ES2906078T3 - Moduladores del canal de potasio - Google Patents

Abstract

Un compuesto de la fórmula: **(Ver fórmula)** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN

Moduladores del canal de potasio

SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente Provisoria de los Estados Unidos n. ° 62/449.270, presentada el 23 de enero de 2017.

ANTECEDENTES

Entre los canales iónicos, los canales de potasio son los más frecuentes y diversos, y se encuentran en una variedad de células animales, como el tejido nervioso, muscular, glandular, inmunitario, reproductivo y epitelial. Estos canales permiten el flujo de potasio dentro y/o fuera de la célula bajo ciertas condiciones. Estos canales están regulados, por ejemplo, por la sensibilidad al calcio, activación por voltaje, segundos mensajeros, ligandos extracelulares y sensibilidad al ATP.

Se sabe que la disfunción de los canales de potasio y la disfunción por otras causas que influyen en estos canales de potasio generan pérdida de control celular, alteración de la función fisiológica y condiciones de enfermedad. Debido a su capacidad para modular la función de los canales iónicos y/o recuperar la actividad de los canales iónicos, los moduladores del canal de potasio se utilizan en el tratamiento farmacológico de una amplia gama de enfermedades patológicas y pueden abordar una variedad aún más amplia de indicaciones terapéuticas.

Los canales de potasio activados por calcio de pequeña conductancia (canal SK) son una subfamilia de canales K+ activados por Ca2+- y la familia de canales SK contiene 4 miembros: SK1, SK2, SK3 y SK4 (a menudo denominados conductancia intermedia). Las funciones fisiológicas de los canales SK se han estudiado especialmente en el sistema nervioso, donde, por ejemplo, son reguladores clave de la excitabilidad neuronal y de la liberación de neurotransmisores, y en el músculo liso, donde son fundamentales para modular el tono de la musculatura vascular, broncotraqueal, uretral, uterina o gastrointestinal.

Debido a estas implicaciones, los moduladores de molécula pequeña de los canales iónicos de potasio podrían tener el potencial para tratar una amplia variedad de enfermedades caracterizadas por disfunción de los canales iónicos de potasio y disfunción por otras causas que influyen en estos canales de potasio.

SUMARIO

Se divulgan compuestos y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y composiciones farmacéuticas de los mismos, que son útiles en el tratamiento de enfermedades asociadas con la disfunción de los canales iónicos de potasio y la disfunción por otras causas que influyen en estos canales de potasio. (Véase, por ejemplo, la Tabla 1). Se descubrió que los compuestos descritos en la presente tienen una o más de las siguientes propiedades beneficiosas: alta solubilidad, alta fracción libre en el cerebro, poca o nada de inhibición de hERG, semividas in vivo prolongadas, buena biodisponibilidad, alta estabilidad microsómica hepática, permeabilidad mejorada como permeabilidad de membrana artificial paralela (PAMPA) y/o baja inhibición de Cyp. Véase, por ejemplo, los datos comparativos en las Tablas 2 y 3.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 es un diagrama que ilustra el efecto del compuesto 1 después de la dosis oral (PO) sobre el temblor inducido por harmalina.

La figura 2 muestra la eficacia y la respuesta a la dosis del compuesto 1 en porcentaje de potencia de movimiento. La figura 3 muestra los efectos del compuesto 1 sobre la irregularidad en la activación de células de Purkinje en cortes ex vivo de ratones transgénicos SCA258Q.

La figura 4 muestra los efectos del compuesto 1 sobre la ataxia inicial en el modelo de ratón Tottering de EA2.

1. Compuestos

En la presente se proporcionan compuestos de la fórmula:

Como se usa en la presente, los términos "sujeto" y "paciente" pueden usarse indistintamente y significan un mamífero que necesita tratamiento, por ejemplo, animales de compañía (por ejemplo, perros, gatos y similares), animales de granja (por ejemplo, vacas, cerdos, caballos, ovejas, cabras y similares) y animales de laboratorio (por ejemplo, ratas, ratones, cobayos y similares). Normalmente, el sujeto es un ser humano que necesita tratamiento.

Cuando la estereoquímica de un compuesto divulgado se menciona o representa por estructura, el estereoisómero mencionado o representado tiene una pureza de al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 99 % o 99,9 % en peso en relación con todos los demás estereoisómeros. El porcentaje en peso puro en relación con todos los otros estereoisómeros es la relación del peso de un estereoisómero sobre el peso de los otros estereoisómeros. Cuando un único enantiómero se menciona o se representa por su estructura, el enantiómero representado o mencionado tiene una pureza óptica de al menos el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 99 % o 99,9 % en peso. El porcentaje de pureza óptica en peso es la relación del peso del enantiómero sobre el peso del enantiómero más el peso de su isómero óptico.

Cuando un compuesto divulgado se menciona o se representa por su estructura sin indicar la estereoquímica, y el compuesto tiene un centro quiral, debe entenderse que el nombre o la estructura abarca un enantiómero del compuesto libre del correspondiente isómero óptico y geométrico, una mezcla racémica del compuesto y mezclas enriquecidas en un enantiómero en relación con su correspondiente isómero óptico.

Se incluyen las sales farmacéuticamente aceptables así como las formas neutras de los compuestos descritos en la presente. Para su uso en medicamentos, las sales de los compuestos se refieren a "sales farmacéuticamente aceptables" no tóxicas. Las formas de sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales ácidas/aniónicas o básicas/catiónicas farmacéuticamente aceptables. Las sales básicas/catiónicas farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de sodio, potasio, calcio, magnesio, dietanolamina, n-metil-D-glucamina, L-lisina, L-arginina, amonio, etanolamina, piperazina y trietanolamina. Las sales ácidas/aniónicas farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, acetato, bencenosulfonato, benzoato, bicarbonato, bitartrato, carbonato, citrato, diclorhidrato, gluconato, glutamato, glicolilarsanilato, hexilresorcinato, bromhidrato, clorhidrato, malato, maleato, malonato, mesilato, nitrato, salicilato, estearato, succinato, sulfato, tartrato y tosilato.

El término "portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un portador, adyuvante o vehículo no tóxico que no destruye la actividad farmacológica del compuesto con el cual se formula. Portadores, adyuvantes o vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden usarse en las composiciones descritas en la presente incluyen, entre otros, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas del suero, tales como albúmina de suero humano, sustancias tamponantes tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, fosfato de hidrógeno disódico, hidrogenofosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilatos, ceras, polímeros en bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y lanolina.

Como se usa en la presente, los términos "tratar" y "tratamiento" se refieren a revertir, aliviar, reducir la probabilidad de desarrollar o inhibir el progreso de una enfermedad o trastorno, o uno o más síntomas de los mismos, como se describe en la presente. En algunas realizaciones, el tratamiento puede administrarse después de que se hayan desarrollado uno o más síntomas, es decir, tratamiento terapéutico. En otras realizaciones, el tratamiento puede administrarse en ausencia de síntomas. Por ejemplo, el tratamiento puede administrarse a un individuo susceptible antes de la aparición de síntomas (por ejemplo, en virtud de un historial de síntomas y/o en virtud de factores genéticos u otros factores de susceptibilidad), es decir, tratamiento profiláctico. El tratamiento también puede continuarse después de que los síntomas se hayan resuelto, por ejemplo, para prevenir o retrasar su reaparición.

El término "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" incluye una cantidad de un compuesto descrito en la presente que provocará una respuesta biológica o médica de un sujeto.

