ES2822375T3

ES2822375T3 - Preparación de la forma no cristalina del ácido obeticólico

Info

Publication number: ES2822375T3
Application number: ES17202916T
Authority: ES
Inventors: André Steiner; Poulsen Heidi Waenerlund; Emilie Jolibois; Melissa Rewolinski; Ralf Gross; Emma Sharp; Fiona Dubas-Fisher; Alex Eberlin
Original assignee: Intercept Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Intercept Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2012-06-19
Filing date: 2013-06-17
Publication date: 2021-04-30
Anticipated expiration: 2033-06-17
Also published as: US20190153020A1; KR101881245B1; AU2017204057B2; CL2014003475A1; US9732116B2; IN2014MN02561A; AU2017204057A1; JP6527077B2; JP6877389B2; JP2017075169A; CA2877122C; US9238673B2; BR112014031828A2; MX2019005819A; TW201410699A; US10047117B2; BR122016011808A2; AU2020202405A1; EP3336097A1; HK1211296A1

Abstract

Procedimiento para la preparación de ácido obeticólico no cristalino, que comprende las etapas de: a) la reacción de ácido 3α-hidroxi-6α-etil-7 -ceto-5β-colán-24-oico con NaBH4 a una temperatura de entre aproximadamente 85ºC y aproximadamente 110ºC en una solución acuosa básica para formar ácido obeticólico, b) el enfriamiento de la mezcla a aproximadamente 80ºC y la transferencia de la misma a un reactor bajo enfriamiento, seguido de enfriamiento de la mezcla que contiene el ácido obeticólico hasta una temperatura de entre aproximadamente 20ºC y aproximadamente 60ºC, c) la adición de acetato de n-butilo y un ácido a la mezcla, d) la separación de la fase orgánica que contiene el ácido obeticólico y la concentración de la fase orgánica mediante destilación para formar un residuo, e) opcionalmente la adición de acetato de n-butilo al residuo y nuevamente la concentración mediante destilación, f) la adición de acetato de n-butilo al residuo, seguido del enfriamiento lento, g) la cristalización del ácido obeticólico, h) el aislamiento de ácido obeticólico cristalino, i) el lavado del ácido obeticólico cristalino resultante con acetato de n-butilo, j) el secado del ácido obeticólico cristalino al vacío, y k) la conversión del ácido obeticólico cristalino en ácido obeticólico no cristalino.

Description

DESCRIPCIÓN

Preparación de la forma no cristalina del ácido obeticólico

Descripción resumida de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de ácido obeticólico no cristalino (Forma 1), un agonista de FXR.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de ácido obeticólico Forma 1, mediante:

a) la reacción de ácido 3a-hidroxi-6a-etil-7-ceto-5p-colán-24-oico con NaBH4 a una temperatura de entre aproximadamente 85°C y aproximadamente 110°C en una solución acuosa básica para formar ácido obeticólico, b) el enfriamiento de la mezcla a aproximadamente 80°C y la transferencia de la misma a un reactor bajo enfriamiento, seguido de enfriamiento de la mezcla que contiene el ácido obeticólico hasta una temperatura de entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 60°C,

c) la adición de acetato de n-butilo y un ácido a la mezcla,

d) la separación de la fase orgánica que contiene el ácido obeticólico y la concentración de la fase orgánica mediante destilación para formar un residuo,

e) opcionalmente la adición de acetato de n-butilo al residuo y nuevamente la concentración mediante destilación, f) la adición de acetato de n-butilo al residuo, seguido del enfriamiento lento,

g) la cristalización del ácido obeticólico,

h) el aislamiento de ácido obeticólico cristalino,

i) el lavado del ácido obeticólico cristalino resultante con acetato de n-butilo,

j) el secado del ácido obeticólico cristalino al vacío, y

k) la conversión del ácido obeticólico cristalino en ácido obeticólico no cristalino (Forma 1).

El procedimiento de la presente invención preferentemente comprende además las etapas de reaccionar de metiléster de ácido E- o E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico con NaOH para formar ácido E- o E/Z-3a-hidroxi-6- etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico, haciendo reaccionar ácido E- o E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico con Pd/C y gas hidrógeno para formar ácido 3a-hidroxi-6a-etil-7-ceto-5p-colán-24-oico.

El procedimiento de la presente invención preferentemente comprende las etapas de reacción de metil-éster de ácido 3a,7-ditrimetilsililoxi-5p-col-6-en-24-oico con CH3CHO para formar metil-éster de ácido E- o E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7- ceto-5p-colán-24-oico; la reacción de metil-éster de ácido E- o E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico con NaOH para formar ácido E- o E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico; la reacción de ácido E- o E/Z-3ahidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico con Pd/C y gas hidrógeno para formar ácido 3a-hidroxi-6a-etil-7-ceto-5pcolán-24-oico.

El procedimiento de la presente invención preferentemente comprende las etapas de reacción de metil-éster de ácido 3a-hidroxi-7-ceto-5p-colán-24-oico con Li[N(CH(CH3)2)2] y Si(CH3)3Cl para formar metil-éster de ácido 3a,7-ditrimetilsililoxi-5p-col-6-en-24-oic ; la reacción de metil-éster de ácido 3a,7-ditrimetilsililoxi-5p-col-6-en-24-oico con CH3CHO para formar ácido E- o E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico; la reacción de metil-éster de ácido E- o E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico con NaOH para formar ácido E- o E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico; la reacción de ácido E- o E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico con Pd/C y gas hidrógeno para formar ácido 3a-hidroxi-6a-etil-7-ceto-5p-colán-24-oico.

El procedimiento de la presente invención preferentemente comprende las etapas de reacción de ácido 3a-hidroxi-7-ceto-5p-colán-24-oico con CH3OH y H2SO4 para formar metil-éster de ácido 3a-hidroxi-7-ceto-5p-colán-24-oico; la reacción de metil-éster de ácido 3a-hidroxi-7-ceto-5p-colán-24-oico con Li[N(CH(CH3)2)2] y Si(CH3)3Cl para formar metil-éster de ácido 3a,7-ditrimetilsililoxi-5p-col-6-en-24-oico; la reacción de metil-éster de ácido 3a,7-ditrimetilsityloxy-5p-col-6-en-24-oico con CH3CHO para formar metil-éster de ácido E- o E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico; la reacción de metil-éster de ácido E- o E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico con NaOH para formar ácido E- o E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico; la reacción de ácido E- o E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico con Pd/C y gas hidrógeno para formar ácido 3a-hidroxi-6a-etil-7-ceto-5p-colán-24-oico.

La presente invención se refiere preferentemente a un procedimiento tal como se ha definido anteriormente, en el que el ácido obeticólico cristalino Forma C se convierte en ácido obeticólico Forma 1 mediante disolución de ácido obeticólico cristalino Forma C en solución acuosa de NaOH y adición de HCl.

Según una realización preferente de la invención para la preparación de ácido obeticólico Forma 1, se hace reaccionar ácido E- o E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico con Pd/C y gas hidrógeno para formar ácido 3a-hidroxi-6a-etil-7-ceto-5p-colán-24-oico y esta reacción se lleva a cabo a una temperatura de entre aproximadamente 100°C y aproximadamente 105°C y a una presión de entre aproximadamente 4 y aproximadamente 5 bar.

Según una realización preferente del procedimiento de la invención para la preparación de ácido obeticólico Forma 1, se hace reaccionar metil-éster de ácido E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico con NaOH para formar ácido E- o E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico a una temperatura de entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 60°C.

Según una realización preferente del procedimiento de la invención para la preparación de ácido obeticólico Forma 1, se hace reaccionar metil-éster de ácido 3a,7-ditrimetilsililoxi-5p-col-6-en-24-oico con CH3CHO para formar metil-éster de ácido E- o E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico en un solvente aprótico polar a una temperatura de entre aproximadamente -50°C y aproximadamente -70°C en presencia de BF3.

Según una realización preferente del procedimiento de la invención para la preparación de ácido obeticólico Forma 1, se hace reaccionar metil-éster de ácido 3a-hidroxi-7-ceto-5p-colán-24-oico con Li[N(CH(CH3)2)2] y Si(CH3)3Cl para formar metil-éster de ácido 3a,7-ditrimetilsililoxi-5p-col-6-en-24-oico en un solvente aprótico polar a una temperatura de entre aproximadamente -10°C y aproximadamente -30°C.

Según una realización preferente del procedimiento de la invención para la preparación de ácido obeticólico Forma 1, se hace reaccionar ácido 3a-hidroxi-7-ceto-5p-colán-24-oico con CH3OH y H2SO4 para formar metil-éster de ácido 3ahidroxi-7-ceto-5p-colán-24-oico bajo calentamiento durante aproximadamente 3 horas, y el pH de la mezcla de reacción se ajusta con una solución acuosa básica a un valor de pH de entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 8,0.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 es un cromatograma de HPLC-UV/EM del compuesto 5 en bruto de la etapa 4 del Ejemplo 1 inyectado a razón de 1 mg/ml, volumen de inyección: 3 pl. El cromatograma se obtiene según el método indicado en el Ejemplo 2.

Figura 2 es un cromatograma de HPLC-UV/EM de compuesto 5 de la etapa 4 del Ejemplo 1, referencia purificada inyectada a razón de 1 mg/ml, volumen de inyección: 20 pl. El cromatograma se obtiene según el método indicado en el Ejemplo 2.

Figura 3 es un cromatograma de UV de compuesto 5 en bruto de la etapa 4 del Ejemplo 1, utilizando el método de HPLC. El cromatograma se obtiene según el método indicado en el Ejemplo 2.

Figura 4A es un registro iónico preciso de m/z 850,61914 ± 3 ppm de la fracción de pico principal (RT 29,0 min) de compuesto 5 de la etapa 4 del Ejemplo 1, aislado puro mediante el método de HPLC (ver el Ejemplo 2). Figura 4B es un registro iónico preciso de m/z 850,61914 ± 3 ppm de la fracción de pico menor (RT 29,9 min) de compuesto 5 de la etapa 4 del Ejemplo 1, aislado puro mediante el método de HPLC (ver el Ejemplo 2). Figura 4C es un registro iónico preciso de m/z 850.61914 ± 3 ppm de compuesto 5 en bruto de la etapa 4 del Ejemplo 1 (ver el Ejemplo 2).

Figura 4D es un registro iónico preciso de m/z 850.61914 ± 3 ppm de compuesto 5 de la etapa 4 del Ejemplo 1

(ver el Ejemplo 2).

Figura 5 es un difractograma de XRPD del ácido obeticólico cristalino Forma C (ver el Ejemplo 3).

Figure 6 muestra los termogramas de TGA y DSC del ácido obeticólico cristalino Forma C (ver el Ejemplo 3). Figura 7 muestra los difractogramas de VT-XRPD del ácido obeticólico cristalino a 25°C, 110°C y 120°C (ver el Ejemplo 3).

Figura 8A es un gráfico de isotermas de GVS del ácido obeticólico cristalino Forma C (ver el Ejemplo 3).

Figura 8B es un gráfico de cinética de GVS del ácido obeticólico cristalino Forma C (ver el Ejemplo 3).

Figura 8C muestra difractogramas de XRPD del ácido obeticólico cristalino Forma C antes y después del análisis de GVS (ver el Ejemplo 3).

Figura 9 muestra difractogramas de XRPD del ácido obeticólico cristalino Forma C antes y después del almacenamiento a 40°C/75% de HR (ver el Ejemplo 3).

Figura 10 es un difractograma de XRPD del lote 1 del ácido obeticólico Forma 1 (ver el Ejemplo 5).

Figura 11 muestra los gráficos de difracción de XRPD para los lotes 1,2, 3, 4, 5 y 6 del ácido obeticólico Forma 1

(ver el Ejemplo 5).

Figura 12 es un espectro de RMN del lote 1 del ácido obeticólico Forma 1 en cfe-DMSO (ver el Ejemplo 5).

Figura 13 muestra los espectros de RMN-1H para los lotes 1, 2, 3, 4, 5 y 6 del ácido obeticólico Forma 1 (ver el Ejemplo 5).

Figura 14 es una expansión del espectro de RMN DEPTQ 13C del ácido obeticólico Forma 1 de la región 10 a 75 ppm (ver el Ejemplo 5).

Figura 15 es una expansión del espectro de RMN DEPT13513C del ácido obeticólico Forma 1 que suprime los carbonos cuaternarios de la región 0-75 ppm (ver el Ejemplo 5).

Figura 16 es un RMN 13C cuantitativo del ácido obeticólico Forma 1 (ver el Ejemplo 5).

Figura 17 es una vista expandida de los picos en 32.3 ppm de la figura 16 (ver el Ejemplo 5).

Figura 18 es un espectro de FT-IR del lote 1 del ácido obeticólico Forma 1 (ver el Ejemplo 5).

Figura 19 muestra termogramas de TGA y DSC del lote 1 del ácido obeticólico Forma 1 (ver el Ejemplo 5). Figura 20 muestra termogramas de DSC modulado del lote 1 del ácido obeticólico Forma 1 (ver el Ejemplo 5). Figura 21 muestra los registros de TGA para los lotes 1, 2, 3, 4, 5 y 6 del ácido obeticólico Forma 1 (ver el Ejemplo 5).

Figura 22 muestra los registros de DSC para los lotes 1,2, 3, 4, 5 y 6 del ácido obeticólico Forma 1 (ver el Ejemplo 5).

Figura 23A es una fotografía del lote 1 del ácido obeticólico Forma 1 bajo microscopía de luz polarizada. Figura 23B es una fotografía del lote 2 del ácido obeticólico Forma 1 bajo microscopía de luz polarizada. Figura 23C es una fotografía del lote 3 del ácido obeticólico Forma 1 bajo microscopía de luz polarizada. Figura 23D es una fotografía del lote 4 del ácido obeticólico Forma 1 bajo microscopía de luz polarizada. Figura 23E es una fotografía del lote 5 del ácido obeticólico Forma 1 bajo microscopía de luz polarizada. Figura 23F es una fotografía del lote 6 del ácido obeticólico Forma 1 bajo microscopía de luz polarizada.

Figura 24 muestra un gráfico de isotermas de GVS del lote 1 del ácido obeticólico Forma 1 (ver el Ejemplo 5). Figura 25 muestra un gráfico de cinética de GVS del lote 1 del ácido obeticólico Forma 1 (ver el Ejemplo 5). Figura 26 muestra difractogramas de XRPD del lote 1 del ácido obeticólico Forma 1 antes y después de GVS (ver el Ejemplo 5).

Figura 27 es un gráfico de la medición de pKa en tres proporciones diferentes de metanol/agua para el ácido obeticólico Forma 1 (ver el Ejemplo 5).

Figura 28 es un gráfico de Yasuda-Shedlovsky para el ácido obeticólico Forma 1 (ver el Ejemplo 5).

Figura 29 es un gráfico que muestra la distribución de las especies según el pH para el ácido obeticólico Forma 1

(ver el Ejemplo 5).

Figura 30 es un gráfico que muestra la curva de diferencias obtenidas mediante potenciometría para el ácido obeticólico Forma 1 (ver el Ejemplo 5).

Figura 31 muestra el perfil de lipofilicidad del ácido obeticólico Forma 1 (ver el Ejemplo 5).

Figura 32 muestra los difractogramas de XRPD del lote 1 de ácido obeticólico Forma 1 tras el almacenamiento a 40°C/75% de HR (ver el Ejemplo 5).

Figura 33 muestra los difractogramas de XRPD del lote 1 de ácido obeticólico Forma 1 tras el almacenamiento a 25°C/97% de HR (ver el Ejemplo 5).

Figura 34 muestra una vista de la molécula de ácido obeticólico Forma G a partir de la estructura cristalina que muestra los elipsoides de desplazamiento atómico anisotrópico para los átomos no de hidrógeno al nivel de probabilidad de 50% (ver el Ejemplo 6).

Figura 35 muestra una vista de los enlaces de hidrógeno intermoleculares de la estructura cristalina del ácido obeticólico Forma G, en la que se muestran los enlaces de hidrógeno con líneas discontinuas (ver el Ejemplo 6).

Figura 36 muestra una superposición de XRPD del patrón simulado de polvos, los patrones experimentales del cristal recogido y el ácido obeticólico Forma G (ver el Ejemplo 6).

Figura 37 muestra un gráfico del perfil plasmático de ácido obeticólico vs. tiempo tras la administración oral de 20 mg/kg de ácido obeticólico Forma 1 y Forma F cristalina (ver el Ejemplo 7).

Figura 38 muestra un gráfico de la concentración plasmática del tauroconjugado de ácido obeticólico Forma 1 y la Forma F cristalina en diferentes intervalos de tiempo tras la administración (ver el Ejemplo 7).

Figura 39 muestra la curva de DSC de la Forma 1 (ver el Ejemplo 7).

Figura 40 muestra la curva de DSC de la Forma 1 (ver el Ejemplo 7).

Descripción detallada de la invención

El ácido obeticólico es un ingrediente farmacéuticamente activo (también conocido como INT-747) con la estructura química:

La presente solicitud describe además composiciones farmacéuticas y formulaciones de ácido obeticólico y usos para dichas composiciones.

Procedimiento para preparar ácido obeticólico

La presente solicitud se refiere a un procedimiento para la preparación de ácido obeticólico altamente puro. El procedimiento de la presente solicitud se muestra en el Esquema 1. El procedimiento es una síntesis en 6 etapas seguida de una etapa de purificación para producir ácido obeticólico altamente puro.

El procedimiento de dicho esquema describe el procedimiento de la presente invención, en la medida en que sus dos últimas etapas se llevan a cabo tal como se especifica anteriormente y en la reivindicación 1, y en el que las etapas anteriores preferentemente se llevan a cabo tal como se ha indicado anteriormente y en las reivindicaciones dependientes.

El procedimiento de la presente invención incluye además un procedimiento según el Esquema 1 en el que los compuestos 4 y 5 comprenden, cada uno, una mezcla de los isómeros E y Z tal como se ilustra mediante las estructuras de los compuestos 4A y 5A a continuación:

En una realización, la proporción de isómeros E/Z del metil-éster de ácido E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (4A) es aproximadamente 50%, superior a aproximadamente 60%, superior a aproximadamente 70%, superior a aproximadamente a 80%, superior a aproximadamente 83%, superior a aproximadamente 85%, superior a aproximadamente 90%, superior a aproximadamente 93%, superior a aproximadamente 95 o superior a aproximadamente 99%. En una realización, la proporción E/Z se determina mediante HPLC. En una realización, la proporción es superior a aproximadamente 80%. En una realización, la proporción es superior a aproximadamente 83%. En una realización, la proporción es superior a aproximadamente 85%. En una realización, la proporción es superior a aproximadamente 90%. En una realización, la proporción es superior a aproximadamente 93%. En una realización, la proporción es superior a aproximadamente 95%. En una realización, la proporción es superior a aproximadamente 99%.

En una realización, la proporción de isómeros E/Z del ácido E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (5A) es aproximadamente 50%, superior a aproximadamente 60%, superior a aproximadamente 70%, superior a aproximadamente a 80%, superior a aproximadamente 83%, superior a aproximadamente 85%, superior a aproximadamente 90%, superior a aproximadamente 93%, superior a aproximadamente 95 o superior a aproximadamente 99%. En una realización, la proporción E/Z se determina mediante HPLC. En una realización, la proporción es superior a aproximadamente 80%. En una realización, la proporción es superior a aproximadamente 83%. En una realización, la proporción es superior a aproximadamente 85%. En una realización, la proporción es superior a aproximadamente 90%. En una realización, la proporción es superior a aproximadamente 93%. En una realización, la proporción es superior a aproximadamente 95%. En una realización, la proporción es superior a aproximadamente 99%.

El procedimiento global del esquema 1 nunca ha sido informado en la técnica. El procedimiento es una síntesis en 6 etapas seguido de una etapa de purificación; sin embargo, la presente invención se define mediante las dos últimas etapas de dicho esquema al llevarlas a cabo tal como se ha definido anteriormente y en la reivindicación 1. La etapa 1 es la esterificación del ácido carboxílico C-24 del ácido 7-ceto-litocólico (KLCA) utilizando metanol en presencia de catálisis ácida y calor para producir el compuesto metil-éster 1. La etapa 2 es la formación de éter de sililenol a partir del compuesto 1 utilizando una base fuerte, seguido del tratamiento con clorosilano para producir compuesto 3. La etapa 3 es una reacción de condensación de aldol del compuesto éter de sililenol 3 y acetaldehído para producir compuesto 4 (o compuesto 4A). La etapa 4 es la hidrólisis de éster, es decir, la saponificación del metil-éster de C-24 del compuesto 4 (o compuesto 4A) para producir el compuesto ácido carboxílico 5 (o compuesto 5A). La etapa 5 es la hidrogenación de la fracción 6-etilideno del compuesto 5 (o compuesto 5A), seguido de la isomerización para producir compuesto 6. La etapa 6 es la reducción selectiva del grupo 7-ceto del compuesto 6 en un grupo 7a-hidroxi para producir ácido obeticólico cristalino. La etapa 7 es la conversión de ácido obeticólico cristalino en ácido obeticólico Forma 1.

El procedimiento de la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de ácido obeticólico Forma 1, en el que el procedimiento utiliza una forma cristalina de ácido obeticólico como un intermediario sintético.

El procedimiento de la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de ácido obeticólico Forma 1, que comprende la etapa de conversión de ácido obeticólico en ácido obeticólico Forma 1.

En una realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de ácido obeticólico Forma 1, que comprende las etapas de reacción del ácido 3a-hidroxi-6a-etil-7-ceto-5p-colán-24-oico (6) con NaBH4 para formar ácido obeticólico cristalino, según el procedimiento indicado anteriormente y en la reivindicación 1, y la conversión de ácido obeticólico cristalino en ácido obeticólico Forma 1.

En una realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de ácido obeticólico Forma 1, que comprende las etapas de hacer reaccionar ácido E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (5A) con Pd/C y gas hidrógeno para formar ácido 3a-hidroxi-6a-etil-7-ceto-5p-colán-24-oico (6),

hacer reaccionar ácido 3a-hidroxi-6a-etil-7-ceto-5p-colán-24-oico (6) con NaBH4 para formar ácido obeticólico cristalino, según el procedimiento indicado anteriormente y en la reivindicación 1, y convertir el ácido obeticólico cristalino en ácido obeticólico Forma 1.

En una realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de ácido obeticólico Forma 1, que comprende las etapas de hacer reaccionar el ácido E-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (5) con Pd/C y gas hidrógeno para formar ácido 3a-hidroxi-6a-etil-7-ceto-5p-colán-24-oico (6), hacer reaccionar el ácido 3a hidroxi-6a-etil-7-ceto-5p-colán-24-oico (6) con NaBH4 para formar ácido obeticólico cristalino, según el procedimiento indicado anteriormente y en la reivindicación 1, y convertir el ácido obeticólico cristalino en ácido obeticólico Forma 1.

En una realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de ácido obeticólico Forma 1, que comprende las etapas de hacer reaccionar metil-éster de ácido E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (4A) con NaOH para formar ácido E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (5A),

hacer reaccionar ácido E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (5A) con Pd/C y gas hidrógeno para formar ácido 3a-hidroxi-6a-etil-7-ceto-5p-colán-24-oico (6),

En una realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de ácido obeticólico Forma 1, que comprende las etapas de hacer reaccionar metil-éster de ácido E-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (4) con NaOH para formar ácido E-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (5),

hacer reaccionar ácido E-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (5) con Pd/C y gas hidrógeno para formar ácido 3a-hidroxi-6a-etil-7-ceto-5p-colán-24-oico (6),

En una realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de ácido obeticólico Forma 1, que comprende las etapas de hacer reaccionar metil-éster de ácido 3a,7-ditrimetilsililoxi-5p-col-6-en-24-oico (3) con CH3CHO para formar metil-éster de ácido E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (4A),

hacer reaccionar metil-éster de ácido E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (4A) con NaOH para formar ácido E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (5A),

En una realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de ácido obeticólico Forma 1, que comprende las etapas de hacer reaccionar metil-éster de ácido 3a,7-ditrimetilsililoxi-5p-col-6-en-24-oico (3) con CH3CHO para formar metil-éster de ácido E/Z-E-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (4),

hacer reaccionar metil-éster de ácido E-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (4) con NaOH para formar ácido E-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (5),

En una realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de ácido obeticólico Forma 1, que comprende las etapas de hacer reaccionar metil-éster de 3a-hidroxi-7-ceto-5p-colán-24-oico (1) con Li[N(CH(CH3)2)2] y Si(CH3)3Cl para formar metil-éster de ácido 3a,7-ditrimetilsililoxi-5p-col-6-en-24-oico (3), hacer reaccionar metil-éster de ácido 3a,7-ditrimetilsililoxi-5p-col-6-en-24-oico (3) con CH3CHO para formar metil-éster de ácido E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (4A),

En una realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de ácido obeticólico Forma 1, que comprende las etapas de hacer reaccionar metil-éster de ácido 3a-hidroxi-7-ceto-5p-colán-24-oico (1) con Li[N(CH(CH3)2)2] y Si(CH3)3Cl t3Cl para formar metil-éster de ácido 3a,7-ditrimetilsityloxy-5p-col-6-en-24-oico (3), hacer reaccionar metil-éster de ácido 3a,7-ditrimetilsililoxi-5p-col-6-en-24-oico (3) con CH3CHO para formar metil-éster de ácido E-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (4),

En una realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de ácido obeticólico Forma 1, que comprende las etapas de hacer reaccionar ácido 3a-hidroxi-7-ceto-5p-colán-24-oico (KLCA) con CH3OH y H2SO4 para formar metil-éster de ácido 3a-hidroxi-7-ceto-5p-colán-24-oico (1),

hacer reaccionar metil-éster de ácido 3a-hidroxi-7-ceto-5p-colán-24-oico (1) con Li[N(CH(CH3)2)2] y Si(CH3)3Cl para formar metil-éster de ácido 3a,7-ditrimetilsililoxi-5p-col-6-en-24-oico (3),

hacer reaccionar metil-éster de ácido 3a,7-ditrimetilsililoxi-5p-col-6-en-24-oico (3) con CH3CHO para formar metil-éster de ácido E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (4A),

En una realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de ácido obeticólico Forma 1, que comprende las etapas de hacer reaccionar ácido 3a-hidroxi-7-ceto-5p-colán-24-oico con CH3OH y H2SO4 para formar metil-éster de ácido 3a-hidroxi-7-ceto-5p-colán-24-oico (1),

hacer reaccionar metil-éster de ácido 3a,7-ditrimetilsililoxi-5p-col-6-en-24-oico (3) con CH3CHO para formar metil-éster de ácido E-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (4),

hacer reaccionar ácido 3a-hydrox-6a-etil-7-ceto-5p-colán-24-oico (6) con NaBH4 para formar ácido obeticólico cristalino, según el procedimiento indicado anteriormente y en la reivindicación 1, y convertir el ácido obeticólico cristalino en ácido obeticólico Forma 1.

