ES2837763T3

ES2837763T3 - Cultivo de células madre embrionarias humanas en la interconexión aire-líquido para la diferenciación en células endocrinas pancreáticas

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Publication number: ES2837763T3
Application number: ES13869259T
Authority: ES
Inventors: Alireza Rezania
Original assignee: Janssen Biotech Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2012-12-31
Filing date: 2013-12-18
Publication date: 2021-07-01
Anticipated expiration: 2033-12-18
Also published as: RU2018116648A; CA2896655C; HK1217110A1; AU2021245259A1; AU2013368221A1; RU2018116648A3; RU2768963C2; AR094347A1; EP2938724B1; JP6557146B2; US20140186305A1; EP2938724A4; RU2018116647A; EP2938724A1; SG10201709338RA; WO2014105543A1; RU2658488C2; PH12015501465A1; AU2021245259B2; AU2018279009A1

Abstract

Un método para producir células humanas que expresan marcadores característicos de las células endocrinas pancreáticas que comprende diferenciar las células humanas que expresan marcadores característicos de las células del endodermo pancreáticas en células humanas que expresan marcadores característicos de las células endocrinas pancreáticas mediante tratamiento con al menos un medio suplementado con un inhibidor de ALK5 o un inhibidor de ALK5 y una hormona tiroidea seleccionada de triyodotironina, tiroxina, GC-1, ácido 3,5-diyodotiropropiónico, KB-141, MB07344, T0681 y GC-24 y mezclas de los mismos, mientras se cultivan en la interconexión aire-líquido.

Description

DESCRIPCIÓN

Cultivo de células madre embrionarias humanas en la interconexión aire-líquido para la diferenciación en células endocrinas pancreáticas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención es en el campo de la diferenciación celular. Más específicamente, la presente invención proporciona métodos, cultivos celulares y medios para generar endodermo pancreático, células precursoras endocrinas pancreáticas y células endocrinas pancreáticas monohormonales a partir de células madre pluripotentes humanas cultivando células en la interconexión aire-líquido.

ANTECEDENTES

[0002] Los avances en la terapia de reemplazo celular de diabetes mellitus tipo I y la escasez de islotes trasplantables de Langerhans tienen interés centrado en el desarrollo de fuentes de células productoras de insulina, o células beta ((3), apropiadas para el injerto. Un enfoque es la generación de funcionales células p a partir de células madre pluripotentes, tales como, células madre embrionarias.

[0003] En el desarrollo embrionario vertebrado, una célula pluripotente da lugar a un grupo de células que comprenden tres capas germinales (ectodermo, mesodermo y endodermo) en un proceso conocido como gastrulación. Los tejidos como la tiroides, el timo, el páncreas, el intestino y el hígado, se desarrollarán a partir del endodermo, a través de una etapa intermedia. La etapa intermedia en este proceso es la formación del endodermo definitivo.

[0004] Al final de gastrulación, el endodermo se divide en dominios anteroposteriores que pueden reconocerse mediante la expresión de un panel de factores que marcan de forma única las regiones anterior, media y posterior del endodermo. Por ejemplo, HHEX y SOX2 identifican la región anterior, mientras que CDX1, 2 y 4 identifican la región posterior del endodermo.

[0005] La migración del tejido endodermo acerca al endodermo en estrecha proximidad con diferentes tejidos mesodérmicos que ayudan a la regionalización del tubo intestinal. Esto se logra mediante una plétora de factores secretados, como FGF, WNTS, TGF-p, ácido retinoico (RA) y ligandos de BMP y sus antagonistas. Por ejemplo, FGF4 y BMP promueven la expresión de CDX2 en el presunto endodermo del intestino posterior y reprimen la expresión de los genes anteriores Hhex y SOX2 (2000 Development, 127: 1563-1567). También se ha demostrado que la señalización de WNT funciona en paralelo con la señalización de FGF para promover el desarrollo del intestino posterior e inhibir el destino del tracto digestivo superior (2007 Development, 134: 2207-2217). Por último, el ácido retinoico secretado por el mesénquima regula el límite entre el tracto digestivo superior y el intestino posterior (2002 Curr Biol, 12: 1215-1220).

[0006] El nivel de expresión de factores de transcripción específicos pueden usarse para designar la identidad de un tejido. Durante la transformación del endodermo definitivo en un tubo intestinal primitivo, el tubo intestinal se regionaliza en amplios dominios que pueden observarse a nivel molecular mediante patrones de expresión génica restringidos. El dominio del páncreas regionalizado en el tubo intestinal muestra una expresión muy alta de PDX1 y una expresión muy baja de CDX2 y SOX2. PDX1, NKX6.1, PTF1A y NKX2.2 se expresan en gran medida en el tejido pancreático; y la expresión de CDX2 es alta en el tejido intestinal.

[0007] La formación del páncreas surge de la diferenciación del endodermo definitivo en endodermo pancreático. Los dominios pancreáticos dorsal y ventral surgen del epitelio del tracto digestivo superior. El tracto digestivo superior también da origen al esófago, la tráquea, los pulmones, la tiroides, el estómago, el hígado y los conductos biliares.

[0008] Las células del endodermo pancreáticas expresan la gen homeobox pancreático-duodenal PDX1. En ausencia de PDX1, el páncreas no se desarrolla más allá de la formación de yemas ventrales y dorsales. Por tanto, la expresión de PDX1 marca un paso crítico en la organogénesis pancreática. El páncreas maduro contiene tejidos tanto exocrinos como endocrinos que surgen de la diferenciación del endodermo pancreático.

[0009] D'Amour et al. describen la producción de cultivos enriquecidos de endodermo definitivo derivado de células madre embrionarias humanas en presencia de una concentración alta de activina y suero bajo (Nature Biotechnology 2005, 23: 1534-1541; Patente de Estados Unidos N° 7.704.738). El trasplante de estas células debajo de la cápsula renal de ratones supuestamente dio como resultado la diferenciación en células más maduras con características de tejido endodérmico (Patente de Estados Unidos N° 7.704.738). Las células endodérmicas definitivas derivadas de células madre embrionarias humanas pueden diferenciarse adicionalmente en células positivas para PDX1 después de la adición de FGF10 y ácido retinoico (publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2005/0266554). El trasplante posterior de estas células precursoras pancreáticas en la almohadilla de grasa de ratones inmunodeficientes dio como resultado la formación de células endocrinas pancreáticas funcionales después de una fase de maduración de 3-4 meses (patente de EE.UU. n° 7.993.920 y patente de EE.UU. n° 7.534.608).

[0010] Fisk et al. informan de un sistema para producir células de los islotes pancreáticos a partir de células madre embrionarias humanas (Patente de Estados Unidos N° 7.033.831). En este caso, la vía de diferenciación se dividió en tres etapas. Las células madre embrionarias humanas se diferenciaron primero en endodermo usando una combinación de butirato de sodio y activina A (Patente de Estados Unidos N° 7.326.572). A continuación, las células se cultivaron con antagonistas de BMP, como Noggin, en combinación con EGF o betacelulina para generar células positivas para PDX1. La diferenciación terminal fue inducida por nicotinamida.

[0011] Inhibidores de moléculas pequeñas también se han utilizado para la inducción de células precursoras endocrinas pancreáticas. Por ejemplo, se han utilizado inhibidores de molécula pequeña del receptor de TGF-p y de los receptores de BMP (Development 2011, 138: 861-871; Diabetes 2011, 60: 239-247) para mejorar significativamente el número de células endocrinas pancreáticas. Además, también se han utilizado activadores de moléculas pequeñas para generar células endodérmicas definitivas o células precursoras pancreáticas (Curr Opin Cell Biol 2009, 21: 727-732; Nature Chem Biol 2009, 5: 258-265).

[0012] HB9 (también conocido como HLXB9 y MNX1) es una proteína activadora transcripcional BHLH expresada temprano en el desarrollo del páncreas empezando aproximadamente en el día embrionario 8. HB9 es también expresado en notocorda y médula espinal. La expresión de HB9 es transitoria y alcanza su punto máximo alrededor del día 10,5 en el epitelio pancreático que se expresa en células que expresan PDX1 y NKX6.1. Aproximadamente en el día 12.5, la expresión de HB9 disminuye y en etapas posteriores se restringe solo a las células p . En ratones homocigotos para una mutación nula de HB9, el lóbulo dorsal del páncreas no se desarrolla (Nat Genet 23: 67-70, 1999; Nat Genet 23: 71-75, 1999). Las células p HB9-/- expresan niveles bajos del transportador de glucosa, GLUT2 y NKX6.1. Además, el páncreas HB9-/- muestra una reducción significativa en el número de células positivas para insulina sin afectar significativamente la expresión de otras hormonas pancreáticas. Por tanto, el control temporal de HB9 es esencial para el desarrollo y la función normales de las células p. Si bien no se sabe mucho sobre los factores que regulan la expresión de HB9 en células p, un estudio reciente en pez cebra sugiere que el ácido retinoico puede regular positivamente la expresión de HB9 (Development, 138, 4597-4608, 2011).

[0013] Las hormonas de la tiroides, tiroxina ("T4") y triyodotironina ("T3"), son las hormonas basadas en tirosina producidas por la glándula tiroides y son principalmente responsables de la regulación del metabolismo. La forma principal de hormona tiroidea en la sangre es T4, que tiene una vida media más larga que la T3. La proporción de T4 a T3 liberada en la sangre es aproximadamente de 20 a 1. La T4 se convierte en la T3 más activa (de tres a cuatro veces más potente que la T4) dentro de las células por la desyodasa.

[0014] La T3 se une a los receptores de hormonas tiroideas, TRal y TPp1 (TR). TR es un receptor de hormonas nucleares, que se heterodimeriza con el receptor X de retinoides. Los dímeros se unen a los elementos de respuesta tiroidea (TRE) en ausencia de ligando y actúan como represores de la transcripción. La unión de T3 a TR reduce la represión de genes dependientes de TRE e induce la expresión de varios genes diana. Si bien numerosos estudios han sugerido un papel de la T3 en el aumento de la proliferación de células p, la reducción de la apoptosis y la mejora de la secreción de insulina, su papel en la diferenciación celular no está definido.

[0015] El factor de crecimiento transformante p ("TGF-p”) es un miembro de una gran familia de citocinas pleiotrópicas que están implicadas en muchos procesos biológicos, que incluyen control del crecimiento, diferenciación, migración, supervivencia celular, fibrosis y especificación del destino del desarrollo. Miembros de la superfamilia TGF-p de la señal a través de un receptor complejo que comprende un receptor de tipo II y de tipo I. Los ligandos de TGF-B (como las activinas y los factores de diferenciación del crecimiento ("GDF")) unen un receptor de tipo II con un receptor de tipo I. El receptor de tipo II fosforila y activa el receptor de tipo I en el complejo. Hay cinco receptores de tipo II de mamíferos: TpR-II, ActR-II, ActR-IIB, BMPR-II y a Mh R-II y siete receptores de tipo I (ALK 1-7). La activina y los ligandos relacionados emiten señales mediante combinaciones de ActR-II o ActR-IIB y ALK4 o ALK5, y las BMP emiten señales mediante combinaciones de ALK2, ALK3 y ALK6 con ActR-II, ActR-IIB o BMPR-II. La AMH envía señales a través de un complejo de AMHR-II con ALK6, y se ha demostrado que el nodo señaliza a través de un complejo de ActR-IIB y ALK7 (Cell. 2003, 113 (6): 685-700). Después de la unión del ligando de TGF-B al receptor apropiado, las señales resultantes se transducen al núcleo principalmente a través de la activación de complejos de Smads. Tras la activación, los receptores de tipo I fosforilan a los miembros de la subfamilia de Smads regulada por receptores. Esto los activa y les permite formar complejos con un mediador común Smad, Smad4. Los Smads 1, 5 y 8 son sustratos para las ALK 1, 2, 3 y 6, mientras que los Smads 2 y 3 son sustratos para las ALK 4, 5 y 7 (FASEB J 13: 2105-2124). Los complejos de Smad activados se acumulan en el núcleo, donde están directamente involucrados en la transcripción de genes diana, generalmente en asociación con otros factores de transcripción específicos de unión al ADN. Los compuestos que inhiben selectivamente los receptores de TGF-p se han desarrollado para aplicaciones terapéuticas y para modular el destino celular en el contexto de la reprogramación y diferenciación de diversas poblaciones de células madre. En particular, los inhibidores de ALK5 se han utilizado previamente para dirigir la diferenciación de células madre embrionarias a un destino endocrino (Diabetes, 2011, 60 (1): 239-47).

[0016] En general, el proceso de diferenciación de las células progenitoras a células beta funcionales pasa a través de varias etapas; y se han logrado grandes avances en la mejora de los protocolos para generar células pancreáticas a partir de células progenitoras, como las células madre pluripotentes humanas. A pesar de estos avances en la investigación, cada paso en el proceso de diferenciación de las células progenitoras presenta un desafío único. Como tal, todavía existe la necesidad de un protocolo que dé como resultado células endocrinas funcionales y, en particular, células p funcionales.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0017]

FIGS. 1A a 1H muestran imágenes de contraste de fase de células cultivadas en la interconexión aire-líquido usando los métodos descritos en el Ejemplo 1 en los siguientes puntos de tiempo: Día 1 (FIG. 1A); Día 5 (FIG. 1B); Día 6 (FIG. 1C); Día 7 (FIG. 1D); Día 9 (FIG. 1E); Día 13 (FIG. 1F); Día 16 (FIG. 1G); y el día 21 (FIG. 1H).

FIGS. 2A a 2K muestran imágenes de células diferenciadas durante una semana en la interconexión airelíquido usando los métodos descritos en el Ejemplo 1 e inmunoteñidas para lo siguiente: DAPI (FIG. 2A); insulina (FIG. 2B); HB9 (FIG. 2C); DAPI (FIG. 2D); glucagón (FIG. 2E); insulina (FIG. 2F); DAPI (FIG. 2G); insulina (FIG. 2H); somatostatina (FIG. 2I); NKX6.1 (FIG. 2J); e insulina (FIG. 2K). Los paneles AC, DF, GI y JK se tomaron del mismo campo.

FIGS. 3A a 3H muestran imágenes de células diferenciadas durante dos semanas en la interconexión airelíquido usando los métodos descritos en el Ejemplo 1 e inmunoteñidas para lo siguiente: insulina (FIG. 3A); glucagón (FIG. 3B); insulina (FIG. 3C); somatostatina (FIG. 3D); insulina (FIG. 3E); NKX6.1 (FIG. 3F); HB9 (FIG. 3G); y NKX6.1 (FIG. 2H). Los paneles A-B, C-D, E-F y G-H se tomaron del mismo campo.

FIGS. 4A a 4D muestran imágenes de células diferenciadas durante tres semanas en la interconexión airelíquido usando los métodos descritos en el Ejemplo 1 y teñidas inmunológicamente para insulina (FIG. 4A), glucagón (FIG. 4B), insulina (FIG. 4C) y somatostatina (FIG. 4D). Los paneles A-B y C-D se tomaron del mismo campo.

FIGS. 5A a 5R representan datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas como se describe en el Ejemplo 1: PDX1 (FIG. 5A); NKX6.1 (FIG. 5B); PAX4 (FIG. 5C); PAX6 (FIG. 5D); NGN3 (FIG. 5E); NKX2.2 (FIG. 5F); ABCC8 (FIG. 5G); cromogranina-A (FIG. 5H); PCSK1 (FIG. 5I); IAPP (FIG. 5J); insulina (FIG. 5K); glucagón (FIG. 5L); somatostatina (FIG. 5M); grelina (FIG. 5N); PTFlA (FIG. 5O); ZIC1 (FIG. 5P); CDX2 (FIG.

5Q); y SOX9 (FIG. 5R). Las células se cultivaron en la interconexión aire-líquido después de la Paso 5. Las FIGS. 6A a 6L representan datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas como se describe en el Ejemplo 2: PDX1 (FIG. 6A); NKX6.1 (FIG. 6B); PAX4 (FIG. 6C); PAX6 (FIG. 6D); NGN3 (FIG. 6E); NKX2.2 (FIG. 6F); ABCC8 (FIG. 6G); cromogranina-A (FIG. 6H); PCSK1 (FIG. 6I); IAPP (FIG. 6J); insulina (FIG. 6K); y glucagón (FIG. 6L).

FIGS. 7A a 7L representan datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas como se describe en el Ejemplo 3: PDX1 (FIG. 7A); NKX6.1 (FIG. 7B); PAX4 (FIG. 7C); PAX6 (FIG. 7D); NGN3 (FIG. 7E); NKX2.2 (FIG. 7F); ABCC8 (FIG. 7G); cromogranina-A (FIG. 7H); PCSK1 (FIG. 7I); IAPP (FIG. 7J); insulina (FIG. 7K); y glucagón (FIG. 7L).

FIGS. 8A a 8H representan datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas como se describe en el Ejemplo 4: PDX1 (FIG. 8A); NKX6.1 (FIG. 8B); NGN3 (FIG. 8C); ABCC8 (FIG. 8D); PCSK1 (FIG. 8E); grelina (FIG. 8F); glucagón (FIG. 8G); e insulina (FIG. 8H).

FIGS. 9A a 9F representan datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas como se describe en el Ejemplo 4: PDX1 (FIG. 9A); NKX6.1 (FIG. 9B); NGN3 (FIG. 9C); ABCC8 (FIG. 9D); glucagón (FIG. 9E); e insulina (FIG. 9F).

FIGS. 10A a 10B representan los resultados de inmunotinción de células del Paso 6 cultivadas en la interconexión aire-líquido de acuerdo con el Ejemplo 4 y tratadas con un inhibidor de SD208 micromolar (FIG.

10A) o con un inhibidor II de ALK5 micromolar II (FIG. 10B) y teñido para cromogranina-A (marcador panendocrino) y NKX6.1 (marcador precursor pancreático y marcador específico de células p).

FIGS. 11A a 11H muestran datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas como se describe en el Ejemplo 6: ABCC8 (FIG. 11A); glucagón (FIG. 11B); amilina (FIG. 11C); insulina (FIG. 11D); NGN3 (FIG.

11E); NKX2.2 (FIG. 11F); NKX6.1 (FIG. 11G); y PDX1 (FIG. 11H). Los datos se muestran como un aumento de veces frente a la línea H1 indiferenciada.

FIGS. 12A a 12H representan datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas como se describe en el Ejemplo 7 y cultivadas en el ALI: ABCC8 (FIG. 12A); glucagón (FIG. 12B); amilina (FIG. 12C); insulina (FIG.

12D); NGN3 (FIG. 12E); NKX2.2 (FIG. 12F); NKX6.1 (FIG. 12G); y PDX1 (FIG. 12H).

FIGS. 13A a 13H representan datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas como se describe en el Ejemplo 8 y cultivadas en el ALI: ABCC8 (FIG. 13A); glucagón (FIG. 13B); amilina (FIG. 13C); insulina (FIG.

13D); NGN3 (FIG. 13E); NKX2.2 (FIG. 13F); NKX6.1 (FIG. 13G); y PDX1 (FIG. 13H).

FIGS. 14A a 14H representan datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas como se describe en el Ejemplo 9 y cultivadas en el ALI: ABCC8 (FIG. 14A); glucagón (FIG. 14B); amilina (FIG. 14C); insulina (FIG.

14D); ISL-1 (FIG. 14E); MNX1 (FIG. 14F); NKX6.1 (FIG. 14G); y SLC30A8 (FIG. 14H).

FIGS. 15A a 15J muestran el perfil FACS de las células del día 3 del Paso 5, diferenciadas según el ejemplo 10, y teñidas para: control de isotipo (FIG. 15A); NKX6.1 (FIG. 15B); NKX2.2 (FIG. 15C); NKX6.1 (eje Y) teñido conjuntamente con insulina (Xaxis) (FIG. 15D); PDX1 (eje X) teñido conjuntamente con KI-67 (eje Y) (FIG. 15E); PAX6 (FIG. 15F); ISL-1 (FIG. 15G); FOXA2 (FIG. 15H); NeuroD (FIG. 15I); y glucagón (eje Y) teñido conjuntamente con insulina (eje X) (FIG. 15J).

FIGS. 16A a 16I muestran el perfil FACS de las células del día 5 del paso 6, diferenciadas según el ejemplo 10 y teñidas para: control de isotipo (FIG. 16A); NKX6.1 (eje Y) teñido conjuntamente con cromogranina-A (eje X) (FIG. 16B); NKX2.2 (eje Y) teñido conjuntamente con cromogranina-A (eje X) (FIG. 16C); NKX6.1 (eje Y) teñido conjuntamente con insulina (eje X) (FIG. 16D); PDX1 (eje X) teñido conjuntamente con KI-67 (eje Y) (FIG. 16E); PAX6 (FIG. 16F), ISL-1 (FIG. 16G); FOXA2 (FIG. 16H); y NeuroD (FIG. 16I).

FIGS. 17A a 17I muestran el perfil FACS (clasificación de células activadas por fluorescencia) de las células del paso 6 el día 15, diferenciadas según el ejemplo 10 y teñidas para: control de isotipo (FIG. 17A); NKX6.1 (eje Y) teñido conjuntamente con cromogranina-A (eje X) (FIG. 17B); NKX2.2 (eje Y) teñido conjuntamente con cromogranina-A (eje X) (FIG. 17C); glucagón (eje Y) combinado con insulina (eje X) (FIG. 17D); NKX6.1 (eje Y) teñido conjuntamente con insulina (eje X) (FIG. 17E); PDX1 (eje X) teñido conjuntamente con KI-67 (eje Y) (FIG. 17F); ISL-1 (FIG. 17G); FOXA2 (FIG. 17H); y NeuroD (FIG. 17I).

FIGS. 18A a 18C muestran el perfil FACS (clasificación de células activadas por fluorescencia) de las células del paso 4 del día 4, diferenciadas según el ejemplo 1 y teñidas para: NKX6.1 (eje Y) teñido conjuntamente con cromogranina-A (eje X) (FIG. 18A); PDX1 (eje X) teñido conjuntamente con KI-67 (eje Y) (FIG. 18B); y NKX6.1 (eje Y) teñido conjuntamente con insulina (eje X) (FIG. 18C).

FIGS. 19A a 19C muestran el perfil FACS (clasificación de células activadas por fluorescencia) de las células del día 6 del paso 6, diferenciadas de acuerdo con el ejemplo 11 y teñidas para: NKX6.1 (eje Y) teñido conjuntamente con cromogranina-A (X- eje) (FIG. 19A); PDX1 (eje X) teñido conjuntamente con KI-67 (eje Y) (FiG. 19B); y NKX6.1 (eje Y) teñido conjuntamente con insulina (eje X) (FIG. 19C).

FIG. 20 muestra la cinética in vivo de la producción de péptido C humano en ratones NOD-SCID trasplantados con diversas poblaciones de células como se describe en el Ejemplo 11.

FIGS. 21A a 21F representan datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas como se describe en el Ejemplo 12: Amilina (FIG. 21A); insulina (FIG. 21B); MAFA (FIG. 21C); NKX6.1 (FIG. 21D); PTF1a (FIG. 21E); y SOX9 (FIG. 21F).

FIGS. 22A a 22D muestran datos de PCR en tiempo real de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas como se describe en el Ejemplo 13: MAFA (FIG. 22A); insulina (FIG. 22B); Amilina (FIG. 22C); y NKX6.1 (FIG. 22D).

FIGS. 23A a 23F representan datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea HI de células madre embrionarias humanas diferenciadas como se describe en el Ejemplo 5: PDX1 (FIG. 23A); NKX6.1 (FIG. 23B); NGN3 (FIG. 23C); ABCC8 (FIG. 23D); glucagón (FIG. 23E); e insulina (FIG. 23f ).

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0018] La invención proporciona un método de producción de células humanas que expresan marcadores característicos de las células endocrinas pancreáticas que comprenden la diferenciación de células humanas que expresan marcadores característicos de las células del endodermo pancreáticas en células humanas que expresan marcadores característicos de células endocrinas pancreáticas mediante tratamiento con al menos un medio suplementado con un inhibidor de ALK5, o un inhibidor de ALK5 y una hormona tiroidea seleccionada de triiodorirronina, tiroxina, GC-1, ácido 3,5-diyodotiropropiónico, KB-141, MB07344, T0681 y GC-24 y mezclas de los mismos, mientras se cultiva en la interconexión aire-líquido.

[0019] La invención proporciona además un medio útil para la diferenciación de células precursoras endocrinas pancreáticas en células que expresan marcadores característicos de células endocrinas pancreáticas, en donde el medio es: un medio para el crecimiento suplementado con 0,25 pM SANT-1, 50 nM RA, 0,025 mM ácido ascórbico; Inhibidor de ALK5500 nM 2-(5-cloro-2-fluorofenilo)pteridina-4-il]piridina-4-ilo-amina (SD208) y T30,1 nM.

[0020] La invención proporciona además un cultivo celular in vitro que comprende una población de células humanas diferenciadas que expresan marcadores característicos de células endocrinas pancreáticas que al menos el treinta por ciento de dichas células diferenciadas son células positivas de insulina monohormonal que expresan Nkx6.1, y en donde la población se obtiene mediante un método de la invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0021] La siguiente descripción detallada de la invención se entenderá mejor cuando se lea en conjunción con las figuras adjuntas. Las figuras se proporcionan con el fin de ilustrar determinadas realizaciones de la presente invención. Sin embargo, la invención no se limita a las disposiciones precisas, los ejemplos y los instrumentos mostrados. Para mayor claridad de la divulgación, y no a modo de limitación, la descripción detallada de la invención se divide en subsecciones que describen o ilustran ciertas características, realizaciones o aplicaciones de la presente invención.

[0022] La presente invención se refiere a la diferenciación de células progenitoras del endodermo, tales como células madre pluripotentes, en células que presentan características de células endocrinas pancreáticas mediante el cultivo de dichas células progenitoras, al menos en parte, en la interconexión aire-líquido que existe en un recipiente de cultivo abierto o un recipiente de cultivo parcialmente lleno de medio. Aunque se denomina en el presente documento "aire" por conveniencia, la invención no se limita a la mezcla de gases y composiciones que se encuentran en el medio ambiente. La invención contempla e incluye específicamente mezclas gaseosas que tienen composiciones diferentes del medio ambiente que incluyen, por ejemplo, mezclas enriquecidas con un componente particular o en las que un componente particular se ha agotado o eliminado.

[0023] Adicionalmente, la presente invención proporciona cultivos celulares para la diferenciación de células madre pluripotentes en células que presentan características de células endocrinas pancreáticas, así como medio de diferenciación que inicia y facilita tal diferenciación. De manera ventajosa, estos cultivos celulares y medios de diferenciación pueden usarse junto con la diferenciación en la interconexión aire-líquido para proporcionar rendimientos previamente no obtenidos de células que expresan marcadores característicos de las células endocrinas pancreáticas.