3. Usos, formulación y administración.

En algunas realizaciones, los compuestos y composiciones descritos en la presente son útiles en el tratamiento de enfermedades y/o trastornos asociados con la actividad de los canales de potasio. Tales enfermedades y/o trastornos incluyen, por ejemplo, afecciones neurodegenerativas y neurológicas (por ejemplo, enfermedad de Parkinson, temblores, enfermedad de Alzheimer, demencia, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), ataxia, ansiedad, depresión, trastornos del estado de ánimo, déficit de memoria y de atención, trastorno bipolar, psicosis, esquizofrenia, lesión cerebral traumática y narcolepsia), enfermedades cardíacas y afecciones relacionadas (por ejemplo, cardiopatía isquémica, cardiopatía coronaria, angina de pecho y espasmos de las arterias coronarias), enfermedades metabólicas y enfermedades de la vejiga (por ejemplo, espasmos de la vejiga, incontinencia urinaria, obstrucción del flujo de salida de la vejiga, disfunción gastrointestinal, síndrome del intestino irritable y diabetes), síntomas de abstinencia asociados con la terminación de la adicción y otras afecciones asociadas con la modulación de los canales de potasio, tales como, por ejemplo, enfermedades respiratorias, epilepsia, convulsiones, ataques, crisis de ausencia, espasmos vasculares, trastornos renales (por ejemplo, poliquistosis renal), disfunción eréctil, diarrea secretora, isquemia, isquemia cerebral, dismenorrea, enfermedad de Reynaud, claudicación intermitente, síndrome de Sjorgren, arritmia, hipertensión, distrofia muscular miotónica, espasticidad, xerostomía, hiperinsulinemia, parto prematuro, alopecia, cáncer, inmunosupresión, migraña y dolor.

La presente divulgación también se refiere a un método para modular la actividad de un canal de potasio en un sujeto que comprende el paso de administrar un compuesto descrito en la presente. En otra realización, la presente divulgación proporciona un método para modular positivamente un canal SK2 en una célula que comprende el paso de poner en contacto la célula con un compuesto descrito en la presente.

En un aspecto, los compuestos y composiciones proporcionados se usan para el tratamiento de temblores. Los temblores incluyen, entre otros, temblores de reposo, activos, posturales, cinéticos, de intención, específicos de tareas e idiopáticos. En un aspecto, los compuestos y composiciones proporcionados se usan para el tratamiento de temblores posturales y activos. Los ejemplos de temblores posturales y/o activos incluyen el temblor esencial, el parkinsonismo inducido por fármacos, el temblor neuropático y los temblores inducidos por toxinas (por ejemplo, abstinencia de alcohol o exposición a metales pesados). En un aspecto, los compuestos y composiciones proporcionados se usan para el tratamiento del temblor esencial.

La presente divulgación se refiere además a un método para el tratamiento del temblor esencial en un sujeto que comprende el paso de administrar un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable o composición descritos en la presente.

El temblor esencial es uno de los trastornos neurológicos más frecuentes, que afecta al -0,9 % de la población general. El temblor esencial se caracteriza por un temblor de acción de las extremidades superiores y, con menor frecuencia, de la cabeza, la voz y el tronco. Se puede identificar un antecedente familiar de temblor esencial en aproximadamente la mitad de los pacientes, lo que sugiere un componente genético. Consumir alcohol a menudo reduce temporalmente el temblor.

En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere a un método para el tratamiento de una enfermedad o afección seleccionada de una enfermedad neurodegenerativa, demencia, enfermedad cardíaca, síntomas de abstinencia asociados con la terminación de la adicción, enfermedad metabólica y enfermedad de la vejiga. En otras realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para el tratamiento de una enfermedad o afección seleccionada de ataxia, distonía, enfermedad de Parkinson, isquemia, lesión cerebral traumática, esclerosis lateral amiotrófica, hipertensión, aterosclerosis, diabetes, arritmia, vejiga hiperactiva y síntomas de abstinencia provocados por la terminación del abuso de alcohol y otras drogas que generan adicción. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para el tratamiento de la ataxia. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un método para el tratamiento de la ataxia espinocerebelosa.

La presente divulgación proporciona composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden un compuesto descrito en la presente; y un portador farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones se pueden usar para el tratamiento de una o más de las enfermedades y afecciones descritas con anterioridad.

Las composiciones descritas en la presente pueden administrarse por vía oral, parenteral, mediante pulverización por inhalación, por vía tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o a través de un reservorio implantado. El término "parenteral" como se usa en la presente incluye técnicas de inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intrasinovial, c, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal. Las formas farmacéuticas líquidas, las preparaciones inyectables, las formas de dispersión sólidas y las formas farmacéuticas para la administración tópica o transdérmica de un compuesto se incluyen en la presente.

La cantidad de los compuestos proporcionados que pueden combinarse con los materiales portadores para producir una composición en una única forma farmacéutica variará según el paciente a tratar y del modo particular de administración. En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas se pueden formular de modo que una dosis de entre 0,01 - 100 mg/kg de peso corporal/día del compuesto proporcionado, tal como, por ejemplo, 0,1 - 100 mg/kg de peso corporal/día, se pueda administrar a un paciente que recibe estas composiciones.

También debe entenderse que una dosis específica y un régimen de tratamiento para cualquier paciente en particular dependerán de diversos factores, que incluyen la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el momento de la administración, la tasa de excreción, la combinación de fármacos, el criterio del médico tratante y la gravedad de la enfermedad en particular que se está tratando. La cantidad de compuesto proporcionado en la composición también dependerá del compuesto particular en la composición.

EJEMPLIFICACIÓN

Los ejemplos representativos que siguen están destinados a ayudar a ilustrar la presente divulgación y no pretenden limitar el alcance de la invención ni deben interpretarse como tales.

N-(4,4-difluorociclohexil)-2-(3-metil-1H-pirazol-1-il)-6-morfolinopirimidin-4-amina

Paso 1:

Un matraz de fondo redondo equipado con una barra agitadora recubierta de teflón se cargó con 4,6-dicloro-2-(metilsulfonil)pirimidina (20,0 g, 88,080 mmol, 1,0 eq.) en tetrahidrofurano a -10°C y se añadió por goteo 3-metil-1H-pirazol (7,23 g, 88,080 mmol, 1,0 equiv.) durante un período de cinco minutos mediante una jeringa. La mezcla de reacción se agitó durante 16 horas a 25 °C y se determinó la finalización de la reacción mediante TLC. La mezcla de reacción se dividió en partes entre agua (500 ml) y acetato de etilo (500 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x 100 ml). La capa orgánica combinada se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró a presión reducida para producir un producto crudo que se purificó mediante cromatografía en columna (acetato de etilo/hexano como sistema de disolvente) para producir 4,6-dicloro-2-(3-metil-1H-pirazol-1-il)pirimidina (10,0 g, 43,859 mmol, 50 % de rendimiento) como una forma pura sólida blanca. MS (MH+): m/z=229,1. Paso 2:

Un matraz de fondo redondo equipado con una barra agitadora recubierta de teflón se cargó con 2,4-dicloro-6-metilpirimidina (11,0 g, 48,24 mmol, 1,0 equiv.), clorhidrato de 4,4-difluorociclohexan-1-amina (9,89 g, 57,89 mmol, 1,2 equiv.) y CS²CO³ (39,19 g, 120,61 mmol, 2,5 equiv.) en acetonitrilo (200 ml). La mezcla de reacción se agitó durante cinco horas a 80 °C y se determinó la finalización de la reacción mediante TLC. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se separó entre agua (100 ml) y acetato de etilo (200 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x 100 ml). La capa orgánica combinada se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró a presión reducida para producir un producto crudo que se purificó mediante cromatografía en columna (acetato de etilo/hexano como sistema de disolvente) para producir 6-cloro-N-(4,4-difluorociclohexil)-2-(3-metil-1H-pirazol-1-il)pirimidin-4-amina (11,0 g, 33,62 mmol, 71 %) como un sólido blanquecino. MS (MH+): m/z=328,1.

Paso 3:

Un matraz de fondo redondo equipado con una barra agitadora recubierta de teflón se cargó con 6-cloro-N-(4,4-difluorociclohexil)-2-(3-metil-1H-pirazol-1-il)pirimidin-4-amina (14,0 g, 42,79 mmol, 1,0 eq.), morfolina (14,91 ml, 171,19 mmol, 4,0 eq.) y trietilamina (23,89 ml, 171,19 mmol, 4,0 eq.) en acetonitrilo (200 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 16 horas a 80 °C y se determinó la finalización de la reacción mediante TLC. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se separó entre agua (100 ml) y acetato de etilo (300 ml). La capa orgánica se separó y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x 100 ml). La capa orgánica combinada se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró a presión reducida para producir un producto crudo que se purificó mediante cromatografía en columna (acetato de etilo/hexano como sistema de disolvente) para producir N-(4,4-difluorociclohexil)-2-(3-metil-1H-pirazol-1-il)-6-morfolinopirimidin-4-amina (1) (12,8 g, 33,84 mmol, 79 % de rendimiento) como un sólido blanquecino.

