KR102577332B1

KR102577332B1 - 항원성 및 안정성이 개선된 항원을 포함하는 잠복결핵 진단용 조성물

Info

Publication number: KR102577332B1
Application number: KR1020210190696A
Authority: KR
Inventors: 최새해; 우주랑; 하경수
Original assignee: 재단법인 오송첨단의료산업진흥재단
Priority date: 2021-12-29
Filing date: 2021-12-29
Publication date: 2023-09-11
Also published as: KR20230100972A

Abstract

본 발명은 항원성 및 안정성이 개선된 항원을 포함하는 잠복결핵 진단용 조성물에 관한 것으로서, 현재 활발히 사용하는 잠복결핵 진단 키트인 QuantiFERON-TB 테스트의 경우, 항원을 튜브에 고정하여 반응하는 방식으로 항원의 역가가 개선될 경우 적은 양으로도 충분한 면역반응을 유도할 수 있다. 본 발명의 항원의 경우, 혈액과의 반응온도인 37℃에서도 4일 정도는 안정성이 확보된 상태임으로 정확한 결과를 획득할 수 있다. 본 발명으로 얻은 변이체 항원은 기존의 야생형보다 항원역가는 2배 개선되었으며, 4℃에서는 10일 정도의 안정성과 37℃에서 4일 안정성이 개선된 효과를 확인하였다.

Description

항원성 및 안정성이 개선된 항원을 포함하는 잠복결핵 진단용 조성물{Composition for diagnosing latent tuberculosis comprising antigen with improved antigenicity and stability}

본 발명은 항원성 및 안정성이 개선된 항원을 포함하는 잠복결핵 진단용 조성물에 대한 것이다.

결핵은 미코박테리아 튜버클레로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 의한 감염성 질병으로, 전 세계적으로 사망의 주요 원인인데, 세계 3대 질병 중의 하나로 전세계 인구의 약 3분의 1인 20억명 정도가 결핵에 감염되어 있다. 우리나라의 경우 결핵 발생율과 결핵으로 인한 사망율은 OECD 국가 중 1위이며, 연간 약 35,000명의 새로운 환자와 약 2,300명 정도의 사망자가 보고되고 있다.

현재 결핵을 진단하는 방법으로 널리 사용되는 것이 결핵균 도말 염색 또는 배양으로 결핵균을 임상적으로 분리하여 확인하는 방법이 있다. 상기 도말 염색은 결핵균을 빠르게 탐지하여 전염력이 높은 환자를 신속하게 선별할 수 있다는 장점이 있지만, 배양검사와 비교시 20-80% 정도로 민감성이 낮아서 어린이, 노인 또는 후천성면역결핍환자와 같이 면역시스템이 손상된 환자에서는 실패율이 높다. 국내에서 비결핵항산균의 분리 빈도가 증가하는 추세여서 도말검사만으로는 활동성 결핵을 진단하기에 불충분하다. 또한, 비결핵 항산균(nontuberculous mycobacteria) 폐질환일 경우에도 객담도말테스트에서 양성으로 나오므로 도말검사만으로 활동성 결핵으로 진단하기 어렵다.

다른 방법으로 사용되는 것이 투베르쿨린시험(Tuberculin skin test) 및 IGRA(IFN-γ release assay)와 같은 면역학적 방법으로 잠복결핵(latent tuberculosis)을 탐지하는 것이다. 투베르쿨린시험은 잠복 결핵을 탐지할 수 있지만 BCG 예방주사를 접종한 경우나 NTM 질병을 구별하지 못하며, 잠복결핵을 확인하기 위해서는 방사선 검사, 객담, 배양검사와 같은 추가적 검사가 필요하다. IGRA인 QuantiFERON-TB 테스트는 환자의 말초혈액세포에 항원의 자극을 통하여 면역세포가 분비하는 인터페론 감마를 측정하는 체외(in vitro) 잠복결핵 검사인데, 항원을 튜브에 고정하여 반응하는 방식으로 항원의 역가가 개선될 경우 적은 양으로도 충분한 면역반응을 유도할 수 있으므로, 항원의 역가 및 안정성을 개선시키는 것이 중요하다.