[0024] El cultivo se puede producir en la interconexión aire-líquido para todas las etapas involucradas en la vía de diferenciación de células madre pluripotentes a células endocrinas pancreáticas, o puede implicar el cultivo en un cultivo plano sumergido en el medio para las primeras etapas de diferenciación, y cultivo en la interconexión airelíquido durante las últimas etapas de diferenciación. Preferiblemente, el proceso de la invención implica la combinación de cultivar células madre pluripotentes en una superficie de soporte sumergida en medio durante las primeras etapas, y luego cultivar la interconexión aire-líquido para las últimas etapas de diferenciación. En tales realizaciones, las células pueden sembrarse inicialmente sobre una superficie sólida para cultivo sumergido y luego retirarse del soporte sólido y volverse a sembrar sobre un soporte poroso para cultivar en la interconexión aire-líquido. Alternativamente, las células se pueden sembrar inicialmente sobre un soporte poroso que luego se sumerge en medio para las primeras etapas de diferenciación y posteriormente se coloca en la interconexión aire-líquido para las últimas etapas de diferenciación. El cultivo en la interconexión aire-líquido para las últimas etapas de diferenciación mejora significativamente la expresión de marcadores endocrinos en comparación con el cultivo de células en estado sumergido durante todo el proceso, lo que indica que un mayor porcentaje de las células se han diferenciado en células endocrinas pancreáticas.

[0025] En una realización, la presente invención se refiere a la diferenciación de células progenitoras endodérmicas en la interconexión aire-líquido de un recipiente de cultivo parcialmente lleno de medios en las células endodérmicas progenitoras pancreáticas que son positivas para Nkx6.1, PDX1, y HB9. Esta invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que el cultivo en la interconexión aire-líquido mejora significativamente la expresión de marcadores endocrinos. Además, se descubrió que las células precursoras endocrinas pancreáticas se pueden generar fácilmente en la interconexión aire-líquido dando como resultado la generación de células predominantemente positivas para insulina de una sola hormona. Se encontró que la siembra unicelular en la interconexión aire-líquido mejora la consistencia de la producción de insulina.

Definiciones

[0026] Las células madre son células no diferenciadas definidas por su capacidad, en el nivel de células individuales, tanto para auto-renovarse como diferenciarse. Las células madre pueden producir células progenitoras, incluidas las progenitoras autorrenovables, las progenitoras no renovables y las células diferenciadas terminalmente. Las células madre también se caracterizan por su capacidad para diferenciarse in vitro en células funcionales de varios linajes celulares de múltiples capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo). Las células madre también dan lugar a tejidos de múltiples capas germinales después del trasplante y contribuyen sustancialmente a la mayoría, si no a todos, los tejidos después de la inyección en blastocistos.

[0027] Las células madre se clasifican por su potencial de desarrollo. Las células madre pluripotentes pueden dar lugar a todos los tipos de células embrionarias.

[0028] La diferenciación es el proceso por el cual una célula no especializada ("no comprometida") o menos especializada adquiere las características de una célula especializada como, por ejemplo, una célula nerviosa o una célula muscular. Una célula diferenciada es aquella que ha asumido una posición más especializada ("comprometida") dentro del linaje de una célula. El término "comprometido", cuando se aplica al proceso de diferenciación, se refiere a una célula que ha avanzado en la vía de diferenciación hasta un punto en donde, en circunstancias normales, continuará diferenciando en un tipo de célula específico o subconjunto de tipos de células. y no puede, en circunstancias normales, diferenciarse en un tipo de célula diferente o revertir a un tipo de célula menos diferenciado. "Desdiferenciación" se refiere al proceso mediante el cual una célula vuelve a una posición menos especializada (o comprometida) dentro del linaje de una célula. Como se usa en este documento, el linaje de una célula define la herencia de la célula, es decir, de qué células procede y a qué células puede dar lugar. El linaje de una célula coloca a la célula dentro de un esquema hereditario de desarrollo y diferenciación. Un marcador específico de linaje se refiere a una característica asociada específicamente con el fenotipo de las células de un linaje de interés y puede usarse para evaluar la diferenciación de una célula no comprometida con el linaje de interés.

[0029] Los "marcadores", como se usan en el presente documento, son moléculas de ácido nucleico o polipéptido que se expresan diferencialmente en una célula de interés. En este contexto, la expresión diferencial significa un nivel aumentado para un marcador positivo y un nivel disminuido para un marcador negativo en comparación con una célula indiferenciada. El nivel detectable del ácido nucleico o polipéptido marcador es suficientemente mayor o menor en las células de interés en comparación con otras células, de modo que la célula de interés se puede identificar y distinguir de otras células usando cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica.

[0030] Como se usa en este documento, una célula es "positiva para" un marcador específico o "positiva" cuando el marcador específico está suficientemente detectó en la célula. De manera similar, la célula es "negativa" para un marcador específico, o "negativa" cuando el marcador específico no se detecta suficientemente en la célula. En particular, el resultado positivo de FACS suele ser superior al 2%, mientras que el umbral negativo de FACS suele ser inferior al 1%. El resultado positivo por PCR suele ser inferior a 34 ciclos (Cts); mientras que negativo por PCR suele ser superior a 34,5 ciclos.

[0031] En los intentos para replicar la diferenciación de células madre pluripotentes en células endocrinas pancreáticas funcionales en cultivos de células estáticos in vitro, el proceso de diferenciación se ve a menudo como progresando a través de una serie de etapas consecutivas. En particular, se suele considerar que el proceso de diferenciación avanza a través de seis etapas. En esta progresión escalonada, "Paso 1" se refiere al primer paso en el proceso de diferenciación, la diferenciación de células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos de las células endodérmicas definitivas (en lo sucesivo denominadas alternativamente como "células de Paso 1"). "Paso 2" se refiere al segundo paso, la diferenciación de células que expresan marcadores característicos de células endodermáticas definitivas en células que expresan marcadores característicos de células tubulares intestinales (en lo sucesivo denominadas alternativamente como "células de Paso 2"). "Paso 3" se refiere al tercer paso, la diferenciación de células que expresan marcadores característicos de las células tubulares intestinales en células que expresan marcadores característicos de las células del endodermo del tracto digestivo superior (en lo sucesivo denominadas alternativamente como "células del paso 3"). El "paso 4" se refiere al cuarto paso, la diferenciación de células que expresan marcadores característicos de las células del endodermo del tracto digestivo superior en células que expresan marcadores característicos de las células precursoras pancreáticas del tracto digestivo superior (en adelante, alternativamente como "células del paso 4"). "Paso 5" se refiere al quinto paso, la diferenciación de células que expresan marcadores característicos de las células precursoras pancreáticas del tracto digestivo superior en células que expresan marcadores característicos de las células del endodermo pancreáticas y/o las células precursoras endocrinas pancreáticas (en lo sucesivo denominadas colectivamente como "células precursoras pancreáticas endodérmicas/endocrinas" o alternativamente como "células del paso 5”). "Paso 6" se refiere a la diferenciación de células que expresan marcadores característicos de células precursoras pancreáticas endodérmicas/endocrinas en células que expresan marcadores característicos de células endocrinas pancreáticas (en lo sucesivo denominadas alternativamente como "células de paso 6").

[0032] Sin embargo, cabe señalar que no todas las células en una población particular progresan a través de estas etapas a la misma velocidad. En consecuencia, no es infrecuente en cultivos celulares in vitro detectar la presencia de células que han progresado menos o más en la ruta de diferenciación que la mayoría de las células presentes en la población, particularmente en las últimas etapas de diferenciación. Por ejemplo, no es raro ver la aparición de marcadores característicos de las células endocrinas pancreáticas durante el cultivo de células en el Paso 5. Con el fin de ilustrar la presente invención, se describen las características de los diversos tipos de células asociadas con las etapas identificadas anteriormente.

[0033] "Células endodérmicas definitivas", como se usa aquí, se refiere a células que llevan las características de las células derivadas del epiblasto durante la gastrulación y que forman el tracto gastrointestinal y sus derivados. Las células del endodermo definitivo expresan al menos uno de los siguientes marcadores: FOXA2 (también conocido como factor nuclear de hepatocitos 3p("HNF3p”)), GATA4, SOX17, CXCR4, Brachyury, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99, y MIXL1. Los marcadores característicos de las células endodérmicas definitivas incluyen CXCR4, FOXA2 y SOX17. Por tanto, las células endodérmicas definitivas pueden caracterizarse por su expresión de CXCR4, FOXA2 y SOX17. Además, dependiendo del tiempo que se permite que las células permanezcan en el Paso 1, se puede observar un aumento en HNF4a.

[0034] "Células tubulares del intestino", como se usa aquí, se refiere a células derivadas de endodermo definitivo que pueden dar lugar a todos los órganos endodérmicos, tales como los pulmones, el hígado, el páncreas, el estómago y el intestino. Las células del tubo digestivo se pueden caracterizar por su expresión sustancialmente aumentada de HNF4a sobre la expresada por las células endodérmicas definitivas. Por ejemplo, diez a quince veces mayor en la expresión de ARNm de HNF4a puede ser observado durante el Paso 2.

[0035] "Células endodérmicas del tracto digestivo superior," como se utiliza aquí, se refiere a células de endodermo que dan lugar al esófago, pulmones, estómago, hígado, páncreas, vesícula biliar y una porción del duodeno. Las células del endodermo del tracto digestivo superior expresan al menos uno de los siguientes marcadores: PDX1, FOXA2, CDX2, SOX2 y HNF4a. Las células del endodermo del tracto digestivo superior pueden caracterizarse por un aumento en la expresión de PDX1, en comparación con las células tubulares intestinales. Por ejemplo, más del cincuenta por ciento de las células en los cultivos del paso 3 expresan típicamente PDX1.

[0036] "Células precursoras pancreáticas del tracto digestivo superior", como se usa aquí, se refiere a células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores: PDX1, Nkx6.1, HNF6, Ngn3, SOX9, PAX4, PAX6, ISL1, gastrina, FOXA2, PTF1A, PROX1 y HNF4a. Las células precursoras pancreáticas del tracto digestivo superior pueden caracterizarse por ser positivas para la expresión de PDX1, NKX6.1 y SOX9.

[0037] "Células del endodermo pancreáticas," como se utiliza aquí, se refiere a células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores: PDX1, Nkx6.1, HNF1 p, PTF1a, HNF6, HNF4a, SOX9, Ngn3; gastrina; HB9 o PROX1. Las células del endodermo pancreáticas pueden caracterizarse por su falta de expresión sustancial de CDX2 o SOX2.

[0038] "Células precursoras endocrinas pancreáticas", como se usa aquí, se refiere a células del endodermo pancreáticas capaces de convertirse en una célula que expresa hormona pancreática. Las células precursoras endocrinas pancreáticas expresan al menos uno de los siguientes marcadores: NGN3; NKX2.2; NeuroD1; ISL1; PAX4; PAX6; o ARX. Las células precursoras endocrinas pancreáticas pueden caracterizarse por su expresión de NKX2.2 y NeuroD1.

[0039] "Células endocrinas pancreáticas", como se usa en este documento, se refieren a células capaces de expresar al menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina, grelina, y el polipéptido pancreático. Además de estas hormonas, los marcadores característicos de las células endocrinas pancreáticas incluyen uno o más de NGN3, NeuroD1, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, ARX, NKX2.2 y PAX6. Las células endocrinas pancreáticas que expresan marcadores característicos de las células p pueden caracterizarse por su expresión de insulina y al menos uno de los siguientes factores de transcripción: PDX1, NKX2.2, NKX6.1, NeuroD1, ISL1, HNF3 p, MAFA y PAX6.

[0040] En este documento se utilizan indistintamente "dl", "1d" y "día 1"; "d2", "2d" y "día 2", y así sucesivamente. Estas combinaciones de letras de números se refieren a un día específico de incubación en las diferentes etapas durante el protocolo de diferenciación escalonada de la presente aplicación.

[0041] "Glucosa" se utiliza aquí para referirse a la dextrosa, un azúcar que se encuentra comúnmente en la naturaleza.

[0042] "NeuroD1" se utiliza aquí para identificar una proteína expresada en células endocrinas pancreáticas progenitoras y el gen que la codifica.

[0043] "LDN-193189" se refiere a ((6-(4-(2-(piperidina-1-ilo)etoxi)fenilo)-3-(piridina-4-ilo)pirazolo[1.5-a]pirimidina, hidrocloruro; DM-3189)) un inhibidor del receptor de BMP disponible bajo la marca comercial STEMOLe Cu LE™ de Stemgent, Inc., Cambridge, MA, EE.UU.

Caracterización, fuente, expansión y cultivo de células madres pluripotentes

A. Caracterización de células madre pluripotentes

[0044] Células madre pluripotentes pueden expresar uno o más de los anticuerpos designados TRA-1-60 y TRA-1-81 (Thomson et al. 1998, Science 282: 1145-1147). La diferenciación de células madre pluripotentes in vitro da como resultado la pérdida de expresión de TRA-1-60 y TRA-1-81. Las células madre pluripotentes indiferenciadas típicamente tienen actividad de fosfatasa alcalina, que puede detectarse fijando las células con paraformaldehído al 4% y luego desarrollándose con un kit de sustrato de fosfatasa alcalina vendido bajo la marca comercial VECTOR® Red como sustrato, como lo describe el fabricante (Vector Laboratorios, CA, EE. UU.). Las células madre pluripotentes indiferenciadas también expresan típicamente OCT4 y TERT, según se detecta mediante RT-PCR.

[0045] Otro fenotipo deseable de células madre pluripotentes propagadas es un potencial de diferenciarse en células de todas las tres capas germinales: endodermo, mesodermo y ectodermo. La pluripotencia de las células madre se puede confirmar, por ejemplo, inyectando células en ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID), reparando los teratomas que se forman utilizando paraformaldehído al 4% y luego examinando histológicamente la evidencia de tipos de células de estas tres capas germinales. Alternativamente, la pluripotencia se puede determinar mediante la creación de cuerpos embrioides y la evaluación de los cuerpos embrioides para detectar la presencia de marcadores asociados con las tres capas germinales.

[0046] Líneas de células madre pluripotentes propagadas se pueden cariotipar utilizando una técnica de bandeo G estándar y se compararon a cariotipos publicados de las especies de primates correspondientes. Es deseable obtener células que tengan un "cariotipo normal", lo que significa que las células son euploides, en las que todos los cromosomas humanos están presentes y no están alterados de forma notable.

B. Fuentes de células madre pluripotentes

[0047] Tipos de células madre pluripotentes ejemplares incluyen las líneas establecidas de células pluripotentes, incluyendo tejido pre-embrionario (tal como, un blastocisto), tejido embrionario, o tejido fetal tomado en cualquier momento durante la gestación, por lo general, pero no necesariamente, antes de aproximadamente las 10 a 12 semanas de gestación. Ejemplos no limitantes son líneas establecidas de células madre embrionarias humanas o células germinales embrionarias humanas, tales como las líneas de células madre embrionarias humanas HI, H7 y H9 (WiCell Research Institute, Madison, WI, EE. UU.), Que se describen como referencia. solamente. También son adecuadas las células tomadas de una población de células madre pluripotentes ya cultivadas en ausencia de células alimentadoras. Células pluripotentes inducidas (IPS), o células pluripotentes reprogramadas, derivadas de células somáticas adultas mediante la expresión forzada de una serie de factores de transcripción relacionados con pluripotentes, como OCT4, NANOG, SOX2, KLF4 y ZFP42 (Annu Rev Genomics Hum Genet 2011, 12: 165-185; ver también IPS, Cell, 126 (4): 663-676). Células madre embrionarias humanas preparadas como describen Thomson et al. se describen sólo como referencia (Patente de Estados Unidos N° 5.843.780; Science, 1998, 282: 1145-1147; Curr Top Dev Biol 1998, 38: 133-165; Proc Natl Acad Sci EE. UU. 1995, 92: 7844-7848). Líneas de células madre embrionarias humanas mutantes, como BG01v descritas solo como referencia (BresaGen, Athens, Georgia), o células derivadas de células somáticas humanas adultas, como las células descritas en Takahashi et al., Cell 131: 1-12 (2007) también se pueden utilizar. Las células madre pluripotentes pueden derivarse de acuerdo con los métodos descritos en: Li et al. (Cell Stem Cell 4: 16-19, 2009); Maherali y col. (Cell Stem Cell 1: 55-70, 2007); Stadtfeld y col. (Cell Stem Cell 2: 230-240); Nakagawa y col. (Nature Biotechnol 26: 101-106, 2008); Takahashi y col. (Cell 131: 861-872, 2007); y Publ. de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2011/0104805. En determinadas realizaciones, las células madre pluripotentes pueden ser de origen no embrionario. Todas estas referencias, patentes y solicitudes de patentes pertenecen al aislamiento, cultivo, expansión y diferenciación de células pluripotentes.

C. Expansión y cultivo de células madre pluripotentes

[0048] Células madre pluripotentes típicamente se cultivan sobre una capa de células alimentadoras que soportan las células madre pluripotentes en varias maneras. Alternativamente, las células madre pluripotentes pueden cultivarse en un sistema de cultivo que está esencialmente libre de células alimentadoras, pero que no obstante apoya la proliferación de células madre pluripotentes sin experimentar una diferenciación sustancial. El crecimiento de células madre pluripotentes en cultivo sin alimentador sin diferenciación se apoya a menudo en un medio acondicionado mediante cultivo previo con otro tipo celular. Alternativamente, el crecimiento de células madre pluripotentes en cultivo sin alimentador sin diferenciación puede apoyarse usando un medio químicamente definido.

[0049] Las células pluripotentes se pueden expandir fácilmente en cultivo usando varias capas alimentadoras o usando recipientes recubiertos con proteína de matriz. Alternativamente, las superficies definidas químicamente en combinación con medios definidos tales como los medios vendidos bajo la marca comercial mTESR®1 (StemCell Technologies, Vancouver, Canadá) pueden usarse para la expansión rutinaria de las células. Las células pluripotentes pueden eliminarse fácilmente de las placas de cultivo mediante digestión enzimática, separación mecánica o varios quelantes de calcio como el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Alternativamente, las células pluripotentes pueden expandirse en suspensión en ausencia de proteínas de matriz o capa alimentadora.

[0050] Hay muchos métodos diferentes de expansión y cultivo de células madre pluripotentes. Por ejemplo, los métodos de Reubinoff et al., Thompson et al., Richard et al. y Publ. de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2002/0072117. Reubinoff y col. (Nature Biotechnology 18: 399-404 (2000)) y Thompson et al. (Science 282: 1145 1147 (1998)) describen el cultivo de líneas de células madre pluripotentes de blastocistos humanos usando una capa de células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón. Richards y col. (Stem Cells 21: 546-556, 2003) evaluó un panel de once capas de células alimentadoras humanas adultas, fetales y neonatales diferentes para determinar su capacidad para soportar el cultivo de células madre pluripotentes humanas, y señaló que las líneas de células madre embrionarias humanas cultivadas en fibroblasto de piel adulta los alimentadores conservan la morfología de las células madre embrionarias humanas y siguen siendo pluripotentes. La Publ. de Sol. de Patente de EE. UU. N° 2002/0072117 describe líneas celulares que producen medios que apoyan el crecimiento de células madre pluripotentes de primate en cultivo libre de alimentador. Las líneas celulares empleadas son líneas celulares mesenquimales y de tipo fibroblasto obtenidas a partir de tejido embrionario o diferenciadas de células madre embrionarias. La Publ. de Sol. de Patente de EE. UU. N° 2002/072117 también describe el uso de las líneas celulares como una capa primaria de células alimentadoras.

[0051] Los métodos para expandir y cultivar células madre pluripotentes se describen, por ejemplo, en Wang et al., Stojkovic et al., Miyamoo et al. y Amit et al. Wang y col. (Stem Cells 23: 1221-1227, 2005) describen métodos para el crecimiento a largo plazo de células madre pluripotentes humanas en capas de células alimentadoras derivadas de células madre embrionarias humanas. Stojkovic y col. (Stem Cells 200523: 306-314, 2005) describen un sistema de células alimentadoras derivado de la diferenciación espontánea de células madre embrionarias humanas. Miyamoto y col. (Stem Cells 22: 433-440, 2004) describen una fuente de células alimentadoras obtenidas de placenta humana. Amit y col. (Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003) describen una capa de células alimentadoras derivada del prepucio humano.

[0052] Se describen otros métodos adecuados para la expansión y el cultivo de células madre pluripotentes, por ejemplo, en Inzunza et al., Patente de EE.UU. n° 6.642.048, WO 2005/014799, Xu et al. y Publ. de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2007/0010011. Inzunza y col. (Stem Cells 23: 544-549, 2005) describen una capa de células alimentadoras de fibroblastos de prepucio postnatales humanos. La Patente de Estados Unidos N° 6.642.048 describe medios que apoyan el crecimiento de células madre pluripotentes de primates en cultivo sin alimentador y líneas celulares útiles para la producción de tales medios. La patente de EE.Uu . n° 6.642.048 informa de líneas celulares mesenquimales y de tipo fibroblasto obtenidas a partir de tejido embrionario o diferenciadas de células madre embrionarias; así como métodos para derivar tales líneas celulares, medios de procesamiento y cultivo de células madre usando tales medios. El documento WO 2005/014799 describe un medio acondicionado para el mantenimiento, la proliferación y la diferenciación de células de mamíferos. WO 2005/014799 informa que el medio de cultivo producido mediante la divulgación está condicionado por la actividad de secreción celular de células murinas; en particular, los hepatocitos transgénicos diferenciados e inmortalizados, denominados MMH (Met Murine Hepatocyte). Xu y col. (Stem Cells 22: 972-980, 2004) describe un medio acondicionado obtenido a partir de derivados de células madre embrionarias humanas que se han modificado genéticamente para sobreexpresar la transcriptasa inversa de telomerasa humana. Publ. de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2007/0010011 describe un medio de cultivo químicamente definido para el mantenimiento de células madre pluripotentes.

[0053] Un sistema de cultivo alternativo emplea un medio libre de suero suplementado con factores de crecimiento capaces de promover la proliferación de células madre embrionarias. Los ejemplos de tales sistemas de cultivo incluyen, pero no se limitan, a Cheon et al., Levenstein et al. y Publ. de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2005/0148070. Cheon y col. (BioReprod DOI: 10.1095/biolreprod.105.046870, 19 de octubre de 2005) describen un sistema de cultivo libre de suero y sin alimentador en donde las células madre embrionarias se mantienen en medio de reemplazo de suero no acondicionado (SR) complementado con diferentes factores de crecimiento capaces de desencadenar autorrenovación de células madre embrionarias. Levenstein y col. (Stem Cells 24: 568-574, 2006) describen métodos para el cultivo a largo plazo de células madre embrionarias humanas en ausencia de fibroblastos o medio acondicionado, usando medios suplementados con bFGF. Publ. de Solicitud de Patente de EE. UU.

2005/0148070 describe un método de cultivo de células madre embrionarias humanas en medios definidos sin suero y sin células alimentadoras de fibroblastos, comprendiendo el método: cultivar las células madre en un medio de cultivo que contiene albúmina, aminoácidos, vitaminas, minerales, al menos una transferrina o sustituto de transferrina, al menos una insulina o sustituto de insulina, el medio de cultivo esencialmente libre de suero fetal de mamífero y que contiene al menos aproximadamente 100 ng/ml de un factor de crecimiento de fibroblastos capaz de activar un receptor de señalización del factor de crecimiento de fibroblastos, donde el factor de crecimiento se suministra a partir de una fuente que no es simplemente una capa alimentadora de fibroblastos, el medio apoyó la proliferación de células madre en un estado indiferenciado sin células alimentadoras o medio acondicionado.

[0054] Otros métodos adecuados de cultivo y la expansión de las células madre pluripotentes se describen en Publ. de Sol. de Patentes de EE. UU. N° 2005/0233446, Patente de EE.UU. N° 6,800,480, Solicitud de Patente de EE.UU. Pub. N° 2005/0244962 y WO 2005/065354. Publ. de Solicitud de Patente de EE. UU. 2005/0233446 describe un medio definido útil en el cultivo de células madre, que incluyen células madre primordiales de primates indiferenciadas. En solución, el medio es sustancialmente isotónico en comparación con las células madre que se cultivan. En un cultivo dado, el medio particular comprende un medio base y una cantidad de cada uno de bFGF, insulina y ácido ascórbico necesaria para soportar el crecimiento sustancialmente indiferenciado de las células madre primordiales. La Patente de EE.UU. N° 6,800,480 informa que se proporciona un medio de cultivo celular para el cultivo de células madre primordiales derivadas de primates en un estado sustancialmente indiferenciado que incluye un medio básico de baja presión osmótica y baja endotoxina que es efectivo para apoyar el crecimiento de células madre primordiales derivado de primates. La divulgación de la patente 6,800,480 informa además que el medio básico se combina con un suero nutritivo eficaz para apoyar el crecimiento de células madre primordiales derivadas de primates y un sustrato seleccionado del grupo que consiste en células alimentadoras y un componente de matriz extracelular derivado de células alimentadoras.. Se observa además que este medio incluye aminoácidos no esenciales, un antioxidante y un primer factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en nucleósidos y una sal de piruvato. La Publ. de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2005/0244962 informa que un aspecto de la divulgación proporciona un método de cultivo de células madre embrionarias de primates y que las células madre en cultivo están esencialmente libres de suero fetal de mamíferos (preferiblemente también esencialmente libres de cualquier suero animal) y en presencia de factor de crecimiento de fibroblastos que se suministra a partir de una fuente que no es solo una capa alimentadora de fibroblastos.

[0055] El documento WO 2005/065354 describe un medio de cultivo isotónico definido que está esencialmente libre de alimento y suero, que comprende: un medio basal, bFGF, insulina y ácido ascórbico en cantidades suficientes para soportar el crecimiento de células madre de mamíferos sustancialmente indiferenciadas. Además, el documento WO 2005/086845 describe un método para el mantenimiento de una célula madre indiferenciada, dicho método comprende exponer una célula madre a un miembro de la familia de proteínas del factor de crecimiento transformante-p (TGF-p), un miembro del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) de proteínas, o nicotinamida (NIC) en una cantidad suficiente para mantener la célula en un estado indiferenciado durante una cantidad de tiempo suficiente para lograr el resultado deseado.

[0056] Las células madre pluripotentes se pueden sembrar sobre un sustrato de cultivo adecuado. En una realización, el sustrato de cultivo adecuado es un componente de matriz extracelular, como los derivados de la membrana basal o que pueden formar parte de acoplamientos de ligando-receptor de molécula de adhesión. Un sustrato de cultivo adecuado es una membrana basal reconstituida vendida bajo la marca comercial MATRIGEL™ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). MATRIGEL™ es una preparación soluble de células tumorales Engelbreth-Holm Swarm que se gelifica a temperatura ambiente para formar una membrana basal reconstituida.

[0057] Otros componentes de la matriz extracelular y mezclas de componentes conocidos en la técnica son adecuados como una alternativa. Dependiendo del tipo de célula que se esté proliferando, esto puede incluir laminina, fibronectina, proteoglicano, entactina, sulfato de heparán y similares, solos o en diversas combinaciones.

