BR112016022798B1 - Usos de células que expressam car19, método de produção de células que expressam car19, misturas reacionais, e composições e seus usos - Google Patents

Abstract

TRATAMENTO DE CÂNCER USANDO RECEPTOR DE ANTÍGENO QUIMÉRICO ANTICD19. A invenção fornece composições e métodos para tratamento de doenças associadas à expressão de CD19, por exemplo, administrando uma célula T re-combinante compreendendo o CAR de CD19 como descrito aqui, em combi-nação com um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de cinase descrito aqui. A invenção também fornece kits e composições descritos aqui.

Description

[001] Este Pedido reivindica a prioridade para os pedidos n° de Série US 61/976,396, depositado em 7 de abril de 2014, n° de Série US 62/007,309, depositado em 3 de junho de 2014, n° de Série US 62/036,493, depositado em 12 de agosto de 2014, n° de Série US 62/076,238, depositado em 6 de novembro de 2014, n° de Série US 62/087,888, depositado em 5 de dezembro de 2014, e n° de Série US 62/097,278, depositado em 29 de dezembro de 2014, os teores dos quais são incorporados aqui por referência em suas totalidades.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] O presente pedido contém uma listagem de sequência que foi submetida eletronicamente em formato ASCII e é pelo presente incorporado por referência em sua totalidade. A referida cópia de ASCII, criada em 6 de Abril de 2015, é chamada N2067-7051WO_SL.txt é de 252.236 bytes em tamanho.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A presente invenção se refere geralmente ao uso de células T criadas para expressar um Receptor de Antígeno Quimérico (CAR), por exemplo, em combinação com outro agente tal como, por exemplo, um inibidor de cinase e/ou uma citocina, para tratar uma doença associada com a expressão da Proteína de Cluster de Diferenciação 19 (CD19).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] Muitos pacientes com malignidades de célula B são incuráveis com a terapia padrão. Além disso, opções de tratamento tradicional frequentemente têm sérios efeitos colaterais. Tentativas foram feitas em imunoterapia de câncer, entretanto, diversos obstáculos tornam este objetivo muito difícil de alcançar eficácia clínica. Embora centenas de assim chamados antígenos de tumor tenham sido identificados, estes são geralmente autoderivados e desse modo são fracamente imunogênicos. Além disso, os tumores usam diversos mecanismos para torná-los hostis à iniciação e propagação de ataque imune.

[005] Desenvolvimentos recentes usando terapia de célula T autóloga (CART) modificada por receptor de antígeno quimérico (CAR), que contam com o redirecionamento de células T para molécula de superfície celular adequada em células de câncer tal como malignidades de célula B, apresentam resultados promissores no aproveitamento do poder do sistema imune para tratar as malignidades de célula B e outros cânceres (veja, por exemplo, Sadelain et al., Cancer Discovery 3:388-398 (2013)). Os resultados clínicos do CART19 derivado de murino (isto é, "CTL019") mostraram-se promissores em estabelecer remissões completas em pacientes que sofrem com CLL bem como em ALL infantil (veja, por exemplo, Kalos et al., Sci Transl Med 3:95ra73 (2011), Porter et al., NEJM 365:725-733 (2011), Grupp et al., NEJM 368:1509-1518 (2013)). Além da capacidade do receptor de antígeno quimérico sob as células T geneticamente modificadas reconhecer e destruir as células alvejadas, uma terapia de célula T terapêutica bem sucedida necessita ter a capacidade de proliferar e persistir durante período de tempo, e também monitorar os escapes de célula leucêmica. A qualidade variável de células T, se ela resulta de uma anergia, supressão ou exaustão terá efeitos sobre o desempenho de células T transformadas por CAR, porém para o que os práticos têm controle limitado durante este período de tempo. Para serem eficazes, células T de paciente transformadas por CAR necessitam persistir e manter a capacidade de proliferar-se em resposta ao antígeno de CAR. Mostrou-se que as células T de paciente de ALL que pacientes que executam células T podem fazer isto com CART19 compreendendo um scFv de murino (veja, por exemplo, Grupp et al., NEJM 368:1509-1518 (2013)).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] A invenção caracteriza, pelo menos em parte, composições e métodos de tratamento de distúrbios tal como câncer (por exemplo, cânceres hematológicos ou outras malignidades de célula B) usando células efetoras imunes (por exemplo, células T ou células NK) que expressam uma molécula de Receptor de Antígeno Quimérico (CAR) (por exemplo, um CAR que se liga a um antígeno de célula B, por exemplo, proteína de Cluster de Diferenciação 19 (CD19) (por exemplo, OMIM Acc. No. 107265, Swiss Prot. Acc No. P15391). As composições incluem, e os métodos incluem administrar, células efetoras imunes (por exemplo, células T ou células NK) expressando um CAR alvejando célula B, em combinação com um inibidor de cinase (por exemplo, um ou mais de um inibidor de CDK4/6, um inibidor de BTK, um inibidor de mTOR um inibidor de MNK, um inibidor de Pl3K/mTOR, ou uma combinação dos mesmos). Em algumas modalidades, a combinação mantém, ou tem melhor eficácia clínica, quando comparada a qualquer terapia sozinha. A engenharia também pertence ao uso de células criadas, por exemplo, células efetoras imunes (por exemplo, células T ou células NK), para expressar uma molécula de CAR que se liga a um antígeno de célula B, por exemplo, CD19, em combinação com um inibidor de cinase (por exemplo, um inibidor de cinase escolhidos de um ou mais de um inibidor de cinase dependente de ciclina 4 (CDK4), um inibidor de tirosina cinase de Bruton (BTK), um inibidor de mTOR, um inibidor de cinase de interação de proteína cinase ativada por mitógeno (MNK), um inibidor de fosfatidilinositol 3-cinase (Pl3K)/mTOR dual, ou uma combinação dos mesmos) para tratar um distúrbio associado com a expressão de um antígeno de célula B, por exemplo, CD19 (por exemplo, um câncer, por exemplo, um câncer hematológico).

[007] Consequentemente, em um aspecto, a invenção pertence a um método de tratamento de um indivíduo, por exemplo, um mamífeo tendo uma doença associada com a expressão de um antígeno de célula B, por exemplo, CD19. O método compreende administrar ao mamífero uma quantidade eficaz de uma célula, por exemplo, uma célula efetora imune (por exemplo, uma célula T ou célula NK) que expressa uma molécula de CAR que liga o antígeno de célula B, em combinação com um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de cinase descrito aqui. Em uma modalidade, a molécula de CAR se liga ao CD19, por exemplo, uma molécula de CAR que liga CD19 descrito aqui. Em outras modalidades, a molécula de CAR se liga ao um ou mais de CD20, CD22 ou ROR1.

[008] Em uma modalidade, a doença associada à expressão de antígeno de célula B (por exemplo, expressão de um ou mais de CD19, CD20, CD22 ou ROR1), é selecionada de uma doença proliferativa tal como um câncer, uma malignidade, ou uma condição pré-cancereoso tal como uma mielodisplasia, uma síndrome mielodisplásica ou uma pré- leucemia, ou é uma indicação relacionada a não câncer associada à expressão do antígeno de célula B, por exemplo, um ou mais de CD19, CD20, CD22 ou ROR1. Em uma modalidade, a doença é um tumor sólido ou líquido. Em uma modalidade, o câncer é câncer pancreático. Em uma modalidade, a doença é um câncer hematológico. Em uma modalidade, o câncer hematológico é leucemia. Em uma modalidade, o câncer é selecionado do grupo que consiste em uma ou mais leucemias agudas incluindo, porém não limitadas à leucemia linfoide aguda de célula B (BALL), leucemia linfoide aguda de célula T (TALL), linfoma linfocítico pequeno (SLL), leucemia linfoide aguda (ALL); uma ou mais leucemias crônicas incluindo, porém não limitadas à leucemia mielogenosa crônica (CML), leucemia linfocítica crônica (CLL). Cânceres hematológicos adicionais ou condições hematológicas incluem, porém não estão limitados a linfoma de célula de revestimento (MCL), leucemia pró-linfocítica de célula B, neoplasma de célula dendrítica plasmacitoide blástica, linfoma de Burkitt, linfoma de célula B grande difuso (DLBCL), linfoma folicular, leucemia de célula capilar, linfoma de célula folicular grande ou célula pequena, condições linfoproliferativas malignas, linfoma de MALT, linfoma de zona marginal, mieloma múltiplo, mielodisplasia e síndrome mielodisplásica, linfoma não Hodgkin, linfoma de Hodgkin, linfoma plasmablástico, neoplasma de célula dendrítica plasmacitoide, e macroglobulinemia de Waldenstrom. Em certas modalidades, a doença associada à expressão de antígeno de célula B (por exemplo, um ou mais de CD19, CD20, CD22 ou ROR1) é uma "pré-leucemia"que é uma coleção diversa de condições hematológicas unidas por produção ineficaz (ou displasia) de células sanguíneas mieloides. Em algumas modalidades, a doença associada à expressão de antígeno de célula B (por exemplo, um ou mais de CD19, CD20, CD22 ou ROR1) inclui, porém não estálimitada a cânceres atípicos e/ou não clássicos, malignidades, condições pré- cancerosas ou doenças proliferativas expressando o antígeno de célula B (por exemplo, um ou mais de CD19, CD20, CD22 ou ROR1). Qualquer combinação das doenças associadas com expressão de antígeno de célula B (por exemplo, um ou mais de CD19, CD20, CD22 ou ROR1) descrito aqui pode ser tratada com os métodos e composições descritas aqui.

[009] Em uma modalidade, a doença associada à expressão de antígeno de célula B (por exemplo, um ou mais de CD19, CD20, CD22 ou ROR1) é um linfoma, por exemplo, MCL, linfoma de Hodgkin, ou DLBCL. Em uma modalidade, a doença associada à expressão de antígeno de célula B (por exemplo, um ou mais de CD19, CD20, CD22 ou ROR1) é leucemia, por exemplo, SLL, CLL e/ou ALL. Em uma modalidade, a doença associada à expressão de antígeno de célula B é mieloma múltiplo (por exemplo, um mieloma múltiplo que é CD19 negativo, por exemplo, tendo uma grande maioria (99,95%) das células de plasma neoplásicas com um fenótipo de CD19 negativo, por exemplo, como detectado tanto por citometra de fluxo quanto RT-PCR.

[0010] Em uma modalidade, o inibidor de cinase é um inibidor de CDK4, por exemplo, um inibidor de CDK4 descrito aqui, por exemplo, um inibidor de CD4/6, tal como, por exemplo, 6-acetil-8-ciclopentil-5- metil-2-(5-piperazin-1-il-piridin-2-ilamino)-8H-pirido [2,3-d]pirimidin-7- ona, cloridrato (também referido como palbociclibe ou PD0332991). Em uma modalidade, o inibidor de cinase é um inibidor de BTK, por exemplo, um inibidor de BTK descrito aqui, tal como, por exemplo, ibrutinibe. Em uma modalidade, o inibidor de cinase é um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor de mTOR descrito aqui, tal como, por exemplo, rapamicina, um análogo de rapamicina, OSI-027. O inibidor de mTOR pode ser, por exemplo, um inibidor de mTORC1 e/ou um inibidor de mTORC2, por exemplo, um inibidor de mTORC1 e/ou mTORC2 inhibitor descrito aqui. Em uma modalidade, o inibidor de cinase é um inibidor de MNK, por exemplo um inibidor de MNK descrito aqui, tal como, por exemplo, 4-amino-5-(4-fluoroanilino)-pirazolo [3,4-d] pirimidina. O inibidor de MNK pode ser, por exemplo, inibidor de MNK1a, MNK1b, MNK2a e/ou MNK2b. Em uma modalidade, o nibidor pode ser um inibidor de Pl3K/mTOR, por exemplo, PF-04695102.

[0011] Em uma modalidade, o inibidor de cinase é um inibidor de CDK4 selecionada de aloisina A; flavopiridol ou HMR-1275, 2-(2- clorofenil)-5,7-di-hidróxi-8- [(3S,4R)-3-hidróxi-1-metil-4-piperidinil]-4- cromenona; crizotinibe (PF-02341066); 2-(2-Clorofenil)-5,7-di-hidróxi-8- [(2R,3S)-2-(hidroximetil)-1-metil-3-pirrolidinil]-4H-1-benzopiran-4-ona, cloridrato (P276-00); 1-metil-5- [ [2- [5-(trifluorometil)-1H-imidazol-2-il]-4- piridinil]óxi]-N- [4-(trifluorometil)fenil]-1H-benzimidazol-2-amina (RAF265); indisulam (E7070); roscovitina (CYC202); palbociclibe (PD0332991); dinaciclibe (SCH727965); N- [5- [ [(5-terc-butiloxazol-2- il)metil]tio]tiazol-2-il]piperidina-4-carboxamida (BMS 387032); ácido 4- [ [9-cloro-7-(2,6-difluorofenil)-5H-pirimido [5,4-d] [2]benzazepin-2- il]amino]-benzóico (MLN8054); 5- [3-(4,6-difluoro-1H-benzimidazol-2-il)- 1H-indazol-5-il]-N-etil-4-metil-3-piridinemetanamina (AG-024322); N- (piperidin-4-il)amida de ácido 4-(2,6-diclorobenzoilamino)-1H-pirazol-3- carboxílico (AT7519); 4- [2-metil-1-(1-metiletil)-1H-imidazol-5-il]-N- [4- (metilsulfonil)fenil]- 2-pirimidinamina (AZD5438); XL281 (BMS908662); e ribociclibe.

[0012] Em uma modalidade, o inibidor de cinase é um inibidor de CDK4, por exemplo, palbociclibe (PD0332991), e o palbociclibe é administrado em uma dose de cerca de 50 mg, 60 mg, 70 mg, 75 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 105 mg, 110 mg, 115 mg, 120 mg, 125 mg, 130 mg, 135 mg (por exemplo, 75 mg, 100 mg ou 125 mg) diariamente durante um período de tempo, por exemplo, diariamente durante 14-21 dias de um ciclo de 28 dias, ou diariamente durante 7 a 12 dias de um ciclo de 21 dias. Em uma modalidade, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais ciclos de palbociclibe são administrados.

[0013] Em uma modalidade, o inibidor de cinase é um inibidor de BTK selecionado de ibrutinibe (PCI-32765); GDC-0834; RN-486; CGI- 560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; e LFM-A13. Em uma modalidade preferida, o inibidor de BTK não reduz ou inibe a atividade de cinase de cinase induzível por interleucina 2 (ITK), e é selecionada de GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; e LFM-A13.

[0014] Em uma modalidade, o inibidor de cinase é um inibidor de BTK, por exemplo, ibrutinibe (PCI-32765), e o ibrutinibe é administrado em uma dose de cerca de 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 420 mg, 440 mg, 460 mg, 480 mg, 500 mg, 520 mg, 540 mg, 560 mg, 580 mg, 600 mg (por exemplo, 250 mg, 420 mg ou 560 mg) diariamente durante um período de tempo, por exemplo, diariamente durante um ciclo de 21 dias, ou diariamente durante ciclo de 28 dias. Em uma modalidade, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais ciclos de ibrutinibe são administrados.

[0015] Em uma modalidade, o inibidor de cinase é um inibidor de mTOR selecionado de tensirolimo; ridaforolimo (1R,2R,4S)-4- [(2R)-2 [(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R, 23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)- 1,18-di-hidróxi-19,30-dimetóxi-15,17,21,23, dimetilfosfinato de 29,35- hexametil-2,3,10,14,20-pentaoxo-11,36-dioxa-4- azatriciclo [30.3.1.04,9]hexatriaconta-16,24,26,28-tetraen-12-il]propil]-2- metoxiciclo-hexila, também conhecido como AP23573 e MK8669; everolimo (RAD001); rapamicina (AY22989); semapimod; (5-{2,4- bis [(3S)-3-metilmorfolin-4-il]pirido [2,3-d]pirimidin-7-il}-2- metoxifenil)metanol (AZD8055); 2-amino-8- [trans-4-(2- hidroxietóxi)ciclo-hexil]-6-(6-metóxi-3-piridinil)-4-metil-pirido [2,3- d]pirimidin-7(8H)-ona (PF04691502); e N2- [1,4-dioxo-4- [ [4-(4-oxo-8- fenil-4 H-1-benzopiran-2-il)morfolínio4-il]metóxi]butil]-L-arginilglicil-L-a- aspartilL-serina-, sal interno (SF1126); e XL7 65.

[0016] Em uma modalidade, o inibidor de cinase é um inibidor de mTOR, por exemplo, rapamicina, e a rapamicina é administrada em uma dose de cerca de 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg (por exemplo, 6 mg) diariamente durante um período de tempo, por exemplo, diariamente durante ciclo de 21 dias, ou diariamente durante ciclo de 28 dias. Em uma modalidade, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais ciclos de rapamicina são administrados. Em uma modalidade, o inibidor de cinase é um inibidor de mTOR, por exemplo, everolimo e o everolimo é administrado em uma dose de cerca de 2 mg, 2,5 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg (por exemplo, 10 mg) diariamente durante um período de tempo, por exemplo, diariamente durante ciclo de 28 dias. Em uma modalidade, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais ciclos de everolimo são administrados.

[0017] Em uma modalidade, o inibidor de cinase é um inibidor de MNK selecionada de CGP052088; 4-amino-3-(p-fluorofenilamino)- pirazolo [3,4-d] pirimidina (CGP57380); cercosporamida; ETC-17804452; e 4-amino-5-(4-fluoroanilino)-pirazolo [3,4-d] pirimidina.

[0018] Em uma modalidade, o inibidor de cinase é um fosfatidilnositol 3-cinase dual (PI3K) e inibidor de mTOR selecionado de 2-Amino-8- [trans-4-(2-hidroxietóxi)ciclo-hexil]-6-(6-metóxi-3-piridinil)-4- metil-pirido [2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (PF-04691502); N- [4- [ [4- (Dimetilamino)-1-piperidinil]carbonil]fenil]-N'- [4-(4,6-di-4-morfolinil- 1,3,5-triazin-2-il)fenil]ureia (PF-05212384, PKI-587); 2-Metil-2-{4- [3- metil-2-oxo-8-(quinolin-3-il)-2,3-di-hidro-1H-imidazo [4,5-c]quinolin-1- il]fenil}propanonitrila (BEZ-235); apitolisibe (GDC-0980, RG7422); 2,4- Difluoro-N-{2-(metilóxi)-5- [4-(4-piridazinil)-6-quinolinil]-3- piridinil}benzenosslfonamida (GSK2126458); ácido maleico de 8-(6- metoxipiridin-3-il)-3-metil-1-(4-(piperazin-1-il)-3-(trifluorometil)fenil)-1H- imidazo [4,5-c]quinolin-2(3H)-ona (NVP-BGT226); 3- [4-(4- Morfolinilpirido [3',2':4,5]furo [3,2-d]pirimidin-2-il]fenol (PI-103); 5-(9- isopropil-8-metil-2-morfolino-9H-purin-6-il)pirimidin-2-amina (VS-5584, SB2343); e N- [2- [(3,5-Dimetoxifenil)amino]quinoxalin-3-il]-4- [(4-metil-3- metoxifenil)carbonil]aminofenilsulfonamida (XL765).

[0019] Em uma modalidade, a célula expressa uma molécula de CAR compreendendo um domínio de ligação anti-CD19 (por exemplo, um anticorpo humanizado ou de murino ou fragmento de anticorpo que especificamente se liga a CD19), um domínio de transmembrana, e um domínio de sinalização intracelular (por exemplo, um domínio de sinalização intracelular compreendendo um domínio coestimulatório e/ou um domínio de sinalização primária). Em uma modalidade, o CAR compreende um anticorpo ou fragmento de anticorpo que inclui um domínio de ligação anti-CD19 descrito aqui (por exemplo, um anticorpo humanizado ou de murino ou fragmento de anticorpo que especificamente se liga a CD19 como descrito aqui), um domínio de transmembrana descrito aqui, e um domínio de sinalização intracelular descrito aqui (por exemplo, um domínio de sinalização intracelular compreendendo um domínio coestimulatório e/ou um domínio de sinalização primária descrito aqui).

[0020] Em uma modalidade, a molécula de CAR é capaz de ligar CD19 (por exemplo, CD19 humano mutante do tipo selvagem). Em uma modalidade, a molécula de CAR compreende um domínio de ligação anti-CD19 compreendendo uma ou mais (por exemplo, todas as três) região determinante complementar de cadeia leve 1 (CDR1 de LC), região determinante complementar de cadeia leve 2 (CDR2 de LC), e região determinante complementar de cadeia leve 3 (CDR3 de LC) de um domínio de ligação anti-CD19 descrito aqui, e uma ou mais (por exemplo, todas as três) região determinante complementar de cadeia pesada 1 (CDR1 de HC), região determinante complementar de cadeia pesada 2 (CDR2 de HC), e região determinante complementar de cadeia pesada 3 (CDR3 de HC) de um domínio de ligação anti-CD19 descrito aqui, por exemplo, um domínio de ligação anti-CD19 compreendendo um ou mais, por exemplo, todos os três, CDRs de LC e um ou mais, por exemplo, todos os três, CDRs de HC. Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 compreende uma ou mais (por exemplo, todas as três) região determinante complementar de cadeia pesada 1 (CDR1 de HC), região determinante complementar de cadeia pesada 2 (CDR2 de HC), e região determinante complementar de cadeia pesada 3 (CDR3 de HC) de um domínio de ligação anti-CD19 descrito aqui, por exemplo, o domínio de ligação anti-CD19 tem duas regiões de cadeia pesada variáveis, cada compreendendo um CDR1 de HC, um CDR2 de HC e um CDR3 de HC descrito aqui. Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 compreende uma região variável de cadeia leve descrito aqui (por exemplo, na tabela 7) e/ou uma região variável de cadeia pesada de murino descrita aqui (por exemplo, na tabela 7). Em uma modalidade, o domínio de ligação anti- CD19 é um scFv compreendendo uma cadeia leve de murino e uma cadeia pesada de murino de uma sequência de aminoácido de tabela 7. Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 (por exemplo, um scFv) compreende: uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos uma, duas ou três modificações (por exemplo, substituições), porém não mais do que 30, 20 ou 10 modificações (por exemplo, substituições) de uma sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia leve fornecida na tabela 7, ou uma sequência com 95-99% de identidade com uma sequência de aminoácido de tabela 7; e/ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos uma, duas, ou três modificações (por exemplo, substituições), porém não mais do que 30, 20 ou 10 modificações (por exemplo, substituições) de uma sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia pesada fornecida na tabela 7, ou uma sequência com 95-99% de identidade a uma sequência de aminoácido de tabela 7. Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 compreende uma sequência de SEQ ID NO:59, ou uma sequência com 95-99% de identidade da mesma. Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 é um scFv, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita aqui, por exemplo, na tabela 7, é ligada a uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita aqui, por exemplo, na tabela 7, por meio de um ligante, por exemplo, um ligante descrito aqui. Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 inclui um ligante de (Gly4-Ser)n, em que n é 1, 2, 3, 4, 5, ou 6, preferivemente 3 ou 4 (SEQ ID NO: 53). A região variável de cadeia leve e região variável de cadeia pesada de um scFv pode ser, por exemplo, em qualquer uma das seguintes orientações: região variável de cadeia pesada de ligante de região variável de cadeia leve ou região variável de cadeia leve de ligante de região variável de cadeia pesada.

[0021] Em uma modalidade, a molécula de CAR compreende um domínio de ligação anti-CD19 humanizado que inclui uma ou mais (por exemplo, todas as três) região determinante complementar de cadeia leve 1 (CDR1 de LC), região determinante complementar de cadeia leve 2 (CDR2 de LC), e região determinante complementar de cadeia leve 3 (CDR3 de LC) de um domínio de ligação anti-CD19 humanizado descrito aqui, e uma ou mais (por exemplo, todas as três) região determinante complementar de cadeia pesada 1 (CDR1 de HC), região determinante complementar de cadeia pesada 2 (CDR2 de HC), e região determinante complementar de cadeia pesada 3 (CDR3 de HC) de um domínio de ligação anti-CD19 humanizado descrito aqui, por exemplo, um domínio de ligação anti-CD19 humanizado compreendendo um ou mais, por exemplo, todos os três, CDRs de LC e um ou mais, por exemplo, todos os três, CDRs de HC. Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 humanizado compreende pelo menos CDR2 de HC. Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 humanizado compreende uma ou mais (por exemplo, todas as três) região determinante complementar de cadeia pesada 1 (CDR1 de HC), região determinante complementar de cadeia pesada 2 (CDR2 de HC), e região determinante complementar de cadeia pesada 3 (CDR3 de HC) de um domínio de ligação anti-CD19 humanizado descrito aqui, por exemplo, o domínio de ligação anti-CD19 humanizado tem duas regiões de cadeia pesada variáveis, cada compreendendo um CDR1 de HC, um CDR2 de HC e um CDR3 de HC descrito aqui. Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 humanizado compreende pelo menos CDR2 de HC. Em uma modalidade, a região variável de cadeia leve compreende uma, duas, três ou todas as quatro regiões de estrutura de sequência germinativa de VK3_L25. Em uma modalidade, a região variável de cadeia leve tem uma modificação (por exemplo, substituição, por exemplo, uma substituição de uma ou mais aminoácidos encontrados na posição correspondente na região variável de cadeia variável de SEQ ID NO: 58, por exemplo, uma substituição em uma ou mais de posições 71 e 87). Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada compreende uma, duas, três ou todas as quatro regiões de estrutura de sequência germinativa de VH4_4-59. Em uma modalidade, a região variável de cadeia pesada tem uma modificação (por exemplo, substituição, por exemplo, uma substituição de um ou mais aminoácidos encontrados na posição correspondente na região variável de cadeia pesada de murino de SEQ ID NO: 58, por exemplo, uma substituição em uma ou mais de posições 71, 73 e 78). Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 humanizado compreende uma região variável de cadeia leve descrito aqui (por exemplo, na tabela 3) e/ou uma região variável de cadeia leve descrita aqui (por exemplo, na tabela 3). Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 humanizado é um scFv compreendendo uma cadeia leve e uma cadeia pesada de uma sequência de aminoácido de tabela 3. Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 humanizado (por exemplo, um scFv) compreende: uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos uma, duas ou três modificações (por exemplo, substituições), porém não mais do que 30, 20 ou 10 modificações (por exemplo, substituições) de uma sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia leve fornecida na tabela 3, ou uma sequência com 95-99% de identidade com uma sequência de aminoácido de tabela 3; e/ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos uma, duas, ou três modificações (por exemplo, substituições), porém não mais do que 30, 20 ou 10 modificações (por exemplo, substituições) de uma sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia pesada fornecida na tabela 3, ou uma sequência com 95-99% de identidade a uma sequência de aminoácido de tabela 3. Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 humanizado compreende uma sequência selecionada de um grupo que consiste em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:12, ou uma sequência com 95-99% de identidade da mesma. Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 humanizado é um scFv, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita aqui, por exemplo, na tabela 3, é ligada a uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita aqui, por exemplo, na tabela 3, por meio de um ligante, por exemplo, um ligante descrito aqui. Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 humanizado inclui um ligante de (Gly4-Ser)n, em que n é 1, 2, 3, 4, 5, ou 6, preferivemente 3 ou 4 (SEQ ID NO: 53). A região variável de cadeia leve e região variável de cadeia pesada de um scFv pode ser, por exemplo, em qualquer uma das seguintes orientações: região variável de cadeia pesada de ligante de região variável de cadeia leve ou região variável de cadeia leve de ligante de região variável de cadeia pesada.

[0022] Em uma modalidade, a molécula de CAR compreende um domínio de transmembrana de uma proteína selecionada do grupo que consiste na cadeia alfa, beta ou zeta do receptor de célula T, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 e CD154. Em uma modalidade, o domínio de transmembrana compreende uma sequência de SEQ ID NO: 15. Em uma modalidade, o domínio de transmembrana compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos uma, duas ou três modificações (por exemplo, substituições), porém não mais do que 20, 10 ou 5 modificações (por exemplo, substituições) de uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15, ou uma sequência com 95-99% de identidade a uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15.

[0023] Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 é conectado ao domínio de transmembrana por uma região de articulação, por exemplo, uma região de articulação descrita aqui. Em uma modalidade, a região de articulação codificada compreende SEQ ID NO:14 ou SEQ ID NO:45, ou uma sequência com 95-99% de identidade da mesma.

[0024] Em uma modalidade, a molécula de CAR também compreende uma sequência codificando um domínio coestimulatório, por exemplo, um domínio coestimulatório descrito aqui. Em uma modalidade, o domínio coestimulatório compreende um domínio de sinalização funcional de uma proteína selecionada do grupo que consiste em OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18) e 4-1BB (CD137). Em uma modalidade, o domínio coestimulatório compreende uma sequência de SEQ ID NO: 16. Em uma modalidade, o domínio coestimulatório compreende uma sequência de SEQ ID NO:51. Em uma modalidade, o domínio coestimulatório compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos uma, duas ou três modificações (por exemplo, substituições), porém não mais do que 20, 10 ou 5 modificações (por exemplo, substituições) de uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO:51, ou uma sequência com 95-99% de identidade a uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO:51.

[0025] Em uma modalidade, a molécula de CAR também compreende uma sequência codificando um domínio de sinalização intracelular, por exemplo, um domínio de sinalização intracelular descrito aqui. Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização funcional de 4-1BB e/ou um domínio de sinalização funcional de CD3 zeta. Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular compreende a sequência de SEQ ID NO: 16 e/ou a sequência de SEQ ID NO:17. Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular compreende a sequência de SEQ ID NO:16 e/ou a sequência de SEQ ID NO:43. Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização funcional de CD27 e/ou um domínio de sinalização funcional de CD3 zeta. Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular compreende a sequência de SEQ ID NO: 51 e/ou a sequência de SEQ ID NO:17. Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular compreende a sequência de SEQ ID NO:51 e/ou a sequência de SEQ ID NO:43. Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos uma, duas ou três modificações (por exemplo, substituições), porém não mais do que 20, 10 ou 5 modificações (por exemplo, substituições) de uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:16 ou SEQ ID NO:51 e/ou uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:17 ou SEQ ID NO:43, ou uma sequência com 95-99% de identidade a uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:16 ou SEQ ID NO:51 e/ou uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:17 ou SEQ ID NO:43. Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular compreende a sequência de SEQ ID NO:16 ou SEQ ID NO:51 e a sequência de SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO:43, em que as consequências compreendendo o domínio de sinalização intracelular são expressas na mesma estrutura e como uma cadeia de polipeptídeo simples.

[0026] Em uma modalidade, a molécula de CAR também compreende uma sequência líder, por exemplo, uma sequência líder descrito aqui. Em uma modalidade, a sequência líder compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13, ou uma sequência com 95-99% de identidade a uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:13.

[0027] Em uma modalidade, a molécula de CAR compreende uma sequência líder, por exemplo, uma sequência líder descrito aqui, por exemplo, uma sequência líder de SEQ ID NO: 13, ou tendo 95-99% de identidade da mesma; um domínio de ligação anti-CD19 descrito aqui, por exemplo, um domínio de ligação anti-CD19 compreendendo um CDR1 de LC, um CDR2 de LC, um CDR3 de LC, um CDR1 de HC, um CDR2 de HC e um CDR3 de HC descrito aqui, por exemplo, um domínio de ligação anti-CD19 de murino descrito na tabela 7, um domínio de ligação anti-CD19 humanizado descrito na tabela 3, ou uma sequência com 95-99% de identidade da mesma; uma região de articulação, por exemplo, uma região de articulação descrita aqui, por exemplo, uma região de articulação de SEQ ID NO:14 ou tendo 95-99% de identidade da mesma; um domínio de transmembrana, por exemplo, um domínio de transmembrana descrito aqui, por exemplo, um domínio de transmembrana tendo uma sequência de SEQ ID NO:15 ou uma sequência tendo 95-99% de identidade da mesma; um domínio de sinalização intracelular, por exemplo, um domínio de sinalização intracelular descrito aqui (por exemplo, um domínio de sinalização intracelular compreendendo um domínio coestimulatório e/ou um domínio de sinalização primária). Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio coestimulatório, por exemplo, um domínio coestimulatório descrito aqui, por exemplo, um domínio coestimulatório de 4-1BB tendo uma sequência de SEQ ID NO:16 ou SEQ ID NO:51, ou tendo 95-99% da identidade da mesma, e/ou um domínio de sinalização primária, por exemplo, um domínio de sinalização primária descrito aqui, por exemplo, um domínio estimulatório de CD3 zeta tendo uma sequência de SEQ ID NO:17 ou SEQ ID NO:43, ou tendo 95-99% de identidade da mesma.

[0028] Em uma modalidade, a molécula de CAR compreende (por exemplo, que consiste em) uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41 ou SEQ ID NO:42, ou uma sequência de aminoácido tendo pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco, 10, 15, 20 ou 30 modificações (por exemplo, substituições), porém não mais do que 60, 50 ou 40 modificações (por exemplo, substituições) de uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41 ou SEQ ID NO:42, ou uma sequência de aminoácido tendo 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade a uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41 ou SEQ ID NO:42.

[0029] Em uma modalidade, a célula expressando a molécula de CAR compreende um vetor que inclui uma sequência de ácido nucleico codificando a molécula de CAR. Em uma modalidade, o vetor é selecionado do grupo que consiste em um DNA, um RNA, um plasmídeo, um vetor de lentivírus, vetor adenoviral, ou um vetor de retrovírus. Em uma modalidade, o vetor é um vetor de lentivírus. Em uma modalidade, o vetor também compreende um promotor. Em uma modalidade, o promotor é um promotor de EF-1. Em uma modalidade, o promotor de EF-1 compreende uma sequência de SEQ ID NO: 100. Em uma modalidade, o vetor é um vetor transcrito in vitro, por exemplo, um vetor que transcreve RNA de uma molécula de ácido nucleico descrito aqui. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico no vetor in vitrotambém compreende uma cauda de poli(A), por exemplo, uma cauda de poli A descrita aqui, por exemplo, compreendendo cerca de 150 bases de adenosina (SEQ ID NO:104). Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico no vetor in vitrotambém compreende uma 3’UTR, por exemplo, uma 3’ UTR descrito aqui, por exemplo, compreendendo pelo menos uma repetição de uma 3’UTR derivada de beta-globulina humana. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico no vetor in vitro também compreende promotor, por exemplo, um promotor de T2A.

[0030] Em certas modalidades das composições e métodos descritos aqui, a célula expressando a molécula de CAR (também referida aqui como uma "célula expressando CAR") é uma célula ou população de células como descrito aqui, por exemplo, uma célula efetora imune humana ou população de células (por exemplo, uma célula T humana ou uma célula NK humana, por exemplo, uma célula T humana descrita aqui ou uma célula NK humana descrito aqui). Em uma modalidade, uma célula T humana é uma célula T de CD8+. Em uma modalidade, a célula é uma célula T autóloga. Em uma modalidade, a célula é uma célula T alostérica. Em uma modalidade, a célula é uma célula T e a célula T é deficiente de diaglicerol cinase (DGK). Em uma modalidade, a célula é uma célula T e a célula T é deficiente de Ikaros. Em uma modalidade, a célula é uma célula T e a célula T é deficiente tanto de DGK quanto Ikaros. Deve-se entender que as composições e métodos descritos aqui recitando o termo "célula"abrangem composições e métodos compreendendo uma ou mais células, por exemplo, uma população de células.

[0031] Em outra modalidade, a célula expressando a molécula de CAR, por exemplo, como descrito aqui, pode também expressar outro agente, por exemplo, um agente que realça a atividade de uma célula expressando CAR.

[0032] Em uma modalidade, o método também inclui administrar uma célula expressando a molécula de CAR, como descrito aqui, opcionalmente em combinação com um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe, em combinação com um agente que realça a atividade de uma célula expressando CAR. Em certas modalidades, o agente é uma citocina, por exemplo, IL-7, IL-15, IL-21, ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o método inclui administrar IL-7 ao indivíduo. A citocina pode ser liberada em combinação com, por exemplo, simultaneamente ou imediatamente após, administração da célula expressando CAR. Alternativamente, a citocina pode ser liberada após um período prolongado de tempo após administração da célula expressando CAR, por exemplo, após a avaliação da resposta do indivíduo à célula expressando CAR.

[0033] Em outras modalidades, o agente que realça a atividade de uma célula expressando CAR pode ser um agente que inibe uma molécula inibitória imune. Exemplos de moléculas inibitórias imunes incluem PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por exemplo, CEACAM- 1, CEACAM-3 e/ou CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 e TGFR beta. Em uma modalidade, o agente que inibe uma molécula inibitória imune compreende um primeiro polipeptídeo, por exemplo, uma molécula inibitória imune, associado com um segundo polipeptídeo que fornece um sinal positivo à célula, por exemplo, um domínio de sinalização intracelular descrito aqui. Em uma modalidade, o agente compreende um primeiro polipeptídeo, por exemplo, de uma molécula inibitória tal como PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por exemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 e/ou CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 ou TGFR beta, ou um fragmento de qualquer um destes (por exemplo, pelo menos uma porção do domínio extracelular de qualquer um destes), e um segundo polipeptídeo que é um domínio de sinalização intracelular descrito aqui (por exemplo, compreendendo um domínio coestimulatório (por exemplo, 41BB, CD27 ou CD28, por exemplo, como descrito aqui) e/ou um domínio de sinalização primária (por exemplo, um domínio de sinalização de CD3 zeta descrito aqui). Em uma modalidade, o agente compreende um primeiro polipeptídeo de PD1 ou um fragmento do mesmo (por exemplo, pelo menos uma porção do domínio extracelular de PD1), e um segundo polipeptídeo de um domínio de sinalização intracelular descrito aqui (por exemplo, um domínio de sinalização de CD28 descrito aqui e/ou um domínio de sinalização de CD3 zeta descrito aqui).

[0034] Em uma modalidade, infusão de linfócito, por exemplo, infusão de linfócito alogênico, é usada no tratamento do câncer, em que a infusão de linfócito compreende pelo menos uma célula expressando CAR que liga se liga um antígeno de célula B (por exemplo, CD19) (também referida aqui como célula expressando CAr de CD19), como descrito aqui. Em uma modalidade, infusão de linfócito autólogo é usada no tratamento do câncer, em que a infusão de linfócito autólogo compreende pelo menos uma célula expressando CD19.

[0035] Em uma modalidade, a célula expressando CAR de CD19, por exemplo, célula T, é administrada a um indivíduo que tem recebido um prévio transplante de célula-tronco, por exemplo, transplante de célula-tronco autólogo.

[0036] Em uma modalidade, a célula expressando CAR de CD19, por exemplo, célula T, é administrada a um indivíduo que tem recebido uma dose prévia de melfalano.

[0037] Em uma modalidade, a célula expressando a molécula de CAR, por exemplo, uma molécula de CAR descrito aqui, é administrada em combinação com um agente que melhora um ou mais efeitos colaterais associados com administração de uma célula expressando uma molécula de CAR, por exemplo, um agente descrito aqui.

[0038] Em uma modalidade, o inibidor de cinase, é administrado em combinação com um agente que melhora um ou mais efeitos colaterais associados com administração do inibidor de cinase, por exemplo, um agente descrito aqui.

[0039] Em uma modalidade, a célula expressando a molécula de CAR, por exemplo, uma molécula de CAR descrito aqui, e o inibidor de cinase são administrados em combinação com um agente adicional que trata a doença associada com CD19, por exemplo, um agente adicional descrito aqui.

[0040] Em uma modalidade, as células expressando uma molécula de CAR, por exemplo, uma molécula de CAR descrito aqui, são administradas em uma dose e/ou planejamento de dosagem descrito aqui.

[0041] Em uma modalidade, a molécula de CAR é introduzida em células T, por exemplo, usando transcrição in vitro, e o indivíduo (por exemplo, humano) recebe uma administração inicial de células compreendendo uma molécula de CAR, e uma ou mais administrações subsequentes de células compreendendo uma molécula de CAR, em que uma ou mais administrações subsequentes são administradas menos do que 15 dias, por exemplo, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, ou 2 dias após a prévia administração. Em uma modalidade, mais do que uma administração de células compreendendo uma molécula de CAR são administradas ao indivíduo (por exemplo, humano) por semana, por exemplo, 2, 3, ou 4 administrações de células compreendendo uma molécula de CAR são administradas por semana. Em uma modalidade, o indivíduo (por exemplo, indivíduo humano) recebe mais do que uma administração de células compreendendo uma molécula de CAR por semana (por exemplo, 2, 3 ou 4 administrações por semana) (também referida aqui como um ciclo), seguida por uma semana sem nenhuma administração de células compreendendo uma molécula de CAR, e em seguida uma ou mais administrações adicionais de células compreendendo uma molécula de CAR (por exemplo, mais do que uma administração das células compreendendo uma molécula de CAR por semana) é administrada ao indivíduo. Em outra modalidade, o indivíduo (por exemplo, indivíduo humano) recebe mais do que um ciclo de células compreendendo uma molécula de CAR, e o tempo entre cada ciclo é menor do que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, ou 3 dias. Em uma modalidade, as células compreendendo uma molécula de CAR são administrados em dias alternados durante 3 administrações por semana. Em uma modalidade, as células compreendendo uma molécula de CAR são administradas durante pelo menos duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais semanas.

[0042] Em uma modalidade, a combinação do inibidor de cinase e as células expressando uma molécula de CAR, por exemplo, uma molécula de CAR descrito aqui, é administrada como um tratamento de primeira linha para a doença, por exemplo, o câncer, por exemplo, o câncer descrito aqui. Em outra modalidade, a combinação do inibidor de cinase e as células expressando uma molécula de CAR, por exemplo, uma molécula de CAR descrito aqui, é administrada como um tratamento de segunda, terceira, quarta linha para a doença, por exemplo, o câncer, por exemplo, o câncer descrito aqui.

[0043] Em uma modalidade, uma célula (por exemplo, uma população de células) descrita aqui é administrada ao indivíduo.

[0044] Em uma modalidade, o método inclui administrar uma população de células, uma pluralidade das quais compreende uma molécula de CAR descrito aqui. Em algumas modalidades, as populações de célula expressando CAR compreende uma mistura de células expressando diferentes CARs. Por exemplo, em uma modalidade, as populações de célula expressando CAR pode incluir uma primeira célula expressando um CAR tendo um domínio de ligação anti-CD19 descrito aqui, e uma segunda célula expressando um CAR tendo um domínio de ligação de CD19 diferente, por exemplo, um domínio de ligação anti-CD19 descrito aqui que difere do domínio de ligação anti-CD19 no CAR expresso pela primeira célula. Como outro exemplo, as populações de célula expressando CAR pode incluir uma primeira célula expressando um CAR que inclui um domínio de ligação anti-CD19, por exemplo, como descrito aqui, e uma segunda célula expressando um CAR que inclui um domínio de ligação de antígeno a um alvo diferente de CD19 (por exemplo, CD123 ou mesotelina). Em uma modalidade, as populações de célula expressando CAR inclui, por exemplo, uma primeira célula expressando um CAR que inclui um domínio de sinalização intracelular primário, e uma segunda célula expressando um CAR que inclui um domínio de sinalização secundário.

[0045] Em uma modalidade, o método inclui administrar umas populações de célula em que pelo menos uma célula na população expressa um CAR tendo um domínio anti-CD19 descrito aqui, e um agente que realça a atividade de uma célula expressando CAR, por exemplo, uma segunda célula expressando o agente que realça a atividade de uma célula expressando CAR. Por exemplo, em uma modalidade, o agente pode ser um agente que inibe uma molécula inibitória imune. Exemplos de moléculas inibitórias imunes incluem PD1, PD-L1, CTLA-4, TIM3, CEACAM (por exemplo, CEACAM-1, CEACAM- 3 e/ou CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 e TGFR beta. Em uma modalidade, o agente que inibe uma molécula inibitória imune compreende um primeiro polipeptídeo, por exemplo, uma molécula inibitória, associado com um segundo polipeptídeo que fornece um sinal positivo à célula, por exemplo, um domínio de sinalização intracelular descrito aqui. Em uma modalidade, o agente compreende um primeiro polipeptídeo, por exemplo, de uma molécula inibitória tal como PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por exemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 e/ou CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 ou TGFR beta, ou um fragmento de qualquer um destes (por exemplo, pelo menos uma porção de um domínio extracelular de qualquer um destes), e um segundo polipeptídeo que é um domínio de sinalização intracelular descrito aqui (por exemplo, compreendendo um domínio coestimulatório (por exemplo, 41BB, CD27 ou CD28, por exemplo, como descrito aqui) e/ou um domínio de sinalização primária (por exemplo, um domínio de sinalização de CD3 zeta descrito aqui). Em uma modalidade, o agente compreende um primeiro polipeptídeo de PD1 ou um fragmento do mesmo (por exemplo, pelo menos uma porção do domínio extracelular de PD1), e um segundo polipeptídeo de um domínio de sinalização intracelular descrito aqui (por exemplo, um domínio de sinalização de CD28 descrito aqui e/ou um domínio de sinalização de CD3 zeta descrito aqui).

[0046] Em outro aspecto, a invenção pertence a uma célula expressando uma molécula de CAR descrito aqui para uso como um medicamento em combinação com um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de cinase descrito aqui (por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe). Em outro aspecto, a invenção pertence a um inibidor de cinase descrito aqui (por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe) para uso como um medicamento em combinação com uma célula expressando uma molécula de CAR descrito aqui.

[0047] Em outro aspecto, a invenção pertence a uma célula expressando uma molécula de CAR descrito aqui para uso em combinação com um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de cinase descrito aqui (por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe), no tratamento de uma doença expressando o antígeno de célula B (por exemplo, CD19). Em outro aspecto, a invenção pertence a um inibidor de cinase descrito aqui (por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe), para uso em combinação com uma célula expressando uma molécula de CAR descrito aqui, no tratamento de uma doença expressando o antígeno de célula B (por exemplo, CD19). Uma doença pode ser, por exemplo, um câncer tal como um câncer hematológico. O câncer pode ser, por exemplo, um linfoma, CLL, MCL, ALL, DLBCL, mieloma múltiplo, ou outro câncer descrito aqui.

[0048] Em outro aspecto, a invenção pertence a uma célula expressando uma molécula de CAR descrito aqui para uso como um medicamento em combinação com uma citocina, por exemplo, IL-7, IL- 15 e/ou IL-21 como descrito aqui. Em outro aspecto, a invenção pertence a uma citocina descrito aqui para uso como um medicamento em combinação com uma célula expressando uma molécula de CAR descrito aqui.

[0049] Em outro aspecto, a invenção pertence a uma célula expressando uma molécula de CAR descrito aqui para uso em combinação com uma citocina, por exemplo, IL-7, IL-15 e/ou IL-21 como descrito aqui, no tratamento de uma doença expressando CD19. Em outro aspecto, a invenção pertence a uma citocina descrita aqui para uso em combinação com uma célula expressando uma molécula de CAR descrito aqui, no tratamento de uma doença expressando CD19.

[0050] Em outro aspecto, a invenção pertence a um método de tratamento de mamífero tendo linfoma de Hodgkin, compreendendo administrar ao mamífero uma quantidade eficaz da célula (por exemplo, células) expressando uma molécula de CAR, por exemplo, uma molécula de CAR descrito aqui.

[0051] Em uma modalidade, a célula expressando uma molécula de CAR, por exemplo, uma molécula de CAR descrito aqui, é administrada em combinação com um agente que aumenta a eficácia de uma célula expressando uma molécula de CAR, por exemplo, um agente descrito aqui.

[0052] Em uma modalidade, a célula expressando uma molécula de CAR, por exemplo, uma molécula de CAR descrita aqui, é administrada em combinação com um agente que melhora uma ou mais efeitos colaterais associados com administração de uma célula expressando uma molécula de CAR, por exemplo, um agente descrito aqui.

[0053] Em uma modalidade, a célula expressando uma molécula de CAR, por exemplo, uma molécula de CAR descrito aqui, é administrada em combinação com um agente que trata linfoma de Hodgkin, por exemplo, um agente descrito aqui.

[0054] Em uma modalidade, a célula expressando uma molécula de CAR, por exemplo, uma molécula de CAR descrito aqui, é administrada em combinação com uma baixa dose de reforço imune de um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor de mTOR descrito aqui. Embora não desejando estar ligado à teoria, acredita-se que o tratamento com uma baixa dose de reforço imune (por exemplo, uma dose que é insuficiente para suprimir completamente o sistema imune, porém suficiente para melhorar a função) é acompanhada por um decréscimo em células T de PD-1 positivo ou um aumento em células de PD-1 negativo. Células T de PD-1 positivo, porém não células T de PD-1 negativo, podem ser esgotadas por envolvimento com células que expressam um ligante de PD-1, por exemplo, PD-L1 ou PD-L2.

[0055] Em uma modalidade, este método pode ser usado para otimizar o desempenho de uma célula CAR descrita aqui no indivíduo. Embora não desejando estar ligado à teoria, acredita-se que, em uma modalidade, o desempenho de células efetoras imunes não modificadas, endógenas, por exemplo, células T, é melhorado. Embora não desejando estar ligado à teoria, acredita-se que, em uma modalidade, o desempenho de uma célula expressando CAR de CD19 é melhorado. Em outras modalidades, células, por exemplo, células T, que têm ou serão criadas para expressar um CAR, podem ser tratadas ex vivo por contato com uma quantidade de um inibidor de mTOR que aumenta o número de células efetoras imunes de PD1 negativo, por exemplo, células T ou aumenta a relação de células efetoras imunes de PD1 negativo, por exemplo, células T/células efetoras imunes de PD1 positivo, por exemplo, células T.

[0056] Em uma modalidade, administração de uma baixa dose de reforço imune de um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor alostérico, por exemplo, RAD001, ou um inibidor catalítico, é iniciada antes da administração de uma célula expressando CAR descrita aqui, por exemplo, células T. Em uma modalidade, o inibidor de mTOR é RAD001 ou rapamicina. Em uma modalidade, as células CAR são administradas após um período de tempo suficiente, ou dosagem suficiente, de um inibidor de mTOR, de modo que o nível de células efetoras imunes de PD1 negativo, por exemplo, células T, ou a relação de células efetoras imunes de PD1 negativo, por exemplo, células T/ Células efetoras imunes de PD1 positivo, por exemplo, células T, tenha sido, pelo menos transitoriamente, aumentado.

[0057] Em uma modalidade, a célula, por exemplo, uma célula efetora imune (por exemplo, uma célula T ou célula NK), a ser criada para expressar um CAR, é colhida após um período de tempo suficiente, ou após dosagem suficiente da baixa dose de reforço imune de um inibidor de mTOR, de modo que o nível de células efetoras imunes de PD1 negativo, por exemplo, células T, ou a relação de células efetoras imunes de PD1 negativo, por exemplo, células T/células efetoras imunes de PD1 positivo, por exemplo, células T, no indivíduo ou colhidas do indivíduo, tenha sido, pelo menos transitoriamente, aumentado.

[0058] Em modalidades, qualquer um dos métodos descritos aqui também compreende realizar linfodepleção em um indivíduo, por exemplo, antes da administração de uma ou mais células que expressam uma molécula de CAR descrita aqui, por exemplo, uma molécula de CAR que liga CD19. A linfodepleção pode compreender, por exemplo, administrar um ou mais de melfalano, citoxano, ciclofosfamida, e fludarabina.

[0059] Em algumas modalidades, a célula expressando CAR que é administrada compreende um CAR regulável (RCAR), por exemplo, um RCAR como descrito aqui. O RCAR pode compreender, por exemplo, um membro de sinalização intracelular compreendendo um domínio de sinalização intracelular e um primeiro domínio comutador, um membro de ligação de antígeno compreendendo um domínio de ligação de antígeno que liga CD19 e um segundo domínio comutador; e um domínio de transmembrana. O método pode também compreender administrar uma molécula de dimerização, por exemplo, em uma quantidade suficiente para causar dimerização dos primeiros e segundos domínios de permutação.

[0060] Em algumas modalidades, a célula expressando CAR e o inibidor de cinase são administrados simultaneamente ou simultaneamente de forma substancial, por exemplo, como uma primeira linha de terapia. Em algumas modalidades, o método compreende administrar uma combinação do inibidor de BTK (por exemplo, ibrutinibe) e a célula expressando CAR (por exemplo, uma célula expressando CAR19) ao indivíduo, como uma terapia de primeira linha.

[0061] Em outras modalidades, a célula expressando CAR e o inibidor de cinase são administrados sequencialmente. Por exemplo, o inibidor de cinase é administrado antes da célula expressando CAR, ou a célula expressando CAR é administrada antes do inibidor de cinase.

[0062] Em algumas modalidades, a doença associada à expressão de CD19 é um câncer hematológico (por exemplo, um câncer hematológico descrito aqui tal como CLL, MCL, ou ALL) e o indivíduo é, ou é identificado como, um responsivo parcial, não responsivo, ou reincidente a uma ou mais terapias quanto ao câncer hematológico, por exemplo, a um inibidor de BTK tal como ibrutinibe. Em algumas modalidades, o indivíduo tem, ou é identificado como tendo, uma mutação de BTK. A mutação pode ser, por exemplo, uma mutação de ponto, uma inserção, ou uma deleção. A mutação pode ser, por exemplo, uma mutação no sítio de ligação para o inibidor de BTK, por exemplo, em ou próxima à bolsa de ligação de ATP. A mutação pode conferir uma resposta diminuída (por exemplo, resistência) ao inibidor de BTK.

[0063] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos descritos aqui, o método compreende administrar o inibidor de BTK (por exemplo, ibrutinibe) ao indivíduo, reduzindo a quantidade (por exemplo, administração de cessação) do inibidor de BTK, e subsequentemente administrando a célula expressando CAR (por exemplo, uma célula expressando CAR19) ao indivíduo.

[0064] Em algumas modalidades, o método compreende administrar o inibidor de BTK (por exemplo, ibrutinibe) ao indivíduo e subsequentemente administrando uma combinação do inibidor de BTK e a célula expressando CAR (por exemplo, uma célula expressando CAR19) ao indivíduo.

[0065] Em algumas modalidades, o método compreende administrar o inibidor de BTK (por exemplo, ibrutinibe) ao indivíduo, reduzindo a quantidade (por exemplo, administração de cessação ou descontinuidade) do inibidor de BTK, e subsequentemente administrando uma combinação da célula expressando CAR (por exemplo, uma célula expressando CAR19) e um segundo inibidor de BTK (por exemplo, um inibidor de BTK diferente do primeiro inibidor de BTK, por exemplo, diferente de ibrutinibe) ao indivíduo. Em algumas modalidades, o segundo inibidor de BTK é escolhido de um ou mais de GDC-0834, RN-486, CGI-560, CGI-1764, HM-71224, CC-292, ONO- 4059, CNX-774, ou LFM-A13, ou uma combinação dos mesmos.

[0066] Em algumas modalidades, a doença associada à expressão de antígeno de célula B (por exemplo, CD19) é um câncer hematológico (por exemplo, um câncer hematológico descrito aqui, por exemplo, CLL, MCL, ou ALL), e o método retarda ou diminuiu resistência ao inibidor de cinase (por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe), à célula expressando CAR (por exemplo, uma célula expressando CAR19) ao indivíduo, ou ambos. Em algumas modalidades, a doença associada à expressão de CD19 é um câncer hematológico (por exemplo, um câncer hematológico descrito aqui, por exemplo, CLL, MCL, ou ALL), e em que o método prolonga a remissão ou retarda a reincidência do câncer hematológico. Por exemplo, a remissão pode ser prolongada, a remissão pode ser retardada, a resistência pode ser retardada, ou resistência pode ser diminuída, em comparação com o curso esperado de doença quando tratada com uma monoterapia do inibidor de cinase ou da célula expressando CAR.

[0067] Regimes de tratamento exemplares que pode ser usados em qualquer um dos métodos anteriormente referidos incluem um ou mais dos seguintes:

[0068] Em uma modalidade, o inibidor de cinase e a célula expressando CAR (por exemplo, a célula expressando CAR19) são administrados ao indivíduo, por exemplo, mamífero, como uma terapia de primeira linha.

[0069] Em outra modalidade, a célula expressando CAR (por exemplo, a célula expressando CAR19) é administrada ao indivíduo, por exemplo, mamífero, após administração do inibidor de cinase.

[0070] Em outras modalidades, a célula expressando CAR (por exemplo, a célula expressando CAR19) é administrada após cesar a administração do inibidor de cinase.

[0071] Em outras modalidades, administração do inibidor de cinase é iniciada antes da administração da célula expressando CAR19, e a célula expressando CAR19 é administrada em combinação com administração continuada do inibidor de cinase.

[0072] Em uma modalidade, a um indivíduo é administrado um inibidor de cinase (por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe), por exemplo, como uma terapia de primeira linha. Após um intervalo de tempo predeterminado, (por exemplo, 1 ou 2 meses, porém também 2 semanas, 3 semanas, 1 mês, 1,5 meses, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 6 meses, 9 meses, 12 meses, 15 meses, ou 18 meses), uma célula expressando CAR (por exemplo, uma célula expressando CAR19) é administrada ao indivíduo alone, ou em combinação com o inibidor de cinase. Em algumas modalidades, a resposta do indivíduo ao tratamento é avaliada em intervalos de tempo predeterminados, por exemplo, antes ou durante o tratamento com o inibidor de cinase e/ou célula expressando CAR. Se a avaliação mostrar que o indivíduo é um responsivo completo, a célula expressando CAR (por exemplo, uma célula expressando CAR19) não será administrada. Se a avaliação mostrar que o indivíduo é um responsivo parcial, ou tem doença estável em resposta, ao inibidor de cinase, a célula expressando CAR (por exemplo, uma célula expressando CAR19) será administrada em combinação com o inibidor de cinase, por exemplo, como descrito aqui. Se a avaliação mostrar que o indivíduo é um não responsivo ou reincidente, a célula expressando CAR (por exemplo, uma célula expressando CAR19) será administrada em combinação com o inibidor de cinase ou um segundo inibidor de cinase, por exemplo, um segundo inibidor de cinase como descrito aqui.

[0073] Em outras modalidades, o indivíduo, por exemplo, mamífero, é, ou é identificado como sendo, uma resposta completa ou parcial ao inibidor de BTK (por exemplo, ibrutinibe), ou um responsivo completo ou parcial à célula expressando CAR19.

[0074] Em algumas modalidades, quando um indivíduo é (ou é identificado como sendo) um responsivo completo ao inibidor de cinase (por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe), ao indivíduo não é administrada uma célula expressando CAR (por exemplo, uma célula expressando CAR19) durante o período de resposta completa. Em outras modalidades, quando um indivíduo é (ou é identificado como sendo) um responsivo completo (por exemplo, um responsivo completo a ibrutinibe) ao inibidor de cinase, ao indivíduo é administrada uma célula expressando CAR (por exemplo, uma célula expressando CAR19) durante o período de resposta completa. Em uma modalidade, depois a célula expressando CAR (por exemplo, uma célula expressando CAR19), o indivíduo experimenta uma resposta prolongada ou reincidência retardada (por exemplo, em comparação com o curso esperado da doença quando tratada sem a terapia com CAR).

[0075] Em algumas modalidades, quando um indivíduo é (ou é identificado como sendo) um responsivo parcial ao inibidor de cinase (por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe), ao indivíduo não é administrada uma célula expressando CAR (por exemplo, uma célula expressando CAR19) durante o período de resposta parcial. Em outras modalidades, quando um indivíduo é (ou é identificado como sendo) um responsivo parcial ao inibidor de cinase, ao indivíduo é administrada uma célula expressando CAR (por exemplo, uma célula expressando CAR19) (sozinho ou em combinação com o inibidor de BTK) durante o período de resposta parcial. Em uma modalidade, após a terapia com CAR, o indivíduo experimenta a resposta completa e/ou resposta prolongada ou reincidência retardada (por exemplo, em comparação com o curso esperado de doença quando tratada sem terapia com CAR).

[0076] Em algumas modalidades, quando um indivíduo tem (ou é identificado como tendo) doença estável após tratamento com o inibidor de cinase (por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe), ao indivíduo não é administrada uma terapia com CAR durante o período de doença estável. Em outras modalidades, quando um indivíduo tem (ou é identificado como tendo) doença estável após tratamento com o inibidor de cinase, ao indivíduo é administrada uma terapia com CAR durante o período de doença estável. Em uma modalidade, após a terapia com CAR, o indivíduo experimenta uma resposta parcial, uma resposta completa e/ou resposta prolongada ou reincidência retardada (por exemplo, em comparação com o curso esperado de doença quando tratada sem terapia com CAR).

[0077] Em algumas modalidades, quando um indivíduo tem (ou é identificado como tendo) doença progressiva após tratamento com o inibidor de cinase (por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe), ao indivíduo não é administrada uma célula expressando CAR (por exemplo, uma célula expressando CAR19) durante o período de doença progressiva. Em outras modalidades, quando um indivíduo tem (ou é identificado como tendo) doença progressiva após tratamento com o inibidor de cinase, ao indivíduo é administrada uma célula expressando CAR (por exemplo, uma célula expressando CAR19) durante o período de doença progressiva. Em uma modalidade, após a terapia com CAR, o indivíduo experimenta doença estável, uma resposta parcial, uma resposta completa e/ou resposta prolongada ou reincidência retardada (por exemplo, em comparação com o curso esperado de doença quando tratada sem terapia com CAR).

[0078] Em outras modalidades, a célula expressando CAR é administrada em combinação com um segundo inibidor de cinase, em que o segundo inibidor de cinase é diferente de ibrutinibe, quando o mamífero é, ou é identificado como sendo, um não responsivo ou reincidente a ibrutinibe. O segundo inibidor de cinase pode ser escolhido de um ou mais de GDC-0834, RN-486, CGI-560, CGI-1764, HM-71224, CC-292, ONO-4059, CNX-774, ou LFM-A13, ou uma combinação dos mesmos.

[0079] Em outras modalidades, o indivíduo, por exemplo, o mamífero, é (ou é identificado como sendo) um responsivo parcial ao inibidor de cinase, e ao indivíduo é administrada a célula expressando CAR (por exemplo, a célula expressando CAR19), sozinho ou em combinação com o inibidor de BTK, durante o período de resposta parcial.

[0080] Em outras modalidades, o indivíduo, por exemplo, o mamífero, é (ou tem identificado como sendo) um não responsivo tendo doença progressiva ou estável após tratamento com ibrutinibe, e ao indivíduo é administrada a célula expressando CAR (por exemplo, a célula expressando CAR19), sozinho ou em combinação com um segundo inibidor de BTK, durante o período de doença progressiva ou estável, em que o segundo inibidor de cinase é diferente de ibrutinibe.

[0081] Em outro aspecto, é fornecido aqui um método de tratamento de um indivíduo, por exemplo, um mamífero, tendo uma doença associada com a expressão de antígeno de célula B (por exemplo, CD19). O método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um inibidor de cinase como descrito aqui (por exemplo, um inibidor de BTK cinase descrito aqui, por exemplo, ibrutinibe) e uma célula expressando CAR (por exemplo, uma célula expressando CAR19) em combinação com (por exemplo, simultaneamente (ou simultaneamente de forma substancial), ou sequencialmente).

[0082] Em algumas modalidades, o inibidor de cinase e a célula expressando CAR (por exemplo, uma célula CAR19) são administrados, em combinação, por exemplo, como uma terapia de primeira linha,

[0083] Em algumas modalidades, o inibidor de cinase é administrado inicialmente, por exemplo, uma monoterapia ou primeira linha de terapia; após reduzir a quantidade (por exemplo, administração de cessação ou descontinuação) do inibidor de cinase, administrar a célula expressando CAR (por exemplo, uma célula expressando CAR19) ao indivíduo.

[0084] Em outras modalidades, o inibidor de cinase é administrado inicialmente, por exemplo, uma monoterapia ou primeira linha de terapia; e subsequentemente administrando uma combinação do inibidor de cinase e a célula expressando CAR (por exemplo, uma célula expressando CAR19) ao indivíduo.

[0085] Em outras modalidades, o inibidor de cinase é administrado inicialmente, por exemplo, uma monoterapia ou primeira linha de terapia; após reduzir a quantidade (por exemplo, administração de cessação ou descontinuação) do inibidor de cinase, administrar uma combinação de um segundo inibidor de cinase e a célula expressando CAR (por exemplo, uma célula expressando CAR19) ao indivíduo.

[0086] Em algumas modalidades, a resposta do indivíduo ao tratamento é avaliada em intervalos de tempo predeterminados, por exemplo, antes ou durante o tratamento com o inibidor de cinase e/ou célula expressando CAR. Se a avaliação mostrar que o indivíduo é um responsivo completo, a célula expressando CAR (por exemplo, uma célula expressando CAR19) não será administrada. Se a avaliação mostrar que o indivíduo é um responsivo parcial, ou tem doença estável em resposta, ao inibidor de cinase, a célula expressando CAR (por exemplo, uma célula expressando CAR19) é administrada em combinação com o inibidor de cinase, por exemplo, como descrito aqui. Se a avaliação mostrar que o indivíduo é um não responsivo ou relapser, a célula expressando CAR (por exemplo, uma célula expressando CAR19) será administrada em combinação com o inibidor de cinase ou um segundo inibidor de cinase, por exemplo, um segundo inibidor de cinase como descrito aqui.

[0087] Em algumas modalidades, a doença associada à expressão de antígeno de célula B (por exemplo, CD19) é um câncer hematológico, leucemia, linfoma, MCL, CLL, ALL, linfoma de Hodgkin, ou mieloma múltiplo.

[0088] Em algumas modalidades, o inibidor de cinase é um inibidor de BTK escolhido de ibrutinibe, GDC-0834, RN-486, CGI-560, CGI- 1764, HM-71224, CC-292, ONO-4059, CNX-774, ou LFM-A13; um inibidor de CDK4 escolhido de palbociclib, aloisine A, flavopiridol, 2-(2- clorofenil)-5,7-di-hidróxi-8- [(3S,4R)-3-hidróxi-1-metil-4-piperidinil]-4- cromenona; crizotinibe (PF-02341066, P276-00, RAF265, indisulam, roscovitina, dinaciclibe, BMS 387032, MLN8054, AG-024322, AT7519, AZD5438, BMS908662; ou ribociclibe; um inibidor de mTOR escolhido de rapamicina, um análogo de rapamicina tal como everolimo, temsirolimo, ridaforolimo, semapimode, AZD8055, PF04691502, SF1126, XL765, ou OSI-027; ou um inibidor de MNK é escolhido de: CGP052088, CGP57380, cercosporamida, ou ETC-1780445-2, ou 4- amino-5-(4-fluoroanilino)-pirazolo [3,4-d] pirimidina.

[0089] Em alguns aspectos, a invenção caracteriza um método de tratamento ou fornecimento uma imunidade antitumor em um indivíduo, por exemplo, mamífero, tendo linfoma de Hodgkin. O método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma célula que expressa uma molécula de CAR que liga CD19, sozinho ou em combinação com uma segunda terapia.

[0090] Em outro aspecto, a invenção caracteriza um método de tratamento, ou fornecimento de imunidade antitumor a um indivíduo, por exemplo, um mamífero, tendo um mieloma múltiplo (por exemplo, um mieloma múltiplo de CD19 positivo, ou um mieloma de CD19 negativo). Em uma modalidade, o mieloma múltiplo é CD19 negativo, por exemplo, tem uma vasta maioria (99,95%) das células de plasma neoplásicas com um fenótipo de CD19 negativo, por exemplo, como detectado tanto por citometra de fluxo quanto RT-PCR. O método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma célula que expressa uma molécula de CAR que liga CD19, sozinho ou em combinação com uma segunda terapia (por exemplo, um padrão de terapia de cuidado para mieloma múltiplo). O método pode também compreender administrar um inibidor de cinase como descrito aqui.

[0091] Em modalidades dos métodos relacionados ao linfoma de Hodgkin ou mieloma múltiplo, a molécula de CAR é uma molécula de CAR humanizada, por exemplo, como descrito aqui. Em modalidades, a molécula de CAR é uma molécula de CAR como descrito aqui. Por exemplo, em modalidades a molécula de CAR compreende um domínio de ligação anti-CD19 que compreende um ou mais de (por exemplo, 2, 3, 4, 5, ou todos de) CDR1 de LC de SEQ ID NO: 5, um CDR2 de LC de SEQ ID NO: 26, e um CDR3 de LC de SEQ ID NO: 27; um CDR1 de HC de SEQ ID NO: 19, um CDR2 de LC de qualquer de SEQ ID NOS: 2023, e um CDR3 de HC de SEQ ID NO: 24.

[0092] Em algumas modalidades dos métodos relacionados ao linfoma de Hodgkin ou mieloma múltiplo, a molécula de CAR (por exemplo, CART19 ou CTL019) é administrada como uma monoterapia. Em algumas modalidades, o método também compreende administrar um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de BTK (tal como ibrutinibe), um inibidor de CDK4, um inibidor de mTOR, ou um inibidor de MNK.

[0093] Em algumas modalidades, dos métodos relacionados ao mieloma múltiplo, a molécula de CAR (por exemplo, CART19 ou CTL019) é administrada em combinação com um padrão de terapia de cuidado para mieloma múltiplo, por exemplo, com quimioterapia mieloablativa e/ou resgate de transplante de célula-tronco autóloga (por exemplo, após administração de melfalano (por exemplo, melfalano em dose elevada)).

[0094] Em outro aspecto, a invenção caracteriza uma composição compreendendo uma célula que expressa uma molécula de CAR que liga um antígeno de célula B (por exemplo, um ou mais de CD19, CD20. CD22 ou ROR1), e um ou mais inibidores de cinase, em que o inibidor de cinase é escolhido de um inibidor de tirosina cinase de Bruton (BTK), um inibidor de cinase 4 dependente de ciclina (CDK4), um inibidor de mTOR, ou um inibidor de cinase de interação de proteína cinase ativada por mitógeno (MNK). A célula expressando CAR e um ou mais inibidores de cinase podem estar presentes em uma forma de dose simples, ou como duas ou mais formas de dose.

[0095] Em modalidades, as composições descritas aqui são para uso como um medicamento.

[0096] Em modalidades, as composições descritas aqui são para uso no tratamento de uma doença associada à expressão de antígeno de célula B (por exemplo, CD19).

Métodos e composições para produção de células expressando CAR

[0097] A presente invenção também fornece, em certos aspectos, um método de preparação de umas populações de célula efetoras imunes (por exemplo, células T ou células NK) que podem ser criadas para expressar um CAR (por exemplo, um CAR descrito aqui), o método compreendendo: fornecer umas populações de célula efetoras imunes; e contatar as células efetoras imunes com um inibidor de cinase (por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe) sob condições suficientes para inibir um alvo do inibidor de cinase (por exemplo, BTK e/ou ITK). O método pode também compreender contatar, por exemplo, transduzir, as células efetoras imunes com um ácido nucleico codificando uma molécula de CAR.

[0098] Em alguns aspectos, a invenção fornece um método de preparação de uma célula expressando CAR (por exemplo, uma célula efetora imune expressando CAR ou população de células), compreendendo: contatar a célula ou população de células com um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe; e introduzir (por exemplo, transducing) um ácido nucleico codificando uma molécula de CAR na célula ou população de células sob condições de modo que a molécula de CAR seja expressa.

[0099] Em certas modalidades dos métodos de produção de células expressando CAR, a molécula de CAR codificada pelo ácido nucleico é uma molécula de CAR que liga CD19. Em modalidades, o método também compreende cultivara célula ou células sob condições que permitem a célula ou pelo menos uma subpopulação das células expressar a molécula de CAR. Em modalidades, a célula é uma célula T ou célula NK, ou as populações de célula inclui células T, células NK, ou ambas. Em modalidades, o método compreende contatar a célula ou células com o inibidor de cinase (por exemplo, durante 10-20, 20-30, 3040, 40-60, ou 60-120 minutos) e subsequentemente remover a maior parte ou todo o inibidor de cinase da célula ou células. Em modalidades, o inibidor de cinase é adicionado após a célula ou células serem colhidas ou antes da célula ou células serem estimuladas. Em modalidades, o inibidor de cinase é um inibidor de BTK, um inibidor de CDK4, um inibidor de mTOR, ou um inibidor de MNK. Em modalidades, o inibidor de cinase é ibrutinibe. Em modalidades, as populações de célula também compreendem células de câncer, por exemplo, leucemia ou células de linfoma. As células de câncer podem ser, por exemplo, células de CLL, MCL, ou ALL. Em modalidades, o inibidor de cinase inibe um alvo (por exemplo, BTK) nas células de câncer, por exemplo, reduz sua atividade em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou 99%. Em modalidades, o inibidor de cinase inibe um alvo (por exemplo, ITK) nas células efetoras imunes, por exemplo, reduz sua atividade em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou 99%.

[00100] Em alguns aspectos, a presente invenção também fornece uma mistura reacional compreendendo um inibidor de cinase (por exemplo, um inibidor de BTK) e uma molécula de CAR ou um ácido nucleico codificando uma molécula de CAR. Em algumas modalidades, a mistura reacional também compreende umas populações de célula efetoras imunes.

[00101] Em algumas modalidades, uma ou mais células efetoras imunes expressam a molécula de CAR ou compreende o ácido nucleico codificando a molécula de CAR. Em algumas modalidades, o inibidor de cinase é escolhido de um inibidor de BTK, um inibidor de CDK4, um inibidor de mTOR, ou um inibidor de MNK. Em algumas modalidades, o inibidor de BTK é escolhido de: ibrutinibe, GDC-0834, RN-486, CGI-560, CGI-1764, HM-71224, CC-292, ONO-4059, CNX-774, ou LFM-A13. Em modalidades, a mistura reacional compreende células de câncer, por exemplo, células de câncer hematológico. As células de câncer podem ser, por exemplo, células que foram colhidas do indivíduo quando as células efetoras imunes foram colhidas do indivíduo.

[00102] Em certos aspectos, a presente invenção também fornece uma mistura reacional compreendendo umas populações de célula efetoras imunes, e uma molécula de CAR ou um ácido nucleico codificando uma molécula de CAR, em que as células efetoras imunes compreendem lTK covalentemente inativado. Em modalidades, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou 99% de ITK são covalentemente inativados. Em algumas modalidades, a mistura reacional também compreende células de câncer. Em modalidades, as células de câncer compreendem BTK covalentemente inativado. Em modalidades, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou 99% de BTK são covalentemente inativados. Em modalidades, um BTK ou ITK forma uma ligação covalente em ou próximo ao seu domínio de ligação de ATP a uma molécula pequena tal como ibrutinibe. Em modalidades, o BTK forma uma ligação covalente em ou próximo ao sua cisteína-481 a uma molécula pequena tal como ibrutinibe.

[00103] Em modalidades, uma mistura reacional como descrita aqui também compreende um tampão ou outro reagente, por exemplo, uma solução contendo PBS. Em modalidades, a mistura reacional também compreende um agente que ativa e/ou expande-se às células da população, por exemplo, um agente que estimula um sinal associado com complexo de CD3/TCR e/ou um ligante que estimula uma molécula coestimulatória na superfície das células. Em modalidades, o agente é uma conta conjugada com anticorpo com anti-CD3, ou um fragmento do mesmo, e/ou anticorpo anti-CD28, ou um fragmento do mesmo. Em modalidades, a mistura reacional também compreende uma ou mais fatores para a proliferação e/ou viabilidade, incluindo sero (por exemplo, soro bovino fetal ou humano), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-Y, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFß, e TNF-a ou qualquer um dos outros aditivos para o crescimento de células. Em modalidades, a mistura reacional também compreende IL-15 e/ou IL-7. Em modalidades, uma pluralidade das células da população na mistura reacional compreende uma molécula do ácido nucleico, por exemplo, uma molécula do ácido nucleico descrita aqui, que compreende uma sequência codificando CAR, por exemplo, uma sequência codificando CAR de CD19, por exemplo, como descrito aqui. Em modalidades, uma pluralidade das células da população na mistura reacional compreende um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um CAR, por exemplo, um CAR descrito aqui, por exemplo, um CAR de CD19 descrito aqui. Em modalidades, o vetor é um vetor descrito aqui, por exemplo, um vetor selecionado do grupo que consiste em um DNA, um RNA, um plasmídeo, um vetor de lentivírus, vetor adenoviral, ou um vetor de retrovírus. Em modalidades, a mistura reacional também compreende um crioprotetor ou estabilizante tal como, por exemplo, um sacarídeo, um oligossacarídeo, um polissacarídeo e um poliol (por exemplo, trehalose, manitol, sorbitol, lactose, sacarose, glicose e dextrano), sais e éteres coroa. Em uma modalidade, o crioprotetor é dextrano.

[00104] Em algumas modalidades, o método de preparação descrito aqui também compreende contatar as populações de célula efetoras imunes com um ácido nucleico codificando uma subunidade de telomerase, por exemplo, hTERT. O ácido nucleico codificando a subunidade de telomerase pode ser DNA.

[00105] Em algumas modalidades, o método de preparação descrito aqui também compreende cultivar as populações de célula efetoras imunes em soro compreendendo soro de hAB a 2%.

[00106] Títulos, subtítulos ou elementos numerados ou letrados, por exemplo, (a), (b), (i) etc, são apresentados meramento para facilidade de leitura. O uso de títulos ou elementos numerados ou letrados neste documento não requer que as etapas ou elementos sejam realizados em ordem alfabética ou que as etapas ou elementos sejam necessariamente discretas uns dos outros.

[00107] Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, e outras referências mencionadas aqui são incorporados aqui por referência em sua totalidade.

[00108] Outras características, objetivos e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição e desenhos, e a partir das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00109] As figuras 1A, 1B e 1C são representações gráficas de citotoxicidade como ensaiado em célula T de ND317 (doador normal) transduzida com CAR anti-CD19 de camundongo ou CARs anti-CD19 humanizados da invenção e cultivada com células K562 de controle que não expressam CD19 (K562cc) como mostrado na figura 1A, células K562 transformadas com CD19 (K562.CD19) como mostrado na figura 1B ou células B malignas isoladas de um paciente de isolado de célula B (Pt 14) como mostrado na figura 1C.

[00110] As figuras 2A e 2B são gráficos mostrando a resposta proliferativa de células anti-CD-19 humanizadas e de camundongo expressando CAR a células CD19+, onde o maior número de células T CAR+ viável correlaciona-se com populações mostrando proliferação de célula CD4+ e CD8+ máxima para células de CLL primária.

[00111] A figura 3 é uma representação gráfica dos espectros de massa de HPLC deconvoluídos para scFvs da invenção, onde a fileira superior descreve scFv não tratado e a fileira inferior descreve o scFv desglicolisado cognato.

[00112] A figura 4 é uma representação gráfica da estabilidade de conformação como medido por Fluorimetria de Varredura Diferencial. A Tm de scFv de camundongo foi de 57°C (linha grossa). Todas as variantes de scFv humanizadas mostram Tm elevada em torno de 70°C em comparação ao scFv de camundongo. Os resíduos introduzidos por humanização têm melhorado a Tm em mais do que 10° C.

[00113] A figura 5 é uma representação gráfica de proliferação de célula T transduzida por CAR de CD19, em que as células CART19 são direcionadas a (a) uma linhagem de célula de leucemia mielogenosa crônica ("CML") que é negativa para a expressão de CD19, e consequentemente usada; (b) células K562 recombinantes positivas quanto à expressão de CD19, e consequentemente usadas como um controle positivo; ou (c) a células B Pt14 isoladas de um paciente de CLL e que expressam CD19 em uma superfície celular.

[00114] As figuras 6A e 6B são esquemáticas de CARs representativos.

[00115] A figura 7 descreve a progressão da doença de ALL primária de HALLX5447 em camundongos NSG após tratamento com células T CAR transduzidas por CD19. O crescimento de células de ALL humanas primárias em camundongos NSG após o tratamento com células T CAR específicas para o controle demonstrado por CD19 de progressão de doença. A porcentagem média de células de ALL humanas de CD19+ foi um indicador de carga de doença no sangue periférico em camundongos NSG para o dia 65 após o implante de tumor. Círculos pretos: camundongos tratados com 100ul de PBS por meio da veia da cauda; quadrados vermelhos: camundongos tratados com células T transduzidas simuladas; triângulos azuis: camundongos tratados com células T transduzidas por CAR de CD19 de murino; e triânguos roxos invertidos: camundongos tratados com células T transduzidas por CAR de CD19 humanizadas. Significância calculada por ANOVA; * significa P<0.01.

[00116] A figura 8 descreve a expressão de CD19 em células de tumor do paciente. Células de tumor de CD45dim de CD138+ foram manchadas quanto ao CD19 (eixo x) e CD38 (eixo y). Aproximadamente 1-2% das células de tumor expressaram o antígeno de CD19.

[00117] A figura 9 é dois gráficos mostrando a proliferação de célula e tamanho de célula de células CART19 quando tratadas com concentrações crescentes de ibrutinibe (10 nM, 100 nM, e 1000 nM).

[00118] As figuras 10A e 10B mostram a proliferação de células CART19 estimuladas com linhagens de célula MCL, ao mesmo tempo em que na presença ou ausência de ibrutinibe. A figura 10A é uma série de histogramas mostrando a proliferação de células CART19 estimuladas com linhagens de célula de tumor MOLM14, JEKO-1, e RL, na presença ou ausência de concentrações crescentes de ibrutinibe (10 nM, 100nM, e 1000 nM). As células foram manchadas por CFSE e analisadas por citometria de fluxo para determinar a porcentagem de células proliferantes, designada pela barra em cada histograma. A figura 10B é uma quantificação de histogramas representativos na figura 10A.

[00119] As figuras 11A e 11B mostram desgranulação de CD107a de células CART19 estimuladas com linhagens de célula MCL na presença ou ausência de ibrutinibe. A figura 11A é uma série de perfis de citometria de fluxo mostrando desgranulação de CD107a de células CART19 estimuladas com linhagens de célula de tumor (MOLM14, JEKO-1, e RL) na presença ou ausência de concentrações crescentes de ibrutinibe (10 nM, 100nM, e 1000 nM). Expressão de CD107a é medida no eixo y. A figura 11B é a quantificação dos resultados da Figura 11A.

[00120] A figura 12 é uma série de perfis de citometria de fluxo mostrando produção de lL-2 intra-citoplasmática por células CART19 estimuladas com linhagens de célula de tumor (MOLM14, JEKO-1, e RL) na presença ou ausência de concentrações crescentes de ibrutinibe (10 nM, 100nM, e 1000 nM). O eixo y representa a expressão de lL-2.

[00121] A figura 13 é uma série de perfis de citometria de fluxo mostrando produção de TNF-a intracitoplasmático por células CART19 estimuladas com linhagens de célula de tumor (MOLM14, JEKO-1, e RL) na presença ou ausência de concentrações crescentes de ibrutinibe (10 nM, 100nM, e 1000 nM). O eixo y representa a expressão de TNF- a.

[00122] A figura 14 é uma série de perfis de citometria de fluxo mostrando produção de IFN-g intracitoplasmático por células CART19 estimuladas com linhagens de célula de tumor (MOLM14, JEKO-1, e RL) na presença ou ausência de concentrações crescentes de ibrutinibe (10 nM, 100nM, e 1000 nM). O eixo y representa a expressão de IFN-g.

[00123] A figura 15 é uma série de gráficos mostrando secreção de citocina de células CART19 estimuladas com linhagens de célula de tumor (MOLM14, JEKO-1, e RL) na presença ou ausência de concentrações crescentes de ibrutinibe (10 nM, 100nM, e 1000 nM).

[00124] As figuras 16A, 16B, 16C, 16D, 16E, e 16 F são gráficos mostrando morte por CART19 de células de tumor, MOLM14 (FIG. 16A e 16D), JEKO (FIG. 16B e 16E), e RL (FIG. 16C e 16F), sozinho ou na presença de concentrações crescentes de ibrutinibe. Células não transduzidas (UTD) ou CART19 foram incubadas com células de tumor em relações variáveis e o fluxo total de células (FIG. 16A, 16B, e 16C) e porcentagem de células mortas foram avaliados (16D, 16E, e 16F).

[00125] As figuras 17A, 17B, e 17C são representações gráficas de morte por CART19 de células de tumor após 24 horas como medido por citometria de fluxo para contar o número total de células. Linhagens de célula de tumor MOLM14 (FIG. 17A), JEKO (FIG. 17B), e RL (FIG. 17C) foram incubadas com células não transduzidas (UTD) ou CART19 sozinho (ALONE), ou em combinação com concentrações variáveis de ibrutinibe.

[00126] FIG. 18A, 18B, 18C, e 18D são representações gráficas de constatação de dose de CART19 no modelo de camundongo MCL RL. A carga de tumor foi monitorada por imageamento de bioluminescência (BLI) ao longo do tempo (FIG. 18A e 18B). A sobrevivência global foi monitorada ao longo do tempo (FIG. 18C).

[00127] As figuras 19A e 19B são representações gráficas de constatação de dose de CART19 no modelo de camundongo de MCL JEKO-1. O tamanho de tumor é monitorado por imageamento de bioluminescência (BLI) ao longo do tempo (FIG. 19A) e a sobrevivência global foi também monitorada ao longo do tempo (FIG. 19B).

[00128] A figura 20 é um esquemático mostrando o protocolo para administrar e avaliar a terapia de combinação de CART19 e ibrutinibe em modelos de camundongo in vivo.

[00129] A figura 21A, 21B, 21C, e 21D é uma representação gráfica mostrando a eficiência de transdução de PBMCs quanto à geração de células T CART19 quando células são tratadas com ibrutinibe antes da transduçãon. PBMCs não tratadas foram analisadas quanto à expressão de CAR19 (Figura 21A) e após transdução (FIG. 21C). PBMCs tratadas por ibrutinibe foram analisadas quanto à expressão de CAR19 antes da transdução (FIG. 21B) e após transdução (FIG. 21D).

[00130] A figura 22A, 22B, 22C, 22D, e 22E é uma representação gráfica do efeito de tratamento com ibrutinibe em proliferação de célula T estimulada por CD3/CD28. Concentrações crescentes de ibrutinibe foram avaliadas: Não tratadas (FIG. 22A); 0.1 µM de ibrutinibe (FIG. 22B); 0.5 µM de ibrutinibe (FIG. 22C), 1 µM de ibrutinibe (FIG. 22D), e 5 µM de ibrutinibe (FIG. 22E).

[00131] A figura 23 é uma representação gráfica demonstrando que ibrutinibe não afeta a citotoxidade de CART19.

[00132] A figura 24 é uma série de representações gráficas que demostram que o tratamento com ibrutinibe não promove distorção de citocinas TH1/TH2 em células CART19.

[00133] As figuras 25A e 25B são representações gráficas mostrando que administração contínua de ibrutinibe não afeta a função de CART19 em compensação de células de tumor in vivo. A figura 25A mostra as células Nalm/6 detectadas em sangue periférico durante cada regime de tratamento. A figura 25B mostra uma curva de sobrevivência Kaplan- Meier comparando a sobrevivência de camundongos recebendo CART19 com ou sem dosagem de ibrutinibe.

[00134] As figuras 26A, 26B, 26C, 26D, 26E, e 26F são representações gráficas que mostram a eficiência de transdução de CAR19 em células de paciente de CLL nos pontos de tempo indicados durante o tratamento com ibrutinibe. As células não foram transduzidas (FIG. 26A, 26B, e 26C), ou foram transduzidas com CAR19 (FIG. 26D, 26E, e 26F). As células manchadas com GAM expressam CAR19 e estão presentes nas caixas em cada perfil.

[00135] FIG. 27 é uma série de representações gráficas descrevendo a taxa de proliferação de células não transduzidas em comparação com células que foram transduzidas com CAR19 nos pontos de tempo indicados durante o tratamento de ibrutinibe a partir de um painel de pacientes.

[00136] As FIGs 28A, 28B, e 28C são representações gráficas demonstrando que o tratamento com ibrutinibe em pacientes de CLL induz à linfocitose. As células do paciente foram isoladas nos pontos de tempo indicados: linha de base (FIG. 28A); ciclo 2, dia 1 (FIG. 28B); e ciclo 12, dia 1 (FIG. 28C).

[00137] As FIGs 29A, 29B, e 29C são representações gráficas demonstrando que o tratamento com ibrutinibe em três pacientes de CLL induz à expressão de CD200 em células de tumor ao longo do tempo em CLL. Cada perfil contém uma sobreposição de histogramas de expressão de CD200 de células isoladas nos pontos de tempo indicados: linha de base (screen); ciclo 2, dia 1; e ciclo 12, dia 1.

[00138] As FIGs 30A, 30B, e 30C são representações gráficas demonstrando que o tratamento com ibrutinibe em pacientes de CLL diminui a frequência de células PD1+ T durante o tempo. As células do paciente foram isoladas nos pontos de tempo indicados: linha de base (FIG. 30A); ciclo 2, dia 1 (FIG. 30B); e ciclo 12, dia 1 (FIG. 30C).

[00139] As FIGs 31A e 31B são uma representação gráfica demonstrando a sensibilidade das linhagens de célula MCL RL (FIG. 31A) e JEKO-1 (FIG. 31B) ao tratamento com ibrutinibe.

[00140] A figura 32 é uma representação gráfica demonstrando o efeito do tratamento com ibrutinibe em um modelo in vivo de MCL.

[00141] As FIGs 33A e B são imagens de análise imuno-histoqímica de um linfoma de Hogdkin mostrando células de expressão de CD19 presentes no tumor. A figura 33A é em ampliação de 1X e a figura 33B é em ampliação de 20X.

[00142] A figura 34 é um diagrama esquemático da estrutura experimental durante um estudo para avaliar a eficácia terapêutica do tratamento com CART19 em pacientes com linfoma de Hodgkin.

[00143] As FIGs 35A, 35B, 35C, e 35D mostram análise de citometria de fluxo de expressão de PD1 e CAR19 em células T. A figura 35A e 35B são perfis representativos de citometria de fluxo demonstrando a distribuição de expressão de PD-1 e CAR19 em células CD4+ T a partir de indivíduos que são respondedores completos (CR) ou não respondedores (NR) à terapia de CART. A figura 35C é um gráfico mostrando o percentual de células PD1 na população de célula CD4+ T de grupos de indivíduos com respostas diferentes à terapia de CART. FIG. 35D é um gráfico mostrando o percentual de células PD1 na população de célula CD8+ T de grupos de indivíduos com respostas diferentes à terapia de CART.

[00144] As FIGs 36A e 36B mostram a distribuição de expressão de PD1 em células de expressão de CD4 2 CAR19 (FIG. 36A) ou células de expressão de CD8 e CAR19 (FIG. 36B) de grupos de indivíduos com respostas diferentes à terapia de CART.

[00145] A figura 37 mostra a análise de citometria de fluxo de expressão de PD1, CAR 19, LAG3, e TIM3 em células T a partir de indivíduos que são respondedores completos (CR) ou não respondedores (NR) à terapia de CART.

[00146] As FIGs 38A e 38B mostram a distribuição de expressão de PD1 e LAG3 (FIG. 38A) ou expressão de PD1 e TIM3 (FIG. 38B) de grupos de indivíduos com respostas diferentes à terapia de CART.

[00147] A figura 39 mostra a imunofenotipagem de IgA de célula de plasma de um paciente de mieloma que recebeu CART19, demonstrando a resposta à terapia de CART19.

[00148] As FIGs 40A e 40B são gráficos que mostram um aumento em títulos para linhas de vacina contra influenza como em comparação com placebo. Na figura 40A, o aumento acima da linha de base em títulos médios geométricos para cada das 3 linhagens de vacinas contra influenza (H1N1 A/California/ 07/2009, H3N2 A/Victoria/210/2009, B/Brisbane/60/ 2008) em relação ao aumento no coorte de placebo 4 semanas após a vacinação é mostrado para cada dos coortes de dosagem de RAD001 na população de intenção de tratamento. A linha preta em negrito indica o aumento de 1,2 vezes em títulos em relação ao placebo que é requerido ser encontrado por 2 de 3 linhagens de vacina contra influenza para encontrar o ponto final primário do estudo. A estrela "*" indica que o aumento em título de GMT em relação ao placebo excede 1 com probabilidade posterior de pelo menos 80 %. A FIG 40B é um gráfico os mesmos dados da figura 40A para o subconjunto de indivíduos com títulos de influenza de linha de base <= 1:40.

[00149] A figura 41 mostra um gráfico de dispersão de concentração de RAD001 versus aumento em vezes em título médio geométrico para cada linhagem de vacina contra influenza 4 semanas após a vacinação. As concentrações de RAD001 (1 hora após dose) foram medidas após os indivíduos terem sido dosados durante 4 semanas. Todos os indivíduos que tinham medições farmacocinéticas foram incluídos no conjunto de análise. O aumento em vezes em títulos médios geométricos em 4 semanas após a vacinação em relação à linha de base é mostrado no eixo.

[00150] A figura 42 é uma representação gráfica mostrando o aumento nos títulos para linhagens de influenza heterólogas como em comparação com placebo. O aumento acima da linha de base em títulos médios geométricos de influenza para 2 linhagens de influenza heterólogas (A/H1N1 linhagem A/Nova Jersey/8/76 e A/H3N2 linhagem A/Victoria/361/11) não contido na vacina contra influenza em relação ao aumento n coorte de placebo 4 semanas após a vacinação é mostrado para cada dos coortes de dosage de RAD001 na população de intenção de tratamento. * indica que o aumento no título em relação ao placebo excede 1 com a probabilidade posterior de pelo menos 80%.

[00151] A figura 43A e 43B são representações gráficas de níveis de IgG e IgM antes e após vacinação contra influenza. Os níveis de anti- A/H1N1/California/07/2009 influenza IgG e IgM foram medidos em soro obtido de indivíduos antes e 4 semanas após a vacinação contra influenza. Nenhuma diferença significante na mudança de linha de base para 4 semanas após a vacinação em anti-H1N1 influenza IgG e IgM levels foi detectada entre o RAD001 e os coortes de placebo (todos os valores de p > 0,05 por teste de soma de teste de soma de classificação Kruskal-Wallis).

[00152] As FIGs 44A, 44B, e 44C são representações gráficas do decréscimo em porcentagem de CD4 e CD8 positivas em PD-1 e aumento em células T CD4 negativas em PD-1 após tratamento de RAD001. O percentual de células T CD4 positivas em PD-1, CD8 e CD4 negativas em PD-1 foi determinado por análise de FACS de amostras de PBMC em linha de base, após 6 semanas de tratamento de fármaco de estudo (Semana 6) e 6 semanas após descontinuação de fármaco de estudo e 4 semanas após vacinação contra influenza (Semana 12). A figura 44A mostra que houve um decréscimo significante (-37,1 - - 28,5%) em células T CD4 positivas em PD-1 em semana 12 em coortes que recebem RAD001 em níveis de dose 0,5 mg/Dia (n=25), 5 mg/Semana (n=29) e 20 mg/Semana (n=30) como em comparação com o coorte de placebo (n=25) com p=0,002 (0,02), p=0,003 (q=0,03), e p= 0,01 (q=0,05) respectivamente. A figura 44B mostra que houve um decréscimo significante (-43,3 - -38,5%) em células T CD8 positivas em PD-1 na semana 12 em coortes que recebem RAD001 (n=109) em níveis de dose de 0,5 mg/Dia (n=25), 5 mg/Semana (n=29) e 20 mg/Semana (n=30) como em comparação com o coorte de placebo (n=25) com p=0,01 (0,05), p=0,007 (q=0,04), e p= 0,01 (q=0,05) respectivamente. A figura 44C mostra que houve aumento significante (3,0 - 4,9%) em células T CD4 negativas em PD-1 na semana 12 em coortes que recebem RAD001 (n=109) em níveis de dose 0,5 mg/Dia (n=25), 5 mg/Semana (n=29) e 20 mg/Semana (n=30) como em comparação com o coorte de placebo (n=25) com p=0,0007 (0,02), p=0,03 (q=0,07), e p= 0,03 (q=0,08) respectivamente.

