JP6637652B2

JP6637652B2 - 抗腫瘍剤の選択方法およびその抗腫瘍剤が含有するｓｉＲＮＡ

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Publication number: JP6637652B2
Application number: JP2014237060A
Authority: JP
Inventors: 一之介兵頭; 建嗣大和; 幸和名取
Original assignee: BIOTHINKTANK, CO. LTD.
Current assignee: BIOTHINKTANK, CO. LTD.
Priority date: 2014-11-21
Filing date: 2014-11-21
Publication date: 2020-01-29
Anticipated expiration: 2034-11-21
Also published as: JP2016099252A

Description

本発明は、抗腫瘍剤の選択方法およびその抗腫瘍剤が含有するｓｉＲＮＡに関する。

ＭＤＭ２およびＭＤＭ４は癌遺伝子であって、ＴＰ５３がん抑制遺伝子を抑制的に制御する（非特許文献１参照）。従って、ＭＤＭ２およびＭＤＭ４を人為的に制御することによる、腫瘍細胞の治療方法の開発が期待される。

Wade, M., Li, Y. C., and Wahl, G. M., MDM2, MDMX and p53 in oncogenesis and cancer therapy. Nat Rev Cancer 13：83-96, 2013

しかしながら、どのような場合に、ＭＤＭ２またはＭＤＭ４をどのように制御すれば腫瘍細胞の増殖を制御できるかは明らかではなかった。

本発明は、効率が良く特異性の高い抗腫瘍剤の選択方法およびその抗腫瘍剤が含有するｓｉＲＮＡを提供することを目的とする。

本発明にかかる一実施態様は、腫瘍を治療するための抗腫瘍剤の選択方法であって、採取した腫瘍細胞のＭＤＭ２および／またはＭＤＭ４の発現を調べる工程と、採取した腫瘍細胞においてＭＤＭ４の発現が高い場合、または採取した腫瘍細胞においてＭＤＭ２の発現が低い場合、ＭＤＭ２および／またはＭＤＭ４の発現を抑制する抑制剤を抗腫瘍剤として選択し、採取した腫瘍細胞においてＭＤＭ４の発現が低い場合、または採取した腫瘍細胞においてＭＤＭ２の発現が高い場合、ＭＤＭ２の発現を抑制する抑制剤を抗腫瘍剤として選択する工程と、を含む抗腫瘍剤の選択方法である。前記腫瘍細胞においてＭＤＭ２の発現が高い場合、ＭＤＭ４の発現を抑制しなくてもよい。また、前記腫瘍細胞が、正常に発現制御される野生型ｐ５３を有していることが好ましい。

上記実施態様において、前記ＭＤＭ２を抑制する抑制剤が、以下の配列からなる二重鎖部分を有するｓｉＮＡを含有してもよい。

CAGCCAUCAACUUCUAGUN （配列番号１）
GUCGGUAGUUGAAGAUCAN （配列番号２）

また、前記ＭＤＭ４を抑制する抑制剤が、以下の配列からなる二重鎖部分を有するｓｉＮＡからなる群:

CCCUCUCUAUGAUAUGCUN （配列番号３）
GGGAGAGAUACUAUACGAN （配列番号４）

GGUCAUGCACUAUUUAGGN （配列番号５）
CCAGUACGUGAUAAAUCCN （配列番号６）

GGUGAAGCAACUUUAUGAN （配列番号７）
CCACUUCGUUGAAAUACUN （配列番号８）

CAACUAUACACCUAGAAGN （配列番号９）
GUUGAUAUGUGGAUCUUCN （配列番号１０）

GUGAUGAUACCGAUGUAGN （配列番号１１）
CACUACUAUGGCUACAUCN （配列番号１２）

より選択されるｓｉＮＡを含有してもよい。。

本発明にかかる他の一実施態様は、ＭＤＭ２の発現を抑制するためのｓｉＮＡであって、以下の配列からなる二重鎖部分を有するｓｉＮＡである。

CAGCCAUCAACUUCUAGUN （配列番号１）
GUCGGUAGUUGAAGAUCAN （配列番号２）

本発明にかかるさらなる一実施態様は、ＭＤＭ４の発現を抑制するためのｓｉＮＡであって、以下の配列からなる二重鎖部分を有するｓｉＮＡからなる群:

CCCUCUCUAUGAUAUGCUN （配列番号３）
GGGAGAGAUACUAUACGAN （配列番号４）

GGUCAUGCACUAUUUAGGN （配列番号５）
CCAGUACGUGAUAAAUCCN （配列番号６）

GGUGAAGCAACUUUAUGAN （配列番号７）
CCACUUCGUUGAAAUACUN （配列番号８）

CAACUAUACACCUAGAAGN （配列番号９）
GUUGAUAUGUGGAUCUUCN （配列番号１０）

GUGAUGAUACCGAUGUAGN （配列番号１１）
CACUACUAUGGCUACAUCN （配列番号１２）

より選択されるｓｉＮＡである。

本発明にかかるさらなる一実施態様は、ＭＤＭ２およびＭＤＭ４の発現を同時に抑制するためのｓｉＮＡペアであって、上記ＭＤＭ２の発現を抑制するためのｓｉＮＡと、上記ＭＤＭ４の発現を抑制するためのｓｉＮＡからなるｓｉＲＮＡペアである。特に、下記配列からなるｓｉＮＡペアであることが好ましい。

CAGCCAUCAACUUCUAGUN （配列番号１）
GUCGGUAGUUGAAGAUCAN （配列番号２）

CCCUCUCUAUGAUAUGCUN （配列番号３）
GGGAGAGAUACUAUACGAN （配列番号４）

本発明にかかるさらなる一実施態様は、上記ｓｉＮＡペアを含有する抗腫瘍剤である。

本発明によって、効率が良く特異性の高い抗腫瘍剤の選択方法およびその抗腫瘍剤が含有するｓｉＲＮＡを提供することができるようになった。

本発明の一実施例において、表１に記載の腫瘍細胞株におけるＭＤＭ２とＭＤＭ４の発現を、ウエスタンブロッティングによって調べた結果を示す図である、本発明の一実施例において、表２に示す配列を有するｓｉＲＮＡ及キメラｓｉＮＡを細胞に導入し、ＭＤＭ２の発現及びｐ５３の発現をウエスタンブロッティングで調べた結果を示す図である、本発明の一実施例において、表３に示す配列を有するｓｉＲＮＡ及キメラｓｉＮＡを細胞に導入し、ＭＤＭ４の発現及びｐ５３の発現をウエスタンブロッティングで調べた結果を示す図である、本発明の一実施例において用いたキメラｓｉＮＡの構造を模式的に示した図である。本発明の一実施例において、表１に示した細胞のうち、野生型のｐ５３遺伝子を有している腫瘍細胞株においてＭＤＭ２またはＭＤＭ４の発現を抑制し、それに伴う細胞残存率を測定した結果を示すグラフである。

以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。

実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、M. R. Green & J. Sambrook (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (4th edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2012); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。

なお、本発明の目的、特徴、利点、および、そのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をこれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。

（１）ＭＤＭ２および／またはＭＤＭ４高発現腫瘍細胞の治療
本発明の一実施態様において、腫瘍を治療するための薬剤の選択方法は、採取した腫瘍細胞のＭＤＭ２および／またはＭＤＭ４の発現を調べる工程と、採取した腫瘍細胞においてＭＤＭ４の発現が高い場合、または採取した腫瘍細胞においてＭＤＭ２の発現が低い場合、ＭＤＭ２および／またはＭＤＭ４の発現を抑制する抑制剤を抗腫瘍剤として選択し、採取した腫瘍細胞においてＭＤＭ４の発現が低い場合、または採取した腫瘍細胞においてＭＤＭ２の発現が高い場合、ＭＤＭ２の発現を抑制する抑制剤を抗腫瘍剤として選択する工程とを含む。

この選択方法には、具体的には少なくとも以下のような場合が含まれる。

（１）採取した腫瘍細胞のＭＤＭ２の発現を調べ、採取した腫瘍細胞において採取した腫瘍細胞においてＭＤＭ２の発現が低い場合、ＭＤＭ２および／またはＭＤＭ４の発現を抑制する抑制剤を抗腫瘍剤として選択し、採取した腫瘍細胞においてＭＤＭ２の発現が高い場合、ＭＤＭ２の発現を抑制する抑制剤を抗腫瘍剤として選択する。