[0058] Las células madre pluripotentes se pueden plaquear sobre el sustrato en una distribución adecuada y en presencia de un medio que promueva la supervivencia celular, la propagación y la retención de las características deseables. Todas estas características se benefician de una cuidadosa atención a la distribución de la siembra y pueden ser determinadas fácilmente por un experto en la técnica. Los medios de cultivo adecuados se pueden preparar a partir de los siguientes componentes, medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) vendido bajo la marca comercial GIBCO™ (Parte n° 11965-092) por Life Technologies Corporation, Grand Island, NY; Medio de Eagle modificado de Knockout Dulbecco (KO DMEM) vendido bajo la marca comercial GIBCO™ (Parte n° 10829-018) por Life Technologies Corporation, Grand Island, NY; Medio basal Ham's F12/50% DMEM; L-glutamina 200 mM vendido bajo la marca comercial GIBCO™ (Parte n° 15039-027) por Life Technologies Corporation, Grand Island, NY; solución de aminoácidos no esenciales vendida bajo la marca comercial GIBCO™ (Parte n° 11140-050) por Life Technologies Corporation, Grand Island, NY; p-mercaptoetanol, Sigma-Aldrich Company, LLC Saint Louis, Mo , (Parte n° M7522); factor de crecimiento de fibroblastos básico recombinante humano (bFGF) vendido bajo la marca comercial GIBCO™ (Parte n° 13256-029) por Life Technologies Corporation, Grand Island, NY.

Diferenciación de las células madre pluripotentes

[0059] Como las células pluripotentes se diferencian hacia células p, que se diferencian a través de varias etapas, cada una de las cuales puede ser caracterizada por la presencia o ausencia de marcadores particulares. La diferenciación de las células en estas etapas se logra mediante las condiciones de cultivo específicas, incluida la presencia y la falta de ciertos factores añadidos al medio de cultivo. En general, esta diferenciación puede implicar la diferenciación de células madre pluripotentes en células endodérmicas definitivas. Estas células endodérmicas definitivas pueden luego diferenciarse aún más en células tubulares intestinales, que a su vez, pueden diferenciarse en células del endodermo del tracto digestivo superior. Las células del endodermo del tracto digestivo superior pueden diferenciarse en células precursoras pancreáticas del tracto digestivo superior que, a su vez, pueden diferenciarse más en células del endodermo pancreáticas, células precursoras endocrinas pancreáticas o ambas. Estas células pueden luego diferenciarse en células productoras de hormonas pancreáticas (como las células p). Esta invención proporciona la diferenciación por etapas de células madre pluripotentes hacia células endocrinas pancreáticas cultivando las células en la interconexión aire-líquido que existe dentro de un recipiente de cultivo parcialmente lleno con medio, específicamente cultivando células del paso 4 al paso 6 en la interconexión aire-líquido.. La diferenciación de las células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos de las células pancreáticas endocrinas.

[0060] Características de las células madre pluripotentes son bien conocidas para los expertos en la técnica, y características adicionales de las células madre pluripotentes continúan a ser identificadas. Los marcadores de células madre pluripotentes incluyen, por ejemplo, la expresión de uno o más de los siguientes: ABCG2, cripto, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, TRA -1-60, TRA-1-81.

[0061] Los ejemplos de células madre pluripotentes incluyen la línea humana embrionaria de células madre H9 (código NIH: WA09), la línea de células madre embrionarias humanas H1 (NIH código: WA01), la línea de células madre embrionarias H7 (código NIH: WA07) humano, y la línea de células madre embrionarias humanas SA002 (Cellartis, Suecia). Las células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores característicos de las células pluripotentes son ejemplos de células adecuadas para su uso en la invención: ABCG2, cripto, CD9, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA -3,SSEA-4, TRA-1-60 y TRA- 1 81.

[0062] Además, adecuada para su uso en la presente invención es una célula que expresa al menos uno de los marcadores característicos del linaje endodermo definitivo. En una realización de la presente invención, una célula que expresa marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo es una célula precursora de estrías primitivas. En una realización alternativa, una célula que expresa marcadores característicos del linaje endodermo definitivo es una célula mesendodérmica. En una realización alternativa, una célula que expresa marcadores característicos del linaje endodermo definitivo es una célula endodérmica definitiva.

[0063] También adecuada para uso en la presente invención es una célula que expresa al menos uno de los marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático. En una realización de la presente invención, una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático es una célula del endodermo pancreático en donde la expresión de PDX1 y NKX6.1 es sustancialmente mayor que la expresión de CDX2 y SOX2. En determinadas realizaciones, más del treinta por ciento de las células expresan PDX1 y NKX6.1 y menos del treinta por ciento de las células expresan CDX2 o SOX2 medido por FACS. Son particularmente útiles las células en las que la expresión de PDX1 y NKX6.1 es al menos dos veces mayor que la expresión de CDX2 o SOX2.

[0064] También adecuada para uso en la presente invención es una célula que expresa al menos uno de los marcadores característicos del linaje endocrino pancreático. En una realización de la invención, una célula que expresa marcadores característicos del linaje endocrino pancreático es una célula endocrina pancreática. En una realización, la célula endocrina pancreática es capaz de expresar al menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina o polipéptido pancreático. En una realización preferida, la célula endocrina pancreática es una célula p productora de insulina.

[0065] En ciertas realizaciones de la invención, para llegar a las células que expresan marcadores característicos de las células endocrinas pancreáticas, un protocolo a partir de células madre pluripotentes o células pluripotentes inducibles, preferiblemente células madre pluripotentes, se emplea. Este protocolo incluye lo siguiente:

Etapa 1: Las células madre pluripotentes, como las células madre embrionarias obtenidas de líneas de cultivo celular, se tratan con factores apropiados para inducir la diferenciación en células que expresan marcadores característicos de las células endodérmicas definitivas. Etapa 2: Las células resultantes de la etapa 1 se tratan con factores apropiados para inducir una mayor diferenciación en células que expresan marcadores característicos de las células del tubo intestinal.

Etapa 3: Las células resultantes de la etapa 2 se tratan con factores apropiados para inducir una mayor diferenciación en células que expresan marcadores característicos de las células del endodermo del tracto digestivo superior.

Etapa 4: Las células resultantes de la etapa 3 se tratan con factores apropiados para inducir una mayor diferenciación en células que expresan marcadores característicos de las células precursoras pancreáticas del tracto digestivo superior. Las células se cultivan opcionalmente en la interconexión aire-líquido al final del paso 4.

Etapa 5: Las células resultantes de la etapa 4 se tratan con factores apropiados y se cultivan en la interconexión aire-líquido para inducir una mayor diferenciación en células que expresan marcadores característicos de células precursoras del endodermo pancreático/endocrinas.

Etapa 6: Las células resultantes de la etapa 5 se tratan con factores apropiados y se cultivan en la interconexión aire-líquido para inducir una mayor diferenciación en células que expresan marcadores característicos de las células endocrinas pancreáticas.

[0066] Aunque la invención, en ciertas realizaciones, abarca la diferenciación de células madre pluripotentes (p. ej., células anteriores al Paso 1) a células del Paso 6, la invención también abarca la diferenciación de células en otras etapas intermedias hacia Paso 6. En particular, la invención abarca la diferenciación de las células del paso 4 al Paso 6. Además, aunque el proceso se describe en etapas discretas, el tratamiento, así como el progreso de las células a través del proceso de diferenciación, puede ser secuencial o continuo.

Etapa 1: Diferenciación de células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas definitivas.

[0067] Células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan marcadores característicos del células endodérmicas definitivas por cualquier método conocido en la técnica o mediante cualquier procedimiento propuesto en este documento. Los métodos útiles para diferenciar células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos de las células endodérmicas definitivas se describen en: Solicitud de patente de Ee .UU. Pub. N° 2007/0254359; Publ. de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2009/0170198; Publ. de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2009/0170198; Publ. de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2011/0091971; Publ. de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2010/0015711; Publ. de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2010/0015711; Publ. de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2012/0190111; Publ. de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2012/0190112; Publ. de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2012/0196365; Publ. de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 20100015711; Publ. de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2012/0190111; Publ. de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2012/0190112; Publ. de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2012/0196365; Publ. de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 20100015711; Publ. de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2012/0190111; Publ. de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2012/0190112; Publ. de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2012/0196365; Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. N° 61/076.900; Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. N° 61/076.908; y la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. N° 61/076.915 se refieren a células madre pluripotentes y a la diferenciación de células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos del linaje endodermo definitivo.

[0068] En una realización de la invención, células madre pluripotentes se tratan con un medio suplementado con activina A y Wnt3a para dar como resultado la generación de células que expresan marcadores característicos de las células endodérmicas definitivas. El tratamiento puede implicar poner en contacto células madre pluripotentes con un medio que contenga aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 150 ng/ml, alternativamente aproximadamente 75 ng/ml a aproximadamente 125 ng/ml, alternativamente aproximadamente 100 ng/ml de activina A. El tratamiento también puede implica poner en contacto las células con aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml, alternativamente aproximadamente 15 ng/ml a aproximadamente 30 ng/ml, alternativamente aproximadamente 20 ng/ml de WNT3A. Las células pluripotentes pueden cultivarse durante aproximadamente dos a cinco días, preferiblemente aproximadamente tres días, para facilitar su diferenciación en células que expresan marcadores característicos de las células endodérmicas definitivas. En una realización, las células se cultivan en presencia de activina A y WNT3A durante un día, seguido de cultivo en presencia de activina A (sin que WNT3A esté presente) durante el resto.

[0069] En otra realización de la invención, células madre pluripotentes se tratan con un medio suplementado con factor de diferenciación de crecimiento 8 ("GDF8") y un inhibidor de sintasa de glucógeno quinasa-3 p ("GSK3p") (tal como los compuestos cíclicos de anilina-piridinotriazina descritos en la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2010/0015711) para inducir la diferenciación en células que expresan marcadores característicos de las células endodérmicas definitivas. Un inhibidor de GSK3p preferido es 14-Prop-2-en-1-ilo-3,5,7,14,17,23,27-heptaazatetraciclo[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]heptacosa-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-nonaen-16-ona, denominado en el presente documento ("Compuesto MCX"). El tratamiento puede implicar poner en contacto células madre pluripotentes con un medio suplementado con aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 150 ng/ml, alternativamente aproximadamente 75 ng/ml a aproximadamente 125 ng/ml, alternativamente aproximadamente 100 ng/ml de GDF8. El tratamiento también puede implicar poner en contacto las células con aproximadamente 0,1 a 5 pM, alternativamente aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2,5 pM, preferiblemente aproximadamente 1 pM de compuesto MCX. Las células pluripotentes se pueden cultivar durante aproximadamente dos a cinco días, preferiblemente de dos a tres días, para facilitar su diferenciación en células que expresan marcadores característicos de las células endodérmicas definitivas.

[0070] En una realización, las células se cultivan en presencia del compuesto GDF8 y MCX por un día, seguido por cultivo en presencia de GDF8 y una concentración más baja de compuesto MCX por un día, seguido de cultivo en la presencia de GDF8 durante un día en ausencia del compuesto MCX. En particular, las células se cultivan en presencia de GDF8 y aproximadamente 1 pM de compuesto MCX durante un día, seguido de cultivo en presencia de GDF8 y aproximadamente 0,1 pM de compuesto m Cx durante un día, seguido de cultivo en presencia de GDF8 durante un día en ausencia del compuesto MCX. En una realización alternativa, las células se cultivan en presencia de GDF8 y aproximadamente 1 pM de compuesto MCX durante un día, seguido de cultivo en presencia de GDF8 y aproximadamente 0,1 pM de compuesto MCX durante un día.

[0071] La generación de células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas definitivas se puede determinar probando la presencia de marcadores antes y después de seguir un protocolo particular. Las células madre pluripotentes normalmente no expresan tales marcadores. Por tanto, la diferenciación de células pluripotentes puede detectarse cuando las células comienzan a expresar marcadores característicos de las células endodérmicas definitivas. Los métodos para evaluar la expresión de marcadores de proteínas y ácidos nucleicos en células cultivadas o aisladas son estándar en la técnica. Estos métodos incluyen RT-PCR, transferencias Northern, hibridación in situ (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Eds. 2001, suplemento)) e inmunoensayos (como análisis inmunohistoquímico de material seccionado, transferencia Western, y para los marcadores que son accesibles en células intactas, el análisis de citometría de flujo (FACS) (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Using Antibodies: a Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).

[0072] Además, la eficiencia de diferenciación se puede determinar mediante la exposición de una población celular tratada con un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador de proteína expresada por las células diferenciadas de interés.

[0073] Las células diferenciadas también se pueden purificar aún más. Por ejemplo, después de tratar las células madre pluripotentes con los métodos de la presente invención, las células diferenciadas pueden purificarse exponiendo una población de células tratadas a un agente (como un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador proteico expresado característicamente por las células diferenciadas que se purifican.

Etapa 2: Diferenciación de células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas definitivas en células que expresan marcadores característicos de células tubulares intestinales

[0074] Las células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas definitivas puede diferenciarse adicionalmente en células que expresan marcadores característicos de células tubulares intestinales. En una realización, la formación de células que expresan marcadores característicos de las células tubulares intestinales incluye cultivar las células que expresan marcadores característicos de las células endodérmicas definitivas con un medio que contiene factor de crecimiento de fibroblastos ("FGF") 7 o FGF10 para diferenciar estas células. Por ejemplo, el medio de cultivo puede incluir desde aproximadamente 25 ng/ml hasta aproximadamente 75 ng/ml, alternativamente desde aproximadamente 30 ng/ml hasta aproximadamente 60 ng/ml, alternativamente aproximadamente 50 ng/ml de FGF7 o FGF10, preferiblemente FGF7. Las células se pueden cultivar en estas condiciones durante aproximadamente dos a tres días, preferiblemente aproximadamente dos días.

[0075] En otra realización, la diferenciación en células que expresan marcadores característicos de células tubulares intestinales incluye el cultivo de células que expresan marcadores característicos de células endodérmicas definitivas con FGF7 o FGF10 y ácido ascórbico (vitamina C). El medio de cultivo puede incluir de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 0,5 mM de ácido ascórbico, alternativamente de aproximadamente 0,2 mM a aproximadamente 0,4 mM, alternativamente aproximadamente 0,25 mM de ácido ascórbico. El medio de cultivo también puede incluir desde aproximadamente 10 ng/ml hasta aproximadamente 35 ng/ml, alternativamente desde aproximadamente 15 ng/ml hasta aproximadamente 30 ng/ml, alternativamente aproximadamente 25 ng/ml de FGF7 o FGF10, preferiblemente FGF7. Por ejemplo, el medio de cultivo puede incluir aproximadamente 0,25 mM de ácido ascórbico y aproximadamente 25 ng/ml de FGF7. En una realización, las células del paso 1 se tratan durante 2 días con FGF7 y ácido ascórbico.

Paso 3: Diferenciación de células que expresan marcadores característicos de células tubulares intestinales en células que expresan marcadores característicos de las células del endodermo del tracto digestivo superior

[0076] Las células que expresan marcadores característicos de células tubulares intestinales pueden diferenciarse adicionalmente en células que expresan marcadores característicos de las células del endodermo del tracto digestivo superior. En una realización, las células del paso 2 se diferencian aún más en células del paso 3 cultivando estas células en un medio de cultivo complementado con un inhibidor del receptor suavizado ("SMO") (como "MRT10" (N-[[[3-benzoilamino)fenilo]amino]tioxometilo]-3,4,5-trimetoxibenzamida)) o ciclopamina) o un antagonista de la vía de señalización Sonic Hedgehog ("SHH") (como el antagonista suavizado 1 ("SANT-1") ((E)-4-bencilo-N-((3,5-dimetilo-1-fenilo-1H-pirazol-4-ilo)metileno-piperazina-1-amina)), o el inhibidor 1 de la vía Hedgehog ("HPI-1") (2-metoxietilo 1,4,5,6,7,8-hexahidro-4-(3-hidroxifenilo)-7-(2-metoxifenilo)-2-metilo-5-oxo-3-quinolincarboxilato)), ácido retinoico y Noggin. Alternativamente, las células del paso 2 pueden diferenciarse en células del paso 3 cultivando estas células en un medio de cultivo suplementado con un inhibidor del receptor de SMO, un antagonista de la vía de señalización de SHH, ácido retinoico y Noggin. Las células se pueden cultivar durante aproximadamente dos a cuatro días, preferiblemente aproximadamente dos días. En una realización, el medio se complementa con desde aproximadamente 0,1 pM hasta aproximadamente 0,3 pM de SANT-1, desde aproximadamente 0,5 pM hasta aproximadamente 3 pM de ácido retinoico y desde aproximadamente 75 ng/ml hasta aproximadamente 125 ng/ml de Noggin. En otra realización, el medio se complementa con aproximadamente 0,25 pM de SANT-1, aproximadamente 2 pM de ácido retinoico y aproximadamente 100 ng/ml de Noggin.

[0077] En una realización alternativa, células del Paso 2 se diferencian además en células del Paso 3 mediante el tratamiento de células del Paso 2 con un medio suplementado con FGF7 o FGF10, ácido retinoico, un inhibidor del receptor de SMO (como MRT10 o ciclopamina) o el antagonista de la vía de señalización de SHH (como SANT-1 o HPI-1), un activador de la proteína quinasa C ("PKC") (como ((2S, 5S)-(E,E)-8-(5-(4-(trifluorometil)fenilo)-2,4-pentadienoilamino)benzolactama ("TPB")) EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ), forbol-12,13-dibutiruto ("PDBu"), forbol-12-miristato-13-acetato ("PMA") o indolactama V ("ILV")), un inhibidor de la proteína morfogénica ósea ("BMP") (tal como LDN-193189, Noggin o Cordina) y ácido ascórbico. En otra realización, el medio puede complementarse con FGF7 o FGF10, ácido retinoico, un inhibidor del receptor de SMO, un antagonista de la vía de señalización de SHH (como SANT-1), un activador de PKC (como TPB), un inhibidor de BMP (como LDN-193189) y ácido ascórbico. Las células se pueden cultivar en presencia de estos factores de crecimiento, agonistas de moléculas pequeñas y antagonistas durante aproximadamente dos a cuatro días, preferiblemente aproximadamente dos a tres días.

[0078] En una realización adicional, el medio se complementa con desde aproximadamente 15 ng/ml a aproximadamente 35 ng/ml de FGF7, de aproximadamente 0,5 pM a aproximadamente 2 pM de ácido retinoico, de aproximadamente 0,1 pM a aproximadamente 0,4 pM de SANT-1, de aproximadamente 100 a aproximadamente 300 nM de TPB, de aproximadamente 50 nM a aproximadamente 200 nM de LDN-193189, y de aproximadamente 0,15 mM a aproximadamente 0,35 mM de ácido ascórbico. En otra realización, el medio se complementa con aproximadamente 25 ng/ml de FGF7, aproximadamente 1 pM de ácido retinoico, aproximadamente 0,25 pM de SANT-1, aproximadamente 200 nM de TPB, aproximadamente 100 nM de LDN-193189 y de aproximadamente 0,25 mM de ácido ascórbico.

Generación de células del paso 4 al Paso 6 mediante el cultivo en la interconexión aire-líquido

[0079] Aunque la presente invención contempla el cultivo a la interconexión aire-líquido para todas las etapas de la ruta de células pluripotentes a célula endocrina pancreática, la invención proporciona preferiblemente para la formación de células del paso 1 al paso 3 en cultivo sumergido, y de las células del paso 4 al paso 6 mediante el cultivo de células en la interconexión aire-líquido. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, la presente invención proporciona un método paso a paso para diferenciar células pluripotentes que comprende el cultivo durante los pasos 4 a 6 en la interconexión aire-líquido. En ciertas realizaciones, las células se pueden cultivar en la interconexión airelíquido durante la totalidad de los pasos 4 a 6. En otras realizaciones, solo el paso 4 tardío al paso 6, o solo los pasos 5 y 6, o solo los pasos 4 y 5, o solo los pasos 4 y 6 incluyen el cultivo en la interconexión aire-líquido.

[0080] Cuando las células se cultivaron en la interconexión aire-líquido (interconexión aire-líquido), las células se pueden cultivar en un sustrato poroso de tal manera que las células están en contacto con el aire en el lado superior y con medios de cultivo celular en la parte inferior. Por ejemplo, se puede agregar un volumen suficiente de medio al fondo de un recipiente de cultivo que contiene el sustrato poroso (p. ej., un inserto de filtro) de manera que el medio entre en contacto con la superficie inferior de las células que residen en el sustrato pero no las encapsula ni las sumerge. Se pueden formar sustratos porosos adecuados de cualquier material que no afecte negativamente al crecimiento y diferenciación de las células. Los sustratos porosos ejemplares están hechos de polímeros tales como tereftalato de polietileno (PET), poliéster o policarbonato. Los sustratos porosos adecuados pueden revestirse o no. En una realización, el sustrato poroso puede recubrirse con MATRIGEL™. En una realización de la invención, el sustrato poroso es un inserto de filtro poroso, que puede revestirse con MATRIGEL™. Sin embargo, preferiblemente, el sustrato poroso es un inserto de filtro no revestido. La porosidad del sustrato debería ser suficiente para mantener la viabilidad celular y promover la diferenciación de las células. Los sustratos adecuados incluyen insertos de filtro que tienen un tamaño de poro de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 3,0 pM, aproximadamente 0,3 a aproximadamente 2,0 pM, aproximadamente 0,3 a aproximadamente 1,0 pM, aproximadamente 0,3 a aproximadamente 0,8 pM, aproximadamente 0,3 a aproximadamente 0,6 pM, aproximadamente 0,3 a aproximadamente 0,5 pM, aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3,0 pM, aproximadamente 0,6 a aproximadamente 3,0 pM, aproximadamente 0,8 a aproximadamente 3,0 pM, aproximadamente 1,0 a aproximadamente 3,0 pM, aproximadamente 2,0 pM a aproximadamente 3,0 pM, preferiblemente aproximadamente 0,4 pM, y una densidad de poros de aproximadamente 50 a aproximadamente 120 millones de poros/cm2, aproximadamente 60 a aproximadamente 110 millones de poros/cm2, aproximadamente 70 a aproximadamente 100 millones poros/cm2, preferiblemente de aproximadamente 80 a unos 100 millones de poros/cm2, aproximadamente 90 a aproximadamente 100 millones poros/cm2, más preferiblemente alrededor de 100 millones de poros/cm2.

[0081] Los medios ventajosamente pueden cambiarse o renovarse diariamente o cada dos días. Las células que crecen sobre el sustrato poroso generalmente no son células individuales, sino que tienen la forma de una hoja o existen como un grupo agregado de células. Las células cultivadas en la interconexión aire-líquido pueden experimentar una tensión de oxígeno mucho mayor en comparación con las células sumergidas en el medio.

[0082] La presente invención abarca por lo tanto la generación de células del paso 4 al paso 6, preferiblemente células del paso 5 y del paso 6, en la interconexión aire-líquido. Las células del paso 4 se pueden cultivar completamente en cultivos planos, completamente en la interconexión aire-líquido, o las células se pueden cultivar en cultivo plano sumergido durante la primera parte del paso 4 y luego se cultivan en la interconexión aire-líquido para la última porción de paso 4. Estas células pueden producirse diferenciando las células madre pluripotentes o diferenciando más las células del paso 3, 4 o 5 derivadas de otros medios.

[0083] En una realización, la presente invención proporciona un método para producir células que expresan marcadores característicos de células endocrinas pancreáticas, preferiblemente células p, a partir de células madre pluripotentes, que comprende el cultivo células madre pluripotentes, diferenciando las células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos de células del endodermo del tracto digestivo superior; y diferenciar las células que expresan marcadores característicos de las células del endodermo del tracto digestivo superior en células que expresan marcadores característicos de las células pancreáticas endocrinas/p mediante cultivo en la interconexión aire-líquido.

[0084] En otra realización, la presente invención proporciona un método para producir células que expresan marcadores característicos de células endocrinas pancreáticas, preferiblemente células p, a partir de células madre pluripotentes, que comprende cultivar células madre pluripotentes, la diferenciación de las células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos de células precursoras pancreáticas del tracto digestivo superior, y diferenciar las células que expresan marcadores característicos de las células precursoras pancreáticas del tracto digestivo superior en células que expresan marcadores característicos de las células endocrinas pancreáticas mediante cultivo en la interconexión aire-líquido.

[0085] El método puede incluir el tratamiento con un medio suplementado con triyodotironina (T3), tiroxina (T4), análogos de T3 o T4, o mezclas de los mismos (denominados en lo sucesivo como "T3/T4"), o un receptor-activina como el inhibidor de la quinasa ("ALK") 5, o tanto T3/T4 como un inhibidor de ALK5. Los análogos de la hormona tiroidea adecuados pueden incluir: GC-1 (Sobertirome) disponible en R&D Systems, Inc. Cat. N° 4554; DITPA (ácido 3,5-diyodotiropropiónico); KB-141, discutido en J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2008, 111: 262-267 y Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 2003, 100: 10067-10072; MB07344, discutido en Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 2007, 104: 15490-15495; T0681, discutido en PLoS One, 2010, 5e8722 y J. Lipid Res. 2009, 50: 938-944; y GC-24, discutido en PLoS One, 2010 e8722 y Endocr. Pract. 2012, 18 (6): 954-964. Los inhibidores de ALK5 útiles incluyen: inhibidor II de ALK5 (Enzo, Farmingdale, NY); ALK5i (Axxora, San Diego, CA); SD208 (R&D Systems (MN)); inhibidor de TGF-B SB431542 (Xcess Biosciences (San Diego, CA)); ITD-1 (Xcess Biosciences (San Diego, CA)); LY2109761 (Xcess Biosciences (San Diego, CA)); A83-01 (Xcess Biosciences (San Diego, c A)); LY2157299 (Xcess Biosciences (San Diego, Ca )); Receptor de TGF-p inh V (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); Receptor de TGF-p inh I (EMD Chemicals, Gibstown, Nj); Receptor de TGF-p inh IV (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); Receptor de TGF-p inh VII (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); Receptor de TGF-p inh VIII (EMD Chemicals, Gibstown, Nj ); Receptor de TGF-p inh II (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); Receptor de TGF-p inh VI (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); Receptor de TGF-p inh III (EMD Chemicals, Gibstown, NJ). El método puede incluir diferenciar las células que expresan marcadores característicos de las células del endodermo del tracto digestivo superior en células que expresan marcadores característicos de las células precursoras pancreáticas del tracto digestivo superior mediante tratamiento con un medio suplementado con inhibidor de T3/T4 o ALK5 y cultivo en un cultivo plano. El método también puede incluir la diferenciación de células que expresan marcadores característicos de células precursoras pancreáticas del tracto digestivo superior en células que expresan marcadores característicos de células p mediante tratamiento con medio suplementado con T3 /T4, o un inhibidor de ALK5, o ambos, y cultivo en la interconexión aire-líquido.

[0086] En una realización, el método incluye el tratamiento con un medio suplementado con T3/T4 y un inhibidor de ALK5. En otras realizaciones, el método incluye el tratamiento de células del paso 3 con un medio suplementado con T3/T4 o un inhibidor de ALK5. El método también puede incluir el tratamiento de células que expresan marcadores característicos del endodermo pancreático/células precursoras endocrinas con un medio suplementado con T3/T4 y un inhibidor de ALK5.

