CN107630015B - 一种稳定的dna-rna双链结构 - Google Patents

一种稳定的dna-rna双链结构 Download PDF

Info

Publication number
CN107630015B
CN107630015B CN201610570758.8A CN201610570758A CN107630015B CN 107630015 B CN107630015 B CN 107630015B CN 201610570758 A CN201610570758 A CN 201610570758A CN 107630015 B CN107630015 B CN 107630015B
Authority
CN
China
Prior art keywords
rna
zipper
mirna
sequence
unit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610570758.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107630015A (zh
Inventor
俞作仁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai East Hospital Tongji University Affiliated East Hospital
Original Assignee
Shanghai East Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai East Hospital filed Critical Shanghai East Hospital
Priority to CN201610570758.8A priority Critical patent/CN107630015B/zh
Priority to PCT/CN2017/093548 priority patent/WO2018014848A1/zh
Priority to US16/319,766 priority patent/US11306310B2/en
Publication of CN107630015A publication Critical patent/CN107630015A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107630015B publication Critical patent/CN107630015B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了一种稳定的DNA‑RNA双链结构，所述的双链结构包括(i)miRNA单元序列，和(ii)RNA拉链单元序列,其中，所述RNA拉链单元序列的5’端与miRNA单元序列的5’端结合，所述RNA拉链单元序列的3’端与miRNA单元序列的3’端结合，所述RNA拉链可将miRNA分子首尾相连形成一个稳定长链结构，且所述RNA拉链单元序列中有1‑3个nt不与miRNA单元序列结合。本发明的DNA‑RNA双链结构可以用于抑制miRNA单元的生物学活性，无生物学毒性，具有高亲和力、高特异性、高稳定性的优点。