（２）採取した腫瘍細胞のＭＤＭ４の発現を調べ、採取した腫瘍細胞においてＭＤＭ４の発現が高い場合、ＭＤＭ２および／またはＭＤＭ４の発現を抑制する抑制剤を抗腫瘍剤として選択し、採取した腫瘍細胞においてＭＤＭ４の発現が低い場合、ＭＤＭ２の発現を抑制する抑制剤を抗腫瘍剤として選択する。

（３）採取した腫瘍細胞のＭＤＭ２およびＭＤＭ４の発現を調べ、採取した腫瘍細胞においてＭＤＭ４の発現が高い場合、ＭＤＭ２および／またはＭＤＭ４の発現を抑制する抑制剤を抗腫瘍剤として選択し、採取した腫瘍細胞においてＭＤＭ２の発現が高い場合、ＭＤＭ２の発現を抑制する抑制剤を抗腫瘍剤として選択する。

（４）採取した腫瘍細胞のＭＤＭ２およびＭＤＭ４の発現を調べ、採取した腫瘍細胞においてＭＤＭ２の発現が低い場合、ＭＤＭ２および／またはＭＤＭ４の発現を抑制する抑制剤を抗腫瘍剤として選択し、採取した腫瘍細胞においてＭＤＭ４の発現が低い場合、ＭＤＭ２の発現を抑制する抑制剤を抗腫瘍剤として選択する。

ここで、高いか低いかは、正常組織における発現を標準レベルとし、標準レベルと比べて判断することとする。この正常組織における発現レベルは、腫瘍細胞が由来する個体とは他の個体の発現レベルであってもよいが、腫瘍細胞と同一個体の発現レベルであることが好ましい。また、腫瘍細胞が由来する組織と異なる組織であってもよいが、腫瘍細胞が由来する組織であることが好ましい。例えば、腫瘍細胞が由来する組織と同じ組織に腫瘍を有しない複数の健常人の当該組織における平均のレベルや、腫瘍細胞が由来する個体において腫瘍細胞が由来する組織のうちの健常な細胞におけるレベルなどが考えられる。

なお、これらの腫瘍において、発現制御が正常に行われる野生型ｐ５３を有することが好ましい。

腫瘍細胞が由来する腫瘍組織は特に限定されないが、固形腫瘍であることが好ましく、乳がん、子宮がん、胃がん、大腸がん、膵がん、肝がん、肺がん、前立腺がん、骨肉腫、メラノーマ、などが例示できる。

ここで、抑制剤は特に限定されないが、アンチセンス核酸、ｓｉＮＡ（すなわち、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＤＮＡ，及びｓｉＲＮＡの一部をＤＮＡに置換したキメラ分子）、ｓｈＮＡ（すなわち、ｓｈＲＮＡ、ｓｈＤＮＡ，及びｓｈＲＮＡの一部をＤＮＡに置換したキメラ分子）、ボナック核酸、核酸アプタマー、デコイ核酸などの核酸医薬であることが好ましく、ｓｉＮＡが特に好ましい。これら核酸配列の決定は、当業者には容易であるが、ｓｉＮＡにおいて、腫瘍抑制効果が高く、オフターゲット作用による腫瘍毒性が少ない点で、好ましい配列を以下に述べる。なお、本明細書において、塩基配列はｓｉＲＮＡの場合で代表させて述べるので、特に明記されていない場合、Ｕ（ウラシル）はＴ（チミン）の意味を含むものとする。実際にｓｉＤＮＡやキメラ分子を用いる場合は、Ｕの代わりにＴに用いるものとする。また、ｓｉＮＡを二重らせんの形で表す、すなわち２列の配列で示す場合、上方の鎖をパッセンジャー鎖、下方の鎖をガイド鎖の配列とし、パッセンジャー鎖は左が５‘端、ガイド鎖は右が５’端とする。

