CN109971714B - 自表达pd-1抗体并靶向间皮素的嵌合抗原受体修饰t细胞及其用途 - Google Patents

自表达pd-1抗体并靶向间皮素的嵌合抗原受体修饰t细胞及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN109971714B
CN109971714B CN201711458257.1A CN201711458257A CN109971714B CN 109971714 B CN109971714 B CN 109971714B CN 201711458257 A CN201711458257 A CN 201711458257A CN 109971714 B CN109971714 B CN 109971714B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
amino acid
seq
antibody
cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201711458257.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109971714A (zh
Inventor
钱其军
金华君
江芏青
刘祥箴
何周
王超
崔连振
李林芳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Cell Therapy Research Institute
Shanghai Cell Therapy Group Co Ltd
Original Assignee
Shanghai Cell Therapy Research Institute
Shanghai Cell Therapy Group Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Cell Therapy Research Institute, Shanghai Cell Therapy Group Co Ltd filed Critical Shanghai Cell Therapy Research Institute
Priority to CN201711458257.1A priority Critical patent/CN109971714B/zh
Priority to PCT/CN2018/123560 priority patent/WO2019128998A1/zh
Publication of CN109971714A publication Critical patent/CN109971714A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109971714B publication Critical patent/CN109971714B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Abstract

本发明提供自表达PD‑1抗体并靶向间皮素的嵌合抗原受体修饰T细胞及其用途。本发明的T细胞自表达PD1抗体并靶向间皮素，优选(1)含有表达识别间皮素的嵌合抗原受体的编码序列和PD‑1抗体的编码序列；和/或(2)表达识别间皮素的嵌合抗原受体和PD‑1抗体。本发明的T细胞在过继性免疫细胞治疗的同时，抑制免疫检查点PD‑1/PD‑L1通路，能原位激活残留的肿瘤特异性T细胞的功能，增加内源性细胞毒性T细胞的抗肿瘤杀伤效应，促进CAR‑T细胞在体内的增殖，从而提高特异性杀伤肿瘤的疗效。

