BRPI0709289A2

BRPI0709289A2 - substrato para análise espectrométrica de massa de uma enzima, processo para analise espectrométrica de massa de uma enzima, embalagem comercial e método para usar o dito substrato

Info

Publication number: BRPI0709289A2
Application number: BRPI0709289-0A
Authority: BR
Inventors: Blas Cerda
Original assignee: Perkinelmer Las Inc
Priority date: 2006-03-13
Filing date: 2007-03-13
Publication date: 2011-07-05
Also published as: JP2009530310A; WO2007106816A2; CN102943106A; EP1999270A2; WO2007106816A3; CA2646505A1; US8476414B2; AU2007226582B2; CN101426926A; US20090068634A1; AU2007226582A1; EP1999270A4

Abstract

SUBSTRATO PARA ANALISE ESPECTROMéTRICA DE MASSA DE UMA ENZIMA, PROCESSO PARA ANALISE ESPECTROMéTRICA DE MASSA DE UMA ENZIMA, EMBALAGEM COMERCIAL E MéTODO PARA USAR O DITO SUBSTRATO. Provê-se um substrato inventivo que inclui um composto de substrato de fórmula A-B^1 ^-B^ 2^-B^ 3^ na qual A é uma parcela açúcar; B^ 1^ é uma parcela ligante que permite a conjugação de parcela A e a estrutura restante do substrato; B^ 2^ contém um elemento carregado permanentemente tal como um grupo amónio quaternário a fim de aumentar afinidades por prótons e eficiências de ionização para análise por espectrometria de massa; e B^ 3^ de vários comprimentos de carbonos conferindo especificidades para as enzimas-alvo. Provê-se também um processo para detectar doenças lisossómicas contatando uma amostra com o substrato inventivo junto com um padrão interno que é análogo marcado isotopicamente do produto clivado por uma enzima-alvo sobre o substrato.

Description

"SUBSTRATO PARA ANÁLISE ESPECTROMÉTRICA DE MASSA DE UMAENZIMA, PROCESSO PARA ANÁLISE ESPECTROMÉTRICA DE MASSA DEUMA ENZIMA, EMBALAGEM COMERCIAL E MÉTODO PARA USAR O DITOSUBSTRATO".

Campo da invenção

A presente invenção refere-se a reagentes analíticos e amétodos baseados em espectroscopia de massa usando estesreagentes para a quantificação simultânea de proteínasnuma amostra. Mais especificamente, a presente invençãorefere-se a reagentes e ensaios multíplices para aquantificação da atividade de enzimas lisossômicas usandoespectroscopia de massa.Histórico da invenção

As doenças de armazenamento lisossômico são um grupo dedistúrbios herdados caracterizados por deficiências emenzimas específicas no corpo, que resulta na incapacidadedo corpo de quebrar substâncias metabólicas. Como umexemplo, a doença de Fabry é um distúrbio dearmazenamento lisossômico visto em uma para cada 40.000pessoas. Ela é causada por uma deficiência na enzimaalfa-galactosidase que resulta então na incapacidade docorpo em quebrar substâncias graxas específicas chamadasglobotriaosilceramida. Um segundo exemplo é a doença deGaucher, uma doença de armazenamento lisossômico causadapor uma incapacidade de quebrar substâncias graxas oulipídios chamados glicosilceramidas (também chamadosglicocerebrosídeos). Indivíduos com a doença de Gauchernão produzem glicocerebrosidase, uma enzima necessáriapara quebrar estas substâncias graxas. Estas substânciasgraxas então se acumulam nas células do fígado, baço, emedula óssea. Um terceiro exemplo é a doença de Pompe, umdistúrbio de armazenamento lisossômico causado por umadeficiência na enzima alfa-glicosidase ácida que énecessária para quebrar determinado açúcar chamadoglicogênio. Quando a enzima alfa-glicosidase ácida estáem falta, o glicogênio acumula-se em vários tecidos eórgãos no corpo.Estas doenças são, em sua maioria, distúrbios dainfância. Na maioria delas, são normais ao nascer e têmdeterioração neurológica progressiva iniciando algumtempo depois. Em alguns deles, a doença manifesta-se naidade adulta. 0 fenótipo clínico depende do tipo e dagravidade do defeito bioquímico. Alguns destes distúrbioslisossômicos, tais como a doença de Pompe e a doença deKrabbe, manifestam-se principalmente na infância.Portanto, esforços contínuos vêm sendo feitos para desenvolver métodos para detectar estes distúrbios antesdo início de sintomas clínicos a fim de que se possaminiciar intervenções terapêuticas.

Durante a década passada os laboratórios que testaramdistúrbios metabólicos têm introduzido a espectroscopia de massa em série em seus programas de triagem de recém-nascidos. A espectroscopia de massa em série continua aganhar popularidade na porque esta tecnologia permite adosagem de muitos metabólitos numa única amostra. Porexemplo, esta tecnologia foi implementada como uma prática clínica rotineira para a detecção de distúrbiosmetabólicos hereditários em recém-nascidos usandoamostras mancha seca de sangue (Schulze A. et al. ,Pediatrics 2003; 111:1399-406). Embora as atividades deenzima lisossômica possam ser quantificadas usandoespectroscopia de massa em série (Gelb M.H. et al. ,Clinicai Chemistry 50:10, 1785-1796, 2004), métodos dedosagens publicados foram adaptáveis rapidamente a umajuste clínico devido a procedimentos lentos ecomponentes incômodos de dosagem tal como clorofórmio.

Conseqüentemente, há uma necessidade contínua de melhoraros métodos e composições para detectar doençaslisossômicas.

Sumário da invenção

Provêm-se processos e composições melhoradas para detectar reações enzimáticas usando espectroscopia demassa de acordo com incorporações da presente invenção.Um substrato inventivo tem a fórmula geralA—(B1—B2—B3) (I) onde A é um monossacarídeo ou umdissacarídeo e B1 é um alquila de C1-C20, um arila de C6-C20 substituído com N ou O, heterocíclico de C6-C20contendo um heteroátomo de N, O, ou S; B2 é

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onde R1 é um alquila de C1-C20; éter de C4-C20; alquila deC1-C20 tendo um substituinte de N, O, ou S; arila de C6-C20substituído com heteroátomo de Ν, O ou S, carbonila deC1-C20, amidila de C1-C20, éter de C1-C20, arila de C6-C20,heterocíclico de C6-C20 contendo um heteroátomo de N, 0,ou S; em cada ocorrência, R2 é independentemente H, umalquila de C1-C20 um alquila de C2-C20 tendo umsubstituinte de alquila de C1-C20; em cada ocorrência, X éindependentemente nulidade, oxigênio, enxofre, ounitrogênio; em cada ocorrência, R3 é independentementenulidade, alquila de C1-C20, C1-C20 tendo um arila de C6-C20substituído, heterocíclico de C6-C20 contendo umheteroátomo de N, O, ou S; η é um número inteiro entre 0e 30, inclusive; em cada ocorrência, R4 éindependentemente nulidade, alquila de C1-C20, C1-C20 tendoum arila de C6-C20 substituído, carbonila de C1-C20,amidila de C1-C20, éter de C1-C20, arila de C6-C20,heterocíclico de C6-C20 contendo um heteroátomo de N, 0,ou S; e B3 é nulidade ou alquila de C1-C20, éter de C4-C20,alquila de C1-C20 tendo um substituinte de N, O, ou S,éster de C1-C20, álcool de C1-C20, alquenila de C1-C20,arila de C6-C20 com heteroátomo, heterocíclico de C6-C20contendo um heteroátomo de Ν, 0 ou S.