Datos analíticos:

MS (MH+): m/z=379,2; RMN de ¹H (400 MHz, DMSO-D6): 88,41 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,07 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 6,25 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,53 (s, 1H), 3,9 (bs, 1H), 3,67 (t, J = 4,4 Hz, 4H), 3,49 (S, 4H), 2,23 (s, 3 H), 2,23-1,97 (m, 3H), 1,92­ 1,90 (m, 3H), 1,55-1,53 (m, 2H). La RMN ¹H mostró, por integración, 3 resonancias de protones en la región aromática y 1 resonancia amplia correspondiente al protón intercambiable en N-18. Los protones aromáticos se observaron como dos dobletes y un singlete, lo que indica dos protones adyacentes y un protón aromático aislado. En la región alifática se observaron resonancias correspondientes a 20 protones, lo que muestra 1 singlete distinto. La integración de estas resonancias correspondió a dos resonancias doblete-doblete campo arriba, una con un protón multiplete parcialmente superpuesto, y cuatro multipletes campo abajo, dos de los cuales se superponen parcialmente. Los multipletes alifáticos campo arriba están asociados con el resto de morfolina de la estructura. Los multipletes campo abajo se dividen además por la proximidad de CF2 a estos protones. En el análisis de LC/MS de alta resolución (HR), el ion pseudomolecular (M+H+) se observó a un bajo voltaje del fragmentador (70 V) en el modo de ion positivo ESI a m/z 379,20580. El otro ion prominente observado en m/z 779,38575 es atribuible al aducto dímero en fuente 2M Na+.

Los datos de RMN de ¹³C revelaron 14 resonancias de carbono separadas y se generaron a partir de un espectro de carbono de ¹³C desacoplado adquirido a 25 °C en CDCb . Las 14 resonancias son consistentes con la estructura de 1 en la que cuatro pares de 18 carbonos son espectroscópicamente equivalentes. Se observó que una resonancia de carbono (C-12 a 77,05 ppm) estaba parcialmente oscurecida por la resonancia de CHCb en el espectro. La presencia de un carbono en esta resonancia se confirmó mediante la recopilación de un espectro de ¹³C en C⁶D⁶; se observó una resonancia a 79,7 ppm sin interferencia desde el pico del disolvente, además de todas las demás resonancias observadas. Se observa un triplete (2J = 244 Hz) en la resonancia C-22 de 122,29, se observan dos tripletes adicionales a 31,53 ppm (C-21 y C-23, 3J = 24,93 Hz) y a 31,53 ppm (C-20 & C-24, 4J = 5,37 Hz). Cada uno de los tripletes observados es consistente con la sustitución F2 en C-22, y con una constante de acoplamiento decreciente con respecto al flúor a medida que aumenta el número de enlaces intermedios.

La conectividad carbono-protón y la conectividad carbono-carbono (a través de las correlaciones C-C-H de 2 y 3 enlaces) del marco molecular se confirmaron mediante la recopilación de espectros de RMN 2D. La conectividad C-H directa fue confirmada mediante HSQC, y la conectividad de 2 y 3 enlaces fue demostrada mediante HMBC. Las correlaciones cruzadas de corto y largo alcance (sobre 2 o 3 enlaces) son consistentes con las conexiones esperadas de la estructura propuesta. Finalmente, los datos de desplazamiento químico observados asignados como se mostró anteriormente fueron consistentes con los desplazamientos químicos 1H y 13C predichos por computadora para la estructura propuesta.

N-(4,4-difluorociclohexil)-2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)-6-metoxipirimidin-4-amina

Paso 1:

Un matraz de 5000 ml, de cuatro bocas, secado en llama, de fondo redondo, equipado con una cuchilla de agitación recubierta de teflón (5 cm) unida con una varilla de vidrio (boca 1), tapón (boca 2) y embudo de adición con tapón (boca 3) y un adaptador de tubo en U de entrada y salida de gas nitrógeno lleno de aceite (boca 4), se cargó con una suspensión de hidruro de sodio (35,2 g, 880 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (1000 ml), se añadió 3,5-dimetilpirazol (84,6 g, 880 mmol, 1 equiv.) a 0 °C y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, se añadió por goteo 4,6-dicloro-2-(metilsulfonil)pirimidina (200 g, 880 mmol, 1 equiv.) (disuelto en diclorometano (1000 ml)) a través de un embudo de goteo a la mezcla de reacción a -78 °C. La mezcla de reacción se agitó a la misma temperatura y se determinó la finalización de la reacción mediante TLC y UPLC. Después de 2 horas, la mezcla de reacción se inactivó con agua a -78 °C y se diluyó con diclorometano. Después de 5 minutos, se decantó el diclorometano y se lavó con una solución de salmuera. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró a presión reducida para producir el producto crudo, que se purificó mediante cromatografía en columna usando acetato de etilo y éter de pet. como disolvente para producir 4,6-dicloro-2-(3,5-dimetil-1h-pirazol-1-il) pirimidina (138 g, 567,71 mmol, 65 %) como un sólido blanquecino. MS (MH+): m/z = 244,2.

Paso 2:

Un matraz de 2000 ml, de tres bocas, secado en llama, de fondo redondo, equipado con una barra agitadora recubierta de teflón (5 cm), un septo (boca 1), tapón (boca 3) y condensador de reflujo equipado con un adaptador de tubo en U de entrada y salida de gas nitrógeno lleno de aceite (boca 2), se cargó con una solución de 4,6-dicloro-2-(3,5-dimetil-1 h-pirazol-1-il) pirimidina (136 g, 559,4 mmol, 1 equiv.) en acetonitrilo (1500 ml) seguido de clorhidrato de 4,4-difluorociclohexilamina (105,6 g, 615,4 mmol, 1,1 equiv.) y N,N-diisopropiletilamina (194,88 ml, 1118,8 mmol, 2 equiv.). La mezcla de reacción se calentó a 80 °C durante 16 horas. La finalización de la reacción se determinó mediante TLC y UPLC. La mezcla de reacción se concentró y el residuo se trituró con agua (500 ml). El sólido resultante se filtró, se lavó con éter de pet., se secó al vacío para producir 6-cloro-N-(4,4-difluorociclohexil)-2-(3,5-dimetil-1h-pirazol-1-il)pirimidin-4-amina (191 g, 556 mmol, >95 %) como un sólido blanquecino. MS (MH+): m/z = 342,0.

Paso 3:

Un matraz de 250 ml, de tres bocas, secado en llama, de fondo redondo, equipado con una barra agitadora recubierta de teflón (2 cm), un septo (boca 1), tapón (boca 3) y condensador de reflujo equipado con un adaptador de tubo en U de entrada y salida de gas nitrógeno lleno de aceite (boca 2), se cargó con una solución de 6-cloro-N-(4,4-difluorociclohexil)-2-(3,5-dimetM-1 h-pirazol-1-M)pirimidin-4-amina (20 g, 58,51 mmol, 1 equiv.) en metanol seguido de metóxido de sodio (21 % en metanol, 5,37 g, 99,47 mmol, 1,7 equiv.). La reacción se calentó hasta 60 °C y se determinó la finalización de la reacción mediante TLC y UPLC. Después de 5 horas, la mezcla de reacción se concentró a presión reducida y el residuo se diluyó con acetato de etilo, se lavó con agua y se lavó con una solución de salmuera. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró a presión reducida para producir el producto crudo que se purificó mediante cromatografía en columna usando acetato de etilo en éter de pet. como sistema de disolvente para producir N-(4,4-difluorociclohexil)-2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)-6-metoxipirimidin-4-amina (2) [16 g (11 g (99 % puro)+ 5 g (92 % puro), 47,41 mmol, -80 %) como un sólido blanco. MS (MH+): m/z =338,1. Datos analíticos: RMN de ¹H (400 MHz, DMSO-d⁶): 87,45 (bs, 1H), 6,06 (s, 1H), 5,72 (s, 1H), 4,01 (bs, 1H), 3,85 (s, 3H), 2,55 (s, 3H), 2,17 (s, 3H), 2,11- 1,82 (m, 6H), 1,60-1,55 (m, 2H).

