EA012436B1 - Композиции для иммунизации против микобактерий - Google Patents

Abstract

Способ формирования Т-клеточного иммунного ответа у хозяина, включающий введение векторной вакцины, содержащей нереплицирующийся или дефектный по репликации вирусный вектор, экспрессирующий продукт трансляции микобактериального гена антигена 85А. Также предложены векторные вакцины и их применения. Также предложен способ индукции ответа CD8 и CD4 Т-клеток памяти против антигена с использованием аденовирусного вектора, экспрессирующего антиген или его иммуногенный фрагмент.

Description

Настоящее изобретение относится к способу формирования Т-клеточного иммунного ответа у хозяина. Данный способ включает стадию введения векторной вакцины, содержащей нереплицирующийся или дефектный по репликации вирусный вектор, экспрессирующий продукт трансляции микобактериального гена антигена 85А (также именуемого здесь как ген Ад85А).

Все публикации, патенты и заявки на патент, процитированные здесь, полностью включены в данное описание изобретения посредством ссылки.

Предшествующий уровень техники

Туберкулез вызывается респираторным патогеном МусоЬас!ейит ЩЬетси1о818 и каждый год убивает 2 миллиона человек, преимущественно в развивающихся странах (1Шр://\у\у\у.\у1ю.т1/д1Ь/риЫ|са1юп8/д1оЬгер01/тйех.1Ит1). Единственная лицензионная вакцина против М. !иЬетси1о818, бацилла Кальметта-Герена (ВСС) (Са1тейе, А., Сиспп. (1924) Апп. 1п51. Райеиг. 38:371), представляет собой аттенуированный штамм МусоЬас!ейит Ьоу18, который в развивающихся странах обычно вводят интрадермально в виде однократной дозы новорожденным младенцам. Обзор многочисленных исследований свидетельствует о том, что вакцинация ВСС является защитной против детского менингеального туберкулеза и системных форм данного заболевания. Однако защитная эффективность является вариабельной (варьирует от 0 до 80%) (Со1йИг, С.А. е! а1. (1994). 1АМА 271:698) в отношении легочного заболевания взрослых, основной глобальной причины смертности от туберкулеза, и уменьшается со временем (81етпе, 1. А. е! а1. (1998) 1п!. 1. ТиЬегс. Ьипд Ό18. 2:200). Причина такой вариабельности не известна. Даже при этих условиях 80% младенцев во всем мире каждый год получают ВСС (1Шр://\у\у\у.\у1ю.т1/тГ-Г8/еп/Гас1104.111т1).

МусоЬас!ейит ШЬетси1о818 представляет собой внутриклеточный патоген, защитная эффективность против которого ассоциирована с поддержанием сильного, клеточно-опосредованного ответа на инфекцию, вовлекающего как СБ4+, так и СБ8+ Т-клетки, и со способностью отвечать цитокинами Т11-типа, в частности ΙΕΝ-γ (Е1упи, 1. Ь., 1. С1ап. (2001) Аппи. Вех. 1ттипо1. 19:93). Вакцинация ВСС индуцирует Тклетки, секретирующие ΙΕΝ-γ, преимущественно Т-клетки фенотипа СБ4+, которые перекрестно реагируют с белками М. ШЬегси1о818 (Ьаипок В е! а1, (1994) 1пГес1юп апй 1ттипйу 62(9):3679-87). Недавние исследования демонстрируют, что ВСС, введенная парентерально, не способна индуцировать Тклеточные иммунные ответы в слизистой оболочке легких, которые могут быть решающими для защиты против легочного заболевания.

Следовательно, существует потребность в разработке других вакцин против микобактериального заболевания.