[00153] A figura 45A e 45B são representações gráficas do decréscimo em porcentagem de CD4 e CD8 positivas em PD-1 e aumento em células T CD4 negativas em PD-1 após tratamento de RAD001 ajustado para as diferenças em expressão de PD-1 em linha de base. O percentual de células T CD4 positivas em PD-1, CD8 e CD4 negativas em PD-1 foi determinado por análise de FACS de amostras de PBMC em linha de base, após 6 semanas de tratamento de fármaco de estudo (Semana 6) e 6 semanas após descontinuação de fármaco de estudo e 4 semanas após vacinação contra influenza (Semana 12). A figura 45A mostra um decréscimo significante de 30,2% em células T PD-1+ CD4 na semana 6 no coorte de RAD agrupado (n=84) em comparação com coorte de placebo (n=25) com p=0,03 (q=0,13). O decréscimo em células T CD4 positivas em PD-1 em semana 12 no RAD misturado como em comparação com o coorte de placebo é 32,7 % com p= 0,05 (q=0,19). A figura 45B mostra um decréscimo significante de 37,4 % em células T CD8 positivas em PD-1 na semana 6 no coorte de RAD001 agrupado (n=84) em comparação com coorte de placebo (n=25) com p=0,008 (q=0,07). O decréscimo em células T CD8 positivas em PD-1 na semana 12 no RAD001 agrupado como em comparação com o coorte de placebo é 41,4% com p=0,066 (q=0,21). As FIG. 45A e 45B representam os dados nas FIGs 44A, 44B, e 44C, porém com os grupos de dosagem RAD001 diferentes de FIGs 44A, 44B, e 44C misturadas no grupo tratado com RAD001 nas FIGs 45A e 45B.

[00154] A figura 46 descreve aumentos em exercício e energia em indivíduos idosos em resposta ao RAD001.

[00155] As FIGs 47A e 47B descrevem o efeito previsto de RAD001 em atividade de P70 S6K em células. A figura 47A descreve inibição de P70 S6 cinase com doses superiores de RAD001 semanais e diárias; A figura 47B descreve inibição de P70 S6 cinase com doses inferiores de RAD001 semanais.

[00156] As FIGs 48A e 48B mostram a expressão de receptor de IL- 7 (CD127) em linhagens celulares de câncer e células de CART. A expressão de CD127 foi medida por análise de citometria de fluxo em três linhagens celulares de câncer: RL (linfoma de célula do revestimento), JEKO (também conhecido como Jeko-1, linfoma de célula do revestimento), e Nalm-6 (B-ALL) (Fig. 48A). A expressão de CD127 foi medida por análise de citometria de fluxo em células positivas em CD3 (CART) que foram infundidas e circulação em camundongos NSG (Fig. 48B).

[00157] As FIG. 49A, 49B, e 49C mostram a resposta antitumor após o tratamento de CART19 e tratamento de IL-7 subsequente. Os camundongos NSG enxertados com uma linhagem de célula de linfoma de revestimento de expressão de luciferase (RL-luc) no dia 0 foram tratados com a variação de dosagens de células CART19 no dia 6, e a carga de tumor foi monitorada. Os camundongos foram divididos em 4 grupos e não receberam nenhuma célula CART19, 0,5x106células CART19 (CART19 0,5E6), 1x106células CART19 (CART19 1E6), ou 2x106células CART19 (CART19 2E6). A carga de tumor após o tratamento de CART foi medida por detecção de bioluminescência (BLI média) (Fig. 49A). Os camundongos recebendo 0,5x106células CART19 (CART19 0,5E6) ou 1x106células CART19 (CART19 1E6) foram randomizados para receberem IL-7 humana recombinante (rhIL- 7) ou não. Carga tumoral, representada aqui pela bioluminescência média (BLI), foi monitorada para os três camundongos (#3827, #3829, e #3815, recebendo a dose de CART19 inicial indicada) da Figura 49A que foram tratados com IL-7, começando no dia 85 (Fig. 49B). IL-7 foi administrada através da injeção de IP 3 vezes semanais. A carga tumoral, representada aqui pela bioluminescência média (BLI) antes do dia 85 (PRE) e após o dia 115 (POST), foi comparada entre camundongos que não receberam IL-7 (CTRL) e camundongo que receberam tratamento de IL-7 (IL-7) (Fig. 49C).

[00158] As FIG. 50A e 50B mostram a dinâmica de célula T após tratamento de IL-7. O nível de células T humanas detectado no sangue foi monitorado para cada dos camundongos que receberam IL-7 ou camundongos de controle (Fig. 50A). O nível de células CART19 (CD3+ células) detectado no sangue foi medido antes (PRE) e 14 dias após (Dia 14) a iniciação de tratamento de IL-7 (Fig. 50B).

[00159] A figura 51 descreve as estruturas de duas configurações de RCAR exemplares. Os números de ligação de antígeno compreendem um domínio de ligação de antígeno, um domínio de transmembrana, e um domínio de switch. Os membros de ligação intracelulares compreendem um domínio de comutador, um domínio de sinalização coestimulante e um domínio de sinalização primária. As duas configurações demonstram que os primeiro e segundo domínios de comutador descritos aqui podem ser em orientações diferentes em relação ao membro de ligação de antígeno e ao membro de ligação intracelular. Outras configurações de RCAR são também descritas aqui.

[00160] A figura 52A é uma imagem de uma linhagem de célula de RL.

[00161] A figura 52B é um grupo de plotagens de dispersão de citometria de fluxo mostrando a expressão de CD19 e CD5 em linhagens celulares de RL e RL primárias.

[00162] A figura 52C é uma imagem mostrando t(11;14) a translocação por hibridização in situ de fluorescência (FISH).

[00163] A figura 52D é um gráfico mostrando o IC50 (por conversão de MTT de porcentagem) de inibição de ibrutinibe em linhagens celulares diferentes.

[00164] A figura 52E é um grupo de imagens e gráficos mostrando o enxerto de RL células em camundongos de nocaute de cadeia NOD- SCID-gama (NSG) e a carga tumoral resultante.

[00165] A figura 52F é um grupo de imagens histológicas mostrando a localização de células de MCL para vários órgãos em camundongos.

[00166] A figura 52G é um grupo de imagens histológicas de camundongos que foram injetados com células de MCL-RL.

[00167] A figura 53A é um grupo de gráficos mostrando o número de células CART19 CD107a+ quando expostas a várias linhagens de célula MCL.

[00168] FIG. 53B é um grupo de gráficos mostrando a quantidade de IL-2 e TNF-alfa produzidas por células CART19 quando expostas a várias linhagens de célula MCL.

[00169] A figura 53C é um gráfico mostrando a porcentagem de morte de várias linhagens de célula MCL por células CART19 em várias relações celulares efetoras:alvo.

[00170] A figura 53D é um gráfico mostrando a quantidade de éster de succinimidila de carboxifluorosceína (CFSE), uma medição de proliferação, em células CART19 expostas a várias linhagens de célula MCL.

[00171] A figura 53E é um grupo de gráficos mostrando a porcentagem de células T antes e após a expansão.

[00172] A figura 53F é um grupo de gráficos mostrando a porcentagem de células T transduzidas CAR-19 ou não transduzidas que expressam ou produzem várias biomoléculas (por exemplo, citocinas).

[00173] A figura 54A é um grupo de imagens mostrando a ativação de célula T cinase induzível por interleucina-2 (ITK) quando as células CART19 foram estimuladas especificamente ou não especificamente.

[00174] FIG. 54B é um grupo de gráficos mostrando expressão de superfície de CD107a (uma medição de desgranulação), produção de IL-2, e produção de TNF-alfa por células CART19 com várias concentrações com ibrutinibe.

[00175] A figura 54C é um grupo de histogramas mostrando a quantidade de CFSE em células CART19 com várias concentrações de ibrutinibe e expressas a várias linhagens de célula MCL.

[00176] A figura 54D é um grupo de gráficos mostrando a expressão ou produção de várias citocinas e biomarcadores como indicadores do estado de Th1 ou Th2 de células CART19 quando combinadas com concentrações diferentes de ibrutinibe.

[00177] A figura 54E é um grupo de gráficos mostrando a morte percentual por células CART19 de várias linhagens de célula MCL quando combinadas com concentrações diferentes de ibrutinibe.

[00178] A figura 54F é um gráfico de barra mostrando a expressão de vários marcadores de função citotóxica intrínseca de células CART19 quando combinadas com várias concentrações de ibrutinibe.

[00179] A figura 55 é uma representação esquemática de uma estrutura experimental de modelo de camundongo in vivo para testar o efeito de CART19 e/ou ibrutinibe sobre camundongos injetados por MCL-RL, com uma leitura sendo luminescência (uma medição do número de tumor células).

[00180] A figura 56 é uma estrutura esquemática de uma estrutura experimental de modelo de camundongo in vivo para testar o efeito de CART19 e/ou ibrutinibe sobre camundongos injetados por MCL-RL, com uma leitura sendo luminescência (uma medição do número de tumor células).

[00181] A figura 57 é um grupo de gráficos mostrando a luminescência (uma medição da medição de número de célula de tumor) em camundongos tratados com ibrutinibe em concentrações diferentes e sua sobrevivência global após tratamento.

[00182] A figura 58 é um grupo de gráficos mostrando a luminescência (uma medição de número de célula de tumor) em camundongos tratados com ibrutinibe ou células CART19 bem como sua sobrevivência global após tratamento.

[00183] A figura 59 é um gráfico mostrando a luminescência (uma medição de número de célula de tumor) em camundongos após o tratamento com ibrutinibe, células não transduzidas T, ibrutinibe com células não transduzidas T, células CART19, e células CART19 com ibrutinibe.

[00184] A figura 60 é um gráfico mostrando a luminescência (uma medição de número de célula de tumor) em camundongos após o tratamento com ibrutinibe sozinho, células CART19 sozinhas, ou a combinação de ibrutinibe com células CART19.

[00185] A figura 61A é um grupo de gráficos mostrando o nível de citocinas de Th1 produzido em camundongos tratados com ibrutinibe e/ou células CART19. A figura 61B é um grupo de gráficos mostrando o nível de Th2 citocinas produzido em camundongos tratados com ibrutinibe e/ou células CART19.

[00186] A figura 61C é um gráfico mostrando a porcentagem de células expressando o marcador de proliferação Ki67 em camundongos tratados com células CART19 ou células CART19 mais ibrutinibe.

[00187] A figura 61D é um gráfico mostrando a porcentagem de células expressando o marcador antiapoptótico BCL-2 em camundongos tratados com células CART19 ou células CART19 mais ibrutinibe.

DESCRIÇÃO DETALHADA Definições

[00188] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comumemnte entendido por alguém versado na técnica a qual a invenção pertence.

[00189] O termo "um, uma (a)" e "um, uma (an)" se refere a um ou a mais do que um (isto é, a pelo menos um) do objetivo gramatical do artigo. Por meio de exemplo, "um elemento" significa um elemento ou mais do que um elemento.

[00190] O termo "cerca de" quando referindo a um valor mensurável tal como uma quantidade, uma duração temporal, e similares, pretende abranger variações de ±20% ou em alguns casos ±10%, ou em alguns casos ±5%, ou em alguns casos ±1%, ou em alguns casos ±0,1% do valor especificado, de modo que as variações sejam apropriadas para realizar os métodos descritos.

[00191] O termo "Receptor de Antígeno Quimérico" ou alternativamente a "CAR" se refere a um grupo de polipeptídeos, tipicamente dois nas modalidades mais simples, que quando em uma célula efetora imune, fornece a célula com especificamente para uma célula alvo, tipicamente uma célula de câncer, e com geração de sinal intracelular. Em algumas modalidades, um CAR compreende pelo menos um domíno de ligação de antígeno extracelular, um domínio de transmembrana e um domínio de sinalização citoplásmica (também referido aqui como "um domínio de sinalização intracelular") compreendendo um domínio de sinalização funcional derivado de uma molécula estimulatória e/ou molécula coestimulatória como definido abaixo. Em alguns aspectos, os grupos de polipeptídeos são contíguos uns aos outros, por exemplo, estão na mesma cadeia de polipeptídeo (por exemplo, compreendem uma proteína de fusão quimérica). Em algumas modalidades, os grupos de polipeptídeos não são contpiguos uns aos outros, por exemplo, são em cadeias de polipeptídeo diferentes. Em algumas modalidades, os grupos de polipeptídeos incluem uma permuta de dimerização que, na presença de uma molécula de dimerização, pode acoplar os polipeptídeos uns aos outros, por exemplo, pode acoplar um domínio de ligação de antígeno a um domínio de sinalização intracelular. Em um aspecto, a molécula estimulatória é a cadeia zeta associada com um complexo de receptor de célula T. Em um aspecto, o domínio de sinalização citoplásmica também compreende uma ou mais domínios de sinalização funcionais derivados de pelo menos uma molécula coestimulatória como definido abaixo. Em um aspecto, a molécula coestimulatória é escolhida das moléculas coestimulatórias descritas aqui, por exemplo, 4-1BB (isto é, CD137), CD27 e/ou CD28. Em um aspecto, o CAR compreende uma proteína de fusão quimérica compreendendo um domíno de ligação de antígeno extracelular, um domínio de transmembrana e um domínio de sinalização intracelular compreendendo um domínio de sinalização funcional derivado de uma molécula estimulatória. Em um aspecto, o CAR compreende uma proteína de fusão quimérica compreendendo um domíno de ligação de antígeno extracelular, um domínio de transmembrana e um domínio de sinalização intracelular compreendendo um domínio de sinalização funcional derivado de uma molécula coestimulatória e um domínio de sinalização funcional derivado de uma molécula estimulatória. Em um aspecto, o CAR compreende uma proteína de fusão quimérica compreendendo um domíno de ligação de antígeno extracelular, um domínio de transmembrana e um domínio de sinalização intracelular compreendendo dois domínios de sinalização funcionais derivados de uma ou mais molécula(s) coestimulatória e um domínio de sinalização funcional derivado de uma molécula estimulatória. Em um aspecto, o CAR compreende uma proteína de fusão quimérica compreendendo um domíno de ligação de antígeno extracelular, um domínio de transmembrana e um domínio de sinalização intracelular compreendendo pelo menos two domínios de sinalização funcionais derivados de uma ou mais molécula(s) coestimulatória e um domínio de sinalização funcional derivado de uma molécula estimulatória. Em um aspecto, o CAR compreende uma sequência líder opcional no terminal amino (N-ter) da proteína de fusão de CAR. Em um aspecto, o CAR também compreende uma sequência líder no terminal N do domínio de ligação de antígeno extracelular, em que a sequência líder é opcionalmente clivada do domínio de ligação de antígeno (por exemplo, um scFv) durante processamento e localização celular CAR à membrana celular.

[00192] O termo "domínio de ligação"se refere à porção funcional de uma proteína que age transmitindo informação dentro da célula para regular a atividade celular por meio de séries de sinalização definidas gerando segundos mensageiros ou funcionando como efetores respondendo a tais mensageiros.

[00193] Como usado aqui, o termo "CD19" se refere à proteína de Cluster de Diferenciação 19, que é um determinante antigênico detectável em células precursoras de leucemia. As sequências de aminoácido e ácido nucleico humanas e de murino podem ser encontradas em uma base de dados pública, tal como GenBank, UniProt e Swiss-Prot. Por exemplo, a sequência de aminoácido de CD19 humano pode ser encontrada como UniProt/Swiss-Prot n° de acesso P15391 e a codificação de sequência de nucleotídeo do CD19 humano pode ser encontrada no n° de acesso NM_001178098. Como usado aqui, "CD19" inclui proteínas compreendendo mutações, por exemplo, mutações de ponto, fragmentos, inserções, deleções e variantes de ligação de CD19 do tipo selvagem de tamanho natural. CD19 é expresso na maioria dos cânceres de linhagem B, incluindo, por exemplo, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica e linfoma não Hodgkin. Outras células com CD19 expresso são fornecidas abaixo na definição de "doença associada à expressão de CD19."É também um marcador precoce de progenitores de célula B. Veja, por exemplo, Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997). Em um aspecto, a porção de ligação de antígeno do CART reconhece e liga um antígeno dentro do domínio extracelular da proteína de CD19. Em um aspecto, a proteína de CD19 é expressa em uma célula de câncer.

[00194] Como usado aqui, o termo "CD20" se refere a um determinante antigênico conhecido ser detectável em células B. CD20 humano é também chamado 4 domínios que abrangem a membrana, subfamília A, membrana 1 (MS4A1). As sequências de aminoácido e ácido nucleico humanas e de murino podem ser encontradas em uma base de dados pública, tal como GenBank, UniProt e Swiss-Prot. Por exemplo, a sequência de aminoácido de CD20 humano pode ser encontrada nos Acessos Nos. NP_690605.1 e NP_068769.2, e a sequência de nucleotídeo codificando as variantes de transcrição 1 e 3 do CD20 humano pode ser encontrada no n° de Acesso NM_152866.2 e NM_021950.3, respectivamente. Em um aspecto, a porção de ligação a antígeno da CAR reconhece e liga um antígeno dentro do domínio extracelular da proteína CD20. Em um aspecto, a proteína CD20 é expressa em uma célula de câncer.

[00195] Como usado aqui, o termo "CD22," se refere a um determinante antigênico conhecido ser detectável em células precursoras de leucemia. As sequências de aminoácido e ácido nucleico humanas e de murino podem ser encontradas em uma base de dados pública, tal como GenBank, UniProt e Swiss-Prot. Por exemplo, as sequências de aminoácido de isoformas 1-5 do CD22 humano podem ser encontradas nos Acessos Nos. NP 001762.2, NP 001172028.1, NP 001172029.1, NP 001172030.1, e NP 001265346.1, respectivamente, e a sequência de nucleotídeo codificando variantes 15 do CD22 humano pode ser encontrada nos n°s de Acesso NM 001771.3, NM 001185099.1, NM 001185100.1, NM 001185101.1, e NM 001278417.1, respectivamente. Em um aspecto, a porção de ligação a antígeno do CAR reconhece e liga um antígeno dentro do domínio extracelular da proteína de CD22. Em um aspecto, a proteína CD22 é expressa em uma célula de câncer.

[00196] Como usado aqui, o termo "ROR1" se refere a um determinante antigênico conhecido ser detectável em células precursoras de leucemia. As sequências de aminoácido e ácido nucleico humanas e de murino podem ser encontradas em uma base de dados pública, tal como GenBank, UniProt e Swiss-Prot. Por exemplo, as sequências de aminoácido de isoformas 1 e 2 precursoras de ROR1 humana podem ser encontradas nos Acessos Nos. NP_005003.2 e NP_001077061.1, respectivamente, e as sequências de mRNA codificando-as podem ser encontradas nos Acessos Nos. NM_005012.3 e NM_001083592.1, respectivamente. Em um aspecto, a porção de ligação a antígeno do CAR reconhece e liga um antígeno dentro do domínio extracelular da proteína ROR1. Em um aspecto, a proteína ROR1 é expressa em uma célula de câncer.

[00197] O termo "anticorpo," como usado aqui, se refere a uma proteína, ou sequência de polipeptídeo derivada de uma molécula de imunoglobulina que especificamente se liga com um antígeno. Anticorpos podem ser imunoglobulinas policlonais ou monoclonais, de cadeias múltiplas ou simples, ou intactas, e podem ser derivados de fontes naturais ou de fontes recombinantes. Anticorpos podem ser tetrâmeros de moléculas de imunoglobulina.

[00198] O termo "fragmento de anticorpo" se refere a pelo menos uma porção de um anticorpo, que retém a capacidade de especificamente interagir com (por exemplo, por ligação, impedimento estérico, estabilização/desestabilização, distribuição espacial) um epitopo de um antígeno. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, porém não estão limitados aos fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv, fragmentos de anticorpo scFv, Fvs ligados a dissulfeto (sdFv), um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CH1, anticorpos lineares, anticorpos de único domínio tal como sdAb (ou VL ou VH), domínios VHH, anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo tal como um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos de Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de articulação, e uma CDR isolada ou outros fragmentos de ligação de epitopo de um anticorpo. Um fragmento de ligação a antígeno pode também ser incorporado nos anticorpos de único domínio, maxicorpos, minicorpos, nanocorpos, intracorpos, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, v-NAR e bis-scFv (veja, por exemplo, Hollinger e Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005). Fragmentos de ligação a antígeno também podem ser enxertados em andaimes com base em polipeptídeos, tal como uma fibronectina tipo III (Fn3) (veja a Patente dos Estados Unidos No.: 6.703.199, que descreve minicorpos de polipeptídeo de fibronectina).

[00199] O termo "scFv" se refere a uma proteína de fusão compreendendo pelo menos um fragmento de anticorpo compreendendo uma região variável de uma cadeia leve e pelo menos um fragmento de anticorpo compreendendo uma região variável de uma cadeia pesada, em que as regiões variáveis de cadeia leve e pesada são contiguamente ligadas, por exemplo, por meio de um ligante sintético, por exemplo, um ligante de polipeptídeo flexível curto, e capaz de ser expresso como um polipeptídeo de única cadeia, e em que a scFv retém a especificidade do anticorpo intacto do qual é derivado. A menos que especificado, como usado aqui uma scFv pode ter as regiões variáveis VL e VH em qualquer ordem, por exemplo, com respeito às extremidades de terminal N-terminal e terminal C do polipeptídeo, a scFv pode compreender VL-ligante-VH ou pode compreender VH-ligante-VL.

[00200] A porção da CAR da invenção compreendendo um anticorpo ou fragmento de anticorpo da mesma pode existir em uma variedade de formas onde o domínio de ligação a antígeno é expresso como parte de uma cadeia de polipeptídeo contíguo incluindo, por exemplo, um fragmento de anticorpo de único domínio (sdAb), um anticorpo de única cadeia (scFv), um anticorpo humanizado ou anticorpo biespecífico (Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nova Iorque; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). Em um aspecto, o domínio de ligação a antígeno de uma composição de CAR da invenção compreende um fragmento de anticorpo. Em outro aspecto, o CAR compreende um fragmento de anticorpo que compreende uma scFv. Os limites de sequência de aminoácido precisos de uma determinada CDR podem ser determinados usando qualquer de diversos esquemas bem conhecidos, incluindo aqueles descritos por Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest,"5a. Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Betesda, MD (esquema de numeração "Kabat"), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 (esquema de numeração "Chotia"), ou uma combinação dos mesmos.

[00201] Como usado aqui, o termo "domínio de ligação"ou "molécula de anticorpo" se refere a uma proteína, por exemplo, uma cadeia de imunoglobulina ou fragmento do mesmo, compreendendo pelo menos uma sequência de domínio variável de imunoglobulina. O termo "domínio de ligação"ou "molécula de anticorpo" abrange anticorpos e fragmento de anticorpos. Em uma modalidade, uma molécula de anticorpo é uma molécula de anticorpo multiespecífica, por exemplo, ela compreende uma pluralidade de sequências de domínio variável de imunoglobulina, em que uma primeira sequência de domínio variável de imunoglobulina da pluralidade tem especificidade de ligação para um primeiro epitopo e uma segunda sequência de domínio variável de imunoglobulina da pluralidade tem especificidade de ligação para um segundo epitopo. Em uma modalidade, uma molécula de anticorpo multiespecífico é uma molécula de anticorpo biespecífico. Um anticorpo biespecífico tem especificidade para não mais do que dois antígenos. Uma molécula de anticorpo biespecífico é caracterizada por uma primeira primeira sequência de domínio variável de imunoglobulina que tem especificidade de ligação para um primeiro epitopo e uma segunda sequência de domínio variável de imunoglobulina que tem especificidade de ligação para um segundo epitopo.

[00202] A porção da CAR da invenção compreendendo um anticorpo ou fragmento de anticorpo da mesma pode existir de uma variedade de formas onde o domínio de ligação de antígeno é expresso como parte de uma cadeia de polipeptídeo contíguo incluindo, por exemplo, um fragmento de anticorpo de único domínio (sdAb), um anticorpo de única cadeia (scFv), um anticorpo humanizado, ou anticorpo biespecífico (Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nova Iorque; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426). Em um aspecto, o domínio de ligação de antígeno de uma composição de CAR da invenção compreende um fragmento de anticorpo. Em outro aspecto, a CAR compreende um fragmento de anticorpo que compreende um scFv.

[00203] O termo "cadeia pesada de anticorpo," se refere ao maior dos dois tipos de cadeias de polipeptídeo presentes em moléculas de anticorpo em suas conformações de ocorrência natural, e que normalmente determina a classe à qual o anticorpo pertence.

[00204] O termo "cadeia leve de anticorpo," se refere ao menor dos dois tipos de cadeias de polipeptídeo presentes em moléculas de anticorpo em suas conformações de ocorrência natural. Cadeias leves kappa (K) e lambda (X) se referem aos dois maiores isótipos de cadeia leve de anticorpos.

[00205] O termo "anticorpo recombinante" se refere a um anticorpo que é gerado usando tecnologia de DNA recombinante, tal como, por exemplo, um anticorpo expresso por um bacteriófago ou sistema de expressão de levedura. O termo deve também ser construído para significar um anticorpo que foi gerado pela síntese de uma molécula de DNA codificando o anticorpo e cuja molécula de DNA expressa uma proteína de anticorpo, ou uma sequência de aminoácido especificando o anticorpo, em que o DNA ou sequência de aminoácido foi obtida usando DNA recombinante ou tecnologia de sequência de aminoácido que está disponível e bem conhecida na técnica.

[00206] O termo "antígeno" ou "Ag" se refere a uma molécula que provoca uma resposta imune. Esta resposta imune pode envolver ou a produção de anticorpo, ou a ativação de células imunologicamente competentes específicas, ou ambas. O técnico versado entenderá que qualquer macromolécula, incluindo virtualmente todas as proteínas ou peptídeos, pode servir como um antígeno. Além disso, antígenos podem ser derivados de DNA recombinante ou genômico. Um técnico versado entenderá que qualquer DNA, que compreende uma sequência de nucleotídeo ou uma sequência de nucleotídeo parcial codificando uma proteína que elicia uma resposta imune, portanto, codifica um "antígeno" como aquele termo é usado aqui. Além disso, alguém versado na técnica entenderá que um antígeno não necessita ser codificado apenas por uma sequência de nucleotídeo de tamanho natural de um gene. É facilmente evidente que a presente invenção inclui, porém não está limitada a, o uso de sequências de nucleotídeo parciais de mais de um gene e que estas sequências de nucleotídeo são dispostas em várias combinações para codificar polipeptídeos que eliciam a resposta imune desejada. Além disso, um técnico versado entenderá que um antígeno não necessita ser codificado por um "gene" absolutamente. É facilmente evidente que um antígeno pode ser gerado sintetizado ou pode ser derivado de uma amostra biológica, ou pode ser macromolécula, além de um polipeptídeo. Tal amostra biológica pode incluir, porém não está limitada a uma amostra de tecido, uma amostra de tumor, uma célula ou um fluido com outros componentes biológicos.

[00207] O termo "efeito anticâncer"se refere a um efeito biológico que pode ser manifestado de várias maneiras, incluindo, porém não limitadas a, por exemplo, um decréscimo em volume de tumor, um decréscimo no número de células de câncer, um decréscimo no número de metástases, um aumento em expectativa de vida, decréscimo em proliferação de célula cancerígena, decréscimo em sobrevivência de célula cancerígena, ou melhora de vários sintomas fisiológicos associados com a condição cancerosa. Um "efeito anticâncer"pode também ser manifestado pela capacidade dos peptídeos, polinucleotídeos, células e anticorpos em prevenção da ocorrência de câncer em primeiro lugar. O termo "efeito antitumor" se refere a um efeito biológico que pode ser manifestado por vários métodos, incluindo, porém não limitados a, por exemplo, um decréscimo em volume de tumor, um decréscimo no número de células de tumor, um decréscimo em proliferação de célula de tumor, ou um decréscimo em sobrevivência de célula de tumor.

[00208] O termo "autólogo"se refere a qualquer material derivado do mesmo indivíduo ao qual ele deve ser posteriormente reintroduzido.

[00209] O termo "alogênico"se refere a qualquer material derivado de um diferente animal da mesma espécie do indivíduo ao qual o material é introduzido. Dois ou mais indivíduos são ditos ser alogênicos a um outro quando os genes em uma ou mais locos não são idênticos. Em alguns aspectos, material alogênico de indivíduos da mesma espécie pode ser suficientemente diferente geneticamente para interagir antigenicamente.

[00210] O termo "xenogênico"se refere a um enxerto derivado de um animal de uma diferente espécie.

[00211] O termo "câncer"se refere a uma doença caracterizada pelo crescimento descontrolado de células aberrantes. Células cancerígenas podem disseminar-se localmente ou através da corrente sanguínea e sistema linfático para outras partes do corpo. Exemplos de vários cânceres são descritos aqui e incluem, porém não estão limitados a, câncer de mama, câncer de próstata, câncer ovariano, câncer cervical, câncer de pele, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer renal, câncer hepático, câncer cerebral, linfoma, leucemia, câncer de pulmão e similares. Os termos "tumor" e "câncer" são usados alternadamente aqui, por exemplo, ambos os termos abrangem tumores sólidos e líquidos, por exemplo, difusos ou circulantes. Como usado aqui, o termo "câncer"ou "tumor" inclui cânceres e tumores pré-malignos, bem como malignos.

[00212] A frase "doença associada com a expressão de CD19" inclui, porém não está limitada a, uma doença associada com a expressão de CD19 ou condição associada com células que expressam, ou em algum momento expressou, CD19 incluindo, por exemplo, doenças proliferativas tal como um câncer ou malignidade ou uma condição pré- cancerosa tal como uma mielodisplasia, uma síndrome mielodisplásica ou uma pré-leucemia; ou uma indicação não relacionada com câncer associada com células que expressam CD19. Para evitar dúvida, uma doença associada com a expressão de CD19 pode incluir uma condição associada com células que não expressam presentemente CD19, por exemplo, porque a expressão de CD19 foi sub-regulada, por exemplo, devido ao tratamento com uma molécula alvejando CD19, por exemplo, um CD19 CAR, porém que em um momento expressou CD19. Em um aspecto, um câncer associado com a expressão de CD19 é um câncer hematológico. Em um aspecto, o câncer hematológico é uma leucemia ou um linfoma. Em um aspecto, um câncer associado com a expressão de CD19 inclui cânceres e malignidades incluindo, porém não limitados a, por exemplo, uma ou mais leucemias agudas incluindo, porém não limitadas a, por exemplo, leucemia linfoide aguda de célula B (BALL), leucemia linfoide aguda de célula T (TALL), leucemia linfoide aguda (ALL); uma ou mais leucemias crônicas incluindo, porém não limitadas a, por exemplo, leucemia mielogenosa crônica (CML), Leucemia Linfoide Crônica (CLL). Cânceres adicionais ou condições hematológicas associadas com a expressão de CD19 compreendem, porém não são limitadas a, por exemplo, leucemia pró-linfocítica de célula B, neoplasma de célula dendrítica plasmacitoide blástica, linfoma de Burkitt, linfoma de célula B grande difusa, linfoma folicular, leucemia de célula capilar, linfoma de célula folicular grande ou célula pequena, condições linfoproliferativas malignas, linfoma de MALT, linfoma de célula de revestimento (MCL), linfoma de zona marginal, mieloma múltiplo, mielodisplasia e síndrome mielodisplásica, linfoma não Hodgkin, linfoma de Hodgkin, linfoma plasmablástico, neoplasma de célula dendrítica plasmacitoide, macroglobulinemia Waldenstrom, e "pré-leucemia"que são uma coleção diversificada de condições hematológicas unidas pela produção ineficaz (ou displasia) de células sanguíneas mieloides, e similares. Outras doenças associadas com a expressão de expressão de CD19 incluem, porém não limitadas a, por exemplo, cânceres atípicos e/ou não clássicos, malignidades, condições pré-cancerosas ou doenças proliferativas associadas com a expressão de CD19. Indicações não relacionadas com o câncer, associadas com a expressão de CD19 incluem, porém não estão limitadas a, por exemplo, doença autoimune, (por exemplo, lúpus), distúrbios inflamatórios (alergia e asma) e transplante. Em algumas modalidades, as células expressando antígeno de tumor expressam, ou em algum momento expressaram, mRNA codificando o antígeno de tumor. Em uma modalidade, células expressando antígeno de tumor produzem a proteína de antígeno de tumor (por exemplo, tipo selvagem ou mutante), e a proteína de antígeno de tumor pode estar presente em níveis normais ou níveis reduzidos. Em uma modalidade, células expressando antígeno de tumor produziram níveis detectáveis de uma proteína de antígeno de tumor em um ponto, e subsequentemente não produziram substancialmente nenhuma proteína de antígeno de tumor detectável.

[00213] A frase "doença associada com a expressão de um antígeno de célula B" inclui, porém não está limitada a, uma doença associada com a expressão de um ou mais de CD19, CD20, CD22 ou ROR1, ou a condição associada com células que expressam, ou em algum momento expressaram, um ou mais de CD19, CD20, CD22 ou ROR1, incluindo, por exemplo, doenças proliferativas tal como um câncer ou malignidade ou uma condição pré-cancerosa, tal como uma mielodisplasia, uma síndrome mielodisplásica ou uma pré-leucemia; ou uma indicação não relacionada com câncer associada com células que expressam um ou mais de CD19, CD20, CD22 ou ROR1. Para evitar dúvida, uma doença associada com a expressão de antígeno de célula B pode incluir uma condição associada com células que no momento não expressam o antígeno de célula B, por exemplo, por que a expressão de antígeno foi sub-regulada, por exemplo, devido a tratamento com uma molécula alvejando o antígeno de célula B, por exemplo, um CAR alvejando célula B, porém que em um momento expressou o antígeno. A frase "doença associada com a expressão de um antígeno de célula B" inclui uma doença associada com a expressão de CD19, como descrito aqui.

[00214] O termo "modificações de sequência conservativa" se refere a modificações de aminoácido que não afetam significantemente ou alteram as características de ligação do anticorpo ou fragmento de anticorpo contendo a sequência de aminoácido. Tais modificações conservativas incluem substituições, adições e deleções de aminoácido. As modificações podem ser introduzidas em um anticorpo ou fragmento de anticorpo da invenção por técnicas padrões conhecidas na arte, tal como mutagênese direcionada ao sítio e mutagênese mediada por PCR. Substituições de aminoácido conservativas são aquelas em que o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Desse modo, um ou mais resíduos de aminoácido dentro de um CAR da invenção podem ser substituídos por outros resíduos de aminoácido da mesma família de cadeia lateral e o CAR alterado pode ser testado usando os ensaios funcionais descritos aqui.

[00215] O termo "estimulação,"se refere a uma resposta primária induzida por ligação de uma molécula estimulatória (por exemplo, um complexo de TCR/CD3 ou CAR) com seu ligante cognato (ou antígeno de tumor no caso de um CAR) desse modo mediando um evento de transdução de sinal, tal como, porém não limitado a, transdução de sinal por meio do complexo TCR/CD3 ou transdução de sinal por meio dos domínios de sinalização ou receptor de NK apropriados do CAR. A estimulação pode mediar a expressão alterada de determinadas moléculas.

[00216] O termo "molécula estimulatória,"se refere a uma molécula expressa por uma célula imune (por exemplo, célula T, célula NK, célula B) que fornece a(s) sequência(s) de sinalização citoplásmica(s) que regulam a ativação da célula imune de uma maneira estimulatória durante pelo menos algum aspecto da série de reação de sinalização de célula imune. Em um aspecto, o sinal é um sinal primário que é iniciado, por exemplo, por ligação de um complexo de TCR/CD3 com uma molécula MHC carregada com peptídeo, e que leva à mediação de uma resposta de célula T, incluindo, porém não limitados a, proliferação, ativação, diferenciação, e similares. Uma sequência de sinalização citoplásmica primária (também referida como um "domínio de sinalização primário") que age de uma maneira estimulatória pode conter um motivo de sinalização que é conhecido como motivo de ativação com base em tirosina imunorreceptora ou ITAM. Exemplos de uma sequência de sinalização citoplásmica contendo ITAM, que é de particular uso na invenção, incluem, porém não estão limitados a, aqueles derivados de CD3 zeta, FcR gama comum (FCER1G), Fc gama RIIa, FcR beta (Fc Épsilon R1b), CD3 gama, CD3 delta, CD3 épsilon, CD79a, CD79b, DAP10, e DAP12. Em um CAR específico da invenção, o domínio de sinalização intracelular em qualquer um ou mais CARS da invenção compreende uma sequência de sinalização intracelular, por exemplo, uma sequência de sinalização primária de CD3-zeta. Em um específico CAR da invenção, a sequência de sinalização primária de CD3-zeta é a sequência fornecida como SEQ ID NO: 17, ou os resíduos equivalentes de uma espécie não humana, por exemplo, camundongo, roedor, macaco (monkey), macaco (ape) e similares. Em um específico CAR da invenção, a sequência de sinalização primária de CD3-zeta é a sequência como fornecido na SEQ ID NO: 43, ou os resíduos equivalentes de uma espécie não humana, por exemplo, camundongo, roedor, macaco (monkey), macaco (ape) e similares.

[00217] O termo "célula apresentando antígeno"ou "APC" se refere a uma célula de sistema imune tal como uma célula acessória (por exemplo, uma célula B, uma célula dendrítica, e similares) que apresenta um antígeno estranho complexado com complexos de histocompatibilidade maior (MHC's) sobre sua superfície. Células T podem reconhecer estes complexos usando seus receptores de célula T (TCRs). APCs processam antígenos e os apresentam a células T.

[00218] Um "domínio de sinalização intracelular," como o termo é usado aqui, se refere a uma porção intracelular de uma molécula. O domínio de sinalização intracelular gera um sinal que promove uma função efetora imune da célula contendo CAR, por exemplo, uma célula de CART. Exemplos de função efetora imune, por exemplo, em uma célula de CART, incluem atividade citolítica e atividade auxiliar, incluindo a secreção de citocinas.

[00219] Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular pode compreender um domínio de sinalização intracelular primário. Exemplos de domínios de sinalização intracelulares primários incluem aqueles derivados das moléculas responsáveis para estimulação primária, ou simulação dependente de antígeno. Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular pode compreender um domínio intracelular coestimulatório. Exemplos de domínios de sinalização intracelulares coestimulatórios incluem aqueles derivados de moléculas responsáveis pelos sinais coestimulatórios, ou estimulação independente de antígeno. Por exemplo, no caso de um CART, um domínio de sinalização intracelular primário pode compreender uma sequência citoplásmica de um receptor de célula T, e um domínio de sinalização intracelular coestimulatório pode compreender sequência citoplásmica de correceptor ou molécula coestimulatória.

[00220] Um domínio de sinalização intracelular primário pode compreender um motivo de sinalização que é conhecido como um motivo de ativação com base em tirosina imunorreceptor ou ITAM. Exemplos de sequências de sinalização citoplásmica primárias contendo ITAM incluem, porém não estão limitados àqueles derivados de CD3 zeta, FcR gama comum (FCER1G), Fc gama RIIa, FcR beta (Fc Epsilon R1b), CD3 gama, CD3 delta, CD3 épsilon, CD79a, CD79b, DAP10, e DAP12.

[00221] O termo "zeta" ou alternativamente "cadeia zeta", "CD3-zeta" ou "TCR-zeta"é definido como uma proteína fornecida como GenBan Acc. No. BAG36664.1, ou os resíduos equivalentes de uma espécie não humana, por exemplo, camundongo, roedor, macaco (monkey), macaco (ape) e similares, e um "domínio estimulatório zeta" ou alternativamente um "domínio estimulatório CD3-zeta" ou um "domínio estimulatório TCR-zeta"é definido como os resíduos de aminoácido do domínio citoplásmico da cadeia zeta, ou derivados funcionais dos mesmos, que são suficientes para funcionalmente transmitir um sinal inicial necessário para ativação de célula T. Em um aspecto, o domínio citoplásmico de zeta compreende resíduos 52 a 164 de GenBank Acc. No. BAG36664.1 ou os resíduos equivalentes de uma espécie não humana, por exemplo, camundongo, roedor, macaco (monkey), macaco (ape) e similares, que são ortólogos funcionais dos mesmos. Em um aspecto, o "domínio estimulatório zeta" ou um "domínio estimulatório CD3-zeta"é a sequência fornecida como SEQ ID NO:17. Em um aspecto, o "domínio estimulatório zeta" ou um "domínio estimulatório CD3-zeta"é a sequência fornecida como SEQ ID NO:43.

[00222] O termo "molécula coestimulatória"se refere ao parceiro de ligação cognato em uma célula T que especificamente se liga com um ligante coestimulatório, desse modo mediando uma resposta coestimulatória pela célula T, tal como, porém não limitada à proliferação. Moléculas coestimulatórias são moléculas de superfície celular diferentes de receptores de antígeno ou seus ligantes que são contribuição para uma resposta imune eficiente. Moléculas coestimulatórias incluem, porém não estão limitadas a uma molécula MHC classe I, BTLA e um receptor de ligante Toll, bem como OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18) , ICOS (CD278), e 4-1BB (CD137). Outros exemplos de tais moléculas coestimulatórias incluem CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8alpha, CD8beta, IL2R beta, IL2R gama, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, e um ligante que especificamente se liga com CD83.

[00223] Um domínio de sinalização intracelular coestimulatório pode ser a porção intracelular de uma molécula coestimulatória. Uma molécula coestimulatória pode ser representada nas seguintes famílias de proteína: proteínas receptoras de THF, proteínas tipo imunoglobulina, receptores de citocina, integrinas, moléculas de ativação linfocítica de sinalização (proteínas SLAM), e receptores de célula NK de ativação. Exemplos de tais moléculas incluem CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, ICAM-1, antígeno-1 associado à função de linfócito (LFA-1), CD2, CDS, CD7, CD287, LIGHT, NKG2C, NKG2D, SLAMF7, NKp80, NKp30, NKp44, NKp46, CD160, B7-H3, e um ligante que especificamente se liga com CD83, e similares.

[00224] O domínio de sinalização intracelular pode compreender a porção intracelular inteira, ou o domínio de sinalização intracelular nativo inteiro, da molécula da qual é derivado, ou um fragmento funcional ou derivado do mesmo.

[00225] O termo "4-1BB" se refere a uma membrana da superfamília de TNFR com uma sequência de aminoácido fornecida como GenBank Acc. No. AAA62478.2, ou os resíduos equivalentes de uma espécie não humana, por exemplo, camundongo, roedor, macaco (monkey), macaco (ape) e similares; e um "domínio coestimulatório 4-1BB"é definido como resíduos de aminoácido 214-255 de GenBank accno. AAA62478.2, ou os resíduos equivalentes de uma espécie não humana, por exemplo, camundongo, roedor, macaco (monkey), macaco (ape) e similares. Em um aspecto, o "domínio coestimulatório 4-1BB"é uma sequência fornecida como SEQ ID NO:16 ou os resíduos equivalentes de uma espécie não humana, por exemplo, camundongo, roedor, macaco (monkey), macaco (ape) e similares.

[00226] "Células efetoras imunes," quando esse termo é usado aqui, se refere a uma célula que é envolvida em uma resposta imune, por exemplo, na promoção de uma resposta efetora imune. Exemplos de células efetoras imunes incluem células T, por exemplo, células T alfa/beta e células T gama/delta, células B, células exterminadoras naturais (NK), células T exterminadoras naturais (NKT), mastócitos, e fagócitos mieloicos-derivados.

[00227] "Função efetora imune ou resposta efetora imune," quando esse termo é usado aqui, se refere à função ou resposta, por exemplo, de uma célula efetora imune, que realça ou promove um ataque imune de uma célula alvo. Por exemplo, uma função ou resposta efetora imune se refere a uma propriedade de uma célula T ou NK que promove a morte ou a inibição de crescimento ou proliferação, de uma célula alvo. No caso de uma célula T, estimulação e coestimulação primária são exemplos de função ou resposta efetora imune.

[00228] O termo "codificando" se refere à propriedade inerente de sequências específicas de nucleotídeos em um polinucleotídeo, tal como um gene, um cDNA, ou um mRNA, para servir como padrões para a síntese de outros polímeros e macromoléculas em processos biológicos tendo ou uma sequência definida de nucleotídeos (por exemplo, rRNA, tRNA e mRNA) ou uma sequência definida de aminoácidos e as propriedades biológicas que resultam dela. Desse modo, um gene, cDNA, ou RNA, codifica uma proteína se a transcrição e translação de mRNA que corresponde àquele gene produz a proteína em uma célula ou outro sistema biológico. Tanto o filamento de codificação, a sequência de nucleotídeo do qual é idêntica à sequência de mRNA e é geralmente fornecida nas listagens de sequência, quanto o filamento de não codificação, usado como o padrão para transcrição de um gene ou cDNA, podem ser referidos como codificando a proteína ou outro produto daquele gene ou cDNA.

[00229] A menos que de outro modo especificado, uma "sequência de nucleotídeo codificando uma sequência de aminoácido"inclui todas as sequências de nucleotídeo que são versões degeneradas uma da outra e que codificam a mesma sequência de aminoácido. A frase sequência de nucleotídeo que codifica uma proteína ou um RNA pode também incluir íntrons para a extensão em que a sequência de nucleotídeo codificando a proteína pode em alguma versão conter um íntron.

[00230] O termo "quantidade efetiva" ou "quantidade terapeuticamente efetiva"é usado alternadamente aqui, e se refere a uma quantidade de um composto, formulação, material, ou composição, como descrito aqui efetivo para obter um resultado biológico particular.

[00231] O termo "endógeno"se refere a qualquer material de ou produzido dentro de um organismo, célula, tecido ou sistema.

[00232] O termo "exógeno"se refere a qualquer material introduzido de ou produzido foram de um organismo, célula, tecido ou sistema.

[00233] O termo "expressão"se refere à transcrição e/ou translação de uma sequência de nucleotídeo particular direcionada por um promotor.

[00234] O termo "vetor de transferência"se refere a uma composição de substância que compreende um ácido nucleico isolado e que pode ser usado para liberar o ácido nucleico isolado para o interior de uma célula. Numerosos vetores são conhecidos na técnica incluindo, porém não limitados a, polinucleotídeos lineares, polinucleotídeos associados com compostos iônicos ou anfifílicos, plasmídeos, e viroses. Desse modo, o termo "vetor de transferência"inclui um plasmídeo de replicação autonomamente ou um vírus. O termo deve também ser construído para também incluir compostos não virais e não plasmídeo que facilitam a transferência de ácido nucleico para dentro das células, tal como, por exemplo, um composto de polilisina, lipossoma, e similares. Exemplos de vetores de transferência viral incluem, porém não estão limitados a vetores adenovirais, vetores virais adeno- associados, vetores retrovirais, vetores lentivirais, e similares.

[00235] O termo "vetor de expressão"se refere a um vetor compreendendo um polinucleotídeo recombinante compreendendo sequências de controle de expressão operativamente ligadas a uma sequência de nucleotídeo a ser expressa. Um vetor de expressão compreende suficientes elementos de ação cis para expressão; outros elementos para expressão podem ser fornecidos pela célula hospedeira ou em um sistema de expressão in vitro. Vetores de expressão incluem todos aqueles conhecidos na técnica, incluindo cosmídeos, plasmídeos (por exemplo, nus ou contidos em lipossomas) e viroses (por exemplo, lentiviroses, retroviroses, adenoviroses, e viroses adeno-associadas) que incorporam o polinucleotídeo recombinante.

[00236] O termo "lentivírus"se refere a um gênero da família Retroviridae. Lentiviroses são as únicas entre as retroviroses a ser capazes de infectar células não divisíveis; elas podem liberar uma quantidade significante de informação genética no DNA da célula hospedeira, então elas são um dos métodos mais eficientes de um vetor de liberação de gene. HIV, SIV, e FIV são todos os exemplos de lentiviroses.

[00237] O termo "vetor lentiviral" se refere a um vetor derivado de pelo menos uma porção de um genoma de lentivírus, incluindo especialmente um vetor lentiviral auto-inativante como fornecido em Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009). Outros exemplos de vetores de lentivírus, que podem ser usados na clínica, incluem, porém não estão limitados a, por exemplo, a tecnologia de liberação de gene LENTIVECTOR® de Oxford BioMedica, o sistema vetor LENTIMAX™ de Lentigen e similares. Tipos não clínicos de vetores lentivirais estão também disponíveis e seriam conhecidos por alguém versado na técnica.

[00238] O termo "homólogo"ou "identidade" se refere à identidade de sequência de subunidade entre duas moléculas poliméricas, por exemplo, entre duas moléculas de ácido nucleico, tais como, duas moléculas de DNA ou duas moléculas de RNA, ou entre duas moléculas de polipeptídeo. Quando uma posição de subunidade em ambas as duas moléculas é ocupada pela mesma subunidade monomérica; por exemplo, se uma posição em cada de duas moléculas de DNA for ocupada por adenina, então elas são homólogas ou idênticas nessa posição. A homologia entre duas sequências é uma função direta do número de pareamentos ou posições homólogas; por exemplo, se metade (por exemplo, cinco posições em um polímero de dez subunidades de comprimento) das posições em duas sequências são homólogas, as duas sequências são 50% homólogas; se 90% das posições (por exemplo, 9 de 10), são pareadas ou homólogas, as duas sequências são 90% homólogas.

[00239] Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos das mesmas (tal como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subseqüências de ligação a antígeno de anticorpos) que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Para a maior parte, anticorpos humanizados e fragmentos de anticorpo dos mesmos são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor ou fragmento de anticorpo) em que resíduos de uma região de determinação complementar (CDR) do receptor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato ou coelho, tendo a especificidade, afinidade, e capacidade desejada. Em alguns casos, os resíduos de região de estrutura Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, um anticorpo humanizado/fragmento de anticorpo pode compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo receptor, nem nas sequências de estrutura ou CDR importadas. Estas modificações também podem refinar e otimizar o desempenho de anticorpo ou fragmento de anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo do mesmo compreenderá substancialmente todos ou pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões de CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou uma significante porção das regiões de FR são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo pode também compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para outros detalhes, veja Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992.

[00240] "Totalmente humana" se refere a uma imunoglobulina, tal como um anticorpo ou fragmento de anticorpo, onde a molécula inteira é de origem humana ou consiste em uma sequência de aminoácido idêntica a uma forma humana do anticorpo ou imunoglobulina.

[00241] O termo "isolado" significa alterado ou removido do estado natural. Por exemplo, um ácido nucleico ou um peptídeo naturalmente presente em um animal vivo não é "isolado,"porém, o mesmo ácido nucleico ou peptídeo parcialmente ou completamente separado dos materiais coexistentes de seu estado natural é "isolado." Um ácido nucleico isolado ou proteína pode existir em forma substancialmente purificada, ou pode existir em um ambiente não nativo, tal como, por exemplo, uma célula hospedeira.

[00242] No contexto da presente invenção, as seguintes abreviações para as bases de ácido nucleico de ocorrência comum são usadas. "A" se refere à adenosina, "C" se refere à citosina, "G" se refere à guanosina, "T" se refere à timidina, e "U" se refere à uridina.

[00243] O termo "operavelmente ligado" ou "controle transcricional" se refere à ligação funcional entre uma sequência regulatória e uma sequência de ácido nucleico heteróloga resultando em expressão da última. Por exemplo, uma primeira sequência de ácido nucleico é operavelmente ligada com uma segunda sequência de ácido nucleico quando a primeira sequência de ácido nucleico é colocada em uma ligação funcional com a segunda sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor é operavelmente ligado a uma sequência de codificação se o promotor afetar a transcrição ou expressão da sequência de codificação. Sequências de DNA operavelmente ligadas podem ser contíguas entre si e, por exemplo, onde necessário para unir duas regiões de codificação de proteína, estão na mesma estrutura de leitura.

[00244] O termo administração "parenteral" de uma composição imunogênica inclui, por exemplo, injeção subcutânea (s.c.), intravenosa (i.v.), intramuscular (i.m.), ou intraesternal, intratumoral, ou técnicas de infusão.

[00245] O termo "ácido nucleico" ou "polinucleotídeo"se refere a ácidos deoxirribonucleicos (DNA) ou ácidos ribonucleicos (RNA) e polímeros dos mesmos em forma de filamento único ou duplo. A menos que especificamente limitado, o termo abrange ácidos nucleicos contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação similares ao ácido nucleico de referência e são metabolizados de uma maneira similar aos nucleotídeos de ocorrência natural. A menos de outro modo indicado, uma sequência de ácido nucleico particular também implicitamente abrange variantes conservativamente modificadas da mesma (por exemplo, substituições de códon degeneradas), alelos, ortólogos, SNPs, e sequências complementares, bem como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, substituições de códon degeneradas podem ser obtidas gerando sequências nas quais a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída por resíduos de base mista e/ou deoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); e Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

[00246] Os termos "peptídeo,""polipeptídeo,"e "proteína" são usados alternadamente, e se referem a um composto compreendido de resíduos de aminoácido covalentemente ligados por ligações de peptídeo. Uma proteína ou peptídeo deve conter pelo menos dois aminoácidos, e nenhuma lsimulação é colocada sobre o número máximo de aminoácidos que pode compreender uma sequência de proteína ou peptídeo. Os polipeptídeos incluem qualquer peptídeo ou proteína compreendendo dois ou mais aminoácidos ligados entre si por ligações de peptídeo. Como usado aqui, o termo se refere tanto a cadeias curtas, que também comumente são referidas na técnica como peptídeos, oligopeptídeos e oligômeros, por exemplo, quanto a cadeias maiores, que geralmente são referidas na técnica como proteínas, das quais existem muitos tipos. "Polipeptídeos"incluem, por exemplo, fragmentos biologicamente ativos, polipeptídeos substancialmente homólogos, oligopeptídeos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipeptídeos, polipeptídeos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusão, entre outros. Um polipeptídeo inclui um peptídeo natural, um peptídeo recombinante, ou uma combinação dos mesmos.

[00247] O termo "promotor" se refere a uma sequência de DNA reconhecida pelo mecanismo sintético da célula, ou mecanismo sintético introduzido, requerido para iniciar a transcrição específica de uma sequência de polinucleotídeo.

[00248] O termo "sequência promotora / regulatória"se refere a uma sequência de ácido nucleico que é requerida para expressão de um produto de gene operavelmente ligado à sequência promotora/regulatória. Em alguns casos, esta sequência pode ser a sequência promotora núcleo e em outros casos, esta sequência pode também incluir uma sequência realçadora e outros elementos regulatórios que são requeridos para expressão do produto de gene. A sequência promotora / regulatória pode, por exemplo, pode ser uma que expressa o produto de gene de uma maneira específica de tecido.

[00249] O termo promotor "constitutivo" se refere a uma sequência de nucleotídeo que, quando operavelmente ligada com um polinucleotídeo que codifica ou especifica um produto de gene, causa o produto de gene ser produzido em célula sob a maioria ou todas as condições fisiológicas da célula.

[00250] O termo promotor "induzível"se refere a uma sequência de nucleotídeo que, quando operavelmente ligada com um polinucleotídeo que codifica ou especifica um produto de gene, causa o produto de gene ser produzido em uma célula substancialmente apenas quando um indutor que corresponde ao promotor está presente na célula.

[00251] O termo promotor "específico de tecido" se refere a uma sequência de nucleotídeo que, quando operavelmente ligada com um polinucleotídeo codificado ou especificado por um gene, causa o produto de gene ser produzido em uma célula substancialmente apenas se a célula for uma célula do tipo de tecido correspondente ao promotor.

[00252] O termo "ligante de polipeptídeo flexível"ou "ligante" como usado no contexto de uma scFv se refere a um ligante de peptídeo que consiste em aminoácidos, tal como resíduos de glicina e/ou serina usados sozinhos ou em combinação, para ligar regiões de cadeia pesada variável e leve variável uma a outra. Em uma modalidade, o ligante de polipeptídeo flexível é um ligante de Gly/Ser e compreende a sequência de aminoácido (Gly-Gly-Gly-Ser)n, onde n é um número inteiro positivo igual a ou maior do que 1. Por exemplo, n=1, n=2, n=3. n=4, n=5 e n=6, n=7, n=8, n=9 e n=10 (SEQ ID NO:105). Em uma modalidade, os ligantes de polipeptídeo flexível incluem, porém não estão limitados à (Gly4 Ser)4 (SEQ ID NO:106) ou (Gly4 Ser)3 (SEQ ID NO:107). Em outra modalidade, os ligantes incluem múltiplas repetições de (Gly2Ser), (GlySer) ou (Gly3Ser) (SEQ ID NO:108). São também incluídos no escopo da invenção, ligantes descritos no WO 2012/138475, incorporado aqui por referência).

[00253] Como usado aqui, um tamponamento 5'(também denominado um tamponamento de RNA, um tamponamento de 7- metilguanosina de RNA ou um tamponamento RNA m7G) é um nucleotídeo de guanina modificado que foi adicionado a "frente" ou extremidade 5' de um RNA mensageiro eucariótico imediatamente após o início de transcrição. O tamponamento 5' que consiste em um grupo terminal que é ligado ao primeiro nucleotídeo transcrito. Sua presença é crítica para reconhecimento pela ribossoma e proteção de RNases. A adição de tamponamento é acoplada à transcrição, e ocorre cotranscricionalmente, de modo que cada um influencie o outro. Imediatamente após o início de transcrição, a extremidade 5' do mRNA sendo sintetizada é ligada por um complexo de sintetização da extremidade associado com RNA polimerase. Este complexo enzimático catalisa as reações químicas que são requeridas para tamponamento de mRNA. A síntese prossegue como uma reação bioquímica de múltiplas etapas. A porção de tamponamento pode ser modificada para modular a funcionalidade de mRNA, tal como sua estabilidade ou eficiência de translação.

[00254] Como usado aqui, "RNA transcrito in vitro" se refere a um RNA, preferivelmente mRNA, que foi sintetizado in vitro. Geralmente, o RNA transcrito in vitroé gerado de um vetor de transcrição in vitro. O vetor de transcrição in vitro compreende um padrão que é usado para gerar o RNA transcrito in vitro.

[00255] Como usado aqui, um "poli(A)"é uma série de adenosinas ligadas por poliadenilação ao mRNA. Na modalidade preferida de uma construção para expressão transitória, o poliA é entre 50 e 5000 (SEQ ID NO: 109), preferivelmente maior do que 64, mais preferivelmente maior do que 100, mais preferivelmente maior do que 300 ou 400. Sequências poli(A) podem ser modificadas quimicamente ou enzimaticamente para modular a funcionalidade de mRNA, tal como localização, estabilidade ou eficiência de translação.

[00256] Como usado aqui, "poliadenilação"se refere à ligação covalente de uma porção de poliadenilila, ou sua variante modificada, a uma molécula de RNA mensageiro. Em organismos eucarióticos, a maioria das moléculas de RNA mensageiro (mRNA) é poliadenilada na extremidade 3'. A cauda 3' poli(A) é uma sequência longa de nucleotídeos de adenina (frequentemente diversas centenas) adicionada ao pré-mRNA através da ação de uma enzima, poliadenilato polimerase. Em eucariotas maiores, a cauda poli(A) é adicionada sobre transcrições que contêm uma sequência específica, o sinal de poliadenilação. A cauda poli(A) e a proteína ligada a ela auxiliam na proteção de mRNA de degradação por exonucleases. Poliadenilação é também importante para terminação de transcrição, exportação do mRNA do núcleo, e translação. A poliadenilação ocorre no núcleo imediatamente após a transcrição de DNA em RNA, porém adicionalmente pode também ocorrer posteriormente no citoplasma. Após a transcrição ter sido terminada, a cadeia de mRNA é clivada por meio da ação de um complexo de endonuclease associado com RNA polimerase. O sítio de clivagem é geralmente caracterizado pela presença da sequência de base AAUAAA próxima do sítio de clivagem. Após o mRNA ter sido clivado, resíduos de adenosina são adicionados a extremidade 3' livre no sítio de clivagem.

[00257] Como usado aqui, "transitória"se refere à expressão de um transgene não integrado durante um período de horas, dias ou semanas, em que o período de tempo de expressão é menor do que o período de tempo para a expressão do gene se integrado no genoma ou contido em um réplicon de plasmídeo estável na célula hospedeira.

[00258] O termo "série de reação de transdução de sinal" se refere à ligação bioquímica entre uma variedade de moléculas de transdução de sinal que desempenham um papel na transmissão de um sinal de uma porção de uma célula para outra porção de uma célula. A frase "receptor de superfície celular" inclui moléculas e complexos de moléculas capazes de receber um sinal e transmitir sinal através da membrana de uma célula.

[00259] O termo "indivíduo" é destinado a incluir organismos vivos em que uma resposta imune pode ser eliciada (por exemplo, mamíferos, humano).

[00260] O termo, uma célula "substancialmente purificada" se refere a uma célula que é essencialmente livre de outros tipos celulares. Uma célula substancialmente purificada também se refere a uma célula que foi separada de outros tipos celulares com os quais ela é normalmente associada em seu estado de ocorrência natural. Em alguns casos, umas populações de célula substancialmente purificadas se refere a uma população homogênea de células. Em outros casos, este termo se refere simplesmente à célula que foi separada das células com as quais é naturalmente associada em seus estados naturais. Em alguns aspectos, as células são cultivadas in vitro. Em outros aspectos, as células não são cultivadas in vitro.

[00261] O termo "terapêutico", como usado aqui, significa um tratamento. Um efeito terapêutico é obtido por redução, supressão, remissão, ou erradicação de um estado de doença.

[00262] O termo "profilaxia", como usado aqui, significa a prevenção de tratamento protetivo para uma doença ou estado de doença.

[00263] No contexto da presente invenção, "antígeno de tumor" ou "antígeno de distúrbio hiperproliferativo" ou "antígeno associado com um distúrbio hiperproliferativo" se refere a antígenos que são comuns a distúrbios hiperproliferativos específicos. Em certos aspectos, os antígenos de distúrbio hiperproliferativo da presente invenção são derivados de, cânceres incluindo, porém não limitados a melanoma primário ou metastático, timoma, linfoma, sarcoma, câncer de pulmão, câncer hepático, linfoma não Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias, câncer uterino, câncer cervical, câncer de bexiga, câncer de rim e adenocarcinomas, tal como câncer de mama, câncer de próstata, câncer ovariano, câncer pancreático, e similares.

[00264] O termo "transfectado" ou "transformado" ou "transduzido" se refere a um processo pelo qual o ácido nucleico exógeno é transferido ou introduzido na célula hospedeira. Uma célula "transfectada" ou "transformada" ou "transduzida"é aquela que foi transfectada, transformada ou transduzida com ácido nucleico exógeno. A célula inclui a célula objeto primária e sua descendência.

[00265] O termo "especificamente se liga," se refere a um anticorpo, ou um ligante, que reconhece e se liga com uma proteína de parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno de tumor estimulatório) presente em uma amostra, porém cujo anticorpo ou ligante substancialmente não reconhece ou se liga a outras moléculas na amostra.

[00266] "Receptor de antígeno quimérico regulável (RCAR)," quando esse termo é usado aqui, se refere a um grupo de polipeptídeos, tipicamente dois nas modalidades mais simples, que quando em uma célula RCARX, fornece a célula RCARX com especificidade para uma célula alvo, tipicamente uma célula de câncer, e com geração regulável de sinal intracelular ou proliferação, que pode otimizar uma propriedade efetora imune da célula RCARX. Uma célula RCARX conta com, pelo menos em parte, um domínio de ligação de antígeno para fornecer especificidade a uma célula alvo que compreende o antígeno ligado pelo domínio de ligação de antígeno. Em uma modalidade, um RCAR inclui uma comutação de dimerização que, na presença de uma molécula de dimerização, pode acoplar um domínio de sinalização intracelular ao domínio de ligação de antígeno.

[00267] "Âncora de membrana" ou "domínio de amarração de membrana", quando esse termo é usado aqui, se refere a um polipeptídeo ou porção, por exemplo, um grupo miristoíla, suficiente para ancorar um domínio extracelular ou intracelular à membrana plasmática.

[00268] "Domínio de comutação,"quando esse termo é usado aqui, por exemplo, quando se referindo a um RCAR, se refere a uma entidade, tipicamente uma entidade com base em polipeptídeo, que, na presença de uma molécula de dimerização, associa-se com outro domínio de comutação. A associação resulta em um acoplamento funcional de uma primeira entidade ligada a, por exemplo, fundida a, um primeiro domínio comutador, e uma segunda entidade ligada a, por exemplo, fundida a, um segundo domínio comutador. Um primeiro e segundo domínio de comutação são coletivamente referidos como uma comutação de dimerização. Em modalidades, o primeiro e segundo domínios de comutação são iguais entre si, por exemplo, eles são polipeptídeos tendo a mesma sequência de aminoácido primária, e são referidos coletivamente como uma comutação de homodimerização. Em modalidades, o primeiro e segundo domínios de comutação são diferentes um do outro, por exemplo, eles são polipeptídeos tendo diferentes sequências de aminoácido primárias, e são referidas coletivamente como uma comutação de heterodimerização. Em modalidades, a comutação é intracelular. Em modalidades, a comutação é extracelular. Em modalidades, o domínio de comutação é uma entidade com base em polipeptídeo, por exemplo, FKBP ou com base em FRB, e a molécula de dimerização é molécula pequena, por exemplo, um rapálogo. Em modalidades, o domínio de comutação é uma entidade com base em polipeptídeo, por exemplo, uma scFv que liga um peptídeo myc, e a molécula de dimerização é um polipeptídeo, um fragmento do mesmo, ou um multímero de um polipeptídeo, por exemplo, um ligante myc ou multímeros de um ligante myc que se liga a uma ou mais scFvs de myc. Em modalidades, o domínio de comutação é uma entidade com base em polipeptídeo, por exemplo, receptor de myc, e a molécula de dimerização é um anticorpo ou fragmentos do mesmo, por exemplo, anticorpo myc.

[00269] "Molécula de dimerização,"quando esse termo é usado aqui, por exemplo, quando se referindo a um RCAR, se refere a uma molécula que promove a associação de um primeiro domínio comutador com um segundo domínio comutador. Em modalidades, a molécula de dimerização não ocorre naturalmente no indivíduo, ou não ocorre em concentrações que resultariam em significante dimerização. Em modalidades, a molécula de dimerização é uma molécula pequena, por exemplo, rapamicina ou um rapálogo, por exemplo, RAD001.

[00270] O termo "bioequivalente" se refere a uma quantidade de um agente diferente do composto de referência (por exemplo, RAD001), requerido para produzir um efeito equivalente ao efeito produzido pela dose de referência ou quantidade de referência do composto de referência (por exemplo, RAD001). Em uma modalidade o efeito é o nível de inibição de mTOR, por exemplo, como medido por inibição de P70 S6 cinase, por exemplo, como avaliado em um ensaio in vivo ou in vitro, por exemplo, como medido por um ensaio descrito aqui, por exemplo, o ensaio Boulay, ou medição de níveis de S6 fosforilado por western blot. Em uma modalidade, o efeito é a alteração da relação de células T de PD-1 positivo / PD-1 negativo, como medido por classificação celular. Em uma modalidade uma quantidade bioequivalente ou dose de um inibidor de mTOR é a quantidade ou dose que obtém o mesmo nível de inibição de P70 S6 cinase como faz a dose de referência ou quantidade de referência de um composto de referência. Em uma modalidade, uma quantidade ou dose bioequivalente de um inibidor de mTOR é a quantidade ou dose que obtém o mesmo nível de alteração em uma relação de células T de PD- 1 positivo / PD-1 negativo como faz a dose de referência ou quantidade de referência de um composto de referência.

[00271] O termo "dose baixa, de realce imune" quando usado em conjunto com um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor de mTOR alostérico, por exemplo, RAD001 ou rapamicina, ou um inibidor de mTOR catalítico, se refere a uma dose de inibidor de mTOR que parcialmente, porém não totalmente, inibe a atividade de mTOR, por exemplo, como medido pela inibição de atividade de P70 S6 cinase. Métodos para a avaliação da atividade de mTOR, por exemplo, por inibição de P70 S6 cinase, são descritos aqui. A dose é insuficiente para resultar em completa supressão imune, porém é suficiente para realçar a resposta imune. Em uma modalidade, a dose baixa, de realce imune, de inibidor de mTOR resulta em um decréscimo no número de células T de PD-1 positivo e/ou um aumento no número de células T de PD-1 negativo, ou um aumento em uma relação de células T PD-1 negativo / células T de PD-1 positivo. Em uma modalidade, a dose baixa, de realce imune, de inibidor de mTOR resulta em um aumento no número de células T naive. Em uma modalidade, a dose baixa, de realce imune, de inibidor de mTOR resulta em um ou mais dos seguintes:

[00272] um aumento na expressão de um ou mais dos seguintes marcadores: CD62Lhigh, CD127high, CD27+, e BCL2, por exemplo, em células T de memória, por exemplo, precursores de célula T de memória;

[00273] um decréscimo na expressão de KLRG1, por exemplo, em células T de memória, por exemplo, precursores de célula T de memória; e

[00274] um aumento no número de precursores de célula T de memória, por exemplo, células com qualquer uma ou uma combinação das seguintes características: CD62Lelevado aumentado, CD127elevado aumentado, CD27+ aumentado, KLRG1 diminuído, e BCL2 aumentado;

[00275] em que qualquer das mudanças descritas acima ocorre, por exemplo, pelo menos transitoriamente, por exemplo, quando comparado a um indivíduo não tratado.

[00276] "Refratária", como usado aqui, se refere a uma doença, por exemplo, câncer, que não responde a um tratamento. Em modalidades, um câncer refratário pode ser resistente a um tratamento antes ou no início do tratamento. Em outras modalidades, o câncer refratário pode tornar-se refratário durante um tratamento.

[00277] Um "responsivo completo", como usado aqui, se refere a um indivíduo tendo uma doença, por exemplo, um câncer, que exibe uma resposta completa, por exemplo, uma remissão completa, a um tratamento. Uma resposta completa pode ser identificada, por exemplo, usando os critérios Cheson como descrito aqui.

[00278] Um "responsivo parcial", como usado aqui, se refere a um indivíduo tendo uma doença, por exemplo, um câncer, que exibe uma resposta parcial, por exemplo, uma remissão parcial, a um tratamento. Uma resposta parcial pode ser identificada, por exemplo, usando os critérios Cheson.

[00279] Um "não responsivo", como usado aqui, se refere a um indivíduo tendo a doença, por exemplo, um câncer, que não exibe uma resposta a um tratamento, por exemplo, o paciente tem doença estável ou doença progressiva. Um não responsivo pode ser identificado, por exemplo, usando os critérios Cheson como descrito aqui.

[00280] O termo "reincidência", como usado aqui, se refere ao reaparecimento de uma doença (por exemplo, câncer) após um período inicial de responsividade (por exemplo, resposta completa ou resposta parcial). O período inicial de responsividade pode envolver o nível de células cancerígenas que se incluem abaixo de um determinado limite, por exemplo, abaixo de 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, ou 1%. O reaparecimento pode envolver o nível de células cancerígenas que surgem acima de um determinado limite, por exemplo, acima de 20%, 1%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, ou 1%. A reincidência pode ser identificada, por exemplo, usando os critérios Cheson, como descrito aqui.

[00281] Faixas: em toda esta descrição, vários aspectos da invenção podem ser apresentados em um formato de faixa. Deve ser entendido que a descrição em formato de faixa é meramente para conveniência e brevidade e não deve construída como uma lsimulação inflexível no escopo da invenção. Consequentemente, a descrição de uma faixa deve ser considerada ter especificamente descritas todas as sub-faixas possíveis, bem como valores numéricos individuais dentro dessa faixa. Por exemplo, a descrição de uma faixa, tal como de 1 a 6 deve ser considerada ter especificamente descritas sub-faixas, tais como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., bem como números individuais dentro dessa faixa, por exemplo, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, e 6. Como outro exemplo, uma faixa, tal como 95 a 99% de identidade, inclui algo com 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade, e inclui sub- faixas tais como 96-99%, 96-98%, 96-97%, 97-99%, 97-98% e 98-99% de identidade. Isto se aplica independente da amplitude da faixa.

Descrição

[00282] São fornecidas aqui composições de matéria e métodos de uso para o tratamento de uma doença tal como câncer (por exemplo, cânceres hematológicos ou outras malignidades de célula B) usando células efetoras imunes (por exemplo, células T ou células NK) que expressam um receptor de antígeno quimérico (CAR) (por exemplo, um CAR que alveja um marcador de célula B, tal como CD19). Os métodos incluem, entre outras coisas, administrar células efetoras imunes (por exemplo, células T ou células NK) expressando um CAR alvejando célula B descrito aqui em combinação com outro agente tal como um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de cinase descrito aqui.

[00283] A presente invenção fornece, pelo menos em parte, experimentos suportando a eficácia elevada de uma combinação de uma terapia com CAR (por exemplo, uma terapia de alvejamento de célula B com CAR) e um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe. A combinação de um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe, com uma terapia com CAR pode aumentar a eficácia da terapia de combinação relativa a uma monoterapia do inibidor de cinase, ou uma dose de células expressando CAR, ou ambos. Estes efeitos benéficos podem, por exemplo, permitir uma dose menor do inibidor de cinase ou das células expressando CAR, ou ambos, ao mesmo tempo em que mantendo a eficácia. Os resultados são aplicáveis a uma ampla variedade de cânceres, por exemplo, cânceres hematológicos e outras malignidades de célula B. Por exemplo, ibrutinibe inibe BTK, que é elevado na maioria dos linfomas. Uma célula efetora imune (por exemplo, célula T ou célula NK) que expressa CAR19 alvejando cânceres com expressão de superfície de CD19, que é expressa na maioria das malignidades de célula B. Alternativamente ou em combinação com CAR19, qualquer outro CAR alvejando célula B (por exemplo, um CAR alvejando uma ou mais de: CD20, CD22, ou ROR1) pode ser usada nas terapias de combinação descritas aqui. Portanto, a combinação de uma terapia com CAR (por exemplo, uma ou mais de terapia com CAR de CD19, CAR de CD20, CAR de CD22 ou CAR de ROR1) com um inibidor de BTK (por exemplo, ibrutinibe) é adequada para o tratamento de uma ampla faixa de cânceres envolvendo a superproliferação de células B, incluindo linfomas (por exemplo, linfoma de Hodgkin), MCL, CLL, DLBCL, e mieloma múltiplo.

[00284] De acordo com a presente invenção, ibrutinibe pode reduzir massas de tumor e mobiliza células B neoplásicas no sangue periférico (veja, por exemplo, Exemplo 8 aqui). Sem desejar ficar preso à teoria, certos linfomas, tal como MCL, são caracterizados por massas de células cancerosas em centros de proliferação em linfonodos. Células efetoras imunes expressando CAR algumas vezes têm dificuldade em penegrar estas massas densamente embaladas. Desse modo, um inibidor de BTK, tal como ibrutinibe, pode reduzir massas de tumor e mobilizar as células B neoplásicas no sangue periférico, tornando as células de linfoma mais vulneráveis às células expressando CAR.

[00285] Alternativamente ou em combinação, inibidores de BTK, tal como ibrutinibe, também podem afetar as células expressando CAR. A presente invenção demonstra que o tratamento com ibrutinibe aumenta o nível de células CART19 circulantes (veja, por exemplo, os dados mostrados no Exemplo 8). Sem desejar ficar preso à teoria, o aumento no nível de células CART19 circulantes pode ser um resultado de, por exemplo, proliferação aumentada, alteração de fenótipo de célula T, ou outros fatores. Por exemplo, ibrutinibe pode inibir ITK, uma cinase com homologia a BTK. ITK é expresso em células T, e sua inibição pode alterar o fenótipo de célula T. Tratamento com um inibidor de cinase, tal como ibrutinibe, pode alterar o fenótipo de célula T de um fenótipo de Th2 a um fenótipo de Th1, e desse modo a cpacidade proliferativa de célula T. Pré-tratamento, ou coadministração, a um indivíduo, de um inibidor de BTK pode aumentar a capacidade proliferativa da célula T no indivíduo, desse modo, aumentando o nível de células circulantes expressando CAR. Além disso, um indivíduo pré-tratado com um inibidor de BTK, por exemplo, ibrutinibe, pode ter uma população de célula T com uma capacidade proliferativa elevada em sua aférese para fabricação de CAR.

[00286] Em um aspecto, a invenção fornece diversos receptores de antígeno quiméricos (CAR) compreendendo um anticorpo ou fragmento de anticorpo criado para ligação específica a um antígeno de célula B (por exemplo, escolhido de um ou mais de CD19, CD20, CD22 ou ROR1 protein). Em um aspecto, a invenção fornece uma célula (por exemplo, célula T) criada para expressar um CAR, em que a célula T de CAR ("CART") exibe uma propriedade anticâncer. Em um aspecto, uma célula é transformada com o CAR e o CAR é expresso em uma superfície celular. Em algumas modalidades, a célula (por exemplo, célula T) é transduzida com um vetor viral codificando um CAR. Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor retroviral. Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor lentiviral. Em algums tais modalidades, a célula pode estavelmente expressar o CAR. Em outra modalidade, a célula (por exemplo, célula T) é transfectada com um ácido nucleico, por exemplo, mRNA, cDNA, DNA, codificando um CAR. Em algums tais modalidades, a célula pode transitoriamente expressar o CAR.

[00287] Em um aspecto, a porção de ligação de proteína anti-CD19 do CAR é um fragmento de anticorpo de scFv. Em um aspecto, tais fragmentos de anticorpo são funcionais pelo fato de que eles mantêm a afinidade de ligação equivalente, por exemplo, eles ligam o mesmo antígeno com afinidade comparável, como o anticorpo de IgG do qual ele é derivado. Em um aspecto, tais fragmentos de anticorpo são funcionais pelo fato de que eles fornecem uma resposta biológica que pode incluir, porém não está limitada à ativação de uma resposta imune, inibição de originação de transdução de sinal de seu antígeno alvo, inibição de atividade de cinase, e similares, como será entendido pelo técnico versado. Em um aspecto, o domínio de ligação de antígeno anti- CD19 do CAR é um fragmento de anticorpo de scFv que é humanizado em comparação com a sequência de murino do scFv do qual ele é derivado. Em um aspecto, a sequência de scFv de murino parental é a construção de CAR19 fornecida na publicação de PCT WO2012/079000 (incorporada aqui por referência) e fornecida aqui como SEQ ID NO:59. Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 é um scFv descrito no WO2012/079000 e fornecido na SEQ ID NO:59.

[00288] Em alguns aspectos, os anticorpos da invenção são incorporados em um receptor de antígeno quimérico (CAR). Em um aspecto, o CAR compreende a sequência de polipeptídeo fornecida como SEQ ID NO: 12 na publicação de PCT WO2012/079000, e fornecida aqui como SEQ ID NO: 58, em que o domínio de scFv é substituído por uma ou mais sequências selecionadas de SEQ ID NOS: 1-12. Em um aspecto, os domínios de scFv de SEQ ID NOS:1-12 são variantes humanizadas do domínio de scFv de SEQ ID NO:59, que é um fragmento de scFV de origem de murino que especificamente liga um CD19 humano. A humanização deste scFv de camundongo pode ser desejada para o ajuste clínico, onde os resíduos específicos de camundongo podem induzir uma resposta de antígeno anticamundongo humano (HAMA) em pacientes que recebem tratamento com CART19, por exemplo, tratamento com células T transduzidas com a construção de CAR19.

[00289] Em um aspecto, o domínio de ligação anti-CD19, por exemplo, scFv humanizado, porção de um CAR da invenção é codificada por um transgene cuja sequência foi otimizada por códon para expressão em uma célula mamífera. Em um aspecto, a contrução de CAR completa da invenção é codificada por um transgene cuja sequência completa foi otimizada por códon para expressão em uma célula mamífera. A otimização por códon se refere à constatação de que a frequência de ocorrência se códons sinônimos (isto é, códons que codificam o mesmo aminoácido) na codificação de DNA é enviasada em diferentes espécies. Tal degeneração de códon permite um polipeptídeo idêntico ser codificado por uma variedade de sequências de nucleotídeo. Uma variedade de métodos de otimização de códon é conhecida na técnica, e incluem, por exemplo, métodos descritos em pelo menos Patentes dos Estados Unidos númerous 5.786.464 e 6.114.148.

[00290] Em um aspecto, o CAR19 humanizado compreende a porção de scFv fornecida na SEQ ID NO:1. Em um aspecto, o CAR19 humanizado compreende a porção de scFv fornecida na SEQ ID NO:2. Em um aspecto, o CAR19 humanizado compreende a porção de scFv fornecida na SEQ ID NO:3. Em um aspecto, o CAR19 humanizado compreende a porção de scFv fornecida na SEQ ID NO:4. Em um aspecto, o CAR19 humanizado compreende a porção de scFv fornecida na SEQ ID NO:5. Em um aspecto, o CAR19 humanizado compreende a porção de scFv fornecida na SEQ ID NO:6. Em um aspecto, o CAR19 humanizado compreende a porção de scFv fornecida na SEQ ID NO:7. Em um aspecto, o CAR19 humanizado compreende a porção de scFv fornecida na SEQ ID NO:8. Em um aspecto, o CAR19 humanizado compreende a porção de scFv fornecida na SEQ ID NO:9. Em um aspecto, o CAR19 humanizado compreende a porção de scFv fornecida na SEQ ID NO:10. Em um aspecto, o CAR19 humanizado compreende a porção de scFv fornecida na SEQ ID NO:11. Em um aspecto, o CAR19 humanizado compreende a porção de scFv fornecida na SEQ ID NO:12.

[00291] Em um aspecto, os CARs da invenção combinam um domínio de ligação de antígeno de um anticorpo específico com uma molécula de sinalização intracelular. Por exemplo, em alguns aspectos, a molécula de sinalização intracelular inclui, porém não está limitada à cadeia CD3-zeta, moléculas de sinalização de 4-1BB e CD28 combinações das mesmas. Em um aspecto, o CAR de CD19 compreende um CAR selecionado da sequência fornecida em uma ou mais de SEQ ID NOS: 31 - 42. Em um aspecto, o CAR de CD19 compreende a sequência fornecida em SEQ ID NO:31. Em um aspecto, o CAR de CD19 compreende a sequência fornecida em SEQ ID NO:32. Em um aspecto, o CAR de CD19 compreende a sequência fornecida em SEQ ID NO:33. Em um aspecto, o CAR de CD19 compreende a sequência fornecida em SEQ ID NO:34. Em um aspecto, o CAR de CD19 compreende a sequência fornecida em SEQ ID NO:35. Em um aspecto, o CAR de CD19 compreende a sequência fornecida em SEQ ID NO:36. Em um aspecto, o CAR de CD19 compreende a sequência fornecida em SEQ ID NO:37. Em um aspecto, o CAR de CD19 compreende a sequência fornecida em SEQ ID NO:38. Em um aspecto, o CAR de CD19 compreende a sequência fornecida em SEQ ID NO:39. Em um aspecto, o CAR de CD19 compreende a sequência fornecida em SEQ ID NO:40. Em um aspecto, o CAR de CD19 compreende a sequência fornecida em SEQ ID NO:41. Em um aspecto, o CAR de CD19 compreende a sequência fornecida em SEQ ID NO:42.

[00292] Além disso, a presente invenção fornece composições de CAR de CD19 e seu uso em medicamentos ou métodos para tratamento de, entre outras doenças, câncer ou qualquer malignidade ou doenças autoimunes envolvendo células ou tecidos que expressam CD19.

[00293] Em um aspecto, o CAR da invenção pode ser usado para erradicar células normais expressando CD19, desse modo aplicável para uso como uma terapia de condicionamento celular antes do transplante celular. Em um aspecto, a célula normal expressando CD19 é uma célula-tronco expressando CD19 e um transplante de célula é um transplante de célula-tronco.

[00294] Em um aspecto, a invenção fornece uma célula (por exemplo, célula T) criada para expressar um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que a célula expressando CAR, por exemplo, célula T de CAR ("CART"), exibe uma propriedade anticâncer. Um antpigeno preferido é CD19. Em um aspecto, o domínio de ligação de antígeno do CAR compreende um fragmento de anticorpo anti-CD19 parcialmente humanizado. Em um aspecto, o domínio de ligação de antígeno do CAR compreende um fragmento de anticorpo anti-CD19 parcialmente humanizado compreendendo um scFv. Consequentemente, a invenção fornece um CD19-CAR que compreende um domínio de ligação anti-CD19 humanizado e é criada em uma célula efetora imune, por exemplo, uma célula T ou uma célula NK, e métodos de seu uso para terapia adotiva.

[00295] Em um aspecto, o CAR de CD19 compreende pelo menos um domínio intracelular selecionado do grupo de um domínio de sinalização de CD13 (4-1BB), um domínio de sinalização de CD28, um domínio de sinal de CD3 zeta, e qualquer combinação dos mesmos. Em um aspecto, o CAR de CD19 compreende pelo menos um domínio de sinalização intracelular é de uma ou mais moléculas coestimulatórias diferentes de um CD137 (4-1BB) ou CD28.

Receptor de Antígeno Quimérico (CAR)

[00296] A presente invenção abrange uma construção de DNA recombinante compreendendo sequences codificando um CAR, em que o CAR compreende um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga especificamente a um antígeno de célula B (por exemplo, CD19, por exemplo, CD19 humano), em que a sequência do fragmento de anticorpo é contígua com e na mesma estrutura na mesma estrutura de leitura como uma sequência de ácido nucleico codificando um domínio de sinalização intracelular. O domínio de sinalização intracelular pode compreender um domínio de sinalização coestimulatório e/ou um domínio de sinalização primária, por exemplo, uma cadeia zeta. O domínio de sinalização coestimulatório se refere a uma porção do CAR compreendendo pelo menos uma porção do domínio intracelular de uma molécula coestimulatória. Em uma modalidade, o domínio de ligação de antígeno é um anticorpo de murino ou fragmento de anticorpo descrito aqui. Em uma modalidade, o domínio de ligação de antígeno é um anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo.

[00297] Em aspectos específicos, uma construção de CAR da invenção compreende um domínio de scFv selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOS:1-12 ou um domínio de scFv de SEQ ID NO:59, em que o scFv pode ser precedido por uma sequência líder opcional tal como fornecido na SEQ ID NO: 13, e seguido por uma sequência de articulação opcional tal como fornecida na SEQ ID NO:14 ou SEQ ID NO:45 ou SEQ ID NO:47 ou SEQ ID NO:49, uma região de transmembrana tal como fornecida na SEQ ID NO:15, um domínio de sinalização intracelular que inclui SEQ ID NO:16 ou SEQ ID NO:51 e uma sequência de CD3 zeta que inclui SEQ ID NO:17 ou SEQ ID NO:43, em que os domínios são contíguos com e na mesma estrutura de leitura para formar uma proteína de fusão simples. É também incluída na invenção uma sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo de cada um dos fragmentos de scFv selecionados do grupo que consiste em SEQ é NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ é NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 e SEQ ID NO:59. É também incluída na invenção uma sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo de cada um dos fragmentos de scFv selecionados do grupo que consiste em SEQ é NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ é NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 e SEQ ID NO:59, e each of the domains de SEQ ID NOS: 13-17, mais a proteína de fusão de CAR de CD19 codificada da invenção. Em um aspecto, construções exemplares de CAR de CD19 compreendem uma sequência líder opcional, um domíno de ligação de antígeno extracelular, uam articulação, um domínio de transmembrana, e um domínio estimulatório intracelular. Em um aspecto, uma construção de CAr de CD19 exemplar compreende uma sequência líder opcional, um domíno de ligação de antígeno extracelular, uma articulação, um domínio de transmembrana, um domínio coestimulatório intracelular e um domínio estimulatório intracelular. Construções de CAR de CD19 específicas contendo domínios humanizados de scFv da invenção são fornecidas como SEQ ID NOS: 31-42, ou um dompinio de scFv de murino as fornecida como SEQ ID NO:59.

[00298] Sequências de CAR de tamanho natural são também fornecidas aqui como SEQ ID NOS: 31-42 e 58, como mostrado na tabela 7 e Tabela 3.

[00299] Uma sequência líder exemplar é fornecida como SEQ ID NO: 13. Uma sequência de articulação/espaçadora exemplar é fornecida como SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO:45 ou SEQ ID NO:47 ou SEQ ID NO:49. Uma sequência de domínio de transmembrana exemplar é fornecida como SEQ ID NO:15. Uma sequência exemplar do domínio de sinalização intracelular da proteína 4-1BB é fornecida como SEQ ID NO: 16. Uma sequência exemplar do domínio de sinalização intracelular de CD27 é fornecida como SEQ ID NO:51. Uma sequência de domínio de y CD3zeta exemplar é fornecida como SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO:43.

[00300] Em um aspecto, a presente invenção abrange uma construção de ácido nucleico recombinante compreendendo uma molécula do ácido nucleico codificando um CAR, em que a molécula de ácido nucleico compreende a sequência de ácido nucleico codificando um domínio de ligação anti-CD19, por exemplo, descrito aqui, que é contíguo com e na mesma estrutura de leitura como uma sequência de ácido nucleico codificando um domínio de sinalização intracelular. Em um aspecto, o domínio de ligação anti-CD19 é selecionado de uma ou mais de SEQ ID NOS:1-12 e 58. Em um aspecto, o domínio de ligação anti-CD19 é codificado pelos resíduos de nucleotídeo 64 a 813 da sequência fornecida em uma ou mais de SEQ ID NOS:61-72 e 59. Em um aspecto, o domínio de ligação anti-CD19 é codificado pelos resíduos de nucleotídeo 64 a 813 de SEQ ID NO:61. Em um aspecto, o domínio de ligação anti-CD19 é codificado pelos resíduos de nucleotídeo 64 a 813 de SEQ ID NO:62. Em um aspecto, o domínio de ligação anti-CD19 é codificado pelos resíduos de nucleotídeo 64 a 813 de SEQ ID NO:63. Em um aspecto, o domínio de ligação anti-CD19 é codificado pelos resíduos de nucleotídeo 64 a 813 de SEQ ID NO:64. Em um aspecto, o domínio de ligação anti-CD19 é codificado pelos resíduos de nucleotídeo 64 a 813 de SEQ ID NO:65. Em um aspecto, o domínio de ligação anti-CD19 é codificado pelos resíduos de nucleotídeo 64 a 813 de SEQ ID NO:66. Em um aspecto, o domínio de ligação anti-CD19 é codificado pelos resíduos de nucleotídeo 64 a 813 de SEQ ID NO:67. Em um aspecto, o domínio de ligação anti-CD19 é codificado pelos resíduos de nucleotídeo 64 a 813 de SEQ ID NO:68. Em um aspecto, o domínio de ligação anti-CD19 é codificado pelos resíduos de nucleotídeo 64 a 813 de SEQ ID NO:69. Em um aspecto, o domínio de ligação anti-CD19 é codificado pelos resíduos de nucleotídeo 64 a 813 de SEQ ID NO:70. Em um aspecto, o domínio de ligação anti-CD19 é codificado pelos resíduos de nucleotídeo 64 a 813 de SEQ ID NO:71. Em um aspecto, o domínio de ligação anti-CD19 é codificado pelos resíduos de nucleotídeo 64 a 813 de SEQ ID NO:72.

[00301] Em um aspecto, a presente invenção abrange uma construção de ácido nucleico recombinante compreendendo um transgene codificando um CAR, em que a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de ácido nucleico codificando um domínio de ligação anti-CD19 selecionada de uma ou mais de SEQ ID NOS:61- 72, em que a sequência é contigua com e na mesma estrutura de leitura como a sequência de ácido nucleico codificando um domínio de sinalização intracelular. Um dompinio de sinalização intracelular exemplar que pode ser usado no CAR inclui, porém não está limitado à, um ou mais domínios de sinalização intracelular de, por exemplo, CD3- zeta, CD28, 4-1BB, e similares. Em alguns casos, o CAR pode compreender qualquer combinação de CD3-zeta, CD28, 4-1BB, e similares. Em um aspecto, a sequência de ácido nucleico de uma construção de CAR da invenção é selecionada de uma ou mais de SEQ ID NOS:85-96. Em um aspecto, a sequência de ácido nucleico de uma construção de CAR é SEQ ID NO:85. Em um aspecto, a sequência de ácido nucleico de uma construção de CAR é SEQ ID NO:86. Em um aspecto, a sequência de ácido nucleico de uma construção de CAR é SEQ ID NO:87. Em um aspecto, a sequência de ácido nucleico de uma construção de CAR é SEQ ID NO:88. Em um aspecto, a sequência de ácido nucleico de uma construção de CAR é SEQ ID NO:89. Em um aspecto, a sequência de ácido nucleico de uma construção de CAR é SEQ ID NO:90. Em um aspecto, a sequência de ácido nucleico de uma construção de CAR é SEQ ID NO:91. Em um aspecto, a sequência de ácido nucleico de uma construção de CAR é SEQ ID NO:92. Em um aspecto, a sequência de ácido nucleico de uma construção de CAR é SEQ ID NO:93. Em um aspecto, a sequência de ácido nucleico de uma construção de CAR é SEQ ID NO:94. Em um aspecto, a sequência de ácido nucleico de uma construção de CAR é SEQ ID NO:95. Em um aspecto, a sequência de ácido nucleico de uma construção de CAR é SEQ ID NO:96. Em um aspecto, a sequência de ácido nucleico de uma construção de CAR é SEQ ID NO:97. Em um aspecto, a sequência de ácido nucleico de uma construção de CAR é SEQ ID NO:98. Em um aspecto, a sequência de ácido nucleico de uma construção de CAR é SEQ ID NO:99.

[00302] A sequência de ácidos nucleicos codificando as moléculas desejadas pode ser obtida usando métodos recombinantes conhecidos na técnica, tal como, por exemplo, analisando as bibliotecas de células expressando o gene, derivando o gene de um vetor conhecido incluir o mesmo, ou isolando diretamente de células e tecidos contendo o mesmo, usando técnicas padrões. Alternativamente, o ácido nucleico de interesse pode ser sinteticamente produzido, em vez de clonado.

[00303] A presente invenção inclui construçõesde vetor retroviral e lentiviral expressando um CAR que pode ser diretamente transduzido em uma célula.

[00304] A presente invenção também inclui uma construção de RNA que pode ser diretamente transferida em uma célula. Um método para geração de mRNA para uso em transfecção envolve transcrição in vitro (IVT) de um modelo com iniciadores especialmente designados, seguido por adição de poliA, para produzir uma construção contendo sequência não trasladada 3’ e 5’ ("UTR"), um tamponamento 5’ e/ou Sítio de Entrada de Ribossoma Interno (IRES), o ácido nucleico a ser expresso, e uma cauda de poliA, tipicamente 50-2000 bases em comprimento (SEQ ID NO:118). RNA assim produzido pode efecientemente transfectar diferentes espécies de células. Em uma modalidade, o modelo inclui sequências para o car CAR. Em uma modalidade, um vetor de CAR de RNA é transduzido em uma célula T por eletroporação.