En una realización, el ácido obeticólico cristalino es la Forma C. En una realización, el ácido obeticólico cristalino Forma C se caracteriza por un patrón de difracción de rayos X similar al indicado en la figura 5. En una realización, el ácido obeticólico cristalino Forma C se cristaliza y recristaliza a partir de acetato de n-butilo.

Etapa 1 (realización preferente)

La etapa 1 es la reacción de ácido 3a-hidroxi-7-ceto-5p-colán-24-oico (KLCA) con CH3OH y H2SO4 para formar metiléster de ácido 3a-hidroxi-7-ceto-5p-colán-24-oico (1). En una realización de la etapa 1, la mezcla de reacción se calentó durante aproximadamene 3 horas y el pH de la mezcla de reacción se ajustó con una solución acuosa básica a un valor de pH de entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 8,0. En una realización, el metil-éster de ácido 3a-hidroxi-7-ceto-5p-colán-24-oico (1) comprende además el tratamiento con carbón activo. En una realización, el metil-éster de ácido 3a-hidroxi-7-ceto-5p-colán-24-oico (1) no comprende además el tratamiento con carbón activo. En una realización, el metil-éster de ácido 3a-hidroxi-7-ceto-5p-colán-24-oico (1) sin el tratamiento con carbón activo proporciona un rendimiento más elevado. En una realización, la reacción de ácido 3a-hidroxi-7-ceto-5p-colán-24-oico (1) con CH3OH y H2SO4 se lleva a cabo en metanol. En una realización, la solución básica es una solución acuosa de NaOH. En una realización, el valor del pH es de entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 7,5.

En una realización, el alcohol metílico actúa como el reactivo metilante, así como el solvente de reacción. En una realización, la solución que contiene el producto se trata con carbón activo durante aproximadamente 30 minutos y se filtra para eliminar los sólidos de carbón. En una realización, la solución que contiene el producto no se trata con carbón activo. Para precipitar el producto, se añade agua a una temperatura de entre aproximadamente 5°C y aproximadamente 20°C y material de inóculo. En otra realización, el agua se encuentra a una temperatura de entre aproximadamente 10°C y aproximadamente 15°C. En una realización, el producto se aísla con una centrífuga y se lava con una mezcla de metanol y agua. En una realización, el contenido de agua del material humectado se cuantifica mediante Karl Fischer (KF). En una realización, el material se seca en una secadora de tambor antes de la utilización en la etapa siguiente. En una realización, el material no se seca antes de la utilización en la etapa siguiente.

Etapa 2 (realización preferente)

La etapa 2 es la reacción de metil-éster de ácido 3a-hidroxi-7-ceto-5p-colán-24-oico (1) con Li[N(CH(CH3)2)2] y Si(CH3)3Cl para formar metil-éster de ácido 3a,7-ditrimetilsililoxi-5p-col-6-en-24-oico (3). En una realización, la etapa 2 se lleva a cabo en un solvente aprótico polar a una temperatura de entre aproximadamente -10°C y aproximadamente -30°C. En una realización, el solvente aprótico polar es el tetrahidrofurano. En una realización, la temperatura es de entre aproximadamente -20 °C y aproximadamente -25°C. En una realización, metil-éster de ácido 3a-hidroxi-7-ceto-5p-colán-24-oico (1) en reacción con Li[N(CH(CH3)2)2] y Si(CH3)3Cl se somete a agitación durante aproximadamente 2 horas.

En una realización, el compuesto 1 se carga en el reactor bajo condiciones inertes. En otra realización, se elimina el agua y metanol residuales mediante destilación azeotrópica repetida a aproximadamente 65°C y presión normal. En otra realización, se añade THF al residuo según resulte necesario y la destilación se repite aproximadamente 4 veces. En otra realización, la destilación se repite aproximadamente 3 veces, aproximadamente 2 veces o aproximadamente 1 vez. En una realización, la solución remanente que contiene el producto presenta un contenido final de agua <0,05% (titulación de Karl Fischer). El agua puede hidrolizar el clorotrimetilsilano, que se añade posteriormente en dicha etapa. En una realización, la solución del producto se preenfría a una temperatura de entre aproximadamente -10°C y aproximadamente -30°C y después se añade clorotrimetilsilano. En otra realización, la solución se preenfría a una temperatura de entre aproximadamente -20°C y aproximadamente -25°C. En una realización, se carga una base fuerte y THF en un reactor separado y se enfrían a una temperatura de entre aproximadamente -10°C y aproximadamente -30°C. En una realización, la base fuerte es diisopropilamida de litio. En otra realización, el reactor es inerte, p.ej., bajo una atmósfera de nitrógeno o argón. En otra realización, la solución de base y THF se enfría a una temperatura de entre aproximadamente -20°C y aproximadamente -25°C. En una realización, la solución fría seca de metil-éster de ácido 3a-hidroxi-7-ceto-5p-colán-24-oico, THF y clorotrimetilsilano se carga en la solución básica a una temperatura de entre aproximadamente -10°C y aproximadamente -30°C. En otra realización, la temperatura es de entre aproximadamente -20°C y aproximadamente -25°C. En una realización, la mezcla de reacción se agita durante aproximadamente 2 horas. En una realización, para el tratamiento final, la mezcla de reacción se añade a una solución ácida preenfriada. En otra realización, la solución ácida es una solución acuosa de ácido cítrico. En una realización, tras la adición, se separa la fase acuosa y se descarta. En una realización, se elimina el solvente de la fase orgánica, mediante destilación al vacío a aproximadamente 50°C. En una realización, el residuo aislado es metil-éster de ácido 3a,7a-ditrimetilsililoxi-5p-col-6-en-24-oico (3) 'sin modificación' en la etapa siguiente. Alternativamente, el compuesto 3 puede purificarse antes de la etapa 3.

Etapa 3 (realización preferente)

La etapa 3 es la reacción de metil-éster de ácido 3a,7-ditrimetilsililoxi-5p-col-6-en-24-oico (3) con CH3CHO para formar metil-éster de ácido 3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (4). En una realización, la etapa 3 se lleva a cabo en un solvente aprótico polar a una temperatura de entre aproximadamente -50°C y aproximadamente -70°C en presencia de BF3. En una realización, el solvente aprótico polar es el diclorometano. En una realización, el BF3 es una solución al 16% en peso en acetonitrilo. En una realización, la temperatura es de entre aproximadamente -60°C y aproximadamente -65°C.

En una realización, el compuesto 3 en un solvente aprótico polar se carga en un reactor inerte. En otra realización, el solvente aprótico polar es el solvente residual de la etapa anterior (p.ej., THF). En una realización, se añade THF para ayudar a eliminar mediante destilación el agua y diisopropilamina residuales. A una temperatura máxima de aproximadamente 50°C, se eliminan mediante destilación al vacío cantidades residuales del solvente aprótico polar. El contenido de agua en el residuo que contiene compuesto 3 se encuentra limitado a <0,5% (titulación de Karl Fischer). El residuo que contiene compuesto 3 a continuación se disuelve en un solvente aprótico polar y se preenfría hasta una temperatura de entre aproximadamente -50°C y aproximadamente -70°C. El solvente aprótico polar es el diclorometano. En otra realización, el residuo que contiene compuesto 3 en el solvente aprótico polar se preenfría a una temperatura de entre aproximadamente -60°C y aproximadamente -65°C. Se añade acetaldehído (CH3CHO). Se carga un solvente aprótico polar y complejo solvatado de trifluoruro de boro (BF3) en un reactor separado y después se enfría a una temperatura de entre aproximadamente -50°C y aproximadamente -70°C. En otra realización, el solvente aprótico polar es el diclorometano. En otra realización, el complejo solvatado de trifluoruro de boro es un complejo de trifluoruro de boro-acetonitrilo. La temperatura de la solución de BF3 es de entre aproximadamente -60°C y aproximadamente -65°C. La solución que contiene compuesto 3 y acetaldehído se añadió a la solución de BF3 a una temperatura de entre aproximadamente -60°C y aproximadamente -65°C. En otra realización, la solución que contiene compuesto 3 y acetaldehído es seca. En una realización, la mezcla de reacción se agita durante aproximadamente dos horas a una temperatura de entre aproximadamente -60°C y aproximadamente -65°C, se calienta hasta una temperatura de entre aproximadamente 23°C y aproximadamente 28°C, se agita durante aproximadamente 2 horas adicionales y se enfría hasta una temperatura de entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 10°C para la hidrólisis/tratamiento final. En una realización, el tiempo total para la adición y la agitación es aproximadamente 4 horas. En una realización, para el tratamiento final, la solución enfriada del reactor se añade a una solución acuosa básica preenfriada. En otra realización, la solución acuosa básica es hidróxido sódico aproximadamente al 50% en peso (NaOH, sosa cáustica). En una realización, las fases se separan y la capa orgánica (inferior) se transfiere a un reactor separado. En una realización, de la capa orgánica, se elimina el solvente mediante destilación a no más de (NMD) 50% en la medida de lo posible. En una realización, el residuo comprende metil-éster de ácido 3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (4) y algo de acetonitrilo y diclorometano. Se entiende que la etapa 4 puede formar metil-éster de ácido E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (4A). El producto de la etapa 3 se lleva directamente a la etapa 4.

Etapa 4 (realización preferente)

La etapa 4 es la reacción de metil-éster de ácido 3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (4) con NaOH para formar ácido E-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (5). En una realización, antes de la etapa 4, el residuo de la etapa 3 se calienta hasta una temperatura de entre aproximadamente 45°C y aproximadamente 6o°C para eliminar las cantidades residuales de solvente. En una realización, la temperatura es de entre aproximadamente 49°C y aproximadamente 55°C. En una realización, la reacción de hidrólisis de éster de reacción de metil-éster de ácido 3ahidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (4) con NaOH se lleva a cabo a una temperatura de entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 25°C en metanol, agua y una solución de NaOH.

En una realización, se carga en un reactor metil-éster de ácido 3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (4) en reacción. En otra realización, el reactor es inerte, p.ej., bajo una atmósfera de nitrógeno o argón. A una temperatura máxima de NMD 50°C, se eliminan mediante destilación al vacío las cantidades residuales del solvente. En una realización, el residuo se calienta hasta una temperatura de entre aproximadamente 45°C y aproximadamente 60°C. En otra realización, el residuo se calienta hasta una temperatura de entre aproximadamente 49°C y aproximadamente 55°C. En otra realización, el residuo de la etapa 3 (compuesto 4) se disuelve en metanol y agua y una solución acuosa básica. En otra realización, la solución acuosa básica es hidróxido sódico aproximadamente al 50% en peso (NaOH, sosa cáustica). La reacción de hidrólisis de éster de la etapa 4 se lleva a cabo a una temperatura de entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 60°C y se agita hasta completar la reacción de hidrólisis. En una realización, la hidrólisis de éster se lleva a cabo a una temperatura de entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 25°C. El pH de la mezcla de reacción se comprueba para verificar que es >12. En el caso de que el pH <12, se añade NaOH adicional. La mezcla de reacción se diluye con agua y la temperatura se ajusta a un valor entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 35°C. En otro aspecto, la mezcla de reacción se diluye con agua y la temperatura se ajusta a un valor entre aproximadamente 25°C y aproximadamente 35°C. En una realización, para el tratamiento final, se separan las fases y la capa acuosa inferior se transfiere a un reactor separado y se descarta la capa orgánica. El compuesto 5 se encuentra en la fase acuosa. En una realización, se añade acetato de etilo y un ácido a la fase acuosa que contiene compuesto 5 con agitación intensiva de la capa acuosa. En otra realización, el ácido es una solución acuosa de ácido cítrico. En una realización, las fases se separan y se descarta la capa acuosa inferior. El compuesto 5 se encuentra en la fase orgánica. En una realización, se elimina por destilación el acetato de etilo de la capa orgánica y se sustituye por acetato de etilo. En una realización, se repite la destilación hasta que el contenido de agua del destilado es NMD 1% o hasta alcanzar un punto de ebullición constante. En una realización, la suspensión se enfría hasta una temperatura de entre aproximadamente 10°C y aproximadamente 30°C y se aísla y se lava con acetato de etilo. En otra realización, la suspensión resultante que contiene compuesto 5 se enfría hasta una temperatura de entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 25°C. En una realización, el secado del producto resultante se lleva a cabo al vacío (p.ej., en una secadora) a aproximadamente 60°C.

En una realización, se cristaliza ácido E-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (5) utilizando etanol. En una realización, se carga en el reactor etanol y el compuesto 5 en bruto. En otra realización, el reactor es inerte. En una realización, para disolver el compuesto 5 en bruto, la mezcla se calienta bajo reflujo. En una realización, la mezcla se enfría en una rampa de enfriamiento controlado hasta una temperatura de entre aproximadamente 15°C y aproximadamente 20°C. En una realización, el compuesto 5 cristalino se aísla utilizando una centrífuga y después se lava con acetato de etilo. En una realización, el secado del compuesto 5 cristalino se lleva a cabo al vacío (p.ej., secadora) y a aproximadamente 60°C. Puede extraerse una muestra para medir la pureza del ensayo y la humedad del compuesto purificado 5. En una realización, el compuesto 5 purificado contiene tanto isómeros E como Z de ácido 3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico. En una realización, la proporción E a Z es de aproximadamente 99:1, de aproximadamente 98:2, de aproximadamente 95: 5, de aproximadamente 90:10, de aproximadamente 85:15, de aproximadamente 80:20, de aproximadamente 75:25, de aproximadamente 70:30, de aproximadamente 65:35, de aproximadamente 60:40, de aproximadamente 55:45 o de aproximadamente 50:50. Ver el Ejemplo 2 para información completa sobre la identificación y caracterización del compuesto 5 purificado.

La etapa 4 también puede llevarse a cabo partiendo de un compuesto que es una mezcla de isómero E/Z. Por ejemplo, la etapa 4 es la reacción de metil-éster de ácido E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (4A) con NaOH para formar ácido E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (5A). En una realización, antes de la etapa 4, el residuo de la etapa 3 se calienta hasta una temperatura de entre aproximadamente 45°C y aproximadamente 60°C para eliminar las cantidades residuales de solvente. En una realización, la temperatura es de entre aproximadamente 49°C y aproximadamente 55°C. En una realización, la reacción de hidrólisis de éster que implica hacer reaccionar metiléster de ácido E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (4) con NaOH se lleva a cabo a una temperatura de entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 25°C en metanol, agua y una solución de NaOH. En una realización, la solución de NaOH es una solución acuosa de 50% al peso.

En una realización, se carga en un reactor metil-éster de ácido E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (4) en reacción. En otra realización, el reactor es inerte, p.ej., bajo una atmósfera de nitrógeno o argón. A una temperatura máxima de NMD 50°C, se eliminan mediante destilación al vacío las cantidades residuales del solvente. En una realización, el residuo se calienta hasta una temperatura de entre aproximadamente 45°C y aproximadamente 60°C. En una realización, la temperatura es de entre aproximadamente 49°C y aproximadamente 55°C. En una realización, el residuo de la etapa 3 (compuesto 4A) se disuelve en metanol y agua y una solución acuosa básica. En otra realización, la solución acuosa básica es hidróxido sódico aproximadamente al 50% en peso (NaOH, sosa cáustica). La reacción de hidrólisis de éster de la etapa 4 se lleva a cabo a una temperatura de entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 60°C y se agita hasta completar la reacción de hidrólisis. En una realización, la hidrólisis de éster se lleva a cabo a una temperatura de entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 25°C. El pH de la mezcla de reacción se comprueba para verificar que es >12. En el caso de que el pH <12, se añade NaOH adicional. La mezcla de reacción se diluye con agua y la temperatura se ajusta a un valor entre aproximadamente 25°C y aproximadamente 35°C. En una realización, para el tratamiento final, se separan las fases y la capa acuosa inferior se transfiere a un reactor separado y se descarta la capa orgánica. El compuesto 5A se encuentra en la fase acuosa. En una realización, se añade acetato de etilo y un ácido a la fase acuosa que contiene compuesto 5A con agitación intensiva de la capa acuosa. En otra realización, el ácido es una solución acuosa de ácido cítrico. En una realización, las fases se separan y se descarta la capa acuosa inferior. El compuesto 5A se encuentra en la fase orgánica. En una realización, se elimina por destilación el acetato de etilo de la capa orgánica y se sustituye por acetato de etilo. En una realización, se repite la destilación hasta que el contenido de agua del destilado es NMD 1% o hasta alcanzar un punto de ebullición constante. En una realización, la suspensión se enfría hasta una temperatura de entre aproximadamente 10°C y aproximadamente 30°C y se aísla y se lava con acetato de etilo. En otra realización, la suspensión resultante que contiene compuesto 5A se enfría hasta una temperatura de entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 25°C. En una realización, el secado del producto resultante se lleva a cabo al vacío (p.ej., en una secadora) a aproximadamente 60°C. El compuesto 5A puede llevarse a la etapa 5 sin purificación.

En una realización, se cristaliza ácido E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (5A) utilizando etanol. En una realización, se carga en el reactor etanol y el compuesto 5A en bruto. En otra realización, el reactor es inerte. En una realización, para disolver el compuesto 5A en bruto, la mezcla se calienta bajo reflujo. En una realización, la mezcla se enfría en una rampa de enfriamiento controlado hasta una temperatura de entre aproximadamente 15°C y aproximadamente 20°C. En una realización, el compuesto 5A cristalino se aísla utilizando una centrífuga y después se lava con acetato de etilo. En una realización, el secado del compuesto 5A cristalino se lleva a cabo al vacío (p.ej., secadora) y a aproximadamente 60°C. En una realización, el producto cristalino aislado de la etapa 4 es compuesto 5.

Etapa alternativa 4 (realización preferente)

El compuesto 5 puede prepararse según un método alternativo. En una realización, el compuesto 4 se carga en el reactor inerte. A aproximadamente 50°C (máximo) pueden eliminarse mediante destilación al vacío cantidades residuales de solvente (p.ej., acetonitrilo, diclorometano). El residuo se disuelve en metanol y se enfría. Se añade agua corriente y sosa cáustica (NaOH al 50% en peso). En una realización, la mezcla de reacción se agita durante aproximadamente cuatro horas a una temperatura de entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 25°C. La solución se diluye con agua corriente y se añade tolueno. Tras la agitación, las fases se separan y la capa acuosa inferior se transfiere al reactor inerte. La capa orgánica se descarta. Se añadió etil-éster de ácido acético y una solución de ácido cítrico durante la agitación intensiva de la capa acuosa. Se separaron las fases y se descartó la capa acuosa inferior. La capa orgánica se transfirió al reactor inerte. A partir de la capa orgánica, se elimina mediante destilación el etil-éster de ácido acético y se sustituye por etil-éster de ácido acético. En una realización, se repite la operación hasta que el contenido de agua del destilado sea no superior a aproximadamente 1% o hasta alcanzar un punto de ebullición constante. La presente suspensión se enfrió hasta una temperatura de entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 25°C, y se aisló el compuesto 5 y se lavó con etil-éster de ácido acético con la centrífuga inerte. El secado se llevó a cabo en la secadora al vacío y a aproximadamente 60°C.

Dicha etapa alternativa 4 también puede llevarse a cabo partiendo de un compuesto que es una mezcla de isómero E/Z. En una realización, el compuesto 4A se carga en el reactor inerte. A aproximadamente 50°C (máximo) pueden eliminarse mediante destilación al vacío cantidades residuales de solvente (p.ej., acetonitrilo, diclorometano). El residuo se disuelve en metanol y se enfría. Se añade agua corriente y sosa cáustica (NaOH al 50% en peso). En una realización, la mezcla de reacción se agita durante aproximadamente cuatro horas a una temperatura de entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 25°C. La solución se diluye con agua corriente y se añade tolueno. Tras la agitación, las fases se separan y la capa acuosa inferior se transfiere al reactor inerte. La capa orgánica se descarta. Se añadió etil-éster de ácido acético y una solución de ácido cítrico durante la agitación intensiva de la capa acuosa. Se separaron las fases y se descartó la capa acuosa inferior. La capa orgánica se transfirió al reactor inerte. A partir de la capa orgánica, se elimina mediante destilación el etil-éster de ácido acético y se sustituye por etil-éster de ácido acético. En una realización, se repite la operación hasta que el contenido de agua del destilado sea no superior a aproximadamente 1% o hasta alcanzar un punto de ebullición constante. La presente suspensión se enfrió hasta una temperatura de entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 25°C, y se aisló el compuesto 5A y se lavó con etiléster de ácido acético con la centrífuga inerte. El secado se llevó a cabo en la secadora al vacío y a aproximadamente 60°C.

Etapa 5 (realización preferente)

La etapa 5 es la reacción de ácido E-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (5) con Pd/C y gas hidrógeno para formar ácido 3a-hidroxi-6a-etil-7-ceto-5p-colán-24-oico (6). La etapa 5 puede llevarse a cabo en una fase (hidrogenación e isomerización juntas) o en dos fases (hidrogenación seguido de isomerización). En una realización, la etapa 5 se lleva a cabo a una temperatura de entre aproximadamente 90°C y aproximadamente 110°C y a una presión de entre aproximadamente 4 y aproximadamente 5 bar. En una realización, durante el tratamiento final, la fase orgánica de la mezcla de reacción se trata con carbón activo. En una realización, la presión es de entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 5,5 bar. En otra realización, la presión es de aproximadamente 5 bar. En una realización, la mezcla de reacción de hidrogenación se deja bajo agitación durante aproximadamente 1 hora. En una realización, el ácido E-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (5) en reacción con Pd/C y gas hidrógeno se calienta hasta aproximadamente 100°C y se agita durante un periodo de entre aproximadamente 2 horas y aproximadamente 5 horas. En una realización, el ácido E-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (5) en reacción con Pd/C y gas hidrógeno se calienta hasta aproximadamente 100°C y se agita durante aproximadamente 3 horas.

En una realización, la reacción de ácido E-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (5) con Pd/C y gas hidrógeno se lleva a cabo en presencia de una solución básica. En una realización, la solución básica es una solución de hidróxido sódico al 50% en peso (NaOH, sosa cáustica). Tras la reacción de hidrogenación, la mezcla de reacción se calienta hasta aproximadamente 100°C (para llevar a cabo la isomerización de la posición C-6 de la configuración beta a la configuración alfa) y después se enfría hasta una temperatura de entre aproximadamente 40°C y aproximadamente 50°C. Para el tratamiento final, se separa mediante filtración el Pd/C. En una realización, al filtrado se añade acetato de n-butilo y un ácido. En otra realización, el ácido es ácido clorhídrico (HCl). La fase acuosa se separa y se descarta tras comprobar el valor del pH para verificar que es ácido. La fase orgánica que contiene el producto se trata con carbón activo. En una realización, se separa el carbón activo mediante filtración y el filtrado resultante que contiene el producto se condensa mediante destilación y la suspensión resultante se enfría hasta una temperatura de entre aproximadamente 10°C y aproximadamente 30°C. En otra realización, la suspensión se enfría hasta una temperatura de entre aproximadamente 15°C y aproximadamente 20°C. Se aísla la suspensión que contiene el compuesto 6 y se lava con acetato de n-butilo. El compuesto 6 se filtra utilizando un filtro de presión. En una realización, el secado se lleva a cabo en el filtro de presión bajo vacío a aproximadamente 80°C.

En una realización en la etapa 5, se mezcla ácido E-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (5), agua, solución de NaOH (p.ej., al 50% en peso) y Pd/C a aproximadamente 5 bar de gas H2 y a una temperatura de entre aproximadamente 100°C y aproximadamente l05°C hasta que ha cesado la incorporación de H2. La mezcla de reacción se enfría hasta una temperatura de entre aproximadamente 40°C y aproximadamente 50°C y se separa mediante filtración el Pd/C. A continuación, se añade acetato de n-butilo y HCl a la solución que contiene compuesto 6. En una realización, se separa la fase acuosa y se descarta. La fase orgánica que contiene el compuesto 6 se trata con carbón activo. El carbón se separa mediante filtración y el filtrado se desplaza a otro reactor, en donde se reduce mediante destilación y después la suspensión se enfría hasta una temperatura de entre aproximadamente 5°C y aproximadamente 20°C. En una realización, se aísla el compuesto 6 mediante filtración y el filtrado se seca en el filtro de presión al vacío a aproximadamente 80°C.

La etapa 5 también puede llevarse a cabo partiendo de un compuesto que es una mezcla de isómero E/Z. Por ejemplo, la etapa 5 es la reacción de ácido E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (5A) con Pd/C y gas hidrógeno y calor para formar ácido 3a-hidroxi-6a-etil-7-ceto-5p-colán-24-oico (6). La etapa 5 puede llevarse a cabo en una fase (hidrogenación e isomerización juntas) o en dos fases (hidrogenación seguido de isomerización). En un aspecto, la etapa 5 se lleva a cabo a una temperatura de entre aproximadamente 90°C y aproximadamente 110°C y a una presión de entre aproximadamente 4 y aproximadamente 5 bar. En una realización, durante el tratamiento final, la fase orgánica de la mezcla de reacción se trata con carbón activo. En una realización, la presión es de entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 5,5 bar. En otra realización, la presión es de aproximadamente 5 bar. En una realización, la mezcla de reacción de hidrogenación se deja bajo agitación durante aproximadamente 1 hora. En una realización, el ácido E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (5A) en reacción con Pd/C y gas hidrógeno se calienta hasta aproximadamente 100°C y se agita durante un periodo de entre aproximadamente 2 horas y aproximadamente 5 horas. En una realización, el ácido E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (5) en reacción con Pd/C y gas hidrógeno se calienta hasta aproximadamente 100°C y se agita durante aproximadamente 3 horas.