Um processo para análise por espectrometria de massa deuma enzima inclui contatar a enzima com um substrato deFórmula I para gerar um produto de clivagem B1—B2—B3 quetem um peso molecular de produto de clivagem em respostaà reação enzimática. Provê-se um padrão interno(B1—B2—B3)' com o substrato de Fórmula I, onde(B1—B2—B3) ' tem pelo menos um isótopo de predomíniosecundário estável de peso molecular diferente do pesomolecular do produto de clivagem e B1, B2, e B3 de(B1—B2—B3) ' são respectivamente idênticos a B1, B2, e B3do substrato de Fórmula I. A análise por espectrometriade massa quantifica a razão massa para carga entre oproduto clivado e o padrão interno e dessa forma aatividade enzimática. Enzimas particulares de interesseem doença de armazenamento lisossômico incluem a- galactosidase A ácida, β-glicocerebrosidase ácida,galactocerebrosídeo α-galactosidase, esfingomielinaseácida, e α-glicosidase ácida. Preferem-se produto declivagem (B1—B2—B3) e padrão interno (B1—B2—B3) 'estruturalmente idênticos diferindo apenas em pesomolecular.

Divulga-se uma embalagem comercial inclusive de substratode Fórmula I, um padrão interno (B1—B2—B3) ' que incluium isótopo de predomínio secundário estável e difere empeso molecular em relação a B1—B2—B3 de Fórmula I de substrato. Provêm-se instruções para detectar atividadede um substrato de Fórmula I reconhecendo uma enzima numaamostra por análise por espectrometria de massa.Um processo para análise por espectrometria de massa deuma enzima inclui rotular um primeiro substrato enzimático de Fórmula I com uma marcação isotópica Llpara produzir L1 (A)—"-(B1—B2—B3) e um segundo substratode Fórmula I com uma marcação isotópica diferente L2 paraproduzir L2 (A)—L12 (B1—B2—B3). Combinando

L1 (A) —L1 (B1—B2—B3) e L2 (A) —L2 (B1—B2—B3) com a enzima parapermitir a clivagem do primeiro e segundo substratos.Quantificando um aumento em produtos de clivagem L1 (A) ,L1 (B1—B2—B3) , l2(A), e L2 (B1—B2—B3) e uma diminuição noprimeiro e segundo substratos por espectrometria demassa, analisa-se a atividade enzimática. O processo de análise por espectrometria de massa descrito éparticularmente bem apropriado para detecção de umadoença de armazenamento lisossômico, sozinha ousimultânea com a detecção de um segundo dispositivo dearmazenamento lisossômico.

Provê-se um processo inventivo que inclui incubar umaamostra com uma solução de dosagem contendo um substratoinventivo e um padrão interno inventivo e submeter aamostra resultante a análise por espectroscopia de massa.

0 processo inventivo elimina a necessidade de técnicaanterior do uso de detergentes, de solventes hostis aousuário tal como clorofórmio, e etapas de extração defase sólida e líquido-líquido. Portanto, o processoinventivo consome menos tempo que os processos de técnicaanterior.

Breve descrição dos desenhos

A Figura 1 é uma estrutura de substrato exemplar paradetectar doenças de armazenamento lisossômico;

A Figura 2 é um esquema genérico de reação enzimáticausando um substrato inventivo;

A Figura 3 são diferenças estruturais significativasentre um substrato inventivo e um substrato de técnicaanterior;

A Figura 4 é um mecanismo de sensibilidade de detecçãoaumentada apresentado por um substrato inventivo emcomparação com um substrato de técnica anterior;

A Figura 5 é um método alternativo para detectaratividades enzimáticas usando marcação dupla de umsubstrato inventivo;

A Figura 6 é um método inventivo para detectar reaçõesenzimáticas usando espectroscopia de massa que évantajoso em comparação com um método de referência detécnica anterior;

A Figura 7 é um espectro de massa em série de uma amostrade substrato dirigido para a doença de Fabry de acordocom a presente invenção bem como o de uma em brancocorrespondente;

A Figura 8 são espectros de massa em série de umsubstrato inventivo dirigido a GAA para a doença de Pompeem respostas a uma amostra doente, uma amostra saudável,ou uma em branco;

A Figura 9 é um gráfico de dispersão indicando atividadesde GAA diferenciais entre 12 amostras de indivíduosrecém-nascidos saudáveis e 3 amostras de indivíduos recém-nascidos com forma positiva de doença de Pompe;

A Figura 10 é um exemplo no qual se usam substratosinventivos e padrões internos num método multípliceprocessando as amostras usando soluções de dosagemcontendo dois tipos de substratos e padrões internos;

A Figura 11 é o efeito de detergente sobre asensibilidade dos padrões internos da presente invenção;e

A Figura 12 é um espectro de massa em série diferencialde uma amostra de substrato inventivo dirigido à doençade Pompe com ou sem a presença de detergente bem como ode uma em branco correspondente;

Descrição detalhada das incorporações preferidasA presente invenção tem utilidade como uma composição dereagente analítico para detectar distúrbios dearmazenamento lisossômico. Através da aplicação desubstratos e padrões internos que são dissolvíveisrapidamente em soluções adaptáveis para análise porespectrometria de massa, detectando atividadesenzimáticas anormais associadas com doenças dearmazenamento lisossômico é mais prático e menos difícilde usar.

A presente invenção refere-se a substratos que visamenzimas lisossômicas incluindo: α-galactosidase A ácida(GLA) , β-glicocerebrosidase ácida (ABG) , a-galactocerebrosídeo α-galactosidase (GALC), a-glicosidase ácida (GAA). Usa-se a ação destas enzimassobre os substratos para medir as atividades enzimáticascorrespondentes num amostra e assim, usam-se estessubstratos para detectar os seguintes distúrbios dearmazenamento lisossômico: Fabry (GLA), Gaucher (ABG),Krabbe (GALC) e Pompe (GAA).

Um substrato inventivo tem a fórmula geral A—(B1—B2—B3)onde A é um monossacarídeo ou um dissacarídeo e B1 é umalquila de C1-C20/ um arila de C6-C2O substituído com N ouO, heterocíclico de C6-C20 contendo um heteroátomo de N,O, ou S; B2 é

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onde R1 é um alquila de C1-C20; éter de C4-C20; alquila deC1-C20 tendo um substituinte de N, O, ou S; arila de C6-C20substituído com heteroátomo de N7 O, ou S, carbonila deC1-C20, amidila de C1-C20, éter de C1-C20, arila de C6-C20,heterocíclico de C6-C20 contendo um heteroátomo de N, 0,ou S; em cada ocorrência, R2 é independentemente H, umalquila de C1-C20, um alquila de C2-C20 tendo umsubstituinte de alquila de C1-C20; em cada ocorrência, X éindependentemente nulidade, oxigênio, enxofre, ounitrogênio; em cada ocorrência, R3 é independentemente nulidade, alquila de C1-C20, C1-C20 tendo um arila de C6-C20substituído, heterocíclico de C6-C20 contendo umheteroátomo de N, 0, ou S; ? é um número inteiro entre 0e 30, inclusive; em cada ocorrência, R4 éindependentemente nulidade, alquila de C1-C20, C1-C20 tendoum arila de C6-C20 substituído, carbonila de C1-C20,amidila de C1-C20, éter de C1-C20, arila de C6-C20,heterocíclico de C6-C20 contendo um heteroátomo de N, O,ou S; e B3 é nulidade ou alquila de C1-C20, éter de C4-C20,alquila de C1-C20 tendo um substituinte de N, 0, ou S, éster de C1-C20, álcool de C1-C20, alquenila de C1-C20,arila de C6-C20 com heteroátomo, heterocíclico de C6-C20contendo um heteroátomo de N, 0 ou S.