Description

一种稳定的DNA-RNA双链结构
技术领域
本发明涉及生物领域，更具体地涉及一种稳定的DNA-RNA双链结构。
背景技术
真核细胞中已经有上千个miRNA序列被发现和预测。越来越多的证据表明，miRNA与疾病密切相关，在多种疾病中，包括癌症，miRNA表达异常。上千种miRNA分子，只有个别功能明确，大多数miRNA在体内的调控功能，以及与疾病的关系未知。
许多miRNA分子被证实是致病miRNA,比如miR-21促进肿瘤发生。特异降低这些miRNA的表达水平，或者特异阻断其生物学功能，被视为具有临床应用前景的一种基因治疗手段。当前，化学修饰的miRNA抑制剂被广泛应用，修饰包括添加2′-O甲基化，带有2′-O结合4'-C亚甲基桥形成高亲和力的RNA锁核酸结构等。化学修饰后的miRNA抑制剂与miRNA结合能力加强了，但阻断miRNA功能的效果及持久性是评判miRNA抑制剂的金标准。常用的miRNA抑制剂包括：
a)反义miRNA寡核苷酸(anti-miRNA oligonucleotide，AMO)是一种单链的由17～22个核苷酸组成的分子，常伴有化学修饰，通常的修饰方式是2′-O-甲基团修饰。AMO能够直接抑制某一特殊的miRNA。即通过碱基配对原则与目的miRNA相结合，然后特异性抑制其功能。反义寡核苷酸敲低miRNA基因表达的作用效果有限，作用时间不持久。
b)铆定核酸(locked nucleic acid，LNA)是对ASO进行LNA修饰后的产物。所谓LNA技术指的是通过引入2′-O,4’-C亚甲基桥形成高亲和力。LNA反义miRNA的作用机制与ASO和AMO的作用机制相同，但是它具有高稳定性和更高的与靶标特异性亲和的优势。
c)miRNA-sponge(miRNA海绵)，携带一个具有miRNA多结合位点的基因序列。导入到细胞后，随载体基因转录，该序列以一种高亲和力占据细胞中的内源性miRNA，从而阻断靶基因与miRNA之间的结合。缺点是作用效果有限，机制复杂，效果不稳定，成本高。
d)miRNA屏障(miR-Mask)，是与miRNA的靶基因结合位点100％互补的一条小分子序列，理论上能够与靶基因以更高的互补性和亲和力结合，优先占据靶基因的结合位点，阻断内源性miRNA与该靶基因的结合。缺点是其抑制作用不稳定，效果有限，复杂的调节机制，此种方法应用并不广泛。
因此，本领域迫切需要开发新的、稳定的miRNA抑制剂。
发明内容
本发明的目的在于提供效果稳定持久的miRNA抑制剂。
在本发明的第一方面，提供了一种稳定的DNA-RNA双链结构，所述的双链结构包括
(i)miRNA单元序列，所述miRNA单元的数量为p，和
(ii)RNA拉链单元序列，所述的RNA拉链单元的数量为g，
其中，所述各RNA拉链单元序列为单链，并且各RNA拉链单元序列5’端与miRNA单元序列的5’端结合，所述各RNA拉链单元序列的3’端与miRNA单元序列的3’端结合，且所述RNA拉链单元序列中有连续0-3个nt不与miRNA单元序列结合；
并且，p和g为正整数，p+g≥3，且|p-g|≤1。
在另一优选例中，所述RNA拉链单元序列中有连续1-2个nt不与miRNA单元序列结合。
在另一优选例中，所述的RNA拉链单元序列为DNA序列。
在另一优选例中，所述的s＝p+g,且s为3-1000000的正整数。
在另一优选例中，所述的s＝p+g,且s为奇数。
在另一优选例中，所述RNA拉链单元序列的5’端与miRNA单元序列的5’端结合的区域为第一结合区域，且第一结合区域的长度N1与RNA拉链单元序列的长度N0之比R1为(0.8-1.2)：2.0。
在另一优选例中，所述RNA拉链单元序列的3’端与miRNA单元序列的3’端结合的区域为第二结合区域，且第二结合区域的长度N2与RNA拉链单元序列的长度N0之比R2为(1.2-0.8)：2.0。
在另一优选例中，第一结合区域的长度N1与第二结合区域的长度N2之比R3为(0.4-0.6)：(0.6-0.4)。
在另一优选例中，所述的第一结合区域和第二结合区域不重叠。
在另一优选例中，所述RNA拉链单元序列中的第一结合区域和第二结合区域之间间隔0-3nt。
在另一优选例中，所述的miRNA单元序列中的第一结合区域和第二结合区域之间间隔0-3nt。
在另一优选例中，所述各miRNA单元序列之间间隔0-3nt。
在另一优选例中，所述各RNA拉链单元序列之间间隔0-3nt
在另一优选例中，所述各RNA拉链单元序列完全相同。
在另一优选例中，所述的miRNA单元选自下组：
miRNA、siRNA、和piRNA。
在另一优选例中，所述的miRNA包括内源性miRNA和外源性miRNA。
在另一优选例中，所述的miRNA包括致病性miRNA。
在另一优选例中，所述的miRNA选自下组：miR-17、miR-221、和let-7a。