En una realización, la reacción de ácido E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (5A) con Pd/C y gas hidrógeno se lleva a cabo en presencia de una solución básica. En una realización, la solución básica es una solución de hidróxido sódico al 50% en peso (NaOH, sosa cáustica). Tras la reacción de hidrogenación, la mezcla de reacción se calienta hasta aproximadamente 100°C (para llevar a cabo la isomerización de la posición C-6 de la configuración beta a la configuración alfa) y después se enfría hasta una temperatura de entre aproximadamente 40°C y aproximadamente 50°C. Para el tratamiento final, se separa mediante filtración el Pd/C. En una realización, al filtrado se añade acetato de n-butilo y un ácido. En otra realización, el ácido es ácido clorhídrico (HCl). La fase acuosa se separa y se descarta tras comprobar el valor del pH para verificar que es ácido. La fase orgánica que contiene el producto se trata con carbón activo. En una realización, se separa el carbón activo mediante filtración y el filtrado resultante que contiene el producto se condensa mediante destilación y la suspensión resultante se enfría hasta una temperatura de entre aproximadamente 10°C y aproximadamente 30°C. En otra realización, la suspensión se enfría hasta una temperatura de entre aproximadamente 15°C y aproximadamente 20°C. Se aísla la suspensión que contiene el compuesto 6 y se lava con acetato de n-butilo. El compuesto 6 se filtra utilizando un filtro de presión. En una realización, el secado se lleva a cabo en el filtro de presión bajo vacío a aproximadamente 80°C.

En una realización en la etapa 5, se mezcla ácido E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico (5A), agua, solución de NaOH (p.ej., al 50% en peso) y Pd/C a aproximadamente 5 bar de gas H2 y a una temperatura de entre aproximadamente 100°C y aproximadamente 105°C hasta que ha cesado la incorporación de H2. La mezcla de reacción se enfría hasta una temperatura de entre aproximadamente 40°C y aproximadamente 50°C y se separa mediante filtración el Pd/C. A continuación, se añade acetato de n-butilo y HCl a la solución que contiene compuesto 6. En una realización, se separa la fase acuosa y se descarta. La fase orgánica que contiene el compuesto 6 se trata con carbón activo. El carbón se separa mediante filtración y el filtrado se desplaza a otro reactor, en donde se reduce mediante destilación y después la suspensión se enfría hasta una temperatura de entre aproximadamente 5°C y aproximadamente 20°C. En una realización, se aísla el compuesto 6 mediante filtración y el filtrado se seca en el filtro de presión al vacío a aproximadamente 80°C.

En otra realización, las reacciones de hidrogenación/isomerización indicadas anteriormente para preparar el compuesto 6 se llevaron a cabo en dos etapas (partiendo de compuesto 5 o compuesto 5A). En primer lugar, la hidrogenación se lleva a cabo a aproximadamente 4 a 5 bar y seguidamente, en segundo lugar, la mezcla de reacción se calienta hasta una temperatura de entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 40°C. El calentamiento de la mezcla de reacción isomeriza el grupo etilo en la posición 6 en la configuración alfa deseada. La mezcla de reacción se calentó hasta completar la isomerización.

Etapa 6 (característica esencial de la invención)

(En la medida en que la materia objeto de la invención es compatible con el procedimiento según la reivindicación 1 aunque no se encuentra limitada al mismo; representa una realización preferente del procedimiento de la invención) La etapa 6 es la reacción de ácido 3a-hidroxi-6a-etil-7-ceto-5p-colán-24-oico (6) con NaBH4 para formar ácido obeticólico cristalino. La etapa 6 se lleva a cabo a una temperatura de entre aproximadamente 85°C y aproximadamente 110°C en una solución acuosa básica. En una realización, la temperatura es de entre aproximadamente 90°C y aproximadamente 95°C. En una realización, la solución acuosa básica es una solución acuosa de NaOH. En una realización, la solución acuosa básica es una mezcla de solución de NaOH al 50% en peso y agua. En una realización, la mezcla de reacción de compuesto 6 y NaBH4 se agitó durante un periodo de entre aproximadamente 3 horas y aproximadamente 5 horas. En otra realización, la mezcla de reacción se agitó durante aproximadamente 4 horas. Para el tratamiento final, tras completar la reacción, la mezcla se enfrió a aproximadamente 80°C y se transfirió a un reactor enfriado. En una realización, a una temperatura de entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 60°C, se añade acetato de n-butilo y un ácido. En una realización, la temperatura es de entre aproximadamente 40°C y aproximadamente 45°C. En otra realización, el ácido es ácido cítrico. La fase acuosa se separa y se descarta tras comprobar el valor del pH para verificar que es ácido. La fase orgánica que contiene el producto se concentra mediante destilación. En una realización, se añade acetato de n-butilo al residuo y se elimina nuevamente mediante destilación. En una realización, se añade nuevamente acetato de n-butilo al residuo y después se enfría lentamente, En otra realización, el residuo se inocula a aproximadamente 50°C. En otra realización, tras producirse la cristalización, la mezcla se calienta a 52°C y después se enfría lentamente hasta una temperatura de entre aproximadamente 15°C y aproximadamente 20°C. En otra realización, el residuo se enfría hasta una temperatura de entre aproximadamente 15°C y aproximadamente 20°C. En una realización, el ácido obeticólico resultante se lava con acetato de n-butilo. En una realización, el ácido obeticólicco se aísla y se lava con acetato de n-butilo (p.ej., en un filtro de presión). En otra realización, el filtro de presión es inerte. El producto cristalino se seca al vacío a aproximadamente 60°C. En una realización, el ácido obeticólico cristalino resultante se aísla a partir de solvente orgánico (p.ej., heptano). Ver el Ejemplo 3 para información completa sobre la identificación y caracterización del ácido obeticólico cristalino Forma C.

Etapa 7 (etapa esencial de la invención)

(En la medida en que la materia objeto de la invención es compatible con el procedimiento según la reivindicación 1 aunque no se encuentra limitada al mismo; representa una realización preferente del procedimiento de la invención) La etapa 7 es la conversión de ácido obeticólico cristalino Forma C en ácido obeticólico Forma 1. En una realización, la etapa 7 comprende la etapa de disolver el ácido obeticólico cristalino Forma C en solución acuosa de NaOH y añadir HCl.

En una realización, se disuelve ácido obeticólico cristalino en agua y solución de sosa cáustica (al 50% en peso) a una temperatura de entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 50°C. En una realización, la temperatura es de entre aproximadamente 30°C y aproximadamente 40°C. En una realización, el ácido obeticólico cristalino es Forma C. en una realización, la solución resultante de ácido obeticólico cristalino Forma C se añade a ácido diluido a una temperatura de entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 50°C. En otra realización, la temperatura es de entre aproximadamente 30°C y aproximadamente 40°C. En otra realización, el ácido es ácido clorhídrico (p.ej., al 37%). En una realización, la solución de ácido clorhídrico al 37% se diluye con agua hasta menos de aproximadamente 1% en volumen. En una realización, la solución de ácido clorhídrico al 37% se diluye con agua hasta menos de aproximadamente 0,7% en volumen. En una realización, la suspensión de producto en el ácido diluido se agita durante aproximadamente 30 minutos a una temperatura de entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 50°C. En otra realización, la temperatura es de entre aproximadamente 30°C y aproximadamente 40°C. En una realización, se aísla ácido obeticólico Forma 1 y se lava con agua (p.ej., en el filtro de presión) a NMD aproximadamente 20°C. En una realización, se aísla ácido obeticólico Forma 1 y se lava con agua (p.ej., en el filtro de presión) a NMD aproximadamente 20°C. En otra realización, el filtro de presión es inerte. El producto se seca en el filtro de presión al vacío a una temperatura de NMD aproximadamente 50°C.

El procedimiento de la presente solicitud utiliza un intermediario cristalino en la preparación de ácido obeticólico Forma 1, que inesperadamente conduce a mejoras significativas en la preparación y pureza global del producto final. Específicamente, la etapa 6 de la síntesis produce una nueva forma cristalina de ácido obeticólico. La producción de dicha forma cristalina conduce a ácido obeticólico Forma 1 sustancialmente puro.

El procedimiento de la presente solicitud es una mejora respecto a los procedimientos dados a conocer en la técnica anterior. La preparación de ácido obeticólico se da a conocer en la publicación de patente US n° 2009/0062526 A1 (denominada en la presente memoria “publicación 526”), en la patente US n° 7.138.390 (denominada en la presente memoria “patente 390”) y en el documento n° WO 2006/122977 (denominado en la presente memoria, “solicitud 977”). El procedimiento para preparar ácido obeticólico en la patente 390 (denominado en la presente memoria, “procedimiento 390”) se ilustra en el Esquema 3 (R es etilo):

aunque dicho procedimiento comprende unas cuantas etapas, adolece de una serie de desventajas. En la totalidad de las etapas, los productos de reacción se purifican en una columna cromatográfica, es decir, es un método de separación muy caro que no puede utilizarse a escala industrial. Además, el rendimiento de reacción en la etapa 2 es extremadamente bajo (12% a 13%), con una reducción considerable del rendimiento global, que es inferior a 3,5%. Dicho procedimiento utiliza además hexametilén-fosfonamida como reactivo, que es un agente carcinogénico conocido.

El procedimiento para preparar ácido obeticólico en la solicitud 977 se ilustra en el Esquema 4.

Esquema 4

etapa 2

trieti amina/

trimeti c orosi ano

-etapa 4

acetaldehido/

trifluoruro de boro

r i il

apa

Hycat.

OH'

etapa 7

purificación

etapa 8

1) borohidruro sodico

en bruto

etapa 9

purificación

etapa 10

purificación

en bruto

ácido obeticólico purificado

El procedimiento 977 para preparar ácido obeticólico es un procedimiento sintético en 8 etapas que incluye una etapa de purificación (etapa 7) seguido de 2 etapas adicionales de purificación. Existe un número significativo de diferencias entre el procedimiento 977 y el procedimiento de la presente solicitud. La Tabla A, a continuación, indica por lo menos algunas diferencias entre los dos procedimientos:

Tabla A: diferencias entre el procedimiento 977 y el procedimiento de la Solicitud

Las diferencias en el procedimiento de la presente solicitud en comparación con el procedimiento 977 resultan en mejoras significativas del procedimiento, incluyendo mejoras relacionadas con la optimización del escalado, seguridad, así como pureza, y mejoras en el procedimiento global. La pureza del ácido obeticólico producido mediante los procedimientos de la presente solicitud es sustancialmente puro. Específicamente, el ácido obeticólico producido mediante los procedimientos de la presente solicitud es sustancialmente más puro que el ácido obeticólico producido mediante procedimientos de la técnica anterior, incluyendo el procedimiento 390 y el procedimiento 977. Por ejemplo, la comparación de los resultados presentados en el Certificado de análisis del ácido obeticólico producido mediante un procedimiento de la presente solicitud y el ácido obeticólico producido mediante el procedimiento 977 se muestra en la Tabla B, a continuación. Los porcentajes de las impurezas se determinaron utilizando métodos de HPLC. Tabla B: comparación de las impurezas del ácido obeticólico generado mediante el procedimiento de la Solicitud y el procedimiento 977

Ácido obeticólico cristalino como intermediario sintético

El ácido obeticólico se está desarrollando actualmente como ingrediente farmacéutico activo en forma de un sólido no cristalino. A fin de facilitar el desarrollo del ácido obeticólico, se ha llevado a cabo un estudio inicial de cristalización y polimorfismo con el objetivo de determinar si las formas cristalinas son accesibles y, en caso afirmativo, si resultan adecuadas para el desarrollo. Tras un cribado de solubilidad preliminar diseñado para proporcionar una mejor comprensión del comportamiento del material en diversos solventes, aparentemente el material presenta una tendencia a formar geles y posiblemente podría cristalizarse. A continuación, se llevó a cabo un amplio cribado de polimorfos, exponiendo el material a un gran abanico de solventes y condiciones de cristalización a fin de identificar y caracterizar el máximo número posible de polimorfos relevantes. Se encontraron cinco formas sólidas diferentes durante dicho cribado.

Tres formas (A, C y D) del ácido obeticólico eran hidratos/solvatos mixtos que contenían 0,25 moles eq. de agua y cantidades variables de un abanico de solventes orgánicos. Al calentarlos, dichos sólidos perdían cristalinidad y el solvente simultáneamente y, desafortunadamente, dichas formas solvatadas no resultaban adecuadas para el desarrollo adicional como ingrediente farmacéutico debido a sus bajas temperaturas de fusión y elevado contenido de solvente. Se indica además que existen formas “ inadecuadas” similares de dicho tipo. Por ejemplo, se encontró una forma solvatada de bajo punto de fusión en experimentos posteriores, así como cristales individuales de otra forma, que se encontró que era un solvato monohidrato/anisol mediante SCXRD (por sus siglas en inglés, difracción de rayos X de cristales individuales).

Las dos formas remanentes presentaban un punto de fusión más elevado y eran potencialmente más prometedoras, aunque una de ellas (la Forma G) no pudo reproducirse en el escalado ni repetirse, a pesar de realizarse muchos intentos. La dificultad para producir dicha forma sola la convierte en inadecuada para el desarrollo. La Forma F no solvatada restante se preparó reproduciblemente, aunque requirió extensos procedimientos de recristalización y la utilización de nitrometano, que es un solvente tóxico y puede detonar en el caso de que se sensibilice con aminas, álcalis, ácidos fuertes o temperaturas elevadas o compresión adiabática. Las inquietudes sobre los niveles residuales de nitrometano provocan que la Forma F también se considere inadecuada para el desarrollo.

Los resultados globales del estudio inicial de cristalización y de polimorfos reveló que el material podía formar diversas formas de materiales cristalinos, aunque ninguno de los materiales cristalinos o formas se consideró adecuado para el desarrollo.

No ha sido hasta mucho después que se ha descubierto la importancia de producir ácido obeticólico cristalino como intermediario en la penúltima etapa del procedimiento de la presente solicitud. El ácido obeticólico cristalino pudo aislarse fácilmente a gran escala utilizando el procedimiento de la solicitud. Dicho ácido obeticólico cristalino se determinó que era consistente con la Forma C a partir del estudio inicial de cristalización y polimorfos. La formación, facilidad de aislamiento y ácido obeticólico cristalino altamente puro producido como intermediario sintético en la etapa 7 en el procedimiento de la presente solicitud son en efecto cruciales para la preparación de ácido obeticólico sustancialmente puro.

El ácido obeticólico cristalino puede ser Forma C caracterizada por un patrón de difracción de rayos X que incluye picos característicos en aproximadamente 4,2, 6,4, 9,5, 12,5 y 16,7 grados 2-Theta. En una realización, el patrón de difracción de rayos X incluye picos característicos en aproximadamente 4,2, 6,4, 9,5, 12,5, 12,6, 15,5, 15,8, 16,0, 16,7 y 19,0 grados 2-Theta. En una realización, el patrón de difracción de rayos X incluye picos característicos en aproximadamente 4,2, 6,4, 8,3, 9,5, 11,1, 12,2, 12,5, 12,6, 15,5, 15,8, 16,0, 16,3, 16,7, 18,6 y 19,0 grados 2-Theta. En una realización, el patrón de difracción de rayos X incluye picos característicos en aproximadamente 4,2, 6,4, 8,3, 9,5, 11,1, 12,2, 12,5, 12,6, 15,5, 15,8, 16,0, 16,3, 16,7, 17,0, 17,8, 18,6, 18,8, 19,0, 20,5 y 20,9 grados 2-Theta. En una realización, el ácido obeticólico cristalino Forma C se caracteriza por un patrón de difracción de rayos X sustancialmente similar al indicado en la figura 5. En una realización, el patrón de difracción de rayos X se recogió en un difractómetro utilizando radiación Ka de Cu (40 kV, 40 mA). En una realización, el patrón de difracción de rayos X incluye picos característicos entre aproximadamente 12,0 y aproximadamente 12,8, y entre aproximadamente 15,4 y aproximadamente 21,0.

En una realización, el ácido obeticólico cristalino Forma C se caracteriza por un termograma de calorimetría diferencial de barrido (DSC, por sus siglas en inglés) con un valor endotérmico a aproximadamente 98±2°C, según medición con un instrumento Mettler DSC 823e. En una realización, el termograma de la calorimetría diferencial de barrido (DSC) presenta un valor endotérmico a aproximadamente 98±2°C según medición con un instrumento Mettler DSC 823e.

En una realización, el ácido obeticólico cristalino, en el que dicho ácido obeticólico cristalino es Forma C y presenta una pureza superior a aproximadamente 90%. En una realización, la pureza de dicho ácido obeticólico cristalino Forma C se determina mediante HPLC. En una realización, el ácido obeticólico cristalino es Forma C, o una sal, solvato o conjugado de aminoácidos farmacéuticamente aceptable del mismo. En una realización, el solvato es un hidrato. En una realización, la pureza es superior a aproximadamente 92%. En una realización, la pureza es superior a aproximadamente 94%. En una realización, la pureza es superior a aproximadamente 96%. En una realización, la pureza es superior a aproximadamente 98%. En una realización, la pureza es superior a aproximadamente 99%.

En una realización, el ácido obeticólico cristalino, en el que dicho ácido obeticólico cristalino es Forma C y presenta una pureza superior a aproximadamente 90%. En una realización, la pureza de dicho ácido obeticólico cristalino Forma C se determina mediante HPLC y/o otros procedimientos analíticos conocidos de la técnica. En una realización, el ácido obeticólico cristalino es Forma C, o una sal, solvato o conjugado de aminoácidos farmacéuticamente aceptable del mismo. En una realización, el solvato es un hidrato. En una realización, la potencia es superior a aproximadamente 92%. En una realización, la potencia es superior a aproximadamente 94%. En una realización, la potencia es superior a aproximadamente 96%. En una realización, la potencia es superior a aproximadamente 98%. En una realización, la potencia es superior a aproximadamente 99%.

En una realización, el ácido obeticólico cristalino Forma C contiene un total inferior a aproximadamente 4% de una o más impurezas seleccionadas de ácido 6-etilursodesoxicólico, ácido 3a-hidroxi-6a-etil-7-queto-5p-colán-24-oico, ácido 6p-etilquenodesoxicólico, ácido 3a,7a-dihidroxi-6-etilidén-5p-colán-24-oico, ácido quenodesoxicólico y ácido 3a(3a,7a-dihidroxi-6a-etil-5p-colán-24-oyloxy)-7a-hidroxi-6a-etil-5p-colán-24-oico. En una realización, las impurezas totales son inferiores a aproximadamente 3,8%. En una realización, las impurezas totales son inferiores a aproximadamente 3,6%.

El Ejemplo 3 de la solicitud proporciona una caracterización completa de dicha forma cristalina de ácido obeticólico.

Se obtuvo la estructura de rayos X de cristales individuales del ácido obeticólico y se asignó la estereoquímica absoluta. Por ejemplo, se determinó la estructura de rayos X de los cristales individuales de ácido obeticólico cristalino Forma G a partir de un cristal obtenido de la recristalización del ácido obeticólico a partir de una solución de acetonitrilo tras el enfriamiento a 5°C a 0,1°C/min, seguido de la maduración a TA/50°C, en ciclos de 8 h durante 1 semana.

La estructura es ortorrómbica, grupo espacial P2-i212-i , y contiene una molécula de ácido obeticólico en la unidad asimétrica. R1 [I>2o(I)] final=3,22%. Se determinó la estereoquímica absoluta de la molécula tal como se muestra posteriormente, con un parámetro de Flack=-0,01 (13). La estructura no presentaba ningún desorden.

Se llevó a cabo un estudio de biodisponibilidad del ácido obeticólico Forma 1 (no cristalino) vs. ácido obeticólico cristalino Forma F (Ejemplo 7). Los resultados del estudio muestran que el estado físico del ácido obeticólico sólido puede desempeñar un papel en la biodisponibilidad de la molécula al administrarla por vía oral en un sujeto. La cinética plasmática tras la administración oral y la eficiencia de la absorción intestinal y la farmacocinética del ácido obeticólico sólido Forma 1 (no cristalina) y de la Forma F cristalina se evaluaron según métodos conocidos de la técnica. El Ejemplo 8 de la presente invención muestra los perfiles de concentración plasmática de ácido obeticólico vs tiempo, el tmax, la Cmaxy y AUC tras la administración de Forma 1 o Forma F de ácido obeticólico (ver las figuras 37 y 38). La Forma F cristalina presenta una biodisponibilidad más elevada que el ácido obeticólico Forma 1 (no cristalino). Los perfiles plasmáticos muestran que la Forma F resulta absorbida más eficientemente (AUC más elevada) e incluso la cinética es más uniforme, reflejando una distribución óptima del fármaco en el contenido intestinal.

La solubilidad en agua del ácido obeticólico Forma 1 (no cristalino) es ligeramente superior a la de la Forma F. La Forma F aparentemente es estable, ya que el análisis termogravimétrico (TGA) no mostró ninguna pérdida de peso en el intervalo de temperaturas estudiado.

Ácido obeticólico sustancialmente puro

El presente procedimiento de la solicitud proporciona ácido obeticólico sustancialmente puro.

Otros nombres para el ingrediente farmacéuticamente activo ácido obeticólico son INT-747, ácido 3a,7a-dihidroxi-6aetil-5p-colán-24-oico, ácido 6a-etil-quenodesoxicólico, 6-etil-CDCA, 6ECDCA y ácido colán-24-oico, 6-etil-3,7-dihidroxi-,(3a,5p,6a,7a)-.

La presente solicitud proporciona un procedimiento para la síntesis de ácido obeticólico Forma 1 altamente puro que resulta seguro y que produce ácido obeticólico a gran escala. En un aspecto, se produce ácido obeticólico Forma 1 en un procedimiento a escala comercial. La expresión “procedimiento a escala comercial” se refiere a un procedimiento que se lleva a cabo como un solo lote de por lo menos aproximadamente 100 gramos. En un aspecto, el procedimiento de la presente solicitud produce ácido obeticólico Forma 1 con un alto rendimiento (>80%) y con impurezas limitadas.

El término “pureza” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la cantidad de ácido obeticólico según la HPLC. La pureza se basa en la pureza “orgánica” del compuesto. La pureza no incluye una medida de cualquier cantidad de agua, solvente, metal, sal inorgánica, etc. En un aspecto, la pureza de ácido obeticólico se compara con la pureza del estándar de referencia mediante la comparación de la superficie bajo el pico. En otro aspecto, el estándar de pureza conocido es un estándar de referencia de ácido obeticólico. En un aspecto, el ácido obeticólico presenta una pureza superior a aproximadamente 96%. En un aspecto, el ácido obeticólico presenta una pureza superior a aproximadamente 98%. Por ejemplo, la pureza del ácido obeticólico Forma 1 es 96,0%, 96,1%, 96,2%, 96,3%, 96,4%, 96,5%, 96,6%, 96,7%, 96,8%, 96,9%, 97,0%, 97,1%, 97,2%, 97,3%, 97,4%, 97,5%, 97,6%, 97,7%, 97,8%, 97,9 %, 98,0%, 98,1%, 98,2%, 98,3%, 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99,0%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, o 99,9%. Por ejemplo, la pureza del ácido obeticólico Forma 1 es 98,0%, 98,1%, 98,2%, 98,3%, 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99,0%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% o 99,9%, Por ejemplo, la pureza del ácido obeticólico es 98,0%, 98,5%, 99,0%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, o 99,9%. Por ejemplo, la pureza del ácido obeticólico es 98,5%, 99,0% o 99,5%. En una realización, el ácido obeticólico es ácido obeticólico Forma 1.

En una realización, el ácido obeticólico presenta una pureza superior a aproximadamente 98%. En una realización, la pureza se determina mediante HPLC. En una realización, la pureza es superior a aproximadamente 98,5%. En una realización, la pureza es superior a aproximadamente 99,0%. En una realización, la pureza es superior a aproximadamente 99,5%. En una realización, el ácido obeticólico es ácido obeticólico Forma 1.

El término “potencia” tal como se utiliza en la presente memoria es una medida de la cantidad de ácido obeticólico basada en la de un estándar conocido (p.ej., criterios de aceptación de entre aproximadamente 95% y aproximadamente 102%). La potencia considera todas las posibles impurezas, incluyendo agua, solventes, e impurezas orgánicas e inorgánicas. En un aspecto, el estándar conocido es el ácido obeticólico. En un aspecto, el ácido obeticólico presenta una potencia superior a aproximadamente 96%. En un aspecto, el ácido obeticólico presenta una potencia superior a aproximadamente 98%. En un aspecto, el estándar conocido es el ácido obeticólico. En otro aspecto, la potencia es 100% menos las cantidades de agua, ceniza sulfatada, solventes residuales y otros contenidos de impurezas, tales como ácido 6-etilursodesoxicólico, ácido 3a-hidroxi-6a-etil-7-queto-5p-colán-24-oico, ácido 6petilquenodesoxicólico, ácido 3a,7a-dihidroxi-6-etilidén-5p-colán-24-oico, ácido quenodesoxicólico y ácido 3a(3a,7adihidroxi-6a-etil-5p-colán-24-oyloxy)-7a-hidroxi-6a-etil-5p-colán-24-oico. En otra realización, la potencia considera las impurezas debidas a agua, solvente, metales, sales inorgánicas y otras impurezas inorgánicas u orgánicas. Por ejemplo, la potencia del ácido obeticólico Forma 1 es 96,0%, 96,1%, 96,2%, 96,3%, 96,4%, 96,5%, 96,6%, 96,7%, 96,8%, 96,9%, 97,0%, 97,1%, 97,2%, 97,3%, 97,4%, 97,5%, 97,6%, 97,7%, 97,8%, 97,9 %, 98,0%, 98,1%, 98,2%, 98,3%, 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99,0%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, o 99,9%. En un aspecto, la potencia del ácido obeticólico Forma 1 es 98,0%, 98,1%, 98,2%, 98,3%, 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99,0%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, o 99,9%. Por ejemplo, la potencia del ácido obeticólico es 98,0%, 98,5%, 99,0%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, o 99,9%, Por ejemplo, la pureza del ácido obeticólico es 98,5%, 99,0% o 99,5%. En una realización, el ácido obeticólico es ácido obeticólico Forma 1.