Description

自表达PD-1抗体并靶向间皮素的嵌合抗原受体修饰T细胞及 其用途
技术领域
本发明属于基因工程学和免疫学，涉及一种靶向间皮素的嵌合抗原受体修饰T细胞及其用途。
背景技术
癌症现在已成为人类健康的头号杀手，快速的生活节奏、巨大的工作压力、不健康的饮食习惯、糟糕的环境都是癌症发生的帮凶，使得癌症的高发率和年轻化趋势也越来越明显。目前常用的治疗手段效果十分有限，仍需探索一个更加有效的治疗方法，来提高癌症患者的生存率和生存质量。
针对恶性肿瘤的免疫治疗近年来发展迅速，取得了令人瞩目的临床疗效。自2011年，Nature及临床肿瘤最顶级杂志JCO分别发表相同题目“肿瘤免疫治疗的时代已经来临”的评论文章(Nature.2011；480(7378):480；J Clin Oncol.2011；29(36):4828)，肿瘤免疫细胞治疗迎来新一轮的研究热潮。
嵌合抗原受体T细胞疗法作为肿瘤免疫治疗的重要分支之一，在恶性血液肿瘤中已经取得了非常好的疗效，对复发难治性B细胞白血病的完全缓解率超过90％。2017年8月，美国FDA批准了诺华的tisagenlecleucel嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)治疗用于治疗儿童和年轻成年患者急性淋巴细胞性白血病(ALL)，成为第一个批准上市的CAR-T药物。紧接着同年10月，美国FDA又宣布批准了Kite Pharma的CAR-T疗法Yescarta上市，治疗罹患特定类型的大B细胞淋巴瘤成人患者。CAR-T药物的陆续获批使得CAR-T治疗迈上了一个新的台阶。
嵌合抗原受体是一种人工合成受体，它通常包含胞外抗原结合域、跨膜铰链区和胞内信号转导区。通过将识别肿瘤相关抗原(tumor associated antigen,TAA)的抗体单链可变区(single-chain fragment variable，scFv)和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAM)”在体外进行基因重组。再通过病毒或其它载体***将其导入T细胞中，这样经过基因改造的T细胞称之为CAR-T细胞。CAR-T细胞在体外经大规模扩增后，回输到患者体内，能够以非MHC限制性的模式表现强效的抗癌作用。
但是，CAR-T细胞治疗实体瘤的疗效目前仍不足。主要原因包括：1、实体瘤异质性高，缺乏适合CAR-T治疗的细胞表面靶点；2、实体瘤具有强烈抑制免疫的微环境。
间皮素是一种通过磷脂酰肌醇区(GPI)锚定在细胞质膜上的糖蛋白，高表达于多种肿瘤组织中，少量表达于正常胸膜、心包和腹膜的间皮细胞中。间皮素基因编码一种69kDa的前体蛋白，经加工形成一个40kDa的膜结合蛋白和一个31kDa称之为巨核细胞促进因子(MPF)的脱落片断并释放出细胞外，我们通常所说的间皮素指的是锚定在膜上的片段，根据其蛋白结构可以分为Region I、II、III三个区域。它一方面可以通过其GPI结构域激活NFκB、MAPK和PI3K细胞内信号通路，促进细胞增殖，抵抗细胞凋亡；另一方面与其受体CA125/MUC16相互作用导致异常的细胞粘附，促进癌细胞转移。由于间皮素在正常组织中的分布有限而在多种恶性肿瘤(间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、胆管癌等)中过表达，因此是一个很有潜力的肿瘤特异性治疗靶点。
目前，以间皮素为靶点的小分子药物、抗毒素已经取得了很好的效果，以此为靶点的CAR-T细胞研究也在如火如荼的展开，主要是针对胰腺癌(NCT01897415,NCT02465983)，间皮瘤(NCT01355965,NCT02414269)，肺癌和乳腺癌(NCT02414269)。
PD1(Programmed Death 1，重编程细胞死亡受体1)是调节性T细胞CD28家族的成员，属于免疫球蛋白超家族受体。PD-1和它的配体PD-L1/PD-L2在T细胞的共抑制和衰竭中起重要作用，他们相互作用抑制了共刺激分子调节的T细胞的繁殖和细胞因子的分泌，下调了抗凋亡分子BCL-xl的表达，削弱了肿瘤特异性T细胞的功能，导致一些肿瘤患者不能完全消除肿瘤。因此，抑制免疫检查点PD-1/PD-L1通路是目前治疗淋巴瘤的一个新的方向和靶标。PD-1抗体阻断治疗对晚期或难治性黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、头颈鳞状上皮细胞癌、结直肠癌、霍奇金淋巴瘤、卵巢癌等都有一定程度的治疗效果，但是其较高的生产成本及应答率不高限制了它在临床中的运用。
发明内容
本文提供一种T细胞，所述T细胞自表达PD1抗体并靶向间皮素。
在一个或多个实施方案中，所述T细胞的基因组中整合了PD1抗体的表达框以及识别间皮素的嵌合抗原受体的表达框。
在一个或多个实施方案中，所述PD1抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第21-495位氨基酸残基所示，或如SEQ ID NO:2所示。
在一个或多个实施方案中，所述PD1抗体的编码序列如SEQ ID NO:4第61-1488位碱基序列所示，或如SEQ ID NO:4所示。
在一个或多个实施方案中，所述识别间皮素的嵌合抗原受体从N端到C端依次含有任选的信号肽、抗间皮素III区单链抗体、铰链区、跨膜区、胞内共刺激信号域和胞内信号域。
在一个或多个实施方案中，所述信号肽为CD8信号肽、CD28信号肽、CD4信号肽或轻链信号肽；更优选地为CD8信号肽；优选地，所述CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第1-22位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第23-272位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述铰链区为CD8铰链区或IgG4CH2CH3铰链区；优选地，所述IgG4CH2CH3铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第273-500位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述跨膜区为CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种；优选为CD8跨膜区，优选其氨基酸序列如SEQ ID NO:1第501-528位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述胞内共刺激信号域包括共刺激信号分子的胞内结构域，包括CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)和DNAX激活蛋白10的胞内结构域；优选地，所述胞内共刺激信号域为CD28的胞内结构域；优选地，所述CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第529-569位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述胞内信号域为CD3ζ胞内信号域或FcεRIγ胞内信号域；优选为CD3ζ胞内信号域，优选地所述CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第570-681位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第23-681位氨基酸残基所示，或如SEQ ID NO:1所示；优选地，所述嵌合抗原受体的编码序列如SEQ ID NO:3第67-2043位碱基所示，或如SEQ ID NO:3所示。
本发明还提供一种组合物，所述组合物含有：含本发明所述嵌合抗原受体的表达框的载体，所述载体用于将所述表达框整合到宿主细胞的基因组中；和含PD1抗体的编码序列或其互补序列的载体，所述载体用于将所述表达框整合到宿主细胞的基因组中。
在一个或多个实施方案中，所述PD1抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第21-495位氨基酸残基所示，或如SEQ ID NO:2所示。
在一个或多个实施方案中，所述PD1抗体的编码序列如SEQ ID NO:4第61-1488位碱基序列所示，或如SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒含有：
(1)含本发明所述嵌合抗原受体的表达框的载体，所述载体用于将所述表达框整合到宿主细胞的基因组中；和
(2)含PD1抗体的编码序列或其互补序列的载体，所述载体用于将所述表达框整合到宿主细胞的基因组中。
在一个或多个实施方案中，所述PD1抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第21-495位氨基酸残基所示，或如SEQ ID NO:2所示。
在一个或多个实施方案中，所述PD1抗体的编码序列如SEQ ID NO:4第61-1488位碱基序列所示，或如SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本发明所述的T细胞或所述T细胞及其表达的PD1抗体。
本发明还提供本文所述的T细胞或所述T细胞及其表达的PD1抗体在制备治疗或预防恶性肿瘤的药物中的用途。优选地，所述恶性肿瘤为其癌细胞表面异常表达间皮素的癌症；优选地，所述癌症选自：腺癌、间皮瘤、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、***、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、头颈鳞状上皮细胞癌、直肠癌、霍奇金淋巴瘤、胰腺癌或***癌；更优选地，所述癌症是间皮素和CA125/MUC16同时高表达的癌症。
附图说明
图1：PD-1抗体以及间皮素嵌合抗原受体基因结构模式图。
图2A：meso3CAR-2A-antiPD1、antiPD1-IRES-meso3CAR、meso3CAR-antiPD1三种CAR-T细胞阳性率。
图2B：meso3CAR-2A-antiPD1、antiPD1-IRES-meso3CAR、meso3CAR-antiPD1三种CAR-T细胞阳性率抗体分泌量。
图3A：CAR与PD1抗体质粒不同配比的条件下构建的meso3CAR-antiPD1T细胞阳性率比较。
图3B：CAR与PD1抗体质粒不同配比的条件下构建的meso3CAR-antiPD1T细胞抗体分泌量比较。
图4：流式检测meso3CAR T与meso3CAR-antiPD1T细胞表面PD1表达。
图5：meso3CAR-antiPD1T细胞对***细胞Hela、卵巢癌细胞SK-OV-3和胃癌细胞HGC-27的杀伤。
图6：meso3CAR-antiPD1在间皮素抗原刺激下IL-2，IL-4，IL-6,IL-10，TNF-α和IFN-γ细胞因子分泌的变化。
图7：meso3CAR T细胞与meso3CAR-antiPD1T细胞对SK-OV-3卵巢癌小鼠移植瘤模型的治疗效果。
具体实施方式
下面对本发明涉及的部分术语进行解释。
在本发明中，术语“表达框”是指表达一个基因所需的完整元件，包括启动子、基因编码序列、PolyA加尾信号序列。
术语“编码序列”在文中定义为核酸序列中直接确定其蛋白产物(例如CAR，单链抗体，铰链区和跨膜区)的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mRNA5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mRNA 3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。
术语“Fc”即抗体的可结晶段(fragment crystallizable,Fc)，是指位于抗体分子"Y"结构的柄部末端，包含抗体重链恒定区CH2和CH3结构域的肽段,是抗体与效应分子或者细胞相互作用的部位。
术语“共刺激分子”是指存在于抗原提呈细胞表面，能与Th细胞上的共刺激分子受体结合，产生协同刺激信号的分子。淋巴细胞的增殖不仅需要抗原的结合，还需要接受共刺激分子的信号。共刺激信号传递给T细胞主要是通过表达在抗原呈递细胞表面的共刺激分子CD80，CD86与T细胞表面的CD28分子结合。B细胞接受共刺激信号可以通过一般的病原体成分例如LPS，或者通过补体成分，或者通过激活了的抗原特异性的Th细胞表面的CD40L。
术语“接头”或铰链是连接不同蛋白或多肽之间的多肽片段，其目的是使所连接的蛋白或多肽保持各自的空间构象，以维持蛋白或多肽的功能或活性。示例性的接头包括含有G和/或S的接头，以及例如Furin 2A肽。
术语“特异性结合”是指抗体或者抗原结合片段与其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。“特异性识别”具有类似的含义。
术语“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's PharmaceuticalSciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。
术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。
术语“受试者”或者“患者”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。
术语“嵌合抗原受体”(CAR)是人工改造受体，能够将识别肿瘤细胞表面抗原的特异性分子(如抗体)锚定在免疫细胞(如T细胞)上，使免疫细胞识别肿瘤抗原或病毒抗原和杀死肿瘤细胞或病毒感染的细胞。CAR通常依次包含任选的信号肽、结合肿瘤细胞膜抗原的多肽如单链抗体、铰链区、跨膜区和胞内信号区。通常，结合肿瘤细胞膜抗原的多肽能够以中等亲和力结合肿瘤细胞广泛表达的膜抗原。结合肿瘤细胞膜抗原的多肽可以是天然多肽或人工合成多肽；优选地，人工合成多肽为单链抗体或Fab片段。