Provê-se, em parte, a especificidade do substrato parauma enzima lisossômica particular por variaçõesestruturais na parcela de açúcar A tal como A sendo alfa-ou beta- glicose ou galactose. Parcelas de açúcarexemplares incluem a-D-glicose para detectar doença dePompe; ß-D-glicose para detectar a doença de Gaucher; a-D-galactose para detectar doença de Fabry; e β-D-galactose para detectar a doença de Krabbe. Além disso,confere-se a especificidade na detecção analítica doproduto do substrato inventivo por variações nocomprimento de carbonos dentro do grupo acila graxo deB3. Estruturas químicas exemplares de B3 incluem um grupoacila graxo de doze carbonos específico para detectar adoença de Pompe; um grupo acila graxo de catorze carbonosespecífico para detectar a doença de Gaucher; um grupoacila graxo de dezesseis carbonos específico paradetectar a doença de Fabry; e um grupo acila graxo dedezoito carbonos específico para detectar a doença deKrabbe.

B1 é uma parcela ligante que funciona para permitir aconjugação da parcela de açúcar A com a estruturarestante do substrato. B1 funciona também como umespaçador entre a parcela de açúcar e a estruturarestante do substrato a fim de prover acesso flexívelpara uma enzima-alvo.

Um grupo amônio quaternário é um componente crucial paraB2. O grupo B2 carrega uma carga permanente, na maioriados casos, uma carga positiva. Em resposta a uma reaçãoenzimática, um produto clivado de B1—B2—B3 que carrega acarga desejada em B2 produz sinal alto na análise porespectrometria de massa e se associa com menoreslimitações no ensaio global. Adicionalmente, a cargapermanente torna o substrato inventivo mais solúvel emtampões aquosos a fim de evitar a necessidade do uso desolventes muito apolares tal como clorofórmio. Emcomparação com os substratos de técnica anterior, osubstrato de acordo com a presente invenção é maishidrofílico e com menos ou nenhuma necessidade dedetergentes. Isto é vantajoso uma vez que como o uso declorofórmio, o uso de detergentes requer lentas etapas delimpeza incluindo extrações de fase sólida e líquido-líquido trabalhosas.

O substrato é estruturalmente terminado por um grupo B3.Como mencionado acima, B3 é estruturalmente modificadopara prover especificidades analíticas na detecção dosprodutos B1—B2—B3 conferindo diferentes comprimentos decadeia carbônica. Portanto, sintetizam-se substratosmuito semelhantes com mudanças em sua massa molecular quesão diferenciáveis pela análise por espectrometria demassa.

Conseqüentemente, como se considera na presente invenção,é possível sintetizar substratos com quatro açúcaresdiferentes, cada um específico para uma enzimalisossômica particular, e cada um tendo um comprimento decadeia ligeiramente diferente no subgrupo B3. A variaçãona massa permite assim a identificação por espectrometriade massa de cada um dos quatro substratos e dos produtosenzimáticos correspondentes em casos nos quais se usam ossubstratos numa dosagem multíplice onde se analisam doisou mais na mesma amostra ou no mesmo tubo ou cavidade deuma placa de micro-titulação. Esta composição permiteassim um único esquema de síntese. Na técnica anterior,cada substrato requer uma única via sintética. Tendo umavia de síntese comum para 2 ou mais destes substratospode significar economias significativas em meios deprodução devido aos processos de produção menos complexose mais curtos e ao uso de matérias-primas comuns.

Para detectar doença de Pompe, uma parcela de açúcarexemplar é a α-D-glicose e uma porção B1—B2—B3 exemplaré uma cadeia de 4-aminofenil-carnitinil-alquila com B3 de10-20 carbonos de comprimento e preferivelmente de 12carbonos de comprimento. Para detectar doença de Gaucher,uma parcela de açúcar exemplar é a β-D-glicose e umaporção B1—B2—B3 exemplar é uma cadeia de 4-aminofenil-carnitinil-alquila com B3 de 10-20 carbonos decomprimento e preferivelmente de 14 carbonos decomprimento. Para detectar doença de Fabry, uma parcelade açúcar exemplar é a α-D-galactose e uma porçãoB1—B2—B3 exemplar é uma cadeia de 4-aminof enil-carnitinil-alquila com B3 de 10-20 carbonos decomprimento e preferivelmente de 16 carbonos decomprimento. Para detectar doença de Krabbe, uma parcelade açúcar exemplar é a β-D-galactose e uma porçãoB1—B2—B3 exemplar é uma cadeia de 4-aminofenil-carnitinil-alquila com B3 de 10-20 carbonos decomprimento e preferivelmente de 18 carbonos decomprimento.

A presente invenção refere-se também a padrões internosprojetados para medida contra a quantidade de produtoscom fórmula geral B1—B2—B3 clivada dos substratosinventivos em resposta às reações enzimáticas. Os padrõesinternos são estruturalmente idênticos aos produtosclivados exceto que os padrões internos diferem na razãomassa para carga (m/z) que a dos produtos clivados poruma etapa de modificação incluindo marcação isotópica.

Portanto, os padrões internos da presente invenção sãoanálogos estáveis marcados isotopicamente dos produtosclivados onde um ou mais átomos são substituídos porisótopos atômicos correspondentes a fim de criar umamudança na massa. Como resultado, uma molécula "maispesada" de padrão interno com o 2D substituído revela umarazão m/ζ diferente nos resultados de espectrometria demassa que um produto clivado normalmente revelaria.

Emprega-se a mudança na massa para identificar produtosclivados dos padrões internos no experimento deespectrometria de massa. Isto é possível porque seadicionam os padrões internos na solução de dosagem emconcentrações conhecidas.

Numa incorporação particular, um subgrupo B1 de umsubstrato inventivo é um grupo aminofenila substituído.

Noutra incorporação particular, um subgrupo B2—B3combinado é um acil-carnitina com uma parcela de amônioquaternário carregada positivamente e a terminação acilaé de comprimento de carbonos de 12 a 18.

Noutra incorporação particular, marca-se um padrãointerno com deutério para causar uma mudança de massa de3 a 9 Daltons do produto clivado correspondente.Noutra incorporação particular, um substrato inventivoespecífico para detectar a doença de Krabbe tem um grupoA de β-D-galactose, um B1 de metila, um grupo B2 deamidila terminando com amônio quaternário, e um grupo B3de álcool de alquenila com um comprimento de carbonos de12 a 20.

Noutra incorporação ainda, um substrato inventivoespecífico para detectar a doença de Gaucher tem um grupoA de β-D-glicose, um B1 de metila, um grupo B2 de amidilaterminando com amônio quaternário, e um grupo B3 deálcool de alquenila com um comprimento de carbonos de 12a 20.

