificación se eligieron debido a que tienen niveles mínimos que las dosis de RAD001 aprobadas para las indicaciones de trasplante y oncología. El nivel mínimo es el nivel más bajo de un medicamento en el cuerpo. El nivel mínimo de RAD001 asociado con el régimen de dosificación oncológica de 10 mg diarios es de aproximadamente 20 ng/ml. El nivel mínimo asociado al régimen de dosificación de 0,75-1,5 mg dos veces al día para el trasplante es de aproximadamente 3 ng/ml. Por el contrario, el nivel mínimo asociado con los regímenes de dosificación utilizados en nuestro estudio de inmunización fue de 3 a 20 veces menor.

Dado que los AE relacionados con RAD001 se asocian con los niveles mínimos, se predijo que los 3 regímenes de dosificación tenían una seguridad adecuada para los voluntarios normales. Además, se predijo que las 3 dosis darían un intervalo de inhibición de mTOR. La P70 S6 quinasa (P70 S6K) es un objetivo corriente abajo que es fosforilada por mTOR. Los niveles de fosforilación de P70 S6K sirven como medida de la actividad de mTOR. Con base en la modelización y simulación de los datos de fosforilación de P70 S6K obtenidos en los estudios preclínicos y clínicos de RAD001, se predijo que 20 mg semanales inhibirían casi totalmente la actividad de mTOR durante una semana completa, mientras que 5 mg semanales y 0,5 mg diarios inhibirían parcialmente la actividad de mTOR.

Los voluntarios ancianos >= 65 años fueron asignados al azar a uno de los 3 grupos de tratamiento con RAD001 (50 sujetos por brazo) o con placebo (20 sujetos por brazo). Los sujetos fueron tratados con el fármaco del estudio durante 6 semanas, se les dio un descanso de 2 semanas y luego recibieron las vacunas contra la gripe (Aggrippal, Novartis) y el neumococo (Pneumovax 23, Merck). La respuesta a la vacunación antigripal se evaluó midiendo la media geométrica de los títulos (GMT) mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación a las 3 cepas de gripe (H1N1, H3N2 y subtipos de gripe B) de la vacuna antigripal 4 semanas después de la vacunación. Los criterios de valoración primarios del estudio fueron (1) la seguridad y la tolerabilidad y (2) un aumento de 1,2 veces en los títulos de la gripe en comparación con el placebo en 2/3 de las cepas de la vacuna contra la gripe 4 semanas después de la vacunación. Se eligió este criterio de valoración debido a que un aumento de 1,2 veces en los títulos de la gripe se asocia con una disminución de la enfermedad de la gripe después de la vacunación, y por lo tanto es clínicamente relevante. Las dosis de 5 mg semanales y 0,5 mg diarios fueron bien toleradas y, a diferencia de la dosis de 20 mg semanales, cumplieron el criterio de valoración principal del GMT (Figura 33A). RAD001 no sólo mejoró la respuesta a la vacunación contra la gripe, sino que también mejoró la respuesta a la vacunación antineumocócica en comparación con el placebo en voluntarios de edad avanzada. La vacuna neumocócica contiene antígenos de 23 serotipos de neumococo. Se midieron los títulos de anticuerpos contra 7 de los serotipos en nuestros sujetos. Los títulos de anticuerpos contra 6/7 serotipos aumentaron en las 3 cohortes de RAD en comparación con el placebo.

Los datos combinados de la gripe y el neumococo sugieren que la inhibición parcial (menos del 80-100%) de mTOR es más eficaz para revertir la disminución de la función inmunitaria relacionada con el envejecimiento que una inhibición más completa de mTOR.

Ejemplo 15: La inhibición de mTOR en dosis bajas aumenta la energía y el ejercicio

En modelos preclínicos, la inhibición de mTOR con el rapalog rapamicina aumenta la actividad física espontánea en ratones viejos (Wilkinson et al. La rapamicina retrasa el envejecimiento en ratones. (2012) Aging Cell; 11:675-82). Es interesante que los sujetos de la cohorte de dosificación diaria de 0,5 mg descrita en el Ejemplo 2 también informaron de un aumento de la energía y la capacidad de ejercicio en comparación con el placebo en los cuestionarios administrados un año después de la dosificación (Figura 39). Estos datos sugieren que la inhibición parcial de mTOR con rapálogos puede tener efectos beneficiosos sobre la morbilidad relacionada con el envejecimiento más allá de la función inmunitaria.

