CN104673796A - 靶向hsv-1病毒ul18基因的小干扰rna及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种靶向HSV-1病毒UL18基因的小干扰RNA及应用。本发明根据靶向HSV-1病毒UL18基因mRNA序列，设计、合成小干扰RNA。本发明首次发现，针对UL18基因的siRNA可导致HSV-1核衣壳无法正常组装，从而最终抑制HSV-1的增殖和感染；同时发现靶向HSV-1 UL18基因的siRNA作为小分子核酸药物还具有体外抑制阿昔洛韦耐药病毒株的作用。本发明可以解决现有HSV-1感染治疗方案中存在的药物毒性大、易产生耐药性、易复发等问题；本发明所提供的siRNA及其修饰物可用于制备预防或治疗HSV-1及与HSV-1病毒感染相关疾病的小分子核酸药物或制剂；且靶向明确，效果明显。

Description

靶向HSV-1病毒UL18基因的小干扰RNA及应用

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，特别涉及靶向HSV-1病毒UL18基因的小干扰RNA分子(siRNA)及应用。

背景技术

单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)属于疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科，是一种以人类为唯一自然宿主的双链包膜DNA病毒，血清学分为HSV-1和HSV-2型。HSV-1在形成局部的疱疹病损后，常常以各种方式进一步引起机体神经***的感染。尤其重要的是在感染神经***的过程中，疱疹病毒能够发挥其生存技巧中最令人叫绝的方式：-潜伏-再激活-这个在进化中形成的生物学优势，使得HSV-1能够在很大程度上避开宿主免疫***的攻击，从而在机体内长期甚至终生停留。HSV-1感染性疾病常反复发作，迁延难愈，给病人造成极大痛苦。目前，药物治疗是治疗HSV感染的主要手段。临床常用的治疗药物主要是无环鸟苷等核苷类及其类似物，如阿昔洛韦(Acyclovir，ACV)、伐昔洛韦等。其作用靶点是病毒DNA聚合酶，抑制病毒的复制。肝素可与病毒膜表面糖蛋白结合；化合物SCH 43478及其类似物抑制HSV的立即早期基因的表达；硫脲抑制剂WAY-150138可抑制UL6参与衣壳组装，抑制子代病毒DNA包装进入衣壳结构。但部分核苷类似物如碘脱氧尿苷、更昔洛韦等具有诱变性，安全性低，并且在上世纪80年代ACV耐药株即已出现，而且随着抗疱疹病毒药物的广泛使用，关于耐药株的报道也越来越多。所以，寻找新的抗疱疹病毒的治疗方法和治疗靶点成为科研工作者的研发目标。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)介导的特异性基因表达沉默现象。在细胞内，dsRNA被核糖核酸酶(又称Dicer)剪切成短的dsRNA(21～25nt)，这种小的dsRNA被称作siRNA。siRNA中的反义链与多种核酸酶形成复合体称作RISC复合体。随后RISC复合体被激活成为活性状态(RISC*)。siRNA的正义链引导RISC*到沉默靶点，RISC*与沉默靶点mRNA结合，在ATP的存在下，mRNA与siRNA的反义链结合互补，引发核酸酶将mRNA剪切成为21～23nt的小片段，继而阻止mRNA的表达翻译，导致目的基因的沉默。已有研究表明siRNA作为高效特异的抗病毒药物具有极大的发展前景，siRNA在HIV-1，SARS病毒，呼吸道综合症病毒等多种病毒的治疗研究中被成功应用。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供靶向HSV-1病毒UL18基因的小干扰RNA分子(siRNA)及其修饰物。解决了现有HSV-1感染治疗方案中存在的药物毒性大、易产生耐药性，易复发等缺陷和问题，制得靶向明确，安全可靠，效果明显的抗HSV-1病毒感染的新型药品。

本发明的另一目的在于提供靶向HSV-1病毒UL18基因的siRNA的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：靶向HSV-1病毒UL18基因的siRNA，所述的siRNA为siRNA181、siRNA182或siRNA183中的一种或至少两种：