A presente invenção refere-se também a métodos para mediras atividades enzimas lisossômicas alvos numa amostra. Aamostra inclui aquela de soro, plasma, sangue total,uréia, saliva, ou outros fluidos biológicos ou lisados detecidos. Num exemplo, a amostra é depositada e seca numamatriz de papel de filtro. Uma porção da amostra de papelde filtro é então é eliminada e depositada num tubo deensaio ou cavidade de placa de micro-titulação na qual seadiciona uma solução de dosagem. A solução de dosagemcompreende tampões aquosos, um substrato e um padrãointerno bem como inibidores requeridos tais como aquelespara glicosidases concorrentes. A mistura de amostra éentão incubada por um determinado período de tempo nafaixa de 30 minutos a 16 horas e numa temperaturaparticular de 30 a 41°C. Uma vez completada a incubação,a reação enzimática termina adicionando-se uma soluçãoque age para precipitar as enzimas. Um tipo exemplar dasolução inclui álcool, acetonitrila ou ácidotrifluoroacético diluído. Transfere-se uma porção damistura de incubação para um novo recipiente de ensaio aoqual se adiciona uma solução pura tal como metanol,acetonitrila, misturas de água/metanol eágua/acetonitrila. Outros tipos de soluções puras sãoselecionados por aqueles treinados na técnica por seremcompatíveis com análise por espectrometria de massa emsérie. A amostra de teste então diluída por uma alíquotade solução pura reduz a quantidade de materialconcorrente endógeno a fim de aumentar relativamente asensibilidade da análise por espectrometria de massa emsérie. Injeta-se diretamente a amostra diluída semmodificação adicional no espectrômetro de massa em sérieou manualmente ou automaticamente com o auxílio decoletores de amostras automáticos ou manipuladores delíquidos. Ajusta-se o espectrômetro de massa em sériepara detectar simultaneamente o substrato adicionado, oproduto enzimático resultante correspondente e os padrõesinternos correspondentes. Executa-se tal detecção pormeio de cintigrafias de íons, cintigrafias de íonsprecursores ou cintigrafias de monitoramento de reaçõesmúltiplas. Ajusta-se o espectrômetro de massa em sériepara detectar um ou mais substratos, produtos e padrõesinternos correspondentes. Usa-se a abundância relativados produtos e padrões internos correspondentesobservados para quantificar a atividade enzimáticacorrespondente.

Amostras na forma de mancha seca de sangue são comumenteusadas quando se faz a triagem de pacientes recém-nascidos e crianças. Para estes indivíduos pacientes osangue coletado e retido num papel de filtro como umcorpo de prova de laboratório que é rapidamente coletávele facilmente armazenado. Uma amostra num papel de filtropode ser eluída antes de incubar com a solução dedosagem. A etapa de eluição é para liberar proteínas dopapel de filtro seco numa solução aquosa que contém umtampão base água tal como salmoura de tampão fosfato einibidor de protease. O inibidor de protease pode, porexemplo, incluir um ou mais dos seguintes: cloridrato deAEBSF numa concentração final de 50 a 400 μg/mL, EDTAdissódico desidratado numa concentração final de 0,2 a 25mg/mL, hemissulfato de leupeptina numa concentração finalde 0,5 a 1 μg/mL, e pepstatina A numa concentração finalde 0,5 a 1 μg/mL. A eluição pode ser executada durante umperíodo de 2 0 a 60 minutos dependendo do tamanho do corpode prova usado e pode ser facilitada com vibraçãovertical ou horizontal. Os extratos líquidos podem serentão transferidos manualmente ou por dispositivosautomáticos de manuseio de líquidos para tubos ou placasde micro-titulação.

Com ou sem ter sido primeiramente solubilizada como acimadescrito, a amostra de sangue seco é incubada numasolução de dosagem. Em particular, a solução de dosagem ébase água. A solução de dosagem contém um tampãoapropriado tal como salmoura tamponada de fosfato, uminibidor de protease apropriado, tal como uma paracompetir com glicosidase, um substrato que é marcado comum isótopo, e um padrão interno que é marcado com umisótopo diferente. 0 inibidor de protease inclui um oumais dos seguintes: inibidor para glicosidase, cloridratode AEBSF numa concentração final de 50 a 400 μg/mL, EDTAdissódico desidratado numa concentração final de 0,2 a 25mg/mL, hemissulfato de leupeptina numa concentração finalde 0,5 a 1 μg/mL, e pepstatina A numa concentração finalde 0,5 a 1 μg/mL. Durante o período de incubação, osubstrato é clivado por uma enzima de interesse daamostra de sangue seco para formar produtos respectivos.Num aspecto, a reação de incubação termina por uma adiçãode álcool puro, acetonitrila ou ácido trifluoroacéticodiluído. Os produtos formados da reação enzimática émuito polar devido principalmente à parcela carregadapositivamente incorporada tal como um cátion de amônioquaternário, permanecendo portanto a necessidade de seusar um solvente não polar tal como clorofórmio paraterminar a reação enzimática e manter os produtos emsolução. Devido à complexidade do sistema MS/MS,moléculas que eventualmente sejam submetidas ao sistemaMS/MS necessitam estar num solvente que não seja "hostil"ao sistema MS/MS. Por exemplo, tal solvente não deve serbase solvente, nem deve conter agentes corrosivos talcomo clorofórmio. Prefere-se etanol puro ou metanol puroporque simplesmente evapora facilmente durante a fase deionização do experimento de espectrometria de massa.Para cada enzima a ser detectada, está contido na soluçãode dosagem um conjunto de substrato específico e umpadrão interno. A solução de dosagem é projetada comoúnica e específica para a detecção de uma enzimaparticular; alternativamente, ela é assim projetada paraser adaptável e universal para a detecção simultânea demúltiplas enzimas. Executa-se a incubação em tubosindividuais, pequenos frascos, ou com uma placa demúltiplas cavidades, tal como uma placa de filtro de 96ou 3 87 cavidades.

o tamanho requerido de um amostra num papel de filtro edaí a quantidade necessária de sangue disponível paradetecção varia com o número de enzimas a ser testado.Praticamente, para a análise de uma única enzima, usa-secomumente um corpo de prova de mancha de sangue seco numpapel de filtro num tamanho de 1-3 mm. Quando se analisarmais do que uma enzima, poderão ser usados tamanhosmaiores de amostras (por exemplo, manchas de sangue de 3-10 mm) . Esta amostra maior é eluída e usada como umafonte unificada para testes múltiplos de enzimas.Os substratos para uma proteína selecionada de interessesão de origem natural ou sintética. A proteína deinteresse é composta de uma enzima que está associada comum estado de doença ou defeito de nascimento ou uma queseja dosada rotineiramente para propósitos médicos. Ossubstratos de enzima de interesse incluem a-galactosidaseA ácida, β-glicocerebrosidase ácida, a-galactosidase galactocerebrosídeo ácida, esfingomielinase ácida, e a-glicosidase ácida.

Uma composição inventiva da fórmula geral A—B1—B2—B3 éhidrofílica num solvente tal como metanol puro ou etanolpuro. A é um monossacarídeo ou um dissacarídeo. B1 é um braço ligante, B2 contém um cátion amônio quaternário queestá permanentemente carregado positivamente, e B3 é umacauda de carbono longa. 0 tipo de parcela A ou ocomprimento da cadeia de alguila na parcela B1—B2—B3difere de acordo com a enzima-alvo examinada. O braçoligante B1 é projetado a fim de conferir característicasrelativamente hidrofílicas. Particularmente, o braçoligante B1 tem uma estrutura de hidrofenol. A parcelaB1—B2—B3 no todo é hidrofílica para garantir boasolubilidade do substrato, e tem um cátion amônioquaternário permanentemente carregado positivamente paragarantir detecção sensível por espectrometria de massa.