Domínio de Ligação de Antígeno

[00305] Em um aspecto, o CAR da invenção compreende um elemento de ligação específico de alvo de outro modo referido como as um domínio de ligação de antígeno. A escolha de porção depende do tipo e número de ligantes que definem a superfície de uma célula alvo. Por exemplo, o domínio de ligação de antígeno pode ser escolhido para reconhecer um ligante que age como um marcador de superfície celular em células alvo associadas com um estado de doença particular. Desse modo, exemplos de marcadores de superfície que podem agir como ligantes para o domínio de ligação de antígeno em um CAR da invenção incluem aqueles associados com infecções virais, bacterianas e parasíticas, doença autoimune e células de câncer.

[00306] Em um aspecto, a resposta de célula T mediada por CAR pode estar direcionada a um antígeno de interesse por meio de criação de um domínio de ligação de antígeno que especificamente liga um antígeno desejado no CAR.

[00307] Em um aspecto, a porção do CAR compreendendo o domínio de ligação de antígeno compreende um domínio de ligação de antígeno que alveja CD19. Em um aspecto, o domínio de ligação de antígeno alveja o CD19 humano. Em um aspecto, o domínio de ligação de antígeno do CAR tem a mesma especificidade de ligação ou uma como o fragmento de scFV de FMC63 descrito no Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997). Em uma modalidade, o domínio de ligação de antígeno do CAR inclui the fragmento de scFV descrito no Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997).

[00308] O domínio de ligação de antígeno pode ser qualquer domínio que se liga ao antígeno incluindo, porém não limitadas a um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo de murino, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, e um fragmento funcional dos mesmos, incluindo, porém não limitadas a um anticorpo de domínio simples tal como um domínio variável de cadeia pesada (VH), um domínio variável de cadeia (VL) e um domínio variável (VHH) de nanocorpo derivado de camelídeo, e a um andaime negativo conhecido na técnica funcionar como domínio de ligação de antígeno , tal como um domínio de fibronectina recombinante, e similares.

[00309] Em uma modalidade, a molécula de CAR compreende um domínio de ligação anti-CD19 compreendendo uma ou mais (por exemplo, todas as três) região determinante complementar de cadeia leve 1 (CDR1 de LC), região determinante complementar de cadeia leve 2 (CDR2 de LC), e região determinante complementar de cadeia leve 3 (CDR3 de LC) de um domínio de ligação anti-CD19 descrito aqui, e uma ou mais (por exemplo, todas as três) região determinante complementar de cadeia pesada 1 (CDR1 de HC), região determinante complementar de cadeia pesada 2 (CDR2 de HC), e região determinante complementar de cadeia pesada 3 (CDR3 de HC) de um domínio de ligação anti-CD19 descrito aqui, por exemplo, um domínio de ligação anti-CD19 compreendendo um ou mais, por exemplo, todos os três, CDRs de LC e um ou mais, por exemplo, todos os três, CDRs de HC. Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 compreende uma ou mais (por exemplo, todas as três) região determinante complementar de cadeia pesada 1 (CDR1 de HC), região determinante complementar de cadeia pesada 2 (CDR2 de HC), e região determinante complementar de cadeia pesada 3 (CDR3 de HC) de um domínio de ligação anti-CD19 descrito aqui, por exemplo, o domínio de ligação anti- CD19 tem duas regiões de cadeia pesada variáveis, cada compreendendo um CDR1 de HC,um CDR2 de HC e um CDR3 de HC descrito aqui. Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 compreende uma região variável de cadeia leve descrito aqui (por exemplo, na tabela 7) e/ou uma região variável de cadeia pesada de murino descrita aqui (por exemplo, na tabela 7). Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 é um scFv compreendendo uma cadeia leve de murino e uma cadeia pesada de murino de uma sequência de aminoácido de tabela 7. Em uma modalidade, o domínio de ligação anti- CD19 (por exemplo, um scFv) compreende: uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos uma, duas ou três modificações (por exemplo, substituições), porém não mais do que 30, 20 ou 10 modificações (por exemplo, substituições) de uma sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia leve fornecida na tabela 7, ou uma sequência com 95 a 99% de identidade com uma sequência de aminoácido de tabela 7; e/ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos uma, duas, ou três modificações (por exemplo, substituições), porém não mais do que 30, 20 ou 10 modificações (por exemplo, substituições) de uma sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia pesada fornecida na tabela 7, ou uma sequência com 95 a 99% de identidade a uma sequência de aminoácido de tabela 7. Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 compreende uma sequência de SEQ ID NO:59, ou uma sequência com 95-99% de identidade da mesma. Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 é um scFv, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita aqui, por exemplo, na tabela 7, é ligada a uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita aqui, por exemplo, na tabela 7, por meio de um ligante, por exemplo, um ligante descrito aqui. Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 inclui um ligante de (Gly4-Ser)n, em que n é 1, 2, 3, 4, 5, ou 6, preferivemente 3 ou 4 (SEQ ID NO: 53). A região variável de cadeia leve e região variável de cadeia pesada de um scFv pode ser, por exemplo, em qualquer uma das seguintes orientações: região variável de cadeia pesada de ligante de região variável de cadeia leve ou região variável de cadeia leve de ligante de região variável de cadeia pesada.

[00310] Em alguns casos, é benéfico para o domínio de ligação de antígeno ser derivado da mesma espécie na qual o CAR finalmente será usado. Por exemplo, para uso em humanos, pode ser benéfico para o domínio de ligação de antígeno do CAR compreender resíduos humanos ou humanizados quanto o domínio de ligação de antígeno de um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

[00311] Desse modo, em um aspecto, o domínio de ligação de antígeno compreende um anticorpo humanizado ou um anticorpo fragment. Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 humanizado compreende uma ou mais (por exemplo, todas as três) região determinante complementar de cadeia leve 1 (CDR1 de LC), região determinante complementar de cadeia leve 2 (CDR2 de LC), e região determinante complementar de cadeia leve 3 (CDR3 de LC) de um domínio de ligação anti-CD19 de murino ou humanizado descrito aqui, e/ou uma ou mais (por exemplo, todas as três) região determinante complementar de cadeia pesada 1 (CDR1 de HC), região determinante complementar de cadeia pesada 2 (CDR2 de HC), e região determinante complementar de cadeia pesada 3 (CDR3 de HC) de um domínio de ligação anti-CD19 de murino ou humanizado descrito aqui, por exemplo, um domínio de ligação anti-CD19 humanizado compreendendo um ou mais, por exemplo, todos os três, CDRs de LC e um ou mais, por exemplo, todos os três, CDRs de HC. Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 humanizado compreende uma ou mais (por exemplo, todas as três) região determinante complementar de cadeia pesada 1 (CDR1 de HC), região determinante complementar de cadeia pesada 2 (CDR2 de HC), e região determinante complementar de cadeia pesada 3 (CDR3 de HC) de um domínio de ligação anti-CD19 de murino ou humanizado descrito aqui, por exemplo, o domínio de ligação anti-CD19 humanizado tem duas regiões de cadeia pesada variáveis, cada compreendendo um CDR1 de HC, um CDR2 de HC e um CDR3 de HC descrito aqui. Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 humanizado compreende uma região variável de cadeia leve humanizada descrita aqui (por exemplo, na tabela 3) e/ou uma região variável de cadeia pesada humanizada descrita aqui (por exemplo, na tabela 3). Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 humanizado compreende uma região variável de cadeia pesada humanizada descrita aqui (por exemplo, na tabela 3), por exemplo, pelo menos duas regiões variáveis de cadeia pesada humanizadas descritas aqui (por exemplo, na tabela 3). Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 é um scFv compreendendo uma cadeia leve e uma cadeia pesada de uma sequência de aminoácido de tabela 3. Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 (por exemplo, um scFv) compreende: uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos uma, duas ou três modificações (por exemplo, substituições), porém não mais do que 30, 20 ou 10 modificações (por exemplo, substituições) de uma sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia leve fornecida na tabela 3, ou uma sequência com 95-99% de identidade com uma sequência de aminoácido de tabela 3; e/ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos uma, duas, ou três modificações (por exemplo, substituições), porém não mais do que 30, 20 ou 10 modificações (por exemplo, substituições) de uma sequência de aminoácido de uma região variável de cadeia pesada fornecida na tabela 3, ou uma sequência com 95-99% de identidade a uma sequência de aminoácido de tabela 3. Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 humanizado compreende uma sequência selecionada de um grupo que consiste em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, e SEQ ID NO:12, ou uma sequência com 95-99% de identidade da mesma. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico codificando o domínio de ligação anti- CD19 humanizado compreende uma sequência selecionada de um grupo que consiste em SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71 e SEQ ID NO:72, ou uma sequência com 95-99% de identidade da mesma. Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 humanizado é um scFv, e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita aqui, por exemplo, na tabela 3, é ligada a uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita aqui, por exemplo, na tabela 3, por meio de um ligante, por exemplo, um ligante descrito aqui. Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 humanizado inclui um ligante de (Gly4-Ser)n, em que n é 1, 2, 3, 4, 5, ou 6, preferivemente 3 ou 4 (SEQ ID NO:53). A região variável de cadeia leve e região variável de cadeia pesada de um scFv pode ser, por exemplo, em qualquer uma das seguintes orientações: região variável de cadeia pesada de ligante de região variável de cadeia leve ou região variável de cadeia leve de ligante de região variável de cadeia pesada.

[00312] Em um aspecto, a porção de domínio de ligação de antígeno compreende uma ou mais sequência selecionada de SEQ ID NOS:1-12. Em um aspecto, o CAR humanizado é selecionado de uma ou mais sequence selecionada de SEQ ID NOS: 31-42. Em alguns aspectos, um anticorpo não humano é humanizado, onde sequências ou regiões específicas do anticorpo são modificadas para aumentar similarmente a um anticorpo naturalmente produzido em um humano ou fragmento do mesmo.

[00313] Um anticorpo humanizado pode ser produzido usando uma variedade de técnicas conhecidas na técnica, incluindo, porém não limitada a enxerto de CDR (veja, por exemplo, Patente Europeia n° EP 239,400; Publicação Internacional n° WO 91/09967; e Patentes dos Estados Unidos n°s 5.225.539, 5.530.101, e 5.585.089, cada uma das quais são incorporadas aqui em sua totalidade por referência), revestimento e recapeamento (veja, por exemplo, Patentes Europeias n°s EP 592,106 e EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805- 814; e Roguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973, cada um dos quais é incorporado aqui por sua totalidade por referência), embaralhamento de cadeia (veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n° 5.565.332, que é incorporado aqui em sua totalidade por referência), e técnicas descritas em, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos n° US2005/0042664, Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos n° US2005/0048617, Patente dos Estados Unidos n° 6.407.213, Patente dos Estados Unidos n° 5.766.886, Publicação Internacional n° WO 9317105, Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Metods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16):10678- 84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994), e Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994), cada um dos quais são incorporados aqui em sua totalidade por referência. Frequentemente, resíduos estruturais nas regiões estruturais serão substituídos com o resíduo correspondente do anticorpo de doador de CDR para alterar, por exemplo, melhorar, ligação de antígeno. Estas substituições de estrutura são identificadas por métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, por modelagem das interações do CDR e resíduos estruturais para identificar os resíduos estruturais importantes para ligação de antígeno e comparação de sequência para identificar os resíduos estruturais não usuais em posições particulares. (veja, por exemplo, Queen et al., Patente dos Estados Unidos n° 5.585.089; e Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323, que são incorporados aqui por referência em suas totalidades.)

[00314] Um anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo tem um ou mais resíduos de aminoácido que permanecem nele de uma fonte que é não humana. Estes resíduos de aminoácido são frequentemente referidos como resíduos de "importação", que são tipicamente tirados de um domínio variável de "importação". Como fornecido aqui, anticorpos humanizados ou fragmento de anticorpos compreendem um ou mais CDRs de moléculas de imunoglobulina não humana e regiões estruturais em que os resíduos de aminoácido compreendendo a estrutura são derivados completamente ou principalmente da linhagem de germinação humana. Múltiplas técnicas para humanização de anticorpos ou fragmentos de anticorpo são conhecidas na técnica e podem essencialmente ser realizadas seguindo o método de Winter e colegas de trabalho (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), substituindo sequências de CDR ou CDRs de roedor pelas sequências correspondentes de CAR de um anticorpo humano, isto é, enxerto de CDR (EP 239,400; Publicação de PCT n° WO 91/09967; e Patentes dos Estados Unidos n°s 4.816.567; 6.331.415; 5.225.539; 5.530.101; 5.585.089; 6.548.640, os teores dos quais são incorporados aqui por referência aqui em sua totalidade). Em tais anticorpos humanizados e fragmento de anticorpos, substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondendo de uma espécie não humana. Anticorpos humanizados são frequentemente anticorpos humanos em que alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos estruturais (FR) são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedor. A humanização de anticorpos e fragmento de anticorpos pode também ser obtida por revestimento ou recapeamento (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); e Roguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994)) ou embaralhamento de cadeia (Patente dos Estados Unidos n° 5.565.332), os teores dos quais são incorporados aqui por referência aqui em sua totalidade.

[00315] A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leves quanto pesados, a serem usados na preparação dos anticorpos humanizados é para reduzir a antigenicidade. De acordo com o assim chamado método "de melhor ajuste", a sequência do domínio variável e o domínio variável de um anticorpo de roedor são analisados em comparação com a biblioteca de sequências de domínio variáveis humanas conhecidas. A sequência humana que é mais próxima àquela do roedor é em seguida aceita como a estrutura humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chotia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987), os teores dos quais são incorporados aqui por referência aqui em sua totalidade). Outro método usa uma estrutura particular derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves e pesadas. A mesma estrutura pode ser usada para diversos anticorpos humanizados diferentes (veja, por exemplo, Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993), os teores dos quais são incorporados aqui por referência aqui em sua totalidade). Em algumas modalidades, a região estrutural, por exemplo, todas as quatro regiões estruturais, da região variável de cadeia pesada são derivadas da sequência germinativa de VH4_4-59. Em uma modalidade, a região estrutural pode compreender, uma, duas, três, quatro ou cinco modificações, por exemplo, substituições, por exemplo, do aminoácido na sequência de murino correspondente (por exemplo, de SEQ ID NO:59). Em uma modalidade, a região estrutural, por exemplo, todas as quatro regiões estruturais da região variável de cadeia leve são derivadas de uma sequência germinativa de VK3_1,25. Em uma modalidade, a região estrutural pode compreender, uma, duas, três, quatro ou cinco modificações, por exemplo, substituições, por exemplo, do aminoácido na sequência de murino correspondente (por exemplo, de SEQ ID NO:59).

[00316] Em alguns aspectos, a porção de uma composição de CAR da invenção que compreende um fragmento de anticorpo é humanizada com retenção de afinidade elevada quanto ao antígeno alvo e outras propriedades biológicas favoráveis. De acordo com um aspecto da invenção, anticorpos humanizados e fragmento de anticorpos são preparados por um processo de análise das sequências parenterais e vários produtos humanizados conceituais usando modelos tridimensionais. Modelos de imunoglobulina tridimensionais são comumente disponíveis e são familiares para aqueles versados na técnica. Programas de computador são disponíveis que ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção destas exibições permite a análise de papéis mais similares dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, por exemplo, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata ligar-se ao antígeno alvo. Deste modo, resíduos de FR podem ser selecionados e combinados do recipiente e sequências de importação de modo que as características de anticorpo desejado ou fragmento de anticorpo, tal como afinidade aumentada quanto ao antígeno alvo, sejam obtidas. Em geral, os resíduos de CDR são diretamente e mais substancialmente envolvidos na influência de ligação de antígeno.

[00317] Um anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo pode manter uma especificidade antigênica similar como o anticorpo original, por exemplo, na presente invenção, a capacidade de ligar o CD19 humano. Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo pode ter afinidade e/ou especificidade melhorada de ligação ao CD19 humano.

[00318] Em um aspecto, o domínio de ligação anti-CD19 é caracterizado por características e propriedades funcionais particulares de um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Por exemplo, em um aspecto, a porção de uma composição de CAR da invenção que compreende um domínio de ligação de antígeno especificamente liga o CD19 humano. Em um aspecto, o domínio de ligação de antígeno tem a mesma especificidade de ligação ou similar ao CD19 humano como o scFv de FMC63 descrito no Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997). Em um aspecto, a invenção se refere a um domínio de ligação de antígeno compreendendo um anticorpo ou fragmento de anticorpo, em que o domínio de ligação de anticorpo especificamente liga-se a uma proteína de CD19 ou fragmento da mesma, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende uma cadeia leve variável e/ou uma cadeia pesada variável que inclui uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1-12 ou SEQ ID NO:59. Em um aspecto, o domínio de ligação de antígeno compreende uma sequência de aminoácido de um scFv selecionada de SEQ ID NOs: 1-12 ou SEQ ID NO:59. Em certos aspectos, o scFv é contíguo com e na mesma estrutura de leitura como uma sequência líder. Em um aspecto, a sequência líder é a sequência de polipeptídeo fonecida como SEQ ID NO:13.

[00319] Em um aspecto, o domínio de ligação anti-CD19 é a fragment, por exemplo, um fragmento variável de cadeia simples (scFv). Em um aspecto, o domínio de ligação anti-CD19 é um anticorpo híbrido de Fv, Fab, (Fab')2, ou bifuncional (por exemplo, biespecífico) (por exemplo, Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)). Em um aspecto, os anticorpos e fragmentos dos mesmos da invenção ligam uma proteína de CD19 com afinidade realçada ou do tipo selvagem.

[00320] Em alguns casos, scFvs podem ser preparados de acordo com o método conhecido na técnica (veja, por exemplo, Bird et al., (1988) Science 242:423-426 e Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Moléculas de ScFv podem ser produzidas por ligação de regiões de VH e VL juntamente usando ligantes de polipeptídeo flexíveis. As moléculas de scFv compreendem um ligante (por exemplo, um ligante de Ser-Gly) com um comprimento otimizado e/ou composiçãode aminoácido. O comprimento do ligante podem grandemente afetar como as regiões variáveis de um scFv dobram e interagem. De fato, se um ligante de polipeptídeo curto for empregado (por exemplo, entre 5 a 10 aminoácidos) a duplicação intracadeia será impedida. A duplicação intracadeia é também requerida para conduzir as duas regiões variáveis juntamente para formar um sítio de ligação de epitopo funcional. Para exemplos de orientação e tamanho de ligante veja, por exemplo, Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, Publicações de Pedido de Patente dos Estados Unidos n°s 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794, e Publicações de PCT n°s WO2006/020258 e WO2007/024715, são incorporadas aqui por referência.

[00321] Um scFv pode compreender um ligante de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, ou mais resíduos de aminoácido entre suas regiões de VL e VH. A sequência ligadora pode compreender qualquer aminoácido de ocorrência natural. Em algumas modalidades, a sequência ligadora compreende aminoácidos glicina e serina. Em outra modalidade, a sequência ligadora compreende grupos de repetições se glicina e serina tal como (Gly4Ser)n, onde n é um número inteiro positivo igual a ou maior do que 1 (SEQ ID NO:18). Em uma modalidade, o ligante pode ser (Gly4Ser)4 (SEQ ID NO:106) ou (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO:107). A variação no comprimento do ligante pode manter ou realçar a atividade, dando origem à eficácia superior em estudos de atividade.

[00322] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácido do domínio de ligação de antígeno (ou outras porções ou o CAR completo) pode ser modificada, por exemplo, uma sequência de aminoácido descrita aqui pode ser modificada, por exemplo, por ums substituição conservadora. Famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).

[00323] O percentual de identidade no contexto de duas ou mais sequências de polipeptídeo ou ácidos nucleicos, se refere a duas ou mais sequências que são iguais. Duas sequências são "substancialmente idênticas"se duas sequências tiverem um porcentagem específica de resíduos de aminoácido ou nucleotídeos que são iguais (por exemplo, 60% de identidade, opcionalmente 70%, 71%. 72%. 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%,81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade sobre uma região especificada, ou, quando não especificadas, sobre a sequência completa), quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima durante uma janela de comparação, ou região designada como medida usando um dos algoritmos de compparação de sequência ou alinhamento manual ou inspensão visual. Opcionalmente, a identidade existe sobre uma região que é de pelo menos cerca de 50 nucleotídeos (ou 10 aminoácidos) em comprimento, ou mais preferivemente sobre uma região que é 100 a 500 ou 1000 ou mais nucleotídeos (ou 20, 50, 200 ou mais aminoácidos) em comprimento.

[00324] Para comparação de sequência, tipicamente uma sequência age como uma sequência de referência, à qual sequências teste são comparadas. Quando usando um algoritmo de comparação de sequência, sequências teste e de referência são inseridas em um computador, coordenadas de subsequência são designadas, se necessário, e parâmetros de programa de algoritmo de sequência são designados. Parâmetros de programa predeterminado podem ser usados, ou parâmetros alternativos podem ser desigandos. O algoritmo de comparação de sequência em seguida calcula o percentual de identidades de sequência quanto às sequências teste relativas à sequência de referência, com base nos parâmetros de programa. Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443, pela pesquisa quanto o método de similaridade Pearson e Lipman, (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444, por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por alinhamento manuale inspeção visual (veja, por exemplo, Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology).

[00325] Dois exemplos de algoritmos que são adequados para determinação de percentual de identidade de sequência e similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos no Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; e Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. O software para a realização de análises por BLAS está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information.

[00326] O percentual de identidade entre duas sequências de aminoácido pode também ser determinado usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduo de peso de PAM120, uma penalidade de extensão de espaço vazio de 12 e uma penalidade de espaço vazio de 4. Além disso, o percentual de identidade entre duas sequências de aminoácido pode ser determinado usando o algoritmo Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453) que foi incorporado incorporado no programa GAP no pacote de software GCG (disponível em www.gcg.com), usando ou uma matriz Blossom 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de espaço vazio de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.

[00327] Em um aspecto, a presente invenção contempla as modificações da sequência de aminoácido de anticorpo de partida ou fragmento (por exemplo, scFv) que geram moléculas funcionalmente equivalentes. Por exemplo, o VH ou VL de um domínio de ligação anti- CD19, por exemplo, scFv, compreendido no CAR pode ser modificado para manter pelo menos cerca de 70%, 71%. 72%. 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%,81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade da região estrutural de VH ou VL de partida do domínio de ligação anti-CD19, por exemplo, scFv. A presente invenção contempla modificações das construções de CAR completas, por exemplo, modificações em uma ou mais aminoácido sequências dos vários domínios da construção de CAR a fim de gerar moléculas funcionalmente equivalentes. A construção de CAR pode ser modificada para manter pelo menos cerca de 70%, 71%. 72%. 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%,81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade da construção de CAR de partida.

CARs Biespecíficos

[00328] Em uma modalidade, uma molécula de anticorpo multiespecífica é uma molécula de anticorpo biespecífica. Um anticorpo biespecífico tem especificidade quanto a não mais do que dois antígenos. Uma molécula de anticorpo biespecífico é caracterizada por uma primeira sequência de domínio variável de imunoglobulina que tem especificidade de ligação quanto a um primeiro epitopo e uma segunda sequência de domínio variável de imunoglobulina que tem especificidade de ligação quanto a um segundo epitopo. Em uma modalidade, o primeiro e segundo epitopos estão no mesmo antígeno, por exemplo, na mesma proteína (ou subunidade de uma proteína multimérica). Em uma modalidade, o primeiro e segundo epitopo sobrepõem-se. Em uma modalidade, o primeiro e o segundo epitopos não se sobrepõem. Em uma modalidade, o primeiro e o segundo epitopos estão em diferentes antígenos, por exemplo, proteínas diferentes (ou subunidades diferentes de uma proteína multimérica). Em uma modalidade, uma molécula de anticorpo biespecífico compreende uma sequência de domínio variável de cadeia pesada e uma sequência de domínio variável de cadeia que têm especificidade de ligação quanto a um primeiro epitopo e uma sequência de domínio variável de cadeia pesada e uma sequência de domínio variável de cadeia que têm especificidade de ligação quanto a um segundo epitopo. Em uma modalidade, uma molécula de anticorpo biespecífico compreende um meio aticorpo tendo especificidade de ligação quanto a um primeiro epitopo e um meio anticorpo tendo especificidade de ligação quanto a um segundo epitopo. Em uma modalidade uma molécula de anticorpo biespecífico compreende um meio anticorpo, ou fragmento da mesma, tendo especificidade de ligação quanto a um primeiro epitopo e um meio anticorpo, ou fragmento da mesma, tendo especificidade de ligação quanto a um segundo epitopo. Em uma modalidade uma molécula de anticorpo biespecífico compreende um scFv, ou fragmento da mesma, tem especificidade de ligação quanto a um primeiro epitopo e um scFv, ou fragmento da mesma, tem especificidade de ligação quanto a um segundo epitopo.

Domínio de Transmembrana

[00329] Com respeito ao domínio de transmembrana, em várias modalidades, um CAR pode ser designado compreender um domínio de transmembrana que é ligado ao domínio extracelular do CAR. Um domínio de transmembrana pode incluir um ou mais aminoácidos adicionais adjacentes à região de transmembrana, por exemplo, um ou mais aminoácidos associados com a região extracelular da proteína da qual a transmembrana foi derivada (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 até 15 aminoácidos da região extracelular) e/ou um ou mais aminoácidos adicionais associados com a região intracelular da proteína da qual a proteína de transmembrana é derivada (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 até 15 aminoácidos da região intracelular). Em um aspecto, o domínio de transmembrana é um que está associado com um dos outros domínios do CAR, por exemplo, em uma modalidade, o domínio de transmembrana pode ser da mesma proteína que o domínio de sinalização, domínio coestimulatório ou o domínio de articulação é derivado. Em outro aspecto, o domínio de transmembrana não é derivado da mesma proteína que qualquer outro domínio do CAR é derivado. Em alguns casos, o domínio de transmembrana pode ser selecionado ou modificado por substituição de aminoácido para evitar ligação de tais domínios aos domínios de transmembrana das mesmas proteínas de membrana de superfície ou diferentes, por exemplo, para minimizar as interações com outros membros do complexo de receptor. Em um aspecto, o domínio de transmembrana é capaz de homodimerização com outro CAR em uma superfície celular de uma célula expressando CAR. Em um aspecto diferente, a sequência de aminoácido do domínio de transmembrana pode ser modificada ou substituída a fim de minimizar as interações com os domínios de ligação do padrão de ligação nativa presente na mesma célula expressando CAR.

[00330] O domínio de transmembrana pode ser derivado de uma fonte natural ou recombinante. Onde a fonte é natural, o domínio pode ser derivado de qualquer proteína de transmembrana ou ligada à membrana. Em um aspecto, o domínio de transmembrana é capaz de sinalizar ao domínio(s) intracelular se o CAR tiver ligação a um alvo. Um domínio de transmembrana de uso particular nesta invenção pode incluir pelo menos a região(s) de transmembrana, por exemplo, da cadeia alfa, beta ou zeta do receptor de célula T, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. Em algumas modalidades, um domínio de transmembrana pode incluir pelo menos a região(s) de transmembrana de, por exemplo, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, IL2R beta, IL2R gama, IL7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tátil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKG2D, NKG2C.

[00331] Em alguns casos, o domínio de transmembrana pode ser ligado à região extracelular do CAR, por exemplo, o domínio de ligação de antígeno do CAR, por meio de uma articulação, por exemplo, uma articulação de uma proteína humana. Por exemplo, em uma modalidade, a articulação pode ser uma articulação de Ig humana (imunoglobulina), por exemplo, uma articulação de IgG4, uma articulação de IgD), um ligante de GS (por exemplo, um ligante de GS descrito aqui), uma articulação de KIR2DS2 ou uma articulação de CD8a. Em uma modalidade, a articulação ou espaçador compreende (por exemplo, que consiste em) a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:14. Em um aspecto, o domínio de transmembrana compreende (por exemplo, que consiste em) um domínio de transmembrana de SEQ ID NO: 15.

[00332] Em um aspecto, a articulação ou espaçador compreende uma articulação de IgG4. Por exemplo, em uma modalidade, a articulação ou espaçador compreende uma articulação da sequência de aminoácido ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM (SEQ ID NO:45). Em algumas modalidades, a articulação ou espaçador compreende uma articulação codificada por uma sequência de nucleotídeo de GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGA GTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCA AGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTG GTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTG GTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCC GGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTG ACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTG TAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCAT CAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACC CTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCT GACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGG AGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACC CCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCG GCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTA GCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAG AAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG (SEQ ID NO:46).

[00333] Em um aspecto, a articulação ou espaçador compreende uma articulação de IgD. Por exemplo, em uma modalidade, a articulação ou espaçador compreende uma articulação da sequência de aminoácido RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKK EKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCF VVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLP RSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSD PPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPG STTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSY VTDH (SEQ ID NO:47). Em algumas modalidades, a articulação ou espaçador compreende uma articulação codificada por uma sequência de nucleotídeo de AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACT GCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGC ACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGA AAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAG ACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTC TTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACC TTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTG ACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGA AGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACT CAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCT GTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTG ATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAG CCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCT GGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGC TCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTC GCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTG GGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGC CAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCC TGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACC ATT (SEQ ID NO:48).

[00334] Em um aspecto, o domínio de transmembrana pode ser recombinante, onde ele compreenderá resíduos predominantemente hidrofóbicos tais como leucina e valina. Em um aspecto, um tripleto de fenilalanina, triptofano e valina, pode ser encontrado em cada extremidade de um domínio de transmembrana recombinante.

[00335] Opcionalmente, um ligante de oligo- ou polipepetídeo curto, entre 2 e 10 aminoácidos em comprimento pode formar a ligação entre o domínio de transmembrana e a região citoplasmática do CAR. Um dupleto de glicina-serina fornece um ligante particularmente adequado. Por exemplo, em um aspecto, o ligante compreende a sequência de aminoácido de GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:49). Em algumas modalidades, o ligante é codificado por uma sequência de nucleotídeo de GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC (SEQ ID NO:50).

[00336] Em um aspecto, a articulação ou espaçador compreende uma articulação de KIR2DS2.

Domínio citoplásmico

[00337] O domínio citoplásmico ou região do CAR inclui um domínio de sinalização intracelular. Um domínio de sinalização intracelular é geralmente responsável pela ativação de pelo menos uma das funções efetoras normais da célula imune em que o CAR foi introduzido. O termo "função efetora" se refere a uma função especializada de uma célula. A função efetora de uma célula T, por exemplo, pode ser atividade citolítica ou atividade ou atividade auxiliadora incluindo a secreção de citocinas. Desse modo, o termo "domínio de sinalização intracelular" se refere à porção de uma proteína que transduz o sinal de função efetora e direciona a célula para realizar uma função especializada. Ao mesmo tempo em que geralmente o domínio de sinalização intracelular pode ser empregado, em muitos casos não é necessário usar a cadeia inteira. Na medida em que uma porção truncada do domínio de sinalização intracelular é usada, tal porção truncada pode ser usada no lugar da cadeia intacta contanto que ele transduza o sinal de função efetora. O termo domínio de sinalização intracelular é desse modo, destinado a incluir qualquer porção truncada do domínio de sinalização intracelular suficiente para transduzir o sinal de função efetora.

[00338] Exemplos de domínios de sinalização intracelular para uso no CAR da invenção incluem as sequências citoplásmicas de um receptor de um receptor de célula T (TCR) e correceptores que agem de comum acordo para iniciar a transdução de sinal seguindo envolvimento de receptor de antígeno, bem como qualquer derivado ou variante destas sequências e qualquer sequência recombinante que tem a mesma capacidade funcional.

[00339] Sabe-se que os sinais gerados através do TCR sozinho não são suficientes para ativação completa da célula T e que o sinal secundário e/ou coestimulatório é também requerido. Desse modo, a ativação de célula T pode ser referida ser mediada por duas classes distintas de sequências de sinalização citoplásmica: aquelas que iniciam a ativação primária dependente de antígeno através do TCR (domínios de sinalização intracelular primários) e aquelas que agem de uma maneira independnete de antígeno para fornecer um sinal secundário ou coestimulatório (domínio citoplásmico secundário, por exemplo, um domínio coestimulatório).

[00340] Um domínio de sinalização primária regula a ativação primária do complexo de TCR de uma maneira estimulatória, ou de uma maneira inibitória. Domínios de sinalização intracelular primários que agem de uma maneira estimulatória podem conter motivos de sinalização que são bem conhecidos como motivos de ativação com base em tirosina imunorreceptora ou ITAMs.

[00341] Exemplos de ITAM contendo domínios de sinalização intracelular primários que são de uso particular na invenção incluem aqueles de CD3 zeta, FcR gama comum (FCER1G), Fc gama RIIa, FcR beta (Fc Epsilon R1b), CD3 gama, CD3 delta, CD3 epsilon, CD79a, CD79b, DAP10, e DAP12. Em uma modalidade, um CAR da invenção compreende um domínio de sinalização intracelular, por exemplo, um domínio de sinalização primária de CD3-zeta.

[00342] Em uma modalidade, um domínio de sinalização primária compreende um domínio de ITAM modificado, por exemplo, um domínio de ITAM mutado que tem atividade alterada (por exemplo, aumentada ou diminuída) em comparação com o domínio de ITAM nativo. Em uma modalidade, um domínio de sinalização primária compreende um domínio de sinalização intracelular primário contendo ITAM modificado, por exemplo, um domínio de sinalização intracelular primário contendo ITAM otimizado e/ou truncado. Em uma modalidade, um domínio de sinalização primária compreende um, dois, três, quatro ou mais motivos de ITAM.

[00343] Outros exemplos de moléculas contendo um domínio de sinalização intracelular primário que são de uso particular na invenção incluem aquelas de DAP10, DAP12, e CD32.

[00344] O domínio de sinalização intracelular do CAR pode compreender o domínio de sinalização de CD3-zeta por si só ou ele pode ser combinado com qualquer(quaisquer) outro(s) domínio(s) de sinalização intracelular desejado útil no contexto de um CAR da invenção. Por exemplo, o domínio de sinalização intracelular do CAR pode compreender uma porção de cadeia de CD3 zeta e um domínio de sinalização coestimulatório. O domínio de sinalização coestimulatório se refere a uma porção do CAR compreendendo o domínio intracelular de uma molécula coestimulatória. Uma molécula coestimulatória é uma molécula de superfície celular diferente de um receptor de antígeno ou seus ligantes que é requerida para uma resposta eficiente de linfócitos a um antígeno. Exemplos de tais moléculas incluem CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD1, ICOS, antígeno 1 associado com função de linfócito (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, e um ligante que especificamente se liga com CD83, e similares. Por exemplo, a coestimulação de CD27 foi demonstrada realçar a expansão, função efetora, e sobrevivência de células CAR T humanas in vitro e aumentar a persistência de célula T humana e atividade antitumor in vivo (Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706). Outros exemplos de moléculas coestimulatórias incluem CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gama, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tátil), NKG2D, CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP- 76, PAG/Cbp, e CD19a.

[00345] As sequências de sinalização intracelular dentro da porção citoplásmica do CAR da invenção podem ser ligadas entre si emum ordem aleatória ou específica. Opcionalmente, um ligante de oligo ou polipeptídeo curto, por exemplo, entre 2 e 10 aminoácidos (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 aminoácidos) em comprimento pode formar a ligação entre a sequência de sinalização intracelular. Em uma modalidade, um dupleto de glicina-serina pode ser usado comoum ligante adequado. Em uma modalidade, um aminoácido simples, por exemplo, uma alanina, uma glicina, pode ser usado como um ligante adequado.

[00346] Em um aspecto, o domínio de sinalização intracelular é designado compreender dois ou mais, por exemplo, 2, 3, 4, 5, ou mais domínios de sinalização coestimulatórios. Em uma modalidade, os dois ou mais, por exemplo, 2, 3, 4, 5, ou mais, domínios de sinalização coestimulatórios, são separados por uma molécula ligadora, por exemplo, uma molécula ligadora descrito aqui. Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular compreende dois domínios de sinalização coestimulatórios. Em algumas modalidades, a molécula ligadora é um resíduo de glicina. Em algumas modalidades, o ligante é um resíduo de alanina.

[00347] Em um aspecto, o domínio de sinalização intracelular é designado compreender o domínio de sinalização de CD3-zeta e o domínio de sinalização de CD28. Em um aspecto, o domínio de sinalização intracelular é designado compreender o domínio de sinalização de CD3-zeta e o domínio de sinalização de 4-1BB. Em um aspecto, o domínio de sinalização de 4-1BB é um domínio de sinalização de SEQ ID NO: 16. Em um aspecto, o domínio de sinalização de CD3-zeta é um domínio de sinalização de SEQ ID NO: 17.

[00348] Em um aspecto, o domínio de sinalização intracelular é designado compreender o domínio de sinalização de CD3-zeta e o domínio de sinalização de CD27. Em um aspecto, o domínio de sinalização de CD27 compreende uma sequência de aminoácido de QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACS P (SEQ ID NO:51). Em um aspecto, o domínio de sinalização de CD27 é codificado por uma sequência de ácido nucleico de AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACAT GACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCT ATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC (SEQ ID NO:52).

[00349] Em um aspecto, a célula expressando CAR descrita aqui pode também compreender um segundo CAR, por exemplo, um segundo CAR que inclui um domínio de ligação de antígeno diferente, por exemplo, ao mesmo alvo (CD19) ou um alvo diferente (por exemplo, CD123 ou mesotelina). Em uma modalidade, quando a célula expressando CAR compreende dois ou mais CARs diferentes, o domínio de ligação de antígenos dos CARs diferentes pode ser de modo que os domínios de ligação de antígenos não interajam uns com os outros. Por exemplo, uma célula expressando um primeiro e segundo CAR pode ter um domínio de ligação de antígeno do primeiro CAR, por exemplo, como um fragmento, por exemplo, um scFv, que não forma uma associação com o domínio de ligação de antígeno do segundo CAR, por exemplo, o domínio de ligação de antígeno do segundo CAR é a VHH.

[00350] Em outro aspecto, a célula expressando CAR descrita aqui pode também expressar outro agente, por exemplo, um agente que realça a atividade de uma célula expressando CAR. Por exemplo, em uma modalidade, o agente pode ser um agente que inibe uma molécula inibitória. Moléculas inibitórias, por exemplo, PD1, podem, em algumas modalidades, diminuir a capacidade de uma célula expressando CAR montar uma resposta efetora imune. Exemplos de moléculas inibitórias incluem PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por exemplo, CEACAM- 1, CEACAM-3 e/ou CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 e TGFR beta. Em uma modalidade, o agente que inibe uma molécula inibitória compreende um primeiro polipeptídeo, por exemplo, uma molécula inibitória, associado com um segundo polipeptídeo que fornece um sinal positivo à célula, por exemplo, um domínio de sinalização intracelular descrito aqui. Em uma modalidade, o agente compreende um primeiro polipeptídeo, por exemplo, de uma molécula inibitória tal como PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por exemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 e/ou CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 ou TGFR beta, ou um fragmento de qualquer um destes (por exemplo, pelo menos uma porção de um domínio extracelular de qualquer um destes), e um segundo polipeptídeo que é um domínio de sinalização intracelular descrito aqui (por exemplo, compreendendo um domínio coestimulatório (por exemplo, 41BB, CD27 ou CD28, por exemplo, como descrito aqui) e/ou um domínio de sinalização primária (por exemplo, um domínio de sinalização de CD3 zeta descrito aqui). Em uma modalidade, o agente compreende um primeiro polipeptídeo de PD1 ou um fragmento do mesmo (por exemplo, pelo menos uma porção de um domínio extracelular de PD1), e um segundo polipeptídeo de um domínio de sinalização intracelular descrito aqui (por exemplo, um domínio de sinalização de CD28 descrito aqui e/ou um domínio de sinalização de CD3 zeta descrito aqui). PD1 é um membro inibitório da família de CD28 de receptores que também inclui CD28, CTLA-4, ICOS, e BTLA. PD-1 é expresso em células B ativadas, células T e células mieloides (Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75). Dois ligantes para PD1, PD-L1 e PD-L2 foram mostrados sub-regular a ativação de célula T na ligação a PD1 (Freeman et a. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1 é abundante em cânceres humanos (Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094). Supressão imune pode ser revertida inibindo a interação local de PD1 com PD-L1.

[00351] Em uma modalidade, o agente compreende o domínio extracelular (ECD) de uma molécula inibitória, por exemplo, Morte Programada 1 (PD1), pode ser fundido a um domínio de transmembrana e domínios de sinalização intracelular tais como 41BB e CD3 zeta (também referido aqui como um CAR de PD1). Em uma modalidade, o CAR de PD1, quando usado em combinações com um CAR de CD19 descrito aqui, melhora a persistência da célula T. Em uma modalidade, o CAR é um CAR de PD1 compreendendo o domínio extracelular de PD1 indicado como sublinhado na SEQ ID NO: 121. Em uma modalidade, o CAR de PD1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:121. Malpvtalllplalllhaarppgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrrnspsnqtdk laafpedrsqpgqdcrf'rvtqlpngrdfhmsvvrarmdsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtl ytttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttq eedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgpeeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdk maeayseigmkgeiTrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (SEQ ID NO: 121).

[00352] Em uma modalidade, o CAR de PD1 compreende a sequência de aminoácido fornecida abaixo (SEQ ID NO:119). pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvt qlpngrdfhmsvvrarmdsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqpl slrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel rvkfsrsadapaykqgqnqlynclnlgrrccydvldkrrgrdpcmggkprrknpqcglynclqkdkmacayscigmkgcrrrgk ghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (SEQ ID NO:119).

[00353] Em uma modalidade, o agente compreende uma sequência de ácido nucleico codificando o CAR de PD1, por exemplo, o CAR de PD1 descrito aqui. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico para o CAR de PD1 é mostrado abaixo, com o ECD de PD1 sublinhado abaixo na SEQ ID NO: 120 atggccctccctgtcactgccctgcttctccccctcgcactcctgctccacgccgctagaccacccggatggtttctggac tctccggatcgcccgtggaatcccccaaccitctcaccggcacicttggtigtgactgaeggceataatgcgaccttcacgtgctcgttctc caacacctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgtcaaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggt cgcaaccgggacaggattgtcggttccgcgtgactcaactgccgaatggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaa cgactccgggacctacctgtgcggagccatctcgctggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgac cgagcgcagagctgaggtgccaactgcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtcacgaccactccg gcgccgcgcccaccgactccggccccaactatcgcgagccagcccctgtcgctgaggccggaagcatgccgccctgccgccggagg tgctgtgcatacccggggattggacttcgcatgcgacatctacatttgggctcctctcgccggaacttgtggcgtgctccttctgtccctggt catcaccctgtactgcaagcggggtcggaaaaagcttctgtacattttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcaaaccacccaggagga ggacggttgctcctgccggpccccgaagaggaagaaggaggttgcgagctgcgcgtgaagttctcccggagcgccgacgcccccgc ctataagcagggccagaaccagctgtacaacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgctggacaagcggcgcggcc gggaccccgaaatgggcgggaagcctagaagaaagaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaagatggccga ggcctactccgaaattgggatgaagggagagcggcggaggggaaaggggcacgacggcctgtaccaaggactgtccaccgccacc aaggacacatacgatgccctgcacatgcaggcccttccccctcgc (SEQ ID NO: 120).

[00354] Em outro aspecto, a presente invenção fornece umas populações de célula expressando CAR, por exemplo, células CART. Em algumas modalidades, as populações de célula expressando CAR compreende uma mistura de células expressando diferentes CARs. Por exemplo, em uma modalidade, as populações de célula expressando CAR pode incluir uma primeira célula expressando um CAR tendo um domínio de ligação anti-CD19 descrito aqui, e uma segunda célula expressando um CAR tendo um domínio de ligação de CD19 diferente, por exemplo, um domínio de ligação anti-CD19 descrito aqui, que difere do domínio de ligação anti-CD19 no CAR expresso pela primeira célula. Como outro exemplo, as populações de célula expressando CAR pode incluir uma primeira célula expressando um CAR que inclui um domínio de ligação anti-CD19, por exemplo, como descrito aqui, e uma segunda célula expressando um CAR que inclui um domínio de ligação de antígeno a um alvo diferente de CD19 (por exemplo, CD123). Em uma modalidade, as populações de célula expressando CAR inclui, por exemplo, uma primeira célula expressando um CAR que inclui um domínio de sinalização intracelular primário, e uma segunda célula expressando um CAR que inclui um domínio de sinalização secundário.

[00355] Em outro aspecto, a presente invenção fornece umas populações de célula em que pelo menos uma célula na população expressa um CAR tendo um domínio de ligação anti-CD19 descrito aqui, e uma segunda célula expressando outro agente, por exemplo, um agente que realça a atividade de uma célula expressando CAR. Por exemplo, em uma modalidade, o agente pode ser um agente que inibe uma molécula inibitória. Moléculas inibitórias, por exemplo, podem, em algumas modalidades, diminuir a capacidade de uma célula expressando CAR para montar uma resposta efetora imune. Exemplos de moléculas inibitórias incluem PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por exemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 e/ou CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 ou TGFR beta. Em uma modalidade, o agente que inibe uma molécula inibitória compreende um primeiro polipeptídeo, por exemplo, uma molécula inibitória, associado com um segundo polipeptídeo que fornece um sinal positivo à célula, por exemplo, um domínio de sinalização intracelular descrito aqui. Em uma modalidade, o agente compreende um primeiro polipeptídeo, por exemplo, de uma molécula inibitória tal como PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por exemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 e/ou CEACAM- 5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 ou TGFR beta, ou um fragmento de qualquer um destes (por exemplo, pelo menos uma porção de um domínio extracelular de qualquer um destes), e um segundo polipeptídeo que é um domínio de sinalização intracelular descrito aqui (por exemplo, compreendendo um domínio coestimulatório (por exemplo, 41BB, CD27 ou CD28, por exemplo, como descrito aqui) e/ou um domínio de sinalização primária (por exemplo, um domínio de sinalização de CD3 zeta descrito aqui). Em uma modalidade, o agente compreende um primeiro polipeptídeo de PD1 ou um fragmento do mesmo (por exemplo, pelo menos uma porção do domínio extracelular de PD1), e um segundo polipeptídeo de um domínio de sinalização intracelular descrito aqui (por exemplo, um domínio de sinalização de CD28 descrito aqui e/ou um domínio de sinalização de CD3 zeta descrito aqui).

Receptores de antígeno quiméricos reguláveis

[00356] Em algumas modalidades, um CAR regulável (RCAR) onde a atividade de CAR pode ser controlada é desejável para otimizar a segurança e eficácia de uma terapia com CAR. Existem muitos modos das atividades de CAR serem reguladas. Por exemplo, apoptose induzível usando, por exemplo, uma caspase fundida a um domínio de dimerização (veja, por exemplo, Di Stasa et al., N Engl. J. Med. 2011 Nov. 3; 365(18):1673-1683), pode ser usada como uma chave de segurança na terapia com CAR da presente invenção. Em uma modalidade, as células (por exemplo, células T ou células NK) expressando um CAR da presente invenção também compreende um comutador de apoptose induzível, em que uma caspase humana (por exemplo, caspase 9) ou uma versão modificada é fundida a uma modificação da proteína FKB humana que permite dimerização condicional. Na presença de uma molécula pequena, tal como um rapalog (por exemplo, AP 1903, AP20187), a caspase induzível (por exemplo, caspase 9) é ativada e induz à rápida apoptose e morte das células (por exemplo, células T ou células NK) expressando um CAR da presente invenção. Exemplos de um comutador de apoptose induzível com base em caspase (ou um ou mais aspectos de tal comutador) foram descritos em, por exemplo, US2004040047; US20110286980; US20140255360; WO1997031899; WO2014151960; WO2014164348; WO2014197638; WO2014197638; todos os quais são incorporados por referência aqui.

[00357] Em um aspecto, um RCAR compreende um grupo de polipeptídeos, tipicamente dois nas modalidades mais simples, em que os componentes de um CAR padrão descrito aqui, por exemplo, um domínio de ligação de antígeno e um domínio de sinalização intracelular, são divididos em polipeptídeos ou membros separados. Em algumas modalidades, os grupos de polipeptídeo incluem um comutador de dimerização que, na presença de uma molécula de dimerização, pode acoplar os polipeptídeos uns aos outros, por exemplo, pode acoplar um domínio de ligação de antígeno a um domínio de sinalização intracelular. Em uma modalidade, os CARs da presente invenção utilizam um comutador de dimerização como aqueles descritos, por exemplo, no WO2014127261, que é incorporado por referência aqui.

[00358] Em um aspecto, um RCAR compreende dois polipeptídeos ou membros: 1) um membro de sinalização intracelular compreendendo um domínio de sinalização intracelular, por exemplo, um domínio de sinalização intracelular primário descrito aqui, e um primeiro domínio comutador; 2) um membro de ligação de antígeno compreendendo um domínio de ligação de antígeno, por exemplo, que alveja CD19, como descrito aqui e um segundo domínio comutador. Opcionalmente, o RCAR compreende um domínio de transmembrana descrito aqui. Em uma modalidade, um domínio de transmembrana pode ser disposto no membro de sinalização intracelular, no membro de ligação de antígeno, ou em ambos. (A menos de outro modo indicado, quando membros ou elementos de um RCAR são descritos aqui, a ordem pode ser como fornecida, porém outras ordens são igualmente incluídas. Em outras palavras, em uma modalidade, a ordem é como mencionado no texto, porém em outras modalidades, a ordem pode ser diferente. Por exemplo, a ordem de elementos em um lado de uma região de transmembrana pode ser diferente do exemplo, por exemplo, a colocação de um dompinio comutador com relação a um domínio de sinalização intracelular pode ser diferente, por exemplo, revertida).

[00359] Em uma modalidade, o primeiro e segundo domínios comutadores podem formar um comutador de dimierização intracelular ou extracelular. Em uma modalidade, o comutador de dimerização pode ser um comutador de homodimerização, por exemplo, onde o primeiro e segundo domínios comutadores são iguais, ou um comutador de heterodimerização, por exemplo, onde o primeiro e segundo domínio comutador são diferentes uns dos outros.

[00360] Em modalidades, um RCAR pode compreender um "multicomutador." Um multicomutador pode compreender domínios comutadores de heterodimerização ou domínios comutadores de homodimerização. Um multicomutador compreende uma pluralidade de, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, domínios comutadores, independentemente, em um primeiro membro, por exemplo, um membro de ligação de antígeno, e um segundo membro, por exemplo, um membro de sinalização intracelular. Em uma modalidade, o primeiro member pode compreender uma pluralidade de primeiros domínios comutadores, por exemplo, domínios comutadores com base em FKBP, e o segundo membro pode compreender uma pluralidade de segundos domínios comutadores, por exemplo, domínios comutadores com base em FRB. Em uma modalidade, o primeiro membro pode compreender um primeiro e um segundo domínio comutador, por exemplo, domínio comutador com base em FKBP e um domínio comutador com base em FRB, e o segundo membro pode compreender um primeiro e um segundo domínio comutador, por exemplo, um domínio comutador com base em FKBP e um domínio comutador com base em FRB.

[00361] Em uma modalidade, o membro de sinalização intracelular compreende uma ou mais domínio de sinalização intracelulars, por exemplo, um domínio de sinalização intracelular primário e uma ou mais domínios de sinalização coestimulatórios.

[00362] Em uma modalidade, o membro de ligação de antígeno pode compreender um ou mais domínios de sinalização intracelular, por exemplo, um ou mais domínios de sinalização coestimulatórios. Em uma modalidade, o membro de ligação de antígeno compreende uma pluralidade, por exemplo, 2 ou 3 domínios de sinalização coestimulatórios descritos aqui, por exemplo, selecionados de 41BB, CD28, CD27, ICOS, e OX40, e em modalidades, no domínio de sinalização intracelular primário. Em uma modalidade, o membro de ligação de antígeno compreende os seguintes domínios de sinalização coestimulatórios, da direção extracelular para intracelular: 41BB-CD27; 41BB-CD27; CD27-41BB; 41BB-CD28; CD28-41BB; OX40-CD28; CD28-OX40; CD28-41BB; ou 41BB-CD28. Em tais modalidades, o membro de ligação intracelular compreende um domínio de CD3 zeta. Em tal modalidade o RCAR compreende (1) um membro de ligação de antígeno compreendendo um domínio de ligação de antígeno, um domínio de transmembrana, e dois domínios coestimulatórios e um primeiro domínio comutador; e (2) um domínio de sinalização intracelular compreendendo um domínio de transmembrana ou um domínio de ligação de membrana e pelo menos um domínio de sinalização intracelular primário, e um segundo domínio comutador.

[00363] Uma modalidade fornece RCARs em que o membro de ligação de antígeno não é ligado à superfície da célula CAR. Isto permite uma célula tendo um membro de sinalização intracelular ser convenientemente pareada com um ou mais domínios de ligação de antígeno, sem transformar a célula com uma sequência que codifica o membro de ligação de antígeno. Em tais modalidades, o RCAR compreende: 1) um membro de sinalização intracelular compreendendo: um primeiro domínio comutador, um domínio de transmembrana, um domínio de sinalização intracelular, por exemplo, um domínio de sinalização intracelular primário, e um primeiro domínio comutador; e 2) um membro de ligação de antígeno compreendendo: um domínio de ligação de antígeno, e um segundo domínio comutador, em que o membro de ligação de antígeno não compreende um domínio de transmembrana ou domínio de ligação de membrana, e, opcionalmente, não compreende um domínio de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, o RCAR pode também compreender 3) um segundo membro de ligação de antígeno compreendendo: um segundo domínio de ligação de antígeno, por exemplo, um segundo domínio de ligação de antígeno que liga um diferente antígeno do que é ligado pelo domínio de ligação de antígeno; e um segundo domínio comutador.

[00364] São também fornecidos aqui RCARs em que o membro de ligação de antígeno compreende ativação biespecífica e capacidade de alvejamento. Nesta modalidade, o membro de ligação de antígeno pode compreender uma ppluralidade, por exemplo, 2, 3, 4, ou 5 domínios de ligação de antígeno, por exemplo, scFvs, em que cada domínio de ligação de antígeno liga-se a um antígeno alvo, por exemplo, diferentes antígenos ou o mesmo antígeno, por exemplo, os mesmos ou epitopos diferentes no mesmo antígeno. Em uma modalidade, a pluralidade de domínios de ligação de antígeno está em tandem, e opcionalmente, um ligante ou a região de articulação é disposta entre cada um dos domínios de ligação de antígenos. Ligantes adequados e as regiões de articulação são descrito aqui.

[00365] Uma modalidade fornece RCARs tendo uma configuração que permite a comutação de proliferação. Nesta modalidade, o RCAR compreende: 1) um membro de sinalização intracelular compreendendo: opcionalmente, um domínio de transmembrana ou domínio de ligação de membrana; um ou mais domínios de sinalização coestimulatórios, por exemplo, selecionados de 41BB, CD28, CD27, ICOS, e OX40, e um domínio comutador; e 2) um membro de ligação de antígeno compreendendo: um domínio de ligação de antígeno, um domínio de transmembrana, e um domínio de sinalização intracelular primário, por exemplo, domínio de CD3 zeta, em que o membro de ligação de antígeno não compreende um domínio comutador, ou não compreende um domínio comutador que se dimeriza com um domínio comutador no membro de sinalização intracelular. Em uma modalidade, o membro de ligação de antígeno não compreende um domínio de sinalização coestimulatório. Em uma modalidade, o membro de sinalização intracelular compreende um domínio comutador de um comutador de homodimerização. Em uma modalidade, o membro de sinalização intracelular compreende um primeiro domínio comutador de um comutador de heterodimerização e o RCAR compreende um segundo membro de sinalização intracelular que compreende um segundo domínio comutador do comutador de heterodimerização. Em tais modalidades, o segundo membro de sinalização intracelular compreende os mesmos domínios de sinalização intracelular como o membro de sinalização intracelular. Em uma modalidade, o comutador de dimerização é intracelular. Em uma modalidade, o comutador de dimerização é extracelular.

[00366] Em qualquer uma das configurações de RCAR descritas aqui, o primeiro e segundo domínios comutadores compreendem um comutador com base em FKBP-FRB como descrito aqui.

[00367] São também fornecidas aqui células compreendendo um RCAR descrito aqui. Qualquer célula que é criada para expressar um RCAR pode ser usada como uma célula RCARX. Em uma modalidade a célula RCARX é uma célula T, e é referida como uma célula RCART. Em uma modalidade, a célula RCARX é uma célula NK, e é referida como uma célula RCARN.

[00368] São também fornecidos aqui ácidos nucleicos e vetores compreendendo sequências codificando RCAR. Sequência codificando vários elementos de um RCAR pode ser disposta na mesma molécula de ácido nucleico, por exemplo, o mesmo plasmídeo ou vetor, por exemplo, vetor viral, por exemplo, vetor lentiviral. Em uma modalidade, (i) a sequência codificando um membro de ligação de antígeno e (ii) sequência codificando um membro de sinalização intracelular, pode estar presente no mesmo ácido nucleico, por exemplo, vetor. A produção das proteínas pode ser obtida, por exemplo, pelo uso de promotores separados, ou pelo uso de um produto de transcrição bicistrônica (que pode resultar na produção de duas proteínas por clivagem de uma produção de translação simples ou pela translação de dois produtos separados). Em uma modalidade, uma sequência codificando um peptídeo clivável, por exemplo, uma sequência de P2A ou F2A, é disposta entre (i) e (ii). Em uma modalidade, uma sequência codificando um IRES, por exemplo, um EMCV ou EV71 IRES, é disposto entre (i) e (ii). Nestas modalidades, (i) e (ii) são transcritos como um RNA simples. Em uma modalidade, um primeiro promotor é operavelmente ligado a (i) e um segundo promotor é operavelmente ligado a (ii), de modo que (i) e (ii) sejam transcritos como mRNAs separados.

[00369] Alternativamente, a sequência codificando vários elementos de um RCAR pode ser disposta nas diferentes moléculas de ácido nucleico, por exemplo, diferentes plasmídeos ou vetores, por exemplo, vetor viral, por exemplo, vetor lentiviral. Por exemplo, a sequência (i) codificando um membro de ligação de antígeno pode estar presente em um primeiro ácido nucleico, por exemplo, um primeiro vetor, e (ii) a sequência codificando um membro de sinalização intracelular pode estar presente no segundo ácido nucleico, por exemplo, o segundo vetor.

Comutadores de Dimerização

[00370] Comutadores de dimerização podem ser não covalentes ou covalentes. Em um comutador de dimerização não covalente, a molécula de dimerização promove uma interação não covalente entre os domínios comutadores. Em um comutador de dimerização covalente, a molécula de dimerização promove uma interação covalente entre os domínios comutadores.

[00371] Em uma modalidade, o RCAR compreende um FKBP/FRAP, ou comutador de dimerização com base em FKBP/FRB. FKBP12 (proteína de ligação de FKBP, ou FK506) é uma proteína citoplásmica abundante que funciona como um alvo intracelular inicial para o fármaco imunossupressor de produto natural, rapamicina. Rapamicina liga-se a FKBP e ao FRAP homólogo de PI3K grande (RAFT, mTOR). FRB é uma porção de 93 aminoácido de FRAP, que é suficiente para ligar o completo de FKBP-rapamicina (Chen, J., Zheng, X. F., Brown, E. J. & Schreiber, S. L. (1995) Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin- binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein and characterization of a critical serina residue. Proc Natl Acad Sci U S A 92: 4947-51.)

[00372] Em modalidades, um FKBP/FRAP, por exemplo, um comutador com base em FKBP/FRB pode usar uma molécula de dimerização, por exemplo, rapamicina ou um análogo de rapamicina.

[00373] A sequência de aminoácido de FKBP é como segue: D V P D Y A S L G G P S S P K K K R K V S R G V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S Y (SEQ ID NO: 122)

[00374] Em modalidades, um domínio comutador de FKBP pode compreender um fragmento de FKBP tendo a capacidade de ligar-se com FRB, ou um fragmento ou análogo do mesmo, na presença de rapamicina ou um rapálogo, por exemplo, a porção sublinhada de SEQ ID NO: 122, que é: V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S (SEQ ID NO: 123)

[00375] A sequência de aminoácido de FRB é como segue: ILWHEMWHEG LEEASRLYFG ERNVKGMFEV LEPLHAMMER GPQTLKETSF NQAYGRDLME AQEWCRKYMK SGNVKDLTQA WDLYYHVFRR ISK (SEQ ID NO: 124)

[00376] "FKBP/FRAP, por exemplo, um permutador com base em FKBP/FRB" quando tal termo é usado aqui, se refere a um comutador de dimerização compreendendo: um primeiro domínio comutador, que compreende um fragmento de FKBP ou análogo do mesmo tendo a capacidade de ligar-se com FRB, ou um fragmento ou análogo do mesmo, na presença de rapamicina ou um rapálogo, por exemplo, RAD001, e tem pelo menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade com, ou difere em não mais do que 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, ou 1 resíduos de aminoácido da sequência de FKBP de SEQ ID NO: 122 ou 123; e um segundo domínio comutador, que compreende um fragmento de FRB ou um análogo do mesmo tendo a capacidade de ligar-se com FRB, ou um fragmento ou análogo do mesmo, na presença de rapamicina ou um rapálogo, e tem pelo menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade com, ou difere em não mais do que 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, ou 1 resíduos de aminoácido da sequência de FRB de SEQ ID NO: 124. Em uma modalidade, um RCAR descrito aqui compreende um domínio comutador compreende resíduos de aminoácido descritos em SEQ ID NO: 122 (ou SEQ ID NO: 123), e um domínio comutador compreende resíduos de aminoácido descritos em SEQ ID NO: 124.

[00377] Em modalidades, o comutador de dimerização de FKBP/FRB compreende um domínio comutador FRB modificado que exibe formação de complexo alterada, por exemplo, realçada entre um domíniocomutador com base em FRB, por exemplo, o domínio comutador de FRB modificado, um domínio comutador com base em FKBP, e a molécula de dimerização, por exemplo, rapamicina ou um rapalógo, por exemplo, RAD001. Em uma modalidade, o domínio comutador de FRB modificado compreende uma ou mais mutações, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais, selecionadas de mutações em posição(s) de aminoácido L2031, E2032, S2035, R2036, F2039, G2040, T2098, W2101, D2102, Y2105, e F2108, onde o aminoácido do tipo selvagem é mutado por qualquer outro aminoácido de ocorrência natural. Em uma modalidade, um FRB mutante compreende uma mutação em E2032, onde E2032 é mutado por fenilalanina (E2032F), metionina (E2032M), arginina (E2032R), valina (E2032V), tirosina (E2032Y), isoleucina (E2032I), por exemplo, SEQ ID NO: 125, ou leucina (E2032L), por exemplo, SEQ ID NO: 126. Em uma modalidade, um FRB mutante compreende uma mutação em T2098, onde T2098 é mutado por fenilalanina (T2098F) ou leucina (T2098L), por exemplo, SEQ ID NO: 127. Em uma modalidade, um FRB mutante compreende uma mutação em E2032 e em T2098, onde E2032 é mutado por qualquer aminoácido, e onde T2098 é mutado por qualquer aminoácido, por exemplo, SEQ ID NO: 128. Em uma modalidade, um FRB mutante compreende uma mutação de E2032I e T2098L, por exemplo, SEQ ID NO: 129. Em uma modalidade, um FRB mutante compreende uma mutação de E2032L e T2098L, por exemplo, SEQ ID NO: 130.

[00378] Tabela 13. FRB mutante exemplar tendo afinidade aumentada quanto a uma molécula de dimerização.

[00379] Outros comutador de dimerização com base em GyrB-GyrB, um comutador de dimerização com base em Gibberelina, um comutador de dimerização de rótulo/aglutinante, e um comutador de dimerização de halo- rótulo/snap-rótulo. Seguindo a orientação fornecida aqui, tais comutadores e moléculas de dimerização relevantes serão evidentes para alguém versado.

Molécula de Dimerização

[00380] A associação entre os domínios comutadores é promovida pela molécula de dimerização. Na presença de interação de molécula de dimerização ou a associação de entre domínios comutadores permite transdução de sinal entre um polipeptídeo associado com, por exemplo, fundido a, um primeiro domínio comutador, e um polipeprídeo associado com, por exemplo, fundido a, um segundo domínio comutador. Na presença de níveis não limitantes de molécula de dimerização, a transdução de sinal é aumentada em 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 5, 10, 50, 100 vezes, por exemplo, como medido em um sistema descrito aqui.

[00381] Rapamicina e análogos de rapamicina (algumas vezes referidos como rapalógos), por exemplo, RAD001, podem ser usados como moléculas de dimerização em um comutador de dimerização com base e, FKBP/FRB descrito aqui. Em uma modalidade, a molécula de dimerização pode ser selecionada de rapamicina (sirolimo), RAD001 (everolimo), zotarolimo, tensirolimo, AP-23573 (ridaforolimo), biolimo e AP21967. Análogos de rapamicina adicionais adequados para uso com comutadores de dimerização com base em FKBP/FRB são também descritos na seção entitulada "Terapias de Combinação", ou na subseção entitulada "Inibidores de mTOR exemplares".

CAR de cisão

[00382] Em algumas modalidades, a célula expressando CAR usa um CAR de cisão. O método de CAR de cisão é descrito em maiores detalhes nas publicações WO2014/055442 e WO2014/055657. Resumidamente, um sistema de CAR de cisão compreende uma célula expressando um primeiro CAR tendo um primeiro domínio de ligação de antígeno e um domínio coestimulatório (por exemplo, 41BB), e a célula também expressa um segundo CAR tendo um segundo domínio de ligação de antígeno e um domínio de sinalização intracelular (por exemplo, CD3 zeta). Quando a célula encontra o primeiro antígeno, o domínio coestimulatório é ativado, e a célula prolifera-se. Quando a célula encontra o segundo antígeno, o domínio de sinalização intracelular é ativado e a atividade de extermínio de célula inicia-se. Desse modo, a célula expressando CAR é apenas totalmente ativada totalmente na presença de ambos os antígenos.

Transfecção de RNA

[00383] São descritos aqui métodos para a produção de um CAR de NRA transcrito in vitro. A presente invenção também inclui um CAR codificando construção de RNA que pode ser diretamente transferida em uma célula. Um método para geração de mRNA para uso em transfecção pode envolver a transcrição in vitro (IVT) de um modelo com iniciadores especialmente designados, seguido por adição de poliA, para produzir uma construção contendo sequência não trasladada 3’ e 5’ ("UTR"), um tamponamento 5' e/ou Sítio de Entrada de Ribossoma Interno (IRES), o ácido nucleico a ser expresso, e uma cauda de poliA, tipicamente 50-2000 bases em comprimento (SEQ ID NO:118). RNA assim produzido pode efecientemente transfectar diferentes espécies de células. Em um aspecto, o modelo inclui sequências para o CAR.

[00384] Em um aspecto, o CAR anti-CD19 é codificado por um mensageiro de RNA (mRNA). Em um aspecto, o mRNA codificando o CAr anti-CD19 é introduzido em uma célula efetora imune, por exemplo, uma célula T ou uma célula NK, para a produção de uma célula expressando CAR, por exemplo, uma célula CART ou uma c'lula NK de CAR.

[00385] Em uma modalidade, o CAR de RNA transcrito in vitro pode ser introduzido em uma célula como uma forma de infecção transitória. O RNA é produzido por transcrição in vitro usando um modelo gerado por reação de cadeia polimerase (PCR). DNA de interesse de qualquer fonte pode ser diretamente convertido por PCR em um modelo para síntese de mRNA in vitro usando iniciadores apropriados e RNA polimerase. A fonte do DNA pode ser, por exemplo, DNA genômico, DNA de plasmídeo, DNA de fago, cDNA, sequência de DNA sintético ou qualquer outra fonte de DNA apropriada DNA. O modelo desejado para transcrição in vitro é um CAR da presente invenção. Por exemplo, o modelo para o CAR de RNA compreende uma região extracelular compreendendo um domínio variável de cadeia simples de um anticorpo antitumor; uma região de articulação, um domínio de transmembrana (por exemplo, um domínio de transmembrana de CD8a); e uma região citoplásmica que inclui um domínio de sinalização intracelular, por exemplo, compreendendo o domínio de sinalização de CD3-zeta e o domínio de sinalização de 4-1BB.

[00386] Em uma modalidade, o DNA a ser usado para PCR contém uma estrutura de leitura aberta. O DNA pode ser de uma sequência de DNA de ocorrência natural do genoma de um organismo. Em uma modalidade, o ácido nucleico pode incluir alguma ou todas as regiões transladadas 5' e/ou 3' (UTRs). O ácido nucleico pode incluir exons e introns. Em uma modalidade, o DNA a ser usado para PCR é uma sequência de ácido nucleico humana. Em outra modalidade, o DNA a ser usado para PCR é uma sequência de ácido nucleico humana incluindo as UTRs 5' e 3'. O DNA pode alternativamente ser uma sequência de DNA artificial que não é normalmente expresso em um organismo deocorrência natural. Uma sequência de DNA artificial exemplar é aquela que contém porções de genes que são ligados entre si para formar uma estrurura de leitura aberta. As porções de DNA que são ligadas juntamente podem ser de um organismo simples ou de mais do que um organismo.

[00387] PCR é usado para gerar um modelo para transcrição in vitro de mRNA que é usado para transfecção. Métodos para realização de PCR são bem conhecidos na técnica. Iniciadores para uso em PCR são designados ter regiões que são substancialmente complementares às regiões do DNA a ser usado como um padrão para o PCR. "Substancialmente complementar", como usado aqui, se refere às sequências de nucleotídeos onde uma maior parte ou todas as bases na sequência iniciadora são complementares, ou uma ou mais bases são não complementares, ou mal combinadas. Sequências substancialmente complementares são capazes de anelar ou hibridizar com o DNA alvo pretendido sob condições de anelamento usadas para PCR. Os iniciadores podem ser designados ser substancialmente complementares a qualquer porção do modelo de DNA. Por exemplo, os iniciadores podem ser designados ampliar a porção de um ácido nucleico que é normalmente transcrita em células (a estrutura de leitura aberta), incluindo UTRs 5' e 3'. Os iniciadores também podem ser designados para ampliar uma porção de um ácido nucleico que codifica um domínio particular de interesse. Em uma modalidade, os iniciadores são designados para ampliar a região de códon de um cDNA humano, incluindo todas ou porções das UTRs 5' e 3'. Iniciadores úteis para PCR podem ser gerados por métodos sintéticos que são bem conhecidos na técnica. "Iniciadores dianteiros"são iniciadores que contêm uma região de nucleotídeos que são substancialmente complementares aos nucleotídeos no modelo de DNA que são a montante da sequência de DNA que deve ser ampliada. "A montante"é usado aqui para referir-se a uma localização 5, à sequência de DNA a ser ampliada, com relação ao filamento ampliado. "Iniciadores reversos"são iniciadores que contêm uma região de nucleotídeos que são substancialmente complementares a um modelo de DNA de filamento duplo que são a jusante da sequência de DNA que deve ser ampliada. "A jusante"é usado aqui para referir-se a uma localização 3'à sequência de DNA a ser ampliada, com relação ao filamento de codificação.

[00388] Qualquer DNA polimerase útil para PCR pode ser usados nos métodos descritos aqui. Os reagentes e polimerase são comercialmente disponíveis de diversas fontes.

[00389] Estruturas químicas com a capacidade de promover estabilidade e/ou eficiência de translação pode também ser usadas. O RNA preferivemente tem UTRs 5’ e 3’. Em uma modalidade, uma UTR 5’ está entre um e 3000 nucleotídeos em comprimento. O comprimento de sequências de UTR 5’ e 3’ a serem adicionadas à região de codificação pode ser alterada por diferentes método, incluindo, porém nõ limitados a, designação de iniciadores para PCR que se anelam a diferentes regiões das UTRs. Usando este método, alguém versado na técnica pode modificar os comprimentos de UTR 5' e 3' requeridos para obter uma eficiência de translação ideal após transfecção do RNA transcrito.

[00390] As UTRs 5’ e 3’ podem ser as UTRs 5’ e 3’ endógenas de ocorrência natural para o ácido nucleico de interesse. Alternativamente, sequências de UTR que não são endógenas ao ácido nucleico de interesse podem ser adicionadas incorporando as sequências de UTR nos iniciadores dianteiros e reversos ou por quaisquer outras modificações do modelo. O uso de sequências de UTR que não são endógenas ao ácido nucleico de interesse pode ser útil para modificar a estabilidade e/ou eficiência de translação do RNA. Por exemplo, sabe- se que os elementos ricos em AU nas sequências de UTR 3' podem diminuir a estabilidade de mRNA. Portanto, UTRs 3' pode ser selecionadas ou designadas para aumentar a estabilidade do RNA transcrito com base nas propriedades de UTRs que são bem conhecidos na técnica.

[00391] Em uma modalidade, uma UTR 5’ pode conter a sequência Kozak do ácido nucleico endógeno. Alternativamente, quando uma UTR 5' que não é endógena ao ácido nucleico de interesse está sendo adicionada por PCR como descrito acima, uma sequência de Kozak consenso pode ser redesignada por adição de uma sequência de UTR 5’. Sequências de Kozak podem aumentar a eficiência de translação de algumas transcrições de RNA, porém não parece ser requerido quanto a todos os RNAs para garantir translação eficiente. O requerimento quanto às sequências Kozak para muitos mRNAs é conhecido na técnica. Em outras modalidades uma UTR 5’ pode ser 5’UTR de um vírus de RNA cujo genoma de RNA é estável em células. Em outras modalidades, vários análogos de nucleotídeo podem ser usados na UTR 3' ou UTR 5' para impedir a degradação de exonuclease do mRNA.

[00392] Para garantir a síntese de RNA de um modelo de DNA sem a necessidade de clonagem de gene, um promotor de transcrição deve ser ligado ao modelo de DNA a montante da sequência a ser transcrita. Quando uma sequência que funciona como um promotor para um RNA polimerase é adicionada à extremidade 5' do iniciador dianteiro, o promotor de RNA polimerase torna-se incorporado no produto de PCR a montante da estrutura de leitura aberta que deve ser transcrito. Em umamodalidade preferida, o promotor é um promotor de T7 polimerase, como descrito aqui em outro lugar. Outros promotores úteis incluem, porém não estão limitados aos promotores de RNA polimerase de T3 e SP6. Sequências de nucleotídeo de consenso para promotores de T7, T3 e SP6 são conhecidos na técnica.

[00393] Em uma modalidade preferida, o mRNA tem tanto um tamponamento na extremidade 5' quanto uma cauda de 3' poli(A) que determina a ligação de ribossoma, iniciação de translação estabilidade de mRNA na célula. Em um modelo de DNA circular, por exemplo, DNA de plasmídeo, RNA polimerase produz um produto concatemérico longo que não é adequado para expressão em células eucarióticas. A transcrição de DNA de plasmídeo linearizado na extremidade da UTR 3' resulta em mRNA de tamanho normal que não é eficaz na transfecção eucariótica mesmo se ele for poliadenilado após a transcrição.

[00394] Em um modelo de DNA linear, RNA polimerase T7 de fago pode estender a extremidade 3' da transcrição além da última base do modelo (Schenborn e Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva e Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003).

[00395] O método convencional de interação de poliA/estiramento T em um modelo de DNA é a clonagem molecular. Entretanto, sequência de poliA/T integrada em DNA de plasmídeo pode causar instabilidade de plasmídeo, que é o motivo do DNA de modelo de plasmídeo obtido de células bacterianas ser frequentemente altamente contaminado com deleções e outras aberrações. Isto torna os procedimentos de clonagem não apenas trabalhosos e demorados, porém frequentemente não seguros. Que é por isso um método que permite a construção de modelos de DNA com poliA/estiramento de T 3' em clonagem altamente desejável.

[00396] O segmento de poliA/T do padrão de DNA transcricional pode ser produzido durante PCR usando um iniciador reverso contendo uma cauda de poliT, tal como cauda de 100T (SEQ ID NO: 110) (o tamanho pode ser de 50 a 5000 T (SEQ ID NO: 111)), ou após PCR por qualquer outro método, incluindo, porém não limitado à ligação de DNA ou recombinação in vitro. Caudas de poli(A) também fornecem estabilidade aos RNAs e reduzem sua degradação. Geralmente, o comprimento de uma cauda de poli(A) positivamente correlaciona-se com a estabilidade do RNA transcrito. Em uma modalidade, a cauda de poli(A) está entre 100 e 5000 adenosinas (SEQ ID NO: 112).

[00397] Caudas de poli(A) de RNAs podem ser também estendidas seguindo a transcrição in vitro com o uso de uma poli(A) polimerase, tal como E. coli poliA polimerase (E-PAP). Em uma modalidade, aumentando o comprimento de uma cauda de poli(A) de 100 nucleotídeos para entre 300 e 400 nucleotídeos (SEQ ID NO: 113) resulta em cerca de um aumento de duas vezes na eficiência de translação do RNA. Adicionalmente, a ligação de diferentes grupos químicos à extremidade 3' pode aumentar a estabilidade de mRNA. Tal ligação pode conter nucleotídeos modificados/artificiais, aptâmeros e outros compostos. Por exemplo, análogos de ATP podem ser incorporados na cauda de poli(A) usando poli(A) polimerase. Análogos de ATP também podem aumentar a estabilidade do RNA.

[00398] Tamponamentos 5'também fornecem estabilidade para as moléculas de RNA. Em uma modalidade preferida, RNAs produzidos pelos métodos descritos aqui incluem um tamponamento 5'. O tamponamento 5'é fornecido usando técnicas conhecidas na técnica e descrito aqui (Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).

[00399] Os RNAs produzidos pelos métodos descritos aqui também podem conter uma sequência de Sítio de Entrada de Ribossoma Interno (IRES). A sequência de IRES pode ser qualquer sequência viral, cromossômica ou artificialmente designada que inicia a ligação de ribossoma independente de tamponamento ao mRNA e facilita a iniciação de translação. Quaisquer solutos adequados para eletroporação, que podem conter fatores facilitando a viabilidade e permeabilidade tal como açúcares, peptídeos, lipídeos, proteínas, antioxidantes, e tensoativos podem ser incluídos.

[00400] RNA pode ser introduzido em células alvo usando qualquer um dos diversos métodos diferentes, por exemplo, métodos comercialmente disponíveis que incluem, porém não estão limitados à electroporação (Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Cologne, Alemanha)), (ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.) ou o Gene Pulser II (BioRad, Denver, Colo.), Multiporador (Eppendort, Hamburg, Alemanha), transfecção mediada por lipossoma catiônico usando lipofecção, encapsulação de polímero, transfecção mediada por peptídeo, ou sistemas de liberação de partícula biolística tal como "pistolas de gene" (veja, por exemplo, Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001).

Métodos de Liberação não virais

[00401] Em alguns aspectos, métodos não virais podem ser usados para liberar um ácido nucleico codificando um CAR descrito aqui em uma célula ou tecidoou indivíduo.

[00402] Em algumas modalidades, o método não viral inclui o uso de um transposon (também chamado um elemento transponível). Em algumas modalidades, um transposon é uma parte de DNA que pode autoinserir-se em um local em um genoma, por exemplo, uma parte de DNA que é capaz deautorreplicar-se e inserir sua cópia em um genoma, ou uma parte de DNA que pode ser emendada de um ácido nucleico maior e inserida em outro lugar em um genoma. Por exemplo, a transposon compreende uma sequência de DNA preparada de repetições invertidas que flanqueiam genes para transposição.

[00403] Métodos exemplares de liberação de ácido nucleico usando um transposon incluem um sistema de transposon Bela Adormecida (SBTS) e um sistema de transposon piggyBac (PB). Veja, por exemplo, Aronovich et al. Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011):R14-20; Singh et al. Cancer Res. 15(2008):2961-2971; Huang et al. Mol. Ther. 16(2008):580-589; Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010):1200-1209; Kebriaei et al. Blood. 122.21(2013):166; Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16; Bell et al. Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65; e Ding et al. Cell. 122.3(2005):473-83, todos os quais são incorporados aqui por referência.

[00404] O SBTS inclui dois componentes: 1) um transposon contendo um transgene e 2) uma fonte de enzima transposase. A transposase pode transpor o transposon de um plasmídeo transportador (ou outro DNA doador) para um DNA alvo, tal como um cromossoma/genoma de célula hospedeira. Por exemplo, a transposase liga-se ao plasmídeo transportador/DNA doador, corta o transposon (incluindo transgene(s)) fora do plasmídeo, e inserí-lo no genoma da célula hospedeira. Veja, por exemplo, Aronovich et al. supra.

[00405] Transposons exemplares incluem um transposon com base em pT2. Veja, por exemplo, Grabundzija et al. ácidos nucleicos Res. 41.3(2013):1829-47; e Singh et al. Cancer Res. 68.8(2008): 2961-2971, todos os quais são incorporados aqui por referência. Transposases exemplares incluem uma transposase do tipo Tc1/mariner, por exemplo, a SB10 transposase ou a SB11 transposase (uma transposase hiperativa que pode ser expressa, por exemplo, de um promotor de citomegalovírus). Veja, por exemplo, Aronovich et al.; Kebriaei et al.; e Grabundzija et al., todos os quais são incorporados aqui por referência.

[00406] Uso do SBTS permite integração eficiente e expressão de um transgene, por exemplo, um ácido nucleico codificando um CAR descrito aqui. Sãofornecidos aqui métodos de geração de uma célula, por exemplo, célula T ou célula NK, que estavelmente expressa um CAR descrito aqui, por exemplo, usando um sistema de transposon tal como SBTS.

[00407] De acordo com os métodos descritos aqui, em algumas modalidades, um ou mais ácidos nucleicos, por exemplo, plasmídeos, contendo os componentes de SBTS são liberados a uma célula (por exemplo, célula T ou NK). Por exemplo, o(s) ácido(s) nucleico(s) é liberado por métodos padrões de liberação de ácido nucleico (por exemplo, DNA de plasmídeo), por exemplo, métodos descritos aqui, por exemplo, electroporação, transfecção, ou lipofecção. Em algumas modalidades, o ácido nucleico contém um transposon compreendendo um transgene, por exemplo, um ácido nucleico codificando um CAR descrito aqui. Em algumas modalidades, o ácido nucleico contém um transposon compreendendo um transgene (por exemplo, um ácido nucleico codificando um CAR descrito aqui) bem como uma sequência de ácido nucleico codificando uma enzima transposase. Em outras modalidades, um sistema com dois ácidos nucleicos é fornecido, por exemplo, um sistema de plasmídeo dual, por exemplo, onde um primeiro plasmídeo contém um transposon compreendendo um transgene, e um segundo plasmídeo contém uma sequência de ácido nucleico codificando umaenzima transposase. Por exemplo, o primeiro e o segundo ácidos nucleicos são coliberados em uma célula hospedeira.

[00408] Em algumas modalidades, células, por exemplo, células T ou NK, são geradas que expressam um CAR descrito aqui usando uma combinação de inserção de gene usando o SBTS e edição genética usando uma nuclease (por exemplo, nucleases de dedo de zinco (ZFNs), Nucleases Efetoras semelhantes ao Ativador de Transcrição (TALENs), o sistema de CRISPR/Cas, ou o sistema CRISPR/Cas, ou meganuclease construída reconstruiu endonucleases homing).

[00409] Em algumas modalidades, uso de um método não viral de liberação permite reprogramação de células, por exemplo, células T ou NK, e infusão direta das células em um indivíduo. Vantagens de vetores não virais incluem, porém não estão limitados à facilidade e custo relativamente baixo de produção de quantidades suficientes requeridas para atender uma população de paciente, estabilidade durante a armazenagem, e falta de imunogenecidade.

Construtos de Ácido Nucleico Codificando um CAR

[00410] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico codificando um ou mais construtos de CAR descritas aqui. Em um aspecto, a molécula de ácido nucleico é fornecida como um mensageiro de transcrição de RNA. Em um aspecto, a molécula de ácido nucleico é fornecida como uma construção de DNA.

[00411] Consequentemente, em um aspecto, a invenção pertence a uma molécula de ácido nucleico isolada codificando um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que o CAR compreende um domínio de ligação anti-CD19 (por exemplo, um domínio de ligação anti-CD19 humanizado), um domínio de transmembrana, e um domínio de sinalização intracelular compreendendo um domínio estimulatório, por exemplo, um domínio de sinalização coestimulatório e/ou um domínio de sinalização primária, por exemplo, cadeia zeta. Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 é um domínio de ligação anti-CD19 descrito aqui, por exemplo, um domínio de ligação anti-CD19 que compreende uma sequência selecionada de um grupo que consiste em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 e SEQ ID NO:59, ou uma sequência com 95 a 99% de identidade da mesma. Em uma modalidade, o domínio de transmembrana é o domínio de transmembrana de uma proteína selecionada do grupo que consiste na cadeia alfa, beta ou zeta do receptor de célula T, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 e CD154. Em uma modalidade, o domínio de transmembrana compreende uma sequência de SEQ ID NO: 15, ou uma sequência com 95 a 99% de identidade da mesma. Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 é conectado ao domínio de transmembrana por uma região de articulação, por exemplo, uma articulação descrita aqui. Em uma modalidade, a região de articulação compreende SEQ ID NO:14 ou SEQ ID NO:45 ou SEQ ID NO:47 ou SEQ ID NO:49, ou uma sequência com 95 a 99% de identidade da mesma. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico isolada também compreende uma sequência codificando um domínio coestimulatório. Em uma modalidade, o domínio coestimulatório é um domínio de sinalização funcional de uma proteína selecionada do grupo que consiste em OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), e 4-1BB (CD137). Em uma modalidade, o domínio coestimulatório compreende uma sequência de SEQ ID NO:16, ou uma sequência com 95 a 99% de identidade da mesma. Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização funcional de 4-1BB e um domínio de sinalização funcional de CD3 zeta. Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular compreende a sequência de SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO:51, ou uma sequência com 95 a 99% de identidade da mesma, e a sequência de SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO:43, ou uma sequência com 95 a 99% de identidade da mesma, em que as consequências compreendendo o domínio de sinalização intracelular são expressas na mesma estrutura e como uma cadeia de polipeptídeo simples.

[00412] Em outro aspecto, a invenção pertence a uma molécula de ácido nucleico isolada codificando uma construção de CAR compreendendo uma sequência líder de SEQ ID NO: 13, um domínio de scFv tendo uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, e SEQ ID NO:59, (ou uma sequência com 95 a 99% de identidade da mesma), uma região de articulação de SEQ ID NO:14 ou SEQ ID NO:45 ou SEQ ID NO:47 ou SEQ ID NO:49 (ou uma sequência com 95 a 99% de identidade da mesma), um domínio de transmembrana tendo uma sequência de SEQ ID NO: 15 (ou uma sequência com 95 a 99% de identidade da mesma), um domínio coestimulatório de 4-1BB tendo uma sequência de SEQ ID NO:16 ou um domínio coestimulatório de CD27 tendo uma sequência de SEQ ID NO:51 (ou uma sequência com 95-99% de identidade da mesma), e um domínio estimulatório de CD3 zeta tendo uma sequência de SEQ ID NO:17 ou SEQ ID NO:43 (ou uma sequência com 95 a 99% de identidade da mesma).

[00413] Em outro aspecto, a invenção pertence a uma molécula de polipeptídeo isolada codificada pela molécula de ácido nucleico. Em uma modalidade, a molécula de polipeptídeo isolada compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:59 ou uma sequência com 95 a 99% de identidade da mesma.

[00414] Em outro aspecto, a invenção pertence a uma molécula do ácido nucleico codificando um receptor de antígeno quimérico (CAR) molecule que compreende um domínio de ligação anti-CD19, um domínio de transmembrana, e um domínio de sinalização intracelular compreendendo um domínio estimulatório, e em que o referido domínio de ligação anti-CD19 compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 e SEQ ID NO:59, ou uma sequência com 95-99% de identidade da mesma.

[00415] Em uma modalidade, a molécula de CAR codificada também compreende uma sequência codificando um domínio coestimulatório. Em uma modalidade, o domínio coestimulatório é um domínio de sinalização funcional de uma proteína selecionada do grupo que consiste em OX40, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18) e 4-1BB (CD137). Em uma modalidade, o domínio coestimulatório compreende uma sequência de SEQ ID NO:16. Em uma modalidade, o domínio de transmembrana é um domínio de transmembrana de uma proteína selecionada do grupo que consiste na cadeia alfa, beta ou zeta do receptor de célula T, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 e CD154. Em uma modalidade, o domínio de transmembrana compreende uma sequência de SEQ ID NO:15. Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização funcional de 4-1BB e um domínio de sinalização funcional de zeta. Em uma modalidade, o domínio de sinalização intracelular compreende a sequência de SEQ ID NO: 16 e a sequência de SEQ ID NO: 17, em que as consequências compreendendo o domínio de sinalização intracelular são expressas na mesma estrutura e como uma cadeia de polipeptídeo simples. Em uma modalidade, o domínio de ligação anti-CD19 é conectado ao domínio de transmembrana por uma região de articulação. Em uma modalidade, a região de articulação compreende SEQ ID NO:14. Em uma modalidade, a região de articulação compreende SEQ ID NO:45 ou SEQ ID NO:47 ou SEQ ID NO:49.

[00416] Em outro aspecto, a invenção pertence a uma molécula de CAR codificada compreendendo uma sequência líder de SEQ ID NO: 13, um domínio de scFv tendo uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, e SEQ ID NO:59, ou uma sequência com 95 a 99% de identidade da mesma, uma região de articulação de SEQ ID NO:14 ou SEQ ID NO:45 ou SEQ ID NO:47 ou SEQ ID NO:49, um domínio de transmembrana tendo uma sequência de SEQ ID NO: 15, um domínio coestimulatório de 4-1BB tendo uma sequência de SEQ ID NO:16 ou um domínio coestimulatório de CD27 tendo uma sequência de SEQ ID NO:51, e um domínio estimulatório de CD3 zeta tendo uma sequência de SEQ ID NO:17 ou SEQ ID NO:43. Em uma modalidade, a molécula de CAR codificada compreende uma sequência selecionada de um grupo que consiste em SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, e SEQ ID NO:59, ou uma sequência com 95-99% de identidade da mesma.

[00417] As sequências de ácido nucleico codificando asmoléculas desejadas podem ser obtidas usando métodos recombinantes conhecidos na técnica, tal como, por exemplo, analisando as bibliotecas de células expressando o gene, derivando o gene de um vetor conhecido incluir o mesmo, ou isolando diretamente de células e tecidos contendo o mesmo, usando técnicas padrão. Alternativamente, o gene de interesse pode ser sinteticamente produzido, em vez de clonado.

[00418] A presente invenção também fornece vetores em que um DNA da presente invenção é inserido. Vetores derivados de retroviroses tal como o lentivírus são ferramentas adequadas para obter transferência de gene de longa duração desde que elas permitam integração estável, de longa duração de um transgene e sua propagação em células filhas. Vetores lentivirais têm a vantagem adicionada sobre vetores derivados de oncorretroviroses tal como viroses de leucemia de murino, pelo fato de que eles podem transduzir células não proliferantes, tal como hepatócitos. Eles também têm a vantagem adicionada da baixa imunogenicidade. Um vetor retroviral pode também ser, por exemplo, um vetor gama-retroviral. Um vetor gama-retroviral pode incluir, por exemplo, um promotor, um sinal de empacotamento (^), um sítio de ligação de iniciador (PBS), uma ou mais (por exemplo, duas) repetições terminais longas (LTR), e um transgene de interesse, por exemplo, um gene codificando um CAR. Um vetor gama-retroviral pode não ter genes estruturais virais tal como gag, pol, e env. Vetores gama-retrovirais exemplares incluem Vírus de Leucemia de Murino (MLV), Vírus de Formação de Foco de Baço (SFFV), e Vírus de Sarcoma Mieloproliferativo (MPSV), e vetores derivados a partir destes. Outros vetores gama-retrovirais são descritos, por exemplo, em Tobias Maetzig et al., "Gammaretroviral vetors: Biology, Technology and Application"Viruses. Junho de 2011 3(6): 677-713.

[00419] Em outra modalidade, o vetor compreendendo o ácido nucleico codificando o CAR desejado da invenção é um vetor adenoviral (A5/35). Em outra modalidade, a expressão de ácidos nucleicos codificando CARs pode ser realizada usando transposons tal como bela adormecida, crisper, CAS9, e nucleasesde dedo de zinco. Veja abaixo, June et al. 2009Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716, é incorporado aqui por referência.

[00420] Em breve sumário, a expressão de ácidos nucleicos naturais ou sintéticos codificando CARs é tipicamente obtida ligando operavelmente um ácido nucleico codificando o polipeptídeo de CAR ou porções do mesmo a um promotor, e incorporando a construção em um vetor de expressão. Os vetores podem ser adequados para replicação e integração de eucariotas. Vetores de clonagem típicas contêm terminadores de transcrição e translação, sequências de iniciação, e promotores úteis para regulação da expressão da sequência de ácido nucleico desejado.

[00421] Os construtos de expressão da presente invenção também podem ser usados para imunização de ácido nucleico e terapia de gene, usando protocolos de liberação de gene padrão. Métodos para liberação de gene são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos n°s 5.399.346, 5.580.859, 5.589.466, incorporadas por referência aqui em suas totalidades. Em outra modalidade, a invenção fornece um vetor de terapia de gene.

[00422] O ácido nucleico pode ser clonado em diversos tipos de vetores. Por exemplo, o ácido nucleico pode ser clonado em um vetor incluindo, porém não limitado a um plasmídeo, um fagemídeo, um derivado de fago, um vírus de animal, e um cosmídeo. Vetores de interesse particular incluem vetores de expressão, vetores de replicação, vetores de geração de sonda, e vetores de sequenciamento.

[00423] Além disso, o vetor de expressão pode ser fornecido a uma célula na forma de um vetor viral. Tecnologia de vetor viral é bem conhecida na técnica e é descrita, por exemplo, em Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1 -4, Cold Spring Harbor Press, NY), e em outros manuais de virologia e biologia molecular. Vírus, que são úteis como vetores incluem, porém não estão limitados aos retrovírus, adenovírus, vírus adeno- associados, vírus da herpes, e lentivírus. Em general, um vetor adequado contém uma origem de replicação funcional em pelo menos um organismo, uma sequência promotora, sítios de endonuclease de restrição conveniente, e um ou mais marcadores selecionáveis, (por exemplo, WO 01/96584; WO 01/29058; e Patente dos Estados Unidos n° 6.326.193).

[00424] Diversos sistemas com base viral foram desenvolvidos para transferência de gene em células mamíferas. Por exemplo, retrovírus fornecem uma plataforma conveniente para sistemas de liberação de gene. Um gene selecionado pode ser inserido em um vetor e embalado em partículas retrovirais usando técnicas conhecidas na técnica. O vírus recombinante pode em seguida ser isolado e liberado para células do indivíduo in vivo ou ex vivo. Diversos sistemas retrovirais são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, vetores de adenovírus são usados. Diversos vetores de adenovírus são conhecidos na técnica. Em uma modalidade, vetores de lentivírus são usados.