siRNA181：正义链：5'-CUCAACGUGCUGUACUACAAC-3'；

反义链：5'-UGUAGUACAGCACGUUGAGGU-3'；

siRNA182：正义链：5'-CCACCAUCAUCCUUACGCUAA-3'；

反义链：5'-AGCGUAAGGAUGAUGGUGGUU-3'；

siRNA183：正义链：5'-CCCGUUAUACGCUAUCCCUAA-3'；

反义链：5'-AGGGAUAGCGUAUAACGGGGG-3'；

siRNA N.C：正义链：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'；

反义链：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'；

其中，siRNA N.C为siRNA阴性对照，其3'端的TT碱基是悬垂序列，是为了增加siRNA在细胞内的稳定性。

本发明中的针对HSV-1病毒UL18基因的siRNA分子，可根据实际需要进行修饰主要由以下的修饰方式：(1)末端修饰方式(一般在正义链5'端修饰)：荧光基团修饰：FAM，CY3等，修饰目的是便于观察；特殊基团修饰：生物素、氨基、胆固醇、磷酸基、S-S修饰等，其中胆固醇修饰目的是便于进入细胞，其他修饰目的是利用末端基团进行其他实验。(2)碱基修饰方式：2'甲氧修饰、2'氟代修饰、硫代修饰等，修饰目的是增加稳定性。

所述的siRNA以及衍生的修饰物可用于制备预防或治疗HSV-1及与HSV-1病毒感染相关的任何疾病的药物或制剂。最主要的用途包括：制成滴眼液，可用于预防和治疗HSV-1感染引起的眼疾；作为涂抹剂，可用于预防和治疗HSV-1感染引起的***疱疹、生殖器疱疹；作为注射针剂，可预防和治疗HSV-1潜伏感染及复发等。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

(1)本发明克服现有治疗HSV-1感染的药物毒性大、易产生耐药性，易复发等缺陷和问题，并通过一定的科技手段制得针对UL18基因的抗HSV-1所有小干扰RNA分子(siRNA)产品及其修饰物。

(2)本发明提供的治疗或预防HSV-1病毒感染的小干扰RNA分子(siRNA)，靶向明确，效果明显；

(3)本发明所提供的通过siRNA治疗或预防HSV-1病毒感染的新方法是疱疹病毒防治的一种新思路。

附图说明

图1是不同浓度siRNA与lipofectamineRNAiMAX的细胞毒性结果图。

图2是实施例4中总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测的结果图。

图3是Real time PCR熔解曲线的结果图；其中，图3A为内参引物GAPDH和UL18基因检测引物的熔解曲线；图3B为内参引物GAPDH和UL18基因检测引物的熔解峰。

图4是Real-time PCR检测siRNA干扰对UL18基因mRNA的抑制作用的结果图。

图5是流式细胞仪检测UL18-EGFP融合蛋白荧光相对表达强度的结果图。

图6是siRNA干扰UL18基因对HSV-1空斑形成的影响的结果图；其中，图6A是不同实验组形成的空斑；图6B是三种siRNA干扰后各实验组的空斑形成量。

图7是siRNA干扰UL18基因对HSV-1感染细胞后胞内病毒粒子数量的影响的结果图；其中，图7A是HSV-1感染对照组；图7B是阴性对照siN.C对照组；图7C是siRNA182干扰组。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂商所建议的实验条件。

实施例1

本发明针对HSV-1病毒UL18基因核苷酸序列，设计siRNA双链序列，封闭和抑制HSV-1UL18基因的表达，导致HSV-1的核衣壳无法正常组装，从而最终抑制HSV-1增殖和感染，以解决现有HSV-1感染治疗方案中存在的药物毒性大、易产生耐药性，易复发等缺陷和问题；本发明所提供的siRNA双链序列可用于制备预防或治疗HSV-1及与HSV-1病毒感染相关的任何疾病的药物或制剂。该siRNA双链序列通过某种方式进入到生物体内时，可以高效、特异的抑制HSV-1疾病相关衣壳蛋白的表达，使有关基因发生沉默，从而对靶基因的表达进行有效敲除，达到治疗和预防HSV-1及与HSV-1病毒感染相关的疾病的目的。本发明靶向明确，效果显著。

本发明根据HSV-1UL18基因序列(Genebank登录号：AB618031.1)，将UL18基因的编码区序列提交siRNA在线设计网站http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNA；https://www.genscript.com/ssl-bin/app/rnai；http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA-finder.html，根据siRNA设计原则初步设计和筛选潜在的siRNA。将UL18基因序列提交http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST网站，分析基因序列的保守性，选取不同毒株及种属间的共同保守区域作为siRNA的潜在靶位，尽可能选择位于保守区域的潜在siRNA。将所选择的siRNA序列提交http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST网站分析同源性，并用RNA二级结构分析软件RNAdraw1.1和RNAstructure 4.2分析靶序列和所设计的siRNA，避免形成较强的二级结构。