한국공개특허 제10-2021-0057315호(2021.05.21 공개)

본 발명의 목적은 ESAT6-CFP10 재조합 항원을 유효성분으로 포함하는 잠복결핵 진단용 조성물 및 이를 포함하는 잠복결핵 진단용 키트를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 환자에서 분리된 시료와 반응시켜, 잠복 결핵 감염 여부를 분석하는 단계를 포함하는 잠복결핵 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 ESAT6-CFP10 재조합 항원을 유효성분으로 포함하는 잠복결핵 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 잠복결핵 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 환자에서 분리된 시료와 반응시켜, 잠복 결핵 감염 여부를 분석하는 단계를 포함하는 잠복결핵 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

도 1은 재조합 ESAT6-CFP10 단백질의 항원성 평가 결과를 나타낸다.
도 2는 재조합 ESAT6-CFP10 단백질의 안정성 평가 결과를 나타낸다.
도 3은 ESAT6-CFP10 단백질의 안정성 향상을 위한 돌연변이체 제작 결과를 나타낸다.
도 4는 SDS-PAGE & RP-HPLC를 이용한 돌연변이체 안정성 시험 결과를 나타낸다.
도 5는 안정성이 개선된 돌연변이체(DG, 120Q 및 89R) 3종의 항원성 평가 결과를 나타낸다.

본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 ESAT6-CFP10 재조합 항원을 유효성분으로 포함하는 잠복결핵 진단용 조성물을 제공한다.

상세하게는, 상기 조성물은 항원성 및 안정성이 개선된 것으로서, 기존의 아생형보다 항원역가는 2배 개선되었으며, 4℃에서는 10일 정도의 안정성과 37℃에서 4일 안정성이 개선된 효과를 확인하였다.

본 발명에서, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 진단은 잠복결핵의 위험이 있는지 또는 잠복결핵의 발병 여부를 확인하거나, 나아가 잠복결핵의 진행 여부 또는 심화 여부를 확인하는 것을 의미할 수 있다.

본 발명에서, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 ESAT6-CFP10 재조합 항원은 120G/204G 또는 DG로 기재하였고, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 ESAT6-CFP10 재조합 항원은 120Q로 기재하였으며, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 ESAT6-CFP10 재조합 항원은 89R로 기재하였다.

한편, 야생형 ESAT6-CFP10 재조합 항원은 서열번호 4로 기재하였다.

본 발명에 있어서, 상기 키트는 상기 ESAT6-CFP10 재조합 항원 뿐만 아니라, 잠복결핵 진단에 적합한 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다.

바람직하게는, 상기 잠복 결핵 감염 여부를 분석하는 단계는 인터페론 감마 분비 검사(Interferon-γ release assay, IGRA)를 통해 분석할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에 기재된 용어 “환자에서 분리된 시료”는 혈액 등을 포함한 생물의 모든 물질을 말하는 것이며, 본 발명의 잠복결핵 진단에 사용할 수 있는 생물학적 시료는 조직, 세포, 모발, 구강 조직, 구강 세포, 혈액, 림프, 골수 액, 타액, 유즙, 소변, 분변, 안구 액, 정액, 뇌추출액, 척수 액, 관절액, 복수, 양막액 또는 세포조직액이 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서, 바람직하게는 상기 시료는 혈액일 수 있다.

이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

< 실험예 >

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. 재조합 항원 ESAT6 - CFP10의 제작( 클로닝 및 정제)

ESAT6와 CFP10 사이에 3개의 G4S linker (GGGGS)가 들어가도록 유전자 합성을 하였고, 합성된 유전자는 pGEX4T-1에 BamHI/EcoRI으로 클로닝 하였다. 안정성 증가를 위해 디자인된 ESAT6/CFP10 돌연변이들은 site-directed mutagenesis 방법으로 유전자를 치환하였고, mutagenesis를 위해 사용된 프라이머는 표 1과 같다.