[00425] Elementos de promotor adicionais, por exemplo, realçadores, regulam a frequência de iniciação transcricional. Tipicamente, estes estão localizados na região 30-110 pb a montante do sítio de partida, embora diversos promotores tenham mostrado conter também elementos funcionais a jusante do sítio de partida. O espaçamento entre os elementos de promotor frequentemente é flexível, de modo que a função do promotor seja preservada quando elementos são invertidos ou movidos, com relação um ao outro. No promotor de timidina cinase (tk), o espaçamento entre elementos de promotor pode ser aumentado para 50 pb à parte, antes da atividade começar a declinar. Dependendo do promotor, parece que elementos individuais podem funcionar cooperativa ou independentemente para ativar a transcrição. Promotores exemplares incluem o gene IE de CMV, EF-1a, ubiquitina C, ou promotores de fosfoglicerocinase (PGK).

[00426] Um exemplo de um promotor que é capaz de expressar um transgene de CAR em uma célula T mamífera é o promotor de EF1a. O promotor de EF1a nativo regula a expressão da subunidade alfa do complexo de fator 1 de alongamento, que é responsável pela liberação enzimática de tRNAs de aminoacila para o ribossoma. O promotor de EF1a foi extensivamente usado em plasmídeos de expressão mamífera e mostrou ser eficaz na regulação de expressão de CAR de transgenes clonados em um vetor lentiviral. Veja, por exemplo, Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009). Em um aspecto, o promotor de EF1a promotor a sequência fornecida como SEQ ID NO:100.

[00427] Outro exemplo de um promotor é a sequência de promotor de citomegalovírus (CMV) imediato precoce. Esta sequência de promotor é uma sequência de promotor constitutiva forte, capaz de regular os altos níveis de expressão de sequência de polinucleotídeo operavelmente ligados à ela. Entretanto, outras sequências de promotor constitutivas também podem ser usadas, incluindo, porém não limitadas ao promotor precoce de vírus símio 40 (SV40), vírus de tumor mamário de camundongo (MMTV), promotor de repetição terminal longa (LTR) de vírus da imunodeficiência humana (HIV), promotor de MoMuLV, um promotor do vírus da leucemia aviária, um promotor precoce imediato do vírus Epstein-Barr, um promotor do vírus de sarcoma Rous, bem como promotores de gene humano tais como, porém não limitados ao promotor de actina, o promotor de miosina, o promotor de fator 1 de alongamento, o promotor de hemoglobina, e o promotor de creatina cinase. Além disso, a invenção não deve ser limitada ao uso de promotores constitutivos. Promotores induzíveis são também contemplados como parte da invenção. O uso de um promotor induzível fornece um comutador molecular capaz de ligar a expressão da sequência de polinucleotídeo à qual ele é operavelmente ligado quando tal expressão é desejada, ou desligar a expressão quando a expressão não é desejada. Exemplos de promotores induzíveis incluem, porém não estão a um promotor de metalotionina, um promotor de glicocorticoide, um promotor de progesterona, e um promotor de tetraciclina.

[00428] Um vetor pode também incluir, por exemplo, uma sequência de sinalpara facilitar a secreção, um terminador de sinal de poliadenilação e transcrição (por exemplo, de gene de Hormônio do Crescimento Bovino (BGH)), um elemento permitindo a replicação epissomal e replicação em procariotas (por exemplo, origem SV40 e ColE1 ou outros conhecidos na técnica) e/ou elementos para permitir a seleção (por exemplo, gene de resistência à ampicilina e/ou marcador de zeocina).

[00429] A fim de avaliar a expressão de um polipeptídeo de CAR ou porção do mesmo, o vetor de expressão a ser introduzido em uma célula pode também conter um gene marcador selecionável ou um gene reporter ou ambos para facilitar a identificação e seleção de células de expressão das populações de célula pesquisada ser transfectada ou infectada por meio de vetores virais. Em outros aspectos, o marcador selecionável pode ser continuado em uma parte separada de DNA e usado em um procedimento de cotransfecção. Tanto marcadores selecionáveis quanto genes repórteres podem ser flanqueados com sequências regulatórias apropriadas para garantir a expressão nas células hospedeiras. Marcadores selecionáveis úteis incluem, por exemplo, genes de resistência a antibiótico, tais como neo e similares.

[00430] Os genes repórteres são usados para identificação de células potencialmente transfectadas e para avaliação da funcionalidade de sequências regulatórias. Em geral, um gene repórter é um gene que não está presente em ou expresso pelo organismo ou tecido receptor e que codifica um polipeptídeo cuja expressão é manifestada por alguma propriedade facilmente detectável, por exemplo, atividade enzimática. A expressão do gene repórter é ensaiada em um período de tempo após o DNA ter sido introduzida nas células receptoras. Genes repórteres adequados podem incluir genes codificando luciferase, beta-galactosidase, cloranfenicol acetil transferase, fosfatase alcalina secretada, ou gene de proteína fluorescente verde (por exemplo, Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Sistemas de expressão adequados são bem conhecidos e podem ser preparados usando técnicas obtidas ou comercialmente obtidos. Em geral, a construção da região de flanqueamento 5’ mínimo mostrando o nível mais elevado de expressão de gene repórter é identificada como o promotor. Tais regiões promotoras podem ser ligadas a um gene repórter e usadas para avaliar os agents quanto a capacidade de modular ua transcrição regulada por promotor.

[00431] Métodos de introdução e expressão de genes em uma célula são conhecidos na técnica. No contexto de um vetor de expressão, o vetor pode ser facilmente introduzido em uma célula hospedeira, por exemplo, célula mamífera, bacteriana, de levedura, ou de inseto por qualquer método na técnica. Por exemplo, o vetor de expressão pode ser transferido em uma célula hospedeira por métodos físicos, químicos ou biológicos.

[00432] Métodos físicos para introdução de um polinucleotídeo em uma célula hospedeira incluem precipitação de fosfato de cálcio, lipofecção, bombardeio de partícula, microinjeção, eletroporação, e similares. Métodos para produção de células compreendendo vetores e/ou ácidos nucleicos exógeno são bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY). Um método preferido para a introdução de um polinucleotídeo em uma célula hospedeira é transfecção de fosfato de cálcio.

[00433] Métodos biológicos para introdução de um polinucleotídeo de interesse em uma célula hospedeira incluem o uso de vetores de DNA e RNA. Vetores virais, e especialmente vetores retrovirais, tornaram-se o método mais amplamente usado para inserção de genes em mamíferos, por exemplo, células humanas. Outros vetores virais podem ser derivados de lentivírus, poxvírus, vírus do herpes simples I, adenovírus e vírus adeno-associado, e similares. Veja, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos n°s 5.350.674 e 5.585.362.

[00434] Métodos químicos para introdução de um polinucleotídeo em uma célula hospedeira incluem sistemas de dispersão coloidal, tal como complexos macromoleculares, nanocápsulas, microesferas, contas, e sistemas com base lipídio incluindo emulsões óleo-em-água, micelas, micelas mistas, e lipossomas. Um sistema coloidal exemplar para uso como um veículo de liberação in vitro e in vivoé um lipossoma (por exemplo, uma vesícula de membrana artificial). Outros métodos de liberação alvejada de estado da técnica de ácidos nucleicos são disponíveis, tal como liberação de polinucleotídeos com nanopartículas alvejadas ou outro sistema de liberação de tamanho submícron adequado.

[00435] No caso onde um sistema de liberação não viral é utilizado, um sistema de liberação exemplar é um lipossoma. O uso de formulações de lipídio é contemplado para a introdução dos ácidos nucleicos em uma célula hospedeira (in vitro, ex vivo ou in vivo). Em outro aspecto, o ácido nucleico pode ser associado com um lipídio. O ácido nucleico associado com um lipídio pode ser encapsulado na interior aquoso de um lipossoma, intercalado dentro da bicamada de lipídio de um lipossoma, ligado a um lipossoma por meio de uma molécula de ligação que é associada tanto com o lipossoma quanto oligonucleotídeo, capturado em um lipossoma, complexado com um lipossoma, disperso em uma solução contendo um lipídio, misturado com um lipídio, combinado com um lipídio, contido como uma suspensão em um lipídio, contido ou complexado com uma micela, ou de outro modo associada com um lipídio. Composições associadas com lipídio, lipídio/DNA ou lipídio/vetor de expressão não estão limitadas a qualquer estrutura particular em solução. Por exemplo, eles podem estar presentes em uma estrutura de bicamada, como micelas, ou com uma estrutura "em colapso". Eles também podem simplesmente ser intercalados em uma solução, possivelmente formando agregados que não são uniformes em tamanho ou forma. Os lipídios são substâncias graxas que podem ser lipídios de ocorrência natural ou sintéticos. Por exemplo, lipídios incluem ou dupletos graxos que ocorrem naturalmente no citoplasma bem como a classe de compostos que contém hidrocarbonetos alifáticos de cadeia longa e seus derivados, tais como ácidos graxos, álcoois, aminas, amino álcoois, e aldeídos.

[00436] Lipídios adequados para uso podem ser obtidos defontes comerciais. Por exemplo, dimiristil fosfatidilcolina ("DMPC") pode ser obtido de Sigma, St. Louis, MO; dicetil fosfato ("DCP") pode ser obtido de K & K Laboratories (Plainview, NY); colesterol ("Choi") pode ser obtido de Calbiochem-Behring; dimiristil fosfatidilglicerol ("DMPG") e outros lipídios podem ser obtidos de Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL.). Soluções de material prima de lipídios em clorofórmio ou clorofórmio/metanol podem ser armazenadas a cerca de -20°C. Clorofórmio é usado como o único solvente, visto que ele é mais facilmente evaporado do que o metanol. "Lipossoma" é um termo genérico abrangendo a uma variedade de veículos de lipídio simples e multilamelares formados pela geração de bicamadas de lipídio fechadas ou agregados. Os lipossomas podem ser caracterizados como tendo estruturas vesiculares com uma membrana de bicamada fosfolipídica e um meio aquoso interno. Lipossomas multilamelares têm camadas lipídicas separadas por meio aquoso. Eles se formam espontaneamente quando os fosfolipídios são suspensos em um excesso de solução aquosa. Os components lipídicos passam por autorrecombinação antes da formação de estruturas fechadas e capturam água e solutos dissolvidos entre as bicamadas lipídicas (Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). Entretanto, composições que têm estruturas diferentes estruturas em solução daquelas da estrurura vesicular normal são também abrangidas. Por exemplo, os lipídios podem assumir uma estrutura de micela ou meramente existir como agregados não uniformes de moléculas lipídicas. São também contemplados complexos de lipofectamina-ácido nucleico.

[00437] Independente do método usado para introduzir ácidos nucleicos exógenos em uma célula hospedeira ou de outro modo expôr uma célula ao inibidor da presente invenção, a fim de confirmar a presença da sequência de DNA recombinante na célula hospedeira, uma variedade de ensaios pode ser realizada. Tais ensaios incluem, por exemplo, ensaios "biológicos moleculares" bem conhecidos por aqueles versados na técnica, tais como Southern e Northern blotting, RT-PCR e PCR; "ensaios bioquímicos"tais como detecção da presença ou ausência de um peptídeo particular, por exemplo, por métodos imunológicos (ELISAs e Western blots) ou por ensaios descritos aqui para identificar agentes que se inluem no escopo da invenção.

[00438] A presente invenção taambém fornece um vetor compreendendo um CAR codificando molécula de ácido nucleico. Em um aspecto, um vetor de CAR pode ser diretamente transduzido em uma célula, por exemplo, uma célula T. Em um aspecto, o vetor é um vetor de clonagem ou expressão, por exemplo, um vetor incluindo, porém não limitado a um ou mais plasmídeos (por exemplo,plasmídeos de expressão, vetores de clonagem, microcírculos, minivetores, double minuto chromosomes), construtosde vetor retroviral e lentiviral. Em um aspecto, o vetor é capaz de expressar a construção de CAR em células T mamíferas. Em um aspecto, a célula T mamífera é uma célula T humana.

Fontes de Células

[00439] Antes da expansão e modificação genética ou outra modificação, um fonte de células, por exemplo, células T ou células exterminadoras naturais (NK), pode ser obtida de um indivíduo. O termo "indivíduo" destina-se a incluir organismos vivos em que uma resposta imune pode ser eliciada (por exemplo, mamíferos). Exemplos de indivíduos incluem humanos, macacos, chimpanzés, cachorros, gatos, camundongos, ratos, e espécies transgênicas dos mesmos. Células T podem ser obtidas de diversas fontes, incluindo células mononucleares de sangue periférico, medula óssea, tecido de linfonodo, sangue de cordão, tecido timo, tecido de um sítio de infecção, ascites, efusão pleural, tecido do baço e tumores.

[00440] Em certos aspectos da presente invenção, células efetoras imunes, por exemplo, células T, podem ser obtidas de uma unidade de sangue coletado de um indivíduo usando qualquer número de técnicas conhecidas pelo técnico versado, tal como separação Ficoll™. Em um aspecto preferido, células do sangue circulante de um indivíduo são obtidospor aferése. O produto de aferése tipicamente contém linfócitos, incluindo células T, monócitos, granulócitos, células B, outros glóbulos brancos nucleados, glóbulos vermelhos, e plaquetas. Em um aspecto, as células coletadas por aferése podem ser lavadas para fornecer a fração de plasma e, opcionalmente, para colocar as células em um tampãoou meios apropriados para etapas de procesamento subsequentes. Em uma modalidade, as células são lavadas com salina tamponada por fosfato (PBS). Em uma modalidade alternativa, a solução de lavagem nãotem cálcio e pode não ter magnésio ou pode não ter, senão todos, os cátions divalentes.

[00441] As etapas de ativação iniciais na ausência de cálcio podem induzir à ativação ampliada. Como aqueles versados na técnica podem facilmente apreciar, uma etapa de lavagem pode ser realizada por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, tal como usando uma centrífuga de "fluxo total" semiautomatizada (por exemplo, o Cobe 2991 cell processor, o Baxter CytoMate, ou o Haemonetics Cell Saver 5) de acordo com as instruções do fabricante. Após lavagem, as células podem ser ressuspensas em uma variedade de tampões biocompatíveis, tais como, por exemplo, livre de Ca, PBS livre de Mg, PlasmaLyte A, ou outra solução salina com ou sem tampão. Alternativamente, Os componentes indesejáveis daamostra de aferése podem ser removidos e as células diretamente ressuspensas em meios de cultura.

[00442] Em um aspecto, células T são isoladas de linfócitos de sangue periférico lisando os glóbulos vermelhos e depauperando os monócitoos, por exemplo, por centrifugação através de um gradiente PERCOLLTM ou por elutriação centrífuga de contrafluxo.

[00443] Os métodos descritos aqui podem incluem, por exemplo, seleção de uma subpopulação específica de células efetoras imunes, por exemplo, células T, que são uma população depauperada por célula T regulatória, células CD25+ depauperada, usando, por exemplo, uma técnica de seleção negativa, por exemplo, descrito aqui. Preferivelmente, as populações de célula T depauperadas regulatórias contém menos do que 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% de células CD25+.

[00444] Em uma modalidade, células T regulatórias, por exemplo, células T de CD25+, são removidas da população usando um anticorpo anti-CD25, ou fragmento do mesmo, ou um ligante de ligação de CD25, IL-2. Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD25, ou fragmento do mesmo, ou ligante de ligação de CD25 é conjugado a um substrato, por exemplo, uma conta, ou é de outro modo revestido em um substrato, por exemplo, uma conta. Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD25, ou fragmento da mesma, é conjugado a um substrato como descrito aqui.

[00445] Em uma modalidade, as células T regulatórias, por exemplo, células T CD25+, são removidas da população usando reagente de depleção de CD25 de MiltenyiTM. Em uma modalidade, a relação de células tpara reagente de depleção de CD25 é de 1e7 células para 20 uL, ou 1e7 células para 15 uL, ou 1e7 células para 10 uL, ou 1e7 células para 5 uL, ou 1e7 células para 2,5 uL, ou 1e7 células para 1,25 uL. Em uma modalidade, por exemplo, para células T regulatórias, por exemplo, depleção de CD25+, maior do que 500 milhões de células/mL é usada. Em um outro aspecto, uma concentração de células de 600, 700, 800, ou 900 milhões de células/mL é usada.

[00446] Em uma modalidade, as populações de célula efetoras imunes a ser depauperada inclui cerca de 6 x 109células T de CD25+. Em outros aspectos, as populações de célula efetoras imunes a ser depauperada incluem cerca de 1 x 109 a 1x 1010célula T de CD25+, e qualquer valor de número inteiro entre eles. Em uma modalidade, a população resultante de células T depauperadas regulatórias tem 2 x 109células T regulatórias, por exemplo, células CD25+, ou menos (por exemplo, 1 x 109, 5 x 108 , 1 x 108, 5 x 107, 1 x 107, ou menos de células CD25+).

[00447] Em uma modalidade, as células T regulatórias, por exemplo, células CD25+, são removidos da solução usando o sistema CliniMAC com um conjunto de tubos de depleção, tal como, por exemplo, tubo 162-01. Em uma modalidade, o sistema CliniMAC é realizado em uma configuração de depleção tal como, por exemplo, DEPLETION2.1.

[00448] Sem desejar estar ligado a uma teoria particular, o decréscimo do nível de reguladores negativos de células imunes (por exemplo, decréscimo do número de células imunes indesejadas, por exemplo, células TREG), em um indivíduo antes da aférese ou durante a fabricação de um produto de célula expressando CAR pode reduzir o risco de reincidência do indivíduo. Por exemplo, métodos de depleção de células TREG são conhecidos na técnica. Métodos de decréscimo de células TREG incluem, porém não estão limitados à ciclofosfamida, anticorpo anti-GITR (um anticorpo anti-GITR descrito aqui), depleção de CD25, e combinações dos mesmos.

[00449] Em algumas modalidades, os métodos de fabricação compreendem reduzir o número de (por exemplo, depleção) células TREG antes da fabricação da célula expressando CAR. Por exemplo, métodos de fabricação compreendem contatar a amostra, por exemplo, a amostra de aferése, com um anticorpo anti-GITR e/ou um anticorpo anti-CD25 (ou fragmento da mesma, ou um ligante de ligação de CD25), por exemplo, para depauperar as células TREG antes da fabricação do produto de célula expressando CAR (por exemplo, célula T, célula NK).

[00450] Em uma modalidade, um indivíduo é pré-tratado com uma ou mais terapias que reduzem as células TREG antes da coleta de células para fabricação de produto de célula expressando CAR, desse modo reduzindo o risco do indivíduo reincindir ao tratamento com célula expressando CAR. Em uma modalidade, métodos de diminuição de células TREG incluem, porém não estão limitados à administração ao indivíduo de um ou mais de ciclofosfamida, anticorpo anti-GITR, depleção de CD25, ou uma combinação dos mesmos. A administração de um ou mais de ciclofosfamida, anticorpo anti-GITR, depleção de CD25, ou uma combinação dos mesmos, pode ocorrer antes, durante ou depois de uma infusão do produto de célula expressando CAR.

[00451] Em uma modalidade, um indivíduo é pré-tratado com ciclofosfamida antes da coleta de células para a fabricação de produto de célula expressando CAR, desse modo reduzindo o risco do indivíduo reincindir ao tratamento com célula expressando CAR. Em uma modalidade, um indivíduo é pré-tratado com um anticorpo anti-GITR antes da coleta de células para fabricação de produto de célula expressando CAR, desse modo reduzindo o risco do indivíduo reincindir ao tratamento com célula expressando CAR.

[00452] Em uma modalidade, as populações de célula a serem removida não são nem as células T regulatórias nem células de tumor, porém células que de outro modo afetam negativamente a expansão e/ou função de células CART, por exemplo, células expressando CD14, CD11b, CD33, CD15, ou outros marcadores expressos por células potencialmente imunossupressoras. Em uma modalidade, tais células são pretendidas ser removidas concorrentemente com células T regulatórias e/ou células de tumor, ou seguindo a referida depleção, ou em outra ordem.

[00453] Os métodos descritos aqui podem incluir mais do que uma etapa de seleção, por exemplo, mais do que uma etapa de depleção. O enriquecimento de uma população de célula T por seleção negativa pode ser realizada, por exemplo, com uma combinação de anticorpos direcionados aos marcadores de superfície exclusivos às células negativamente selecionadas. Um método é a classificação e/ou seleção de células por meio de imunoaderência magnética negativa ou citometria de fluxo que usa um coquetel de anticorpos monoclonais direcionado aos marcadores de superfície celular presentes nas células negativamente selecionadas. Por exemplo, para enriquecer as células CD4+ por seleção negativa, um coquetel de anticorpo monoclonal pode incluir anticorpos para CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, e CD8.

[00454] Os métodos descritos aqui também podem incluir a remoção de células da população que expressa um antígeno de tumor, por exemplo, um antígeno de tumor que não compreende CD25, por exemplo, CD19, CD30, CD38, CD123, CD20, CD14 ou CD11b, para desse modo fornecer umas populações de célula regulatórias depauperadas, por exemplo, depauperadas por CD25+, e depauperadas por antígeno de tumor que são adequadas para expressão de um CAR, por exemplo, um CAR descrito aqui. Em uma modalidade, células expressando antígeno de tumor são removidas simultaneamente com as células T regulatórias, por exemplo, células CD25+. Por exemplo, um anticorpo anti-CD25, ou fragmento do mesmo, e um anticorpo de antígeno antitumor, ou fragmento do mesmo, pode ser ligado ao mesmo substrato, por exemplo, conta, que pode ser usado para remover células ou um anticorpo anti-CD25, ou fragmento do mesmo, ou o anticorpo de antígeno antitumor, ou fragmento do mesmo, pode ser ligado às contas separadas, uma mistura das quais pode ser usada para remover as células. Em outras modalidades, a remoção de células T regulatórias, por exemplo, células CD25+, e a remoção das células expressando antígeno de tumor é sequencial, e pode ocorrer, por exemplo, em qualquer ordem.

[00455] São também fornecidos métodos que incluem a remoção de células da população que expressa um inibidor de ponto de checagem, por exemplo, um inibidor de ponto de checagem descrito aqui, por exemplo, uma ou mais de células PD1+, células LAG3+, e células TIM3+, para desse modo fornecer umas populações de célula T regulatórias depauperadas, por exemplo, células depauperadas por CD25+, e células depauperadas por inibidor de ponto de checagem, por exemplo, células depauperadas por PD1+, LAG3+ e/ou TIM3+. Inibidores de ponto de checagem exemplares incluem B7-H1, B7-1, CD160, P1H, 2B4, PD1, TIM3, CEACAM (por exemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 e/ou CEACAM-5), LAG3, TIGIT, CTLA-4, BTLA e LAIR1. Em uma modalidade, as células expressando inibidor de ponto de checagem são removidas simultaneamente com as células T regulatórias, por exemplo, CD25+. Por exemplo, um anticorpo anti- CD25, ou fragmento do mesmo, e um anticorpo de inibidor de ponto anti-checagem, ou fragmento do mesmo, podem ser ligados a mesma conta que pode ser usada para remover as células, ou um anticorpo anti-CD25, ou fragmento do mesmo, e o anticorpo de inibidor de ponto anti-checagem, ou fragmento do mesmo, podem ser ligados às contas separadas, uma mistura dos quais pode ser usada para remover as células. Em outras modalidades, a remoção de células T regulatórias, por exemplo, células CD25+, e a remoção das células expressando inibidor de ponto de checagem é sequencial, e pode ocorrer, por exemplo, em qualquer ordem.

[00456] Métodos descritos aqui podem incluir uma etapa se seleção positiva. Por exemplo, células T podem ser isoladas por incubação com contas conjugadas por anti-CD3/anti-CD28 (por exemplo, 3x28), tal como DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T, durante um período de tempo suficiente para seleção positive das células T desejadas. Em uma modalidade, o período de tempo é cerca de 30 minutos. Em uma outra modalidade, o período de tempo varia de 30 minutos a 36 horas ou mais e todos os valores de número inteiro entre eles. Em uma outra modalidade, o período de tempo é pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 horas. Ainda em outra modalidade, o período de tempo é 10 a 24 horas, por exemplo, 24 horas. Períodos de tempo de incubação maiores podem ser usados para isolar células T em qualquer situação onde existem algumas células T em comparação com outros tipos de célula, talcomo em isolamento de linfócitos infiltrantes do tumor (TIL) de tecido de tumor ou de indivíduos imunocomprometidos. Além disso, o uso de períodos de tempo de incubação maiores pode aumentar a eficiência de captura de células T de CD8+. Desse modo, simplesmente encurtando ou alongando o tempo, as células T são deixadas ligar-se às contas CD3/CD28 e/ou aumentando ou diminuindo a relação de contas para células T (como descrito também aqui), subpopulações de células T podem ser preferencialmente selecionadas para ou contra em início de cultura ou em outros pontos de tempo durante o processo. Adicionalmente, aumentando ou diminuindo a relação de anticorpos anti-CD3 e/ou anti-CD28 nas contas ou outra superfície, subpopulações de células T podem ser preferencialmente selecionadas para ou contra em início de cultura ou em outros pontos de tempo desejados.

[00457] Em uma modalidade, uma população de célula T pode ser selecionada que expressa um ou mais de IFN-v, TNFa, IL-17A, IL-2, IL- 3, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-13, granzima B, e perforina, ou outras moléculas apropriadas, por exemplo, outras citocinas. Métodos para análise de expressão celular podem ser determinados, por exemplo, pelos métodos descritos na Publicação de PCT n°: WO 2013/126712.

[00458] Para isolamento de umas populações de célula desejada por seleção positiva ou negativa, a concentração de células e surperfície (por exemplo, partículas tal como contas) pode ser variada. Em certos aspectos, pode ser desejável diminuir significamente o volume em que as contas e células são misturadas juntamente (por exemplo, aumentar a concentração de células), para garantir o contato máximo de células e contas. Por exemplo, em um aspecto, uma concentração de 10 bilhões de células/mL, 9 bilhões/mL, 8 bilhões/mL, 7 bilhões/mL, 6 bilhões/mL, ou 5 bilhões/mL é usada. Em um aspecto, uma concentração de 1 bilhão de células/mL é usada. Ainda em um aspecto, uma concentração de células de 75, 80, 85, 90, 95, ou 100 milhões de células/mL é usada. Em outros aspectos, concentrações de 125 ou 150 milhões de células/mL podem ser usadas.

[00459] O uso de concentrações elevadas pode resultar em produção celular, ativação celular, e expansão celular aumentadas. Além disso, o uso de concentrações celulares elevadas permite captura mais eficiente de células, que pode fracamente expressar antígenos alvo de interesse, tal como células T de CD28 negativo, ou de amostras onde existem muitas células de tumor presentes (por exemplo, tecido, tumor,sangue leucêmico, etc.). Tais populações de células podem ter valor terapêutico e seriam desejável obter. Por exemplo, o uso de concentração elevada de células permite seleção mais eficiente de células T de CD8+ que normalmente têm expressão de CD28 mais fraca.

[00460] Em um aspecto relacionado, pode ser desejável usar concentrações menores de células. Diluindo-se significamente a mistura de células T e surperfície (por exemplo, partículas tal como contas), interações entre as partículas e células são minimizadas. Isto seleciona células que expressam quantidade elevadas de antígenos desejados a serem ligados às partículas. Por exemplo, células T de CD4+ expressam níveis elevados de CD28 e são mais eficientemente capturadas do que concentrações diluídas de células T de CD8+. Em um aspecto, a concentração de células usada é de 5 x 106/mL. Em outros aspectos, a concentração usada pode ser de cerca de 1 x 105/mL a 1 x 106/mL, e qualquer valor de número inteiro nos intervalos.

[00461] Em outros aspectos, as células podem ser incubadas em um rotor durante durações de tempo variáveis em velocidades variáveis a 2 a 10oC ou em temperatura ambiente.

[00462] Células T para estimulação também podem ser congeladas após uma etapa de lavagem. Não desejando estar ligado à teoria, as etapas de congelamento e descongelamento subsequente fornecem um produto mais uniforme removendo os granulócitos e até certo ponto, monócitos na população célula. Após a etapa de lavagem que remove o plasma e plaquetas, as células podem ser suspensas em uma solução de congelação. Ao mesmo tempo em que muitas soluções e parâmetros de congelação são conhecidos na técnica e sera úteis neste contexto, um método envolve o uso de PBS contendo 20% de DMSO e 8% de albumina de soro humano, ou meios de cultura contendo 10% de Dextran 40 e 5% de Dextrose, 20% de Albumina de soro humano e 7,5% de DMSO, ou 31,25% de Plasmalyte-A, 31,25% de Dextrose a 5%, 0,45% de NaCl, 10% de Dextran 40 e 5% de Dextrose, 20% de Albumina de soro humano, e 7,5% de DMSO ou outros meios de congelação de célula adequados contendo por exemplo, Hespan e PlasmaLyte A, as células em seguida são congeladas para -80°C em uma taxa de 1° por minuto e armazenadas na fase de vapour de um tanque de armazenagem de nitrogênio. Outros métodos de congelação controlada podem ser usados bem como congelação não controlada imediatamente a -20° C ou em nitrogênio líquido.

[00463] Em certos aspectos, células crioconservadas são descongeladas e lavadas como descrito aqui e deixadas repousar durante uma hora em temperatura ambiente antes da ativação usando os métodos da presente invenção.

[00464] Também contemplado no contexto da invenção está a coleta de amostras de sangue ou produto de aférese de um indivíduo em um período de tempo antes de quando as células expandidas como descrito aqui possam ser necessárias. Com tal, a fonte das células a serem expandidas pode ser coletada em qualquer ponto de tempo necessário, e células desejadas, tal como células T, isoladas e congeladas para uso posterior em terapia com célula efetora imune para qualquer número de doenças ou condições que se beneficiariam da terapia com célula efetora imune, tal como those descrito aqui. Em um aspecto, uma amostra de sangue ou uma aferése é tirada de um indivíduo geralmente saudável. Em certos aspectos, uma amostra de sangue ou uma aférese é tirada de umindivíduo geralmente saudável que está em risco de desenvolver uma doença, porém que ainda não desenvolveu uma doença, e as células de interesse são isoladas e congeladas para uso posterior. Em certos aspectos, as células T podem ser expandidas, congeladas eusadas em um momento posterior. Em certos aspectos, amostras são coletadas de um paciente imediatamente após diagnóstico de uma doença particular como descrito aqui, porém antes de quaisquer tratamentos. Em um outro aspecto, as células são isoladas de uma amostra de sangue ou uma aférese de um indivíduo antes de qualquer número de modalidades de tratamento relevantes, incluindo, porém não limitados ao tratamento com agentes tais como natalizumabe, efalizumabe, agentes antivirais, quimioterapia, radiação, agentes imunossupressores, tais como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato, e FK506, anticorpos, ou outros agentes imunoablativos tais como CAMPATH, anticorpos anti-CD3, citoxano, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, e irradiação.

[00465] Em um outro aspecto da presente invenção, células T são obtidas de um paciente diretamente após o tratamento que deixa o indivíduo com células T funcionais. A este respeito, observou-se que após certos tratamentos de câncer, em particular tratamentos que lesam o sistema imune, imediatamente após o tratamento durante o período quando os pacientes normalmente estariam se recuperando do tratamento, a qualidade de células T obtidas pode ser ideal ou melhorada quanto à sua capacidade de expandir-se ex vivo. Igualmente, após a manipulação ex vivo, usando os métodos descritos aqui, estas células podem estar em um estado preferido para enxerto realçado e expansão in vivo. Desse modo, contempla-se no contexto da presente invenção coletar células sanguíneas, incluindo células T, células dentríticas, ou outras células da linhgem hematopoietica, durante esta fase de recuperação. Além disso, em certos aspectos, regimes de mobilização (por exemplo, mobilização com GM-CSF) e condicionamento podem ser usados para criar uma condição em um indivíduo em que a repopulação, recirculação, regeneração, e/ou expansão de tipos celulares particulars é favorecida, especialmente durante uma janela definida de tempo após a terapia. Tipos de células ilustrativos incluem células T, células B, células dendríticas, e outras células do sistema imune.

[00466] Em uma modalidade, as células efetoras imunes expressando uma molécula de CAR, por exemplo, uma molécula de CAR descrito aqui, são obtidas de um indivíduo que tem recebido uma baixa dose de reforço imune de um inibidor de mTOR. Em uma modalidade, as populações de célula efetoras imunes, por exemplo, células T, a ser criada para expressar um CAR, é colhida após um período de tempo suficiente, ou após dosagem suficiente da baixa dose de reforço de um inibidor de mTOR, de modo que o nível de células efetoras imunes de PD1 negativo, por exemplo, células T, ou a relação de células efetoras imunes de PD1 negativo, por exemplo, células T/células efetoras imunes de PD1 positivo, por exemplo, células T, no indivíduo ou colhidas do indivíduo tenha sido, pelo menos transitoriamente, aumentada.

[00467] Em outras modalidades, população de células efetoras imunes, por exemplo, células T, que tem, ou será criada para expressar um CAR, pode ser tratada ex vivo por contato com uma quantidade de um inibidor de mTOR que aumenta o número de células efetoras imunes de PD1 negativo, por exemplo, células T ou aumenta a relação de células efetoras imunes de PD1 negativo, por exemplo, células T/células efetoras imunes de PD1 positivo, por exemplo, células T.

[00468] Em uma modalidade, uma população de célula T é deficient de diaglicerol cinase (DGK). Células deficientes de DGK incluem células que não expressam RNA de DGK ou proteína, ou têm atividade de DGK reduzida ou inibida. As células deficientes de DGK podem ser geradas por métodos genéticos, por exemplo, administração de agentes de interferência de RNA, por exemplo, siRNA, shRNA, miRNA, para reduzir ou impedir a expressão de. Alternativamente, células deficientes de DGK DGK podem ser geradas por tratamento com inibidores de DGK descritos aqui.

[00469] Em uma modalidade, uma população de célula T é deficiente de Ikaros. Células deficientes de Ikaros incluem células que não expressam RNA de Ikaros ou proteína, ou têm atividade de Ikaros reduzida ou inibida, células deficientes de Ikaros podem ser geradas por métodos genéticos, por exemplo, administração de agentes de interferência de RNA, por exemplo, siRNA, shRNA, miRNA, para reduzir ou impedir a expressão de Ikaros. Alternativamente, células deficientes de Ikaros podem ser geradas por tratamento com inibidores de Ikaros, por exemplo, lenalidomida.

[00470] Em modalidades, uma população de célula T é deficiente de DGK e deficiente de Ikaros, por exemplo, não expressa DGK e Ikaros, ou tem atividade de DGK e Ikaros reduzida ou inibida. Tais células deficientes de DGK e Ikaros podem ser geradas por qualquer um dos métodos descritos aqui.

[00471] Em uma modalidade, as células NK são obtidas do indivíduo. Em outra modalidade, as células NK são uma linhagem de célula NK, por exemplo, linhagem de célula NK-92 (Conkwest).

CAR Alogênico

[00472] Em modalidades descritas aqui, a célula efetora imune pode ser uma célula efetora imune alogênica, por exemplo, célula T ou célula NK. Por exemplo, a célula pode ser uma célula T alostérica, por exemplo, uma célula T alostérica sem a expressão de um receptor de célula T funcional (TCR) e/ou antígeno de leucócito humano (HLA), por exemplo, HLA classe I e/ou HLA classe II.

[00473] A célula T sem um TCR funcional pode ser, por exemplo, criada de modo que ela não expresse qualquer TCR funcional em sua superfície, criada de modo que ela não expresse uma ou mais subunidades que compreendem um TCR funcional ou criada de modoque ela produza muito pouco TCR funcional em sua superfície. Alternativamente, a célula T pode expressar um TCR substancialmente comprometido, por exemplo, por expressão de formas mutadas ou truncadas de uma ou mais das subunidades do TCR. O termo "TCR substancialmente comprometido" significa que este TCR não provocará uma reação imune adversa em um hospedeiro.

[00474] A célula T descrita aqui pode ser, por exemplo, criada de modo que ela não expresse um HLA funcional em sua superfície. Por exemplo, uma célula T descrita aqui, pode ser criada de modo que o HLA de expressão de superfície celular, por exemplo, HLA classe 1 e/ou HLA classe II, seja sub-regulado.

[00475] Em algumas modalidades, a célula T pode não ter um TCR funcional e um HLA funcional, por exemplo, HLA classe I e/ou HLA classe II.

[00476] Células T modificadas sem a expressão de um TCR e/ou HLA funcional podem ser obtidas por quaisquer métodos adequados, incluindo um nocaute ou redução de uma ou mais subunidades TCR ou HLA. Por exemplo, a célula T pode incluir uma redução de TCR e/ou HLA usando siRNA, shRNA, repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR), nuclease efetora tipo ativador de transcrição (TALEN), ou endonuclease de dedo de zinco (ZFN).

[00477] Em algumas modalidades, a célula alogênica pode ser uma célula que não expressa ou expressa em baixos níveis de uma molécula inibitória, por exemplo, por qualquer método descrito aqui. Por exemplo, a célula pode ser uma célula que expressa ou expressa em baixos níveis de uma molécula inibitória, por exemplo, que pode diminuir a capacidade de uma célula expressar CAR para montar uma resposta efetora imune. Exemplos de moléculas inibitórias incluem PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por exemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 e/ou CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 e TGFR beta. A inibição de uma molécula inibitória, por exemplo, por inibição no nível de DNA, RNA ou proteína, pode otimizar uma célula expressando desempenho de CAR. Em modalidades, um ácido nucleico inibitório, por exemplo, um ácido nucleico inibitório, por exemplo, um dsRNA, por exemplo, um siRNA ou shRNA, repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR), uma nuclease efetora tipo ativador de transcrição (TALEN), ou uma endonuclease de dedo de zinco (ZFN), por exemplo, como descrito aqui, pode ser usado.

siRNA e shRNA para inibir TCR ou HLA

[00478] Em algumas modalidades, a expressão de TCR e/ou expressão de HLA pode ser inibida usando siRNA ou shRNA que alveja um ácido nucleico codificando um TCR e/ou HLA em uma célula T.

[00479] A expressão de siRNA e shRNAs em células T pode ser obtida usando qualquer sistema de expressão convencional, por exemplo, tal como um sistema de expressão lentiviral.

[00480] Os shRNAs exemplares que sub-regulam a expressão de componente do TCR são descritos, por exemplo, na Publicação dos Estados Unidos No.: 2012/0321667. siRNA e shRNA exemplares que sub-regulam a expressão de genes HLA classe I e/ou HLA classe II são descritos, por exemplo, na Publicação dos Estados Unidos n°: US 2007/0036773.

CRISPR para inibir TCR ou HLA

[00481] "CRISPR" ou "CRISPR para TCR e/ou HLA" ou "CRISPR para inibir TCR e/ou HLA" como usado aqui se refere a um grupo de repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas, ou um sistema compreendendo tal grupo de repetições. "Cas", como usado aqui, se refere a uma proteína associada à CRISPR. Um sistema de "CRISPR/Cas" se refere a um sistema derivado de CRISPR e Cas que pode ser usado para silenciar ou mutar um gene de TCR e/ou HLA.

[00482] Sistemas de CRISPR/Cas de ocorrência natural são encontrados em aproximadamente 40% de genomas de eubactérias sequenciados e 90% de arquea sequenciada. Grissa et al. (2007) BMC Bioinformatics 8: 172. Este sistema é um tipo de sistema imune procariótico que confere resistência a elementos genéticos estrannhos tais como plasmídeos e fagos e fornece uma forma de imunidade adquirida. Barrangou et al. (2007) Science 315: 1709-1712; Marragini et al. ( 2008) Science 322: 1843-1845.

[00483] O sistema CRISPR/Cas foi modificado para uso em uma edição de gene (genes específicos de silenciamento, realce ou mudança) em eucariotas tais como camundongos ou primatas. Wiedenheft et al. (2012) Nature 482: 331-8. Isto é realizado introduzindo na célula eucariótica um plasmídeo contendo um CRISPR especificamente designado e um ou mais Cas apropriados.

[00484] A sequência de CRISPR, algumas vezes chamada de um local de CRISPR, compreende repetições alternadas e espaçadores. Em uma CRISPR de ocorrência natural, os espaçadores geralmente compreendem sequências estranhas à bactéria tal como uma sequência de plasmídeo ou fago; no sistema de TCR e/ou HLA CRISPR/Cas, os espaçadores são derivados da sequência de gene TCR ou HLA.

[00485] RNA do local de CRISPR é constitutivamente expresso e processado por proteínas Cas em RNAs pequenos. Estes compreendem um espaçador flanqueado por uma sequência de repetição. Os RNAs guiam outras proteínas de Cas para silenciar elementos genéticos exógenos no nível de RNA ou DNA. Horvath et al. (2010) Science 327: 167-170; Makarova et al. (2006) Biology Direct 1: 7. Os espaçadores desse modo, funcionam como modelos para moléculas de RNA, analogamente aos siRNAs. Pennisi (2013) Science 341: 833-836.

[00486] Como estes ocorrem naturalmente em muitos tipos diferentes de bactérias, a disposição exatada da CRISPR e estrutura, função e número de genes de Cas e seu produto difere um pouco de espécie para espécie. Haft et al. (2005) PLoS Comput. Biol. 1: e60; Kunin et al. (2007) Genome Biol. 8: R61; Mojica et al. (2005) J. Mol. Evol. 60: 174-182; Bolotin et al. (2005) Microbiol. 151: 2551-2561; Pourcel et al. (2005) Microbiol. 151: 653-663; e Stern et al. (2010) Trends. Genet. 28: 335-340. Por exemplo, as proteínas de Cse (subtipo de Cas, E. coli) (por exemplo, CasA) formam uma Cascata complexa funcional, que processa a transcrição de RNAs por CRISPR em unidades de espaçador-repetição que a Cascata mantém. Brouns et al. (2008) Science 321: 960-964. Em outros procariotas, Cas6 processa a transcrição de CRISPR. A inativação de fago com base em CRISPR em E. coli requer a Cascata e Cas3, porém não Cas1 ou Cas2. As proteínas de Cmr (módulo de RAMP de Cas) em Pyrococcus furiosus e outros procariotas formam um complexo funcional com RNAs de CRISPR pequenos que reconhecem e clivam RNAs alvos complementares. Um sistema de CRISPR mais simples dependem da proteína Cas9, que é uma nuclease com dois sítios de corte ativos, um para cada filamento da hélice dupla. Combinação de Cas9 e NRA de local de CRISPR pode ser usada em um sistema para edição de gene. Pennisi (2013) Science 341: 833-836.

[00487] O sistema de CRISPR/Cas pode, desse modo, editar um gene de TCR e/ou HLA (adicionando ou deletando um par de base), ou introduzir uma interrupção prematura, desse modo diminuir a expressão de um TCR e/ou HLA. O sistema de CRISPR/Cas pode alternativamente ser usado como interferência de RNA, desligando o gene de TCR e/ou HLA em um modelo reversível. Em uma célula mamífera, por exemplo, o RNA pode guiar a proteína Cas para um promotor de TCR e/ou HLA, estericamente bloqueando as RNA polimerases.

[00488] Sistemas de CRISPR/Cas artificiais podem ser gerados que inibem o TCR e/ou HLA, usando tecnologias conhecidas na técnica, por exemplo, aquelas descritas na Publicação dos Estados Unidos No. 20140068797, e Cong (2013) Science 339: 819-823. Outros sistemas de CRISPR/Cas artificiais que são conhecidos na técnica também podem ser gerados que inibem TCR e/ou HLA, por exemplo, aqueles descritos no Tsai (2014) Nature Biotechnol., 32:6 569-576, Patentes dos Estados Unidos n°s: 8.871.445; 8.865.406; 8.795.965; 8.771.945; e 8.697.359.

TALEN para inibir TCR e/ou HLA

[00489] "TALEN" ou "TALEN para HLA e/ou TCR" ou "TALEN para inibir HLA e/ou TCR" se refere a uma nuclease efetora tipo ativador de transcrição, uma nuclease artificial que pode ser usada para editar o gene de HLA e/ou TCR.

[00490] TALENs são produzidas artificialmente fundindo um domínio de ligação de DNA efetor de TAL a um domínio de clivagem de DNA. Efeitos tipo ativador de transcrição (TALEs) podem ser criados para ligar qualquer sequência de DNA desejada, incluindo uma porção do gene de HLA ou TCR. Combinando um TALE criado com um domínio de clivagem de DNA, uma enzima de restrição pode ser produzida que é específica a qualquer sequência de DNA desejada, incluindo uma sequência de HLA ou TCR. Estas podem em seguida ser introduzidas em uma célula, em que elas podem ser usadas para edição de genoma. Boch (2011) Nature Biotech. 29: 135-6; e Boch et al. (2009) Science 326: 1509-12; Moscou et al. (2009) Science 326: 3501.

[00491] TALEs são proteínas secretadas por bactérias Xanthomonas. O domínio de ligação de DNA contém uma sequência de 33-34aminoácidos altamente conservada, com a exceção do 12° e 13° aminoácidos. Estas duas posições são altamente variáveis, mostrando uma forte correlação com reconhecimento de nucleotídeo específico. Elas podem desse modo, ser criadas para ligar uma sequência de DNA desejada.

[00492] Para produzir uma TALEN, uma proteína de TALE é fundida a uma nuclease (N), que é uma FokI endonuclease do tipo selvagem ou mutada. Diversas mutações a FokI foram feitas para seu uso em TALENs; estas, por exemplo, melhoram a ativida ou especificidade de clivagem. Cermak et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39: e82; Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8; Hockemeyer et al. (2011) Nature Biotech. 29: 731-734; Wood et al. (2011) Science 333: 307; Doyon et al. (2010) Nature Metods 8: 74-79; Szczepek et al. (2007) Nature Biotech. 25: 786-793; e Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 200: 96.

[00493] O domínio de FokI funciona como um dímero, requerendo dois construtos com domínios de ligação de DNA único para sítios no genoma alvo com orientação e espaçamento apropriados. Tanto o número de resíduos de aminoácido entre o domínio de ligação de DNA de TALE quanto o domínio de clivagem de FokI e o número de bases entre os dois sítios de ligação de TALEN individuais parecem ser parâmetros importantes para obtenção de níveis elevados de atividade. Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8.

[00494] Uma TALEN de HLA ou TCR pode ser usada dentro de uma célula para produzir uma ruptura de filamento duplo (DSB). Uma mutação pode ser introduzida no sítio de ruptura se os mecanismos de reparação repararem impropriamente a ruptura por meio de ligação de extremidade não homóloga. Por exemplo, o reparo impróprio pode introduzir uma mutação de mudança de estrutura. Alternativamente, DNA estranho pode ser introduzido na célula junto com a TALEN; dependendo das consequências do DNA estranho e sequência cromossômica, este processo pode ser usado para corrigir um defeito no gene de HLA ou TCR ou introduzir tal defeito em um gene de TCR ou HLA do tipo selvagem, desse modo, diminuindo a expressão de HLA ou TCR.

[00495] TALENs específicas às sequências em HLA ou TCR podem ser construídas usando qualquer método conhecido na técnica, incluindo vários esquemas usando componentes modulares. Zhang et al. (2011) Nature Biotech. 29: 149-53; Geibler et al. (2011) PLoS ONE 6: e19509.

Nuclease do dedo de zinco para inibir HLA e/ou TCR

[00496] "ZFN" ou "Nuclease do Dedo de Zinco" ou "ZFN para HLA e/ou TCR" ou "ZFN para inibir HLA e/ou TCR" se refere a uma nuclease de dedo de zinco, uma nuclease artificial que pode ser usada para editar o gene de HLA e/ou TCR.

[00497] Como uma TALEN, uma ZFN compreende um domínio de FokI nuclease (ou derivado do mesmo) fundido a um domínio de ligação de DNA. No caso de uma ZFN, o domínio de ligação de DNA compreende um ou mais dedos de zinco. Carroll et al. (2011) Genetics Society of America 188: 773-782; e Kim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160.

[00498] Um dedo de zinco é um motivo estrutural de proteína pequena estabelecido por um ou mais íons de zinco. Um dedo de zinco pode compreender, por exemplo, Cys2His2, e pode reconhecer uma sequência de aproximadamente 3-pb. Vários dedos de zinco de especificidade conhecida podem ser combinados para produzir polipeptídeos de múltiplos dedos de sequências de cerca de 6, 9, 12, 15 ou 18-pb. Várias técnicas de seleção e montagem modular estão para gerar dedos de zinco (e combinações dos mesmos) reconhecendo sequências específicas, incluindo exibição de fago, levedura, sistemas de um híbrido, sistemas de um híbrido e dois híbridos bacterianos, e células mamíferas.

[00499] Como uma TALEN, um ZFN deve dimerizar-se para clivar o DNA. Desse modo, um par de ZFNs é requerido para alvejar sítios de DNA não palindrômicos. As duas ZFNs individuais devem ligar filamentos opostos do DNA com suas nucleases apropriadamente espaçadas à parte. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10570-5.

[00500] Também como uma TALEN, uma ZFN pode criar uma ruptura de filamento duplo no DNA, que pode criar uma mutação de mudança de estrutura se reparada impropriamente, induzindo a um decréscimo na expressão e quantidade de HLA e/ou TCR em uma célula. ZFNs também podem ser usadas com recombinação homóloga para mutar-se no gene de HLA ou TCR.

[00501] ZFNs específicas às sequências em HLA e/ou TCR podem ser construídas usando qualquer método conhecido na técnica. Veja, por exemplo, Provasi (2011) Nature Med. 18: 807-815; Torikai (2013) Blood 122: 1341-1349; Cathomen et al. (2008) Mol. Ther. 16: 1200-7; e Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 400: 96; Publicação de Patente dos Estados Unidos 2011/0158957; e Publicação de Patente dos Estados Unidos 2012/0060230.

Expressão de Telomerase

[00502] Embora não desejando estar ligado a qualquer teoria particular, em algumas modalidades, uma célula T terapêutica tem persistência de curto prazo em um paciente, devido aos telômeros encurtados na célula T; consequentemente, a transfecção com um gene de telomerase pode alongar os telômeros da célula T e melhorar a persistência da célula T no paciente. Veja, Carl June, "Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic", Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007). Desse modo, em uma modalidade, uma célula efetora imune, por exemplo, uma célula T, ectopicamente expressa uma subunidade de telomerase, por exemplo, a subunidade catalítica de telomerase, por exemplo, TERT, por exemplo, hTERT. Em alguns aspectos, esta invenção fornece um método de produção de uma célula expressando CAR, compreendendo contatar uma célula com um ácido nucleico codificando uma subunidade de telomerase, por exemplo, a subunidade catalítica de telomerase, por exemplo, TERT, por exemplo, hTERT. A célula pode ser contatada com o ácido nucleico antes de, simultânea com, ou depois de contatada com uma construção codificando um CAR.

[00503] Em um aspecto, a invenção caracteriza um método de preparação de umas populações de célula efetoras imunes (por exemplo, células T ou células NK). Em uma modalidade, o método compreende: fornecer umas populações de célula efetoras imunes (por exemplo, células T ou células NK), contatar as populações de célula efetoras imunes com um ácido nucleico codificando um CAR; e contatar as populações de célula efetoras imunes com um ácido nucleico codificando uma subunidade de telomerase, por exemplo, hTERT, sob condições que permitem a expressão de CAR e telomerase.

[00504] Em uma modalidade, o ácido nucleico codificando a subunidade de telomerase é o DNA. Em uma modalidade, o ácido nucleico codificando a subunidade de telomerase compreende um promotor capaz de regular a expressão da subunidade de telomerase.

[00505] Em uma modalidade, hTERT tem a sequência de aminoácido de GenBank Protein ID AAC51724.1 (Meyerson et al., "hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up- Regulated in Tumor Cell and during Immortalization" Cell Volume 90, Emissão 4, 22 de Agosto de 1997, Páginas 785-795) como segue: MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPA AFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCER GAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAW GLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQA RPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSAS RSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVS PARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDT PCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLG SRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTH CPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSP WQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLS LQELTWKMSVRGCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMS VYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQL RELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTF RREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRT FVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCV RRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLR DAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQG SILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTF LRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFP WCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFG VLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQ VWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQ WLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAA NPALPSDFKTILD (SEQ ID NO: 131)

[00506] Em uma modalidade, a hTERT tem uma sequência pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 131. Em uma modalidade, a hTERT tem uma sequência de SEQ ID NO: 131. Em uma modalidade, a hTERT compreende uma deleção (por exemplo, de não mais do que 5, 10, 15, 20, ou 30 aminoácidos) no terminal N, no terminal C, ou ambos. Em uma modalidade, a hTERT compreende uma sequência de aminoácido transgênica (por exemplo, de não mais do que 5, 10, 15, 20, ou 30 aminoácidos) no terminal N, no terminal, ou ambos.

[00507] Em uma modalidade, a hTERT é codificada por a sequência de ácido nucleico de GenBank n° de acesso AF018167 (Meyerson et al., "hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cell and during Immortalization" Cell Volume 90, Emissão 4, 22 de Agosto de 1997, Páginas 785-795): 1 caggcagcgt ggtcctgctg cgcacgtggg aagccctggc cccggccacc cccgcgatgc 61 cgcgcgctcc ccgctgccga gccgtgcgct ccctgctgcg cagccactac cgcgaggtgc 121 tgccgctggc cacgttcgtg cggcgcctgg ggccccaggg ctggcggctg gtgcagcgcg 181 gggacccggc ggctttccgc gcgctggtgg cccagtgcct ggtgtgcgtg ccctgggacg 241 cacggccgcc ccccgccgcc ccctccttcc gccaggtgtc ctgcctgaag gagctggtgg 301 cccgagtgct gcagaggctg tgcgagcgcg gcgcgaagaa cgtgctggcc ttcggcttcg 361 cgctgctgga cggggcccgc gggggccccc ccgaggcctt caccaccagc gtgcgcagct 421 acctgcccaa cacggtgacc gacgcactgc gggggagcgg ggcgtggggg ctgctgttgc 481 gccgcgtggg cgacgacgtg ctggttcacc tgctggcacg ctgcgcgctc tttgtgctgg 541 tggctcccag ctgcgcctac caggtgtgcg ggccgccgct gtaccagctc ggcgctgcca 601 ctcaggcccg gcccccgcca cacgctagtg gaccccgaag gcgtctggga tgcgaacggg 661 cctggaacca tagcgtcagg gaggccgggg tccccctggg cctgccagcc ccgggtgcga 721 ggaggcgcgg gggcagtgcc agccgaagtc tgccgttgcc caagaggccc aggcgtggcg 781 ctgcccctga gccggagcgg acgcccgttg ggcaggggtc ctgggcccac ccgggcagga 841 cgcgtggacc gagtgaccgt ggtttctgtg tggtgtcacc tgccagaccc gccgaagaag 901 ccacctcttt ggagggtgcg ctctctggca cgcgccactc ccacccatcc gtgggccgcc 961 agcaccacgc gggcccccca tccacatcgc ggccaccacg tccctgggac acgccttgtc 1021 ccccggtgta cgccgagacc aagcacttcc tctactcctc aggcgacaag gagcagctgc 1081 ggccctcctt cctactcagc tctctgaggc ccagcctgac tggcgctcgg aggctcgtgg 1141 agaccatctt tctgggttcc aggccctgga tgccagggac tccccgcagg ttgccccgcc 1201 tgccccagcg ctactggcaa atgcggcccc tgtttctgga gctgcttggg aaccacgcgc 1261 agtgccccta cggggtgctc ctcaagacgc actgcccgct gcgagctgcg gtcaccccag 1321 cagccggtgt ctgtgcccgg gagaagcccc agggctctgt ggcggccccc gaggaggagg 1381 acacagaccc ccgtcgcctg gtgcagctgc tccgccagca cagcagcccc tggcaggtgt 1441 acggcttcgt gcgggcctgc ctgcgccggc tggtgccccc aggcctctgg ggctccaggc 1501 acaacgaacg ccgcttcctc aggaacacca agaagttcat ctccctgggg aagcatgcca 1561 agctctcgct gcaggagctg acgtggaaga tgagcgtgcg gggctgcgct tggctgcgca 1621 ggagcccagg ggttggctgt gttccggccg cagagcaccg tctgcgtgag gagatcctgg 1681 ccaagttcct gcactggctg atgagtgtgt acgtcgtcga gctgctcagg tctttctttt 1741 atgtcacgga gaccacgttt caaaagaaca ggctcttttt ctaccggaag agtgtctgga 1801 gcaagttgca aagcattgga atcagacagc acttgaagag ggtgcagctg cgggagctgt 1861 cggaagcaga ggtcaggcag catcgggaag ccaggcccgc cctgctgacg tccagactcc 1921 gcttcatccc caagcctgac gggctgcggc cgattgtgaa catggactac gtcgtgggag 1981 ccagaacgtt ccgcagagaa aagagggccg agcgtctcac ctcgagggtg aaggcactgt 2041 tcagcgtgct caactacgag cgggcgcggc gccccggcct cctgggcgcc tctgtgctgg 2101 gcctggacga tatccacagg gcctggcgca ccttcgtgct gcgtgtgcgg gcccaggacc 2161 cgccgcctga gctgtacttt gtcaaggtgg atgtgacggg cgcgtacgac accatccccc 2221 aggacaggct cacggaggtc atcgccagca tcatcaaacc ccagaacacg tactgcgtgc 2281 gtcggtatgc cgtggtccag aaggccgccc atgggcacgt ccgcaaggcc ttcaagagcc 2341 acgtctctac cttgacagac ctccagccgt acatgcgaca gttcgtggct cacctgcagg 2401 agaccagccc gctgagggat gccgtcgtca tcgagcagag ctcctccctg aatgaggcca 2461 gcagtggcct cttcgacgtc ttcctacgct tcatgtgcca ccacgccgtg cgcatcaggg 2521 gcaagtccta cgtccagtgc caggggatcc cgcagggctc catcctctcc acgctgctct 2581 gcagcctgtg ctacggcgac atggagaaca agctgtttgc ggggattcgg cgggacgggc 2641 tgctcctgcg tttggtggat gatttcttgt tggtgacacc tcacctcacc cacgcgaaaa 2701 ccttcctcag gaccctggtc cgaggtgtcc ctgagtatgg ctgcgtggtg aacttgcgga 2761 agacagtggt gaacttccct gtagaagacg aggccctggg tggcacggct tttgttcaga 2821 tgccggccca cggcctattc ccctggtgcg gcctgctgct ggatacccgg accctggagg 2881 tgcagagcga ctactccagc tatgcccgga cctccatcag agccagtctc accttcaacc 2941 gcggcttcaa ggctgggagg aacatgcgtc gcaaactctt tggggtcttg cggctgaagt 3001 gtcacagcct gtttctggat ttgcaggtga acagcctcca gacggtgtgc accaacatct 3061 acaagatcct cctgctgcag gcgtacaggt ttcacgcatg tgtgctgcag ctcccatttc 3121 atcagcaagt ttggaagaac cccacatttt tcctgcgcgt catctctgac acggcctccc 3181 tctgctactc catcctgaaa gccaagaacg cagggatgtc gctgggggcc aagggcgccg 3241 ccggccctct gccctccgag gccgtgcagt ggctgtgcca ccaagcattc ctgctcaagc 3301 tgactcgaca ccgtgtcacc tacgtgccac tcctggggtc actcaggaca gcccagacgc 3361 agctgagtcg gaagctcccg gggacgacgc tgactgccct ggaggccgca gccaacccgg 3421 cactgccctc agacttcaag accatcctgg actgatggcc acccgcccac agccaggccg 3481 agagcagaca ccagcagccc tgtcacgccg ggctctacgt cccagggagg gaggggcggc 3541 ccacacccag gcccgcaccg ctgggagtct gaggcctgag tgagtgtttg gccgaggcct 3601 gcatgtccgg ctgaaggctg agtgtccggc tgaggcctga gcgagtgtcc agccaagggc 3661 tgagtgtcca gcacacctgc cgtcttcact tccccacagg ctggcgctcg gctccacccc 3721 agggccagct tttcctcacc aggagcccgg cttccactcc ccacatagga atagtccatc 3781 cccagattcg ccattgttca cccctcgccc tgccctcctt tgccttccac ccccaccatc 3841 caggtggaga ccctgagaag gaccctggga gctctgggaa tttggagtga ccaaaggtgt 3901 gccctgtaca caggcgagga ccctgcacct ggatgggggt ccctgtgggt caaattgggg 3961 ggaggtgctg tgggagtaaa atactgaata tatgagtttt tcagttttga aaaaaaaaaa 4021 aaaaaaa (SEQ ID NO: 132)

[00508] Em uma modalidade, a hTERT é codificada por um ácido nucleico tendo uma sequência pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96, 97%, 98%, ou 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 132. Em uma modalidade, a hTERT é codificada por um ácido nucleico de SEQ ID NO: 132.

Ativação e Expansão de células efetoras imunes (por exemplo, células T)

[00509] Células efetoras imunes tal como células T podem ser ativadas e expandidas geralmente usando métodos como descrito, por exemplo, nas Patentes dos Estados Unidos 6.352.694; 6.534.055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358; 6.887.466; 6.905.681; 7.144.575; 7.067.318; 7.172.869; 7.232.566; 7.175.843; 5.883.223; 6.905.874; 6.797.514; 6.867.041; e Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos n° 20060121005.

[00510] O procedimento de expansão ex vivo de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras descrito no Patente dos Estados Unidos n° 5.199.942, incorporada aqui por referência, pode ser aplicado às células da presente invenção. Outros métodos adequados são conhecidos na técnica, portanto, a presente invenção é não está limitada a qualquer método particular de expansão ex vivo das células. Resumidamente, cultura e expansão ex vivo das células T pode compreender: (1) coletar células-tronco hematopoieticas e progenitoras de CD34+ de um mamífero de coletas de sangue periférico ou explantes de medula óssea; e (2) expandir tais células ex vivo. Além dos fatores de crescimento celular descritos no Patente dos Estados Unidos n° 5.199.942, outros fatores tais como flt3-L, IL-1, IL-3 e ligante de c-kit, podem ser usados para cultura e expansão das células.

[00511] Geralmente, umas populações de célula efetoras imunes por exemplo, células depauperadas por célula T regulatória, pode ser expandida por contato com uma superfície tendo ligado a ela um agente que estimula um sinal associado com o complexo de CD3/TCR e um ligante que estimula uma molécula coestimulatória na superfície das células T. Em particular, populações de célula T podem ser estimuladas como descrito aqui, tal como por contato com um anticorpo anti-CD3, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, ou um anticorpo anti- CD2 imobilizado em um superfície, ou por contato com um ativador de proteína cinase C (por exemplo, briostatina) em conjunção com um ionóforo de cálcio. Para coestimulação de uma molécula acessória na superfície das células T, um ligante que liga a molécula acessória é usado. Por exemplo, umas populações de célula T pode ser contatada com um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28, sob condições apropriadas para estimulação de proliferação das células T. Para estimular a proliferação de células T de CD4+ ou células T de CD8+, um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28 podem ser usados. Exemplos de um anticorpo anti-CD28 incluem 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besançon, França) podem ser usados como outros método comumente conhecidos na técnica (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Met. 227(1-2):53-63, 1999).

[00512] Em certos aspectos, o sinal estimulatório primário e o sinal coestimulatório quanto à célula T pode ser fornecido por diferentes protocolos. Por exemplo, os agentes que fornecem cada sinal podem estar em solução ou acoplados a uma superfície. Quando acoplados a uma superfície, os agentes podem ser acoplados à mesma superfície (isto é, em formação "cis") ou às superfícies separadas (isto é, em formação "trans"). Alternativamente, um agente pode ser acoplado a uma superfície e ao outro agente na solução. Em um aspecto, o agente fornecendo o sinal coestimulatório é ligado a uma superfície celular e o agente fornecendo o sinal de ativação primária está em solução ou acoplado a uma superfície. Em certos aspectos, ambos os agentes podem estar em solução. Em um aspecto, os agentes podem estar em forma solúvel, e em seguida reticuladas a uma superfície, tal como uma célula expressando receptores de Fc ou um anticorpo ou outro agente de ligação que se ligará aos agentes. A este respeito, veja, por exemplo, Publicações de Pedido de Patente dos Estados Unidos n°s 20040101519 e 20060034810 quanto às células apresentadoras de antígeno artificiais (aAPCs) que são contempladas para uso na ativação e expansão de células T na presente invenção.

[00513] Em um aspecto, os dois agentes são imobilizados nas contas, ou na mesma conta, isto é, "cis," ou em contas separadas, isto é, "trans." Por meio de exemplo, o agente que fornece o sinal de ativação primária é um anticorpo anti-CD3 ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo e o agente que fornece o sinal coestimulatório é um anticorpo anti-CD28 ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo; e ambos os agentes são coimobilizados à mesma conta em quantidades molecular equivalentes. Em um aspecto, uma relação de 1:1 de cada anticorpo ligado às contas para expansão de célula T de CD4+ e crescimento de célula T é usada. Em certos aspectos da presente invenção, uma relação de anticorpos anti CD3:CD28 ligados às contas é usada de modo que um aumento na expansão de célula T seja observado em comparação à expansão observada usando uma relação de 1:1. Em um aspecto particular, um aumento de cerca de 1 a cerca de 3 vezes é observado em comparação com a expansão observada usando uma relação de 1:1. Em um aspecto, a relação de anticorpo CD3:CD28 ligado às contas varia de 100:1 a 1:100 e todos os valores de número inteiro entre eles. Em um aspecto, mais anticorpo anti-CD28 é ligado às partículas do que o anticorpo anti-CD3, isto é, a relação de CD3:CD28 é menor do que aquela. Em certos aspectos, a relação de anticorpo anti CD28 para anticorpo anti CD3 ligado às contas é maior do que 2:1. Em um aspecto particular, uma relação de 1:100 de CD3:CD28 de anticorpo ligado às contas é usada. Em um aspecto, uma relação de 1:75 CD3:CD28 de anticorpo ligado às contas é usada. Em um outro aspecto, a 1:50 CD3:CD28 ratio of anticorpo ligado às contas é usada. Em um aspecto, uma relação de 1:30 CD3:CD28 de anticorpo ligado às contas é usada. Em um aspecto preferido, uma relação de 1:10 de CD3:CD28 de anticorpo ligado às contas é usada. Em um aspecto, uma relação de 1:3 de CD3:CD28 de anticorpo ligado às contas é usada. Ainda em um aspecto, uma relação de 3:1 de CD3:CD28 de anticorpo ligado às contas é usada.

[00514] Relações de partículas para células de 1:500 a 500:1 e qualquer valor de números inteiros entre eles podem ser usadas para estimular células T ou outras células alvo. Como aqueles versados na técnica podem facilmente apreciar, a relação de partículas para células pode depender do tamanho de partícula com relação à célula alvo. Por exemplo, contas de tamanho pequeno apenas ligariam apenas algumas células, ao mesmo tempo em que contas maiores ligariam muitas. Em certos aspectos, a relação de células para partículas varia de 1:100 a 100:1 e qualquer valor de números inteiros entre eles e em outros aspectos, a relação compreende 1:9 a 9:1 e qualquer valor de números inteiros entre eles, pode também ser usado para estimular as células T. A relação de partículas acopladas a anti-CD3- e anti-CD28 para células T que resulta na estimulação de célula T pode variar como observado acima incluem 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, e 15:1 com uma relação preferida sendo de pelo menos 1:1 partículas por célula T. Em um aspecto, uma relação de partículas para células de 1:1 ou menor é usada. Em um aspecto particular, uma relação de parícula:célula preferida é de 1:5. Em outros aspectos, a relação de partículas para células pode ser variada dependendo do dia da estimulação. Por exemplo, em um aspecto, a relação de partículas para células é de 1:1 a 10:1 no primeiro dia e partículas adicionais são adicionadas às células todos os dias ou a cada dois dias daí em diante até 10 dias, em relações finais de 1:1 a 1:10 (com base nas contas celulares no dia da adição). Em um aspecto particular, a relação de partículas para células é de 1:1 no primeiro dia de estimulação e adjustada para 1:5 no terceiro e quinto dias de estimulação. Em um aspecto, as partículas são adicionadas em uma base diária ou a cada dois dias para uma relação final de 1:1 no primeiro dia, e 1:5 no terceiro e quinto dias de estimulação. Em um aspecto, a relação de partículas para células é de 2:1 no primeiro dia de estimulação e ajustada 1:10 no terceiro e quinto dias de estimulação. Em um aspecto, as partículas são adicionadas emu ma base diária ou a cada dois dias para uma relação final de 1:1 no primeiro dia, e 1:10 no terceiro e quinto dias de estimulação. Alguém versado na técnica apreciará que uma variedade de outras relações pode ser adequada para uso na presente invenção. Em particular, as relações variarão dependendo do tamanho de partícula e do tamanho e tipo de célula. Em um aspecto, as relações mais típicas para uso são na vizinhaça de 1:1, 2:1 e 3:1 no primeiro dia.

[00515] Em outros aspectos, as células, tal como células T, são combinadas com contas revestidas por agente, as contas e as células são subsequentemnte separadas, e em seguida as células são cultivadas. Em um aspecto alternativo, antes da cultura, as contas revestidas por agente e células não são seperadas, porém são cultivadas juntas. Em um outro aspecto, as contas e células são primeiro concentradas por aplicação de uma força, tal como uma força magnética, resultando em ligação aumentada de marcadores de superfície celular, desse modo induzindo à estimulação celular.

[00516] Por meio de exemplo, proteínas de superfície celular podem ser ligadas permitindo as contas paramagnéticas às quais anti-CD3 e anti-CD28 são ligadas (3x28 contas) contatarem as células T. Em um aspecto, as células (por exemplo, 104 a 109células T) e contas (por exemplo, contas DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T paramagnéticas em uma relação de 1:1) são combinadas em um tampão, por exemplo, PBS (sem cátions divalentes tais como, cálcio e magnésio). Novamente, aqueles versados na técnica podem facilmente apreciar que qualquer concentração celular pode ser usada. Por exemplo, a célula alvo pode ser muito rara na amostra e compreende apenas 0,01% da amostra ou a amostra completa (isto é, 100%) pode compreender a célula alvo de interesse. Consequentemente, qualquer número de célula está no contexto da presente invenção. Em certos aspectos, pode ser desejável significantemente diminuir o volume em que as partículas e células são misturadas juntas (isto é, aumentar a concentração de células), para garantir contato máximo de células e partículas. Por exemplo, em um aspecto, uma concentração de cerca de 10 bilhões de células/mL, 9 bilhões/mL, 8 bilhões/mL, 7 bilhões/mL, 6 bilhões/mL, 5 bilhões/mL, ou 2 bilhões de células/mL é usada. Em um aspecto, mais do que 100 milhões de células/mL são usados. Em um outro aspecto, uma concentração de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ou 50 milhões de células/mL é usada. Ainda em um aspecto, uma concentração de células de 75, 80, 85, 90, 95, ou 100 milhões de células/mL é usada. Em outros aspectos, concentrações de 125 ou 150 milhões de células/mL podem ser usadas. O uso de concentrações elevadas pode resultar uma produção de célula, ativação celular, e expansão celular aumentada. Além disso, o uso de concentrações de célula elevadas permite captura mais eficiente de células que podem fracamente expressar antígenos alvo de interesse, tal como células T de CD28 negativo. Tais populações de células podem ter valor terapêutico e seriam desejáveis obter em certos aspectos. Por exemplo, usando concentração elevada de células permite seleção de células T de CD8+ mais eficiente do que expressão de CD28 normalmente mais fraca.

[00517] Em uma modalidade, células transduzidas com um ácido nucleico codificando um CAR, por exemplo, um CAR descrito aqui, são expandidas, por exemplo, por um método descrito aqui. Em uma modalidade, as células são expandidas em cultura durante um período de diversas horas (por exemplo, cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 18, 21 horas) a cerca de 14 dias (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias). Em uma modalidade, as células são expandidas durante um período de 4 a 9 dias. Em uma modalidade, as células são expandidas durante um período de 8 dias ou menos, por exemplo, 7, 6 ou 5 dias. Em uma modalidade, as células, por exemplo, uma célula CAR de CD19 descrita aqui, são expandidas em cultura durante 5 dias, e as células resultantes são mais potente do que as mesmas células expandidas em cultura durante 9 dias sob as mesmas condições de cultura. A potência pode ser definida, por exemplo, por várias funções de célula T, por exemplo, proliferação, extermínio de célula alvo, produção de citocina, ativação, migração, ou combinações das mesmas. Em uma modalidade, as células, por exemplo, uma célula CAR de CD19 descrita aqui, expandida durante 5 dias mostram pelo menos um aumento de uma, duas, três, ou quatro vezes em duplicações de células sob estimulação de antígeno em comparação com as mesmas células expandidas em cultura durante 9 dias sob as mesmas condições de cultura. Em uma modalidade, as células, por exemplo, as células expressando um CAR de CD19 descrito aqui, são expandidas em cultura durante 5 dias, e as células resultantes exibem produção de citocina pró-inflamatória elevada, por exemplo, níveis de IFN-Y e/ou GM- CSF, em comparação com as mesmas células expandidas em cultura durante 9 dias sob as mesmas condições de cultura. Em uma modalidade, as células, por exemplo, uma célula CAR de CD19 descrita aqui, expandida durante 5 dias mostram pelo menos um aumento de uma, duas, três, quatro, cinco, dez vezes ou mais em pg/mL de produção de citocina pró-inflamatória, por exemplo, níveis de IFN-Y e/ou GM-CSF, em comparação com as mesmas células expandidas em cultura durante 9 dias sob as mesmas condições de cultura.

[00518] Diversos ciclos de estimulação também podem ser desejados de modo que tempo de cultura de células T pode ser 60 dias ou mais. Condições apropriadas para cultura de célula T incluem meios apropriados (por exemplo, Meios Essenciais Mínimos ou Meios de RPMI 1640 ou, X-vivo 15, (Lonza)) que podem conter fatores necessários para proliferação e viabilidade, incluindo soro (por exemplo, soro bovino fetal ou humano), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-Y, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFß, e TNF-a ou quaisquer outros aditivos para o crescimento de células conhecidos pelo técnico versado. Outros aditivos para o crescimento de células incluem, porém não estão limitados a tensoativo, plasmanato, e agentes de redução tais como N- acetil-cisteína e 2-mercaptoetanol. Meios podem incluir RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15, e X-Vivo 20, Otimizador, com aminoácidos adicionados, piruvato de sódio, e vitaminas, ou livres de soro ou suplementados com uma quantidade apropriada de soro (ou plasma) ou um grupo definido de hormônios, e/ou uma quantidade de citocine(s) suficiente para o crescimento e expansão de células T. Antibióticos, por exemplo, penicilina e estreptomicina, são incluídos apenas em cultura experimentais, não em culturas de células que não devem ser infundidas em um indivíduo. As células alvo são mantidas sob condições necessárias para suportar o crescimento, por exemplo, uma temperatura apropriada (por exemplo, 37° C) e atmosfera (por exemplo, ar mais CO2a 5%).

[00519] Em uma modalidade, as células são expandidas meios apropriados (por exemplo, os meios descritos aqui) que incluem uma ou mais interleucinas que resulta em pelo menos um aumento de 200 vezes (por exemplo, 200 vezes, 250 vezes, 300 vezes, 350 vezes) em células durante um período de 14 dias de expansão, por exemplo, como medido por um método descrito aqui tal como citometria de fluxo. Em uma modalidade, as células são expandidas na presença de IL-15 e/ou IL-7 (por exemplo, IL-15 e IL-7).

[00520] Em modalidades, metods descrito aqui, por exemplo, métodos de fabricação de célula expressando CAR, compreendem a remoção de células T regulatórias, por exemplo, células T de CD25+, de uma população de célula, por exemplo, usando um anticorpo anti- CD25, ou fragmento do mesmo, ou um ligante de ligação de CD25, IL- 2. Métodos de remoção de células T regulatórias, por exemplo, células T de CD25+, de uma população de célula são descrito aqui. Em modalidades, os métodos, por exemplo, métodos de fabricação, também compreendem contatar uma população de célula (por exemplo, uma população de célula em que células T regulatórias, tal como células T de CD25+, foi depauperada; ou uma população de célula que foi previamente contatada um anticorpo anti-CD25, fragmento do mesmo, ou ligante de ligação de CD25) com IL-15 e/ou IL-7. Por exemplo, a população de célula (por exemplo, que foi anteriormente contatada um anticorpo anti-CD25, fragmento do mesmo, ou ligante de ligação de CD25) é expandida na presença de IL-15 e/ou IL-7.

[00521] Em algumas modalidades uma célula expressando CAR, descrita aqui, é contatada com uma composição compreendendo um polipeptídeo de interleucina-15 (IL-15), um polipeptídeo de receptor alfa de interleucina-15 (IL-15Ra), ou uma combinação tanto de um polipeptídeo de IL-15 quanto de um polipeptídeo de IL-15Ra, por exemplo, hetIL-15, durante a fabricação da célula expressando CAR, por exemplo, ex vivo. Em modalidades, uma célula expressando CAR, descrita aqui, é contatada com uma composição compreendendo um polipeptídeo de IL-15 durante a fabricação da célula expressando CAR, por exemplo, ex vivo. Em modalidades, uma célula expressando CAR, descrita aqui, é contatada com uma composição compreendendo uma combinação tanto de um polipeptídeo de IL-15 e um polipeptídeo de IL- 15 Ra durante a fabricação da célula expressando CAR, por exemplo, ex vivo. Em modalidades, uma célula expressando CAR, descrita aqui, é contatada com uma composição compreendendo hetIL-15 durante a fabricação da célula expressando CAR, por exemplo, ex vivo.

[00522] Em uma modalidade a célula expressando CAR descrita aqui é contatada com uma composição compreendendo hetIL-15 durante expansão ex vivo. Em uma modalidade, a célula expressando CAR descrita aqui é contatada com uma composição compreendendo um polipeptídeo de IL-15 durante expansão ex vivo. Em uma modalidade, a célula expressando CAR descrita aqui é contatada com uma composição compreendendo tanto um polipeptídeo de IL-15 quanto polipeptídeo de IL-15Ra durante expansão ex vivo. Em uma modalidade, o contato resulta na sobrevivência e proliferação de uma subpopulação de linfócito, por exemplo, células T de CD8+.

[00523] Células T que foram expostas variadas vezes de estimulação podem exibir características diferentes. Por exemplo, produtos de células mononuclear de sangue típico ou sangue periférico por aférese têm uma população célula T auxiliadora (TH, CD4+) que é maior do que a população de célula T citotóxica ou supressora (TC, CD8+). A expansão ex vivo de células T estimulando receptores de CD3 e CD28 produz umas populações de célula T que antes de cerca de 8 a 9 dias consiste predominatemente em células TH, ao mesmo tempo em que após cerca de 8 a 9 dias, as populações de célula T compreende uma população cada vez maior de células TC. Consequentemente, dependendo do propósito de tratamento, a infusão de um indivíduo com uma população de célula T que compreende predominamente células TH, pode ser vantajoso. Similarmente, Se um subgrupo específico de antígeno de células TC tiver sido isolado, pode ser benefice expandir este subgrupo para um grau maior.

[00524] Além disso, além dos marcadores de CD4 e CD8, outros fenótipos podem significantemente variar, porém em maior parte, reproduzivelmente durante o curso de um processo de expansão de célula. Desse modo, tal reproduzibilidade permite a capacidade de adaptar um produto de célula T ativada para propósitos específicos.

[00525] Em outras modalidades, o método de preparação descrito aqui também compreende contatar as populações de célula efetoras imunes com um ácido nucleico codificando uma subunidade de telomerase, por exemplo, hTERT. O ácido nucleico codificando a subunidade de telomerase pode ser DNA.

[00526] Em algumas modalidades, um inibidor de cinase (por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe) é adicionado durante o processo de fabricação de célula CAR. De acordo com a teoria não limitante aqui, o inibidor de cinase pode melhorar a qualidade das populações de células produzidas. Por exemplo, células expressando CAR são frequentemente produzidas de uma amostra de aférese de plasma do próprio paciente de câncer, que pode conter células de câncer, e o inibidor de cinase pode alterar a sinalização naquelas células de cancer (por exemplo, um câncer expressando BTK tal como CLL ou MCL), por exemplo, reduzindo sua proliferação ou nívis crescentes de apoptose. Como outro exemplo, o inibidor de cinase pode alterar a sinalização nas células expressando CAR (ou células efetoras imunes antes delas expressarem CAR), por exemplo, inibindo ITK em células T. O inibidor de cinase pode mudar o equlíbrio de células T de células TH2 a células TH1.

[00527] O inibidor de cinase (por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe) pode ser adicionado à mistura reacional em um nível suficiente para inibir seu alvo, por exemplo, BTK. Em algumas modalidades, o inibidor de cinase (por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe) é adicionado em uma concentração de cerca de 0,10,2, 0,2-0,5, 0,5-1, 1-2, 2-5, ou 5-10 µM. Em algumas modalidades, o inibidor de cinase é um inibidor covalente (tal como ibrutinibe) e um pulso curto é suficiente para irreversivelmente inativar o alvo ao mesmo tempo em que evitando toxicidade não específica. Consequentemente, o inibidor de cinase pode ser adicionado, por exemplo, 10 a 20, 20 a 30, 30 a 40, 40 a 60, ou 60 a 120 minutos. O inibidor de cinase pode também ser adicionado durante períodos de tempo mais longos, por exemplo, se o inibidor de cinase tiver um não covalente de ação. Desse modo, o inibidor de cinase pode ser adicionado, por exemplo, durante 2 a 4, 4 a 6, 6 a 8, 8 a 12, 12 a 18, ou 18 a 24 horas, ou durante 1 a 2, 2 a 3, 3 a 4, 4 a 6, 6 a 8, 8 a 10 dias, ou durante todo comprimento de tempo em que as células estão sendo cultivadas. O inibidor de cinase pode ser adicionado em vários pontos durante o processo de fabricação, por exemplo, depois da colheita das células, antes da estimulação com contas, após estimulação com contas, antes da transdução, depois da transdução, ou antes da administração das células ao paciente. Em algumas modalidades, o inibidor de cinase (por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe) é adicionado após colheita das células ou antes da estimulação, por exemplo, com contas. Antes e depois, neste contexto, podem referir-se, por exemplo, cerca de 1, 5, 15, 30, 45, ou 60 minutos antes ou depois, ou 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 horas antes ou depois.

[00528] Visto que um CAR de CD19 é construído, vários ensaios podem ser usados para avaliar a atividade da molécula, tal como, porém não limitado à capacidade de expandir células T após estimulação de antígeno, sustentar a expansão de célula T na ausência de re- estimulação, e atividades anticâncer em modelos in vitro e de animal. Ensaios para avaliar os efeitos de um CAR de CD19 são descritos em maiores detalhes abaixo.

[00529] Análise Western blot de expressão de CAR em células T primárias pode ser usada para detectar a presença de monômeros e dímeros. Veja, por exemplo, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Muito resumidamente, células T (mistura de 1:1 de células T de CD4+ e CD8+) expressando os CARs são expandidas in vitro durante mais do que 10 dias seguido por lise e SDS-PAGE sob condições de redução. CARs contendo o domíniio citoplásmico de TCR- Z de tamanho natural e a cadeia TCR-Z endógena são detectados por western blottingusando um anticorpo para a cadeia TCR-Z. Os mesmos subgrupos de célula T são usados para análise de SDS-PAGE sob condições de não redução para permitir a avaliação de formação de dímero covalente.

[00530] Expansão in vitro de células T CAR+ seguindo estimulação de antígeno pode ser medida por citometria de fluxo. Por exemplo, uma mistura de células T de CD4+ e CD8+ é estimulada com contas de aCD3/aCD28 seguido por transdução com vetores lentivirais expressando GFP sob o controle dos promotores a ser analisados. Promotores exemplares incluem os promotores de gene IE de CMV, EF- 1a, ubiquitina C, ou fosfoglicerocinase (PGK). Fluorescência de GFP é avaliada no dia 6 de cultura nos subgrupos de célula T de CD4+ e/ou CD8+ por citometria de fluxo. Veja, por exemplo, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Alternativamente, uma mistura de células T de CD4+ e CD8+ é estimulada com contas magnéticas revestidas por aCD3/aCD28 no dia 0, e transduzida com CAR no dia 1 usando um vetor lentiviral bicistrônico expressando CAR junto com eGFP usando uma sequência sequência de salto ribossômica 2A. Culturas são re-estimuladas com células K562 de CD19+ (K562-CD19), células K562 do tipo selvagem (K562 do tipo selvagem) ou células K562 expressando hCD32 e 4-1BBL na presença de anti-CD3 e anticorpo anti-CD28 (K562-BBL-3/28) após lavagem. IL-2 exógena é adicionada às culturas a cada dois dias a 100 IU/mL. As células T de GFP+ são enumeradas por citometria de fluxo usando contagem com base em conta. Veja, por exemplo, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 14531464 (2009).

[00531] Expansão de célula T de CAR+ sustentada na ausência de re-estimulação pode também ser medida. Veja, por exemplo, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Resumidamente, o volume de célula T média (fl) é medido no dia 8 da cultura usando uma contadora de partícula Coulter Multisizer, um Nexcelom Cellometer Vision ou Millipore Scepter, após estimulação com contas magnéticas revestidas por aCD3/aCD28 no dia 0, e transdução com o CAR indicado no dia 1.

[00532] Modelos de animal também podem ser usados para medir uma atividade de CART. Por exemplo, modelo de xenoenxerto usando células T CAR+específicas de CD19 para tratar uma ALL pré-B humana pimária em camundongos imunodeficientes pode ser usado. Veja, por exemplo, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Muito resumidamente, após estabelecimento de ALL, os camundongos são randomizados para grupos de tratamento. Diferentes números de células T criadas por aCD19-Z e aCD19-BB-Z são coinjetadas em uma relação de 1:1 em camundongos NOD-SCID-Y-/- transportando B-ALL. O número de cópias de vetor de aCD19-Z e aCD19-BB-Z em DNA de baço de camundongos é avaliado em vários momentos após injeção de célula T. Os animais são avaliados quanto à leucemia em intervalos semanais. Contagens de célula imatura de B-ALL de CD19+ de sangue periférico são medidas em camundongos que são injetados com células T CAR+ de aCD19-Z ou células T transduzidas por simulação. Curvas de sobrevivência para os grupos são comparadas usando o teste de logrank. Além disso, contagens de célula T de CD4+ e CD8+ de sangue periférico absoluto, 4 semanas após injeção de célula T em camundongos NOD-SCID-Y-/- também podem ser analisadas. Os camundongos são injetados com células leucêmicas e 3 semanas depois são injetados com células T criadas para expressar CAR por um vetor lentiviral bicistrônico que codifica o CAR ligado a eGFP. Células T são normalizadas para 45 a 50% de entrada de células T GFP+ misturando com células transduzidas por simulação antes da injeção, e confirmadas por citometria de fluxo. Animais são avaliados quanto à leucemia em intervalos de 1 semana. Curvas de sobrevivência quanto aos grupos de célula T de CAR+são comparadas usando o teste logrank.

[00533] A resposta de tratamento com CAR dependente de dose pode ser avaliada. Veja, por exemplo, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Por exemplo, sangue periférico é obtido 35 a 70 dias após estabelecimento de leucemia em camundongos injetados no dia 21 com células T CAR, um número equivalente de células T transduzidas por simulação, ou nenhuma célula T. Os camundongos de cada grupo são randomicamente sangrados para determinação de contagens de blasto de ALL de CD19+ de sangue periférico e, em seguida, mortos nos dias 35 e 49. Os animais restantes são avaliados nos dias 57 e 70.

[00534] A avaliação de proliferação de célula e produção de citocina foi anteriormente descrita, por exemplo, em Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Resumidamente, a avaliação de proliferação mediada por CAR é realizada em placas de microtítulo misturando células T lavadas com células K562 expressando CD19 (K19) ou CD32 e CD137 (KT32-BBL) para uma relação final de célula T:K562 de 2:1. As células K562 são irradiadas com radiação gama antes do uso. Anticorpos monoclonais anti-CD3 (clone OKT3) e anti-CD28 (clone 9.3) são adicionados às culturas com células KT32-BBL para funcionar como um controle positivo para estimulação de proliferação de célula T visto que estes sinais suportam expansão de célula T de CD8+ de longa duração ex vivo. Células T são enumeradas em culturas usando contas fluorescentes CountBright™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) e citometria de fluxo como descrito pelo fabricante. Células T CAR+são identificadas por expressão de GFP usando células T que são criadas com vetores entivirais expressando CAR ligado a eGFP-2A. Para células T CAR+ não expressando GFP, as células T CAR+ são detectadas com proteína CD19 recombinante biotinilada e um conjugado de avidin-PE secundário. A expressão de CD4+ e CD8+ em células T é também simultaneamente detectada com anticorpos monoclonais específicos (BD Biosciences). Avaliações de citocina são realizadas em sobrenadantes coletados 24 horas após re-estimulação usando o kit de disposição de conta citométrica de citocina TH1/TH2 humana (BD Biosciences, San Diego, CA) de acordo com as instruções do fabricante. A fluorescência é avaliada usando um citômetro de fluxo FACScalibur, e os dados são analisados de acordo com as instruções do fabricante.

[00535] A citotoxicidade pode ser avaliada por um ensaio de liberação de 51Cr padrão. Veja, por exemplo, Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009). Resumidamente, células alvo (linhagens K562 e células pro-B-ALL primárias) são carregadas com 51Cr (como NaCrO4, New England Nuclear, Boston, MA) a 37oC durante 2 horas com agitação frequente, lavadas duas vezes em RPMI completo e colocadas em placas de microtítulo. Células T efetoras são misturadas com células alvo nas cavidades em RPMI completo em relações variáveis de célula efetora:célula alvo (E:T). Cavidades adicionais contendo meios apenas (liberação espontânea, SR) ou uma solução de 1% de detergente triton-X 100 (liberação total, TR) são também preparadas. Após 4 horas de incubação a 37oC, o sobrenadante de cada cavidade é colhido. O 51Cr liberado é em seguida medido usando uma contadora de partícula de gama (Packard Instrument Co., Waltham, MA). Cada condição é realizada em pelo menos triplicatas, e a porcentagem de lise é calculada usando a fórmula: % Lise = (ER- SR) / (TR - SR), onde ER representa amédia de 51Cr liberado para cada condição experimental.

[00536] Tecnologias de imageamento podem ser usadas para avaliar a proliferação e tráfego específico de CARs em modelos de animal transportando tumor. Tais ensaios foram descritos, por exemplo, em Barrett et al., Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011). Resumidamente, camundongos NOD/SCID/Yc-/-(NSG) são injetados IV com células Nalm-6 após 7 dias, depois com células T 4 horas após eletroporação com os construtos de CAR. As células T são estavelmente transfectadas com uma construção lentiviral para expressar vagalume luciferase, e camundongos são submetidos a imageamento para bioluminescência. Alternativamente, a eficácia terapêutica e especificidade de uma única de injeção de células T CAR+ em modelo de xenoenxerto de Nalm-6 podem ser medidas como o seguinte: camundongos NSG são injetados com células transduzidas por Nalm-6 para estavelmente expressar vagalume luciferase, seguido por uma injeção na veia da cauda simples de células T eletroporadas com CAR de CD19 7 dias depois. Os animals são submetidos a imageamento em vários pontos de tempo após injeção. Por exemplo, mapas de calor de densidade de fóton de positiva leucemia de vagalume luciferase em camundongos representativos no dia 5 (2 dias antes do tratamento) e dia 8 (24 horas após PBLs de CAR+) podem ser gerados.

[00537] Outros ensaios, incluindo aqueles descritos na seção de Exemplo aqui, bem como aqueles que são conhecidos na técnica também podem ser usados para avaliar os construtos de CAR de CD19 da invenção.

Inibidor de Cinase

[00538] Em uma modalidade, o inibidor de cinase é um inibidor de CDK4, por exemplo, um inibidor de CDK4 descrito aqui, por exemplo, um inibidor de CDK4/6, tal como, por exemplo, cloridrato de 6-acetil-8- ciclopentil-5-metil-2-(5-piperazin-1-il-piridin-2-ilamino)-8H-pirido [2,3- d]pirimidin-7-ona, (também referido como palbociclibe ou PD0332991). Em uma modalidade, o inibidor de cinase é um inibidor de BTK, por exemplo, um inibidor de BTK descrito aqui, tal como, por exemplo, ibrutinibe. Em uma modalidade, o inibidor de cinase é um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor de mTOR descrito aqui, tal como, por exemplo, rapamicina, um análogo de rapamicina, OSI-027. O inibidor de mTOR pode ser, por exemplo, um inibidor de mTORC1 e/ou um inibidor de mTORC2, por exemplo, um inibidor de mTORC1 e/ou mTORC2 inhibitor descrito aqui. Em uma modalidade, o inibidor de cinase é um inibidor de MNK, por exemplo, um inibidor de MNK descrito aqui, tal como, por exemplo, 4-amino-5-(4-fluoroanilino)-pirazolo [3,4-d] pirimidina. O inibidor de MNK pode ser, por exemplo, inibidor de MNK1a, MNK1b, MNK2a e/ou MNK2b.

[00539] Em uma modalidade, o inibidor de cinase é um inibidor de CDK4 selecionado de aloisina A; flavopiridol ou HMR-1275, 2-(2- clorofenil)-5,7-di-hidróxi-8- [(3S,4R)-3-hidróxi-1-metil-4-piperidinil]-4- cromenona; crizotinibe (PF-02341066; cloridrato de 2-(2-Clorofenil)-5,7- di-hidróxi-8- [(2R,3S)-2-(hidroximetil)-1-metil-3-pirrolidinil]-4H-1- benzopiran-4-ona, (P276-00); 1-metil-5- [ [2- [5-(trifluorometil)-1H- imidazol-2-il]-4-piridinil]óxi]-N- [4-(trifluorometil)fenil]-1H-benzimidazol-2- amina (RAF265); indisulam (E7070); roscovitina (CYC202); palbociclibe (PD0332991); dinaciclibe (SCH727965); N- [5- [ [(5-terc-butiloxazol-2- il)metil]tio]tiazol-2-il]piperidina-4-carboxamida (BMS 387032); ácido 4- [ [9-cloro-7-(2,6-difluorofenil)-5H-pirimido [5,4-d] [2]benzazepin-2- il]amino]-benzóico (MLN8054); 5- [3-(4,6-difluoro-1H-benzimidazol-2-il)- 1H-indazol-5-il]-N-etil-4-metil-3-piridinemetanamina (AG-024322); 4- (2,6-diclorobenzoilamino)-1H-pirazol-3-carboxílico acid N-(piperidin-4- il)amida (AT7519); 4- [2-metil-1-(1-metiletil)-1H-imidazol-5-il]-N- [4- (metilsulfonil)fenil]-2-pirimidinamina (AZD5438); e XL281 (BMS908662).

[00540] Em uma modalidade, o inibidor de cinase é um inibidor de CDK4, por exemplo, palbociclibe (PD0332991), e o palbociclibe é administrado em uma dose de cerca de 50 mg, 60 mg, 70 mg, 75 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 105 mg, 110 mg, 115 mg, 120 mg, 125 mg, 130 mg, 135 mg (por exemplo, 75 mg, 100 mg ou 125 mg) diariamente durante um período de tempo, por exemplo, diariamente durante 14 a 21 dias de um ciclo de 28 dias, ou diariamente durante 7 a 12 dias de um ciclo de 21 dias. Em uma modalidade, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais ciclos de palbociclibe são administrados.

[00541] Um inibidor de CDK4/6 exemplar é LEE011 (também chamado ribociclibe), a estrutura da qual é mostrada abaixo.