＜腫瘍細胞においてＭＤＭ４の発現が高い場合＞
本発明のｓｉＮＡは、腫瘍細胞においてＭＤＭ４の発現が高い場合における、ＭＤＭ２および／またはＭＤＭ４の発現を抑制するためのｓｉＮＡであって、ＭＤＭ２の発現を抑制するためのｓｉＮＡの二重鎖部分が、
１４８９：
CAGCCAUCAACUUCUAGUN （配列番号１）
GUCGGUAGUUGAAGAUCAN （配列番号２）
であって、
ＭＤＭ４の発現を抑制するためのｓｉＮＡの二重鎖部分が、以下の配列を有するｓｉＮＡからなる群:
４５２：
CCCUCUCUAUGAUAUGCUN （配列番号３）
GGGAGAGAUACUAUACGAN （配列番号４）
３１７：
GGUCAUGCACUAUUUAGGN （配列番号５）
CCAGUACGUGAUAAAUCCN （配列番号６）
３４７：
GGUGAAGCAACUUUAUGAN （配列番号７）
CCACUUCGUUGAAAUACUN （配列番号８）
７８８：
CAACUAUACACCUAGAAGN （配列番号９）
GUUGAUAUGUGGAUCUUCN （配列番号１０）
１０３６：
GUGAUGAUACCGAUGUAGN （配列番号１１）
CACUACUAUGGCUACAUCN （配列番号１２）
より選択される。ＭＤＭ２とＭＤＭ４の発現の一方を抑制する場合、いずれか一方の配列を用いて発現を抑制すればよく、ＭＤＭ２とＭＤＭ４の発現の両方を抑制する場合、両方の配列を用いて発現を抑制すればよい。

ここで、パッセンジャー鎖の３‘端の塩基とガイド鎖の５’端の塩基は標的ｍＲＮＡと塩基対を形成しないことが明らかになっており（Betancur et al., Frontiers in Genetics vol.3, p.1-6, 2012; Ma. J-B et al., Nature vol.434, p.666-670, 2005; Frank F. Nature vol.465, p.818-822, 2010 + supplemental information）、どの塩基であってもｓｉＮＡの発現抑制能は低下しないと考えられるので、特に限定されない。

また、これらのｓｉＮＡは、片側の鎖または両側の鎖の３‘末端にオーバーハングが付加されていてもよく、その配列及びヌクレオチドの個数は限定されないが、配列はｍＲＮＡに相補的な配列、あるいはポリＴであることが好ましく、個数は２個であることが好ましい。

＜腫瘍細胞においてＭＤＭ２の発現が高い場合＞
本発明のｓｉＮＡは、腫瘍細胞においてＭＤＭ２の発現が高い場合における、ＭＤＭ２の発現を抑制するためのｓｉＮＡであって、ＭＤＭ２の発現を抑制するためのｓｉＲＮＡが、
１４８９：
CAGCCAUCAACUUCUAGUN （配列番号１）
GUCGGUAGUUGAAGAUCAN （配列番号２）
である。

この時、ＭＤＭ４の発現を抑制してもよいが、抑制しなくてもかまわない。発現を抑制する場合は、腫瘍細胞においてＭＤＭ４の発現が高い場合に用いられる上記５つの配列から選択してもよい。

（２）医薬への応用
本発明に係る抗腫瘍剤はまた、有効成分である核酸の他、必要に応じて、一般に用いられる各種成分をさらに含み得るものであり、例えば、1種以上の医薬的に許容され得る賦形剤、崩壊剤、希釈剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、懸濁化剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤、コーティング剤などを含み得る。

投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。この場合、疾患、症状などに応じた適当な投与経路を選択する。本発明に係る抗腫瘍剤は、経口経路、非経口経路のいずれによっても投与できる。非経口経路としては、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内などへの投与を挙げることができる。さらに、経粘膜投与または経皮投与を実施することができる。

剤形は、特に限定されず、種々の剤形、例えば、経口投与のためには、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁液、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、エキス剤、エリキシル剤とすることができる。非経口剤としては、例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤などの注射剤；経皮投与または貼付剤、軟膏またはローション；口腔内投与のための舌下剤、口腔貼付剤；ならびに経鼻投与のためのエアゾール剤；坐剤とすることができるが、これらには限定されない。これらの製剤は、製剤工程において通常用いられる公知の方法により製造することができる。また本発明に係る薬剤は、持続性または徐放性剤形であってもよい。

注射剤を調製する場合は、有効成分にpH調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤などを添加し、常法により皮下、筋肉内及び静脈内用注射剤を製造することができる。この場合のpH調節剤及び緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどを挙げることができる。安定化剤としてはピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、チオグリコール酸、チオ乳酸などを挙げることができる。局所麻酔剤としては塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどを挙げることができる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが例示できる。