Ejemplo 16: Inhibición de la P70 S6 quinasa con RAD001

Se realizó una modelización y simulación para predecir los intervalos de dosis diarias y semanales de RAD001 que se prevé que inhiban parcialmente la actividad de mTOR. Como se ha señalado anteriormente, P70 S6K es fosforilada por mTOR y es el objetivo corriente abajo de mTOR que está más estrechamente relacionado con el envejecimiento, ya que la eliminación de P70 S6K aumenta la vida útil. Por lo tanto, se hizo una modelización de las dosis de RAD001 que inhiben parcialmente la actividad de P70 S6K. Se prevé que las dosificaciones semanales en el intervalo de >= 0,1 mg y < 20 mg logren una inhibición parcial de la actividad de P70 S6K (Figura 40).

Para la dosificación diaria, las concentraciones de RAD001 de 30 pM a 4 nM inhibieron parcialmente la actividad de P70 S6K en las líneas celulares (Tabla 13). Se prevé que estas concentraciones séricas se alcancen con dosis de RAD001 >= 0,005 mg a < 1,5 mg diarios.

Tabla 13: Porcentae de inhibición de la actividad P70 S6K en células HeLa in vitro

Conclusión

Procedimientos de tratamiento de la morbilidad relacionada con el envejecimiento, o en general la mejora de una respuesta inmune, con dosis de inhibidores de mTOR que sólo inhiben parcialmente P70 S6K. La eficacia de la inhibición parcial de mTOR con dosis bajas de RAD001 en indicaciones de envejecimiento es un hallazgo inesperado. Los intervalos de dosis de RAD001 entre >= 0,1 mg a < 20 mg semanales y >= 0,005 mg a < 1,5 mg diarios lograrán la inhibición parcial de mTOR y, por tanto, se espera que tengan eficacia en la morbilidad relacionada con el envejecimiento o en la mejora de la respuesta inmunitaria.

Ejemplo 17: MSLN CART en el Cáncer de Ovario

La actividad antitumoral de una dosis única de 2 * 106 células T mesotelina CAR se evaluó previamente en un modelo de ratón de tumor de ovario in vivo , como se describe en el Ejemplo 8. Para ver si la actividad antitumoral con las células T CAR M5 y M11 en este modelo, como se describe en el Ejemplo 8, se administró a las células T CAR una dosis más alta de 4 * 106 células T mesotelina CAR 14 días después de la implantación del tumor, cuando los volúmenes tumorales eran una media de 150 mm3, y se administró una dosis idéntica de seguimiento de células T CAR. A la mitad de los ratones se les administró una segunda dosis idéntica de células T CAR cinco días después para ver si esto mejoraba la actividad antitumoral observada anteriormente en este modelo.

Materiales y Procedimientos:

Línea celular: OVCAR8 es una línea celular humana de cáncer de ovario derivada de una paciente de 64 años con adenocarcinoma de ovario, y ha sido transducida para expresar mCherry. Las células se cultivaron en medio RMPI con 10 % de suero bovino fetal. Esta línea celular crece adherida en frascos de cultivo de tejidos. Esta línea celular forma tumores en ratones cuando se implanta por vía subcutánea en el flanco y se mezcla con matrigel. La adición de matrigel a las células durante la implantación permite que se desarrolle una matriz en el flanco del ratón que proporciona una estructura para que las células tumorales empiecen a crecer. A lo largo de 10-12 días, el tapón de matrigel se degrada y el tumor sólido que queda está formado por células tumorales y células estromales circundantes. Las células OVCAR8 se han modificado para que expresen mCherry, de modo que el crecimiento de la célula tumoral también se pueda monitorizar mediante la obtención de imágenes de los ratones.

Ratones: Los ratones nSG de 6 semanas de edad (NOD. Cgr PrkdcscidIl2rgtm/WjllSzJ) se recibieron del Jackson Laboratory (número de stock 005557). Se permitió que los animales se aclimataran en las instalaciones de Novartis NIBRI durante al menos 3 días antes de la experimentación. Los animales se manipularon de acuerdo con las normas y directrices del ACUC de Novartis. Se implantaron transpondedores electrónicos para la identificación de los animales en el flanco izquierdo un día antes de la implantación del tumor. Los ratones fueron afeitados en el flanco derecho antes de la implantación del tumor.

Implantación del tumor: Las células OVCAR8 en fase logarítmica se cosecharon tras la tirpsinización con tripsina-EDTA al 0,25 %. Las células se lavaron en tubos falcon de 50 ml a 1.200 rpm durante 5 minutos, una vez en medio de crecimiento y luego dos veces en PBS estéril frío. Las células se resuspendieron en PBS a una concentración de 100*10^®por ml y se mantuvieron en hielo. A continuación, la solución de PBS que contenía las células se mezcló 1:1 con matrigel, lo que dio como resultado una concentración final de 50*10^®células por ml de PBS-matrigel. Las células se colocaron en hielo y se implantaron inmediatamente en ratones. Los tumores se implantaron por vía subcutánea en 200 ul en el flanco derecho.