[0087] Una realización de la invención es un método de formación de las células que expresan marcadores característicos de células p que comprenden células que se diferencian que expresan marcadores característicos de las células del endodermo del tracto digestivo superior en células que expresan marcadores característicos de células p mediante el cultivo en la interconexión aire-líquido. Una célula que expresa marcadores característicos de las células p expresa insulina y al menos uno de los siguientes factores de transcripción: PDX1, NKX2.2, NKX6.1, NeuroD1, 1SL1, HNF3p, MAFA, pAX4 y PAX6. En una realización, los métodos de la invención dan como resultado la formación de células que son positivas para NKX6.1, PDX1 y HB9. Por consiguiente, la invención proporciona un método para inducir la expresión de PDX1, NKX6.1 y HB9 en células humanas cultivando células del endodermo pancreáticas en la interconexión aire-líquido en condiciones suficientes para inducir tal expresión. La invención también proporciona un método para inducir la expresión de PDX1, NKX6.1 y NGN3 en células humanas cultivando células del endodermo pancreáticas en la interconexión aire-líquido. El método puede incluir tratamiento con un medio suplementado con T3, un inhibidor de ALK5 o ambos. Por tanto, en una realización, el medio puede complementarse con T3, mientras que en otra realización, el medio puede complementarse con un inhibidor de ALK5. En otra realización, el medio puede complementarse tanto con t 3 como con un inhibidor de ALK5. Las células del paso 6 pueden ser células que son positivas para NKX6.1, PDX1 y HB9. En otras realizaciones, las células del paso 6 son células positivas para una sola hormona. Por ejemplo, las células del paso 6 pueden ser células que (a) coexpresan NKX6.1 y cromogranina-A o (b) coexpresan NKX6.1 e insulina.

[0088] El cultivo de las células en la interconexión aire-líquido incluye sembrar las células sobre un sustrato poroso, tal como un inserto de filtro poroso. En determinadas realizaciones, el tamaño de los poros del sustrato puede oscilar entre aproximadamente 0,4 y aproximadamente 3 micrómetros, o cualquiera de los tamaños de poros mencionados aquí. La siembra se puede lograr liberando células como células individuales o agrupaciones de células de cultivos en monocapa en una suspensión y posteriormente dividiendo alícuotas de la suspensión celular en un sustrato poroso colocado en la interconexión aire-líquido. Las células se pueden sembrar sobre el sustrato poroso a partir de una suspensión que comprende aproximadamente 1000 células/pl hasta aproximadamente 100.000 células/pl, aproximadamente 1000 células/pl hasta aproximadamente 90.000 células/pl, aproximadamente 1000 células/pl hasta aproximadamente 80.000 células/pl, alrededor de 1000 células/pl a aproximadamente 70.000 células/pl, aproximadamente 1000 células/pl a aproximadamente 60.000 células/pl, aproximadamente 1000 células/pl a aproximadamente 50.000 células/pl, aproximadamente 1000 células/pl hasta aproximadamente 40.000 células/pl, aproximadamente 1000 células/pl hasta aproximadamente 30.000 células/pl, aproximadamente 1000 células/pl hasta aproximadamente 20.000 células/pl, aproximadamente 1000 células/pl hasta aproximadamente 10.000 células/pl, aproximadamente 1000 células/pl hasta aproximadamente 5000 células/pl, aproximadamente 5000 células/pl hasta aproximadamente 100.000 células/pl, aproximadamente 10.000 células/pl hasta aproximadamente 100.000 células/pl, aproximadamente 20.000 células/pl a aproximadamente 100.000 células/pl, aproximadamente 30.000 células/pl a aproximadamente 100.000 células/pl, aproximadamente 40.000 células/pl a aproximadamente 100.000 células/pl, aproximadamente 50.000 células/pl a aproximadamente 100.000 células/pl, aproximadamente 60.000 células/pl a aproximadamente 100.000 células/pl, aproximadamente ut 20.000 células/pl a aproximadamente 80.000 células/pl, aproximadamente 30.000 células/pl a aproximadamente 70.000 células/pl, aproximadamente 40.000 células/pl a aproximadamente 60.000 células/pl, preferiblemente aproximadamente 50.000 células/pl. Las células se pueden sembrar como gotitas de la suspensión celular que contienen células individuales o grupos de células. El depósito de células resultante puede contener de aproximadamente 5 x 106 a aproximadamente 5 x 107 células/cm2, aproximadamente 6 x 106 a aproximadamente 5 x 107 células/cm2, aproximadamente 7 x 106 a aproximadamente 5 x 107 células/cm2, aproximadamente 8 x 106 a aproximadamente 5 x 107 células/cm2, aproximadamente 9 x 106 a aproximadamente 5 x 107 células/cm2, aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 5 x 107 células/cm2, aproximadamente 2 x 107 a aproximadamente 5 x 107 células/cm2, aproximadamente 2 x 107 a aproximadamente 5 x 107 células/cm2, aproximadamente 3 x 107 a aproximadamente 5 x 107 células/cm2, aproximadamente 3 x 107 a aproximadamente 5 x 107 células/cm2, aproximadamente 4 x 107 a aproximadamente 5 x 107 células/cm2, aproximadamente 5 x 106 a aproximadamente 4 x 107 células/cm2,aproximadamente 5 x 106 a aproximadamente 3 x 107 células/cm2, aproximadamente 5 x 106 a aproximadamente 2 x 107 células/cm2, aproximadamente 5 x 106 a aproximadamente 1 x 107 células/cm2, aproximadamente 5 x 106 a aproximadamente 9 x 106 células/cm2, aproximadamente 5 x 106 a aproximadamente 8 x 106 células/cm2, aproximadamente 5 x 106 a aproximadamente 7 x 106 células/cm2, aproximadamente 5 x 106 a aproximadamente 6 x 106 células/cm2, aproximadamente 7 x 106 a aproximadamente 4 x 107 células/cm2, aproximadamente 8 x 106 a aproximadamente 3 x 107 células/cm2, aproximadamente 9 x 106 a aproximadamente 2 x 107 células/cm2, preferiblemente del orden de o aproximadamente 1 x 107 células/cm2.

[0089] En una realización, la invención se refiere a un método de potenciación de la expresión de la proteína HB9 mediante el cultivo y la diferenciación de una población de células precursoras endodérmicas pancreáticas co-positivas PDX1 y Nkx6.1 en células endocrinas pancreáticas co-positivas PDX1 y Nkx6.1 en la interconexión aire-líquido sobre un sustrato poroso. Alternativamente, la expresión de la proteína HB9 puede inducirse cultivando y diferenciando una población de células del endodermo del tracto digestivo superior, que consisten principalmente en células positivas para PDX1, en la interconexión aire-líquido. En algunas realizaciones, la población de células del endodermo pancreáticas se obtiene mediante una diferenciación escalonada de células pluripotentes al menos, en parte, en la interconexión aire-líquido.

[0090] En otra realización, la invención proporciona un método para mejorar el número de células positivas de una hormona (p. ej. células que co-expresan Nkx6.1 y la insulina o las células que producen Nkx6.1 y cromogranina-A) mediante el cultivo y la diferenciación de una población de células que coexpresan PDX1 y NKX6.1 en una interconexión aire-líquido. En otra realización, las células del endodermo pancreáticas cultivadas en la interconexión aire-líquido se diferencian adicionalmente a células endocrinas pancreáticas mediante el tratamiento con un compuesto seleccionado entre los siguientes: inhibidor de ALK5, inhibidor de BMP, inhibidor de gamma-secretasa, ligandos de efrina, inhibidor de EphB, inhibidor de PKC, inhibidor de EGFr, ácido retinoico, vitamina C, T3/T4, glucosa, reguladores del ciclo celular, reguladores de WNT, inhibidor de SHH o combinaciones de los mismos.

[0091] En algunas realizaciones, las células del endodermo pancreáticas cultivadas en la interconexión aire-líquido se diferencian además en células precursoras endocrinas pancreáticas y en las células que expresan la hormona pancreáticas. En una realización alternativa, la invención abarca células preparadas mediante los métodos de la invención que expresan insulina pero no NKX6.1. En algunas realizaciones, una población de endodermo pancreático generada en la interconexión aire-líquido se trasplanta a animales diabéticos para una maduración adicional in vivo de células endocrinas pancreáticas funcionales.

Paso 4: Diferenciación de células que expresan marcadores característicos de las células del endodermo del tracto digestivo superior en células que expresan marcadores característicos de células precursoras del tracto digestivo superior pancreáticas

[0092] En una realización, los métodos de la invención incluyen el tratamiento de células del paso 3 con un medio de diferenciación que comprende un medio de crecimiento suplementado con uno o más de los siguientes: (a) un inhibidor de ALK5 seleccionado del grupo que consiste en: receptor de TGF-p inh V, receptor de TGF-p inh I, receptor de TGF-p inh IV, receptor de TGF-p inh VII, TGF- receptor p inh VIII, receptor TGF-p inh II, receptor TGF-p inh VI, receptor TGF-p inh III, inhibidor de TGF-B SB431542, SD208, ITD-1, LY2109761, A83-01, LY2157299, inhibidor de ALK5i y ALK5 II; (b) una hormona tiroidea seleccionada del grupo que consiste en T3, T4, análogos de T3, análogos de T4 y mezclas de los mismos; (c) un inhibidor del receptor suavizado seleccionado de MRT10 o ciclopamina; (d) un antagonista de la vía de señalización de SHH seleccionado entre SANT-1 o HPI-1; (e) un inhibidor del receptor de BMP seleccionado entre LDN-193189, Noggin o Cordina; (f) un activador de PKC seleccionado de TPB, PDBu, PMA e ILV; (g) un factor de crecimiento de fibroblastos seleccionado de FGF7 o FGF10; (h) ácido retinoico; (i) ácido ascórbico; (j) heparina; y (k) sulfato de zinc. Por ejemplo, un medio de crecimiento como MCDB131 o BLAR puede complementarse con un inhibidor de SMO (como MRT10 o ciclopamina) o un antagonista de la vía de señalización de SHH (como SANT-1 o HPI-1), un inhibidor de BMP (como LDN-193189, Noggin o Cordina), ácido ascórbico y un activador de PKC (como TPB, PDBu, PMA o ILV), para proporcionar un medio de diferenciación útil. El cultivo de células del paso 3 en dicho medio durante aproximadamente dos a cuatro días, preferiblemente aproximadamente tres días, normalmente es suficiente para diferenciar las células del paso 3 en células del paso 4. En otra realización, el medio puede complementarse con un inhibidor de SMO y un antagonista de la vía de señalización de SHH. En una realización preferida, las células del paso 3 pueden tratarse con un medio complementado con aproximadamente 0,25 pM de SANT-1; aproximadamente ácido retinoico 100 nM; aproximadamente 2 ng/ml de FGF7; aproximadamente 100 nM de LDN-193189; aproximadamente 0,25 mM de ácido ascórbico; y aproximadamente 100 nM de TPB durante tres días. En otra realización, el medio se complementa además con T3, tal como de aproximadamente 5 nM a aproximadamente 25 nM, alternativamente aproximadamente 10 nM de T3.

[0093] En el paso 4, las células pueden cultivarse en un cultivo planar o en la interconexión aire-líquido. Específicamente, en el presente documento se describe un cultivo celular in vitro para diferenciar células derivadas de células madre pluripotentes en la interconexión aire-líquido que comprende: (a) un recipiente de cultivo; (b) un volumen de medio de cultivo dentro de dicho recipiente suficiente para llenar sólo una parte del volumen de dicho recipiente; (c) aire dentro de dicho recipiente que llena una parte de dicho recipiente contiguo a dicho medio; (d) un sustrato poroso situado en la interfaz entre dicho medio y dicho aire; y (e) células derivadas de células madre pluripotentes dispuestas sobre la superficie de dicho sustrato de manera que dicho medio contacte sólo con una parte de la superficie de dichas células. Alternativamente, las células que expresan marcadores característicos de las células del endodermo del tracto digestivo superior se pueden diferenciar en células que expresan los marcadores característicos de las células precursoras pancreáticas del tracto digestivo superior mediante tratamiento con un medio suplementado como se describió anteriormente en un cultivo plano.

[0094] En una realización adicional, las células al final del paso 4 se pueden tratar con un inhibidor de quinasa asociada a Rho ("ROCK") tal como Y27632 ((1R,4r)-4-((R)-1-aminoetilo)-N-(piridina-4-ilo) ciclohexanocarboxamida), GSK269962 (N-[3-[[2-(4-Amino-1,2,5-oxadiazol-3-ilo)-1-etilo-1H-imidazo[4,5-c]piridina-6-ilo]oxi]fenilo]-4-[2-(4-morfolinilo)etoxi]benzamida), H1152 ((S)-(+)-2-Metilo-1-[(4-metilo-5-isoquinolinilo)sulfonilo]homopiperazina, 2HCl,) y SR3677 dihidrocloruro de (W-[2-[2-(Dimetilamino)etoxi]-4-(1H-pirazol-4-ilo)fenilo-2,3-dihidro-1,4-benzodioxina-2-carboxamida). En determinadas formas de realización, se pueden utilizar aproximadamente 10 pM del inhibidor de ROCK.

[0095] En ciertas realizaciones, solamente tarde en el paso 4 son células cultivadas en la interconexión aire-líquido. En una realización, sólo las células tardías del paso 4 que se trataron con un inhibidor de ROCK se cultivan en la interconexión aire-líquido. En determinadas realizaciones, las células se pueden tratar con una solución de desprendimiento de células, tal como una solución que contiene enzimas proteolíticas y colagenolíticas antes del cultivo en la interconexión aire-líquido.

[0096] En una realización alternativa, las células del paso 3 se pueden tratar con un medio de diferenciación que comprende un crecimiento medio suplementado con un inhibidor de ALK5, Noggin, y un activador de PKC (como TPB). En determinadas realizaciones, el medio se puede complementar con aproximadamente 0,1 pM de inhibidor de ALK5, aproximadamente 100 ng/ml de Noggin y aproximadamente 500 nM de TPB. El cultivo celular puede estar en formato monocapa. El tratamiento puede durar un total de aproximadamente tres días. En ciertas realizaciones, las células pueden tratarse durante dos días y luego, el último día, las células pueden tratarse con enzimas proteolíticas, enzimas colagenolíticas o ambas, como dispasa, y dividirse en grupos de células que tienen un diámetro de menos de aproximadamente 100 micrones seguido de cultivo en presencia de un inhibidor de ALK5 y LDN-193189. En determinadas formas de realización, los grupos de células que tienen un diámetro de menos de aproximadamente 100 micrómetros pueden cultivarse en un medio complementado con aproximadamente 200 nM de inhibidor de ALK5 y aproximadamente 100 nM de LDN-193189.

Paso 5: Diferenciación de las células que expresan marcadores característicos de células precursoras del tracto digestivo superior pancreáticas en células que expresan marcadores característicos de las células precursoras endodérmicas/endocrinas pancreáticas

[0097] En una realización, los métodos de la invención incluyen el tratamiento de células del paso 4 con un medio de diferenciación que comprende un crecimiento medio suplementado con uno o más de los siguientes: (a) un inhibidor de ALK5 seleccionado del grupo que consiste en: receptor de TGF-p inh V, receptor de TGF-p inh I, receptor de TGF-p inh IV, receptor de TGF-p inh VII, receptor de TGF-p inh VIII, receptor de TGF-p inh II, receptor de TGF-p inh VI, receptor de TGF-p inh III, inhibidor de TGF-B SB431542, SD208, ITD-1, LY2109761, A83-01, LY2157299, ALK5¡ e inhibidor II de ALK5; (b) una hormona tiroidea seleccionada del grupo que consiste en T3, T4, análogos de T3, análogos de T4 y mezclas de los mismos; (c) un inhibidor del receptor suavizado seleccionado de MRT10 o ciclopamina; (d) un antagonista de la vía de señalización de SHH seleccionado entre SANT-1 o HPI-1; (e) un inhibidor del receptor de BMP seleccionado entre LDN-193189, Noggin o Cordina; (f) un activador de PKC seleccionado de TPB, PDBu, PMA e ILV; (g) un factor de crecimiento de fibroblastos seleccionado de FGF7 o FGF10; (h) ácido retinoico; (i) ácido ascórbico; (j) heparina; y (k) sulfato de zinc, y cultivar las células en la interconexión aire-líquido durante aproximadamente dos a cuatro días, preferiblemente aproximadamente tres días, para diferenciar las células en células del paso 5. En otra realización, el medio de crecimiento se complementa con un inhibidor de SMO (como MRT10 o ciclopamina) o un antagonista de la vía de señalización de SHH (como SANT-1 o HPI-1), ácido retinoico, T3, ácido ascórbico, un inhibidor del receptor de BMP (como LDN-193189, Noggin o Cordina) y un inhibidor de ALK5. En otra realización, los métodos de la invención incluyen tratar células del paso 4 con un medio suplementado con un inhibidor de SMO, antagonista de la vía de señalización de SHH, ácido retinoico, T3, ácido ascórbico, un inhibidor del receptor de BMP y un inhibidor de ALK5 y cultivar las células en la interconexión aire-líquido durante aproximadamente dos a cuatro días, preferiblemente aproximadamente tres días, para diferenciar las células en células del paso 5. En una realización, las células del paso 4 se diferencian en células del paso 5 tratando las células con un medio suplementado con aproximadamente 0,25 pM de SANT-1, aproximadamente 50 nM de ácido retinoico, aproximadamente 0,25 mM de ácido ascórbico, aproximadamente 50 nM de LDN-193189, aproximadamente 10 nM de T3 y aproximadamente 1000 nM de inhibidor de ALK5. En determinadas realizaciones, el inhibidor de ALK5 es SD208 ((2-(5-Cloro-2-fluorofenilo)pteridina-4-ilo]piridina-4-ilo-amina). En una realización, el medio se complementa con aproximadamente 1000 nM de SD208.

[0098] En aún otra realización, los métodos de la invención incluyen el tratamiento de células del paso 4 con un medio suplementado con heparina, un inhibidor de SMO o antagonista de vía de señalización SHH, ácido retinoico, un inhibidor del receptor de BMP y un inhibidor de ALK5 y el cultivo de la células en la interconexión aire-líquido durante aproximadamente dos a cuatro días, preferiblemente aproximadamente tres días, para diferenciar las células en células del paso 5. En una realización alternativa, el medio puede complementarse con un inhibidor de SMO y un antagonista de la vía de señalización de SHH, junto con con ácido retinoico, un BMP del inhibidor del receptor y un inhibidor ALK5.

[0099] El medio puede además ser complementado con ZnSO4. Por ejemplo, aproximadamente 10 pM ZnSO4 se puede añadir. Por lo tanto, en una realización, las células del paso 4 pueden diferenciarse en células del paso 5 mediante el tratamiento de células en paso 4 con un medio suplementado con heparina, ZnSÜ4, un inhibidor de SMO o antagonista de la vía de señalización de SHH, ácido retinoico, LDN-193189 e inhibidor II de ALK5. En una realización alternativa, el medio puede complementarse con un inhibidor de SMO y un antagonista de la vía de señalización de SHH. En una realización, las células del paso 4 se diferencian en células del paso 5 tratando las células con un medio suplementado con aproximadamente 10 pg/ml de heparina, aproximadamente 0,25 pM de SANT-1, aproximadamente 50 nM de ácido retinoico, aproximadamente 50 nM de LDN-193189, aproximadamente 10 nM de T3 y aproximadamente 1000 nM de inhibidor de ALK5. Los inhibidores de ALK5 adecuados incluyen, entre otros, SD208, inhibidor II de ALK5, receptor de TGF-p en V, receptor de TGF-p en I, receptor de TGF-p en IV, receptor de TGF-p en VII, receptor de TGF-p en VIII, Receptor de TGF-p inh II, receptor de TGF-p inh VI, receptor de TGF-p inh III y combinaciones de los mismos.

[0100] En una realización, el inhibidor de ALK5 es inhibidor II de ALK5. En otra realización, se utilizan aproximadamente 1000 nM de inhibidor II de ALK5. En una realización alternativa, las células del paso 4 se tratan con un medio suplementado con aproximadamente 10 pg/ml de heparina, aproximadamente 0,25 pM SANT-1, alrededor del ácido retinoico 50 nM, aproximadamente LDN-193189 100 nM, y alrededor de 10.000 nM del inhibidor II de ALK5.

[0101] En aún otra realización alternativa, los métodos de la invención incluyen el tratamiento de células del paso 4 con un medio suplementado con un inhibidor de SMO o antagonista de vía de señalización SHH, ácido retinoico, y un inhibidor de ALK5 y cultivar las células en la interconexión aire-líquido durante aproximadamente 2 días para diferenciar las células en células del paso 5. En una realización alternativa, el medio puede complementarse con un inhibidor de SMO y un antagonista de la vía de señalización de SHH. En una realización, las células del paso 4 se diferencian en células del paso 5 tratando las células con un medio suplementado con aproximadamente 0,25 pM de SANT-1, aproximadamente 50 nM de ácido retinoico, aproximadamente 50 nM de LDN-193189 y aproximadamente 1000 nM de un Inhibidor de ALK5 (como SD208 o inhibidor II de ALK5). En ciertas realizaciones, el medio puede ser MCDB-131 (Life Technologies Corporation, Grand Island, NY).

[0102] La cantidad de células sembradas para cultivo en la interconexión aire-líquido puede variar. Por ejemplo, para cultivar las células en la interconexión aire-líquido, gotitas de una suspensión de células que contiene de aproximadamente 2 x 105 células/pl a aproximadamente 6 x 105 células/pl, 3 x 105 células/pl de aproximadamente 6 x 105 células/pl, 4 x 105 células/pl a aproximadamente 6 x 105 células/pl, 5 x 105 células/pl a aproximadamente 6 x 105 células/pl, 2 x 105 células/pl a aproximadamente 5 x 105 células/pl, 2 x 105 células/pl a aproximadamente 4 x 105 células/pl, o aproximadamente 3 x 105 células/pl se pueden sembrar en un sustrato poroso como un filtro ubicado en la interconexión aire-líquido. En algunas realizaciones, las gotas de una célula de suspensión que contiene de aproximadamente 0,5 x 105 células/pl a aproximadamente 0,75 x 105 células/pl, aproximadamente 0,6 x 105 células/pl hasta aproximadamente 0,75 x 105 células/pl, o alrededor de 0,5 x 105 células/pl a alrededor de 0,6 x 105 células/pl se siembran sobre un soporte poroso para ser cultivado en la interconexión aire-líquido.

[0103] En otra realización, los métodos de la invención incluyen tratar las células del paso 4 con un medio suplementado con un inhibidor del receptor de BMP (p. ej., LDN-193189, Noggin o Cordina) y un inhibidor de ALK5 durante aproximadamente 1 día para diferenciar las células del paso 4 en las células del paso 5. Por ejemplo, el medio puede complementarse con aproximadamente 100 nM de LDN-193189 y con aproximadamente 200 nM de inhibidor de ALK5. Preferiblemente, esta realización también incluye pretratar las células con dispasa. Las células pueden tener forma de grupos. En determinadas realizaciones, las células se pueden tratar con una solución de desprendimiento de células, tal como una solución que contiene enzimas proteolíticas y colagenolíticas antes del cultivo en la interconexión aire-líquido. En una realización, las células del paso 4 cultivadas según las realizaciones de la invención se utilizan y diferencian en células del paso 5, mientras que en otras realizaciones se pueden utilizar las células del paso 4 cultivadas según otros protocolos.

[0104] De acuerdo con el método anterior, la invención proporciona además un cultivo celular para la diferenciación de las células que expresan marcadores característicos de células precursoras del tracto digestivo superior pancreáticas en células que expresan marcadores característicos de células precursoras pancreáticas endodérmicas/pancreáticas endocrinas que comprenden: (a) un recipiente de cultivo; (b) un volumen de medio de cultivo dentro de dicho recipiente suficiente para llenar sólo una parte del volumen de dicho recipiente; (c) aire dentro de dicho recipiente que llena una parte de dicho recipiente contiguo a dicho medio; (d) un sustrato poroso situado en la interfaz entre dicho medio y dicho aire; y (e) células que expresan marcadores característicos de células precursoras pancreáticas del tracto digestivo superior derivadas de células madre pluripotentes dispuestas sobre la superficie de dicho sustrato de manera que dicho medio contacta sólo con una parte de la superficie de dichas células.

[0105] En ciertas realizaciones, el cultivo de células en el Paso 5 en la interconexión aire-líquido puede aumentar la expresión de hormonas pancreáticas. Por consiguiente, la invención también proporciona métodos para potenciar la expresión de hormonas pancreáticas cultivando células en la interconexión aire-líquido. En algunas realizaciones, las células en el Paso 5 pueden tratarse como se describe en el presente documento y en las Tablas VIII a XIII siguientes. En determinadas realizaciones, el método también puede reducir la expresión de PTF1a, SOX9, CDX2 (marcador de intestino), ZIC1 (marcador de ectodermo) y SOX2 (marcador de endodermo anterior).

[0106] En una realización, el método incluye las células diferenciadoras que expresan marcadores característicos de células precursoras del tracto digestivo superior pancreáticas de las células que expresan marcadores característicos de células endocrinas pancreáticas por tratamiento con un medio suplementado con T3/T4, o un inhibidor de ALK5 o ambos T3/T4 y un inhibidor de ALK5 y cultivo en la interfaz de líquido aéreo.

Paso 6: Diferenciación de células que expresan marcadores característicos de células precursoras pancreáticas endodérmicas/pancreáticas endocrinas en células que expresan marcadores característicos de células endocrinas pancreáticas

[0107] En una realización de la invención, los métodos incluyen el tratamiento de células del paso 5 con un medio de diferenciación que comprende un medio de crecimiento suplementado con uno o más de los siguientes: (a) un inhibidor de ALK5 seleccionado del grupo que consiste en: receptor de TGF-p inh V, receptor de TGF-p inh I, receptor de TGF-p inh IV, receptor de TGF-p inh VII, receptor TGF-p inh VIII, receptor TGF-p inh II, receptor TGF-p inh VI, receptor TGF-p inh III, inhibidor de TGF-B SB431542, SD208, ITD-1, LY2109761, A83-01, LY2157299, ALK5i e inhibidor II de ALK5; (b) una hormona tiroidea seleccionada del grupo que consiste en T3, T4, análogos de T3, análogos de T4 y mezclas de los mismos; (c) un inhibidor del receptor suavizado seleccionado de MRT10 o ciclopamina; (d) un antagonista de la vía de señalización de SHH seleccionado entre SANT-1 o HPI-1; (e) un inhibidor del receptor de BMP seleccionado entre LDN-193189, Noggin o Cordina; (f) un activador de PKC seleccionado de TPB, PDBu, PMA e ILV; (g) un factor de crecimiento de fibroblastos seleccionado de FGF7 o FGF10; (h) ácido retinoico; (i) ácido ascórbico; (j) heparina; y (k) sulfato de zinc y cultivo en la interconexión aire-líquido durante aproximadamente dos a cuatro días, preferiblemente aproximadamente tres días, para diferenciar las células del paso 5 en células del paso 6. En una realización, el medio de crecimiento se complementa con un inhibidor de SMO (como MRT10 o ciclopamina) o un antagonista de la vía de señalización de SHH (como SANT-1 o HPI-1), ácido retinoico, ácido ascórbico, T3/T4 y un inhibidor de ALK5. En una realización alternativa, el medio puede complementarse con un inhibidor de SMO y un antagonista de la vía de señalización de SHH. Las células del paso 5 se pueden diferenciar en células del paso 6 mediante el tratamiento con un medio suplementado con aproximadamente 0,25 pM de SANT-1, aproximadamente 50 nM de AR, aproximadamente 0,25 mM de ácido ascórbico, aproximadamente 500 mM de inhibidor de ALK5 y aproximadamente 0,1 nM de T3 durante unos tres días. Alternativamente, las células del paso 5 se pueden diferenciar en células del paso 6 mediante el tratamiento con un medio suplementado con aproximadamente 0,25 pM de SANT-1, aproximadamente 50 nM de ácido retinoico, aproximadamente 0,25 mM de ácido ascórbico, aproximadamente 500 nM de inhibidor de ALK5 y 10 nM de T3 durante aproximadamente tres días. Las células se pueden cultivar en dicho medio durante dos días más, o más, si se desea.

