ES2714383T3 - Vacuna TB contra la tuberculosis para impedir la reactivación - Google Patents
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Abstract
Vacuna para la utilización en el bloqueo de la reactivación de la tuberculosis en individuos con infección latente por M. tuberculosis, que comprende un antígeno que se expresa constitutivamente durante la infección por M. tuberculosis o un ácido nucleico codificante de dicho antígeno, en el que el antígeno, perteneciente al sistema de excreción ESX-1, se selecciona del grupo que consiste en: i) ESAT6, CFP10, Rv3614c, Rv3615c, EspR, Rv3868, Rv3869, Rv3870, Rv3871, Rv3872, Rv3873, Rv3876, Rv3877, Rv3878, Rv3879c, Rv3880c, Rv3881c, Rv3882c, Rv3883c y Rv3865, ii) una parte inmunogénica que comprende un epítopo de una célula B o célula T de cualquiera de las secuencias en (i), y iii) un análogo de secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a cualquiera de las secuencias en (i) o (ii) y siendo simultáneamente inmunogénica mediante el bloqueo de la reactivación de la infección latente de tuberculosis al administrarla como vacuna terapéutica.
Description
DESCRIPCION
Vacuna TB contra la tuberculosis para impedir la reactivacion
Campo de la invencion
La presente invencion da a conocer una vacuna que puede administrate en individuos con infeccion latente para impedir la reactivacion de la infeccion latente de tuberculosis causada por una especie del complejo tuberculosis de microorganismos (Mycobacterium tuberculosis, M. bovis y M. africanum) utilizando como diana antfgenos expresados constitutivamente, tales como ESAT6, CFP10 y otros antfgenos del sistema de excrecion ESX-1.
Antecedentes generales
La tuberculosis humana es causada por Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) es un problema sanitario global grave, responsable de aproximadamente 3 millones de muertes al ano, segun la OMS. La incidencia mundial de nuevos casos de tuberculosis (TB) ha cafdo durante la decada de los 1960 y 1970, aunque durante las ultimas decadas esta tendencia ha cambiado marcadamente en parte debido a la aparicion del SIDA y las cepas resistentes a multiples farmacos de M. tuberculosis.
Los organismos del complejo tuberculosis pueden causar una diversidad de enfermedades, aunque la via de invasion mas comun es mediante inhalacion de las bacterias. Esto inicia una infeccion en el pulmon, que finalmente puede extenderse a otras partes del cuerpo. Normalmente, esta infeccion presenta un crecimiento restringido por el sistema inmunologico, por lo que la mayona de individuos infectados muestra pocos indicios, aparte de la tos y la fiebre, que finalmente disminuye. Aproximadamente el 30% de los individuos no pueden contener la infeccion y desarrollan la enfermedad primaria, que en muchos casos finalmente demostrara ser fatal. Sin embargo, se cree que incluso aquellos individuos que aparentemente controlan la infeccion siguen infectados, probablemente durante el resto de su vida. Ciertamente los individuos que se han mantenido sanos durante anos o incluso decadas pueden desarrollar subitamente tuberculosis, que ha demostrado estar causada por el mismo organismo por el que fueron infectados hace muchos anos anteriormente. M. tuberculosis y otros organismos del complejo TB son unicos en que las micobacterias pueden evitar la respuesta inmunologica y sobrevivir durante periodos prolongados de un estadio refractario no replicante o de replicacion lenta. A esto se denomina TB latente y actualmente es un problema sanitario global muy significativo que se estima que afecta a aproximadamente 1/3 de la poblacion mundial (Anon., 2001).
La unica vacuna actualmente disponible para el uso clmico es la BCG, una vacuna cuya eficacia sigue siendo controvertida. Aunque la BCG funciona consistentemente bien en modelos animales de infeccion primaria, claramente no ha conseguido controlar la epidemia de TB. En coherencia con ello, la vacunacion de BCG aparentemente proporciona proteccion frente a la TB pediatrica (que se debe a infeccion primaria), ofreciendo simultaneamente poca o ninguna proteccion frente a la enfermedad adulta (que con frecuencia es la reactivacion de la infeccion latente adquirida en la infancia). Tambien se ha demostrado que la vacunacion de los individuos actualmente sensibilizados a micobacterias o con infeccion latente resulta ineficaz.
El curso de una infeccion por M. tuberculosis transcurre esencialmente en 3 fases, tal como se ilustra en la figura 1. Durante la etapa aguda, las bacterias proliferan en los organos, hasta que la respuesta inmunologica se incrementa hasta el punto en que puede controlar la infeccion, despues de los cual la carga bacteriana alcanza un pico y empieza a declinar. Despues de lo anterior, se establece una etapa latente en que la carga bacteriana se mantiene estable a un nivel bajo. En esta etapa actualmente se cree que M. tuberculosis pasa de la multiplicacion activa a un estado de latencia, convirtiendose esencialmente en no replicante y permaneciendo en el interior del granuloma.
Sin embargo, recientemente se ha puesto de manifiesto que incluso en el estadio de infeccion caracterizado por un numero bacteriano constantemente bajo, por lo menos parte de la poblacion bacteriana se mantiene en un estado de metabolismo activo (Talaat A.M. et al., 2007). Por lo tanto, estas bacterias sobreviven, mantienen un metabolismo activo y se replican frente a una fuerte respuesta inmunologica. Por lo tanto, en el individuo infectado existe un equilibrio entre las bacterias no replicantes (que puede resultar muy diffcil de detectar por el sistema inmunologico, ya que se localizan intracelularmente) y las bacterias lentamente replicantes que presentan un perfil de expresion activo aunque modificado, en un intento de adaptacion al medio hostil del huesped inmune. Las bacterias en este estadio tipicamente no son la diana de la mayona de las vacunas preventivas que actualmente se estan desarrollando en el campo de la TB, tal como ejemplifica la falta de actividad al administrar vacunas preventivas clasicas en animales experimentales infectados latentemente (Turner, 2000).
En algunos casos, el equilibrio se inclina en favor del patogeno y la infeccion entra en la etapa de reactivacion, en la que las bacterias empiezan a replicarse rapidamente y se incrementa el numero de bacterias en el individuo infectado. Las bacterias que se replican en individuos infectados latentemente bajo una presion inmunologica muy fuerte son la diana para la estrategia de vacunacion en la presente invencion. Las bacterias en este estadio infectivo latente tipicamente no son la diana de la mayona de las vacunas preventivas que actualmente se estan desarrollando en el campo de la TB, tal como ejemplifica la falta de actividad al administrar vacunas preventivas clasicas en animales experimentales infectados latentemente (Turner, 2000). Lo anterior no resulta inesperado, ya que actualmente es
conocido que una respuesta inmunologica fuerte del huesped resulta en la regulacion negativa de muchos antigenos, tal como el antigeno de vacuna preventiva mayor Ag85 y PstS (Rogerson B.J. et al., 2006). Para Ag85B se ha demostrado que despues de la infeccion se produce un incremento transitorio inicial de la expresion de Ag85B aunque ya dos semanas despues de la infeccion, el nivel de expresion bacteriana de Ag85B ha cafdo de 0,3 transcritos por UFC de M. tb. durante el periodo del maximo a 0,02 transcritos por UFC, y este nivel bajo se mantiene por lo menos hasta 100 dfas despues de la infeccion. De esta manera, en cualquier punto temporal despues de la semana 2 de infeccion, menos de 2% de las bacterias expresan activamente Ag85B (ibid.). La baja expresion de Ag85B esta soportada por una rapida cafda del numero de celulas T capaz de generar IFN-g en respuesta a Ag85B en el pulmon 3 semanas despues de la infeccion o posteriormente.
En contraste, algunos antigenos se expresan mas establemente (constitutivamente) durante todas las diferentes etapas de la infeccion y un ejemplo de ello es ESAT6. T ras la etapa inicial de infeccion, el nivel de expresion de ESAT-6 se estabiliza en 0,8 transcritos por UFC de M. tuberculosis. Este es un nivel de transcripcion mucho mas elevado que para Ag85B y este nivel se mantiene establemente durante por lo menos 100 dfas despues de la infeccion (Rogerson B.J. et al., 2006). Nuevamente los datos de transcripcion estan apoyados por datos inmunologicos que muestran un reconocimiento fuerte por parte de las celulas T de ESAT-6 en los estadios posteriores de infeccion en el sitio de la infeccion (ibid.). Este patron de expresion constitutiva es una caractenstica importante que ilustra que estas moleculas satisfacen funciones esenciales de crucial importancia para el patogeno, funciones que dependen de genes que necesitan expresarse constitutivamente para que el patogeno sobreviva en el huesped inmunologico. Estas moleculas son la base para la presente invencion y son antfgenos particularmente importantes para vacunas administradas en individuos con infeccion latente, ya que presentan como dianas todos los estadios del ciclo de vida bacteriano y, por lo tanto, presentan la base mas amplia posible de actividad. Lo anterior es diferente del pensamiento actual, que se ha centrado en identificar los antfgenos regulados positivamente por las micobacterias durante la persistencia no replicante (Andersen, P. 2007, WO02048391, WO04006952, Lin MY y Ottenhoff TH, 2008; Leyten EM. et al. 2006). Aunque tales antfgenos se encuentran regulados positivamente durante la persistencia no replicante, pueden no encontrarse disponibles para el reconocimiento inmunologico, ya que las cantidades disponibles de las bacterias no replicantes son inferiores a un umbral razonable para la deteccion o para la induccion de funciones efectoras inmunologicas protectoras.
En contraste, varias protemas del sistema de secrecion de ESX-1 se ha demostrado que son altamente inmunogenicas y se expresan a niveles elevados. ESX-1 se encuentra conservado en varias micobacterias patogenicas e implicado en la virulencia de bacilos tuberculosos. La contribucion de las protemas ESX-1 individuales en la secrecion de ESAT-6, CFP10 y EspA ha sido bien documentada (Pym A.S. et al., 2003; Guinn K.I. et al., 2004; Stanley, S.A. et al., 2003; Brodin, P. et al. 2006; MacGurn JA et al. 2005; Raghavan, S. et al. 2008) y la funcion de las moleculas efectoras se ha demostrado que es la lisis membranal, el escape del fagosoma y la expansion bacteriana (Gao L.Y. et al., 2004; Smith J. et al., 2008).