[00542] Sem estar ligado à teoria, acredita-se que a administração de uma célula expressando CAR descrita aqui com um inibidor de CDK4/6 (por exemplo, LEE011 ou outro inibidor de CDK4/6 descrito aqui) possa obter responsividade elevada, por exemplo, com taxas de remissão elevadas e/ou taxas de reincidência menores, por exemplo, em comparação com um inibidor de CDK4/6 sozinho.

[00543] Embora não desejando estar ligado à teoria, em algumas modalidades o inibidor de CDK4/6 age para reduzir atividade de ciclina D1 em células de câncer, por exemplo, células MCL. Algumas células de câncer são caracterizadas por níveis de ciclina D1 elevados devido a uma translocação. CDK4 se complexa com ciclina D para promover a progressão de ciclo celular. Consequentemente, em algumas modalidades, a administração do inibidor de CK4/6 reduz a proliferação de célula de câncer. Veja, por exemplo, Marzec et al., "Mantle cell limphoma cells express predominantly cyclin D1a isoform and are highly sensitive to selective inhibition of CDK4 kinase activity." Blood. 1 de Setembro de 2006;108(5):1744-50. Epub 11 de maio de 2006.

[00544] Em uma modalidade, o inibidor de cinase é um inibidor de BTK selecionado de ibrutinibe (PCI-32765); GDC-0834; RN-486; CGI- 560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO-4059; CNX-774; e LFM-A13. Em uma modalidade, o inibidor de BTK não reduz ou inibe a atividade de cinase de cinase induzível por interleucina 2 (ITK), e é selecionado de GDC-0834; RN-486; CGI-560; CGI-1764; HM-71224; CC-292; ONO- 4059; CNX-774; e LFM-A13.

[00545] Em uma modalidade, o inibidor de cinase é um inibidor de BTK, por exemplo, ibrutinibe (PCI-32765), e o ibrutinibe é administrado em uma dose de cerca de 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 420 mg, 440 mg, 460 mg, 480 mg, 500 mg, 520 mg, 540 mg, 560 mg, 580 mg, 600 mg (por exemplo, 250 mg, 420 mg ou 560 mg) diariamente durante um período de tempo, por exemplo, diariamente durante ciclo de 21 dias, ou diariamente durante ciclo de 28 dias. Em uma modalidade, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais ciclos de ibrutinibe são administrados.

[00546] Em modalidades, o inibidor de BTK (por exemplo, ibrutinibe) é administrado a um indivíduo que tem CLL, linfoma de célula de revestimento (MCL), ou linfoma linfocítico pequeno (SLL). Por exemplo, o indivíduo ao qual o inibidor de BTK é administrado tem uma deleção na ramificação curta de cromossoma 17 (del(17p), por exemplo, em uma célula leucêmica). Em outros exemplos, o indivíduo ao qual o inibidor de BTK é administrado não tem um del(17p). Em modalidades, o indivíduo ao qual o inibidor de BTK é administrado reincidiu à CLL ou SLL, por exemplo, o indivíduo foi anteriormente administrado com uma terapia de câncer (por exemplo, foram anteriormente administradas uma, duas, três, ou quatro terapias de câncer). Em modalidades, o indivíduo ao qual o inibidor de BTK é administrado tem CLL ou SLL refratário. Em outras modalidades, o indivíduo ao qual o inibidor de BTK é administrado tem linfoma folicular, por exemplo, linfoma folicular reincidente ou refratário.

[00547] A estrutura de ibrutinibe (1- [(3R)-3- [4-Amino-3-(4- fenoxifenil)-1H-pirazolo [3,4-d]pirimidin-1-il]piperidin-1-il]prop-2-en-1- ona) é mostrada abaixo.

[00548] Concentrações de ibrutinibe excedendo aproximadamente 400 nM não são clinicamente relevantes. No estudo por Advani et al (J Clin Oncol 2012;31:88), a concentração de soro de pico médio de ibrutinibe foi de cerca de 130ng/mL, que é equivalente a 295 nM (com base no peso molecular de ibrutinibe de 440.5). Portanto, os dados mostram o efeito de ibrutinibe sobre células T em uma concentração de 1uM que significantemente excede a concentração clinicamente relevante in vivo.

[00549] Em uma modalidade, o inibidor de cinase é um inibidor de mTOR selecionado de temsirolimo; ridaforolimo (1R,2R,4S)-4- [(2R)-2 [(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R, 23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)- 1,18-di-hidróxi-19,30-dimetóxi-15,17,21,23, 29,35-hexametil- 2,3,10,14,20-pentaoxo-11,36-dioxa-4-azatriciclo [30.3.1.04,9] hexatriaconta-16,24,26,28-tetraen-12-il]propil]-2-metoxiciclo-hexil dimetilfosfinato, também conhecido como AP23573 e MK8669; everolimo (RAD001); rapamicina (AY22989); simapimode; (5-{2,4- bis [(3S)-3-metilmorfolin-4-il]pirido [2,3-d]pirimidin-7-il}-2- metoxifenil)metanol (AZD8055); 2-amino-8- [trans-4-(2- hidroxietóxi)ciclo-hexil]-6-(6-metóxi-3-piridinil)-4-metil-pirido [2,3- d]pirimidin-7(8H)-ona (PF04691502); e N2- [1,4-dioxo-4- [ [4-(4-oxo-8- fenil-4 H-1-benzopiran-2-il)morfolínio4-il]metóxi]butil]-L-arginilglicil-L-a- aspartilL-serina-, sal interno (SF1126); e XL765.

[00550] Em uma modalidade, o inibidor de cinase é um inibidor de mTOR, por exemplo, rapamicina, e a rapamicina é administrada em uma dose de cerca de 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg (por exemplo, 6 mg) diariamente durante um período de tempo, por exemplo, diariamente durante ciclo de 21 dias, ou diariamente durante ciclo de 28 dias. Em uma modalidade, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais ciclos de rapamicina são administrados. Em uma modalidade, o inibidor de cinase é um inibidor de mTOR, por exemplo, everolimo e o everolimo é administrado em uma dose de cerca de 2 mg, 2.5 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg (por exemplo, 10 mg) diariamente durante um período de tempo, por exemplo, diariamente durante ciclo de 28 dias. Em uma modalidade, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais ciclos de everolimo são administrados.

[00551] Em uma modalidade, o inibidor de cinase é um inibidor de MNK selecionado de CGP052088; 4-amino-3-(p-fluorofenilamino)- pirazolo [3,4-d] pirimidina (CGP57380); cercosporamida; ETC-17804452; e 4-amino-5-(4-fluoroanilino)-pirazolo [3,4-d] pirimidina.

[00552] Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui, opcionalmente em combinação com um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe, é administrada a um indivíduo em combinação com um inibidor de fosfoinositídeo 3-cinase (PI3K) (por exemplo, um inibidor de PI3K descrito aqui, por exemplo, idelalisibe ou duvelisibe) e/ou rituximabe. Em modalidades, uma célula expressando CAR, descrita aqui, é administrada a um indivíduo em combinação com idelalisibe e rituximabe. Em modalidades, uma célula expressando CAR, descrita aqui, é administrada a um indivíduo em combinação com duvelisibe e rituximabe. Idelalisibe (também chamado GS-1101 ou CAL-101; Gilead) é uma molécula pequena que bloqueia a isoforma delta de PI3K. A estrutura de idelalisibe (5-Fluoro-3-fenil-2- [(1S)-1-(7H-purin-6-ilamino)propil]-4(3H)-quinazolinona) é mostrada abaixo.

[00553] Duvelisibe é uma molécula pequena que bloqueia PI3K-d,Y. A estrutura de duvelisibe (8-Cloro-2-fenil-3- [(1S)-1-(9H-purin-6- ilamino)etil]-1(2H)-isoquinolinona) é mostrada abaixo.

[00554] Em modalidades, o indivíduo tem CLL. Em modalidades, o indivíduo tem CLL reincidente, por exemplo, o indivíduo foi anteriormente administrado uma terapia de câncer (por exemplo, foi anteriormente administrado um anticorpo anti-CD20 ou foi anteriormente administrado ibrutinibe). Por exemplo, o indivíduo tem uma deleção na ramificação curta de cromossoma 17 (del(17p), por exemplo, em uma célula leucêmica). Em outros exemplos, o indivíduo não tem um del(17p). Em modalidades, o indivíduo compreende uma célula leucêmica compreendendo uma mutação no gene de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (IgVH). Em outras modalidades, o indivíduo não compreende uma célula leucêmica compreendendo uma mutação no gene de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (IgVH). Em modalidades, o indivíduo tem uma deleção na ramificação longa de cromossoma 11 (del(11q)). Em outras modalidades, o indivíduo não tem um del(11q). Em modalidades, idelalisibe é administrado em uma dosagem de cerca de 100 a 400 mg (por exemplo, 100 a 125, 125 a 150, 150 a 175, 175 a 200, 200 a 225, 225 a 250, 250 a 275, 275 a 300, 325 a 350, 350 a 375, ou 375 a 400 mg), por exemplo, BID. Em modalidades, duvelisibe é administrado em uma dosagem de cerca de 15 a 100 mg (por exemplo, cerca de 15 a 25, 25 a 50, 50 a 75, ou 75 a 100 mg), por exemplo, duas vezes ao dia. Em modalidades, rituximabe é administrado em uma dosagem de cerca de 350 a 550 mg/m2 (por exemplo, 350 a 375, 375 a 400, 400 a 425, 425 a 450, 450 a 475, ou 475 a 500 mg/m2), por exemplo, intravenosamente.

[00555] Em uma modalidade, o inibidor de cinase é um fosfatidilnositol 3-cinase dual (PI3K) e inibidor de mTOR selecionado de 2-Amino-8- [trans-4-(2-hidroxietóxi)ciclo-hexil]-6-(6-metóxi-3-piridinil)-4- metil-pirido [2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (PF-04691502); N- [4- [ [4- (Dimetilamino)-1-piperidinil]carbonil]fenil]-N'- [4-(4,6-di-4-morfolinil- 1,3,5-triazin-2-il)fenil]ureia (PF-05212384, PKI-587); 2-Metil-2-{4- [3- metil-2-oxo-8-(quinolin-3-il)-2,3-di-hidro-1H-imidazo [4,5-c]quinolin-1- il]fenil}propanonitrila (BEZ-235); apitolisibe (GDC-0980, RG7422); 2,4- Difluoro-N-{2-(metilóxi)-5- [4-(4-piridazinil)-6-quinolinil]-3- piridinil}benzenosslfonamida (GSK2126458); ácido maleico de 8-(6- metoxipiridin-3-il)-3-metil-1-(4-(piperazin-1-il)-3-(trifluorometil)fenil)-1H- imidazo [4,5-c]quinolin-2(3H)-ona (NVP-BGT226); 3- [4-(4- Morfolinilpirido [3',2':4,5]furo [3,2-d]pirimidin-2-il]fenol (PI-103); 5-(9- isopropil-8-metil-2-morfolino-9H-purin-6-il)pirimidin-2-amina (VS-5584, SB2343); e N- [2- [(3,5-Dimetoxifenil)amino]quinoxalin-3-il]-4- [(4-metil-3- metoxifenil)carbonil]aminofenilsulfonamida (XL765).

[00556] Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui, opcionalmente em combinação com um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe, é administrada a um indivíduo em combinação com um inibidor de linfoma anaplásico cinase (ALK). Inibidores de ALK cinase exemplares incluem, porém não estão limitados a (Pfizer), ceritinibe (Novartis), alectinibe (Chugai), brigatinibe (também chamado AP26113; Ariad), entrectinibe (Ignyta), PF-06463922 (Pfizer), TSR-011 (Tesaro) (veja, por exemplo, Identificador de teste Clínico n° NCT02048488), CEP-37440 (Teva), e X-396 (Xcovery). Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer sólido, por exemplo, um câncer sólido descrito aqui, por exemplo, câncer pulmonar.

[00557] O nome químico de crizotinibe é 3- [(1R)-1-(2,6-dicloro-3- fluorofenil)etóxi]-5-(1-piperidin-4-ilpirazol-4-il)piridin-2-amina. O nome químico de ceritinibe é 5-Cloro-N2- [2-isopropóxi-5-metil-4-(4- piperidinil)fenil]-N4- [2-(isopropilsulfonil)fenil]-2,4-pirimidinadiamina. O nome químico de alectinibe é 9-etil-6,6-dimetil-8-(4-morfolinopiperidin- 1-il)-11-oxo-6,11-di-hidro-5H-benzo [b]carbazol-3-carbonitrila. O nome químico de brigatinibe é 5-Cloro-N2-{4- [4-(dimetilamino)-1-piperidinil]-2- metoxifenil}-N4- [2-(dimetilfosforil)fenil]-2,4-pirimidinadiamina. O nome químico de entrectinibe é N-(5-(3,5-difluorobenzil)-1H-indazol-3-il)-4-(4- metilpiperazin-1-il)-2-((tetra-hidro-2H-piran-4-il)amino)benzamida. O nome químico de PF-06463922 é (10R)-7-Amino-12-fluoro-2,10,16- trimetil-15-oxo-10,15,16,17-tetra-hidro-2H-8,4-(meteno)pirazolo [4,3- h] [2,5,11]-benzoxadiazaciclotetradecina-3-carbonitrila. A estrutura química de CEP-37440 é (S)-2-((5-cloro-2-((6-(4-(2- hidroxietil)piperazin-1-il)-1-metóxi-6,7,8,9-tetra-hidro-5H- benzo [7]anulen-2-il)amino)pirimidin-4-il)amino)-N-metilbenzamida. O nome químico de X-396 é (R)-6-amino-5-(1-(2,6-dicloro-3- fluorofenil)etóxi)-N-(4-(4-metilpiperazina-1-carbonil)fenil)piridazina-3- carboxamida.

[00558] Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui, opcionalmente em combinação com um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe, é administrada a um indivíduo em combinação com um inibidor de indoleamina 2,3- dioxigenase (IDO). IDO é uma enzima que catalisa a degradação do aminoácido, L-triptofano, em quinurenina. Muitos cânceres superexpressam IDO, por exemplo, câncer prostático, colorretal, pancreático, cervical, gástrico, ovariano, cabeça e pulmonar. pDCs, macrófagos, e células dendríticas (DCs) podem expressam IDO. Sem estar ligado à teoria, acredita-se que um decréscimo em L-triptofano (por exemplo, catalisado por IDO) resulte em um ambiente imunossupressor induzindo anergia e apoptose de célula T. Desse modo, sem estar ligado à teoria, acredita-se que um inibidor de IDO possa realçar a eficácia de uma célula expressando CAR descrita aqui, por exemplo, diminuindo a supressão ou morte de uma célula imune expressando CAR. Em modalidades, o indivíduo tem um tumor sólido, por exemplo, um tumor sólido descrito aqui, por exemplo, câncer prostático, colorretal, pancreático, cervical, gástrico, ovariano, cabeça ou pulmonar. Inibidores exemplares de IDO incluem, porém não estão limitados a 1-metil-triptofano, indoximod (NewLink Genetics) (veja, por exemplo, Identificadores de Teste Clínico n°s NCT01191216; NCT01792050), e INCB024360 (Incyte Corp.) (veja, por exemplo, Identificadores de Teste Clínico n°s NCT01604889; NCT01685255)

[00559] Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui, opcionalmente em combinação com um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe, é administrada a um indivíduo em combinação com um modulador de células supressoras derivadas de mieloide (MDSCs). MDSCs acumulam-se na periferia e no sítio de tumor de muitos tumores sólidos. Estas células suprimem as respostas de célula T, desse modo impedindo a eficácia de terapia de célula expressando CAR. Sem estar ligado à teoria, acredita-se que a administração de um modulador de MDSC realce a eficácia de uma célula expressando CAR descrita aqui. Em uma modalidade, o indivíduo tem um tumor sólido, por exemplo, um tumor sólido descrito aqui, por exemplo, glioblastoma. Moduladores exemplares de MDSCs incluem, porém não estão limitados a MCS110 e BLZ945. MCS110 é um anticorpo monoclonal (mAb) contra fator de estimulação de colônia de macrófago (M-CSF). Veja, por exemplo, Identificador de teste Clínico n° NCT00757757. BLZ945 é um inibidor de molécula pequena de receptor de fator de estimulação de colônia (CSF1R). Veja, por exemplo, Pyonteck et al. Nat. Med. 19(2013):1264-72. A estrutura de BLZ945 é mostrada abaixo.

[00560] Em algumas modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui, opcionalmente em combinação com um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe, é administrada a um indivíduo em combinação com um polipeptídeo de interleucina-15 (IL-15), um polipeptídeo de receptor alfa de interleucina-15 (IL-15Ra), ou uma combinação tanto de um polipeptídeo de IL-15 e um polipeptídeo de IL-15Ra, por exemplo, hetIL-15 (Admune Therapeutics, LLC). hetIL-15 é um complexo não covalente heterodimérico de IL-15 e IL-15Ra. hetIL-15 é descrito em, por exemplo, U.S. 8.124.084, U.S. 2012/0177598, U.S. 2009/0082299, U.S. 2012/0141413, e U.S. 2011/0081311, incorporados aqui por referência. Em modalidades, het- IL-15 é administrada subcutâneamente. Em modalidades, o indivíduo tem um câncer, por exemplo, câncer sólido, por exemplo, melanoma ou câncer de cólon. Em modalidades, o indivíduo tem um câncer metastático.

Aplicação Terapêutica Doenças e/ou Distúrbios Associados com CD19

[00561] Em um aspecto, a invenção fornece métodos para tratamento de uma doença associada à expressão de CD19. Em um aspecto, a invenção fornece métodos para o tratamento de uma doença em que parte do tumor é negativo quanto ao CD19 e parte do tumor é positivo quanto ao CD19. Por exemplo, o CAR da invenção é útil para tratamento de indivíduos que tenham sido submetidos a tratamento de uma doença associada à expressão elevada de CD19, em que o indivíduo foi submetido ao tratamento quanto aos níveis elevados de CD19 exibe uma doença associada com níveis elevados de CD19.

[00562] As terapias descritas aqui podem ser usadas para tratar, por exemplo, indivíduos que respondem a um inibidor de cinase tal como ibrutinibe (por exemplo, resposta parcial ou resposta completa) ou indivíduos que não respondem (por exemplo, não responsivos ou reincidentes). Sem desejar ficar preso à teoria, diversos pacientes submetendo-se ao tratamento com inibidores de cinase (por exemplo, inibidores de BTK tal como ibrutinibe) podem mostrar uma resposta reduzida ao tratamento (por exemplo, são responsivos parciais ou não responsivos ao tratamento, ou reincidem durante o tratamento). Consequentemente, a administração das terapias de CAR descrita aqui, em combinação com os inibidores de cinases pode resultar em efeitos benéficos.

[00563] Regimes terapêuticos exemplares para estes indivíduos são descritos abaixo.

[00564] Em alguns casos, quando o indivíduo é um não responsivo ou reincidente a um inibidor de cinase (por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe), o inibidor de cinase é retirado e terapia com CAR é administrada. Em outros casos, quando os indivíduos não respondem a um inibidor de cinase (por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe), a terapia com o inibidor de cinase é continuada e a terapia com CAR é adicionada ao regime. Este uso é suportado, por exemplo, por experimentos no Exemplo 8 aqui, que indica que a terapia com CAR é eficaz como uma monoterapia em células resistentes a ibrutinibe. Sem desejar ficar preso à teoria, a continuação da terapia com o inibidor de cinase pode melhorar a eficácia da terapia com CAR, por exemplo, aumentando o número de células expressando CAR na corrente sanguínea (veja, Exemplo 8 aqui).

[00565] Sem estar ligado à teoria, um indivíduo que é um não responsivo ou reincidente a um inibidor de cinase (por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe) pode ser não responsivo por pelo menos duas razões: os indivíduos podem ter uma mutação no fármaco alvo (por exemplo, BTK, por exemplo, uma mutação de C481S) que impede a inibição de alvo, ou podem ter alterações em outras séries de reações que regulam a proliferação mesmo quando o alvo é adequadamente inibido (por exemplo, uma mutação em PLCY, tal como uma mutação de ativação em PLCY resultando em sinalização de célula independente de BTK constitutiva). O tratamento pode ser alterado dependendo da razão da não responsividade. Por exemplo, Na primeira situação (em algumas modalidades), se os indivíduos tiverem (ou forem identificados como tendo) uma mutação que impede o inibidor de cinase de inibir seu alvo, um segundo inibidor de cinase (por exemplo, direcionado contra o mesmo alvo) pode ser substituído por (ou administrado em combinação com) o inibidor de cinase. Mais especificamente, em algumas modalidades onde o pacinte tem (ou é identificado como tendo) uma mutação que impede ibrutinibe de inibir BTK, um segundo inibidor de BTK, por exemplo, um inibidor de BTK descrito aqui tal como GDC-0834, RN-486, CGI-560, CGI-1764, HM- 71224, CC-292, ONO-4059, CNX-774, ou LFM-A13) pode ser substituído por ibrutinibe. Sem desejar ficar preso à teoria, o segundo inibidor de cinase pode agir em uma região do alvo que não é rompida pela mutação, e, portanto, o indivíduo é sensível ao segundo inibidor de cinase. Em outras modalidades, o inibidor de cinase original (por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe) é mantido. De acordo com a teoria não limitante aqui, o inibidor de cinase original pode ter atividade útil nas células expressando CAR, por exemplo, promovendo um fenótipo de TH1, promovendo a proliferação, ou de outro modo aumentando os níveis ou atividade das células.

[00566] Como acima observado, em alguns casos um indivíduo é não responsivo por que o indivíduo tem uma alteração (por exemplo, uma mutação) em outra série de reação que pode regular a proliferação mesmo quando o alvo é adequadamente inibido. Consequentemente, se o indivíduo tiver (ou for identificado como tendo) uma alteração em uma série de reação que torna o inibidor de atividade de cinase ineficaz, a terapia com inibidor de cinase pode ser mantida. Sem desejar ficar preso à teoria, a atividade de inibidor de cinase (por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe) pode promover mudanças biológicas úteis nas células de câncer mesmo se o inibidor de cinase sozinho não for suficiente para dimunir a proliferação. Por exemplo, o inibidor de cinase pode ser suficiente para mobilizar as células de câncer fora dos linfonodos, tornando-o mais vulnerável à terapia com CAR.

[00567] Voltando agora para os indivíduos que respondem a um inibidor de cinase (por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe), vários regimes terapêuticos são agora descritos. Em algumas modalidades, quando um indivíduo é (ou é identificado como sendo) um responsivo completo ao inibidor de cinase, ao indivíduo não é administrada uma terapia com CAR durante o período de resposta completa. Em outras modalidades, quando um indivíduo é (ou é identificado como sendo) um responsivo completo ao inibidor de cinase, ao indivíduo é administrada uma terapia com CAR durante o período de resposta completa. Em uma modalidade, após a terapia com CAR, o indivíduo experimenta a resposta prolongada ou reincidência retardada (por exemplo, em comparação com o curso esperado de doença quando tratada sem terapia com CAR). Por exemplo, MCL tratada com monoterapia de ibrutinibe tem uma duração média de resposta de cerca de 17,5 meses.

[00568] Em algumas modalidades, quando um indivíduo é (ou é identificado como sendo) um responsivo parcial ao inibidor de cinase (por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe), ao indivíduo não é administrada uma terapia com CAR durante o período de resposta parcial. Em outras modalidades, quando um indivíduo é (ou é identificado como sendo) um responsivo parcial ao inibidor de cinase, ao indivíduo é administrada uma terapia com CAR durante o período de resposta parcial. Em uma modalidade, após a terapia com CAR, o indivíduo experimenta a resposta completa e/ou resposta prolongada ou reincidência retardada (por exemplo, em comparação com o curso esperado de doença quando tratada sem terapia com CAR).

[00569] Em algumas modalidades, quando um indivíduo tem (ou é identificado como tendo) doença estável após o começo de tratamento com o inibidor de cinase (por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe), ao indivíduo não é administrada uma terapia com CAR durante o período de doença estável. Em outras modalidades, quando um indivíduo tem (ou é identificado como tendo) doença estável após o começo de tratamento com o inibidor de cinase, ao indivíduo é administrada uma terapia com CAR durante o período de doença estável. Em uma modalidade, após a terapia com CAR, o indivíduo experimenta uma resposta parcial, uma resposta completa e/ou resposta prolongada ou reincidência retardada (por exemplo, em comparação com o curso esperado de doença quando tratado sem terapia com CAR).

[00570] Em algumas modalidades, quando um indivíduo tem (ou é identificado como tendo) doença progressiva após o começo de tratamento com o inibidor de cinase (por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe), ao indivíduo não é administrada uma terapia com CAR durante o período de doença progressiva. Em outras modalidades, quando um indivíduo tem (ou é identificado como tendo) doença progressiva após o começo de tratamento com o inibidor de cinase, ao indivíduo é administrada uma terapia com CAR durante o período de doença progressiva. Em uma modalidade, após a terapia com CAR, o indivíduo experimenta doença estável, uma resposta parcial, a resposta completa e/ou resposta prolongada ou reincidência retardada (por exemplo, em comparação com o curso esperado de doença quando tratada sem terapia com CAR).

[00571] Desse modo, uma ou mais etapas de avaliação de doença podem ser realizadas antes ou durante o tratamento, para determinar qual curso de tratamento é adequado para um determinado paciente. Por exemplo, a um indivíduo pode ser administrado um inibidor de cinase (por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe) como uma terapia de primeira linha. Em seguida, após um período de tempo (por exemplo, 1 ou 2 meses, porém também 2 semanas, 3 semanas, 1 mês, 1,5 meses, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 6 meses, 9 meses, 12 meses, 15 meses, ou 18 meses) a resposta do paciente pode ser avaliada. Se a avaliação mostrar que o indivíduo é um responsivo completo, em algumas modalidades, a terapia com CAR não será administrada, por exemplo, como descrito acima. Se a avaliação mostrar que o indivíduo é um responsivo parcial ou tem doença estável, em algumas modalidades, a terapia com CAR será administrada em combinação com o inibidor de cinase, por exemplo, como descrito acima. Se a avaliação mostrar que o indivíduo é um não responsivo ou reincidente, em algumas modalidades, a terapia com CAR será administrada em combinação com o inibidor de cinase ou um segundo inibidor de cinase, por exemplo, como descrito acima. Em algumas modalidades, os controles de inibidor de cinase a doença ao mesmo tempo em que uma célula expressando CAR está sendo fabricada, por exemplo, ao mesmo tempo em que as células T do próprio paciente estão sendo criadas para expressar um CAR e/ou outros fatores.

[00572] Padrões clínicos para classificação de um estado de responsivo ou estado reincidente do paciente são conhecidos na técnica. Como um exemplo, quanto ao linfoma maligno, critérios de resposta padronizados são descritos em Cheson et al, J Clin Oncol 17:1244 (1999) e Cheson et al., "Revised Response Criteria for Malignant Limphoma", J Clin Oncol 25:579-586 (2007) (ambos os quais são incorporados por referência aqui em sua totlidade). Consequentemente, em algumas modalidades, um indivíduo é considerado um responsivo completo, responsivo parcial, tendo doença estável, um não responsivo, ou um reincidente de acordo com critérios Cheson ou critérios Cheson modificados. Critérios para classificar outras malignidades hematológicas são conhecidos na técnica.

[00573] De acordo com os critérios na tabela 2 de Cheson 2007, um responsivo completo tem desaparecimento de toda evidência de doença; um responsivo parcial tem regressão de doença mensurável e nenhum novo sítio; um paciente com doença estável tem uma dificuldade de atingir CR/PR ou PD; e um paciente com doença reincidente ou doença progressiva tem qualquer nova lesão ou aumento em mais do que ou igual a 50% de sítios anteriormente envolvidos de nadir. A avaliação pode envolver uma determinação de se a doença é ávida de FDG, PET positivo ou negativo, se nódulos estão presentes, por exemplo, palpáveis no fígado ou baço, se a medula óssea é depurada ou mostra envolvimento.

[00574] A terapia com CAR e o inibidor de cinase (por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe) podem ser administrados, por exemplo, simultaneamente ou sequencialmente. Em algumas modalidades, a terapia com CAR é iniciada substancialmente ao mesmo tempo quando a terapia com o inibidor de cinase inicia-se. Em algumas modalidades, a terapia com CAR é iniciada antes da terapia com inibidor de cinase iniciar. Em algumas modalidades, a terapia com CAR é iniciada após a terapia de inibidor de cinase iniciar. Por exemplo, a terapia com CAR pode ser iniciada, por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, ou 4 semanas, ou 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12, 15, 18, ou 24 meses após da terapia de inibidor de cinase iniciar. Em algumas modalidades, a terapia com CAR é iniciada ao mesmo tempo em que um paciente tem níveis fisiologicamente relevantes do inibidor de cinase em seu corpo.

[00575] Quando administrados em combinação, a terapia com CAR e o inibidor de cinase (por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe), ou ambos, podem ser administrados em uma quantidade ou dose que é igual, menor o maior do que a quantidade ou dosagem de cada agente usado individualmente, por exemplo, como uma monoterapia. Em certas modalidades, a quantidade ou dosagem administrada da terapia com CAR, o inibidor de cinase, ou ambos, é menor (por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, ou pelo menos 50%) do que a quantidade ou dosagem de cada agente usado individualmente, por exemplo, como uma monoterapia. Em outras modalidades, a quantidade ou dosagem da terapia com CAR, o inibidor de cinase, ou ambos, que resulta em um efeito desejado (por exemplo, tratamento de câncer) é menor (por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, ou pelo menos 50% menor) do que a quantidade ou dosagem de cada agente usado individualmente, por exemplo, como uma monoterapia, requerida para obter o mesmo efeito terapêutico.

[00576] Quando administrados em combinação, a terapia com CAR e o inibidor de cinase (por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe), ou ambos, podem ser administrados com uma duração que é igual, menor ou maior do que a duração de cada agente usado individualmente, por exemplo, como uma monoterapia. Em certas modalidades, a duração de administração da terapia com CAR, o inibidor de cinase, ou ambos, é mais curta (por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, ou pelo menos 50%) do que a duração de cada agente usado individualmente, por exemplo, como uma monoterapia. Em outras modalidades, a duração de administração da terapia com CAR, o inibidor de cinase, ou ambos, que resulta em um efeito desejado (por exemplo, tratamento de câncer) é mais curta (por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, ou pelo menos 50% mais curta) do que a duração de cada agente usado individualmente, por exemplo, como uma monoterapia, requerida para obter o mesmo efeito terapêutico. Em alguma modalidade, ao paciente é administrado um curso abreviado do inibidor de cinase (por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe). Por exemplo, o curso abreviado do inibidor de cinase pode durar cerca de 0-2, 2-4, 4-6, 6-8, 8-10, 10-12, 12-15, 15-18, 18-21, ou 21-24 meses no total ou pode durar cerca de 02, 2-4, 4-6, 6-8, 8-10, 10-12, 12-15, 15-18, 18-21, ou 21-24 meses após administração da terapia com CAR. Em modalidades, o curso abreviado do inibidor de cinase termina antes da reincidência. Em modalidades, o inibidor de cinase é administrado em níveis normais (por exemplo, monoterapia) durante o curso abreviado.

[00577] Em modalidades, uma dose simples de células expressando CAR compreende cerca de 5 x 108células CART de CD19. Uma dose de células expressando CAR pode também compreender cerca de 5 x 106, 1 x 107, 2 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 2 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 2 x 109, ou 5 x 109células, por exemplo, células CAR de CD19, por exemplo, células CART de CD19.

[00578] Em um aspecto, a invenção pertence a um vetor compreendendo CAR de CD19 aperavelmente ligado ao promotor para expressão em células mamíferas, por exemplo, células T. Em um aspecto, a invenção fornece uma célula recombinante, por exemplo, uma célula T, expressando o CAR de CD19 para uso no tratamento de tumores expressando CD19, em que a célula T recombinante expressando o CAR de CD19 é denominada um CAR de CD19T. Em um aspecto, o CART de CD19 descrito aqui, é capaz de contatar uma célula de tumor com pelo menos um CART de CD19 expresso em sua superfície de modo que o CART alveje a célula de tumor e o crescimento de tumor é inibido.

[00579] Em um aspecto, a invenção pertence a um método de inibição de crescimento de uma célula de tumor expressando CD19, compreendendo contatar a célula de tumor com uma expressando CAR de CD19, por exemplo, uma célula T CAR de CD19, descrito aqui de modo que o CART seja ativado em resposta ao antígeno e alveje a célula de câncer, em que o crescimento do tumor é inibido. A célula expressando CAR de CD19, por exemplo, célula T, é administrada em combinação com um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de cinase descrito aqui.

[00580] Administrado "em combinação", como usado aqui, significa que dois (ou mais) diferentes tratamentos são liberados ao indivíduo durante o curso da aflição do indivíduo com o distúrbio, por exemplo, os dois ou mais tratamentos são liberados após o indivíduo ter sido diagnosticado com o distúrbio e antes do distúrbio ter sido curado ou eliminado ou tratamento ter cessado por outras razões. Em algumas modalidades, a liberação de um tratamento ainda está ocorrendo quando a liberação do segundo iniciar, de modo que exista sobreposição em termos de administração. Isto é algumas vezes referida aqui como liberação "simultânea"ou "concorrente". Em outras modalidades, a liberação de um tratamento termina antes da liberação do outro tratamento iniciar. Em algumas modalidades de qualquer caso, o tratamento é mais eficaz por causa da administração combinada. Por exemplo, o segundo tratamento é mais eficaz, por exemplo, um efeito equivalente é observado com menos do segundo tratamento, ou o segundo tratamento reduz sintoma em uma maior extensão, do que seria observada se o segundo tratamento fosse administrado na ausência do primeiro tratamento, ou a situação análoga é observada com o primeiro tratamento. Em algumas modalidades, a liberação é de modo que a redução em um sintoma, ou outro parâmetro relacionado ao distúrbio é maior do que a que seria observada com um tratamento liberado na ausência do outro. O efeito dos dois tratamentos pode ser parcialmente aditivo, totalmente aditivo, ou maior do que aditivo. A liberação pode ser de modo que um efeito do primeiro tratamento liberado seja ainda detectável quando o segundo é liberado. Em uma modalidade, a célula expressando CAR é administrada em uma dose e/ou planejamento de dosagem descrito aqui, e o inibidor de cinase ou agente que realça a atividade da célula expressando CAR é administrado em uma dose e/ou planejamento de dosagem descrito aqui.

[00581] A invenção inclui um tipo de terapia celular onde as células T são geneticamente modificadas para expressar um receptor de antígeno quimérico (CAR) e a célula T de CAR é infundida a um receptor em necessidade da mesma. A célula infudida é capaz de exterminar as células de tumor no receptor. Ao contrário das terapias de anticorpo, células T modificadas por CAR são capazes de replicar-se in vivo resultando em persistência a longo prazo que pode induzir ao controle de tumor prolongado. Em vários aspectos, as células T administradas ao paciente, ou seus descendentes, persistem no paciente durante pelo menos quatro meses, cinco meses, seis meses, sete meses, oito meses, nove meses, dez meses, onze meses, doze meses, treze meses, quatorze meses, quinze meses, dezesseis meses, dezessete meses, dezoito meses, dezenove meses, vinte meses, vinte e um meses, vinte e dois meses, vinte e três meses, dois anos, três anos, quatro anos, ou cinco anos após a administração da célula T ao paciente.

[00582] A invenção também inclui um tipo de terapia celular onde células T são modificadas, por exemplo, por RNA transcrito in vitro, para transitoriamente expressar um receptor de antígeno quimérico (CAR) e o célula T de CAR é infundida a um receptor em necessidade da mesma. A célula infundida é capaz de exterminar células de tumor no recipiente. Desse modo, em vários aspectos, as células T administradas ao paciente, estão presentes durante menos do que um mês, por exemplo, três semanas, duas semanas, uma semana, após a administração da célula T ao paciente.

[00583] Sem desejar estar ligado a qualquer teoria particular, a resposta de imunidade antitumor eliciada pelas células T modificadas por CAR pode ser uma resposta imune ativa ou passiva, ou alternativamente pode ser devido a uma resposta imune direta vs indireta. Em um aspecto, as células T transduzidas por CAR exibem secreção de citocina pró-inflamatória específica e atividade citolítica potente em resposta às células de câncer humanas expressando o CD19, resistem à inibição de CD19 solúvel, mediam a morte espectadora e mediam a regressão de um tumor humano estabelecido. Por exemplo, células de tumor sem antígeno dentro um campo heterogêneo de tumor expressando CD19 podem ser suscetíveis à destruição indireta por células T redirecionadas ao CD19 que foi anteriormente reagido contra células de câncer de antígeno positivo adjacentes.

[00584] Em um aspecto, as células T modificadas por CAR totalmente humanas da invenção podem ser um tipo de vacina para imunização ex vivo e/ou terapia in vivo em um mamífero. Em um aspecto, o mamífero é um humano.

[00585] Com respeito à imunização ex vivo, pelo menos um dos seguintes ocorrem in vitro antes da administração da célula em um mamífero: i) expansão das células, ii) introdução de um ácido nucleico codificando um CAR nas células ou iii) crioconservação das células.

[00586] Procedimentos ex vivosão bem conhecidos na técnica e são descritos mais totalmente abaixo. Resumidamente, células são isoladas de um mamífero (por exemplo, um humano) e geneticamente modificadas (isto é, transduzidas ou transfectadas in vitro) com um vetor expressando um CAR descrito aqui. A célula modificada por CAR pode ser administrda a um receptor para fornecer um benefício terapêutico. O receptor mamífero pode ser um humano e a célula modificada por CAR pode ser autóloga com respeito ao receptor. Alternativamente, as células podem ser alogênicas, singênicas ou xenogênicas com respeito ao receptor. Além de usar uma vacina com base em célula em termos de imunização ex vivo, também incluídos nos métodos descritos aqui estão as composições e métodos para imunização in vivo para eliciar uma resposta imune direcionada contra um antígeno em um paciente.

[00587] Geralmente, as células ativadas e expandidas, como descrito aqui, podem ser utilizadas no tratamento e prevenção de doenças que surgem em indivíduos que são imunocomprometidos. Em particular, as células expressando CAR descritas aqui são usadas no tratamento de doenças, distúrbios e condições associadas com expressão de CD19. Em certos aspectos, as células são usadas no tratamento de pacientes em risco de desenvolver doenças, distúrbios e condições associadas com expressão de CD19. Desse modo, a presente invenção fornece métodos para o tratamento ou prevenção de doenças, distúrbios e condições associadas com expressão de CD19 compreendendo administrar a um indivíduo em necesidade da mesma, uma quantidade terapeuticamente eficaz das células expressando CAR descritas aqui, em combinação com um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de cinase descrito aqui.

[00588] A presente invenção também fornece métodos para inibição da proliferação ou redução de uma população de célula expressando CD19, os métodos compreendendo contatar umas populações de célula compreendendo uma célula expressando CD19 com uma célula expressando CAR anti-CD19 descrita aqui que se liga à célula expressando CD19, e contatar as populações de célula expressando CD19 com um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de cinase descrito aqui. Em um aspecto específico, a presente invenção fornece métodos para inibição da proliferação ou redução das populações de célula de câncer expressando CD19, os métodos compreendendo contatar a população de célula de câncer expressando CD19 com uma célula expressando CAR anti-CD19 descrita aqui que se liga à célula expressando CD19, e contatar a célula expressando CD19 com um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de cinase descrito aqui. Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos para inibição da proliferação ou redução as populações de célula de câncer expressando CD19, os métodos compreendendo contatar a população de célula de câncer expressando CD19 com uma célula expressando CAR anti- CD19 descrita aqui que se liga à célula expressando CD19 e contatar a célula expressando CD19 com um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de cinase descrito aqui. Em certos aspectos, a combinação da célula expressando CAR anti-CD19 descrita aqui e do inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de cinase descrito aqui, reduz a quantidade, número, quantidade ou porcentagem de células e/ou células de câncer em pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 65%, pelo menos 75%, pelo menos 85%, pelo menos 95%, ou pelo menos 99% em um indivíduo com ou modelo de animal quanto a um câncer hematológico ou outro câncer associado com células expressando CD19 com relação a um controle negativo. Em um aspecto, o indivíduo é um humano.

[00589] A presente invenção também fornece métodos para prevenção, tratamento e/ou controle de uma doença associada com células expressando CD19 (por exemplo, um câncer hematológico ou câncer atípico expressando CD19), os métodos compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade dos mesmos uma célula expressando CAR anti-CD19 que se liga à célula expressando CD19 e administrar um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de cinase descrito aqui. Em um aspecto, o indivíduo é um humano. Exemplos não limitantes de distúrbios associados com células expressando CD19 incluem distúrbios autoimunes (tal como lúpus), distúrbios inflamatórios (tal como alergias e asma) e cânceres (tais como cânceres hematológicos ou cânceres atípicos expressando CD19).

[00590] A presente invenção também fornece métodos para prevenção, tratamento e/ou controle de uma doença associada com células expressando CD19, os métodos compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade dos mesmos uma célula CART anti-CD19 da invenção que se liga à célula expressando CD19. Em um aspecto, o indivíduo é um humano.

[00591] A presente invenção fornece métodos para prevenção de reincidência de câncer associado com células expressando CD19, os métodos compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade dos mesmos uma célula expressando anti-CD19 (tal como uma célula CART anti-CD19) da invenção que se liga à célula expressando CD19. Em um aspecto, os métodos compreendem administrar ao indivíduo em necessidade dos mesmos uma quantidade eficaz de uma célula expressando anti-CD19 (tal como uma célula CART anti-CD19) descrito aqui que se liga à célula expressando CD19 em combinação com uma quantidade eficaz de outra terapia.

[00592] Em um aspecto, a invenção pertence a um método de tratamento de câncer em um indivíduo. O método compreende administrar ao indivíduo uma célula (por exemplo, uma célula efetora imune) expressando um CAR alvejando célula B, por exemplo, uma célula T ou célula NK, descrito aqui, em combinação com um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de cinase descrito aqui, de modo que o câncer seja tratado no indivíduo. Um exemplo de um câncer que é tratável pelos métodos descritos aqui é um câncer associado com expressão do antígeno de célula B, por exemplo, CD19. Em uma modalidade, a doença é um tumor sólido ou líquido. Em uma modalidade, a doença é um câncer hematológico. Em uma modalidade, o câncer hematológico é leucemia. Em uma modalidade, o câncer hematológico é um neoplasma de célula B maduro, por exemplo, de acordo com classificação WHO. Em uma modalidade, o câncer hematológico é uma malignidade derivada de linfócito B de CD19+. Em uma modalidade, o câncer é selecionado do grupo que consiste em uma ou mais leucemias agudas incluindo, porém não limitadas à leucemia linfoide aguda de célula B (BALL), leucemia linfoide aguda de célula T (TALL), linfoma linfocítico pequeno (SLL), leucemia linfoide aguda (ALL); uma ou mais leucemias crônicas incluindo, porém não limitadas à leucemia mielogenosa crônica (CML), leucemia linfocítica crônica (CLL); cânceres hematológicos adicionados ou condições hematológicas incluindo, porém não limitados a linfoma de célula de revestimento (MCL), leucemia pró-linfocítica de célula B, neoplasma de célula dendrítica plasmacitoide blástica, linfoma de Burkitt, linfoma de célula B grande difuso (DLBCL) (por exemplo, linfoma de célula B grande rico em histiócito/célula T, DLCBL primário do CNS, DLBCL cutâneo primário tipo "perna", ou EBV+ DLBCL do idoso), DLBCL associada com inflamação crônica, linfoma folicular, linfoma folicular pediátrico, leucemia de célula capilar, linfoma folicular de célula grande ou célula pequena, condições linfoproliferativas malignas, linfoma de MALT (linfoma extranodal de zona marginal de tecido linfoide associado à mucosa), linfoma de zona marginal, mieloma múltiplo, mielodisplasia e síndrome mielodisplásica, linfoma não Hodgkin, linfoma de Hodgkin, linfoma plasmablástico, neoplasma de célula dendrítica plasmacitoide, Waldenstrom macroglobulinemia, linfoma esplênica de zona marginal, linfoma esplênico/leucemia (por exemplo, não classificável), linfoma de célula B pequena de polpa pequena difusa esplênica, leucemia de célula capilar-variante, linfoma linfoplasmacítico, uma doença de cadeia pesada (por exemplo, doença de cadeia pesada alfa, doença de cadeia pesada gama, ou doença de cadeia pesada mu), mieloma de célula plasmática, plasmocitoma solitário ósseo, plasmocitoma extraósseo, linfoma nodal de zona marginal, linfoma nodal pediátrico de zona marginal, linfoma de centro folicular cutâneo primário, granulomatose linfomatoide, linfoma de célula B grande mediastinal (timo) primário, linfoma de célula B grande intravascular l, linfoma de célula B grande de ALK+, linfoma de célula B grande surgindo em doença de Castleman associada com HHV8, linfoma de efusão primário, linfoma de célula B não classificável (por exemplo, com características intermediárias entre DLBCL e linfoma de Burkitt ou intermediárias entre DLBCL e linfoma de Hodgkin clássico), e "pré-leucemia"que são uma coleção diversa de condições hematológicas unidas por produção ineficaz (ou displasia) de células sanguíneas mieloides, e à doença associada à expressão de antígeno de célula B (por exemplo, CD19-) incluem, porém não estão limitados a cânceres atípicos e/ou não clássicos, malignidades, condições pré-cancerosas ou doenças proliferativas expressando antígeno de célula B (por exemplo, CD19); e qualquer combinaçãos das mesmas.

[00593] Em algumas modalidades, o câncer é linfoma de Hodgkin, e o paciente é tratado com células expressando CAR, por exemplo, como uma monoterapia, ou em combinação com um ou mais produtos terapêuticos adicionais. Em modalidades, o linfoma de Hodgkin é de estágio I, II, III, ou IV. O produto terapêutico adicional pode compreender, por exemplo, um inibidor de cinase tal como um inibidor de BTK como ibrutinibe. O produto terapêutico adicional pode compreender um tratamento para o linfoma de Hodgkin. O produto terapêutico adicional pode compreender, por exemplo, terapia por radiação, MOPP (Mustargen, Oncovina, Prednisona, e Procarbazine), ABVD (Adriamicina, bleomicina, vinblastina, e dacarbazina), Stanford V (um regime com quimioterapia e tratamento com radiação), ou BEACOPP (Bleomicina, Etoposídeo, Adriamicina, Ciclofosfamida, Oncovina, Procarbazina, Prednisona). Em algumas modalidades, o indivíduo foi anteriormente tratado com, ou está resistente a, ou é refratário a, um ou mais de terapia por radiação, MOPP, Stanford V, ou BEACOPP.

[00594] Indicações relacionadas a não câncer associadas com expressão de antígeno de célula B, por exemplo, um ou mais de CD19, CD20, CD22 ou ROR1, incluem, porém não estão limitados a, por exemplo, doença autoimune, (por exemplo, lúpus), distúrbios inflamatórios (alergia e asma) e transplante.

[00595] Em algumas modalidades, um câncer que pode ser tratado com a combinação descrita aqui é mieloma múltiplo. Mieloma múltiplo é um câncer do sangue, caracterizado por acúmulo de um clone de célula plasmática na medula óssea. Terapias atuais para mieloma múltiplo incluem, porém não estão limitadas ao tratamento com lenalidomida, que é um análogo de talidomide. Lenalidomida tem atividades que incluem atividade antitumor, inibição de angiogênese, e imunomodulação. Em algumas modalidades, um CAR de CD19, por exemplo, como descrito aqui, pode ser usado para alvejar células de mieloma. Em algumas modalidades, a combinação descrita aqui pode ser usada com uma ou mais terapias adicionais, por exemplo, tratamento com lenalidomida.

[00596] As células expressando CAR, descritas aqui, podem ser administradas sozinhas, ou como uma composição farmacêutica em combinação com diluentes e/ou com outros componentes tais como IL- 2 ou outras citocinas ou populações de célula.

[00597] Em modalidades, uma quimioterapia por linfodepleção é administrada ao indivíduo antes de, concorrentemente com, ou após a administração (por exemplo, infusão) de células CAR, por exemplo, células expressando CAR descritas aqui. Em um exemplo, a quimioterapia por linfodepleção é administrada ao indivíduo antes da administração de células CAR. Por exemplo, a quimioterapia por linfodepleção termina 1 a 4 dias (por exemplo, 1, 2, 3, ou 4 dias) antes da infusão de célula CAR. Em modalidades, múltiplas doses de células CAR são administradas, por exemplo, como descrito aqui. Por exemplo, uma única dose compreende cerca de 5 x 108células CAR. Em modalidades, uma quimioterapia por linfodepleção é administrada ao indivíduo antes de, concorrentemente com, ou após a administração (por exemplo, infusão) de uma célula expressando CAR descrita aqui. Câncer Hematológico

[00598] Condições de câncer hematológico são os tipos de câncer tais como leucemia, linfoma e condições linfoproliferativas malignas que afetam o sangue, medula óssea e o sistema linfático.

[00599] A leucemia pode ser classificada como leucemia aguda e leucemia crônica. Leucemia aguda pode ser também classificada como leucemia mielogenosa aguda (AML) e leucemia linfoide aguda (ALL). Leucemia crônica inclui leucemia mielogenosa crônica (CML) leucemia linfoide crônica (CLL). Outras condições relacionadas incluem síndromes mielodisplásicas (MDS, anteriormente conhecida como "pré- leucemia") que são uma coleção diversa de condições hematológicas unidas por produção ineficaz (ou displasia) de células sanguíneas mieloides e risco de transformação em AML.

[00600] Linfoma é um grupo de tumores de célula sanguínea que se desenvolve de linfócitos. Linfomas exemplares incluem linfoma não Hodgkin e linfoma de Hodgkin.

Terapias de combinação

[00601] A combinação de uma célula expressando CAR descrita aqui (por exemplo, e um inibidor de cinase descrito aqui) pode ser usada em combinação com outros agentes e terapias conhecidos.

[00602] Uma célula expressando CAR descrita aqui, o inibidor de cinase e/ou pelo menos um agente terapêutico adicional pode ser administrado simultaneamente, na mesma ou em composições separadas, ou sequencialmente. Para administração sequencial, a célula expressando CAR descrita aqui pode ser administrada primeiro, e o agente adicional pode ser administrado em segundo, ou a ordem de administração pode ser invertida.

[00603] A terapia com CAR e/ou outros agentes terapêuticos, procedimentos ou modalidades pode ser administrada durante períodos de distúrbio ativo, ou durante um período de remissão ou doença menos ativa. A terapia com CAR pode ser administrada antes de outro tratamento, concorrentemente com o tratamento, após tratamento, ou durante remissão do distúrbio.

[00604] Quando administrada em combinação, a terapia com CAR e um ou mais agentes adicionais (por exemplo, inibidor de cinase e/ou um terceiro agente), ou todos, pode ser administrada em uma quantidade ou dose que é igual, menor ou maior do que a quantidade ou dosagem de cada agente usado individualmente, por exemplo, como uma monoterapia. Em certas modalidades, a quantidade administrada ou dosagem da terapia com CAR, o agente adicional (por exemplo, inibidor de cinase e/ou terceiro agente), ou todos, é menor (por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, ou pelo menos 50%) do que a quantidade ou dosagem de cada agente usado individualmente, por exemplo, como uma monoterapia. Em outras modalidades, a quantidade ou dosagem da terapia com CAR, do agente adicional (por exemplo, inibidor de cinase e/ou terceiro agente), ou todos, que resulta em um efeito desejado (por exemplo, tratamento de câncer) é menor (por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, ou pelo menos 50% menor) do que a quantidade ou dosagem de cada agente usado individualmente, por exemplo, como uma monoterapia, requerida para obter o mesmo efeito terapêutico.

[00605] Em outros aspectos, a combinação da célula expressando CAR descrita aqui (por exemplo, e o inibidor de cinase) pode ser usada em um regime de tratamento em combinação com cirurgia, quimioterapia, radiação, agentes imunossupressores, tais como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato, e FK506, anticorpos, ou outros agentes imunoablativos tais como CAMPATH, anticorpos anti-CD3 ou outras terapias com anticorpo, citoxina, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, citocinas, e irradiação, vacina de peptídeo, tal como aquela descrita no Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971.

[00606] Em uma modalidade, a combinação de uma célula expressando CAR descrita aqui (por exemplo, e um inibidor de cinase descrito aqui) pode ser usada em combinação com outro agente quimioterapêutico. Agentes quimioterapêuticos exemplares incluem uma antraciclina (por exemplo, doxorubicina (por exemplo, doxorubicina lipossômica)); uma alcaloide de vinca (por exemplo, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina); um agente de alquilação (por exemplo, ciclofosfamida, decarbazina, melfalano, ifosfamida, temozolomida); um anticorpo de célula imune (por exemplo, alentuzamabe, gentuzumabe, rituximabe, ofatumumabe, tositumomabe, brentuximabe); um antimetabólito (incluindo, por exemplo, antagonistas de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inibidores de adenosina deaminase (por exemplo, fludarabina)); um agonista de proteína relacionada a TNFR (GITR) induzido por glicocorticoide; um inibidor de proteassoma (por exemplo, aclacinomicina A, gliotoxina ou bortezomibe); um imunomodulador tal como talidomida ou um derivado de talidomida (por exemplo, lenalidomida).

[00607] Agentes quimioterapêuticos gerais considerados para uso em combinação com terapias incluem anastrozol (Arimidex®), bicalutamida (Casodex®), sulfato de bleomicina (Blenoxane®), busulfan (Myleran®), injeção de busulfano (Busulfex®), capecitabina (Xeloda®), N4-pentoxicarbonil-5-deóxi-5-fluorocitidina, carboplatina (Paraplatin®), carmustina (BiCNU®), clorambucil (Leukeran®), cisplatina (Platinol®), cladribina (Leustatin®), ciclofosfamida (Cytoxan® ou Neosar®), citarabina, citosina arabinosídeo (Cytosar-U®), injeção de citarabina lipossômica (DepoCyt®), dacarbazina (DTIC-Dome®), dactinomicina (Actinomicina D, Cosmegan), cloridrato de daunorubicina (Cerubidine®), injeção de citrato de daunorubicina lipossômica (DaunoXome®), dexametasona, docetaxel (Taxotere®), cloridrato de doxorubicina (Adriamycin®, Rubex®), etoposídeo (Vepesid®), fosfato de fludarabina (Fludara®), 5-fluorouracil (Adrucil®, Efudex®), flutamida (Eulexin®), tezacitibina, gencitabina (difluorodeoxicitidina), hidroxiureia (Hydrea®), Idarubicina (Idamycin®), ifosfamida (IFEX®), irinotecano (Camptosar®), L-asparaginase (ELSPAR®), leucovorina cálcica, melfalano (Alkeran®), 6-mercaptopurina (Purinetol®), metotrexato (Folex®), mitoxantrona (Novantrone®), milotarg, paclitaxel (Taxol®), phoenix(Ítrio90/MX-DTPA), pentostatina, polifeprosano 20 com implante de carmustina (Gliadel®), citrato de tamoxifeno (Nolvadex®), teniposídeo (Vumon®), 6-tioguanina, tiotepa, tirapazamina (Tirazone®), cloridrato de topotecano para injeção (Hycamptin®), vinblastina (Velban®), vincristina (Oncovin®), e vinorelbina (Navelbine®).

[00608] Agentes de alquilação exemplares incluem, sem lsimulação, mostardas de nitrogênio, derivados de etilenimina, alquil sulfonatos, nitrossoureias e triazenos: mostarda de uracila (Aminouracil Mustard®, Chloretaminacil®, Demetildopan®, Desmetildopan®, Haemanthamina®, Nordopan®, Uracil nitrogen mustard®, Uracillost®, Uracilmostaza®, Uramustin®, Uramustine®), clormetina (Mustargen®), ciclofosfamida (Cytoxan®, Neosar®, Clafen®, Endoxan®, Procytox®, RevimmuneTM), ifosfamida (Mitoxana®), melfalano (Alkeran®), Clorambucil (Leukeran®), pipobroman (Amedel®, Vercyte®), trietilenomelamina (Hemel®, Hexalen®, Hexastat®), trietilenetiofosforamina, Temozolomida (Temodar®), tiotepa (Tioplex®), busulfano (Busilvex®, Myleran®), carmustina (BiCNU®), lomustina (CeeNU®), estreptozocina (Zanosar®), e Dacarbazina (DTIC-Dome®). Agentes de alquilação exemplares adicionais incluem, sem lsimulação, Oxaliplatina (Eloxatin®); Temozolomida (Temodar® e Temodal®); Dactinomicina (também conhecida como actinomicin-D, Cosmegen®); Melfalano (também conhecido como L-PAM, L-sarcolisina, e mostarda de fenilalanina, Alkeran®); Altretamina (também conhecida como hexametilmelamina (HMM), Hexalen®); Carmustina (BiCNU®); Bendamustina (Treanda®); Busulfano (Busulfex® e Myleran®); Carboplatina (Paraplatin®); Lomustina (também conhecida como CCNU, CeeNU®); Cisplatina (também conhecida como CDDP, Platinol® e Platinol®-AQ); Clorambucil (Leukeran®); Ciclofosfamida (Cytoxan® e Neosar®); Dacarbazina (também conhecida como DTIC, DIC e imidazol carboxamida, DTIC-Dome®); Altretamina (também conhecida como hexametilmelamina (HMM), Hexalen®); Ifosfamida (Ifex®); Prednumustine; Procarbazina (Matulane®); Mecloretamina (também conhecida como mostarada de nitrogênio, mustina e cloridrato de mecloroetamina, Mustargen®); Estreptozocina (Zanosar®); Tiotepa (também conhecido como tiofosfoamida, TESPA e TSPA, Tioplex®); Ciclofosfamida (Endoxan®, Cytoxan®, Neosar®, Procytox®, Revimmune®); e HCI de Bendamustina HCl (Treanda®).

[00609] Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui, opcionalmente em combinação com um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe, é administrada a um indivíduo em combinação com fludarabina, ciclofosfamida, e/ou rituximabe. Em modalidades, uma célula expressando CAR, descrita aqui, é administrada a um indivíduo em combinação com fludarabina, ciclofosfamida, e rituximabe (FCR). Em modalidades, o indivíduo tem CLL. Por exemplo, o indivíduo tem uma deleção na ramificação curta de cromossoma 17 (del(17p), por exemplo, em uma célula leucêmica). Em outros exemplos, o indivíduo não tem um del(17p). Em modalidades, o indivíduo compreende uma célula leucêmica compreendendo uma mutação no gene de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (IgVH). Em outras modalidades, o indivíduo não compreende uma célula leucêmica compreendendo uma mutação no gene de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (IgVH). Em modalidades, a fludarabina é administrada em uma dosagem de cerca de 10 a 50 mg/m2 (por exemplo, cerca de 10 a 15, 15 a 20, 20 a 25, 25 a 30, 30 a 35, 35 a 40, 40 a 45, ou 45 a 50 mg/m2), por exemplo, intravenosamente. Em modalidades, a ciclofosfamida é administrada em uma dosagem de cerca de 200-300 mg/m2 (por exemplo, cerca de 200-225, 225-250, 250-275, ou 275-300 mg/m2), por exemplo, intravenosamente. Em modalidades, o rituximabe é administrado em uma dosagem de cerca de 400-600 mg/m2 (por exemplo, 400-450, 450500, 500-550, ou 550-600 mg/m2), por exemplo, intravenosamente.

[00610] Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui, opcionalmente em combinação com um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe, é administrada a um indivíduo em combinação com bendamustina e rituximabe. Em modalidades, o indivíduo tem CLL. Por exemplo, o indivíduo tem uma deleção na ramificação curta de cromossoma 17 (del(17p), por exemplo, em uma célula leucêmica). Em outros exemplos, o indivíduo não tem um del(17p). Em modalidades, o indivíduo compreende uma célula leucêmica compreendendo uma mutação no gene de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (IgVH). Em outras modalidades, o indivíduo não compreende uma célula leucêmica compreendendo uma mutação no gene de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (IgVH). Em modalidades, a bendamustina é administrada em uma dosagem de cerca de 70-110 mg/m2 (por exemplo, 70-80, 80-90, 90-100, ou 100-110 mg/m2), por exemplo, intravenosamente. Em modalidades, o rituximabe é administrada em uma dosagem de cerca de 400-600 mg/m2 (por exemplo, 400-450, 450500, 500-550, ou 550-600 mg/m2), por exemplo, intravenosamente.

[00611] Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui, opcionalmente em combinação com um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe, é administrada a um indivíduo em combinação com rituximabe, ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, e/ou um corticosteroide (por exemplo, prednisona). Em modalidades, uma célula expressando CAR, descrita aqui, é administrada a um indivíduo em combinação com rituximabe, ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, e prednisona (R-CHOP). Em modalidades, o indivíduo tem linfoma de célula B grande difuso (DLBCL). Em modalidades, o indivíduo DLBCL de estágio limitado não volumoso (por exemplo, compreende um tumor tendo um tamanho/diâmetro menor do que 7 cm). Em modalidades, o indivíduo é tratad com radiação em combinação com o R-CHOP. Por exemplo, ao indivíduo é administrado R-CHOP (por exemplo, 1 a 6 ciclos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 ciclos de R-CHOP), seguido por radiação. Em alguns casos, ao indivíduo é administrado R-CHOP (por exemplo, 1 a 6 ciclos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 ciclos de R-CHOP) seguido por radiação.

[00612] Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui, opcionalmente em combinação com um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe, é administrada a um indivíduo em combinação com etoposídeo, prednisona, vincristina, ciclofosfamida, doxorubicina, e/ou rituximabe. Em modalidades, uma célula expressando CAR, descrita aqui, é administrada a um indivíduo em combinação com etoposídeo, prednisona, vincristina, ciclofosfamida, doxorubicina, e rituximabe (EPOCH-R). Em modalidades, uma célula expressando CAR, descrita aqui, é administrada a um indivíduo em combinação com EPOCH-R ajustado à dose (DA-EPOCH-R). Em modalidades, o indivíduo tem linfoma de célula B, por exemplo, um linfoma de célula B agressiva rearranjado por Myc.

[00613] Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui, opcionalmente em combinação com um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe, é administrada a um indivíduo em combinação com rituximabe e/ou lenalidomida. Lenalidomida ((RS)-3-(4-Amino-1-oxo 1,3-di-hidro-2H-isoindol- 2- il)piperidina-2,6-diona) é um imunomodulador. Em modalidades, uma célula expressando CAR, descrita aqui, é administrada a um indivíduo em combinação com rituximabe e lenalidomida. Em modalidades, o indivíduo tem linfoma folicular (FL) ou linfoma de célula de revestimento (MCL). Em modalidades, o indivíduo tem FL e não foi anteriormente tratado com uma terapia de câncer. Em modalidades, lenalidomida é administrada em uma dosagem de cerca de 10 a 20 mg (por exemplo, 10 a 15 ou 15 a 20 mg), por exemplo, diariamente. Em modalidades, rituximabe é administrado em uma dosagem de cerca de 350 a 550 mg/m2 (por exemplo, 350 a 375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475, ou 475-500 mg/m2), por exemplo, intravenosamente.

[00614] Imunomoduladores exemplares incluem, por exemplo, afutuzumabe (disponível de Roche®); pegfilgrastim (Neulasta®); lenalidomida (CC-5013, Revlimid®); talidomida (Thalomid®), pomelidomida, actimide (CC4047); e IRX-2 (mistura de citocinas humanas incluindo interleucina 1, interleucina 2, e interferon Y, CAS 951209-71-5, disponível de IRX Therapeutics).

[00615] Antraciclinas exemplares incluem, por exemplo, doxorubicina (Adriamycin® e Rubex®); bleomicina (lenoxane®); daunorubicina (cloridrato de dauorubicina, daunomicin, e cloridrato de rubidomicina, Cerubidine®); daunorubicina lipossômica (citrato de daunorubicina lipossômica, DaunoXome®); mitoxantroae (DHAD, Novantrone®); epirubicina (Ellence™); idarubicina (Idamycin®, Idamycin PFS®); mitomicina C (Mutamycin®); geldanamicina; herbimicina; ravidomicina; e desacetilravidomicina.

[00616] Alcaloides de vinca exemplares incluem, por exemplo, tartarato de vinorelbina (Navelbine®), Vincristina (Oncovin®), e Vindesina (Eldisine®)); vinblastina (também conhecida como sulfato de vinblastina, vincaleucoblastina e VLB, Alkaban-AQ® e Velban®); e vinorelbina (Navelbine®).

[00617] Inibidores de proteossoma exemplares incluem bortezomibe (Velcade®); carfilzomibe (PX-171-007, (S)-4-Metil-N-((S)-1-(((S)-4- metil-1-((R)-2-metiloxiran-2-il)-1-oxopentan-2-il)amino)-1-oxo-3- fenilpropan-2-il)-2-((S)-2-(2-morfolinoacetamido)-4-fenilbutanamido)- pentanamida); marizomib (NPI-0052); citrato de ixazomibe (MLN-9708); delanzomibe (CEP-18770); e O-Metil-N- [(2-metil-5-tiazolil)carbonil]-L- seril-O-metil-N- [(1S)-2- [(2R)-2-metil-2-oxiranil]-2-oxo-1-(fenilmetil)etil]- L-serinamida (ONX-0912).

[00618] Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui, opcionalmente em combinação com um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe, é administrada a um indivíduo em combinação com brentuximabe. Brentuximabe é um conjugado de anticorpo-fármaco de anticorpo anti-CD30 e monometil auristatina E. Em modalidades, o indivíduo tem linfoma de Hodgkin (HL), por exemplo, HL reincidente ou refratário. Em modalidades, o indivíduo compreende CD30+ HL. Em modalidades, o indivíduo foi submetido a um transplante de célula-tronco autotóloga (ASCT). Em modalidades, o indivíduo não foi submetido a um ASCT. Em modalidades, brentuximabe é administrado em uma dosagem de cerca de 1-3 mg/kg (por exemplo, cerca de 1-1.5, 1.5-2, 2-2.5, ou 2.5-3 mg/kg), por exemplo, intravenosamente, por exemplo, a cada 3 semanas.

[00619] Em modalidades, uma célula expressando CAR descrita aqui, opcionalmente em combinação com um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe, é administrado a um indivíduo em combinação com brentuximabe e dacarbazina ou em combinação com brentuximabe e bendamustina. Dacarbazina é um agente de alquilação com um nome químico de 5-(3,3-Dimetil-1- triazenil)imidazole-4-carboxamida. Bendamustina é um agente de alquilação com um nome químico de ácido 4- [5- [Bis(2-cloroetil)amino]- 1-metilbenzimidazol-2-il]butanóico. Em modalidades, o indivíduo tem linfoma de Hodgkin (HL). Em modalidades, o indivíduo não foi anteriormente tratado com uma terapia de câncer. Em modalidades, o indivíduo é pelo menos 60 anos de idade, por exemplo, 60, 65, 70, 75, 80, 85, ou mais velho. Em modalidades, dacarbazina é administrada em uma dosagem de cerca de 300-450 mg/m2 (por exemplo, cerca de 300325, 325-350, 350-375, 375-400, 400-425, ou 425-450 mg/m2), por exemplo, intravenosamente. Em modalidades, bendamustina é administrada em uma dosagem de cerca de 75-125 mg/m2 (por exemplo, 75-100 ou 100-125 mg/m2, por exemplo, cerca de 90 mg/m2), por exemplo, intravenosamente. Em modalidades, brentuximabe é administrado em uma dosagem de cerca de 1-3 mg/kg (por exemplo, cerca de 1-1,5, 1.5-2, 2-2,5, ou 2,5-3 mg/kg), por exemplo, intravenosamente, por exemplo, a cada 3 semanas.

[00620] Em algumas modalidades, uma célula expressando CAR, descrita aqui, é administrada a um indivíduo em combinação com um inibidor de CD20, por exemplo, um anticorpo anti-CD20 (por exemplo, um anticorpo anti-CD20 mono- ou biespecífico) ou um fragmento do mesmo. Anticorpos anti-CD20 incluem, porém não estão limitados a rituximabe, ofatumumabe, ocrelizumabe, veltuzumabe, obinutuzumabe, TRU-015 (Trubion Pharmaceuticals), ocaratuzumabe, e Pro131921 (Genentech). Veja, por exemplo, Lim et al. Haematologica. 95.1(2010):135-43.

[00621] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD20 compreende rituximabe. Rituximabe é um anticorpo monoclonal humano/de camundongo quimérico IgG1 kappa que se liga ao CD20 e causa citólise de uma célula expressando CD20, por exemplo, como descrito no www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl. pdf. Em modalidades, uma célula expressando CAR, descrita aqui, é administrada a um indivíduo em combinação com rituximabe. Em modalidades, o indivíduo tem CLL ou SLL.

[00622] Em algumas modalidades, rituximabe é administrado intravenosamente, por exemplo, como uma infusão intravenosa. Por exemplo, cada infusão fornece cerca de 500 a 2000 mg (por exemplo, cerca de 500 a 550, 550 a 600, 600 a 650, 650 a 700, 700 a 750, 750 a 800, 800 a 850, 850 a 900, 900 a 950, 950 a 1000, 1000 a 1100, 1100 a 1200, 1200 a 1300, 1300 a 1400, 1400 a 1500, 1500 a 1600, 1600 a 1700, 1700 a 1800, 1800 a 1900, ou 1900 a 2000 mg) de rituximabe. Em algumas modalidades, rituximabe é administrado em uma dose de 150 mg/m2 a 750 mg/m2, por exemplo, cerca de 150 a 175 mg/m2, 175 a 200 mg/m2, 200 a 225 mg/m2, 225 a 250 mg/m2, 250 a 300 mg/m2, 300 a 325 mg/m2, 325 a 350 mg/m2, 350 a 375 mg/m2, 375 a 400 mg/m2, 400 a 425 mg/m2, 425 a 450 mg/m2, 450 a 475 mg/m2, 475 a 500 mg/m2, 500 a 525 mg/m2, 525 a 550 mg/m2, 550 a 575 mg/m2, 575 a 600 mg/m2, 600 a 625 mg/m2, 625 a 650 mg/m2, 650 a 675 mg/m2, ou 675 a 700 mg/m2, onde m2 indica a área de superfície corporal do indivíduo. Em algumas modalidades, rituximabe é administrado em um intervalo de dose de pelo menos 4 dias, por exemplo, 4, 7, 14, 21, 28, 35 dias, ou mais. Por exemplo, rituximabe é administrado em um intervalo de dose de pelo menos 0,5 semanas, por exemplo, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 semanas, ou mais. Em algumas modalidades, rituximabe é administrado em uma dose e intervalo de dose descrito aqui durante um período de tempo, por exemplo, pelo menos 2 semanas, por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 semanas, ou mais. Por exemplo, rituximabe é administrado em uma dose e intervalo de dose descrito aqui durante um total de pelo menos 4 doses por ciclo de tratamento (por exemplo, pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, ou mais doses por ciclo de tratamento).

[00623] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD20 compreende ofatumumabe. Ofatumumabe é um anticorpo monoclonal humano de IgG1k anti-CD20 com um peso molecular de aproximadamente 149 kDa. Por exemplo, ofatumumabe é gerado usando tecnologia transgênica de camundongo e hibridoma e é expresso e purificado de uma linhagem de célula de mmurino recombinante (NS0). Veja, por exemplo, www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf; e Identificador de Teste Clínico número NCT01363128, NCT01515176, NCT01626352, e NCT01397591. Em modalidades, uma célula expressando CAR, descrita aqui, é administrada a um indivíduo em combinação com ofatumumabe. Em modalidades, o indivíduo tem CLL ou SLL.

[00624] Em algumas modalidades, ofatumumabe é administrado como uma infusão intravenosa. Por exemplo, cada infusão fornece cerca de 150-3000 mg (por exemplo, cerca de 150-200, 200-250, 250300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1200, 1200-1400, 1400-1600, 1600-1800, 1800-2000, 2000-2200, 2200-2400, 2400-2600, 2600-2800, ou 2800-3000 mg) de ofatumumabe. Em modalidades, ofatumumabe é administrado em uma dose de partida de cerca de 300 mg, seguida por 2000 mg, por exemplo, durante cerca de 11 doses, por exemplo, durante 24 semanas. Em algumas modalidades, ofatumumabe é administrada em um intervalo de dose de pelo menos 4 dias, por exemplo, 4, 7, 14, 21, 28, 35 dias, ou mais. Por exemplo, ofatumumabe é administrado em um intervalo de dose de pelo menos 1 semana, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24, 26, 28, 20, 22, 24, 26, 28, 30 semanas, ou mais. Em algumas modalidades, ofatumumabe é administrado em uma dose e intervalo de dose descrito aqui durante um período de tempo, por exemplo, pelo menos 1 semana, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 60 semanas ou mais, ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses ou mais, ou 1, 2, 3, 4, 5 anos ou mais. Por exemplo, ofatumumabe é administrado em uma dose e intervalo de dose descrito aqui durante um total de pelo menos 2 doses por ciclo de tratamento (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, ou mais doses por ciclo de tratamento).

[00625] Em alguns casos, o anticorpo anti-CD20 compreende ocrelizumabe. Ocrelizumabe é um anticorpo monoclonal anti-CD20 humanizado, por exemplo, como descrito nos Identificadores de Teste Clínico Nos. NCT00077870, NCT01412333, NCT00779220, NCT00673920, NCT01194570, e Kappos et al. Lancet. 19.378(2011):1779-87.

[00626] Em alguns casos, o anticorpo anti-CD20 compreende veltuzumabe. Veltuzumabe é um anticorpo monoclonal humanizado contra CD20. Veja, por exemplo, Identificador de teste Clínico n° NCT00547066, NCT00546793, NCT01101581, e Goldenberg et al. Leuk Linfoma. 51(5)(2010):747-55.

[00627] Em alguns casos, o anticorpo anti-CD20 compreende GA101. GA101 (também chamado obinutuzumabe ou RO5072759) é um anticorpo monoclonal anti-CD20 humanizado criado por glico. Veja, por exemplo, Robak. Curr. Opin. Investig. Drugs. 10.6(2009):588-96; Clinical Trial Identifier Numbers: NCT01995669, NCT01889797, NCT02229422, e NCT01414205; e www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.p df.

[00628] Em alguns casos, o anticorpo anti-CD20 compreende AME- 133v. AME-133v (também chamado LY2469298 ou ocaratuzumabe) é um anticorpo monoclonal de IgG1 humanizado contra CD20 com afinidade aumentada quanto ao receptor de FcYRIIIa e uma atividade de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) realçada em comparação com rituximabe. Veja, por exemplo, Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25; e Forero-Torres et al. Clin Cancer Res. 18.5(2012):1395-403.

[00629] Em alguns casos, o anticorpo anti-CD20 compreende PRO131921. PRO131921 é um anticorpo monoclonal anti-CD20 humanizado criado para ter melhor ligação a FcYRIIIa e ADCC realçada em comparação com rituximabe. Veja, por exemplo, Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25; e Casulo et al. Clin Immunol. 154.1(2014):37-46; e Identificador de teste Clínico n° NCT00452127.

[00630] Em alguns casos, o anticorpo anti-CD20 compreende TRU- 015. TRU-015 é uma proteína de fusão de anti-CD20 derivada de domínios de um anticorpo contra CD20. TRU-015 é menor do que anticorpos monoclonais, porém mantém funções efetoras mediadas por Fc. Veja, por exemplo, Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25. TRU- 015 contém um fragmento variável de cadeia simples anti-CD20 (scFv) ligado a uma articulação de IgG1 humana, domínios de CH2, e CH3, porém se os domínios de CH1 e CL.

[00631] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD20 descrito aqui é conjugado ou de outro modo ligado a um agente terapêutico, por exemplo, um agente quimioterapêutico (por exemplo, citoxano, fludarabina, inibidor de histona desacetilase, agente de desmetilação, vacina de peptídeo, antibiótico anti-tumor, inibidor de tirosina cinase, agente de alquilação, antimicrotúbullo ou agente antimitótico), agente antialérgico, agente antináusea (ou antiemético), aliviador de dor, ou agente citoprotetor descrito aqui.

[00632] Em modalidades, uma célula expressando CAR, descrita aqui, é administrada a um indivíduo em combinação com um inibidor de linfoma 2 de célula B (BCL-2) (por exemplo, venetoclax, também chamado ABT-199 ou GDC-0199;) e/ou rituximabe. Em modalidades, uma célula expressando CAR, descrita aqui, é administrada a um indivíduo em combinação com venetoclax e rituximabe. Venetoclax é uma molécula pequena que inibe a proteína antiapoptótica, BCL-2. A estrutura de venetoclax (4-(4-{ [2-(4-clorofenil)-4,4-dimetilciclo-hex-1-en- 1-il]metil}piperazin-1-il)-N-({3-nitro-4- [(tetra-hidro-2H-piran-4- ilmetil)amino]fenil}sulfonil)-2-(1H-pirrolo [2,3-b]piridin-5-ilóxi)benzamida) é mostrada abaixo.

[00633] Em modalidades, o indivíduo tem CLL. Em modalidades, o indivíduo tem CLL reincidente, por exemplo, o indivíduo foi anteriormente administrado uma terapia de câncer. Em modalidades, venetoclax é administrada em uma dosagem de cerca de 15 a 600 mg (por exemplo, 15-20, 20-50, 50-75, 75-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, ou 500-600 mg), por exemplo, diariamente. Em modalidades, rituximabe é administrada em uma dosagem de cerca de 350-550 mg/m2 (por exemplo, 350-375, 375-400, 400-425, 425-450, 450-475, ou 475-500 mg/m2), por exemplo, intravenosamente, por exemplo, mensalmente.

[00634] Em uma modalidade, células expressando um CAR, descritas aqui, opcionalmente em combinação com um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe, são administradas a um indivíduo em combinação com uma molécula que diminui a população de célula Treg. Métodos que diminuem o número de (por exemplo, depauperam) células Treg são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, depleção de CD25, administração de ciclofosfamida, modulação de função de GITR. Sem desejar ficar preso à teoria, acredita-se que reduzindo o número de células Treg em um indivíduo antes da aférese ou antes da administração de uma célula expressando CAR descrita aqui reduz o número de células imunes indesejadas (por exemplo, Tregs) no microambiente de tumor e reduz o risco do indivíduo de reincindir. Em uma modalidade, células expressando um CAR descritas aqui, opcionalmente em combinação com um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe, são administradas a um indivíduo em combinação com uma molécula alvejando GITR e/ou modulação de funções de GITR, tal como um agonista de GITR e/ou um anticorpo de GITR que depaupera as células T regulatórias (Tregs). Em modalidades, células expressando um CAR descritas aqui, opcionalmente em combinação com um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe, são administradas a um indivíduo em combinação com ciclofosfamida. Em uma modalidade, as moléculas de ligação de GITR e/ou moléculas modulando as funções de GITR (por exemplo, agonista de GITR e/ou anticorpos de GITR de depleção de Treg) são administradas antes da administração da célula expressando CAR. Por exemplo, em uma modalidade, o agonista de GITR pode ser administrado antes da aférese das células. Em modalidades, ciclofosfamida é administrada ao indivíduo antes da administração (por exemplo, infusão ou reinfusão) da célula expressando CAR ou antes da aférese das células. Em modalidades, ciclofosfamida e um anticorpo anti-GITR são administrados ao indivíduo antes da administração (por exemplo, infusão ou re-infusão) da célula expressando CAR ou antes da aférese das células. Em uma modalidade, o indivíduo tem câncer (por exemplo, um câncer sólido ou um câncer hematológico tal como ALL ou CLL). Em uma modalidade, o indivíduo tem CLL. Em modalidades, o indivíduo tem ALL. Em modalidades, o indivíduo tem um câncer sólido, por exemplo, um câncer sólido descrito aqui.

[00635] Agonistas de GITR exemplares incluem, por exemplo, proteíns de fusão de GITR e anticorpos anti-GITR (por exemplo, anticorpos anti-GITR bivalentes) tal como, por exemplo, uma proteína de fusão de GITR descrita na Patente dos Estados Unidos n°: 6.111.090, Patente Europeia n°: 090505B1, Patente dos Estados Unidos n°: 8.586.023, Publicações de PCT Nos.: WO 2010/003118 e 2011/090754, ou um anticorpo anti-GITR descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n°: 7.025.62, Patente Europeia n°: 1947183B1, Patente dos Estados Unidos n°: 7.812.135, Patente dos Estados Unidos n°: 8.388.967, Patente dos Estados Unidos n°: 8.591.886, Patente Europeia n°: EP 1866339, Publicação de PCT n°: WO 2011/028683, Publicação de PCT n°: WO 2013/039954, Publicação de PCT n°: W02005/007190, Publicação de PCT n°: WO 2007/133822, Publicação de PCT n°: WO2005/055808, Publicação de PCT n°: WO 99/40196, Publicação de PCT n°: WO 2001/03720, Publicação de PCT n°: WO99/20758, Publicação de PCT n°: WO2006/083289, Publicação de PCT n°: WO 2005/115451, Patente dos Estados Unidos n°: 7.618.632, e Publicação de PCT n°: WO 2011/051726.

[00636] Em uma modalidade, a combinação de uma célula expressando CAR descrita aqui e um inibidor de cinase descrito aqui é administrada a um indivíduo em combinação com um agonista de GITR, por exemplo, um agonista de GITR descrito aqui. Em uma modalidade, o agonista de GITR é administrado antes da célula expressando CAR. Por exemplo, em uma modalidade, o agonista de GITR pode ser administrado antes da aférese das células. Em uma modalidade, o indivíduo tem CLL.

[00637] Fármacos que inibem a fosfatase calcineurina dependente de cálcio (ciclosporina e FK506) ou inibe a p70S6 cinase que é importante pata a sinalização induzida por fator de crescimento (rapamicina). (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993) também podem ser usados. Em um outro aspecto, as composições de célula da presente invenção podem ser administradas a um paciente em conjunção com (por exemplo, antes de, simultaneamente ou após) transplante de medula óssea, terapia ablativa com célula T usando agentes de quimioterapia tal como, fludarabina, terapia com feixe externo (XRT), ciclofosfamida, e/ou anticorpos tais como OKT3 ou CAMPATH. Em um aspecto, as composições de célula da presente invenção são administradas após terapia ablativa com célula B tal como agentes que reagem com CD20, por exemplo, Rituxan. Por exemplo, em uma modalidade, os indivíduos podem ser submetidos ao tratamento padrão com quimioterapia com dose elevada seguida por transplante de célula-tronco de sangue periférico. Em certas modalidades, após o transplante, os indivíduos recebem uma infusão das células imunes expandidas da presente invenção. Em uma modalidade adicional, células expandidas são administradas antes ou depois da cirurgia.

[00638] Em uma modalidade, ao indivíduo pode ser administrado um agente que reduz ou melhora os efeitos colaterais associados com a administração de uma célula expressando CAR. Efeitos colaterais associados com a administração de uma célula expressando CAR incluem, porém não estão limitados a CRS, e linfo-histiocitose hemofagocítica (HLH), também chamada Síndrome da Ativação de Macrófagos (MAS). Sintomas de CRS incluem febres altas, náusea, hipotensão transitória, hipoxia, e similares. Consequentemente, os métodos descritos aqui podem compreender administrar uma célula expressando CAR descrita aqui a um indivíduo e também administrar um agente para controlar os níveis elevados de um valor solúvel resultante de tratamento com uma célula expressando CAR. Em uma modalidade, o fator solúvel elevado no indivíduo é um ou mais de IFN- Y, TNFa, receptor de IL-2 e IL-6. Portanto, um agente administrado para tratar este efeito colateral pode ser um agente que neutraliza um ou mais destes fatores solúveis. Exemplos de tais agentes incluem, porém não estão limitados a um esteroide (por exemplo, corticosteroide), um inibidor de TNFa, e um inibidor de IL-6. Um exemplo de um inibidor de TNFa é uma molécula de anticorpo anti-TNFa tal como, infliximabe, adalimumabe, certolizumabe pegol, e golimumabe. Outro exemplo de um inibidor de TNFa é uma proteína de fusão tal como entanercept. Inibidor de pequena molécula de TNFa inclui, porém não está limitado aos derivados de xantina (por exemplo, pentoxifilina) e bupropiona. Um exemplo de um inibidor de IL-6 é uma molécula de anticorpo anti-IL-6 ou molécula de anticorpo de receptor anti-IL-6 tal como tocilizumabe (toc), sarilumabe, elsilimomabe, CNTO 328, ALD518/BMS-945429, CNTO 136, CPSI-2364, CDP6038, VX30, ARGX-109, FE301, e FM101. Em uma modalidade, molécula de anticorpo de receptor anti-IL-6 é tocilizumabe. Um exemplo de um inibidor com base em IL-1R é anacinra.

[00639] Em uma modalidade, ao indivíduo pode ser administrado um agente que realça a atividade de uma célula expressando CAR. Por exemplo, em uma modalidade, o agente pode ser um agente que inibe uma molécula inibitória. Moléculas inibitórias, por exemplo, Morte Programada 1 (PD1), podem, em algumas modalidades, diminuir a capacidade de uma célula expressando CAR montar uma resposta efetora imune. Exemplos de moléculas inibitórias incluem PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por exemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 e/ou CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 e TGFR beta. A inibição de uma molécula inibitória, por exemplo, por inibição no nível de DNA, RNA ou proteína, pode otimizar o desempenho de célula expressando CAR. Em modalidades, um ácido nucleico inibitório, por exemplo, um dsRNA, por exemplo, um siRNA ou shRNA, repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR), uma nuclease efetora tipo ativador de transcrição (TALEN), ou uma endonuclease de dedo de zinco (ZFN), pode ser usado para inibir a expressão de uma molécula inibitória na célula expressando CAR. Em uma modalidade, o inibidor é um shRNA. Em uma modalidade, a molécula inibidora é inibida dentro de uma célula expressando CAR. Nestas modalidades, uma molécula de dsRNA que inibe a expressão da molécula inibidora é ligada ao ácido nucleico que codifica um componente, por exemplo, todos os componentes, do CAR. Em uma modalidade, o inibidor de um sinal inibitório pode ser, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a uma molécula inibitória. Por exemplo, o agente pode ser um anticorpo ou fragmento de anticorpo que liga se liga a PD1, PD-L1, PD-L2 ou CTLA4 (por exemplo, ipilimumabe (também referido como MDX-010 e MDX101, e comercializado como Yervoy®; Bristol-Myers Squibb; Tremelimumabe (anticorpo monoclonal IgG2 disponível de Pfizer, anteriormente conhecido como ticilimumabe, CP-675,206).). Em uma modalidade, o agente é um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a TIM3. Em uma modalidade, o agente é um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a LAG3. Em uma modalidade, o agente é um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a CEACAM (por exemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 e/ou CEACAM-5).

[00640] PD1 é um membro inibitório da família de CD28 de receptores que também inclui CD28, CTLA-4, ICOS, e BTLA. PD1 é expresso em células B ativadas, células T e células mieloides (Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75). Dois ligantes para PD1, PD-L1 e PD- L2 foram mostrados sub-regular a ativação de célula T na ligação a PD1 (Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1 é abundante em cânceres humanos (Dong et al. 2003 J Mol Med 81:2817; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094). A imunossupressão pode ser revertida inibindo a interação local de PD1 com PD-L1. Anticorpos, fragmento de anticorpos, e outros inibidores de PD1, PD-L1 e PD-L2 são conhecidos e podem ser usados em combinação com um CAR de CD19 descrito aqui. Por exemplo, nivolumabe (também referido como BMS-936558 ou MDX1106; Bristol-Myers Squibb) é um anticorpo monoclonal de IgG4 totalmente humano que especificamente bloqueia PD1. Nivolumabe (clone 5C4) e outros anticorpos monoclonais humanos que especificamente se ligam a PD1 são descritos em US 8.008.449 e WO2006/121168. Pidilizumabe (CT-011; Cure Tech) é um anticorpo monoclonal IgG1k humanizado que se liga a PD1. Pidilizumabe e outros anticorpos monoclonais anti-PD1 humanizados são descritos no WO2009/101611. Pembrolizumabe (anteriormente conhecidos como lambrolizumabe, e também referidos como Keytruda, MK03475; Merck) é um anticorpo monoclonal IgG4 humanizado que se liga a PD1. Pembrolizumabe e outros anticorpos anti-PD1 humanizados são descritos no US 8.354.509 e WO2009/114335. MEDI4736 (Medimmune) é um anticorpo monoclonal humano que se liga a PDL1, e inibe a interação do ligante com PD1. MDPL3280A (Genentech / Roche) é um anticorpo monoclonal de IgG1 otimizado por Fc humano que se liga a PD-L1. MDPL3280A e outros anticorpos monoclonais humanos a PD-L1 são descritos na Patente dos Estados Unidos n°: 7.943.743 e Publicação dos Estados Unidos n°: 20120039906. Outros agentes de ligação anti-PD-L1 incluem YW243.55.S70 (regiões variáveis de cadeia pesada e leve são mostradas na SEQ ID NOs 20 e 21 em WO2010/077634) e MDX-1 105 (também referido como BMS- 936559, e, por exemplo, anti-PD-L1 agente de ligação descritos em WO2007/005874). AMP-224 (B7-DCIg; Amplimmune; por exemplo, descritos em WO2010/027827 e WO2011/066342), é um receptor solúvel de fusão de Fc de PD-L2 que bloqueia a interação entre PD1 e B7-H1. Outros anticorpos anti-PD1 incluem AMP 514 (Amplimmune), entre outros, por exemplo, anticorpos anti-PD1 descritos em US 8.609.089, US 2010028330, e/ou US 20120114649.

[00641] TIM3 (imunoglobulina-3 de célula T) também regula negativamente a função de célula T, particularmente em células T citotóxicas 1 de CD8+ e T auxiliadoras 1 de CD4+ secretando IFN-g, e desempenha um papel crítico em exaustão de célula T. A inibição da interação entre TIM3 e seus ligantes, por exemplo, galectina-9 (Gal9), fosfotidilserina (PS), e HMGB1, pode aumentar a resposta imune. Anticorpos, fragmentos de anticorpo, e outros inibidores de TIM3 e seus ligantes são disponíveis na técnica e podem ser usados em combinação com um CAR de CD19 descrito aqui. Por exemplo, anticorpos, fragmentos de anticorpo, moléculas pequenas, ou inibidores de peptídeo que alvejam TIM3 liga-sem ao domínio de IgV de TIM3 para inibir a interação com seus ligantes. Anticorpos e peptídeos qie inibem TIM3 são descritos no WO2013/006490 e US20100247521. Outros anticorpos anti-TIM3 incluem versões humanizadas de RMT3-23 (descritos em Ngiow et al., 2011, Cancer Res, 71:3540-3551), e clone 8B.2C12 (descrito em Monney et al., 2002, Nature, 415:536-541). Anticorpos biespecíficos que inibem TIM3 e PD-1 são descritos em US20130156774.

[00642] Em outras modalidades, o agente que realça a atividade de uma célula expressando CAR é um inibidor de CEACAM (por exemplo, inibidor de CEACAM-1, CEACAM-3, e/ou CEACAM-5). Em uma modalidade, o inibidor de CEACAM é uma molécula de anticorpo anti- CEACAM. Anticorpos anti-CEACAM-1 exemplares são descritos no WO 2010/125571, WO 2013/082366 WO 2014/059251 e WO 2014/022332, por exemplo, um anticorpo monoclonal 34B1, 26H7, e 5F4; ou uma forma recombinante dos mesmos, como descrito no, por exemplo, US 2004/0047858, US 7,132,255 e WO 99/052552. Em outras modalidades, o anticorpo anti-CEACAM liga um CEACAM-5 como descrito em, por exemplo, Zheng et al. PLoS One. 2 de Setembro de 2010;5(9). pii: e12529 (DOI:10:1371/journal.pone.0021146), ou reage por cruzamento com CEACAM-1 e CEACAM-5 como descrito em, por exemplo, WO 2013/054331 e US 2014/0271618.

[00643] Sem desejar ficar preso à teoria, acredita-se que as moléculas de adesão de célula de antígeno carcinoembriônico (CEACAM), tal como CEACAM-1 e CEACAM-5, mediem, pelo menos em parte, inibição de uma resposta imune antitumor (veja, por exemplo, Markel et al. J Immunol. 15 de Março de 2002;168(6):2803-10; Markel et al. J Immunol. 1 de Novembro de 2006;177(9):6062-71; Markel et al. Immunology. Fevereiro de 2009;126(2):186-200; Markel et al. Cancer Immunol Immunother. Fevereiro de 2010;59(2):215-30; Ortenberg et al. Mol Cancer Ther. Junho de 2012;11(6):1300-10; Stern et al. J Immunol. 1 de Junho de 2005;174(11):6692-701; Zheng et al. PLoS One. 2 de Setembro de 2010;5(9). pii: e12529). Por exemplo, CEACAM-1 foi descrito como um ligante heterofílico para TIM-3 e como desempenhando um papel na tolerância e exaustão de célula T mediada por TIM-3 (veja, por exemplo, WO 2014/022332; Huang, et al. (2014) Nature doi:10.1038/nature13848). Em modalidades, o cobloqueio de CEACAM-1 e TIM-3 foi mostrado realçar uma resposta imune antitumor iem modelos de câncer colorretal (veja, por exemplo, WO 2014/022332; Huang, et al. (2014), supra). Em outras modalidades, o cobloqueio de CEACAM-1 e PD-1 reduz a tolerância de célula T como descrito, por exemplo, em WO 2014/059251. Desse modo, inibidores de CEACAM podem ser usados como outros imunomoduladores descritos aqui (por exemplo, inibidores anti-PD-1 e/ou anti-TIM-3) para realçar uma resposta imune contra um câncer, por exemplo, um melanoma, um câncer de pulmão (por exemplo, NSCLC), um câncer de bexiga, um câncer de cólon, um câncer ovariano, e outros câncers como descrito aqui.

[00644] LAG3 (ativação de linfócito de gene-3 ou CD223) é uma molécula de superfície celular expressa em células T e células B tativadas que foi mostrado expressar um papel em exaustão de célula T de CD8+. Anticorpos, fragmentos de anticorpo, e outros inibidores de LAG3 e seus ligantes são disponíveis na técnica e podem ser usados em combinação com um CAR de CD19 descrito aqui. Por exemplo, BMS-986016 (Bristol-Myers Squib) é um anticorpo monoclonal que alveja LAG3. IMP701 (Immutep) é um anticorpo de LAG3 antagonista e IMP731 (Immutep e GlaxoSmithKline) é um anticorpo de LAG3 de depleção. Outros inibidores de LAG3 incluem IMP321 (Immutep), que é uma proteína de fusão recombinante de uma porção de LAG3 solúvel e Ig que se liga às moléculas de MHC classe II e ativa células apresentadoras de antígeno (APC). Outros anticorpos são descritos, por exemplo, no WO2010/019570.

[00645] Em algumas modalidades, a terapia com CAR e o inibidor de cinase são administrados em combinação com um agonista de receptor semelhante a dobre de sino (TLR). O agonista de TLR pode ser agonista de TLR9. Em algumas modalidades, o agonista de TLR é um oligodeoxinucleotídeo, por exemplo, um oligodeoxinucleotídeo enriquecido por CG, por exemplo, um oligodeoxinucleotídeo enriquecido por CG não metilado. Veja, por exemplo, Sagiv-Barfi et al., "Ibrutinibe enhances the antitumor immune response induced by intratumoral injection of a TLR9 ligand in syngeneic mouse linfoma model." Blood. 6 de Fevereiro de 2015. pii: blood-2014-08-593137, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, o agonista de TLR é administrado em combinação com uma célula NK expressando CAR. Sem estar ligado à teoria, o agonista de TLR pode promover a ativação de células NK tal como células NK expressando CAR. Em algumas modalidades, o agonista de TLR é administrado por injeção, por exemplo, injeção intra-humoral.