根据以上原则设计了3对靶向HSV-1UL18基因的siRNA(siRNA181、siRNA182、siRNA183)，将设计好的siRNA提交上海吉玛公司合成，同时合成siRNA阴性对照siRNAN.C(不会对任何基因有干扰作用)。

设计合成的3对靶向HSV-1病毒UL18基因的siRNA以及siRNA阴性对照siRNA N.C，其序列如下：

siRNA181：正义链：5'-CUCAACGUGCUGUACUACAAC-3'；

反义链：5'-UGUAGUACAGCACGUUGAGGU-3'；

siRNA182：正义链：5'-CCACCAUCAUCCUUACGCUAA-3'；

反义链：5'-AGCGUAAGGAUGAUGGUGGUU-3'；

siRNA183：正义链：5'-CCCGUUAUACGCUAUCCCUAA-3'；

反义链：5'-AGGGAUAGCGUAUAACGGGGG-3'；

siRNA N.C：正义链：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'；

反义链：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'；

其中，siRNA N.C中的3'端的TT碱基是悬垂序列，是为了增加siRNA在细胞内的稳定性。

本发明中的针对HSV-1病毒UL18基因的siRNA分子，可根据实际需要进行修饰主要由以下的修饰方式：(1)末端修饰方式(一般在正义链5'端修饰)：荧光基团修饰：FAM，CY3等，修饰目的是便于观察；特殊基团修饰：生物素、氨基、胆固醇、磷酸基、S-S修饰等，其中胆固醇修饰目的是便于进入细胞，其他修饰目的是利用末端基团进行其他实验。(2)碱基修饰方式：2'甲氧修饰、2'氟代修饰、硫代修饰等，修饰目的是增加稳定性。

实施例2HSV-1病毒的培养及滴度测定

(1)HSV-1病毒的培养

中方瓶培养Vero细胞(ATCC CCL81，购自ATCC公司)长至细胞50％汇合，弃培养液，PBS缓冲液(0.01M、pH 7.4)洗1～2次。取出-80℃保存HSV-1F株病毒(购自中国科学院武汉病毒研究所)，迅速融解，将200μL的病毒悬液加入培养瓶，于37℃，5％(v/v)CO₂培养箱中吸附2h，期间每隔15min缓慢摇晃数次。加入细胞培养基DMEM(购自life公司)维持液4mL，置37℃，5％CO₂培养箱继续培养。显微镜下观察细胞完全病变后，将细胞冻融三次，冻存管分装病毒培养液，-80℃保存备用。

(2)TCID₅₀测定

Vero细胞调整细胞数1.5×10⁵cells/mL加入96孔细胞培养板进行培养，100μL/孔，37℃，5％CO2培养箱培养过夜，待细胞长成单层，按终点稀释法滴定病毒的TCID₅₀。用维持液10倍系列稀释病毒。接种系列稀释病毒液，每个稀释度设8个复孔，同时设正常细胞对照孔。96孔板置于37℃，5％CO₂培养，逐日观察并记录出现细胞病变的孔数，至细胞病变不再发展时，按Reed-Muench方法计算TCID₅₀。

TCID₅₀＝病变率高于50％组稀释度的对数值+距离比。

结果显示：HSV-1的半数组织感染量(TCID₅₀)为10^-7.5/100μL，即每孔接种100μL滴度为10^-7.5HSV-1，可使50％的细胞发生病变。

实施例3siRNA N.C及转染试剂细胞毒性测定

MTT法测定siRNA N.C及转染试剂对Vero细胞的毒性：①细胞经胰酶消化后，加入96孔培养板中，100μL/孔，细胞密度达到1.5×10⁵cells/mL，24h后弃培养液。②分别将不同浓度(pmol/cm²)的siRNA N.C稀释于25μL OPTI-MEM转染培养液(购自life公司)中，混匀；③另取不同浓度转染试剂LipofectamineRNAiMAX(购自Invitrogen公司)稀释于25μL OPTI-MEM转染培养液，室温孵育5min；④将步骤②与步骤③的转染培养液混合，形成转染混合液，室温孵育20min；共设16个不同浓度剂量组；⑤将预好的96孔细胞培养板，吸弃培养上清，每孔加入50μL转染混合液，轻轻振板混匀，于37℃、5％CO₂培养箱继续培养；⑥转染4h后，吸弃转染混合液，加入细胞生长液(DMEM培养基含10％灭活胎牛血清，购自life公司)，96孔板置于37℃，5％CO₂培养箱培养48h。⑦每孔加入5mg/mL MTT 10μL，继续培养4h，弃MTT液后每孔加入DMSO(二甲基亚砜)100μL，继续培养1h。⑧酶标读数仪比色(波长570nm，参考波长630nm)，测吸光度A值。细胞存活率(％)＝实验组A570/对照组A570×100％(见图1)。