在另一优选例中，所述的RNA拉链单元序列中含有LNA修饰碱基。
在另一优选例中，所述的RNA拉链单元序列的长度大于或等于19nt，较佳地为19-26nt。
在另一优选例中，所述的miRNA单元序列的长度大于或等于18nt，较佳地为18-23nt。
在另一优选例中，所述的RNA拉链单元抑制miRNA单元的生物学功能。
在另一优选例中，抑制miR-221的RNA拉链单元的序列如SEQ ID NO.:1所示。
在另一优选例中，抑制miR-17的RNA拉链单元的序列如SEQ ID NO.:2所示。
在另一优选例中，抑制let-7a的RNA拉链单元的序列如SEQ ID NO.:3所示。
在本发明的第二方面，提供了一种本发明第一方面所述的DNA-RNA双链结构的用途，用于抑制所述miRNA单元的生物学功能。
在本发明的第三方面，提供了一种形成本发明第一方面所述DNA-RNA双链结构的方法，包括步骤：
(i)将所述的RNA拉链单元序列与所述的miRNA单元序列接触，从而形成本发明第一方面所述DNA-RNA双链结构。
在另一优选例中，所述的方法是体外方法。
在另一优选例中，所述的方法是非治疗性非诊断性方法。
在本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括：(a)用于形成本发明第一方面所述DNA-RNA双链结构的RNA拉链单元序列和(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于抑制与所述RNA拉链单元序列结合的miRNA单元序列。
在本发明的第五方面，提供了一种RNA拉链单元序列的用途，用于制备抑制miRNA的药物组合物，且所述的RNA拉链单元序列与所述miRNA可以形成本发明第一方面所述DNA-RNA双链结构。
在本发明的另一方面，还提供了以下内容：
1.微小RNA拉链能够特异抑制靶微小RNA与靶基因的结合，阻断其生物学功能，有细胞内基因敲低的作用；
2.微小RNA拉链的结构设计，能够将靶微小RNA分子首尾相连，形成RNA-DNA双链结构；
3.在拉链分子中间设计了1-3个额外碱基，使得靶微小RNA分子相连之间有足够空间形成稳定的DNA-RNA双链；
4.为了避免微小RNA拉链的自身结合，以及增强微小RNA拉链与靶miRNA之间结合的特异性，铆定核酸(locked nucleic acid，LNA)技术被用于合成微小RNA拉链。
5.20-80nM浓度的微小RNA拉链，抑制靶miRNA的效果最佳；
6.该微小RNA拉链不仅能够用于miRNA,也可以用于其他微小RNA,包括piRNA和内源性siRNA的特异抑制；
7.微小RNA拉链具有潜力用于临床，靶向抑制致病性微小RNA；
8.微小RNA拉链具有与靶向miRNA高亲和力、高特异性、高稳定性结合的优势；
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1A显示了微小RNA拉链结构。
图1B显示了微小RNA拉链将靶miRNA分子首尾相连，形成稳定的DNA-RNA双链结构。
图2显示了微小RNA-17拉链序列及结构图。
图3显示了微小RNA-221拉链序列及结构图。
图4显示了微小RNA let-7a拉链序列及结构图。
图5显示微小RNA-17拉链特异降低了miR-17在细胞内表达水平。
图6显示微小RNA-221拉链特异降低了miR-221在细胞内表达水平。
图7显示微小RNA let-7a拉链特异降低了let-7a在细胞内表达水平,但对同源性很高的let-7家族成员let-7b及let-7c没有作用，表明RNA拉链功能的特异性。
图8显示微小RNA-221拉链抑制miR-221的效果与浓度相关。
图9显示了两种不同结构的微小RNA-221拉链结构。
图10显示带有缺口的miR-221拉链效果明显优于不带缺口的miR-221Δ拉链。
图11显示带有缺口的miR-17拉链效果明显优于不带缺口的miR-17Δ拉链。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种稳定的DNA-RNA双链结构，所述的双链结构包括(i)miRNA单元序列，和(ii)RNA拉链单元序列,其中，所述RNA拉链单元序列的5’端与miRNA单元序列的5’端结合，所述RNA拉链单元序列的3’端与miRNA单元序列的3’端结合，且所述RNA拉链单元序列中有1-3个nt不与miRNA单元序列结合。实验表明，每个单元中具有1-3个不结合碱基的DNA-RNA双链结构可以有效抑制miRNA单元的生物学活性，具有高亲和力、高特异性、高稳定性的优点。
术语
如本文所用，术语“微小RNA拉链”、“微小RNA zipper”和“RNA拉链单元”可互换使用。