La naturaleza total de la respuesta inmunologica que controla la infeccion latente y los factores que conducen a la reactivacion en gran medida se desconocen. Sin embargo, existe cierta evidencia de un desplazamiento en los tipos celulares dominantes responsables. Aunque las celulas T CD4 son esenciales y suficientes para el control de la infeccion durante la etapa aguda, los estudios sugieren que las respuestas de las celulas T CD8 son mas importantes en la etapa latente (van Pinxteren L.A. et al., 2000).
Tal como apreciara facilmente el experto en la materia, la expresion de un gen no resulta suficiente para convertirlo en un buen candidato a vacuna. La unica manera de determinar si una protema resulta reconocida por el sistema inmunologico durante la infeccion latente con M. tuberculosis es producir la protema dada y someterla a ensayo en un ensayo apropiado tal como se indica en la presente memoria. A este respecto, el grupo de los presentes inventores ha demostrado que los antfgenos expresados fuertemente por micobacterias, tales como ESAT-6 (por sus siglas en ingles, diana antigenica secretoria temprana-6), son reconocidas en individuos en todos los estadios de infeccion y, de hecho, en particular en individuos con infeccion latente (Boesen, Ravn y Doherty, 2002). Sin embargo, las celulas T espedficas de ESAT-6 durante la infeccion natural son, aunque pueden encontrarse presentes en un gran numero, practicamente en exclusividad del fenotipo denominado efector, que son celulas T diferenciadas terminalmente con un periodo de vida muy limitado y de baja actividad como celulas T protectoras frente a enfermedades infecciosas (Seder R. et al., 2008). Lo anterior es marcadamente diferente de las denominadas celulas T polifuncionales de alta calidad que son estimuladas por la vacuna que se demuestra en el presente estudio que protege frente a la reactivacion de la TB.
Es muy diferente de las protemas altamente expresadas e inmunogenicas que resultan utiles como vacunas postexposicion debido a que muchas provocan reacciones de hipersensibilidad y, de esta manera, agravan la situacion. Esto se ha demostrado claramente en el ensayo clmico de vacuna original de la tuberculina de Koch. La vacuna se administro como vacuna postexposicion en pacientes que sufnan de diferentes formas de la enfermedad, incluyendo TB cutanea y pulmonar. El ensayo fue totalmente fallido y varios de los pacientes incluidos murieron debido a reacciones severas de hipersensibilidad (Guttstadt, 1891). De los varios cientos de antfgenos que es conocido que se expresan durante la infeccion primaria y sometidas a ensayo como vacunas, menos de media docena han demostrado un potencial significativo. Hasta el momento solo se ha demostrado algun potencial como vacuna postexposicion de un solo antfgeno (Lowrie, 1999). Sin embargo, esta vacuna solo funciono si se administraba como vacuna de ADN, una tecnica experimental hasta ahora no aprobada para el uso humano. Ademas, la tecnica ha
demostrado ser controvertida, y otros grupos afirman que la vacunacion mediante este protocolo induce proteccion no espedfica o incluso agrava la enfermedad (Turner, 2000).
El documento n° WO 2004/006952 A1 da a conocer una vacuna terapeutica contra la infeccion latente o activa de tuberculosis, que comprende un antigeno polipeptidico inducido bajo condiciones de poco oxfgeno.
Henao-Tamayo et al., Tuberculosis 89:142-148, 2009, describe un estudio de vacunacion postexposicion en cobayas contra Mycobacterium tuberculosis. Se concluyo que la vacunacion del presente estudio podfa retrasar inicialmente el proceso de la enfermedad, aunque el efecto fue transitorio.
Por lo tanto, una estrategia de vacunacion postexposicion eficaz para proteger individuos infectados frente a la reactivacion de la enfermedad resulta altamente deseable.
Descripcion resumida de la invencion
La invencion se refiere a tratar las infecciones causadas por especies del complejo tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis, M. bovis, M. africanum) por una vacuna que puede administrarse en individuos con infeccion latente para evitar la reactivacion de la infeccion latente de tuberculosis causada por especies de los microorganismos del complejo tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis., M.bovis, M.africanum), al utilizar como diana antigenos expresados constitutivamente, tales como ESAT6 y CFP10. ESAT6 y CFP10 se requieren todas interdependientemente para la secrecion y todos pertenecen al sistema de secrecion ESX-1, que es conocido que resulta esencial para la virulencia. Estos antigenos secretados resultan cruciales para la diseminacion bacteriana y lisis de las membranas celulares. ESAT6 Y CFP10 tambien son antigenos que se expresan constitutivamente en los diferentes estadios de la enfermedad, mientras que, p.ej., la expresion de Ag85 se regula negativamente poco despues de la infeccion. Inesperadamente, los antigenos expresados constitutivamente inmunogenicos evitan la reactivacion de la infeccion latente de tuberculosis al administrarlos como vacuna postexposicion, manteniendo de esta manera la infeccion en estado latente.
Exposicion detallada de la invencion
La invencion da a conocer una vacuna o composicion inmunogenica que se administra postexposicion en individuos con infeccion latente, que evita la reactivacion de la tuberculosis, que comprende un antfgeno que se expresa constitutivamente durante la infeccion por M. tuberculosis o un acido nucleico codificante de dicho antfgeno.
La invencion se refiere en particular a una vacuna para la utilizacion en el bloqueo de la reactivacion de la tuberculosis en individuos con infeccion latente por M. tuberculosis, que comprende un antfgeno que se expresa constitutivamente durante la infeccion por M. tuberculosis o un acido nucleico codificante de dicho antfgeno, en el que el antfgeno, perteneciente al sistema de excrecion ESX-1, se selecciona del grupo que consiste en:
i) ESAT6, CFP10, Rv3614c, Rv3615c, EspR, Rv3868, Rv3869, Rv3870, Rv3871, Rv3872, Rv3873, Rv3876, Rv3877, Rv3878, Rv3879c, Rv3880c, Rv388lc, Rv3882c, Rv3883c y Rv3865,
ii) una parte inmunogenica que comprende un epftopo de una celula B o celula T de cualquiera de las secuencias en (i), y
iii) un analogo de secuencia de aminoacidos que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a cualquiera de las secuencias en (i) o (ii) y siendo simultaneamente inmunogenica mediante el bloqueo de la reactivacion de la infeccion latente de tuberculosis al administrarla como vacuna terapeutica.
Preferentemente, la composicion comprende antfgenos expresados constitutivamente, pertenecientes al sistema de excrecion ESX-1, ESAT6, CFP10, Rv3614c, Rv3615c, EspR, Rv3868, Rv3869, Rv3870, Rv3871, Rv3872, Rv3873, Rv3876, Rv3877, Rv3878, Rv3879c, Rv3880c, Rv3881c, Rv3882c, Rv3883c, Rv3865c o una parte inmunogenica, p.ej., un epftopo de celula T, de cualquiera de dichas secuencias o un analogo de secuencia de aminoacidos que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a cualquiera de las secuencias, siendo simultaneamente inmunogenico.
En la presente memoria se describe ademas una composicion que comprende una mezcla de partes inmunogenicas preferentemente seleccionadas del grupo que consiste en la SEC ID n° 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 y 31.
Otra realizacion de la invencion es una composicion en la que dichos polipeptidos se fusionan con un antfgeno expresado por bacterias dentro de la familia de las micobacterias, preferentemente en donde la pareja de fusion es un antfgeno que se expresa constitutivamente. Una protema de fusion preferente comprende Es a T6 fusionado con CFP10.
La composicion segun la invencion preferentemente comprende un sistema de administracion adicional seleccionado de vacunas recombinantes vivas, es decir, organismos geneticamente modificados, tales como bacterias o virus que expresan genes micobacterianos, o sistemas de administracion inmunogenicos, tales como vacunas de ADN, que son
plasmidos que expresan genes o fragmentos genicos para las protemas indicadas anteriormente, o vacunas de protemas, es decir, las protemas mismas o peptidos sinteticos derivados de las protemas mismas administradas en un sistema de administracion, tal como un adyuvante. El adyuvante preferentemente se selecciona del grupo que consiste en bromuro de dimetildiocta-decilamonio (DDA), Quil A, poli I:C, hidroxido de aluminio, adyuvante incompleto de Freund, IFN-y, IL-2, IL-12, monofosforil Upido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM), dibehenato de trehalosa y dipeptido muramilo (DPM), todavfa mas preferentemente un adyuvante que estimula una respuesta de celulas T polifuncionales, tales como DDA/TDB y IC31.
El adyuvante mas preferente comprende DDA/TDB y/o poli I:C. Alternativamente, la secuencia de aminoacidos se lipida de manera que produzca un efecto autoadyuvante del polipeptido.
La invencion da a conocer ademas antigenos descritos anteriormente para la utilizacion en el tratamiento de la tuberculosis latente y el bloqueo de la reactivacion de la infeccion.
Un metodo se da a conocer ademas para tratar un animal, incluyendo un ser humano, contra la reactivacion de la infeccion de tuberculosis causado por micobacterias virulentas, p.ej., por Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum o Mycobacterium bovis, que comprende administrar en el animal la vacuna o composicion inmunogenica indicada anteriormente, en el que dicha vacuna o composicion inmunogenica se administra postinfeccion, tal como durante o despues de la infeccion de estadio agudo y/o durante la infeccion de estadio latente.
El metodo puede comprender una etapa de identificacion de un sujeto con infeccion latente con una micobacteria virulenta, p.ej., mediante un procedimiento diagnostico, tal como la prueba cutanea de tuberculina de Mantoux (TST), el ensayo QuantiFERON, la deteccion in vitro de respuestas a HBHa o la deteccion de IP10 tras la estimulacion con un antfgeno expresado constitutivamente.