프라이머 명칭	서열
ESAT_S89R_F	ATTAGCGAAGCCGGTCAGGCAATGGCTCGTACCGAAGGCAACGTTACCGGCATGTT
ESAT_S89R_R	AACATGCCGGTAACGTTGCCTTCGGTACGAGCCATTGCCTGACCGGCTTCGCTAAT
ESAT_S89L_F	ATTAGCGAAGCCGGTCAGGCAATGGCTCTTACCGAAGGCAACGTTACCGGCATGTT
ESAT_S89L_R	AACATGCCGGTAACGTTGCCTTCGGTAAGAGCCATTGCCTGACCGGCTTCGCTAAT
CFP_K120Q_F	GAGGTGGAAGCATGGCAGAAATGCAGACGGATGCGGCAACCCTGGCAC
CFP_K120Q_R	GTGCCAGGGTTGCCGCATCCGTCTGCATTTCTGCCATGCTTCCACCTCC
CFP_K120G_F	GAGGTGGAAGCATGGCAGAAATGGGGACGGATGCGGCAACCCTGGCAC
CFP_K120G_R	GTGCCAGGGTTGCCGCATCCGTCCCCATTTCTGCCATGCTTCCACCTC
CFP_E204G_F	CAGTATAGCCGTGCCGACGAGGGGCAGCAGCAGGCGCTGTCTAGC
CFP_E204G_R	GCTAGACAGCGCCTGCTGCTGCCCCTCGTCGGCACGGCTATACTG

각 돌연변이는 WT의 DNA를 주형으로 하여 PCR 산물을 생성하고, DpnI을 50℃에서 1시간 동안 처리하여 플라스미드 주형을 분해한 뒤 형질전환 하였다. 형질전환체는 시퀀싱을 통해 염기의 치환을 확인하였다.

ESAT6/CFP10 WT과 돌연변이들은 E. coli strain인 BL21[DE3]에서 발현하였다. 단백질 발현은 100 mg/mL의 앰피실린(ampicillin)을 포함하는 LB 배지에서 배양하였고, 0.5 mM IPTG, 18℃, 16 hr 조건에서 발현하였다. E. coli cell은 PBS에서 초음파처리(sonication)로 파쇄한 후, 원심분리하고 상층액을 취하여 정제하였다. GST를 포함하는 ESAT6/CFP10 WT과 돌연변이들은 GST resin에 붙인 상태로 1 mg의 단백질 당 1 unit의 트롬빈(thrombin)을 처리하였으며, GST와 분리된 ESAT6/CFP10 WT과 돌연변이들은 flow-through로 회수하였다.

2. 항원성 평가

재조합 단백질들의 항원성 평가를 위하여 항원에 의해 활성화된 사람 primary T 세포가 분비하는 IFN-γ 측정을 위해 V-PLEX Human IFN-γ kit(Meso Scale Discovery)를 사용하여 정량화하였다.

재조합 단백질들(항원)의 엔도톡신(endotoxin) 유무 확인을 위해서 사용한 사람말초혈액세포(PBMCs)는 Lonza에서 구매하였다. 항원성 유무 확인을 위한 사람말초혈액세포는 건강한 일반 성인들 중에 과거 결핵에 걸린 경험이 있는 사람과 없는 사람들의 혈액을 채취해서 Histopaque-1119 (Sigma)을 이용하여 사람말초혈액세포를 분리하였다. 분리한 사람말초혈액세포를 2 × 10⁵ 개씩 96 well plate 에 깐 뒤 항원 단백질과 양성 대조군(positive control)으로 재조합 정제 단백질 유도체(purified protein derivative; PPD)를 주어진 농도별로 24 시간에서 72 시간 동안 처리한 후 세포 배양액을 회수하였다. 회수한 세포배양액은 V-PLEX Human IFN-γ kit를 이용하여 배양액 내 IFN-γ의 양을 정량하였다.