Краткое описание сущности изобретения

В данной работе неожиданно обнаружили, что вирусные векторы, экспрессирующие микобактериальный антиген 85 А (Ад85А), могут индуцировать Т-клеточный иммунный ответ у пациента-человека при введении в виде иммуногенной композиции. Поэтому в изобретении предложен способ индукции Тклеточного иммунного ответа против микобактериального антигена у пациента-человека, включающий стадию введения указанному пациенту иммуногенной композиции, содержащей нереплицирующийся или дефектный по репликации вирусный вектор, экспрессирующий продукт трансляции микобактериального гена Ад85А. Предпочтительно, данная иммуногенная композиция представляет собой векторную вакцину. Этот подход с новой вакциной значительно улучшает силу и продолжительность Тклеточного иммунного ответа. Предпочтительно, Т-клеточный ответ представляет собой ответ Т-клеток памяти.

Антиген 85А (Ад85А) (регистрационные №№ САА17868 и ВХ842584) является членом комплекса Ад85. Он представляет собой семейство белков, включающее антигены 85А, 85В и 85С, секретируемые М. ЩЬетси1о818, ВСС и многими другими видами микобактерий (Найй, С. е! а1., (1996) 1пГес1. 1ттип. 64:3038-3047). Антиген 85А (Ад85А) является высококонсервативным у всех видов микобактерий и является иммунодоминантным в исследованиях животных и человека. Ад 85А (Ад85А) кодируется геном ГЬрА. Антиген 85А (Ад85А) из МусоЬас!епит ЩЬетси1о818 приведен в 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1 и 2 в данном описании.

В современных стратегиях индукции усиленных Т-клеточных ответов в исследовании туберкулезных вакцин использовали технологию рекомбинантных ДНК с использованием плазмидных, бактериальных или вирусных векторов и рекомбинантного белка для экспрессии антигенов М. ШЬетси1о818. Было показано, что вакцинация мышей ДНК Ад85А, повторно иммунизируемых вектором МУА, экспрессирующим Ад85А, дает степень защиты, эквивалентную ВСС, после контрольного заражения М. ШЬетси1о818 (МсЗНапе. Н. е! а1, (2002). 1пГес!. 1ттип. 70:1623-1626). Однако иммунные ответы, формируемые однократной или повторной иммунизацией одним рекомбинантным вектором МУА, были слабыми.

Для долговременной защиты против микобактериального заболевания, такого как туберкулез, считается важным поддерживать Т-клетки памяти, которые могут продолжать стимулировать защитный иммунитет в течение десятилетий.

Вторичные иммунные ответы (тетогу 1ттипе ге8роп8е8) классически приписывают повторной активации долгоживущих антигенспецифических Т-лимфоцитов, которые происходят непосредственно из

- 1 012436 дифференцированных эффекторных Т-клеток и продолжают существовать равномерно в состоянии покоя. Полагают, что эффекторные Т-клетки и Т-клетки памяти распределяются по всем тканям в организме, в частности, по эпителиальным поверхностям (таким как кожа и кишечник), где вероятной является повторная встреча с патогенами.

Было показано, что Т-клетки памяти являются гетерогенными и включают в себя по меньшей мере две субпопуляции, наделенные разной способностью к миграции и эффекторной функции (К.ешйагб1, К.Ь. е! ай, (2001) Ыа!иге. 410, 101-105). Клетки из первой субпопуляции имеют сходство с эффекторными клетками, образующимися при первичном ответе, в том, что они не имеют Ь-селектина и ССК7, представляющих собой хоминг-рецепторы лимфатических узлов, и экспрессируют рецепторы для миграции в воспаленные ткани. При повторной встрече с антигеном эти эффекторные Т-клетки памяти (ТЕМ) могут быстро продуцировать ΙΕΝ-γ или 1Ь-4, или высвобождать предварительно запасенный перфорин. Клетки из второй субпопуляции экспрессируют Ь-селектин и ССК7 и не имеют немедленной эффекторной функции. Эти центральные Т-клетки памяти (ТСМ) имеют низкий порог активации и, при повторной стимуляции во вторичных лимфоидных органах, пролиферируют и дифференцируются в эффекторы Цет, 6. е! ай, (2001). 1. Ехр. Меб. 193, 987-994).

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что дефектный по репликации вирусный вектор, экспрессирующий Ад 85А (Ад85А) (в данном случае проиллюстрированный примером МУА85А), может индуцировать высокие уровни антигенспецифических Т-клеток памяти, секретирующих интерферон-γ: как эффекторных Т-клеток памяти, так и центральных Т-клеток памяти, при использовании его одного у здоровых добровольцев, не подвергавшихся воздействию ВСС.