实验结果显示：siRNA N.C和转染试剂在各剂量条件下对细胞存活率都没有显著影响，见表1。

表1不同浓度siRNA N.C和lipofectamineRNAiMAX细胞毒性(x±s，n＝4)

实施例4siRNA对HSV-1病毒的作用

1、细胞内HSV-1病毒mRNA水平检测

(一)细胞样品制备：

(1)Vero细胞生长液(DMEM培养基含10％灭活胎牛血清)将胰酶消化过的Vero细胞稀释为5.0×10⁵cells/mL，2mL/孔植入6孔细胞培养板，置于37℃、5％CO₂培养箱培养至细胞90％汇合；

(2)取100pmol siRNA(见表2)稀释于250μL OPTI-MEM转染培养液中，混匀；

(3)取5μL Lipofectamine RNAiMAX稀释于250μL OPTI-MEM转染培养液，室温孵育5min；

(4)将步骤(2)与步骤(3)的转染培养液混合，形成转染混合液，室温孵育20min；

(5)吸弃6孔板培养上清，每孔加入1000μL OPTI-MEM转染培养液和500μL转染混合液，轻轻振板混匀，于37℃、5％CO₂培养箱继续培养；

(6)转染4h后，吸弃转染混合液，加入HSV-1病毒稀释液(MOI＝1)100μL，37℃、5％CO₂培养箱继续培养，每15min轻轻摇板一次，使病毒充分感染细胞；

(7)病毒感染2h后，吸弃病毒液，加入2mL维持培养液DMEM，37℃、5％CO₂培养箱继续培养；48h后收集细胞抽提总RNA。

表2靶向UL18基因的siRNA序列

(二)细胞总RNA提取：

(1)Trizol试剂(购自Invitrogen公司)，裂解病变细胞：弃培养液，PBS洗一遍，按1mL Trizol/10cm²细胞的比例加1mL Trizol，室温放置5min，使细胞充***解。

(2)吹打细胞，将裂解液转移至DEPC处理过的1.5mL EP管。

(3)按200μL氯仿/mL Trizol的比例加入200μL氯仿，上下剧烈翻转混匀15s，室温放置2～3min。

(4)4℃，不超过12000g(11970g)离心15min。

(5)小小吸取上层水相至另一离心管。

(6)按0.5mL异丙醇/mL Trizol的比例加入500μL异丙醇，混匀，室温放置5～10min。

(7)4℃不超过12000g(11970g)离心10min，吸弃上清，RNA沉于管底。

(8)按1mL 75％乙醇/mL Trizol的比例加入1000μL 75％(v/v)乙醇(-20℃预冷)，小心吹打沉淀。

(9)4℃不超过7500g(7490g)离心5min，尽量弃上清。

(10)室温干燥5～10min(勿过于干燥，沉淀成凝胶状即可)。

(11)加入50μL DEPC水，小心吹打溶解样品。-80℃保存。

(12)取5μL样品，稀释20倍，核酸蛋白分析仪上确定RNA纯度及含量。

将siRNA转染进入细胞后，HSV-1感染，HSV-1感染24h后，抽提RNA。得到的RNA用3μL进行1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA是否降解。电泳显示三条特征性条带，证明提取的RNA未被降解(见图2)，可用于后续试验。

(三)逆转录：

在0.2mL DEPC处理的PCR管中加入以下试剂：

反应条件：25℃，5min；42℃，30min；85℃，5min；0℃，forever。cDNA产物-20℃保存。

(四)Real-time PCR：

△△Ct法检测各组样品中目的基因的相对表达量。每个样品设3个平行孔，同时设不加模板的空白对照。CFX96实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad公司)进行扩增，使用SsoFast^TM Supermix检测。