실험 진행과정은 다음과 같다.

1) Kit 내의 plate를 150㎕의 wash buffer (0.05% PBST) 로 3번 씻는다.

2) 회수한 세포 배양액 50㎕를 well 에 넣어준다.

3) 세포 배양액이 담긴 plate를 adhesive film으로 밀봉한 후 상온에서 shaker 위에서 200 rpm으로 2시간 방치한다.

4) Plate를 150㎕의 wash buffer로 3번 씻는다.

5) Detection antibody (anti-IFN-γ-SULFO TAG) 25㎕를 각 well에 넣어준다.

6) Plate를 adhesive film으로 밀봉한 후 상온에서 shaker 위에서 200 rpm으로 2시간 방치한다.

7) Plate를 150㎕의 wash buffer로 3번 씻는다.

8) 150㎕의 2× Read Buffer T를 각 well에 넣어준다.

9) 각 well의 IFN-γ 양은 MESO SECTOR S 600 (Meso Scale Discovery) 장비를 사용하여 측정한다.

* Commercial 항원: Mycobacterium tuberculosis CFP10: ESAT6 chimera Recombinant protein, Catalog : MBS313439(MyBioSource.com)

3. SDS-PAGE & CE-SDS 분석

1) 프로테아제(Protease) 저해제 효과

정제한 ESAT6/CFP10을 프로테아제 저해제(Protease inhibitor) 유무에 따라 샘플링하였다. 5 ㎍의 각 단백질은 5×Laemmli sample buffer와 섞어 100℃에서 10분 동안 끓이고 식힌 후, 4~12% SDS-폴리아크릴아미드 젤(polyacrylamide gel)로 분리하였다. 젤은 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 염색하여 단백질 절편(fragment)의 패턴을 비교하였다.

2) CE-SDS 시료준비

시료의 순도 및 불순물의 함량을 평가하기 위하여 CE-SDS (Maurice, ProteinSimple) 분석을 진행하였다. 분석된 시료는 2종으로 ESAT6·CFP10와 프로테아제 저해제(Protease inhibitor)가 처리된 ESAT6·CFP10 (ESAT6·CFP10+Inhibitor)이다. 시료는 환원 조건하에서 분석되었으며, β-머캡토에탄올(β-mercaptoethanol)을 이용하여 수행하였다. 분석을 위한 시료는 표 2와 같이 혼합하여 준비한다. 이후 시료는 환원을 위하여 70℃에서 10분 동안 유지하였다. 열을 가한 시료는 상온에서 5분간 방치한 후 13,000g에서 5분간 원심분리를 실시하였다. 원심분리 완료 후 상층액을 취하여 분석에 사용하였다. 시료와 함께 CE-SDS MW marker도 동일한 방법으로 준비하여 분석한다. Internal standard(IS) 10kDa을 시료와 같이 분석하여 이를 기준으로 시료의 크기와 relative migration time을 계산한다.

UV detector로 측정된 세기(intensity)에 해당하는 Area 값으로부터 각 시료의 피크(peak)에 대한 상대적인 점유율을 계산하였다.

시료가 준비되면 Maurice 시스템을 이용하여 분석을 시작한다. 분석 장비는 시작 전 최소 30분 이상 켜두어 준비한다. 분석에 사용되는 시약(reagents)과 시료를 해당하는 위치에 넣고 카트리지 (Muarice CE-SDS cartridges, ProteinSimple)를 장비에 삽입하여 분석을 시작한다. 시료의 분석조건은 표 3과 같다. 실험에 사용된 시약 및 재료는 표 4에 자세히 기술하였다.