На протяжении последних 10 лет были разработаны новые иммунологические анализы для измерения и количественной оценки Т-клеточных ответов. Авторы настоящего изобретения использовали ЕЫ8РОТ (иммуноферментный спот-анализ от англ. Еигуте-йикеб 1ттипо5огЬеи1 зро!) анализ интерферона-гамма (ΙΕΝ-γ) в качестве основных иммунологических данных для клинических испытаний с МУА85А, поскольку секреция ΙΕΝ-у из антигенспецифических Т-клеток является самым лучшим доступным кореллятом защиты против М. 1иЬегси1о515. Кроме того, ЕБ18РОТ анализ является хорошо воспроизводимым и чувствительным методом количественной оценки числа антигенспецифических Тклеток, секретирующих ΙΕΝ-γ.

Авторы настоящего изобретения использовали два ЕЫ8РОТ анализа: ех-угуо (свежий) ЕЫ8РОТ анализ, где мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) инкубируют с антигеном в течение 18 часов для определения уровней ССК7-циркулирующих эффекторных Т-клеток, и ЕЫ8РОТ анализ в культуре, где РВМС инкубируют с антигеном в течение 10-14 суток для измерения уровней ССК7+ центральных Т-клеток памяти (Собкш е! а1, Л, 2002).

Авторы настоящего изобретения открыли, что вакцинация МУА85А индуцирует сильный ответ центральных Т-клеток памяти, специфичный в отношении антигена 85А (Ад85А), который все еще определяется через 3 недели после вакцинации, когда ответ циркулирующих эффекторных Т-клеток является практически неопределимым.

Это является первой демонстрацией того, что долговременная популяция центральных Т-клеток памяти может быть значительно усилена у пациента путем введения иммуногенной композиции, экспрессирующей микобактериальный антиген.

Подразумевается, что используемый в данном описании термин Т-клетка памяти включает как ССК.7- (эффекторные Т-клетки памяти), так и ССК7+ (центральные Т-клетки памяти) субпопуляции Тклеток. Это определение также включает как СЭ4 Т-клетки памяти, ограниченные классом II, так и СЭ8 Т-клетки памяти, ограниченные классом Ι. Предпочтительно, Т-клетки памяти, индуцированные векторными вакцинами по изобретению, характеризуются экспрессией ССК7+ на поверхности клеток. Они упоминаются в данном описании как центральные Т-клетки памяти.

Предпочтительно, ответ Т-клеток памяти, индуцированный иммуногенными композициями по изобретению, представляет собой защитный Т-клеточный ответ. Защитный иммунный ответ можно измерить с помощью иммуноанализа секреции ΙΕΝ-у, предпочтительно из антигенспецифических Т-клеток. Предпочтительно, ответ Т-клеток памяти является долговременным и сохраняется в течение по меньшей мере 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25 или более лет. Наиболее предпочтительно, защитный иммунный ответ является пожизненным.

Предпочтительно, ген Ад85А экспрессируется в вирусном векторе. Предпочтительно ген Ад85А экспрессируется в нереплицирующемся или дефектном по репликации вирусном векторе.

Термин векторные вакцины хорошо известен в данной области. Вектор, используемый в способе по изобретению, представляет собой нереплицирующийся или дефектный по репликации вирусный вектор. Используемый в данном описании термин нереплицирующийся или дефектный по репликации означает не способный к репликации в значительной степени в большинстве нормальных клеток человека. Вирусы, которые являются нереплицирующимися или дефектными по репликации, могут становиться таковыми естественным путем (например, они могут быть выделены в таком виде из природной среды) или искусственно, например путем селекции ίη νίΙΐΌ или пугем генетической манипуляции, например

- 2 012436 делеции гена, который является критическим для репликации. Обычно существует один или несколько типов клеток, в которых можно выращивать вирусы, такие как клетки СЕЕ для модифицированного вируса Анкара (МУА). В общем, вирусный вектор должен иметь способность стимулировать Т-клеточный ответ.