El modelo OVCAR8 expresa endógenamente la mesotelina y, por lo tanto, puede utilizarse para probar la eficacia in vivo de las células T CAR dirigidas a la mesotelina. Este modelo crece bien cuando se implanta por vía subcutánea en el flanco de los ratones y puede calibrarse para medir elvolumen del tumor. Tras la implantación de 10*10^®células tumorales en una mezcla 50:50 de PBS y matrigel, los tumores se establecen y pueden medirse con precisión en una semana. A los 13-15 días, el volumen promedio del tumor es de 100-200 mm³, y los tumores alcanzan un volumen final (1.000-1.200 mm³) a los 60-65 días. Las actividades antitumorales de los agentes terapéuticos suelen probarse una vez que los tumores están completamente injertados y el matrigel reabsorbido. Por lo tanto, existe una amplia ventana con este modelo durante la cual se puede observar la actividad antitumoral de las células T CAR.

Dosificación de células T CAR: Los ratones fueron dosificados con 4*10⁶células T CAR (13,3x10⁶células T totales) 14 días después de la implantación del tumor. Las células se descongelaron parcialmente en un baño de agua a 37 grados Celsius y luego se descongelaron completamente añadiendo 1 ml de PBS estéril frío al tubo que contenía las células. Las células descongeladas se transfirieron a un tubo falcon de 15 ml y se ajustaron a un volumen final de 10 ml con PBS. Las células se lavaron dos veces a 1.000 rpm durante 10 minutos cada vez y luego se contaron en un hemocitómetro. A continuación, se resuspendieron las células T a una concentración de 133*10⁶células por ml de PBS frío y se mantuvieron en hielo hasta que se dosificaron los ratones. Los ratones fueron inyectados por vía intravenosa a través de la vena de la cola con 100 ul de las células T para una dosis de 4*10⁶células T CAR (13,3x10⁶células T totales) por ratón. Siete ratones por grupo fueron tratados con 100 ul de PBS solo (PBS) o con células T transducidas con un CAR de isotipo (Isotype). 14 ratones por grupo fueron tratados con células T mesotelina CAR SS1, células T mesotelina CAR ^m5 o células T mesotelina CAR M11. Cinco días después, los grupos SSI, M5 y M11 se dividieron por la mitad y siete ratones de cada grupo fueron tratados con una segunda dosis idéntica de células T CAR. Los grupos se identificaron como SS1 simple (una dosis de células T CAR SS1), SS1 doble (dos dosis de células T CAR SS1), M5 simple (una dosis de células T CAR M5), M5 doble (dos dosis de células T c Ar M5), M11 simple (una dosis de células T CAR M11), M11 doble (dos dosis de células T CAR M11). Las células T de isotipo, las células T SS1, las células T M5 y las células T M11 se prepararon en paralelo a partir del mismo donante.

Monitorización de los animales: El estado de salud de los ratones se controló diariamente, incluyendo mediciones del peso corporal dos veces por semana. El porcentaje de cambio en el peso corporal se calculó como (PC^actual-PC^inicial)/(PC^inicial) * 100 %. Los tumores se controlaron 2-3 veces a la semana mediante un calibrador y los volúmenes tumorales (TV) se calcularon mediante la fórmula del elipsoide: TV(mm^P) = ((longitud * anchura²) * 3,14159))/6. Los volúmenes tumorales se presentan como la media /- error estándar de la media (SEM). Los valores del porcentaje de tratamiento/control (T/C) se calcularon mediante la siguiente fórmula:

% T/C = 100 x AT/AC i f AT > 0 ;

% de regresión = 100 x AT/T¡r¡c¡ai i f AT < 0

donde T = volumen tumoral medio del grupo tratado con el fármaco el último día del estudio; Tiniciai = volumen tumoral medio del grupo tratado con el fármaco el día inicial de la dosificación; AT = volumen tumoral medio del grupo tratado con el fármaco el último día del estudio - volumen tumoral medio del grupo tratado con el fármaco el día inicial de la dosificación; C = volumen tumoral medio del grupo de control el último día del estudio; y AC = volumen tumoral medio del grupo de control en el último día del volumen tumoral medio del estudio del grupo de control en el día inicial de dosificación. Los valores de T/C en el intervalo de 100 % - 42 % se interpretan como de nula o mínima actividad antitumoral; los valores de T/C que son < 42 % y > 10 % se interpretan como de actividad antitumoral o de inhibición del crecimiento tumoral. Los valores de T/C < l0 % o de regresión > -10 % se interpretan como estasis tumoral. Los valores de regresión < -10 % se indican como regresión.