Reagent	Reduced sample	IgG STD
Sample	45.5 μL	1 tube
Sample buffer (1×)	50 μL	50 μL
10kDa 25× internal standard	2 μL	2 μL
14.2 M ß-mercaptoethanol	2.5 μL	2.5 μL

	Reducing conditions
Step	Volage	Time
Injection	4600 V	20 sec
Seperation	5750 V	25 min

시약 및 재료명	제조사	Cat. No.
Maurice CE-SDS molecular weight	ProteinSimple	046-432
Maurice sample vial	ProteinSimple	046-083
ß-mercaptoethanol	Sigma	M6250
CE-SDS size application kit	ProteinSimple	PSMAK02-S
Muarice CE-SDS cartridges
Maurice CE-SES cartridge cleaning vials
Maurice clear screw cap
Maurice glass reagent vials
Maurice 96 well plate
Maurice CE-SDS separation matrix
Maurice CE-SDS running buffer-top
Maurice CE-SDS running-bottom
Maurice CE-SDS 1× sample buffer
Maurice CE-SDS wash solution
Maurice CE-SDS conditioning solution 1
Maurice CE-SDS conditioning solution 2
Maurice CE-SDS 25× internal standard

4. In gel digestion의 LC-MS 분석

SDS-폴리아크릴아미드 젤(polyacrylamide gel)로부터 분리한 단백질을 포함하는 밴드는 washing solution (25mM NH₄HCO₃ in 50% acetonitrile)으로 염색 시약을 제거하였다. 아세토니트릴(Acetonitrile)로 버퍼가 완전히 치환된 젤은 10 mM DTT로 56℃에서 1시간 반응하고, 남아있는 용액을 제거한 후 55 mM 이오도아세트아미드(iodoacetamide)로 처리한 뒤 세척하였다. 아세토니트릴(Acetonitrile)로 버퍼가 완전히 치환된 젤은 10 ng/μL enzyme (Trypsin/Lys-C mix)과 섞어 37℃에서 16시간 동안 반응시키고, NH₄HCO₃과 아세토니트릴(acetonitrile)로 펩타이드를 회수하고 건조하였다.

Proteomic 분석은 Easy-nano LC가 연결된 Q-exactive hybrid quadrupole orbitrap mass spectrometer를 사용해 분석하였다. 0.1% 포름산(formic acid)에 녹여진 건조된 펩타이드는 nano LC system으로 주입하였다. 펩타이드의 분리는 Easy-spray C18 column (100 Å, 5 μm, 300 μm i.d. × 50 cm; Thermo Fisher Scientific)을 사용하였고, solution A (0.1% formic acid in water)와 solution B (0.1% formic acid in acetonitrile)의 비율을 점진적 농도 구배로 (5 - 80%) 40분 동안 300 nL/min 유속으로 분리시켰다. 얻어진 데이터는 Homo sapiens (Human) database를 통해 Proteome Discoverer software (version 2.4, Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 database search 하였다.

5. 3차구조 모델링 및 안정화 돌연변이 계산

G4S linker가 연결된 ESAT6/CFP10 모델 구조는 Discovery studio 2021 (version 2021, BIOVIA)을 사용하였다. 모델 생성을 위해 ESAT6/CFP10의 X-ray 구조 (PDB:3FAV)를 모델 템플릿으로 사용했고, Build and Edit Protein과 Minimize and Refine Protein tool을 이용하여 가장 낮은 에너지 상태의 모델을 생성하였다. 생성된 모델은 Design Protein tool의 Calculate Mutation Energy를 통해 SER89, LYS120의 돌연변이로 안정화에 영향을 주는 아미노산을 계산하였다.

6. 안정성 평가를 위한 SDS-PAGE 및 RP- HPLC 분석

1) SDS-PAGE

ESAT6/CFP10 WT과 돌연변이들은 0, 4, 7, 10일간 각각 4, 37℃에서 보관 후 샘플링 하였다. 5 ㎍의 각 단백질은 5× Laemmli sample buffer와 섞어 100℃에서 10분 동안 끓이고 식힌 후, 4~12% SDS-폴리아크릴아미드 젤(polyacrylamide gel)로 분리하였다. 젤은 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 염색하여 단백질 절편(fragment)의 패턴을 비교하였다.