Примерами вирусных векторов, которые являются полезными в этом контексте, являются векторы на основе вируса осповакцины, такие как МУА или ХТУАС. Предпочтительным вирусным вектором является штамм вируса осповакцины МУА или штамм, происходящий из МУА. Альтернативы векторам на основе вируса осповакцины включают в себя векторы на основе других поксвирусов, включая векторы на основе вирусов оспы птиц, такие как векторы на основе вирусов оспы кур или оспы канареек. Особенно подходящим в качестве вектора на основе вируса оспы птиц является штамм вируса оспы канареек, известный как АЬУАС (имеющийся в продаже под названием Капарох), и штаммы, происходящие из АЬУАС, а также штамм вируса оспы кур, известный как ЕР9. Другими альтернативами являются альфавирусные векторы, аденовирусные векторы, векторы на основе вируса герпеса, флавивирусные векторы, ретровирусные векторы и векторы на основе вирусов гриппа.

Например, вектор может представлять собой вектор на основе аденовируса, не являющегося человеческим. Неожиданно обнаружили, что применение аденовирусного вектора индуцирует очень сильный ответ СБ8 Т-клеток памяти, помимо очень сильного ответа СБ4 Т-клеток памяти. Индукция ответа как СБ8, так и СБ4 Т-клеток памяти одной и той же вакциной, по-видимому, является полезной как в профилактике, так и в лечении микобактериального заболевания. Способ индукции ответа СБ8 и СБ4 Тклеток памяти в отношении антигена с использованием аденовирусного вектора, экспрессирующего антиген или его иммунногенный фрагмент, следовательно, также включен в объем данной заявки. Антиген, экспрессирующийся аденовирусным вектором, предпочтительно представляет собой микобактериальный антиген, как описано выше, наиболее предпочтительно Ад85А, но, в качестве альтернативы, может представлять собой любой другой подходящий антиген.

Объем данного изобретения охватывает также применение аденовирусного вектора, экспрессирующего антиген или его иммуногенный фрагмент, в изготовлении лекарственного средства для индукции ответа СБ8 и СБ4 Т-клеток памяти в отношении данного антигена. Предпочтительно, согласно данному изобретению предложено применение аденовирусного вектора, экспрессирующего микобактериальный антиген или его иммунногенный фрагмент, в изготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики микобактериального заболевания. Данный антиген предпочтительно представляет собой микобактериальный антиген, как описано выше, наиболее предпочтительно Ад85А, но, в качестве альтернативы, может представлять собой любой другой подходящий антиген Предпочтительно, чтобы вирусный вектор не мог вызывать серьезную инфекцию у пациента-человека.

Репликацию вируса обычно измеряют двумя путями: 1) синтез ДНК и 2) вирусный титр. Более точно, термин нереплицирующийся или дефектный по репликации, как он используется в данном описании и как он используется в отношении поксвирусов, означает вирусы, которые удовлетворяют одному из двух или обоим следующим критериям:

1) демонстрируют 1 1од (10-кратное) снижение синтеза ДНК по сравнению с копенгагенским штаммом вируса осповакцины в клетках МК.С-5 (линия человеческих клеток);

2) демонстрируют 2 1од снижение вирусного титра в клетках НЕБА (линия человеческих клеток) по сравнению с копенгагенским штаммом вируса осповакцины.

Примеры поксвирусов, которые подпадают под это определение, представляют собой МУА, ΝΥУАС и вирусы оспы птиц, тогда как вирус, который не подпадает под это определение, представляет собой аттенуированный штамм вируса осповакцины М7.

Согласно данному изобретению также предложено применение иммуногенной композиции, содержащей нереплицирующийся или дефектный по репликации вирусный вектор, экспрессирующий продукт трансляции микобактериального гена Ад85А, в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения микобактериального заболевания у пациента-человека. Предпочтительно, иммуногенная композиция представляет собой векторную вакцину. Данная иммуногенная композиция и векторная вакцина действуют путем индукции у пациента Т-клеточного иммунного ответа.