术语“单链抗体”(scFv)是指由抗体轻链可变区(VL区)氨基酸序列和重链可变区(VH区)氨基酸序列经铰链连接而成，具有结合抗原能力的抗体片段。在某些实施方案中，感兴趣单链抗体(scFv)来自感兴趣的抗体。感兴趣的抗体可以是人抗体，包括人鼠嵌合抗体和人源化抗体。抗体可以是分泌型或膜锚定型。
为了提高meso3CAR-T细胞治疗效果，本发明构建了一种自表达PD-1抗体的meso3CAR T细胞，在过继性免疫细胞治疗的同时，抑制免疫检查点PD-1/PD-L1通路，能原位激活残留的肿瘤特异性T细胞的功能，增加内源性细胞毒性T细胞的抗肿瘤杀伤效应，促进CAR-T细胞在体内的增殖，从而提高特异性杀伤肿瘤的疗效。此外，本发明设计的PD-1抗体的Fc片段为突变型的IgG4Fc，避免了与树突状细胞表面的γ-2受体结合而被巨噬细胞识别并吞噬，使自表达PD-1抗体的CAR-T细胞发挥功能的同时又不引起AICD反应。
因此，本发明提供一种PD-1抗体，所述PD-1抗体含有抗PD-1单链抗体和IgG4Fc。在某些实施方案中，所述IgG4Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第267-495位氨基酸残基所示；优选地，其编码序列如SEQ ID NO:4第799-1485位碱基序列所示。
在某些实施方案中，所述抗PD-1单链抗体(scFv)中抗体轻链可变区(VL区)氨基酸序列如SEQ ID NO:2第21-131位氨基酸残基所示；优选地，其编码序列如SEQ ID NO:4第61-393位碱基序列所示。在某些实施方案中，所述抗PD-1单链抗体中的重链可变区(VH区)氨基酸序列如SEQ ID NO:2第147-266位氨基酸序列所示；优选地，其编码序列如SEQ ID NO:4第439-798位碱基序列所示。在某些实施方案中，所述抗PD-1单链抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO:2第21-266位氨基酸残基所示；优选地，其编码序列如SEQ ID NO:4第61-798位碱基序列所示。
在某些实施方案中，所述PD-1抗体还含有轻链信号肽。在某些实施方案中，所述PD-1抗体从N端到C端，依次含有轻链信号肽、抗PD-1单链抗体和IgG4Fc。在某些实施方案中，所述轻链信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第1-20位氨基酸残基所示；优选地，所示轻链信号肽的编码序列如SEQ ID NO:4第1-60位碱基序列所示。
在某些实施方案中，所述PD-1抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第21-495位氨基酸序列所示，或者如SEQ ID NO:4所示。
本发明还包括所述PD-1抗体的编码序列或其互补序列，所述编码序列至少包括本文所述的IgG4Fc的编码序列或其互补序列。在某些实施方案中，所述PD-1抗体的编码序列含有SEQ ID NO:4第61-1495位碱基序列所示的序列，优选含有SEQ ID NO:4所示的序列。
本发明还包括一种核酸构建物，所述核酸构建物含有本发明所述的PD-1抗体的编码序列或其互补序列。优选地，所述核酸构建物是表达载体或用于将所述编码序列或其互补序列整合入宿主细胞的整合载体。
本发明还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本文所述的核酸构建物。
本发明还提供所述PD-1抗体、其编码序列或互补序列、核酸构建物以及宿主细胞在制备治疗或预防恶性肿瘤中的用途，所述肿瘤尤其是与PD-1相关的肿瘤，包括但不限于本文所述的各种恶性肿瘤。
本发明还提供一种经meso3CAR基因修饰并能表达PD-1抗体的T细胞，该T细胞能高水平稳定的表达meso3CAR基因及PD-1抗体，外源表达的meso3CAR基因可以准确的靶向间皮素，增强T细胞的增殖能力及细胞因子的分泌，增强CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤，并通过增强免疫反应，发挥抗肿瘤作用。同时，外源表达的PD-1抗体可以消除肿瘤细胞的免疫逃逸，恢复巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，促进肿瘤细胞的凋亡，发挥抗肿瘤的免疫反应。此外，外源meso3CAR基因及PD-1抗体基因可经PB转座酶***整合到T细胞的基因组中，从而在T细胞中稳定持续的表达。本发明高水平稳定表达meso3CAR基因及PD-1抗体基因的T细胞可用于多种间皮素高表达的恶性肿瘤的治疗。
本发明的CAR通常含有任选的信号肽序列、识别间皮素抗原的scFv、铰链区、跨膜区、胞内共刺激信号域和胞内信号域。
信号肽是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链(长度5-30个氨基酸)，常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移(定位)的N-末端的氨基酸序列(有时不一定在N端)，它负责把蛋白质引导到细胞含不同膜结构的亚细胞器内。信号肽可以是分泌型信号肽或膜结合型信号肽。在本发明的某些实施方案中，信号肽为CD8信号肽、CD28信号肽或CD4信号肽或轻链信号肽；更优选地为CD8信号肽。CD8信号肽的氨基酸序列可如SEQ ID NO:1第1-22位氨基酸残基所示；在某些实施方案中，其编码序列如SEQ ID NO:3第1-66位碱基所示。
本文所述的识别间皮素抗原的scFv可以是本领域周知的针对间皮素抗原的单链抗体。优选的是，该单链抗体的轻链可变区氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列来自针对间皮素近膜端氨基酸序列的抗体。优选地，本文所述的抗间皮素单链抗体是针对间皮素的Region I或III的单链抗体。优选的是，该单链抗体的轻链可变区氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列来自针对间皮素Region I或III的氨基酸序列的抗体。在某些实施方案中，间皮素Region I的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；间皮素Region III的氨基酸序列如SEQ IDNO:9所示。示例性的抗间皮素Region I的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:10。示例性的抗间皮素Region III的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第23-272位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:3第67-816位核苷酸序列所示。本文中，如果没有特别说明，间皮素指锚定在膜上的间皮素片段。
本文中，铰链区指免疫球蛋白重链CH1和CH2功能区之间的区域，该区富含脯氨酸，不形成α螺旋，易发生伸展及一定程度扭曲，有利于抗体的抗原结合部位与抗原表位间的互补性结合。适用于本文的铰链区可选自CD8的胞外铰链区、IgG1Fc CH2CH3铰链区、IgD铰链区、CD28的胞外铰链区、IgG4Fc CH2CH3铰链区和CD4的胞外铰链区的任意一种或多种。铰链区优选是长50个氨基酸残基以上、更优选长80个氨基酸以上的铰链区。在某些实施方案中，本文使用CD8α铰链区或IgG4Fc CH2CH3铰链区。示例性的IgG4FcCH2CH3铰链区的氨基酸序列SEQ ID NO:1第273-500位氨基酸残基所示，示例性的IgG4FcCH2CH3铰链区的编码序列如SEQ ID NO:3第817-1500位所示。
跨膜区可以是CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种；优选为CD8跨膜区，优选其氨基酸序列如SEQ ID NO:1第501-528所示；在某些实施方案中，其编码序列如SEQ ID NO:3第1501-1584位碱基所示。
胞内共刺激信号域包括共刺激信号分子的胞内结构域可选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)和DNAX激活蛋白10(DAP10)的胞内结构域。在某些实施方案中，所述共刺激信号分子的胞内结构域为CD28的胞内结构域，优选其氨基酸序列如SEQ ID NO:1第529-569位氨基酸残基所示，示例性的编码序列如SEQ ID NO:3第1585-1707位碱基所示。
胞内信号域优选为免疫受体酪氨酸活化基序，可以是CD3ζ胞内信号域或FcεRIγ胞内信号域；优选为CD3ζ胞内信号域，优选地所述CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列如SEQ IDNO:1第570-681位氨基酸残基所述；在某些实施方案中，其编码序列如SEQ ID NO:3第1708-2043所示。
在某些实施方案中，所述嵌合抗原受体从N端到C端依次含有：任选的CD8信号肽、抗间皮素Region III的scFv、IgG4Fc CH2CH3铰链区、CD8跨膜区、CD28的胞内结构域和CD3ζ胞内信号域；优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第23-681位氨基酸残基所示。在某些实施方案中，所述嵌合抗原受体还含有CD8信号肽，优选地，该嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第1-22位氨基酸残基所示。
应理解，本发明也包括本文所述的嵌合抗体受体及其编码序列。
形成本文嵌合抗原受体的上述各部分，如信号肽、抗间皮素单链抗体的轻链可变区和重链可变区、铰链区、跨膜区、胞内共刺激信号域和胞内信号域等，相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含G和S的接头序列。接头的长度可以是3～25个氨基酸残基，例如3～15、5～15、10～20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2～20个，例如2～15、2～10、2～8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)等。
应理解，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的氨基酸序列末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的序列的活性。为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。因此，本文的CAR的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本文。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。
本文还包括编码所述嵌合抗原受体的多核苷酸序列。本文的多核苷酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。
本文所述的多核苷酸序列通常可以用PCR扩增法获得。具体而言，可根据本文所公开的核苷酸序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。例如，在某些实施方案中，编码本文所述融合蛋白的多核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本文还包括核酸构建物，其含有本文所述的编码所述嵌合抗原受体的多核苷酸序列或编码所述PD-1抗体的多核苷酸序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。在某些实施方案中，所述核酸构建物是表达框。
调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本文。
在某些实施方案中，所述核酸构建物是载体。具体而言，可将本文CAR的编码序列或PD-1抗体的编码序列克隆入许多类型的载体，例如这些类型的载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。载体可以是表达载体。表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。
通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。例如，在某些实施方案中，本发明使用逆转录病毒载体，该逆转录病毒载体含有复制起始位点，3’LTR，5’LTR，本文所述CAR的编码序列或PD-1抗体的编码序列，以及任选的可选择的标记。
合适的启动子包括但不限于即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，也可考虑使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期限表达时打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，而在当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
在某些实施方案中，可使用CN201510021408.1所公布的各种启动子序列，包括但不限于该申请SEQ ID NO:5所示的含mCMV增强子、hCMV增强子和EF1α启动子的CCEF启动子；SEQ ID NO:7所示的含CD3e增强子、mCMV增强子、hCMV增强子和EF1α启动子的TCEF启动子；SEQ ID NO:8所示的含mCMV增强子、hCMV增强子和含内含子的EF1α启动子的CCEFI启动子；SEQ ID NO:3所示的含CD3e增强子和含内含子的EF1α启动子的TEFI启动子；以及SEQ IDNO:3所示的含CD3e增强子、mCMV增强子、hCMV增强子和含内含子的EF1α启动子的TCEFI启动子。本文将该申请的全部内容以引用的方式纳入本文。