[0108] Como alternativa, células del paso 5 se pueden diferenciar en células del Paso 6 por tratamiento con un medio suplementado con heparina, un inhibidor de SMO o antagonista de vía de señalización SHH, un inhibidor de BMP, T3/T4, y un inhibidor de ALK5 y el cultivo en la interconexión aire-líquido durante aproximadamente seis a catorce días, alternativamente aproximadamente 6 días, alternativamente aproximadamente 7 días, alternativamente aproximadamente 8 días, alternativamente aproximadamente 9 días, alternativamente aproximadamente 10 días, alternativamente aproximadamente 11 días, alternativamente aproximadamente 12 días, alternativamente aproximadamente 13 días, y alternativamente aproximadamente de 14 días. En una realización alternativa, el medio puede complementarse con un inhibidor de SMO y un antagonista de la vía de señalización de SHH. Por ejemplo, las células pueden cultivarse en el medio suplementado con aproximadamente 10 pg/ml de heparina, aproximadamente 0,25 pM de SANT-1, aproximadamente 100 nM de LDN-193189, aproximadamente 1000 nM de T3 y aproximadamente 500 a aproximadamente 10.000 nM, aproximadamente 1000 a aproximadamente 10.000 nM, aproximadamente 5000 a aproximadamente 10.000 nM, aproximadamente 600 a aproximadamente 5000 nM, aproximadamente 700 a aproximadamente 5000 nM, aproximadamente 800 a aproximadamente 5000 nM, aproximadamente 900 a aproximadamente 5000 nM, aproximadamente 1000 nM a aproximadamente 5000 nM, aproximadamente 600 a aproximadamente 1000 nM, aproximadamente 700 a aproximadamente 1000 nM, aproximadamente 800 a aproximadamente 1000 nM, aproximadamente 600 a aproximadamente 1200 nM, aproximadamente 700 a aproximadamente 1200 nM, aproximadamente 800 a aproximadamente 1200 nM, aproximadamente 900 a aproximadamente 1200 nM, alternativamente aproximadamente 500 nM, alternativamente aproximadamente 1000 mM, y alternativamente aproximadamente 10.000 nM de un inhibidor de ALK5.

[0109] Los inhibidores de ALK5 adecuados incluyen, pero no se limitan a SD208, inhibidor II de ALK5, receptor TGF-p inh V, receptor TGF-p inh I, receptor TGF-p inh IV, receptor TGF-p inh VII, receptor TGF-p inh VIII, receptor de TGF-p inh II, receptor de TGF-p inh VI, receptor de TGF-p inh III y combinaciones de los mismos.

[0110] En una realización, el inhibidor de ALK5 es inhibidor II de ALK5. En otra realización, se utilizan aproximadamente 1000 nM de inhibidor II de ALK5. En consecuencia, en una realización, las células del paso 5 se pueden diferenciar en células del paso 6 mediante el tratamiento con un medio suplementado con heparina, inhibidor de SMO o antagonista de la vía de señalización de SHH, un inhibidor de BMP, inhibidor de T3/T4 e inhibidor de ALK5 y cultivo en la interconexión aire-líquido durante unos seis días. En una realización alternativa, el medio puede complementarse con un inhibidor de SMO y un antagonista de la vía de señalización de SHH. En determinadas realizaciones, las células se pueden tratar con una solución de desprendimiento de células, tal como una solución que contiene enzimas proteolíticas y colagenolíticas antes del cultivo en la interconexión aire-líquido.

[0111] En otra realización, las células del Paso 5 se pueden diferenciar en células del Paso 6 por tratamiento con un medio suplementado con heparina, un inhibidor de SMO o antagonista de vía de señalización SHH, un inhibidor de BMP, T3, y inhibidor II de ALK5 y cultivo en la interconexión aire-líquido durante aproximadamente 5 días a aproximadamente 15 días, aproximadamente 6 días a aproximadamente 14 días, aproximadamente 7 días a aproximadamente 13 días, aproximadamente 8 días a aproximadamente 12 días, aproximadamente 9 días a aproximadamente 11 días, aproximadamente 5 días a aproximadamente 10 días, aproximadamente 10 días a aproximadamente 15 días, alternativamente aproximadamente 5 días, alternativamente aproximadamente 6 días, alternativamente aproximadamente 7 días, alternativamente aproximadamente 8 días, alternativamente aproximadamente 9 días, alternativamente aproximadamente 10 días, alternativamente aproximadamente 11 días, alternativamente aproximadamente 12 días, alternativamente aproximadamente 13 días, alternativamente aproximadamente 14 días, alternativamente aproximadamente 15 días. En una realización, las células se cultivan en la interconexión aire-líquido durante 5 días o más, 6 días o más, 7 días o más, 8 días o más, 9 días o más, 10 días o más, 11 días o más, 12 días o más, 13 días o más, 14 días o más, 15 días o más. En una realización, las células se cultivan en la interconexión aire-líquido durante 15 días o menos, 14 días o menos, 13 días o menos, 12 días o menos, 11 días o menos, 10 días o menos, 9 días o menos, 8 días o menos, 7 días o menos, 6 días o menos, 5 días o menos. En una realización, las células se cultivan en la interconexión aire-líquido durante aproximadamente 10 días. En otra realización, las células se cultivan en la interconexión aire-líquido durante aproximadamente 11 días. En una realización alternativa, las células se cultivan en la interconexión aire-líquido durante aproximadamente 12 días. En otra realización más, las células se cultivan en la interconexión aire-líquido durante aproximadamente 15 días. En estas realizaciones, el medio puede complementarse con aproximadamente 10 pg/ml de heparina, aproximadamente 0,25 pM de SANT-1, aproximadamente 100 nM de LDN-193189, aproximadamente 1000 nM de T3 y aproximadamente 10.000 nM de inhibidor II de ALK5. En determinadas formas de realización, el medio se puede complementar adicionalmente con sulfato de zinc (ZnSO4). Por ejemplo, el medio puede complementarse adicionalmente con aproximadamente 10 pM de ZnSO4. En una realización alternativa, el medio puede complementarse tanto con un inhibidor de SMO como con un antagonista de la vía de señalización de SHH.

[0112] De acuerdo con el método anterior, en este documento se describe un cultivo celular para diferenciar células que expresan marcadores característicos de células precursoras pancreáticas endodérmicas/pancreáticas endocrinas en células que expresan marcadores característicos de las células endocrinas pancreáticas, que comprenden: (a) un recipiente de cultivo; (b) un volumen de medio de cultivo dentro de dicho recipiente suficiente para llenar sólo una parte del volumen de dicho recipiente; (c) aire dentro de dicho recipiente que llena una parte de dicho recipiente contiguo a dicho medio; (d) un sustrato poroso situado en la interconexión entre dicho medio y dicho aire; y (d) células que expresan marcadores característicos de células precursoras endodérmicas pancreáticas/endocrinas pancreáticas derivadas de células madre pluripotentes dispuestas sobre la superficie de dicho sustrato de manera que dicho medio contacta solo con una porción de la superficie de dichas células.

[0113] En una realización, las células del paso 5 cultivadas de acuerdo con realizaciones de la invención se utilizan y se diferenciaron en las células del paso 6, mientras que se pueden utilizar las células del paso 5 cultivadas de acuerdo con otros protocolos en otras formas de realización.

[0114] En otra realización, los métodos de la invención dan como resultado la generación de células del paso 6, que son positivas para una sola hormona. Por tanto, en una realización, los métodos de la invención dan como resultado células del paso 6 que coexpresan NKX6.1 y cromogranina-A. En otra realización, los métodos de la invención dan como resultado células del paso 6 que coexpresan NKX6.1 e insulina.

[0115] En ciertas realizaciones de la invención, el método emplea un medio personalizado de BLAR (véase la Tabla II) en los pasos 4 a 6. El medio de preferencia puede ser intercambiado cada día o, alternativamente, cada dos días. En ciertas realizaciones de la invención, los métodos incluyen tratar las células del paso 4 al paso 6 con los componentes especificados en las cantidades enumeradas en las Tablas VIII a XIII, en este documento.

[0116] En otra realización, la invención se refiere a un método de producción de las células del paso 6 que co-expresan de Nkx6.1 y cromogranina-A que comprende el cultivo en la interconexión aire-líquido en los pasos 4 a 6, preferiblemente pasos 5 y 6. En aún otra realización, la invención se refiere a un método de producción de células positivas de insulina monohormonal que expresan células Nkx6.1 mediante el cultivo en la interconexión aire-líquido en los pasos 4 a 6, preferiblemente pasos 5 a 6.

[0117] El cultivo de las células en la interconexión aire-líquido durante o después del paso 4 puede mejorar significativamente la expresión de los marcadores del endodermo pancreático junto con los marcadores relacionados con el sistema endocrino. Por consiguiente, la invención proporciona métodos para potenciar la expresión del endodermo pancreático y marcadores relacionados con el sistema endocrino cultivando células durante o después del paso 4 en la interconexión aire-líquido.

[0118] En otra realización, la invención también proporciona métodos para aumentar el rendimiento de células positivas Nkx6.1 que co-expresan la insulina, cromogranina-A o cromagranina-A y la insulina mediante el cultivo de células del paso 4 y células subsiguientes en la interconexión aire-líquido en presencia de un inhibidor de ALK5. En una realización, el inhibidor de ALK5 es el inhibidor II de ALK5. Otros inhibidores de ALK 5 adecuados incluyen, pero no se limitan a receptor de TGF-p inh V, receptor de TGF-p inh I, receptor de TGF-p inh IV, receptor de TGF-p inh VII, receptor de TGF-p inh VIII, receptor TGF-p inh II, receptor de TGF-p inh VI, receptor de TGF-p inh III y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, además del inhibidor de ALK5, las células pueden tratarse como se describe en las Tablas VIII a XIII a continuación.

[0119] En una realización, la invención proporciona métodos para aumentar las células positivas Nkx6.1 que co expresan insulina, cromogranina-A o cromagranina-A e insulina por cultivo de células durante el paso 5 en la interconexión aire-líquido en la presencia de inhibidor II de ALK5. En una realización, el método comprende además cultivar células durante el paso 5 en presencia del inhibidor II y T3 de ALK5.

Maduración in vivo de las células del paso 6

[0120] En ciertas realizaciones de la divulgación, las células de paso 6 preparadas de acuerdo con los métodos de la invención pueden ser maduradas adicionalmente in vivo. En una realización, estas células pueden madurar más mediante trasplante in vivo en un mamífero. Por ejemplo, las células se pueden trasplantar debajo de la cápsula renal de un ratón. En una realización, las células del paso 6 que maduran más in vivo son células que coexpresan NXK6.1 e insulina. En otra realización, las células del paso 6 que maduran más in vivo son células que coexpresan NXK6.1 y cromagranina. En una realización alternativa del documento, la maduración in vivo de (a) células que coexpresan NXK6.1 e insulina o (b) células que coexpresan NXK6. 1 y cromagranina dan como resultado la producción temprana de péptido C. En determinadas realizaciones, el nivel de producción de péptido C a partir del trasplante de aproximadamente 3 millones de células del paso 6 es similar a la cantidad de péptido C producido al trasplantar aproximadamente 3.000 islotes humanos.

[0121] El cultivo en la interconexión aire-líquido de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento también es muy adecuado para su uso en la selección de compuestos por su efecto sobre la secreción de hormonas pancreáticas y marcadores endocrinos. En particular, las células del paso 4 al paso 6 cultivadas en la interconexión aire-líquido se pueden usar en varios formatos de cultivo, incluidos formatos de 384 a 6 pocillos, para evaluar el efecto que tiene la inclusión de una variedad de moléculas pequeñas o biológicas, en varias dosis e intervalos de tiempo, tienen en la expresión subsiguiente de endodermo pancreático, precursor endocrino pancreático, endocrino pancreático y marcadores de células p pancreáticas. Tal evaluación se puede realizar midiendo la expresión génica por PCR, la expresión de proteínas por FACS, tinción inmune o por ELISA para la secreción de factores por células afectadas por la adición de moléculas pequeñas o biológicas.

Células que pueden obtenerse por los métodos de la invención

[0122] La invención también proporciona una célula o población de células que se pueden obtener por un método de la invención. La invención también proporciona una célula o población de células obtenidas mediante un método de la invención.

[0123] La invención también proporciona una célula o población de células, preferiblemente que expresan marcadores característicos de células endocrinas pancreáticas, caracterizados por co-expresión significativa de Nkx6.1 y cromogranina-A. La invención también proporciona una célula positiva para insulina o una población de células positivas para insulina, que expresan preferiblemente marcadores característicos de las células endocrinas pancreáticas, caracterizados por la expresión de NKX6.1 (opcionalmente >30%). Estas son poblaciones de células no descritas previamente como se explica en el Ejemplo 10.

Métodos de tratamiento

[0124] Se describen en este documento métodos de tratamiento. En particular, métodos para tratar a un paciente que padece o corre el riesgo de desarrollar diabetes.

[0125] La invención también proporciona una célula o población de células que se pueden obtener o se obtienen por un método de la invención para uso en un método de tratamiento. En particular, la invención proporciona una célula o población de células que se pueden obtener o se obtienen mediante un método de la invención para su uso en un método de tratamiento de un paciente que padece o está en riesgo de desarrollar diabetes.

[0126] La diabetes puede ser diabetes de tipo 1 o de tipo 2.

[0127] En una realización, el método de tratamiento comprende implantar células obtenidas u obtenibles mediante un método de la invención en un paciente.

[0128] En una realización, el método de tratamiento comprende diferenciar las células madre pluripotentes in vitro en células del paso 1, paso 2, paso 3, paso 4, paso 5 o paso 6, por ejemplo, como se describe en este documento, e implantar las células diferenciadas en un paciente.

[0129] En una realización, el método comprende además la etapa de cultivar células madre pluripotentes, por ejemplo como se describe en este documento, antes de la etapa de diferenciar las células madre pluripotentes.

[0130] En una realización, el método comprende además la etapa de diferenciación de las células in vivo, después de la etapa de implantación.

[0131] En una realización, el paciente es un mamífero, preferiblemente un ser humano.

[0132] En una realización, las células pueden ser implantadas como células dispersadas o formadas en grupos que se pueden infundir en la vena portal hepática. Alternativamente, las células pueden proporcionarse en soportes poliméricos degradables biocompatibles, dispositivos porosos no degradables o encapsulados para proteger de la respuesta inmune del huésped. Las células pueden implantarse en un sitio apropiado en un receptor. Los sitios de implantación incluyen, por ejemplo, el hígado, páncreas natural, espacio subcapsular renal, epiplón, peritoneo, espacio subseroso, intestino, estómago o una bolsa subcutánea.

[0133] Para mejorar aún más la diferenciación, la supervivencia o la actividad de las células implantadas in vivo, los factores adicionales, tales como factores de crecimiento, antioxidantes o agentes anti-inflamatorios, se pueden administrar antes, simultáneamente con, o después de la administración de las células. Estos factores pueden ser secretados por células endógenas y expuestos a las células administradas in situ. Las células implantadas pueden inducirse a diferenciarse mediante cualquier combinación de factores de crecimiento administrados endógenos y exógenos conocidos en la técnica.

[0134] La cantidad de células utilizadas en la implantación depende de varios factores que incluyen el estado del paciente y la respuesta a la terapia, y puede ser determinada por un experto en la técnica.

[0135] En una realización, el método de tratamiento comprende además incorporar las células en un tridimensional de soporte antes del implante. Las células se pueden mantener in vitro sobre este soporte antes de la implantación en el paciente. Alternativamente, el soporte que contiene las células puede implantarse directamente en el paciente sin cultivo in vitro adicional. El soporte se puede incorporar opcionalmente con al menos un agente farmacéutico que facilite la supervivencia y la función de las células trasplantadas.

EJEMPLOS

Ejemplo de Referencia 1

Cultivo de células precursoras endocrinas pancreáticas en la interconexión aire-líquido

[0136] Este ejemplo examina y demuestra que las células precursoras endocrinas pancreáticas (células de Paso 5) pueden ser maduradas adicionalmente sobre el cultivo en la interconexión aire-líquido. Para cultivar células precursoras endocrinas pancreáticas en la interconexión aire-líquido, las células madre embrionarias se diferenciaron en células precursoras endocrinas pancreáticas según el protocolo que se analiza a continuación.

[0137] Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 se sembraron como células individuales a 1 x 105 células/cm2 en placas recubiertas de Matrigel™ (1:30 dilución; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) en medio mTESR®1 (StemCell Technologies, Vancouver, Canadá) complementado con 10 pM de Y27632 (inhibidor de rocas, número de catálogo Y0503, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se lavaron en PBS incompleto (solución salina tamponada con fosfato sin Mg o Ca). A continuación, las células se diferenciaron de acuerdo con el siguiente protocolo:

a) Paso 1: (3 días): 60-70% de cultivos adherentes confluentes de células H1 indiferenciadas sembradas en superficies recubiertas con MATRIGEL™ 1:30 se expusieron a medio GIBCO® RPMI 1640 (Life Technologies Corporation, Grand Island, NY) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 0,2% (Hyclone, Utah), 100 ng/ml de activina A (AA; Pepro-tech; Rocky Hill, NJ) y 20 ng/ml de Wnt3A (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN) solo durante el primer día. Durante los dos días siguientes, las células se cultivaron en GIBCO® RPMI con FBS al 0,5% y 100 ng/ml de AA.

b) Paso 2: (3 días): Las células del paso 1 se expusieron luego al medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM-F12) (Life Technologies Corporation, NY) suplementado con FBS al 2% y 50 ng/ml de FGF7 (Peprotech) por tres días.

c) Paso 3: (4 días): Las células del paso 2 se cultivaron luego durante cuatro días en medio DMEM-HG (Life Technologies Corporation, Grand Island, NY) suplementado con 0,25 pM SANT-1 (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO) , ácido retinoico 2 pM (Sigma-Aldrich), 100 ng/ml de Noggin (R&D Systems) y 1% (v/v) de un suplemento vendido bajo la marca comercial B27® por Life Technologies Corporation, Grand Island, NY (Cat. N°: 17504044).

d) Paso 4: (3 días): Las células del paso 3 se cultivaron luego durante tres días en medio DMEM-HG suplementado con inhibidor de ALK50,1 pM (ALK5i; Axxora, San Diego, CA), 100 ng/ml de Noggin, TPB 500 nM ((2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(Trifluorometilo)fenilo)-2,4-pentadienoilamino)benzolactama; EMD Chemicals Inc, Gibbstown NJ) y 1% de B27 en formato monocapa. Para el último día de cultivo, las células se trataron con 5 mg/ml de dispasa (Becton Dickinson, Bedford, MA, # 354235) durante 5 minutos, seguido de un pipeteado suave para mezclar y romper en grupos de células (<100 micrones). Los grupos de células se transfirieron a un matraz Spinner de poliestireno desechable de 125 ml (Corning) y se centrifugaron a 80 a 100 rpm durante la noche en suspensión con DMEM-HG suplementado con inhibidor de ALK5200 nM, LDN-193189 100 nM (Stemgent, CA), y 1% B27.

e) Paso 5: (1 día): Las células del paso 4 se trataron luego con 5 mg/ml de dispasa durante 5 minutos, seguido de un pipeteado suave para mezclar y dividir en grupos de células (<100 micrómetros). Los grupos de células se transfirieron a un frasco Spinner de poliestireno desechable de 125 ml (Corning, NY) y se centrifugaron a 80 a 100 rpm durante la noche en suspensión con DMEMHG suplementado con inhibidor de ALK5200 nM, LDN-193189 100 nM (Stemgent, CA), y 1% B27.

[0138] Los grupos del paso 5 del día 1 se sembraron en insertos de filtro de cultivo celular poroso de 0,4 micrones (BD Biosciences, membranas de PET, # 353493) en placas de 6 pocillos (en alícuotas de 10 microlitros que contenían aproximadamente 1 millón de células) y se cultivaron durante 3 semanas a la interconexión aire-líquido agregando 1,5 ml de DMEM-HG 1 % B27 en la parte inferior del inserto y sin medios encima del inserto. FIGS. 1 A a H representan imágenes de contraste de fase de los grupos en varios puntos de tiempo posteriores a la siembra en la interconexión aire-líquido. FIGS. 2 A a K muestran los resultados de inmunotinción para las siguientes proteínas 1 semana después de la siembra de los grupos de células en los filtros: DAPI (FIG. 2a ); insulina (FIG. 2B); HB9 (FIG. 2C); DAPI (FIG.

2D); glucagón (FIG. 2E); insulina (FIG. 2F); DAPI (FIG. 2G); insulina (FIG. 2H); somatostatina (FIG. 21); NKX6.1 (FIG.

2J); e insulina (FIG. 2K). Mientras que las FIGS. 3 A a H representan los resultados de inmunotinción para las siguientes proteínas 2 semanas después de la siembra en los filtros: insulina (FIG. 3A); glucagón (FIG. 3B); insulina (FIG. 3C); somatostatina (FIG. 3D); insulina (FIG. 3E); NKX6.1 (FIG. 3F); HB9 (FIG. 3G); y NKX6.1 (FIG. 3H). En la FIG. 2, los paneles A-C, D-F, G-I y J-K se tomaron de los mismos campos. En la Fig. 3, los paneles A-B, C-D, E-F y G-H, respectivamente, se tomaron de los mismos campos. FIGS. 4 A a D representan los resultados de la inmunotinción para las siguientes proteínas 3 semanas después de la siembra en los filtros: insulina (Fig. 4A); glugacón (FIG. 4B); insulina (FIG. 4C); y somatostatina (FIG. 4D). En la FIG. 4, los paneles A-B y C-D, respectivamente, se tomaron de los mismos campos.

[0139] En el paso 4 y cultivos posteriores, el ARNm se recogió para el análisis por PCR de genes endodérmicos/endocrinos pancreáticos relevantes. El ARN total se extrajo con el RNeasy® Mini Kit (Qiagen; Valencia, CA) y se sometió a transcripción inversa utilizando un kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc se amplificó usando Taqman Universal Master Mix y Taqman Gene Expression Assays que se precargaron en Taqman Arrays personalizados (Applied Biosystems). Los datos se analizaron utilizando el software de detección de secuencias (Applied Biosystems) y se normalizaron a células madre embrionarias humanas indiferenciadas (hES) utilizando el método AACt ((es decir, resultados de qPCR corregidos con controles internos (AACt = ACtmuestra - ACtreferencia)). Todos los cebadores se compraron de Applied Biosystems. FACS y análisis de inmunofluorescencia se realizaron como se ha descrito previamente (Diabetes, 61,20126, 2012).

[0140] FIGS. 5A a R representan datos de análisis PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas como se describe en el Ejemplo 1: PDX1 (FIG. 5A); NKX6.1 (FIG. 5B); Pax4 (FIG. 5C); Pax6 (FIG. 5D); NGN3 (FIG. 5E); NKX2.2 (FIG. 5F); ABCC8 (FIG. 5G); cromogranina-A (FIG. 5H); PCSK1 (FIG. 5I); IAPP (FIG. 5J); insulina (FIG. 5K); glucagón (FIG. 5L); somatostatina (FIG. 5M); grelina (FIG. 5N); Ptfla (FIG. 5O); Zic1 (FIG. 5P); CDX2 (FIG. 5Q); y SOX9 (FIG. 5R). Después de un cultivo de 3 semanas en la interconexión aire-líquido, hubo un aumento significativo dependiente del tiempo en la expresión de marcadores asociados con la maduración de células endocrinas, como ABCC8, IAPP (Amylin) y PCSK1. Hubo una caída significativa en la expresión de PTF1a y SOX9 y una expresión muy baja de CDX2 (marcador intestinal), ZIC1 (marcador de ectodermo) y SOX2 (marcador de endodermo anterior), mientras que la expresión de NKX6.1 y PDX1 se mantuvo en un nivel muy alto. La expresión de todas las hormonas pancreáticas mejoró significativamente durante el período de cultivo de 3 semanas en la interconexión aire-líquido.

Ejemplo de referencia 2

Cultivo de células precursoras endocrinas pancreáticas en la interconexión aire-líquido utilizando varios insertos de filtro

[0141] Este ejemplo examina el tipo y la porosidad de los insertos de filtro en la diferenciación de las células de endodermo pancreático en la interconexión aire-líquido. Para examinar los efectos del tipo y la porosidad de los insertos de filtro, se diferenciaron las células madre embrionarias utilizando el protocolo que se analiza a continuación.

[0142] Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (paso 40) se sembraron como células individuales en 1 x 105 células/cm2 en placas recubiertas de Matrigel™ (1:30 de dilución; BD Biosciences, NJ) o insertos de filtro recubiertos de MATRIGEL™ (Millipore PIHT 30R 48) en un medio que comprende DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (dilución 1:100, Invitrogen), ácido ascórbico 0,25 mM (Sigma, MO), 100 ng/ml de FGF2 (R&D Systems, MN), 1 ng/ml de TGF-p (R&D Systems), ITS-X (dilución 1:100), BSA libre de ácidos grasos al 2% (Lampire, PA) y 20 ng/ml de IGF-1 (R&D Systems), complementado con 10 pM de Y27632 (Rock inhibitor, Cat. N° Y0503, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se lavaron en PBS incompleto (solución salina tamponada con fosfato sin Mg o Ca). A continuación, las células se diferenciaron de acuerdo con el siguiente protocolo:

a. Paso 1 (3 días): Las células se cultivaron durante un día en medio MCDB-131 (Cat. N° de Invitrogen 10372 019) suplementado con BSA sin ácidos grasos al 2% (Proliant, Cat. N°68700), 0,0012 g/ml de sodio bicarbonato (SigmaAldrich, Cat. N° S3187), 1X GlutaMax™ (Invitrogen, Cat. N° 35050-079), D-glucosa 4,5 mM (SigmaAldrich, Cat. N° G8769), 100 ng/ml de GDF8 (R&D Systems) y 1 pM de Compuesto MCX. A continuación, las células se cultivaron durante un día más en medio MCDB-131 complementado con BSA sin ácidos grasos al 2%, 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio, 1X GlutaMax™, D-glucosa 4,5 mM, 100 ng/ml de GDF8 y 0,1 pM de Compuesto MCX. Posteriormente, las células se cultivaron durante un día adicional en medio MCDB-131 complementado con BSA sin ácidos grasos al 2%, 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio, 1X GlutaMax™, D-glucosa 4,5 mM y 100 ng/ml de GDF8.

b. Paso 2 (2 días): Las células del paso 1 se trataron luego durante dos días con medio MCDB-131 complementado con BSA sin ácidos grasos al 2%; 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio; 1X GlutaMax™; D-glucosa 4,5 mM; ácido ascórbico 0,25 mM (Sigma, MO) y 25 ng/ml de FGF7 (R&D Systems, MN).

c. Paso 3 (2 días): Las células del paso 2 se trataron luego con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1: 200 de ITS-X (Invitrogen, CA); Glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0017 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 0,25 pM SANT-1 (Sigma, MO); 1 pM RA (Sigma, MO); 25 ng/ml de FGF7; ácido ascórbico 0,25 mM; TPB 200 nM (activador de Pk C; Cat. N° 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); y LDN-193189 100 nM (inhibidor del receptor de BMP; Cat. N° 04-0019; Stemgent) durante dos días.

d. Paso 4 (3 días): Las células del paso 3 se trataron luego con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0017 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 0,25 pM SANT-1; RA 100 nM; 2 ng/ml de FGF7; LDN-193189 100 nM; ácido ascórbico 0,25 mM; T3 10 nM (T6397, Sigma) y TPB 100 nM durante tres días.

e. Paso 5 (3 días): Las células del paso 4 se trataron luego con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 0,25 pM SANT-1; RA 50 nM; ácido ascórbico 0,25 mM; T3 10 nM, LDN-193189 50 nM; inhibidor SD208 de ALk 51000 nM, durante tres días. SD208 (2-(5-cloro-2-fluorofenilo)pteridina-4-ilo]piridina-4-ilo-amina) es una pteridina 2,4-disustituida, inhibidor competitivo de ATP de la quinasa TGF-pRI, descrito en Molecular Pharmacology 2007, 72: 152-161, y que tiene la estructura mostrada en la Fórmula I.