[00646] Em algumas modalidades, o agente que realça a atividade de uma célula expressando CAR pode ser, por exemplo, uma proteína de fusão compreendendo um primeiro domínio e um segundo domínio, em que o primeiro domínio é uma molécula inibitória, ou fragmento da mesma, e o segundo domínio é um polipeptídeo que é associado com um sinal positivo, por exemplo, um polipeptídeo compreendendi um domínio de sinalização intracelular como descrito aqui. Em algumas modalidades, o polipeptídeo que é associado com um sinal positivo pode incluir um domínio coestimulatório de CD28, CD27, ICOS, por exemplo, um domínio de sinalização intracelular de CD28, CD27 e/ou ICOS, e/ou um domínio de sinalização primária, por exemplo, de CD3 zeta, por exemplo, descrito aqui. Em uma modalidade, a proteína de fusão é expressa pela mesma célula que expressa o CAR. Em outra modalidade, a proteína de fusão é expressa por uma célula, por exemplo, uma célula T que não expressa um CAR anti-CD19.

[00647] Em uma modalidade, o agente que realça a atividade de uma célula expressando CAR, descrita aqui, é miR-17-92.

[00648] Em uma modalidade, o agente que realça a atividade de um CAR descrito aqui é uma citocina. Citocinas têm importantes funções relacionadas à expansão, diferenciação, sobrevivência, e homeostase de célula T. Citocinas que podem ser administradas ao indivíduo recebendo uma célula expressando CAR descrita aqui incluem: IL-2, IL- 4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-18, e IL-21, ou uma combinação das mesmas. Em modalidades preferidas, uma citocina administrada é IL-7, IL-15, ou IL- 21, ou uma combinação das mesmas. A citocina pode ser administrada uma vez ao dia ou mais do que uma vez ao dia, por exemplo, duas vezes ao dia, três vezes ao dia, ou quatro vezes a dia. A citocina pode ser administrada durante mais do que um dia, por exemplo, a citocina é administrada durante 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, ou 4 semanas. Por exemplo, a citocina é administrada uma vez ao dia durante 7 dias.

[00649] Em modalidades, a citocina é administrada em combinação com células expressando CAR. A citocina pode ser administrada simultaneamente concorrentemente com as células expressando CAR, por exemplo, administrada no mesmo dia. A citocina pode ser preparada na mesma composição farmacêutica como as células expressando CAR, ou pode ser preparada em uma composição farmacêutica separada. Alternativamente, a citocina pode ser administrada imediatamente após a administração das células T expressando CAR, por exemplo, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, ou 7 dias após administração das células expressando CAR. Em modalidades onde a citocina é administrada em um regime de dosagem que ocorre durante mais do que um dia, o primeiro dia do regime de dosagem de citocina pode ser no mesmo dia como a administração com as células expressando CAR, ou o primeiro dia do regime de dosame de citocina pode ser 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, ou 7 dias após a administração das células T expressando CAR. Em uma modalidade, no primeiro dia, as células expressando CAR são administradas ao indivíduo, e no segundo dia, uma citocina é administrada uma vez ao dia durante os próximos 7 dias. Em uma modalidade preferida, a citocina a ser administrada em combinação com as células expressando CAR é IL-7, IL-15, e/ou IL-21.

[00650] Em outras modalidades, a citocina é administrada durante um período suficiente de tempo após administração das células expressando CAR, por exemplo, pelo menos 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 10 semanas, 12 semanas, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, ou 1 ano ou mais após a administração de células expressando CAR. Em uma modalidade, a citocina é administrada após a avaliação da resposta do indivíduo às células expressando CAR. Por exemplo, ao indivíduo são administradas células expressando CAR de acordo com a dosagem e regimes descritos aqui. A resposta do indivíduo à terapia como CART é avaliada nas 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 10 semanas, 12 semanas, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, ou 1 ano ou mais após a administração de células expressando CAR, usando qualquer um dos métodos descritos aqui, incluindo inibição de crescimento de tumor, redução de células de tumor circulantes, ou regressão de tumor. Indivíduos que não exibem uma resposta suficiente à terapia com CART podem ser administrados com uma citocina. A administração da citocina ao indivíduo que tem uma resposta sub-ideal à terapia com CART melhora a eficácia de CART e/ou atividade antitumor. Em uma modalidade preferida, a citocina administrada após a administração de células expressando CAR é IL-7. Combinação com uma dose baixa de um inibidor de mTOR

[00651] Em uma modalidade, as células expressando uma molécula de CAR, por exemplo, uma molécula de CAR descrita aqui, são administradas em combinação com uma baixa dose de reforço imune de um inibidor de mTOR.

[00652] Em uma modalidade, uma dose de um inibidor de mTOR é associada com, ou fornece, inibição de mTOR de pelo menos 5, porém não mais do que 90%, pelo menos 10, porém não mais do que 90%, pelo menos 15, porém não mais do que 90%, pelo menos 20, porém não mais do que 90%, pelo menos 30, porém não mais do que 90%, pelo menos 40, porém não mais do que 90%, pelo menos 50, porém não mais do que 90%, pelo menos 60, porém não mais do que 90%, ou pelo menos 70, porém não mais do que 90%.

[00653] Em uma modalidade, uma dose de um inibidor de mTOR é associada com, ou fornece, inibição de mTOR de pelo menos 5, porém não mais do que 80%, pelo menos 10, porém não mais do que 80%, pelo menos 15, porém não mais do que 80%, pelo menos 20, porém não mais do que 80%, pelo menos 30, porém não mais do que 80%, pelo menos 40, porém não mais do que 80%, pelo menos 50, porém não mais do que 80%, ou pelo menos 60, porém não mais do que 80%.

[00654] Em uma modalidade, uma dose de um inibidor de mTOR é associada com, ou fornece, inibição de mTOR de pelo menos 5, porém não mais do que 70%, pelo menos 10, porém não mais do que 70%, pelo menos 15, porém não mais do que 70%, pelo menos 20, porém não mais do que 70%, pelo menos 30, porém não mais do que 70%, pelo menos 40, porém não mais do que 70%, ou pelo menos 50, porém não mais do que 70%.

[00655] Em uma modalidade, uma dose de um inibidor de mTOR é associada com, ou fornece, inibição de mTOR de pelo menos 5, porém não mais do que 60%, pelo menos 10, porém não mais do que 60%, pelo menos 15, porém não mais do que 60%, pelo menos 20, porém não mais do que 60%, pelo menos 30, porém não mais do que 60%, ou pelo menos 40, porém não mais do que 60%.

[00656] Em uma modalidade, uma dose de um inibidor de mTOR é associada com, ou fornece, inibição de mTOR de pelo menos 5, porém não mais do que 50%, pelo menos 10, porém não mais do que 50%, pelo menos 15, porém não mais do que 50%, pelo menos 20, porém não mais do que 50%, pelo menos 30, porém não mais do que 50%, ou pelo menos 40, porém não mais do que 50%.

[00657] Em uma modalidade, uma dose de um inibidor de mTOR é associada com, ou fornece, inibição de mTOR de pelo menos 5, porém não mais do que 40%, pelo menos 10, porém não mais do que 40%, pelo menos 15, porém não mais do que 40%, pelo menos 20, porém não mais do que 40%, pelo menos 30, porém não mais do que 40%, ou pelo menos 35, porém não mais do que 40%.

[00658] Em uma modalidade, uma dose de um inibidor de mTOR é associada com, ou fornece, inibição de mTOR de pelo menos 5, porém não mais do que 30%, pelo menos 10, porém não mais do que 30%, pelo menos 15, porém não mais do que 30%, pelo menos 20, porém não mais do que 30%, ou pelo menos 25, porém não mais do que 30%.

[00659] Em uma modalidade, uma dose de um inibidor de mTOR é associada com, ou fornece, inibição de mTOR de pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5, porém não mais do que 20%, pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5, porém não mais do que 30%, pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5, porém não mais do que 35, pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5, porém não mais do que 40%, ou pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5, porém não mais do que 45%.

[00660] Em uma modalidade, uma dose de um inibidor de mTOR é associada com, ou fornece, inibição de mTOR de pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5, porém não mais do que 90%.

[00661] Como é descrito aqui, a extensão de inibição de mTOR pode ser expressa como a extensão de inibição de P70 S6 cinase, por exemplo, a extensão de inibição de mTOR pode ser determinada pelo nível de decréscimo na atividade de P70 S6 cinase, por exemplo, pelo decréscimo na fosforilação de um substrato de P70 S6 cinase. O nível de extensão de inibição de mTOR pode ser avaliada por um método descrito aqui, por exemplo, pelo ensaio Boulay, ou avaliação de níveis de S6 fosforilado por western blot.

INIBIDORES DE MTOR EXEMPLARES

[00662] Como usado aqui, o termo "inibidor de mTOR" se refere a um composto ou ligante, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, que inibe a mTOR cinase emu ma célula. Em uma modalidade um inibidor de mTOR é um inibidor alostérico. Em uma modalidade um inibidor de mTOR é um inibidor catalítico.

[00663] Inibidores de mTOR alostéricos incluem o composto tricíclio neutron rapamicina (sirolimo), compostos relacionados com rapamicina, que são compostos tendo estrutura e funcionalidade similarmente a rapamicina incluindo, por exemplo, derivados de rapamicina, análogos de rapamicina (também referido como rapálogos) e outros compostos de macrolídeo que inibem a atividade de mTOR.

[00664] Rapamicina é um antibiótico de macrolídeo produzido por streptomyces hygroscopicus tendo a estrutura mostrada na fórmula A.

[00665] Veja, por exemplo, McAlpine, J.B., et al., J. Antibiotics (1991) 44: 688; Schreiber, S.L., et al., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113: 7433; Patente dos Estados Unidos n° 3.929.992. Existem vários esquemas de numeração propostos para rapamicina. Para evitar confusão, quando análogos de rapamicina específicos são nomeados aqui, os nomes são fornecidos com referência à rapamicina usando o esquema de numeração de fórmula A.

[00666] Análogos de rapamicina úteis na invenção são, por exemplo, análogos substituídos por O em que o grupo hidroxila no anel ciclo- hexila de rapamicina é substituído por OR1 em que R1 é hidroxialquila, hidroxialcoxialquila, acilaminoalquila, ou aminoalquila; por exemplo, RAD001, também conhecido como, everolimo como descrito no US 5.665.772 e WO94/09010 o teor dos quais é incorporado por referência. Outros análogos de rapamicina adequados incluem aqueles substituídos na posição 26 ou 28. O análogo de rapamicina podem ser um epímero de um análogo mencionado acima, particularmente um epímero de um análogo substituído na posição 40, 28 ou 26, e pode opcionalmente ser hidrogenado, por exemplo, como descrito no US 6.015.815, WO95/14023 e WO99/15530 o teor dos quais é incorporado por referência, por exemplo, ABT578 também conhecido como zotarolimo ou um análogo de rapamicina descrito no US 7.091.213, WO98/02441 e WO01/14387 o teor dos quais é incorporado por referência, por exemplo, AP23573 também conhecido como ridaforolimo.

[00667] Exemplos de análogos de rapamicina adequados para uso na presente invenção de US 5,665,772 incluem, porém não estão limitados à 40-O-benzil-rapamicina, 40-O-(4’-hidroximetil)benzil- rapamicina, 40-O- [4’-(1,2-di-hidroxietil)]benzil-rapamicina, 40-O-alil- rapamicina, 40-O- [3’-(2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4(S)-il)-prop-2’-en-1’-il]- rapamicina, (2’E,4’S)-40-O-(4’,5’-di-hidroxipent-2’-en-1’-il)-rapamicina, 40-O-(2-hidróxi)etoxicarbonilmetil-rapamicina, 40-O-(2-hidróxi)etil- rapamicina, 40-O-(3-hidróxi)propil-rapamicina, 40-O-(6-hidróxi)hexil- rapamicina, 40-O- [2-(2-hidróxi)etóxi]etil-rapamicina, 40-O- [(3S)-2,2- dimetildioxolan-3-il]metil-rapamicina, 40-O- [(2S)-2,3-di-hidroxiprop-1-il]- rapamicina, 40-O-(2-acetóxi)etil-rapamicina, 40-O-(2-nicotinoilóxi)etil- rapamicina, 40-O- [2-(N-morfolino)acetóxi]etil-rapamicina, 40-O-(2-N- imidazolilacetóxi)etil-rapamicina, 40-O- [2-(N-metil-N’- piperazinil)acetóxi]etil-rapamicina, 39-O-desmetil-39,40-O,O-etileno- rapamicina, (26R)-26-di-hidro-40-O-(2-hidróxi)etil-rapamicina, 40-O-(2- aminoetil)-rapamicina, 40-O-(2-acetaminoetil)-rapamicina, 40-O-(2- nicotinamidoetil)-rapamicina, 40-O-(2-(N-metil-imidazo-2’- ilcarbetoxamido)etil)-rapamicina, 40-O-(2-etoxicarbonilaminoetil)- rapamicina, 40-O-(2-tolilsulfonamidoetil)-rapamicina e 40-O- [2-(4’,5’- dicarboetóxi-1’,2’,3’-triazol-1’-il)-etil]-rapamicina.

[00668] Outros análogos de rapamicina úteis na presente invenção são análogos onde o grupo hidroxila no anel ciclo-hexil de rapamicina e/ou o grupo hidróxi na posição 28 é substituído com um grupo hidroxiéster são conhecido, por exemplo, análogos de rapamicina encontrados US RE44.768, por exemplo, tensirolimo.

[00669] Outros análogos de rapamicina úteis na presente invenção incluem aqueles em que o grupo metóxi na posição 16 é substituído com outro substituinte, preferivemente (opcionalmente substituído por hidróxi) alquinilóxi, benzila, ortometoxibenzila ou clorobenzila e/ou em que o grupo metóxi na posição 39 é deletado juntamente com o carbono 39 de modo que o anel ciclo-hexila de rapamicina torne-se um anel ciclopentila sem o grupo metóxi de posição 39; por exemplo, como descrito no WO95/16691 e WO96/41807, o teor dos quais é incorporado por referência. Os análogos podem ser também modificados de modo que o hidróxi na posição 40 de rapamicina seja alquilada e/ou a carbonila 32 seja reduzida.

[00670] Análogos de rapamicina de WO95/16691 incluem, porém não estão limitados à 16-demetóxi-16-(pent-2-inil)óxi-rapamicina, 16- demetóxi-16-(but-2-inil)óxi-rapamicina, 16-demetóxi-16-(propargil)óxi- rapamicina, 16-demetóxi-16-(4-hidróxi-but-2-inil)óxi-rapamicina, 16- demetóxi-16-benzilóxi-40-O-(2-hidroxietil)-rapamicina, 16-demetóxi-16- benzilóxi-rapamicina, 16-demetóxi-16-orto-metoxibenzil-rapamicina, 16-demetóxi-40-O-(2-metoxietil)-16-pent-2-inil)óxi-rapamicina, 39- demetóxi-40-desóxi-39-formil-42-nor-rapamicina, 39-demetóxi-40- desóxi-39-hidroximetil-42-nor-rapamicina, 39-demetóxi-40-desóxi-39- carbóxi-42-nor-rapamicina, 39-demetóxi-40-desóxi-39-(4-metil- piperazin-1-il)carbonil-42-nor-rapamicina, 39-demetóxi-40-desóxi-39- (morfolin-4-il)carbonil-42-nor-rapamicina, 39-demetóxi-40-desóxi-39- [N- metil,N-(2-piridin-2-il-etil)]carbamoil-42-nor-rapamicina e 39-demetóxi- 40-desóxi-39-(p-toluenesulfonil-hidrazonometil)-42-nor-rapamicina.

[00671] Análogos de rapamicina de WO96/41807 incluem, porém não estão limitados à 32-deoxo-rapamicina, 16-O-pent-2-inil-32-deoxo- rapamicina, 16-O-pent-2-inil-32-deoxo-40-O-(2-hidróxi-etil)-rapamicina, 16-O-pent-2-inil-32-(S)-di-hidro-40-O-(2-hidroxietil)-rapamicina, 32(S)- di-hidro-40-O-(2-metóxi)etil-rapamicina e 32(S)-di-hidro-40-O-(2- hidroxietil)-rapamicina.

[00672] Outro análogo de rapamicina adequado é umirolimo como descrito no US2005/0101624 o teor do qual é incorporado por referência.

[00673] RAD001, de outro modo conhecido como everolimo (Afinitor®), tem o nome químico (1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)- 1,18-di-hidróxi-12-{(1R)-2- [(1S,3R,4R)-4-(2-hidroxietóxi)-3-metoxiciclo- hexil]-1-metiletil}-19,30-dimetóxi-15,17,21,23,29,35-hexametil-11,36- dioxa-4-aza-triciclo [30.3.1.04,9]hexatriaconta-16,24,26,28-tetraeno- 2,3,10,14,20-pentaona.

[00674] Outros exemplos de inibidores de mTOR alostéricos incluem sirolimus (rapamicina, AY-22989), 40- [3-hidróxi-2-(hidroximetil)-2-metil- propanoate]-rapamicina (também chamado tensirolimo ou CCI-779) e ridaforolimo (AP-23573/MK-8669). Outros exemplos de inibidores de mTOR alostérico incluem zotarolimo (ABT578) e umirolimo.

[00675] Alternativamente ou adicionalmente, inibidores de mTOR competitivos de APT catalíticos constataram alvejar o domínio de mTOR cinase diretamente e alvejar tanto mTORC1 quanto mTORC2. Estes inibidores de mTORC1 são também mais eficazes do que tais inibidores de mTOR alostéricos como rapamicina, por que eles modulam saídas de mTORC1 resistentes à rapamicina tais como fosforilação de 4EBP1- T37/46 e translação dependente de tamponamento.

[00676] Inibidores catalíticos incluem: BEZ235 ou 2-metil-2- [4-(3- metil-2-oxo-8-quinolin-3-il-2,3-di-hidro-imidazo [4,5-c]quinolin-1-il)-fenil]- propionitrila, ou a forma de sal de monotosilato. A síntese de BEZ235 é descrita no WO2006/122806; CCG168 (de outro modo conhecido como AZD-8055, Chresta, C.M., et al., Cancer Res, 2010, 70(1), 288-298) que tem o nome químico {5- [2,4-bis-((S)-3-metil-morfolin-4-il)- pirido [2,3d]pirimidin-7-il]-2-metóxi-fenil}-metanol; 3- [2,4-bis [(3S)-3- metilmorfolin-4-il]pirido [2,3-d]pirimidin-7-il]-N-metilbenzamida (WO09104019); 3-(2-aminobenzo [d]oxazol-5-il)-1-isopropil-1H- pirazolo [3,4-d]pirimidin-4-amina (WO10051043 e WO2013023184); A N-(3-(N-(3-((3,5-dimetoxifenil)amino)quinoxalina-2-il)sulfamoil)fenil)-3- metóxi-4-metilbenzamida (WO07044729 e WO12006552); PKI-587 (Venkatesan, A.M., J. Med.Chem., 2010, 53, 2636-2645) que tem o nome químico 1- [4- [4-(dimetilamino)piperidina-1-carbonil]fenil]-3- [4- (4,6-dimorfolino-1,3,5-triazin-2-il)fenil]urea; GSK-2126458 (ACS Med. Chem. Lett., 2010, 1, 39-43) que tem o nome químico 2,4-difluoro-N-{2- metóxi-5- [4-(4-piridazinil)-6-quinolinil]-3-piridinil}benzenossulfonamida; ; 5-(9-isopropil-8-metil-2-morfolino-9H-purin-6-il)pirimidin-2-amina (WO10114484); (E)-N-(8-(6-amino-5-(trifluorometil)piridin-3-il)-1-(6-(2- cianopropan-2-il)piridin-3-il)-3-metil-1H-imidazo [4,5-c]quinolin-2(3H)- ilidene)cianamida (WO12007926).

[00677] Outros exemplos de inibidores de mTOR catalíticos incluem 8-(6-metóxi-piridin-3-il)-3-metil-1-(4-piperazin-1-il-3-trifluorometil-fenil)- 1,3-di-hidro-imidazo [4,5-c]quinolin-2-ona (WO2006/122806) e Ku- 0063794 (Garcia-Martinez JM, et al.,Biochem J., 2009, 421(1), 29-42.. Ku-0063794 é um inibifor específico do alvo mamífero de rapamicina (mTOR).) WYE-354 é outro exemplo de um inibidor de mTOR catalítico (Yu K, et al. (2009). Biochemical, Cellular, and In vivo Activity of Novel ATP-Competitive and Selective Inhibitors do mammaliam Target of Rapamicyn. Cancer Res. 69(15): 6232-6240).

[00678] Inibidores de mTOR úteis de acordo com a presente invenção também incluem pró-fármacos, derivados, sais farmaceuticamente aceitáveis, ou análogos dos mesmos de qualquer um dos anteriores.

[00679] Inibidores de mTOR, tal como RAD001, podem ser formulados para liberação com base em métodos bem estabelecidos na técnica, com base nas dosagens particulares descrita aqui. Em particular, a Patente dos Estados Unidos 6.004.973 (incorporada aqui por referência) fornece exemplos de formulações usáveis com os inibidores de mTOR descrito aqui.

AVALIAÇÃO DE INIBIÇÃO DE MTOR

[00680] mTOR fosforila a cinase P70 S6, desse modo ativando P70 S6 cinase e permitindo-o fosforilar seu substrato. A extensão de inibição de mTOR pode ser expressa como a extensão de inibição de P70 S6 cinase, por exemplo, a extensão de inibição de mTOR pode ser determinada pelo nível de decréscimo em atividade de P70 S6 cinase, por exemplo, pelo decréscimo em fosforilação de um substrato de P70 S6 cinase. Alguém pode determinar o nível de inibição de mTOR, medindo a atividade de P70 S6 cinase (a capacidade de P70 S6 cinase de fosforilar um substrato), na ausência de inibidor, por exemplo, antes da administração de inibidor, e na presença de inibidor, ou após a administração de inibidor. O nível de inibição de P70 S6 cinase determina o nível de inibição de mTOR. Desse modo, se a P70 S6 cinase for inibida em 40%, a atividade de mTOR, como medido por atividade de P70 S6 cinase, será inibida em 40%. A extensão ou nível de inibição referida aqui é o nível médio de inibição durante o intervalo de dosagem. Por meio de exemplo, se o inibidor é fornecido uma vez por semana, o nível de inibição será determinado pelo nível médio de inibição durante aquele intervalo, a saber, uma semana.

[00681] Boulay et al., Cancer Res, 2004, 64:252-61, pelo presente incorporado por referência, ensinam um ensaio que pode ser usado para avaliar o nível de inibição de mTOR (referido aqui como o ensaio de Boulay). Em uma modalidade, o ensaio depende da avaliação da atividade de P70 S6 cinase de amostras biológicas antes e depois da administração de um inibidor de mTOR, por exemplo, RAD001. As amostram podem ser tiradas em momentos pré-selecionados após o tratamento com um inibidor de mTOR, por exemplo, 24, 48, e 72 horas após tratamento. Amostras biológicas, por exemplo, de células mononucleares de sangue periférico ou pele (PBMCs) podem ser usadas. Extratos de proteína totais são preparados das amostras. P70 S6 cinase é isolada dos extratos de proteína por imunoprecipitação usando um anticorpo que especificamente reconhece a P70 S6 cinase. Atividade da P70 S6 cinase isolada pode ser medida em um ensaio de cinase in vitro. A cinase isolada pode ser incubada com substratos de subunidade 40S ribossômica (que é um substrato endógeno de P70 S6 cinase) e gama-32P sob condições que permitem a fosforilação do substrato. Em seguida, a mistura reacional pode ser resolvida em um gel de SDS-PAGE, e sinal de 32P analisado usando um PhosphorImager. Um sinal de 32P correspondendo ao tamanho da subunidade 40S ribossômica indica o substrato fosforilado e a atividade de P70 S6 cinase. O aumento e decréscimo na atividade de cinase podem ser calculados quantificando a área e intensidade do sinal de 32P do substrato fosforilado (por exemplo, usando ImageQuant, Molecular Dynamics), designando os valores de unidade arbitrária ao sinal quantificado, e comparando os valores de após administração com valores de antes da administração ou com um valor dde referência. Por exemplo, a porcentagem de inibição de atividade de cinase pode ser calculada com a seguinte fórmula: 1-(valor obtido após administração/valor obtido antes da administração) X 100. Como descrito acima, a extensão ou nível de inibição referido aqui é o nível médio inibição durante o intervalo de dose.

[00682] Métodos para a avaliação de atividade de cinase, por exemplo, a atividade de P70 S6 cinase, são também fornecidos no US 7.727.950, pelo qual incorporado por referência.

[00683] O nível de inibição de mTOR pode também ser avaliado por uma mudança na relação de células T negativas de PD1 para positivas de PD1. Células T de sangue periférico podem ser identificadas como negativas ou positivas de PD1 por métodos conhecidos na técnica.

Inibidores de mTOR de baixa dose

[00684] Métodos descritos aqui usam inibidores de mTOR de baixa dose de reforço imune, por exemplo, inibidores de mTOR alostérico, incluindo rapálogos tal como RAD001. Ao contrário, os níveis de inibidor que inibem totalmente ou quase totalmente a série de reação de mTOR são imunossupressores e são usados, por exemplo, para impedir rejeição de transplante de órgão. Além disso, doses elevadas de rapálogos que inibem totalmente mTOR também inibem o crescimento de célula de tumor, e são usadas para tratar uma variedade de cânceres (veja, por exemplo, Antineoplastic effects of mammalian target of rapamicinae inhibitors. Salvadori M. World J Transplant. 2012 Oct 24;2(5):74-83; Current and Future Treatment Strategies for Patients com Advanced Hepatocellular Carcinoma: Role of mTOR inhibition. Finn RS. Liver Cancer. 2012 Nov;1(3-4):247-256; Emerging pathways in Hepatocellular Carcinoma. Moeini A, Cornellà H, Villanueva A. Liver Cancer. 2012 Sep;1(2):83-93; Targeted cancer therapy - are days of systemic chemotherapy numbered? Joo WD, Visintin I, Mor G. Maturitas. 2013 Sep 20.; Role of natural and adaptive immunity in renal cell carcinoma response to VEGFR-TKIs and mTOR inhibitor. Santoni M, Berardi R, Amantini C, Burattini L, Santini D, Santoni G, Cascinu S. Int J Cancer. 2 de Outrubor de 2013).

[00685] A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na constatação surpreendente que doses de inibidores de mTOR bem abaixo daquelas usadas nos cenários clínicos atuais têm um efeito superior em aumentar uma resposta imune em um indivíduo e aumentar a relação de células T de PD-1 negativo/Células T de PD-1 positivo. Foi surpreendente que baixas doses de inibidores de mTOR, produzindo apenas inibição parcial de atividade de mTOR, foram capazes de efetivamente melhorar respostas imunes em indivíduos humanos e aumentar a relação de células T de PD-1 negativo/células T de PD-1 positivo.

[00686] Alternativamente, ou, além disso, sem desejar estar ligado por qualquer teoria, acredita-se que uma baixa dose de reforço imune de um inibidor de mTOR pode aumentar números de célula T natural, por exemplo, pelo menos transitoriamente, por exemplo, em comparação com um indivíduo não tratado. Alternativamente ou adicionalmente, novamente embora não desejando estar ligado à teoria, acredita-se que tratamento com um inibidor de mTOR após uma suficiente quantidade de tempo ou dosagem resulta em um ou mais dos seguintes:

[00687] um aumento na expressão de um ou mais dos seguintes marcadores: CD62Lelevado, CD127elevado, CD27+, e BCL2, por exemplo, sobre células T de memória, por exemplo, precursores de célula T de memória;

[00688] um decréscimo na expressão de KLRG1, por exemplo, sobre células T de memória, por exemplo, precursores de célula T de memória; e

[00689] um aumento no número de precursores de célula T de memória, por exemplo, células com qualquer uma ou combinação das seguintes características: CD62Lelevado aumentado, CD127elevado aumentado, CD27+ aumentado, KLRG1 diminuído, e BCL2 aumentado;

[00690] e em que qualquer das mudanças descritas acima ocorre, por exemplo, pelo menos transitoriamente, por exemplo, em comparação com um indivíduo não tratado (Araki, K e outro. (2009) Nature 460:108-112). Precursores de célula T de memória são células T de memória que são precoces no programa de diferenciação. Por exemplo, células T de memória têm uma ou mais das seguintes características: CD62Lelevado aumentado, CD127elevado aumentado, CD27+ aumentado, KLRG1 diminuído, e/ou BCL2 aumentado.

[00691] Em uma modalidade, a invenção se refere a uma composição, ou forma de dosagem, de um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor de mTOR alostérico, por exemplo, um rapálogo, rapamicina, ou RAD001, ou um inibidor de mTOR catalítico, que, quando administrado sobre um regime de dosagem selecionado, por exemplo, uma vez diariamente ou uma vez semanalmente, é associado com: um nível de inibição de mTOR que não é associado com completa ou significante supressão imune, porém é associado com realçamento da resposta imune.

[00692] Um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor de mTOR alostérico, por exemplo, um rapálogo, rapamicina, ou RAD001, ou um inibidor de mTOR catalítico, pode ser fornecido em uma formulação de liberação sustentada. Quaisquer das composições ou formas de dosagem unitárias descritas aqui podem ser fornecidas em uma formulação de liberação sustentada. Em algumas modalidades, uma formulação de liberação sustentada terá menor biodisponibilidade do que uma formulação de liberação imediata. Por exemplo, em modalidades, para atingir um efeito terapêutico similar de uma formulação de liberação imediata, uma formulação de liberação sustentada terá de cerca de 2 a cerca de 5, cerca de 2,5 a cerca de 3,5, ou cerca de 3 vezes a quantidade de inibidor fornecida na formulação de liberação imediata.

[00693] Em uma modalidade, formas de liberação imediata, por exemplo, de RAD001, tipicamente usadas para uma administração por semana, tendo 0,1 a 20, 0,5 a 10, 2,5 a 7,5, 3 a 6, ou cerca de 5, mg por forma de dosagem unitária, são fornecidas. Para administrações uma vez por semana, estas formulações de liberação imediata correspondem a formas de liberação prolongada, tendo, respectivamente, 0,3 a 60, 1,5 a 30, 7,5 a 22,5, 9 a 18, ou cerca de 15 mg de um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor de mTOR alostérico, por exemplo, rapamicina ou RAD001. Em modalidades, ambas as formas são administradas sobre uma base de uma vez/semana.

[00694] Em uma modalidade, formas de liberação imediata, por exemplo, de RAD001, tipicamente usadas para uma administração por dia, tendo 0,005 a 1,5, 0,01 a 1,5, 0,1 a 1,5, 0,2 a 1,5, 0,3 a 1,5, 0,4 a 1,5, 0,5 a 1,5, 0,6 a 1,5, 0,7 a 1,5, 0,8 a 1,5, 1,0 a 1,5, 0,3 a 0,6, ou cerca de 0,5 mg por forma de dosagem unitária, são fornecidas. Para administrações uma vez por dia, estas formas de liberação imediata correspondem às formas de liberação sustentada, tendo, respectivamente, 0,015 a 4,5, 0,03 a 4,5, 0,3 a 4,5, 0,6 a 4,5, 0,9 a 4,5, 1,2 a 4,5, 1,5 a 4,5, 1,8 a 4,5, 2,1 a 4,5, 2,4 a 4,5, 3,0 a 4,5, 0,9 a 1,8, ou cerca de 1,5 mg de um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor de mTOR alostérico, por exemplo, rapamicina ou RAD001. Para administrações uma vez por semana, estas formas de liberação imediata correspondem às formas de liberação sustentada, tendo, respectivamente, 0,1 a 30, 0,2 a 30, 2 a 30, 4 a 30, 6 a 30, 8 a 30, 10 a 30, 1,2 a 30, 14 a 30, 16 a 30, 20 a 30, 6 a 12, ou cerca de 10 mg de um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor de mTOR alostérico, por exemplo, rapamicina ou RAD001.

[00695] Em uma modalidade, formas de liberação imediata, por exemplo, de RAD001, tipicamente usadas para uma administração por dia, tendo 0,01 a 1,0 mg por forma de dosagem unitária, são fornecidas. Para administrações uma vez por dia, estas formas de liberação imediata correspondem às formas de liberação sustentada, tendo, respectivamente, 0,03 a 3 mg de um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor de mTOR alostérico, por exemplo, rapamicina ou RAD001. Para administrações uma vez por semana, estas formas de liberação imediata correspondem às formas de liberação sustentada, tendo, respectivamente, 0,2 a 20 mg de um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor de mTOR alostérico, por exemplo, rapamicina ou RAD001.

[00696] Em uma modalidade, formas de liberação imediata, por exemplo, de RAD001, tipicamente usadas para uma administração por semana, tendo 0,5 a 5,0 mg por forma de dosagem unitária, são fornecidas. Para administrações uma vez por semana, estas formas de liberação imediata correspondem às formas de liberação sustentada, tendo, respectivamente, 1,5 a 15 mg de um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor de mTOR alostérico, por exemplo, rapamicina ou RAD001.

[00697] Como descrito acima, um alvo da trilha de mTOR é o P70 S6 cinase. Desse modo, doses de inibidores de mTOR que são úteis nos métodos e composições descritos aqui são aquelas que são suficientes para ativar não mais do que 80% de inibição de atividade de P70 S6 cinase relativos à atividade do P70 S6 cinase na ausência de um inibidor de mTOR, por exemplo, como medido por um ensaio descrito aqui, por exemplo, o ensaio Boulay. Em um outro aspecto, a invenção fornece uma quantidade de um inibidor de mTOR suficiente para ativar não mais do que 38% de inibição de atividade de P70 S6 cinase relativos à atividade de P70 S6 cinase na ausência de um inibidor de mTOR.

[00698] Em um aspecto, a dose de inibidor de mTOR útil nos métodos e composições da invenção é suficiente para ativar, por exemplo, quando administrada a um indivíduo humano, 90 +/-5 % (isto é, 85-95%), 89+/-5 %, 88+/-5 %, 87+/-5 %, 86+/-5 %, 85+/-5 %, 84+/-5 %, 83+/-5 %, 82+/-5 %, 81+/-5 %, 80+/-5 %, 79+/-5 %, 78+/-5 %, 77+/5 %, 76+/-5 %, 75+/-5 %, 74+/-5 %, 73+/-5 %, 72 +/-5%, 71 +/-5%, 70 +/-5%, 69 +/-5%, 68 +/-5%, 67 +/-5%, 66 +/-5%, 65 +/-5%, 64 +/-5%, 63 +/-5%, 62 +/-5%, 61 +/-5%, 60 +/-5%, 59 +/-5%, 58 +/-5%, 57 +/-5%, 56 +/-5%, 55 +/-5%, 54 +/-5%, 54 +/-5%, 53 +/-5%, 52 +/-5%, 51 +/-5%, 50 +/-5%, 49 +/-5%, 48 +/-5%, 47 +/-5%, 46 +/-5%, 45 +/-5%, 44 +/-5%, 43 +/-5%, 42 +/-5%, 41 +/-5%, 40 +/-5%, 39 +/-5%, 38 +/-5%, 37 +/-5%, 36 +/-5%, 35 +/-5%, 34 +/-5%, 33 +/-5%, 32 +/-5%, 31 +/-5%, 30 +/-5%, 29 +/-5%, 28 +/-5%, 27 +/-5%, 26 +/-5%, 25 +/-5%, 24 +/-5%, 23 +/-5%, 22 +/-5%, 21 +/-5%, 20 +/-5%, 19 +/-5%, 18 +/-5%, 17 +/-5%, 16 +/-5%, 15 +/-5%, 14 +/-5%, 13 +/-5%, 12 +/-5%, 11 +/-5%, ou 10 +/-5%, de inibição de atividade de P70 S6 cinase, por exemplo, como medido por um ensaio descrito aqui, por exemplo, o ensaio Boulay.

[00699] A atividade de P70 S6 cinase em um indivíduo pode ser medida usando métodos conhecidos na técnica, tal como, por exemplo, de acordo com os métodos descritos na Patente dos Estados Unidos 7.727.950, por análise de imunotransferência de níveis de fosfoP70 S6K e/ou níveis de fosfoP70 S6 ou por ensaios de atividade cinase in vitro.

[00700] Como usado aqui, o termo "cerca de" em referência a uma dose de inibidor de mTOR se refere a até uma variabilidade de +/- 10% em uma quantidade de inibidor de mTOR, porém não pode incluir nenhuma variabilidade em torno da dose estabelecida.

[00701] Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos compreendendo administrar a um indivíduo um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor alostérico, por exemplo, RAD001, em uma dosagem dentro de um nível mínimo de alvo. Em algumas modalidades, o nível mínimo é significantemente menor do que níveis mínimos associados com regimes de dosagem usados em pacientes de transplante de órgão e câncer. Em uma modalidade, inibidor de mTOR, por exemplo, RAD001, ou rapamicina, é administrado para resultar em um nível mínimo que é menos do que ^, 1/4, 1/10, ou 1/20 do nível mínimo que resulta em imunossupressão ou um efeito anticâncer. Em uma modalidade, inibidor de mTOR, por exemplo, RAD001, ou rapamicina, é administrado para resultar em um nível mínimo que é menos do que ^, 1/4, 1/10, ou 1/20 do nível mínimo fornecido no suplemento de empacotamento aprovado pelo FDA para uso em imunossupressão ou indicações anticâncer.

[00702] Em uma modalidade, um método descrito aqui compreende administrar a um indivíduo um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor alostérico, por exemplo, RAD001, em uma dosagem que fornece um nível mínimo alvo de 0,1 a 10 ng/mL, 0,1 a 5 ng/mL, 0,1 a 3ng/mL, 0,1 a 2 ng/mL, ou 0,1 a 1 ng/mL.

[00703] Em uma modalidade, um método descrito aqui compreende administrar a um indivíduo um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor alostérico, por exemplo, RAD001, em uma dosagem que fornece um nível mínimo alvo de 0,2 a 10 ng/mL, 0,2 a 5 ng/mL, 0,2 a 3ng/mL, 0,2 a 2 ng/mL, ou 0,2 a 1 ng/mL.

[00704] Em uma modalidade, um método descrito aqui compreende administrar a um indivíduo um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor alostérico, por exemplo, RAD001, em uma dosagem que fornece um nível mínimo alvo de 0,3 a 10 ng/mL, 0,3 a 5 ng/mL, 0,3 a 3ng/mL, 0,3 a 2 ng/mL, ou 0,3 a 1 ng/mL.

[00705] Em uma modalidade, um método descrito aqui compreende administrar a um indivíduo um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor alostérico, por exemplo, RAD001, em uma dosagem que fornece um nível mínimo alvo de 0,4 a 10 ng/mL, 0,4 a 5 ng/mL, 0,4 a 3 ng/mL, 0,4 a 2 ng/mL, ou 0,4 a 1 ng/mL.

[00706] Em uma modalidade, um método descrito aqui compreende administrar a um indivíduo um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor alostérico, por exemplo, RAD001, em uma dosagem que fornece um nível mínimo alvo de 0,5 a 10 ng/mL, 0,5 a 5 ng/mL, 0,5 a 3 ng/mL, 0,5 a 2 ng/mL, ou 0,5 a 1 ng/mL.

[00707] Em uma modalidade, um método descrito aqui compreende administrar a um indivíduo um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor alostérico, por exemplo, RAD001, em uma dosagem que fornece um nível mínimo alvo de 1 a 10 ng/mL, 1 a 5 ng/mL, 1 a 3 ng/mL, ou 1 a 2 ng/mL.

[00708] Como usado aqui, o termo "nível mínimo"se refere a uma concentração de um fármaco em plasma pouco antes da próxima dose, ou a concentração de fármaco mínima entre duas doses.

[00709] Em algumas modalidades, um nível mínimo alvo de RAD001 é em uma faixa de entre cerca de 0,1 e 4,9 ng/mL. Em uma modalidade, o nível mínimo alvo é abaixo de 3 ng/mL, por exemplo, é entre 0,3 ou menos e 3 ng/mL. Em uma modalidade, o nível mínimo alvo é abaixo de 3 ng/mL, por exemplo, é entre 0,3 ou menos e 1 ng/mL.

[00710] Em um outro aspecto, a invenção pode utilizar um inibidor de mTOR diferente de RAD001 em uma quantidade que é associada com um nível mínimo alvo que é bioequivalente ao nível mínimo alvo específico para RAD001. Em uma modalidade, o nível mínimo alvo para um inibidor de mTOR diferente de RAD001, é um nível que fornece o mesmo nível de inibição de mTOR (por exemplo, como medido por um método descrito aqui, por exemplo, a inibição de P70 S6 cinase) assim como um nível mínimo de RAD001 descrito aqui.

Composições Farmacêuticas: Inibidores de mTOR

[00711] Em um aspecto, a presente invenção se refere a composições farmacêuticas compreendendo um inibidor de mTOR, por exemplo, um inibidor de mTOR como descrito aqui, formulado para uso em combinação com células CAR descritas aqui.

[00712] Em algumas modalidades, o inibidor de mTOR é formulado para administração em combinação com um adicional, por exemplo, como descrito aqui.

[00713] Em geral, os compostos da invenção serão administrados em quantidades terapeuticamente efetivas como descrito acima por meio de qualquer dos modos usuais e aceitáveis conhecidos na técnica, isoladamente ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos.

[00714] As formulações farmacêuticas podem ser preparadas usando procedimentos de mistura e dissolução convencionais. Por exemplo, a substância de fármaco de volume (por exemplo, um inibidor de mTOR ou forma estabilizada do composto (por exemplo, complexo com um derivado de ciclodextrina ou outro conhecido agente de complexação) é dissolvida em um solvente adequado na presença de um ou mais dos excipientes descritos aqui. O inibidor de mTOR é tipicamente formulado em formas de dosagem farmacêuticas para fornecer uma dosagem facilmente controlável do fármaco e para fornecer ao paciente um produto elegante e facilmente manuseável.

[00715] Compostos da invenção podem ser administrados como composições farmacêuticas por qualquer rotina convencional, em particular entericamente, por exemplo, oralmente, por exemplo, na forma de comprimidos ou cápsulas, ou parentericamente, por exemplo, na forma de suspensões ou soluções injetáveis, topicamente, por exemplo, na forma de loções, geis, unguentos ou cremes, ou em uma forma nasal ou de supositório. Onde um inibidor de mTOR é administrado em combinação com (simultaneamente com ou separadamente de) outro agente como descrito aqui, em um aspecto, ambos os componentes podem ser administrados pela mesma rotina (por exemplo, parentericamente). Alternativamente, outro agente pode ser administrado por uma diferente rotina relativa ao inibidor de mTOR. Por exemplo, um inibidor de mTOR pode ser administrado oralmente e o outro agente pode ser administrado parentericamente.

LIBERAÇÃO SUSTENTADA

[00716] Inibidores de mTOR, por exemplo, inibidores de mTOR alostéricos ou inibidores de mTOR catalíticos, descritos aqui podem ser fornecidos como formulações farmacêuticas em forma de formas de dosagem sólidas orais compreendendo um inibidor de mTOR descrito aqui, por exemplo, rapamicina ou RAD001, que satisfaça requerimentos de estabilidade de produto e/ou tenha propriedades farmacocinéticas favoráveis sobre os comprimidos de liberação imediata (IR), tais como concentrações de pico plasmático médias reduzidas, variabilidade inter- e intra-paciente reduzida em uma extensão de absorção de fármaco e na concentração de pico plasmático, relação de Cmax / Cmin reduzida e/ou efeitos alimentares reduzidos. Fornecidas formulações farmacêuticas podem permitir ajuste de dose mais preciso e/ou reduzir frequência de eventos adversos, desse modo, fornecendo tratamentos seguros para pacientes com um inibidor de mTOR descrito aqui, por exemplo, rapamicina ou RAD001.

[00717] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece formulações de liberação estendida estáveis de um inibidor de mTOR descrito aqui, por exemplo, rapamicina ou RAD001, que são sistemas multiparticulados e podem ter revestimentos e camadas funcionais.

[00718] O termo "formulação multiparticulada de liberação estendida" como usado aqui se refere a uma formulação que permite liberação de um inibidor de mTOR descrito aqui, por exemplo, rapamicina ou RAD001, durante um período de tempo estendido, por exemplo, durante pelo menos 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 horas. A formulação de liberação estendida pode conter matrizes e revestimentos preparados de excipientes especiais, por exemplo, como descrito aqui, que são formulados de uma maneira como para preparar o ingrediente ativo disponível durante um período de tempo estendido seguindo ingestão.

[00719] O termo "liberação estendida" pode ser indistintamente usado com os termos "liberação sustentada" (SR) ou "liberação prolongada". O termo "liberação estendida" se refere a uma formulação farmacêutica que não libera substância de fármaco ativa imediatamente após dosagem oral, porém, em uma estendida de acordo com a definição na monografia das famacopeias Ph. Eur. (7a Ed.) para comprimidos e cápsulas e capítulo geral USP <1151> para formas de dosagem farmacêuticas. O termo "liberação imediata" (IR) como usado aqui se refere a uma formulação farmacêutica que libera 85% da substância de fármaco ativa em menos do que 60 minutos de acordo com a definição de Guia para Industria: "Teste de Dissolução de Formas de Dosagem Orais Sólidas de Liberação imediata" (FDA CDER, 1997). Em algumas modalidades, o termo "liberação imediata" significa liberação de everolismus de comprimidos no tempo de 30 minutos, por exemplo, como medido no ensaio de dissolução descrito aqui.

[00720] Formulações de liberação estendida estáveis de um inibidor de mTOR descrito aqui, por exemplo, rapamicina ou RAD001, podem ser caracterizadas por um perfil de liberação in vitro usando ensaios conhecidos na técnica, tal como, um ensaio de dissolução como descrito aqui: um vaso de dissolução carregado com 900 mL de tampão de fosfato pH 6,8 contendo sulfato de dodecila de sódio 0,2% a 37°C e a dissolução é realizada usando um método de pá a 75 rpm de acordo com monografia de teste USP 711, e monografia de teste Ph.Eur. 2.9.3. respectivamente.

[00721] Em algumas modalidades, formulações de liberação estendida estáveis de um inibidor de mTOR descrito aqui, por exemplo, rapamicina ou RAD001, liberam o inibidor de mTOR no ensaio de liberação in vitro de acordo com as seguintes especificações de liberação: 0,5h: <45%, ou <40, por exemplo, <30% 1h: 20-80%, por exemplo, 30-60% 2h: >50%, ou >70%, por exemplo, >75% 3h: >60%, ou >65%, por exemplo, >85%, por exemplo, >90%.

[00722] Em algumas modalidades, formulações de liberação estendida estáveis de um inibidor de mTOR descrito aqui, por exemplo, rapamicina ou RAD001, liberam 50% do inibidor de mTOR não antes do que 45, 60, 75, 90, 105 min ou 120 min no ensaio de dissolução in vitro. Métodos de Liberação de Biopolímero

[00723] Em algumas modalidades, uma ou mais células expressando CAR como descrito aqui, opcionalmente em combinação com um inibidor de cinase, por exemplo, um inibidor de BTK tal como ibrutinibe, podem ser administradas ou liberadas ao indivíduo por meio de um andaime de bioplímero, por exemplo, um implante de biopolímero. Andaimes de biopolímero podem suportar ou realçar a liberação, expansão, e/ou dispersão das células expressando CAR descrito aqui. Um andaime de biopolímero compreende um polímero biocompatível (por exemplo, não substancialmente induz uma resposta imune ou inflamatória) e/ou biodegradável que pode ser de ocorrência natural ou sintético.

[00724] Exemplos de adequados biopolímeros incluem, porém não estão limitados à ágar, agarose, alginato, cimento de fosfato de alginato/cálcio (CPC), beta-galactosidase (ß-GAL), (1,2,3,4,6- pentaacetil a-D-galactose), celulose, quitina, quitosana, colágeno, elastina, gelatina, colágeno de ácido hialurônico, hidroxiapatite, poli(3- hidroxibutirato-co-3-hidróxi-hexanoato) (PHBHHx), poli(lactídeo), poli(caprolactona) (PCL), poli(lactídeo-co-glicolido) (PLG), óxido de polietileno (PEO), poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), óxido de polipropileno (PPO), polivinil álcool) (PVA), seda, proteína de soja, e proteína de soja isolada, sozinha ou em combinação com qualquer outra composição de polímero, em qualquer concentração e em qualquer relação. O biopolímero pode ser aumentado ou modificado com moléculas promovendo migração ou adesão, por exemplo, peptídeos miméticos de colágeno que se ligam ao receptor de colágeno de linfócitos, e/ou moléculas estimulatórias para realçar a liberação, expansão, ou função, por exemplo, atividade de anticâncer, das células a ser liberadas. O andaime de biopolímero pode ser um injetável, por exemplo, um gel ou uma composição semissólida, ou sólida.

[00725] Em algumas modalidades, células expressando CAR descrito aqui são semeadas sobre o andaime de biopolímero antes da liberação ao indivíduo. Em modalidades, o andaime de biopolímero também compreende um ou mais adicionais agentes terapêuticos descritos aqui (por exemplo, outra célula expressando CAR, um anticorpo, ou uma molécula pequena) ou agentes que realçam a atividade de uma célula expressando CAR, por exemplo, incorporados ou conjugados aos biopolímeros do andaime. Em modalidades, o andaime de biopolímero é injetado, por exemplo, intratumoralmente, ou cirurgicamente implantado no tumor ou em uma proximidade do tumor suficiente para mediar um efeito antitumor. Exemplos adicionais de composições de biopolímero e métodos para sua liberação são descritos em Stephan e outro, Nature Biotechnology, 2015, 33:97-101; e WO2014/110591.

Composições farmacêuticas e tratamentos

[00726] Composições farmacêuticas da presente invenção podem compreender uma célula expressando CAR, por exemplo, uma pluralidade de células expressando CAR, como descrito aqui, em combinação com um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitáveis. Tais composições podem compreender tampões, tais como, salina tamponada neutra, salina tamponada por fosfato e similares; carboidratos tais como glicose, manose, sacarose ou dextranos, manitol; proteínas; polipeptídeos ou aminoácidos, tal como, glicina; antioxidantes; agentes quelantes, tal como, EDTA ou glutationa; adjuvantes (por exemplo, hidróxido de alumínio); e conservantes. Composições da presente invenção são, em um aspecto, formuladas para administração intravenosa.

[00727] Composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas de uma maneira apropriada à doença a ser tratada (ou prevenida). A quantidade e frequência de administração serão determinadas por tais fatores como a condição do paciente, e o tipo e a gravidade da doença do paciente, apesar das dosagens apropriadas poderem ser determinadas por testes clínicos.

[00728] Em uma modalidade, a composição farmacêutica é substancialmente livre de, por exemplo, não existe nenhum nível detectável de um contaminante, por exemplo, selecionado do grupo que consiste em endotoxina, micoplasma, lentivírus competente de replicação (RCL), p24, ácido nucleico VSV-G, gag de HIV, contas revestidas de anti-CD3/anti-CD28 residual, anticorpos de camundongo, soro humano coagulado, albumina de soro bovino, soro bovino, componentes de meio de cultura, célula de empacotamento de vetor ou componentes de plasmídeo, uma bactéria e um fungo. Em uma modalidade, a bactéria é pelo menos uma selecionada do grupo que consiste em Alcaligenes faecalis, Candida albicans, Escherichia coli, Haemophilus influenza, Neisseria meningitides, Pseudomonas aeruginosa, Staphilococcus aureus, Streptococcus pneumonia, e Streptococcus pyogenes grupo A.

[00729] Quando "uma quantidade imunologicamente efetiva,""uma quantidade efetiva de antitumor,""uma quantidade efetiva de inibição de tumor," ou "quantidade terapêutica"for indicada, a quantidade precisa das composições da presente invenção a ser administrada pode ser determinada por um médico com consideração de diferenças individuais em idade, peso, o tamanho de tumor, extensão de infecção ou metástase, e condição do paciente (indivíduo). Pode geralmente ser estabelecido que uma composição farmacêutica compreendendo as células T descritas aqui pode ser administrada em uma dosagem de 104 a 109células/kg de peso corporal, em alguns casos 105 a 106células/kg de peso corporal, incluindo todos os valores de número inteiro dentro daquelas faixas. As composições de célula T também podem ser administradas múltiplas vezes nestas dosagens. As células podem ser administradas usando técnicas de infusão que são comumente conhecidas em imunoterapia (veja, por exemplo, Rosenberg e outro, New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988).

[00730] Em certos aspectos, pode ser desejado administrar células T ativadas a um indivíduo e em seguida, subsequentemente, novamente retira sangue (ou ter uma aférese realizada), ativar células T dele de acordo com a presente invenção, e reinfundir o paciente com estas células T ativadas e expandidas. Este processo pode ser realizado múltiplas vezes a cada poucas semanas. Em certos aspectos, as células T podem ser ativadas de exames de sangue de 10cc a 400cc. Em certos aspectos, as células T são ativadas de exames de sangue de 20cc, 30cc, 40cc, 50cc, 60cc, 70cc, 80cc, 90cc, ou 100cc.

[00731] A administração das composições individuais pode ser realizada em qualquer maneira conveniente, incluindo por inalação por aerosol, injeção, ingestão, transfusão, implantação ou transplante. As composições descritas aqui podem ser administradas a um paciente trans-arterialmente, subcutaneamente, intradermicamente, intratumoralmente, intranodalmente, intramedularmente, intramuscularmente, por injeção intravenosa (i.v.), ou intraperitonealmente. Em um aspecto, as composições de célula T da presente invenção são administradas a um paciente por injeção intradérmica ou subcutânea. Em um aspecto, as composições de célula T da presente invenção são administradas por injeção i.v. As composições de células T podem ser injetadas diretamente em um tumor, linfonodo, ou sítio de infecção.

[00732] Em um aspecto exemplar particular, os indivíduos podem ser submetidos à leucaférese, em que leucócitos são coletados, enriquecidos ou depauperados ex vivo para selecionar e/ou isolar as células de interesse, por exemplo, células T. Estes isolados de célula T podem ser expandidos por métodos conhecidos na técnica e tratados de modo que um ou mais construtos de CAR da invenção podem ser introduzidas, desse modo criando um célula T de CAR da invenção. Indivíduos em necessidade dos mesmos podem subsequentemente ser submetidos a tratamento padrão com quimioterapia em dose elevada seguida por transplante de célula-tronco de sangue periférico. Em certos aspectos, após ou concorrente com o transplante, os indivíduos recebem uma infusão das células expandidas T de CAR da presente invenção. Em um aspecto adicional, células expandidas são administrados antes ou depois da cirurgia.

[00733] A dosagem dos tratamentos acima a ser administrada a um paciente variará com a natureza precisa da condição que está sendo tratadae do receptor do tratamento. A escala de dosagens para administração humana pode ser realizada de acordo com as práticas aceitas na técnica. A dose quanto ao CAMPATH, por exemplo, geralmente será na faixa de 1 a cerca de 100 mg para um paciente adulto, geralmente administrada diariamente durante um período entre 1 e 30 dias. A dose diariamente preferida é de 1 a 10 mg por dia, embora em alguns casos doses maiores de até 40 mg por dia possam ser usadas (descrito no Patente dos Estados Unidos n° 6.120.766).

[00734] Em uma modalidade, o CAR é introduzid em células T, por exemplo, usando transcrição in vitro, e o indivíduo (por exemplo, humano) recebe uma administração inicial de células T CAR da invenção, e uma ou mais administrações subsequentes das células T CAR da invenção, em que uma ou mais administrações subsequentes são administradas em menos do que 15 dias, por exemplo, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, ou 2 dias após a prévia administração. Em uma modalidade, mais do que uma administração das células T CAR da invenção são administradas ao indivíduo (por exemplo, humano) por semana, por exemplo, 2, 3, ou 4 administrações das células T CAR da invenção são administrados por semana. Em uma modalidade, o indivíduo (por exemplo, indivíduo humano) recebe mais do que uma administração das células T CAR por semana (por exemplo, 2, 3 ou 4 administrações por semana) (também referida aqui como um ciclo), seguida por uma semana sem nenhuma administração de células T CAR, e em seguida uma ou mais administrações adicionais das células T CAR (por exemplo, mais do que uma administração das células T CAR por semana) é administrada ao indivíduo. Em outra modalidade, o indivíduo (por exemplo, indivíduo humano) recebe mais do que um ciclo de células CAR T, e o tempo entre cada ciclo é menos do que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, ou 3 dias. Em uma modalidade, o células T CAR são administrados em dias alternados durante 3 administrações por semana. Em uma modalidade, as células T CAR da invenção são administradas durante pelo menos duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais semanas.

[00735] Em um aspecto, células expressando CAR são geradas usando vetores virais lentivirais, tal como lentivírus. Células, por exemplo, CARTs geradas de tal modo terão expressão de CAR estável.

[00736] Em um aspecto, células expressando CAR, por exemplo, CARTs, são geradas usando um vetor viral tal como um vetor gamarretroviral, por exemplo, um vetor gamarretroviral descrito aqui. CARTs geradas usando estes vetores podem ter expressão de CAR.

[00737] Em um aspecto, CARTs transitoriamente expressam vetores de CAR durante 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 dias após transdução. Expressão transitória de CARs pode ser realizada por liberação de vetor de CAR de RNA. Em um aspecto, o RNA de CAR é transduzido na célula T por eletroporação.

[00738] Um problema potencial que pode surgir em pacientes que estão sendo tratados usando células T transitoriamente expressando CAR (particularmente com scFv de murino transportando CARTs) é anafilaxia após múltiplos tratamentos.

[00739] Sem estar ligado a esta teoria, acredita-se que tal resposta anafilática seria causada por um paciente desenvolmendo resposta a ani-CAR humoral, isto é, anticorpos anti-CAR tendo um isótipo anti-IgE. Acredita-se que um anticorpodo paciente produzindo células que sofrem uma mudança de classe de isótipo IgG (que não causa profilaxia) para isótipo IgE quando existe um intervalo de dez a quatorze dias em exposição ao antígeno.

[00740] Se um paciente está em risco elevado de gerar uma resposta ao anticorpo anti-CAR durante o curso de terapia transitória com CAR (tal como aquelas geradas por transduções de RNA), intervalos de infusão de CART não devem demorar não mais do que dez a quatorze dias.

EXEMPLOS

[00741] A invenção é também descrita em detalhes por referência aos seguintes exemplos experimentais. Estes exemplos são fornecidos para propósitos de ilustração apenas, e não se destinam a ser limitantes, a menos que de outro modo especificado. Desse modo, a invenção não deve de modo algum ser construída como sendo limitada aos seguintes exemplos, porém em vez disso, deve ser construída para abranger quaisquer e todas as variações que se tornam evidentes como um resultado do ensinamento fornecido aqui.

[00742] Sem outra descrição, acredita-se que alguém versado na técnica possa, usando a descrição precedente e os seguintes exemplos ilustrativos, preparar e utilizar os compostos da presente invenção e praticar osmétodos reivindicados. Os seguintes exemplos de trabalho especificamente pontuam os vários aspectos da presente invenção, e não devem ser construídos como limitantes de modo algum ao restante da invenção.

Exemplo 1: Humanização de Anticorpo Anti-CD19 de Murino

[00743] Uma molécula de anticorpo de CD19 pode ser, por exemplo, uma molécula de anticorpo (por exemplo, uma molécula de anticorpo anti-CD19 humanizado) descrita no WO2014/153270, que é incorporada aqui por referência em sua totalidade. Humanização de anticorpo de CD19 de murino é desejada para o ajuste clínico, onde os resíduos específicos de camundongo podem induzir uma resposta de antígeno anticamundongo humano (HAMA) em pacientes que recebem tratamento com CART19, isto é, tratamento com células T transduzidas com a construção de CAR19. Sequências de VH e VL de anticorpo de CD19 de murino derivado de hibridoma foram extraídas de literatura publicada (Nicholson et al, 1997, supra). Humanização foi realizada enxertando regiões de CDR de anticorpo de CD19 de murino em estruturas aceptoras de linhagem germinativa humana VH4_4-59 e VK3_L25 (base de dados vBASE). Além das regiões de CDR, cinco resíduos estruturais, isto é, VH #71, #73, #78 e VL #71 #87, acreditados suportar a integridade estrutural das regiões de CDR foram, mantidos da sequência de murino. Além disso, os elementos J humanos, JH4 e JK2, foram usados para cadeia pesada e leve, respetivamente. As sequências de aminoácido do anticorpo humanizado foram designadas FMC63_VL_hz e FMC63_VH_hz1, respectivamente, e são mostradas abaixo na tabela 1. A numeração de resíduo segue Kabat (Kabat E.A. et al, 1991, supra). Para definições de CDR, tanto Kabat bem como Chotia et al, 1987 supra) foram usados. Os resíduos provenientes de CD19 de camundongo sçao mostrados em negrito/itálico. As posições #60/61/62 encaixotadas indicam o sítio de modificação pós- translacional (PTM) potencial em CDR H2, também chamado HCDR2.

[00744] Tabela 1: Sequências de aminoácido de domínios variáveis de CD19 humanizado (SEQ ID NOs:114-117, respectivamente, na ordem de apresentação).

[00745] Estas IgGs de CD19 humanizadas foram usadas para gerar os scFvs solúveis para para expressão e scFvs para as construtos de CD19 de CART totais (veja os Exemplos abaixo). De interesse foi que durante a humanização, a posição 62 na região de CDRH2 preferiu ser um resíduo de serina em vez da alanina presente no CDRH2 de murino. A sequência de murino não tem uma modificação pós-translacional (PTM), e tem asparagina-serina-alanina nas posições 60/61/62, respectivamente em CDRH2. Isto gera motivos de PTM potenciais (indicados como o sítio encaixotado em CDRH2) durante o curso de humanização. Foi testado se o sítio de PTM gerado durante o processo de humanização era um realmente um PTM "real" ou meramente um sítio teórico. Foi hipotetizado que o motivo de aminoácido, asparagina seguido por serina (NS) podem ser suscetíveis a desaminação pós- translacional, porém algumas vezes isso não foi facilmente perceptível. Foi também hipotetizado que a asparagina seguida por qualquer aminoácido, exceto prolina, e em seguida por serina (NxS, x#P) pode ser suscetível à N-glicolisação pós-translacional. Para testar esta hipótese, duas variantes de IgG, foram geradas em que a asparagina na posição 60 (conhecida ser um sítio de glicosilação) foi mutada por serina, ou glutamina e designada FMC63_VH_hz2 (N60S) e FMC63_VH_hz2 (N60Q), respectivamente. Estes construtos foram gerados a fim de eliminar o sítio de modificação pós-translacional potencial (PTM) e testar quanto à atividade mantida (veja o Exemplo 2, abaixo).

Clonagem:

[00746] Sequências de DNA codificando domínios de VL e VH humanizados e de camungo foram obtidas, e os códons para os construtos foram otimizados para expressão em células de Homo sapiens.

[00747] Sequências codificando domínios de VL e VH foram subclonados dos vetores de clonagem em vetores de expressão adequados para secreção em células mamíferas. As cadeias leves e pesadas foram clonadas em vetores de expressão individuais para permitir a cotransfecção. Elementos do vetor de expressão incluem um promotor (promotor realçador de Citomegalovírus (CMV)), um sinal de sequência para facilitar a secreção, um sinal de poliadenilação e terminador de transcrição (gene de Hormônio de Crescimento Bovino (BGH)), um elemento permitindo replicação epissômica e replicação em procariotas (por exemplo, de origem SV40 e ColE1 ou outros conhecidos na técnica) e elementos para permitir secreção (gene resistente à ampicilina e marcador de zeocina).

Expressão:

[00748] Candidatos de IgG quiméricos e humanizados foram expressos em células HEK293F mamíferas em uma escala de 1mL. Os sobrenadantes depurados foram usados para estudos de ligação de FACS. Mais precisamente, células HEK293F foram diluídas para 5E5 células/mL em meio FreeStyle suplementado com Pen/Strep e 1 mL transferido em uma placa de 24 cavidades fundas de base redonda. 0,5 µg de plasmídeos de expressão de mamífero de cadeia leve e 0,5 µg de cadeia pesada foram diluídos no mesmo meio juntamente com 4 µl de FuGENE HD (Roche REF 04709705001). Após 15 minutos de incubação em RT, mistura de DNA/Fugene foi adicionada gota a gota às células e colocada em um incubador de CO2 a 5% a 250 rpm, 37°C durante cinco dias. Os sobrenadantes foram em seguida separados das células po centrifugação. Para medir o teor de IgG, alíquotas de 200 µL foram colocadas nas cavidades de placas de microtítulo de 96 cavidades. Todas as amostras e padrões foram medidos em duplicata usando Protein A Dip e biossensores de leitura (Fortebio Cat No 185010). A placa foi colocada em um instrumento Octet (ForteBio) e deixada equilibrar para 27° C na câmara termostatizada. Os dados foram processados automaticamente usando software Octet User versão 3.0 e concentração determinada por comparação a uma curva de padrão de IgG.

Análise de Ligação por FACS:

[00749] Anticorpos humanizados e quiméricos foram avaliados com um ensaio de ligação de citometria de fluxo usando linhagem celular 300.19-hsCD19FL. Esta linhagem celular foi gerada transfectando a linhagem de célula preB de camundongo 300.19 com um vetor (hCD19 FL/pEF4-myc-HisA) codificando a sequência codificando CD19 de tamanho natural e promotor natural bem como um gene resistente à Zeocina. Em síntese, 300.19 células foram eletroporadas com o plasmídeo linearizado e em seguida células expressando altos níveis de hsCD19 foram identificados usando um Ab humano anti-CD19 conjugado a APC (clone HIB19 de BD 555415) e subsequentemente classificados usando um citômetro de fluxo FACS Aria. As células hsCD19+ classificadas foram cultivadas e confirmadas expressar estavelmente níveis elevados de hsCD19.

[00750] O ensaio de ligação pode se realizado diretamente com os meios de cultura sem soro contendo uma IgG expressa. Todas as IgGs avaliadas foram normalizadas para a mesma concentração (85 nM), antes de serem diluídas por uma diluição serial de até 3 vezes 1,4pM. Em seguida, em uma placa de 96 cavidades, alíquotas de 5x105 células/células foram incubadas durante 30 minutos a 4°C com IgGs diluídas. As células foram lavadas duas vezes com tampão de FACS (0,5% de BSA em PBS) antes da adição do anticorpo de detecção, um iGG anti-hu de cabra conjugada a APC, fragmento de Fc específico (Dianova #109-136-098), diluído 1:1000 em tampão de FACS.Células foram incubadas durante mais 30 minutos a 4°C, em seguida lavadas duas vezes em tampão de FACS e ensaiadas usando FACS Calibur (BD Bioscience). Plotagem de curvas de ligação (média de intensidade de fluorescência versus concentração de IgG) e determinação EC50 foram realizadas com GraphPad PrismTM 3.0 software com análise de regressão não linear, resposta à dose sigmoidal (declividade variável).

[00751] As análises FACS mostram que ligação aparente quanto a todas as igGs avaliadas pode variar amplamente, com alguns construtos exibindo uma mudança de 5 a 10 vezes em EC50 como uma IgG versus um scFv. Com base nos valores EC50, candidatos de chumbo são escolhidos que têm uma afinidade de ligação dentro de um fator de 2 ou melhor em comparação com a referência quimérica.

Exemplo 2: Caracterização de fragmentos de scFv solúveis em anti-CD19 derivados de anticorpos de IgG de CD19 humanizados

[00752] Fragmentos de scFv solúves foram gerados das IgGs de CD19 humanizadas descrita no Exemplo 1 usando técnicas debiologia molecular padrões. Estes scFvs solúveis foram usados em estudos de caracterização para examinar a estabilidade, expressão de superfície celular, e propriedades de ligação dos scFvs. Adicionalmente, os experimentos foram também conduzidos para investigar o impacto do PTM potencial durante o processo de humanização.

Expressão e Purificação de scFv

[00753] Para transfecção de cada construção de scFv, em torno de 3e8 células 293F foram transfectadas com 100 µg de plasmídeo usando PEI como o reagente de transfecção na relação de 3:1 (PEI:DNA). As células foram cultivadas em 100 mL de meios de expressão de EXPi293 (Invitrogen) em um frasco agitador a 37°C, 125 rpm, CO2a 8%. A cultura foi colhida após seis dias e usada para purificação de proteína.

[00754] Células 293F foram colhidas por centrifugação a 3500g durante 20 minutos. O sobrenadante foi colhido e filtrado através de VacuCap90 PF Filter Unit (w/0,8/0,2µm Super Membrane, PALL). Cerca de 400 µl de 400ul de contas de Ni-NTA agarose (Qiagen) foram adicionados ao sobrenadante. A mistura foi girada e incubada durante 4 horas a 4°C. Ela foi carregada em uma coluna de purificação e lavada com tampão de lavagem com Histidina a 20 mM. A proteína foi eluída com 500µl de tampão de eluição com Histidina a 300 mM. As amostras foram dialisadas contra tampão de PBS a 4C durante a noite. Amostras de proteína foram quantificadas usando nanodrop 2000c.

Conformação de scFv e Análise de estabilidade coloidal

[00755] A termostabilidade do scFv foi determinada por DSF : mistura de 10-20 µl de amostra de proteína com a tintura Sypro Orange (Invitrogen Cat#S6650) de uma diluição final a 1:1000, em um volume total de 25 µl em PBS, ciclo BioRad CFX1000 (25 C durante 2 minutos, em seguida incremento 0.5° C durante 30 segundos, 25 a 95° C).

[00756] Para experimento de SEC analítico, cerca de 15 a 20µg de amostra de proteína de scFv em 20µl de PBS foram injetados em TSKgel Super SW2000 em taxa de fluxo de 0,3mL/minutos em um Agilent 1100 series.

EC50 por Ligação de FACS

[00757] Linhagens de célula de camundongo 300.CD19 foram cultivadas em RPMI 1640 com 0,5 mg/mL de Zeocina. Em torno de 5e5 células/por cavidade foram transferidas para a placa de 96 cavidades BD Falcon 96. As células foram centrifugadas a 900 rpm (centrífuga Sorval Legend XT) durante 3 minutos. Os sobrenadantes foram removidos. Amostras de proteína de scFv Anti-CD19 foram diluídas em DPBS com 5% de FBS. As amostras foram adicionadas nas cavidades, bem misturadas com as células e incubadas durante 1 hora. As células foram lavadas duas vezes no DPBS com 5% de FBS. As células foram incubadas com antipoli His PE (R&D) durante 1 hora, lavadas duas vezes antes de análise de FACS (LSRII de BD Biosciences).

Análise Cinética por Proteon

[00758] As cinéticas foram determinadas usando Bio-Rad Proteon. A imobilização foi realizada usando acoplamento de amina padrão em um chip de sensor GLC. As amostras de scFv foram diluídas para 0,03 mg/mL em acetato pH 4,5 e aplicadas ao chip em uma taxa de fluxo de 30 µL/minuto durante 300 segundos. O ligante de CD19 foi em seguida diluído serialmente em PBS-Tween e injetado em uma taxa de fluxo de 50 µL/min durante 120 segundos com um tempo de dissociação de 480 segundos. A superfície do chip foi regenerada com glicina pH 2,5. Os dados foram ajustados usando um modelo 1:1 Langmuir.

Expressão de superfície de CART19 e manchamento por FACS

[00759] Células de suspensão de HEK293F transitoriamente transfectadas com diferentes CARTs anti-hCD19 foram colhidas 2 dias após a transfecção. Cerca de 1e6 células foram colocadas em cada cavidade de uma placa de 96 cavidades em forma de V (Greiner Bioona, Alemanha) e lavadas três vezes com 0,2 mL de tampão de FACS (1XPBS contendo 4% de albumina de soro bovino (BSA) (fração de BSA V, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). As células foram ressuspensas em 0,2 mL do tampão de FCAS com 0,2 µg de proteína L biotinilada (GenScript, Piscataway, NJ) ou 100 nM de hCD19(AA 1-291)-hIgG1 Fc (Gerada em NIBRI) e incubadas a 4°C durante 30 minutos. As células foram em seguida lavadas com 0,2 mL de tampão de FACS três vezes, e incubadas com 1 µl de estreptavidina Alexa Fluor 488 (Life Technologies, Grand Island, NY) em 0,2 mL de tampão de FACS para amostras com proteína L, ou 2 µl de anti-human Fcx anti-humano de PE (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) em 0,2 mL de tampão de FACS para amostras com Fc de hCD19-hIgG1 durante 30 minutos a 4°C no escuro. Após lavagem com 0,2 mL de tampão de FACS três vezes, células foram analisadas em uma máquina LSRII (BD Biosciences, San Jose, CA) usando o software FACSDiva (BD Biosciences, San Jose, CA). Manchamento de imunofluorescência foi analisado como o log relativo de fluorescência de células, e a porcentagem das células positivas de Alexa Fluor 488 ou positivas de PE foi medida.

Análise de PMTs potenciais gerados durante o Processo de Humanização

[00760] De interesse foi que durante a humanização, a posição 62 na região CDRH2 prefere ser um resíduo de serina, em vez da alanina presente no CDRH2 de murino como descrito no Exemplo 1. Foi testado se o sítio de PTM gerado durante o processo de humanização era de fato um PTM "real" ou meramente um sítio teórico. Duas variantes de IgG foram geradas em que a asparagina na posição 60 (conhecida ser um sítio de glicosilação) foi mutada por serina, ou glutamina e designada FMC63_VH_hz2 (N60S) e FMC63_VH_hz2 (N60Q), respectivamente. Estes construtos foram gerados a fim de eliminar o sítio de modificação pós-translacional potencial (PTM) e testar a atividade mantida.

Resultados

[00761] O scFv anti-CD19 humanizado e scFv de camundongo foram expressos em células 293F e purificados através de rótulo His. A expressão e produção de scFv totalmente humanizado foram muito maiores do que o scFv de camundongo original (dados não mostrados).

[00762] Para confirmar a identidade e avaliar a integridade, os construtos de scFv são analisados com ou sem incubação com N- glicanase F (PNGaseF) seguido tanto por cromatografia líquida de desempenho elevado-espectrometria de massa (HPLC-MS) (Veja, Figura 3) e SDS-PAGE (dados não mostrados). PNGaseF é uma enzima específica para a remoção de estruturas de glicano ligado por N da sequência de consenso N-X-S/T/C onde X é qualquer aminoácido, exceto prolina. Resumidamente, as amostras são diluídas em água para 0,1 µg/µL e deixadas sem tratamento ou incubadas com PNGaseF em uma relação de 1:2 (peso/peso) PNGaseF: scFV durante 3 horas a 37°C.

[00763] Análise de SDS-PAGE é realizada usando um gel NuPAGE 4-12% de Bis-Tris de Novex. Aproximadamente 2 µg de scFV são carregados em cada coluna e a eletroforese é conduzida a 200 V constante durante 40 minutos. Após a eletroforese, o gel é manchado usando manchamento por PhastGel Blue R 250 (Amersham Pharmacia) e a mancha retirada com ácido acético a 10%, metanol a 30%.

[00764] Análise de HPLC-MS é realizada no sistema Water’s Acquity UPLC acoplado a um espectômetro de massa Xevo-Tof. Aproximadamente 1 µg de cada amostra é carregadas em uma coluna R 1/10 2,1 x 100 mm 10 µm POROS (Applied Biosciences) ajustada para 60°C em uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min. As fases móveis são compostas de ácido fórmico a 0,1% (A) e ácido fórmico a 0,1%, isopropanol a 75%, acetonitrila a 25% (B). A proteína é eluída da coluna com um gradiente de fase reversa de 25% a 90% B em 12 minutos. A aquisição é realizada usando varredura positiva por eletrovaporização na faixa m/z de 600-4000 Da com uma rampa de voltagem de cone fonte 20-50V. Os espectros resultantes são deconvoluídos usando MaxEnt1.

[00765] O sítio de glicosilação foi introduzido durante o processo de humanização. As variantes de não PTM (VH: N60S ou N60Q) ficaram sem esta forma adicional. A construção foi a única com um sítio de consenso de glicosilação ligada por N em CDR2 de HC. A partir da análise de SDS-PAGE, as amostras não tratadas migraram como faixas consistentes com os pesos moleculares aproximados das consequências para todos os construtos, exceto 103101-WT (S/N) para o qual dupleto é o bservado. Esta construção é a única com um sítio de consenso de glicosilação ligada por N em H-CDR2. Quando tratada com PNGaseF, a faixa de peso molecular elevado do dupleto não está mais presente, sugerindo ocupância parcial do sítio. Similarmente, os pesos moleculares observados dos espectros de massa deconvoluídos são consistentes com aqueles preditos das sequências de aminoácido. Entretanto, ao mesmo tempo em que os outros construtos demonstraram uma espécie molecular primária simples, 103101-WT (S/N) também teve uma população 1217 Daltons maior do que aquela predita da sequência que não está mais presente após o tratamento com PNGaseF. Isto é consistente com a presença de uma glicoforma ligada por N predominante simples, provavelmente oligomanose 5 com base em massa. A presença da forma glicosilada foi confirmada pela análise de MS como mostrado na figura 3.

[00766] A estabilidade de conformação foi medida por Fluorimetria de Varredura Diferencial (DSF). Como mostrado na figura 4, a Tm de scFv de camundongo foi de 57°C, ao mesmo tempo em que as variantes humanas mostraram Tm mais elevada em torno de 70°C. A Tm para o scFv totalmente humanizado é muito melhor do que scFv de murano, claramente mostrando que o scFv totalmente humanizado é mais estável do que o scFv de murino. Esta estabilidade provavelmente irá transladar para a construção de CART19, provavelmente induzindo à propriedades terapêuticas melhoradas.

[00767] A atividade do scFv purificado foi medido por ligação às células de expressão de hCD19 bem como por ligação ao antígeno de hCD19 usando método de detecção com base em SPR. Linhagem de célula de camundongo 300 foi usada para determinar a ligação de scFvs. O EC50 de scFv de camundongo quanto ao hCD19 foi em torno de 06 a 1,6 nM. As variantes humanizadas mostraram EC50 da mesma faixa na faixas de EC50s baixa ou sub nM.

Exemplo 3: Construtos de CAR de CD19

[00768] ScFv a ser usado na construção de CAR final foi derivado da IgG humanizada descrita no Exemplo 1. A ordem em que os domínios de VL e VH aparecem no scFv foi variada (isto é, orientação VL-VH, ou VH-VL), e onde três ou quatro cópias da subunidade "G4S" (SEQ ID NO:18), em que cada subunidade compreende a sequência GGGGS (SEQ ID NO:18) (por exemplo, (G4S)3 (SEQ ID NO:107) ou (G4S)4(SEQ ID NO:106)), conectam os domínios variáveis para criar a totalidade do domínio de scFv, como mostrado na tabela 2. Tabela 2. Construtos de scFv de CD19 humanizada mostrando orientação VH e VL e tamanho de ligante ("3G4S"é descrita como SEQ ID NO: 107 e "4G4S"é descrita como SEQ ID NO: 106).

[00769] As sequências dos fragmentos de scFv humanizado (SEQ ID NOS: 1-12) são fornecidas abaixo na tabela 3. Construtos totais de CAR foram gerados usando SEQ ID NOs: 1-12 com sequências adicionais, SEQ ID NOs: 13-17, mostradas abaixo, para gerar construtos totais de CAR com SEQ ID NOs: 31-42.

[00770] • líder (sequência de aminoácido) (SEQ ID NO: 13) MALPVTALLLPLALLLHAARP

[00771] • líder (sequência de ácido nucleico) (SEQ ID NO: 54) ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCT GCTGCATGCCGCTAGACCC

[00772] • Articulação de CD8 (sequência de aminoácido) (SEQ ID NO: 14) TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD

[00773] • Articulação de CD8 (sequência de ácido nucleico) (SEQ ID NO: 55) ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCAT CGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCA GCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCT GTGAT

[00774] • Transmembrana de CD8 (sequência de aminoácido) (SEQ ID NO: 15) IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC

[00775] • transmembrana (sequência de ácido nucleico) (SEQ ID NO: 56) ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTC CTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC

[00776] • Domínio intracelular de 4-1BB (sequência de aminoácido) (SEQ ID NO: 16) KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

[00777] • Domínio Intracelular de 4-1BB (sequência de ácido nucleico) (SEQ ID NO: 60) AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTA TGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCC GATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG

[00778] • Domínio de CD3 zeta (sequência de aminoácido) (SEQ ID NO: 17) RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEM GGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLY QGLSTATKDTYDALHMQALPPR

[00779] • CD3 zeta (sequência de ácido nucleico) (SEQ ID NO: 101) AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCA GGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGA GGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGA TGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTAC AATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATT GGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCC TTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCC TTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC

[00780] • Domínio de CD3 zeta (sequência de aminoácido; Sequência de Referência de NCBI NM_000734.3) (SEQ ID NO:43) RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEM GGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLY QGLSTATKDTYDALHMQALPPR

[00781] • CD3 zeta (sequência de ácido nucleico; Sequência de Referência de NCBI NM_000734.3); (SEQ ID NO:44) AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCA GGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGA GGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGA TGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTAC AATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATT GGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCC TTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCC TTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC

[00782] • Articulação de IgG4 (sequência de aminoácido) (SEQ ID NO:102) ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM

[00783] • Articulação de IgG4 (sequência de nucleotídeo) (SEQ ID NO:103) GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGA GTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCA AGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTG GTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTG GTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCC GGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTG ACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTG TAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCAT CAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACC CTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCT GACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGG AGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACC CCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCG GCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTA GCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAG AAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG

[00784] Todos estes clones continham uma mudança de resíduo de Q/K no domínio de sinal do domínio coestimulatório derivado de 4-1BB. Tabela 3: Construtos de CAR de CD19 Humanizados

[00785] Tabela 7: Construtos de CAR de CD19 de murino

[00786] As consequências de sequências de CDR humanizado dos domínios de scFv são mostradas na tabela 4 para os domínios variáveis de cadeia pesada e na tabela 5 para os domínios variáveis de cadeia leve. "ID" significa a respective SEQ ID NO para cada CDR. Tabela 4. CDRs de Domínio Variável de Cadeia Pesada (Kabat)

[00787] Tabela 5. CDRs de Domínio Variável de Cadeia Leve

[00788] Tabela 6 é uma identificação chave correlacionando os nomes numéricos de construtos de à orientação específica da cadeias leve e pesada do scFv, o número de unidades ligadoras (isto é, (G4S)3 (SEQ ID NO:107) ou (G4S)4 (SEQ ID NO:106)), separando as cadeias pesadas e leves, e distinguindo as sequências de aminoácido na CDR2 de cadeia pesada. Tabela 6: Designações de CAR de CD19.

[00789] Os fragmentos de scFv de CAR foram em seguida clonados em vetores lentivirais para criar uma construção de CAR de tamanho natural em uma estrutura de codificação simples, e usando o promotor de EF1 alfa para expressão (SEQ ID NO: 100). Promotor de EF1 alfa CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCC CACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCG GTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTC GTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTA TATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTT GCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCC TGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTC CACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGG AAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTT CGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCG CCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTT CGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACG CTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGC ACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCC CGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAG CGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCG GCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGC CCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGC GGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAAT GGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCAC ACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGA CTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCT CGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTT ATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTA GGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTT TGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAA AGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA (SEQ ID NO: 100).

[00790] Análise dos construtos de CAR humanizado foi conduzida como descrito no Exemplo 4.

Exemplo 4: Análise de construtos de CD19 humanizadas em CART

[00791] Para avaliar a viabilidade de alvejar CD19 por meio de uma tecnologia de CAR, os fragmentos variáveis de cadeia simples quanto a um anticorpo anti-CD19 são clonados em um vetor de expressão de Car lentiviral com a cadeia CD3zeta e a molécula coestimulatória 4-1BB em quarto configurações diferentes e a construçãoideal é selecionada com base na quanlidade da resposta de célula T efetora de células T transduzidas por CAR de CD19 ("CART19" ou "células T CART19") em resposta aos alvos de CD19+. Respostas de célula T efetoras incluem, porém não estão limitadas à expansão celular, proliferação, duplicação, produção de citocina e morte de célula alvo ou atvidade citolítica (desgranulação).

Materiais e Métodos Geração de Células T CART19 humanizado redicecionadas

[00792] Os vetores de transferência lentivirais de CART19 humanizado são usados para produzir o material genômico empacotado nas partículas lentivirais pseusotipadas de VSVg. DNA de vetor de transferência lentiviral é misturado com os três componentes de empacotamento de VSVg, gag/pol e rev em combinação com reagente de lipofectamina para transfectá-los juntamente nas células 293T. Após 24 e 48 horasr, Os meios são coletados, filtrados e concentrados por ultracentrifugação. A preparação viral resultante é armazenada a -80C. O número de unidades de transdução é determinado por titulação em células SupT1. Células T CART19 redirecionadas são produzidas por ativação de células T naivefrescas comprometendo-se com contas CD3x28 durante 24 horas e em seguida adicionando o número apropriado de unidades de de transdução para obter a porcentagem desejada de células transduzidas T. Estas células T modificadas são deixadas expandir até elas se tornarem descansadas e reduzirem de tamanho em cujo ponto elas são crioconservadas para análise posterior. Os números e tamanhos da célula são medidos usando um contador multisizer III. Antes da crioconservação, a porcentagem de células transduzidas (expressando o CART19 em uma superfície celular) e sua intensidade de fluorescência relativa daquela expressão são determinadas por análise citométrica de fluxo em um LSRII. A partir das plotagens de histogama, os níveis de expressão relativa dos CARs podem ser examinados comparando-se a porcentagem transduzida com sua intensidade fluorescente relativa.

Avaliação da atividade citolítica, capacidades de proliferação e secreção de citocina de células T redirecionadas a CART19 humanizadas.

[00793] Para avaliar as capacidades funcionais de células CAR19 T humanizadas para matar, proliferar e segregar as citocinas, as células são descongeladas e permitidas recuperar-se durante a noite. Além de CART19 humanizada, a CART19 de murino foi usada para propósitos comparativos enquanto SS1-BBz foi usado como CAR expresso não alvejante para efeito de célula CAR/T de base. O padrão-ouro de "controle" (GS) CART19 foi usado em todos os ensaios para comparar a variação de ensaio. Importantemente, GS CART19 são células produzidas em condições de fabricação de grau de pesquisa (isto é, grau não clínico) e incluem a adição de IL-2 à cultura de crescimento. Isto provavelmente impacta a viabilidade global e funcionalidade destas células e não deveria ser avaliado como uma comparação direta à produção de grau de pesquisa das outras populações de célula T transduzidas. O extermínio da célula T foi direcionado para K562, uma linhagem de célula de leucemia célula mielogenosa crônica expressando ou não expressando células CD19 ou Pt14, B isoladas de pacientes com CLL. Para este ensaio de citotoxicidade com base em fluxo, as células alvo são manchadas com CSFE para quantificar sua presença. As células alvo foram manchadas para expressão de CD19 para confirmar os níveis de antígenos alvo similares. As atividades citolíticas de células CAR19 T são medidas em uma titulação de relações de célula efetora:alvo de 10:1, 3:1, 1:1, 0,3:1 e 0:1 onde as efetoras foram definidas como células T expressando o receptor quimérico anti-CD19. Os ensaios foram iniciados misturando-se um número apropriado de células T com um número constante de células alvo. Depois de 16 horas, o volume total de cada mistura foi removido e cada cavidade lavada combinando-se adequadamente. As células T foram manchadas para CD2 e todas as células manchadas com marcador vivo/morto 7AAD. Após a lavagem final, as células peletizadas foram re-suspensas em um volume específico com um número predeterminado de contagem das contas. Os dados de manchamento da célula foram coletados por citometria de fluxo de LSRII e analisados com o software FloJo usando contas para quantificar os resultados.

[00794] Para medir a proliferação da célula e produção de citocina de células CAR19 T humanizadas, as células são descongeladas e permitidas recuperar durante a noite. Além de CART19 humanizada, a CART19 de murino foi usada para propósitos comparativos enquanto SS1-BBz foi usado como um CAR expresso não alvejante para efeito de célula CAR/T de base. O padrão-ouro de "controle" (GS) CART19 foi usado em todos os ensaios para comparar a variação do ensaio. As células T foram direcionadas para K562, uma linhagem de célula de leucemia mielogenosa crônicaexpressando ou não expressando células CD19 ou Pt14, B isoladas de pacientes com CLL. Além disso, contas CD3x28 foram usadas para avaliar o potencial das células T para responder aos sinais imunológicos endógenos. Para analisar a proliferação, as células T foram manchadas com CSFE. A proliferação é a diluição da mancha de CSFE que reflete a separação das marcações parentais agora em duas células filha. O ensaio testa apenas uma relação de efetora:alvo de 1:1 e 1:0 onde as efetoras foram definidas como células T expressando o receptor quimérico anti-CD19. O ensaio é realizado em duplicata e 24h após a mistura das células, 50% dos meios são removidos/substituídos para análise de citocina usando o painel Luminex 10-plex de detecção de citocinas humanas. Após 5 dias, as células T foram manchadas para expressão de CAR, fenotipadas como células CD4 ou CD8 e manchadas para vida/morte com 7AAD. Após a lavagem final, as células peletizadas foram ressuspensas em um volume específico com um número predeterminado de contas de contagem de BD. Os dados de manchamento da célula foram coletados por citometria de fluxo de LSRII e analisados com o software FloJo usando contas para quantificar os resultados. As contagens de célula totais foram determinadas por número de células contadas em relação a um número específico de contas multiplicadas pela fração das contas ainda a ser contadas.

[00795] Para avaliar o potencial para as células CART19 humanizadas funcionarem similarmente à CART19 de murino atualmente bem sucedida, nós quisemos avaliar in vitro a capacidade de matar as células alvo, para proliferar com respeito ao antígeno alvejado e para mostrar sinais de persistência. Acondicionando-se cada dentre os construtos lentivirais de CART19 humanizada e titulando-as em células SupT1, nós podemos determinar a quantidade de vírus para normalizar as transduções a estarem ao redor de 50%. Isto permite comparações mais diretas de atividade começando com sítios de integração médios similares por célula.

[00796] As células CAR19 T terapêuticas são geradas começando- se com o sangue de um doador de apheresed normal cujas células T não tratadas são obtidas por seleção negativa para células T, linfócitos CD4+ e CD8+. Estas células são ativadas por contas CD3x28 em 10% de RPMI a 37C, 5% de CO2.

[00797] Após 24h, as células T estão explodindo e a quantidade normalizada de vírus é adicionada. As células T começam a dividir em um padrão de crescimento logarítmico que é monitorado medindo-se as contagens de célula por mL e tamanho de célula. Quando as células T começam a descansar, o crescimento logarítmico diminui e o tamanho da célula encolhe. A combinação da redução da taxa de crescimento e o tamanho da célula T que chega a ~300 fl determina o estado para as células T serem criopreservadas ou reestimuladas.

[00798] Há uma tendência muito similar das células T descansarem como visto por tamanho. O padrão de quase sobreposição entre as células CART humanizadas com a população de CART19 e UTD de murino atual não indica nenhum efeito incomum de CAR19 humanizada na expansão de célula T normal após a ativação. Como um controle, SS1-BBz é usado para definir a atividade de CAR independente de antígeno indesejado. O perfil de expansão nos números de célula total mostra as diferenças nos números reais nas expansões individuais é provavelmente devido principalmente ao número de partida diferente de células. Normalizando-se os números de célula T de partida, um agrupamento apertado é visto para todas as células CART19. Além disso, o efeito indesejado da ativação de CAR independente de antígeno é detectado na linha em execução inferior e superior do grupo.

[00799] O nível de expressão de superfície para cada uma destas células de expressão de CAR19 foi determinado. O vírus titulado normalizado para transdução mostra os níveis de expressão comparáveis correlacionando-se com a eficiência de transdução, percentual de células transduzidas. Alguns CARs tiveram seus títulos extrapolados de embalagens anteriores e, entretanto, suas porcentagens transduzidas são mais baixas, seu MFI é da mesma forma reduzido como esperado. Os resultados indicam que não há nenhum efeito negativo detectável de CAR19 humanizada na capacidade das células se expandirem normalmente quando comparadas ás células UTD e CAR19 T de murino.

[00800] A capacidade das células CART19 humanizadas para seletivamente discernir um epitopo específico de superfície de célula expresso em células e o destruir é analisada. Células K562 tipo selvagem não expressam CD19, mas, podem ser transduzidas para expressar CD19. Comparando-se estas curvas de extermínio, a titulação da quantidade das células efetoras mostra que aquelas células que expressam CD19 são destruídas. Células T redirecionadas do mesmo doador e modificadas com células CART19 humanizadas ou células CART19 de murino clínicas atuais não indicam nenhuma diferença em sua capacidade de exterminar. As curvas de extermínio mostram que uma capacidade de extermínio muito similar é encontrada entre células CART19 humanizadas que alvejam células de CLL CD19+ do paciente 14. De forma interessante, há uma diminuição na atividade citolítica global, em particularmente GS CART19, sugerindo que estas células podem possuir propriedades inibidoras específicas. O nível similar de CD19 expresso nas células alvo indica que o nível de expressão não é a razão para diferenças no extermínio da célula.

[00801] A propriedade necessária das células CART19 humanizadas para proliferar depois de ver as células alvo é encontrada em todos os construtos após serem estimulados pelas contas CD3x28 de controle e os alvos de expressão de CD19. O alvejamento de células de CLL Pt14 parece indicar uma taxa de proliferação ligeiramente maior com scFvs com uma orientação de cadeia luz a pesada sem desvios vistos ao ter uma ligação de GGGGS 3x ou 4x (SEQ ID NOS 107 e 106, respectivamente). Os resultados proliferativos refletem o número total de células acumuladas durante os 5 dias, indicando que as CART19s humanizadas, 2146, 2144, 2136, 2141 e 2137 direcionam um sinal mais proliferativo para as células T. De forma impressionante, isto foi detectado nas células CART19 humanizadas alvejando as células de CLL Pt14.

[00802] Em geral, os construtos de CART19 humanizados exibem características muito similares à CART19 de murino atual na atividade citolítica, resposta proliferativa e secreção de citocina para alvos específicos de antígeno. O potencial das células CART19 humanizadas, (2146, 2144, 2136, 2141 e 2137), de direcionar um sinal mais proliferativo às células T na ativação alvo pareceu ser um benefício extra destes novos construtos para potencialmente realçar a resposta terapêutica.

Resultados

[00803] Usando igualmente os ensaios de proteção de citocina e de desgranulação, é demonstrado que as células CART19 T criadas especificamente alvejam as células CD19+.

[00804] Células ND317 transduzidas com construtos de CD19CAR humanizadas (a.k.a. "huCART19") da invenção foram analisadas. Foi uma similaridade apertada no tamanho das células T durante sua expansões após a ativação de CD3x28 e transdução com os candidatos de CART19 humanizados em relação às células T não modificadas (UTD) e CART19 de murino.