Resultados:

La actividad antitumoral de las células T mesotelina CAR se evaluó en un modelo de xenoinjerto de adenocarcinoma de ovario subcutáneo. Tras la implantación de las células tumorales el día 0, los ratones portadores de tumores fueron distribuidos aleatoriamente en grupos de tratamiento y se les administraron 4*10® células T CAR (13,3x106 células T totales) por vía intravenosa a través de la vena lateral de la cola el día 14 tras la implantación del tumor. Se administró una segunda dosis idéntica de células T a la mitad de los ratones 5 días después. El crecimiento del tumor y la salud de los animales se controlaron hasta que alcanzaron el punto final. Los ratones de todos los grupos fueron eutanasiados entre los días 57 y 62, cuando los tumores empezaron a mostrar signos de ulceración que provocaron un cambio en las puntuaciones de la condición corporal de los animales.

La media /- SEM del volumen tumoral para todos los grupos de tratamiento se representa en la Figura 43. El grupo de tratamiento con PBS, que no recibió ninguna célula T, demuestra la cinética de crecimiento tumoral de OVCAR8 en ratones NSG implantados subcutáneamente. El grupo de tratamiento con isotipo recibió células T transducidas con un CAR de control. Estas células sirven como control de células T para mostrar la respuesta inespecífica de las células T de donantes humanos en este modelo. Tanto el grupo de tratamiento con PBS como el de isotipo demuestran una progresión tumoral continua a lo largo de este estudio. El grupo del isotipo muestra un crecimiento tumoral ligeramente más lento, debido a la actividad de fondo de las células T del donante. Al igual que en estudios anteriores, una dosis única de 4*10® células T CAR+ no produce cambios en el crecimiento del tumor en el grupo tratado con SS1. Una dosis doble de células T CAR SS1 tampoco produjo cambios en el crecimiento del tumor OVCAR8. Los grupos de dosis única M5 y M11 muestran una clara actividad antitumoral, al igual que lo hicieron anteriormente cuando se dosificaron con 2*10® células T CAR+. Tanto los grupos de doble dosis de M5 como de M11 muestran una mayor actividad antitumoral en comparación con los grupos de dosis única. Los tumores de estos grupos muestran una regresión en lugar de una inhibición del crecimiento tumoral. El grupo de doble dosis de M5 demuestra una regresión completa en cuatro de los siete ratones, sin tumor medible en múltiples puntos temporales.

El cambio en el volumen del tumor en comparación con el grupo del isotipo (delta T/C %) se calculó en el día 52, que es la última medición del volumen del tumor antes de que los ratones fueran eliminados debido a la ulceración de los tumores. La Tabla 14 muestra los valores delta T/C de cada grupo. Tanto el grupo de dosis única como el de dosis doble de SS1 no muestran actividad antitumoral, similar a la del grupo tratado con PBS de control. El grupo de dosis única de M5 muestra una inhibición del crecimiento tumoral con un valor delta T/C del 30,28 %, mientras que el grupo de dosis doble de M5 muestra una regresión con un valor de -63,90 %. El grupo de dosis única de M11 muestra una actividad antitumoral mínima con un valor delta T/C del 52,91 %, mientras que el grupo de dosis doble de M11 también demuestra una regresión con un valor de -15,80 %.

Tabla 14. Delta T/C Volumen Tumoral del Tratamiento/Control

Discusión:

Este estudio demostró que las células T CAR específicas de mesotelina (M5 y M11), cuando se dosifican por segunda vez cinco días después de una dosis inicial de células T, son capaces de provocar la regresión de los tumores OVCAR8. Esta respuesta junto con la actividad antitumoral tras una única dosis de las células T CAR M5 y M11 son duraderas. Además, cuatro de los siete ratones del grupo de doble dosis de M5 demuestran una regresión completa sin tumor medible por calibre o palpación.

Como se ha visto anteriormente, por ejemplo, en el Ejemplo 8, una dosis única de 2*106 células T CAR de las células T CAR M5 o M11 muestra actividad antitumoral y lo que parece ser estasis en el modelo de xenoinjerto OVCAR8 en ratones NSG. En este estudio, una dosis única de 4*106 células T CAR M5 o M11 muestra el mismo resultado. En comparación con las células T CAR de isotipo o las células T CAR de SS1, los grupos M5 y M11 muestran una clara actividad antitumoral incluso como dosis única (Figura 43). La administración de una segunda dosis de las células T CAR SS1 no muestra una mayor respuesta antitumoral. Sin embargo, la administración de una segunda dosis de las células T CAR M5 o M11 da lugar a una mayor respuesta antitumoral y conduce a la regresión de los tumores en ambos grupos.