Numa incorporação, a invenção prove um reagente defórmula A—B1—B2—B3 na qual A é um monossacarídeo ou umdissacarídeo e preferivelmente uma aldoexose ou umacetoexose; B1 é um f enol, nitrofenol, ou um éster defenila tal como benzoato de fenila; B2 contém umaextensão cátion amônio quaternário pendente de estruturaque antes da condensação a B1 sozinho ou também com umacauda B3 é carnitina,

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(AV29285L800, ARVI Co. Ltd., Yerevan, Armênia),(Pubchem n° 3833216),<formula>formula see original document page 17</formula>

(Pubchemn0 786970, CAS 25518-46-1), ou

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(Chembank 1271)

A é um monossacarideo ou um dissacarídeo e B1 é umalquila de C1-C20 arila de C6-C2O substituído com N ou 0,heterocíclico de C6-C2O contendo um heteroátomo de N, O,

<formula>formula see original document page 17</formula>

onde R1 é um alquila de C1-C20; éter de C4-C20; alquila deC1-C20 tendo um substituinte de N, O, ou S; arila de C6-C20substituído com heteroátomo de N, O, ou S, heterocíclico de C6-C20 contendo um heteroátomo de N, O, ou S; em cadaocorrência, R2 é independentemente um H, um alquila deC1-C20, um alquila de C2-C20 tendo um substituinte dealquila de C1-C20; em cada ocorrência, X éindependentemente nulidade, oxigênio, enxofre, ounitrogênio; em cada ocorrência, R3 é independentementenulidade, alquila de C1-C20, C1-C20 tendo um arila de C6-C20substituído, heterocíclico de C6-C20 contendo umheteroátomo de N, 0, ou S; ? é um número inteiro entre 0e 30, inclusive; em cada ocorrência, R4 éindependentemente nulidade, alquila de C1-C20, C1-C20 tendoum arila de C6-C20 substituído, carbonila de C1-C20,amidila de C1-C20, éter de C1-C20, arila de C6-C20,heterocíclico de C6-C20 contendo um heteroátomo de N, O,ou S; e B3 é nulidade ou alquila de C1-C20, éter de C4-C20,alquila de Ci-C2O tendo um substituinte de Ni 0, ou S,éster de Ci-C2O/ álcool de Ci-C20, alquenila de Ci-C20,arila de C6-C20 com heteroátomo, heterocíclico de C6-C20contendo um heteroátomo de Ν, O ou S.

A Figura 1 mostra uma estrutura de substrato exemplarpara detectar doenças de armazenamento lisossômico. Aestrutura é composta de um açúcar (A) na forma de umaglicose ou de uma galactose e um grupo alifático Β. 0grupo B é composto ainda de um braço ligante (B1) naforma de nitrofenila, um subgrupo B2 de um carnitinila, eum subgrupo B3 na forma de um alquila com um comprimentode carbono na faixa de 12, 14, 16, ou 18. Um cátionamônio quaternário situado no subgrupo B2 prove um íonque evita a necessidade de ionização adicionalcontrariamente necessária para detecção porespectrometria de massa.

A Figura 2 mostra uma reação enzimática genérica usandoum substrato inventivo. Em resposta à ligação porafinidade específica e reação enzimática, o substrato éclivado em dois grupos, uma parcela açúcar A e um grupoalifático Β. 0 grupo B é composto de um nitrofenila, umcarnitinila, e parcelas alquila de cadeia longa. Ambos osgrupos são analisados por MS/MS. Um padrão interno tambémé submetido simultaneamente à análise por MS/MS. O padrãointerno é um análogo marcado isotopicamente de B comdeutério para substituir átomos de hidrogênio num grupometila.

A Figura 3 ilustra diferenças estruturais significativasentre um substrato inventivo e um substrato de referênciade técnica anterior conhecido na técnica. As diferençasexistem principalmente na porção acila de cadeia longasendo que ao contrário do substrato de técnica anterior,um cátion amônio quaternário permanentemente carregadopositivamente presente no substrato inventivo o torna umíon "pronto" para o propósito de análise porespectrometria de massa a jusante. Portanto, não énecessária nenhuma ionização adicional e daí nenhumaperda de intensidade de sinal. Adicionalmente, emcomparação com o substrato de técnica anterior, osubstrato inventivo é quimicamente menos não polar.

Portanto, um solvente no qual se dissolve o substratoinventivo não tem de ser extremamente não polar nemnecessita da adição de um detergente. Solventesextremamente não polares, tal como clorofórmio, não sãofavoráveis ao usuário e não são recomendados para ESI-MS/MS. O uso de detergente também degrada afuncionalidade do espectrômetro de massa uma vez que osdetergentes sujam as partes internas do espectrômetro demassa muito rapidamente de modo a causar uma diminuiçãosignificativamente em desempenho. Quando se usam taisreagentes, exige-se adicionar etapas extras para removerestes reagentes antes de se submeter uma amostra àanálise MS/MS. Para recuperar os produtos que serãoanalisados, a técnica anterior usa clorofórmio ou acetatode etila numa etapa de extração líquido-líquido. Pararemover o detergente, a técnica anterior usa extrações emfase sólida. Portanto, embora seja possível adaptar estesprocedimentos em laboratórios clínicos, os substratos detécnica anterior tornam seu uso extremamente difícil senão inaproveitável.

A Figura 4 ilustra uma diferença estrutural entre umsubstrato inventivo e um substrato de técnica anterior.

Em resposta ao reconhecimento de afinidade e reaçãoenzimática, uma parte do substrato inventivo, denominada"produto enzimático", é clivada. Ao contrário de umproduto produzido do substrato de técnica anterior, oproduto enzimático da presente invenção tem um íon"pronto" incorporado (painel de fundo) que estápermanentemente carregado positivamente. Qualquer análitoque se introduz no espectrômetro de massa deve torna-seum íon a ser detectado. Um dos fatores de máximaimportância que afeta a sensibilidade é a eficiência deionização, isto é a facilidade com que o análito ionizauma vez exposto à fonte de íons. Uma vez expostas à fontede íons, as moléculas competem umas com as outras porprótons. Moléculas com elevadas afinidades por prótonscompetem mais eficazmente por ligação com próton e seionizam mais eficientemente. No caso de uma moléculainventiva que já possui uma carga positiva permanente,como resultado, o produto enzimático da presente invençãolibera intensidade de sinal que está em ordem de grandezamelhor.

A Figura 5 mostra diferenças no processo de mediratividade e expressão de enzima usando um métodoinventivo de acordo com a presente invenção. 0 métodoinventivo permite uma medição simultânea tanto dadiminuição no nível de um substrato como do aumento nonível de um produto. Isto é vantajoso em relação a outrosmétodos na técnica que empregam apenas a medição numproduto de uma reação enzimática. Portanto, o métodoinventivo oferece sensibilidade e especificidade maiores.Para um substrato inventivo, marca-se tanto a porção Acomo a porção B com um primeiro marcador sinalizador. Ummarcador sinalizador exemplar é um marcador isotópico.