2) RP-HPLC

Reverse phase HPLC 분석은 1260 Infinity LC system (Agilent, USA)를 사용하였다. 10 ㎍의 단백질을 Xbridge protein BEH300 C4 (300 Å, 3.5 μm, 4.6 × 150 mm; Waters) 컬럼에 주입하였고, solution A (0.1% FA in water)와 solution B (0.1% FA in acetonitrile)의 비율을 solution B가 점진적 농도구배로 (20 - 50%) 20분 동안 분리하고, 3분 동안 100%가 되도록 한 후, 9분간 solution A를 80%로 하여 32분동안 1.44 mL/min으로 분리하였다. Detector의 UV 파장은 190~400 nm 범위에서 UV 흡수 파장은 220 nm, 280 nm을 사용하였다.

< 실시예 1> 항원성 및 안정성 평가

항원성을 평가하기 위하여 ESAT6-CFP10 단백질 처리 후 PBMC에서 IFN-γ(IGRA)의 방출을 확인하는 실험을 수행하였다. PPD를 양성 대조군으로 사용하였다. 대조군 상용 CFP10 키메라 및 재조합 ESAT6-CFP10 모두 양성 잠복 결핵 환자의 PBMC에서 농도 의존적으로 IFN-γ의 방출 수준을 증가시키는 것으로 확인되었다. 재조합 ESAT6/CFP10 단백질은 10 μg/mL의 농도에서 대조군에 비해 적어도 2배 더 높은 항원 반응성을 보였다(도 1). IFN-γ 방출 분석(IGRA)의 결과는 재조합 ESAT6/CFP10의 더 높은 항원 반응성이 엔도톡신(endotoxin)에 의해 유발된 것이 아님을 보여주었다.

항원성이 개선된 재조합 항원 ESAT6-CFP10은 시간이 지남에 따라 분해되었다. 그러나 프로테아제 저해제(Protease inhibitor)를 첨가하여 재조합 단백질의 안정성을 유지하였으며, 정제과정에서 불순물에 해당하는 프로테아제의 활성을 억제하는 결과를 SDS-PAGE와 CE-SDS를 통해 확인하였다(도 2A). CE-SDS 실험은 항원의 24%만이 프로테아제 억제제가 없을 때 온전하게 유지되는 반면 항원의 94%는 그러한 억제제의 존재하에서 온전하게 남아 있음을 보여준다(도 2B).

< 실시예 2> 항원 안정성 향상을 위한 조작

프로테아제 억제제를 첨가하지 않고 항원 ESAT6-CFP10의 안정성을 향상시키기 위해, in gel digestion에 기초한 LC-MS를 수행하여 프로테아제에 의해 절단된 약한 부위에 대한 정보를 얻었다. 본 발명자들은 SDS-PAGE에서 3개의 다른 조각 밴드(A, B, C)를 선택하고 절제하였다. 3가지 다른 프로테아제(Trypsin, chymotrypsin, Glu-C)로 처리한 후, 각 밴드의 LC-MS 실험에서 확인된 펩타이드 서열을 표적 단백질과 일치시켰다. 13kDa(A) 밴드에서 확인된 서열은 아미노산 121~204번으로 CFP10에 해당한다. 12kDa(B) 밴드에서는 ESAT6과 CFP10 서열이 모두 확인되었으며, 일부 단편화된 CFP10과 ESAT6은 아미노산 서열 17에서 82까지이며 SDS-PAGE 젤에서 완전히 분리되지 않은 것으로 예측된다. 5 kDa(C) 밴드는 주로 ESAT6(1~82)으로 식별되었다(도 3A). 젤 밴드에서 확인된 모든 펩티드는 ESAT6 및 CFP10의 나선-회전-나선을 모두 포함하고 Glu16, Glu82, Lys120 및 Glu204 아미노산은 절단의 결과로 강하게 관찰되었다. 이는 ESAT6 및 CFP10의 역평행 나선 형태의 구조가 프로테아제로부터 비교적 안정적으로 유지된다는 것을 의미한다. 3개의 아미노산은 절단의 시작 부위가 아니라 최종 생성물의 위치로 간주된다. 따라서 항원 안정화를 위한 엔지니어링은 ESAT6 및 CFP10의 링커 영역에 초점을 맞추었다. 특히 ESAT6과 CFP10을 연결하여 짧은 α-helix(88~92) 단백질의 3차 구조와 LC-MS 결과를 바탕으로 돌연변이가 도입되어야 하는 아미노산을 선별하였다. Ser89, Lys120, Glu204가 가장 유력한 후보였으며, Discovery studio 2021을 이용하여 구조적 변화에 영향을 미치지 않으면서 돌연변이 에너지가 가장 낮은 돌연변이체를 최종 선정하였다(도 3B). 일부 돌연변이체는 구조적 불안정성을 증가시키지만 Ser89가 Leu, Arg로 돌연변이 되었을 때 구조적 안정성이 증가하였다. Lys120에서 Gln으로의 돌연변이는 또한 돌연변이 에너지를 증가시켰다. 2차 구조가 없는 부위에 존재하는 Glu204를 글리신으로 대체하여 프로테아제의 영향을 받지 않도록 하였다.