La mayor actividad antitumoral de las células T CAR M5 y M11 puede atribuirse a varios mecanismos. La primera es que una dosis mayor de células T CAR logra la regresión en el modelo OVCAR8. El aumento de la dosis de células T CAR, por ejemplo, a 8*106 células T CAR, por ejemplo, en una sola dosis, puede aumentar la actividad antitumoral y producir una regresión. Otro mecanismo es que las dosis adicionales de células T CAR mejoran la actividad antitumoral y la regresión del tumor. Por ejemplo, la dosis inicial puede dar lugar a cierta actividad antitumoral debido a la expansión de las células T CAR y a la producción de citoquinas por parte de las células T. La administración de una dosis adicional, por ejemplo, una segunda dosis cinco días más tarde mientras las células todavía están en expansión, puede aumentar la actividad de las células debido a las citocinas que ya están produciendo las células T CAR administradas anteriormente.

Además, estudios anteriores han demostrado la infiltración de células T CAR en los tumores OVCAR8. La infiltración de las células T CAR también se estudia en los ratones que han recibido una dosis doble de las células T CAR para determinar si hay una mayor infiltración de células T CD8+ (citotóxicas). La persistencia de las células T CAR también se evalúa mediante un análisis de las células en el bazo y la médula ósea de estos ratones.

Ejemplo 18: Mapeo de Epítopos Mediante Intercambio de Hidrógeno-Deuterio-Espectrometría de Masas

Se realizó una espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX) para predecir las regiones de la mesotelina que contribuyen a los epítopos reconocidos por los constructos de scFv s S l y M5. En HDX, los hidrógenos de la columna vertebral de la amida de una proteína objetivo se intercambian con deuterio. La interacción entre la proteína objetivo y una proteína de unión, por ejemplo, un anticuerpo, "protege" regiones de la proteína objetivo de la accesibilidad del disolvente, impidiendo así el intercambio de hidrógeno en la interfaz entre la proteína objetivo y la proteína de unión. Por lo tanto, la espectrometría de masas HDX puede utilizarse para sondear el mapeo de las interfaces de unión a proteínas, por ejemplo, para predecir el epítopo de un anticuerpo.

Como se describe en el Ejemplo 2, el análisis de las constructos de scFv M5, M11, M12, M14, M16, M17, M21 y M23 mediante la unión de epítopos con base en SPR contra SS1 indicó que M5 y M11 se unen a un epítopo diferente del SS1. Para conocer las regiones de la mesotelina humana que pueden estar unidas a SS1 y ^m5, se realizó la espectrometría de masas HDX de la siguiente manera.

Clonación de Plásmidos de Expresión

Se clonó un fragmento de ADN correspondiente a los aminoácidos Val 297 - Gly 588 de la Mesotelina (Uniprot Q13421) en un vector de expresión de mamíferos utilizando los sitios de restricción HindlII y EcoRI en los 5' y 3' respectivamente. Posteriormente, se insertó una señal de secreción en el amino terminal correspondiente a los aminoácidos METDTLLLWVLLLWVPGSTGDAAQPAASE (SEQ ID NO: 376). En el terminal carboxilo, una etiqueta V5-His correspondiente a los aminoácidos TRGSGKPIPNPLLGLDSTRTGHHHHHHHHHH (SEQ ID NO: 377). Los tres sitios de glicosilación previstos fueron mutados: N388Q, N496Q y N523Q. La secuencia final expresada se proporciona a continuación:

Mesotelina Deficiente en Glicosilación (296-588; N388Q, N496Q, N523Q)

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDAAQPAASEVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDR

VNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMSPEDIRKWQVTSLETLKALLEVNKGHEMSP

QVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKA

RLAFQNMQGSEYFVKIQS FLGGAPTEDLKALSQQQVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLK

AEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGTRGSGKPIPNPLLGLDSTRTGHHHHHHHHHHHH (SEQ ID

NO: 378)

El scFv correspondiente a la IgG M5 (por ejemplo, SEQ ID NO: 43) se clonó de forma similar en un vector de expresión de mamíferos con el líder N-terminal MALPv Ta LLLPLALLLHAa Rp (SEQ ID NO: 379) y una etiqueta de purificación de ocho histidinas C-terminal GSHHHHHH (SEQ ID NO: 380). La secuencia final expresada se proporciona a continuación

MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVEKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGW

INPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCASGWDFDYWGQGTLVTVSSGGGGSG

GGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRYYLSWYQQKPGKAPKLLIYTASILQNG

VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQTYTTPDFGPGTKVEIKGSHHHHHHHH (SEQ ID NO:

381 )

Expresión y Purificación de Proteínas

Tanto la Mesotelina como el scFv M5 se expresaron bajo el control de un promotor CMV en el sistema de expresión Expi293 (Life Technologies). Los plásmidos de mesotelina y scFv fueron cotransfectados en 2L de células Expi293 a una densidad de 2,3 *l l06células/m y viabilidad >97 % utilizando 1mg de cada plásmido purificado y 5 mg de polietilenimina (PEI) en medio Opti-MEM (Life Technologies). La mesotelina también se transfectó sola siguiendo un protocolo similar pero en 1 L de células utilizando 1 mg de ADN plasmídico y 2,5 mg de PEI. La transfección se llevó a cabo durante 5 días y luego se cosecharon las células cuando la viabilidad alcanzó el 80 %.

Una vez que la viabilidad cayó al 80 %, las células y el medio condicionado se recogieron y se centrifugaron a 4.000 x g durante 10 minutos. A continuación, el medio acondicionado se filtró a través de un filtro de 0,22 pM para eliminar cualquier resto y se agitó durante la noche con la resina de purificación cOmplete His-Tag de Roche a 4°C. Se añadió un total de 3 mL de perlas al medio condicionado de scFv-M5/Mesotelina y 1. Se añadieron 5 mL de perlas al medio de Mesotelina sola.

A la mañana siguiente, las perlas se cargaron en una Econo-Columna de Bio-Rad y se lavaron con 15 volúmenes de columna de 50 mM Tris.Cl pH=8,0, 300mM NaCl y luego 8 volúmenes de columna de 50 mM Tris.Cl pH=8,0, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol. Las proteínas se eludieron de la columna con 50 mM Tris.Cl pH=8,0, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol. La muestra eludida se recogió y concentró a 6 ml y se cargó en una columna Superdex 7516/60 conectada a un AKTAxpress (GE) en 20mM HEPES pH=7,4, 150 mM NaCl. Se recogieron las eluciones correspondientes al tamaño esperado del complejo mesotelina:M5 o de la mesotelina sola y se concentraron a 5mg/ml.

Mapeo de epítopos por intercambio de hidrógeno-deuterio/espectrometría de masas

Intercambio de hidrógeno-deuterio (HDx) en combinación con espectrometría de masas (MS) (Woods VL, Hamuro Y (2001) High Resolution, High-Throughput Amide Deuterium Exchange-Mass Spectrometry (DX^mS) Determination of Protein Binding Site Structure and Dynamics: Utility in Pharmaceutical Design. J. Cell. Biochem. Supp; 84(37): 89-98.) se utilizó para mapear el sitio de unión putativo de los anticuerpos scFv M5 y SS1 en la mesotelina humana(296-588), referida en el presente documento como hMSLN296-588 (SEQ ID No 278). En HDx, los hidrógenos amídicos intercambiables de las proteínas se sustituyen por deuterio. Este procedimiento es sensible a la estructura/dinámica de la proteína y a la accesibilidad del disolvente y, por lo tanto, es capaz de informar sobre las localizaciones que experimentan una disminución en la captación de deuterio tras la unión del ligando.

Los experimentos HDx/MS se realizaron utilizando procedimientos similares a los descritos en la literatura (Chalmers MJ, Busby SA, Pascal BD, He Y, Hendrickson CL, Marshall AG, Griffin PR (2006) Probing protein ligand interactions by automated hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Anal. Chem; 78(4): 1005-1014.Chalmers, 2006). Los experimentos se realizaron en una plataforma HDx/MS de Waters, que incluía un automuestreador LEAP, un UPLC nanoACQUITY y un espectrómetro de masas Synapt G2. El tampón de deuterio utilizado para etiquetar con deuterio la columna vertebral de la proteína hMSLN296-588 fue 25 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4; el porcentaje global de deuterio en la solución fue 94,5 %. Para los experimentos de etiquetado con deuterio de hMSLN296-5s8 en ausencia de anticuerpos, se diluyeron 400 pmol de hMSLN296-588, con un volumen de 6,9 pl, utilizando 100 pl del tampón de deuterio durante 15 minutos a 4 °C. A continuación, la reacción de etiquetado se apagó con 100 pl de tampón de apagado refrigerado a 2 °C durante tres minutos y se inyectó en el sistema LC-MS para la digestión automatizada con pepsina y el análisis de péptidos.