N-(4,4-difluorociclohexil)-6-metoxi-2-(4-metiltiazol-2-il) pirimidin-4-amina

Paso 1:

Un matraz de fondo redondo de tres bocas equipado con una barra agitadora recubierta de teflón se cargó con éter dietílico (250 ml) y se transfirió n-BuLi (241,98 ml, 604,96 mmol, 2,5 M en hexano) a -78 °C. Se añadió una solución de 4-metiltiazol (50,0 g, 504,13 mmol) en éter dietílico (200 ml) durante un período de 30 minutos. La mezcla de reacción se convirtió en una suspensión de color amarillo pálido. Después de 1,5 horas, se añadió DMF (58,54 ml, 756,20 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. El progreso de la reacción se controló mediante TLC. Una vez completada la reacción, la mezcla se vertió en HCl acuoso frío (400 ml, 4 N) con agitación y separó las dos capas. La capa orgánica se lavó con HCl acuoso frío (2 x 80 ml, 4N)). Las capas acuosas combinadas se basificaron lentamente con K2CO3 (pH 7) y se extrajeron con éter dietílico (3 x 150 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio y se evaporaron hasta sequedad a temperatura ambiente al vacío para producir 4-metiltiazol-2-carbaldehído (60,0 g, crudo) como un líquido amarillo pálido. Ese material crudo se usó en el siguiente paso sin purificación adicional.

Paso 2:

Un matraz de fondo redondo de dos bocas equipado con una barra agitadora recubierta de teflón se cargó con 4-metiltiazol-2-carbaldehído (60,0 g, crudo) en piridina (38,04 ml, 472,40 mmol). Se añadió clorhidrato de hidroxilamina (32,82 g, 472,40 mmol) en partes durante un período de 15 minutos. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas en atmósfera de nitrógeno. El progreso de la reacción se controló mediante TLC. Una vez completada la reacción, la mezcla se vertió en agua helada y se agitó durante 20 minutos, el sólido obtenido se filtró y se secó al vacío para producir oxima de 4-metiltiazol-2-carbaldehído (40,0 g, 281,69 mmol, 59 % durante dos pasos) como un sólido blanquecino. MS (MH+): m/z=143,0

Paso 3:

Un matraz de fondo redondo de dos bocas equipado con una barra agitadora recubierta de teflón se cargó con una solución de oxima de 4-metiltiazol-2-carbaldehído (35,0 g, 246,44 mmol) y piridina (87,33 ml, 1084,35 mmol) en 1,4-dioxano (140 ml). Se añadió lentamente anhídrido trifluoroacético (51,38 ml, 369,66 mmol) a -10 °C y se dejó agitar a temperatura ambiente durante 16 horas. El progreso de la reacción se controló mediante TLC. Una vez finalizada la reacción, la mezcla se diluyó con agua (250 ml) y se extrajo con éter dietílico (3 x 350 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua (2 x 250 ml), salmuera (100 ml), se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron a presión reducida para producir 4-metiltiazol-2-carbonitrilo (35,0 g, crudo) como un líquido marrón claro. Ese material crudo se usó en el siguiente paso sin purificación adicional. Datos analíticos: RMN de ¹H (400 MHz, DMSO-d⁶): 87,90 (s, 1 H), 2,51 (s, 3 H).

Paso 4:

Un matraz de fondo redondo de dos bocas equipado con una barra agitadora recubierta de teflón se cargó con 4-metiltiazol2-carbonitrilo (35,0 g, crudo) en metanol (280 ml) y se añadió metóxido de sodio (16,77 g, 310,45 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 3 horas, se añadió cloruro de amonio (30,19 g, 564,66 mmol) y se agitó durante otras 16 horas. El progreso de la reacción se controló mediante TLC. Una vez completada la reacción, la mezcla se filtró y se lavó con metanol. El filtrado se concentró a presión reducida y el residuo se trituró con éter dietílico (150 ml). El sólido formado se filtró y se secó al vacío para producir clorhidrato de 4-metiltiazol-2-carboximidamida (35,0 g, crudo) como un sólido blanquecino. Ese material crudo se usó en el siguiente paso sin purificación adicional. MS (MH+): m/z=142,0.

Paso 5:

Un matraz de fondo redondo de dos bocas equipado con una barra agitadora recubierta de teflón se cargó con clorhidrato de 4-metiltiazol-2-carboximidamida (35,0 g, bruto) en etanol (350 ml) y malonato de dietilo (150,81 ml, 988,64 mmol). Se añadió por goteo etóxido de sodio (320 ml, 988,64 mmol, 21 % en EtOH) a temperatura ambiente y se calentó hasta 85 °C. Después de 3 horas, la mezcla de reacción se concentró a presión reducida. Se añadió agua (20 ml) y se acidificó con HCl 1,5 N (pH 2-3). El sólido obtenido se filtró y se secó al vacío para producir 2-(4-metiltiazol-2-il)pirimidin-4,6-diol (29,0 g, crudo) como un sólido amarillo pálido. Ese material crudo se usó en el siguiente paso sin purificación adicional. MS (MH+): m/z=210,0.

Paso 6:

Un matraz de fondo redondo de dos bocas equipado con una barra agitadora recubierta de teflón se cargó con una suspensión de 2-(4-metiltiazol-2-il)pirimidina-4,6-diol (29,0 g, crudo) y POCb (290 ml). Se añadió N,N-dietilanilina (37,84 ml, 235,85 mmol) a temperatura ambiente y se calentó a reflujo a 100 °C durante 2 horas. El progreso de la reacción se controló mediante TLC. El exceso de POCb se eliminó mediante destilación. El residuo se diluyó con 500 ml de agua fría, se neutralizó con solución saturada de bicarbonato de sodio y se extrajo con éter dietílico (2 x 500 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua (3 x 200 ml), salmuera (100 ml), se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron a presión reducida. El residuo se trituró con n-pentano (100 ml). El sólido obtenido se filtró y se secó al vacío para producir 2-(4,6-dicloropirimidin-2-il)-4-metiltiazol 7 (19,5 g, 79,59 mmol, 32 % en cuatro pasos) como un sólido amarillo pálido. MS (MH+): m/z=245,9.

Paso 7:

Un matraz de fondo redondo de dos bocas equipado con una barra agitadora recubierta de teflón se cargó con una suspensión de 2-(4,6-dicloropirimidin-2-il)-4-metiltiazol (19,0 g, 77,56 mmol) y clorhidrato de 4,4-difluorociclohexan-1-amina (13,30 g, 77,56 mmol) en acetonitrilo (190 ml). Se añadió carbonato de cesio (37,89 g, 116,34 mmol) y la mezcla de reacción se calentó a 80 °C durante 16 horas. El progreso de la reacción se controló mediante TLC. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente, se filtró y el sólido se lavó con acetato de etilo (500 ml). El filtrado se lavó con agua (2 x 100 ml), salmuera (100 ml), se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (gel de sílice 60-120) eluida con EtOAc al 15 % en hexano. Las fracciones relevantes que contenían el compuesto requerido se combinaron y evaporaron hasta sequedad bajo presión reducida para producir 6-cloroN-(4,4-difluorociclohexil)-2-(4-metiltiazol-2-il)pirimidin-4-amina (22,5 g, 65,25 mmol, 84 %) como un sólido de espuma blanquecino. MS (MH+): m/z=344,9.

Paso 8:

Un matraz de fondo redondo de dos bocas equipado con una barra agitadora recubierta de teflón se cargó con 6-cloro-N-(4,4-difluorociclohexil)-2-(4-metiltiazol-2-il)pirimidin-4-amina (27,0 g, 78,47 mmol) en metanol (450 ml). Se añadió metóxido de sodio (21,19 g, 392,36 mmol) y se calentó hasta 80 °C durante 16 horas. El progreso de la reacción se controló mediante TLC. Se eliminó el exceso de metanol a presión reducida y el residuo se diluyó con una solución acuosa de cloruro de amonio al 10 % (100 ml) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 150 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua (2 x 100 ml), salmuera (100 ml), se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (gel de sílice 60-120) eluyendo con 35-40 % de EtOAc en hexano. Las fracciones relevantes que contenían el compuesto objetivo se combinaron y evaporaron hasta sequedad a presión reducida para producir N-(4,4-difluorociclohexil)-6-metoxi-2-(4-metiltiazol-2-il)pirimidin-4-amina (3) (23,4 g, 68,82 mmol, 87 %) como un sólido blanquecino. MS (MH+): m/z=341,0. Datos analíticos: RMN de ¹H (400 MHz, DMSO-d⁶): 67,41 (s, 1 H), 7,40 (s, 1 H), 5,81 (s, 1 H), 3,87 (s, 3 H), 2,43 (s, 3 H), 2,08-1,89 (m, 6 H), 1,61-1,52 (m, 2 H).