Se da a conocer ademas la utilizacion de un antfgeno indicado anteriormente para la fabricacion de una vacuna postexposicion o composicion inmunogenica contra la reactivacion de infecciones latentes causadas por especies del complejo tuberculosis, p.ej., Mycobacterium tuberculosis, M. bovis y M. africanum, en el que dicha vacuna o composicion inmunogenica es para la administracion postinfeccion, tal como durante o despues de la infeccion de estadio aguda y/o durante el estadio latente, que comprende una o mas partes inmunogenicas indicadas anteriormente.
El exito de Mycobacterium como patogeno se debe al modo complejo en que interactua con su huesped: un proceso controlado en parte por el sistema bacteriano especializado de secrecion de protemas ESX-1. El sistema ESX-1 administra protemas bacterianas (p.ej., ESAT-6, CFP10 y EspA) en celulas huesped y resulta crucial para la virulencia. Tras ser secretada a partir de los bacilos, la protema ESAT-6 forma poros en la membrana fagosomica, permitiendo que los bacilos escapen al interior del citosol desde su confinamiento en el fagosoma y facilita de esta manera la expansion celula a celula.
Este patron de expresion constitutiva es una caractenstica importante que ilustra que estas moleculas satisfacen funciones esenciales de crucial importancia para el patogeno, funciones que dependen de genes que necesitan expresarse constitutivamente para que el patogeno sobreviva en el huesped inmunologico. Estas moleculas son la base para la presente invencion y son antfgenos particularmente importantes para vacunas administradas en individuos con infeccion latente, ya que presentan como dianas todos los estadios del ciclo de vida bacteriano y, por lo tanto, presentan la base mas amplia posible de actividad.
ESAT6, CFP10 y EspA resultan necesarios interdependientemente para la secrecion y todos pertenecen al sistema de secrecion ESX-1, que es conocido que resulta esencial para la virulencia. Estos antfgenos secretados resultan cruciales para la diseminacion bacteriana y lisis de las membranas celulares. ESAT6, CFP10 y EspA tambien son antfgenos que se expresan constitutivamente en los diferentes estadios de la enfermedad, mientras que, p.ej., la expresion de Ag85 se regula negativamente poco despues de la infeccion. Los antfgenos expresados constitutivamente inmunogenicos evitan la reactivacion de la infeccion latente de tuberculosis al administrarlos como vacuna terapeutica, manteniendo de esta manera la infeccion en estado latente.
Definiciones
Celulas T polifuncionales
La expresion celulas T polifuncionales se refiere a celulas T que expresan simultaneamente la totalidad de las citoquinas IFN-y, IL-2, y TNF-a, o IL-2 mas por lo menos una de las dos otras citoquinas IFN-y y TNF-a.
Polipeptidos
El termino “polipeptido” en la presente invencion presenta su significado habitual. Es decir, una cadena de aminoacidos de cualquier longitud, incluyendo una protema de longitud completa, oligopeptidos, peptidos cortos y fragmentos de los mismos, en la que los residuos aminoacidos estan unidos mediante enlaces peptfdicos covalentes.
El polipeptido puede modificarse químicamente mediante glucosilacion, lipidacion (p.ej., mediante lipidacion química con palmitoiloxi succinimida, tal como indican Mowat et al., 1991 o con cloruro de dodecanoilo, tal como indican Lustig et al., 1976), comprendiendo grupos prosteticos, o al contener aminoacidos adicionales, tales como, p.ej., una etiqueta de His o un peptido de senal.
Cada polipeptido puede, de esta manera, caracterizarse por aminoacidos espedficos y estar codificado por secuencias de acido nucleico espedficas. Se entendera que entre tales secuencias se incluyen analogos y variantes producidos mediante metodos recombinantes o sinteticos, en las que tales secuencias polipeptfdicas han sido modificadas mediante sustitucion, insercion, adicion o delecion de uno o mas residuos aminoacidos en el polipeptido recombinante y todavfa ser inmunogenicas en cualquiera de los ensayos biologicos descritos en la presente memoria. Las sustituciones preferentemente son “conservadoras”. Se definen de acuerdo con la tabla a continuacion. Los aminoacidos en el mismo bloque de la segunda columna y preferentemente en la misma lmea en la tercera columna, pueden sustituirse entre sf. Los aminoacidos en la tercera columna se indican en codigo de una letra.
Un polipeptido preferente en la presente invencion es un antfgeno inmunogenico de M. tuberculosis producido al someter el organismo a las tensiones asociadas a la infeccion latente. Dicho antfgeno tambien puede derivarse, por ejemplo, de las celulas de M. tuberculosis y/o el filtrado del cultivo de M. tuberculosis. De esta manera, un polipeptido que comprende una parte inmunogenica de uno de los antfgenos anteriormente indicados puede consistir enteramente de la parte inmunogenica, o puede contener secuencias adicionales. Las secuencias adicionales pueden derivarse del antfgeno nativo de m. tuberculosis o ser heterologas y tales secuencias pueden ser inmunogenicas, aunque ello no resulta necesario.
Cada polipeptido esta codificado por una secuencia espedfica de acido nucleico. Se entendera que entre tales secuencias se incluyen analogos y variantes de las mismas, en las que tales secuencias de acido nucleico han sido modificadas por sustitucion, insercion, adicion o delecion de uno o mas acidos nucleicos. Las sustituciones preferentemente son sustituciones silenciosas en el uso de codones que no conducira a ningun cambio en la secuencia de aminoacidos, pero pueden introducirse para potenciar la expresion de la protema.
En el presente contexto, la expresion “fragmento polipeptfdico sustancialmente puro” se refiere a una preparacion de polipeptidos que contiene como maximo 5% en peso de otro material polipeptido con el que se encuentra nativamente asociado (resultan preferentes porcentajes inferiores de otro material polipeptfdico, p.ej. Como maximo 4%, como maximo 3%, como maximo 2%, como maximo 1% y como maximo 1^%). Resulta preferente que el polipeptido sustancialmente puro sea por lo menos 96% puro, es decir, que el polipeptido constituya por lo menos 96% en peso del material polipeptfdico total presente en la preparacion y resultan preferentes porcentajes mas altos, tales como por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99%, por lo menos 99,2%, por lo menos 99,5% y por lo menos 99,75%. Resulta especialmente preferente que el fragmento polipeptfdico se encuentra en “forma esencialmente pura”, es decir, que el fragmento polipeptfdico se encuentra esencialmente libre de cualquier otro antfgeno con el que se encuentra asociado nativamente, es decir, libre de cualquier otro antfgeno procedente de bacterias pertenecientes al complejo de tuberculosis o una micobacteria virulenta. Lo anterior puede llevarse a cabo mediante la preparacion del fragmento polipeptfdico mediante metodos recombinantes en una celula huesped no micobacteriana, tal como se escribe en detalle posteriormente, o mediante la smtesis del fragmento polipeptfdico mediante metodos bien conocidos de smtesis peptfdica en fase solida o lfquida, p.ej., mediante el metodo descrito por Merrifield o variaciones del mismo. Para el proposito de la presente invencion, se entendera que la definicion anterior de “polipeptido o fragmento polipeptfdico sustancialmente puro” no excluye tales polipeptidos o fragmentos polipeptfdicos en caso de hallarse presentes en combinacion con otros antfgenos purificados o sinteticos de origen micobacteriano o no micobacteriano.
Por la expresion “micobacteria virulenta” se entiende que una bacteria capaz de causar la enfermedad tuberculosa en un animal o en un ser humano. Entre los ejemplos de micobacterias virulentas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, M. tuberculosis, M. africanum y M. bovis. Son ejemplos de animales relevantes, vacas, comadrejas, tejones y canguros.
Por “un individuo infectado” se entiende un individuo con una infeccion demostrada por cultivo o microscopfa por micobacterias virulentas y/o un individuo diagnosticado clmicamente con TB y que es responsable de la quimioterapia anti-TB. El cultivo, la microscopfa y el diagnostico clmico de la TB son bien conocidos por cualquier experto en la materia.
Por la expresion “ individuo positivo para DPP” se entiende un individuo con una prueba de Mantoux positiva o un individuo en que el DPP (derivado de protema purificada) induce una respuesta de recuerdo in vitro positiva determinada por la liberacion de IFN-y.
Por la expresion “individuo con infeccion latente” se entiende un individuo que ha sido infectado por una micobacteria virulenta, p.ej., M. tuberculosis, pero no muestra ningun indicio de tuberculosis activa. Es probable que los individuos que han sido vacunados, p.ej. por BCG, o tratados para TB, todavfa retengan las micobacterias dentro de sus cuerpos, aunque ello actualmente resulta imposible de demostrar ya que tales individuos se esperana que fuesen positivos si se sometieran a ensayo para reactividad de DPP Sin embargo, en su sentido mas exacto, “con infeccion latente” puede utilizarse para describir cualquier individuo que presenta M. tuberculosis que reside en sus tejidos pero que no se encuentra clmicamente enfermo. Un individuo con infeccion latente puede identificarse mediante varios metodos en uso clmico actualmente, tales como la prueba cutanea de la tuberculina de Mantoux (TST), el ensayo QuantiFERON y en el futuro podnan existir medios todavfa mas sensibles de diagnostico de este estadio particular de la infeccion, tales como la deteccion in vitro recientemente sugerida de respuestas a HBHA (Hougardy, 2007) o la deteccion de IP10 tras la estimulacion in vitro con ESAT6 (Ruhwald, 2008).