Para los experimentos de etiquetado con deuterio de hMSLN296-588 en presencia de scFv M5, se diluyeron 400 pmol de hMSLN296-588 coexpresado con M5, volumen de 6,9 pl, utilizando 100 pl del tampón de deuterio durante 15 minutos a 4 °C. A continuación, la reacción de etiquetado se apagó con 100 pl de tampón de apagado refrigerado a 2 °C durante tres minutos y se inyectó en el sistema LC-MS para la digestión automatizada con pepsina y el análisis de péptidos. Para los experimentos de etiquetado con deuterio de hMSLN296-588 en presencia de scFv SS1, se combinan 400 pmol de hMSLN296-588 con 480 pmol de SS1 scFv. Tras la incubación del SS1 con hMSLN296-588 durante 30 minutos a 4 °C, el volumen total de 6,9 pl se diluyó con 100 pl del tampón de deuterio durante 15 minutos a 4 °C. A continuación,

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un receptor antigénico quimérico (CAR), en el que el CAR comprende: i) un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende un dominio de unión a la antimesotelina humana, ii) un dominio transmembrana, y iii) un dominio de señalización intracelular que comprende un dominio estimulador, y en el que dicho dominio de unión a la antimesotelina comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 49, o una secuencia con 95-99 % de identidad con SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 49, opcionalmente en el que el dominio de unión a la antimesotelina es un scFv.

2. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, en la que el dominio de unión a la antimesotelina comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 43 o la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 49.

3. La molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de unión a la antimesotelina comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 91 o SEQ ID NO: 97, o una secuencia con 95-99 % de identidad con una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 91 o SEQ ID NO: 97.

4. La molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que

a) el CAR codificado incluye un dominio transmembrana que comprende un dominio transmembrana de una proteína seleccionada del grupo que consiste en la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 y CD154;

b) el dominio transmembrana codificado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; c) el dominio transmembrana codificado comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6;

d) el dominio transmembrana codificado comprende una secuencia de aminoácidos con 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6; o

e) la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio transmembrana comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 17, o una secuencia con 95-99 % de identidad con una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 17.

5. La molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el dominio de unión a la antimesotelina codificado está conectado al dominio transmembrana por una región bisagra, en la que

a) la región bisagra codificada comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, o la región bisagra codificada comprende una secuencia con 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, o

b) la región bisagra codificada comprende una secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 13, o la región bisagra codificada comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia con 95 99 % de identidad con una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:13.

6. La molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una secuencia que codifica un dominio costimulador, en la que

a) el dominio coestimulador codificado es un dominio de señalización funcional derivado de una proteína seleccionada del grupo que consiste en OX40, CD2, CD27, CD28, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278) y 4-1BB (CD137);

b) el dominio costimulador codificado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7;

c) el dominio costimulador codificado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7;

d) el dominio costimulador codificado comprende una secuencia con 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7;

e) la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio costimulador comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 18; o

f) la secuencia que codifica el dominio costimulador comprende una secuencia con 95-99 % de identidad con una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 18.

7. La molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el dominio de señalización intracelular codificado comprende un dominio de señalización funcional de 4-1BB y/o un dominio de señalización funcional de CD3 zeta, opcionalmente en la que el dominio de señalización intracelular codificado comprende

(ii) una secuencia de aminoácidos que tenga al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7 y una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9 o de SEQ ID NO: 10;

(iii) una secuencia de aminoácidos con 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O:7 y una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10;

(iv) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7 y la secuencia de SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO: 10, en la que las secuencias que comprenden el dominio de señalización intracelular se expresan en el mismo marco y como una sola cadena polipeptídica; o

8. La molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una secuencia líder en la que la secuencia líder comprende opcionalmente una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

9. Una molécula aislada de receptor antigénico quimérico (CAR) codificada por la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que, opcionalmente, el CAR comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67, o SEQ ID NO: 73.

10. Una molécula aislada de receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende: i) un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que incluye un dominio de unión a la antimesotelina humana, ii) un dominio transmembrana, y iii) un dominio de señalización intracelular, en el que el dominio de unión a la antimesotelina (por ejemplo, un scFv) comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 49, o una secuencia con 95-99 % de identidad con SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 49, opcionalmente en el que el dominio de unión a la antimesotelina es un scFv.

11. La molécula de CAR aislada de la reivindicación 10, en la que el dominio de unión a la antimesotelina humana (por ejemplo, un scFv) comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 43 o la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 49.