(S)-1-(6-((4,4-difluorociclohexil)amino)-2-(4-metiltiazol-2-il)pirimidin-4-il)etan-1-ol

Paso 1:

Un tubo sellado de 250 ml, equipado con una barra agitadora recubierta de teflón (2 cm), se cargó con una solución de 6-cloroN-(4,4-difluorociclohexil)-2-(4-metiltiazol-2-il)pirimidin-4-amina (4,9 g, 14,24 mmol, 1,0 eq.) y tributil(1-etoxivinil)estannano (5,65 g, 15,66 mmol, 1,1 eq) en N,N-dimetilformamida (60 ml). La mezcla de reacción se desgasificó utilizando gas argón durante 5-10 minutos, seguida de la adición de dicloruro de bis(trifenilfosfina)paladio(II) (0,2 g, 0,28 mmol, 0,02 eq.). La mezcla de reacción se selló y se calentó a 80 °C durante 16 horas (la finalización de la reacción se determinó mediante LCMS) y se enfrió hasta temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó con agua (300 ml) y se extrajo con acetato de etilo (2 x 150 ml). Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se evaporaron para producir un producto crudo como un sólido pegajoso de color marrón claro. El material crudo se purificó mediante cromatografía en columna (acetato de etilo/hexano como sistema de disolvente) para producir N-(4,4-difluorociclohexil)-6-( 1-etoxivinil)-2-(4-metiltiazol-2-il)pirimidin-4-amina (4,1 g, 10,78 mmol, 75 %) como un sólido blanquecino. MS (MH+): m/z=381,0.

Paso 2:

Un matraz de fondo redondo equipado con una barra agitadora recubierta de teflón se cargó con N-(4,4-difluorociclohexil)-6-(1-etoxivinil)-2-(4-metiltiazol-2-il)pirimidin-4-amina (9,0 g, 23,67 mmol, 1,0 eq) en acetona (120 ml) seguido de la adición de una solución acuosa de ácido clorhídrico 2N (20 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas y se determinó la finalización de la reacción mediante LCMS. La mezcla de reacción se concentró para eliminar la acetona, se diluyó con agua helada (100 ml), se basificó con una solución saturada de bicarbonato de sodio y se extrajo con acetato de etilo (2 x 100 ml). Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se evaporaron a presión reducida para producir un producto crudo como un sólido pegajoso de color marrón claro. El material crudo se purificó mediante cromatografía en columna (acetato de etilo/hexano como sistema de disolvente) para producir 1-(6-((4,4-difluorocidohexil)amino)-2-(4-metiltiazol-2-il)pirimidin-4-il)etan-1-ona (6,1 g, 17,32 mmol, 73 %) como un sólido blanquecino. MS (MH+): m/z=353,0.

Paso 3:

Un matraz de fondo redondo equipado con una barra agitadora recubierta de teflón se cargó con 1-(6-((4,4-difluorociclohexil)amino)-2-(4-metiltiazol-2-il)pirimidin-4-il)etan-1-ona (5,6 g, 15,90 mmol, 1,0 eq.) en metanol (80 ml) a -10 °C seguido de borohidruro de sodio (0,302 g, 7,95 mmol, 0,5 eq.). La mezcla de reacción se agitó a la misma temperatura durante 1 hora y la finalización de la reacción se determinó mediante LCMS. La mezcla de reacción se inactivó con agua y se concentró a presión reducida para eliminar el metanol. El residuo se diluyó con agua helada (100 ml) y se extrajo con acetato de etilo (2 x 100 ml). Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se evaporaron a presión reducida para producir 1-(6-((4,4-difluorocidohexN)amino)-2-(4-metiltiazol-2-il)pirimidin-4-il)etan-1-ol 4 (5,5 g, 15,53 mmol, 97 %) como un sólido blanquecino de una mezcla racémica. MS (MH+): m/z=355,0.

Paso 4:

El compuesto racémico 1-(6-((4,4-difluorociclohexil)amino)-2-(4-metiltiazol-2-il)pirimidin-4-il)etan-1-ol 4 (5,5 g) se purificó mediante HPLC quiral (columna: Chiralpak-IC (250*20*5,0 p); fase móvil A: N-hexano (0,1 % DEA), fase móvil B: IPA:DCM (90:10) isocrático: 50:50 (A:B); caudal: 15,0 ml/minuto; 120/iny; tiempo de corrida: 15 minutos) para producir (S)-1-(6-((4,4-difluorociclohexil)amino)-2-(4-metiltiazol-2-il)pirimidin-4-il)etan-1-ol 5 (2,1 g, 5,93 mmol, 38 %) como un sólido blanquecino de las primeras fracciones eluidas (pico-1, RT= 4,24 min.). MS (MH+): m/z=355,0. RMN de 1H (400 MHz, DMSOd6): 87,59-7,57 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 7,37(s, 1H), 6,64 (s, 1H), 5,37-5,36 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 4,52-4,50 (t, J = 11,2 Hz, 5,6 Hz, 1H), 4,05 (bs, 1H), 2,43 (s, 3H), 2,10-1,96 (m, 6H), 1,62-1,59 (m, 2H), 1,35­ 1,33 (d, J = 6,4 Hz, 3H). Otro enantiómero: (R)-1-(6-((4,4-difluorociclohexil)amino)-2-(4-metiltiazol-2-il)pirimidin-4-il)etan-1-ol 6 (2,05 g, 5,78 mmol, 37 %) como un sólido blanquecino de las segundas fracciones de elución (pico-2, RT= 6,45 min.). MS (MH+): m/z=355,0. RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6): 87,60-7,59 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 7,37(s, 1H), 6,64 (s, 1H), 5,38 (bs, 1H ), 4,52-4,51 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 4,10 (bs, 1H), 2,43 (s, 3H), 2,10-1,91 (m, 6H), 1,65­ 1,57 (m, 2H), 1,35-1,34 (d, J = 6,8 Hz, 3H).

2-(3-ciclopropil-1H-pirazol-1-il)-N-(4,4-difluorociclohexil)-6-morfolinopirimidin-4-amina

Paso 1:

Un matraz de 1000 ml, de tres bocas, secado en llama, de fondo redondo, equipado con una barra agitadora recubierta de teflón (3 cm), un septo (boca 1), tapón (boca 3) y condensador de reflujo equipado con un adaptador de tubo en U de entrada y salida de gas nitrógeno lleno de aceite (boca 2), se cargó con una solución de 4,6-dicloro-2-(metiltio)pirimidina (150 g, 768,94 mmol, 1,0 equiv.) en acetonitrilo (1500 ml) seguido de clorhidrato de 4,4-difluorociclohexilamina (158,35 g, 922,733 mmol) y carbonato de cesio (526 g, 1614 mmol, 2,1 equiv.). La mezcla de reacción se calentó a 75 °C durante 16 horas. La mezcla de reacción se filtró para eliminar el carbonato de cesio, luego el filtrado se concentró a presión reducida para producir 210 g (93 % de rendimiento) de 6-cloro-N-(4,4-difluorociclohexil)-2-(metiltio)pirimidin-4-amina como un sólido amarillo pálido. MS (MH+): m/z = 294,0.

Paso 2:

Una solución de 6-cloro-N-(4,4-difluorociclohexil)-2-(metiltio)pirimidin-4-amina (60 g, 204,24 mmol, 1,0 equiv.) y morfolina (35,6 ml, 408,48 mmol, 2,0 equiv. ) en acetonitrilo (600 ml) se calentó a 85 °C en un tubo sellado durante 16 horas. Una vez finalizada la reacción, la mezcla de reacción se concentró y el residuo resultante se inactivó con agua helada. El sólido obtenido se filtró y se lavó con agua (500 ml), hexano (250 ml), se secó al alto vacío para producir N-(4,4-difluorociclohexil)-2-(metiltio)-6-morfolinopirimidin-4-amina como un sólido blanquecino (62 g, 88 % de rendimiento). MS (MH+): m/z =345,2.