Para um padrão interno inventivo para o substrato, marca-se tanto a porção A como a porção B com um segundomarcador sinalizador que é diferente do primeiro marcadorsinalizador. Cada um dentre o marcador sinalizador númeroum e o marcador sinalizador número dois, éindependentemente um dos seguintes exemplos de marcadorisotópico: carbono-13, deutério, nitrogênio-15.A Figura 6 ilustra métodos inventivos exemplares, com opainel inferior mostrando detecção de reações enzimáticasusando espectrometria de massa que são vantajosos emcomparação com um método de referência de técnicaanterior mostrado no topo da figura. Comparado com ométodo de técnica anterior, o método inventivo eliminamuitas etapas que são inerentes com o uso de substratosnão polares e seus padrões internos relativos. Maisespecificamente, o método inventivo não mais necessitadas etapas que servem para limpar o solvente não polare/ou detergentes, o envolvimento dos quais é prejudicialaos espectrômetros de massa. Estas etapas incluem aremoção de clorofórmio por uma etapa de extração líquido-líquido, a remoção dos detergentes por uma etapa deseparação com s£lica-gel, e a etapa de processo deextração em fase sólida (SPE). Estas etapas extrasadicionam também um erro estatístico que se adiciona àanálise a jusante. Uma vez que o substrato de acordo coma presente invenção é menos não polar ao contrário do datécnica anterior, um solvente menos não polar tal comometanol puro ou etanol puro é aqui operativo.

Opcionalmente, marca-se tanto a porção A como a porçãoB1—B2—B3 com marcadores sinalizadores . Os marcadoressinalizadores localizam-se em um ou mais dos átomosincluindo C, Η, Ρ, N, ou S. Os marcadores sinalizadoresincluem, mas não se limitam a, marcadores isotópicos. Nocaso de marcação isotópica, substitui-se pelo menos umátomo na estrutura de substrato por um isótopo estável.Por exemplo, os hidrogênios são substituídos por D, ou12C substituído por 13C.

Quando simultaneamente se detecta mais que uma doençacombinando múltiplos substratos dirigidos às respectivasenzimas, os substratos diferem não apenas no tipo daparcela açúcar que confere especificidade à enzima, mastambém no comprimento da parcela cauda B3. Isto éparticularmente importante com o uso de MS/MS como umaferramenta de detecção uma vez que as moléculasdiferenciadas de substrato inventivo tendo índice demassa diferenciado correspondente correspondem às váriasenzimas sendo examinadas.

Os padrões internos são marcados isotopicamente paraquantificar produtos de reações enzimáticas. 0 padrãointerno é quimicamente idêntico ao produto enzimáticogerado pela ação da enzima sobre o substrato inventivo,mas carrega marcações isotópicas que podem incluir D,13C, 15N, 17O, 18O, ou 34S, que permitem que o análogomarcado isotopicamente seja detectado independentementepor técnicas de MS. 0 padrão interno é rotuladodiferentemente tanto em sua porção de açúcar A como naporção ligante B1—B2—B3. Com espectroscopia de massa,provê-se uma mensuração simultânea tal que tanto adiminuição do sinal de substrato como o aumento nosprodutos A e B1—B2—B3 sejam registrados simultaneamente.Este design aumenta a sensibilidade e a especificidade doensaio.

0 uso de um tampão de coquetel de substrato universalpara extrair uma única amostra de sangue seco porpaciente para distribuição subseqüente em múltiplasreações de dosagem é vantajoso para triagem comprodutividade operacional elevada e automática porque eleevita a necessidade de obter vários punções de amostra damesma amostra de sangue seco. Isto reduz também avariação causada por distribuição não homogênea de sangueno papel de filtro. A eficiência de extração pode variarcom as diferentes enzimas sendo analisadas.Particularmente, a composição do tampão de coquetel desubstrato universal é escolhida para garantir o máximodesempenho para uma enzima que a mínima atividadeespecífica de todas as enzimas testadas.

Todos os reagentes incluindo os substratos, os produtosclivados, e os padrões internos são opcionalmentepurificados até homogeneidade por HLPC em fase reversa ese caracterizam por ESI-MS. Os componentes de ensaio taiscomo substratos de enzimas, produtos de ensaio, e padrõesinternos são processados através de um meio a fim deremover componentes de tampão em excesso. A remoção doscomponentes de tampão é particularmente apropriada paraespectrometria de massa em série uma vez que se esperaeliminar por eletro-aspersão a presença de componentes detampão em excesso.

A abordagem descrita para enzimas de ensaio usandoreagentes de substrato e ESI-MS de acordo com a presenteinvenção pode ser amplamente aplicada. As técnicasmultíplices podem ser expandidas para dosar dúzias deenzimas ou mais simultaneamente numa única reação,eliminando a necessidade de múltiplos ensaios paraauxiliar em diagnoses de confirmação de distúrbios raros.O método pode ser usado para medir várias enzimassimultaneamente quando se avalia a taxa de fluxo químicoatravés de uma via bioquímica específica ou paramonitorar vias sinalizadoras bioquímicas. Devido àelevada sensibilidade da detecção por ESI-MS empregada, oque requer somente quantidades abaixo de micro-grama dosreagentes de substrato por ensaio, a síntese de centenasde reagentes de substrato numa escala abaixo de gramatorna-se prática e econômica.

Exemplos

Exemplo 1

Para cada amostra, perfura-se um disco de 3 mm dediâmetro das áreas de sangue seco num papel de filtro numtubo de micro-centrífuga ou numa cavidade de uma placa demicro-titulação de 96 cavidades. O disco de sangue éentão diretamente incubado com uma solução de dosagemcontendo substratos dirigidos para a doença de Fabry numaconcentração final de 3 mmol/L e padrões internos numaconcentração final de 0,05 mmol/L. Também se adiciona àsolução de dosagem, um tampão de acetato de sódio numaconcentração final de 0,5 mol/L. A mistura de ensaiocontendo o disco de sangue é incubada por 15 a 24 horas a37°C com vibração orbital (150 rpm) num vibrador a artermostático. Após o período de incubação, adiciona-seuma alíquota de metanol puro (sem o uso de clorofórmio)em cada tubo ou cavidade para terminar a reaçãoenzimática. Antes de ir para o espectrômetro de massa, amistura reagente incubada é diluída com um solventeapropriado. Para a análise por espectrometria de massa,opera-se a fonte de eletro-aspersão em modo positivo, edetectam-se os íons em modos de íon original ecintigrafia de perda neutra. Calcula-se a quantidade deproduto enzimático da razão de abundância iônica doproduto para o padrão interno menos aquela de um embranco.

Como mostrado na Figura 7, o padrão interno é detectadoem m/z de 494,5; e o produto enzimático do substratodirigido para a doença de Fabry é detectado em m/z de491,5 numa quantidade mínima num branco de água (topo) enuma quantidade significativa com a presença de umaamostra de sangue seco (fundo).

Exemplo 2

Uma reação enzimática usando um substrato voltado para adoença de Pompe e a partir daí executa-se análise porespectrometria de massa usando o método especificado no

Exemplo 1.

A Figura 8 mostra um exemplo no qual se sintetiza umsubstrato inventivo (tal como um daqueles mostrados naFigura 1) usando α-D-glicose como a parcela açúcar eportanto específica para a enzima lisossômica GAA (doençade Pompe). Para este exemplo particular escolheu-se acadeia de alquila contendo 10 carbonos e portanto usou-sedecanoil-carnitina na síntese do substrato.

Semelhantemente, sintetizou-se o padrão internocorrespondente usando decanoil-carnitina que tinha trêshidrogênios substituídos por deutérios num dos trêsgrupos metila da parcela carnitinila. Usando estesubstrato e padrão interno, processaram-se amostras demancha de sangue seco de dois recém-nascidos, umindivíduo saudável e o outro um positivo conformado paradoença de Pompe, com o método da presente invençãodescrito na Figura 5. Além disso, processou-se umaamostra de papel de filtro em branco não contendo sangueseguindo o mesmo procedimento para as manchas de sangueseco. Foram usadas para as três amostras, a mesma soluçãode dosagem contendo tampões, substratos, inibidores epadrões internos. Portanto, todas as amostras receberam amesma concentração de reagentes. As soluções finais deamostras foram analisadas num espectrômetro de massa emsérie quadripolar de triplo ESI Waters Quattro Microusando um íon origem de 176 triagens. Os picospredominantes mostrados nos espectros são aquelescorrespondendo ao substrato intacto, padrão interno eproduto enzimático correspondente. Como todas as amostrasforam processadas com a mesma concentração de reagentes,a abundância relativa entre produto e padrões internos éuma indicação da atividade relativa de enzima entre asamostras.