Por el termino “reactivacion” se entiende la situacion en que el equilibrio entre bacterias no replicantes (que pueden resultar muy diffciles de detectar por el sistema inmunologico, ya que se localizan intracelularmente) y bacterias en replicacion lenta, que presentan un perfil de expresion activo aunque modificado en un intento por adaptarse al medio hostil en el que se encuentran en el huesped inmunologico, se inclina en favor del patogeno y la infeccion entra en la etapa en que las bacterias nuevamente empiezan a replicarse rapidamente y el numero de bacterias en el individuo infectado se incrementa. Las bacterias que se replican en individuos con infeccion latente bajo una presion inmunologica muy fuerte son la diana para la estrategia de vacunacion en la presente invencion.
Por el termino “ IFN-y” se entiende interferon-gamma. La medicion de IFN-y se utiliza como indicacion de una respuesta inmunologica.
Por las expresiones “fragmento de acido nucleico” y “secuencia de acido nucleico” se entiende cualquier molecula de acido nucleico que incluye ADN, ARN, ANB (acidos nucleicos bloqueados), APN, ARN, ARNdc e tubridos de ARN-ADN. Se incluyen ademas moleculas de acidos nucleicos que comprenden nucleosidos no naturales. La expresion incluye moleculas de acidos nucleicos de cualquier longitud, p.ej., de 10 a 10.000 nucleotidos, dependiendo de la utilizacion. En el caso de que la molecula de acidos nucleicos este destinada a la utilizacion como farmaceutico, p.ej., en la terapia de ADN, o para la utilizacion en un metodo para producir un polipeptido segun la invencion, preferentemente se utiliza una molecula codificante de por lo menos un epftopo, con una longitud de aproximadamente 18 a aproximadamente 1.000 nucleotidos, insertando opcionalmente la molecula en un vector.
A lo largo de la presente especificacion, a menos que el contexto requiera lo contrario, el termino "comprende", o variaciones del mismo, tales como "comprende" o "que comprende", se entendera que implican la inclusion de un elemento, numero entero o grupo de numeros enteros indicado, aunque sin excluir ningun otro numero entero o grupo de elementos o numeros enteros.
Los genes expresados constitutivamente se definen como genes que, despues de un analisis detallado del ARNm a nivel poblacional, se expresan igualmente bien in vivo en el pulmon en puntos temporales posteriores a las tres semanas postinfeccion, tras correlacionarse con el numero de UFC de M. tb. en el pulmon. A partir de dicha definicion se infiere que un gen constitutivo puede expresarse diferencialmente en un unico nivel bacteriano. El metodo para cuantificar la expresion genica es la PCR cuantitativa. La expresion “igualmente bien” se define como dentro de /- 5 veces el nivel de la medicion anterior. La comparacion en todos los casos es respecto al punto temporal inmediatamente anterior al presente. El tiempo entre mediciones no puede ser mayor que el tiempo entre la infeccion y la medicion anterior. P.ej., en el caso de que la expresion de un gen se mida en una primera ocasion en la semana 3 postinfeccion, la segunda medicion no puede realizarse despues de 6 semanas postinfeccion y la tercera, 12 semanas postinfeccion, etc.
Los antfgenos expresados constitutivamente son polipeptidos o partes de estos polipeptidos que son productos de genes expresados constitutivamente.
Identidad de secuencias
La expresion “identidad de secuencias” indica una medicion cuantitativa del grado de homologfa entre dos secuencias de aminoacidos de igual longitud o entre dos secuencias de nucleotidos de longitud igual. Las dos secuencias que deben compararse deben alinearse hasta el mejor ajuste posible, permitiendo la insercion de huecos o, alternativamente, el truncado en los extremos de las secuencias de las protemas. La identidad de las secuencias puede calcularse como:
en la que Ndif es el numero total de residuos no identicos en las dos secuencias tras alinearlas y en la que Nref es el numero de residuos en una de las secuencias. Por lo tanto, la secuencia de ADN AGTCAGTC presentara una identidad de secuencia de 75% respecto a la secuencia AATCAATC (Ndif=2 y Nref=8). Un hueco se cuenta como no identidad del residuo o residuos espedficos, es decir, la secuencia de ADN AGTGTC presentara una identidad de secuencia de 75% respecto a la secuencia de ADN AGTCAGTC (Ndif=2 y Nref=8). La identidad de secuencia puede calcularse alternativamente con el programa BLAST, p.ej., el programa BLASTP (Pearson, 1988, o www.ncbi.nlm.nih.gov/cgibin/BLAST). En un aspecto de la invencion, la alineacion se lleva a cabo con el metodo de alineacion de secuencias ClustalW con parametros por defecto tal como indican Thompson J. et al., 1994, disponible en http://www2.ebi.ac.uk/clustalw/.
Un porcentaje mmimo preferente de identidad de secuencia es de por lo menos 80%, tal como de por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99%, y por lo menos 99,5%.
Parte inmunogenica
En una realizacion preferente de la invencion, el polipeptido comprende una parte inmunogenica del polipeptido, tal como un epftopo para una celula B o celula T.
La parte inmunogenica de un polipeptido es una parte del polipeptido que induce una respuesta inmunologica en un animal o en un ser humano, y/o en una muestra biologica determinada mediante cualquiera de los ensayos biologicos indicados en la presente memoria. La parte inmunogenica de un polipeptido puede ser un epftopo de celula T o un epftopo de celula B. Las partes inmunogenicas pueden relacionarse con una o unas pocas partes relativamente pequenas del polipeptido; pueden encontrarse dispersas en toda la secuencia polipeptfdica o situarse en partes espedficas del polipeptido. Para unos cuantos polipeptidos, se ha demostrado que los epftopos se encuentran dispersos en todo el polipeptido cubriendo la secuencia completa (Rawn et al., 1999). Con el fin de identificar los epftopos de celulas T relevantes que son reconocidos durante una respuesta inmunologica, resulta posible utilizar oligopeptidos solapantes para la deteccion de epftopos del CMH de clase II, preferentemente sinteticos, con una longitud de, p.ej., 20 residuos aminoacidos derivados del polipeptido. Estos peptidos pueden someterse a ensayo en ensayos biologicos (p.ej., el ensayo de IFN-y tal como se indica en la presente memoria) y algunos de ellos proporcionara una respuesta positiva (y, de esta manera, ser inmunogenica) como evidencia de la presencia de un epftopo de celula T en el peptido. Para ESAT-6 y CFP10, tales estudios han demostrado que todas las partes del antfgeno contienen epftopos de celulas T (Mustafa et al., 2000; Arend S.M. et al., 2000). Para la deteccion de epftopos del CMH de clase I resulta posible predecir los peptidos que se uniran (Stryhn et al., 1996) y seguidamente producir estos peptidos sinteticamente y someterlas a ensayo en ensayos biologicos relevantes, p.ej., el ensayo de IFN-y tal como se describe en la presente memoria. Los peptidos que preferentemente presentan una longitud de, p.ej., 8 a 11 residuos aminoacidos derivados del polipeptido. Pueden determinarse los epftopos de celula B mediante el analisis del reconocimiento por celulas B de peptidos solapantes que cubren el polipeptido de interes, tal como describen, p.ej., Harboe et al., 1998. En consistencia con esta definicion, puede identificarse una parte inmunogenica de un polipeptido tal como se describe en la presente memoria como parte que induce una respuesta inmunologica, ver la definicion de “respuesta inmunologica” posteriormente en la presente memoria.
Aunque la longitud minima de un epftopo de celula T se ha demostrado que es de por lo menos 6 aminoacidos, resulta normal que tales epftopos esten constituidos de tramos mas largos de aminoacidos. Por lo tanto, resulta preferente que el fragmento polipeptfdico de la invencion presente una longitud de por lo menos 7 residuos aminoacidos, tales como por lo menos 8, por lo menos 9, por lo menos 10, por lo menos 12, por lo menos 14, por lo menos 16, por lo menos 18, por lo menos 20, por lo menos 22, por lo menos 24 y por lo menos 30 residuos aminoacidos. Por lo tanto, en realizaciones importantes del metodo inventivo, resulta preferente que el fragmento de polipeptido presente una longitud de como maximo 50 residuos aminoacidos, tal como, como maximo, 40, 35, 30, 25 y 20 residuos aminoacidos. Se espera que los peptidos con una longitud de entre 10 y 20 residuos aminoacidos demostrara ser mas eficientes como epftopos del CMH de clase II y, por lo tanto, las longitudes especialmente preferentes del fragmento polipeptfdico utilizado en el metodo inventivo son 18, tal como 15, 14, 13, 12 e incluso 11 residuos aminoacidos. Se espera que los peptidos con una longitud de entre 7 y 12 residuos aminoacidos demostrara ser mas eficientes como epftopos del CMH de clase I y, por lo tanto, las longitudes especialmente preferentes del fragmento polipeptfdico utilizado en el metodo inventivo son 11, tal como 10, 9, 8 e incluso 7 residuos aminoacidos.
Las partes inmunogenicas de los polipeptidos pueden ser reconocidas por una amplia parte (frecuencia alta) o por una parte menor (frecuencia baja) de la poblacion humana geneticamente heterogenea. Ademas, algunas partes inmunogenicas inducen respuestas inmunologicas elevadas (dominantes), mientras que otras inducen respuestas mas bajas, aunque significativas (subdominantes). La frecuencia elevada><frecuencia baja puede relacionarse con la parte inmunogenica de union a moleculas de CMH ampliamente distribuidas (tipo HLA) o incluso por multiples moleculas del CMH (Sinigaglia, 1988; Kilgus, 1991).
En el contexto de proporcionar moleculas candidatas para una nueva vacuna contra la tuberculosis, los epftopos subdominantes son, sin embargo, tan relevantes como los epftopos dominantes, ya que se ha demostrado (Olsen, 2000) que tales epftopos pueden inducir proteccion con independencia del hecho de que no resultan tan fuertemente o ampliamente reconocidos.
Variantes
Una caractenstica comun de los polipeptidos de la invencion es su capacidad de inducir una respuesta inmunologica, tal como se ilustra en los ejemplos. Se entiende que una variante de un polipeptido de la invencion producida mediante sustitucion, insercion, adicion o delecion tambien puede ser inmunogenica, segun se determine mediante cualquiera de los ensayos descritos en la presente memoria.