可选择的标记包括可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从被病毒载体感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。有用的可选择标记基因包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因。
在某些实施方案中，将本文所述嵌合抗原受体的编码序列和PD-1抗体的编码序列分别克隆到用于将目的核酸序列整合到宿主细胞的基因组中的载体(也称为整合载体)中，尤其是转座子载体。在某些实施方案中，该转座子载体是含有选自piggybac、sleepingbeauty、frog prince、Tn5或Ty的转座元件的真核表达载体。这类转座子载体含有相应转座子的5’反向末端重复序列(5’LTR)和相应转座子的3’反向末端重复序列(3’LTR)。转座酶可以是来自piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5或Ty转座***的转座酶。当使用来自不同转座***的转座酶时，所述载体中的5’LTR和3’LTR的序列也相应改变为与该转座***适配的序列，这可由本领域技术人员容易地确定。在5’LTR和3’LTR之间是本发明的CAR或抗体的表达框，包括相应的启动子序列、CAR或抗体的编码序列以及polyA加尾信号序列。
在某些实施方案中，转座酶是来自piggybac转座***的转座酶。因此，在这些实施方案中，转座子5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列分别为piggybac转座子的5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列。在某些实施方案中，转座子5’反向末端重复序列如CN 201510638974.7(本文将其内容以引用的方式纳入本文)SEQ ID NO:1所示。在某些实施方案中，转座子3’反向末端重复序列如CN 201510638974.7SEQ ID NO:4所示。在某些实施方案中，piggybac转座酶为含c-myc核定位信号编码序列的转座酶。在某些实施方案中，piggybac转座酶的编码序列如CN 201510638974.7SEQ ID NO:5所示。
转座酶编码序列的启动子可以是本领域已知的用于控制转座酶编码序列表达的各种启动子。在某些实施方案中，使用CMV启动子控制转座酶编码序列的表达。CMV启动子的序列可如CN 201510638974.7SEQ ID NO:6所示。
在某些实施方案中，本发明含嵌合抗原受体的表达框的载体为CN201510638974.7所公开的pNB328载体。可采用本领域常规的方法制备本发明的嵌合抗原受体的编码序列，并将其克隆入合适的载体中。
在某些实施方案中，所述用于将目的基因整合到宿主细胞的基因组中的载体不含有转座酶编码序列。例如，可在pNB328载体的基础上除去转座酶编码序列即可获得这类载体。通常，用这类载体将PD-1抗体的编码序列及信号肽编码序列(如轻链信号肽的编码序列)整合到宿主细胞的基因组中。示例性的轻链信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2第1-20位氨基酸残基所示，示例性的轻链信号肽的编码序列如SEQ ID NO：4第1-60位碱基所示。
在某些实施方案中，本文所述的经meso3CAR基因修饰并能表达PD-1抗体的T细胞可转入：用于在T细胞基因组中整合入嵌合抗原受体表达框的含转座酶编码序列的载体，和用于在T细胞基因组中整合入本文所述的PD-1抗体的表达框的不含转座酶编码序列的载体。
优选地，所述T细胞转入了以pNB328载体为骨架载体构建的含嵌合抗原受体编码序列的载体以及以pS328载体(与pNB328相比不含转座酶编码序列)为骨架载体构建的含PD-1抗体编码序列的载体。在某些实施方案中，所述嵌合抗原受体的编码序列如SEQ IDNO:3所示；所述PD-1抗体的编码序列如SEQ ID NO:4第61-1488位碱基序列。在某些实施方案中，所述含PD-1抗体的编码序列的载体中，PD-1抗体的信号肽为轻链信号肽。示例性的轻链信号肽的氨基酸序列可如SEQ ID NO:1第1-20位氨基酸残基所示；示例性的轻链信号肽的编码序列如SEQ ID NO:4第1-60位核苷酸序列所示。更具体而言，在某些实施方案中，所述在T细胞基因组中整合入嵌合抗原受体编码序列的含转座酶编码序列的载体依次含有5’LTR、启动子、轻链号肽编码序列、识别间皮素抗原的scFv的编码序列(优选为识别间皮素Region III的scFv的编码序列)、IgG4Fc CH2CH3铰链区的编码序列、CD8跨膜区的编码序列、CD28胞内结构域的编码序列、CD3ζ胞内信号域的编码序列、polyA加尾信号序列、3’LTR和转座酶的编码序列及其启动子；所述在T细胞基因组中整合入本文所述的PD-1抗体的编码序列的不含转座酶编码序列的载体在5’LTR和3’LTR之间依次含有启动子、轻链信号肽的编码序列、PD-1抗体的编码序列和polyA加尾信号序列。
优选地，转染时，含嵌合抗原受体编码序列的载体与含PD-1抗体编码序列的载体的质量比为1～7：1～3，优选1：1～3，更优选1：1～2，更优选1：1。
转染的方法为本领域常规的方法，包括但不限于：病毒转导、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电转等。在某些实施方案中，采用电转将所述载体转染感兴趣的细胞中。
感兴趣的细胞可以是本领域周知的各种T细胞，包括但不限于外周血T淋巴细胞、细胞毒杀伤T细胞(CTL)、辅助T细胞、抑制/调节性T细胞、γδT细胞以及细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)等混合细胞群体的T细胞。在某些实施方案中，T细胞可来源于B细胞恶性肿瘤患者的PBMC。在某些实施方案中，T细胞为原代培养T细胞。
本发明还提供一种组合物，所述组合物含有含本文所述嵌合抗原受体表达框的载体和含本文所述PD-1抗体的表达框的载体。该组合物中还可含有合适的试剂，包括但不限于转染用的试剂。
本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒含有含本文所述嵌合抗原受体表达框的载体和含本文所述PD-1抗体的表达框的载体，或者含有本文所述的组合物。试剂盒中还可配有将所述载体转入细胞中的试剂或仪器。
应理解，本文所述的表达框除含有本文所述的CAR或抗体的编码序列外，还至少含有合适的启动子和polyA加尾信号序列。
本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本文所述的T细胞或所述T细胞及其表达的PD-1抗体。药物组合物中可含有合适的药学上可接受的载体或辅料。药物组合物中含有治疗或预防有效量的T细胞。可根据患者的病情等因素确定T细胞的治疗或预防有效量。
本发明还提供本文所述的T细胞或所述T细胞及其表达的PD-1抗体或其药物组合物在制备治疗治疗或预防恶性肿瘤的药物中的用途。本发明还提供恶性肿瘤的治疗或预防方法，所述方法包括给予需要的对象治疗或预防有效量的本发明所述的T细胞。适用于本文所述T细胞进行治疗或预防的癌症优选癌细胞表面异常表达间皮素的癌症；优选地，所述癌症选自：腺癌、间皮瘤、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、***、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、头颈鳞状上皮细胞癌、直肠癌、霍奇金淋巴瘤、胰腺癌或***癌；更优选地，所述癌症是间皮素和CA125/MUC16同时高表达的癌症。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。全文及附图中的“Meso3CAR”和“meso3CAR”表示相同含义。
实施例1：重组质粒pNB328-meso3CAR、pS328-antiPD1、pNB328-meso3CAR-2A-antiPD1和pNS328-antiPD1-IRES-meso3CAR的构建
分别委托商业公司人工合成meso3CAR的编码序列(SEQ ID NO:3)、antiPD1的编码序列(SEQ ID NO:4)、meso3CAR-2A-antiPD1的编码序列(2A的编码序列如SEQ ID NO:5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示)和antiPD1-IRES-meso3CAR的编码序列(IRES的编码序列如SEQ ID NO:7所示)，其结构模式如图1所示。将各序列分别装入pNB328、pS328载体EcoRI和SalI酶切位点之间(pNB328的结构及序列参见CN 201510638974.7，本文将其全部内容以引用的方式纳入本文；与pNB328相比，pS328缺少PB转座子，其它元件与pNB328相同)，构建出的重组质粒分别命名为pNB328-meso3CAR、pS328-antiPD1、pNB328-meso3CAR-2A-antiPD1、pNB328-antiPD1-IRES-meso3CAR。各结构模式图中未示出启动子序列和polyA加尾信号序列，其分别位于5’LTR和信号肽序列之间以及3’LTR之前。
实施例2：自表达PD1抗体的靶向间皮素的CAR T细胞构建
外周血单核细胞(PBMCs)由Ficoll分离法分离获得。将PBMC贴壁培养2-4h，其中未贴壁的悬浮细胞即为初始T细胞，将悬浮细胞收集到15ml离心管中，1200rmp离心3min，弃上清，加入生理盐水，1200rmp离心3min,弃生理盐水，并重复此步骤；取四个1.5ml离心管，每管加入5×106个细胞，编号a、b、c，1200rmp离心3min，弃上清，取电转试剂盒(来自Lonza公司)，a、b、c管按比例加入电转试剂共100ul，a管加入构建好的重组质粒pNB328-meso3CAR和pS328-antiPD1各4ug，b管加入pNB328-meso3CAR-2A-antiPD1质粒6ug，c管加入pNB328-antiPD1-IRES-meso3CAR质粒6ug；将混合液转移至电转杯中，放入电转仪，选取所需程序，进行电击；使用试剂盒中的微量吸管将电转好的细胞悬液转移到加好培液的六孔板中(含2％FBS的AIM-Ⅴ培液)，混匀，置于37℃，5％CO2培养箱培养，六小时后加入刺激因子IL-2和meso/anti-CD28，37℃，5％CO2培养3～4天，观察T细胞的生长情况，获得自表达PD1抗体并靶向间皮素的meso3CAR-antiPD1T细胞、meso3CAR-2A-antiPD1T细胞、antiPD1-IRES-meso3CAR T细胞。
此外，在另一离心管中加入5×106个细胞，编号d，1200rmp离心3min，弃上清，取电转试剂盒(来自Lonza公司)，按比例加入电转试剂共100ul，并加入6ug对照质粒(pNB328-meso3CAR)，按前文所述方法构建得到对照T细胞，即meso3CAR T细胞。
实施例3：比较三种自表达PD1抗体的靶向间皮素的CAR T细胞阳性率以及抗体分泌
1、流式检测CAR T细胞阳性率
收集实施例获得的meso3CAR-antiPD1T细胞、meso3CAR-2A-antiPD1T细胞和antiPD1-IRES-meso3CAR T细胞，各分为两份，每份1×106个细胞，生理盐水洗涤两遍，100ul生理盐水重悬细胞，一份加入1ug的间皮素-生物素，另一份不加，4℃孵育30分钟。生理盐水洗涤两遍，再次用100ul生理盐水重悬细胞，加入1ul的链霉素-PE抗体，4℃孵育30分钟。生理盐水洗涤两遍，上机检测，以只加二抗的为对照，结果如图2A。
2、ELISA检测所述三种T细胞的antiPD1抗体表达量
①用包被液将PD1抗原稀释至0.5ug/ml(5ul+1ml包被液)，100ul/孔包被酶标反应板，4℃过夜。
②用PBST清洗5遍，每次3分钟，用吸水纸拍干，200ul/孔。
③每孔加封闭液100ul，37℃孵育1小时。
④用PBST清洗5遍，每次3分钟，用吸水纸拍干，200ul/孔。
⑤加入样品及标准品，100ul/孔，设复孔和对照孔，37℃孵育1小时。
⑥用PBST清洗5遍，每次3分钟，用吸水纸拍干，200ul/孔。
⑦封闭液将IgG F4HRP1：30000稀释，100ul/孔，37℃孵育45分钟。
⑧用PBST清洗5遍，每次3分钟，用吸水纸拍干，200ul/孔。
⑨加入显色液TMB，100ul/孔，37℃避光显色10-15min。
⑩加入终止液终止反应，50ul/孔。
酶标仪上450nm处测OD值，绘制标准曲线，计算PD-1抗体浓度。
结果如图2B所示。
实施例4：pNBS328-meso3CAR与pS328-antiPD1质粒配比
分别将pNBS328-meso3CAR与pS328-antiPD1质粒的量设置为1ug+7ug、2ug+6ug、3ug+5ug、4ug+4ug、5ug+3ug、6ug+2ug、7ug+1ug这7种配比，进行CAR T细胞构建，构建方法同实施例2。
采用实施例3所述方法检测7种配比下构建得到的CAR T细胞的阳性率及抗体分泌量，结果分别如图3A、3B。
实施例5：meso3CAR-antiPD1T细胞对自身PD1的封闭作用
收集实施例2构建得到的meso3CAR T细胞和meso3CAR-antiPD1T细胞，使用BD的流式抗体PE-鼠抗人CD279检测PD1的表达，流式方法实施例3。
结果如图4所示，自表达PD1抗体的meso3CAR-antiPD1T可以封闭自身的PD1表达。
实施例6：meso3CAR T与meso3CAR-antiPD1T细胞的杀伤功能对比
采用实时无标记细胞功能分析仪检测实施例2构建得到的meso3CAR T与meso3CAR-antiPD1T细胞在体外对肿瘤细胞的杀伤作用。
具体而言，选取MHC class I分型匹配的效应细胞与靶细胞，应用艾森公司的实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)检测上述两种CAR-T细胞的体外杀伤活性，具体步骤如下：
(1)调零：每孔加入50μl DMEM或1640培养液，放入仪器中，选择step 1，调零；