Paso 3:

Un matraz de 100 ml, de tres bocas, secado en llama, de fondo redondo, equipado con una barra agitadora recubierta de teflón (3 cm), un septo (boca 1), tapón (boca 3) y condensador de reflujo equipado con un adaptador de tubo en U de entrada y salida de gas nitrógeno lleno de aceite (boca 2), se cargó con una solución de N-(4,4-difluorociclohexil)-2-(metiltio)-6-morfolinopirimidin-4-amina (1 g, 2,90 mmol) en tetrahidrofurano (15 ml) seguido de 4-N,N-dimetilaminopiridina (0,1 g, 0,87 mmol, 0,3 equiv.), trietilamina (1,2 ml, 8,71 mmol, 3,0 equiv.) y anhídrido de Boc (3,16 g, 14,51 mmol, 5,0 equiv.), luego la mezcla de reacción se calentó a 80 °C durante 16 horas. Una vez finalizada la reacción, la mezcla de reacción se inactivó con agua y se extrajo con acetato de etilo (2 x 75 ml). La capa orgánica combinada se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró para producir (4,4-difluorociclohexil)(2-(metiltio)-6-morfolinopirimidin-4-il)carbamato de terc-butilo como una goma amarilla (1,1 g, 85 %). MS (MH+): m/z =445,2.

Paso 4:

Un matraz de 100 ml, de una sola boca, de fondo redondo, conectado con un condensador de reflujo equipado con un adaptador de tubo en U de entrada y salida de gas nitrógeno lleno de aceite, una barra agitadora recubierta de teflón (1 cm), se cargó con una solución de (4,4-difluorociclohexil)(2-(metiltio)-6-morfolinopirimidin-4-il)carbamato de terc-butilo (50 g, 112,47 mmol) en diclorometano (600 ml) seguido de ácido 3-cloroperbenzoico (ácido mcloroperbenzoico) (58,2 g, 337,42 mmol, 3,0 equiv.) a 0°C. La mezcla de reacción se calentó lentamente hasta temperatura ambiente y se agitó durante 30 minutos. Una vez finalizada la reacción, la mezcla de reacción se inactivó con una solución saturada de bicarbonato y se extrajo con diclorometano (2 x 250 ml). La capa orgánica combinada se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró para producir (4,4-difluorociclohexil)(2-(metilsulfonil)-6-morfolinopirimidin-4-il)carbamato de terc-butilo como una goma blanquecina (52 g, 97 % de rendimiento). MS (MH+): m/z =477,3.

Paso 5:

Un matraz de 100 ml, de una sola boca, de fondo redondo, conectado con un condensador de reflujo equipado con un adaptador de tubo en U de entrada y salida de gas nitrógeno lleno de aceite, una barra agitadora recubierta de teflón (2 cm), se cargó con una solución de (4,4-difluorociclohexil)(2-(metilsulfonil)-6-morfolinopirimidin-4-il)carbamato de terc-butilo (0,9 g, 1,88 mmol) en acetonitrilo (10 ml) seguido de 3-ciclopropil-1H-pirazolo (0,3 g, 2,83 mmol, 1,5 equiv.) y carbonato de cesio (1,23 g, 3,77 mmol, 2,0 equiv.). La mezcla de reacción se calentó a 80 °C durante 16 horas, y la finalización de la reacción se determinó mediante TLC y LCMS. La mezcla de reacción se filtró y el filtrado se concentró. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna utilizando gel de sílice 60-120 con acetato de etilo-éter de pet. como sistema de disolvente. El material aislado se secó al vacío para producir (2-(3-ciclopropil-1H-pirazol-1-il)-6-morfolinopirimidin-4-il)(4,4-difluorociclohexil)carbamato de terc-butilo como un sólido blanquecino (0,8 g, 84 %). ^m S (MH+): m/z =505.

Paso 6:

Un matraz de 100 ml, de tres bocas, secado en llama, de fondo redondo, equipado con una barra agitadora recubierta de teflón (2 cm), un septo (boca 1), tapón (boca 3) y adaptador de tubo en U de entrada y salida de gas nitrógeno lleno de aceite (boca 2), se cargó con una solución de (2-(3-ciclopropil-1H-pirazol-1-il)-6-morfolinopirimidin-4-il)(4,4-difluorociclohexil)carbamato de terc-butilo (1,2 g, 1,98 mmol, 1 eq.) en diclorometano (40 ml) seguido de ácido trifluoroacético (2,5 ml, 32,55 mmol, 16,4 eq.) a 0 °C. La mezcla de reacción se calentó lentamente hasta temperatura ambiente y se agitó a la misma temperatura durante 6 horas. La finalización de la reacción se determinó mediante TLC y UPLC. La mezcla de reacción se concentró y el residuo resultante se inactivó con una solución saturada de bicarbonato de sodio al 10 %, se extrajo con acetato de etilo (2 x 100 ml) y se concentró a presión reducida para proporcionar el producto crudo. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna utilizando gel de sílice 60-120, acetato de etilo-éter de pet. como sistema de disolvente. El sólido resultante se secó al vacío para producir 2-(3-ciclopropil-1H-pirazol-1-il)-N-(4,4-difluorociclohexil)-6-morfolinopirimidin-4-amina 7 (0,73 g, 90 %). MS (MH+): m/z=405. Datos analíticos: RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6): 88,39 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,08 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,14 (d, J = 2,80 Hz, 1H), 5,53 (s, 1H), 3,88 (s, 1H), 3,69-3,67 (m, 4H), 3,50 (m, 4H), 1,99-1,90 (m, 7H), 1,56-1,54 (m, 2H), 0,93-0,89 (m, 2H), 0,72-0,71 (m, 2H).

ENSAYOS BIOLÓGICOS

La actividad biológica se determinó de la siguiente manera. La corriente iónica a través de los canales K+ activados por Ca2+ de pequeña conductancia (canales SK, subtipo 2) se midió usando la configuración de células enteras de la técnica de fijación de parche en un montaje de fijación en parche utilizando células de cultivo de tejido HEK293 que expresan canales SK2 como se describe en Hougaard et al., British Journal of Pharmacology 151, 655 - 665, 8 de mayo de 2007, cuyas enseñanzas se incorporan en la presente a modo de referencia. En un aspecto, un compuesto se define como un modulador alostérico positivo (PAM) de SK si el compuesto aumenta la corriente en este ensayo, por ejemplo, si el valor SC¹⁰⁰ del compuesto es inferior o igual a 10 mM según lo determinado por este ensayo. El valor SC¹⁰⁰ se define como la concentración de compuesto que aumenta la corriente basal en un 100 %.

El valor SC¹⁰⁰ se proporciona en la Tabla 1.

A ratas macho Sprague Dawley se les administró vehículo, 10 o 30 mg/kg del compuesto 1 mediante administración oral 30 minutos antes de la inyección de harmalina a fin de investigar el efecto terapéutico del compuesto 1 sobre el temblor inducido por harmalina. Inmediatamente después de la inyección de harmalina, los animales se colocaron en el aparato de cuantificación de temblores y se cuantificaron los eventos de temblores durante 60 minutos. Se generó una señal de evento de temblor cuando una pequeña banda transmisora de metal colocada en la pata delantera derecha del animal se movió dentro del campo electromagnético generado por una antena de espira dentro del aparato de prueba. Las emisiones del amplificador se digitalizaron a una frecuencia de muestreo de 1000 Hz y la señal se procesó y analizó utilizando el software LabView (National Instruments). Para minimizar la señal del comportamiento ambulatorio y de acicalamiento, la señal se filtró con un filtro de promedio móvil no ponderado de 128 ms, y los eventos con amplitudes > 0,5 V y una duración de > 300 ms se contaron como un evento de temblor. Los datos se analizaron en intervalos de un minuto durante el transcurso de la prueba y se presentaron como la suma de los eventos de temblor durante toda la prueba de 60 minutos. Como se muestra en la figura 1, se observó una inhibición significativa de los temblores a una dosis de 30 mg/kg del compuesto 1.

También se ha demostrado la reducción del temblor con el compuesto 1 mediante la medición de la frecuencia del temblor de todo el cuerpo a través de un acelerómetro de placa de fuerza.