Fórmula 1:

f. Paso 6 (5 días): Las células del paso 5 se trataron luego con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 0,25 pM SANT-1; RA 50 nM; ácido ascórbico 0,025 mM; Inhibidor de ALK5500 nM; T30,1 nM durante tres días.

[0143] En algunas culturas, en el paso 3 al paso 6, las células cultivadas en placas planares fueron tratadas con 1X ACCUTASE™ (StemCell Tech, Vancouver) durante 1-3 minutos a temperatura ambiente seguido de la eliminación de la enzima y el raspado de las células por un raspador celular. La suspensión resultante de las células se sembraron a una densidad de aproximadamente 2-6 x 106 células en 0,4 insertos de filtro de cultivo de células porosas micras con un área superficial de aproximadamente 4,2 cm2 en placas de 6 pocillos. Los diversos insertos de filtro usados se identifican en la Tabla I. Se añadieron 1,5 ml de medio al fondo de cada inserto y no se añadió más medio al lado apical del filtro. En algunos cultivos, los filtros se recubrieron durante 1 hora a temperatura ambiente con MATRIGEL™ (dilución 1:30) y las células se sembraron en la parte superior de los insertos recubiertos en la interconexión airelíquido o con el medio en la parte superior del inserto. Los medios fueron reemplazados cada dos días durante la duración del estudio.

[0144] FIG. 6 representa datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas como se describe en el Ejemplo 2: PDX1 (FIG.

6A); NKX6.1 (FIG. 6B); PAX4 (FIG. 6C); PAX6 (FIG. 6D); NGN3 (FIG. 6E); NKX2.2 (FIG. 6F); ABCC8 (FIG. 6G); cromogranina-A (FIG. 6H); PCSK1 (FIG. 6I); IAPP (FIG. 6J); insulina (FIG. 6K); y glucagón (FIG. 5L). El cultivo de células del paso 4 en insertos de filtro (Corning, 3412, BD 353493 y Millipore PIHT 30R 48) mejoró significativamente los marcadores del endodermo pancreático junto con los marcadores relacionados con el sistema endocrino. El recubrimiento de los filtros con MATRIGEL™ disminuyó significativamente los beneficios de cultivar en el filtro en la interconexión aire-líquido. Además, las células cultivadas en insertos de filtro de baja densidad de poros (BD 353090, Corning 3452) mostraron menos supervivencia y diferenciación.

Ejemplo de referencia 3

Las células del endodermo pancreáticas cultivadas en la interconexión aire-líquido mostraron una expresión mejorada de marcadores endocrinos en comparación con cultivos planos o cultivos mantenidos en filtros en la interconexión líquido-líquido

[0145] Este ejemplo se refiere a las diferencias en la propensión de la diferenciación de las células de endodermo pancreático cultivadas en sustratos planos en comparación con las cultivadas en la interconexión aire-líquido. Además, el efecto de la interconexión aire-líquido se destacó aún más al diferenciar las células en los insertos, pero con medios agregados tanto en la parte superior como en la inferior de los insertos.

[0146] Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (paso 40) se sembraron como células individuales en 1 x 105 células/cm2 en placas recubiertas de Matrigel™ (1:30 de dilución; BD Biosciences, NJ) o insertos de filtro recubiertos de MATRIGEL™ (Millipore PIHT 30R 48) en un medio que comprende DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (dilución 1:100, Invitrogen), ácido ascórbico 0,25 mM (Sigma, MO), 100 ng/ml de FGF2 (r &D Systems, MN), 1 ng/ml de TGF-p (R&D Systems), ITS-X (dilución 1:100), BSA libre de ácidos grasos al 2% (Lampire, PA) y 20 ng/ml de IGF-1 (R&D Systems), complementado con 10 pM de Y27632 (Rock Inhibitor, Cat. N° Y0503, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se lavaron en PBS incompleto (solución salina tamponada con fosfato sin Mg o Ca). Para las células cultivadas en insertos de filtro, al comienzo del paso 1, en algunos cultivos se agregó medio solo en la parte inferior del inserto y la parte superior del inserto se mantuvo en la interconexión aire-líquido, mientras que en otros cultivos también se agregó medio, tanto en la parte superior del elemento filtrante como en la parte inferior del elemento filtrante. A continuación, las células se diferenciaron de acuerdo con el siguiente protocolo:

a) Paso 1 (3 días): Las células se cultivaron durante un día en medio MCDB-131 (Invitrogen, Cat. N° 10372 019) suplementado con 2% libre de ácidos grasos. BSA (Proliant, Cat. N° 68700), 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio (SigmaAldrich, Cat. N° S3187), 1X GlutaMax™ (Invitrogen, Cat. N° 35050-079), D-glucosa 4,5 mM (Sigma-Aldrich, Cat. N° G8769), 100 ng/ml de GDF8 (R&D Systems) y compuesto MCX 1 pM. A continuación, las células se cultivaron durante un día más en medio MCDB-131 complementado con BSA sin ácidos grasos al 2%, 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio, 1X GlutaMax™, D-glucosa 4,5 mM, 100 ng/ml de GDF8 y 0,1 pM de Compuesto MCX. Posteriormente, las células se cultivaron durante un día adicional en medio MCDB-131 complementado con BSA sin ácidos grasos al 2%, 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio, 1X GlutaMax™, D-glucosa 4,5 mM y 100 ng/ml de GDF8.

b) Paso 2 (2 días): A continuación, las células del paso 1 se trataron durante dos días con medio MCDB-131 complementado con BSA sin ácidos grasos al 2%; 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio; 1X GlutaMax™; D-glucosa 4,5 mM; ácido ascórbico 0,25 mM (Sigma, MO) y 25 ng/ml de FGF7 (R&D Systems, MN).

c) Paso 3 (2 días): Las células del paso 2 se trataron luego con medio BLAR personalizado (fabricado por Invitrogen, consulte la Tabla II para conocer los componentes de los medios BLAr ) complementado con una dilución 1:200 de ITS-X (Invitrogen, CA); Glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0017 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 0,25 pM SANT-1 (Sigma, MO); 1 pM RA (Sigma, MO); 25 ng/ml de FGF7; ácido ascórbico 0,25 mM; TPB 200 nM (activador de Pk C; Cat. N° 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); y LDN-193189 100 nM (inhibidor del receptor de BMP; Cat. N° 04-0019; Stemgent) durante dos días.

d) Paso 4 (3 días): Las células del paso 3 se trataron luego con medio BLAR suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0017 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 0,25 pM SANT-1; RA 100 nM; 2 ng/ml de FGF7; LDN-193189 100 nM; ácido ascórbico 0,25 mM; T3 10 nM (T6397, Sigma) y TPB 100 nM durante tres días.

e) Paso 5 (3 días): Las células del paso 4 se trataron con medio BLAR suplementado con una dilución 1:200 de ITSX; Glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 0,25 pM SANT-1; RA 50 nM; ácido ascórbico 0,25 mM; T3 10 nM; LDN-193189 50 nM; Inhibidor de ALK5 1000 nM (SD208) durante tres días.

f) Paso 6 (5 días): Las células del paso 5 se trataron luego con medio BLAR suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 0,25 pM SANT-1; RA 50 nM; ácido ascórbico 0,025 mM; inhibidor de ALK5500 nM; T30,1 nM durante tres días.

[0147] En algunos cultivos, al final del paso 3, las células cultivadas en placas planares fueron tratadas con 1X Accutase™ (StemCell Tech, Vancouver) durante 1-3 minutos a temperatura ambiente seguido de la eliminación de la enzima y el raspado de las células por un raspador celular. La suspensión resultante de las células se sembraron a una densidad de 2-6 x 106 células (en alícuotas de 50-100 pl) en 0,4 micras de insertos de filtro de cultivo de células porosas (BD 353493) en placas de 6 pocillos. Se añadieron 1,5 ml de medio al fondo de cada inserto y no se añadió más medio al lado apical del filtro. El medio se reemplazó cada día otro día durante la duración del estudio. El medio se reemplazó cada día.

[0148] FIG. 7 representa datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas como se describe en el Ejemplo 3: PDX1 (FIG.

7A); NKX6.1 (FIG. 7B); PAX4 (FIG. 7C); PAX6 (FIG. 7D); NGN3 (FIG. 7E); NKX2.2 (FIG. 7F); ABCC8 (FIG. 7G); cromogranina-A (FIG. 7H); PCSK1 (FIG. 7I); IAPP (FIG. 7J); insulina (FIG. 7K); y glucagón (FIG. 7L).

[0149] El cultivo de células en insertos de filtro en la interconexión aire-líquido en los pasos 4 a 6, mejoró significativamente los marcadores relacionados con el sistema endocrino pancreático. Además, las células cultivadas y diferenciadas en insertos de filtro recubiertos con MATRIGEL™ desde el inicio del paso 1 con medio en la parte superior e inferior de los insertos de filtro mostraron niveles más bajos de endodermo pancreático y expresión endocrina en comparación con las células cultivadas en cultivos planos o en la interconexión aire-líquido. Además, las células del endodermo pancreáticas cultivadas en insertos de filtro en la interconexión aire-líquido mostraron la mayor expresión de células endocrinas pancreáticas en comparación con todas las configuraciones probadas.

Ejemplo de referencia 4

Las células del endodermo pancreáticas cultivadas en la interconexión aire-líquido y tratadas con el inhibidor II de ALK5 mostraron un número significativamente mayor de células positivas por NKX6.1 que coexpresaban cromogranina-a e insulina

[0150] Este ejemplo se llevó a cabo para mostrar que el inhibidor II de ALK5 era único en la generación de una población significativa de las células en la interconexión aire-líquido que expresa Nkx6.1 y la insulina o cromogranina-A. Además, esta observación fue exclusiva de los cultivos en la interconexión aire-líquido. Los cultivos sumergidos en cultivos planos en monocapa no mostraron un número significativo de células NKX6.1 que expresaban insulina o cromogranina-A.

[0151] Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (paso 40) se sembraron como células individuales en 1 X 105 células/cm2 en placas recubiertas Matrigel™ (01:30 de dilución; BD Biosciences, NJ) o insertos de filtro recubiertos de Matrigel (Millipore PIHT 30R 48) en un medio que comprende DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), Glutamax (dilución 1:100, Invitrogen), ácido ascórbico 0,25 mM (Sigma, Mo), 100 ng/ml de FGF2 (R&D Systems, MN), 1 ng/ml de TGF-B (R&D Systems), ITS-X (dilución 1:100), BSA libre de ácidos grasos al 2% (Lampire, pA) y 20 ng/ml de IGF-1 (R&D Systems), complementado con 10 pM de Y27632 (Rock Inhibitor, Cat. N° Y0503, SigmaAldrich, St. Louis, MO). Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se lavaron en PBS incompleto (solución salina tamponada con fosfato sin Mg o Ca). A continuación, las células se diferenciaron de acuerdo con el siguiente protocolo:

a) Paso 1 (3 días): las células se cultivaron durante un día en medio MCDB-131 (Cat. N° de Invitrogen 10372 019) suplementado con BSA sin ácidos grasos al 2% (Proliant Cat. N° 68700), 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio (Cat. N° SigmaAldrich S3187), 1X GlutaMax™ (Cat. N° de Invitrogen 35050-079), D-glucosa 4,5 mM (Cat. N° SigmaAldrich G8769), 100 ng/ml GDF8 (R&D Systems) y compuesto MCX 1 pM. Después, las células se cultivaron durante un día más en medio MCDB-131 complementado con BSA sin ácidos grasos al 2%, 0,0012 g/ml de bicarbonato de carbonato de sodio, 1X GlutaMax™, D-Glucosa 4,5 mM, GDF8 100 ng/ml y compuesto MCX 0,1 pM. Después, las células se cultivaron durante un día más en medio MCDB-131 complementado con BSA sin ácidos grasos al 2%, 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio, 1X GlutaMax™, D-glucosa 4,5 mM y 100 ng/ml de GDF8.

c) Paso 3 (2 días): las células del paso 2 se trataron luego con medio BLAR personalizado (Invitrogen) complementado con una dilución 1:200 de ITS-X (Invitrogen, Ca); Glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0017 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 0,25 pM SANT-1 (Sigma, MO); 1 pM RA (Sigma, MO); 25 ng/ml de FGF7; ácido ascórbico 0,25 mM; TPB 200 nM (activador de PKC; Cat. N° 565740; EMD Chemicals, Gibstown, NJ); y LDN-193189100 nM (inhibidor del receptor de BMP; Cat. N° 04-0019; Stemgent) durante dos días.

d) Paso 4 (3 días): A continuación, las células del paso 3 se trataron con medio BLAR complementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0017 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 0,25 pM SANT-1; RA 100 nM; 2 ng/ml de FGF7; LDN-193189100 nM; ácido ascórbico 0,25 mM; y TPB 100 nM durante tres días.

e) Paso 5 (- 3 días): Las células del paso 4 se trataron luego con medio BLAR suplementado con una dilución 1:200 de iTs -X; Glucosa 20 mM; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 0,25 pM SANT-1; RA 50 nM; LDN 50 nM; 500-1000 nM de varios inhibidores de ALK5 (consulte la lista de inhibidores utilizados en la Tabla III) durante tres días.

f) Paso 6 (7 días): Las células del paso 5 se trataron luego con medio BLAR suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 20 mM; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 0,25 pM SANT-1; RA 50 nM; inhibidor de ALK5500-1000 nM (consulte la Tabla III para ver la lista de inhibidores probados).

[0152] En algunos cultivos, en el final de un día del paso 4, las células cultivadas en placas planares fueron tratadas con 1X Accutase (StemCell Tech, Vancouver) durante 1-3 min a temperatura ambiente seguido de la eliminación de la enzima y el raspado de células por un raspador de células. La suspensión resultante de las células se sembraron a una densidad de 2-4 X 106 células (en alícuotas de 25-50 pL) en 0,4 micras de insertos de filtro de cultivo de células porosas (BD 353493) en placas de 6 pocillos. Se añadieron 1,5 ml de medio al fondo de cada inserto y no se añadió más medio al lado apical del filtro. Los medios fueron reemplazados cada dos días durante la duración del estudio.

[0153] La Figura 8 representa datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas y cultivadas en la interconexión airelíquido como se describe en el Ejemplo 4 después del día 1 del paso 4, día 3 del paso 5 y día 6 del paso 6 en la interconexión aire-líquido: PDX1 (FIG. 8A), NKX6.1 (FIG. 8B), NGN3 (FIG. 8C), ABCC8 (FIG. 8D), PCSK1 (FIG. 8E), grelina (FIG. 8F), glucagón (FIG. 8G) e insulina (FIG. 8H).

[0154] La Figura 9 representa datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas como se describe en el Ejemplo 4 y cultivadas en cultivos de monocapa plana en el día 3 del paso 5 y el día 4 del paso 6 para PDX1 (FIG. 9A), NKX6.1 (FIG. 9B), NGN3 (FIG. 9C), ABCC8 (FIG. 9D), PCSK1 (FIG. 9E), Grelina (Fig. 9F), glucagón (FIG. 9G) e insulina (FIG.

9H). La comparación de las figuras 8 y 9 revela que el tratamiento de cultivos planos en el paso 5 y el paso 6 con el inhibidor II de ALK5 dio como resultado una caída en la expresión de insulina en el paso 6 en comparación con el paso 5. Sin embargo, el tratamiento de cultivos en la interconexión aire-líquido con el inhibidor de ALK5 dio como resultado un aumento de la expresión de insulina en el paso 6 en comparación con la paso 5. El mismo patrón también se aplicó a la expresión de NGN3 y NKX6.1 en los cultivos de interconexión aire-líquido en comparación con los cultivos de monocapa.

[0155] La Figura 10 muestra los resultados de inmunotinción para las células del paso 6 cultivadas en la interconexión aire-líquido en medios tratados con un inhibidor de SD208 micromolar (Panel 9A) o un inhibidor II de ALK5 micromolar II (Panel 10B) y teñidos para cromogranina-A (marcador pan-endocrino) y NKX6.1 (marcador precursor pancreático y marcador específico de células p). Los cultivos tratados con el inhibidor II de ALK5 dieron como resultado la coexpresión de NKX6.1 y cromogranina-A. Sin embargo, los cultivos tratados con SD208 mostraron una coexpresión muy baja de NKX6.1 y cromogranina-A.

[0156] El cultivo de células precursoras pancreáticas del tracto digestivo superior en insertos de filtro en la interconexión aire-líquido en combinación con el inhibidor II de ALK5 mejoró significativamente el número de células positivas a NKX6.1 que coexpresan insulina o cromogranina-A. Además, el mismo protocolo aplicado a las células cultivadas en cultivos en monocapa tradicionales no logró mostrar un número significativo de células positivas a NKX6.1 que coexpresaban insulina o cromogranina-A. Por último, el tratamiento de células cultivadas en la interconexión aire-líquido con inhibidores de ALK5 distintos del inhibidor II de ALK5 no logró mostrar un número significativo de células positivas a NKX6.1 que coexpresaban insulina o cromogranina-A. Estos resultados indican que una combinación única de cultivo en la interconexión aire-líquido con un medio suplementado con el inhibidor II de ALK5 dio como resultado la coexpresión de insulina/cromogranina-A y NKX6.1.

Ejemplo de referencia 5

Comparación de varios inhibidores de ALK5 en los pasos 5 a 6 para las células cultivadas en la interconexión aire-líquido

[0157] Este ejemplo muestra que el inhibidor II de ALK5 fue único en la generación de una población significativa de células en la interconexión aire-líquido que expresa NKX6.1 e insulina o cromogranina-A. Los inhibidores de TGF-p adicionales probados se enumeran en la Tabla IV.

[0158] Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (paso 40) se sembraron como células individuales en 1 x 105 células/cm2 en placas recubiertas de Matrigel™ (1:30 de dilución; BD Biosciences, NJ) en un medio que comprende DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (dilución 1:100, Invitrogen), ácido ascórbico 0,25 mM (Sigma, MO), 100 ng/ml de FGF2 (R&D Systems, MN), 1 ng/ml de TGF-p (R&D Systems), ITS-X (dilución 1:100), BSA sin ácidos grasos al 2% (Lampire, PA) y 20 ng/ml de IGF-1 (R&D Systems), complementado con 10 pM de Y27632 (Rock Inhibitor, Cat. N° Y0503, Sigma-Aldrich). Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se lavaron en PBS incompleto (solución salina tamponada con fosfato sin Mg o Ca). A continuación, las células se diferenciaron de acuerdo con el siguiente protocolo:

a. Paso 1 (3 días): Las células se cultivaron durante un día en medio MCDB-131 (Cat. N° de Invitrogen 10372 019) complementado con BSA libre de ácidos grasos al 2% (Proliant, Cat. N° 68700); 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio (SigmaAldrich, Cat. N° S3187); 1X GlutaMax™ (Invitrogen, Cat. N° 35050-079); D-glucosa 4,5 mM (Sigma-Aldrich, Cat. N° G8769); 100 ng/ml de GDF8 (R&D Systems); y compuesto m Cx 1 pM. A continuación, las células se cultivaron durante un día más en medio MCDB-131 complementado con: BSA sin ácidos grasos al 2%; 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio; 1X GlutaMax™; D-glucosa 4,5 mM; 100 ng/ml de GDF8; y compuesto MCX 0,1 pM. A continuación, las células se cultivaron durante un día más en medio MCDB-131 complementado con BSA sin ácidos grasos al 2%, 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio, 1X GlutaMax™, D-glucosa 4,5 mM y 100 ng/ml de GDF8.

c. Paso 3 (2 días): Las células del paso 2 se trataron luego con medio BLAR personalizado (Invitrogen) complementado con una dilución 1:200 de ITS-X (Invitrogen, CA); Glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0017 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 0,25 pM SANT-1 (Sigma, MO); 1 pM RA (Sigma, MO); 25 ng/ml de FGF7; ácido ascórbico 0,25 mM; TPB 200 nM (activador de PKC; Cat. N° 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); y LDN-193189 100 nM (inhibidor del receptor de BMP; Cat. N° 04-0019; Stemgent) durante dos días.

d. Paso 4 (2 días): las células del paso 3 se trataron luego con medio BLAR complementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0017 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 0,25 pM SANT-1; RA 100 nM; 2 ng/ml de FGF7; LDN-193189 100 nM; ácido ascórbico 0,25 mM; y TPB 100 nM durante dos días, luego, al final del paso 4, las células cultivadas en placas planas se trataron durante 4 horas con 10 pM de Y27632, se aclararon con PBS y se trataron durante 5 minutos a temperatura ambiente con 1X TrypLE™ (Invitrogen) seguido de la eliminación de la enzima, enjuague con medio basal y raspado de células con un raspador de células. La suspensión resultante de las células se sembraron a una densidad de 0,5-0,75 x 105 células (en 10 pl de alícuotas) en 0,4 micras insertos de filtros de cultivo de células porosas (BD 353493) en placas de 6 pocillos, o sobre 10 cm insertos de filtro (Coming, # 3419) en placas de 10 cm. Se agregaron 1,5 ml de medio al fondo de cada inserto en las placas de 6 pocillos y se añadieron 7,5 ml de medio al fondo de cada inserto de 10 cm). No se añadió más medio al lado apical del filtro. Los medios fueron reemplazados todos los días durante la duración del estudio.

e. Paso 5 (3 días): Las células del paso 4 se cultivaron luego en la interconexión aire-líquido en medio BLAR complementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 20 mM; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 10 pg/ml de heparina (Sigma, n° H3149), SANT-1 0,25 pM; RA 50 nM; LDN-193189 100 nM; 1000 nM de varios inhibidores de A l K5 (ver la lista de inhibidores utilizados en la Tabla IV) durante tres días.

f. Paso 6 (6 días): Las células del paso 5 se trataron luego con medio BLAR suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 20 mM; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 10 pg/ml de heparina (Sigma, n° H3149), SANT-1 0,25 pM; LDN-193189 100 nM, T3 1000 nM, inhibidor de ALK5 1000 nM (consulte la Tabla IV para ver la lista de inhibidores probados) durante seis días.

[0159] La Figura 23 representa datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas y cultivadas en la interconexión airelíquido como se describe en el Ejemplo 5 después del día 4 del paso 5 y el día 6 del paso 6: PDX1 (FIG. 23A), NKX6.1 (FIG. 23B), NGN3 (FIG. 23C), ABCC8 (FIG. 23D), glucagón (FIG. 23E) e insulina (FIG. 23F). De manera similar a los resultados del Ejemplo 4, el cultivo de células precursoras pancreáticas del tracto digestivo superior en insertos de filtro en la interconexión aire-líquido y el tratamiento con el inhibidor II de ALK5 mejoró significativamente la expresión de insulina y glucagón. El tratamiento de las células precursoras pancreáticas del tracto digestivo superior con otros inhibidores de ALK5 no dio como resultado una expresión significativa de insulina o glucagón.

Ejemplo de referencia 6

Efecto de la densidad celular de siembra en la interconexión aire-líquido en la diferenciación posterior en células endocrinas

[0160] Este ejemplo identifica una gama de densidades de siembra en la interconexión aire-líquido y la expresión resultante de marcadores endocrinos. Para realizar los estudios en este ejemplo, las células madre embrionarias se diferenciaron utilizando el protocolo que se analiza a continuación.

[0161] Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (paso 40) se sembraron como células individuales en 1 x 105 células/cm2 en placas recubiertas de Matrigel™ (1:30 de dilución; BD Biosciences, NJ) en un medio que comprende DMEM-F12 (Invitrogen, CA), GlutaMax™ (dilución 1:100, Invitrogen), ácido ascórbico 0,25 mM (Sigma, MO), 100 ng/ml de FGF2 (R&D Systems, MN), 1 ng/ml de TGF-p (R&D Systems), ITS-X (dilución 1:100), BSA sin ácidos grasos al 2% (Lampire, PA) y 20 ng/ml de IGF-1 (R&D Systems), complementado con 10 pM de Y27632 (Rock Inhibitor, Cat. N° Y0503, Sigma). Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se lavaron en PBS incompleto (solución salina tamponada con fosfato sin Mg o Ca). A continuación, las células se diferenciaron de acuerdo con el siguiente protocolo:

a) Paso 1 (3 días): Las células se cultivaron durante un día en medio MCDB-131 (Invitrogen, Cat. N° 10372 019) suplementado con BSA sin ácidos grasos al 2% (Proliant, Cat. N° 68700); 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio (SigmaAldrich, Cat. N° S3187); 1X GlutaMax™ (Invitrogen, Cat. N° 35050-079); D-glucosa 4,5 mM (Sigma-Aldrich, Cat. N° G8769); 100 ng/ml de GDF8 (R&D Systems); y compuesto MCX 1 pM. A continuación, las células se cultivaron durante un día más en medio MCDB-131 complementado con BSA sin ácidos grasos al 2%, 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio, 1X GlutaMax™, D-glucosa 4,5 mM, 100 ng/ml de GDF8 y 0,1 pM Compuesto MCX. Posteriormente, las células fueron cultivadas durante un día más en medio MCDB-131 complementado con BSA sin ácidos grasos al 2%, 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio, 1X GlutaMax™, 4,5 mM D-glucosa y 100 ng/ml de GDF8.

b) Paso 2 (2 días): A continuación, las células del paso 1 se trataron durante dos días con medio MCDB-131 complementado con BSA sin ácidos grasos al 2%; 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio; 1X GlutaMax™; D-glucosa 4,5 mM; ácido ascórbico 0,25 mM (Sigma, MO); y 25 ng/ml de FGF7 (R&D Systems, MN).

c) Paso 3 (2 días): Las células del paso 2 se trataron luego con medio BLAR personalizado (Invitrogen) complementado con una dilución 1:200 de ITS-X (Invitrogen, CA); Glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0017 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 0,25 pM SANT-1 (Sigma, MO); 1 pM RA (Sigma, MO); 25 ng/ml de FGF7; ácido ascórbico 0,25 mM; TPB 200 nM (activador de PKC; Cat. N° 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); y LDN-193189 100 nM (inhibidor del receptor de BMP; Cat. N° 04-0019; Stemgent) durante dos días. Luego, al final de la paso 3, las células cultivadas en placas planas se trataron durante 4 horas con 10 pM de Y27632, se enjuagaron con PBS y se trataron durante 5 minutos a temperatura ambiente con 1X TrypLE™ (Invitrogen) seguido de la eliminación de la enzima, enjuague con medio basal y raspado de células con un raspador de células. La suspensión resultante de las células se sembraron a una densidad de 0,1, 0,5, 1 y 5 x 106 células (en 10 pl de alícuotas) sobre 0,4 micras insertos de filtro de cultivo de células porosas (BD 353493) en placas de 6 pocillos. Se añadieron 1,5 ml de medio al fondo de cada inserto y no se añadió más medio al lado apical del filtro. Los medios fueron reemplazados todos los días durante la duración del estudio.

d) Paso 4 (2 días): Las células del paso 3 se cultivaron luego en la interconexión aire-líquido en medio BLAR suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0017 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 10 pg/ml de heparina (Sigma, n° H3149), SANT-1 0,25 pM; RA 100 nM; 2 ng/ml de FGF7; LDN-193189 100 nM; ácido ascórbico 0,25 mM; y TPB 100 nM durante dos días.

e) Paso 5 (3 días): Las células del paso 4 se trataron luego con medio BLAR suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 20 mM; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 10 pg/ml de heparina (Sigma, n° H3149), SANT-1 0,25 pM; RA 50 nM; LDN-193189 100 nM; 10000 nM de inhibidor II de a LK5 durante tres días.

f) Paso 6 (14 días): Las células del paso 5 se trataron luego con medio BLAR suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 20 mM; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 10 pg/ml de heparina (Sigma, n° H3149), SANT-1 0,25 pM; inhibidor de ALK5 10000 nM, LDN-193189 100 nM y T3 1000 nM durante catorce días.