軟膏剤を調製する場合は、有効成分に通常使用される基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤などが必要に応じて配合され、常法により混合、製剤化される。基剤としては、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィンなどを挙げることができる。保存剤としては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピルなどを挙げることができる。

抗腫瘍剤に含有される有効成分の量は、該有効成分の用量範囲や投薬の回数などにより適宜決定できる。

用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無など）、および担当医師の判断など応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重1kgあたり約0．01μg〜100mg程度、好ましくは約0．1μg1mg程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記投与量は1日1回乃至数回に分けて投与することができる。

（１）腫瘍細胞株におけるＭＤＭ２及びＭＤＭ４の発現とｓｉＲＮＡによる発現抑制
各腫瘍細胞株（表１参照）の細胞抽出液を用いて、ウエスタンブロッティングを行った。

１次抗体として、抗ＭＤＭ２マウスモノクローナル抗体（２Ａ１０）（Abcam社）、抗ＭＤＭ４ウサギポリクローナル抗体（Bethyl Laboratories社）、抗ｐ５３マウスモノクローナル抗体（ＢＰ５３−１２）（Cell Sciences社）、抗ｐ２１マウスモノクローナル抗体（ＤＣＳ６０）（Cell Signaling Technology社）、抗βアクチンマウスモノクローナル抗体（８Ｈ１０Ｄ１０）（Cell Signaling Technology社）を用い、２次抗体は、ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧヒツジ抗体及びＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧロバ抗体（GE Healthcare社）を用いた。ＨＲＰの基質としてECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthare社)を用い、Ez-Capture II Imaging System (アトー株式会社)によって化学発光を検出した。結果を図１に示す。

wtTP53と示したＭＣＦ−７からＡ５４９まで細胞株は野生型のｐ５３遺伝子を有しており、ｐ５３の発現は抑制されている。これらの細胞では、ＭＤＭ２かＭＤＭ４のいずれかが高レベルで発現している。また、mtTP52と示したＫａｔｏＩＩＩからＤＬＤ−１までの細胞株は変異型の不活性なｐ５３遺伝子を有しているため、その発現が検出される細胞株もあるが、いずれもＭＤＭ４が中〜高レベルで発現していた。

これらの細胞でＭＤＭ２またはＭＤＭ４の発現を抑制するため、表２（ＭＤＭ２）及び表３（ＭＤＭ４）に示す配列を有するｓｉＲＮＡ及キメラｓｉＮＡを、Lipofectamine RNAiMAX （Invitrogen社）を用いて細胞に導入（６穴ディッシュの場合、導入前日に０．６〜１．５x１０^５個播種した培養に対し、１ｎＭのｓｉＲＮＡを用い、９６穴ディッシュの場合、導入前日に０．５〜１．５x１０^３個播種した培養に対し、０．２、１．０、５．０ｎＭのｓｉＲＮＡを用いた）し、ＭＤＭ２またはＭＤＭ４の発現及びｐ５３の発現を同様にウエスタンブロッティングで調べた。その結果を図２及び表４（ＭＤＭ２）、図３及び表５（ＭＤＭ４）に示す。図３では、ｐ５３の活性化の指標として、ｐ２１の発現も同時に調べた。なお、表２においては、３４７から１７１３までは公知の配列であり、４８０から７４１４までは新規に設計した配列であり、表３においては、２３５から１６０３までは公知の配列であり、３１７から２２６３までは新規に設計した配列である。コントロールとしては、ｓｉＲＮＡ不添加（Mock）、無関係な配列を有するｓｉＲＮＡ（Naito-1）、ランダムな配列を有するｓｉＲＮＡ（Naito random）を用いた。これらの配列を表６に示す。

また、いくつかの配列に対しては、キメラｓｉＮＡでも同様に実験を行い、表にその結果を示した。キメラｓｉＮＡ（dsRDC）の構造（パッセンジャー鎖は１６から２３番目、ガイド差は１から６番目がＤＮＡで、残りの塩基はＲＮＡ）を図４に示す。

このように、新規配列として、６４３、６９１、８３０、１４８９、２３８１、６０６８は、十分なＭＤＭ２抑制活性を有し、非特異的なｐ５３発現亢進活性は有していない。また、新規配列として、３１７、３４７、４５２、７８８、１０３６は、十分なＭＤＭ４抑制活性を有し、非特異的なｐ５３発現亢進活性は有していない。