En una realización, el ácido obeticólico contiene un total inferior a aproximadamente 2% de una o más impurezas seleccionadas de ácido 6-etilursodesoxicólico, ácido 3ahidroxi-6a-etil-7-queto-5p-colán-24-oico, ácido 6petilquenodesoxicólico, ácido 3a,7a-dihidroxi-6-etilidén-5p-colán-24-oico, ácido quenodesoxicólico y ácido 3a(3a,7adihidroxi-6a-etil-5p-colán-24-oiloxi)-7a-hidroxi-6a-etil-5p-colán-24-oico. En una realización, las impurezas totales son inferiores a aproximadamente 1,5%. En una realización, las impurezas totales son inferiores a aproximadamente 1,4%. En una realización, el ácido obeticólico es ácido obeticólico Forma 1.

En una realización, el ácido obeticólico contiene menos de aproximadamente 10% de agua, menos de aproximadamente 9% de agua, menos de aproximadamente 8% de agua, menos de aproximadamente 7% de agua, menos de aproximadamente 6% de agua, menos de aproximadamente 5% de agua, menos de aproximadamente 4% de agua, menos de aproximadamente 3% de agua, menos de aproximadamente 2% de agua, o menos de aproximadamente 1% de agua, En una realización, el ácido obeticólico contiene menos de aproximadamente 1,2% de agua. En una realización, el ácido obeticólico contiene menos de aproximadamente 1,0% de agua. En una realización, el ácido obeticólico es ácido obeticólico Forma 1.

En otra realización, el ácido obeticólico contiene no más de (NMD) de 0,15% de ácido 6-etilursodesoxicólico y ácido 3a,7a-dihidroxi-6-etilidén-5p-colán-24-oico. En otra realización, el ácido obeticólico contiene un total inferior a aproximadamente 0,07% de ácido 6-etilursodesoxicólico y ácido 3a,7a-dihidroxi-6-etilidén-5p-colán-24-oico. En una realización, el ácido obeticólico contiene un total inferior a aproximadamente 0,06% de ácido 6-etilursodesoxicólico y ácido 3a,7a-dihidroxi-6-etilidén-5p-colán-24-oico. En una realización, el ácido obeticólico contiene un total inferior a aproximadamente 0,05% de ácido 6-etilursodesoxicólico y ácido 3a,7a-dihidroxi-6-etilidén-5p-colán-24-oico. En una realización, el ácido obeticólico es ácido obeticólico Forma 1.

En una realización, el ácido obeticólico contiene no más de (NMD) 0,15% de ácido 3a-hidroxi-6a-etil-7-queto-5p-colán-24-oico. En una realización, el ácido obeticólico contiene menos de aproximadamente 0,07% de ácido 3a-hidroxi-6aetil-7-queto-5p-colán-24-oico. En una realización, el ácido obeticólico contiene menos de aproximadamente 0,06% de ácido 3a-hidroxi-6a-etil-7-queto-5p-colán-24-oico. En una realización, el ácido obeticólico contiene menos de aproximadamente 0,05% de ácido 3a-hidroxi-6a-etil-7-queto-5p-colán-24-oico. En una realización, el ácido obeticólico es ácido obeticólico Forma 1.

En una realización, el ácido obeticólico contiene no más de (NMD) 0,15% de ácido 6p-etilquenodesoxicólico. En una realización, el ácido obeticólico contiene menos de aproximadamente 0,07% de ácido 6p-etilquenodesoxicólico. En una realización, el ácido obeticólico contiene menos de aproximadamente 0,06% de ácido 6p-etilquenodesoxicólico. En una realización, el ácido obeticólico contiene menos de aproximadamente 0,05% de ácido 6petilquenodesoxicólico. En una realización, el ácido obeticólico es ácido obeticólico Forma 1.

En una realización, el ácido obeticólico contiene no más de (NMD) 3% de ácido quenodesoxicólico (CDCA). En una realización, el ácido obeticólico contiene menos de aproximadamente 1% de CDCA. En una realización, el ácido obeticólico contiene menos de aproximadamente 0,5% de CDCA. En una realización, el ácido obeticólico contiene menos de aproximadamente 0,3% de CDCA. En una realización, el ácido obeticólico contiene menos de aproximadamente 0,2% de CDCA. En una realización, el ácido obeticólico es ácido obeticólico Forma 1.

En una realización, el ácido obeticólico contiene no más de (NMD) 4% de CDCA y ácido 6p-etilursodesoxicólico. En una realización, el ácido obeticólico contiene no más de (NMD) 1,5% de ácido 3a(3a,7a-dihidroxi-6a-etil-5p-colán-24-oyloxy)-7a-hidroxi-6a-etil-5p-colán-24-oico. En una realización, el ácido obeticólico contiene no más de (NMD) 1% de ácido 3a(3a,7a-dihidroxi-6a-etil-5p-colán-24-oyloxy)-7a-hidroxi-6a-etil-5p-colán-24-oico. En una realización, el ácido obeticólico contiene no más de (NMD) 0,07% de ácido 3a(3a,7a-dihidroxi-6a-etil-5p-colán-24-oyloxy)-7a-hidroxi-6a-etil-5p-colán-24-oico. En una realización, el ácido obeticólico contiene no más de (NMD) 0,06% de ácido 3a(3a,7adihidroxi-6a-etil-5p-colán-24-oyloxy)-7a-hidroxi-6a-etil-5p-colán-24-oico. En una realización, el ácido obeticólico contiene no más de (NMD) 0,05% de ácido 3a(3a,7a-dihidroxi-6a-etil-5p-colán-24-oyloxy)-7a-hidroxi-6a-etil-5p-colán-24-oico. En una realización, el ácido obeticólico es ácido obeticólico Forma 1.

Formulación y administración oral

El ácido obeticólico está destinado a la administración oral. En una realización, la formulación está destinado a la administración oral para la prevención y el tratamiento de enfermedades y condiciones mediadas por FXR. En una realización, la formulación comprende ácido obeticólico Forma 1. En otra realización, la formulación comprende ácido obeticólico sustancialmente puro.

Las formulaciones adecuadas para la administración oral pueden proporcionarse en forma de unidades discretas, tales como tabletas, cápsulas, sellos (cápsula de oblea utilizada por farmacéuticos para presentar un fármaco), pastillas, en las que cada una contiene una cantidad predeterminada de ácido obeticólico; en forma de polvos o gránulos; en forma de soluciones o suspensiones en líquidos acuosos o no acuosos, o en forma de emulsiones de aceite-en-agua o de agua-en-aceite.

Las formulaciones de la invención pueden prepararse mediante cualquier método adecuado, típicamente mediante la mezcla uniforme e íntima de ácido obeticólico con líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos, en las proporciones requeridas seguido de, en caso necesario, el conformado de la mezcla resultante en la forma deseada. Por ejemplo, puede prepararse una tableta mediante la compresión de una mezcla íntima que comprende unos polvos o gránulos de ácido obeticólico y uno o más ingredientes opcionales, tales como ligante, lubricante, diluyente inerte o agente dispersante activo en superficie, o mediante moldeo de una mezcla íntima de ingrediente activo en polvo y diluyente líquido inerte.

Por ejemplo, puede administrarse una o más tabletas para obtener un nivel de dosis diana basado en el peso del sujeto, p.ej., un ser humano de entre aproximadamente 30 kg y aproximadamente 70 kg.

En una realización, el sujeto es un niño y la formulación es utiliza para tratar la atresia biliar. La atresia biliar, también conocida como “ductopenia extrahepática” y “colangiopatía obliterante progresiva” es una enfermedad congénita o adquirida del hígado y una de las formas principales de rechazo crónico de un aloinjerto hepático trasplantado. En la forma congénita, el conducto biliar común entre el hígado y el intestino delgado se encuentra bloqueado o ausente. El tipo adquirido con mayor frecuencia se observa en el contenido de una enfermedad autoinmune, y es una de las formas principales de rechazo crónico de un aloinjerto hepático trasplantado.

Los bebés y niños con atresia biliar presentan colestasis progresiva con todas las características concomitantes habituales: ictericia, prurito, mala absorción con retardo del crecimiento, deficiencias en vitaminas liposolubles, hiperlipidemia y finalmente cirrosis con hipertensión portal. En caso de que no se identifique, la condición conduce a insuficiencia hepática pero no ictericia nuclear, ya que el hígado todavía es capaz de conjugar la bilirrubina y la bilirrubina conjugado no puede cruzar la barrera hematoencefálica. La causa de la condición es desconocida. Los únicos tratamientos eficaces son determinadas cirugías, tales como el procedimiento de Kasai, o el trasplante de hígado.

En una realización, el niño humano recibió un procedimiento de Kasai, en el que el procedimiento de Kasai proporciona eficazmente un conducto biliar funcional al nacer sin un conducto biliar o con uno completamente bloqueado en el momento del nacimiento.

Además de los ingredientes específicamente indicados anteriormente, las formulaciones orales de la presente invención pueden incluir otros agentes conocidos por el experto farmacéutico, considerando el tipo de formulación en cuestión. Las formulaciones orales adecuadas pueden incluir agentes saborizantes.

En una realización, la formulación farmacéutica es de ácido obeticólico producido mediante un procedimiento de la invención (ácido obeticólico Forma 1). En otra realización, la formulación se administra por vía oral.

En una realización, la formulación se presenta en forma de tableta. En otra realización, la formulación comprende ácido obeticólico y uno o más componentes seleccionados de celulosa microcristalina, glicolato sódico de almidón, estearato de magnesio, material de recubrimiento o dióxido de silicio coloidal. En una realización, el material de recubrimiento es un material de recubrimiento Opadry®.

En otra realización, la formulación comprende entre aproximadamente 0,1 mg y aproximadamente 1500 mg de ácido obeticólico en cada tableta. En otra realización, la formulación comprende entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 100 mg. En otra realización, la formulación comprende entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 50 mg. En otra realización, la formulación comprende entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 30 mg. En otra realización, la formulación comprende entre aproximadamente 4 mg y aproximadamente 26 mg. En otra realización, la formulación comprende entre aproximadamente 5 mg y aproximadamente 25 mg. En una realización, la formulación comprende entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 2 mg. En una realización, la formulación comprende entre aproximadamente 1,2 mg y aproximadamente 1,8 mg. En una realización, la formulación comprende aproximadamente 1,5 mg.

En una realización, la formulación comprende entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 25 mg de ácido obeticólico en cada tableta. En una realización, la formulación comprende aproximadamente 1 mg de ácido obeticólico, entre aproximadamente 180 y aproximadamente 190 mg de celulosa microcristalina, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 15 mg de glicolato sódico de almidón, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 3 mg de estearato de magnesio y entre aproximadamente 5 mg y aproximadamente 10 mg de material de recubrimiento. En una realización, el material de recubrimiento es un material de recubrimiento Opadry®.

En una realización, la formulación comprende entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 25 mg de ácido obeticólico en cada tableta. En una realización, la formulación comprende aproximadamente 1 mg de ácido obeticólico, aproximadamente 185,0 mg de celulosa microcristalina, aproximadamente 12,0 mg de glicolato sódico de almidón, aproximadamente 2,0 mg de estearato de magnesio y aproximadamente 8,0 mg de material de recubrimiento. En una realización, el material de recubrimiento es un material de recubrimiento Opadry®.

En una realización, la formulación comprende entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 25 mg de ácido obeticólico en cada tableta. En una realización, la formulación comprende aproximadamente 5 mg de ácido obeticólico, entre aproximadamente 175 y aproximadamente 190 mg de celulosa microcristalina, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 15 mg de glicolato sódico de almidón, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 3 mg de estearato de magnesio y entre aproximadamente 5 mg y aproximadamente 10 mg de material de recubrimiento. En una realización, el material de recubrimiento es un material de recubrimiento Opadry®.

En una realización, la formulación comprende entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 25 mg de ácido obeticólico en cada tableta. En una realización, la formulación comprende aproximadamente 5 mg de ácido obeticólico, aproximadamente 181,0 mg de celulosa microcristalina, aproximadamente 12,0 mg de glicolato sódico de almidón, aproximadamente 2,0 mg de estearato de magnesio y aproximadamente 8,0 mg de material de recubrimiento. En una realización, el material de recubrimiento es un material de recubrimiento Opadry®.

En una realización, la formulación comprende entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 25 mg de ácido obeticólico en cada tableta. En una realización, la formulación comprende aproximadamente 10 mg de ácido obeticólico, entre aproximadamente 170 y aproximadamente 180 mg de celulosa microcristalina, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 15 mg de glicolato sódico de almidón, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 3 mg de estearato de magnesio y entre aproximadamente 5 mg y aproximadamente 10 mg de material de recubrimiento. En una realización, el material de recubrimiento es un material de recubrimiento Opadry®.

En una realización, la formulación comprende entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 25 mg de ácido obeticólico en cada tableta. En una realización, la formulación comprende aproximadamente 10 mg de ácido obeticólico, aproximadamente 176,0 mg de celulosa microcristalina, aproximadamente 12,0 mg de glicolato sódico de almidón, aproximadamente 2,0 mg de estearato de magnesio y aproximadamente 8,0 mg de material de recubrimiento. En una realización, el material de recubrimiento es un material de recubrimiento Opadry®.

En una realización, la formulación comprende entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 25 mg de ácido obeticólico en cada tableta. En una realización, la formulación comprende aproximadamente 25 mg de ácido obeticólico, entre aproximadamente 150 y aproximadamente 160 mg de celulosa microcristalina, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 15 mg de glicolato sódico de almidón, entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 3 mg de estearato de magnesio, entre aproximadamente 5 mg y aproximadamente 10 mg de material de recubrimiento, y entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 10 mg de dióxido de silicio coloidal. En una realización, el material de recubrimiento es un material de recubrimiento Opadry®.

En una realización, la formulación comprende entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 25 mg de ácido obeticólico en cada tableta. En una realización, la formulación comprende aproximadamente 25 mg de ácido obeticólico, aproximadamente 157,0 mg de celulosa microcristalina, aproximadamente 12,0 mg de glicolato sódico de almidón, aproximadamente 2,0 mg de estearato de magnesio, aproximadamente 8,0 mg de material de recubrimiento y aproximadamente 4,0 mg de dióxido de silicio coloidal. En una realización, el material de recubrimiento es un material de recubrimiento Opadry®.

Todos los porcentajes y proporcionados utilizados en la presente memoria, a menos que se indique lo contrario, son en peso. La impureza dimérica en porcentaje es en porcentaje de superficie, típicamente cuantificado mediante HPLC analítica.

En toda la descripción, en donde se indican que las composiciones presentan, incluyen o comprenden componentes específicos, se encuentra contemplado que las composiciones también consistan esencialmente, o consistan en, los componentes indicados. De manera similar, en donde se indica que los métodos o procedimientos incluyen o comprenden etapas específicas de procedimiento, los procedimientos también consisten esencialmente, o consisten en, las etapas de procesamiento indicadas. Además, debe entenderse que el orden de las etapas o el orden para llevar a cabo determinadas acciones es irrelevante, con la condición de que la invención siga siendo operable. Además, pueden llevarse a cabo simultáneamente dos o más etapas o acciones.

En una realización, la tableta comprende amarillo Opadry®. En otra realización, la tableta comprende blanco Opadry®. En otra realización, la tableta comprende verde Opadry®.

Composiciones farmacéuticas

El ácido obeticólico, incluyendo el ácido obeticólico Forma 1, formas sustancialmente puras de ácido obeticólico y formas cristalinas de ácido obeticólico, o una sal, o solvato farmacéuticamente aceptable o conjugado de aminoácidos del mismo resulta útil con una diversidad de fines medicinales. El ácido obeticólico puede utilizarse en métodos para la prevención o el tratamiento de enfermedades y condiciones mediadas por FXR. En una realización, la enfermedad o condición se selecciona de atresia biliar, enfermedad hepática colestática, enfermedad hepática crónica, esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), infección de hepatitis C, enfermedad hepática alcohólica, cirrosis biliar primaria (CBP), daño hepático debido a fibrosis progresiva, fibrosis hepática y enfermedades cardiovasculares, incluyendo ateroesclerosis, arterioesclerosis, hipercolesterolemia e hiperlipidemia. En una realización, puede utilizarse ácido obeticólico Forma 1 puede utilizarse en métodos para reducir los triglicéridos. En una realización, puede utilizarse ácido obeticólico cristalino en métodos para reducir el nivel de triglicéridos. El ácido obeticólico Forma 1 o el ácido obeticólico cristalino puede incrementar el HDL. Entre otros efectos del ácido obeticólico Forma 1 o el ácido obeticólico cristalino se incluyen la reducción del nivel de fosfatasa alcalina (FAL), la bilirrubina, ALT, AST y GGT.

Una realización se refiere a una composición farmacéutica que comprende ácido obeticólico y un portador farmacéuticamente aceptable en el que el ácido obeticólico se produce mediante un procedimiento de la invención, p.ej., ácido obeticólico Forma 1. En una realización, la composición farmacéutica comprende ácido obeticólico sustancialmente puro y un portador farmacéuticamente aceptable. En otra realización, la composición farmacéutica comprende ácido obeticólico cristalino y un portador farmacéuticamente aceptable. En otra realización, el ácido obeticólico cristalino es la Forma C.

Una realización se refiere a un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o condición relacionada con FXR en un sujeto, que comprende administrar una cantidad eficaz de ácido obeticólico Forma 1 producida mediante un procedimiento de la invención o una composición farmacéutica del mismo. Otra realización se refiere a un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o condición relacionada con FXR en un sujeto, que comprende administrar una cantidad eficaz de ácido obeticólico sustancialmente puro producida mediante un procedimiento de la invención o una composición farmacéutica del mismo. Una realización se refiere a un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o condición relacionada con FXR en un sujeto, que comprende administrar una cantidad eficaz de ácido obeticólico cristalino o una composición farmacéutica del mismo. En otra realización, el ácido obeticólico cristalino es la Forma C. En una realización, el ácido obeticólico cristalino es la Forma A. En una realización, el ácido obeticólico cristalino es la Forma C. En una realización, el ácido obeticólico cristalino es la Forma D. En una realización, el ácido obeticólico cristalino es la forma F. En una realización, el ácido obeticólico cristalino es la Forma G.

En otra realización, la enfermedad o condición es una enfermedad cardiovascular o enfermedad hepática colestática y para la reducción del nivel de triglicéridos. En otra realización, la enfermedad cardiovascular es ateroesclerosis o hipercolesterolemia. En otra realización, el sujeto es un mamífero. En otra realización, el mamífero es un ser humano.

En otra realización, el compuesto o composición farmacéutica se administra por vía oral, parenteral o tópica. En otra realización, el compuesto o composición farmacéutica se administra por vía oral.

Una realización se refiere a un método para inhibir la fibrosis en un sujeto que sufre de una condición colestática, en el que el método comprende la etapa de administrar en el sujeto una cantidad eficaz de ácido obeticólico o una composición farmacéutica del mismo, en el que el ácido obeticólico se produce mediante el procedimiento de la invención. Una realización se refiere a un método para inhibir la fibrosis en un sujeto que sufre de una condición colestática, en el que el método comprende la etapa de administrar en el sujeto una cantidad eficaz de ácido obeticólico o una composición farmacéutica del mismo, en el que el ácido obeticólico se produce mediante el procedimiento de la invención. En una realización, la fibrosis que debe inhibirse ocurre en un órgano en el que se expresa FXR.

En una realización, la condición colestática se define como presentando niveles séricos anormalmente elevados de fosfatasa alcalina, 7-glutamil-transpeptidasa (GGT) y 5'-nucleotidasa. En otra realización, la condición colestática se define adicionalmente como presentándose con por lo menos un síntoma clínico. En otra realización, el síntoma es picor (prurito). En otra realización, la fibrosis se selecciona del grupo que consiste en fibrosis hepática, fibrosis renal y fibrosis intestinal. En otra realización, la condición colestática se selecciona del grupo que consiste en cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, colestasis inducida farmacológicamente, colestasis hereditaria y colestasis intrahepática del embarazo. En otra realización, el sujeto no sufre de una condición colestática asociada a una enfermedad o condición seleccionado del grupo que consiste en cáncer hepático y biliar primario, cáncer metastásico, sepsis, nutrición parenteral total crónica, fibrosis quística y enfermedad hepática granulomatosa.

En otra realización, el sujeto presenta fibrosis hepática asociada a una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en hepatitis B, hepatitis C, enfermedades hepáticas parasitarias, infecciones bacterianas, víricas y fúngicas post-trasplante, enfermedad hepática alcohólica (EHA), enfermedad hepática grasa no alcohólica (EHGNA), esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), enfermedades hepáticas inducidas por metotrexato, isoniazida, oxifenistatina, metildopa, clorpromazina, tolbutamida o amiodarona; hepatitis autoinmune, sarcoidosis, enfermedad de Wilson, hemocromatosis, enfermedad de Gaucher, enfermedades de almacenamiento del glucógeno de tipos III, IV, VI, IX y X, deficiencia antitripsina a - síndrome de Zellweger, tirosinemia, fructosemia, galactosemia, desequilibrio vascular asociado al síndrome de Budd-Chiari, enfermedad veno-oclusiva o trombosis de la vena portal, y fibrosis hepática congénita.

En otra realización, el sujeto presenta fibrosis intestinal asociada a una enfermedad seleccionado del grupo que consiste en enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colitis post-radiación y colitis microscópica.

En otra realización, el sujeto presenta fibrosis renal asociada a una enfermedad seleccionado del grupo que consiste en nefropatía diabética, nefroesclerosis hipertensiva, glomerulonefritis crónica, glomerulopatía del trasplante crónica, nefritis intersticial crónica y enfermedad renal poliquística.

Definiciones

Por comodidad, se recogen en la presente memoria determinados términos utilizados en la especificación, ejemplos y reivindicaciones adjuntas.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “ácido obeticólico” u “OCA” se refiere a un compuesto que presenta la estructura química:

entre otros nombres químicos para el ácido obeticólico se incluyen: ácido 3a,7a-dihidroxi-6a-etil-5p-colán-24-oico, ácido 6a-etil-quenodesoxicólico, 6-etil-CDCA, 6ECDCA, ácido colán-24-oico, 6-etil-3,7-dihidroxi-,(3a,5p, 6a,7a)- e INT-747. El número de registro CAS para el ácido obeticólico es 459789-99-2. Dicho término se refiere a todas las formas del ácido obeticólico, p.ej., no cristalino, cristalino y sustancialmente puro.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “ácido obeticólico cristalino” se refiere a cualquier forma cristalina de un compuesto que presenta la estructura química:

Ácido obeticólico cristalino se refiere a que el compuesto cristaliza en una disposición de empaquetamiento cristalino específica en las tres dimensiones espaciales o el compuesto presenta planos de cara externa. La forma cristalina del ácido obeticólico (o una sal, conjugado de aminoácidos o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo) puede cristalizar en diferentes disposiciones de empaquetamiento cristalino, la totalidad de los cuales presenta la misma composición elemental del ácido obeticólico. Las diferentes formas cristalinas habitualmente presentan diferentes patrones de difracción de rayos X, espectros de infrarrojos, puntos de fusión, densidad, dureza, forma del cristal, propiedades ópticas y eléctricas, estabilidad y solubilidad. El solvente de recristalización, velocidad de cristalización, temperatura de almacenamiento y otros factores pueden causar que domine una forma cristalina. Los cristales del ácido obeticólico pueden prepararse mediante cristalización bajo condiciones diferentes, p.ej., diferentes solventes, temperaturas, etc.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “ácido obeticólico cristalino Forma C” se refiere a una forma cristalina del ácido obeticólico con un patrón de difracción de rayos X que es sustancialmente similar al indicado en la figura 5, p.ej., la forma cristalina según se caracteriza en el Ejemplo 3.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “ácido obeticólico sustancialmente puro” se refiere a ácido obeticólico que presenta una potencia superior a aproximadamente 95%. La potencia del ácido obeticólico considera las impurezas, incluyendo, p.ej., agua, solventes y otras impurezas orgánicas e inorgánicas que se encuentran en una muestra de ácido obeticólico. En otra realización, el estándar conocido para la potencia es 100% de ácido obeticólico, y la potencia se determina restando los porcentajes de impurezas, tales como solvente, agua y otras impurezas orgánicas e inorgánicas, respecto del 100% del estándar conocido. En un aspecto, entre las impurezas inorgánicas se incluyen, p.ej., sales inorgánicas y ceniza sulfatada. En un aspecto, entre las impurezas orgánicas se incluyen ácido 6-etilursodesoxicólico, ácido 3a-hidroxi-6a-etil-7-queto-5p-colán-24-oico, ácido 6p-etilquenodesoxicólico, ácido 3a,7adihidroxi-6-etilidén-5p-colán-24-oico, ácido quenodesoxicólico y ácido 3a(3a,7a-dihidroxi-6a-etil-5p-colán-24-oyloxy)-7a-hidroxi-6a-etil-5p-colán-24-oico. Las cantidades de las impurezas pueden determinarse mediante procedimientos conocidos de la técnica, p.ej., HPLC, RMN, o métodos de la Farmacopea US o la Farmacopea europea, o una combinación de dos o más de dichos métodos.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “pureza” se refiere a un análisis química de un compuesto obtenido de, p.ej., la HPLC. En una realización, la pureza de un compuesto se compara con la pureza del estándar de referencia, p.ej., ácido obeticólico, mediante la superficie bajo su pico respectivo para las comparaciones. En una realización, la pureza considera las impurezas orgánicas en una muestra.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “mezcla de reacción” se refiere a una mezcla de una o más sustancias combinadas entre sí. En una realización, la mezcla o la combinación de las sustancias causa una transformación o cambio químico en una o más de las sustancias originales.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “ácido obeticólico Forma 1” se refiere a ácido obeticólico no cristalino. En una realización, dicha forma de ácido obeticólico se produce mediante un ácido obeticólico cristalino como intermediario sintético. Por ejemplo, dicha forma de ácido obeticólico se produce mediante el procedimiento de la solicitud mediante ácido obeticólico cristalino Forma C como el intermediario sintético. En una realización, el ácido obeticólico Forma 1 es la forma que se utiliza como el ingrediente farmacéuticamente activo. Ver el Ejemplo 5 para más información.