Individuo inmune
Un individuo inmune se define como una persona o un animal, que ha eliminado o controlado una infeccion por micobacterias virulentas o que ha recibido una vacunacion profilactica, tal como la vacunacion con M. bovis BCG.
Respuesta inmunologica
La respuesta inmunologica puede monitorizarse mediante uno de los metodos siguientes:
• una respuesta celular in vitro se determina mediante la induccion de la liberacion de una citoquina relevante, tal como IFN-y, o la induccion de la proliferacion de los linfocitos extrafdos de un animal o ser humano actualmente o previamente infectado por micobacterias virulentas o inmunizados con el polipeptido relevante. La induccion se lleva a cabo mediante la adicion del polipeptido o la parte inmunogenica del polipeptido a una suspension que comprende entre 2x105 celulas y 4x105 celulas por pocillo. Las celulas que se afslan de sangre, bazo, Idgado o pulmon y la adicion del polipeptido o la parte inmunogenica, resultando en una concentracion no superior a 20 |jg por ml de suspension y llevando a cabo la estimulacion durante dos a cinco dfas. Para la monitorizacion de la proliferacion celular, las celulas se pulsan con timidina marcada radioactivamente y despues de 16 a 22 horas de incubacion, se detecta la proliferacion mediante recuento de centelleo ftquido. Se define una respuesta positiva como una respuesta superior al fondo mas dos desviaciones estandar. La liberacion de IFN-y puede determinarse mediante el metodo de ELISA, que es bien conocido por un experto en la materia. Se define una respuesta positiva como una respuesta superior al fondo mas dos desviaciones estandar. Otras citoquinas diferentes de IFN-y podrian ser relevantes al monitorizar la respuesta inmunologica contra el polipeptido, tal como IL-12, TNF-a, IL-4, IL-5, IL-10, IL-6 y TGF-p. Otro metodo mas sensible para detectar la respuesta inmunologica es el metodo ELISpot, en el que se determina la frecuencia de celulas productoras de IFN-y. En una placa de ELIspot (MAHA, Millipore) prerrecubierta con anticuerpos anti-IFN-Y murinos (PharMingen) se incuba una gradacion de numero de celulas aisladas de sangre, bazo o pulmon (tfpicamente entre 1 y 4x105 celulas/pocillo) durante 24 a 32 horas en presencia del polipeptido o la parte inmunogenica, resultando en una concentracion no superior a 20 jg por ml. A continuacion, las placas se incuban con anticuerpos anti-IFN-Y biotinilados, seguido de la incubacion con estreptavidina-fosfatasa alcalina. Las celulas productoras de IFN-y se identifican mediante la adicion de BCIP-NBT (Sigma), dando lugar el sustrato relevante a manchas. Estas manchas pueden enumerarse utilizando un microscopio de diseccion. Tambien resulta posible determinar la presencia de ARNm codificante de la citoquina relevante, mediante la utilizacion de la tecnica de PCR. Habitualmente se mide una o mas citoquinas utilizando, por ejemplo, PCR, ELISPOT o ELISA. El experto en la materia apreciara que puede utilizarse un incremento o reduccion significativo de la cantidad de cualquiera de dichas citoquinas inducidas por un polipeptido espedfico, en la evaluacion de la actividad inmunologica del polipeptido.
• Tambien puede determinarse una respuesta celular in vitro mediante la utilizacion de lrneas de celulas T derivadas de un individuo inmune o de una persona infectada por M. tuberculosis, en donde las lrneas de celulas T se han regulado con micobacterias vivas, extractos de las celulas bacterianas o filtrados de cultivo durante 10 a 20 dfas con la adicion de IL-2. La induccion se lleva a cabo mediante la adicion de no mas de 20 jg de polipeptido por ml de suspension a las lrneas de celulas T que contienen entre 1x105 celulas y 3x105 celulas por pocillo y llevando a cabo la incubacion durante dos a seis dfas. La induccion de IFN-y o liberacion de otra citoquina relevante se detecta mediante ELISA. La estimulacion de las celulas T tambien puede monitorizarse mediante la deteccion de la proliferacion celular utilizando timidina marcada radioactivamente tal como se ha indicado anteriormente. Para ambos ensayos se define una respuesta positiva como una respuesta superior al fondo mas dos desviaciones estandar.
• Puede determinarse una respuesta celular in vivo como una respuesta de hipersensibilidad de tipo retardado (HTR) positiva tras la inyeccion intradermica o la aplicacion local de un parche de como maximo 100 jg del polipeptido o la parte inmunogenica en un individuo que se encuentra clrnica o subclrnciamente infectado con una micobacteria virulenta, presentando una respuesta positiva un diametro de por lo menos 5 mm 72 a 96 horas despues de la inyeccion o aplicacion.
• Se determina una respuesta humoral in vitro por una respuesta espedfica de anticuerpos en un individuo inmune o infectado. La presencia de anticuerpos puede determinarse mediante una tecnica de ELISA o una transferencia
western en la que el polipeptido o la parte inmunogenica se adsorbe a una membrana de nitrocelulosa o a una superficie de poliestireno. El suero preferentemente se diluye en PBS de 1:10 a 1:100 y se anade al polipeptido adsorbido y se lleva a cabo la incubacion durante 1 a 12 horas. Mediante la utilizacion de anticuerpos secundarios marcados, puede determinarse la presencia de anticuerpos espedficos mediante la medicion de la DO, p.ej., mediante ELISA, en donde una respuesta positiva es una respuesta superior al fondo mas dos desviaciones estandares o, alternativamente, una respuesta visual en una transferencia western.
• Otro parametro relevante es la medicion de la proteccion en modelos animales inducida tras la vacunacion con el polipeptido en un adyuvante o despues de la vacunacion de ADN. Entre los modelos animales adecuados se incluyen primates, cobayas o ratones, que se retan con una infeccion de una micobacteria virulenta. La lectura para la proteccion inducida podna ser una reduccion de la carga bacteriana en organos diana en comparacion con animales no vacunados, tiempos de supervivencia prolongados en comparacion con los animales no vacunados y una menor perdida de peso en comparacion con los animales no vacunados.
Metodos de preparation
En general, los antigenos de M. tuberculosis y las secuencias de ADN codificantes de tales antfgenos, pueden prepararse utilizando cualquiera de entre una diversidad de procedimientos. Pueden purificarse como protemas nativas a partir de celulas de M. tuberculosis o filtrado de cultivo, mediante procedimientos tales como los indicados anteriormente. Tambien pueden producirse los antfgenos inmunogenicos recombinantemente, utilizando una secuencia de ADN codificante del antfgeno, que ha sido insertada en un vector de expresion y expresada en un huesped apropiado. Son ejemplos de celulas huesped, E. coli. Los polipeptidos o parte inmunogenica de los mismos tambien pueden producirse sinteticamente, presentando menos de aproximadamente 100 aminoacidos, y generalmente menos de 50 aminoacidos, y pueden generarse utilizando tecnicas bien conocidas por el experto ordinario en la materia, tal como tecnicas de fase solida disponibles comercialmente, en las que se anaden secuencialmente aminoacidos a una cadena de aminoacidos en crecimiento.
En la construccion y preparacion de ADN plasirndico codificante del polipeptido tal como se define para la vacunacion de ADN, puede utilizarse una cepa huesped tal como E. coli. a continuacion, el ADN plasmfdico puede prepararse a partir de cultivos de la cepa huesped portadora del plasmido de interes, y purificarse utilizando, p.ej., el kit de columna de Qiagen Giga-Plasmid (Qiagen, Santa Clarita, CA, USA), incluyendo una etapa de eliminacion de endotoxinas. Resulta preferente que el ADN plasmfdico utilizado para la vacunacion de ADN se encuentre libre de endotoxinas.
Protefnas de fusion
Los polipeptidos inmunogenicos tambien pueden producirse como protemas de fusion, metodos mediante los cuales pueden conseguirse caractensticas superiores del polipeptido de la invencion. Por ejemplo, parejas de fusion que facilitan la exportacion del polipeptido en el caso de que se produzca recombinantemente; parejas de fusion que facilitan la purificacion del polipeptido, y parejas de fusion que potencian la inmunogenicidad del fragmento polipeptfdico de la invencion, son todas posibilidades interesantes. Por lo tanto, la invencion se refiere ademas a un polipeptido de fusion que comprende por lo menos un polipeptido o parte inmunogenica definida anteriormente y por lo menos una pareja de fusion. La pareja de fusion puede ser, para potenciar la inmunogenicidad, otro polipeptido derivado de M. tuberculosis, tal como un fragmento polipeptfdico derivado de una bacteria perteneciente al complejo de la tuberculosis, tal como ESAT-6, CFP10, TB10.4, RD1-ORF5, RD1-ORF2, Rv1036, MPB64, MPT64, Ag85A, Ag85B (MPT59), MPB59, Ag85C, lipoprotema de 19kDa, MPT32 y alfa-cristalina, o por lo menos un epftopo de celula T de entre cualquiera de los antfgenos anteriormente mencionados (Skj0t et al 2000; WO0179274; WO01 04151; ; solicitud de patente US n° 09/0505,739; Rosenkrands et al., 1998; Nagai et al., 1991). La invencion se refiere ademas a un polipeptido de fusion que comprende fusiones mutuas de dos o mas de los polipeptidos (o partes inmunogenicas de los mismos) de la invencion.
Otras parejas de fusion, que podnan potenciar la inmunogenicidad del producto, son linfoquinas tales como IFN-y, IL-2 e IL-12. Con el fin de facilitar la expresion y/o la purificacion, la pareja de fusion puede ser, p.ej., una protema fimbrial bacteriana, p.ej., los componentes del pilus, pilina y papA; la protema A; el peptido ZZ (las fusiones ZZ son comercializadas por Pharmacia en Suecia); la protema de union a maltosa; la glutation-S-transferasa, la pgalactosidasa o la polihistidina. Las protemas de fusion pueden producirse recombinantemente en una celula huesped, que podna ser E. coli, y es una posibilidad la induccion de una region conectora entre las diferentes parejas de fusion.