miRNA是一类转录后通过与目标mRNAs碱基互补配对来调节基因表达的因子。大多数miRNAs的功能仍然不清楚，且很少miRNA靶相互作用被实验性证实。先前阻断miRNA功能的方法，包括反义寡核苷酸，miRNA海绵、miRNA屏障、miRNA小分子抑制剂等。反义寡核苷酸，其抑制miRNA的效果有限。miRNA海绵或者miRNA屏障特异敲低miRNA基因，由于效果不够稳定以及复杂的调节机制，也未能被广泛的应用。
本发明利用miRNA序列短的特征，巧妙设计了一种微小RNA拉链，能够将微小RNA首尾相连，同时借助铆定核酸(locked nucleic acid，LNA)技术，固化了微小RNA拉链与微小RNA之间的互补配对结合，有效阻断微小RNA与靶基因的结合，进而抑制微小RNA生物学功能的发挥。
具体地，本发明建立一种与靶miRNA高亲和力，高特异性，高稳定性结合的微小RNA拉链，从而阻断miRNA与靶基因之间的结合，使得miRNA功能缺失。
鉴于miRNA的只有18-23个碱基，发明人巧妙设计了一种寡聚核苷酸DNA单链，其与一个miRNA分子序列后半段以及另一个分子的前半段互补，称之为微小RNA拉链。
为避免自身结构互补以及提高结合特异性，铆定核酸(locked nucleic acid，LNA)技术被应用于合成微小RNA拉链。
微小RNA拉链具有与靶向miRNA高亲和力、高特异性、高稳定性结合的优势。
如本文所用，术语“miRNA单元序列”包括miRNA、siRNA、和piRNA，是广义的小RNA(微小RNA)序列。
如本文所用，术语“miRNA”(microRNA)是一类由内源基因编码的长度约20-24个核苷酸的非编码单链RNA分子，在动植物中参与对大量基因的表达调控。到目前为止，在动植物以及病毒中已经发现四千多种miRNA分子。大多数miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇(cluster)的形式存在于基因组中。每种miRNA可以调控多个靶基因，而几种miRNA也可以共同参与调节同一基因，组成复杂的调节网络。据推测，miRNA调节着人类一半以上基因的表达。miRNA存在多种形式，最原始的是pri-miRNA；pri-miRNA经过Drosha加工后，成为pre-miRNA，即miRNA前体，长度大约为50-90个核苷酸；pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后，成为长约20-24个核苷酸的成熟miRNA。miRNA主要通过抑制翻译和加速mRNA的脱腺苷酸化抑制靶基因表达，其机制有别于siRNA介导的mRNA降解。
如本文所用，术语“RNAi”(RNA interference,RNA干扰)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA)诱发的、高效特异性降解具有互补配对序列的RNA的现象。由于使用RNAi技术可以特异性关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及肿瘤的基因治疗等领域。dsRNA介导的RNAi现象在真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等多种真核生物中均有发现，而且在植物中的转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)、共抑制(cosuppression)及RNA介导的病毒抗性、真菌的抑制(quelling)现象也均属于RNAi在不同物种的表现形式。
如本文所用，术语“siRNA”(Small interfering RNA,siRNA)是指一种小RNA分子(约21-25个核苷酸)，可由Dicer(RNA酶Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶)从其前体(比如dsRNA、shRNA等)加工而成，也可由化学方法合成或由其它蛋白加工产生。siRNA是siRISC的主要成员，激发与之序列互补的目标RNA被迅速切割降解，导致目标基因的沉默，因此成为RNAi中的关键功能分子。
如本文所用，术语“DNA-RNA双链结构”是本发明的微小RNA拉链(DNA)与微小RNA(RNA)首尾相连形成的稳定的双链结构，从而抑制miRNA单元的生物学功能。具体地，所述的DNA-RNA双链结构包括：
(i)miRNA单元序列，所述miRNA单元的数量为p，和
(ii)RNA拉链单元序列，所述的RNA拉链单元的数量为g，
其中，所述各RNA拉链单元序列为单链，并且各RNA拉链单元序列5’端与miRNA单元序列的5’端结合，所述各RNA拉链单元序列的3’端与miRNA单元序列的3’端结合，且所述RNA拉链单元序列中有连续0-3个nt不与miRNA单元序列结合；