El temblor de todo el cuerpo se midió con un monitor de temblores de San Diego Instruments (San Diego, California, EE. UU.). Los animales fueron previamente tratados con 3, 10 o 30 mg/kg del compuesto 1 por vía oral 30 minutos antes de la administración intraperitoneal de 5 mg/kg de harmalina. Se midió el temblor durante 30 minutos después de la administración de harmalina, y los datos se analizaron mediante transformada rápida de Fourier y se informaron como un espectro de potencia de frecuencia. Harmalina indujo un aumento significativo en el espectro de potencia en una banda de frecuencias entre 10 y 14 Hz. En este intervalo , 3, 10 y 30 mg/kg redujeron significativamente el temblor. Los datos se analizaron más a fondo calculando el porcentaje de potencia de movimiento (% de MP), definido como la potencia en la banda de 9 a 13 Hz dividida por la potencia total en todo el espectro (0 a 30 Hz) multiplicada por 100. Según este análisis, 3, 10 y 30 mg/kg redujeron significativamente el temblor inducido por harmalina (harmalina vehículo (n=13); harmalina 3 mg/kg del compuesto 1 (n=8), P<0,01; 10 mg/kg del compuesto 1 (n=16) y 30 mg/kg del compuesto 1 (n=13), respectivamente, P<0,05) (figura 2).

En conjunto, estos datos muestran que el compuesto 1 reduce significativamente el temblor inducido por harmalina medido por dos diseños experimentales distintos.

El grado en que los compuestos modulan los canales SK2 in vivo se expresa como % de SK2 SC¹⁰⁰, que es la relación de la concentración del fármaco libre en el cerebro con la potencia medida del compuesto en el canal SK2. Se calcula de la siguiente manera: C^fb = C^mb x BFF, donde C^mb es la concentración de compuesto medida por espectrometría de masas por cromatografía líquida de cerebros que se recolecta inmediatamente después del registro del temblor (Tabla 1, "Concentración cerebral medida"). C^fb es la cantidad de compuesto libre no complejado con proteína y, por lo tanto, libre para interactuar con el canal SK2 (Tabla 1, "Concentración cerebral libre calculada"). BFF es la fracción libre promedio del compuesto medida por diálisis de equilibrio en experimentos separados (concentración de prueba 1 uM incubada en homogeneizado de tejido cerebral de rata al 10 % durante 5 horas a 37°C) (Tabla 1, "Fracción libre del cerebro"). El fármaco libre en el cerebro disponible para interactuar con los canales SK2 (C^fb) se obtiene multiplicando el nivel cerebral total medido (C^mb) por la fracción libre media (BFF) Luego, la cantidad de compuesto libre se expresa en términos de su potencia contra el canal SK2 de la siguiente manera: % de SK2 SC100 = C^fb /SK2 SC1003100, donde SK2 SC100 (Tabla 1, "SK2 SC100") es el valor medido de la potencia del compuesto en los canales SK2 y % de SK2 SC100 (Tabla 1, "% de SK2 SC100") es la concentración cerebral libre (CFB) normalizada a SK2 SC100. Los valores se proporcionan en la Tabla 1.

Tabla 1

Efecto sobre la irregularidad en la activación de células de Purkinje en cortes ex vivo de ratones transgénicos SCA2 58Q

En cortes cerebelosos de ratones SCA2 58Q, las neuronas de Purkinje presentan activaciones caóticas, medibles como un aumento en el coeficiente de variación del intervalo entre picos (CV de ISI), una medida de la regularidad del intervalo de activación entre potenciales de acción. La diferencia en el CV del ISI entre ratones de tipo salvaje (N=8) y SCA2 58Q (N=11) se ilustra en la figura 3 (P<0,005). También se muestra que la aplicación de baño secuencial de 1 (N=11) o 3 pM (N=10) del compuesto 1 revirtió parcialmente el aumento en el CV del ISI observado en cortes cerebelosos de ratones SCA2 58Q de once meses (P<0,05). Esos datos indican que el compuesto 1 regulariza la activación de Purkinje restaurando parcialmente el intervalo entre picos en este modelo de ratón de ataxia espinocerebelosa.

Evaluación del efecto del compuesto en el modelo de ratón Tottering con ataxia episódica 2 (EA2)

El compuesto 1 ha demostrado eficacia en modelos animales validados de ataxia hereditaria (EA2) y ET (temblor inducido por harmalina). Para evaluar si el compuesto 1 puede aliviar la ataxia en un modelo de enfermedad, se evaluó en el modelo de ratón "Tottering" con EA2 Estos ratones muestran una ataxia basal que surge de la irregularidad en la activación del marcapasos de las células de Purkinje debido a una mutación de pérdida de función en los canales P/Q Ca2+ (la misma proteína que está mutada en SCA6), lo que provoca la ataxia episódica 2 (EA2). Los animales se evaluaron en el aparato para el suelo con varillas paralelas que cuenta automáticamente el número de veces que la pata del animal se desliza a través de las varillas de metal espaciadas uniformemente y la distancia total que recorre el animal. Luego, la ataxia inicial se expresó como la relación de ataxia, que es el número total de deslices dividido por la distancia total que recorre el animal en centímetros. El aumento en la relación de ataxia entre ratones de tipo salvaje y EA2 se ilustra en la figura 4.

En este estudio, a los ratones con EA2 (8-10 meses de edad; n=18) se les inyectó por vía intraperitoneal el compuesto 1 o el vehículo 30 minutos antes de colocarlos en el aparato para el suelo con varillas paralelas. Los animales se evaluaron en un diseño de estudio cruzado en el que cada animal recibió tanto el vehículo como 10 mg/kg del compuesto 1. Se dejaron tres días entre dosis para un período de reposo farmacológico del compuesto. A la dosis administrada en este estudio, el compuesto 1 revirtió completamente el aumento en la relación de ataxia observada en ratones con EA2 frente a los de tipo salvaje. Estos datos indican que el compuesto 1 restaura el rendimiento normal en esta medida de la función motora en un modelo de ataxia cerebelosa hereditaria.

Ventajas comparativas

Los siguientes estudios ilustran ventajas técnicas adicionales de los compuestos divulgados en la presente.

Las pruebas de solubilidad acuosa (solubilidad cinética) de los compuestos se realizaron en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) y se midieron mediante el método del matraz agitado. En este ensayo, la solución madre de DMSO del compuesto de prueba se añade al tampón seguido de equilibrio (agitación), filtración y determinación de la cantidad soluble mediante HPLC-UV. Las condiciones utilizadas en el ensayo se resumen a continuación. Los resultados se muestran en la Tabla 2 y en la Tabla 3.

- Concentración del compuesto: 200 pM con 1 % de DMSO (n=2)

- Tampón acuoso: Sistema tampón de fosfato 0,05 M pH 7,4

- Período de equilibrio: 16 horas a temperatura ambiente (~23°C) con agitación

- Preparación de la muestra: Filtración

- Análisis: HPLC-UV

- Compuestos de referencia: Cafeína (alta solubilidad) y dietilestilbestrol (baja solubilidad)

El perfil de estabilidad metabólica de los compuestos se realizó en microsomas hepáticos. En este ensayo, el compuesto de prueba se incuba con microsomas hepáticos en presencia de NADPH durante 2 puntos temporales a 37°C. Al final de la incubación, la reacción se inactiva con un estándar interno que contiene acetonitrilo y el compuesto original restante se determina mediante LC-MS/MS. Las condiciones utilizadas en el ensayo se resumen a continuación. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

- Tiempo de incubación: 0 y 30 minutos a pH 7,4, 37°C

- Concentración de prueba: 1 pM en DMSO al 0,02 % a pH 7,4 (n=2)

- Concentración de NADPH en el ensayo: 1mM

- Concentración de proteína de microsoma hepático en el ensayo: 0,5 mg/ml

- Análisis: LC-MS/MS

- Datos informados: % de compuesto original restante (% de PCR)

- Se incluyen los compuestos de referencia para la depuración alta y baja

- Especies evaluadas: ratón, rata, perro, mono y ser humano

Los compuestos descritos en la presente se probaron para la inhibición de CYP en 5 isoformas (3A4, 2D6, 2C9, 2C19 y 1A2). En este ensayo, los sustratos específicos de la isoforma CYP se incuban con microsoma hepático humano (HLM) en presencia de compuestos de prueba y se determina la formación de metabolitos. Se calcula el porcentaje de inhibición de la formación de metabolitos a diferentes concentraciones del compuesto de prueba y se determina la IC50. Las condiciones utilizadas en el ensayo se resumen a continuación. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