（２）腫瘍細胞株に対するＭＤＭ２抑制配列の増殖抑制活性
ＭＤＭ２抑制配列として（１）で選択された配列（６４３、６９１、８３０、１４８９、２３８１、６０６８）を有するｓｉＲＮＡ及びキメラｓｉＮＡについて、ＭＤＭ２抑制によるｐ５３の発現抑制解除を通じた増殖抑制活性を調べた。

具体的には、ＳＪＳＡ−１細胞に対し、１ｎＭの各ｓｉＲＮＡをトランスフェクトして５日間培養し、その後ＷＳＴ−８細胞増殖アッセイを行い、ｓｉＲＮＡを導入していないコントロール細胞の細胞数に対する、ｓｉＲＮＡ導入細胞の細胞数の割合（ここでは細胞残存率と呼ぶ）を調べた。ＭＤＭ２抑制による細胞増殖阻害効果が大きいほど、細胞残存率が小さくなる。表６にその結果を示したが、ここでは、細胞残存率が６０％以下であるものを合格とした。なお、いくつかの配列については、キメラｓｉＮＡ分子を用いて同様に細胞残存率を調べ、増殖阻害率＝１００−細胞残存率とし、表７にその結果を示したが、ここでは、その比が４０％以上であるものを合格とした。

次に、増殖阻害効果がｐ５３の発現抑制解除によるかどうかを調べた。

まず、ＳＪＳＡ-１細胞（ＭＤＭ２高発現骨肉種）を用いて変異型ｐ５３の安定発現細胞を作製した。ヒト変異型ｐ５３株（Ａ１３８Ｖ）は、野生型ヒトｐ５３のコドン１３８のアラニンをバリンに変換したドミナントネガティブ変異体で、野生型ｐ５３の機能を有さず、野生型ｐ５３を拮抗抑制する。（Yamato, K et al., A human temperature-sensitive p53 mutant p53Val-138: modulation of the cell cycle, viability and expression of p53-responsive genesOncogene 11:1-6, 1995）。そのヒトTP53(A138V) cDNAをpCMVneo（Tsutsumi-Ishii Y, et al, Response of heat shock element within the human HSP70 promoter to mutated p53 genes. Cell Growth Differ 6:1-8, 1955）のＢａｍＨＩサイトに導入し、ＴＰ５３（Ａ１３８Ｖ）／ｐＣＭＶｎｅｏを作製した。一方、ＳＪＳＡ-１細胞を１ウエル当り２ｍｌの培地（１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ１６４０）に１×１０^５細胞で播種した。翌日、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）６μｌとＰｌａｓｍｉｄＤＮＡ２μｇをＯｐｔｉ-ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で希釈してそれぞれ２００μｌとした後、両者を混和し、室温で３０分間静置し、その後全量を培養に添加して、トランスフェクションを行った。２４時間後に、細胞をトリプシン処理し、０．９ｍｇ／ｍｌのＧ４１８添加培地に再懸濁し、１ウエル当り培地量１００μｌ、細胞数１００細胞で播種した。その後、３−４日毎に培地を交換し、十分に細胞が増えた所で、残存した複数のクローンについて変異型ｐ５３の発現を調べ、最も高い発現を示したクローン８を選択し、変異型ｐ５３の安定発現細胞株とした。正常のＳＪＳＡ−１細胞と同様にキメラｓｉＮＡ分子を用いて同様に細胞残存率を調べ、増殖阻害率＝１００−細胞残存率とし、表７にその結果を示したが、その比が４０％以上であるものを合格とした。

次に、この変異型ｐ５３導入細胞の細胞残存率に対するＳＪＳＡ−１細胞の細胞残存率の比を調べた。すなわち、ＭＤＭ２に対するｓｉＲＮＡによってＭＤＭ２発現が抑制され、ｐ５３の発現抑制解除が生じても、変異型ｐ５３導入細胞では、変異型ｐ５３がｐ５３に拮抗し、ｓｉＲＮＡの効果が相殺される。従って、ＳＪＳＡ−１細胞において、ＭＤＭ２発現の抑制によって特異的にｐ５３発現抑制が解除され、それによって増殖抑制が生じる場合、変異型ｐ５３導入細胞では増殖抑制が生じないことになる。そこで、変異型ｐ５３導入細胞の細胞残存率に対するＳＪＳＡ−１細胞の細胞残存率の比が、ＳＪＳＡ−１細胞の細胞残存率より大きいと、ｐ５３によるのではない非特異的増殖が生じていることがわかる。こうすることで、オフターゲット効果の低い配列を選択することができた。