(2)靶细胞铺板：***细胞Hela，卵巢癌细胞SK-OV-3、胃癌HGC-27(均购买于美国菌种保藏中心ATCC)按每孔104个细胞/50μl铺在含有检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定一下，再放入仪器中，开始step 2，培养细胞；
(3)加入效应细胞：靶细胞培养24h后，暂停step 2，加入效应细胞，每孔50μl，效靶比分别设置为4:1，以未转质粒的Mock T细胞作为对照，开始step 3，继续共培养24h后，观察细胞增殖曲线。
结果如图5所示，自表达PD1抗体的meso3CAR-antiPD1T细胞与单独的meso3CAR T细胞杀伤功能基本一致，抗体表达并没有影响CAR-T功能。
实施例7：meso3CAR与meso3CAR-antiPD1T细胞在间皮素抗原的特异性刺激下细胞因子释放对比
用2ug/ml的间皮素抗原包被96孔板，4℃包被过夜，PBS清洗3遍，分别加入1×105个实施例2构建得到的meso3CAR、meso3CAR-antiPD1T细胞以及对照的Mock T细胞(转入，培养24h后收集细胞上清。用BDTMCBA Human Th1/Th2Cytokine Kit II检测这三种T细胞受间皮素抗原刺激后细胞因子的分泌情况，具体步骤如下：
(1)混合人的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ捕获磁珠，涡旋振荡混匀捕获磁珠，每管加入50ul混匀后的捕获磁珠；
(2)加入50ul人的Th1/Th2细胞因子标准品(倍比稀释5000pg/ml、2500pg/ml、1250pg/ml、625pg/ml、312.5pg/ml、156pg/ml、80pg/ml、40pg/ml、20pg/ml、0pg/ml)和50ul的待测样品(经稀释液2倍稀释)；
(3)每管加入50ul的人的Th1/Th2-II-PE的检测抗体；
(4)室温避光孵育3h；
(5)每管加入1ml的洗涤缓冲液，200离心5min，弃上清；
(6)每管加入300ul的洗涤缓冲液重悬细胞，并转移至流式管中，用流式细胞仪检测荧光值。
结果如图6所示，自表达PD1抗体的meso3CAR-antiPD1T细胞与单独的meso3CAR T细胞的细胞因子分泌量没有明显差异。
实施例8：meso3CAR与meso3CAR-antiPD1T细胞对卵巢癌小鼠移植瘤模型的治疗效果
1、4～6周龄NSG完全免疫缺陷小鼠25只，平均重量22～27g，由百奥赛图生物公司提供，SPF级动物实验室饲养。
2、体外培育人卵巢癌细胞SK-OV-3-luc，取对数生长期贴壁生长细胞，0.25％胰酶消化，离心、收集细胞后用PBS重悬，1000rmp室温离心2分钟，弃上清，再用PBS液重悬后离心收集细胞，调整细胞悬液浓度至5×107个/ml。
3、于小鼠右肋背部皮下接种SK-OV-3-luc细胞，0.1ml/只。接种7天后，可通过活体成像仪观察荧光强度，将NSG免疫缺陷小鼠随机分为5组。每组注射相应的T细胞为1×107个/100ul，PBS组给予100ul PBS；给药途径为尾静脉注射。
4、每日观察小鼠的生活状态并每隔4天通过活体成像仪观察小鼠肿瘤变化。
结果如图7所示，在SK-OV-3卵巢癌小鼠移植瘤模型中，Meso3CAR-antiPD1T细胞较Meso3CAR T细胞具有明显较好的治疗作用，而Meso3CAR-wt-antiPD1T细胞基本没有效果。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述。本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 上海细胞治疗研究院
上海细胞治疗工程技术研究中心集团有限公司
<120> 自表达PD-1抗体并靶向间皮素的嵌合抗原受体修饰T细胞及其用途
<130> 179823
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 681
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
35 40 45
Phe Asp Leu Gly Phe Tyr Phe Tyr Ala Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Cys Ile Tyr Thr Ala Gly Ser Gly
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
85 90 95
Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
100 105 110
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Ala Asn Thr Arg
115 120 125
Ser Thr Tyr Tyr Leu Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
130 135 140
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
165 170 175
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Arg Ile Ser Ser
180 185 190
Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu
195 200 205
Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
225 230 235 240
Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Tyr Phe Asp
245 250 255
Ser Asn Asn Trp His Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
260 265 270
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
275 280 285
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
290 295 300
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
305 310 315 320
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
325 330 335
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr
340 345 350
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
355 360 365
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
370 375 380
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
385 390 395 400
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
405 410 415
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
420 425 430
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
435 440 445
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
450 455 460
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
465 470 475 480
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
485 490 495
Ser Leu Gly Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
500 505 510
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
515 520 525
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
530 535 540
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
545 550 555 560
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
565 570 575
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
580 585 590
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
595 600 605
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
610 615 620
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
625 630 635 640
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
645 650 655
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
660 665 670
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
675 680
<210> 2
<211> 495
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly
35 40 45
Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
115 120 125
Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro
145 150 155 160
Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
165 170 175
Asn Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu
180 185 190
Trp Met Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu
195 200 205
Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr
210 215 220
Ala Tyr Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
260 265 270
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val
275 280 285
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
290 295 300
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
305 310 315 320
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
325 330 335
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
340 345 350
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
355 360 365
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
370 375 380
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
385 390 395 400
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
405 410 415
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
420 425 430
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
435 440 445
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
450 455 460
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
465 470 475 480
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
485 490 495
<210> 3
<211> 2046
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgagcgagg tgcagctggt ggagtccggg ggaggcctgg tccagcctgg gggatccctg 120
agactctcct gcgcagcctc tggattcgac ctcggtttct acttttacgc ctgttgggtc 180
cgccaggctc cagggaaggg cctggagtgg gtctcatgca tttatactgc tggtagtggt 240