El término “tratando” incluye cualquier efecto, p.ej., disminuir, reducir, modular o eliminar, que resulta en la mejora de la condición, enfermedad, trastorno, etc. “Tratando” o “tratamiento” de un estado de enfermedad incluye: inhibir el estado de enfermedad, es decir, detener el desarrollo del estado de enfermedad o sus síntomas clínicos, o aliviar el estado de enfermedad, es decir, causar una regresión temporal o permanente del estado de enfermedad o de sus síntomas clínicos.

El término “prevenir” el estado de enfermedad incluye causar que los síntomas clínicos del estado de enfermedad no se desarrollen en un sujeto que puede encontrarse expuesto o predispuesto al estado de enfermedad, pero que todavía no experimenta o manifiesta síntomas del estado de enfermedad.

La expresión “estado de enfermedad” se refiere a cualquier enfermedad, trastorno, condición, síntoma o indicación. La expresión “cantidad eficaz” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la cantidad de ácido obeticólico (p.ej., un ligando activador de FXR) que produce un efecto terapéutico agudo o crónico con la administración de dosis apropiada. El efecto incluye la prevención, corrección, inhibición o reversión de los síntomas, signos y patología subyacente de una enfermedad/condición (p.ej., fibrosis hepática, renal o intestinal) y complicaciones relacionadas en cualquier medida detectable.

La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de ácido obeticólico que, administrada en un mamífero para tratar una enfermedad, resulta suficiente para llevar a cabo dicho tratamiento para la enfermedad. La “cantidad terapéuticamente eficaz” variará dependiendo del ácido obeticólico, las enfermedades y su gravedad y la edad, peso, etc. del mamífero que debe tratarse.

Puede formularse una cantidad terapéuticamente eficaz de ácido obeticólico con un portador farmacéuticamente aceptable para la administración en un ser humano o en un animal. De acuerdo con lo anterior, puede administrarses ácido obeticólico o sus formulaciones, por ejemplo por vías oral, parenteral o tópica, para proporcionar una cantidad eficaz del compuesto. En realizaciones alternativas, el ácido obeticólico preparado de acuerdo con la presente invención puede utilizarse para recubrir o impregnar un dispositivo médico, p.ej., una endoprótesis.

La expresión "efecto farmacológico" tal como se utiliza en la presente memoria comprende efectos producidos en el sujeto que consiguen el propósito deseado de una terapia. En una realización, un efecto farmacológico se refiere a que indicaciones primarias del sujeto bajo tratamiento se han prevenido, aliviado o reducido. Por ejemplo, un efecto farmacológico sería uno que resultase en la prevención, alivio o reducción de indicaciones primarias en un sujeto tratado. En otra realización, un efecto farmacológico se refiere a que trastornos o síntomas de las indicaciones primarias del sujeto bajo tratamiento se han prevenido, aliviado o reducido. Por ejemplo, un efecto farmacológico sería uno que resultase en la prevención o reducción de indicaciones primarias en un sujeto tratado.

La invención comprende además ácido obeticólico marcado isotópicamente o sales, solvato o conjugados de aminoácidos farmacéuticamente aceptables del mismo, que son idénticos a los indicados en las fórmulas de la invención y posteriormente, excepto por el hecho de que uno o más átomos han sido sustituidos por un átomo que presenta una masa atómica o un número másico diferente de la masa atómica o número másico habitualmente observado en la naturaleza. Entre los ejemplos de isótopos que pueden incorporarse en ácido obeticólico, o sales, solvato o conjugados de aminoácidos farmacéuticamente aceptables del mismo se incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, flúor, tal como 3H, 11C, 14C y 18F.

El ácido obeticólico, o sales, solvatos o conjugados de aminoácidos farmacéuticamente aceptables del mismo que contienen los isótopos anteriormente indicados y/o otros isótopos de otros átomos se encuentran comprendidos dentro del alcance de la presente invención. El ácido obeticólico marcado isotópicamente, o sales, solvatos o conjugados de aminoácidos farmacéuticamente aceptables del mismo, por ejemplo aquellos en los que se han incorporado isótopos radioactivos, tales como 3H, 14C, resultan útiles en ensayos de distribución en tejidos de fármacos y/o sustratos. Los isótopos tritiados, es decir, 3H, y carbono-14, es decir 14C, resultan particularmente preferentes por su facilidad de preparación y detectabilidad. Además, la sustitución con isótopos más pesados, tales como el deuterio, es decir 2H, puede proporcionar determinadas ventajas terapéuticas que resultan de la mayor estabilidad metabólica, por ejemplo la semivida in vivo incrementada o requisitos de dosis reducidos y, por lo tanto, puede resultar preferente en algunas circunstancias, ácido obeticólico marcado isotópicamente, o sales, solvatos o conjugados de aminoácidos farmacéuticamente aceptables del mismo pueden prepararse generalmente, llevando a cabo los procedimientos dados a conocer en los Esquemas y/o en los Ejemplos de la invención, mediante la sustitución de un reactivo marcado isotópicamente disponible fácilmente por un reactivo no marcado isotópicamente. En una realización, el ácido obeticólico, o sales, solvatos o conjugados de aminoácidos farmacéuticamente aceptables no se marcan isotópicamente. En una realización, el ácido obeticólico deuterado resulta útil para ensayos bioanalíticos. En otra realización, el ácido obeticólico, o sales, solvatos o conjugados de aminoácidos farmacéuticamente aceptables del mismo se marcan radioactivamente.

La expresión “ isómeros geométricos” se refiere a los diastereómeros que deben su existencia a una rotación impedida en torno a dobles enlaces. Dichas configuraciones se diferencian en sus nombres por los prefijos cis y trans, o Z y E, que indican que los grupos se encuentran el mismo lado o en lados opuestos del doble enlace en la molécula según las reglas de Cahn-Ingold-Prelog.

El término “solvatos” se refiere a formas de adición de solvente que contienen cantidades estequiométricas o no estequiométricas de solvente. El ácido obeticólico presenta una tendencia a atrapar una proporción molar fija de moléculas de solvente en el estado sólido cristalino, formando de esta manera un solvato. En el caso de que el solvente sea agua, el solvato formado es un hidrato; en el caso de que el solvente sea alcohol, el solvato formado es un alcoholato. Los hidratos se forman mediante la combinación de una o más moléculas de agua con una de las sustancias en las que el agua conserva su estado molecular de H2O, siendo esta combinación capaz de formar uno o más hidratos. Adicionalmente, los compuestos de la presente invención, por ejemplo, las sales de los compuestos, pueden existir en forma hidratada o no hidratada (anhidra) o como solvatos con otras moléculas de solvente. Entre los ejemplos no limitativos de hidratos se incluyen monohidratos, dihidratos, etc. Entre los ejemplos no limitativos de solvatos se incluyen solvatos de etanol, solvatos de acetona, etc.

El término “tautómeros” se refiere a compuestos cuyas estructuras difieren marcadamente en la disposición de los átomos, aunque existen en un equilibrio fácil y rápido. Debe entenderse que el ácido obeticólico puede ilustrarse como diferentes tautómeros. También debe entenderse que, en el caso de que el ácido obeticólico y los intermediarios sintéticos de la invención presentan formas tautoméricas, todas las formas tautoméricas se pretende que se encuentren comprendidas dentro del alcance de la invención, y la denominación de ácido obeticólico no excluye ninguna forma tautomérica. El ácido obeticólico y los intermediarios sintéticos de la invención pueden existir en varias formas tautoméricas, incluyendo la ceto-enol. Por ejemplo, en el tautomerismo ceto-enol, se produce un desplazamiento simultáneo de electrones y un átomo de hidrógeno. Los tautómeros existen como mezclas de un grupo tautomérico en solución. En forma sólida, habitualmente predomina un tautómero. Aunque puede describirse un tautómero, la presente invención incluye todos los tautómeros de los presentes compuestos.

Una “composición farmacéutica” es una formulación que contiene ácido obeticólico en una forma adecuada para la administración en un sujeto. En una realización, la composición farmacéutica se encuentra en masa o en forma de dosis unitaria. Puede resultar ventajoso formular composiciones en forma de dosis unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosis. La forma de dosis unitaria tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto bajo tratamiento; cada unidad que contiene una cantidad predeterminada de reactivo activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosis unitaria de la invención está dictada y es directamente dependiente de las características únicas del reactivo activo y del efecto terapéutico particular que debe conseguirse, y de las limitaciones inherentes al arte de producción de compuestos, tal como un agente activo para el tratamiento de individuos.

La forma de dosis unitaria es cualquiera de entre una diversidad de formas, incluyendo, por ejemplo, una cápsula, una bolsa IV, una tableta, una sola bomba o un inhalador de aerosol, o un vial. La cantidad de ácido obeticólico (p.ej., una formulación de ácido obeticólico, o una sal, solvato o conjugado de aminoácidos farmacéuticamente aceptable del mismo) en una dosis unitaria de composición es una cantidad eficaz y se modifica según el tratamiento particular implicado. El experto en la materia apreciará que en ocasiones resulta necesario realizar variaciones rutinarias de la dosis según la edad y condición del paciente. La dosis también dependerá de la vía de administración. Se encuentra contemplada una diversidad de vías, incluyendo las vías oral, pulmonar, rectal, parenteral, transdérmica, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, por inhalación, bucal, sublingual, intrapleural, intratecal, intranasal y similares. Entre las formas de dosis para la administración tópica o transdérmica de un compuesto de la presente invención se incluyen polvos, sprays, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. En una realización, el ácido obeticólico se mezcla bajo condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable, y con cualesquiera conservantes, tampones o propelentes que resulten necesarios.

La expresión “dosis flash” se refiere a formulaciones de ácido obeticólico que son formas de dosis de dispersión rápida.

La expresión “ liberación inmediata” se define como la liberación de ácido obeticólico a partir de una forma de dosis en un periodo de tiempo relativamente breve, generalmente de hasta aproximadamente 60 minutos. La expresión “ liberación modificada” se define para incluir liberación retardada, liberación prolongada y liberación pulsada. La expresión “ liberación pulsada” se define como una serie de liberaciones de fármaco a partir de una forma de dosis. La expresión “ liberación sostenida” o “ liberación prolongada” se define como una liberación continua de ácido obeticólico a partir de una forma de dosis durante un periodo prolongado.

Un “sujeto” incluye mamíferos, p.ej., seres humanos, animales de compañía (p.ej., perros, gatos, aves y similares), animales de granja (p.ej., vacas, ovejas, cerdos, caballos, aves y similares) y animales de laboratorio (p.ej., ratas, ratones, cobayas, aves y similares). En una realización, el sujeto es un ser humano. En una realización, el sujeto es un niño humano (p.ej., de entre aproximadamente 30 kg y aproximadamente 70 kg). En una realización, el niño humano ha recibido un procedimiento de Kasai, en el que el procedimiento de Kasai proporciona eficazmente un conducto biliar funcional debido a que ha nacido sin un conducto biliar o con uno completamente bloqueado en el momento del nacimiento.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “farmacéuticamente aceptable” se refiere a los compuestos, materiales, composiciones, portadores y/o formas de dosis que resultan, dentro del alcance del criterio médico razonable, adecuados para la utilización en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otros problemas o complicaciones, en la medida de una proporción beneficio/riesgo razonable.

La expresión “excipiente farmacéuticamente aceptable” se refiere a un excipiente que resulta útil para preparar una composición farmacéutica que es generalmente segura, no tóxica y que no resulta indeseable biológicamente o de otro modo e incluye un excipiente que resulta aceptable para el uso veterinario, así como farmacéutico humano. Un “excipiente farmacéuticamente aceptable” tal como se utiliza en la especificación y reivindicaciones incluye tanto uno como más de uno de tales excipientes.

Aunque resulta posible administrar ácido obeticólico directamente sin ninguna formulación, el ácido obeticólico habitualmente se administra en forma de formulaciones farmacéuticas que comprenden un excipiente farmacéuticamente aceptable y ácido obeticólico. Dichas formulaciones pueden administrarse mediante una diversidad de vías, incluyendo las vías oral, bucal, rectal, intranasal, transdérmica, subcutánea, intravenosa, intramuscular e intranasal. La formulación oral de ácido obeticólico se describe adicionalmente en la presente memoria en la sección titulada “Formulación y administración oral”.

En una realización, el ácido obeticólico puede administrarse por vía transdérmica. A fin de administrar por vía transdérmica, se requiere un dispositivo de administración transdérmica (“parche”). Dichos parches transdérmicos pueden utilizarse para proporcionar una infusión continua o discontinua de un compuesto de la presente invención en cantidades controladas. La construcción y utilización de parches transdérmicos para la administración de agentes farmacéuticos es bien conocida de la técnica. Ver, por ejemplo, la patente US n° 5.023.252. Dichos parches pueden construirse para la administración continua, pulsátil o a demanda de los agentes farmacéuticos.

En una realización se proporciona una formulación farmacéutica que comprende por lo menos ácido obeticólico tal como se ha indicado anteriormente en una formulación adaptada para la administración bucal y/o sublingual, o nasal. La presente realización proporciona la administración de ácido obeticólico de una manera que evita complicaciones gástricas, tales como el metabolismo de primer paso por el sistema gástrico y/o por el hígado. Dicha vía de administración también puede reducir los tiempos de absorción, proporcionando una aparición más rápida del beneficio terapéutico. Los compuestos de la presente invención pueden proporcionar perfiles de solubilidad particularmente favorables para facilitar las formulaciones sublinguales/bucales. Dichas formulaciones típicamente requieren concentraciones relativamente elevadas de ingredientes activos para administrar cantidades suficientes de ingredientes activos en la limitada superficie de la mucosa sublingual/bucal durante los periodos relativamente cortos en los que la formulación se encuentra en contacto con la superficie, para permitir la absorción del ingrediente activo. De esta manera, la muy elevada actividad del ácido obeticólico, en combinación con su elevada solubilidad, facilita su idoneidad para la formulación sublingual/bucal.

El ácido obeticólico preferentemente se formula en una forma de dosis unitaria, en la que cada dosis contiene entre aproximadamente 0,1 mg y aproximadamente 1500 mg. En otra realización, la formulación comprende entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 100 mg. En otra realización, la formulación comprende entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 50 mg. En otra realización, la formulación comprende entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 30 mg. En otra realización, la formulación comprende entre aproximadamente 4 mg y aproximadamente 26 mg. En otra realización, la formulación comprende entre aproximadamente 5 mg y aproximadamente 25 mg. En otra realización, la formulación comprende entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 2 mg. En otra realización, la formulación comprende entre aproximadamente 1,2 mg y aproximadamente 1,8 mg. En otra realización, la formulación comprende entre aproximadamente 1,3 mg y aproximadamente 1,7 mg. En una realización, la formulación comprende aproximadamente 1,5 mg. La expresión “forma de dosis unitaria” se refiere a unidades físicamente discretas que resultan adecuadas como dosis unitarias para sujetos humanos y otros mamíferos, en las que cada unidad contiene una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado, asociado con un excipiente farmacéutico adecuado tal como se ha indicado anteriormente.

El ácido obeticólico resulta generalmente eficaz en un amplio intervalo de dosis. Por ejemplo, las dosis diarias se encuentran comprendidas dentro del intervalo de entre aproximadamente 0,0001 y aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal. En el tratamiento de los adultos humanos, el intervalo de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 15 mg/kg/día, en una única dosis o en dosis divididas, resulta especialmente preferente. En una realización, la formulación comprende entre aproximadamente 0,1 mg y aproximadamente 1500 mg. En otra formulación, la formulación comprende entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 100 mg. En otra formulación, la formulación comprende entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 30 mg. En otra formulación, la formulación comprende entre aproximadamente 4 mg y aproximadamente 26 mg. En otra formulación, la formulación comprende entre aproximadamente 5 mg y aproximadamente 25 mg. En otra formulación, la formulación comprende entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 2 mg. En otra formulación, la formulación comprende entre aproximadamente 1,2 mg y aproximadamente 1,8 mg. En otra formulación, la formulación comprende entre aproximadamente 1,3 mg y aproximadamente 1,7 mg. En otra formulación, la formulación comprende aproximadamente 1,5 mg. Sin embargo, se entenderá que la cantidad de ácido obeticólico realmente administrada será determinada por el médico, a la luz de las circunstancias relevantes, incluyendo la condición que debe tratarse, la vía de administración seleccionada, la forma del ácido obeticólico administrado, la edad, peso y respuesta del paciente individual, y la gravedad de los síntomas del paciente, y por lo tanto, los intervalos de dosis anteriormente indicados no pretenden limitar el alcance de la invención en modo alguno. En algunos casos, los niveles de dosis inferiores al límite inferior del intervalo anteriormente indicado pueden resultar más que adecuados, mientras que en otros casos pueden utilizarse dosis todavía mayores sin causar ningún efecto secundario perjudicial, con la condición de que dichas dosis más grandes se dividan en primer lugar en varias dosis pequeñas para la administración durante todo el día.

La expresión “procedimiento de la invención” se refiere a un método para preparar ácido obeticólico según se define en las reivindicaciones. El término “fibrosis” se refiere a una condición que implica el desarrollo de tejido conectivo fibroso excesivo, p.ej., tejido cicatricial, en un tejido u órgano. Dicha generación de tejido cicatricial puede producirse en respuesta a la infección, inflamación o lesión del órgano debido a una enfermedad, traumatismo, toxicidad química, etc. Puede desarrollarse fibrosis en una diversidad de diferentes tejidos y órganos, incluyendo el hígado, riñón, intestino, pulmón, corazón, etc.

El término “ inhibiendo” o “ inhibición”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a cualquier efecto positivo detectable sobre el desarrollo o progresión de una enfermedad o condición. Dicho efecto positivo puede incluir el retraso o bloqueo de la aparición de por lo menos un síntoma o signo de la enfermedad o condición, el alivio o reversión del síntoma o síntomas o signo o signos, y el retraso o bloqueo del agravamiento adicional del síntoma o síntomas, o signo o signos.

Tal como se utiliza en la presente memoria, una “condición colestática” se refiere a cualquier enfermedad o condición en la que la excreción de bilis a partir del hígado está deteriorada o bloqueada, lo que puede producirse en el hígado o en los conductos biliares. La colestasis intrahepática y la colestasis extrahepática son los dos tipos de condición colestática. La colestasis intrahepática (que se produce dentro del hígado) es la más comúnmente observada en la cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, sepsis (infección generalizada), hepatitis alcohólica aguda, toxicidad farmacológica, nutrición parenteral total (alimentada por vía intravenosa), malignidad, fibrosis quística y embarazo. La colestasis extrahepática (que se produce fuera del hígado) puede estar causada por tumores de conducto biliar, estenosis, quistes, divertículos, formación de cálculos en el conducto biliar común, pancreatitis, tumor pancreático o pseudoquistes, y compresión debida a una masa o tumor en un órgano próximo.

Entre los síntomas y signos clínicos de una condición colestática se incluyen: picor (prurito), fatiga, piel u ojos ictéricos, incapacidad para digerir determinados alimentos, náuseas, vómitos, heces pálidas, orina oscura y dolor abdominal en el cuadrante superior derecho. Un paciente con una condición colestática puede ser diagnosticado y monitorizado clínicamente basándose en un conjunto de ensayos de laboratorio clínico estándares, incluyendo la medición de los niveles de fosfatasa alcalina, Y-glutamil-transpeptidasa (GGT), 5'-nucleotidasa, bilirrubina, ácidos biliares y colesterol en el suero sanguíneo del paciente. Generalmente, se diagnostica una condición colestática en un paciente en el caso de que los niveles séricos de la totalidad de los tres marcadores diagnósticos: fosfatasa alcalina, GGT y 5'nucleotidasa, se consideren anormalmente elevados. El nivel sérico normal de dichos marcadores puede variar en cierto grado entre laboratorios y entre procedimientos, según el protocolo de ensayo. De esta manera, el médico podrá determinar, basándose en el procedimiento de laboratorio y de ensayo específico, qué es un nivel sanguíneo anormalmente elevado para cada uno de los marcadores. Por ejemplo, un paciente que sufre de una condición colestática generalmente presenta un nivel de fosfatasa alcalina superior a aproximadamente 125 UI/l, más de aproximadamente 65 Ui/l de GGT y más de aproximadamente 17 NIL de 5'-nucleotidasa en sangre. Debido a la variabilidad en el nivel de los marcadores séricos, puede diagnosticarse una condición colestática basándose en los niveles anormales de dichos tres marcadores además de por lo menos uno de los síntomas indicados anteriormente, tales como picor (prurito).

El término “órgano” se refiere a una estructura diferenciada (tal como en el corazón, pulmón, riñón, hígado, etc.) que consiste en células y tejidos y la realización de alguna función específica en un organismo. Dicho término comprende además partes corporales que realizan una función o cooperan en una actividad (p.ej., un ojo y estructuras relacionadas que constituyen los órganos visuales). El término “órgano” comprende además cualquier estructura parcial de células y tejidos diferenciados que es potencialmente capaz de desarrollarse en una estructura completa (p.ej., un lóbulo o una sección de un hígado).

En la especificación, las formas singulares incluyen además el plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria presentan los mismos significados entendidos comúnmente por el experto ordinario en la materia a la que se refiere la presente invención. En caso de conflicto, prevalecerá la presente especificación.

Todos los porcentajes y proporciones utilizados en la presente memoria, a menos que se indique lo contrario, son en peso. De los ejemplos siguientes, sólo el Ejemplo 1 es un ejemplo del procedimiento de la presente invención.

Ejemplos

EJEMPLO 1: síntesis de ácido obeticólico

Los números de compuestos a los que se hace referencia en el presente procedimiento sintético se refieren a los presentes en el Esquema 1 y en la reacción que corresponde a cada una de las e tapas.

Etapa 1. Preparación de metil-éster de ácido 3a-hidroxi-7-ceto-5B-colán-24-oico (1):

acido 3a-hidroxi-7-ceto-5(3-colan-24-oico m etil-ester de acido 3a-hidroxi-7-ceto-5(3-colan-24-oico KLCA

Reacción 1: esterificación de ácido carboxílico C-24 de ácido 7-ceto-litocólico (KLCA)

Se esterificó ácido 3a-hidroxi-7-ceto-5p-colán-24-oico (KLCA; 500,0 g, 1,28 moles) utilizando alcohol metílico (2500 ml), en presencia de catálisis ácida (ácido sulfúrico, 1,0 ml) y se calentó a una temperatura de entre 62°C y 64°C durante aproximadamente 3 horas, rindiendo metil-éster de ácido 3a-hidroxi-7-ceto-5p-colán-24-oico (1). En dicha reacción, el alcohol metílico actúa como el reactivo metilante, así como el solvente de reacción. Para el tratamiento final, se ajustó el valor del pH con solución de hidróxido sódico (2 N) a un pH entre 7,0 y 7,5. La solución se trató con carbón activo (25 g) durante aproximadamente 30 minutos y se filtró para eliminar los sólidos de carbón. Alternativamente, la solución no se trató con carbón activo. Para precipitar el producto, se añadió agua (625 ml) a una temperatura de entre 10°C y 15°C durante 15 minutos y se añadió material de inóculo. La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora a una temperatura de entre 10°C y 15°C. Se añadió una parte de agua (1875 ml) durante aproximadamente 20 a 25 minutos. La suspensión de producto se agitó durante 30 minutos a una temperatura de entre 10°C y 15°C. El producto se aisló con una centrífuga y se lavó con una mezcla de metanol y agua (1:1, 350 ml). El contenido de agua del material humectado se cuantificó mediante Karl Fischer (KF). El material se secó en una secadora de tambor al vacío a NMD 70°C. El material también puede utilizarse en la etapa siguiente sin secado. El rendimiento (calculado en producto seco) era de 501,4 g (1,24 moles, 96,8%).

Etapa 2. Preparación de metil-éster de ácido 3a,7a -ditrimetilsililoxi-5B-col-6-en-24-oico

Í31

Reacción 2: formación de éter de sililenol a partir de metil-éster de ácido 7-ceto-litocólico

Se cargó compuesto 1 (60,69 g, 150 mmoles, calculado como sustancia seca), que contenía agua y metanol residuales) en el reactor bajo condiciones inertes y se disolvió en tetrahidrofurano (THF, 363 ml). Se eliminó el agua y el metanol mediante destilación azeotrópica repetida a aproximadamente 65°C y presión normal. Se añadió THF al residuo según resultase necesario y la destilación se repitió aproximadamente 4 veces. La solución remanente debe presentar un contenido final de agua <0,05% (titulación de Karl Fischer). La solución se preenfrió a una temperatura de entre -20°C y -25°C y después se añadió clorotrimetilsilano (73,33 g, 675 mmoles, 4,5 equivalentes) en aproximadamente 30 a 45 minutos. Bajo una atmósfera de nitrógeno, se cargó diisopropilamida de litio (solución de LDA al 28%, 900 moles) y THF (504 ml) en un reactor inerte separado y se enfrió a una temperatura de entre -20°C y -25°C. En la solución fría seca de compuesto 1, se cargó THF (84 ml) y clorotrimetilsilano en la solución de LDA a una temperatura de entre -20°C y -25°C. A continuación, la mezcla de reacción se agitó durante aproximadamente 2 horas. Para el tratamiento final, la mezcla de reacción se añadió a una solución acuosa preenfriada de ácido cítrico (34,6 g en 300 ml) a una temperatura de entre 2°C y 8°C. Tras la adición, se separó la fase acuosa y se descartó. A partir de la fase orgánica, se eliminó el líquido mediante destilación al vacío a máximo 50°C. El residuo aislado contenía compuesto 3 y algunos solventes residuales y se utilizó 'sin modificación' en la etapa siguiente.