Estes espectros mostram claramente que no indivíduosaudável há atividade de GAA abundante uma vez que aconversão de substrato em produto é muito perceptívelpela abundância do produto em relação à abundância dopadrão interno. Ao contrário, a amostra correspondente aorecém-nascido positivo para Pompe mostra atividade deenzima GAA desprezível uma vez que não há nenhumaconversão perceptível de substrato em produto. 0 picopequeno correspondente ao produto que é perceptível noespectro do recém-nascido positivo para Pompe é atribuídocomo histórico. 0 exame do espectro resultante doprocessamento da amostra em branco revela também umpequeno pico correspondendo ao produto. Neste caso devidoà ausência de sangue nesta amostra fica claro que oprocessamento da amostra causa um pequeno grau dehidrólise não enzimática do substrato. A comparação daabundância relativa dos picos de produto/padrão internonos espectros de Pompe e em branco indicam que o pico deproduto pequeno na amostra positiva para Pompe é devidoprincipalmente à hidrólise não enzimática. 0 fato de quehá uma pequena quantidade de hidrólise não enzimática deproduto não é surpreendente uma vez que as ligaçõesglicosídicas são bem instáveis. Entretanto, deste exemplofica claro que o grau de hidrólise não enzimática desubstrato é desprezível quando comparado com a quantidadede conversão em produto em indivíduos saudáveis.Portanto, este histórico não deve constituir qualquerlimitação do método. Estes espectros mostram claramente autilidade dos substratos da presente invenção uma vez quelês mostram claramente que eles são clinicamenteespecíficos, sensíveis e estáveis. Adicionalmente, estesreagentes mantêm sua utilidade ao mesmo tempo em quepermitem simplificação significativa do ensaio.

Exemplo 3

A Figura 9 mostra os resultados de processamento deamostras de manchas de sangue seco sendo 12 de recém-nascidos saudáveis e 3 de recém-nascidos positivos paraPompe. Os reagentes e métodos são os mesmos que aquelesdescritos nas Figura 6. Uma vez que os padrões internossão introduzidos em concentrações conhecidas, é possívelquantificar as atividades enzimáticas relacionando aabundância relativa do produto e padrão interno com aconcentração do padrão interno. Esta figura mostra umgráfico de dispersão das atividades enzimáticasdeterminadas em micro-mols/hora/litro de unidades desangue para os 15 indivíduos estudados. Deste gráficopercebe-se claramente que há uma clara distinção entre aatividade de GAA de recém-nascidos saudáveis e aatividade de recém-nascidos afetados. As atividadesregistradas dos três pacientes com Pompe são desprezíveiscomparadas com aquelas dos indivíduos saudáveis. Nota-seque, tal como descrito na Figura 6, a hidrólise nãoenzimática produz um pequeno grau de histórico. Os dadosaqui apresentados não são corrigidos para histórico. Nãoobstante, a diferença entre saudável e doente é marcante.

Exemplo 4

A Figura 10 mostra um exemplo no qual os substratosinventivos e os padrões internos descritos na Figura 1são usados num método multíplice processando as amostrasusando soluções de dosagem contendo dois tipos desubstratos e padrões internos. Um substrato objetivando adoença de Pompe e o outro a doença de Krabbe. 0 métodousado é o mesmo que aquele descrito na Figura 8, somentecom a diferença que agora se analisam os substratos para duas enzimas. 0 substrato de Pompe é o substrato daFigura 1 preparado com decanoil-carnitina e o substratode Krabbe é o substrato da Figura 1 preparado comtetradecanoil-carnitina. A amostra usada neste exemplo éuma amostra de mancha de sangue seco de um recém-nascidosaudável. Além disso, processou-se uma amostra de soluçãoem branco não contendo sangue seguindo o mesmoprocedimento. Ao contrário do ensaio de uma só enzimadescrito na Figura 8, os picos predominantes mostradosnos espectros da Figura 10 são aqueles correspondendo aosdois substratos intactos adicionados às soluções, os doispadrões internos adicionados às soluções e os doisprodutos enzimáticos correspondentes.

Neste exemplo observa-se que a atividade de duas ou maisenzimas pode ser detectada simultaneamente retendo aomesmo tempo sensibilidade suficientemente boa. Esteexemplo mostra ainda a utilidade da presente invençãoprovendo simplificação adicional ao método como ele épossível consolidar preparações de amostras.

Exemplo 5

A Figura 11 mostra o efeito de detergente sobre asensibilidade dos padrões internos da presente invenção.Usam-se estes dados para exemplificar o impacto dedetergentes sobre a sensibilidade global do ensaio. Adespeito do fato de que os padrões internos já estejamcarregados antes da análise por espectrometria de massa,a supressão de íon pode ainda representar uma regra emsua sensibilidade. Os detergentes são conhecidos porcausar supressão de íon significativa. Neste caso,mostra-se a sensibilidade dos padrões internos emsoluções puras (metanol puro) com e sem detergentes. Alémdisso, mostra-se também a sensibilidade dos padrõesinternos em soluções contendo manchas de sangue secoextraídas com e sem detergentes. Neste exemplo, padrõesinternos de vários comprimentos de cadeia de alquilaforam dissolvidos ou na solução pura ou na solução dedosagem a partir da qual as manchas de sangue seco foramextraias e processadas tal como descrito nas Figuras 8 e10. Neste exemplo uma alíquota de cada tipo de soluçãonão continha nenhum detergente enquanto outra continha.Portanto, a única diferença nestes pares de amostras foia presença ou ausência de detergente. Os pares deamostras foram analisados por espectrometria de massa emsérie. A intensidade de sinal dos padrões internos emcada amostra foi registrada e usada para gerar umasensibilidade relativa média. 0 gráfico mostra asintensidades médias normalizadas para amostrasprocessadas com e sem detergente. É evidente que odetergente não causa supressão de íon observado pelasintensidades menores em amostras contendo detergente.Esta figura indica também que o impacto de detergente émuito mais pronunciado em amostras contendo matrizescomplexas tal como sangue e assim enfatiza a necessidadede se evitar o uso de tais substâncias em ensaios por espectrometria de massa em série.Exemplo 6

A Figura 12 mostra um exemplo no qual se analisa o efeitode detergente sobre a atividade enzimática. Nesteexemplo, usou-se um substrato desta invenção (Figura 1) contendo α-D-glicose e uma cadeia de ácido graxo com 16carbonos para processar manchas de sangue seco de acordocom o procedimento descrito na Figura 6. A fim de testaro efeito de detergente, preparam-se amostras em paralelodos mesmo pacientes de acordo com o método acima com e sem detergente. A Figura 11 mostra que o detergentedegrada a sensibilidade do ensaio. Entretanto, permaneceua questão sobre se o detergente tem qualquer impactosobre a atividade enzimática. Os espectros mostrados naFigura 12 mostram claramente que o detergente tem um efeito sobre a atividade enzimática avaliado. Neste casoa ausência de detergente na solução de dosagem melhora ataxa de atividade enzimática demonstrado pela abundânciamais elevada do produto em relação ao seu padrão internocorrespondente para a amostra processada sem nenhum detergente. Este exemplo reafirma ainda a utilidade dapresente invenção demonstrando que não apenas o métodopode ser simplificado, mas que ao fazê-lo melhora asensibilidade do ensaio reduzindo supressão de íon emelhorando a atividade das enzimas-alvo.