このように、配列１４８９が、最も効果的に且つ特異的に、ｐ５３の発現抑制解除を通じて細胞増殖を阻害する。

（３）腫瘍細胞株に対するＭＤＭ４抑制配列の増殖抑制活性
ＭＤＭ４発現抑制配列として（１）で選択された配列（３１７、３４７、４５２、７８８、１０３６）を有するキメラｓｉＮＡについて、ＭＤＭ４発現抑制によるｐ５３の発現抑制解除を通じた増殖抑制活性を調べた。

まず、ＭＣＦ７細胞を用い、キメラｓｉＮＡを導入したときのＭＤＭ４ｍＲＮＡの発現を、以下のようにして、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって調べた。９６穴プレート１ウエル当りＭＣＦ−７細胞を４０００個播種し、翌日キメラｓｉＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸを用いて導入した。４８時間後、RealTime ready Cell Lysis Kit（Ｒｏｃｈｅ社）とTranscriptor universal cDNA Master（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて、ＲＮＡ抽出とｃＤＮＡ合成を行なった。１ウエルから４０μｌのＲＮＡ抽出液を得て、そのうち２μｌのＲＮＡを用いて２０μｌのスケールで逆転写反応を行なった。反応後の逆転反応液から０．８μｌのｃＤＮＡと、１μｌの２０ＸＭＤＭ４プライマー・ＴａｑＭａｎプローブ（アッセイＩＤ：Ｈｓ００９６７２３８、ＡＢＩ社）と０．３μｌ２０Ｘ１８ＳｒＲＮＡプライマー・ＴａｑＭａｎプローブ（アッセイＩＤ：Ｈｓ０３９２８９９０、ＡＢＩ社）、１０μｌ 2x FastStart Universal Probe Master （ＲＯＸ）（Ｒｏｃｈｅ社）、７．９μｌ精製水（合計２０μｌ）を用いて９６穴プレートで、Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR Systemを用いてＭＤＭ４ｃＤＮＡを増幅した。表７に、１８ＳｒＲＡを内部コントロールとして、Naito-I導入細胞に対する相対的ＭＤＭ４ｍＲＮＡ量を示した。

次に、（２）と同様にしてＷＳＴ８による細胞残存率の解析を行い、Naito-Iを用いたときの細胞残存数を１００％としたときの細胞残存率を算出した。そして、本実施例では、得られた細胞残存率をＭＤＭ４発現抑制効果と比較した。ＭＤＭ４発現抑制効果に対して、細胞残存率があまりに小さいものは非特異的細胞致死が生じていると考えられるが、細胞残存率が６０％以下で、且つ、細胞残存率／ＭＤＭ４ｍＲＮＡ発現が６０％以上を合格としたとき、これら５つの配列については、すべて合格になった。このように、これら５つの配列は、オフターゲット効果が低いと考えられる。比較例（配列８６１及び１６０３）とともに、その結果を表９に示す。

このように、配列３１７、３４７、４５２、７８８、１０３６は、最も効果的に且つ特異的に、ＭＤＭ４発現抑制を通じて細胞増殖を阻害する。

（４）腫瘍細胞に対するＭＤＭ２またはＭＤＭ４発現抑制の細胞増殖に対する効果
表１に示した細胞のうち、野生型のｐ５３遺伝子を有しているＭＣＦ−７からＣ３２ＴＧまでの細胞株について、ＭＤＭ２またはＭＤＭ４の発現を抑制し、それに伴う細胞残存率を測定した。具体的な実験方法は（２）（３）と同様にし、コントロールの配列（siNaito-1）の細胞残存率を１００％としたときの相対的な細胞残存率を算出した。なお、発現抑制にはキメラｓｉＮＡ分子を用い、ＭＤＭ２については配列１０６８及び１４８９、ＭＤＭ４については配列４５２及び１０３６を用いた。その結果を図５に示す。