[0162] Se recogieron muestras de ARN en los pasos 4, 5, y 6, y se analizaron por PCR en tiempo real. La Figura 11 representa datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas como se describe en el Ejemplo 6 y cultivadas en la interconexión aire-líquido: ABCC8 (FIG. 11A); glucagón (FIG. 11B); amilina (FIG. 11C); insulina (FIG. 11D); NGN3 (FIG. 11E); NKX2.2 (FIG. 11F); NKX6.1 (FIG. 11G); y PDX1 (FIG. 11H). Las densidades de siembra en el intervalo de 0,1-1 x 106 células/10 ml dieron como resultado una expresión similar de endodermo pancreático y marcadores endocrinos en las pasos 5 a 6. A la densidad de siembra más alta probada (5 x 106 células/10 ml) en la interconexión aire-líquido, hubo una caída en la expresión de los marcadores endocrinos.

Ejemplo de Referencia 7

Comparación de 0,4, 1 y 3 micras de insertos de filtros de tamaño de poro

[0163] Este ejemplo compara el efecto del tamaño de poro del filtro en la diferenciación posterior en la interconexión aire-líquido. Para realizar los estudios en este ejemplo, las células madre embrionarias se diferenciaron utilizando el protocolo que se analiza a continuación.

[0164] Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (paso 40) se sembraron como células individuales en 1 x 105 células/cm2 en placas recubiertas de Matrigel™ (1:30 de dilución; BD Biosciences, NJ) en un medio que comprende DMEM-F12 (Invitrogen, CA), GlutaMax™ (dilución 1:100, Invitrogen), ácido ascórbico 0,25 mM (Sigma, MO), 100 ng/ml de FGF2 (R&D Systems, MN), 1 ng/ml de TGF-p (R&D Systems), ITS-X (dilución 1:100), BSA sin ácidos grasos al 2% (Lampire, PA) y 20 ng/ml de IGF-1 (R&D Systems), complementado con 10 pM de Y27632 (Rock Inhibitor, Cat. N° Y0503, Sigma). Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se lavaron en PBS incompleto (solución salina tamponada con fosfato sin Mg o Ca). A continuación, las células se diferenciaron de acuerdo con el siguiente protocolo:

a) Paso 1 (3 días): Las células se cultivaron durante un día en medio MCDB-131 (Invitrogen, Cat. N° 10372 019) suplementado con BSA sin ácidos grasos al 2% (Proliant, Cat. N° 68700); 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio (SigmaAldrich, Cat. N° S3187), 1X GlutaMax™ (Cat. N° de Invitrogen 35050-079); D-glucosa 4,5 mM (Sigma-Aldrich, Cat. N° G8769), 100 ng/ml de GDF8 (R&D Systems); y 1 pM MCX. A continuación, las células se cultivaron durante un día más en medio MCDB-131 complementado con BSA sin ácidos grasos al 2%, 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio, 1X GlutaMax™, D-glucosa 4,5 mM, 100 ng/ml de GDF8 y 0,1 pM Compuesto MCX. Después, las células se cultivaron durante un día más en medio MCDB-131 complementado con BSA sin ácidos grasos al 2%, 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio, 1X GlutaMax™, D-glucosa 4,5 mM y 100 ng/ml de GDF8.

c) Paso 3 (2 días): Las células del paso 2 se trataron luego con medio BLAR personalizado (Invitrogen) complementado con una dilución 1:200 de ITS-X (Invitrogen, CA); Glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0017 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 0,25 pM SANT-1 (Sigma, MO); 1 pM RA (Sigma, MO); 25 ng/ml de FGF7; ácido ascórbico 0,25 mM; TPB 200 nM (activador de PKC; Cat. N° 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); y LDN-193189 100 nM (inhibidor del receptor de BMP; Cat. N° 04-0019; Stemgent) durante dos días.

d) Paso 4 (2 días): Las células del paso 3 se trataron luego con medio BLAR suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0017 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 0,25 pM SANT-1; RA 100 nM; 2 ng/ml de FGF7; LDN-193189 100 nM; ácido ascórbico 0,25 mM; y TPB 100 nM durante dos días. Luego, al final del paso 4, las células cultivadas en placas planas se trataron durante 4 horas con 10 pM de Y27632, se enjuagaron con PBS y se trataron durante 5 minutos a temperatura ambiente con 1X TrypLE™ (Invitrogen) seguido de la eliminación de la enzima, enjuague con medio basal y raspado de células con un raspador de células. La suspensión resultante de las células se sembraron a una densidad de 0,5-0,75 x 106 células (en 10 pl de alícuotas) en 0,4, 1, o 3 micrones de insertos de filtro de cultivo de células porosas en 6 pocillos placas. Se añadieron 1,5 ml de medio al fondo de cada inserto y no se añadió más medio al lado apical del filtro. Los medios fueron reemplazados todos los días durante la duración del estudio.

e) Paso 5 (3 días): Las células del paso 4 se cultivaron luego en la interconexión aire-líquido en medio BLAR suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 20 mM; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 10 pg/ml de heparina (Sigma, n° H3149), SANT-1 0,25 pM; RA 50 nM; LDN-193189 100 nM; 10000 nM de inhibidor II de a Lk 5 durante tres días.

f) Paso 6 (15 días): Las células del paso 5 se trataron luego con medio BLAR suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 20 mM; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 10 pg/ml de heparina (Sigma, n° H3149), SANT-1 0,25 pM; LDN-193189 100 nM, T3 1000 nM, inhibidor II de ALK5 10000 nM durante quince días.

[0165] Se recogieron muestras de ARN en el paso 6 y se analizaron por PCR en tiempo real. La Figura 12 representa datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas como se describe en este Ejemplo y cultivadas en la interconexión aire-líquido: ABCC8 (FIG. 12A); glucagón (FIG. 12B); amilina (FIG. 12C); insulina (FIG. 12D); NGN3 (FIG. 12E); NKX2.2 (FIG. 12F); NKX6.1 (FIG. 12G); y PDX1 (FIG. 12H). Los tamaños de poro de los insertos de filtro que varían de 0,4 a 3 micrones no afectaron significativamente la expresión del endodermo pancreático o los marcadores endocrinos en la interconexión aire-líquido.

Ejemplo de Referencia 8

Comparación de la diferenciación de las células precursoras del tracto digestivo superior pancreáticas en la interconexión aire-líquido a la interconexión líquido-líquido (L/L) en insertos de filtro

[0166] Este ejemplo compara el impacto de cultivo en la interconexión aire-líquido para el cultivo en la interconexión líquido-líquido en la diferenciación de células precursoras pancreáticas del tracto digestivo superior en insertos de filtro. Para realizar los estudios en este ejemplo, las células madre embrionarias se diferenciaron utilizando el protocolo que se analiza a continuación.

[0167] Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (paso 40) se sembraron como células individuales en 1 x 105 células/cm2 en placas recubiertas Matrigel™ (1:30 de dilución; BD Biosciences, NJ) en un medio que comprende DMEM-F12 (Invitrogen, CA), GlutaMax™ (dilución 1:100, Invitrogen), ácido ascórbico 0,25 mM (Sigma, MO), 100 ng/ml de FGF2 (R&D Systems, MN), 1 ng/ml de TGF-p (R&D Systems), ITS-X (dilución 1:100), BSA sin ácidos grasos al 2% (Lampire, PA) y 20 ng/ml de IGF-1 (R&D Systems), complementado con 10 pM de Y27632 (Rock Inhibitor, Cat. N° Y0503, Sigma-Aldrich). Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se lavaron en PBS incompleto (solución salina tamponada con fosfato sin Mg o Ca). A continuación, las células se diferenciaron de acuerdo con el siguiente protocolo:

a) Paso 1 (3 días): Las células se cultivaron durante un día en medio MCDB-131 (Invitrogen Cat. N° 10372 019) complementado con BSA sin ácidos grasos al 2% (Proliant, Cat. N° 68700); 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio (Cat. N° SigmaAldrich S3187); 1X GlutaMax™ (Invitrogen, Cat. N° 35050-079), D-glucosa 4,5 mM (Sigma-Aldrich, Cat. N° G8769); 100 ng/ml de GDF8 (R&D Systems); y compuesto MCX 1 pM. A continuación, las células se cultivaron durante un día más en medio MCDB-131 complementado con BSA sin ácidos grasos al 2%, 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio, 1X GlutaMax™, D-glucosa 4,5 mM, 100 ng/ml de GDF8 y 0,1 pM de compuesto MCX. A continuación, las células se cultivaron durante un día más en medio MCDB-131 complementado con BSA sin ácidos grasos al 2%, 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio, 1X GlutaMax™, D-glucosa 4,5 mM y 100 ng/ml de GDF8.

d) Paso 4 (2 días): Las células del paso 3 se trataron luego con medio BLAR suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0017 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 0,25 pM SANT-1; RA 100 nM; 2 ng/ml de FGF7; LDN-193189 100 nM; ácido ascórbico 0,25 mM; y TPB 100 nM durante dos días, luego, al final del paso 4, las células cultivadas en placas planas se trataron durante 4 horas con 10 pM de Y27632, se enjuagaron con PBS y se trataron durante 5 minutos a temperatura ambiente con 1X TrypLE™ (Invitrogen) seguido de la eliminación de la enzima, enjuague con medio basal y raspado de células con un raspador de células. La suspensión resultante de las células se sembraron a una densidad de 0,5-0,75 x 106 células (en alícuotas de 10 pl) en Matrigel™ recubiertas con 0,4 micras de filtro de cultivo de células porosas insertos en placas de 6 pocillos. Se añadieron 1,5 ml de medio al fondo de cada inserto y no se añadió más medio al lado apical del filtro. Para la condición L/L, también se agregó medio en la parte superior de los insertos del filtro, lo que resultó en una interconexión líquido-líquido. Los medios fueron reemplazados todos los días durante la duración del estudio.

e) Paso 5 (3 días): Las células del paso 4 se cultivaron luego en la interconexión aire-líquido en medio BLAR suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 20 mM; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 10 pg/ml de heparina (Sigma, n° H3149), SANT-1 0,25 pM; RA 50 nM; LDN-193189 100 nM; 10000 nM de varios inhibidores II de A l K5 durante tres días.

f) Paso 6 (10 días): Las células del paso 5 se trataron luego con medio BLAR complementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 20 mM; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 10 pg/ml de heparina (Sigma, n° H3149), SANT-1 0,25 pM; LDN-193189 100 nM, T3 1000 nM, inhibidor II de ALK5 10000 nM durante diez días.

[0168] Se recogieron muestras de ARN en las pasos 5 a 6 y se analizaron por PCR en tiempo real. La Figura 13 representa datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas como se describe en el Ejemplo 8 y cultivadas en la interconexión aire-líquido: ABCC8 (FIG. 13A); glucagón (FIG. 13B); amilina (FIG. 13C); insulina (FIG. 13D); NGN3 (FIG. 13E); NKX2.2 (FIG. 13F); NKX6.1 (FIG. 13G); y PDX1 (FIG. 13H). La diferencia más dramática se observó con una regulación al alza significativa (7X) de glucagón en condiciones L/L en comparación con la interconexión airelíquido.

Ejemplo de referencia

Células precursoras endodérmicas/endocrinas pancreáticas cultivadas en la interconexión aire-líquido pueden usarse para cribar una biblioteca de compuestos.

[0169] Este ejemplo examina el uso de cultivos de interconexión aire-líquido para cribar bibliotecas de compuestos. Para hacerlo, las células madre embrionarias se diferenciaron utilizando el protocolo que se describe a continuación.

[0170] Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (paso 40) se sembraron como células individuales en 1 x 105 células/cm2 en placas recubiertas de Matrigel™ (1:30 de dilución; BD Biosciences, NJ) en un medio que comprende DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (dilución 1:100, Invitrogen), ácido ascórbico 0,25 mM (Sigma, MO), 100 ng/ml de FGF2 (R&D Systems, MN), 1 ng/ml de TGF-p (R&D Systems), ITS-X (dilución 1:100), BSA sin ácidos grasos al 2% (Lampire, PA) y 20 ng/ml de IGF-1 (R&D Systems), complementado con 10 pM de Y27632 (Rock Inhibitor, Cat. N° Y0503, Sigma). Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se lavaron en PBS incompleto (solución salina tamponada con fosfato sin Mg o Ca). A continuación, las células se diferenciaron de acuerdo con el siguiente protocolo:

a) Paso 1 (3 días): Las células se cultivaron durante un día en medio MCDB-131 (Cat. N° Invitrogen 10372-019) suplementado con BSA sin ácidos grasos al 2% (Proliant, Cat. N° 68700), 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio (SigmaAldrich, Cat. N° S3187), 1X GlutaMax™ (Invitrogen, Cat. N° 35050-079), D-glucosa 4,5 mM (Sigma-Aldrich, Cat. N° G8769), 100 ng/ml de Gd F8 (R&D Systems) y compuesto MCX 1 pM. A continuación, las células se cultivaron durante un día más en medio MCDB-131 complementado con BSA sin ácidos grasos al 2%, 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio, 1X GlutaMax™, D-glucosa 4,5 mM, 100 ng/ml de GDF8 y 0,1 pM Compuesto MCX. A continuación, las células se cultivaron durante un día más en medio MCDB-131 complementado con BSA sin ácidos grasos al 2%, 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio, 1X GlutaMax™, D-glucosa 4,5 mM y 100 ng/ml de GDF8.

c) Paso 3 (2 días): Las células del paso 2 se trataron luego con medio BLAR personalizado (Invitrogen) complementado con una dilución 1:200 de ITS-X (Invitrogen, CA); Glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0017 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 0,25 pM SANT-1 (Sigma, MO); 1 pM RA (Sigma, MO); 25 ng/ml de FGF7; ácido ascórbico 0,25 mM; TPB 200 nM (activador de PKC; Cat. N° 565740; e Md Chemicals, Gibbstown, NJ); y LDN-193189 100 nM (inhibidor del receptor de BMP; Cat. N° 04-0019; Stemgent) durante dos días.

d) Paso 4 (2 días): Las células del paso 3 se trataron luego con medio BLAR suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0017 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 0,25 pM SANT-1; RA 100 nM; 2 ng/ml de FGF7; LDN-193189 100 nM; ácido ascórbico 0,25 mM; y TPB 200 nM durante dos días, luego, al final del paso 4, las células cultivadas en placas planas se trataron durante 4 horas con 10 pM de Y27632, se enjuagaron con PBS y se trataron durante 5 minutos a temperatura ambiente con 1X TrypLE™ (Invitrogen) seguido de la eliminación de la enzima, enjuague con medio basal y raspado de células con un raspador de células. La suspensión resultante de las células se sembraron a una densidad de 0,5-0,75 x 106 células (en 10 pl alícuotas) en Matrigel™ recubiertas con 0,4 micras de filtro de cultivo de células porosas insertos en placas de 6 pocillos. Se añadieron 1,5 ml de medio al fondo de cada inserto y no se añadió más medio al lado apical del filtro.

e) Paso 5 (3 días): Las células del paso 4 se cultivaron luego en la interconexión aire-líquido en medio BLAR suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 20 mM; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 10 pg/ml de heparina (Sigma, # H3149), 10 pM ZnSO4 (Sigma, Z0251), 0,25 pM SANT-1; RA 50 nM; LDN-193189 100 nM; 10000 nM de inhibidor II de ALK5 durante tres días.

f) Paso 6 (12 días): Las células del paso 5 se trataron luego con medio BLAR suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 20 mM; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 10 pg/ml de heparina (Sigma, # H3149), 10 pM ZnSO4 (Sigma, Z0251), 0,25 pM SANT-1; LDN-193189 100 nM; T3 1000 nM; Inhibidor II de ALK5 10000 nM durante doce días. En esta etapa, los compuestos enumerados en la Tabla V se seleccionaron para identificar compuestos potenciales que afectan el endodermo y los marcadores endocrinos.

[0171] Las muestras de ARN se recogieron en el paso 6 y se analizaron por PCR en tiempo real. La Figura 14 representa datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas como se describe en el Ejemplo 9 y cultivadas en la interconexión aire-líquido: ABCC8 (FIG. 14A); glucagón (FIG. 14B); amilina (FIG. 14C); insulina (FIG. 14D); ISL-1 (FIG.

14E); MNX1 (FIG. 14F); NKX6.1 (FIG. 14G); y SLC30A8 (FIG. 14H). Este ejemplo muestra el potencial de las células cultivadas en la interconexión aire-líquido como herramienta de detección.

Ejemplo de Referencia 10

Perfil FACS de las células del paso 5 y paso 6 cultivadas en la interconexión aire-líquido

[0172] Este ejemplo estudia la composición de los cultivos de paso 5 y paso 6 en la interconexión aire-líquido. Para realizar los estudios en este ejemplo, las células madre embrionarias se diferenciaron en cultivos de paso 5 y paso 6 utilizando el protocolo que se describe a continuación.

[0173] Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (paso 40) se sembraron como células individuales en 1 x 105 células/cm2 en placas recubiertas de Matrigel™ (01:30 de dilución; BD Biosciences, NJ) en un medio que comprende DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (dilución 1:100, Invitrogen), ácido ascórbico 0,25 mM (Sigma, MO), 100 ng/ml de FGF2 (R&D Systems, MN), 1 ng/ml de TGF-p (R&D Systems), ITS-X (dilución 1:100), BSA sin ácidos grasos al 2% (Lampire, PA) y 20 ng/ml de IGF-1 (R&D Systems), complementado con 10 pM de Y27632 (Rock Inhibitor, Cat. N° Y0503, Sigma). Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se lavaron en PBS incompleto (solución salina tamponada con fosfato sin Mg o Ca). A continuación, las células se diferenciaron de acuerdo con el siguiente protocolo:

a) Paso 1 (3 días): Las células se cultivaron durante un día en medio MCDB-131 (Invitrogen, Cat. N° 10372 019) suplementado con BSA sin ácidos grasos al 2% (Proliant, Cat. N° 68700), 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio (Cat. N° SigmaAldrich S3187); 1X GlutaMax™ (Invitrogen, Cat. N° 35050-079); D-glucosa 4,5 mM (Sigma-Aldrich, Cat. N° G8769); 100 ng/ml de GDF8 (R&D Systems); y compuesto MCX 1 pM. A continuación, las células se cultivaron durante un día más en medio MCDB-131 complementado con BSA sin ácidos grasos al 2%, 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio, 1X GlutaMax™, D-glucosa 4,5 mM, 100 ng/ml de GDF8 y 0,1 pM Compuesto MCX. A continuación, las células se cultivaron durante un día más en medio MCDB-131 complementado con BSA sin ácidos grasos al 2%, 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio, 1X GlutaMax™, D-glucosa 4,5 mM y 100 ng/ml de GDF8.

b) Paso 2 (2 días): Las células del paso 1 se trataron luego durante dos días con medio MCDB-131 complementado con BSA libre de ácidos grasos al 2%; 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio; 1X GlutaMax™; D-glucosa 4,5 mM; ácido ascórbico 0,25 mM (Sigma, MO) y 25 ng/ml de FGF7 (R&D Systems, MN).

d) Paso 4 (3 días): Las células del paso 3 se trataron luego con medio BLAR suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0017 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 0,25 pM SANT-1; RA 100 nM; 2 ng/ml de FGF7; LDN-193189 100 nM; ácido ascórbico 0,25 mM; y TPB 200 nM durante tres días, luego, al final del paso 4, las células cultivadas en placas planas se trataron durante 4 horas con 10 pM de Y27632, se enjuagaron con PBS y se trataron durante 5 minutos a temperatura ambiente con 1X TrypLE™ (Invitrogen) seguido de la eliminación de la enzima, enjuague con medio basal y raspado de células con un raspador de células. La suspensión resultante de las células se sembraron a una densidad de 0,5-0,75 x 106 células (en 10 pl alícuotas) en Matrigel™ recubiertas con 0,4 micras de filtro de cultivo de células porosas insertos en placas de 6 pocillos. Se añadieron 1,5 ml de medio al fondo de cada inserto y no se añadió más medio al lado apical del filtro.

e) Paso 5 (3 días): Las células del paso 4 se cultivaron luego en la interconexión aire-líquido en medio BLAR suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 20 mM; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 10 pg/ml de heparina (Sigma, # H3149), 10 pM ZnSÜ4 (Sigma, Z0251), 0,25 pM SANT-1; RA 50 nM; LDN-193189100 nM; 10000 nM de varios inhibidores II de ALK5 durante tres días.

f) Paso 6 (15 días): Las células del paso 5 se trataron luego con medio BLAR suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 20 mM; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 10 pg/ml de heparina (Sigma, # H3149), 10 pM ZnSÜ4 (Sigma, Z0251), 0,25 pM SANT-1; LDN-193189 100 nM, T3 1000 nM, inhibidor II de ALK5 10000 nM durante 5-15 días.

[0174 ] Las células se recogieron en el paso 5 y diversos puntos de tiempo en el paso 6 y se analizaron por FACS. La tinción FACS se realizó como se describió anteriormente (Diabetes, 61, 2016, 2012) y utilizando los anticuerpos enumerados en la Tabla VI. La Figura 15 representa el perfil FACS de las células recogidas en el paso 5. La Figura 16 muestra el perfil FACS de las células del día 5 del paso 6 cultivadas en la interconexión aire-líquido. Por último, la Figura 17 muestra el perfil del paso 6 el día 15 de las células cultivadas en la interconexión aire-líquido. Como se muestra en la Figura 15, en el paso 5, había pocas células que coexpresaban insulina y NKX6.1 (~ 1%) y una parte significativa de las células positivas a PDX1 estaban en ciclo celular activo, medido por la coexpresión de PDX1 y KI. -67 (~ 23%; KI-67 es indicativo de células que están en ciclo celular activo). Sin embargo, en el paso 6, día 5 (FIG.

16), hubo una caída significativa en la proliferación de células PDX1 (8%) mientras que hubo un aumento significativo en el número de células NKX6.1 que coexpresan cromogranina A (51%; cromogranina- A es un marcador pan endocrino) o insulina (14%). Además, hubo un aumento significativo en las células que expresan los marcadores precursores endocrinos ISL-1, NeuroD y NKX2.2. Esto indica que los cultivos únicos del paso 6 permitieron una rápida maduración de las células desde un destino progenitor en proliferación hasta las células endocrinas de maduración temprana. Además, se observó un aumento en el porcentaje de células que coexpresan insulina y NXK6.1 (33%) al prolongar el paso 6 a 15 días (FIG. 17). Además, hubo una disminución adicional en el porcentaje de células positivas para PDX1 que estaban en el ciclo celular (1%) y un aumento adicional en el porcentaje de ISL-1 y NeuroD. Por último, la mayoría de las células positivas para hormonas eran células positivas para insulina de una sola hormona (34% de células positivas para insulina de una sola hormona, 7% de células positivas para glucagón de una sola hormona y 8% de células poliorgánicas). La coexpresión significativa de NKX6.1 y cromogranina-A y células positivas para insulina de una sola hormona que expresan NKX6.1 (> 30%) destaca una población celular no descrita anteriormente.

E je m p lo d e re fe re n c ia 11

^{M ad u rac ió n} in vivo ^{d e c é lu la s N K X6.1 C ro m o g ra n in a -A in s u lin a , N K X6.1 C ro m o g ra n in a -A - in s u lin a - y}p ro g e n ito re s p a n c re á tic o s c o e x p re s a n d o PDX1 y N K X 6.1 fre n te a is lo te s h u m an o s en ra to n es S C ID

[0175 ] Este ejemplo destaca la composición in vitro de células diferenciadas y el efecto sobre el rendimiento celular in vivo. En particular, 5 millones de células precursoras pancreáticas del tracto digestivo superior en paso 4 día 4 (PDX1 NKX6.1+) preparadas de acuerdo con el Ejemplo 1 en cultivos planos, 5 millones de células negativas para NKX6.1 cromogranina-A cultivadas en la interconexión aire-líquido, y 3 millones de células positivas para NKX6.1 cromogranina-A preparadas según el Ejemplo 10 en la interconexión aire-líquido se trasplantaron en la cápsula renal de ratones SCID no diabéticos como se describe en (Diabetes 2012, 61 (8): 2016-29). Se rastreó a los ratones para determinar el péptido C humano circulante como una medida del estado de maduración de las células en función del tiempo. Además, en cohortes separadas de ratones, se trasplantaron 1500-4000 equivalentes de islotes humanos cadavéricos (laboratorios PRODO, Irvine, CA) como control positivo.