Etapa 3. Preparación de metil-éster de ácido 3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5B-colán-24-oico:

Reacción 3: condensación de aldol del éter de sililenol y acetaldehído

Se cargó compuesto 3 (164,68 g, 300 mmoles, calculado como sustancia seca) en THF en un reactor inerte. A una temperatura máxima de 50°C, se eliminaron mediante destilación al vacío las cantidades residuales de THF. El contenido de agua en el residuo se limitó a <0,5% (titulación de Karl Fischer) a fin de continuar. A continuación, el residuo se disolvió en diclorometano (200 ml) y se preenfrió a una temperatura de entre -60°C y -65°C. Seguidamente, se añadió acetaldehído (33,8 ml, 600 mmoles). Bajo una atmósfera de nitrógeno, se cargó diclorometano (700 ml) y trifluoruro de boro (solución al 16% en peso en acetonitrilo, 318 g, 750 mmoles) en un reactor separado y después se enfrió a una temperatura de entre -60°C y -65°C. A una temperatura de entre -60°C y -65°C, se añadió solución del compuesto 3 seco. La mezcla de reacción se agitó durante aproximadamente dos horas a una temperatura de entre -60°C y -65°C, se calentó hasta una temperatura de entre 23°C y 28°C, se agitó durante aproximadamente 3 horas adicionales y se enfrió a una temperatura de entre aproximadamente 2°C y 10°C para la hidrólisis/tratamiento final. Para el tratamiento final, la solución enfriada del reactor se añadió a una solución acuosa preenfriada de sosa cáustica al 50% en peso (40 ml) y 660 ml de agua. Tras aproximadamente 10 minutos de agitación intensa, se separaron las fases y la capa orgánica (inferior) se transfirió a un reactor separado. A partir de la capa orgánica, se eliminó el solvente mediante destilación a NMD 50% en la medida de lo posible. El residuo, que consistía en compuesto 4 y algo de acetonitrilo remanente y diclorometano, se descargó en tambores. El compuesto 4A, una mezcla de isómeros E/Z, también puede prepararse mediante el procedimiento indicado anteriormente para la etapa 3.

Etapa 4. Preparación de ácido 3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5B-colán-24-oico (5):

Reacción 4: saponificación de éster de C-24

Se cargó compuesto 4 (258,37 g, 600 mmoles, calculado como sustancia seca) en un reactor inerte. A una temperatura máxima de NMD 50°C, se eliminaron mediante destilación al vacío cantidades residuales del solvente. El residuo se disolvió en metanol (360 ml) y agua (54 ml) y se añadió sosa cáustica al 50% en peso (54 ml). La mezcla de reacción se calentó a una temperatura de entre 49°C y 53°C y se agitó a esta temperatura durante por lo menos 2 horas. Se comprobó el pH de la mezcla de reacción y se verificó que era >12. En el caso de que el pH fuese <12, se añadía NaOH adicional y se repetía el tiempo de reacción de 2 horas. La solución se diluyó con agua (1000 ml) y se ajustó la temperatura a un valor entre 25°C y 35°C. Para el tratamiento final, la mezcla de reacción se dejó en reposo durante por lo menos 30 minutos. Se separaron las fases y la capa acuosa inferior se transfirió a un reactor separado y se descartó la capa orgánica. Se añadió acetato de etilo (1400 ml) y ácido cítrico acuoso (244 g en 480 ml) bajo agitación intensa de la capa acuosa. La mezcla de reacción se agitó a una temperatura de entre 25°C y 35°C durante 10 minutos. Se separaron las fases y se descartó la capa acuosa inferior. Se eliminó el acetato de etilo mediante destilación respecto de la capa orgánica y se sustituyó por acetato de etilo (800 ml). Se repitió dicha operación hasta que el contenido de agua del destilado fuese NMD 1% o hasta alcanzar un punto de ebullición constante. La suspensión se enfrió a una temperatura de entre 20°C y 25°C, se agitó durante 30 minutos y después se aisló el producto y se lavó con acetato de etilo (100 ml, 3 a 4 veces). El secado se llevó a cabo en una secadora de tambor al vacío a aproximadamente 60°C. El rendimiento fue de 118,71 g (47,5% a partir de KLCA) de compuesto 5 en bruto. El compuesto 4A, una mezcla de isómeros E/Z, también puede utilizarse como material de partida para producir compuesto 5A, una mezcla de isómeros E/Z.

A continuación, se cristalizó el compuesto 5 en bruto utilizando etanol. El compuesto en bruto para la cristalización también puede ser una mezcla de isómeros E/Z, compuesto 5A. Se cargó etanol (390 a 520 ml) y compuesto 5 en bruto (130 g) en un reactor inerte. Para disolver el compuesto 5 en bruto, la mezcla de reacción se calentó bajo reflujo. A continuación, se enfrió la mezcla de reacción en una rampa de enfriamiento controlado de 15°C a 20°C en 3 a 5 horas en un perfil lineal. Se aisló el compuesto cristalino 5A utilizando una centrífuga y después se lavó con acetato de etilo (50 a 100 ml, 2 veces). El secado se llevó a cabo en una secadora de tambor al vacío y a aproximadamente 60°C. Ello condujo a un rendimiento de 85,85 g (66%). Se extrajo una muestra para medir la pureza del ensayo y la humedad del compuesto 5 purificado. El compuesto 5 purificado era el isómero E del ácido 3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico. Ver el Ejemplo 2 para información completa sobre la identificación y caracterización del compuesto 5 purificado. El aislamiento del compuesto 5 purificado, el isómero E, puede ser opcional. Los isómeros E y Z presentan solubilidades diferentes. El isómero E es menos soluble y cristaliza de manera que el isómero Z puede separarse mediante lavado.

Un método alternativo para preparar el compuesto 5 es el siguiente: Se carga compuesto 4 (111,96 g) en el reactor inerte. A máximo 50°C, se eliminan mediante destilación al vacío las cantidades residuales de solvente (p.ej., acetonitrilo, diclorometano). Se disuelve el residuo en metanol (156 ml) y se enfría a aproximadamente 10°C. Se añade agua corriente (23,4 ml) y sosa cáustica al 50% (23,4 ml). La mezcla de reacción se agita durante aproximadamente cuatro horas a una temperatura de entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 25°C. La solución se diluye con agua corriente (433 ml) y se añade tolueno (144 ml). Tras la agitación, las fases se separan y la capa acuosa inferior se transfiere al reactor inerte. La capa orgánica se descarta. Se añade etil-éster de ácido acético (607 ml) y una solución de ácido cítrico (105,7 g en 208 ml de agua) durante la agitación intensiva de la capa acuosa. Se separan las fases y se descarta la capa acuosa inferior. La capa orgánica se transfiere al reactor inerte. A partir de la capa orgánica, se elimina mediante destilación el etil-éster de ácido acético y se sustituye por etil-éster de ácido acético (347 ml). En una realización, se repite dicha operación con etil-éster de ácido acético (173 ml) hasta que el contenido de agua del destilado sea no superior a aproximadamente 1% o hasta alcanzar un punto de ebullición constante. La presente suspensión se enfrió hasta una temperatura de entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 25°C. Se aisló el compuesto 5 y se lavó con etil-éster de ácido acético (3 a 4 veces, 43 ml cada vez) con la centrífuga inerte. El secado se llevó a cabo en una secadora de tambor al vacío y a aproximadamente 60°C (rendimiento de 64,8% basado en el compuesto 1). El compuesto 4A (una mezcla de isómeros E/Z) también puede utilizarse como material de partida para la etapa 4, para producir compuesto 5A (una mezcla de isómeros E/Z).

Etapa 5. Preparación de ácido 3a-hidroxi-6-etil-7-ceto-5B-colán-24-oico (6):

o

Reacción 5: hidrogenación de la fracción 6-etilideno

Se cargó en el reactor de hidrogenación una mezcla de compuesto 5 purificado (110 g, 264 mmoles), agua (1100 ml), solución de sosa cáustica (35,8 ml, 682 mmoles) al 50% y catalizador de paladio (Pd/C, 11 g). La temperatura se ajustó a un valor de entre 25°C y 35°C y el reactor se enjuagó tres veces con nitrógeno (2 bar) y tres veces con hidrógeno (1 bar). Dichos valores de presión se proporcionan respecto a la presión ambiente (=0 bar). Se aplicó una presión de hidrógeno de 5 bar y la mezcla de reacción se calentó a 100°C (para la isomerización en la posición alfa) durante un periodo de 1,5 horas y después se agitó durante 3 horas, manteniendo simultáneamente la presión de hidrógeno en un valor entre 4,5 y 5 bar. A continuación, se enfrió la mezcla de reacción hasta una temperatura de entre 40°C y 50°C. Para el tratamiento final, se separó el Pd/C mediante filtración. Al filtrado, se añadió acetato de nbutilo (1320 ml) y ácido clorhídrico (67,8 ml, 815 mmoles, 37%). Se separó la fase acuosa y se descartó. La fase orgánica se trató con carbón activado (5,5 g) durante aproximadamente 10 minutos a una temperatura de entre 40°C y 50°C. Se separó el carbón activado mediante filtración y el filtrado se condensó mediante destilación y la suspensión resultante se enfrió a una temperatura de entre 15°C y 20°C en 2 a 3 horas. Se aisló el compuesto 6 precipitado y se lavó con acetato de n-butilo (160 ml). El producto se filtró utilizando un filtro de presión. El secado se llevó a cabo en el filtro de presión al vacío y a aproximadamente 60°C. Ello condujo a 89,8 g (81,2%) de compuesto 6. El compuesto 5A, una mezcla de isómeros E/Z, puede utilizarse en la etapa 5 para preparar el compuesto 6.

Etapa 6. Preparación de ácido 3a,7a-dihidroxi-6a-etil-5B-colán-24-oico (ácido obeticólico):

Reacción 6: reducción selectiva del grupo 7-ceto en grupo 7a-hidroxi

Una mezcla de compuesto 6 (86 g, 205,4 mmoles), agua (688 ml) y solución de hidróxido sódico al 50% (56,4 ml) se hizo reaccionar con borohidruro de sodio (7,77 g, 205,4 mmoles) en una mezcla de solución de hidróxido sódico al 50% en peso (1,5 ml) y agua (20 ml) a una temperatura de entre 90°C y 105°C. La mezcla de reacción se calentó bajo reflujo y se agitó durante por lo menos 3 horas. Para el tratamiento final, tras completar la reacción, la mezcla de reacción se enfrió a aproximadamente 80°C y se transfirió a un reactor enfriado. A una temperatura de entre 30°C y 50°C, se añadió acetato de n-butilo (860 ml) y ácido cítrico (320,2 g, anhidro) en agua (491 ml). Se separó la fase acuosa y se descartó tras comprobar el valor del pH para verificar que era ácido. Se transfirió la fase orgánica y se destiló. El residuo se diluyó con acetato de n-butilo y se enfrió lentamente hasta una temperatura de entre 15°C y 20°C y el ácido obeticólico en bruto se filtró utilizando una centrífuga. El producto humectado se cristalizó a partir de acetato de n-butilo. Se aisló el producto ácido obeticólico y se lavó con acetato de n-butilo (43 ml, 4 veces) en un filtro de presión inerte. El secado se llevó a cabo en el filtro de presión al vacío y a aproximadamente 80°C. Ello condujo a 67,34 g (77,9%) de ácido obeticólico cristalino. Ver el Ejemplo 3 para información completa sobre la identificación y caracterización del ácido obeticólico cristalino.

Etapa 7. Preparación de ácido obeticólico Forma 1:

acido obetico ico crista uno Forma C

Reacción 7: preparación de ácido obeticólico Forma 1 a partir de ácido obeticólico cristalino Forma C

Se disolvió ácido obeticólico cristalino Forma C (58 g) en agua (870 ml) y solución de sosa cáustica (al 50%, 8,7 ml, 166 mmoles) a una temperatura de entre 30°C y 40°C. La mezcla se agitó hasta disolver todo el sólido. El producto se precipitó utilizando el tratamiento final siguiente. Se añadió lentamente solución de ácido obeticólico mediante un filtro a ácido clorhídrico diluido (al 37%, 16,05 ml, 193 mmoles) en agua (870 ml) a una temperatura de entre 30°C y 40°C. La suspensión se agitó durante aproximadamente 30 minutos a una temperatura de entre 30°C y 40°C y después se enfrió a NMD 20°C. Se aisló el producto y se lavó con agua (465 ml, 6 veces) en un filtro de presión inerte. El secado se llevó a cabo en el filtro de presión al vacío a una temperatura de NMD 50°C. Lo anterior condujo a 53,2 g (91,7%) de ácido obeticólico Forma 1.

EJEMPLO 2: caracterización del ácido E-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5B-colán-24-oico (5):

El compuesto 5 es el intermediario clave para el procedimiento de la solicitud. Se aisló el compuesto a partir de acetato de etilo y después se cristalizó a partir de etanol. El compuesto 5 altamente puro permite una producción eficiente y de alto rendimiento de compuesto 6 y seguidamente ácido obeticólico cristalino Forma C y ácido obeticólico Forma 1, incluyendo ácido obeticólico sustancialmente puro.

La estructura del compuesto 5 de la etapa 4 en el Ejemplo 1 se confirmó utilizando RMN 1H, RMN 13C y espectrometría de masas. El producto en bruto de la etapa 4 resultó en un producto principal en el tiempo de retención (TR) 27,457 min y un producto menor en el TR 28,078 min en el cromatograma de UV generado mediante el método de control de calidad 1, mediante acoplamiento de CL-EM. Los dos productos son los isómeros E/Z del compuesto 5:

Estos dos isómeros muestran la misma masa exacta y la misma fragmentación en el espectro de EM/EM. No pueden distinguirse a partir de los datos de espectrometría de masas.

Utilizando un método semipreparativo para aislar los picos de isómero E/Z, se confirmaron las estructuras de los isómeros E/Z utilizando un enfoque de dos etapas. El método de control de calidad de HPLC 1 utilizó un tampón de ácido fosfórico no volátil y, de esta manera, el acoplamiento de CL/EM directo con el tampón no volátil no resultó posible. Los ensayos preliminares para el ajuste del método mostraron que sólo un método de UPLC permitía un número muy elevado de platos para una separación adecuada de los isómeros E/Z. El enfoque de dos etapas fue el siguiente: La etapa A fue la identificación de los isómeros E/Z en dos muestras con el método de UPLC/Em recién desarrollado, y la etapa B fue el aislamiento de la fracción de los picos de isómero E/Z con el método de HPLC 2 y la posterior identificación con el método de UPLC/EM 1. Los datos experimentales de los métodos fueron los siguientes: Tabla C

Se muestran los resultados en las figuras 1 y 2. Las figuras 1 y 2 son cromatogramas de UPLC de UV/EM para “compuesto 5 en bruto” (figura 1) y compuesto 5 “referencia purificada” (figura 2) obtenidos en una columna de UPLC de alto rendimiento. Para la figura 1, la muestra se disolvió a razón de 1 mg/ml en ACN/H201:1; 200x2mm Hypersil GOLD R122; LMA:H20+10mM AF 0.1%HFo; LMB:ACN; 45%-20-60%(10); 0,4 ml/min; 40°C; UVA=200nm; 3pl de volumen de inyección. Para la figura 2, la muestra se disolvió a razón de 1 mg/ml en ACN/H2O; 200x2mm Hypersil GOLD R122; A: AF 10mM HFo al 0,1%; B: ACN; 45%-20-60% de B(10); 0,4 ml/min; 20 pl de volumen de inyección. En ambas muestras, el peso molecular del componente principal (TR: 9,92 min) y del componente menor (TR: 10,77 min) era igual al esperado y las masas exactas de los dos compuestos eran consistentes con las estructuras proporcionadas, tal como se muestra en las Tablas D y E de los datos de medición de iones positivos y negativos mostrados a continuación:

Tabla D: datos de la medición de iones positivos

Tabla E: datos de medición de iones negativos

Para garantizar la portabilidad del método de HPLC de control de calidad 2, se repitió la separación original exactamente bajo las condiciones prescritas. El pico principal y el pico menor se aislaron en semipreparativa. El cromatograma de UV resultante con las posiciones marcadas de las fracciones atrapadas se muestra en la figura 3. La figura 3 es un cromatograma de UV del compuesto 5 en bruto utilizando el método de HPLC 2: 125x4mm Purospher STAR C18 5 pm AG; LMA:H2O pH 2.6 con H3PO4; LMB:ACN; 30% de B-10-35%-30-60%-1-90% (9); 1 ml/min; 35°C; UVA=200nm; en el EM; 25 ml. Después, se aislaron por separado las fracciones aisladas con el método de UPLC/EM recién desarrollado. Para la evaluación de los registros de iones exactos del ion cuasimolecular, se utilizó [2 M+NH4] a 850,61914±3 ppm. Los cromatogramas resultantes de la fracción pico principal, la fracción de pico menor y de las dos muestras se muestran en la figura 4 (A-D). Los estudios de EM mostraron que los dos picos generados mediante el método de control de calidad 2 en TR 27,457 y en TR 28,078 min son dos isómeros con la fórmula C26H40O4. Dicha fórmula es consistente con la estructura propuesta para los isómeros E/Z. De esta manera, el desarrollo del método de UPLC-EM ha mostrado que los isómeros E/Z del ácido 3a-hidroxi-etilidén-7-ceto-5p-cholic-24 son cromatográficamente separables con resolución elevada. Los datos de EM exactos del espectrómetro de masas de FR-ICR son consistentes con la estructura propuesta para los isómeros E/Z. Para ambos isómeros, se derivó la misma fórmula: C26H40O4.

Debido al aislamiento semipreparativo de los picos de isómero E/Z con el método de HPLC 2 y la posterior identificación con el método de UPLC-EM, los presentes inventores pueden mostrar que los dos picos generados mediante el método de control de calidad 2 (TR 27,457 minutos y t R 28,078 minutos, ver la figura 1) son los dos isómeros con la fórmula C26H40O4. Dicha fórmula es consistente con la estructura propuesta para los isómeros E/Z. Junto con los resultados de RMN indicados posteriormente, se obtuvieron las asignaciones siguientes: TR 27,457 minutos pertenece al isómero E y TR 28,078 minutos, al isómero Z.

La asignación de los desplazamientos de 1H y 13C para el isómero del ácido 3a-hidroxi-etilidén-7-ceto-5p-cholic-24 se muestran posteriormente. Se estimaron los desplazamientos según "L. Bettarello et al., II Farmaco 55, 51-55, 2000 (sustancia ácido 3a-hidroxi-7-ceto-5p-colán-24-oico).

Tabla F: asignación de desplazamiento de 1H (RMN-1H, 500 MHz, 303K, CD3OD)

Tabla G: asignación de desplazamiento de 13C (RMN-13C, 125 MHz, 303K, CD3OD)

(continuación)

EJEMPLO 3: caracterización de ácido obeticólico cristalino Forma C

La caracterización de estado sólido completa del producto de la etapa 6 del Esquema 1 y del Ejemplo 1 muestra que el ácido obeticólico es cristalino. Dicha forma cristalina se etiqueta como Forma C. A continuación, se proporciona una tabla que resume la caracterización del ácido obeticólico cristalino Forma C.

Tabla G: resumen de las características del ácido obeticólico cristalino Forma C

Análisis térmico

Los datos de DSC (por sus siglas en inglés, calorimetría diferencial de barrido) se recogieron en un Mettler DSC 823e dotado de un automuestreador de 34 posiciones. El instrumento se calibró para energía y temperatura utilizando indio certificado. Típicamente, se calentaron 0,5 a 1 mg de cada muestra, en una cápsula de aluminio perforada, a 10°Cmin-1 de 25°C a 350°C. Se mantuvo sobre la muestra una purga de nitrógeno a 50 m lm in-1. El software de control del instrumento y de análisis de los datos era STARe v9.20.

Los datos de TGA (por sus siglas en inglés, análisis termogravimétrico) se recogieron en un Mettler TGA/DTA 851e dotado de un automuestreador de 34 posiciones. El instrumento se calibró para la temperatura utilizando indio certificado. Típicamente, se cargan 5 a 10 mg de cada muestra en un crisol de aluminio tarado y se calientan a 10°Cmin-1 de temperatura ambiente a 300°C. Se mantuvo sobre la muestra una purga de nitrógeno a 50 m lm in-1. El software de control del instrumento y de análisis de los datos era STARe v9.20.

Se observaron dos etapas de pérdida de peso mediante TGA del ácido obeticólico cristalino Forma C. La primera tuvo lugar entre la temperatura ambiente (t.a.) y 85°C (0,41%) y la segunda se produjo entre 85°C-115°C (4,10%). La primera etapa de pérdida de peso puede atribuirse a la pérdida de agua, y la segunda etapa se atribuye a la pérdida del agua remanente (agua responsable de una pérdida de peso de aproximadamente 1,2%) y la pérdida del heptano unido (aprox. 3,4% de pérdida de peso). El ácido obeticólico cristalino Forma C contenía entre 0,15 y 0,2 moles de solvente (heptano) y aprox. 1,5% p/p (0,3 moles). El termograma de DSC del ácido obeticólico cristalino Forma C contenía una endoterma. Ésta era bastante aguda y aparecía aproximadamente a 98°C. Ver la figura 6. Diferentes solventes presentarían diferentes puntos de ebullición y, por lo tanto, se evaporarían a diferentes temperaturas en los experimentos de DSC y TGA.

Análisis de difracción de rayos X de los polvos (XRPD)

Bruker AXS C2 GADDS

Se recogieron los patrones de difracción de rayos X de los polvos en un difractómetro Bruker AXS C2 GADDS utilizando radiación Ka de Cu (40 kV, 40 mA), mesa XYZ automatizada, videomicroscopio láser para el posicionamiento automático de las muestras y un detector de área bidimensional HiStar. La óptica de rayos X consistía en un único espejo multicapa Gobel acoplado con un colimador perforado de 0,3 mm. Se llevó a cabo una comprobación semanal de funcionamiento utilizando un corindón estándar NlST 1976 certificado (placa plana).

La divergencia de haz, es decir, el tamaño efectivo del haz de rayos X en la muestra, era de aproximadamente 4 mm. Se utilizó un modo de barrido continuo 0-0 con una distancia de detector de muestras de 20 cm que proporciona un abanico 20 eficaz de 3,2° a 29,7°. Típicamente, la muestra se expuso al haz de rayos X durante 120 segundos. El software utilizado para la recogida de datos era GADDS para WNT 4.1.16 y los datos se analizaron y se presentaron utilizando Diffrac Plus EVA v 9.0.0.2 o v 13.0.0.2.

Condiciones ambientales: Las muestras pasadas bajo condiciones ambientales se prepararon en forma de especímenes de placa plana utilizando polvos tal como se recibieron, sin molienda. Se prensaron suavemente aproximadamente 1 a 2 mg de la muestra sobre un portaobjetos de vidrio a fin de obtener una superficie plana. Condiciones no ambientales: Las muestras pasadas bajo condiciones no ambientales se montaron en una oblea de silicio con compuesto conductor del calor. A continuación, se calentó la muestra hasta la temperatura apropiada a aprox. 10°Cmin-1 y posteriormente se mantuvo isotérmicamente durante aprox. 1 minuto antes de iniciar la recogida de datos.

Bruker AXS/Siemens D5000

Se recogieron los patrones de difracción de rayos X de los polvos en un difractómetro Siemens D5000 utilizando radiación de Ka de Cu (40 kV, 40 mA), goniómetro 0-0, divergencia de V20 y ranuras receptoras, un monocromador secundario de grafito y un contador de centelleo. Se comprobó el rendimiento del instrumento utilizando un estándar de corindón certificado (NIST 1976). El software utilizado para la recogida de datos era Diffrac Plus XRD Commander v2.3.1 y los datos se analizaron y presentaron utilizando Diffrac Plus EVA v 11,0.0.2 o v 13.0.0.2.

Las muestras se pasaron bajo condiciones ambientales como especímenes de placa plana utilizando polvos sin modificación. Se empaquetaron suavemente aproximadamente 20 mg de la muestra en una cavidad recortada en una oblea de silicio de fondo cero (510) pulida. La muestra se hizo girar respecto a su propio plano durante el análisis. Los datos de la recogida de datos son:

• Rango angular: 2° a 42° 20

• Tamaño de paso: 0,05° 20

• Tiempo de recogida: 4 spaso-1

Bruker AXS D8 Advance

Se recogieron los patrones de difracción de rayos X de los polvos en un difractómetro Bruker D8 utilizando radiación de Ka de Cu (40 kV, 40 mA), goniómetro 0-20, divergencia de V4 y ranuras receptoras, un monocromador secundario de grafito y un contador de centelleo. Se comprobó el rendimiento del instrumento utilizando un estándar de corindón certificado (NIST 1976). El software utilizado para la recogida de datos era Diffrac Plus XRD Commander v2.5.0 y los datos se analizaron y presentaron utilizando Diffrac Plus EVA v 11.0.0.2 o v 13.0.0.2.

Las muestras se pasaron bajo condiciones ambientales como especímenes de placa plana utilizando polvos sin modificación. Se empaquetaron suavemente aproximadamente 5 mg de la muestra en una cavidad recortada en una oblea de silicio de fondo cero (510) pulida. La muestra se hizo girar respecto a su propio plano durante el análisis. Los datos de la recogida de datos son:

• Rango angular: 2° a 42° 20

• Tamaño de paso: 0,05° 20

• Tiempo de recogida: 0,5 spaso-1

La XRPD mostró que los polvos aislados de la etapa 6 del procedimiento de la invención se recogieron en un Bruker AXS D8 Advance. Ver la figura 5. Los datos correspondientes para el difractograma de rayos X se presentan en la tabla, posteriormente. El software utilizado para la recogida de datos era Diffrac Plus XRD Commander v2.6.1 y los datos se analizaron y presentaron utilizando Diffrac Plus EVA v13.0.0.2 o v15.0.0.0. Las muestras se pasaron bajo condiciones ambientales como especímenes de placa plana utilizando polvos sin modificación. Se empaquetó suavemente la muestra en una cavidad recortada en una oblea de silicio de fondo cero (510) pulida. La muestra se hizo girar respecto a su propio plano durante el análisis. Los datos de la recogida de datos son:

• Rango angular: 2° a 42° 20

• Tamaño de paso: 0,05° 20

• Tiempo de recogida: 0,5 spaso-1

Tabla H: datos de difractograma de rayos X del ácido obeticólico cristalino Forma C

La VT-XRPD (difracción de rayos X de temperatura variable) reveló que la endoterma observada en el termograma de DSC correspondía a la desolvatación de la muestra ya que no se observaron cambios de forma con el calentamiento. Existe una diferencia de temperaturas entre los datos de DSC y de VT-XRPD, ya que el experimento de VT-XRPD se llevó a cabo en un espacio grande con la muestra expuesta, mientras que el experimento de DSC se llevó a cabo en un espacio cerrado confinado. Dicha diferencia es de aproximadamente 20°C y explica por qué la muestra se fundió a una temperatura mucho más baja en el experimento de DSC y la muestra todavía presentaba una apariencia cristalina a 110°C en el experimento de VT-XRPD. La VT-XRPD mostró que el secado del solvente del material resultaba en pérdida de cristalinidad que es consistente con que el material se encuentra en forma solvatada. Ver la figura 7.