根据基因测序结果，利用软件Primer Premier 5.0、Oligo6.67设计Real timePCR检测引物，产物大小在200bp左右为好。

(1)UL18Real time PCR检测引物：

UL18Real检测引物上游：5'-TTTCCCGTTCCGCTTCCA-3'；

UL18Real检测引物下游：5'-AGAGGCGACTCCCGTTGTAG-3'；

产物长度145bp。

(2)GAPDH Real time PCR检测引物：

GAPDH Real检测引物上游：5'-CCCACTCCTCCACCTTTGAC-3'；

GAPDH Real检测引物下游：5'-TCTTCCTCTTGTGCTCTTGC-3'；

产物长度182bp。

(3)反应体系：

(4)反应条件：

①95℃for 1min；

②95℃for 5s；

③58℃for 5s+Plate read；

④Go to step②for 39more times；

⑤Melting Curve from 65℃to 95℃，read every 0.2℃，hold 3s+Plate read。

Bio-Rad CFX Manager软件分析结果，计算各样品组目的基因相对表达量。

病毒基因UL18检测引物与GAPDH检测引物分别对cDNA样品进行PCR扩增，SYBR GreenΙ掺入法实时检测反应的产物量。利用Bio-Rad CFX Manager软件检测各样品的CT值并计算相对表达量。

Real time PCR熔解曲线(见图3)，没有出现非特异性扩增。采用比较Ct法计算目的基因的相对表达水平R(见图4)。1-R计算得出siRNA181、siRNA182、siRNA183对UL18基因的沉默效率分别为29.78％、64.15％和78.56％。

2、流式细胞术检测siRNA沉默效率

(1)pUL18-EGFP-N1融合蛋白表达重组质粒制备：HSV-1感染Vero细胞48h后，Trizol法抽提总RNA，逆转录合成cDNA第一链。以cDNA为模板，PCR扩增UL18目的基因。反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收和纯化PCR产物UL18片段。接种含pEGFP-N1质粒的大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α(大肠杆菌DH5α，是市售菌株)，37℃培养过夜。质粒小抽试剂盒(购自OMEGA公司)抽提pEGFP-N1质粒；用PstI和HindIII双酶切PCR产物UL18片段和表达载体pEGFP-N1，37℃水浴反应6h，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收酶切产物。将PCR产物的UL18片段的酶切回收产物和表达载体pEGFP-N1的酶切回收产物于16℃连接16h，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞内，将转化菌液涂板培养过夜，挑取单克隆进行菌液PCR鉴定，菌液PCR鉴定的阳性克隆在进行菌液扩大培养，提取重组质粒，进行双酶切鉴定以及测序鉴定。

鉴定结果显示成功重组的pUL18-EGFP-N1融合蛋白表达重组质粒，进行大批量抽提，抽提的pUL18-EGFP-N1重组质粒测质粒浓度及纯度后，-20℃保存备用。

(2)将siRNA和pUL18-EGFP-N1重组质粒共转染48h后，吸弃培养上清，冷的PBS洗一次，每孔加入200μL胰酶消化细胞；吸弃胰酶，每孔加入600μL冷的PBS吹打细胞，转移至1.5mL EP管，1000r/min离心3min。小心弃上清，600μL冷的PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测每孔细胞平均荧光强度(MFI)和荧光表达平均阳性细胞率a，计算细胞总荧光强度(TFI)，即TFI＝10000×MFI×a(请确认)。与阴性对照siRNA N.C(siN.C)孔细胞相比，定量分析每孔细胞UL18-EGFP荧光相对表达强度(relative fluorescence intensity，RFI)，计算siRNA沉默效率。

流式细胞仪检测结果(图5)，计算细胞总荧光强度。与单转pUL18-EGFP-N1组比较，siRNA N.C阴性对照组荧光强度与其无显著性差异(p>0.05)，siRNA实验组荧光强度与其有显著性差异(p<0.01)(见图5)。与siRNA N.C阴性对照相比，siRNA181、siRNA182、siRNA183对UL18基因的沉默效率分别为80.1％、94.76％和91.83％。