< 실시예 3> SDS-PAGE & RP-HPLC를 이용한 돌연변이 안정성 시험

선택된 돌연변이체의 조합을 통해 7가지 유형의 돌연변이체를 만들었다. 온도 및 시간에 따른 항원의 안정성을 WT와 비교하였다. 먼저, 동일한 조건에서 발현 및 정제된 항원의 주 밴드의 변화를 SDS-PAGE 방법을 사용하여 프로테아제 억제제(protease inhibitor) 없이 4℃에서 0, 4, 7, 10일 동안 관찰하였다(도 4A). WT 및 204G 돌연변이체는 4일 후에 유사한 속도로 분해되기 시작하였다. 그러나 나머지 6개 돌연변이체의 안정성은 10일 후에도 유지되었다. 37℃에서의 안정성은 4℃에서의 안정성과 달랐고 거의 모든 돌연변이체가 분해되었다. 4일 후 주 밴드가 남은 돌연변이체는 DG(120G 및 204G), 120Q 및 89R 돌연변이체뿐이었다. 더욱이, 그들의 분해 패턴은 4℃의 것과 달랐다(도 4A). RP-HPLC를 이용하여 WT, 204G 및 3개의 돌연변이체(DG, 120Q 및 89R)를 정량화하였을 때 (도 4B) SDS-PAGE와 유사한 결과가 도출되었다.