Sorción gravimétrica de vapor (GVS)

Se obtuvieron isotermas de sorción utilizando un analizador de sorción de humedad SMS DVS intrínseco, controlado por el software de control intrínseco DVS v1.0.0.30. Se mantuvo la temperatura de la muestra a 25°C con los controles del instrumento. Se controló la humedad mezclando corrientes de nitrógeno seco y húmedo, con un caudal total de 200 m lm in-1. Se midió la humedad relativa mediante una sonda Rotronic calibrada (rango dinámico de 1,0% a 100% de HR) situado en proximidad a la muestra. Se monitorizó constantemente el cambio de peso (relajación de masa) de la muestra como función del % de HR (humedad relativa), mediante una microbalanza (precisión ±0,005 mg).

Se introdujeron 5 a 20 mg de muestra en una cesta de malla de acero inoxidable tarada, bajo condiciones ambientales. La muestra se cargó y descargó a 40% de HR y a 25°C (condiciones ambientales típicas). Se llevó a cabo una isoterma de sorción de la humedad tal como se indica de manera general posteriormente (2 barridos, proporcionando 1 ciclo completo). La isoterma estándar se llevó a cabo a 25°C a intervalos de 10% de HR en el intervalo de 0,5% a 90% de HR. El análisis de los datos se llevó a cabo en Microsoft Excel utilizando el paquete de análisis de DVS v6.0.0.7. Los parámetros del método para los experimentos de SMS DVS intrínseco fueron los siguientes:

continuación

Las muestras se recuperaron tras completar la isoterma y se reanalizaron mediante XRPD.

El análisis del ácido obeticólico cristalino Forma C mostró que la muestra era ligeramente higroscópica, al observar un incremento de masa de 1,18% entre 0% y 90% de HR. Dicha incorporación de agua era constante durante todo el análisis y se alanzó el equilibrio en todas las etapas. La histéresis de la curva es pequeña, indicando que la muestra perdió fácilmente el agua que había incorporado. El análisis de XRPD después del análisis de GVS mostró que la muestra no había sido modificada. Ver las figuras 8A, 8B y 8C.

Determinación del agua mediante titulación de Karl Fischer (KF)

Se midió el contenido de agua de cada muestra en un culombímetro Mettler Toledo DL39 utilizando reactivo Hydranal coulomat AG y una purga de argón. Se introdujeron muestras sólidas taradas en el recipiente en un crisol de TGA de platino que está conectada a un Subaseal para evitar la entrada de agua. Se utilizaron aprox. 10 mg de muestra en cada titulación y se realizaron determinaciones por duplicado.

El análisis de Karl Fischer mostró que el ácido obeticólico cristalino Forma C contenía 1,5% de agua que correspondía a aproximadamente 0,3 moles de agua.

Estabilidad durante una semana a 40°C y con 75% de HR

Se determinó la estabilidad del ácido obeticólico a 40°C y 75% de HR (humedad relativa) de la manera siguiente. Se almacenó una muestra de ácido obeticólico en una cámara de atmósfera húmeda durante una semana a 40°C/75% de HR. La muestra se reanalizó mediante XRPD y se encontró que no había sido modificada.

El estudio de estado sólido mostró que la presencia de una cantidad relativamente grande solvente orgánico resulta necesaria para cristalizar el ácido obeticólico Forma C. Es altamente improbable que una muestra de ácido obeticólico Forma C cristalice espontáneamente para formar ácido obeticólico cristalino Forma C durante el almacenamiento. EJEMPLO 4: formulación de tableta de ácido obeticólico

La tabla a continuación muestra la composición cuantitativa de las tabletas de ácido obeticólico. Se utilizaron formulaciones de 5 mg, 10 mg y 25 mg como material de ensayo clínico de fase 3.

T l I l r i r n lí l

continuación

EJEMPLO 5: caracterización de ácido obeticólico Forma 1

Ácido obteicólico Forma 1 se refiere a la forma no cristalina del ácido obeticólico. Dicha forma de ácido obeticólico puede producirse mediante un ácido obeticólico cristalino como intermediario sintético. El ácido obeticólico Forma 1 puede utilizarse como el ingrediente farmacéuticamente activo. El ácido obeticólico Forma 1 se caracteriza y analiza de la manera siguiente.

El lote 1 del ácido obeticólico Forma 1 se caracteriza utilizando las técnicas siguientes: evaluación mediante difracción de rayos X de los polvos (XRPD) para cristalinidad, resonancia magnética nuclear (RMN) de 1H y 13C, espectroscopía de infrarrojo con transformada de Fourier (FT-IR), evaluación óptica (p.ej., forma/tamaño de las partículas), propiedades térmicas (p.ej., calorimetría diferencial de barrido (DSC) y análisis termogravimétrico (TGA)), determinación del agua mediante Karl Fischer (KF), almacenamiento a 40°C y 75% de HR y reanálisis tras 2 semanas mediante XRPD, pKa mediante el método potenciométrico, Log P/D (octanol/agua) mediante potenciometría y estabilidad frente a la humedad utilizando sorción gravimétrica de vapor (GVS; p.ej., ciclo completo de sorcióndesorción con análisis de sólidos recogidos mediante XRPD). También se caracterizaron cinco otros lotes (p.ej., lotes 2, 3, 4, 5 y 6) de ácido obeticólico Forma 1 y se compararon utilizando las técnicas siguientes: evaluación mediante XRPD y comparación con el patrón del lote principal 1, RMN de 1H y 13C, FT-IR, evaluaciones ópticas (p.ej., forma/tamaño de partículas), propiedades térmicas (p.ej., DSC, TGA y microscopía de platina caliente) y determinación del agua mediante KF.

Análisis de difracción de rayos X de los polvos (XRPD)

Se recogieron los patrones de difracción de rayos X de los polvos en un difractómetro Bruker AXS C2 GADDS utilizando radiación Ka de Cu (40 kV, 40 mA), mesa XYZ automatizada, videomicroscopio láser para el posicionamiento automático de las muestras y un detector de área bidimensional HiStar. La óptica de rayos X consiste en un único espejo multicapa Gobel acoplado con un colimador perforado de 0,3 mm. La divergencia de haz, es decir, el tamaño efectivo del haz de rayos X en la muestra, era de aproximadamente 4 mm. Se utilizó un modo de barrido continuo 0-0 con una distancia de detector de muestras de 20 cm que proporciona un abanico 20 eficaz de 3,2° a 29,7°. Típicamente, la muestra se expuso al haz de rayos X durante 120 segundos. El software utilizado para la recogida de datos era GADDS para WNT 4.1.16 y los datos se analizaron y se presentaron utilizando Diffrac Plus EVA v 9.0.0.2 o v 13.0.0.2.

Las muestras pasadas bajo condiciones ambientales se prepararon en forma de especímenes de placa plana utilizando polvos tal como se recibieron, sin molienda. Se prensaron suavemente aproximadamente 1 a 2 mg de la muestra sobre una oblea de silicio a fin de obtener una superficie plana. Los difractogramas muestran que el ácido obeticólico Forma 1 es no cristalino (ver las figuras 10 y 11).

Caracterización de RMN

Se recogieron los espectros de RMN en un instrumento Bruker de 400 MHz dotado de un automuestreador y controlado por una consola DRX400. Se adquirieron experimentos automatizados utilizando ICONNMR v4.0.4 (compilación 1) operando con Topspin v 1.3 (nivel de revisión 8) utilizando los experimentos Bruker estándares con carga. Para la espectroscopía no rutinaria, los datos se adquirieron mediante la utilización de Topspin únicamente. Las muestras se prepararon en d6-DMSO, a menos que se indique lo contrario. El análisis fuera de línea se llevó a cabo utilizando un ACD SpecManager v9.09 (compilación 7703).

La figura 12 muestra el espectro de RMN-1H para el lote 1. Los espectros de RMN-1H de los lotes 2 a 6 también se registraron y se compararon con el espectro del lote 1. Ver la figura 13. Todos los espectros eran similares, aunque con cantidades variables de agua. Se observaron algunas diferencias en la integración del gran grupo de protones entre 0,75 ppm y 2 ppm, en el que los picos se solapan y no pueden integrarse por separado. La Tabla J muestra el número total de protones integrados en los espectros de los lotes 1 a 6 considerando la variación en la región de 0,75 a 2 ppm.

Tabla J

Se ha excluido el protón del ácido carboxílico, de manera que el número de protones debería ser 43, aunque de hecho varía entre 40 y 43 entre los 6 espectros. Sin embargo, el área de la que procede la variación (0,75-2 ppm) es bastante amplia, y debido a la calidad de la línea base, esta integración no es fiable.

Debido a que el espectro no pudo asignarse por completo y la integración variaba, se registró un espectro de RMN-C13 del lote 2. La figura 14 muestra el espectro de DEPTQ, en el que los picos de CH2 y carbonos cuaternarios apuntan hacia arriba, mientras que los grupos CH3 y CH apuntan hacia abajo. Hay trece picos apuntando hacia abajo, que corresponden a nueve CH y cuatro grupos CH3. Lo anterior es consistente con la estructura. El pico del carbono del ácido carboxílico se observó en 175 ppm. Se ha excluido de dicha vista ampliada en aras de la claridad de la zona de interés. Sin embargo, sólo hay once picos apuntando hacia arriba, mientras que debería haber doce, ya que hay diez grupos CH2 y dos carbonos cuaternarios en la molécula (excluyendo el carbonilo). Un carbono aparentemente se solapa con otra señal. Por lo tanto, se recogió un espectro DEPT135, suprimiendo las señales de carbono cuaternario, que podría mostrar si la señal solapante es cuaternaria. Ver la figura 15. Una comparación entre el espectro DEPT135 y el espectro DEPTQ muestra que desaparece un pico (en 42,5 ppm). Hay dos carbonos cuaternarios en la molécula, que deberían corresponder a la desaparición de dos picos. Por lo tanto, la señal del carbono solapante es una cuaternaria.

Además, se llevó a cabo un experimento para determinar el tiempo de relajación de los carbonos a fin de determinar en dónde solapaba la señal faltante de carbono cuaternario con otra señal de carbono. Ver la figura 16. Dicho espectro de 13C contiene picos que están integrados. Lo anterior mostró que el pico en 32,3 ppm explica dos carbonos. Ver la figura 17 para una vista ampliada del pico en 32,3 ppm. De esta manera, las integraciones explican veintiséis carbonos (incluyendo el ácido carboxílico), lo que es consistente con la estructura.

FT-IR con ATR

Los datos se recogieron en un Perkin-Elmer Spectrum One dotado de un accesorio de muestreo ATR Universal. Los datos se recogieron y analizaron utilizando el software Spectrum v5.0.1. Ver la figura 18.

Análisis térmico mediante calorimetría de barrido diferencial (DSC) y análisis termogravimétrico (TGA)

Los datos de DSC se recogieron en un TA Instruments Q2000 dotado de un automuestreador de 50 posiciones. El instrumento se calibró para energía y temperatura utilizando indio certificado. Típicamente, se calentaron 0,5 a 3 mg de cada muestra, en una cápsula de aluminio perforada, a 10°Cmin'1 de 25°C a 350°C. Se mantuvo sobre la muestra una purga de nitrógeno a 50 m lm in-1. El software de control del instrumento era Advantage for Q Series v2.8.0.392 y Thermal Advantage v4.8.3, y los datos se analizaron utilizando Universal Analysis v4.3A. Para DSC modulada, la muestra se preparó tal como anteriormente y la cápsula se calentó a 2°C.min-1 de 25°C a 200°C. Las condiciones del modulador eran una amplitud de 0,20°C y una periodicidad de 40 s. El intervalo de muestreo era 1 s/pt.

Los datos de TGA se recogieron en un TA Instruments Q500 dotado de un automuestreador de 16 posiciones. El instrumento se calibró para la temperatura utilizando Alumel certificado. Típicamente, se cargan 5 a 10 mg de cada muestra en un crisol de aluminio pretarado y cápsula de DSC de aluminio, y se calientan a 10°Cmin-1 de temperatura ambiente a 350°C. Se mantiene sobre la muestra una purga de nitrógeno a 60 m lm in-1. El software de control del instrumento era Advantage for Q Series v2.8.0.392 y Thermal Advantage v4.8.3.

Se llevó el análisis térmico del lote 1 mediante DSC y TGA. El registro de TGA (ver la figura 19) muestra una pérdida de peso de 1,7% entre la temperatura ambiente y 121°C, que probablemente es la pérdida de agua. El registro de DSC (ver la figura 19) muestra una endoterma ancha de baja temperatura, correspondiente probablemente a la pérdida de agua, seguido de una pequeña endoterma con inicio en 94°C.

Dicha segunda endoterma podría indicar una transición vitrea y se investigó adicionalmente mediante DSC modulada (ver la figura 20). Dicha técnica permite que sucesos reversibles, tales como una transición vitrea, se separen de los irreversibles, tales como la pérdida de solvente o la fusión de una forma cristalina. El registro de flujo térmico reversible en la DSC modulada muestra la transición vitrea como una etapa con un punto de inflexión (Tg) en 95°C. Ésta es elevada para una transición vitrea y sugiere que la Forma 1 es estable. La pequeña endoterma con inicio en 89°C en el registro de flujo térmico no reversible corresponde a la relajación molecular del material en masa a la temperatura de transición vitrea.

El registro de DSC (ver la figura 19) muestra descomposición desde aproximadamente 220°C, que también corresponde al registro de TGA curvándose hacia abajo.

Los registros de TGA de los lotes 1, 2, 3, 4, 5 y 6 son de forma similar (ver la figura 21). Las pérdidas de peso medida entre la temperatura ambiente y 120°C se muestran en la Tabla K. Son consistentes con las cantidades variables de agua observada mediante RMN. Dichas cantidades se cuantificaron adicionalmente mediante titulación de agua de Karl Fischer (KF). Ver la determinación del agua mediante KF.

Tabla K: resumen de las pérdidas de peso en TGA de las muestras recibidas

La figura 22 muestra los registros de DSC de los seis lotes a modo de comparación. Los registros son similares, con una endoterma ancha a baja temperatura de tamaño variable, consistente con las cantidades variables de agua, seguido de una pequeña endoterma en torno a la temperatura de transición vitrea, tal como se observa en la sección DSC y TGA. Se resumen los resultados en la Tabla L, a continuación.

Tabla L: resumen de los resultados de DSC de las muestras recibidas

Microscopia de luz polarizada (MLP)

Se estudiaron las muestras en un microscopio de luz polarizada Leica LM/DM con una videocámara digital para la captura de imágenes. Se colocó una pequeña cantidad de cada muestra sobre un portaobjetos de vidrio, montada en aceite de silicona con un cubreobjetos de vidrio, separando las particulas individuales lo mejor posible. La muestra se visionó con una ampliación apropiada y luz parcialmente polarizada, acoplada con un filtro de falso color A.

Las figuras 23A-23F muestran que los lotes 1, 2, 3, 4, 5 y 6 son material constituido de aglomerados duros grandes de particulas irregulares pequeñas. Todos los lotes 1, 2, 3, 4, 5 y 6 presentan una apariencia similar. No se observó birrefringencia bajo la luz polarizada en un plano, lo que es consistente con que el material no sea cristalino. Los tamaños de particula se encuentran comprendidos entre 1 pm y 3 pm. El pequeño tamaño de estas particulas sugiere que han precipitado muy rápidamente.

Sorción gravimétrica de vapor (GVS)

Se obtuvieron isotermas de sorción utilizando un analizador de sorción de humedad SMS DVS intrínseco, controlado por el software SMS Analysis Suite. Se mantuvo la temperatura de la muestra a 25°C con los controles del instrumento. Se controló la humedad mezclando corrientes de nitrógeno seco y húmedo, con un caudal total de 200 m lm in-1. Se midió la humedad relativa mediante una sonda Rotronic calibrada (rango dinámico de 1,0% a 100 % de HR) situado en proximidad a la muestra. Se monitorizó constantemente el cambio de peso (relajación de masa) de la muestra como función del % de HR con una microbalanza (precisión ±0,005 mg).

Típicamente, se introducen 5 a 20 mg de muestra en una cesta de malla de acero inoxidable tarada, bajo condiciones ambientales. La muestra se cargó y descargó a 40% de HR y a 25°C (condiciones ambientales típicas). Se llevó a cabo una isoterma de sorción de la humedad tal como se indica de manera general posteriormente (2 barridos, proporcionando 1 ciclo completo). La isoterma estándar se llevó a cabo a 25°C a intervalos de 10% de HR en el intervalo de 0,5% a 90% de HR.

Tabla M

Se obtuvo la isoterma de sorción gravimétrica de vapor (GVS) para el lote 1 a 25°C y se muestra en la figura 24. La muestra aparentemente es moderadamente higroscópica, con un cambio total de peso de 3,8% entre 0% y 90% de humedad relativa (HR). La histéresis (zona entre las curvas de adsorción y desorción) es pequeña, indicando que el sólido libera con bastante facilidad el agua adsorbida. No se observó formación de hidrato. No hubo un cambio significativo de peso después de todo el experimento (0,3%).

El gráfico de cinética de la GVS (figura 25) muestra que la adsorción del agua se produjo mayoritariamente a humedades muy elevadas, y la desorción, a humedades muy bajas. En la etapa de adsorción, la muestra alcanzó el equilibrio bastante rápidamente hasta 80% de HR y tardó más en equilibrarse a 90% de HR. En la desorción, la masa se estabilizó en todas las etapas.

Tras completar la GVS, se recuperó la muestra y se analizó nuevamente mediante XRPD, que mostró que el material todavía era no cristalino (figura 26).

Determinación del agua mediante Karl Fischer (KF)

Se midió el contenido de agua de cada muestra en un culombímetro Mettler Toledo DL39 utilizando reactivo Hydranal Coulomat AG y una purga de argón. Se introdujeron muestras sólidas taradas en el recipiente en un crisol de TGA de platino que estaba conectado a un Subaseal para evitar la entrada de agua. Se utilizaron aproximadamente 10 mg de muestra en cada titulación y se realizaron determinaciones por duplicado.

La titulación del agua mediante Karl Fischer culombimétrica proporcionó un resultado de 2,4% en peso de agua. Lo anterior es ligeramente superior a la pérdida de peso observada mediante TGA. Podría significar que parte del agua no resulta liberada del material con el calentamiento, aunque probablemente se debe a los diferentes procedimientos experimentales para estas dos técnicas.

Se determinó el contenido de agua de cada lote mediante Karl Fischer culombimétrica. La Tabla N muestra dichos resultados y los compara con resultados anteriores de Karl Fischer obtenidos y con las pérdidas de peso observadas mediante TGA. Los datos son consistentes, ya que la tendencia es la misma en los tres análisis. Los datos de Karl Fischer obtenidos anteriormente muestran cantidades más pequeñas de agua que los resultados obtenidos ahora. Lo anterior es consistente con que el material sea higroscópico, aunque algunas muestras han incorporado más agua que otras. La pérdida de peso de TGA es consistentemente más baja que los resultados obtenidos mediante titulación de Karl Fischer, lo que podría significar que parte del agua queda atrapada en el material y no resulta liberada con el calentamiento, aunque también podría deberse al procedimiento experimental.

Tabla N: resultados del Karl Fischer (KF) y resumen de los datos de contenido de agua

Determinación y predicción de pKa

Los datos de determinación de pKa se recogieron en un instrumento Sirius GlpKa con un módulo D-PAS. Las mediciones se realizaron a 25°C en solución acuosa mediante UV en mezclas de metanol-agua mediante potenciometría. Los medios de titulación se habían ajustado según fuerza iónica (ISA, por sus siglas en inglés) con KCl 0,15 M (aq.). Los valores observados en las mezclas de metanol-agua se corrigieron a 0% de cosolvente mediante una extrapolación de Yasuda-Shedlovsky. Los datos se refinaron utilizando el software Refinement Pro v1.0. Se realizó una predicción de los valores de pKa utilizando el software de predicción de pKa ACD v9.

Se midió la pKa del ácido obeticólico mediante potenciometría utilizando metanol como cosolvente (figura 27) y se extrapoló a 0% de cosolvente utilizando una extrapolación de Yasuda-Shedlovsky (figura 28). La pKa permite la determinación de la proporción de forma neutra y forma ionizada del compuesto a un pH dado. La figura 29 muestra la distribución de las especies según el pH.

Determinación de LogP

Se recogieron datos mediante titulación potenciométrica en un instrumento Sirius GlpKa utilizando tres proporciones de octanol:agua de fuerza iónica ajustada (ISA) para generar los valores de LogP, ion LogP y LogD. Los datos se refinaron utilizando el software Refinement Pro v1.0. La predicción de los valores de LogP se realizó utilizando el software ACD v9 y Syracuse KOWWIN v1.67.

Tabla O: LogP predicho y medido

Se predijo LogP utilizando el software ACD y después se midió mediante potenciometría. Se llevaron a cabo tres titulaciones a tres proporciones diferentes de octanol/agua ISA, proporcionando la curva de diferencias representada en la figura 30. La curva negra es la titulación de pKa acuosa pura y las 3 curvas de color corresponden a tres proporciones de octanol / agua ISA. Los desplazamientos de la pKa permiten la determinación de LogP.

La curva de lipofilicidad (logD como función del pH) se muestra en la figura 31. LogD es el coeficiente de distribución, que representa la lipofilicidad combinada de todas las especies presentes a un pH específico. LogP es una constante de compuesto, que corresponde al coeficiente de repartición de la especie neutra pura, mientras que ion LogP es la de la especie ionizada pura. Puede determinarse LogP e ion LogP a partir de la curva de lipofilicidad, como la intersección del eje Y con, respectivamente, la tangente al inicio de la escala de pH (momento en que la molécula se encuentra puramente en su forma neutra) y la tangente al final de la escala de pH (momento en que la molécula se encuentra completamente ionizada).

Estabilidad tras dos semanas a 40°C y 75% de HR y a 25°C y 97% de HR

Una muestra del lote 1 se almacenó a 40°C y con 75% de humedad relativa (HR) en un ensayo acelerado de estabilidad de la forma sólida. Otra muestra se almacenó a 25°C y con 97% de humedad relativa para comprobar el efecto de una humedad muy elevada. Ambas muestras se analizaron nuevamente mediante XRPD tras cinco días y tras dos semanas. Ambas muestras se mantuvieron no cristalinas bajo las dos condiciones de almacenamiento durante un máximo de dos semanas, mostrando que la Forma 1 es estable frente a dichas condiciones. Ver las figuras 32 y 33. Los seis lotes analizaron eran todos no cristalinos. Se midió una temperatura de transición vitrea de 95°C con un experimento de DSC modulada. Los seis lotes aparentemente eran muy similares según todas las técnicas analíticas utilizadas, siendo la única diferencia el contenido de agua, que variaba entre 1,9% y 2,8% según la titulación de Karl Fischer. El análisis térmico mostró la cantidad variable de agua y señaló a descomposición que se iniciaba en aproximadamente 175-220°C. La pKa medida era de 4,82 y LogP era de 5,54. La evaluación de microscopía mostró aglomerados duros de gran tamaño de partículas irregulares muy pequeñas.

Los ensayos de estabilidad mostraron que el material todavía era no cristalino tras dos semanas bajo condiciones aceleradas (40°C/75% de HR) o bajo humedad elevada (25°C/97% de HR). El análisis de sorción gravimétrica de vapor (GVS) mostró que el material sólo era moderadamente higroscópico, con una ganancia total de peso de 3,8% de 0% a 90% de humedad relativa (HR). No se observó formación de hidratos bajo GVS. La muestra analizada nuevamente mediante XRPD tras la GVS todavía era no cristalina. La elevada temperatura de transición vitrea y los resultados de los ensayos de estabilidad sugieren que la forma no cristalina es estable.

EJEMPLO 6: Estructura de rayos X de cristales individuales y estereoquímica absoluta

Se determinó la estructura de rayos X de los cristales individuales de ácido obeticólico a partir de un cristal obtenido de la recristalización del ácido obeticólico a partir de una solución de acetonitrilo tras el enfriamiento a 5°C a 0,1°C/min, seguido de la maduración a TA/50°C, en ciclos de 8 h durante 1 semana (verla figura 34). La estructura es consistente con la Forma G y se generó un patrón de XRPD simulado como patrón de referencia para dicho material. La Forma G puede prepararse mediante enfriamiento de una solución de ácido obeticólico en, p.ej., acetonitrilo.

La estructura es ortorrómbica, grupo espacial P2i2i2-i, y contiene una molécula de ácido obeticólico en la unidad asimétrica. R1 [I>2o(I)] final=3,22%. El cristal mostraba morfología prismática de dimensiones aproximadas 0,4 x 0,4 x 0,3 mm. Se determinó la estereoquímica absoluta de la molécula como S en los centros quirales C5, C9, C10 y C14 y R en los centros quirales C3, C6, C7, C8, C13, C17 y C22 con un parámetro de Flack=- 0,01 (13). Para la estructura invertida con centros quirales C5, C9, C10 y C14 en la configuración R y centros quirales C3, C6, C7, C8, C13, C17 y C22 en la configuración S, el parámetro de Flack=10,01 (13), confirmando la asignación indicada anteriormente. Globalmente, la estructura presentaba un conjunto fuerte de datos y ningún desorden.

El software utilizado para asignar la estereoquímica (PLATON) determinó el centro quiral (C8) como un estereocentro R, mientras que la asignación del software ACD (y la Cahn-Ingold-Prelog) para (C8) era S. Sin embargo, la asignación de las diferencias de Bijvoet ara el sistema de anillos B/C está absolutamente definida por la estructura cristalina. La determinación de la estructura absoluta utilizando estadística bayesiana en diferencias de Bijvoet (Hooft et al., J. Appl. Cryst., 41, 96-103, 2008), revela que la probabilidad de que la estructura absoluta tal como se presenta sea correcta es de 1,000, mientras que las probabilidades de que la estructura absoluta sean gemelos racémicos o falsa son de 0,000 y 0,000, respectivamente. El equivalente Flack y su incertidumbre se calculan mediante dicho programa que son -0,019 (17).