As publicações e documentos de patentes mencionados norelatório indicam os níveis daqueles treinados na técnica à qual se refere a invenção. Estes documentos epublicações aqui se incorporam por referência na mesmaextensão como se cada documento ou publicação individualfosse especifica e individualmente aqui incorporada porreferência.

A descrição anterior ilustra incorporações particularesda invenção, mas não significa ser uma limitação emresposta à prática da mesma. As reivindicações seguintes,incluído todas as equivalentes das mesmas, tencionamdefinir a abrangência da invenção.

Claims

1. Substrato para análise espectrométrica de massa de umaenzima, caracterizado pelo fato de ter a fórmula:A— (B1—B2-B3) (I)onde A é um monossacarídeo ou um dissacarídeo e B1 é umalquila de Ci-C2O/ um arila de C6-C2O substituído com N ouO, heterocíclico de C6-C2O contendo um heteroátomo de N,O, ou S; B2 é<formula>formula see original document page 30</formula>onde R1 é um alquila de C1-C20; éter de C4-C20; alquila deC1-C20 tendo um substituinte de N, O, ou S; arila de C6-C20com heteroátomo substituído de N, O, ou S, carbonila deC1-C20, amidila de C1-C20, éter de C1-C20, arila de C6-C20,heterocíclico de C6-C20 contendo um heteroátomo de N, O,ou S; em cada ocorrência, R2 é independentemente H, umalquila de Ci-C20, um alquila de C2-C20 tendo umsubstituinte de alquila de C1-C20; em cada ocorrência, X éindependentemente nulidade, oxigênio, enxofre, ounitrogênio; em cada ocorrência, R3 é independentementenulidade, alquila de C1-C20, C1-C20 tendo um arila de C6-C20substituído, heterocíclico de C6-C20 contendo umheteroátomo de N, 0, ou S; η é um número inteiro entre 0e 30, inclusive; em cada ocorrência, R4 éindependentemente nulidade, alquila de C1-C20, C1-C20 tendoum arila de C6-C20 substituído, carbonila de C1-C20,amidila de C1-C20, éter de C1-C20, arila de C6-C20,heterocíclico de C6-C20 contendo um heteroátomo de N, O,ou S; e B3 é nulidade ou alquila de C1-C20, éter de C4-C20,alquila de C1-C20 tendo um substituinte de N, 0, ou S,éster de C1-C20, álcool de C1-C20, alquenila de C1-C20,arila de C6-C20 com heteroátomo, heterocíclico de C6-C20contendo um heteroátomo de N, 0 ou S.

2. Substrato, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de A e (B1—B2—B3) seremseparados por uma ação da dita enzima.

3. Substrato, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de A ser uma aldoexose ou umacetoexose.

4. Substrato, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de A ser uma D-glicose ou uma D-galactose.

5. Substrato, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de B1 ser arila de C6 tendo umsubstituinte estendendo-se do anel.

6. Substrato, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de B1 ser fenila, nitrofenila, ouum éster de fenila.

7. Substrato, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de B2 ser carnitinila.

8. Substrato, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de B3 ser alquila de C2-C2O tendoum substituinte de 0 presente como um carbonila.

9. Substrato, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de cada uma das porções A e(B1—B2—B3) incluírem um isótopo de prevalênciasecundária estável de um elemento.

10. Substrato, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de, em cada ocorrência, o ditoisótopo de prevalência secundária estável ser selecionadodo grupo consistindo de 2D, 13C, 15N, 17O, 18O, 31P e 34S.

11. Processo para análise espectrométrica de massa de umaenzima, caracterizado pelo fato de compreender: contatara dita enzima com o dito substrato de fórmula IA—(B1—B2—B3) conforme definido pela reivindicação 1 paragerar um produto de clivagem (B1—B2—B3) tendo um pesomolecular de produto de clivagem em resposta à reaçãoenzimática; prover um padrão interno (B1—B2—B3)' com odito substrato onde (B1—B2—B3) ' tem pelo menos um isótopode prevalência secundária estável de peso moleculardiferente do peso molecular do produto de clivagem e B1,B2, e B3 de (B1—B2—B3)' estão detalhados na fórmula Iconforme definida pela reivindicação 1; e quantificar arazão massa para carga entre o dito produto clivado e odito padrão interno usando análise espectrométrica demassa.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de a dita enzima ser selecionadado grupo consistindo de α-galactosidase A ácida, β-glicocerebrosidase ácida, galactocerebrosídeo a-galactosidase, esfingomielinase ácida, e a-glicosidaseácida.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o dito produto de clivagem(B1—B2—B3) ser estruturalmente idêntico ao dito padrãointerno (B1—B2—B3) ' .

14. Embalagem comercial, caracterizada pelo fato decompreender como ingredientes ativos: um substrato defórmula I A—(B1—B2—B3) conforme definido pelareivindicação 1; um padrão interno de fórmula (B1—B2—B3)'tendo um peso molecular de isótopo de prevalênciasecundária estável diferente daquele de (B1—B2—B3) ; einstruções para detectar atividade de uma enzima numaamostra por análise espectrométrica de massa.

15. Processo para análise espectrométrica de massa de umaenzima, caracterizado pelo fato de compreender: marcar umprimeiro substrato de fórmula I A—(B1—B2—B3) conformedefinido pela reivindicação 1 com uma marca isotópica Llpara formar um primeiro substrato L1 (A)—"-(B1—B2—B3);marcar um segundo substrato de fórmula I A—(B1—B2—B3)conforme definida pela reivindicação 1 com uma marcaisotópica L2 para formar um segundo substratoL2 (A)—L2 (B1—B2—B3) , sendo que a dita marca isotópica L2 édiferente da dita marca isotópica LI; combinar o ditoprimeiro substrato L1 (A)—L1 (B1—B2—B3) e o dito segundosubstrato L2 (A)—1,2 (B1—B2—B3) com a dita enzima num recipiente no qual o dito primeiro substratoL1 (A)—L1 (B1—B2—B3) é clivado pela dita enzima para formarliA e "(B1—B2—B3) e o dito segundo substratoL2 (A)—L2 (B1—B2—B3) é clivado pela dita enzima para formarL2A e l2Cb1—B2—B3); e quantificar uma diminuição do ditoprimeiro substrato L1 (A)—1,1 (B1—B2—B3) e do dito segundosubstrato L2 (A)—^(B1—B2—B3) e um aumento dos ditos L1A,L1 (B1—B2—B3) , l2A , e L2(Bx—B2—B3).

16. Processo, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de o dito recipiente ser um tubode teste, um pequeno frasco de teste, ou uma micro-placacom múltiplas cavidades.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de a dita mensuração serexecutada por espectrometria de massa.

18. Processo, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de a dita enzima ser selecionadado grupo consistindo de α-galactosidase A ácida, β-glicocerebrosidase ácida, galactocerebrosídeo a-galactosidase, esfingomielinase ácida, e a-glicosidaseácida.

19. Método para usar o dito substrato, conforme definidopela reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser paradetectar uma primeira doença de armazenamento lisossômiconuma amostra coletada de um indivíduo.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato de compreender ainda detecçãosimultânea de uma segunda doença de armazenamentolisossômico.