agcacgtact acgcgagctg ggcgaaaggc cgattcacca tctccagaga caattcgaag 300
aacacgctgt atctgcaaat gaacagtctg agagccgagg acacggccgt gtattactgt 360
gcgagatcta ctgctaatac tagaagtact tattatctta acttgtgggg ccaaggcacc 420
ctggtcaccg tctcctcagg cggaggcgga tcaggtggtg gcggatctgg aggtggcgga 480
agcgacatcc agatgaccca gtctccatcc tccctgtctg catctgtggg agacagagtc 540
accatcactt gccaggccag tcagaggatt agtagttact tatcctggta tcagcagaaa 600
ccagggaaag ttcccaagct cctgatctat ggtgcatcca ctctggcatc tggggtcccc 660
tcgcggttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcag 720
cctgaagatg ttgccactta ctactgtcag agttatgctt attttgatag taataattgg 780
catgctttcg gcggagggac caaggtggag atcaaagagt ccaaatatgg tcccccatgc 840
ccaccatgcc cagcacctcc cgtggccgga ccatcagtct tcctgttccc cccaaaaccc 900
aaggacactc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc 960
caggaagacc ccgaggtcca gttcaactgg tacgtggatg gcgtggaggt gcataatgcc 1020
aagacaaagc cgcgggagga gcagttccag agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1080
gtcctgcacc aggactggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc 1140
ctcccgtcct ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agagccacag 1200
gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1260
ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1320
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1380
agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga atgtcttctc atgctccgtg 1440
atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc tctgggtaaa 1500
cccttttggg tgctggtggt ggttggtgga gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca 1560
gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt aagaggagca ggctcctgca cagtgactac 1620
atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca 1680
ccacgcgact tcgcagccta tcgctccaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc 1740
gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag 1800
tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg 1860
aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac 1920
agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag 1980
ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct 2040
cgctga 2046
<210> 4
<211> 1488
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120
ctctcctgca gggccagcaa aggtgtcagt acatctggct atagttattt gcactggtat 180
caacagaaac ctggccaggc tcccaggctc ctcatctatc ttgcatccta cctagaatct 240
ggcgtcccag ccaggttcag tggtagtggg tctgggacag acttcactct caccatcagc 300
agcctagagc ctgaagattt tgcagtttat tactgtcagc acagcaggga ccttccgctc 360
acgttcggcg gagggaccaa agtggagatc aaaggtggag gcggttcagg cggaggtggc 420
agcggcggtg gcgggtcgca ggtgcagctg gtgcagtccg gcgtggaggt gaagaagcct 480
ggcgcctccg tcaaggtgtc ctgtaaggcc tccggctaca ccttcaccaa ctactacatg 540
tactgggtgc ggcaggcccc aggccaggga ctggagtgga tgggcggcat caacccttcc 600
aacggcggca ccaacttcaa cgagaagttc aagaaccggg tgaccctgac caccgactcc 660
tccaccacaa ccgcctacat ggaactgaag tccctgcagt tcgacgacac cgccgtgtac 720
tactgcgcca ggcgggacta ccggttcgac atgggcttcg actactgggg ccagggcacc 780
accgtgaccg tgtcctccga gtccaaatat ggtcccccat gcccaccatg cccagcacct 840
gagttcgagg ggggaccatc agtcttcctg ttccccccaa aacccaagga cactctcatg 900
atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg gtggtggacg tgagccagga agaccccgag 960
gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 1020
gaggagcagt tccagagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1080
tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc 1140
gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagagc cacaggtgta caccctgccc 1200
ccatcccagg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1260
taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1320
accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcag gctaaccgtg 1380
gacaagagca ggtggcagga ggggaatgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1440
cacaaccact acacacagaa gagcctctcc ctgtctctgg gtaaatga 1488
<210> 6
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgtaggaaac gaggcagcgg cgccacaaac ttctctctgc taaagcaagc aggtgatgtt 60
gaagaaaacc ccgggcct 78
<210> 7
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Arg Arg Lys Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln
1 5 10 15
Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 8
<211> 197
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccggcgggtt tctgacatcc ggcgggtttc tgacatccgg cgggtttctg acatccggcg 60
ggtttctgac atccggcggg tttctgacat ccggcgggtt tctgacatcc ggcgggtttc 120
tgacatccgg cgggtttctg acatccggcg ggtttctgac atccggcggg tgactcacaa 180
ccccagaaac agacata 197
<210> 9
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Glu Val Glu Lys Thr Ala Cys Pro Ser Gly Lys Lys Ala Arg Glu Ile
1 5 10 15
Asp Glu Ser Leu Ile Phe Tyr Lys Lys Trp Glu Leu Glu Ala Cys Val
20 25 30
Asp Ala Ala Leu Leu Ala Thr Gln Met Asp Arg Val Asn Ala Ile Pro
35 40 45
Phe Thr Tyr Glu Gln Leu Asp Val Leu Lys His Lys Leu Asp Glu Leu
50 55 60
Tyr Pro Gln Gly Tyr Pro Glu Ser Val Ile Gln His Leu Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Phe Leu Lys Met Ser Pro Glu Asp Ile Arg Lys Trp Asn Val
85 90
<210> 10
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Tyr Pro Lys Ala Arg Leu Ala Phe Gln Asn Met Asn Gly Ser Glu Tyr
1 5 10 15
Phe Val Lys Ile Gln Ser Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Glu Asp Leu
20 25 30
Lys Ala Leu Ser Gln Gln Asn Val Ser Met Asp Leu Ala Thr Phe Met
35 40 45
Lys Leu Arg Thr Asp Ala Val Leu Pro Leu Thr Val Ala Glu Val Gln
50 55 60
Lys Leu Leu Gly Pro His Val Glu Gly Leu Lys Ala Glu Glu Arg His
65 70 75 80
Arg Pro Val Arg Asp Trp Ile Leu Arg Gln Arg Gln Asp Asp Leu Asp
85 90 95
Thr Leu Gly Leu Gly Leu Gln Gly Gly Ile Pro Asn Gly Tyr Leu
100 105 110
<210> 11
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile
130 135 140
Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser
145 150 155 160
Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser
165 170 175
Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro
180 185 190
Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile
195 200 205
Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
210 215 220
Ser Lys His Pro Leu Thr Tyr Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
225 230 235 240