Вакцины по изобретению могут быть либо профилактическими (т.е. для предупреждения инфекции), либо вакцинами для применения после контакта с источником инфекции (т.е. для лечения после инфекции, но до начала заболевания), либо терапевтическими (т.е. для лечения заболевания), но типично будут представлять собой профилактические вакцины или вакцины для применения после контакта с источником инфекции.

Микобактериальные заболевания, которые можно лечить или предупреждать с помощью векторной вакцины по настоящему изобретению, включают в себя туберкулез, лепру, инфекцию МусоЬас1егшт аушш, нетуберкулезную микобактериальную инфекцию, язву Бурули, инфекцию или заболевание, вызванное МусоЬас1егшш Ьоу18, инфекцию, вызванную МусоЬас1егшт рага1иЬегси1о818, или родственное заболевание. Другие заболевания (т.е. немикобактериальные заболевания) включают в себя воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, аутоиммунное заболевание, рак, рак мочевого пузыря, натуральную оспу и обезьянью оспу.

- 3 012436

Можно использовать специализированные конструкции вирусных векторов для облегчения получения и применения векторной вакцины. Все векторные конструкции, раскрытые в данном описании, образуют аспекты данного изобретения. Векторные вакцины, содержащие эти вирусные конструкции, также включены в качестве аспектов данного изобретения.

Например, один или более генов антигена могут быть укорочены по С-концу или Ν-концу данного гена. Это может оказывать влияние на облегчение клонирования и конструирования векторной вакцины и, альтернативно или дополнительно, может приводить к повышенной эффективности. Способы укорочения обычно известны специалисту в данной области. Простейшим способом осуществления укорочений этого типа является применение различных хорошо известных методик генной инженерии для избирательного удаления кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты на любом конце гена антигена, а затем вставка желательной кодирующей последовательности в вирусный вектор. Например, укорочения кандидатного белка создают, избирательно используя 3'- и/или 5'-экзонуклеазные стратегии для разрушения, соответственно, 3'- и/или 5'-концов кодирующей нуклеиновой кислоты. Предпочтительно, последовательность гена дикого типа укорачивают таким образом, что экспрессируемый антиген укорачивается на 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более аминокислот относительно родительского антигена. Наиболее предпочтительно, ген антигена представляет собой Лд85Л, который укорочен на 15 аминокислот по С-концу относительно антигена Лд85Л дикого типа (8ЕО ΙΌ N0:3, продукт экспрессии 8Е0 ΙΌ N0:4).

Антигены, подходящие для применения в данном изобретении, также включают фрагменты родительского антигена, при условии, что эти фрагменты имеют антигенную детерминанту или эпитоп, общий с родительским антигеном или иммунологически идентифицируемый с родительским антигеном. Полинуклеотиды, кодирующие эти фрагменты, также подходят для применения в иммуногенных композициях и векторных вакцинах по изобретению.

Используемый в данном описании термин фрагмент относится к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, которая является такой же, как часть, но не вся, аминокислотной последовательности родительского антигена, из которого он происходит, или одним из его функциональных эквивалентов. Данные фрагменты должны содержать по меньшей мере η последовательных аминокислот из данной последовательности и, в зависимости от конкретной последовательности, η предпочтительно равно 7 или более (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или более). Маленькие фрагменты могут образовывать антигенную детерминанту.

Гены антигенов по изобретению также могут кодировать варианты или функциональные эквиваленты родительского антигена. Такая молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой природный вариант, такой как встречающийся в природе аллельный вариант, или данная молекула может представлять собой вариант, для которого не известно, что он встречается в природе. Такие не встречающиеся в природе варианты молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены с помощью методик мутагенеза, включая методики, используемые в отношении молекул нуклеиновых кислот, клеток или организмов.

Среди вариантов в этом отношении есть варианты, которые отличаются от вышеупомянутых последовательностей гена антигена нуклеотидными заменами, делениями или вставками. Данные замены, делеции или вставки могут включать один или более нуклеотидов. Данные варианты могут быть изменены в кодирующих или в некодирующих участках, или и в тех и других. Изменения в кодирующих участках могут давать консервативные или неконсервативные аминокислотные замены, делеции или вставки.