[00805] Experiências mostraram pequena diferença no número de células T que se acumularam durante suas expansões após a ativação de CD3x28 e transdução com os candidatos de CART19 humanizados diferentes em relação às células CART19 de murino e T não modificadas (UTD).

[00806] As expressões da superfície da célula de CART19 humanizadas são comparáveis e seu nível de expressão muito similar à CART19 de murino. A sobreposição dos histogramas plotando o padrão de manchamento de expressão de superfície da célula de cada dentre as células T transduzidas de CART19 humanizadas e a intensidade fluorescente média (MFI) calculada destes perfis correlaciona-se bem com a porcentagem de células transduzidas.

[00807] Além disso, a CART19 humanizada têm atividades citotóxicas específicas similares no alvejamento de células alvo de expressão de CD19 e comparáveis à CART19 de murino. As plotagens de ensaios de extermínio com base em fluxo de 16 hr usando as relações Efetor para Alvo (E:T) de titulação relações com células CART19 humanizadas efetoras alvejando CSFE rotularam K562cc (FIG. 1A. não expressando controles de CD19), K562.CD19 (FIG. 1B, células K562 transduzidas para expressar CD19) ou Pt14 (FIG. 1C, células B de paciente com CLL). As atividades citolíticas de todas as células CART19 humanizadas são similares e comparáveis à CART19 de murino. As diferenças na atividade citolítica entre alvos diferentes são similares e comparáveis indicando que a atividade de CART19 de murino é preservada na forma humanizada de CART19.

[00808] Sobreposição de histograma de células CART19 humanizadas marcadas por CFSE 6 dias após serem misturadas com células alvo mostra sua capacidade proliferativa (FIG. 5). A resposta proliferativa liberada de CAR19 é uma resposta necessária após o comprometimento com e extermínio de células alvo de desenvolver uma resposta clínica positiva. A diluição do manchamento de SS1-BBz CSFE, um indicador da divisão células filha que diluem-se fora da mancha da célula parental, é um resultado das divisões de manutenção de células T não descansadas em um mecanismo independente de alvejamento.

[00809] A capacidade global das populações da célula de proliferar é avaliada com contas CD3x28 que imitam o comprometimento endógeno de TCR e de CD28 coestimuladora. Os dados indicam que cada população de célula tem um potencial de proliferação comparável. Todas as células CART19 de murino e humanizadas proliferam-se fortemente e comparavelmente no comprometimento com células K562 que expressam CD19. As células CART19 humanizadas da mesma forma responderam bem às células B obtidas de um paciente com CLL, entretanto, algumas parecem responder ligeiramente menos. Como mostrado na FIG. 2A e 2B, as células CART19 humanizadas 2136, 2137, 2140, 2141, 2144 e 2146 podem ser vistas por terem uma proliferação ligeiramente mais forte como comprovado pela maior diluição do manchamento de CSFE. Estes construtos têm a mesma orientação de cadeia variável de leve para pesada, indicando que isto é a orientação de escolha. Um olhar mais íntimo nas mudanças de aminoácido no sítio de CDR2 pesado (Tabela 1) revela que cada uma das três variações YSSSL, YQSSL e YNSSL (SEQ ID NOS: 28, 29 e 30, respectivamente) são representadas nos construtos que pareciam ter as proliferações mais fortes depois de obsevar os alvos. Além disso, estes construtos observados têm igualmente o ligante de G4S contendo 3 cópias da subunidade (3G4S) (SEQ ID NO: 107) e o ligante de G4S contendo 4 cópias da subunidade (4G4S) (SEQ ID NO: 106), indicando que o tamanho do ligante não influenciou a função.

[00810] Das expansões proliferativas descritas acima, os números de célula totais após 5 dias de comprometimento pós-tumor são determinados. As células mostram um declínio nos números que foram semeados inicialmente, indicando que a ativação é requerida para manter a sobrevivência. Um controle de ativação endógeno é analisado para mostrar que a contagem de célula total no término de 6 dias foi similar. As células de CART19 humanizadas alvejando as células K562 expressando CD19 mostram que as duas células CART19 de murino terminam igualmente com os números de célula mais altos, com 2146 ligeiramente acima de todos os outros construtos com valores similares. Os números de célula totais foram da mesma forma analisados 6 dias após a exposição às células B do Paciente 14 (pt14), e de forma interessante mostra que os construtos de CART19 humanizadas previamente selecionadas 2146, 2144, 2136, 2141 e 2137, todas as quais têm a orientação de cadeia leve a pesada e representam as três variações de aminoácido YSSSL, YQSSL e YNSSL (SEQ ID NOS: 28, 29 e 30, respectivamente), resultaram em números de célula totais mais altos, mais altos do que as CART19s de murino. Esta diferenciação inesperada entre os vários clones anti-CD19CAR humanizados pode transladar a melhor eficácia clínica de células CART transduzidas com estes construtos.

[00811] Níveis de base de citocina produzida de células CART19 humanizadas após a exposição às células K562 de controle não expressando CD19 foram analisados. Sobrenadantes de 24 hr foram analisados usando um painel luminex 30-plex. O perfil de citocina potencial da estimulação do sistema imune endógeno com as contas CD3x28 indica que cada dentre as populações de célula tem um perfil de citocina comparável.

[00812] Os dados da mesma forma mostram que a CART19 humanizada e CART19 de murino produzem perfis de citocina similares em níveis similares ao responderem aos mesmos alvos. O perfil de citocina foi mais baixo, porém, similares ao alvejar as células alvo do Pt14.

Exemplo 5: Tratamento com célula T de CAR CD19 humanizada em um modelo de ALL in vivo.

[00813] Células de ALL primárias humanas podem ser cultivadas em camundongos imunocomprometidos sem ter cultivado-as in vitro. Estes camundongos podem ser usados para testar a eficácia de células T de receptor de antígeno quimérico (CAR) em um modelo que representa a população de paciente que será encontra na clínica. O modelo usado aqui, HALLX5447, foi passado duas vezes em camundongos NOD.Cg- PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), antes do uso em estudos testando a eficácia de células T CAR.

[00814] Células T CAR de CD19 de murino foram anteriormente mostradas alvejar e células de leucemia em um modelo de camundongo NSG de ALL humana primária. O scFv de CD19 (fragmento variável de Fc de cadeia simples) foi humanizado e o presente exemplo compara a capacidade de células T expressando um CAR de CD19 humanizado (CAR 2) eliminar as células de tumor ALL in vivoàquela das células T CAR de CD19 de murino. Aqui, a eficácia destas células foi diretamente comparada em camundongos com ALL humana primária estabelecida, como avaliado por análise de FACS de sangue periférico de células CD19+ humana. Após um implante de 1,5x106células de ALL primárias intravenosamente, uma carga de doença de 2,5 a 4% de células CD19+ humanas no sangue foi obtida em 2 semanas após implante de tumor. Esta porcentagem des CD19 é de células totais no sangue dos camundongos. 100% de células humanas nos camundongos antes do tratamento com células T CAR são células de tumor. Porcentagens acima de 2% de células CD19+ humanas no sangue periférico são consideradas ser doença de ALL humana estabelecida neste modelo. Os camundongos transportando leucemia foram tratados com as células T CAR, visto que a leucemia é estabelecida nos camundongos, aproximadamente duas a três semanas após implante de tumor. Os camundongos em cada grupo foram tratados com 5x106células T humanas totais. As eficiências de transdução das células de doador humano com o CAR expressando lentivírus foram entre 40 a 60%. Após tratamento com as células T, camundongos foram sangrados semanalmente para análise da porcentagem de células CD19+ humana no sangue como o biomarcador para a progressão de doença.

[00815] Materiais e Métodos:

[00816] Células de ALL primárias humanas:Células primárias não foram cultivadas in vitro antes do implante. Estas células foram colhidas de um paciente com ALL e em seguida transferidas em camundongos para estabelecimento e expansão. Após as células de tumor serem foram expandidas nos camundongos, a medula óssea e esplenócitos foram colhidos e de forma viável congelados em batelados para reimplante. As células foram congeladas em 90% de FBS e 10% de DMSO em uma concentração mínima de 5x106células por mililitro. Para reimplante, as células de ALL congeladas foram descongeladas e em seguida injetadas intravenosamente nos camundongos NSG, a fim de gerar camundongos com ALL que serão usados para comparar a eficácia antitumor das células T CAR de CD19 humanizadas e as células T CAR de CD19 de murino.

[00817] Camundongos: Camundongos NSg de 6 semanas de idade (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) foram recebidos do Jackson Laboratory (número de matéria-prima 005557). Os animais foram deixados aclimatarem-se ao biotério Novartis NIBRI durante pelo menos 3 dias antes do experimento. Os animais foram manipulados de acordo com os regulamentos e orientações de Novartis ACUC.

[00818] Implante de Tumor:células de ALL primárias humanas seriamente inoculadas in vivo, modelo HALLX5447, foram descongeladas em um banho de água a 37°C. As células foram em seguida transferidas para um tubo cônico de 15 mL e lavadas duas vezes com PBS estétil fria. As células de ALL primárias foram em seguida contadas e ressuspensas em uma concentração de 15x106 células por mililitro de PBS. As células foram colocadas em gelo e imediatamente (dentro de uma hora) implantadas nos camundongos. As células de ALL foram injetadas intravenosamente por meio da veia da cauda em um volume de 100 µl, para um total de 1,5x106 células por camundongo.

[00819] Dosagem de célula T CAR: aos camundongos foram administradas 5x106 células T 16 dias após o implante de tumor. As células foram parcialmente descongeladas em um banho de água a 37 graus Celsius e em seguida completamente descongeladas pela adição de 1 mL de PBS estéril fria ao tubo contendo as células. As células descongeladas foram transferidas para um tubo falcon de 15 mL e adjustadas para um fvolume final de 10 mL com PBS. As células foram lavadas duas vezes a 1000 rpm durante 10 minutos cada vez e em seguida contada em um hemocitômetro. Células T foram em seguida ressuspensas em uma concentração de 50x106 células por mL de PBS fria e mantidas em gelo até os camundongos serem dosados. Os camundongos foram injetados intravenosamente por meio da veia da cauda com 100 µl das células T CAR para uma dose de 5x106 células T por camundongo. Cinco camundongos por grupo foram tratados com 100 µl de PBS sozinha (PBS), células T não transduzidas (Simulação), células T CAR de CD19 de murino (muCTL019), ou células T CAR de CD19 humanizadas (huCTL019). As células T não transduzidas, células T muCTL019, e células T huCTL019 foram todas preparadas do mesmo doador humano em paralelo.

[00820] Monitoramento de Animal: O estado de saúde dos camundongos foi monitorado diariamente, incluindo duas avaliações de peso corporal semanalmente. O percentual de mudança no peso do corpo foi calculado como (BWcorrente - BWinicial)/(BWinicial) x 100%. A carga de tumor foi monitorada semanalmente por análise de FACS de sangue periférico. Os camundongos foram sangrados semanalmente por meio da veia da cauda em tubos revestidos por que foram mantidos no gelo. 10 a 20µl de sangue foram semeadas dos tubos em placas de 96 cavidades em gelo. Glóbulos vermelhos foram lisados com tampão de lise de glóbulo vermelho ACK (Life Technologies, número de catálogo A10492-01) e em seguida lavados duas vezes com PBS fria. As células foram incubadas com uma mistura de bloqueio de Fc de bloco de Fc humano e camundongo (Miltenyi Biotec, catálogos números 130-059901 e 130-092-575) durante 30 minutos e em seguida incubadas com um anticorpo anti-CD19 humano durante 30 minutos. As células foram fixadas com uma solução de paraformaldeído a 2% durante 20 minutos, lavadas e armazenadas em PBS + 2% de FBS durante a noite antes da análise em um BD Canto ou Fortessa, seguida por outra análise usando o software FlowJo FACS. As células foram analisadas para determinar a porcental de células CD19+ humanas no sangue dos camundongos NSG HALLX5447 transportando tumor de ALL humano. As porcentagens de CD19 no sangue são reportadas como o erro médio + padrão da média (SEM).

[00821] A porcentagem dos valores de tratamento/controle (T/C) foi calculada usando a seguinte fórmula: % T/C = 100 x ?T/?C se ?T > 0 ; % de Regressão = 100 x ?T/Tinicial se ?T < 0 ; onde T = a porcentagem média de CD19 de sangue periférico do grupo tratado com fármaco no dia final do estudo; Tinicial = porcentagem de CD19 de sangue periférico do grupo tratado com fármaco no dia inicial de dosagem; ?T = porcentagem média de CD19 de sangue periférico do grupo tratado com fármaco no dia final do estudo - porcentagem média de CD19 de sangue periférico do grupo tratado com fármaco no dia inicial de dosagem; C = porcentagem média de CD19 de sangue periférico do grupo de controle no dia final do estudo; e ?C = porcentagem média de CD19 de sangue periférico do grupo de controle no dia final do estudo - porcentagem média de CD19 de sangue periférico do grupo de controle no dia inicial de dosagem.

[00822] Valores de T/C na faixa de 100% a 42% são interpretados não ter atividade antitumor ou ter mínima; Valores de T/C que são < 42% e > 10% são interpretados ter atividade antitumor ou inibição de crescimento de tumor. Valores de T/C < 10% ou valores de regressão > -10% são interpretados ser estase de tumor. Valores de regressão < - 10% são reportados como regressão. Resultados:

[00823] A atividade antitumor de célula T CAR de CD19 de murino e humanizadas foi avaliada e diretamente comparada em um modelo primário de ALL humana. Após implante de tumor no dia 0, camundongos foram randomizados em grupos de tratamento e tratados com 5x106 células T intravenosamente no dia 16. A carga de doença de ALL e saúde do animal foram monitoradas até os animais alcançarem a finalidade. Os camundongos em todos os grupos foram eutanizados no dia 65 após o implante de tumor quando a carga de doença nos grupos de controle estava acima de 80% de células CD19+ no sangue periférico.

[00824] Uma clara diferença na carga de doença foi observada entre os grupos de controle e os grupos tratados com as células T CAR de CD19 de murino ou humanizadas com P<0,01 do dia 24 após o implante de tumor, e continuou até o final do estudo no dia 65. As células T CAR de CD19 de murino ou humanizadas demonstram uma cappacidade similar de controlar o crescimento de célula de tumor de ALL HALLX5447 humana em camundongos NSG. Ambos os grupos mostraram um nível de doença de sangue periférico máximo de 12 a 15% de células CD19+ humanas no dia 21 após implante de HALLX5447. 42 dias após implante de célula de tumor, nenhuma célula CD19+ humana foi detectável no grupo huCTL019, ao mesmo tempo em que a porcentagem de células CD19+ humanas no grupo muCTL019 caiu em cerca de 1%. Tanto as células T CAR de CD19 de murino quanto humanizadas resultaram em uma capacidade comparável de controlar a expansão de células de ALL humanas primárias neste modelo (P>0,05). O % de Valores de T/C para o grupo célula T transduzida por simulação foi de 94,40%, demonstrando que células T transduzidas por simulação não tinha nenhuma atividade antitumor. A porcentagem de regressão do grupo muCTL019 foi de -89,75% e o grupo huCTL019 foi de -90,46%, demonstrando que ambos estes tratamentos foram capazes de causar regressão do modelo de tumor HALLX5447. As porcentagens de célula CD19+ humana de sangue periférico como uma medida da carga de doença nestes camundongos são mostradas na figura 7. O grupo de tratamento com PBS, que não recebeu quaisquer células T, demonstrou cinéticos de crescimento de tumor de ALL primário de referência camundongos NSG intravenosamente implantados. O grupo de tratamento com simulação recebeu células T não transduzidas que foram submetidas ao mesmo processo de expansão in vitro como as células CAR T. Estas células funcionam como um controle célula T para mostrar a resposta não específica das células T neste modelo de tumor. Tanto os grupos de tratamento com PBS quanto célula T transduzida por simulação demonstraram progressão de tumor contínua por todo o experimento. Tanto as células T CAR de CD19 de murino quanto humanizadas controlam a progressão de doença dentro de uma semana das injeções de 5x106célula T e demonstram uma cpacidade similar de sustentar o controle da doença durante o curso deste estudo de 65 dias.

[00825] A atividade antitumor de células T CAR de CD19 de murino e humanizadas transduzidas foi avaliada em um estudode eficácia em camundongos NSG transportando um modelo primário de ALL humana, HALLX5447. Este estudo demonstraram que tanto as células T CAR de CD19 de murino quanto humanizadas (muCTL019 e huCTL019) são capazes de montar uma resposta antitumor em um modelo primário de ALL humana. Além disso, esta resposta, como ensaiada por carga de doença de sangue periférico é a mesmo para as células muCTL019 e huCTL019. Tanto as células T CAR de CD19 de murino quanto humanizadas controlam o crescimento de ALL primária dentro de uma semana dos camundongos sendo dosados com as células T. Inicialmente, após tratamento, a carga de doença continou aumentar antes de diminuir oara níveis virtualmente não detectáveis. Um tratamento com células T CAR de murino ou humanizadas em uma resposta antitumor prolongada durante o curso da progressão da doença de 65 dias em camundongos tratados por controle. As células T CAR de CD19 humanizadas demonstraram uma capacidade similar de montar uma resposta ao tumor anti-CD19 eficaz e controlar a carga de doença de ALL como foi observado com as células CAR T de CD19 de murino.

Exemplo 6: células T CAR de CD19 para uso no tratamento de mieloma múltiplo.

[00826] Mesmo com os regimes atuais de quimioterapia, terapias alvejadas, e transplante de medula óssea autóloga, mieloma é considerado uma doença incurável. O presente exemplo descreve o tratamento de mieloma múltiplo (MM) com células T autotólogas direcionadas a CD19 com um receptor de antígeno quimérico (lentivírus/CD19:4-1BB:CD3zeta; também conhecido como "CART19" ou CTL019). Este exemplo demonstra que terapias com CAR direcionadas a CD19 têm o potencial para estabelecer remissões duráveis de longa duração, profundas com base no alvejamento da célula-tronco de mieloma e/ou células de tumor que expressam níveis muito baixos (não detectáveis pela maioria dos métodos) de CD19.

[00827] No tratamento de um paciente com uma leucemia de célula plasmática secundária agressiva, constatamos que CART19 administrado dois dias após um transplante de célula-tronco autóloga de salvamento resultou em rápida clearance de leucemia de célula plasmática e uma resposta parcial muito boa em um paciente que progrediu através de múltiplas linhagens de quimioterapia. Este paciente foi dependente de transfusão durante meses antes do tratamento; em dois meses após o tratamento, ele teve suas contagens sanguíneas recuperadas (com contagens de plaquetas de faixa normal e contagens de glóbulos brancos) e não foiram requeridas transfusões, visto que ele teve alta hospitalar de seu tratamento.

[00828] Porque as células de mieloma expressam naturalmente CD19, a constataçãor de que o tratamento com CART19 induziu uma rápida e significante resposta ao tumor foi surpreendente. Sem desejar estar ligado a qualquer teoria, concluiu-se que CART19 pode ser usado para tratar o mieloma, porque: (1) ao mesmo tempo em que acredita-se que células de mieloma sejam tradicionalmentenegativas quanto à expressão de CD19 por citometria de fluxo, existem dados indicando que as células de mieloma podem expressar níveis muito baixos de CD19, de modo que expressão seja detectável por RNA, porém não por citometria de fluxo ou imuno-histoquímica; e (2) o conceito de alvejamento da célula B clonotípica, que é pensada ser a célula-tronco cancerosa qie dá origem ao mieloma múltiplo, e é particularmente resistente à quimioterapia. Existe uma relação clonal entre células B e células de tumor de mieloma, porém a terapia de mieloma tradicional é alvejada nas células plasmáticas malignas diferentes de células B. CART19 para tratamento de mieloma, portanto, alveja uma população de célula diferente mais do que terapias de mieloma.

[00829] Na única experiência do paciente, o paciente tinha células plasmáticas circulantes, e fomos capazes de testar suas células de tumor quanto à expressão de CD19. Aproximadamente 1 a 2% das células de tumor dele expressaram o antígeno de CD19. (FIG. 8). Desse modo, concluiu-se que CART19 pode ter um efeito direto sobre uma população muito pequena das células de tumor dele; uma resposta parcial muito boa, embora não tenha sido previsto com base no alvejamento de apenas a população muito pequena de células CD19+ de tumor.

[00830] Neste caso, CART19 foi administrado após transplante com resgate de célula-tronco autóloga após dose elevada de melfalano. Embora esta seja uma terapia padrão em mieloma, ela não é curativa. Além disso, este paciente foi anteriormente submetido a transplantes de célula-tronco autotólogas tandem e reincidiram precocemente (<6 meses) após o transplante. Sem desejar estar ligado a uma teoria particular, o uso de células CART19 como descrito no presente exemplo pode ter um mecanismo de não sobreposição no tratamento de mieloma quando combinado com um transplante de célula-tronco autóloga de salvamento.

[00831] Um paciente com mieloma múltiplo refratório foi tratado com CTL019 após quimioterapia mieloablativa e ASCT. A remissão foi mantida, apesar da perda de CTL019 detectável e reconstituição de células B positivas de CD19 normais, indicando que esta resposta não requeira a atividade de CTL019 prolongada. Além disso, esta resposta de paciente foi realizada mesmo que a vasta maioria (99,95%) das células plasmáticas neoplásicas fosse negativa de CD19 tanto por citometria de fluxo quanto RT-PCR.

[00832] A ausência de expressão de CD19 detectável nesta população de célula plasmática neoplásica dominante do paciente sugere que o alvo clinicamente relevante de CTL019 residia fora desta população negativa de CD19 dominante. Células plasmáticas neoplásicas em pacientes de mieloma múltiplo exibem heterogeneidade genética, imunofenotípica e funcional. Subpopulações particulares podem ser requeridas para sobrevivência do clone através da terapia anti-mieloma. No paciente reportado aqui, por exemplo, o subgrupo expressando CD19 pequeno de células plasmáticas foi relativamente resistente ao melfalano, porém sensível ao CTL019. Esta constatação sugere que alvejar terapeuticamente um subgrupo pequeno do clone pode induzir a benefício clínico durável, quando acoplado com terapia antimieloma convencional.

[00833] Alternativamente, o alvo clinicamente relevante de CTL019 neste paciente pode ter residido fora da população de célula plasmática neoplásica. Por exemplo, o CTL019 pode alvejar uma população de célula-tronco que é relativamente pequena, porém dá origem às células plasmáticas neoplásicas. Mieloma múltiplo pode, portanto, ser uma doença de tipos de células de linhagem B tardia múltiplas, não exatamente células plasmáticas diferenciadas terminalmente, de modo que as terapias como CTL019 que alvejam linfócitos B possam ser auxiliares úteis para terapias que diretamente alvejam células plasmáticas.

[00834] Dez pacientes de mieloma múltiplo serão tratados com CART19 em um teste de fase I, pelo menos três pacientes foram tratados até hoje.

Dose Racional e Riscos/Benefícios

[00835] Optou-se por usar dosagem fixa por meio da rotina de administração intravenosa para este protocolo. O objetivo primário deste protocolo foi testar a segurança e viabilidade de administrar CART-19 células a pacientes com mieloma múltiplo. As toxicidades primária que foram antecipadas são (I) liberação de citocina quando os CARs encontram seu antígeno CD 19 substituto em células B malignas ou normais; (2) depleção de células B normais, similar à terapia de rituximabe; (3) síndromes de pele responsiva a esteróide e gastrointestinais semelhantes à doença do enxerto versus hospedeiro, como foi observado anteriormente quando células T autólogas expandidas/coestimuladas foram acopladas com ASCT a MM. Um conceito teórico foi se a transformação ou proliferação descontrolada das células T CART-19 podem ocorrer em resposta a níveis elevados de CD 19. Isto foi uma menor preocupação neste Pedido, em comparação a outro estudo de pacientes de CLL, visto que o desafio de células B clonotípicas em MM acredita-se ser muito menor do que o desafio de células B malignas nos pacientes de CLL refratários tratados sob aquele estudo.

Dose Racional

[00836] Com os primeiros 3 pacientes, observamos a atividade clínica em doses variando de 1,4 x l07 a l.l x l09 células CART-19. Esta observação demonstra, pelo menos nos primeiros 3 pacientes tratados, que não existe uma ligação óbvia dose resposta. A resposta completa foi observada em pacientes administrados com duas diferenças log de duplicação em dose. Desse modo, ao contrário de fármacos padrões que são metabolizados, células T de CAR podem ter uma ampla faixa de dose resposta. Isto é mais provavelmente porque as células T de CAR são capazes de proliferar extensivamente nos pacientes. Portanto, estabelecemos uma faixa de dose de l-5 x 108 células CART-19 para infusão. Neste estudo de único paciente oferecido em uma base de uso compassivo, ao paciente foi oferecido até 5 x l08 células CART19, sem nenhum limite de dose inferior. Para a experiência de dez pacientes, aos pacientes serão oferecidas 1-5 x 107 células CART-19.

Planejamento Geral

[00837] Este foi estudo de único paciente oferecido em uma base de uso compassivo; ele foi modelado após um estudo de Fase I para determinar se a infusão de células T autólogas transduzidas para expressar CART-19 é segura. Os objetivos primários do estudo foram determinar a segurança, tolerabilidade e potencial de enxerto de células T CART-19 em pacientes submetidos salvamento de ASCT após recidiva precoce após o primeiro ASCT. O protocolo que consiste em um estudo piloto de rótulo aberto.

[00838] Na entrada os indivíduos serão submetidos a biópsia de medula óssea e rotina de laboratório e avaliação de imageamento de seu MM. Indivíduos elegíveis sofrerão aferese de estado constante para obter grandes números de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) para a fabricação de CART-19. As células T serão purificadas da PBMC, transduzidas com o vetor lentiviral TCRZ/4-1BB, expandidas in vitro e em seguida congeladas para futura administração. O número de pacientes que têm coleções de célula T inadequadas, expansão ou fabricação em comparação com o número de pacientes que têm células T bem sucedidamente fabricadas será registrado; viabilidade de fabricação de produto não é acreditada ser problemática nespa população de paciente.

[00839] Indivíduos geralmente tiveram adequadas células-tronco de sangue periférico restantes armazenadas da mobilização/coleção realizada em preparação para seu primeiro ASCT para conduzir dois ASCT adicionais. Aqueles que não serão submetidos a um segundo procedimento de mobilização coleção antes ou após sua aferese de estado constante com um regime de acordo com a preferência do médico atendente. Aproximadamente duas semanas após a leucaferese inicial, os indivíduos serão admitidos ao hospital e receberão dose elevada de melfalano (dia -2) seguida por infusão de células-tronco autólogas dois dias depois (dia 0), e todos os indivíduos receberão infusão de células CART-19 doze a quatorze dias depois (dia +12-14). Até 10 pacientes serão arrolados.

[00840] Todos os indivíduos terão testes sanguíneos para avaliar a segurança, e enxerto e persistência das células CART-19 em intervalos regulares até a semana 4 do estudo. No dia +42 e dia +100, os indivíduos serão submetidos a aspirações/biópsias de medula óssea para estimar a carga de célula plasmática de medula óssea e tráfico de células CART-19 para a medula óssea. Uma avaliação de resposta formal será feita no dia 100 de acordo com os critérios 136 do International Mieloma Working Group (IMWG), e TTP será monitorada de acordo com a prática clínica de rotina para pacientes com mieloma múltiplo. O resultado de eficácia principal medido neste estudo será uma comparação de TTP após um ASCT inicial do paciente a TTP após o ASCT neste estudo.

[00841] Visto que a finalidade primária deste estudo é segurança e viabilidade de infusão de células CART -19 ASCT, o estudo empregará uma norma de interrupção precoce. Resumidamente, se menos do que 2 eventos severos, adversos inesperados, ocorrerem entre os primeiros cinco indivíduos tratados, o estudo em seguida acumulará um adicional de cinco indivíduos para um arrolamento alvo de 10. Observaremos indivíduos tratados durante 40 dias após infusão de CART-19 (isto é, até a primeira avaliação de resposta oficial no dia 42) antes do arrolamento de um subseqüente indivíduo até cinco indivíduos terem sido arrolados e desse modo observados. Para tratamento do segundo grupo de cinco pacientes, nenhum período de espera será requerido entre indivíduos.

[00842] Após os 6 meses de intenso acompanhamento, os indivíduos serão avaliados pelo menos trimestralmente durante dois anos com uma história médica, exame físico, e testes sanguíneos. Após esta avaliação, os indivíduos entrarão em um estudo roll-over para acompanhamento anual por telefone e questionário durante até mais treze anos para estimar quanto ao diagnóstico de problemas de saúde a longo prazo, tal como desenvolvimento de nova malignidade.

Finalidades de Estudo Primário

[00843] A experiência piloto é designada para testar a segurança e viabilidade das células T autólogas transduzidas com o CD19 TCRZ/4- lBB em pacientes passando por salvamento de ASCT para MM após reincidiva precose após primeiro ASCT.

[00844] Finalidades primárias de segurança e viabilidade incluem:

[00845] Ocorrência de eventos adversos relacionados com estudo, definidos como NCJ CTC 2: grau 3 sinais/sintomas, toxicidades de laboratório e eventos clínicos que são possivelmente, provavelmente ou definitivamente relacionados ao tratamento de estudo em qualquer tempo da infusão até a semana 24. Isto incluirá toxicidade infusional e qualquer toxicidade possivelmente relacionada com células CART-19 incluindo, porém não limitadas à: a. Febres b. Erupção cutânea c. Neutropenia, trombocitopenia, anemia, aplasia da medula d. Disfunção hepática e. Infiltrados pulmonares e outra toxicidade pulmonar f. Síndromes tipo GVHD afetando o trato gastrointestinal ou pele.

[00846] A viabilidade da fabricação de células CART-19 de produtos de aferese do paciente. O número de produtos fabricados que não atendem aos critérios de liberação para eficiência de transdução de vetor, pureza de célula T, viabilidade, esterilidade e contaminação de tumor será determinado.

[00847] A profundidade e duração de resposta após transplante de célula-tronco autóloga com CART19 serão comparadas à profundidade e duração de resposta de que cada paciente inicialmente obteve seguindo transplante de célula-tronco autóloga padrão.

Seleção e Retirada de Indivíduo Critérios de Inclusão

[00848] Indivíduos devem ter sofrido um anterior ASCT para MM e progrediram em 365 dias de infusão de célula-tronco. Indivíduos que sofreram dois anteriores ASCTs como parte de um regime de consolidação de ASCT tandem planejado são elegíveis. A progressão será definida de acordo com critérios IMWG para doença progressiva ou, para pacientes que atingiram CR ou sCR após inicial ASCT, critérios para liberação de CR (Durie et al. Leucemia 2006;20(9):1467-1473). N.B.: Não existe nenhum requisito que pacientes devem arrolar dentro de 365 dias de anterior ASCT, e os pacientes podem ser tratados com outros agentes, incluindo agentes experimentais, após reincidiva /progressão após anterior ASCT antes do arrolamento neste estudo.

[00849] Os indivíduos devem ter consentimento informado escrito, assinado.

[00850] Os indivíduos devem ter adequada função de órgão vital para receber alta dose de melfalano, como definido pelos critérios a seguir, medidos dentro de 12 semanas antes da data de infusão de melfalano:. a. Creatinina sérica < 2,5 ou clearance de creatinina estimada >30 mL/min e não dependente de diálise. b. SGOT < 3x o limite superior de bilirubina normal e total < 2,0 mg/dl (exceto para pacientes nos quais a hiperbilirubinemia é atribuída à síndrome de Gilbert). c. Fração de ejeção ventricular esquerda (LVEF) > 45% ou, se LVEF é <45%, uma avaliação formal por um cardiologista não identificando nenhum dano de função cardiovascular clinicamente significante. Avaliação de LVEF deve ser realizada dentro de seis semanas de arrolamento. d. Adequada função pulmonar com FEV1, FVC, TLC, DLCO (após ajuste apropriado para volume de pulmão e concentração de hemoglobina) >40% de valores preditos. O teste de função pulmonar deve ser realizado dentro de seis semanas de arrolamento.

[00851] Indivíduos devem ter um estado de desempenho de ECOG de 0-2, a menos que um estado de maior desempenho seja devido apenas à dor óssea.

[00852] Critérios de ExclusãoOs indivíduos não devem:

[00853] Ter qualquer infecção ativa e descontrolada.

[00854] Ter hepatite B ativa, hepatite C, ou infecção por HIV.

[00855] Qualquer distúrbio médico descontrolado que impediria a participação como delineado.

Regime de Tratamento

[00856] Terapia para mieloma múltiplo reincidivo/progressivo

[00857] Os pacientes podem receber, antes do arrolamento, terapia para mieloma múltiplo reincidivo/progressivo de acordo com a preferência de seus médicos atendentes. A terapia pode continuar no arrolamento.

[00858] Pacientes devem interromper toda terapia durante duas semanas antes da aferese e durante duas semanas antes da alta dose de melfalano. Se mais de duas semanas são esperadas transcorrer entre a aferese e alta dose de melfalano, os pacientes podem resumir a terapia após aferese no critério de seus médicos atendentes.

[00859] Alta dose de Melfalano (dia -2)

[00860] Os pacientes serão admitidos no hospital no dia -3 ou -2 e serão submetidos a exame pelo médico atendente e testes de laboratório de rotina, que incluirão a monitoração dos parâmetros para síndrome de lise tumoral, antes do início do protocolo de tratamento. Sangue para teste de laboratório de monitoração de MM (SPEP, imunoglobulinas quantitativas, e análise de cadeia leve livre de soro), será retirado antes do início de terapia se tais testes não foram realizados dentro de 7 dias de admissão.

[00861] Terapia de alta dose consistirá em melfalano em uma dose de 200 mg/m2 administrada intravenosamente durante aproximadamente 20 minutos no dia -2. A dose de melfalano será reduzida para 140 mg/m2 para pacientes >70 anos de idade ou para pacientes de qualquer idade que, no critério do médico atendente, pode não tolerar uma dose de 200 mg/m2. Todos os pacientes receberão profilaxia antiemética padrão, que pode incluir dexametasona, e profilaxia antibiótica padrão.

[00862] Reinfusão de célula-tronco (dia 0)

[00863] Infusão de célula-tronco ocorrerá no dia 0, pelo menos 18 horas após a administração da alta dose de melfalano. Células-tronco serão infundidas intravenosamente durante aproximadamente 20 a 60 minutos após a pré-medicação, de acordo com prática institucional padrão. Pelo menos 2 x 106 CD34+ progenitoras/kg de peso corporal devem ser infundidas. Além disso, pelo menos 1 x 106 CD34+ progenitoras/kg peso corporal devem estar disponíveis como um produto de célula-tronco de cópia de segurança a ser infundido no evento de enxerto retardado ou falência de enxerto tardio. G-CSF deve ser administrada SQ começando no dia +5, dosada de acordo com prática institucional padrão. Outras medidas de cuidados suportivos, tal como suporte de transfusão serão feitas de acordo com normas institucionais padrão.

[00864] Infusão de Célula CART19 (dia +12-14)

[00865] Uma única dose de células T transduzidas de CART-19 será administrada, consistindo até 5 x 107células CART-19. A dose mínima aceitável para infusão de células transduzidas com o vetor CD19 TCRZ4-1BB é 1 x 107. Células CART-19 serão administradas como uma única dose por rápida infusão i.v. no dia +12-14 após infusão de célula- tronco. Se o paciente não atender a qualquer dos critérios de inclusão descritos aqui na janela dos dias 12-14, a infusão de CART-19 pode ser retardada além do dia +12-14 até os critérios serem satisfeitos.

[00866] Manutenção de Lenalidomida

[00867] Indivíduos que receberam e toleraram a manutenção de lenalidomida após seu primeiro ASCT reiniciará a terapia de manutenção de lenalidomida em aproximadamente dia + 100, assumindo que não existe nenhuma contraindicação no diagnóstico do médico atendente. A dose inicial será de 10 mg diariamente, a menos que experiência anterior dite uma dose inicial alternativa para um paciente particular. A terapia de manutenção continuará até a progressão da doença ou intolerância.

[00868] Preparação e Administração de Fármaco de Estudo

[00869] As células CART-19 T são preparadas na CVPF e não são liberadas da CVPF até os critérios de liberação aprovados pelo FDA para as células infundidas (por exemplo, dose celular, pureza celular, esterilidade, número médio de cópia de vetores/célula, etc.) serem atendidos. Na liberação, as células são levadas para a cabeceira do leito para administração.

[00870] Descongelamento celular. As células congeladas serão transportadas em gelo seco para a cabeceira do leito do indivíduo. As células serão descongeladas na cabeceira do leito usando um banho de água mantido a 36°C a 38°C. A bolsa será suavemente massageada até as células estarem exatamente descongeladas. Não deve haver nenhum pedaço congelado deixado no recipiente. Se o produto de célula CART-19 parece estar danificado ou a bolsa estar vazando, ou de outro modo parece estar comprometido, ele não deve ser infundido e deve ser retornado para CVPF como especificado abaixo.

[00871] Pré-medicação. Efeitos colaterais seguindo infusões de célula T incluem febre transitória, calafrios, e/ou náusea; veja Cruz et al. para revisão (Cytotherapy 2010;12(6):743-749). Recomenda-se que o indivíduo seja pré-medicado com acetaminofeno e cloridrato de difenidramina antes da infusão de células CART-19. Estas medicações podem ser repetidas a cada seis horas quando necessário. Um curso de medicação anti-inflamatória não esteroidal pode ser prescrito se o paciente continua a ter febre não aliviada por acetaminofeno. Recomenda-se que os pacientes não recebam corticosteróides sistêmicos, tais como hidrocortisona, prednisona, metilprednisolona ou dexametasona em qualquer momento, exceto no caso de uma emergência de desafio da vida, visto que isto pode ter um efeito adverso sobre as células T.

[00872] Reação febril. No evento improvável de que o indivíduo desenvolve sepse ou bacteremia sistêmica após infusão de célula T de CAR, culturas apropriadas e controle médico devem ser iniciados. Se um produto de célula T CART-19 contaminado é suspeito, o produto pode ser novamente testado quanto à esterilidade usando amostras arquivadas que são armazenadas na CVPF.

[00873] Administração. A infusão ocorrerá em uma sala isolada em Rhoads, usando precauções para pacientes imunossuprimidos. As células T transduzidas serão administradas por rápida infusão intravenosa em uma taxa de fluxo de aproximadamente 10 mL a 20 mL por minuto por meio de um conjunto de sangue tipo Y sem látex de gauge 18 com uma torneira de 3 direções. A duração da infusão será com base no volume total a ser infundido e a taxa de infusão recomendada. Cada bolsa de infusão terá afixado a ela um rótulo contendo o seguinte: "PARA USO AUTÓLOGO APENAS."Além disso, o rótulo terá pelo menos dois únicos identificadores, tais como as iniciais do indivíduo, data de nascimento, e número de estudo. Antes da infusão, dois indivíduos independentemente verificarão todas estas informações na presença do indivíduo e assim confirmarão que a informação é corretamente comparada ao participante.

[00874] Equipamento de emergência médica (isto é, trole de emergência) estará disponível durante a infusão no case do indivíduo ter uma resposta alérgica, ou severa crise hipotensiva, ou qualquer outra reação à infusão. Sinais vitais (temperatura, taxa de respiração, pulso, e pressão sanguínea) serão verificados antes e após a infusão, em seguida a cada 15 minutos durante pelo menos uma hora e até estes sinais estarem satisfatórios e estáveis. Ao indivíduo será solicitado que não vá embora até o médico considerar que é seguro para ele fazê-lo.

Empacotamento

[00875] A infusão será compreendida de uma única dose de 1-5 x 107 células CA T19 transduzidas, com uma dose mínima aceitável de 1 x 107 células CART-19 para infusão. Cada bolsa conterá uma alíquota (volume dependente da dose) de criomeio contendo os seguintes graus infundíveis (% v/v): 31,25% plasmalyte-A, 31,25% de dextrose (5%), 0,45% de NaCl, até 7,5% de DMSO, 1% de dextrana 40, 5% de albumina de soro humano.

Aferese

[00876] Um procedimento de aferese de grande volume (12 a 15 litros ou 4-6 volumes de sangue) é realizado no centro de aferese. PBMC são obtidas para CART-19 durante este procedimento. De uma única leucaferese, a intenção é colher pelo menos 5 x 109 céluas brancas sanguíneas para fabricar CART-19 T. Leucócitos sanguíneos de referência para os requisitos look-back FDA, e para pesquisa são também obtidos e criopreservados. O produto celular é acreditado ser pronto para liberação aproximadamente 2 a 4 semanas depois. Quantificação de subgrupo de linfócito de citometria de fluxo, incluindo determinação de célula B CD19 e CD20. Avaliação de referência é feita para anticorpo anti-VSV-G humano e antimurino (HAMA). Se um indivíduo teve anteriormente uma adequada coleção de aferese depositada de acordo com as atuais Good Manufacturing Practices na Clinical Cell and Vaccine Production Facility, estas células podem ser usadas como a fonte de células para fabricação de CART-19. Usando um produto de aferese depositado evitaria o custo, tempo, e risco do indivíduo sofrer uma coleção de aferese adicional.

Quimioterapia Citorredutiva

[00877] A quimioterapia de linfodepleção será alta dose de melfalano como descrito aqui.

Infusão de CART-19

[00878] A infusão começará no dia +12-14 após reinfusão de célula- tronco.

[00879] No dia + 12-14 antes da primeira infusão, pacientes terão um CBC com diferencial, e a avaliação de contagens de CD3, CD4 e CD8 visto que a quimioterapia é administrada em parte para induzir linfopenia.

[00880] A primeira dose será administrada usando uma única dose. As células são descongeladas na cabeceira da cama do paciente. As células descongeladas serão administradas em uma taxa de infusão tão rápida quanto tolerada, de modo que a duração da infusão seja de aproximadamente 10 a 15 minutos. A fim de facilitar a mistura, as células serão administradas simultaneamente usando um adaptador Y. Os indivíduos serão infundidos e pré-medicados como descrito aqui. Os sinais vitais dos indivíduos serão avaliados e a oximetria de pulso feita antes da dosagem, no término da infusão, e a cada 15 minutos subsequentemente durante 1 hora e até estes estarem estáveis e satisfatórios. Uma amostra de sangue para determinação de um nível de CART-19 de referência é obtida algum tempo antes da primeira infusão e 20 minutos a 4 horas após cada infusão (e enviado para TCSL).

[00881] Pacientes experimentando toxicidades relacionadas a alta dose de melfalano terão sua escala de infusão retardada até estas toxicidades terem resolvido. As toxicidades específicas que justificam atraso de infusões de célula T incluem: 1) Pulmonares: Requisito para oxigênio suplementar para manter a saturação maior do que 95% ou presença de anormalidades radiográficas em raio-x de tórax que são progressivas; 2) Cardíacas: Nova arritmia cardíaca não controlada com gerenciamento médico; 3) Hipotensão requerendo suporte vasopressor. 4) Infecção Ativa: Culturas de sangue positivo para bactérias, fungos, ou vírus centro de 48 horas de infusão de célula T.

Controle de Toxicidade

[00882] Proliferação de célula T descontrolada. Toxicidade associada com infusões de célula T alogeneicas ou autólogas foram controladas com um curso de imunossupressão farmacológica. Toxicidade associada com corpo T foi reportada responder a corticosteróides sistêmicos. Se a proliferação de célula T descontrolada ocorrer (toxicidade grau 3 ou 4 relacionada a células CART-19), indivíduos podem ser tratados com corticosteroides. Os indivíduos serão tratados com metilprednisolona de pulso (2 mg/kg i.v. divididos q8 hr x 2 dias), seguido por um rápido afunilamento.

[00883] Além disso, com base nas observações de indivíduos tratados em outro protocolo, existe algum conceito para síndrome de ativação de macrófago (MAS), embora a carga de tumor de CD 19+ seja esperada ser muito menor em pacientes com mieloma do que em pacientes com CLL. Tratamento e tempo de tratamento desta toxicidade será no critério do médico do paciente e do investigador do estudo. O controle sugerido pode incluir: se o indivíduo tem uma febre maior do que 101°F que demora mais do que 2 dias consecutivos e não existe nenhuma evidência de infecção (culturas de sangue negativo, CXR ou outra fonte), tocilizumabe 4 mg/kg pode ser considerado. A adição de corticosteroides e terapia anti-TNF pode ser considerada no critério do médico.

[00884] Depleção de célula B. É possível que a depleção de célula B e hipogamaglobulinemia ocorra. Isto é comum com terapias direcionadas anti-CD20. No evento de hipogamaglobulinemia clinicamente significante (isto é, infecções sistêmicas), indivíduos serão administrados imunoglobulina intravenosa (IVIG) por normas de dosagem clínica estabelecidas para restaurar níveis normais de níveis de imunoglobulina sérica, como foi feito com Rituximabe.

[00885] Falência de enxerto primário. Falência de enxerto primário (isto é, não enxerto) pode ser mais comum após segundo ASCT em comparação ao primeiro ASCT. Os critérios de eligibilidade estipulam que células-tronco suficientes devem estar disponíveis para reinfusão de resgate nos critérios do médico atendente no evento de falência de enxerto primário.

Resultados

[00886] Três pacientes de mieloma múltiplo avançado refratário ao tratamento foram agora tratados com CTL019 nesta experiência em curso. Os resultados para dois destes pacientes mostram que ambos tiveram substanciais efeitos antitumor da terapia de CTL019 com base na avaliação de eficácia primária no ponto do tempo de três meses. O terceiro paciente não atingiu ainda o ponto do tempo de três meses. Os resultados para os dois pacientes são descritos em maiores detalhes abaixo.

[00887] O primeiro paciente de mieloma completou sua avaliação de resposta dia +100 e teve uma resposta muito boa à terapia de CART19. Os testes a seguir foram realizados com os seguintes resultados: - SPEP/imunofixação: negativo - imunofixação de urina: faixa de cadeia leve kappanão mensurável fraca em sua imunofixação (também presente no dia 38, então não nova) De outro modo, o paciente atende aos critérios para remissão completa rigorosa incluindo: - relação de cadeia leve sem soro: normal - biópsia de medula óssea: negativa - Imunofenotipagem de IgA: IgA é abaixo do limite de detecção.

[00888] Diferente da cadeia leve kappa não mensurável fraca resulta de imunofixação de urina, o paciente atende a todos os critérios para "remissão completa rigorosa". O sumário da imunotipagem de célula plasmática em 3 pontos do tempo (dia -2, dia +38, dia +103) é mostrado na Figura 39, e demonstra que o IgA do paciente é abaixo do limite de detecção. O sumário mostra carga de mieloma pesada no dia -2 e nenhuma detectável no dia +38 e +103, que classifica o paciente como "MRD negativo" por análise de fluxo. No dia +103, o sumário mostra recuperação de normais, policlonais, células plasmáticas CD19+ e células B. O paciente não teve nenhum sintoma de doença ou terapia e está funcionando como uma pessoa normal.

[00889] O segundo paciente tratado ainda não atingiu o ponto do tempo de dia +100. Entretanto, neste ponto do tempo, está indo muito bem, porém é muito cedo para determinar o efeito da infusão de CTL019.

Exemplo 7: Terapia combinada de inibidor de cinase/célula T CAR19 para linfoma de célula do revestimento.

[00890] Terapia de célula T adotiva mantém promessa considerável para o tratamento de malignidades linfoides. Respostas clínicas promissoras em linfoma linfocítico pequeno/leucemia linfocítica crônica (SLL/CLL) e leucemia linfocítica aguda (ALL), usando transferência adotiva de células T autólogas transduzidas com receptores de antígeno quiméricos (CAR) contra o antígeno CD19 específico de célula B (células T CAR19 / células CART19) usando CTL109. Reportamos recentemente dados iniciais sobre 3 pacientes de SLL/CLL refrativos à quimioterapia arrolados em experiência de fase I para tratar malignidades positivas de CD19 usando CAR específico de CD19 (células T CAR19 / células CART19). O método usado envolveu a modificação genética de células T de volume derivadas de paciente usando a lentivírus para expressar um CAR alvejando CD19 que contém domínios de sinalização derivados de CD137 e TcRz. Para este estudo as células foram expandidas usando nossa metodologia de expansão de conta anti-CD3 e -CD28, e células foram infundidas precocemente após linfodepleção sem suporte de citocina (Kalos M, et al. (2011) Sci Transl Med. 3: 95ra73; e Porter DL, et al. (2011) N Engl J Med. 365: 725-733). Estes resultados precoces foram extremamente promissores: (i) seguindo um único curso de tratamento 2/3 pacientes obtiveram completas remissões e permanecem livres de doença agora em 15+ meses após o tratamento, ao mesmo tempo em que o terceiro paciente, que foi tratado com corticosteroides logo após a infusão de célula T demonstrou uma forte resposta parcial. (ii) Nestes pacientes foram capazes de recapitular os elementos acreditados ser requeridos para eficácia final de estratégias com base em terapia de célula T adotiva, a saber, expansão de célula T in vivo robusta, erradicação da doença, contração de célula T, e persistência funcional a longo prazo. Até esta data, 10 pacientes de SLL/CLL foram tratados com 2 permanecendo na remissão clínica e molecular completa, 5 experimentando remissão parcial, e 3 apresentando ausência de resposta mensurável. Em outro estudo, dois pacientes com ALL de célula B obtiveram completa remissão com 1 reincidindo com células leucêmicas sem expressão de CD19.

[00891] Linfoma de célula de revestimento (MCL), tanto antes quanto depois da transformação de célula grande, também provavelmente se beneficiará da terapia adotiva com base em CART19, em particular quando combinado com inibidores de cinase tal como aqueles que afetam diretamente células MCL.

[00892] Para também analisar a combinação de terapia adotiva com base em CART19 em combinação com inibidores de cinase, análises de alta capacidade serão usadas para avaliar diversos inibidores alvejando as cinases críticas para patogênese de MCL: CDK4/6, BTK, e mTOR em combinação com células CART19. As combinações mais promissoras serão avaliadas em maiores detalhes, tanto in vitro quanto in vivo, em modelo de camundongo de xenotransplante de MCL, que finalmente podem orientar o desenvolvimento de um protocolo clínico para avaliar a combinação de inibidor de cinase de molécula pequena e a imunoterapia de célula CART em pacientes de MCL.

[00893] Neste estudo, estudos pré-clínicos serão realizados para determinar eficácia clínica potencial deste método nos vários subtipos de MCL e para avaliar a capacidade de alvejar terapeuticamente células MCL usando células CART19 ou sozinhas ou em combinação com inibidores de molécula pequena de proteínas selecionadas da expressão e atividade de família cinase de que é crítica para sobrevivência e crescimento de células MCL.

Planejamento de Pesquisa

[00894] Em um cenário pré-clínico, a capacidade de terapeuticamente alvejar células MCL, tanto cultivadas quanto células do tipo primárias, usando inibidores de cinases com relevância patogênica documentada em MCL e células CART19 será avaliada. Um ensaio MTT de alta capacidade será usado para determinar o efeito destes agentes para identificar combinações ideais potenciais, dosagem e tempo da aplicação do agente. As 2 a 3 combinações mais promissoras serão avaliadas em maiores detalhes com respeito à função celular, sinalização celular com base em fosforilação, e expressão de gene primeiro in vitro e posteriormente in vivo no modelo de xenotransplante de MCL.

Estudos in-vitro para caracterizar a capacidade de combinações de inibidor de cinase/célula CART-19 para efetivamente alvejar células MCL

[00895] Neste objetivo, ensaios funcionais, fenotípicos, bioquímicos, e moleculares detalhados listados acima para estudar in vitro o impacto dos inibidores de cinase de molécula pequena em células MCL, bem como para examinar interações entre células CART19 e células MCL e o impacto dos inibidores sobre estas interações seja examinado.

[00896] Os valores de referência para atingir este objetivo serão para gerar um conjunto de dados abrangente para:

[00897] i. Documentar que células CART19 são ativadas por e lisam as células MCL cultivadas e primárias;

[00898] ii. Demonstrar que os inibidores de cinase selecionados realçam a capacidade um do outro e/ou células CART19 para eliminar células MCL sem impactar negativamente a função de célula CART19 quando apropriadamente aplicados com respeito à dose e, para alguns, tempo do inibidor vs. Administração de célula CART19; e

[00899] iii. Estabelecer um regime para a escala e dosagem para o inibidor de BTK a ser usado nos experimentos de xenotransplante de MCL in vivo usando os camundongos NSG.

[00900] Os objetivos deste estudo são, por exemplo, avaliar seja identificar as combinações terapêuticas ideais de inibidores de molécula pequena alvejando cinases críticas para patologia de MCL: CDK4, BTK, e mTOR junto com células CART19, monitor a atividade de CART19, e caracterizar os efeitos funcionais, bioquímicos, e moleculares da terapia sobre MCL.

[00901] Estes estudos devem estabelecer um esquema racional para escala para o tempo e dose de inibidor de cinase de tratamento de BTK em conjunção com terapia de CART19 a ser avaliada in-vivo em objetivo 2.

Estudos in-vivo para avaliar a capacidade de células CART19 alvejarem linfoma folicular, sozinhas e em combinação com inibidor de BTK

[00902] Neste objetivo, testaremos em modelos animais a capacidade das combinações de inibidor selecionado/célula CART19 afetarem o crescimento de células MCL estabelecidas e primárias.

[00903] Os valores de referência para realizar este objetivo serão para gerar um conjunto de dados para:

[00904] i. demonstrar que a combinação de inibidor selecionado /célula CART19 acentuadamente realça a sobrevivência de animais enxertados com MCL em comparação com os controles (animais tratados com agente único e de simulação);

[00905] ii. estabelecer um regime para a escala e dosagem para a combinação de inibidor de cinase selecionado/CART19 a ser usada como a base para uma futura experiência clínica.

[00906] Os objetivos deste estudo incluem a avaliação do tratamento e escala de dose definidas no objetivo 1 para a combinação de inibidor de cinase identificado/CART19 mais inibidor de BTK, e testar se o tratamento com BTK sinergiza com CART19 para alvejar MCL em camundongos NSG xenotransplantados com células MCL, tanto cultivadas quanto primárias.

[00907] Os seguintes tipos celulares, compostos, animais e metodologias experimentais serão usados para realizar os objetivos propostos:

Células MCL:

[00908] Quatro linhagens de célula MCL (Jeko-1, Mino, SP-49, e SP- 53) e viavelmente amostras congeladas de 15 MCL primárias (12 típicas e 3 blastoides). Ao mesmo tempo em que as linhagems celulares desenvolvem-se bem espontaneamente, as células primárias serão cultivadas sozinhas, bem como na presença de meio condicionado coletado de células estromais de medula óssea HS5 para melhorar sua viabilidade.

Células CART19:

[00909] Células T humanas primárias criadas para expressar CAR19 serão geradas usando transdução de lentivírus e usando os protocolos estabelecidos ((Kalos M, et al. (2011) Sci Transl Med. 3: 95ra73; e Porter DL, et al. (2011) N Engl J Med. 365: 725-733). Após um único evento de transdução células T tipicamente expressam CAR19 em frequências excedendo a 30%.

[00910] Os estudos usarão populações de CART 19 de cinco pacientes de SLL/CLL (50 a 100 frasconetes/paciente com 1x107 células/frasconetes já estão disponíveis). Células CART19 serão identificadas usando um anticorpo de idiotipo específico anti-CAR19 (STM). A atividade de CART19 será controlada tanto in vitro quanto in vivo em camundongos NSG da maneira padronizada usando linhagems celulares NALM-6 CD19+, K562 CD19-negativo, e K562 transduzidas por CD19. Embora a função de célula CART19 não seja restrita a MHC, célula CART19 de pelo menos 5 pacientes de MCL também serão usados.

Inibidores de cinase

[00911] Inibidores das seguintes cinases serão testados: CDK4/6 (PD0332991), BTK (PCI-32765), mTORC1 (rapamicina), MNK (4- Amino-5-(4-fluoroanilino)-pirazolo [3,4-d]pirimidina (Marzec M, et al. PLoS One 6:e24849); e um novo composto de Eli Lilly (Gupta M, et al. (2012) Blood 119:476-487); mTOR (OSI-027), e dual PI3K/mTOR (PF- 04691502).

[00912] Os compostos serão avaliados primeiro no espectro predeterminado de doses efetivas, incluindo as concentrações não tóxicas atingidas em soros de pacientes, para garantir a inibição de cinase ideal.

Animais:

[00913] Os experimentos in-vivo serão realizados usando camundongos nulos de NOD-SCID-IL-2Rgc (NSG) que são criados e disponíveis do Stem Cell e Xenograft Core usando reprodutores obtidos de Jackson Laboratory (Bar Harbor). Camundongos serão alojados em condições estéreis usando microisoladores HEPAfiltrados e alimentados com alimento irradiado e água acidificada.

[00914] Camundongos transplantados são tratados com antibióticos (neomicina e polimixina) para a duração do experimento. Animais com seis a oito semanas de idade, misturas iguais de machos e fêmeas, serão utilizados para todos os estudos de acordo com os protocolos aprovados pelo Institutional Animal Care e Use Committee.

[00915] Utilizou-se animais NSG em estudos de transferência adotiva de célula T anteriores especificamente para avaliar a atividade diferencial de células CART19 (Witzig TE, et al. (2010) Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2010:265-270, ensaio MTT). O ensaio MTT de alta capacidade para avaliar o crescimento de célula MCL será realizado primeiro em resposta ao inibidor de cinases aplicado sozinho ou em várias combinações. Este ensaio é capaz de simultaneamente determinar a taxa e viabilidade de proliferação celular, permitindo avaliação eficiente de muitas combinações possíveis de inibidores de molécula pequena na presença ou ausência de células CART19. Os aspectos chave desta análise serão caracterizar o efeito de fármaco com respeito ao efeito potencial sinérgico, aditivo, ou antagonístico. Além disso, o efeito dos inibidores de molécula pequena sobre células CART19 será avaliado. Ao mesmo tempo em que a inibição de BTK deve ser específica de célula B, inibição de mTOR e CDK4/6 afetará células CART19. Estabelecimento do tempo apropriado da aplicação de fármaco para minimizar seu efeito potencial sobre células CART19 será aquele dos objetivos destes experimentos.

[00916] Para realizar o teste, células MCL serão semeadas em placas de 96 cavidades em 1x104células/cavidade, em triplicatas, e expostas a meio ou inibidores de cinase em várias combinações e várias concentrações de células CART-19. Após 48 e 74 horas, o número relativo de células metabolicamente ativas será determinado pelo uso de ensaio colorimétrico de redução de MTT (Promega).

[00917] A significância de diferença entre os valores médios (+/- S.D.) dos controles e diferentes condições de tratamento será avaliada usando test t de Student com o valor P de < 0,05 considerado ser estatisticamente significante.

Ensaios de proliferação celular e apoptose:

[00918] As combinações de fármaco mais promissoras serão em seguida avaliadas nos ensaios de rotulagem de CFSE e rotulagem de extremidade de entalhe dUTP terminal (túnel) para determinar ambos os componentes citostáticos e citotóxicos de inibição de crescimento de célula MCL, respectivamente. No primeiro ensaio, células MCL serão rotuladas com adição de CFSE do inibidor de BTK e/ou células CART- 19 não rotuladas. Após 48 horas, as células cultivadas serão as analisadas por FACS para o padrão de rotulagem de CFSE das células tipo MCL. O ensaio de túnel será feito usando o Kit de Ensaio de Fragmentação de DNA ApoAlert de BD Biosciences de acordo com o protocolo do fabricante.

[00919] Em síntese, células MCL serão cultivadas com os inibidores e/ou células CART19 durante 48 ou 72 horas. Após ser lavadas, as células serão manchadas com anticorpo anti-CD20 rotulado e permeabilizadas, lavadas, e incubadas em tampão TdT durante 1 hora a 37°C. A reação será interrompida, as células lavadas, ressuspensas, e analisadas por citometria de fluxo usando o software CellQuest PRO.

Ensaios funcionais de CART 19:

[00920] Serão avaliados a atividade efetora de células CART19 contra linhagems de célula MCL usando desgranulação de CD107, ensaios de Secreção de Citocina Intracelular (ICS), ensaios de citólise de proliferação, e ensaios de detecção de citocina multiplex (32). Para desgranulação e ensaios ICS, efetoras (células T) e Alvo (células de tumor) serão coincubadas na presença de anticorpo anti-CD107 durante 4 horas em E:T de 0.2:1 seguido por manchamento para superfície (CAR19, CD3, CD8, CD4) e marcadores de citocina intracelular de acordo com os protocolos estabelecidos. Citólise de células MCL será avaliada usando ensaios de citólise com base em citometria de fluxo. Para ensaios de proliferação, células efetoras serão pré-carregadas com CFSE (Carboxifluoresceína sucinimidil éster carbóxi-fluorosceína- sucinil esterase), misturadas com células alvo em E:T de 0.2:1, co- incubadas a 37oC durante 4 dias, manchadas para marcadores de superfície (CAR19, CD3, CD8, CD4) e analisadas quanto à diluição de CFSE por citometria de fluxo.

Ensaios de citocina multiplex

[00921] Será avaliada a produção de citocinas por células CART19 em resposta a alvos de MCL usando ensaios de conta com base em Luminex como descrito no (STM32). Para estas análises será empregado o kit Invitrogen 30-plex que simultaneamente mede IL-1ß, IL-1RA, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12 (p40p70), IL- 13, IL-15, IL-17, TNF-a, IFN-a, IFN-Y, GM-CSF, MIP-1a, MIP-1ß, IP-10, MIG, Eotaxina, RANTES, MCP-1, VEGF, G-CSF, EGF, FGF-basic, e HGF em soro, plasma, ou sobrenadante de cultura de tecido.

Análise de citometria multiparamétrica de fluxo de células CART19T:

[00922] Será avaliada a modulação de marcadores de superfície associada com ativação funcional e supressão de células CART19 seguindo co-incubação com células de tumor usando citometria de fluxo de quatro cores e um BD LSR II comum equipado com 4 laseres (azul (488 nM), violeta (405 nM), verde (532 nM), e vermelho (633 nM) disponível pela University of Pennsylvania Abramson Cancer Center Flow Cytometry Core. Todos os dados de citometria de fluxo serão analisados usando o software FlowJo (TreeStar, San Carlos, CA). Estas análises serão realizadas essencialmente como descrito no (STM42), usando um canal de descarga para excluir células mortas e células alvo (CD19+), e um reagente específico de idiotipo de CAR19 para detectar células CART19 (STM). Serão avaliados os seguintes marcadores sobre células positivas e negativas de CART19 (CD3+/CD8+ e CD3+/CD4+) pós co-incubação com células de tumor, sobre células intactas ou permeabilizadas quando necessário. Estabelecemos painéis multiparamétricos para estes marcadores: - função de ativação/efetora: CD25, CD154, CD134, CD137, CD69, CD57, CD28, T-bet - inibição: CD152 (CTLA4), PD1, LAG3, CD200 - supressão (Treg) CD4+/CD25++/CD127-, Fox-P3+

[00923] Simultaneamente, células MCL identificadas por manchamento de CD19 e CD5, serão examinadas para expressão das proteínas imunossupressivas: CD174 (PD-L1) CD173 (PD-L2) e CD152.

Impacto inibidor sobre sinalização celular:

[00924] Esta parte do estudo focará apenas nos compostos selecionados; aqueles que provaram ser os mais efetivos nos ensaios funcionais (crescimento celular, proliferação, e apoptose) descritos acima. O efeito será estudado separadamente para cada fármaco e para as combinações selecionadas e os estudos serão ajustados aos compostos específicos. Por exemplo, ao mesmo tempo em que a combinação dos inibidores de mTORC1 e MNK avaliará a sinalização de mTORC1, em particular a fosforilação de eIF-4E, inibição de BTK focará nas séries de reação de PI3K-AKT e MEK-ERK, e inibição de CDK4/6 em fosforilação de Rb. Estes estudos serão realizados por Western blotting usando anticorpos fosfoespecíficos como descrito (Marzec M, et al. (2006) Blood. 108:1744-1750; Marzec M, et al. (2008) Blood 111: 2181-2189; Zhang Q, et al. (2011) Proc Natl Acad Sci USA 108: 11977-11982). Em síntese, as células MCL serão lisadas e os extratos de proteína serão ensaiados usando o método Lowry (Bio-Rad) e carregadas no gel de poliacrilamida. Para examinar a fosforilação de proteína, as membranas manchadas serão incubadas com os anticorpos fosfor-específicos, por exemplo, aqueles específicos para S6rp S235/236, eIF4E S209, 4E-BP1 T37/46, 4E-BP1 T70 (Sinalização Celular) para avaliar a atividade mTORC1 e MNK e sua inibição. Em seguida, as membranas serão incubadas com os anticorpos secundários, conjugados a peroxidase apropriados. As manchas serão desenvolvidas usando o ECL Plus System from Amersham.

Análise de expressão de gene de escala de genoma:

[00925] Inibição de sinalização celular tipicamente leva a mudanças em transcrição de gene. Para determinar os efeitos do inibidor selecionado, ou alguns inibidores sobre a transcrição de gene em MCL, uma análise de expressão de gene de escala de genoma será realizada do mesmo modo descrito no Marzec M, et al. (2008) Blood 111: 21812189; Zhang Q, et al. (2011) Proc Natl Acad Sci USA 108: 11977-11982. Em síntese, as células serão tratadas em culturas triplicadas com o inibidor selecionado ou seu diluente durante 0, 4, e 8 horas. O RNA total será também purificado para enriquecer para mRNA que será transcrito em reverso, rotulado e examinado por hibridização para o microchip Affimetrix contra todos os éxons de gene conhecidos. Os dados de microensaio serão normalizados e sumariados usando RMA como implementado em GeneSpring e algoritmo MAS5. Os valores p resultantes serão corrigidos para teste múltiplo usando falsa taxa de constatação (FDR) pelo Benjamini-Hochberg Step-up Method. O teste de expressão diferencial será realizado usando uma variedade de ferramentas incluindo SAM e PartekPro. Os genes de interesse emergentes em seguida serão agrupados com base nos padrões de expressão (GeneSpring ou Spotfire), e os grupos serão analisados para grupos funcionais e séries de reação em KEGG, Ingenuity Pathway Analysis, e bases de dados de Gene Ontology usando o NIH-David como a ferramenta de pesquisa. Para os genes identificados com base nos dados, a confirmação de expressão independente pela RTPCR quantitativa será realizada em um maior conjunto de amostras (pelo menos 20) de vários tipos de MCL (padrão vs. blastoide e SOX11- positivo vs. SOX11-negativo).

Análise de Sequência de DNA de exoma total:

[00926] Para melhor caracterizar os casos de MCL com respeito a sua patogênese e, para a possível extensão, resposta às terapias de combinação aqui propostas, a sequência de DNA exômico será examinada. Captura de exoma total e seqüenciamento de geração seguinte da MCL e amostras de DNA de sangue periférico normal serão realizadas usando o NimbleGen Sequence Capture 2.1M Human Exome Array e o instrumento HiSeq 2000/1000 Illumina.

Avaliação do efeito do tratamento nos tumores xenotransplantados:

[00927] Os camundongos NSG transportarão os tumores de MCL (derivados de ambas as linhagens de célula MCL: Jeko e Mino e células primárias implantadas como ou fragmentos de tecido ou, menos preferivelmente, suspensões celulares). Os tumores serão propagados por implante subcutâneo dos pequenos fragmentos de tumor. A terapia será iniciada assim que os tumores atingiram 0,2-0,3 cm de diâmetro. Os inibidores de cinase serão administrados por gavagem em dose e tempo pré-selecionados in vitro (por exemplo, esperamos aplicar o inibidor de BTK simultaneamente com células CART19, devido a sua especificidade de célula B e ausência esperada de qualquer efeito inibitório sobre células CART19). Células CART-19 serão injetadas na veia do rabo dos camundongos transportando tumor em uma dose de 1x107/animal, o inibidor de cinase(s) será administrado por gavagem em dose e tempo pré-selecionado in vitro. Estabelecemos uma dose ser suficiente para reproduzivelmente erradicar células malignas e, ao mesmo time, não induzir doença de xenoenxerto versus hospedeiro. Um grande estoque mestre de células CART19 (1x 1010) será gerado e congelado para minimizar a variabilidade associada com diferenças celulares efetoras. A medida primária destes experimentos será a sobrevivência, que será avaliada usando curvas Kaplan/Meier. Como uma medida secundária, será avaliada a expansão diferencial de células CART19 em animais após a infusão de célula T. Isto será tornado possível pelo fato de que o produto de célula T infundida será composto de células positivas e negativas de CART19 em uma relação definida. Para estes ensaios, os animais serão sangrados semanalmente por sangramento da veia no rabo (25 microlitros de cada vez), seguido por lise de células vermelhas sanguíneas e manchamento para CD3, CD4, CD8, e CART19 humanas. Expansão preferencial de células CART19 (pelo menos a 2 vezes de aumento na relação de CART19+/CART19-) será evidência de expansão de célula CART19 direcionada por MCL seletiva. Para estimar os resultados do tratamento, volumes dos tumores subcutâneos implantados serão medidos, determinados como segue, de acordo com a fórmula: volume = 0,4ab2, onde a e b designam respectivamente diâmetros longos e curtos do tumor. Diferenças de volumes de tumor entre os grupos tratados e não tratados de camundongos serão estatisticamente analisadas usando um teste t padrão. Os camundongos serão sacrificados ou no término dos experimentos (>30 dias), ou se os tumores atingirem > 1,2 cm de diâmetro, ou quando qualquer evidência do sofrimento do animal é observada. As diferenças de volumes de tumor entre os grupos tratados e não tratados de camundongos serão estatisticamente analisadas usando um teste t padrão. Os tumores, bem como os órgãos internos serão colhidos, processados e analisados por histologia e, para tecidos selecionados, por imunoistoquímica usando a bateria de anticorpos contra células B (CD20, CD79a, Pax-5, CD10, BCL-6) e células T (CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, TIA-1), e o marcador de proliferação Ki-67.

Análise estatística:

[00928] Nos estudos funcionais in vitro, a significância de diferença entre os valores médios (+/- S.D.) dos controles e diferentes condições de tratamento será avaliada usando o teste t de Student com o valor P de < 0,05 considerado ser estatisticamente significante. Com base em nossa experiência anterior, espera-se que as diferenças entre os grupos de camundongo experimentais sejam grandes. Desse modo, 10 camundongos NSG serão usados para cada grupo de tratamento, que assegurará pelo menos 90% de força a nível de erro tipo 1 de 0,05 com uma amostra de dois lados /-test, dado a relação entre as diferenças em tratamento, a média e desvio padrão é pelo menos 3, que é esperada. Os dados serão apresentados como media ± SEM. A comparação entre os grupos será feita usando o teste t de duas amostras. Um valor de p < 0,05 é considerado ser significante. Para estudos de sobrevivência sem tumor, grupos de 10 camundongos serão usados para comparação de sobrevivência, e o estado da doença (tumor vs. nenhum tumor) e tempo sem tumor para cada camundongo serão registrados. A curva de sobrevivência Kaplan-Meier será plotada e o teste de classificação log será realizado para comparar as curvas de sobrevivência. O nível de significância é controlado a 0,05.

Exemplo 8: Terapia combinada de Ibrutinibe/célula T CAR19 para linfoma de célula do revestimento

[00929] Os experimentos descritos neste exemplo caracterizam a atividade de CART19 em combinação com tratamento com ibrutinibe para tratar linfoma de célula de revestimento in vitro e in vivo. Ibrutinibe é um inibidor de molécula pequena de BTK frequentemente usado para tratamento de alguns cânceres hematológicos. Os experimentos in vitro descritos aqui incluem a avaliação de proliferação, produção de citocina, desgranulação de CD107a, e citotoxicidade. Modelos de camundongo de Xenoplant foram utilizados para investigar a eficácia e dosagem ideal de CART19 com tratamento com ibrutinibe in vivo. Embora o ibrutinibe apresente considerável atividade em MCL, cerca de 30% de pacientes não respondem e entre os respondedores, apenas 21% a cerca de um terço experimentam completa remissão (Wang et al. NEJM 369.6(2013):507-16). A obtenção de uma completa emissão está associada com sobrevivência sem progresso melhorado. Além disso, terapia pode levar à resistência ao fármaco com a duração deresposta média de 17,5 meses. Em alguns cenários, mutações em sítios de ligação a BTK ou imediatamente a jusante foram observadas após terapia com ibrutinibe, realçando um mecanismo de resistência ao fármaco que pode se tornar cada vez mais frequente. Veja, por exemplo, Woyach et al. NEJM. 370.24(2014):2286-94. Além disso, bloqueio de função de BTK leva à inibição de sinalização de receptor de célula B (BCR) e não é diretamente citotóxico. Veja, por exemplo, Ponader et al. Blood. 119.5(2012):1182-89. Ausência de citotoxicidade e falência para erradicar clones malignos predispõe à evolução clonal sob uma pressão de seleção. Além disso, constataçãos preliminares de transformação aumentada para doença agressiva em pacientes tratados com ibrutinibe para CLL são consideradas. Veja, por exemplo, Byrd et al. NEJM. 369.1(2013):32-42; e Parikh et al. Blood. 123.11(2014):1647-57.

[00930] Infusão de células T autólogas transduzidas com receptores de antígeno quiméricos (CAR) contra o antígeno de CD19 específico de célula B (CTL019, CART19) leva a respostas clínicas dramáticas na maioria dos pacientes com vários neoplasmas de célula B, principalmente leucemia linfoblástica aguda (ALL). Veja, por exemplo, Maude et al. NEJM. 371.16(2014):1507-17; e Ruella et al. Expert Opin. Biol. Ther. (2015):1-6. A presença de massas de linfonodo ou doenças volumosas pode levar à infiltração de célula T diminuída e conseqüente atividade antitumor reduzida. Linfadenopatia volumosa não parece prejudicar a resposta a ibrutinibe. Wang et al. NEJM. 369.6(2013):507- 16. Além disso, ibrutinibe tem mostrado particular eficácia na redução de massas de tumor e mobilização de células B neoplásicas no sangue periférico.

Métodos

[00931] Linhagens celulares e amostras primárias. Linhagens de célula MCL foram obtidas de ATCC (Mino, Jeko-1, SP-49) ao mesmo tempo em que MCL-RL foi generada de uma efusão pleural progressiva de um paciente de MCL. Para experimentos in vitro, linhagens celulares foram mantidas em cultura com meio RPMI suplementado com soro de bezerro fetal a 10%, penicilina, e estreptomicina. Para alguns experimentos, células de MCL-RL e Jeko-1 foram transduzidas com luciferase verde de bezerro clique/eGFP e em seguida classificadas para obter uma população >99% positiva. As linhagens de célula de leucemia aguda MOLM-14, K562 ou NALM-6 e a linhagem de célula TALL JURKAT foram usadas como controles. Estas linhagens celulares foram originalmente obtidas da ATCC. Espécimes de medula óssea de MCL humana primária não identificados (BM) e de sangue periférico (PB) foram obtidos das práticas clínicas da University of Pennsylvania. Para todos os estudos funcionais, células primárias foram descongeladas pelo menos 12 horas antes do experimento e repousadas a 37° C.

[00932] Geração de construtos de CAR e células CAR T. O receptor de antígeno quimérico anti-CD19 murino (contendo uma articulação CD8, domínio coestimulatório 41BB e domínio de sinalização CD3 zeta) foi gerado como previamente descrito. Veja, por exemplo, Milone et al. Molecular Therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy. 17.8 (2009):1453-64. Produção de células T expressando CAR foi realizada como previamente descrito. Veja, por exemplo, Gill et al. Blood. 123.15 (2014): 2343-54. Células T CD4 e CD8 doadoras normais ou células mononucleares PB (PBMC) foram obtidas do Human Immunology Core of the University of Pennsylvania. Células T foram semeadas a 1x106/mL, com uma relação de CD4:CD8 de 1:1 e expandidas em meio X-vivo 15 (Lonza, 04-418Q), AB de soro humano a 5% (Gemini, 100-512), penicilina/estreptomicina (Gibco, 15070063) e Glutamax (Gibco, 35050061) usando Dynabeads anti-CD3/CD28 (Life Technologies, 11161D) adicionadas no dia 1 de cultura e removidas no dia 6. Células T foram transduzidas com lentivírus no dia 2. Células T foram expandidas em cultura durante 8 a 15 dias e colhidas quando o volume celular médio ficou abaixo de 300 fl. Células T foram em seguida criopreservadas em FBS 10% DMSO para futuros experimentos. Antes de todos os experimentos, células T foram descongeladas e repousadas durante a noite a 37° C.

[00933] Ibrutinibe. ibrutinibe (PCI-32765) foi adquirido de MedKoo (#202171) ou Selleck Biochemicals (#S2680) como um pó ou solução de DMSO. Para experimentos in vitro, ibrutinibe foi diluído para as concentrações de 10, 100 e 1000 nM. Para experimentos in vivo, pó de ibrutinibe foi dissolvido em uma solução de HP-beta-ciclodextrina a 10% (1,6 mg/mL) e administrado a camundongos na água de beber.

[00934] Análise de citometria de fluxo multiparamétrica.Anticorpos anti-humanos foram adquiridos de Biolegend, eBioscience, ou Becton Dickinson. As células foram isoladas de cultura in vitro ou de animais, lavadas uma vez em PBS suplementada com 2% de soro de bezerro fetal, e manchadas durante 15 minutos em temperatura ambiente. Para a quantificação de número de células, contas de Countbright (Invitrogen) foram usadas de acordo com as instruções do fabricante. Em todas as análises, a população de interesse foi controlada com base em características de dispersão dianteiras vs. Laterais seguidas por controle de singleto, e as células vivas foram controladas usando Live Dead Aqua (Invitrogen). O controle de tempo foi incluído para o controle de qualidade. A expressão de superfície de CAR19 foi previamente detectada como descrito. Veja, por exemplo, Kalos et al. Science Translational Medicine. 3.95(2011):95ra73. A citometria de fluxo foi realizada em um citômetro de Fortessa-LSR de quatro lasers (Becton- Dickinson) e analisada com FlowJo X 10.0.7r2 (Tree Star).

[00935] Ensaio de desgranulação.O ensaio de desgranulação foi previamente realizado como descrito. Veja, por exemplo, Kalos et al. Science Translational Medicine. 3.95(2011):95ra73. As células T foram incubadas com células alvo em uma relação de 1:5 em meios de células T. Anticorpos anti-CD107a-PECY7 (Biolegend), anti-CD28 (BD Biosciences), anti-CD49d (BD Biosciences) e monensina (BD Biosciences) foram adicionados à cocultura. Depois de 4 horas, as células foram colhidas e manchadas para expressão de CAR, manchamento de CD3, CD8 e Live aqua (Invitrogen). As células foram fixadas e permeabilizadas (tampões Invitrogen Fix/Perm) e o manchamento intracelular foi em seguida realizado para detectar múltiplas citocinas (IFN, TNFa, IL-2, GM-CSF, MIP1b).

[00936] Ensaio de proliferação.As células T foram lavadas e ressuspensas em 1x107/mL em 100 ul de PBS e manchadas com 100 ul de CFSE 2,5 uM (Invitrogen) durante 5 minutos a 37° C. A reação foi em seguida extinguida com meios frios, e as células foram lavadas três vezes. Os alvos foram irradiados em uma dose de 100 Gy. As células T foram incubadas em uma relação de 1:1 com células alvo irradiadas durante 120 horas, adicionando-se os meios em 24 horas. As células foram em seguida colhidas, manchadas para CD3, CAR e Live Dead aqua (Invitrogen), e as contas de Countbright (Invitrogen) foram adicionadas antes da análise citométrica de fluxo para quantificação absoluta.

[00937] Ensaios de citotoxicidade.Células Luciferase/eGFP+ NALM- 6 ou RL foram previamente usadas para ensaio de citotoxicidade como descrito. Veja, por exemplo, Gill et al. Blood. 123.15(2014):2343-54. Os alvos foram incubados nas relações indicadas com células T efetoras durante 4 ou 16 horas. O extermínio foi calculado por imageamento de bioluminescência em uma câmera Xenogen IVIS-200 Spectrum.

[00938] Medidas de citocina.Células alvo e efetoras foram coincubadas em uma relação de 1:1 em meios de células T durante 24 h. O sobrenadante foi colhido e analisado por disposição de Luminex 30-plex (Luminex Corp, FLEXMAP 3D) de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen). Veja, por exemplo, Kalos et al. Science Translational Medicine. 3.95(2011):95ra73.

[00939] Experiências In vivo. Camundongos NOD-SCID -/- de cadeia Y (NSG) originalmente obtidos de Jackson Laboratories foram adquiridos de Stem Cell e Xenograft Core of the University of Pennsylvania. Todas as experiências foram realizadas em protocolos aprovados pelo Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC). Diagramas esquemáticos dos modelos de xenoenxerto utilizados são discutidos aqui. As células (linhagens celulares de MCL ou células T) foram injetadas em 200 ul de PBS na concentração indicada nas veias do rabo dos camundongos. O imageamento bioluminescente foi realizado usando uma câmera Xenogen IVIS-200 Spectrum e analisado com o software de LivingImage v. 4.3.1 (Caliper LifeSciencies). Os animais foram eutanizados no final da experiência ou quando eles conheceram as finalidades pré-especificadas de acordo com os protocolos de IACUC.

[00940] Imunoistoquímica. O manchamento imunoistoquímico (IHC) de tecidos incrustados com parafina fixados em formalina foi realizado em um instrumento Leica Bond-III usando o Bond Polymer Refine Detection System. Os anticorpos contra CD3, CD4, CD8, Pax5 e CyclinD1 foram usados não diluídos. A recuperação de epitopo induzida por calor foi realizada durante 20 minutos com solução de ER2 (Leica Microsystems AR9640). As imagens foram digitalmente adquiridas usando o Aperio ScanScopeTM.

[00941] Análise estatística. Todas as estatísticas foram realizadas usando GraphPad Prism 6 para windown, versão 6.04.

Linhagens celulares de linfoma de célula de revestimento

[00942] A maioria das linhagens de linfoma de célula de revestimento (MCL) na existência foi imortalizada e propagada por muitas gerações in vitro, desse modo perdendo sua dependência na sinalização do receptor de célula B. Por conseguinte, elas são insuficientemente sensíveis ao ibrutinibe. Experiências in vitro foram realizadas para determinar a sensibilidade das linhagens de célula de MCL no tratamento com ibrutinibe. Estas linhagens celulares foram da mesma forma usadas para avaliar a eficácia do tratamento de combinação com ibrutinibe/CART19 em experiências discutidas também neste exemplo. Células de MCL foram colhidas da efusão pleural de um paciente com MCL recaído multiplicado. Ambas as células originais (RLprimária) e uma linhagem celular derivada delas (RL) tiveram uma morfologia blastoide, imunofenótipo de MCL típico e foram positivas para a translocação de t(11;14) clássica por hibridização in-situ por fluorescência (FISH) (FIG. 52A, 52B, 52C).

[00943] Células de RL e JEKO-1 foram cultivadas com doses diferentes de ibrutinibe (0,1 nM, 1nM, 10nM, 100nM, 1µM, e 10 µM) e a sensibilidade ao ibrutinibe foi determinada medindo-se a redução da bioluminescência (BLI). Como mostrado na FIG. 31A, células RL foram sensíveis ao tratamento com ibrutinibe de uma maneira dependente de dose. Entretanto, as células JEKO-1 foram resistentes ao tratamento com ibrutinibe (nenhuma demonstração de bioluminescência reduzida como uma função de dosagem de ibrutinibe aumentada).

[00944] A sensibilidade de céulas de RL, Jeko-1, e Mino ao ibrutinibe foi da mesma forma analisada usando um ensaio de MTT. A exposição de RL às concentrações crescentes de ibrutinibe in vitro levou a uma inibição dependente de dose de proliferação e da fosforilação de mediador a jusante, indicando um efeito em alvo de ibrutinibe, com uma IC50 de 10nM. Em comparação, as linhagens celulares de de MCL estabelecidas, Jeko-1 e Mino, foram relativamente resistentes ao ibrutinibe, com resultados de IC50 até 10 µM (FIG. 52D). Para confirmar RL como um modelo viável para experiências in vivo, camundongos nocaute de cadeia y NOD-SCID imunodeficientes (NSG) foram enxertados com 1x106 células RL expressando luciferase (FIG. 52E). Sua carga de tumor e sobrevivência foram avaliadas. Depois da injeção intravenosa, MCL foi enxertado em todos os camundongos e localizado no baço e fígado, seguido por disseminação à medula óssea, sangue e linfonodos (FIG. 52F). A histologia do baço e fígado afetados é consistente com a infiltração de parênquima de MCL. (FIG. 52G).

[00945] Estes resultados mostraram que estas linhagens celulares diferentes podem, portanto, ser usadas para apresentar igualmente o MCL sensível a ibrutinibe e resistente a ibrutinib.

Células de linfoma de célula de revestimento são sensíveis à exterminação por CART19

[00946] A maior parte do trabalho pré-clínico que mostra a eficácia de CART19 foi feito usando linhagens de célula B-ALL, que não são sensíveis ao ibrutinibe. Além disso, as melhores respostas clínicas até agora foram relatadas em pacientes com B-ALL, considerando que os pacientes com malignidades de célula B indolentes têm declaradamente respostas inferiores.

[00947] Para mostrar que MCL é sensível ao extermínio por CART19 neste modelo, célula T de doador saudável foram transduzidas com uma construção de CAR anti-CD19 que foi usada em tentativas clínicas. Veja, por exemplo, Porter, NEJM 2011. Uma série de experiências in vitro foram realizadas para mostrar que a linhagem celular sensível ao ibrutinibe RL e a linhagem celular resistente ao ibrutinibe Jeko-1 levam à desgranulação de CART-19 equivalente, produção de citocina, extermínio e proliferação (FIG. 53A, 53B, 53C, 53D). Além disso, o sangue periférico ou medula óssea foram obtidos de dois pacientes com MCL em fase leucêmica, permitindo a expansão e transdução de células T autólogas com CAR anti-CD19. Células de CART19 derivadas de pacientes autólogos foram reativas ao MCL considerando que as células T não transduzidas foram não reativas ao seu MCL autólogo respectivo (FIG. 53E, 53F). Estes resultados indicam que MCL é sensível às funções efetoras de CART19.

Avaliação de tratamento com ibrutinibe/CART19 in vitro

[00948] Um efeito de ibrutinibe em células T foi previamente descontado com base em ensaios de atividade a curto prazo, como descrito em Honigberg et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107(2010):13075-80. Depois, uma análise do efeito de ibrutinibe na cinase de célula T ITK foi relatada para suportar um papel imunomodulador de ibrutinibe em células T CD4 inibindo-se a polarização do tipo Th2. Veja Dubovsky et al. Blood 122.15(2013):2539- 49. A análise de citocina de pacientes tratados com CART19 por vários grupos indica que a terapia de CART19 está associada com ambos Th1 (IL2, IFNy, TNF), Th2 (IL-4, IL-5, IL-10) e outras citocinas (veja, por exemplo, Kalos et al. Science Translational Medicine 3.95(2011):95ra73). Neste exemplo, o efeito da função de CART19 foi avaliado com ibrutinibe acima e abaixo das concentrações de ibrutinibe que seriam esperadas em pacientes (concentração de pico média em soro 100-150ng/mL) Veja, Advani et al. J. Clin. Oncol. 2013; 31:88.

[00949] As células CART19 foram constatadas conter ITK. A estimulação não específica de células CART19 pelo TCR na presença de ibrutinibe levou a uma redução em ITK fosforilada (pITK-Y180) como previamente relatado para células T CD4+. Veja Dubovsky et al. Blood 122.15(2013):2539-49. Em comparação, a estimulação específica de células CART19 pelo CAR não levou à ativação de ITK diminuída (FIG. 54A). Esta observação indicou que a função de CART19 provavelmente não seria afetada adversamente por exposição ao ibrutinibe.

[00950] Além disso, a função in vitro a curto e a longo prazo de células CART19 na presença de ibrutinibe foi determinada. Ibrutinibe a clinicamente concentrações pertinentes não prejudicou CART19 célula proliferação, desgranulação ou produção de citocina; embora em concentrações suprafisiológicas, havia a inibição das funções da célula CART19, provavelmente representando a toxicidade não específica (FIG. 54B, 54C, 10B).

[00951] Em particular, PBMCs isoladas de um doador saudável normal foram transduzidas com uma construção de CAR anti-CD19 lentiviral como descrito acima. As células T expressando CAR19 resultantes (CART19) foram cultivadas e inoculadas para determinar a proliferação e capacidade de expansão. Uma relação de 1:1 de células T expressando CD4:CD8 foram cultivadas com ou sem concentrações diferentes de ibrutinibe (10nM, 100nM, e 1000 nM de ibrutinibe). Ibrutinibe foi adicionado em cada passagem da célula. O número de células foi contado no dia 0, dia 5, dia 6, dia 7, dia 9, e dia 10 (FIG. 9A). O volume da célula foi da mesma forma monitorado (FIG. 9B).

[00952] O manchamento de CFSE e análise de citometria de fluxo foram da mesma forma usados para avaliar a proliferação das células CART19 na presença de ibrutinibe depois da estimulação por linhagens de célula de tumor MOLM14, JEKO-1, e RL. MOLM14 é uma linhagem de célula de AML, e JEKO-1 e RL são linhagens de célula de linfoma de célula de revestimento. Especificamente, as células RL são uma nova linhagem de célula de MCL derivada de células B neoplásicas obtidas de uma efusão pleural de um paciente com MCL recaído. As células CART19 e células de tumor foram misturadas em uma relação de 1:1 e a proliferação foi avaliada durante 5 dias. A porcentagem da proliferação das células é designada em cada histograma na FIG. 10A. A quantificação da proliferação como mostrado na FIG. 10B mostra que doses altas de ibrutinibe poderiam inibir a proliferação de célula CART 19 durante a cocultura com linhagens de célula de MCL.

[00953] A desgranulação das células T indica a ativação das células T citolíticas e a capacidade de iniciar a citotoxicidade específica de antígeno. CD107a é um marcador funcional da desgranulação de células T transitoriamente expressas na superfície da célula depois da estimulação da célula T. A análise por citometria de fluxo foi usada para quantificar as células T CART19 expressando CD107a após a estimulação com linhagens de célula de tumor MOLM14, JEKO-1, e RL. As células expressando CD107a estavam presentes no Q2 (quadrante 2) dos perfis de célula mostrados na FIG. 11A. A quantificação dos resultados obtidos dos perfis da FIG. 11A é mostrada na FIG. 11B. Estes resultados indicam que a cocultura das células CART19 com MCL-RL ou JEKO-1 levou à desgranulação de CD107a específica de CAR volumosa.

[00954] A produção de citocina por célula T CART19 na presença de ibrutinibe foi da mesma forma quantificada após a estimulação por linhagens de célula de tumor diferentes. A produção de IL-2, TNF-a, e IFN-y foi avaliada por citometria de fluxo. As células que produzem as citocinas estão presentes no quadrante 2 dos perfis mostrados na FIG. 12, FIG. 13, e FIG. 14. Células T CART19 estimuladas por JEKO-1 e RL mostraram um aumento na expressão de citocina. Da mesma forma, as concentrações crescentes do tratamento com ibrutinibe não afetaram a porcentagem das células produtoras de citocina CART19.

[00955] A secreção de citocina de células CART19 após a estimulação por células de tumor e na presença de concentração variada de ibrutinibe foi analisada por ensaio LUMINEX 30-plex. As citocinas segregadas por células TH1, tais como IL-2, IFN-y, e TNF-a, foram analisadas. As citocinas segregadas por células TH2, incluindo IL- 4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-15, IL-17, MIP1a, GM-CSF, MIP-1b, CP-1, IL-1Ra, IL-7, IP-10, IL-1b, VEGF, G-CSF, EGF, HGF, IFNa, IL-12, RANTES, Eotaxina, IL-2R, MIG, e IL-8, foram analisadas. Como mostrado na FIG. 15, citocinas de TH1 e TH2 foram segregados pelas células T CART19.

[00956] Da mesma forma, as experiências usando duas técnicas diferentes indicaram que não houve diferença na polarização de Th1/Th2 entre células CART19 expostas ao ibrutinibe e não expostas ao ibrutinibe (FIG. 54D).

[00957] O extermínio das células de MCL por células CART19 foi aumentado na presença de ibrutinibe, sugerindo pelo menos um efeito aditivo da combinação (FIG. 54E). Entretanto, a função citotóxica intrínseca das células CART19 não foi aumentada na presença de ibrutinibe. (FIG. 54F).

[00958] Os ensaios de bioluminescência adicionais foram realizados para avaliar o extermínio da célula CART19 de células de tumor. As células CART19 foram semeadas com células de tumor MOLM14, JEKO-1, e RL carregando um repórter de luciferase em relações variadas, tal como 1:1; 1:0.5; 1:0.25; e 1:0 em uma placa de 96 cavidades, em duplicata. Após 24 horas, a bioluminescência foi detectada e quantificada. Os resultados indicaram que a bioluminescência em amostras de MOLM14 não diminuiu após a incubação com células CART19. Entretanto, para células JEKO-1 e RL, a bioluminescência diminuiu na presença das células CART19, indicando que as células CART19 mediaram o extermínio das células JEKO-1 e RL (FIG. 16A, 16B, 16C, 16D, 16E, e 16F). Houve uma diminuição adicional na bioluminescência quando tratada com ibrutinibe, indicando que a combinação de ibrutinibe e CART19 causou o extermínio das células JEKO-1 e RL aumentado do que com o tratamento apenas de CART19. Consistente com estes resultados, o cálculo das células totais após cada tratamento mostrou que o tratamento de CART19 de células JEKO-1 e RL causou a redução no número de célula e uma redução adicional quando tratadas com CART19 e ibrutinibe (FIG. 17B e 17C), sugerindo que a terapia de combinação não só foi eficaz para o extermínio das células de MCL, mas levou ao extermínio eficiente das linhagens de célula de MCL.

Avaliação do tratamento com ibrutinibe/CART19 in vivo

[00959] Nestas experiências, os modelos de camundongo de linfoma de célula de revestimento foram usados para avaliar a terapia de combinação com CART19 e ibrutinibe in vivo.

[00960] Os diagramas esquemáticos tais como aqueles mostrados nas FIGs. 20, 55, e 5A foram usados neste exemplo. A FIG. 20 mostra um diagrama esquemático da terapia de combinação de CART19/ibrutinibe de teste nos modelos de camundongo in vivo de MCL. 1x106células de linhagens de célula de RL (MCL-3), JEKO-1 (MCL-4), e NALM6 (MCL-5) são injetadas em camundongos NSG (20 camundongos para cada experiência). Após 1 semana para permitir o enxerto, o tratamento é iniciado no Dia 0, em que o tratamento é: 0,5- 1x106 de células CART19 (por injeção), 25 mg/kg/dia de ibrutinibe (gavagem oral), ou CART19 + tratamento com ibrutinibe. No Dia 7, Dia 14, Dia 21, e Dia 28, a bioluminescência é imageada para monitorar o tamanho do tumor. Os camundongos que estão recebendo tratamento com ibrutinibe são continuamente tratados com ibrutinibe. A sobrevivência dos camundongos é da mesma forma monitorada. FIG. 55 e 56 mostra os diagramas esquemáticos adicionais da terapia de combinação de CART19/ibrutinibe de teste nos modelos de camundongo in vivo de MCL. 2 x 106Células de MCL-RL são injetadas em camundongos NSG. Depois de uma semana para permitir o enxerto (enxerto confirmado por imageamento por bioluminescência), o tratamento é iniciado no Dia 7 (após a injeção de célula MCL-RL) em que o tratamento é: controle de veículo, células CART19 (2 x 106 células), e/ou ibrutinibe (125 mg/kg/dia). Nos dias 14, 21, 28, e 35 (após a injeção de células MCL-RL), a bioluminescência é imageada para monitorar o tamanho do tumor.