Otras parejas de fusion interesantes son los polipeptidos, que se lipidan de manera que el polipeptido inmunogenico sea presentado de una manera adecuada al sistema inmunologico. Este efecto es, p.ej., conocido de vacunas a base del polipeptido OspA de Borrelia burgdorferi, tal como se describe en, p.ej., el documento n° WO 96/40718 A, o vacunas a base de la lipoprotema Oprl de Pseudomonas aeruginosa (Cote-Sierra J., 1998). Otra posibilidad es la fusion N-terminal de una secuencia de senal conocida y una cistema N-terminal con el polipeptido inmunogenico. Dicha fusion resulta en la lipidacion del polipeptido inmunogenico en la cistema N-terminal, al ser producido en un huesped de produccion adecuado.
Usos
Vacuna
Una vacuna es una preparacion biologica que establece o mejora la inmunidad frente a una enfermedad particular. Las vacunas pueden ser profilacticas (p.ej., para prevenir o mejorar los efectos de una futura infeccion por cualquier patogeno natural o “salvaje”), postexposicion (p.ej., para evitar la reactivacion en individuos con infeccion latente sin smtomas clmicos) o terapeuticas (p.ej., vacunas utilizadas para tratar la enfermedad activa solas o combinadas con el tratamiento antibiotico para acortar el tratamiento).
Un modelo animal de TB latente
Con el fin de inducir una infeccion latente de grado bajo por M. tb, los animales en primer lugar recibieron una infeccion en aerosol utilizando una dosis normal de M. tb (aproximadamente 150 bacterias en los pulmones). Tras 6 semanas de infeccion, seguidamente los animales recibieron un tratamiento quimioterapeutico suboptimo de 6 semanas durante las que se erradico la mayor parte de las bacterias, aunque no todas. Las bacterias restantes estableceran una infeccion latente. T ras el tratamiento quimioterapeutico, algunos animales se vacunan para examinar la capacidad de la vacuna de bloquear la reactivacion de la infeccion latente, que se producira espontaneamente 5 a l5 semanas despues del tratamiento quimioterapeutico. Ver la figura 2.
Vacuna de protefnas
Otra parte de la invencion se refiere a una composicion de vacuna que comprende un polipeptido (o por lo menos una parte inmunogenica del mismo) o polipeptido de fusion segun la invencion. Con el fin de garantizar un rendimiento optimo de dicha composicion de vacuna, resulta preferente que comprenda un portador, vetnculo o adyuvante inmunologica o farmaceuticamente aceptable.
Una vacuna eficaz, en la que un polipeptido de la invencion es reconocido por el animal, sera capaz en un modelo animal de reducir la carga bacteriana en los organos diana, prolongar el tiempo de supervivencia y/o reducir la perdida de peso tras el reto por un Mycobacterium virulento, en comparacion con animales no vacunados.
Los portadores adecuados se seleccionan del grupo que consiste en un polfmero al que el polipeptido o polipeptidos se unen mediante interaccion no covalente hidrofobica, tal como un plastico, p.ej., poliestireno, o un polfmero al que el polipeptido o polipeptidos se unen covalentemente, tal como un polisacarido, o un polipeptido, p.ej., albumina de suero bovino, ovoalbumina o hemocianina de lapa americana. Los vetnculos adecuados se seleccionan del grupo que consiste en un diluyente y un agente de suspension. El adyuvante se selecciona preferentemente del grupo que consiste en bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA), Quil A, poli I:C, hidroxido de aluminio, adyuvante incompleto de Freund, IFN-y, IL-2, IL-12, monofosforil-lfpido A (MPL), dimicolato de trehalosa (DMT), dibehenato de trehalosa y dipeptido muramilo (DPM).
La preparacion de vacunas que contienen secuencias peptfdicas como ingredientes activos es generalmente bien entendida en la tecnica, tal como ejemplifican las patentes US n° 4.608.251, n° 4.601.903, n° 4.599.231 y n° 4.599.230.
Entre otros metodos para conseguir un efecto adyuvante para la vacuna se incluye la utilizacion de agentes tales como el hidroxido de aluminio o fosfato (alumina); tambien pueden utilizarse polfmeros sinteticos de azucares (Carbopol), agregacion de la protema en la vacuna mediante tratamiento termico, agregacion mediante reactivacion de anticuerpos (Fab) tratados con pepsina, mezcla con celulas bacterianas, tales como C. parvum o endotoxinas o componentes lipopolisacaridos de bacterias Gram-negativas, emulsion en vetnculos aceites fisiologicamente aceptables, tales como monooleato de sorbitan (Aracel A) o emulsion con solucion al 20 por ciento de un perfluorocarburo (Fluosol-DA) utilizado como sustituto en bloque. Otras posibilidades implican la utilizacion de sustancias inmunomoduladoras, tales como citoquinas o inductores de IFN-y sinteticos, tales como poli I:C en combinacion con los adyuvantes anteriormente mencionados.
Otra posibilidad interesante para conseguir el efecto adyuvante es utilizar la tecnica descrita en Gosselin et al., 1992. Brevemente, puede conjugarse un antfgeno relevante, tal como un antfgeno de la presente invencion, con un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo de union a antfgeno) contra los receptores de Fcy sobre los monocitos/macrofagos.
Las vacunas se administran de una manera compatible con la formulacion de dosis, y en cantidad suficiente para ser inmunogenicas y eficaces en el bloqueo de la reactivacion. La cantidad que debe administrarse depende del sujeto que debe tratarse, incluyendo, p.ej., la capacidad del sistema inmunologico del individuo de montar una respuesta inmunologica y el grado de proteccion deseado. Los intervalos de dosis adecuados son del orden de varios cientos de microgramos de ingrediente activo por vacunacion, con un intervalo preferente de entre aproximadamente 0,1 |jg y 1.000 jg , tal como en el intervalo de entre aproximadamente 1 jg y 300 jg , y especialmente en el intervalo de entre aproximadamente 10 jg y 50 jg . Los regfmenes adecuados para la administracion inicial e inyecciones de refuerzo tambien son variables, aunque se tipifican por una administracion inicial seguido de inoculaciones posteriores u otras administraciones.
El modo de aplicacion puede variar ampliamente. Cualquiera de los metodos convencionales de administracion de una vacuna es aplicable. Entre ellos se cree que incluyen la aplicacion oral en una base fisiologicamente aceptable
solida o en una dispersion fisiologicamente aceptable, por via parenteral, mediante inyeccion o similar. La dosis de la vacuna dependena de la via de administracion y variara segun la edad de la persona que debe vacunarse y, en menor grado, el tamano de la persona que debe vacunarse.
Las vacunas se administran convencionalmente por v^a intrapulmonar, p.ej., mediante aerosol o inhalacion, por v^a parenteral, mediante inyeccion, por ejemplo, por via subcutanea o intramuscular. Entre las formulaciones adicionales que resultan adecuadas para otros modos de administracion se incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones orales. Para los supositorios, entre los ligantes y portadores tradicionales pueden incluirse, por ejemplo, polialquilenglicoles o trigliceridos; tales supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en el intervalo de 0,5% a 10%, preferentemente de 1-2%. Entre las formulaciones orales se incluyen excipientes normalmente utilizados tales como, por ejemplo, grados farmaceuticos de manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina sodica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones adoptan la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, pfldoras, capsulas, formulaciones o polvos de liberacion sostenida y ventajosamente contienen 10% a 95% de ingrediente activo, preferentemente 25% a 70%.
En muchos casos, resultara necesarias multiples administraciones de la vacuna. En casos en que el individuo ya ha resultado infectado o se sospecha que se ha infectado, la vacunacion anterior puede haber proporcionado suficiente inmunidad para evitar la enfermedad primaria pero, tal como se ha comentado anteriormente, el refuerzo de esta respuesta inmunologica no ayudara contra la infeccion latente. En tal situacion, la vacuna necesariamente debera ser una vacuna postexposicion disenada para eficacia contra el estadio latente de la infeccion o resurgimiento de la infeccion tuberculosis activa.
Debido a la variacion genetica, diferentes individuos pueden reaccionar con respuestas inmunologicas de diferente intensidad contra el mismo polipeptido. Por lo tanto, la vacuna segun la invencion puede comprender varios polipeptidos diferentes para incrementar la respuesta inmunologica. La vacuna puede comprender dos o mas polipeptidos o partes inmunogenicas, en la que la totalidad de los polipeptidos son tal como se ha definido anteriormente, o algunos aunque no todos los peptidos pueden obtenerse de las micobacterias virulentas. En el ultimo ejemplo, los polipeptidos que no satisfacen necesariamente los criterios proporcionados anteriormente para los polipeptidos pueden actuar segun su propia inmunogenicidad o actuar meramente como adyuvantes.
La vacuna puede comprender 1 a 20, tal como 2 a 20 o incluso 3 a 20 polipeptidos o polipeptidos de fusion diferentes, tales como 3 a 10 polipeptidos o polipeptidos de fusion diferentes.
Vacuna de ADN
Los fragmentos de acidos nucleicos de la invencion pueden utilizarse para llevar a cabo la expresion in vivo de antfgenos, es decir, los fragmentos de acidos nucleicos pueden utilizarse en las denominadas vacunas de ADN tal como en la revision proporcionada por Ulmer et al., 1993.
Por lo tanto, en la presente memoria tambien se describe una vacuna postexposicion que comprende un fragmento de acidos nucleicos segun la invencion, llevando a cabo la vacuna la expresion in vivo de antfgenos por el animal, incluyendo un ser humano en el que se ha administrado la vacuna, siendo eficaz la cantidad de antfgeno expresado para proporcionar el tratamiento de las infecciones causadas por micobacterias virulentas en un animal, incluyendo un ser humano.