并且，p和g为正整数，p+g≥3，且|p-g|≤1。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明的微小RNA拉链能够特异抑制靶微小RNA与靶基因的结合，阻断其生物学功能，有细胞内基因敲低的作用。
(b)本发明的微小RNA拉链的结构设计，能够将靶微小RNA分子首尾相连，形成RNA-DNA双链结构。
(c)本发明的微小RNA拉链具有与靶向miRNA高亲和力、高特异性、高稳定性结合的优势。
(d)本发明的微小RNA拉链对靶向miRNA的敲低功能具有高度的序列特异性，对同源的其他miRNA无作用，没有脱靶效应。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1
微小RNA拉链设计
利用微小RNA序列短的特征，设计了一个DNA序列(称之为微小RNA拉链)，靶向对应某miRNA分子，其与一个miRNA分子后半部分序列以及另一个miRNA分子的前半部分序列互补。一个miRNA拉链分子可以将两个靶miRNA分子首尾相连。本发明的微小RNA拉链结构如图1A所示。
研究发现，在微小RNA拉链序列中设计1-3个额外碱基(图1A微小RNA拉链黑色部分)，在两个miRNA分子之间为产生一个小缺口，为产生稳定的核酸结构提供了充足的空间，不仅有利于miRNA基因敲低的效果，又能保证微小RNA拉链与靶miRNA之间结合的特异性。
为了避免微小RNA拉链的自身结合，以及增强微小RNA拉链与靶miRNA之间结合的特异性，铆定核酸(locked nucleic acid，LNA)技术被用于合成微小RNA拉链。
使用Exiqon的LNATM oligo工具和设计指南，分别构建结合于miR-17、miR-221和let-7a的微小RNA拉链。图2、图3和图4分别是设计的miR-17拉链、miR-221拉链及let-7a拉链。
miR-17拉链、miR-221拉链和let-7a拉链序列如下(带+号者为LNA修饰碱基)
miR-221拉链：5’AA+TGTAGCTAGAAACCCAGCA+GAC 3’；(SEQ ID NO.:1)
miR-17拉链：5’A+AGCACTTTGGCTACCTGCACT+GT 3’；(SEQ ID NO.:2)
let-7a拉链：5’CTACTACCTCACAACT+ATACA+AC 3’；(SEQ ID NO.:3)
实施例2
微小RNA拉链功能和特异性验证
为了检测微小RNA拉链对靶miRNA的影响，miR-17拉链被合成，如图2所示，并将其转染到乳腺癌细胞系MDA-AB-231细胞。本方案利用荧光定量PCR反应，检测在转染miR-17拉链前后细胞中mi-17在细胞中的表达丰度。
结果证明如图5所示，30nM浓度的微小RNA-17拉链转染细胞24小时，就能将靶miRNA-17在细胞内水平降低80％左右。
另外验证了miR-221拉链在乳腺癌细胞株MDA-MB-231，对miR-221丰度的影响检测。
结果如图6所示，30nM浓度的微小RNA-221拉链转染细胞24小时，就能将靶miRNA-221在细胞内水平降低70-80％左右，并且该功能在一定范围内与微小RNA拉链的浓度正相关(图8)。
另外验证了let-7a拉链在乳腺癌细胞株MDA-MB-231，对let-7a、let-7b和let-7c丰度的影响检测。
结果如图7所示，30nM浓度的let-7a拉链转染细胞24小时，就能将靶let-7a在细胞内水平降低70-80％左右，但不影响同源let-7b及let-7c的表达。并且对靶let-7a的表达抑制在一定范围内与微小RNA拉链的浓度正相关(图7)。
实施例3
微小RNA拉链结构优化及功能验证
为了优化最佳效果的微小RNA拉链结构，验证是否需要在两个靶向miRNA之间建立缺口，发明人构建了两种不同结构的拉链(图9)，其中一个是在两个靶miRNA之间没有缺口，称作微小RNAΔ拉链，与带有缺口的微小RNA拉链相比，比较两种结构的效果。
miR-17拉链和miR-221拉链序列如下(带+号者为LNA修饰碱基)
miR-221Δ拉链：AA+TGTAGCTGAAACCCAGCA+GAC；(SEQ ID NO.:4)
结果如图10所示，带有缺口的微小RNA拉链效果显著优于不带缺口的拉链。
同样方法，合成了带缺口和不带缺口的miR-17拉链，拉链序列如下(带+号者为LNA修饰碱基)
miR-17Δ拉链：A+AGCACTTTGCTACCTGCACT+GT；(SEQ ID NO.:5)
用核酸印迹杂交方法，证实带有缺口的miR-17拉链效果优于不带缺口的miR-17Δ拉链(图11)
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Figure IDA0001053948370000011
Figure IDA0001053948370000021

