ES2617877T3 - Composiciones de ARN interferente asimétrico y uso de las mismas - Google Patents

Composiciones de ARN interferente asimétrico y uso de las mismas Download PDF

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Abstract

Una molécula dúplex de ARN interferente asimétrico que consiste en: una cadena no codificante, que consiste en 19-23 nucleótidos, en la que la cadena no codificante contiene un saliente 3' y un saliente 5', y en la que el saliente 3' consiste en nucleótidos de ARN, y una cadena codificante, que consiste en 14-17 nucleótidos, en la que la cadena codificante es al menos un 70 % complementaria a la cadena no codificante, en la que la cadena no codificante es al menos un 70 % complementaria a un ARNm diana; y en la que la cadena no codificante y la cadena codificante forman una región bicatenaria de 14, 15, 16 o 17 pares de bases nucleotídicas

Description

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hemicelulasa, una integrasa, una invertasa, una isomerasa, una cinasa, una lactasa, una lipasa, una lipoxigenasa, una lisozima, una pectinesterasa, una peroxidasa, una fosfatasa, una fosfolipasa, una fosforilasa, una poligalacturonasa, una proteinasa o peptidasas, una pulanasa, una recombinasa, una transcriptasa inversa, una topoisomerasa, una xilanasa, k-RAS, β-Catenina, Rsk1, PCNA, p70S6K, Survivina, mTOR, PTEN, Parp1, o p21.
Las moléculas de ARN dúplex pueden seleccionarse entre el grupo que consiste en
aiNbs1
aiEF2
aiStat3-A
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aiStat3-B
aiPTEN
aip70S6K
aimTOR
aiRsk1
aiPCNA
aiParp1
aiSurvivina
aiNQO1
aip21-A
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aip21-B
aik-Ras
aiβ-catenina-1
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La presente divulgación también proporciona una célula. La célula puede comprender el vector de expresión. La célula puede comprender la molécula de ARN dúplex. En otra realización más, la célula es una célula de mamífero, una célula de ave o una célula bacteriana.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1A muestra la estructura de una molécula de ARN dúplex que tiene tanto un saliente 3' como un saliente 5' en la primera cadena. La figura 1B muestra la estructura de una molécula de ARN dúplex que tiene tanto un saliente 3' como un saliente 5' en la primera cadena, y una mella en el dúplex. La figura 1C muestra la estructura de una molécula de ARN dúplex que tiene tanto un saliente 3' como un saliente 5' en la primera cadena, y un hueco en la segunda cadena. La figura 2A muestra la estructura de una molécula de ARN dúplex que tiene un extremo romo, y un saliente 5' en la primera cadena. La figura 2B muestra la estructura de una molécula de ARN dúplex que tiene un extremo romo, y un saliente 3' en la primera cadena. La figura 2C muestra la estructura de una molécula de ARN dúplex que tiene salientes 3' en ambos extremos del dúplex y que la primera cadena es mayor que la segunda cadena. La figura 2D muestra la estructura de una molécula de ARN dúplex que tiene salientes 5' en ambos extremos del dúplex y que la primera cadena es mayor que la segunda cadena. La figura 3 muestra la inducción del silenciamiento génico de β-catenina por aiRNA (ARN interferentes asimétricos). La figura 3A muestra la confirmación de los oligos. Después de la hibridación, los oligos se confirmaron en un 20 % de gel de poliacrilamida. Carril 1, 21 nt/21 nt; carril 2, 12 nt(a)/21 nt; carril 3, 12 nt(b)/21 nt; carril 4, 13 nt/13 nt; carril 5, 13 nt/21 nt; carril 6, 14 nt/14 nt; carril 7, 14 nt(a)/21 nt; carril 8, 14 nt(b)/21 nt; carril 9, 15 nt/15 nt; carril 10, 15 nt/21 nt. La figura 3B muestra los efectos de los oligos en el silenciamiento génico. Las células HeLa se pusieron en placas a 200.000 células/pocillo en una placa de cultivo de 6 pocillos, 24 horas más tarde se transfectaron con siRNA desordenado (carril 1), E2F1 dirigido a siRNA de 21 pb (carril 2, como un control para especificidad) o beta-catenina dirigida a siRNA de 21 pb (carril 3, como control positivo), o la misma concentración de aiRNA de diferente mezcla de longitud: 12 nt(a)/21 nt (carril 4); 12 nt (b)/21 nt (carril 5); 13 nt/21 nt (carril 6); 14 nt (a)/21 nt (carril 7); 14 nt (b)/21 nt (carril 8); 15 nt/21 nt (carril 