[0176] La población negativa Nkx6.1+ cromogranina-A se preparó como sigue: las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (paso 40) se sembraron como células individuales en 1 x 105 células/cm2 en MATRIGEL™ (disolución 1:30; placas recubiertas de BD Biosciences, NJ) en un medio que comprende DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (dilución 1:100, Invitrogen), ácido ascórbico 0,25 mM (Sigma, MO), 100 ng/ml de FGF2 (R&D Systems, MN), 1 ng/ml de TGF-p (R&D Systems), ITS-X (dilución 1:100), BsA libre de ácidos grasos al 2% (Lampire, pA), y 20 ng/ml de IGF-1 (R&D Systems), complementado con 10 pM de Y27632 (Rock Inhibitor, Cat. N° Y0503, Sigma). Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se lavaron en PBS incompleto (solución salina tamponada con fosfato sin Mg o Ca). A continuación, las células se diferenciaron de acuerdo con el siguiente protocolo:

a. Paso 1 (3 días): Las células se cultivaron durante un día en medio MCDB-131 (Invitrogen, Cat. N° 10372 019) suplementado con BSA libre de ácidos grasos al 2% (Proliant, Cat. N° 68700); 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio (SigmaAldrich, Cat. N° S3187); 1X GlutaMax™ (Invitrogen, Cat. N° 35050-079); D-glucosa 4,5 mM (Cat. N° Sigma-Aldrich G8769); 100 ng/ml de GDF8 (R&D Systems); y compuesto m Cx 1 pM. A continuación, las células se cultivaron durante un día más en medio MCDB-131 complementado con BSA sin ácidos grasos al 2%, 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio, 1X GlutaMax™, D-glucosa 4,5 mM, 100 ng/ml de GDF8 y 0,1 pM Compuesto MCX. A continuación, las células se cultivaron durante un día más en medio MCDB-131 complementado con BSA sin ácidos grasos al 2%, 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio, 1X GlutaMax™, D-glucosa 4,5 mM y 100 ng/ml de GDF8.

c. Paso 3 (2 días): Las células del paso 2 se trataron luego con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1:200 de ITS-X (Invitrogen, CA); Glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0017 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 0,25 pM SANT-1 (Sigma, MO); 1 pM RA (Sigma, MO); 25 ng/ml de FGF7; ácido ascórbico 0,25 mM; TPB 200 nM (activador de Pk C; Cat. N° 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); y LDN-193189 100 nM (inhibidor del receptor de BMP; Cat. N° 04-0019; Stemgent) durante dos días. Luego, las células del paso 3 se trataron con 1X ACCUTASE™ durante 1-3 minutos a temperatura ambiente, seguido de la eliminación de la enzima y el raspado de las células con un raspador de células. La suspensión de células resultante se sembró a una densidad de ~ 2 x 106 células/10 ml en insertos de filtro de cultivo celular poroso de 0,4 micrómetros. Se añadieron 1,5 ml de medio al fondo de cada inserto y no se añadió más medio al lado apical del filtro.

d. Paso 4 (2 días): Las células del paso 3 se cultivaron luego en la interconexión aire-líquido en medio MCDB-131 complementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0017 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 0,25 pM SANT-1; RA 100 nM; 2 ng/ml de FGF7; LDN-193189 100 nM; ácido ascórbico 0,25 mM; T3 100 nM (T6397, Sigma) y TPB 100 nM durante dos días.

e. Paso 5 (2 días): Las células del paso 4 se trataron luego con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 20 mM; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 0,25 pM SANT-1; RA 50 nM; LDN-193189 50 nM; Inhibidor de ALK5 500 nM (SD208) durante dos días.

f. Paso 6 (6 días): Las células del paso 5 se trataron luego con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 20 mM; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 0,25 pM SANT-1; RA 50 nM; Inhibidor de ALK5 500 nM; durante seis días.

[0177] La Tabla VII a continuación destaca el nivel de expresión de varios marcadores endodérmicos y endocrinos pancreático para las tres poblaciones derivadas de células madre embrionarias humanas. Específicamente, la Tabla VII compara los resultados de lo siguiente: (1) población del día 4 del paso 4 generada según el ejemplo 1 (día 4 del paso 4); (2) población precursora endodérmica/endocrina pancreática generada de acuerdo con el Ejemplo 11 (endodérmica/endocrina pancreática); y (3) población NKX6.1+ cromogranina-A+ insulina generada de acuerdo con el Ejemplo 10 (NKX6.1+ cromogranina-A+ insulina ). La información del perfil FACS para cada uno se representa en las Fig S. 17-19. Específicamente, la FIG. 17 representa el perfil FACS de la población de cromogranina A NKX6.1+; FIG. 18 representa el perfil FACS de las células del día 4 del paso 4; y FIG. 19 muestra el perfil de FACS del paso 6 día 6 células endocrinas pancreáticas generadas de acuerdo con el Ejemplo 11.

[0178] Después de la aplicación, los ratones fueron probados periódicamente para la concentración de circulación de péptido C humano. Se probó el péptido C humano circulante recolectando sangre a través de la vena safena. El plasma se almacenó a -20 ° C y luego se analizó usando un péptido C humano mediante un kit ELISA (Alpco Diagnostics, Salem, NH). Los resultados se muestran gráficamente en la Figura 20.

[0179] La Figura 20 muestra la cinética de la producción de péptido C a partir de las tres poblaciones derivadas de ES en comparación con diversas dosis de islotes humanos. La población de células que expresan la coexpresión sustancial de NKX6.1 y cromogranina-A y NKX6.1 e insulina dio como resultado una producción temprana significativa de péptido C. El nivel de producción de péptido C fue similar al trasplante de aproximadamente 4000 islotes humanos a las 12 semanas. Sin embargo, a las 16 semanas después del trasplante, los niveles de péptido C humano casi habían duplicado la magnitud del péptido C observado con el trasplante de 4000 islotes humanos.

[0180] Sin embargo, el trasplante de células progenitoras que expresan PDX1 y Nkx6.1, o una población mixta de células precursoras pancreáticas y células polihormonales (cromogranina-A+ NKX6.1-) requiere períodos de tiempo significativamente más largos para secretar niveles equivalentes de péptido C como 4000 islotes humanos.

Ejemplo de Referencia 12

Adición de inhibidor de secretasa gamma XX aumenta más los marcadores de maduración de las células del paso 6 cultivadas en la interconexión aire-líquido

[0181] Este ejemplo pone de relieve que los inhibidores de Notch, tales como inhibidores de secretasa gamma, mejoran aún más los marcadores de maduración de células p mientras que la expresión de retención de NKX6.1. Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (paso 42) se sembraron como células individuales a 1 x 105 células/cm2 en placas recubiertas de Matrigel™ (1:30 dilución; BD Biosciences, NJ) en un medio que comprende DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (dilución 1:100, Invitrogen), ácido ascórbico 0,25 mM (Sigma, Mo ), 100 ng/ml de FGF2 (R&D Systems, Mn ), 1 ng/ml de TGF-p (R&D Systems), ITS-X (dilución 1:100), BsA libre de ácidos grasos al 2% (Lampire, PA) y 20 ng/ml de IGF-1 (R&D Systems), complementado con 10 pM de Y27632 (Rock Inhibitor, Cat. N° Y0503, Sigma). Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se lavaron en PBS incompleto (solución salina tamponada con fosfato sin Mg o Ca). A continuación, las células se diferenciaron de acuerdo con el siguiente protocolo:

a) Paso 1 (3 días): las células se cultivaron durante un día en medio MCDB-131 (Cat. N° Invitrogen 10372 019) suplementado con BSA sin ácidos grasos al 2% (Proliant, Cat. N° 68700), 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio (SigmaAldrich, Cat. N° S3187); 1X GlutaMax™ (Cat. N° de Invitrogen 35050-079); D-glucosa 4,5 mM (Cat. N° Sigma-Aldrich G8769); 100 ng/ml de GDF8 (R&D Systems); y compuesto MCX 1 pM. Luego se cultivaron las células para día adicional en medio MCDB-131 complementado con BSA sin ácidos grasos al 2%, bicarbonato de sodio 0,0012 g/ml, 1X GlutaMax™, D-glucosa 4,5 mM, 100 ng/ml de GDF8 y compuesto MCX 0,1 pM. A continuación, las células se cultivaron durante un día más en medio MCDB-131 complementado con BSA sin ácidos grasos al 2%, 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio, 1X GlutaMax™, D-glucosa 4,5 mM y 100 ng/ml de GDF8.

d) Paso 4 (3 días): A continuación, las células del paso 3 se trataron con medio BLAR complementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0017 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 0,25 pM SANT-1; RA 100 nM; 2 ng/ml de FGF7; LDN-193189100 nM; ácido ascórbico 0,25 mM; y TPB 200 nM durante tres días, luego, al final del paso 4, las células cultivadas en placas planas se trataron durante 4 horas con 10 pM de Y27632, se enjuagaron con PBS y se trataron durante 5 minutos a temperatura ambiente con 1X TrypLE™ (Invitrogen) seguido de la eliminación de la enzima, enjuague con medio basal y raspado de las células con un raspador de células. La suspensión resultante de las células se sembraron a una densidad de 0,5-0,75 x 106 células (en 10 pl alícuotas) en Matrigel™ recubiertas con 0,4 micras de filtro de cultivo de células porosas insertos en placas de 6 pocillos. Se añadieron 1,5 ml de medio al fondo de cada inserto y no se añadió más medio al lado apical del filtro.

e) Paso 5 (3 días): Las células del paso 4 se cultivaron luego en la interconexión aire-líquido en medio BLAR suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 20 mM; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 10 pg/ml de heparina (Sigma, # H3149), 10 pM ZnSO4 (Sigma, Z0251), 0,25 pM SANT-1; RA 50 nM; LDN-193189100 nM; 10000 nM de varios inhibidores II de ALK5 durante tres días.

f) Paso 6 (14 días): Las células del paso 5 se trataron luego con medio BLAR suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 20 mM; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 10 pg/ml de heparina (Sigma, # H3149), 10 pM ZnSO4 (Sigma, Z0251), 0,25 pM SANT-1; LDN-193189 100 nM, T3 1000 nM, inhibidor II de ALK5 10000 nM durante 14 días.

[0182] En el paso 6, se ensayaron varias dosis (100 nM a 5000 nM) de inhibidor de secretasa gamma XX (EMD, # 565789). El ARNm se recogió en el paso 6 el día 4 y el paso 6 el día 8. La FIG. 21 describe los datos de PCR para marcadores clave de maduración de células p junto con marcadores progenitores pancreáticos. Como se muestra en la FIG. 21, los marcadores de maduración, como amilina (Panel 21A), insulina (Panel 21B) y MAFA (Panel 21C) se regularon significativamente al alza mientras que la expresión de NKX6.1 (Panel 21D) no se vio afectada significativamente. Sin embargo, los marcadores precursores pancreáticos, como PTF1a (Panel 21 E) y SOX9 (Panel 21 F), se regularon significativamente a la baja.

Ejemplo de referencia 13

La presencia de inhibidor de ALK5 es esencial para la regulación positiva de MAFA y adición posterior de T3 mejora aún más la expresión de MAFA

[0183] Este ejemplo pone de relieve la capacidad de adición del inhibidor II de ALK5 para regular al alza la expresión de AFP, y que la adición de T3 con inhibidor de ALK5 y LDN-193189 mejora aún más la expresión de MAFA.

[0184] Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (paso 42) se sembraron como células individuales en 1 x 105 células/cm2 en placas recubiertas de Matrigel™ (1:30 de dilución; BD Biosciences, NJ) en un medio que comprende DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (dilución 1:100, Invitrogen), ácido ascórbico 0,25 mM (Sigma, MO), 100 ng/ml de FGF2 (R&D Systems, MN), 1 ng/ml de TGF-p (R&D Systems), ITS-X (dilución 1:100), BSA sin ácidos grasos al 2% (Lampire, PA) y 20 ng/ml de IGF-1 (R&D Systems), complementado con 10 pM de Y27632 (Rock Inhibitor, Cat. N° Y0503, Sigma). Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se lavaron en PBS incompleto (solución salina tamponada con fosfato sin Mg o Ca). A continuación, las células se diferenciaron de acuerdo con el siguiente protocolo:

a) Paso 1 (3 días): Las células se cultivaron durante un día en medio MCDB-131 (Cat. N° de Invitrogen 10372 019) suplementado con 2% de BSA libre de ácidos grasos (Cat. N° Proliant 68700), bicarbonato de sodio 0,0012 g/ml (Cat. N° SigmaAldrich S3187); 1X GlutaMax™ (Cat. N° de Invitrogen 35050-079); D-glucosa 4,5 mM (Cat. N° Sigma-Aldrich G8769); 100 ng/ml de GDF8 (R&D Systems); y compuesto MCX 1 pM. A continuación, las células se cultivaron durante un día más en medio MCDB-131 complementado con BSA sin ácidos grasos al 2%, 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio, 1X GlutaMax™, D-glucosa 4,5 mM, 100 ng/ml de GDF8 y 0,1 pM Compuesto MCX. A continuación, las células se cultivaron durante un día más en medio MCDB-131 complementado con BSA sin ácidos grasos al 2%, 0,0012 g/ml de bicarbonato de sodio, 1X GlutaMax™, D-glucosa 4,5 mM y 100 ng/ml de GDF8.

d) Paso 4 (3 días): A continuación, las células del paso 3 se trataron con medio BLAR complementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 4,5 mM; 1X GlutaMax™; 0,0017 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 0,25 pM SANT-1; RA 100 nM; 2 ng/ml de FGF7; LDN-193189100 nM; ácido ascórbico 0,25 mM; y TPB 200 nM durante tres días, luego, al final del paso 4, las células cultivadas en placas planas se trataron durante 4 horas con 10 pM de Y27632, se enjuagaron con PBS y se trataron durante 5 minutos a temperatura ambiente con 1X TrypLE™ (Invitrogen) seguido de la eliminación de la enzima, enjuague con medio basal y raspado de células con un raspador de células. La suspensión resultante de las células se sembraron a una densidad de 0,5-0,75 x 106 células (en 10 pl alícuotas) en Matrigel™ recubiertas con 0,4 micras de filtro de cultivo de células porosas insertos en placas de 6 pocillos. Se añadieron 1,5 ml de medio al fondo de cada inserto y no se añadió más medio al lado apical del filtro.

e) Paso 5 (3 días): Las células del paso 4 se cultivaron luego en la interconexión aire-líquido en medio BLAR complementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 20 mM; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 10 pg/ml de heparina (Sigma, # H3149), 10 pM ZnSO4 (Sigma, Z0251), 0,25 pM SANT-1; RA 50 nM; LDN-193189 100 nM; 10000 nM de inhibidor II de ALK5 durante tres días.

f) Paso 6 (8 días): Las células del paso 5 se trataron luego con medio BLAR suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; Glucosa 20 mM; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato de sodio; 2% de BSA sin ácidos grasos; 10 pg/ml de heparina (Sigma, # H3149), 10 pM ZnSO4 (Sigma, Z0251), 0,25 pM SANT-1; LDN-193189 100 nM, T3 1000 nM, inhibidor II de ALK5 10000 nM durante 8 días.

[0185] En el paso 6, inhibidor de ALK5, T3, o LDN se retiraron en diversas combinaciones para prueba para el impacto de cada factor sobre la expresión de Nkx6.1, insulina y MAFA. El ARNm se recogió en el paso 6 el día 5 y el paso 6 el día 8. La FIG. 22 representa los datos de PCR para marcadores clave de maduración de células p junto con marcadores progenitores pancreáticos. Como se muestra en la FIG. 22, la eliminación del inhibidor de a LK5 en el paso 6 dio como resultado una caída drástica en la expresión de MAFA. Mientras que la combinación del inhibidor de ALK5, LDN-183189 (inhibidor del receptor de BMP) y T3 mejoró significativamente la expresión de MAFA (FIG. 22A), insulina (FIG. 22B), Amilina (FIG. 22c ) y expresión moderadamente mejorada de NKX6.1 (FIG. 22D).

Ejemplo de referencia 14

Protocolo adicional para el cultivo de las células del paso 6 en la interconexión aire-líquido

[0186] Este ejemplo describe materiales y métodos adicionales para el cultivo de las células del paso 6 en la interconexión aire-líquido.

[0187] Los materiales utilizados incluyen los siguientes: insertos de filtro de 10 cm de Corning (Cat. N° 3419, membrana de policarbonato de 0,4 micras); Medio MCDB-131 (Invitrogen, Cat. N° 10372-019) o medio personalizado BLAR (fabricado por Invitrogen); ITS-X (Invitrogen, Ca); hormona tiroidea (T3): inhibidor II-ENZO de Sigma ALK5 (Cat. N° ALX- 27-445); LDN-193189- StemGent (# 04-0074); heparina (Sigma, H3149); y BSA- libre de ácidos grasos (Proliant/Lampire, 7500804).

[0188] Preparación de medios basales de paso 6: Añadir 1,5 gramos/litro de bicarbonato de sodio a medio de MCDB 131, además de 2% de BSA, más 1:200X ITS-X, además de la glucosa adicional 15 mM.

[0189] Preparación de medio de diferenciación de paso 6: Para los medios basales paso 6, añadir inhibidor II de ALK5 10 micromolar, 100 nM LDN-193189, y 1 micromolar T3.

Métodos

[0190] Añadir 7,5 ml del medio de diferenciación del paso 6 a la parte inferior de un inserto de filtro de 10 cm. Agregue grupos de células en pequeños volúmenes (20-30 pl) a la parte superior de los insertos de filtro. Normalmente, se colocan aproximadamente 50 grupos de células por 10 cm de inserto. En la siembra, cada grupo de células contiene aproximadamente 0,5 M de células.

[0191] El medio se cambia preferiblemente todos los días. Las células se pueden eliminar del inserto del filtro eliminando los agregados celulares individualmente, por ejemplo, utilizando una punta de pipeta de boca ancha, o todos los agregados se pueden eliminar a la vez enjuagando la parte superior del filtro con medio basal. Los agregados celulares se adhieren de manera suelta a los insertos.

[0192] Además de las condiciones de cultivo específicas descritas en los ejemplos anteriores, otras condiciones de cultivo adecuadas para la diferenciación de células pluripotentes, o su progenie, en células endocrinas pancreáticas se exponen en las Tablas VIII a XIII. Como se usa en estas tablas, "ALK5 inh." es un inhibidor de ALK5, "RA" es ácido retinoico, "Vit. C" es ácido ascórbico, "inh". es inhibidor, "actuar". es activador, ZnSO4 es sulfato de zinc, "MCX" es un compuesto MCX y "AA" es activina A. En ciertas realizaciones, cualquiera de los tratamientos en un paso (p. ej., paso 4) puede combinarse con cualquiera de los tratamientos en otro paso (p. ej., paso 5).

(Continuación)

[0193] A continuación se muestran intervalos ejemplares de los componentes enumerados en la Tabla X tal como se usan en los métodos de la invención:

[0194] La Tabla XI mostrada a continuación, ilustra condiciones de cultivo ejemplares alternativas adecuadas para su uso en la realización de los métodos de la invención.

[0195] La Tabla XII mostrada a continuación, ilustra condiciones de cultivo ejemplares alternativas adecuadas para su uso en la realización de los métodos de la invención.

[0196] Como se ha detallado anteriormente, la presente invención proporciona, entre otras cosas, un método de formación de células que expresan marcadores característicos de células p que comprenden células que se diferencian que expresan marcadores característicos de células del endodermo del tracto digestivo superior en células que expresan marcadores característicos de las células p mediante tratamiento con un medio suplementado con T3/T4, o un inhibidor de ALK5, o tanto T3/T4 como un inhibidor de ALK5 y cultivo en la interconexión aire-líquido. En una realización, sólo se cultivan células del paso 4 al paso 6 en la interconexión aire-líquido. Las células del paso 6 pueden ser positivas para NKX6.1, PDX1 y HB9. Por consiguiente, la invención también proporciona un método para inducir la expresión de PDX1, NKX6.1 y HB9 en células derivadas de células madre pluripotentes que comprende: (a) cultivar células madre pluripotentes; (b) diferenciar las células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos de las células del endodermo del tracto digestivo superior; y (c) diferenciar las células que expresan marcadores característicos de las células del endodermo del tracto digestivo superior en células que expresan PDX1, NKX6.1 y HB9 mediante tratamiento con un medio suplementado con T3/T4, o un inhibidor de ALK5, o tanto T3/T4 como inhibidor de ALK5 y cultivo en la interconexión aire-líquido. Además, las células resultantes del paso 6 pueden ser células positivas para una sola hormona. En una realización, las células del paso 6 que coexpresan NKX6.1 y cromogranina-A. En otra realización, las células del paso 6 coexpresan NKX6.1 e insulina.

[0197] En ciertas realizaciones, los procedimientos incluyen el tratamiento de células del paso 5 con un medio suplementado con T3/T4 y un inhibidor de ALK5, como inhibidor II de ALK5. En estas formas de realización, el medio puede complementarse ventajosamente además con uno o más de ácido retinoico, ácido ascórbico, SANT-1 o LDN-139189.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir células humanas que expresan marcadores característicos de las células endocrinas pancreáticas que comprende diferenciar las células humanas que expresan marcadores característicos de las células del endodermo pancreáticas en células humanas que expresan marcadores característicos de las células endocrinas pancreáticas mediante tratamiento con al menos un medio suplementado con un inhibidor de ALK5 o un inhibidor de ALK5 y una hormona tiroidea seleccionada de triyodotironina, tiroxina, GC-1, ácido 3,5-diyodotiropropiónico, KB-141, MB07344, T0681 y GC-24 y mezclas de los mismos, mientras se cultivan en la interconexión aire-líquido.

2. El método de la reivindicación 1, que además comprende:

a. diferenciar las células humanas que expresan marcadores característicos de las células precursoras pancreáticas del tracto digestivo superior en células humanas que expresan marcadores característicos de las células del endodermo pancreáticas mientras se cultivan en la interconexión aire-líquido;

b. diferenciar las células humanas que expresan los marcadores característicos de las células del endodermo del tracto digestivo superior en células humanas que expresan los marcadores característicos de las células precursoras pancreáticas del tracto digestivo superior seguido de la diferenciación de las células humanas que expresan los marcadores característicos de las células precursoras del tracto digestivo superior del páncreas en células humanas que expresan los marcadores característicos de las células del endodermo pancreáticas mediante el cultivo de las células que expresan marcadores característicos de las células precursoras pancreáticas del tracto digestivo superior en la interconexión aire-líquido; o

c. diferenciar las células madre pluripotentes humanas en células que expresan marcadores característicos de las células precursoras pancreáticas del tracto digestivo superior seguido de la diferenciación de células humanas que expresan marcadores característicos de las células precursoras pancreáticas del tracto digestivo superior en células humanas que expresan marcadores característicos de las células del endodermo pancreáticas mediante el cultivo de células que expresan marcadores característicos del precursor del tracto digestivo superior pancreático células en la interconexión aire-líquido.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en donde sólo las células que expresan marcadores característicos de las células precursoras pancreáticas del tracto digestivo superior, las células del endodermo pancreáticas y las células precursoras endocrinas pancreáticas se cultivan en la interconexión aire-líquido.

4. El método de la reivindicación 1, en donde el método comprende además diferenciar células humanas que expresan marcadores característicos de las células precursoras pancreáticas del tracto digestivo superior en células humanas que expresan marcadores característicos de las células del endodermo pancreáticas mediante tratamiento con al menos un medio suplementado con un inhibidor de ALK5, o tanto un inhibidor de ALK5 como una hormona tiroidea seleccionada de triyodotironina, tiroxina, GC-1, ácido 3,5-diyodotiropropiónico, KB-141, MB07344, T0681, GC-24 y mezclas de los mismos mientras se cultivan en la interconexión aire-líquido.

5. El método de la reivindicación 4, en donde el método comprende además diferenciar células humanas que expresan marcadores característicos de las células del endodermo del tracto digestivo superior en células humanas que expresan marcadores característicos de las células precursoras pancreáticas del tracto digestivo superior mediante tratamiento con al menos un medio suplementado con un inhibidor de ALK5, una hormona tiroidea, tanto un inhibidor de ALK5 como una hormona tiroidea mientras se cultiva en la interconexión aire-líquido, en donde la hormona tiroidea se selecciona de triyodotironina, tiroxina, GC-1, ácido 3,5-diyodotiropropiónico, KB-141, MB07344, T0681, GC-24 y mezclas de los mismos.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el inhibidor de ALK5 es el inhibidor II de ALK5 o 2-(5-cloro-2-fluorofenilo)pteridina-4-ilo]piridina-4-ilo-amina (SD208) y en donde:

las células que expresan marcadores característicos de las células endocrinas pancreáticas expresan marcadores característicos de las células p; y/o

las células que expresan marcadores característicos de las células endocrinas pancreáticas son positivas para NKX6.1, PDX1 y HB9; y/o

las células que expresan marcadores característicos de las células endocrinas pancreáticas coexpresan NKX6.1 y cromogranina A, por ejemplo, al menos el treinta por ciento de las células resultantes coexpresan NKX6.1 y cromogranina A; y/o

las células que expresan marcadores característicos de las células endocrinas pancreáticas coexpresan NKX6.1 e insulina, por ejemplo, al menos el treinta por ciento de las células resultantes coexpresan NKX6.1 e insulina; y/o

las células que expresan marcadores característicos de las células endocrinas pancreáticas son células positivas para una sola hormona.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde la diferenciación de las células madre pluripotentes humanas en células que expresan marcadores característicos de las células precursoras pancreáticas del tracto digestivo superior comprende diferenciar las células humanas que expresan marcadores característicos de las células del endodermo del tracto digestivo superior en células humanas que expresan marcadores característicos de células precursoras del tracto digestivo superior pancreáticas por tratamiento con un medio suplementado con un inhibidor de ALK5, o una hormona tiroidea seleccionada entre triyodotironina, tiroxina, GC-1, ácido 3,5-diyodotiropropiónico, KB-141, MB07344, T0681, GC-24 y mezclas de los mismos, o un inhibidor de ALK5 y una hormona tiroidea en un cultivo plano.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el método comprende el tratamiento con un medio suplementado con triyodotironina y un inhibidor de ALK5.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho inhibidor de ALK5 se selecciona del grupo que consiste en: inhibidor II de ALK5, ALK5i, 2-(5-cloro-2-fluorofenilo)pteridina-4-ilo]piridina-4-ilo-amina (SD208), SB431542, ITD-1, LY2109761, A83-01, LY2157299, receptor de TGF-p inh V, receptor de TGF-p inh I, receptor de TGF-p inh IV, receptor de TGF-p inh VII, receptor de TGF-p inh VIII, receptor de TGF-p inh II, receptor de TGF-p inh VI y receptor de TGF-p inh III, por ejemplo, en los que dicho inhibidor de ALK5 es el inhibidor II de ALK5.

10. El método de la reivindicación 1, en donde

la hormona tiroidea es triyodotironina y el inhibidor de ALK5 es el inhibidor II de ALK5, y/o

el medio se complementa además con uno o más de ácido retinoico, ácido ascórbico, sAn T-1 o LDN-193189.

11. El método de la reivindicación 1, en donde las células del endodermo pancreáticas humanas en la interconexión aire-líquido se diferencian de las células endocrinas pancreáticas humanas por tratamiento con un inhibidor de Alk5 y triyodotironina (T3).

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el inhibidor de ALK5 es el inhibidor II de ALK5 y en donde:

el método aumenta la expresión de hormonas pancreáticas, tales como PDX1, NKX6.1 y HB9; y/o el método reduce la expresión de PTF1a, SOX9, CDX2, ZIC1 y SOX2; y/o

el método aumenta el número de células positivas a NXK6.1 que coexpresan insulina, cromogranina-A o tanto cromogranina-A como insulina.

13. Un medio útil para diferenciar las células precursoras endocrinas pancreáticas en células que expresan marcadores característicos de las células endocrinas pancreáticas, en donde dicho medio es:

un medio para el crecimiento suplementado con SANT-1 0,25 pM, RA 50 nM, ácido ascórbico 0,025 mM; 500 nM, inhibidor de ALK5 (2-(5-cloro-2-fluorofenilo)pteridina-4-ilo]piridina-4-ilo-amina) (SD208) y T30,1 nM.

14. Un cultivo celular in vitro que comprende una población de células humanas diferenciadas que expresan marcadores característicos de las células endocrinas pancreáticas en donde al menos el treinta por ciento de dichas células diferenciadas son células positivas para insulina de una sola hormona que expresan NKX6.1, y en donde la población se obtiene mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.