[00961] O efeito do tratamento apenas com ibrutinibe em um modelo de camundongo in vivo de MCL foi examinado. As células RL transfectadas com o gene de GFP/luciferase foram intravenosamente injetadas em camundongos NSG imunodeficientes, resultando em 100% de enxerto de MCL no fígado e baço, com expansão eventual nos linfonodos e medula óssea. Os camundongos foram tratados com doses variadas de ibrutinibe, 25 mg/kg/dia e 250 mg/kg/dia. A bioluminescência média, representando o crescimento de tumor, foi avaliada em vários pontos de tempo. Como mostrado na FIG. 32, tumores derivados de RL demonstraram sensibilidade relacionada à dose. Experiências adicionais titulando-se doses de ibrutinibe em camundongos contendo célula de RL foram realizadas e são mostradas na FIG. 57. Uma dose mais alta levou a uma atividade antitumor melhor sem toxicidade crescente, em linha com a dose mais alta de ibrutinibe usada na clínica para MCL (Wang et al. NEJM 369.6(2013): 507-16).

[00962] A conclusão da dose de CART19 foi da mesma forma realizada. Duas linhagens de célula de MCL, RL (MCL-1) e JEKO-1 (MCL-2), carregando um repórter de luciferase de GFP foram injetadas em camundongos NSG no dia 0. As células T CART19 foram injetadas no dia 7 em dosagens variadas, por exemplo, em 0,5 x e6 células, 1 x e6 células, ou 2 x e6 células. Os camundongos foram monitorados, por exemplo, durante 100 dias. Em vários pontos de tempo, os camundongos foram monitorados quanto ao tamanho de tumor (por exemplo, imageamento por bioluminescência) (FIG. 18A e 18B, e FIG. 19A), e para sobrevivência global (por exemplo, curva de sobrevivência de Kaplan-Meier) (FIG. 18C e FIG. 19B). Doses diferentes de células CART19 que mostram uma eficácia antitumor dependente de dose, com 2 x 106células CART19/camundongo sendo a dose mais efetiva (FIG. 19A).

[00963] Estes estudos forneceram uma oportunidade de administrar uma comparação head-to-head das duas terapias para MCL. Como mostrado na FIG. 58, a sobrevivência à longo prazo só foi alcançada em camundongos tratados com células CART-19. Não houve diferença no efeito antitumor ao comparar as células T não transduzidas mais ibrutinibe com ibrutinibe apenas. Portanto, em todas as experiências subsequentes, os grupos controle foram veículo e ibrutinibe apenas (FIG. 59).

[00964] A adição de CART19 para ibrutinibe foi da mesma forma testada, como detalhado no diagrama esquemático na FIG. 56. A avaliação do efeito de ibrutinibe sobre a carga de tumor indicou o crescimento de tumor modestamente atrasado em pontos de tempo iniciais. Em comparação, a terapia de célula CART19 levou a uma clara diminuição na carga de tumor durante várias semanas. Em camundongos que recebem apenas células CART19, isto foi seguido por uma recaída indolente começando no Dia 40, considerando que camundongos que foram tratados com células CART19 bem como ibrutinibe não tiveram doença detectável até o Dia 80 (FIG. 60). A histopatologia dos órgãos colhidos no término da experiência mostrou persistência da doença em todos os camundongos tratados com controle e ibrutinibe com focos de necrose de tumor nos tratados com ibrutinibe. A maioria dos camundongos tratados apenas com CART19 mostrou recaída indolente à longo prazo que foi acompanhada pela persistência das células CART19, enquanto os camundongos tratados com CART19-ibrutinibe mostraram clearance do tumor e desaparecimento de CART19 de órgãos envolvidos (dados não mostrados).

Mecanismo do efeito combinado de CART19 e ibrutinibe

[00965] As experiências in vitro aqui indicaram que ibrutinibe não prejudicou nem aumentou claramente as funções do efetor de CART19 à curto prazo. Os estudos in vivo mostraram que a monoterapia de ibrutinibe teve um efeito antitumor modesto. Os resultados indicaram que ibrutinibe poderia realçar significativamente a função antitumor de células CART19 (FIG. 60). Portanto, as experiências foram realizadas para determinar o mecanismo para este efeito.

[00966] A inibição de ITK foi mostrada para inibir a polarização de Th2 e inclinar para um fenótipo de Th1 (Dubovsky et al. Blood 122.15(2013):2539-49). Em camundongos tratados com células CART19 e ibrutinibe, um aumento nas células Th1 quando comparado com a monoterapia de célula CART19 não foi observado usando este ensaio (FIG. 61A, 61B). Entretanto, a exposição de camundongos ao ibrutinibe levou a um aumento nas células CART19 periféricas. Não houve diferença no marcador de proliferação Ki67 entre o grupo de tratamento e um grupo controle (FIG. 61C), assim este ensaio não detectou uma diferença na proliferação. Similarmente, não houve diferença no marcador antiapoptótico Bcl2 ou o marcador de apoptose fosfotidil serina, sugerindo que a diferença nos números de célula CART não foi relatada a um prejuízo da apoptose (FIG. 61D). Como ibrutinibe foi associado com linfocitose periférica em pacientes, as experiências foram realizadas para determinar se isto foi da mesma forma constatado em camundongos tratados apenas com ibrutinibe. Uma semana após começar o ibrutinibe, havia mais células de MCL circulantes e menos células de MCL nodal/órgão em camundongos tratados com ibrutinibe. De forma interessante, este aumento foi observado igualmente em modelo in vivo resistente e sensível a ibrutinibe, como foi da mesma forma observado em camundongos NSG enxertados com linhagem de célula de leucemia aguda NALM-6 (dados não mostrados).

[00967] Para entender o papel de ibrutinibe na expansão de célula T in vivo, enxertamos camundongos NSG com células MCL-RL WT e os tratamos com células T positivas de luciferase. Igualmente, os camundongos tratados com CTL019 e CTL019-ibrutinibe mostraram intensa expansão de célula T em comparação a UTD ou UTD-ibrutinibe (dados não mostrados). Em seguida, investigamos a frequência de diferentes subconjuntos de células T in vivo e não vimos diferenças em células T PB 1 semana depois da infusão de células T (dados não mostrados). Considerando que CXCR4 está envolvido na mobilização de célula B direcionada a ibrutinibe em humanos, nós conferimos a expressão de CXCR4 in vivo em células T PB de camundongos tratados com CTL019 ou CTL019-ibrutinibe: o nível de CXCR4 foi similar nos 2 grupos (dados não mostrados). Finalmente, a expressão de receptor inibidor/coestimulador em PB de células T de camundongos tratados com CART19 e CART19-ibrutinibe foi analisada. Nenhuma diferença na expressão de TIM3, LAG3, CD137 ou CTLA4 foi evidente, entretanto uma tendência a uma expressão de PD-1 reduzida foi notada em camundongos tratados com CTL019 e UTD combinados com ibrutinibe. Conclusões

[00968] Terapias para malignidades de célula B incluem inibidores de molécula pequena de sinalização de BCR e terapias com base em célula de T direcionada a CD19. No ajuste de MCL reincidente, o inibidor de BTK ibrutinibe é agora aprovado pela FDA e gera altas taxas de resposta iniciais. Infelizmente, estas respostas tendem a ser passageiras e requerem doses de fármaco mais altas que aquelas usadas para CLL. CART-19 leva a respostas duráveis em pacientes com B-ALL de alto risco, e também pode ser eficaz em outras malignidades de célula B. Os dados preliminares sugerem que as respostas de malignidades de célula B maduras a CART-19 podem ser mais baixo do que aquelas de B-ALL, porém o mecanismo desta disparidade ainda não foi averiguado. Este exemplo investigou o impacto de adicionar ibrutinibe a CART19 no tratamento de MCL.

[00969] Linhagens celulares de MCL diferentes com sensibilidades variáveis a ibrutinibe (IC50 que varia de 10 nM a 10 µM) foram usadas para experiências in vitro. Estas linhagens celulares diferentes foram usadas para modelar igualmente MCL sensível a ibrutinibe e resistente a ibrutinibe. Em todas as doses, porém as mais altas de ibrutinibe, a função de célula CART19 ficou inalterada, com a cinética de expansão de célula T intacta, morte e reconhecimento de tumor, e produção de citocina. Além disso, os resultados não revelaram uma polarização T auxiliar em exposição de ibrutinibe. Esta constatação pode ser devido a uma combinação de fatores, inclusive o uso de uma cultura mista de células CD4 e CD8, em comparação ao modelo de experimentação apenas com CD4 realizado por Dubovksy et al. Blood 122. 15(2013): 2539-49. Igualmente, as linhagens celulares sensíveis a ibrutinibe e resistentes a ibrutinibe fortemente ativaram as células CART19 e induziram à morte, produção de citocina e proliferação. A combinação de CART19 e ibrutinibe in vitro leva pelo menos à morte de tumor aditiva. Os resultados neste exemplo mostram uma superioridade de CART19 sobre ibrutinibe quando cada qual foi usado como monoterapia em doses clinicamente relevantes e programas de administração (dose única para CART19, administração contínua para ibrutinibe).

[00970] Um modelo de MCL de xenoenxerto sistêmico também foi gerado neste exemplo, usando a linhagem celular MCL-RL gerada em um laboratório. O tratamento destes camundongos com diferentes doses de células CAR19 T alogênicas levou a um efeito antitumor dependente de dose. Uma resposta de dose similar a CART-19 também foi observada na linhagem celular JEKO-1 resistente a ibrutinibe. MCL- RL foi tratada in vivo com diferentes doses (por exemplo, 0, 25 e 125 mg/kg/dia) de Ibrutinibe, levando respectivamente a uma sobrevivência total mediana de 70, 81 e 100 dias (p < 0,001). Uma comparação in vivo direta do ibrutinibe 125 mg/kg e CART19 mostrou um controle de tumor significativamente melhorado para camundongos tratados com CART19. Da mesma forma, camundongos enxertados com MCL-RL foram tratados com veículo, ibrutinibe, CART19 ou a combinação de CART19 e ibrutinibe (iCART19). Em doses clinicamente relevantes, a monoterapia de MCL com CART19 foi superior em relação à monoterapia com ibrutinibe, e a combinação de ibrutinibe com CART19 levou a um efeito antitumor aumentado. Em particular, a combinação de iCART19 in vivo levou a níveis circulantes inicialmente mais altos de células CART19, seguidos por respostas de tumor profundo, e recaídas foram significativamente retardadas quando ibrutinibe foi adicionado a CART19. A combinação de iCART19 resultou em um controle de tumor melhorado com 80% de camundongos alcançando a remissão completa e sobrevivência sem doença a longo prazo. Mecanicamente, os camundongos tratados com ibrutinibe tiveram números mais altos de células CART19 circulantes sem alterações em Th1/Th2 ou fenótipo de memória. Desse modo, os resultados aqui mostraram que podem ser combinados com ibrutinibe CART19 de uma maneira racional e sugerem que as propriedades de cada uma destas terapias podem compensar pelas deficiências da outra, desse modo levando ao efeito antitumor à longo prazo aumentado. As experiências e resultados de combinação de inibição de sinalização de BCR com terapia de célula T direcionada a anti-CD19 abrem caminho para combinações racionais de terapias de não resistência cruzada para malignidades de célula B.

[00971] A cinética de resposta de tumor e recaída sugere que ibrutinibe serve para aprofundar a resposta inicial alcançada por CTL019 sozinho, ou realçar a capacidade de imunovigilância a longo prazo de células CTL019.

Exemplo 9: Terapia combinada de célula T de Ibrutinibe/CAR19 para leucemia linfocítica crônica

[00972] Ibrutinibe é também utilizado para tratamento de leucemia linfocítica crônica (CLL). Ibrutinibe não tem demonstrado efeitos citotóxicos sobre células T ou células NK. Entretanto, em células CLL, Ibrutinibe promove morte celular programada e inibe adesão e migração de célula de tumor. Neste exemplo, os experimentos foram realizados para examinar: 1) o efeito de Ibrutinibe sobre produção de CART19 de pacientes submetidos à terapia de Ibrutinibe; e 2) o tempo ideal de tratamento com Ibrutinibe em combinação com CART19 para função in vivo ideal.

Efeito de Ibrutinibe sobre função e produção de CART19

[00973] PBMCs de doador normal foram obtidos usando aférese como descrito aqui, por exemplo, no Exemplo 6. Os PBMCs foram incubados com 5 µM de Ibrutinibe durante 30 minutos ou foram deixados não tratados (para controle), e em seguida as células foram lavadas duas vezes. As células foram em seguida transduzidas com construtos de lentivírus contendo CAR19 para gerar células T CART19 usando os métodos descritos aqui, por exemplo, no Exemplo 4. O número de células T CART19 geradas de análise FACs de PBMCs tratados com Ibrutinibe foi realizado para determinar o número de células T CART19 geradas de PBMCs tratados por Ibrutinibe comparado aos PBMCs não tratados. Como mostrado na figura 21, 15% dos PBMCs tratados por Ibrutinibe transduzidos expressaram CAR19 e 12% dos PBMCs não tratados transduzidos expressaram CAR19. Estes resultados demonstram que tratamento de Ibrutinibe não afeta a eficiência de transducção lentiviral ou produção de célula T de CART19. Portanto, células T CART19 podem ser fabricadas de pacientes de CLL submetidos ao tratamento de Ibrutinibe.

[00974] Outras análises in vitro foram realizadas para determinar o efeito de Ibrutinibe sobre proliferação de célula T de CART19, citotoxicidade de CART19, e a relação de produção de citocina de TH1:TH2.

[00975] Para avaliar a proliferação celular, as células foram manchadas com CFSE para detecção de células em proliferação e analisadas por FACS, como descrito no Exemplo 4. As células T CART19 foram incubadas com concentrações variáveis de Ibrutinibe (0,1 µM, 0,5 µM, 1 µM, e 5 µM), e foram estimuladas com contas de CD3/CD28 ou foram deixadas desestimuladas. Na FIG. 22, histogramas foram sobrepostos para comparar as células T CART19 não estimuladas às estimuladas por CD3/CD28 em cada concentração de Ibrutinibe. Para cada concentração de Ibrutinibe, proliferação de célula T estimulada por CD3/CD28 foi observada, desse modo demonstrando que tratamento de Ibrutinibe não afetou proliferação de célula CART19.

[00976] O efeito de Ibrutinibe sobre citotoxicidade de células T CART19 foi também avaliado, usando métodos descritos no Exemplo 4. Células T transduzidas por CAR19 e não transduzidas foram tratadas com meios, DMSO, ou 1 µM de Ibrutinibe. Um ensaio de morte com base em fluxo foi realizado usando efetor de titulação para relações alvo (E;T) com células CART19 de efetor (meios, DMSO, ou tratadas por Ibrutinibe) para determinar atividade citotóxica específica contra células alvo expressando CD19. Como mostrado na figura 23, as células T CART19 tratadas com Ibrutinibe demonstraram a mesma porcentagem de atividade citotóxica específica contra células expressando CD19 alvo como controles (células T CART19 tratadas com meios ou DMSO). Desse modo, tratamento de Ibrutinibe não afeta a citotoxicidade de CART19.

[00977] Tratamento de ibrutinibe pode limitar ativação de TH2, e, portanto, pode promover pressão seletiva de TH1 em células T e distorcer citocinas TH1/TH2 em pacientes de CLL humanos. Os ensaios foram realizados para avaliar produção de citocina TH1 e TH2 na presença ou ausência de Ibrutinibe ou DMSO (controle). Como mostrado na figura 24, Ibrutinibe não promove a distorção de citocinas TH1 e TH2 em células CART 19.

Eficácia de tratamento de combinação de ibrutinibe/CART19 in vivo

[00978] A função de CART19 foi avaliada em um modelo de camundongo in vivo. As células Nalm/6 (linhagem celular de leucemia linfoblástica aguda humana) foram implantadas em camundongos NSG, e os camundongos foram monitorados diariamente durante pelo menos 50 dias. O modelo de tumor Nalm/6 produz tumores que não são sensíveis a Ibrutinibe, e portanto permitem análise de função de CART19 in vivo e eficácia em reduzir tratamento de câncer / volume de tumor. Iniciando no dia 7, aos camundongos foram administrados DMSO (controle) ou Ibrutinibe diariamente por sonda oral. CART19 foi administrado no dia 7 ou dia 9, ou os camundongos foram deixados não tratados (controle). Nos dias 4, 11, 18, 25 e 32, o número de células Nalm/6 circulando nos camundongos foi medido, por exemplo, por análise FACS de sangue periférico, para determinar a eficácia do CART19 para limpar células Nalm/6 na presença ou ausência de Ibrutinibe. Por exemplo, as células foram manchadas com anticorpo humano anti-CD19 para determinar a porcentagem de células CD19+ humanas (Nalm/6) no sangue dos camundongos NSG portadores de tumor.

[00979] Como mostrado na figura 25A, os camundongos que não receberam injeções de CART19 exibiram um aumento em células Nalm/6 de tumor. Entretanto, os camundongos que receberam injeções de CART19 em combinação com diariamente a administração de DMSO mostraram limpeza bem sucedida (redução) de células Nalm/6. Os camundongos que receberam injeções de CART19 em combinação com diariamente a administração de Ibrutinibe também mostraram limpeza bem sucedida das células Nalm/6 com os mesmos cinéticos e eficácia como os camundongos que receberam tratamento de DMSO. Portanto, estes resultados demonstram que tratamento de Ibrutinibe não prejudica função de CART19 na limpeza de células Nalm/6 deste modelo de tumor.

[00980] O estado de saúde dos camundongos foi monitorado durante pelo menos 50 dias após injeção das células Nalm/6. A curva de sobrevivência de Kaplan-Meier de FIG. 25B mostra que nenhum dos camundongos que foram não tratados (não receberam células CART19 T) e receberam DMSO ou Ibrutinibe sobreviveu mais do que 30 dias após injeção das células Nalm/6. Entretanto, tratamento com células CART19 T, com DMSO ou com Ibrutinibe aumentou a sobrevivência dos camundongos. Desse modo, estes resultados tomados em conjunto com os resultados de carga de tumor da FIG. 13A demonstram que tratamento de Ibrutinibe não prejudica função de CART19 na limpeza de células de tumor do modelo de tumor NSG-Nalm/6 in vivo.

Tempo ideal de tratamento de combinação de ibrutinibe/CART19 em pacientes de CLL

[00981] O tempo ideal para tratamento de Ibrutinibe de CLL durante a administração de CART19 foi avaliado usando amostras de pacientes de CLL que foram submetidos ao tratamento de Ibrutinibe durante um ano. As amostras de PBMC de 9 pacientes de CLL (Paciente 111330026, Paciente 111330030, Paciente 111330039, Paciente 111330056, Paciente 111330073, Paciente 111330074, Paciente 111330081, Paciente 111330086, e Paciente 111330111) foram isoladas em diferentes ciclos do tratamento de Ibrutinibe e foram usadas para fabricar células CART19 T. As amostras de PBMC foram coletadas antes do tratamento de Ibrutinibe para estabilizar uma linha de base, e em seguida coletadas para tratamento de Ibrutinibe no ciclo 2, dia 1, e ciclo 12, dia 1. Diversos parâmetros diferentes de fabricação de CART19 foram avaliados, tais como, transducção, proliferação, citoxicidade, e produção de citocina. Outras avaliações podem incluir imunofenotipagem ex vivo, tais como, a avaliação de memória, moléculas de inibidor, e exaustão.

[00982] A FIG. 26 mostra os resultados de análise de citometria de fluxo de transdução de CAR19 de células T do Paciente 111330030, que foi representativa dos resultados obtidos dos outros 8 pacientes após transducção de CAR. PBMCs foram coletados dos pacientes nos momentos indicados (linha de base, por exemplo, antes do tratamento; ciclo 2 no dia 1; e ciclo 12 no dia 1) e foram transduzidos com vetore lentivirais contendo CAR19, usando métodos como descrito, por exemplo, no Exemplo 4. Os PBMCs transduzidos foram em seguida manchados por anexina, CD3, CD4, e GAM (para detectar CAR), e em seguida analisados por análise FACS. A região empacotada nos gráficos na FIG. 14 mostra a porcentagem de células que foram GAM positivas, e com sucesso transduzidas para células T CART19. Os três gráficos inferiores mostram que CAR19 foi com sucesso transduzido em cerca de 23% de células na linha de base, 28% de células no ciclo 2, dia 1, e 44% de células no ciclo 12, dia 1.

[00983] Em seguida, a taxa de proliferação (ou duplicações de população) das células CART19 ou as células não transduzidas (controle) foi avaliada em cada ponto de tempo (linha de base, ciclo 2 no dia 1, e ciclo 12 no dia 1) durante 12 dias. FIG. 27 mostra as representações gráficas das duplicações de população durante 12 dias para três pacientes, Paciente 111330039 (#39), Paciente 111330026 (#26), e Paciente 111330030 (#30). Estes resultados indicam que no que diz respeito à taxa de proliferação, PBMCs isolados entre ou no ciclo 2, dia 1 e ciclo 12, dia 1 são preferidos para transducção de CAR.

Mecanismos potenciais para tratamento de ibrutinibe afetando função de CART19

[00984] Vários mecanismos de tratamento de Ibrutinibe que podem afetar função de CART19 foram avaliados de amostras de paciente de CLL.

[00985] Análise de células expressando CD19 (CD19+) foi avaliada por análise FACS. PBMCs de um paciente de CLL submetido ao tratamento de Ibrutinibe foram isolados na linha de base (antes do tratamento de Ibrutinibe), no ciclo 2, dia 1, e no ciclo 12, dia 1, e foram subsequentemente manchados para CD19. Análise FACS mostrou que Ibrutinibe causa um decréscimo em células expressando CD19 (FIG. 28A, FIG. 28B, e FIG. 28C). Desse modo, estes resultados indicam que tratamento com Ibrutinibe induz linfocitóse.

[00986] Análise adicional foi realizada para examinar expressão de CD200 sobre células de tumor ao longo do tempo durante tratamento de Ibrutinibe. A molécula imunossupressiva CD200 é super regulada sobre células de tumor CLL de célula B primária. CD200 liga-se ao seu receptor, CD200R, que é expresso em células da linhagem de monócito/macrófago e em linfócitos T. A interação de CD200 com seu receptor libera um sinal inibitório para a linhagem de macrófago alterando perfis de citocina de TH1 a TH2 e resulta na indução de células T regulatórias. As amostras de Pacientes 111330030, 111330026, e 111330039 na linha de base (tela), ciclo 2, dia 1, e ciclo 12, dia 1 foram manchadas por anexina, CD19 (para classificar para células expressando CD19 de tumor), e CD200 e analisadas por FACS. Os histogramas detectando expressão de CD200 em células de tumor de cada ponto de tempo foram sobrepostos para cada paciente (FIG. 29A, 29B, e 29C). Geralmente, expressão de CD200 em células de tumor diminuiu ao longo do tempo durante tratamento de Ibrutinibe.

[00987] A frequência de células T expressando PD1 durante tratamento de Ibrutinibe foi também avaliada. As amostras de pacientes foram obtidas na linha de base, ciclo 2, dia 1, e ciclo 12, dia 1 e manchadas com anexina, CD3, CD8, e PD1. As células que foram negativas para anexina e positivas para CD3 foram analisadas para expressão de CD8 e PD1. As células que expressam CD8 e PD1 são designadas pela caixa na FIG. 30A, 30B, e 30C. Comparação de perfis de FACS de células na linha de base (FIG. 30A), ciclo 2, dia 1 (FIG. 30B), e ciclo 12, dia 1 (FIG. 30C), indica que tratamento de Ibrutinibe diminui a frequência de células expressando PD1 ao longo do tempo.

[00988] Os dados obtidos dos experimentos descritos acima indicam que o tempo ideal para administrar terapia de CART19 aos pacientes de CLL recebendo Ibrutinibe é entre ciclo 2 e ciclo 12, ou no ciclo 12.

Exemplo 10: Terapia de célula T de CAR19 para linfoma de Hodgkin

[00989] Terapia de célula T de CAR19 pode também ser usada para tratar linfoma de Hodgkin (HL). Linfoma de Hodgkin é caracterizado pela presença de células Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) malignas que são derivadas de células B centrais germinais clonais. Existem diversos fatores que indicam a eficácia terapêutica de terapia de célula T de CAR19 para HL. Coloração de CD19 de tumores HL mostra células expressando CD19 (CD19+) dentro do tumor e microambiente tumoral (FIG. 33). Um estudo mostrou que uma população de célula B clonal (CD20+CD27+ALDH+) que expressa CD19 é responsável pela geração e manutenção de linhagens celulares de linfoma de Hodgkin, e também circula no sangue da maior parte de pacientes de HL (Jones e outro, Blood, 2009, 113(23):5920-5926). Esta população de célula B clonal foi também sugerida para dar origem a ou contribuir para a geração das células de HRS malignas. Desse modo, terapia de CART19 esgotaria esta população de célula B que contribui para tumorigênese ou manutenção de células de tumor. Outro estudo mostrou que eliminação de célula B retarda o desenvolvimento de tumor sólido em modelos de murino múltiplos (Kim e outro, J Immunotherapy, 2008, 31(5):446-57). Em apoio à ideia de que eliminação de células B no microambiente tumoral de HL resulta em algum efeito antitumor, terapias atuais, tal como, rituxano, estão sendo clinicamente testadas para alvejamento e eliminação de células B tumorais em HL (Younes e outro, Blood, 2012, 119(18):4123-8). De novo, carcinogênese relacionada à inflamação crônica foi também mostrada ser dependente de célula B (de Visser, e outro, Cancer Cell, 2005, 7(5):411-23). Os resultados destes estudos indicam que alvejamento da população de célula B, particularmente no microambiente tumoral de HL, seria útil para tratar HL, reduzindo ou inibindo progressão da doença ou desenvolvimento do tumor.

[00990] Além disso, células B normais expressando CD19 também infiltram o microambiente tumoral em HL. Estudos anteriores com terapia de CART19 em CLL e ALL (por exemplo, descritos nos Exemplos 4 e 5) mostram que exposição de CART19 aos alvos de CD19+ levam à produção de citocina e produção de macrófago. Desse modo, modulação do microambiente tumoral de HL de um microambiente pro-tumoral para um microambiente antitumoral pode ser ativada por infusão de CART19 para interagir com células B de CD19+ normais presentes no HL. Por exemplo, exposição de CART19 aos alvos expressando CD19 causa produção de citocina, por exemplo, citocinas inflamatórias, que promovem atividade antitumor através da expansão de células T citotóxicas, ativação de macrófagos, e recrutamento de outras células efetoras imunes com várias funções que inibem desenvolvimento de tumor, tais como, leucócitos, macrófagos, e células apresentando antígeno. Pelo fato de as células B de CD19+ alvo não poderem ser malignas (por exemplo, normalmente células circulantes B), um transiente ao invés de efeito de CART19 prolongado pode ser preferido para modulação do microambiente tumoral.

[00991] Um estudo para examinar a eficácia terapêutica de terapia de CART19 em pacientes de HL pode ser realizado como descrito abaixo (FIG. 34). O estudo também avaliará a segurança e tolerabilidade de CART19 em indivíduos de HL, e determinará o efeito de células CART19 sobre o microambiente tumoral de HL.

[00992] 8 pacientes com HL clássico são tratados neste estudo. Pacientes são de todas as idades, embora protocolos separados para liberação de fármaco possam ser estabelecidos para pacientes pediátricos e adultos. Pacientes neste estudo não têm nenhuma opção de tratamento potencialmente curativo disponível (tal como, transplante de célula-tronco autóloga (ASCT) ou alogênica), ou não são adequados para tais opções de tratamento curativo. Por exemplo, os pacientes podem ser qualquer dos seguintes: PET+ após quimioterapia de resgate, PET+ após o tratamento com brentuximab, ou PET+ após ASCT com ou sem anterior exposição ao brentuximab. Os pacientes terão um prognóstico limitado (diversos meses a menos do que ou igual a 2 anos de sobrevivência esperada) com terapias atualmente disponíveis. E finalmente, os pacientes não terão recebido terapia de anticorpo anti-CD20. Os pacientes são excluídos devido a falta de viabilidade, por exemplo, se o paciente tem números insuficientes de células T para 6 infusões de CART19.

[00993] Um CAR19 de mRNA é produzido por transcrição in vitro. O CAR19 mRNA é eletroporado em células T doadoras, e as células resultantes são expandidas e estimuladas por incubação com contas de CD3/CD28. As dosagens contendo 1x108 - 5x108 de células T de CAR19 eletroporadas por RNA são liberadas ao paciente três vezes por semana durante duas semanas (por exemplo, nos dias 0, 2, 4, 7, 9 e 11). A taxa de resposta geral será avaliada por varredura de CT, PET e clínica no 1o mês após o tratamento. Resposta e sobrevivência serão monitoradas mensalmente durante os primeiros 6 meses, em seguida a cada 3 meses até 2 anos após a primeira infusão de CART19 (dia 0). Técnicas de monitoramento incluem biópsia do tumor ou linfonodo (por exemplo, para análise imunoistoquímica e/ou RNA para perfil de expressão do gene) e varredura de PET antes e depois do tratamento com CART19. Por exemplo, o efeito das células CART19 sobre o microambiente tumoral de HL é analisado comparando os resultados de perfil de expressão do gene realizado em biópsias de linfonodo acessíveis de pacientes selecionados antes do tratamento e aproximadamente uma semana após o tratamento (ou o tempo apropriado após o tratamento para permitir alteração de fenótipo celular). Para avaliar a segurança e tolerabilidade do tratamento com CART19, a frequência e severidade de eventos adversos são reportadas, incluindo a frequência de síndrome de liberação de citocina (CRS) e síndrome de ativação de macrófago (MAS).

[00994] A quimioterapia pode ser administrada concorrentemente com o tratamento com CART19. A primeira dose de CART19 pode ser precedida por quimioterapia de linfodepleção, por exemplo, citoxano.

Exemplo 11: Subgrupo não responsivo de pacientes de CLL exibe expressão aumentada de moléculas de inibidor de ponto de checagem imune

[00995] Neste estudo, células CART19 de fabricação clínica de 34 pacientes de CLL foram avaliadas quanto à expressão de moléculas de inibidor de ponto de checagem imune, tal como PD-1, LAG3, e TIM3. A resposta desta coorte ao CART19 foi conhecida e, consequentemente uma correlação entre a resposta e padrões de expressão de biomarcadores pôde ser avaliada.

[00996] Células CART19 fabricadas de pacientes de CLL com respostas diferentes à terapia com CART foram analisadas por citometria de fluxo para determinar a expressão de CAR e as moléculas de inibidor de ponto de checagem imune PD-1, LAG3, e TIM3. As células CART19 foram de: doadores saudáveis (HD) (n=2); pacientes de CLL que responderam à terapia com CART (CR) (n=5); pacientes de CLL que parcialmente responderam à terapia com CART (PR) (n=8); pacientes de CLL que não responderam à terapia com CART (NR) (n=21). As células foram manchadas com anticorpos fluorescentemente rotulados que especificamente reconhecem CD3, CD4, CD8, CD27, CD45RO, a molécula de CAR19, e moléculas de ponto de checagem imune PD-1, LAG3, e TIM3, de acordo com métodos padrões para análise por citometria de fluxo conhecidos na técnica. A expressão de cada marcador, por exemplo, CD4+, CD8+, etc., foi determinada por software de análise por citometria de fluxo, e subpopulações (por exemplo, células T de CD4+, células T de CD8+, ou células T expressando CAR19) foram também analisadas quanto à expressão de moléculas de ponto de checagem imune PD-1, LAG3, e TIM3.

[00997] Um exemplo dos perfis de análise por citometria de fluxo usados para determinar a expressão de marcador de superfície é mostrado nas figuras 35A e 35B. As células T expressando CD4 foram determinadas usando citometria de fluxo, e foram também analisadas quanto à expressão de CAR19 e PD-1, de modo que o eixo x dos perfis indique a expressão de CAR19 (os quadrantes de topo esquerdo (Q5) e base esquerda (Q8) mostram as células CD4+ negativas de CAR19-, ao mesmo tempo em que os quadrantes de topo direito (Q6) e base direita (Q7) mostram as células CD4+ expressando CAR19) e o eixo y mostra a expressão de PD-1 (os quadrantes de base esquerda (Q8) e direita (Q7) mostram as células CD4+ negativas de PD-1 e os quadrantes de topo esquerdo (Q5) e direito (Q6) mostram as células CD4+ expressando PD-1). Na população de CD4+ de um responsivo a CART, 44,7% das células totais expressavam PD-1, e cerca de 22,3% das células expressando CAR19 foram positivas de PD-1, ao mesmo tempo em que 27,2% de células expressando CAR19 foram negativas de PD-1 (Figura 35A). Ao contrário, na população de CD4+ de um não responsivo, houve um decréscimo significante em células expressando CAR19 totais (cerca de 15,3% em comparação aos 49,5% em CR), com 14,7% das células expressando CAR19 sendo positivas de PD-1 ao mesmo tempo em que apenas 0,64% foi negativa de PD-1 (Figura 35B). A comparação entre os perfis na figura 35A e figura 35B mostra uma porcentagem muito maior das células CD4+ de um não responsivo expressam PD-1 (cerca de 92,9%) em comparação com o responsivo a CART (cerca de 44,7%).

[00998] Usando os métodos e análise descritos acima, a porcentagem de células expressando PD-1 (PD-1+) da porpulação CD4+ e da porpulação CD8+ foi determinada para cada paciente em cada grupo de resposta. Não responsivos mostraram ter uma porcentagem maior de células PD-1+ tanto nas populações CD4+ (figura 35C) quanto CD8+ (figura 35D) em comparação com àqueles que que responderam à terapia com CAR (CR); o aumento de porcentagem de PD-1 média foi estatisticamente significante tanto para populações CD4+ quanto CD8+. Responsivos parciais (PR) exibiram porcentagens maiores de células PD-1+ do que responsivos (CR) tanto em populações CD4+ (figura 35C) quanto CD8+ (figura 35D).

[00999] Em seguida, a porcentagem de células expressando PD-1 (PD-1+) da população de CD4+ expressando CAR19 e da população CD8+ expressando CD19 foi determinada para cada paciente em cada grupo de resposta. Análise similar foi realizada como acima, com a etapa adicional de analisar as células CD4+ e CD8+ quanto à expressão de CAR19, e após identificação das células expressando CAR19, determinando a porcentagem de células com expressão de PD-1das populações de células expressando CAR19. Uma tendência similar como aquela observada nas populações globais CD4+ e CD8+ foi observada quanto às populações CD4+ e CD8+ expressando CAR19: não responsivos mostraram ter uma porcentagem maior de células PD- 1+ tanto nas populações CD4+ (figura 36A) quanto CD8+ (figura 36B) em comparação com aqueles que responderam à terapia com CAR (CR); o aumento da porcentagem de PD-1 foi estatisticamente significante tanto para populações CD4+ quanto CD8+. Responsivos parciais (PR) exibiram porcentagens maiores de células PD-1+ do que responsivos (CR), tanto em populações CD4+ (figura 36A) quanto CD8+ (figura 36B).

[001000] Outra análise foi realizada para determinar a distribuição de células expressando PD-1, LAG3, e TIM3 de pacientes com diferentes respostas à terapia com CAR. Análise de perfil de célula representativa quanto à expressão de PD-1, LAG3, e TIM3 na população CD4+ é mostrada na figura 37. As populações de célula foram primeiro analisadas quanto à expressão de CD4+ e CD8+. A população de CD4+ (ou população de CD8+, não mostrada) foi em seguida analisada quanto à expressão de PD-1 e CAR19 (figura 37, perfis à esquerda). Como anteriormente descrito, não responsivos (NR) tinham uma porcentagem de células significantemente aumentada que foram PD-1+ total em comparação com os responsivos a CART (CR) (cerca de 92,9% de PD- 1 positivo para NR em comparação com 44,7% de PD-1 positivo para CR). Além disso, em não responsivos, as células expressando CAR19 foram principalmente positivas de PD-1 (14,7% de PD-1 positivo e CAR+ em comparação com 0,64% de PD-1 negativo e CAR+). Em seguida as populações foram analisadas quanto à coexpressão de PD- 1 e LAG3 (figura, perfis centrais). Células que expressaram tanto PD-1 quanto LAG3 são mostradas no quadrante de topo direito (Q2). Não responsivos tiveram porcentagem de células significantemente aumentada que expressavam tanto inibidores de ponto de checagem imune, PD-1 quanto LAG3, comparados aos responsivos ao CART (67,3% em comparação a 7,31%). A expressão de PD-1 foi também analisada com expressão de TIM3. Na figura 37, perfis à direita, a caixa indica células que expressam tanto PD-1 quanto TIM3. Similares aos resultados obtidos com PD-1 e LAG3, os não responsivos tiveram uma porcentagem significantemente maior de células que expressavam ambos os inibidores de ponto de checagem imune, PD-1 e TIM3, em comparação com responsivos a CART (83,3% em comparação a 28,5%). A porcentagem de células expressando PD-1 (PD1+), células expressando PD-1 e LAG3 (PD1+LAG3+), e células expressando PD-1 e TIM3 (PD1+TIM3+) foi determinada para cada paciente em cada grupo de resposta usando a análise por citometria de fluxo como descrito acima. Os não responsivos mostraram ter uma porcentagem aumentada de células PD1+ LAG3+ (FIG. 38A) e células PD1+TIM3+ (Figura 38B) em comparação com rensponsivos a CART que foi estatisticamente significantemente para ambas as populações celulares. Responsivos parciais também mostraram uma porcentagem aumentada de ambas as populações celulares comparados aos responsivos a CART, com as médias sendo diminuídas em comparação com os não responsivos.

[001001] Estes resultados indicam que pacientes que não responderam à terapia com CAR exibem expressão aumentada de inibidores de ponto de checagem imune (por exemplo, PD-1, LAG3, e TIM3) em comparação com pacientes que respondem ou parcialmente respondem à terapia com CAR. Desse modo, estes resultados mostram que agentes que inibem ou diminuem a expressão de inibidores de ponto de checagem imune, por exemplo, PD-1, LAG3, ou TIM3, podem ser úteis para administração a pacientes recebendo terapia com CAR para impedir imunossupressão através de séries de reação de ponto de checagem imune (por exemplo, mediada por PD-1, LAG3, ou TIM3), desse modo aumentando a eficácia das células expressando CAR.

Exemplo 12: Efeitos de inibição de mTOR sobre Imunossenescência no Idoso

[001002] Uma das séries de reação mais claramente ligada ao envelhecimento é a série de reação de mTOR. O inibidor de mTOR rapamicina mostrou prolongar a vida útil em camundongos e melhorar uma variedade de condições relacionadas com a idade em camundongos idosos (Harrison, DE et al. (2009) Nature 460:392-395; Wilkinson JE et al. (2012) Aging Cell 11:675-682; e Flynn, JM et al. (2013) Aging Cell 12:851-862). Desse modo, estas constataçãos indicam que inibidores de mTOR podem ter efeitos benéficos sobre o envelhecimento e condições relacionadas ao envelhecimento em humanos.

[001003] Um fenótipo relacionado com a idade pode ser estudado em uma curta estrutura de tempo de teste clínico é a imunossenescência. A imunossenescência é o declínio na função imune que ocorre no idoso, induzindo a uma suscetibilidade aumentada à infecção e uma resposta diminuída à vacina, incluindo vacina contra influenza. O declínio na função imune com a idade é o acúmulo de defeitos, incluindo um decréscimo na capacidade de células-tronco hematopoieticas (HSCs) de gerar linfócitos naive, e um aumento no número de linfócitos positivos de PD-1 exaustos que têm respostas defeituosas à estimuação antigênica (Boraschi, D et al. (2013) Sci. Transl. Med.5:185ps8; Lages, CS et al. (2010) Aging Cell 9:785-798; e Shimatani, K et al., (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:15807-15812). Os estudos em camundongos idosos mostraram que 6 semanas de tratamento com o inibidor de mTOR rapamicina rejuvenesceram a função de HSC induzindo à produção melhorada de linfócitos naive, resposta melhorada à vacina contra influenza, e vida útil prolongada (Chen, C et al. (2009) Sci. Signal. 2:ra75).

[001004] Para avaliar os efeitos de inibição de mTOR em fenótipos relacionados com o envelhecimento e se o inibidor de mTOR RAD001 melhora a imunossenescência, a resposta à vacina contra influenza em voluntários idosos recebendo RAD001 ou placebo foi avaliada. As constataçãos apresentadas aqui sugerem que RAD001 realçou a resposta à vacina contra influenza em voluntários idosos em doses que foram bem toleradas. RAD001 também reduziu a porcentagem de linfócitos T de CD4 e CD8 positivos de Morte Programada (PD)-1 que se acumulam com a idade. Estes resultados mostram que a inibição de mTOR tem efeitos benéficos sobre imunossenescência em voluntários idosos.

[001005] Como descrito aqui, um tratamento de 6 semanas com o inibidor de mTOR RAD001, um análogo de rapamicina, imelhorou a resposta à vacina contra influenza em voluntários humanos idosos.

Métodos População de Estudo

[001006] Voluntários Idosos >= 65 anos de idade sem doenças médicas subjacentes instáveis foram inscritos em 9 locais na Nova Zelândia e Austrália. Os critérios de exclusão na triagem incluíram hemoglobina < 9,0 g/dL, contagem de glóbulos brancos <3.500/mm3, contagem de neutrófilo <2.000/mm3, ou contagem de plaqueta <125.000/mm3, diabetes não controlada, doença cardíaca isquêmica instável, doença pulmonar clinicamente subjacente significante, história de uma imunodeficiência ou recebendo terapia imunossupressiva, história de coagulopatia ou condição médica requerendo anticoagulação de longa duração, taxa de filtragem glomerular estimada < 30 mL/minuto, presença de hipercholesterolemia não controlada severa (>350 mg/dL, 9,1 mmol/L) ou hipertrigliceridemia (>500 mg/dL, 5,6 mmol/L).

[001007] Demográficos de referência entre os ramais de tratamento foram similares (Tabela 7). Dos 218 indivíduos inscritos, 211 completaram o estudo. Sete indivíduos retirados do estudo. Cinco indivíduos retiradosdevido a eventos adversos (AEs), um indivíduo retirou o consentimento, e um indivíduo deixou o estudo como um resultado de violação de protocolo.

[001008] Tabela 7: Características demográficas e de referência dos Pacientes do Estudo *O índice de massa corporal é o peso em quilogramas dividido pelo quadrado da altura em metros

Projeto e Condução de Estudo

[001009] De dezembro de 2011 a abril de 2012, 218 voluntários idosos foram inscritos em um experimento controlado por placebo, randomizado, observador-cego. Os indivíduos foram randomizados para ramais de tratamento usando um sistema de randomização automatizado validado com uma relação de RAD001 para placebo de 5:2 em cada ramal de tratamento. Os ramais de tratamento foram: RAD001 0,5 mg diariamente ou placebo RAD001 5 mg semanalmente ou placebo RAD001 20 mg semanalmente ou placebo

[001010] O experimento foi observador-cego porque as coortes de placebo no RAD001 0,5 mg diariamente e 20 mg semanalmente diferenciaramLevemente das tabelas deRAD001 naquelas coortes. A equipe do estudo avaliando os indivíduos não foi totalmente cega. A duração de tratamento para todas as coortes foi de 6 semanas durante cujo tempo os indivíduos foram submetidos à avaliações de segurança na clínica a cada 2 semanas. Depois os indivíduos foram dosados durante 4 semanas, níveis de estado constante de RAD001 foram medidos pré-dose e em uma hora após a dose. Após conclusão do curso de 6 semanas de fármaco de estudo, os indivíduos foi dada uma pausa sem fármaco, de 2 semanas, para reverter qualquer imunossupressão induzida por RAD001 possível, e em seguida foi uma vacina contra influenza sazonal 2012 (Agrippal®, Novartis Vaccines and Diagnostics, Siena, Italy) contendo as linhagems H1N1 A/California/ 07/2009, H3N2 A/Victoria/210/2009, B/Brisbane/60/ 2008. Quatro semanas após a vacina contra influenza, os indivíduos tiveram soro coletado para avaliações de titulação de influenza. Titulações de anticorpo para as 3 linhagems de de vacina contra 3 influenza bem como para 2 linhagems heterólogas (cepa A/H1N1 A/New Jersy/8/76 e linhagem A/H3N2 A/Victoria/361/11) foram medidas por ensaio deinibição de hemaglutinação padrão (Kendal, AP et al. (1982) Concepts and procedures for laboratory-based influenza surveillance. Atlanta: Centers for Disease Control and Prevention B17-B35). Níveis de IgG e IgM específicos quanto à A/H1N1/California/07/2009 foram medidos em amostras de soro tiradas antes e 4 semanas depois da vacina contra influenza como anteriormente descrito (Spensieri, F. et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:14330-14335). Os resultados foram expressos como intensidade de fluorescência.

[001011] Todos os indivíduos forneceram consentimento imformativo por escrito. O estudo foi conduzido de acordo com os princípios de Good Clinical Practice e foi aprovado pelos comitês de ética e agências regulatórias.

Segurança

[001012] Avaliação de evento adverso e coleta de sangue quanto às avaliações de segurança hematológica e bioquímica foram realizadas durante as visitas de estudo. Informação de envento adverso foi também coletada em diários que os indivíduos preencheram em casa durante as 6 semanas que eles tiveram em estudo de fármaco. Os dados sobre todos os eventos adversos foram coletados a partir do momento do consentimento informático até 30 dias após a última visita de estudo. Os eventos foram classificados pelos investigadores como brandos, moderados ou severos.

Análise Estatística

[001013] A análise primária geométrica de relações de titulação média foi feita usando um modelo de regressão de Bayesian normal com antecedentes não informativos. Este modelo foi ajustado para cada titulação de anticorpo na escala log. O resultado primário em cada modelo foi a avaliação do dia 84. A avaliação do dia 63 foi incluída no vetor de resultado. O modelo ajustado usando SAS 9.2 proc misturado com a prévia declaração. A estrutura de covariância da matriz foi considerada como não estruturada (opção tipo = UN). Um antecedente plano foi usado. Para a análise secundária de taxas de soroconversão, regresão logística foi usada.

[001014] A população destinada a tratamento foi definida quando todos os indivíduos que receberam pelo menos uma dose total de fármaco de estudo e que não tiveram nenhum desvio de protocolos principais impactando os dados de eficácia. 199 fora do total de 218 indivíduos inscritos no estudo estavam na população destinada a tratamento.

Imunofenotipagem

[001015] Células mononucleares de sangue periférico foram isoladas de sangue total coletado em 3 pontos de tempo: linha de referência; após 6 semanas de tratamento com o fármaco de estudo; e no término de estudo quando os indivíduos ficaram sem o fármaco de estudo durante 6 semanas e 4 semanas após vacina contra influenza. Setenta e seis subgrupos de PBMC foram analisados por citometria de fluxo usando 8 paineis de imunofenotipagem por cor no Human Immune Monitoring Center at Stanford University, CA, USA como anteriormente descrito (Maecker, HT et al. (2012) Nat Rev Immunol. 12:191-200). Setenta e seis subgrupos de PBMC foram analisados por citometria de fluxo usando 8 paineis de imunofenotipagem liofilizado por cor (BD Lyoplate, BD Biosciences, San Diego, CA). Amostras de PBMC com viabilidade >80% e produção de 2x106células ou maior foram incluídas na análise.

[001016] Mudanças relativas dos imunofenótipos de referência para a semana 6 de tratamento com fármaco de estudo e de referência para o término do estudo (semana 12) foram calculadas para cada uma das coortes de dosagem de RAD001. Teste T de student foi conduzido para examinar se a mudança relativa dos imunofenótipos de referência para os dois pontos de tempo de amostragem de sangue foi sifnificantemente diferente de zero, respectivamente, dentro de cada grupo de dosagem após ajuste quanto ao efeito de placebo. Imputação de dados ausente na análise de efeito de tratamento não foi conduzida. Portanto se um paciente tem uma ausência de dados fenotípicos na linha de base, este paciente não deve ser incluído na análise para este fenótipo. Se um paciente tiver uma ausência de dados de fenótipo nas semanas 6 ou 12, em seguida este paciente não contribuirá para a análise deste fenótipo quanto ao ponto de tempo afetado.

[001017] 608 testes em 76 fenótipos sob 3 grupos de dosagem foram conduzidos para comparar o efeito de tratamento contra o efeito de placebo. A metodologia de taxa de falsa constatação estratificada (FDR) foi implementada para controlar a ocorrência de falsos positivos associada com múltiplos testes forneceu ainda intensidade cconsideravelmente melhor. O tipo celular foi considerado como o fator de estratificação e Cálculo de FDR (valor q) corrigido dentro de cada estrato respectivamente. Todas as hipóteses nulas foram rejeitadas em nível de significância de 0,05 com correspondente valor q < 0,1. A estratégia de ajuste de múltiplo teste com rejeição em nível de significância 0,05 e correspondendo q<0,1 assegurou que menos do que 10% das constataçãos são falsas.

[001018] Em uma segunda análise, as mudanças de imunofenótipo entre os grupos de tratamento agrupado e placebo, onde todos os três grupos de dosagem de RAD001 foram combinados. Para determinar que mudanças de imunofenótipo diferenciados entre os grupos tratadas e placebo, dentro das relações de contagem celular de paciente para cada fenótipo medido foram calculados entre a linha de base e a Semana 6 de tratamento com o fármaco de estudo e entre a linha de base e o término do estudo (Semana 12). As relações foram transformadas por log, e analisadas por análise de covariância em cada ponto do tempo, a fim de detectar uma diferença entre os grupos de tratamento agrupado e placebo. 152 testes em 76 fenótipos foram realizados para comparar o efeito de tratamento agrupado contra o efeito de placebo. A metodologia de controle da taxa de constatação falsa estratificada (FDR) foi implementada para controlar a ocorrência de falsos positivos associados com teste múltiplo embora forneça força consideravelmente melhor (Benjamini, Y. et al. (1995) J. Roy. Statist. 57:289-300; e Sun, L. et al. (2006) Genet. Epidemiol. 30:519-530). Um grupo de tipo celular foi tomado como o fator de estratificação e cálculo de FDR (valor-q) foi conduzido dentro de cada estrato respectivamente. Todas as hipóteses nulas em nível de significância de 0,05 e valor-q menor do que 20% foram rejeitadas. Isto pode ser interpretado que a rejeição de apenas aquelas hipóteses com valores P menores do que 0,05 e menores do que 20% de probabilidade do que cada resultado significante observado é devido a teste múltiplo.

Resultados

[001019] Em geral, RAD001 foi bem tolerado, particularmente os regimes de dosagem de 0,5 mg diariamente e 5 mg semanalmente. Nenhuma morte ocorreu durante o estudo. Três indivíduos experimentaram quatro sérios eventos adversos (SAEs) que foram avaliados como não relacionados a RAD001. Os 4 SAEs foram hemorragia retinal do olho esquerdo com subseqüente cegueira em um indivíduo com contagens normais de plaqueta que completaram um curso de 6 semanas de 5 mg semanalmente de RAD001 6 semanas anteriormente; dor severa nas costas em um indivíduo tratado com placebo e gastroenterite severa em um indivíduo tratado com placebo. Uma lista de eventos adversos relacionados com o tratamento (AEs) com uma incidência >2% em qualquer grupo de tratamento é fornecida na tabela 8. O AE relacionado com RAD001 mais comum foi úlcera na boca que, na maioria dos casos, foi de leve severidade. Em geral, indivíduos que receberam RAD001 tiveram uma incidência similar de AEs como aqueles tratados com placebo. Apenas uma AE severa foi avaliada como relacionada a úlceras da boca RAD001 em um indivíduo tratado com 20 mg semanalmente de RAD001. Tabela 8: Incidência de AEs relacionada com tratamento >2% em qualquer grupo de tratamento por termo preferido

[001020] A capacidade de RAD001 de melhorar a função imune em voluntários idosos foi avaliada medindo a resposta serológica à vacina contra influenza sazonal 2012. As titulações da média geométrica (GMT) de inibição de hemaglutinação (HI) para cada uma das 3 linhagens de vacina contra influenza e 4 semanas após vacina contra influenza são fornecidas na tabela 9. A análise primária variável foi a relação de GMT para HI (4 semanas após vacina/referência). O estudo foi intensificado para ser capaz de demonstrar que em pelo menos 2 fora as 3 linhagens de vacina contra houve 1) um aumento de GMT > 1,2 vezes com relação ao placebo; e 2) uma probabilidade posterior não menor do que 80% que a relação de placebo-GMT corrigido excedeu a. Esta finalidade foi escolhida porque um aumento 1,2 vezes na relação de influenza GMT induzido pela adjuvante de vacina MF-59 foi associado com um decréscimo na enfermidade por influenza (Iob, A et al. (2005) Epidemiol Infect 133:687-693).

[001021] Tabela 9. GMTs de HI para cada linhagem de vacina contra influenza em referência e em 4 semanas após vacina contra influenza A linha de referência indica 2 semanas antes da vacina contra influenza Semana 4 indica 4 semanas após vacina contra influenza N é número de indivíduos por coorte GMT é titulação media geométrica Relação de GMT é o GMT na semana 4 pós vacinação/GMT em referência CV% indica o coeficiente de variação

[001022] Na população destinada a tratamento (ITT), a baixa dose de coortes RAD001 de reforço imune (0,5 mg diariamente ou 5 mg semanalmente), porém não alta dose de coorte (20 mg semanalmente) atendem à finalidade primária da estudo (Figura 40A). Isto demonstra que existe um mecanismo imunomodulatório distinto de RAD001 nas baixas doses, e que na dose mais levada, os efeitos imunossupressores conhecidos de inibição de mTOR podem ser considerados. Além disso, os resultados sugerem uma tendência à função imune melhorada no idoso, após tratamento com baixa dose de RAD001 de reforço imune.

[001023] Em uma análise de subgrupo, o subgrupo de subindivíduos com baixas titulações de influenza de referência (< 1:40) experimentou um maior aumento associado com RAD001 em titulações do que a população ITT (Figura 40B). Estes dados mostram que RAD001 é particularmente eficaz no realce de resposta à vacina contra influenza de indivíduos que não tiveram titulações protetivas (>1:40) em referência, e, portanto, estavam em risco maior de enfermidade por influenza.

[001024] Gráficos de dispersão de concentração de RAD001 versus aumento em título para cada linhagem de vacina de influenza mostram uma relação de resposta/exposição inversa (Figura 41). Modelamento e simulação com base em fosforilação mediada por mTOR de S6 cinase (S6K) predizem que os 20 mg de regime de dose semanal inibem atividade de S6K mediada por mTOR quase completamente, os 5 mg regime de dose semanal inibem atividade de S6K mais de 50%, e o 0,5 mg de regime de dose diária inibe fosforilação de S6K por aproximadamente 38% durante o intervalo de dose (Tanaka, C e outro, (2008) J. Clin. Oncol 26:1596-1602). Desse modo, inibição parcial de mTOR, por exemplo, fosforilação de S6K mediada por mTOR, com dose RAD001 de baixo realçamento imune, pode ser como, se não mais eficaz, do que inibição quase completa de mTOR com dose RAD001 elevada no realçamento da resposta imune do idoso.

[001025] Taxas de soroconversão 4 semanas após vacinação de influenza foram também avaliadas. Seroconversão foi definida como a mudança de um título de pré-vacinação negativo (isto é, título de HI <1:10) para título de Hl pós-vacinação > 1:40 ou pelo menos 4 vezes aumento de um título de Hl pré-vacinação não negativo (> 1:10). Na população com intenção de tratar, as taxas de soroconversão para as linhagems B e H3N2 foram aumentadas no RAD001 em comparação com as coortes placebo, apesar dos aumentos não encontrarem significância estatística (Tabela 10). Na subpopulação de indivíduos com títulos de influenza de linha de base <= 1:40, tratamento de RAD001 também aumentou as taxas de soroconversão para as linhagems B e H3N2, e estes resultados atingiram significância estatística para a linhagem B no 0,5 mg de coorte de dose diária. Estes dados também mostram que RAD001 realçou a resposta sorológica à vacinação de influenza no idoso.

[001026] Tabela 10. Porcentagem de indivíduos com soroconversão para influenza 4 semanas após vacinação *Relação Odds para soroconversão entre RAD001 e Placebo significantemente diferente de 1 (valor bilateral < 0.05 obtido por regressão logística como efeito fixo)

[001027] Vacinas contra influenza sazonal atual frequentemente fornecem proteção contra linhagens continuamente emergentes de influenza que se apresentam como variantes de vírus anteriormente circulantes. Entretanto, camundongos vacinas contra influenza na presença do inibidor de mTOR rapamicina, em comparação com placebo, desenvolveram uma resposta sorológica mais ampla à influenza. A resposta sorológica mais ampla incluía anticorpos para epitopos conservados expressos por múltiplos subtipos de influenza que fornecem proteção contra infecção com linhagens heterólogas de influenza não continha na vacina (Keating, R et al. (2013) Nat Immunology 14:2166-2178). Para determinar se RAD001 ampliou a resposta sorológica à influenza nos voluntários idosos, titulações de HI para as 2 linhagens heterólogas de influenza não continham na vacina contra influenza (linhagem A/H1N1 A/New Jersey/8/76 e linhagem A/H3N2 A/Victoria/361/11) foram medidas. O aumento nas relações de GMT de HI quanto às linhagens heterólogas foi maior no RAD001 em comparação com coortes de placebo (Figura 42). Além disso, taxas de soroconversão para as linhagens heterólogas foram maiores em RAD001 em comparação com coortes de placebo. O aumento nas taxas de soroconversão nas coortes de dosagem de RAD001 de 5 e 20 mg semanalmente foi estatisticamente significante para a linhagem heteróloga de H3N2 (Tabela 11). A taxa de soroconversão de H3N2 para as coortes de RAD001 agrupadas foi de 39% versus 20% para a coorte de placebo (p=0,007). Os resultados apresentados aqui sugerem que a inibição de mTOR amplia a resposta sorológica de voluntários idosos à vacina contra influenza, e aumenta as titulações de anticorpo para as linhagens heterólogas de influenza não contidas na vacina contra influenza sazonal.

[001028] Resposta sorológica ampliada para linhagens heterólogas de influenza em camundongos tratados com rapamicina foi associada com uma inibição de mudança de classe em células B e um aumento em níveis de IgM anti-influenza (Keating, R. et al. (2013) Nat Immunol 14:2166-2178). Entretanto, a inibição de mudança de classe pode não estar envolvida na resposta sorológica ampliada em humanos tratadas com RAD001 porque os níveis de IgM e IgG anti-influenza após vacinação não diferiram entre as coortes tratadas com RAD001 e placebo (Figure 43).

[001029] Tabela 11: Porcentagem de indivíduos que soroconverteram em linhagens heterólogas de influenza 4 semanas após vacina contra influenza sazonal * Relação Odds para soroconversão entre RAD001 e Placebo significantemente diferente de 1 (valor p bilateral < 0,05 obtida por regressão logística com tratamento como efeito fixo)

[001030] Para determinar o mecanismo pelo qual RAD001 realçou função imune em voluntários idosos, imunofenotipagem foi realizada em amostras de PBMC obtidas de indivíduos na linha de base, após 6 semanas de tratamento de fármaco de estudo e 4 semanas após vacinação de influenza (6 semanas após descontinuação de fármaco de estudo). Apesar da porcentagem de maior parte de subconjuntos de PBMC não diferirem entre o RAD001 e coortes placebo, a porcentagem de células CD4 e CD8 de PD-1 positivo foi menor no RAD001 em comparação com coortes placebo (Figura 44). As células CD4 e CD8 de PD-1 positivo acumulam-se com a idade e têm respostas defeituosas para estimulação de antígeno porque PD-1 inibe proliferação de célula T induzida por receptor de célula T, produção de citocina e função citolítica (Lages, CS e outro, (2010) Aging Cell 9:785-798). Existiu um aumento em porcentagem de células T de PD-1 positivo ao longo do tempo na coorte placebo. Na semana 12 (4 semanas pós vacinação), este aumento pode ter sido devido à vacinação de influenza, visto que o vírus de influenza foi mostrado aumentar células T de PD-1 positivo (Erikson, JJ e outro (2012) JCI 122:2967-2982). Entretanto, a porcentagem de células T CD4 de PD-1 positivo aumentou da base de linha na semana 6 e 12 em todos os coortes de RAD001 (Figura 44A). A porcentagem de células CD8 de PD-1 positivo também diminuiu da base de linha em ambas as semanas 6 e 12 nas duas coortes de RAD001 de dose inferior (Figura 44B). A porcentagem de células T CD4 de PD-1 negativo foi avaliada e aumentada nas coortes de RAD001 em comparação com as coortes placebo (Figura 44C).

[001031] Sob análise estatística mais rigorosa, onde os resultados das coortes RAD001 foram agrupados e ajustados para diferenças em expressão de PD-1 de base de linha, existiu uma diminuição estatisticamente significante de 30,2% em células T CD4 de PD-1 positivo na semana 6 na coorte de RAD agrupado (n=84) comparado à coorte placebo (n=25) com p=0,03 (q=0,13) (Figura 45A). A diminuição em células T CD4 de PD-1 positivo na semana 12 no RAD agrupado em comparação com a coorte placebo é 32,7% com p=0,05 (q=0,19). Figura 45B mostra uma diminuição estatisticamente significante de 37,4% nas células T CD8 de PD-1 positivo na semana 6 na coorte de RAD001 agrupado (n=84) comparado à coorte placebo (n=25) com p=0,008 (q=0,07). A diminuição em células T CD8 de PD-1 positivo na semana 12 no RAD001 agrupado em comparação com a coorte placebo é 41,4% com p=0,066 (q=0,21). Desse modo, os resultados das Figuras 44 e 45 juntos sugerem que a diminuição associada ao RAD001 na porcentagem de células T CD4 e CD8 de PD-1 positivo pode contribuir para função imune realçada.

Conclusão

[001032] Em conclusão, os dados apresentados aqui mostram que o inibidor de mTOR RAD001 melhora o declínio relacionado à idade na função imunológica do idoso humano quando avaliado em resposta à vacinação da gripe, e que esta melhora é obtida com um equilíbrio de risco/benefício aceitável. Em um estudo de camundongos idosos, o tratamento de 6 semanas com o inibidor de rapamicina de mTOR aumentou não só a resposta à vacinação da gripe, porém, da mesma forma o período de vida prolongado, sugerindo que a melhora da imunossenescência pode ser um marcador de um efeito mais amplo em fenótipos relacionados ao envelhecimento.

[001033] Visto que a dosagem de RAD001 foi descontinuada 2 semanas antes da vacinação, os efeitos de realce imunes de RAD001 podem ser mediados por mudanças em uma população de célula pertinente que persiste após a descontinuação do tratamento com fármaco. Os resultados apresentados aqui mostram que RAD001 diminuiu a porcentagem de células CD4 e CD8 positivas de PD-1 exaurido em comparação ao placebo. A expressão de PD-1 é induzida por sinalização de TCR e permanece alta na determinação da estimulação do antígeno persistente incluindo infecção viral crônica. Enquanto não desejando estar ligado por teoria, é possível que RAD001 reduza a ativação imune crônica em voluntários idosos e desse modo levar a uma diminuição na expressão de PD-1. RAD001 pode da mesma forma inibir diretamente a expressão de PD-1 como foi relatado para a imunofilina ciclosporina A (Oestreich, KJ et al. (2008) J Immunol. 181:4832-4839). Uma redução induzida por RAD001 na porcentagem de células T positivas de PD-1 é provavelmente para melhorar a qualidade das respostas de célula T. Isto é consistente com estudos prévios que mostram que a inibição de mTOR melhorou a qualidade da resposta de célula CD8 T de memória à vacinação em camundongos e primatas (Araki, K et al. (2009) Nature 460:108-112). Em camundongos idosos, a inibição de mTOR foi da mesma forma mostrada para aumentar o número de células-tronco hematopoiéticas, levando à produção aumentada de linfócitos que não receberam tratamento (Chen, C et al. (2009) Sci Signal 2:ra75). Embora as diferenças significantes nas porcentagens de linfócitos que não receberam tratamento nos coortes de RAD001 versus placebo não tenham sido detectadas neste exemplo, este possível mecanismo pode ser também investigado.

[001034] O mecanismo pelo qual RAD001 ampliou a resposta sorológica às linhagems heterólogas da influenza pode ser também investigado. A rapamicina foi da mesma forma mostrada para inibir a troca de classe em células B após a vacinação da gripe. Como um resultado, um único repertório de anticorpos anti-influenza foi gerado o qual promoveu a proteção de linhagem cruzada contra infecção letal com subtipos de vírus influenza não contidos na vacina da influenza (Keating, R et al. (2013) Nat Immunol. 14:2166-2178). Os resultados descritos aqui não mostraram que RAD001 alterou a troca de classe de célula B nos indivíduos idosos que tinham descontinuado RAD001 2 semanas antes da vacinação da influenza. Embora o mecanismo subjacente requeira elucidação adicional, a resposta sorológica aumentada para linhagems de influenza heterólogas descritas aqui pode conferir proteção aumentada à doença influenza em idades quando há uma combinação incorreta entre a vacina sazonal e linhagems circulantes de influenza na comunidade.

[001035] O efeito de RAD001 sobre títulos de anticorpo de influenza foi comparável ao efeito do adjuvante de vacina de MF59 que é aprovado para realçar a resposta do idoso à vacinação da influenza (Podda, A (2001) Vaccine 19:2673-2680). Portanto, o realce direcionado a RAD001 da resposta do anticorpo à vacinação da influenza pode transladar em benefício clínico como demonstrado com a vacina da influenza com adjuvante de MF59 no idoso (Iob, A et al. (2005) Epidemiol Infect. 133:687-693). Entretanto, RAD001 é da mesma forma usado para suprimir a resposta imune de pacientes com transplante de órgão. Estes resultados aparentemente paradoxais elevam a possibilidade que os efeitos imunomoduladores de inibidores de mTOR podem ser dependentes de dose e/ou antígeno (Ferrer, IR et al. (2010) J Immunol. 185:2004-2008). Uma tendência para uma relação de resposta à vacinação/exposição a RAD001 inversa foi vista aqui. É possível que a inibição de mTOR completa suprima a função imune pelo mecanismo de ciclofilina-rapamicina normal, considerando que a inibição de mTOR parcial, pelo menos no idoso, aumenta a função imune devido a uma inibição de fenótipo relacionada ao envelhecimento distinta. De interesse, a atividade de mTOR é aumentada em uma variedade de tecidos incluindo células-tronco hematopoiéticas em modelos de animais envelhecidos (Chen C. et al. (2009) Sci Signal 2:ra75 e Barns, M., et al. (2014) Int J Biochem Cell Biol. 53:174-185). Desse modo, o declínio da atividade de mTOR aos níveis vistos em tecido jovem, ao invés da supressão mais completa de atividade de mTOR, pode ser de benefício clínico em indicações de envelhecimento.

[001036] O perfil de segurança dos inibidores de mTOR tal como RAD001 no tratamento de indicações relacionadas ao envelhecimento foi de preocupação. A toxicidade de RAD001 em doses usadas em oncologia ou indicações de transplante de órgão inclui taxas de estomatite, diarreia, náusea, citopenias, hiperlipidemia, e hiperglicemia que seriam inaceitáveis para muitas indicações relacionadas ao envelhecimento. Entretanto, estes AEs estão relacionados aos níveis mínimos de RAD001 no sangue. Portanto, os regimes de dosagem de RAD001 usados neste estudo foram escolhidos para minimizar os níveis mínimos. Os níveis mínimos de RAD001 médios dos coortes de 0,5 mg por dia, 5 mg por semana e 20 mg por semana foram foram 0,9 ng/mL, abaixo de 0,3 ng/mL (o limite mais baixo de quantificação), e 0,7 ng/mL, respectivamente. Estes níveis mínimos são significativamente mais baixos do que os níveis mínimos associados com regimes de dosagem usados no transplante de órgão e pacientes com câncer. Além disso, o curso de 6 semanas limitados de tratamento diminuiu o risco de eventos adversos. Estes resultados sugerem que os regimes de dosagem usados neste estudo podem ter um risco/benefício aceitável para algumas condições do idoso. No entanto, números significantes de indivíduos nas experiências descritas aqui desenvolveram úlceras na boca mesmo quando dosados tão baixos quanto 0,5 mg por dia. Portanto, o perfil de segurança de baixa dose de RAD001 de realce imune garante outro estudo. O desenvolvimento de inibidores de mTOR com perfis de segurança mais claros do que os rapálogos atualmente disponíveis pode fornecer melhores opções terapêuticas no futuro para condições associadas ao envelhecimento.

Exemplo 13: Realce de Resposta Imune para Vacina em Indivíduos Adultos

[001037] A função imune declina no idoso, levando a uma incidência de aumento de infecção e uma resposta diminuída à vacinação. Como uma primeira etapa na determinação se a inibição de mTOR tem efeitos antienvelhecimento em humanos, uma tentativa controlada por placebo randomizada foi administrada para determinar se o inibidor de mTOR RAD001 reverte o declínio relacionado ao envelhecimento na função imune como avaliado em resposta à vacinação em voluntários idosos. Em todos os casos, consentimentos manifestos apropriados foram obtidos e o estudo foi aprovado pelas autoridades de saúde nacionais.

[001038] Os seguintes 3 regimes de dosagem de RAD001 foram usados no estudo: 20 mg por semana (nível mínimo: 0.7 ng/mL) 5 mg por semana (nível mínimo estava abaixo dos limites de detecção) 0,5 mg por dia (nível mínimo: 0,9 ng/mL)

[001039] Estes regimes de dosagem foram escolhidos porque eles têm níveis mínimos mais baixos do que as doses de RAD001 aprovadas para o transplante e indicações de oncologia. O nível mínimo é o nível mais baixo de um fármaco no corpo. O nível mínimo de RAD001 associado com o regime de dosagem de oncologia diário de 10 mg é aproximadamente 20 ng/mL. O nível mínimo associado com o regime de dosagem de transplante de 0,75-1,5 mg duas vezes ao dia é aproximadamente 3 ng/mL. Em comparação, o nível mínimo associado com os regimes de dosagem usados em nosso estudo de imunização foi 3-20 vezes mais baixo.

[001040] Visto que AEs relacionados a RAD001 estão associados com níveis mínimos, os 3 regimes de dosagem foram preditos ter segurança adequada para voluntários normais. Além disso, as 3 doses foram preditas para dar uma gama de inibição de mTOR. P70 S6 Cinase (P70 S6K) é um alvo a jusante que é fosforilado por mTOR. Níveis de fosforilação de P70 S6K servem como uma medida da atividade de mTOR. Com base na modelagem e simulação dos dados de fosforilação de P70 S6K obtidos em estudos pré-clínicos e clínicos de RAD001, 20 mg por semana foi predito quase completamente inibir a atividade de mTOR durante uma semana completa, considerando que 5 mg por semana e 0,5 mg por dia foram preditos inibir parcialmente a atividade de mTOR.

[001041] Voluntários idosos >= 65 anos de idade foram randomizados a um dos 3 grupos de tratamento com RAD001 (50 indivíduos por subdivisão) ou placebo (20 indivíduos por subdivisão). Os indivíduos foram tratados com fármaco de estudo durante 6 semanas, determinado uma interrupção de 2 semanas, e em seguida receberam as vacinações de influenza (Aggrippal, Novartis) e pneumocócica (Pneumovax 23, Merck). A resposta à vacinação da influenza foi avaliada medindo-se os títulos da média geométrica (GMTs) por ensaio de inibição de hemaglutinação às 3 linhagems de influenza (subtipos de influenza H1N1, H3N2 e B) na vacina de influenza 4 semanas após a vacinação. As finalidades primárias do estudo foram (1) segurança e tolerabilidade e (2) um aumento de 1,2 vezes em títulos de influenza em comparação ao placebo em 2/3 das linhagems de vacina de influenza 4 semanas após a vacinação. Esta finalidade foi escolhida porque um aumento de 1,2 vez nos títulos de influenza está associado com uma diminuição na doença influenza após vacinação, e portanto, é clinicamente pertinente. As doses diárias de 5 mg por semana e 0,5 mg por dia foram bem toleradas e ao contrário das doses diárias de 20 mg por semana, conheceram a finalidade primária de GMT (Figura 40A). RAD001 não só melhorou a resposta à vacinação de influenza, mas da mesma forma melhorou a resposta a vacinação pneumocócica em comparação ao placebo em voluntários idosos. A vacina pneumocócica contém antígenos de 23 sorotipos pneumocócicos. Os títulos de anticorpo para 7 dos sorotipos foram medidos em nossos indivíduos. Os títulos de anticorpo para 6/7 sorotipos foram aumentados em todos os 3 coortes de RAD comparados ao placebo.

[001042] Os dados de título de influenza e pneumocócico combinados sugerem que a inibição de mTOR parcial (menor que 80-100%) é mais efetiva na reversão do declínio relacionado ao envelhecimento na função imune do que a inibição de mTOR mais completa.

Exemplo 14: Inibição de mTOR de dose baixa aumenta a energia e exercício

[001043] Em modelos pré-clínicos, a inibição de mTOR com o rapálogo rapamicina aumenta a atividade física espontânea em camundongos idosos (Wilkinson et al. Rapamycin slows aging in mice. (2012) Aging Cell; 11:675-82). De interesse, indivíduos no coorte de dosagem de 0,5 mg diária descritos no Exemplo 13 da mesma forma relataram energia aumentada e capacidade de exercício em comparação ao placebo em questionários administrados um ano após a dosagem (Figura 46). Estes dados sugerem que a inibição de mTOR parcial com rapálogos pode ter efeitos benéficos na morbidez relacionada ao envelhecimento apenas da função imune.

Exemplo 15: Inibição de P70 S6 cinase com RAD001

[001044] A modelagem e simulação foram realizadas para predizer faixas de dose diárias e semanais de RAD001 que são preditas para inibir parcialmente a atividade de mTOR. Como notado acima, P70 S6K é fosforilada por mTOR e é o alvo a jusante de mTOR que está mais intimamente ligado ao envelhecimento porque o nocaute de P70 S6K aumenta o período de vida. Portanto, a modelagem foi realizada de doses de RAD001 que parcialmente inibem a atividade de P70 S6K. A dosagem semanal na faixa de >= 0,1 mg e < 20 mg é predita para alcançar a inibição parcial da atividade de P70 S6K (Figura 47).

[001045] Para a dosagem diária, as concentrações de RAD001 de 30 pM a 4 nM inibiram parcialmente a atividade de P70 S6K nas linhagens celulares (Tabela 12). Estas concentrações de soro são preditas ser obtidas com doses de RAD001 >= 0,005 mg a < 1,5 mg por dia.

[001046] Tabela 12: Percentual de inibição da atividade de P70 S6K em células HeLa in vitro

Conclusão

[001047] Métodos de tratar a morbidez relacionada ao envelhecimento, ou geralmente realçando uma resposta imune, com doses de inibidores de mTOR que inibem apenas parcialmente P70 S6K. A eficácia da inibição de mTOR parcial com doses baixas de RAD001 em indicações de envelhecimento é uma constatação inesperada. Dose de RAD001 varia entre >= 0,1 mg a < 20 mg por semana e >= 0,005 mg a < 1,5 mg por diário alcançará a inibição de mTOR parcial e, portanto, espera-se ter eficácia na morbidez relacionada ao envelhecimento ou no realce da resposta imune.

Exemplo 16: IL-7 exógena realça a função de células CAR T

[001048] Após a transferência adotiva de células CAR T, alguns pacientes experimentam a persistência limitada das células CAR T, que podem resultar nos níveis subideais da atividade antitumor. Neste exemplo, os efeitos da administração de IL-7 exógena humana são avaliados em modelos de xenoenxerto de camundongo onde uma resposta subideal inicial para células CAR T foi observada.

[001049] Expressão do receptor de IL-7 CD127 foi avaliada primeiro em linhagens de célula cancerosa diferentes e em células de expressão de CAR. Duas linhagens celulares de linfoma de célula de revestimento (RL e Jeko-1) e uma linhagem de célula B-ALL (Nalm-6) foram analisadas por citometria de fluxo para expressão de CD127. Como mostrado na Figura 48A, fora das três linhagens de célula cancerosa testadas, RL mostrou ter a expressão mais alta de CD127, seguido por Jeko-1 e Nalm-6. Células CART19 foram infundidas em camundongos NSG e a expressão de CD127 foi avaliada nas células CART19 circulantes por citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 48B, CD127 é expressa uniformemente em todas as células CART19 circulantes.

[001050] A seguir, o efeito de tratamento exógeno com lL-7 sobre a atividade antitumor de células CART19 foi avaliado em um modelo animal de linfoma. Os camundongos NSG foram enxertados com uma linhagem de célula de revestimento expressando luciferase (RL luc) no dia 0 (D0), seguido por tratamento de células CART19 no dia 6. Os camundongos NSG foram divididos em grupos, onde um grupo não recebeu nenhuma célula CART19, um segundo grupo recebeu 0,5 x106células CART19, um terceiro grupo recebeu 1x106células CART19, e um quarto grupo recebeu 2x106 células CART19. O tamanho de tumor foi monitorado medindo a bioluminescência média dos tumores enxertados durante mais do que 80 dias. Apenas camundongos recebendo 2x106células CART19 demonstraram rejeição do tumor e inibição de crescimento de tumor (Figura 49A). Camundongos dos dois grupos recebendo 0,5 x106células CART19 ou 1x106células CART19 mostraram uma resposta antitumor subideal. Camundongos destes dois grupos foram em seguida randomizados, onde três camundongos (camundongo #3827 e #3829 que receberam 0,5x106 células CART19, e camundongo #3815 que receberam 1x106células CART19) receberam IL-7 humana recombinante exógena IL-7 em uma dosagem de 200 ng/camundongo por injeção intraperitoneal três vezes semanalmente iniciando no dia 85, e dois camundongos não. A carga de tumor de camundongos recebendo IL-7 exógena a partir do dia 85 a 125, como detectado por bioluminescência média, é mostrada na figura 49B. Todos os camundongos recebendo IL-7 mostraram uma resposta dramática de 1-3 log de redução em carga de volume. Os camundongos que originalmente receberam uma dose maior de células CART19 (camundongo #3815 que recebera 1x106células CART19) mostraram uma resposta mais profunda. Quando comparando a carga de tumor de camundongos que receberam tratamento com lL-7 para controle, antes e depois do tratamento com lL-7, a redução de tumor tumor na carga de tumor foi apenas observada nos camundongos que receberam tratamento com lL- 7 (Figura 49C).

[001051] Dinâmicas de célula T após tratamento com lL-7 no modelo de linfoma animal foram também examinadas. Células CART19 humanas não foram detectáveis no sangue antes do tratamento com lL- 7. No tratamento de IL-7, houve rápido aumento, porém variável no número de células T nos camundongos tratados (Figura 50A). A expansão de célula T observada em camundongos recebendo a IL-7 também se correlaciona com resposta de tumor. O camundongo com o número mais elevado de células T detectadas no sangue em uma expansão de pico durante tratamento com lL-7 (mouse #3815) teve a redução mais robusta na carga de tumor (veja a 49B). Além disso, o tempo de expansão de pico correlacionou-se com a dose de célula T injetada como linha de referência. O número/nível de células expressando CD3 no sangue foram também medidos antes e depois do tratamento com lL-7. Em camundongos de controle, células expressando muito pouco CD3 foram detectadas, ao mesmo tempo em que camundongos tratados por IL-7-mostraram um aumento significante em células CD3+ após tratamento com lL-7 (Figura 50B).

[001052] Juntamente, os resultados neste exemplo demonstram que o tratamento com IL-7 exógena aumenta a proliferação de célula T e atividade antitumor in vivo, indicando que o uso de IL-7 em pacientes com resultados sub-ideais após terapia com CAR pode melhorar a resposta antitumor nestes pacientes.

EQUIVALENTES

[001053] As descrições de cada e todas as patentes, pedido de patente, e publicação citados aqui, são pelo presente, incorporados aqui por referência em sua totalidade. Ao mesmo tempo em que esta invenção foi descrita com referência a aspectos específicos, é evidente que outros aspectos e variações desta invenção podem ser planejados por outros versados na técnica sem afastar-se do escopo e espírito reais da invenção. As reivindicações anexas são destinadas a ser construídas para incluir todos os aspectos e variações equivalentes.

Claims (41)

1. Uso de uma população de células que expressam uma molécula de CAR que se liga a CD19 ("células expressando CAR-19") em combinação com um ou mais inibidores de quinase, caracterizado pelo fato de que é para preparação de uma composição ou medicamento para tratamento de um câncer hematológico em um mamífero, sendo que o um ou mais inibidores de quinase são um inibidor de tirosina-quinase de Bruton (BTK).

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: (a) o inibidor de quinase e as células que expressam CAR19 são para administração ao mamífero como primeira linha de terapia; ou (b) as células expressando CAR19 são para administração ao mamífero após a administração do inibidor de quinase, opcionalmente, sendo que: (i) as células expressando CAR19 são para administração após cessar a administração do inibidor de quinase; ou (ii) as células expressando CAR19 são para administração em combinação com a administração continuada do inibidor de quinase.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o mamífero é identificado como sendo um respondedor completo ou parcial do inibidor de BTK (por exemplo, ibrutinibe) ou um respondedor completo ou parcial das células que expressam CAR19.

4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o inibidor de BTK é selecionado dentre ibrutinibe, GDC-0834, RN-486, CGI-560, CGI-1764, HM-71224, CC-292, ONO-4059, CNX- 774, ou LFM-A13.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o inibidor da quinase é ibrutinibe e o ibrutinibe tem uma dose de 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 420 mg, 440 mg, 460 mg, 480 mg, 500 mg, 520 mg, 540 mg, 560 mg, 580 mg ou 600 mg por dia.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que as células expressam uma molécula de CAR compreendendo um domínio de ligação anti-CD19, um domínio transmembrana e um domínio de sinalização intracelular.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que: (i) o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio co-estimulador e um domínio de sinalização primário; (ii) o domínio de ligação anti-CD19 compreende uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 1 (LC CDR1), uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 2 (LC CDR2), uma região determinante de complementariedade de cadeia leve 3 (LC CDR3), uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada 1 (HC CDR1), uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada 2 (HC CDR2), e uma região determinante de complementariedade de cadeia pesada 3 (HC CDR3) de um domínio de ligação anti-CD19; (iii) o domínio de ligação anti-CD19 compreende uma região variável da cadeia leve de murídeo da Tabela 7, uma região variável de cadeia pesada de murídeo da Tabela 7, ou ambas; (iv) o domínio de ligação anti-CD19 compreende uma LC CDR1 da SEQ ID NO: 25, uma LC CDR2 da SEQ ID NO: 26 e uma LC CDR3 da SEQ ID NO: 27; (v) o domínio de ligação anti-CD19 compreende uma HC CDR1 da SEQ ID NO: 19, uma HC CDR2 de qualquer uma das SEQ ID NOS: 20-23 e uma HC CDR3 da SEQ ID NO: 24; (vi) o domínio de ligação anti-CD19 compreende uma sequência da SEQ ID NO: 59, ou uma sequência com de 95 a 99% de sua identificação; e/ou (vii) o domínio de ligação anti-CD19 está ligado ao domínio transmembranar por uma região articulada, por exemplo, sendo que a região articulada compreende uma sequência da SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 45.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação anti-CD19 é um domínio de ligação anti-CD19 humanizado, opcionalmente em que: (a) o domínio de ligação anti-CD19 humanizado compreende uma sequência selecionada dentre: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12, ou uma sequência com de 95 a 99% de identidade a esta; e/ou (b) o domínio de ligação anti-CD19 humanizado é um scFv que compreende uma região variável de cadeia leve ligada a uma região variável da cadeia pesada através de um ligante, por exemplo, sendo que o ligante compreende uma sequência da SEQ ID NO: 53.

9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que: (i) a molécula CAR compreende um domínio transmembrana de uma proteína selecionada dentre: cadeia alfa, beta ou zeta do receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33 CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 ou CD154, opcionalmente, sendo que o domínio transmembrana compreende uma sequência da SEQ ID NO: 15; (ii) a molécula de CAR compreende um domínio co- estimulatório, por exemplo, sendo que o domínio co-estimulatório compreende um domínio de sinalização funcional de uma proteína selecionada dentre: OX40, CD2, CD27, CD28, ICAM-1, LFA-1 (CDlla/CD18) ou 4-1BB (CD137), por exemplo, sendo que o domínio co- estimulatório compreende uma sequência da SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 51; (iii) a molécula de CAR compreende um domínio de sinalização intracelular, por exemplo, sendo que: (a) o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização funcional de 4-1BB, um domínio de sinalização funcional de CD3 zeta, ou ambos; ou (b) o domínio de sinalização intracelular compreende uma sequência de CD27, um domínio de sinalização funcional de CD3 zeta, ou ambos, (iv) a molécula de CAR compreende ainda uma sequência líder, por exemplo, sendo que a sequência líder compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13; ou (v) a molécula de CAR compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, ou SEQ ID NO: 42.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o domínio de sinalização intracelular compreende: (a) uma sequência da SEQ ID NO: 16, uma sequência da SEQ ID NO: 17, ou ambas; (b) uma sequência da SEQ ID NO: 16, uma sequência da SEQ ID NO: 43, ou ambas; (c) uma sequência da SEQ ID NO: 51, uma sequência da SEQ ID NO: 17, ou ambas; ou (d) uma sequência da SEQ ID NO: 51, uma sequência da SEQ ID NO: 43, ou ambas.

11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a composição é para uso em combinação com um agente que inibe uma molécula inibidora imunitária selecionada dentre: PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (por exemplo, CEACAM-1, CEACAM-3 e/ou CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 ou TGFR beta.

12. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a composição compreende 1-5 x 108células que expressam CAR19.

13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a composição compreende cerca de 5 x 106, 1 x 107, 2 x 107 ou 5 x 107células que expressam CAR19.

14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que as células que expressam CAR19 são administradas em uma dosagem de 104 a 109células que expressam CAR19/kg de peso corporal.

15. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o câncer hematológico é um câncer hematológico associado à expressão de CD19.

16. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o câncer hematológico é selecionado dentre uma leucemia ou um linfoma.

17. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o câncer hematológico é selecionado dentre: (i) leucemia linfocítica crônica (LLC), linfoma de células do manto (MCL), mieloma múltiplo, leucemia linfoblástica aguda (LLA), linfoma de Hodgkin, leucemia linfoblástica aguda de células B (BALL), leucemia linfoblástica aguda de células T (TALL), linfoma linfocítico pequeno (SLL), leucemia prolinfocítica de células B, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), DLBCL associado a inflamação crônica, linfoma folicular, linfoma folicular pediátrico, leucemia de células pilosas ou um linfoma folicular de células grandes, condições linfoproliferativas malignas, linfoma MALT (linfoma da zona marginal extranodal do tecido linfóide associado à mucosa), linfoma da zona marginal, mielodisplasia e síndrome mielodisplásica, linfoma não- Hodgkin, linfoma plasmablástico, neoplasia de células dendríticas plasmocitóides, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma da zona marginal esplênica, linfoma/leucemia esplênica, polpa difusa vermelha esplênica, linfoma de pequenas células B, leucemia de células variantes pilosas, linfoma linfoplasmocitário, doença de cadeia pesada, mieloma de células plasmáticas, plasmocitoma ósseo solitário, plasmocitoma ósseo extra, linfoma nodal da zona marginal, linfoma nodal pediátrico da zona marginal, linfoma do centro folicular cutâneo primário, granulomatose linfomatóide, linfoma de grandes células B do mediastino primário (timo), linfoma intravascular de grandes culas B, linfoma de ALB + linfoma de grandes células B, linfoma de células B grandes surgindo em doença de Castleman multicêntrica associada a HHV8, linfoma de efusão primário, linfoma de células B ou linfoma não classificativo; ou (ii) MCL, CLL, ALL, linfoma de Hodgkin ou mieloma múltiplo.

18. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que a composição é para uso em combinação com uma citoquina, opcionalmente, sendo que a citoquina é IL-7, IL-15 ou IL-21.

19. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o CAR é um CAR regulável (RCAR), opcionalmente, sendo que o RCAR compreende: (a) um membro de sinalização intracelular compreendendo um domínio de sinalização intracelular e um primeiro domínio de troca, (b) um membro de ligação ao antígeno compreendendo um domínio de ligação ao antígeno que liga CD19 e um segundo domínio de troca; e (c) um domínio transmembrana.

20. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que: (i) o mamífero é identificado como apresentando uma mutação de BTK; (ii) o mamífero é identificado como um respondedor parcial, não respondedor ou recidivante a uma ou mais terapias para o câncer hematológico; (iii) o mamífero é identificado como sendo um respondedor parcial do inibidor de quinase e são administradas ao mamífero as células que expressam CAR19, isoladamente ou em combinação com o inibidor de BTK, durante o período de resposta parcial; (iv) o inibidor de BTK é ibrutinibe, o mamífero é identificado como sendo um não respondedor possuindo doença progressiva ou estável após tratamento com ibrutinibe, e as células que expressam CAR19 são para administração ao mamífero, isoladamente ou em combinação com um segundo inibidor de BTK diferente de ibrutinibe, durante o período de doença progressiva ou estável; (v) o mamífero sofreu depleção linfocitária, opcionalmente, sendo que a extirpação linfocitária compreende a administração de um ou mais entre melfalano, citoxano, ciclofosfamida e fludarabina; ou (vi) o mamífero sofre uma redução nas células T que expressam PD1 após a administração do inibidor de quinase.

21. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que: (i) a resistência ao inibidor de quinase, às células que expressam CAR19, ou a ambos, é retardada ou diminuída; ou (ii) a remissão do câncer hematológico é prolongada ou a recaída do câncer hematológico é retardada.

22. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o inibidor de BTK é ibrutinibe, o mamífero é identificado como sendo um não respondedor ou reincidente ao ibrutinibe e as células que expressam CAR19 são administradas em combinação com um segundo inibidor de quinase diferente de ibrutinibe.

23. Uso, de acordo com a reivindicação 20 ou 22, caracterizado pelo fato de que o segundo inibidor de quinase é escolhido dentre um ou mais dentre GDC-0834, RN-486, CGI-560, CGI- 1764, HM-71224, CC-292, ONO- 4059, CNX-774 ou LFM-A13 ou uma combinação dos mesmos.

24. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que o inibidor de quinase é o ibrutinibe e o ibrutinibe é formulado para administração durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, ou mais ciclos, por exemplo, sendo que o comprimento do ciclo é 21 ou 28 dias.

25. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que: (i) a administração das células expressando CAR19 é iniciada pelo menos 1, 2, 3 ou 4 semanas, ou 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12, 15, 18 ou 24 meses, após o início da administração do inibidor de quinase; (ii) as células e o inibidor de quinase são formulados para administração simultânea; ou (iii) as células e o inibidor de quinase são formulados para liberação sequencial.

26. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o uso compreende a realização de uma infusão de linfócitos com pelo menos uma célula que expresse CAR19.

27. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a administração de uma dose baixa, melhoradora da imunidade, de um inibidor de mTOR ao mamífero, opcionalmente, sendo que o inibidor de mTOR é everolimo ou rapamicine.

28. Método para produzir uma célula que expressa CAR19 (por exemplo, uma célula efetora imunitária que expressa CAR19), ou uma população de células, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contatar a célula ou população de células com um inibidor de BTK; e (b) introduzir (por exemplo, por transdução) um ácido nucleico que codifica uma molécula de CAR que se liga a CD19 na célula ou população de células sob condições tais que a molécula de CAR seja expressa.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula T ou célula NK, ou a população de células inclui células T, células NK, ou ambas.

30. Método, de acordo com a reivindicação 28 ou 29, caracterizado pelo fato de que: (i) compreende colocar em contato a célula ou população de células com o inibidor de BTK durante 10-20, 20-30, 30-40, 40-60 ou 60-120 minutos e subsequentemente remover a maior parte ou a totalidade do inibidor de BTK das célula ou população de células; (ii) o inibidor de BTK é adicionado após a célula ou população de células ser colhida ou antes da célula ou população de células ser estimulada; ou (iii) o inibidor de BTK é selecionado dentre: ibrutinibe, GDC- 0834, RN-486, CGI-560, CGI-1764, HM-71224, CC-292, ONO-4059, CNX-774 ou LFM-A13.

31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 30, caracterizado pelo fato de que a população de células também compreende células cancerígenas, opcionalmente, sendo que o inibidor de BTK inibe um BTK nas células cancerígenas.

32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 31, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a depleção de células T reguladoras (por exemplo, células CD25+) da população de células.

33. Mistura reacional, caracterizada pelo fato de que compreende uma população de células efetoras imunitárias, um inibidor de BTK e uma molécula de CAR que se liga a CD19 ou um ácido nucleico que codifica uma molécula de CAR que se liga a CD19.

34. Mistura reacional, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que: (i) uma ou mais das células efetoras imunes expressam a molécula de CAR ou compreendem o ácido nucleico que codifica a molécula de CAR; (ii) o inibidor de BTK é selecionado dentre ibrutinibe, GDC- 0834, RN-486, CGI-560, CGI-1764, HM-71224, CC-292, ONO-4059, CNX-774 ou LFM-A13; ou (iii) a mistura reacional compreende adicionalmente células cancerígenas.

35. Mistura reacional, caracterizada pelo fato de que compreende uma população de células efetoras imunitárias e uma molécula de CAR que se liga a CD19 ou um ácido nucleico que codifica uma molécula de CAR que se liga a CD19, sendo que as células efetoras imunitárias compreendem ITK covalentemente inativada.

36. Mistura reacional, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que compreende ainda células cancerígenas, opcionalmente, sendo que as células cancerígenas compreendem BTK covalentemente inativada.

37. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma célula que expressa uma molécula de CAR que se liga a CD19 (uma “célula expressando CAR19”) e um ou mais inibidores de quinase, sendo que os referidos um ou mais inibidores de quinase incluem um inibidor de tirosina quinase de Bruton (BTK), opcionalmente, sendo que a célula que expressa CAR19 e o um ou mais inibidores de quinase estão presentes em uma forma de dose única, ou como duas ou mais formas de dose.

38. Uso da composição, como definida na reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento.

39. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27 ou 38, método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 32, ou composição, de acordo com reivindicação 37, caracterizado(a) pelo fato de que a célula expressando CAR19 é uma célula efetora imune humana (por exemplo, uma célula T humana ou célula NK humana) ou população de células.

40. Uso de uma célula efetora imune que expressa uma molécula de CAR que se liga a CD19 em combinação com um inibidor de tirosina quinase de Bruton, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento.

41. Uso de uma composição que compreende uma quantidade eficaz da célula efetora imune ou terapia de combinação, como definida na reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para prover imunidade antitumoral em um indivíduo.