9). Las células se cosecharon 48 horas después de la transfección. La expresión de β-catenina se determinó por transferencia Western. E2F1 y actina se usan como controles. Las figuras 4 y 5 muestran la relación estructura-actividad de los oligos de aiRNA, con o sin sustituciones de bases, en la medicación del silenciamiento génico. Las células Hela se transfectaron con el aiRNA indicado. Las células se cosecharon y los lisados se generaron 48 horas después de la transfección. Se realizaron transferencia de Western para detectar los niveles de β-catenina y actina. si se refiera a un oligonucleótido de siRNA de β-catenina. El marcado numérico por encima de cada carril corresponde a los oligos de aiRNA en la Tabla 3. La figura 6 muestra los análisis del mecanismo del silenciamiento génico activado por aiRNA. La figura 6a muestra el análisis de transferencia northern de los niveles de ARNm de β-catenina en las células transfectadas con aiRNA o siRNA para el número de días indicado. La figura 6b muestra el esquema de PCR 5'-RACE para β-catenina que muestra la escisión de ARNm y el producto de PCR esperado. La figura 6c muestra que los productos de escisión de β-catenina mediados por aiRNA se amplificaron por PCR 5'-RACE a partir de células transfectadas con aiRNA durante 4 o 8 horas. La figura 6d muestra el esquema del sitio de escisión de ARNm de β-catenina confirmado por la secuenciación del fragmento de PCR 5'-RACE. La figura 6e muestra la eficiencia de la carga de RISC diferencial de aiRNA y siRNA. Los dúplex de aiRNA o siRNA se transfectaron en células Hela 48 horas después de la transfección con pCMV-Ago2. Ago2 se inmunoprecipitó en los puntos temporales indicados tras la transfección de aiRNA o siRNA, y se realizó un análisis de transferencia northern para determinar los niveles de ARN pequeño asociado a Ago2/RISC. Los niveles de Ago2 (mostrados a continuación) se determinaron por transferencia western tras IP. La figura 6f muestra los efectos de atenuar Ago2 o Dicer en la actividad de silenciamiento génico de aiRNA y siRNA. Las células se transfectaron con siRNA desordenado (siCon), o Ago2 dirigido a siRNA (siAgo2), o Dicer (siDicer) 24 horas antes de la transfección con aiRNA desordenado (Con) o Stat3 dirigido a aiRNA (ai). Las células se cosecharon y se realizó un análisis de transferencia western 48 horas tras la transfección de aiStat3.
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La figura 13 muestra la comparación de aiRNA con siRNA en la eficacia del silenciamiento génico y la durabilidad contra múltiples dianas. Las células Hela se transfectaron con siRNA desordenado (c), aiRNA (ai), o siRNA (si) dirigidos a (a) β-catenina a 10 nM, (b) Stat3, (c) EF2, o (d) NQO1 a 20 nM. ARN y la proteína se purificaron en los puntos temporales indicados y se analizaron para determinar los niveles de ARNm mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) y los niveles de proteína por transferencia western. Los datos de qRT-PCR se normalizan con respecto a las células transfectadas siCon. La figura 14 muestra que el silenciamiento génico mediado por aiRNA es eficaz contra diversos genes en múltiples líneas celulares. La figura 14a muestra que un dúplex de aiRNA es más eficaz que siRNA en el direccionamiento a βcatenina en diferentes líneas de células de mamífero. La figura 14b muestra el análisis de transferencia western de Nbs1, Survivina, Parp1, p21 de células transfectadas con 20 nM del aiRNA o siRNA indicado durante 48 horas. La figura 14c muestra el análisis de transferencia western de Rsk1, PCNA, p70S6K, mTOR, y PTEN de células transfectadas con 20 nM del aiRNA o siRNA indicado durante 48 horas. La figura 14d muestra el silenciamiento génico específico de alelos de k-Ras por aiRNA. El aiRNA dirigido a k-Ras de tipo silvestre se ensayó para el silenciamiento de k-Ras tanto en líneas celulares de k-Ras de tipo silvestre (DLD1) como de k-Ras mutante (SW480) por análisis de transferencia western. La figura 15 muestra la falta de silenciamiento génico no específico mediante la cadena codificante, inmunoestimulación y estabilidad en suero de los aiRNA. La figura 15a muestra un análisis de RT-PCR de la expresión de genes inducibles de interferón en control PBMC tratados o incubados con