Claims (13)

1.一种稳定的DNA-RNA双链结构，其特征在于，所述的双链结构包括
(i) miRNA单元序列，所述miRNA单元的数量为p，和
(ii) RNA拉链单元序列，所述的RNA拉链单元的数量为g，
其中，所述各RNA拉链单元序列为单链，并且各RNA拉链单元序列5’端与miRNA单元序列的5’端互补结合，所述各RNA拉链单元序列的3’端与miRNA单元序列的3’端互补结合，且所述RNA拉链单元序列中有连续1-3个nt不与miRNA单元序列互补结合；
并且，p和g为正整数，p+g≥3，且|p-g|≤1；
其中, 所述RNA拉链单元序列的5’端与miRNA单元序列的5’端结合的区域为第一结合区域，且第一结合区域的长度N1与RNA拉链单元序列的长度N0之比R1为(0.8-1.2)：2.0；
且所述RNA拉链单元序列的3’端与miRNA单元序列的3’端结合的区域为第二结合区域，且第二结合区域的长度N2与RNA拉链单元序列的长度N0之比R2为(1.2-0.8)：2.0。
2.如权利要求1所述的双链结构，其特征在于，所述RNA拉链单元序列中有连续1-2个nt不与miRNA单元序列结合。
3.如权利要求1所述的双链结构，其特征在于，所述的RNA拉链单元序列为DNA序列。
4.如权利要求1所述的双链结构，其特征在于，s=p+g，且s为奇数。
5.如权利要求1所述的双链结构，其特征在于，第一结合区域的长度N1与第二结合区域的长度N2之比R3为(0.4-0.6)：(0.6-0.4)。
6.如权利要求1所述的双链结构，其特征在于，所述的miRNA单元选自下组：
miRNA、siRNA、和piRNA。
7.如权利要求6所述的双链结构，其特征在于，所述的miRNA选自下组：miR-17、miR-221、和let-7a。
8.如权利要求1所述的双链结构，其特征在于，所述的RNA拉链单元序列中含有LNA修饰碱基。
9.如权利要求1所述的双链结构，其特征在于，所述的RNA拉链单元抑制miRNA单元的生物学功能。
10. 如权利要求9所述的双链结构，其特征在于，所述的RNA拉链单元抑制miR-221的生物学功能，且抑制miR-221的RNA拉链单元的序列如SEQ ID NO.: 1所示。
11. 如权利要求9所述的双链结构，其特征在于，所述的RNA拉链单元抑制miR-17的生物学功能，且抑制miR-17的RNA拉链单元的序列如SEQ ID NO.: 2所示。
12. 如权利要求9所述的双链结构，其特征在于，所述的RNA拉链单元抑制let-7a的生物学功能，且抑制let-7a的RNA拉链单元的序列如SEQ ID NO.: 3所示。
13.一种RNA拉链单元序列的用途，其特征在于，用于制备抑制miRNA的药物组合物，且所述的RNA拉链单元序列与所述miRNA可以形成权利要求1所述DNA-RNA双链结构。
CN201610570758.8A 2016-07-19 2016-07-19 一种稳定的dna-rna双链结构 Active CN107630015B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610570758.8A CN107630015B (zh) 2016-07-19 2016-07-19 一种稳定的dna-rna双链结构
PCT/CN2017/093548 WO2018014848A1 (zh) 2016-07-19 2017-07-19 一种小rna抑制剂
US16/319,766 US11306310B2 (en) 2016-07-19 2017-07-19 MicroRNA inhibitor