12. La molécula de CAR aislada de las reivindicaciones 10 u 11, en la que el dominio transmembrana comprende

(ii) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;

13. La molécula de CAR aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en la que el dominio de unión a la antimesotelina humana está conectado al dominio transmembrana por una región bisagra, en la que la región bisagra comprende SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:36, o una secuencia con 95-99 % de identidad con la misma.

14. La molécula de CAR aislada de cualquiera de las reivindicaciones 10-13, en la que el dominio de señalización intracelular comprende un dominio costimulador, en el que el dominio coestimulador comprende

b) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7;

c) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; o

15. La molécula de CAR aislada de cualquiera de las reivindicaciones 10-14, en la que el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización funcional de 4-1BB y un dominio de señalización funcional de CD3 zeta.

16. La molécula de CAR aislada de la reivindicación 15, en la que el dominio de señalización intracelular comprende

(i) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9;

(ii) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10; (iii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 20, 10 o 5 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7 y de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9 o de SEQ ID NO: 10;

(iv) una secuencia de aminoácidos con 95-99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O:7 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10; o

17. La molécula aislada de CAR de cualquiera de las reivindicaciones 10-16, que comprende además una secuencia líder, en la que la secuencia líder comprende opcionalmente la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o una secuencia con 95-99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1.

18. Un dominio humano de unión a la antimesotelina, que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 49, o una secuencia con 95-99 % de identidad con SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 49, opcionalmente en el que el dominio de unión a la antimesotelina es un scFv.

19. El dominio de unión a la antimesotelina humana de la reivindicación 18, en el que el dominio de unión a la antimesotelina humana comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 43 o la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 49.

20. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el vector se selecciona del grupo que consiste en un ADN, un ARN, un plásmido, un vector lentivirus, un vector adenoviral o un vector retroviral.

21. Una célula efectora inmune que comprende el vector de la reivindicación 20.

22. Un procedimiento in vitro para fabricar una célula efectora inmunitaria que comprende transducir una célula efectora inmunitaria con un vector de la reivindicación 20.

23. Un procedimiento in vitro para generar una población de células con ARN que comprende introducir un ARN transcrito in vitro o un ARN sintético en una célula, donde el ARN comprende una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

24. Una célula que comprende una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en un procedimiento para proporcionar una inmunidad anticancerosa en un mamífero, comprendiendo dicho procedimiento administrar al mamífero una cantidad eficaz de la célula.

25. Una célula que comprende una molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en un procedimiento de tratamiento de un mamífero que tiene una enfermedad asociada con la expresión de mesotelina, en la que la enfermedad se selecciona entre una enfermedad proliferativa tal como un cáncer o una neoplasia, o una condición precancerosa, comprendiendo el procedimiento la administración al mamífero de una cantidad eficaz de la célula.

26. La molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, la molécula de CAR aislada de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 17, el dominio de unión a la antimesotelina de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 19, el vector de la reivindicación 20 o la célula de la reivindicación 21, para su uso como medicamento.

27. La molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, la molécula de CAR aislada de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 17, el dominio de unión a la antimesotelina de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 19, el vector de la reivindicación 20 o la célula de la reivindicación 21, para su uso en el tratamiento de una enfermedad asociada a la expresión de mesotelina, en la que la enfermedad se selecciona entre una enfermedad proliferativa, tal como un cáncer o una neoplasia, o una condición precancerosa.

28. La célula, para uso de la reivindicación 25, o la molécula de ácido nucleico aislada, la molécula de CAR aislada, el dominio de unión a la antimesotelina, el vector o la célula, para uso de la reivindicación 27, en la que la enfermedad es un cáncer asociado con la expresión de mesotelina seleccionado del grupo que consiste en mesotelioma, mesotelioma pleural maligno, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células escamosas o cáncer de pulmón de células grandes, cáncer de páncreas, adenocarcinoma ductal pancreático, cáncer de páncreas metastásico, cáncer de ovario, cáncer colorrectal y cáncer de vejiga, o cualquier combinación de los mismos.

29. Una célula de la reivindicación 21, que expresa además un agente que inhibe una molécula que inhibe la función de las células T, en la que el agente comprende:

30. La célula, para uso de la reivindicación 25, o 28, en la que el ácido nucleico se introduce en las células T o en las células NK utilizando la transcripción in vitro, y el sujeto recibe una administración inicial de las células que comprenden el ácido nucleico, y una o más administraciones posteriores de las células que comprenden el ácido nucleico, en la que la una o más administraciones posteriores se administran menos de 15 días, por ejemplo, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, o 2 días después de la administración anterior.