dúplex de siRNA o aiRNA de β-catenina durante 16 horas. La figura 15b muestra un análisis RT-PCR de la expresión de genes inducibles de interferón en células Hela transfectadas con control o transfectadas con aiRNA o siRNA de EF2 o Survivina durante 24 horas. La figura 15c muestra el análisis de micromatrices para determinar los cambios en la expresión de genes relacionados con la respuesta a interferón conocidos. El ARN total aislado de células Hela transfectadas con aiRNA y siRNA se analizó por micromatriz. La figura 15d muestra que no se detecta ningún silenciamiento génico no específico mediado por cadena codificante para aiRNA. Las células se co-transfectaron con aiRNA o siRNA y un plásmido que expresaba Stat3 (ARN codificante) o un plásmido que expresaba Stat3 no codificante (ARN no codificante). Las células se cosecharon y el ARN se recogió 24 horas después de la transfección y los niveles relativos de ARN codificante o no codificante de Stat3 se determinaron por PCR o RT-PCR cuantitativa en tiempo real (inserciones). La figura 15e muestra la estabilidad de dúplex de aiRNA y siRNA en suero humano. Los dúplex de aiRNA y siRNA se incubaron en suero humano al 10 % a 37 ºC durante la cantidad indicada de tiempo antes de la electroforesis en gel. Se indica el dúplex restante (% de control). La figura 15f ilustra el modelo propuesto para el silenciamiento específico de genes mediado por el dúplex de aiRNA. La figura 16 muestra la potente actividad antitumoral de aiRNA contra β-catenina en un modelo de ratón de xenoinjerto de colon humano SW480. A los ratones inmunosuprimidos con cáncer de colon humano SW480 subcutáneo establecido se les administró por vía intravenosa (iv) 0,6 mnol de siRNA de β-catenina complejados con PEI, aiRNA de β-catenina complejados con PEI o un siRNA no relacionado complejado con PE como control negativo diario. El tamaño del tumor se evaluó periódicamente durante el tratamiento. Cada punto representa la media  SEM de seis tumores. La figura 17 muestra la potente actividad antitumoral de aiRNA contra β-catenina en un modelo de ratón de xenoinjerto de colon humano HT29. A los ratones inmunosuprimidos con cáncer de colon humano HT29 subcutáneo establecido se les dio por vía intravenosa (iv) 0,6 nmol siRNA de β-catenina complejados con PEI, aiRNA de β-catenina complejados con PEI o un siRNA no relacionado complejado con PEI como control cada dos días. El tamaño del tumor se evaluó periódicamente durante el tratamiento. Cada punto representa la media  SEM de cinco tumores.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una molécula de ARN dúplex asimétrico que es capaz de realizar un silenciamiento génico selectivo en una célula eucariota. En una realización, la molécula de ARN dúplex comprende una primera cadena y una segunda cadena. La primera cadena es más larga que la segunda cadena. La segunda cadena es sustancialmente complementaria a la primera cadena, y forma una región bicatenaria con la primera cadena.
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El término "aislado" o "purificado" como se usa en el presente documento, se refiere a un material que está sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan en su estado nativo. La pureza y la homogeneidad se determinan típicamente usando técnicas de química analítica tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía líquida de alto rendimiento.
Como se usa en el presente documento, "modular" y sus equivalentes gramaticales se refieren a aumentar o disminuir (por ejemplo, silenciamiento), en otras palabras, regulación en sentido ascendente o descendente. Como se usa en el presente documento, "silenciamiento génico" se refiere a la reducción de la expresión génica, y puede referirse a una reducción de la expresión génica de aproximadamente el 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o el 95 % del gen diana.
Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a cualquier animal (por ejemplo, un mamífero), incluyendo, pero sin limitación, seres humanos, primates no humanos, roedores, y similares, que ha de ser el receptor de un tratamiento particular. Típicamente, los términos "sujeto" y "paciente" se usan de forma intercambiable en el presente documento en referencia a un sujeto humano.