Claims (23)

1.一种T细胞，所述T细胞自表达PD-1抗体并靶向间皮素，其中，所述T细胞：
（1）含有识别间皮素的嵌合抗原受体的编码序列和PD-1抗体的编码序列；和/或
（2）表达识别间皮素的嵌合抗原受体和PD-1抗体；
其中，所述识别间皮素的嵌合抗原受体含有CD8信号肽、氨基酸序列如SEQ ID NO:1第23-272位氨基酸残基所示的抗间皮素III区单链抗体、IgG4 CH2CH3铰链区、CD8跨膜区、CD28的胞内结构域和CD3ζ胞内信号域；
所述PD-1抗体含有抗PD-1单链抗体和IgG4Fc，其中，所述IgG4Fc的氨基酸序列如SEQID NO:2第267-495位氨基酸残基所示，所述抗PD-1单链抗体中抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2第21-131位氨基酸残基所示、重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2第147-266位氨基酸序列所示。
2.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述T细胞的基因组中整合了PD-1抗体的表达框以及识别间皮素的嵌合抗原受体的表达框。
3.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第1-22位氨基酸残基所示。
4.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述IgG4 CH2CH3铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第273-500位氨基酸残基所示。
5.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第501-528位氨基酸残基所示。
6.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述CD28的胞内结构域的氨基酸序列如SEQID NO:1第529-569位氨基酸残基所示。
7.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列如SEQID NO:1第570-681位氨基酸残基所示。
8.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体具有以下一项或多项特征：
所述CD8信号肽的编码序列如SEQ ID NO:3第1-66位碱基所示；
所述抗间皮素III区单链抗体的编码序列如SEQ ID NO:3第67-816位核苷酸序列所示；
所述IgG4 CH2CH3铰链区的编码序列如SEQ ID NO:3第817-1500位所示；
所述CD8跨膜区的编码序列如SEQ ID NO:3第1501-1584位碱基所示；
所述CD28胞内结构域的编码序列如SEQ ID NO:3第1585-1707位碱基所示；
所述CD3ζ胞内信号域的编码序列如SEQ ID NO:3第1708-2043所示。
9.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ IDNO:1第23-681位氨基酸残基所示，或如SEQ ID NO:1所示。
10.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体的编码序列如SEQ IDNO:3第67-2043位碱基所示，或如SEQ ID NO:3所示。
11.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述PD-1抗体还含有轻链信号肽。
12.如权利要求11所述的T细胞，其特征在于，所述轻链信号肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:2第1-20位氨基酸残基所示。
13.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述抗PD-1单链抗体的氨基酸序列如SEQID NO:2第21-266位氨基酸残基所示。
14.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述抗PD-1单链抗体的编码序列如SEQ IDNO:4第61-798位碱基序列所示。
15.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述PD-1抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第21-495位氨基酸序列所示，或者如SEQ ID NO:2所示。
16.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述PD-1抗体的编码序列如SEQ ID NO:4第61-1485位氨基酸残基所示，或如SEQ ID NO:4所示。
17.一种组合物或试剂盒，所述组合物或试剂盒含有：
（1）含权利要求1和3-10中任一项所限定的嵌合抗原受体的表达框的载体，所述载体用于将所述表达框整合到宿主细胞的基因组中；和
（2）含权利要求1和11-16中任一项所限定的PD-1抗体的编码序列或其互补序列的载体，所述载体用于将所述表达框整合到宿主细胞的基因组中。
18.一种药物组合物，所述药物组合物含有权利要求1-16中任一项所述的T细胞或含有所述T细胞及其表达的PD-1抗体。
19.权利要求1-16中任一项所述的T细胞或所述T细胞及其表达的PD-1抗体在制备治疗或预防恶性肿瘤的药物中的用途；其中，所述恶性肿瘤为其癌细胞表面异常表达间皮素的癌症。
20.如权利要求19所述的用途，其特征在于，所述癌症选自：间皮瘤、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、***、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、黑色素瘤、肾细胞癌、头颈鳞状上皮细胞癌、直肠癌、霍奇金淋巴瘤、胰腺癌或***癌。
21.如权利要求19所述的用途，其特征在于，所述癌症是间皮素和CA125/MUC16同时高表达的癌症。
22.如权利要求20所述的用途，其特征在于，所述肺癌是非小细胞肺癌。
23.如权利要求19所述的用途，其特征在于，所述癌症为腺癌。
CN201711458257.1A 2017-12-28 2017-12-28 自表达pd-1抗体并靶向间皮素的嵌合抗原受体修饰t细胞及其用途 Active CN109971714B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711458257.1A CN109971714B (zh) 2017-12-28 2017-12-28 自表达pd-1抗体并靶向间皮素的嵌合抗原受体修饰t细胞及其用途
PCT/CN2018/123560 WO2019128998A1 (zh) 2017-12-28 2018-12-25 自表达pd-1抗体并靶向间皮素的嵌合抗原受体修饰t细胞及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711458257.1A CN109971714B (zh) 2017-12-28 2017-12-28 自表达pd-1抗体并靶向间皮素的嵌合抗原受体修饰t细胞及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109971714A CN109971714A (zh) 2019-07-05
CN109971714B true CN109971714B (zh) 2023-06-20