La estructura del ácido obeticólico contiene un anillo de 5 elementos y 3 anillos de seis elementos que están fusionados entre sí. El análisis conformacional del anillo de 5 elementos (C13, C14, C15, C16 y C17) revela que el descriptor de empaquetamiento más próximo para este anillo es una media silla. El análisis conformacional de los tres anillos de 6 elementos (C1, C2, C3, C4, C5 y C10); (C5, C6, C7, C8, C9 y C10) y (C 8, C9, C11, C12 C13 y C14) revela que el descriptor de empaquetamiento más próximo para dichos anillos es una silla.

Se observan en la estructura cristalina dos enlaces de hidrógeno intermoleculares únicos. Cada molécula del ácido obeticólico forma un enlace de hidrógeno con dos moléculas relacionadas de diferente simetría del ácido obeticólico, con los oxígenos O1 y O4 actuando como donantes de los oxígenos O3 y O1, respectivamente, que actúan como aceptores, O1-H1C---O3 [D - A = 2.7419(12)Á] y O4-H4C---O1 [D - A = 2.6053(13)A (ver la figura 35). Estas interacciones resultan en una red 3-dimensional compleja unida mediante enlaces de hidrógeno. El mapa de diferencias de Fourier final muestra densidades electrónicas máxima y mínima de 0,402 y -0,176 eÁ-3, respectivamente.

Una superposición del patrón de XRPD calculado para la estructura con los lotes experimentales muestra que el cristal es consistente con la masa y es ácido obeticólico Forma G (ver la figura 36).

Tabla 1. Datos cristalinos para el ácido obeticólico Forma G

Solventes de cristalización Acetonitrilo.

Método de cristalización Maduración a TA/50°C

Fórmula empírica C26 H44 O4

Peso de la fórmula 420,63

Temperatura 100(2) K

Longitud de onda 1,54178 A

Tamaño del cristal 0,40 x 0,40 x 0,30 mm

Hábito cristalino Prisma incoloro

Sistema cristalino Ortorrómbico

Grupo espacial P 2221

Dimensiones de celda a=8,72510(10) A a=90°

unitaria

6=12,69860(10) A p=90°

c=22,5408(2) A y=90°

Volumen 2497,44(4) A3

Z 4

Densidad (calculada) 1,119 Mg/m3

Coeficiente de absorción 0.574 mm-1

F(000) 928

Tabla 2. Recogida de datos y refinado de estructuras para el ácido obeticólico Forma G

Difractómetro SuperNova, Dual, Cu at zero, Atlas

Fuente de radiación SuperNova (Cu) fuente de rayos X, Ka de Cu

Método de recogida de datos Barridos omega

Intervalo theta para recolección de datos 9,15 a 74,49°

intervalos del índice -10 < h < 10, -15 < k < 15, -28 < l < 26

Reflexiones recogidas 50001

Reflexiones independientes 5073 [R(int)=0,0220]

Cobertura de reflexiones independientes 99,4%

Variaciones en reflexiones de comprobación N/A

Corrección de absorción Semi-empírico de equivalentes

Transmisión max. y min. 1,00000 y 0,78605

Técnica de solución de estructura directa

Programa de solución de estructura SHELXTL (Sheldrick, 2001)

Técnica de refinado Matriz completa de cuadrados mínimos en F2

Programa de refinado SHELXTL (Sheldrick, 2001)

Función minimizada Iw(Fo2-Fc2)2

Datos/restricciones/parámetros 5073 / 0 / 286

Bondad de ajuste en F2 1,060

A/Omax 0,001

Índices R finales

5039 datos; I>2o(I) R1=0,0320, wR2=0,0859

Todos los datos R1=0,0322, wR2=0,0861

Esquema de ponderación calc. w=1 / [a2 (Fo2)+( 0,0503P)2+0,5520P]

donde P=(Fo2+2Fc2)/3

Parámetro de estructura absoluta: -0,01(13)

Mayor diferencia pico y agujero 0,402 y -0,176 eA'3

El resumen de refinado de la estructura es el siguiente:

Átomos no H ordenados, XYZ Refinado libre

Átomos no H ordenados, U Anisotrópico

(continuación)

Átomos H (en el carbono), XYZ Posiciones idealizadas montadas en átomos unidos

Átomos H (en el carbono), U Múltiplo apropiado de U(eq) para átomo unido

Átomos H (en heteroátomos), XYZ Refinado libre

Átomos H (en heteroátomos), U Isotrópico

Átomos desordenados, OCC Sin desorden

Átomos desordenados, XYZ Sin desorden

Átomos desordenados, U Sin desorden

Ejemplo 7: diferencia de biodisponibilidad entre ácido obeticólico Forma 1 (no cristalino) y formas cristalinas (Forma F)

El estado físico del ácido obeticólico sólido puede desempeñar un papel en la biodisponibilidad de la molécula al administrarla por vía oral en un sujeto (p.ej., ratas). El estudio indicado posteriormente se llevó a cabo para discriminar la cinética plasmática tras una única administración oral y la eficiencia de la absorción intestinal y la farmacocinética de las formas no cristalinas y cristalinas sólidas del ácido obeticólico. Se compararon los perfiles de concentración plasmática de ácido obeticólico vs tiempo, el tmax, la Cmaxy y AUC tras la administración de Forma 1 (no cristalina) o Forma F de ácido obeticólico (ver las figuras 37 y 38).

Se administró ácido obeticólico Forma 1 (no cristalino) y Forma F en ratas y de cada animal se extrajo sangre en diferentes periodos de tiempo durante por lo menos 3 horas. Se estudiaron seis animales de cada forma de ácido obeticólico.

Protocolo experimental:

La sustancia de ensayo utilizada fue el ácido obeticólico Forma 1 (no cristalino) y Forma F cristalina. La Forma F puede prepararse mediante maduración a partir de acetonitrilo o nitrometano. La formulación se preparó en forma de una suspensión en agua a pH 4. El modelo de estudio eran ratas Sprague-Dawley macho adultas de aproximadamente 225 a aproximadamente 250 g (Harlan Laboratories). Se utilizaron seis animales por vía de administración. La dosis fue PO de 20 mg/kg/5 ml. Los animales fueron sometidos a ayuno durante la noche antes del tratamiento con la formulación de ácido obeticólico. La administración oral se llevó a cabo mediante sonda gástrica.

El día uno, en los animales se ajustó una cánula implantada en la vena yugular izquierda (SOP VIVO/SAF6); se aplicó anestesia con isoflurano. El experimento se inició un día después de la recuperación de la cirugía. Se extrajeron aproximadamente 500 pl de sangre (250 pl de plasma) mediante la cánula en una jeringa heparinizada (heparina Na) y se recogieron inmediatamente en microtubos en un baño de hielo/agua. Dentro de la hora siguiente, se centrifugaron las muestras a 10000xg durante 5 minutos a 4°C. El plasma se transfirió inmediatamente a microtubos y se almacenó a -20°C. Las muestras de sangre se extrajeron 30 minutos, 1 hora, 1,3 horas, 2 horas y 3 horas después de la dosis. Las muestras de plasma se analizaron utilizando el método cuantitativo de HPLC-ES/EM/EM. Se llevó a cabo un estudio farmacocinético utilizando métodos no compartimentales.

Resultados:

Las concentraciones plasmáticas medias de ácido obeticólico tras 20 mg/kg p.c. de administración de dosis oral única de las dos formas sólidas se informan en la figura 37. Los valores son de medias de seis grupos de experimentos para cada formulación. En el gráfico se proporcionan las desviaciones estándar.

Tras la administración de la forma cristalina, se consiguió la Cmax tras 1,5 horas y la concentración plasmática de ácido obeticólico seguía una cinética periódica con un valor máximo y tras 3 horas la dosis era prácticamente la mitad de la Cmax.

El perfil cinético tras la administración de ácido obeticólico Forma 1 (no cristalino) es diferente de la Forma F cristalina. Se obtuvo un pico temprano de concentración plasmática tras 30 minutos y un segundo pico tras 2 horas. La variabilidad de los datos en las 6 ratas era muy baja y este comportamiento era estadísticamente diferente del de la forma cristalina. La AUC para las tres horas estudiadas era más elevada que para la forma cristalina. La cinética sugiere que el ácido obeticólico todavía se encuentra presente en el plasma tras 3 horas. Se ha demostrado anteriormente que el paso del ácido obeticólico por el hígado produce el metabolito hepático tauroconjugado, que resulta secretado a la bilis y se acumula en la circulación enterohepática. De esta manera, la medición del tauroconjugado puede utilizarse para determinar el paso de la cantidad de ácido obeticólico por el hígado. La tasa de formación de tauroconjugado se informa en la figura 38, que muestra que la formación de tauroconjugado es más rápida y se alcanza una concentración más elevada tras la administración de la forma cristalina.

Punto de fusión y transición vítrea

El punto de fusión del ácido obeticólico Forma 1 (no cristalino) y la Forma F cristalina se midió utilizando un método convencional. El punto de fusión del ácido quenodesoxicólico y del ácido ursodesoxicólico se midieron como compuestos de referencia. Las mediciones se llevaron a cabo por triplicado. Para la forma cristalina, la transición de estado sólido a estado líquido se define como la temperatura de fusión (Tf), mientras que para la forma no cristalina se define como la temperatura de transición vítrea (Tg). En la tabla se informa los valores medidos expresados tanto en °C Celsius como en °K Kelvin.

Tabla 3: puntos de fusión del ácido obeticólico (Forma 1 y Forma F) y CDCA y UDCA

Resultados:

Los valores obtenidos para CDCA y UDCA concuerdan con los informados anteriormente, en donde el punto de fusión de UDCA es superior al de CDCA. La temperatura de transición vítrea Tg de la Forma 1 (102-112°C) es inferior a la temperatura de punto de fusión Tf de la Forma F (120-124°C). Dicho patrón observado concuerda con los datos anteriormente informados al comparar las dos formas en estado sólido. La Forma F presenta una transición adicional a una temperatura más elevada (235-237°C).

La proporción entre la temperatura de punto de fusión más alta y la temperatura de transición vítrea expresada en grados Kelvin es bastante similar a la de otros fármacos y otros ácidos biliares. (J. Kerc et al. Thermochim. Acta, (248) 81-95, 1995).

Análisis de calorimetría de barrido diferencial

Se llevó a cabo un análisis de calorimetría diferencial de barrido (DSC) para definir mejor los puntos de fusión y el estado físico de las formas cristalinas y no cristalinas del ácido obeticólico. El instrumento utilizado fue un Mettler Toledo DSC modelo 821e. Se sometieron a análisis aproximadamente 4 a 5 mg de cada Forma 1 y Forma F. Los compuestos se expusieron al intervalo de temperaturas de 30°C a 300°C a 10°C/min de tasa de calentamiento. La figura 39 muestra la curva de DSC obtenida para el ácido obeticólico Forma F cristalino. Se detectó una transición endotérmica en 120,04°C correspondiente al punto de fusión del compuesto. Dicho resultado se confirmó mediante microscopía de platina caliente (HSM); en el intervalo de 30°C a 240°C, la transición sólido-líquido observada se encontraba en 122-124°C. En el registro de DSC, la forma e intensidad del pico obtenido para la Forma F concordaban con el comportamiento típico mostrado por las formas cristalinas. Sin embargo, la anchura del pico es bastante amplia; ello puede deberse a cristales no homogéneos. El análisis termogravimétrico (TGA) no mostró ninguna pérdida de peso en el intervalo de temperaturas de 30°C a 300°c.

La figura 40 muestra la curva de DSC obtenida para el ácido obeticólico Forma 1 no cristalino. Se observó una transición endotérmica en 79,95°C. La forma e intensidad del pico concuerdan con el comportamiento esperado de los compuestos no cristalinos. Para dichas sustancias, la energía requerida para la transición sólido-líquido (transición vítrea) es inferior que para los compuestos cristalinos. El termograma no mostró ninguna pérdida de peso en el intervalo de temperaturas de 30°C a 300°c.

Solubilidad en agua

La solubilidad en agua del ácido obeticólico Forma 1 (no cristalino) y la Forma F cristalina se midió siguiendo procedimientos conocidos de la técnica. Brevemente, se suspendió el sólido en agua a un pH bajo (Hcl 0,1 moles/l) y se dejó que se equilibrase a 25°C durante una semana bajo agitación suave. La solución saturada se filtró y la concentración del compuesto en solución se midió mediante HPLC-ES-EM/EM.

Resultados:

La Forma 1 presenta una solubilidad más elevada: 17,9 |jmoles/l vs. 9,1 |jmoles/l para la Forma F.

Según los datos de biodisponibilidad del ácido obeticólico, la Forma F cristalina es superior a la del ácido obeticólico Forma 1 (no cristalino). A pesar de un pico más temprano de concentración plasmática tras la administración de la Forma 1, los perfiles plasmáticos muestran que la Forma F resulta absorbida más eficientemente (AUC más elevada) e incluso la cinética es más uniforme, reflejando una distribución óptima del fármaco en el contenido intestinal. La Forma 1 muestra dicho pico temprano, seguido de un segundo pico posterior con una Cmax inferior a la de la Forma F. La solubilidad en agua de la Forma 1 es superior a la de la Forma F. La Forma F aparentemente es estable, ya que el análisis termogravimétrico (TGA) no mostró ninguna pérdida de peso en el intervalo de temperaturas estudiado. Según dichos resultados, la Forma F, al administrarse por vía oral, aparentemente resulta más eficientemente absorbida por el intestino y asimilada por el hígado. La tasa de formación del metabolito hepático principal tauroconjugado es prácticamente el doble para la Forma F que para la Forma 1, sugiriendo un transporte y acumulación más eficientes en la circulación enterohepática y la concentración plasmática tras 3 horas.

Ejemplo 8: preparación de ácido obeticólico marcado radioactivamente

Se preparó ácido obeticólico marcado radioactivamente según el esquema a continuación.

Esquema 5

= 14C

Se registraron los espectros de RMN en solución de CDCI3 y MeOD-d4 en tubos de DE 5 mm (Norell, Inc. 507-HP) a 30°C y se recogieron en un Varían VNMRS-400 a 400 MHz para el 1H. Los desplazamientos químicos (8) son respecto al tetrametilsilano (TMS=0,00 ppm) y se expresan en ppm. Se realizó la CL-EM/EM en un espectrómetro de masas con trampa iónica Accela-Thermo Finnigan LCQ Fleet operando en modo de ionización EST(-). Se realizó la HPLC en un Agilent 1200 series (columna: Xterra MS C8, 250 x 4,6 mm, 5 pm, 40°C) en línea p-Ram. Se obtuvo la actividad específica en un LSA (analizador de centelleo líquido, Perkin Elmer, Tri-Carb 2900TR).

Preparación de compuesto 2X

A una solución de diisopropilamina (1,59 g, 15,8 mmoles) en THF seco (6,0 ml) se añadió n-BuLi (6,30 ml, 2,5 M, 15,8 mmoles) a -20°C. Tras agitar la mezcla de reacción durante 1 h a -20°C, enfriarla a -78°C y añadir TMSCl (1,72 g, 15,8 mmoles) seguido de compuesto 1X (3,00 g, 6,29 mmoles) en THF seco (6,0 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 1 h a -78°C, se desactivó mediante la adición de NaHCO3 y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. Se separó la capa orgánica y se concentró al vacío, proporcionando el compuesto 2X (3,29 g, 95%) y se utilizó para la etapa siguiente sin purificación adicional.

Preparación de compuesto 3X

El [1-14C]octaldehído (330 mCi, 5,63 mmoles) (preparado a partir de [14C]BaCO3, SA=58,6 mCi/mmoles) en tolueno (1,0 ml) y acetaldehído (130 mg, 2,95 mmoles) en DCM (2,0 ml) se mezclaron a -78°C y después se transfirieron a una solución de compuesto 2X (3,29 g, 6,00 mmoles) en DCM (13,0 ml) seguido de la adición de BF3'OEt2 (1,05 g, 7,40 mmoles) a -78°C. Tras agitar durante 1 h a -78°C, se dejó que la mezcla de reacción se calentase a 35°C y se agitó durante 1 h a la temperatura anteriormente indicada. La reacción se desactivó mediante la adición de agua (10 ml), se extrajo la capa acuosa con DCM, se secó la capa orgánica agrupada sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía de columna en SO 2 (hexano: EtOAc=5:1 a 3:1), proporcionando el compuesto 3X (102 mCi, 31%, SAW 37,0 mCi/mmoles) en forma de un sólido blanco.

RMN-1H (CDCl3, Varian, 400 MHz): 80,65 (3H, s); 0,93 (3H, d, J= 6,0 Hz), 1,01 (3H, s), 1,06-1,49 (12H, m), 1,62-2,04 (7H, m), 1,69 (3H, d, J= 6,8 Hz), 2,18-2,28 (2H, m), 2,32-2,43 (2H, m), 2,58 (1H, dd, J= 12,8, 4,0 Hz), 3,62-3,70 (1H, m), 3,67 (3H, s), 6,18 (1H, q, J= 6,8 Hz).

Preparación de compuesto 4X

A una solución de compuesto 3X (102 mCi, 2,75 mimóles) en MeOH (6,0 ml) se añadió NaOH (220 mg, 5,50 mimóles) en H2O (3,0 ml) a temperatura ambiente. Tras agitar la mezcla de reacción durante 1 h a 45°C, y enfriarla hasta la temperatura ambiente, se eliminó el MeOH bajo presión reducida y se diluyó con H2O (12 ml). Se acidificó la capa acuosa con H3PO4, se extrajo con DCM y la capa orgánica se concentró al vacío. El residuo se suspendió en Et2O y el precipitado se recogió mediante filtración, proporcionando el compuesto 4X (86,3 mCi, 85%) en forma de un sólido blanco.

RMN-1H (CDCl3, Varian, 400 MHz); 80,63 (3H, s), 0,92 (3H, d, J= 6,0 Hz), 0,99 (3H, s), 1,04-1,50 (13H, m), 1,61-2,01 (7H, m), 1,67 (3H, d, J= 7,2 Hz), 2,21-2,28 (2H, m), 2,35-2,41 (2H, m), 2,56 (1H, dd, J= 12,8, 4,0 Hz), 3,58-3,69 (1H, m), 6,16 (1H, q,J= 7,2 Hz).

Preparación de compuesto 5X

La mezcla de compuesto 4X (86,3 mCi, 2,35 mmoles) y Pd/C al 5% (100 mg) en solución aq. 0,5 M de NaOH (10 ml, 5,0 mmoles) se agitó durante 10 h a temperatura ambiente bajo una atmósfera de H2 (balón) y después se agitó durante 14 h a 100°C. El catalizador se separó mediante filtración, se lavó con agua y el filtrado se acidificó con H3PO4. Se recogieron los precipitados mediante filtración, se disolvió el sólido en EtOAc, se lavó con solución hipersalina, se filtró a través de una almohadilla corta de SiO2 y se concentró al vacío. El sólido residual se recristalizó con EtOAc, proporcionando el compuesto 5X (67,7 mCi, 78%) en forma de un sólido blanco.

RMN-1H (MeOD-d4, Varian, 400 MHz): 80,71 (311, s), 0,75-0,84 (1H, m), 0,81 (3H, t, J = 7,4 Hz), 0,921,01 (1H, m), 0,96 (3H, d, J= 6,4 Hz), 1,06-1,38 (7H, m), 1,25 (3H, s), 1,41-1,96 (1211, m), 2,01-2,05 (1H, m), 2,11-2,24 (2H, m), 2,30-2,37 (1H, m), 2,50 (1H, t, J= 11,4 Hz), 2,80-2,85 (1H, m), 3,42-3,49 (1H, m).

Preparación de ácido [etil-1-14C]obeticólico

A una solución de compuesto 5X (67,7 mCi, 1,83 mmoles) en solución aq. 2 M de NaOH (4,50 ml, 9,00 mmoles) se añadió una solución de NaBH4 (416 mg, 11,0 mmoles) en 1120 (2,0 ml) a 80°C. Tras agitar la mezcla de reacción durante 2 h a 100°C, se añadió agua (6,0 ml) a temperatura ambiente y se acidificó con H3PO4. La capa acuosa se extrajo con DCM, se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró a través de una almohadilla corta de SiO2 y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía de columna en SiO2 (hexano:EtOAc=1:1 a 1:3), proporcionando el producto (44,0 mCi, 65%) en forma de un sólido blanco. El producto (44,0 mCi, 1,19 mmoles) y ácido obeticólico (120 mg, 0,285 mmoles) se disolvieron en EtOAc (4 ml); la solución se agitó durante 2 h a 50°C y después se concentró al vacío. El aceite residual se suspendió en Et2O y el precipitado se recogió mediante filtración, proporcionando el ácido [etil-1-14C]obeticólico (560 mg, 38,5 mCi, SA=29 mCi/mmol) en forma de un sólido blanco. RMN-1H (CDCl3, Varian, 400 MHz): 80,66 (3H, s), 0,88 (311, s), 0,93 (3H, t, J = 7,2 Hz), 0,93 (3H, d, I = 6,4 Hz), 0,96 1,04 (1H, m), 1,08-1,52 (14H, m), 1,51-1,60 (1011, m), 2,22-2,30 (111, m), 2,36-2,44 (1H, m), 3,38-3,45 (111, m), 3,71 (IH, s). CL-EM/EM (EM: LCQ Fleet): EM calc.: 421,56; EM observado: 421,07 [M-H]-.

Radio-TLC: placa de TLC de sílice 60 F254 y la fase móvil es EtOAc. La pureza radioquímica era de 98,90%, Rf=0,675 HPLC (Agilent 1200 series): fase móvil: acetonitrilo: tampón de fosfato 5 mM (pH=3):MeOH=450:450:100 La pureza radioquímica era de 98,19% (p-ram), Rt=20,00 min.

El ácido etil-1-14C]obeticólico presenta la fórmula molecular 14C-|C25H44O4 y un peso molecular de 421,46 a la actividad específica de 29 mCi/mmol según la LSC.

Claims

REIVINDICACIONES

i . Procedimiento para la preparación de ácido obeticólico no cristalino, que comprende las etapas de:

a) la reacción de ácido 3a-hidroxi-6a-etil-7-ceto-5p-colán-24-oico con NaBH4 a una temperatura de entre aproximadamente 85°C y aproximadamente 110°C en una solución acuosa básica para formar ácido obeticólico,

b) el enfriamiento de la mezcla a aproximadamente 80°C y la transferencia de la misma a un reactor bajo enfriamiento, seguido de enfriamiento de la mezcla que contiene el ácido obeticólico hasta una temperatura de entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 60°C,

c) la adición de acetato de n-butilo y un ácido a la mezcla,

d) la separación de la fase orgánica que contiene el ácido obeticólico y la concentración de la fase orgánica mediante destilación para formar un residuo,

e) opcionalmente la adición de acetato de n-butilo al residuo y nuevamente la concentración mediante destilación,

f) la adición de acetato de n-butilo al residuo, seguido del enfriamiento lento,

g) la cristalización del ácido obeticólico,

h) el aislamiento de ácido obeticólico cristalino,

i) el lavado del ácido obeticólico cristalino resultante con acetato de n-butilo,

j) el secado del ácido obeticólico cristalino al vacío, y

k) la conversión del ácido obeticólico cristalino en ácido obeticólico no cristalino.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende la etapa de:

hacer reaccionar ácido E-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico con Pd/C y gas hidrógeno para formar ácido 3a-hidroxi-6a-etil-7-ceto-5p-colán-24-oico.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, que comprende la etapa de:

hacer reaccionar metil-éster de ácido E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico con NaOH para formar ácido E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el ácido E-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico se cristaliza utilizando etanol para formar ácido E-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4, que comprende además la etapa de:

hacer reaccionar metil-éster de ácido 3a,7-ditrimetilsililoxi-5p-col-6-en-24-oico con CH3CHO para formar metil-éster de ácido E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, que comprende además la etapa de:

hacer reaccionar metil-éster de ácido 3a-hidroxi-7-ceto-5p-colán-24-oico con Li[N(CH(CH3)2)2] y Si(CH3)3Cl para formar metil-éster de ácido 3a,7-ditrimetilsililoxi-5p-col-6-en-24-oico.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, que comprende además la etapa de:

hacer reaccionar ácido 3a-hidroxi-7-ceto-5p-colán-24-oico con CH3OH y H2SO4 para formar metil-éster de ácido 3a-hidroxi-7-ceto-5p-colán-24-oico.
8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en el que se hace reaccionar ácido E-3ahidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico con Pd/C y gas hidrógeno para formar ácido 3a-hidroxi-6a-etil-7-ceto-5p-colán-24-oico a una temperatura de entre aproximadamente 90°C y aproximadamente 110°C.
9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, en el que se hace reaccionar metil-éster de ácido E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico con NaOH para formar ácido E- o E/Z-3a-hidroxi-6-etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico a una temperatura de entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 60°C.
10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en el que se hace reaccionar metil-éster de ácido 3a,7-ditrimetilsililoxi-5p-col-6-en-24-oico con CH3CHO para formar metil-éster de ácido E/Z-3a-hidroxi-6- etilidén-7-ceto-5p-colán-24-oico en un solvente aprótico polar a una temperatura de entre aproximadamente -50°C y aproximadamente -70°C en presencia de BF3.
11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en el que se hace reaccionar metil-éster de ácido 3a-hidroxi-7-ceto-5p-colán-24-oico con Li[N(CH(CH3)2)2] y Si(CH3)3Cl para formar metil-éster de ácido 3a,7-ditrimetilsililoxi-5p-col-6-en-24-oico en un solvente aprótico polar a una temperatura de entre aproximadamente -10°C y aproximadamente -30°C.
12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en el que, en la reacción de ácido 3a-hidroxi-7- ceto-5p-colán-24-oico con CH3OH y H2SO4 para formar metil-éster de ácido 3a-hidroxi-7-ceto-5p-colán-24 oico, la mezcla de reacción se calienta durante aproximadamente 3 horas, y el pH de la mezcla de reacción se ajusta con una solución acuosa básica a un valor de pH de entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 8,0.