Los términos tales como "tratar" o "tratamiento" o "para tratar" o "aliviar" o "para aliviar" como se usan en el presente documento, se refieren tanto a (1) las medidas terapéuticas que curan, ralentizan, disminuyen los síntomas de, y/o detener el avance de una afección patológica diagnosticada o trastorno y (2) las medidas profilácticas o preventivas que impiden o retrasan el desarrollo de una afección o trastorno patológico diana. Por lo tanto, aquellos que necesitan tratamiento incluyen los que ya padecen el trastorno; aquellos propensos a padecer el trastorno; y aquellos en los que el trastorno se va a prevenir. Un sujeto se "trata" con éxito, de acuerdo con los métodos de la presente invención si el paciente muestra uno o más de los siguientes: una reducción en el número de o ausencia completa de células cancerosas; una reducción en el tamaño del tumor; inhibición de o una ausencia de infiltración de células cancerosas en órganos periféricos, incluyendo la propagación del cáncer en el tejido blando y el hueso; inhibición de o una ausencia de metástasis tumoral; inhibición o ausencia de crecimiento del tumor; el alivio de uno o más síntomas asociados al cáncer específico; reducción de la morbilidad y la mortalidad; y mejora en la calidad de vida.
Como se usa en el presente documento, los términos "inhibición", "para inhibir" y sus equivalentes gramaticales, al usarse en el contexto de una bioactividad, se refieren a la regulación descendente de la bioactividad, que puede reducir o eliminar la función, tal como la producción de una proteína o la fosforilación de una molécula. En realizaciones particulares, la inhibición puede referirse a una reducción de aproximadamente el 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o el 95 % de la actividad diana. Al usarse en el contexto de un trastorno o enfermedad, los términos se refieren al éxito en la prevención de la aparición de los síntomas, alivio de los síntomas,
o eliminación de la enfermedad, afección o trastorno.
Como se usa en el presente documento, la expresión "sustancialmente complementaria" se refiere a la complementariedad de una región de bases apareadas, de doble cadena entre dos ácidos nucleicos y no cualquier región monocatenaria tal como un saliente terminal o una región hueco entre dos regiones bicatenarias. La complementariedad no necesita ser perfecta; puede haber cualquier número de desajustes de pares de bases, por ejemplo, entre los dos ácidos nucleicos. Sin embargo, si el número de desajustes es tan grande que no puede ocurrir hibridación ni siquiera bajo las condiciones de hibridación menos rigurosas, la secuencia no es una secuencia sustancialmente complementaria. Cuando dos secuencias se definen como "sustancialmente complementarias" en el presente documento, significa que las secuencias son suficientemente complementarias entre sí para hibridarse en las condiciones de reacción seleccionadas. La relación de complementariedad de ácido nucleico y la rigurosidad de la hibridación suficiente para lograr la especificidad se conoce bien en la técnica. Dos cadenas sustancialmente complementarias pueden ser, por ejemplo, perfectamente complementarias o pueden contener de 1 a muchos desajustes, siempre que las condiciones de hibridación sean suficientes para permitir, por ejemplo, la discriminación entre una secuencia de emparejamiento y una secuencia sin emparejamiento. Por consiguiente, las secuencias sustancialmente complementarias pueden hacer referencia a secuencias con complementariedad de pares de bases de 100, 95, 90, 80, 75, 70, 60, 50 por ciento o menos, o cualquier número entre medias, en una región bicatenaria.
Como se usa en el presente documento, los antagomirs son inhibidores de miRNA, y se pueden utilizar en el silenciamiento de miRNA endógenos. Como se usa en el presente documento, los miméticos o mímicos son agonistas de miRNA, y pueden usarse para reemplazar miRNA endógenos como equivalentes funcionales y, elevando así las rutas afectadas por dichos miRNA endógenos.
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En comparación con las moléculas de siRNA simétrico correspondiente, sin embargo, las moléculas de ARN dúplex asimétrico son incapaces de realizar un silenciamiento génico selectivo (ibídem).