La eficacia de dicha vacuna de ADN puede potenciarse posiblemente mediante la administracion del gen codificante del producto de expresion junto con un fragmento de ADN codificante de un polipeptido que presenta la capacidad de modular la respuesta inmunologica.
Vacunas recombinantes vivas
Una posibilidad para activar eficazmente una respuesta inmunologica celular para una vacuna postexposicion puede conseguirse mediante la expresion del antfgeno relevante en una vacuna en un microorganismo no patogenico o virus. Los ejemplos bien conocidos de tales microorganismos son Mycobacterium bovis BCG, Salmonella y Pseudomona y son ejemplos de virus, el virus Vaccinia y los adenovirus.
Por lo tanto, en la presente memoria se describe ademas una mejora de la vacuna BCG viva actualmente disponible, en la que una o mas copias de una secuencia de ADN codificante de uno o mas polipeptidos tal como se han definido anteriormente se han incorporado en el genoma del microorganismo de una manera que permite que este exprese y secrete el polipeptido. La incorporacion de mas de una copia de una secuencia de nucleotidos de la invencion se encuentra contemplado que potencie la respuesta inmunologica.
Otra posibilidad es integrar el ADN codificante del polipeptido segun la invencion en un virus atenuado, tal como el virus Vaccinia o un adenovirus (Rolph et al., 1997). El virus Vaccinia recombinante es capaz de replicarse dentro del citoplasma de la celula huesped infectada y el polipeptido de interes por lo tanto puede inducir una respuesta inmunologica, que se contempla que induce proteccion frente a TB.
A continuacion, se describe la invencion en mayor detalle en los ejemplos no limitativos siguientes.
Leyendas de figura
Figura 1: el curso de una infeccion por M. tuberculosis se produce esencialmente en 3 etapas.
Figura 2: modelo de vacunacion postexposicion para bloquear la reactivacion.
Figura 3: modelo de vacunacion de TB.
Vista general esquematica del modelo utilizado en el Statens Serum Institut (SSI) para el ensayo de las vacunas postexposicion. Se infectaron ratones con M. tb virulentos por la via de aerosol. Entre las semanas 6 y 12 postinfeccion, los ratones fueron tratados con antibioticos para establecer un estado de TB latente. Los ratones se vacunaron 2 a tres veces a intervalos de 3 semanas a partir de la semana 10 postinfeccion con los candidatos a vacuna postexposicion. Se dejo tiempo para que la enfermedad se reactivase en los ratones y aproximadamente 20 semanas despues, se evaluaron los pulmones para el numero de bacterias con el fin de evaluar la eficacia de proteccion de la vacuna.
Figura 4: la vacuna postexposicion indujo proteccion por ESAT6 pero no Ag85.
Se infectaron los ratones, se trataron y se vacunaron segun la vista general esquematica en el Ejemplo 1. Los ratones se sacrificaron entre las semanas 30 y 40 posteriores a la infeccion y en este punto temporal se evaluaron los pulmones para la carga bacteriana (figura A, C-E) o, tal como se muestra en la figura 4B, en la que se determino la carga bacteriana en varios puntos temporales durante la infeccion con ESAT6. (A y B) Carga bacteriana de animales vacunados con ESAT6 en comparacion con la de animales de control. (C) Carga bacteriana de animales vacunados con Ag85B en comparacion con la de animales de control. (D) Carga bacteriana de animales vacunados con ESAT-6 pepmix (pool de peptidos solapantes que cubren la secuencia completa de ESAT6) en comparacion con animales vacunados con Ag85B y con animales de control. (E) Proteccion frente a la reactivacion tras la vacunacion postexposicion con ratones vacunados con Ag85B-ESAT6 (H1) en comparacion con la de ratones de control no vacunados. Todos los datos en la figura 4A, C-E se muestran como graficos de puntos en los que se representa cada animal individual, ilustrando la media, mientas que cada punto temporal en la figura 4B es representativo de 6 animales individuales y se muestra como media ± error estandar de la media (SEM) (B). T odos los analisis estadfsticos se llevaron a cabo utilizando una prueba t no emparejada (figura A-C y E) o una prueba de comparaciones multiples de Tukey (figura D), en donde p<0,05 se considero el nivel de significancia.
Figura 5: la vacunacion postexposicion de ESAT-6 indujo las celulas T polifuncionales.
Las celulas procedentes de pulmones infectados procedentes de animales no vacunados o vacunados con ESAT-6 se estimularon in vitro con ESAT-6 antes de la tincion con anti-CD4, -CD8, -IFN-y, -TNF-a e -IL-2. (A y B) Se determinaron los perfiles de citoquinas dividiendo en primer lugar las celulas T CD4 en celulas IFN-y positivas (+) o IFN-y negativas (-). Se analizaron tanto las celulas IFN-Y+ como IFN-y- con respecto a la produccion de TNF-a e IL-2. Los graficos circulares (A y B) presentan un codigo de colores segun el perfil de produccion de citoquinas y resumen las fracciones de la respuesta de celulas T CD4+ (de entre las celulas T CD4 espedficas de ESAT-6) que son positivas para un perfil de produccion de citoquinas dado. (C) Se muestran todas las posibles combinaciones de citoquinas en el eje x del grafico circular y se proporciona para cada grupo de inmunizacion el porcentaje de celulas T CD4+ espedficas de ESAT-6 en ratones no vacunados (columnas grises) o en ratones vacunados con ESAT-6 (columnas negras) que expresan cualquier combinacion de citoquinas. (D) Se vacunaron ratones con infeccion latente dos veces con ESAT-6 y 20 semanas despues de la ultima vacunacion, se evaluaron los pulmones para el numero de bacterias con el fin de determinar la eficacia de proteccion. (**p<0,01, prueba de comparaciones multiples de Tukey de ANOVA unidireccional).
Figura 6: Analisis agrupados de todos los experimentos postexposicion
Para un experimento individual en que se hada utilizado ESAT6, Rv3871, Ag85B, Rv3905, Rv3445, Rv0569 or Rv2031c (figura A), Ag85B-ESAT6 (H1) o Ag85B-ESAT6-Rv2660 (H56) (figura B) para la vacunacion postexposicion, se comparo la mediana de la carga bacteriana del grupo de control de adyuvante con la carga bacteriana de cada raton individual en un grupo vacunado con uno cualquiera de los antfgenos mencionados anteriormente. En las figuras A y B, cada punto corresponde al nivel de proteccion, es decir, ALog10 UFC proporcionado por la vacunacion en comparacion con el grupo de control de adyuvante y consiste en varios experimentos independientes. (A) Log10 proteccion para los antfgenos individuales ESAT6, Rv3871, Ag85B, Rv3905, Rv3445, Rv0569 o Rv2031c (B) o para los antfgenos dbridos H1 y H56 en comparacion con ESAT6 solo. Se aplico el analisis estadfstico para las comparaciones de las medianas entre los diferentes grupos utilizando la prueba de comparaciones multiples de Kruskall Wallis. Se considero que p<0,05 era el nivel de significancia. Figura 7: efecto de la vacunacion postexposicion con Rv3871 en comparacion con ESAT6 y animales de control. Se infectaron los ratones, se trataron y se vacunaron en las semanas 10, 13 y 18 posteriores a la infeccion. En la semana 36 posterior a la infeccion, se sacrificaron los ratones y linfocitos pulmonares procedentes tanto de ratones vacunados como de control solucion salina no vacunados se reestimularon in vitro con Rv3871 (fig. 7A) o ESAT6 (fig. 7B). Se evaluo la liberacion de IFN-y mediante ELISA y se obtuvieron muestras por triplicado. Los datos se representan como medias ± SEM. Se determino la eficacia de proteccion proporcionada por las vacunas mediante enumeracion de las bacterias en pulmon cultivado a partir de homogenado de pulmones completos (n=16 a 18). Los datos representados como grafico de puntos, en los que cada punto representa un animal individual y se ilustran con la mediana (lmea roja).
Ejemplos
EJEMPLO 1: modelo de TB murina para la vacunacion
El modelo Cornell ha sido ampliamente utilizado como modelo murino para el estudio de la TB latente. Este modelo se adapto en el laboratorio de los presentes inventores para el ensayo de la capacidad de los candidatos de vacuna de bloquear la reactivacion. Los ratones se infectaron inicialmente con aerosol de M. tb virulento y en la semana 6 despues de la infeccion se inicio el tratamiento antibiotico para reducir la carga bacteriana. Esto se llevo a cabo para mimetizar el estadio latente de una infeccion humana, que no se produce espontaneamente en los ratones. Durante esta etapa latente (una etapa con un numero de bacterias continuamente bajo), los ratones se inmunizaron dos veces y se determino la capacidad de la vacuna de bloquear la reactivacion, mediante el cultivo de bazos y pulmones para M. tb vivos 20 semanas despues de la ultima inmunizacion. La larga duracion de los experimentos resulta necesaria para permitir un tiempo suficiente para la reactivacion de la enfermedad, que es un requisito previo para una lectura de la eficacia de la vacuna (figura 3).
EJEMPLO 2: la vacuna postexposicion indujo proteccion por ESAT6 pero no Ag85.
Se ha demostrado que ESAT-6 y Ag85B son protectoras en la vacuna profilactica, tanto como componentes individuales como tambien como molecula de fusion Ag85B-ESAT6 (H1). Sin embargo, al someter a ensayo estos antigenos en el modelo postexposicion (tal como se ha indicado anteriormente, en el Ejemplo 1), solo ESAT6 presento un efecto protector y crecimiento de bacterias de control durante la etapa de reactivacion (figura 4). Ademas, tal como se observa en la figura 4B, la proteccion por ESAT6 frente a la reactivacion se manifiesta tan pronto como en la semana 18 despues de la infeccion y esta proteccion se mantuvo durante la totalidad del curso del experimento (hasta la semana 40 posterior a la infeccion). Lo anterior contrasta con lo observado al utilizar Ag85B como vacuna postexposicion (figura 4C y D), en la que no se produjo una reduccion significativa de la carga bacteriana en comparacion con el control. Ademas, los presentes inventores evaluaron la protema de fusion H1, que esta compuesta de los antfgenos de TB Ag85B y ESAT-6, que han demostrado una prometedora eficacia en un contexto profilactico. Al utilizar esta molecula como una vacuna postexposicion en el modelo de postexposicion del SSI, fue capaz de reducir significativamente el numero de bacterias (figura 4E).