Family

ID=67063176

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711458257.1A Active CN109971714B (zh) 2017-12-28 2017-12-28 自表达pd-1抗体并靶向间皮素的嵌合抗原受体修饰t细胞及其用途

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN109971714B (zh)
WO (1) WO2019128998A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111234032B (zh) * 2019-12-12 2021-07-23 首都医科大学附属北京妇产医院 用于治疗卵巢癌的双靶点嵌合抗原受体及制备方法与应用
CN113943709A (zh) * 2021-09-14 2022-01-18 复旦大学 一种多功能抗hiv-1的car-t细胞及其构建方法和应用
TW202332771A (zh) * 2021-12-21 2023-08-16 大陸商深圳市菲鵬生物治療股份有限公司 轉基因免疫細胞及其構建方法和應用
CN116410332A (zh) * 2021-12-29 2023-07-11 上海细胞治疗集团有限公司 抗间皮素纳米抗体嵌合抗原受体及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105026429A (zh) * 2012-08-21 2015-11-04 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 间皮素结构域-特异性单克隆抗体及其用途

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015090230A1 (en) * 2013-12-19 2015-06-25 Novartis Ag Human mesothelin chimeric antigen receptors and uses thereof
ES2767423T3 (es) * 2014-01-13 2020-06-17 Hope City Receptores de antígenos quiméricos (CARS) con mutaciones en la región del espaciador Fc y métodos para su uso
ES2791953T3 (es) * 2014-06-06 2020-11-06 Us Health Receptores de antígeno quimérico dirigidos a mesotelina y usos de los mismos
EP3322732A2 (en) * 2015-07-13 2018-05-23 Cytomx Therapeutics Inc. Anti-pd-1 antibodies, activatable anti-pd-1 antibodies, and methods of use thereof
PT3328419T (pt) * 2015-07-30 2021-11-26 Macrogenics Inc Moléculas de ligação pd-1 e métodos de utilização
BR112018003339A8 (pt) * 2015-08-21 2022-10-18 Carsgen Therapeutics Ltd Anticorpos antimesotelina completamente humanos e células imunoefetoras que direcionam mesotelina

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105026429A (zh) * 2012-08-21 2015-11-04 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 间皮素结构域-特异性单克隆抗体及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN109971714A (zh) 2019-07-05
WO2019128998A1 (zh) 2019-07-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109306014B (zh) 一种靶向间皮素的嵌合抗原受体修饰t细胞及其用途
CN108018299B (zh) 靶向bcma的嵌合抗原受体及其用途
CN109971712B (zh) 特异性靶向cd19抗原且高水平稳定表达pd-1抗体的car-t细胞及用途
CN109971714B (zh) 自表达pd-1抗体并靶向间皮素的嵌合抗原受体修饰t细胞及其用途
CN109971725B (zh) 抗体修饰的嵌合抗原受体修饰t细胞及其用途
CN108004259B (zh) 靶向b细胞成熟抗原的嵌合抗原受体及其用途
DK1432431T3 (en) Methods and compositions for modulating interleukin-21 activity
JP2021516996A (ja) 生物学的に関連する直交サイトカイン／受容体対
WO2010030002A1 (ja) 外来性ｇｉｔｒリガンド発現細胞
TW201542593A (zh) 能夠結合ｃｄ１２３和ｃｄ３的雙特異性單價雙抗體及其用途
TW201237165A (en) Mutant interleukin-2 polypeptides
CN109971713B (zh) 稳定表达PD-1抗体的Muc1特异性CAR-T细胞及其用途
CN109971716B (zh) 自分泌cd47抗体的egfr特异性car-t细胞及其用途
CN115916225A (zh) 使用表达嵌合抗原受体的病毒特异性免疫细胞治疗和预防同种异体反应性
WO2019129174A1 (zh) 靶向cd19且高水平稳定表达cd40抗体的car-t细胞及其用途
WO2019129124A1 (zh) 包含CD40抗体与muc1特异性嵌合抗原受体基因的T细胞及其用途
JP2021511060A (ja) 腫瘍治療を改善するための、腫瘍微小環境における代謝モジュレーターの発現
CN109971724B (zh) 靶向ErbB受体家族且自表达PD-1抗体的CAR-T细胞及其用途
US20200237874A1 (en) Combination therapy for the treatment of cancer
WO2020034081A1 (en) Bcma-targeting chimeric antigen receptor and uses thereof
CN109971718B (zh) 获得高阳性率car-t细胞的方法
CN109971717B (zh) 共表达cd40抗体与间皮素特异性嵌合抗原受体的t细胞及其用途
KR20190105584A (ko) 암 치료를 위한 병용 요법
WO2019128996A1 (zh) 自表达cd47抗体的间皮素特异性car-t细胞及其用途
WO2019129142A1 (zh) 自分泌CD40抗体且靶向ErbB受体家族的CAR-T细胞及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP03 Change of name, title or address

Address after: No. 1585 Yuanguo Road, Jiading District, Shanghai, 201805

Patentee after: SHANGHAI CELL THERAPY Research Institute

Country or region after: China

Patentee after: Shanghai Cell Therapy Group Co.,Ltd.

Address before: No. 1585 Yuanguo Road, Jiading District, Shanghai, 201805

Patentee before: SHANGHAI CELL THERAPY Research Institute

Country or region before: China

Patentee before: SHANGHAI CELL THERAPY GROUP Co.,Ltd.