La presente invención es pertinente a las moléculas de ARN dúplex asimétricas que son capaces de realizar un silenciamiento génico específico de secuencia. En una realización, una molécula de ARN de la presente invención comprende una primera cadena y una segunda cadena, en la que la segunda cadena es sustancialmente complementaria a la primera cadena, y forma una región bicatenaria con la primera cadena, en la que la primera cadena es mayor que la segunda cadena; excluir las moléculas de ARN dúplex asimétricas desveladas en Elbashir (Elbashir y col., 2001c), específicamente las moléculas de ARN dúplex asimétricas enumeradas en la Tabla 1. La molécula de ARN comprende una región bicatenaria, y dos extremos independientemente seleccionados entre el grupo que consiste en un saliente 5', un saliente 3', y un extremo romo. La cadena de ARN puede tener nucleótidos desiguales o imperfectamente emparejados.
En una realización, la primera cadena es al menos 1 nt más larga que la segunda cadena. En una realización adicional, la primera cadena es al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nt más larga que la segunda cadena. En otra realización, la primera cadena es 20-100 nt más larga que la segunda cadena. En una realización adicional, la primera cadena es 2-12 nt más larga que la segunda cadena. Aún en una realización adicional, la primera cadena es 3-10 nt mas larga que la segunda cadena.
En una realización, la región bicatenaria tiene una longitud de 3-98 pb. En una realización adicional, la región bicatenaria tiene una longitud de 5-28 pb. Aún en una realización adicional, la región bicatenaria tiene una longitud de 10-19 pb. La longitud de la región bicatenaria puede ser de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 pb.
En una realización, la región bicatenaria de la molécula de ARN no contiene ninguna incompatibilidad o abultamiento. En otra realización, la región bicatenaria de la molécula de ARN contiene una incompatibilidad y/o abultamiento.
En una realización, cuando la primera cadena es 5'-UUCGAAGUAUUCCGCGUACGU 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGUG o 5'-CGAAGUAUUCCGCGUACGUGA, la segunda cadena tiene una longitud de como mucho 17 nucleótidos, o contiene al menos una incompatibilidad con la primera cadena, o contiene al menos una modificación.
En una realización alternativa, la primera cadena no es 5'-UUCGAAGUAUUCCGCGUACGU 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGUG o 5'-CGAAGUAUUCCGCGUACGUGA.
En una realización, la primera cadena comprende una secuencia que es sustancialmente complementaria a una secuencia de ARNm diana. En otra realización, la segunda cadena comprende una secuencia que es sustancialmente complementaria a una secuencia de ARNm diana.
La presente invención es pertinente para las moléculas de ARN bicatenario asimétrico que son capaces de realizar un silenciamiento génico. En una realización, una molécula de ARN de la presente invención comprende una primera cadena y una segunda cadena, en la que la segunda cadena es sustancialmente complementaria, o parcialmente complementaria a la primera cadena, y la primera cadena y la segunda cadena forman al menos una región bicatenaria, en la que la primera cadena es más larga que la segunda cadena (longitud asimétrica). La molécula de ARN de la presente invención tiene al menos una región bicatenaria, y dos extremos independientemente seleccionados entre el grupo que consiste en un saliente 5', un saliente 3', y un extremo romo (por ejemplo, véanse las figuras 1A, 2A-2D).