- Concentración del fármaco de prueba (inhibidor): 8 concentraciones diferentes (100 mM a 0,005 mM)

- Matriz: Microsoma hepático humano (Invitrogen, life technologies)

- Se utilizarán sustratos de sonda específicos para las isoformas como se indica a continuación:

- CYP3A4: Midazolam

- CYP2D6: Bufuralol

- CYP2C9: Diclofenac

- CYP2C19: Mefinitoína

- CYP1A2: Fenacetina

- Cofactores: NADPH (1 mM final en ensayo)

- Análisis de muestra: LC-MS/MS (metabolitos)

- Inhibidores de referencia específicos incluidos en todos los ensayos (ketoconazol/quinidina/sulfafenazol/ticlopidina/furafilina)

- Tampón: Tampón de fosfato de potasio (100 mM) pH 7,4

- Nivel de DMSO en el ensayo: 0,1 %

- Análisis de los datos: % de inhibición sobre el control

Los compuestos se analizaron en un ensayo de canal de potasio cardiaco hERG. El hERG es responsable de una corriente rectificadora retardada rápida (k r) en los ventrículos humanos. La inhibición de kr es la causa más frecuente de la prolongación del potencial de acción cardíaco mediante fármacos no cardíacos. Véase, por ejemplo, Brown, A.M. y Rampa, D. (2000). Drug-induced long QT syndrome: is HERG the root of all evil? Pharmaceutical News 7, 15-20.

Las células HEK-293 se transfectaron de forma estable con ADNc de hERG. Los transfectantes estables se seleccionaron por coexpresión con el gen de resistencia a G418 incorporado en el plásmido de expresión. La presión de selección se mantuvo incluyendo G418 en el medio de cultivo. Las células se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco/mezcla de nutrientes F-12 (D-MEM/F-12) complementado con suero bovino fetal al 10 %, penicilina G sódica 100 U/ml, sulfato de estreptomicina 100 pg/ml y G418 500 pg/ml. Los registros de cultivos celulares se mantienen archivados en Charles River Laboratories.

Las células se transfirieron a la cámara de registro y se superfundieron con solución de control de vehículo. La solución de pipeta para registros de células enteras fue (composición en mM): aspartato de potasio, 130; MgCb, 5; EGTA, 5; a Tp , 4; HEPES, 10; pH ajustado a 7,2 con KOH. La solución de pipeta se preparó en lotes, se dividió en alícuotas, se almacenó congelada y se descongeló una alícuota nueva cada día. Se fabricaron pipetas de parche a partir de tubos capilares de vidrio utilizando un extractor de micropipetas P-97 (Sutter Instruments, Novato, CA). Se usó un amplificador de fijación en parche comercial para grabaciones de células enteras. Antes de la digitalización, los registros actuales se filtraron en paso bajo a una quinta parte de la frecuencia de muestreo.

El inicio y la inhibición en estado estable de la corriente hERG se midieron usando un patrón de pulsos con amplitudes fijas (prepulso de acondicionamiento: 20 mV durante 2 s; pulso de prueba: -50 mV durante 2 s) repetido a intervalos de 10 s, desde un potencial de mantenimiento de -80 mV. La corriente de cola máxima se midió durante el paso de 2 s a -50 mV.

Se aplicó una concentración de artículo de prueba a cada célula (n = 3). La corriente máxima se midió durante la rampa de prueba. Se mantuvo un estado estable durante al menos 30 segundos antes de aplicar el artículo de prueba o el control positivo. Se midió la corriente máxima hasta que se alcanzó un nuevo estado estable. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Los datos de biodisponibilidad oral se recogieron en ratas de la siguiente manera. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

- Cepa/sexo de la rata: Sprague Dawley/macho

- Edad/peso corporal: 6 a 8 semanas/ 250-300 gms

- N. ° de animales por grupo: n=3

- N. ° total de grupos: 2 (1 mpk IV y 10 mpk PO)

- Ruta de administración: Oral (PO)/ Intravenosa (IV)

- Volumen de dosis: Intravenosa (2 ml/kg) y oral (10 ml/kg)

- Vehículos de formulación: Formulaciones estándar o sugeridas por los niveles de dosis del patrocinador (IV y oral): 1 mg/kg; intravenosa y 10 mg/kg; oral o como se sugiere

- En ayunas/alimentado: La dosis oral se realizará con animales en ayunas durante la noche Frecuencia de dosis: Dosis única

- Puntos temporales para la recolección de sangre: (57 muestras de plasma para análisis)

- IV - 10 puntos (predosis; 5 min; 15 min; 30 min; 1 h; 2 h; 4 h; 6 h; 8 h; 24 h) [n=3 ratas]

- PO - 9 puntos (predosis; 15 min; 30 min; 1 h; 2 h; 4 h; 6 h; 8 h; 24 h) [n=3 ratas]

-Recolección de muestras de sangre: Cánula de vena yugular

- Anticoagulante: EDTA K2 al 0,2 %

- Análisis de muestras mediante un método bioanalítico de grado de descubrimiento desarrollado para la estimación del compuesto de prueba en plasma utilizando sistemas LC-MS/MS.

Como se muestra en los datos de la Tabla 2 anterior, compuesto 1 es más de 3 veces más potente en SK2 que el comparador A y más de 14 veces más potente en SK2 que el comparador B. El compuesto 1 también tiene mejor solubilidad, mayor BFF, mayor estabilidad microsomal, y mayor biodisponibilidad oral que el comparador A. También se demostró una mejora general en BFF y en la solubilidad sobre el comparador A y el comparador C derivado de fenilo a través de los compuestos descritos en la presente, como se muestra en la Tabla 3. El compuesto 1 se reproduce desde arriba para facilitar la comparación.

Tabla 3

(continuación)

Si bien hemos descrito varias realizaciones de esta invención, es evidente que nuestros ejemplos básicos pueden modificarse para proporcionar otras realizaciones que utilicen los compuestos y métodos de esta invención. Por lo tanto, se apreciará que el alcance de esta invención se definirá por las reivindicaciones adjuntas más que por las realizaciones específicas que se han representado a modo de ejemplo.

A menos que se defina lo contrario, a todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente se les otorga el significado frecuentemente conocido por los expertos en la técnica.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un compuesto de la fórmula:

   

   2. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el compuesto tiene la fórmula

   

   o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

   

   o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

   4. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el compuesto tiene la fórmula

   

   o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

   5. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el compuesto tiene la fórmula

   

   o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

   6. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el compuesto tiene la fórmula

   

   o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

   7. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y un portador farmacéuticamente aceptable.

   8. Un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o una composición de la reivindicación 7 para usar en el tratamiento de una enfermedad o afección sensible a la modulación del canal de potasio activado por calcio de pequeña conductancia (canal SK).

   9. El compuesto para uso o composición para uso de la reivindicación 8, en donde la enfermedad o afección es sensible a la modulación del canal SK2.

   10. El compuesto para uso o composición para uso de la reivindicación 8, en donde la enfermedad o afección se selecciona de una enfermedad neurodegenerativa, demencia, enfermedad cardíaca, síntomas de abstinencia asociados con la terminación de la adicción, enfermedad metabólica y enfermedad de la vejiga.

   11. El compuesto para uso o composición para uso de la reivindicación 8, en donde la enfermedad o afección se selecciona de ataxia, distonía, temblores, enfermedad de Parkinson, isquemia, lesión cerebral traumática, esclerosis lateral amiotrófica, hipertensión, aterosclerosis, diabetes, arritmia, vejiga hiperactiva y síntomas de abstinencia provocados por la terminación del abuso de alcohol y otras drogas que generan adicción.

   12. El compuesto para uso o composición para uso de la reivindicación 11, en donde la enfermedad o afección es temblor esencial.

   13. El compuesto para uso o composición para uso de la reivindicación 11, en donde la enfermedad o afección es ataxia.

   14. El compuesto para uso o composición para uso de la reivindicación 13, en donde la enfermedad o afección es ataxia espinocerebelosa.

   15. El compuesto para uso o composición para uso de la reivindicación 8, en donde la enfermedad o afección es ansiedad.