ＭＤＭ４の発現が高いＭＣＦ−７からＡ５４９までの腫瘍細胞において、ＭＤＭ２およびＭＤＭ４のいずれの発現を抑制した場合も効率よく細胞増殖が抑制された。一方、ＭＤＭ２の発現が高いＳＪＳＡ−１からＣ３２ＴＧまでの腫瘍細胞においては、ＭＤＭ２の発現を抑制した場合に効率よく細胞増殖が抑制されたが、ＭＤＭ４の発現を抑制した場合には、それほど細胞増殖が抑制されなかった。このことから、腫瘍細胞が発現している遺伝子によって、抑制する遺伝子を決定するのが、治療法として効果であることがわかる。すなわち採取した腫瘍細胞のＭＤＭ２およびＭＤＭ４の発現を調べ、腫瘍細胞においてＭＤＭ４の発現が高い場合、ＭＤＭ２および／またはＭＤＭ４の発現を抑制し、ＭＤＭ２の発現が高い場合、ＭＤＭ２の発現を抑制するのが好ましく、後者の場合、ＭＤＭ４の発現を抑制しても、配列によっては全く効果がない訳ではないが、それほど効果的ではない。

Claims

腫瘍を有する患者を治療するための抗腫瘍剤の選択方法であって、
前記患者から採取した腫瘍細胞のＭＤＭ４の発現を調べる工程と、
前記採取した腫瘍細胞においてＭＤＭ４の発現が高い場合、ＭＤＭ２の発現を抑制する抑制剤を抗腫瘍剤として選択する工程と、
を含む抗腫瘍剤の選択方法。
前記腫瘍細胞が、正常に発現制御される野生型ｐ５３を有している、請求項１に記載の抗腫瘍剤の選択方法。
前記ＭＤＭ２を抑制する抑制剤が、以下の配列からなる二重鎖部分を有するｓｉＮＡを含有する、請求項１または２に記載の抗腫瘍剤の選択方法。

CAGCCAUCAACUUCUAGUN （配列番号１）
GUCGGUAGUUGAAGAUCAN （配列番号２）
ＭＤＭ２の発現を抑制するためのｓｉＮＡであって、以下の配列からなる二重鎖部分を有するｓｉＮＡ。

CAGCCAUCAACUUCUAGUN （配列番号１）
GUCGGUAGUUGAAGAUCAN （配列番号２）
ＭＤＭ４の発現を抑制するためのｓｉＮＡであって、以下の配列からなる二重鎖部分を有するｓｉＮＡからなる群:

CCCUCUCUAUGAUAUGCUN （配列番号３）
GGGAGAGAUACUAUACGAN （配列番号４）

GGUCAUGCACUAUUUAGGN （配列番号５）
CCAGUACGUGAUAAAUCCN （配列番号６）

GGUGAAGCAACUUUAUGAN （配列番号７）
CCACUUCGUUGAAAUACUN （配列番号８）

CAACUAUACACCUAGAAGN （配列番号９）
GUUGAUAUGUGGAUCUUCN （配列番号１０）

GUGAUGAUACCGAUGUAGN （配列番号１１）
CACUACUAUGGCUACAUCN （配列番号１２）

より選択されるｓｉＮＡ。
ＭＤＭ２およびＭＤＭ４の発現を同時に抑制するためのｓｉＮＡペアであって、
ＭＤＭ２の発現を抑制するためのｓｉＮＡが、請求項４に記載のｓｉＮＡであって、
ＭＤＭ４の発現を抑制するためのｓｉＮＡが、請求項５に記載のｓｉＮＡであるｓｉＲＮＡペア。
下記配列からなる、請求項６に記載のｓｉＮＡペア。

CAGCCAUCAACUUCUAGUN （配列番号１）
GUCGGUAGUUGAAGAUCAN （配列番号２）

CCCUCUCUAUGAUAUGCUN （配列番号３）
GGGAGAGAUACUAUACGAN （配列番号４）
請求項６または７に記載のｓｉＮＡペアを含有する抗腫瘍剤。
ＭＤＭ４の発現が高い腫瘍細胞に対する抗腫瘍剤であって、ＭＤＭ２の発現抑制剤を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
前記ＭＤＭ２の発現抑制剤が、請求項４に記載のｓｉＮＡを含有する、請求項９に記載の抗腫瘍剤。