En el campo de la fabricación de reguladores de ARN pequeño donde los cambios, adiciones y deleciones de un único nucleótido pueden afectar críticamente a la funcionalidad de la molécula (Elbashir y col., 2001c), el andamiaje de aiRNA proporciona una plataforma estructural distinta de la estructura de siRNA clásica de ARN bicatenario de 21 nt que es simétrica en cada cadena y sus salientes 3' respectivos. Además, el aiRNA de la presente invención proporciona un nuevo enfoque muy necesario en el diseño de una nueva clase de reguladores de molécula pequeña que, como se muestra por los datos incluidos en los ejemplos a continuación, puede superar los obstáculos
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Tabla 4: Secuencias de aiRNA usadas para las figuras 4-5
aiRNA #
Estructura genérica Secuencia
1
15-21 (NNN---NNN) imagen32
2
15-21a (NNNNNN---romo) imagen33
3
15-21b (romo---NNNNNN) imagen34
4
15-21c (NNNN---NN) imagen35
5
15-21d (NN---NNNN) imagen36
7
15-18b (corte romo 3'---NNN) imagen37
8
15-21d (N---NNNNN) imagen38
9
15-21e (NNNNN---N) imagen39
10
15-22a (NNNN---NNN) imagen40
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15-22b (NNN---NNNN) imagen41
imagen42
13
15-24a (NNNNN---NNNN) imagen43
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15-24b (NNNN---NNNNN) imagen44
15
15-27 (NNNNNN---NNNNNN) imagen45
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15-20a (NNN---NN)
34
17
15-20b (NNNN---N) imagen46
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15-20c (NN---NNN) imagen47
21
15-19c (NNNN-romo) imagen48
22
15-18a (NN---N) imagen49
23
15-18b (NNN-romo) imagen50
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15-18c (romo---NNN) imagen51
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15-17a (NN---romo) imagen52
26
15-17b (romo---NN) imagen53
29
14-20 (NNN---NNN) imagen54
30
14-19a (NNN---NN) imagen55
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14-19b (NN---NNN) imagen56
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14-18b (NNN---N) imagen57
34
16-21a (NNN---NN) imagen58
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16-21b (NN---NNN) imagen59
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17-21 (NN---NN)
35
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18-21a (NN---N) imagen60
38
18-21b (N---NN) imagen61
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18-21c (NNN---romo) imagen62
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19-21a (NN---romo) imagen63
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18-21b (romo---NNN) imagen64
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19-21c (N---N) imagen65
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20-21a (N---romo) imagen66
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20-21b (romo---N) imagen67
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Incompatibilidad y miRNA imagen68
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Extremo 5' homólogo a diana imagen69
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NNNNNNNNNNNNNNN 3'NNNNNNNNNNNNNNNNNNDDD5' imagen70
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NNNNNNNNNNNNNNN 3'DDDNNNNNNNNNNNNNNNNNN5' imagen71
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NNNNNNNNNNNNNNN 3'DDDNNNNNNNNNNNNNNNDDD5' imagen72
51
DNDNNNNNNNDNDND 3'NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN5' imagen73
52
NNNNNNNNNNNNNNN 3'NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
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5'
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NNNNNNNNNNNNNNN 3'NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN5' imagen74
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DNNNNNNNNNNNNNN 3'DDDNNNNNNNNNNNNNNNNNN5' imagen78
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DNNNNNNNNNNNNNN 3'NNNNNNNNNNNNNNNNNNDDD5' imagen79
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NNNNNNNNNNNNNND 3'DDDNNNNNNNNNNNNNNNNNN5' imagen80
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NNNNNNNNNNNNNND 3'NNNNNNNNNNNNNNNNNNDDD5' imagen81
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NNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'DDDNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5 imagen82
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NNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'NNNNNNNNNNNNNNNNNNDDD-5' imagen83
En la tabla 4, A, U, G, C representan nucleótidos, mientras que a, t, g, c representan desoxinucleótidos.
Ejemplo 2. Mecanismo de silenciamiento génico activado por aiRNA
5 Para investigar el mecanismo de atenuación génica inducida por aiRNA, primero determinó si el silenciamiento génico por aiRNA se produce a nivel de traducción o de ARNm. El análisis de transferencia Northern de β-catenina en células transfectadas con 10 nM del aiRNA de 15 pb mostró que el aiRNA redujo los niveles de ARNm en más de un 95 % en 24 horas y la disminución duró más de 4 días (figura 6a), lo que sugiere que aiRNA media el
10 silenciamiento génico al nivel del ARNm. La reducción del ARNm de β-catenina inducida por aiRNA fue sustancialmente más rápida, eficaz y duradera que por siRNA (figura 6a). Además, se determinó si el aiRNA de 15 pb catalizó la escisión específica de sitio del ARNm de β-catenina. El ARN total aislado de células transfectadas con el aiRNA de 15 pb se examinó mediante amplificación rápida de extremos de ADNc (5'-RACE) y PCR para determinar la presencia de los fragmentos de escisión de ARNm de β-catenina (figura 6b). Se detectaron fragmentos
15 de escisión de β-catenina 4 y 8 horas después de la transfección de aiRNA (figura 6c). El análisis de secuencia mostró que la escisión tenía lugar en la secuencia diana de aiRNA entre las bases 10 y 11 con respecto al extremo
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Claims (1)

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