3、空斑减数实验检测siRNA对HSV-1增殖的抑制作用

①细胞生长液将胰酶消化过的Vero细胞稀释为1.8×10⁵cells/mL，1mL/孔植入24孔细胞培养板，置于37℃、5％CO₂培养箱培养至细胞70％汇合；②取20pmolsiRNA稀释于50μL OPTI-MEM转染培养液中，混匀；③取1μLLipofectamineRNAiMAX稀释于50μL OPTI-MEM转染培养液，室温孵育5min；④将步骤②与步骤③的转染培养液混合，形成转染混合液，室温孵育20min；⑤取预好的24孔细胞培养板，吸弃培养上清，每孔加入400μL OPTI-MEM转染培养液和100μL转染混合液，轻轻振板混匀，于37℃、5％CO₂培养箱继续培养；⑥转染4h后，吸弃转染混合液，加入HSV-1病毒稀释液(30PFU/孔)100μL，37℃、5％CO2培养箱继续培养，每15min轻轻摇板一次；⑦病毒感染2h后，吸弃病毒液，冷的PBS溶液洗一遍，加入0.1％(w/w)的羧甲基纤维素覆盖培养液1mL，37℃、5％CO₂培养箱继续培养；⑧病毒感染72h后，吸弃羧甲基纤维素覆盖液，加入10％(v/v)甲醛固定15min；⑨吸弃甲醛液，加入500μL 1％(w/v)结晶紫染色液；染色20min后，自来水缓缓冲洗干净；⑩计数空斑，按照公式计算siRNA的空斑形成抑制率。

空斑结果显示：和病毒对照组相比，针对HSV-1病毒UL18基因的siRNA能有效抑制病毒空斑的形成，空斑数和病毒对照有显著性差异(P<0.01)，而阴性对照siRNA N.C(siN.C)对病毒空斑形成没有影响(P>0.05)(见图6)。siRNA181、siRNA182、siRNA183对HSV-1病毒空斑形成抑制率分别为58.02％、79.39％、79.39％(表3)。

表3siRNA干扰UL18基因对病毒空斑形成的抑制率

V是HSV-1对照，*P>0.05，**P<0.05，***P<0.01，^△表示siRNA N.C阴性对照组与HSV-1对照组比无差异性。

4、siRNA对HSV-1感染细胞后细胞内病毒粒子数量的影响

通过透射电镜观察siRNA作用后HSV-1病毒感染的Vero细胞形态学变化，发现病毒对照组和siRNA N.C(siN.C)阴性对照组细胞表面吸附较多病毒颗粒，细胞核内含有大量病毒衣壳，而siRNA作用组病毒含量明显减少，核内极少病毒颗粒(图7)。

实施例5siRNA的应用

本发明所提供的siRNA双链序列以及衍生的修饰物可用于制备预防或治疗HSV-1及与HSV-1病毒感染相关的疾病的药物或制剂。该siRNA双链序列通过某种方式进入到生物体内后，可以高效、特异的抑制HSV-1疾病相关衣壳蛋白的表达，使有关基因发生沉默，从而对靶基因的表达进行有效敲除，最终达到治疗和预防HSV-1及与HSV-1病毒感染相关的疾病目的。本发明靶向明确，效果明显。

最主要的用途包括：制成滴眼液，可用于预防和治疗HSV-1感染引起的眼疾；作为涂抹剂，可用于预防和治疗HSV-1感染引起的***疱疹、生殖器疱疹；作为注射针剂，可预防和治疗HSV-1潜伏感染及复发等。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.靶向HSV-1病毒UL18基因的siRNA，其特征在于：所述的siRNA为siRNA181、siRNA182或siRNA183中的一种或至少两种：

siRNA181：正义链：5'-CUCAACGUGCUGUACUACAAC-3'；

反义链：5'-UGUAGUACAGCACGUUGAGGU-3'；

siRNA182：正义链：5'-CCACCAUCAUCCUUACGCUAA-3'；

反义链：5'-AGCGUAAGGAUGAUGGUGGUU-3'；

siRNA183：正义链：5'-CCCGUUAUACGCUAUCCCUAA-3'；

反义链：5'-AGGGAUAGCGUAUAACGGGGG-3'。

2.根据权利要求1所述的靶向HSV-1病毒UL18基因的siRNA，其特征在于：将所述的siRNA进行末端修饰或碱基修饰。

3.根据权利要求2所述的靶向HSV-1病毒UL18基因的siRNA，其特征在于：所述的末端修饰为FAM、CY3、生物素、氨基、胆固醇、磷酸基或S-S修饰。

4.根据权利要求2所述的靶向HSV-1病毒UL18基因的siRNA，其特征在于：所述的碱基修饰为2'甲氧修饰、2'氟代修饰或硫代修饰。

5.权利要求1～4任一项所述的靶向HSV-1病毒UL18基因的siRNA在抑制UL18基因表达中的应用。

6.权利要求1～4任一项所述的靶向HSV-1病毒UL18基因的siRNA在制备预防或治疗HSV-1及与HSV-1病毒感染相关疾病的药物或制剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的药物或制剂为滴眼液。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的药物或制剂为涂抹剂。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的药物或制剂为注射针剂。