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610570758.8A CN107630015B (zh) 2016-07-19 2016-07-19 一种稳定的dna-rna双链结构

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107630015A CN107630015A (zh) 2018-01-26
CN107630015B true CN107630015B (zh) 2021-03-09

Family

ID=60991951

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610570758.8A Active CN107630015B (zh) 2016-07-19 2016-07-19 一种稳定的dna-rna双链结构

Country Status (3)

Country Link
US (1) US11306310B2 (zh)
CN (1) CN107630015B (zh)
WO (1) WO2018014848A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114958850B (zh) * 2021-06-04 2023-12-15 南京大学 一种基因组件、含有此基因组件的递送***及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101918554A (zh) * 2007-12-18 2010-12-15 独立行政法人产业技术综合研究所 多糖/双链rna复合物
CN104271742A (zh) * 2012-03-04 2015-01-07 株式会社博纳克 微小rna抑制剂

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008049078A1 (en) * 2006-10-18 2008-04-24 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Nicked or gapped nucleic acid molecules and uses thereof
US20090099034A1 (en) * 2007-06-07 2009-04-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Reagents and Methods for miRNA Expression Analysis and Identification of Cancer Biomarkers
EP2201022A4 (en) 2007-08-27 2012-01-04 Boston Biomedical Inc COMPOSITION OF ASYMMETRIC RNA DUPLEX AS MICRO-RNA MIMETICUM OR INHIBOTOR
US20100184841A1 (en) 2008-12-18 2010-07-22 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Extended dicer substrate agents and methods for the specific inhibition of gene expression
EP2609198B8 (en) * 2010-08-24 2018-03-28 Sirna Therapeutics, Inc. SINGLE-STRANDED RNAi AGENTS CONTAINING AN INTERNAL, NON-NUCLEIC ACID SPACER
AU2012308320C1 (en) * 2011-09-14 2018-08-23 Translate Bio Ma, Inc. Multimeric oligonucleotide compounds
US20160215316A1 (en) * 2015-01-22 2016-07-28 Genomic Expression Aps Gene synthesis by self-assembly of small oligonucleotide building blocks
CN105132424A (zh) 2015-08-17 2015-12-09 深圳大学 microRNA抑制剂、microRNA抑制剂表达载体及其构建方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101918554A (zh) * 2007-12-18 2010-12-15 独立行政法人产业技术综合研究所 多糖/双链rna复合物
CN104271742A (zh) * 2012-03-04 2015-01-07 株式会社博纳克 微小rna抑制剂

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MicroRNA sponges: competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells;Ebert,M.S.等;《Nat. Methods》;20071231;第4卷;第721–726页 *
RNA干扰与siRNA(小干扰RNA)研究进展;史毅 等;《生命科学》;20081231;第20卷(第2期);第196–201页 *
Small RNA zippers lock miRNA molecules and block miRNA function in mammalian cells;Lingyu Meng 等;《NATURE COMMUNICATIONS》;20170103;第1-10页 *

Also Published As

Publication number Publication date
US11306310B2 (en) 2022-04-19
WO2018014848A1 (zh) 2018-01-25
CN107630015A (zh) 2018-01-26
US20200071697A1 (en) 2020-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6236498B2 (ja) 非対称性干渉ｒｎａの組成物およびその使用
Pasternak et al. Unlocked nucleic acid–an RNA modification with broad potential
CN102575252B (zh) 用于多价rna干扰的多核苷酸、组合物及其使用方法
JP5145557B2 (ja) マイクロｒｎａを有効成分として含有する腫瘍増殖抑制剤、および癌治療用医薬組成物
US10519443B2 (en) Microrna inhibitor system and methods of use thereof
KR20110110776A (ko) 유전자 발현의 특이적 억제를 위한 연장된 다이서 기질 제제 및 방법
JP2014097072A5 (zh)
Snead et al. Biogenesis and function of endogenous and exogenous siRNAs
JP2017502665A (ja) オフターゲットを防ぐために変形したｒｎａ干渉誘導拡散およびその用途
Fluiter et al. The therapeutic potential of LNA-modified siRNAs: reduction of off-target effects by chemical modification of the siRNA sequence
JP2007530431A5 (zh)
US20100292299A1 (en) Nucleotide Motifs Providing Localization Elements and Methods of Use
TWI382849B (zh) 產生藉由基因靜默效應以用於皮膚維護之化妝品的方法以及編碼基因靜默效應物之基因重組核苷酸
Ogata et al. Biaryl modification of the 5′-terminus of one strand of a microRNA duplex induces strand specificity
WO2019004420A1 (ja) ヘテロ二本鎖型ａｎｔｉｍｉＲ
CN107630015B (zh) 一种稳定的dna-rna双链结构
CN108245527B (zh) 通过miR-1181进行抗癌的方法和药物及其应用
US20210230593A1 (en) Programmable conditional sirnas and uses thereof
WO2023283548A1 (en) Signal activatable nucleic acid constructs with wobble base pairings
US11312958B2 (en) Components and methods for producing toxic RNAs in eukaryotic cells
Korkmaz et al. RNA-Based therapeutic oligonucleotide strategies
KR101993894B1 (ko) 마이크로 rna를 포함하는 이중나선 올리고 rna 구조체
CN108295086B (zh) 通过miR-4418进行抗癌的方法和药物及其应用
KR100929700B1 (ko) 일부 단일가닥의 다중 간섭 유도 ｒｎａ
TW202313977A (zh) 作為新穎基因靜默技術的短雙股ｄｎａ及其應用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: 200120 No. 150, Jimo Road, Shanghai, Pudong New Area

Patentee after: SHANGHAI EAST HOSPITAL (EAST HOSPITAL TONGJI University SCHOOL OF MEDICINE)

Address before: 200120 No. 150, Jimo Road, Shanghai, Pudong New Area

Patentee before: SHANGHAI EAST Hospital

CP01 Change in the name or title of a patent holder