< 실시예 4> 돌연변이들의 항원성 유지

WT과도 비교하여 안정성이 개선된 돌연변이체(DG, 120Q 및 89R) 3종의 항원성 평가를 말초혈액세포(PBMC)를 통하여 수행하였다. 잠복결핵 환자 2명과 일반 정상인 2명의 말초혈액세포로부터 항원성 평가 결과는 WT을 포함하여 3종의 돌연변이체는 잠복결핵 환자서만 IFN- γ (IGRA)의 분비가 증가하는 현상이 발생하였으며. 그 정도는 WT 가 비교하여 유사했다. 도입된 돌연변이가 항원성에는 영향을 주지 않은 것으로 판단된다(도 5).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Osong Medical Innovation Foundation <120> Composition for diagnosing latent tuberculosis comprising antigen with improved antigenicity and stability <130> ADP-2021-0886 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant antigen ESAT6-CFP10 120G/204G <400> 1 Gly Ser Leu Gln Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu 1 5 10 15 Ala Ala Ala Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu 20 25 30 Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly 35 40 45 Gly Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala 50 55 60 Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile 65 70 75 80 Ser Glu Ala Gly Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly 85 90 95 Met Phe Leu Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Met Ala Glu Met Gly Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln 115 120 125 Glu Ala Gly Asn Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile 130 135 140 Asp Gln Val Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly 145 150 155 160 Ala Ala Gly Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala 165 170 175 Ala Asn Lys Gln Asn Gln Glu Leu Asp Glu Leu Ser Thr Asn Ile Arg 180 185 190 Gln Ala Gly Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Gly Gln Gln Gln Ala 195 200 205 Leu Ser Ser Gln Met Glu Phe Pro Gly Arg Leu Glu Arg Pro His Arg 210 215 220 Asp 225 <210> 2 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant antigen ESAT6-CFP10 120Q <400> 2 Gly Ser Leu Gln Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu 1 5 10 15 Ala Ala Ala Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu 20 25 30 Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly 35 40 45 Gly Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala 50 55 60 Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile 65 70 75 80 Ser Glu Ala Gly Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly 85 90 95 Met Phe Leu Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Met Ala Glu Met Gln Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln 115 120 125 Glu Ala Gly Asn Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile 130 135 140 Asp Gln Val Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly 145 150 155 160 Ala Ala Gly Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala 165 170 175 Ala Asn Lys Gln Asn Gln Glu Leu Asp Glu Leu Ser Thr Asn Ile Arg 180 185 190 Gln Ala Gly Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala 195 200 205 Leu Ser Ser Gln Met Glu Phe Pro Gly Arg Leu Glu Arg Pro His Arg 210 215 220 Asp 225 <210> 3 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant antigen ESAT6-CFP10 89R <400> 3 Gly Ser Leu Gln Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu 1 5 10 15 Ala Ala Ala Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu 20 25 30 Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly 35 40 45 Gly Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala 50 55 60 Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile 65 70 75 80 Ser Glu Ala Gly Gln Ala Met Ala Arg Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly 85 90 95 Met Phe Leu Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Met Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln 115 120 125 Glu Ala Gly Asn Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile 130 135 140 Asp Gln Val Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly 145 150 155 160 Ala Ala Gly Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala 165 170 175 Ala Asn Lys Gln Asn Gln Glu Leu Asp Glu Leu Ser Thr Asn Ile Arg 180 185 190 Gln Ala Gly Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala 195 200 205 Leu Ser Ser Gln Met Glu Phe Pro Gly Arg Leu Glu Arg Pro His Arg 210 215 220 Asp 225 <210> 4 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant antigen ESAT6-CFP10 wild type <400> 4 Gly Ser Leu Gln Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu 1 5 10 15 Ala Ala Ala Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu 20 25 30 Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly 35 40 45 Gly Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala 50 55 60 Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile 65 70 75 80 Ser Glu Ala Gly Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly 85 90 95 Met Phe Leu Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Met Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln 115 120 125 Glu Ala Gly Asn Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile 130 135 140 Asp Gln Val Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly 145 150 155 160 Ala Ala Gly Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala 165 170 175 Ala Asn Lys Gln Asn Gln Glu Leu Asp Glu Leu Ser Thr Asn Ile Arg 180 185 190 Gln Ala Gly Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala 195 200 205 Leu Ser Ser Gln Met Glu Phe Pro Gly Arg Leu Glu Arg Pro His Arg 210 215 220 Asp 225

Claims

서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 ESAT6-CFP10 재조합 항원을 유효성분으로 포함하는 잠복결핵 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 항원성 및 안정성이 개선된 것을 특징으로 하는 잠복결핵 진단용 조성물.
제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 잠복결핵 진단용 키트.
제1항 또는 제2항의 조성물을 환자에서 분리된 시료와 반응시켜, 잠복 결핵 감염 여부를 분석하는 단계를 포함하는 잠복결핵 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 시료는 혈액인 것을 특징으로 하는 잠복결핵 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 잠복 결핵 감염 여부를 분석하는 단계는 인터페론 감마 분비 검사(Interferon-γ release assay, IGRA)를 통해 분석하는 것을 특징으로 하는 잠복결핵 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.