EJEMPLO 3: produccion inducida por vacuna postexposicion por mezcla de peptidos ESAT6
Tal como se ha mostrado en los ejemplos, anteriormente, la molecula ESAT-6 es muy activa al administrarla postexposicion, resultando en una reduccion de la carga bacteriana en comparacion con el grupo de control y tambien en comparacion con Ag85B. Ademas, los presentes inventores mostraron que ESAT-6 administrada como pool de peptidos solapantes en lugar de una protema recombinante tambien conduce a una mejor proteccion frente a la reactivacion en comparacion con tanto el grupo de control como Ag85B, demostrando la fuerte actividad de ESAT6 y la capacidad de funcionar como vacuna postexposicion (figura 4D).
Peptidos ESAT-6 solapantes (P1-P13) utilizados para el experimento de proteccion:
P1 MTEQQWNFAGIEAAA (SEC ID n° 19).
P2 NFAGIEAAASAIQGN (SEC ID n° 20).
P3 ASAIQGNVTSIHSLL (SEQ ID NO. 21).
P4 NVTSIHSLLDEGKQS (SEQ ID NO. 22).
P5 SLLDEGKQSLTKLAA (SEQ ID NO. 23).
P6 KQSLTKLAAAWGGSG (SEQ ID NO. 24).
P7 AAWGGSGSEAYQGVQ (SEQ ID NO. 25).
P8 GSEAYQGVQQKWDAT (SEQ ID NO. 26).
P9 QQKWDATATELNNAL (SEQ ID NO. 27).
P10 TATELNNALQNLART (SEQ ID NO. 28).
P11 ALQNLARTISEAGQA (SEQ ID NO. 29).
P12 TISEAGQAMASTEGN (SEQ ID NO. 30).
P13 QAMASTEGNVTGMFA (SEQ ID NO. 31).
EJEMPLO 5: Vacunacion postexposicion con celulas T polifuncionales inducidas por ESAT-6
Con el fin de examinar el efecto de una vacunacion postexposicion con ESAT-6 sobre el perfil de expresion de citoquinas de las celulas espedficas de ESAT-6, en primer lugar, los ratones se infectaron con aerosol con M. tb virulentas y en la semana 6 despues de la infeccion se inicio el tratamiento antibiotico para reducir la carga bacteriana y establecer una infeccion latente. Durante la etapa latente, los ratones se vacunaron (tal como se muestra en la figura 3) tres veces a intervalos de 3 semanas y se determino la capacidad de la vacuna de ESAT-6 de influir sobre el numero de celulas T polifuncionales y de bloquear la reactivacion de M. tb 20 semanas despues de la ultima vacunacion. Los resultados mostraron que se produce una respuesta de ESAT-6 sustancial en el grupo no vacunado, pero que el perfil de expresion de citoquinas era marcadamente diferente en comparacion con el grupo vacunado con ESAT-6 (fig. 5), en particular en terminos de celulas T polifuncionales (celulas T CD4 IFN-Y+TNF-a+IL-2+). De esta manera, en comparacion con el grupo no vacunado, los presentes inventores observaron un numero reducido de celulas T CD4
IFN-Y/TNF-a y un numero incrementado de celulas T CD4 polifuncionales triple positivas que coexpresan IFN-y/TNF-a/IL-2. La presencia incrementada de celulas T polifuncionales se correlacionaba con un numero de bacterias reducido en los pulmones de los animales vacunados con ESAT-6 (fig. 5D).
EJEMPLO 6: vacunacion postexposicion con ESAT6 protege mas consistentemente frente a la reactivacion que otros antfgenos asociados a la infeccion de estadio temprano y de estadio tardfo.
Con el fin de determinar que antfgenos proteg ân mas consistentemente frente a la proteccion, los presentes inventores realizaron un analisis agrupado de datos normalizados basado en todos los experimentos postexposicion realizados. Los datos procedentes de experimentos individuales se normalizaron mediante comparacion de la carga bacteriana de cada raton individual dentro de un grupo con la mediana del grupo de control; es decir, cada punto de datos representa la diferencia (Log10 UFC mediana de control -Log10 UFC grupo de vacuna) entre UFC mediana de control y UFC de cada individuo (figura 6). En la figura 6A, la comparacion del conjunto de datos agrupados de proteccion para los antfgenos asociados a latencia Rv0569, Rv2031c y los antfgenos tempranos Ag85B, ESAT6, Rv3871, Rv3905 y Rv3445, de los cuales los dos ultimos son protemas de la familia de ESAT6 muestra que los animales vacunados con ESAT6 estan significativamente mejor protegidos frente a la reactivacion en comparacion con otros antfgenos evaluados. Ademas, los niveles de proteccion alcanzados tras la vacunacion postexposicion con Rv3871 y protema ESX-1 aparentemente tambien se encuentran elevados en comparacion con otros antfgenos (figura 6A). Con el fin de demostrar adicionalmente la actividad de ESAT6, en particular, los presentes inventores compararon la proteccion proporcionada por ESAT6 con los dos constructos de fusion H1 (Ag85B-ESAT6) y H56 (Ag85B-ESAT6-Rv2660), en donde ambos contienen ESAT6 (figura 6B). El analisis mostro que la actividad de ESAT6 todavfa resulta en la proteccion frente a la reactivacion al incluirlo en los dos constructos de fusion mencionados anteriormente.
EJEMPLO 7: la vacunacion postexposicion con otro elemento de la familia de ESX-1, Rv3871, aparentemente presenta un efecto inhibitorio del proceso de reactivacion.
Los presentes inventores evaluaron otros elementos de la familia de ESX-1 en paralelo con ESAT6 y encontraron que la vacunacion postexposicion con Rv3871 conduda a una induccion de una respuesta inmunologica espedfica de Rv3871 (fig. 7B), aunque no de la magnitud de la respuesta inmunologica inducida por ESAT6 (fig. 7A). Sin embargo, ambas respuestas inmunologicas, las inducidas por ESAT6 y por Rv3871, fueron superiores a las observadas en animales de control de solucion salina. La induccion de una respuesta inmunologica espedfica de vacuna se asocio a una carga bacteriana reducida (mediana) en ambos grupos de vacuna en comparacion con el grupo de solucion salina. Lo anterior indica que Rv3871 podna presentar un efecto similar de proteccion frente a la reactivacion al de ESAT6, demostrado por los niveles similares de numero bacteriano en estos dos grupos en comparacion con el nivel algo elevado en el grupo de control (figura 7C).
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Claims (11)
1. Vacuna para la utilizacion en el bloqueo de la reactivacion de la tuberculosis en individuos con infeccion latente por M. tuberculosis, que comprende un antigeno que se expresa constitutivamente durante la infeccion por M. tuberculosis o un acido nucleico codificante de dicho antigeno, en el que el antigeno, perteneciente al sistema de excrecion ESX-1, se selecciona del grupo que consiste en:
i) ESAT6, CFP10, Rv3614c, Rv3615c, EspR, Rv3868, Rv3869, Rv3870, Rv3871, Rv3872, Rv3873, Rv3876, Rv3877, Rv3878, Rv3879c, Rv3880c, Rv3881c, Rv3882c, Rv3883c y Rv3865,
ii) una parte inmunogenica que comprende un epftopo de una celula B o celula T de cualquiera de las secuencias en (i), y
iii) un analogo de secuencia de aminoacidos que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a cualquiera de las secuencias en (i) o (ii) y siendo simultaneamente inmunogenica mediante el bloqueo de la reactivacion de la infeccion latente de tuberculosis al administrarla como vacuna terapeutica.
2. Vacuna para la utilizacion segun la reivindicacion 1, en la que los polipeptidos se fusionan con un antigeno expresado por bacterias en la familia de las micobacterias.
3. Vacuna para la utilizacion segun la reivindicacion 2, en la que la pareja de fusion es un antfgeno que se expresa constitutivamente.
4. Vacuna para la utilizacion segun la reivindicacion 3, que comprende ESAT6 fusionado con CFP10.
5. Vacuna para la utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un sistema de administracion adicional seleccionado de vacunas recombinantes vivas, que es organismos geneticamente modificados, tales como bacterias o virus que expresan genes micobacterianos, o sistemas de administracion inmunogenica, tales como vacunas de ADN, es decir, plasmidos expresantes de genes o fragmentos genicos de las protemas indicadas anteriormente, o vacunas de protemas, es decir, las protemas mismas o peptidos sinteticos derivados de las protemas mismas administradas en un sistema de administracion, tal como un adyuvante.
6. Vacuna para la utilizacion segun la reivindicacion 5, en la que el adyuvante comprende DDA/TDB y/o poli I:C
7. Vacuna para la utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la secuencia de aminoacidos es lipidada de manera que permite un efecto autoadyuvante del polipeptido.
8. Antfgeno seleccionado del grupo definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para la utilizacion en el tratamiento de la tuberculosis latente.
9. Antfgeno seleccionado del grupo definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para la utilizacion en la fabricacion de una vacuna contra la reactivacion de las infecciones latentes causadas por especies del complejo de tuberculosis seleccionado del grupo que consiste en Mycobacterium tuberculosis, M. bovis y M. africanum.
10. Antfgeno para la utilizacion segun la reivindicacion 9, en el que dicha vacuna esta destinada a la administracion despues de la infeccion en el estadio agudo y/o durante la infeccion en estadio latente.
11. Antfgeno para la utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, en el que la vacuna comprende una o mas partes inmunogenicas tal como se definen en las reivindicaciones 1 a 4.
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