Альтернативно или в дополнение к использованию генного укорочения, ген, кодирующий антиген, может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептидную метку, так, чтобы она была ковалентно связана с антигеном при трансляции. Предпочтительно, полипептидная метка выбрана из группы, состоящей из РК метки, ЕЬАО метки, ΜΥ С метки, полигистидиновой метки или любой метки, которую можно определить с помощью моноклонального антитела. Другие примеры будут очевидны квалифицированному специалисту в данной области. В случае использования, РК метка предпочтительно имеет последовательность Рго-А8п-Рго-Ееи-О1у-Ееи-А8р. Метка этого типа может облегчать определение экспрессии антигена и клонов, экспрессирующих данный антиген, и альтернативно или дополнительно может приводить к увеличению эффективности.

Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептидную метку, может быть расположена таким образом, что после трансляции данная метка находится на С-конце или Ν-конце экспрессируемого антигена, или она может быть расположена внутри экспрессируемого антигена. Предпочтительно метка расположена на С-конце экспрессируемого антигена. Нуклеотиды, кодирующие линкерную последовательность, могут быть встроены между нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептидную метку, и нуклеиновой кислотой, кодирующей экспрессируемый антиген. Предпочтительно, линкерная последовательность, когда она экспрессируется, содержит аминокислоты С1у-8ег-11е. Более предпочтительно аминокислоты 01у-8ег-11е встроены между Ν-концевой последовательностью антигена и меткой экспрессируемого антигена. Наиболее предпочтительно экспрессируемый антиген представляет собой Ад85а (Ад85А), и РК метка расположена на С-конце гена Ад85а (Ад85А).

Ген, кодирующий антиген, также может включать лидерную последовательность. Лидерная после

- 4 012436 довательность может влиять на процессинг первичного транскрипта в мРНК, на стабильность мРНК или на эффективность трансляции. Предпочтительно, лидерная последовательность усиливает экспрессию и/или иммуногенность антигена. Повышенная иммуногенность может быть определена, например, с помощью ЕБ18Р0Т анализа в культуре и ех νίνο. Повышенный уровень экспрессии может быть определен, например, с использованием моноклонального антитела для определения количества продуцируемого белка. Предпочтительно, экспрессия и/или иммуногенность увеличиваются в 2, 3 раза или более раз по сравнению с антигеном, экспрессируемым без лидерной последовательности. Примером подходящей лидерной последовательности является ΐ-РА (тканевой активатор плазминогена) (Майи А.8. е! а1. (2000) МктоЬек 1иТес1. 2000 Νον; 2(14): 1677-85).

Предпочтительно, конструкция вирусного вектора включает укороченную по С-концу последовательность Ад85А, слитую с лидерной последовательностью ТРА. В еще одном другом предпочтительном воплощении вирусный вектор по изобретению экспрессирует укороченную по С-концу последовательность Ад85А, слитую с лидерной последовательностью ТРА и с последовательностью РК метки. Предпочтительно, лидерная последовательность слита с Ν-концом антигена, а последовательность метки слита либо внутри, либо с С-концом белка. В особенно предпочтительном воплощении конструкция вирусного вектора содержит полинуклеотид, кодирующий Ад85а (Ад85А), укороченный по С-концу на 15 аминокислот, слитый с последовательностью ТРА и с С-концевой РК меткой последовательности РгоА8п-Рго-Беи-Беи-С1у-Беи-А8р, где аминокислотные остатки С1у-8ег-11е присутствуют между последовательностью Ад85А и РК меткой (8ЕЦ ΙΌ N0:5). Предпочтительно, продукт экспрессии вирусного вектора имеет аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ N0:6.

Было обнаружено, что защитный эффект Т-клеток, отмеченный авторами данного изобретения, является особенно сильным у пациентов-людей, которые ранее подвергались воздействию микобактериального антигена. Стратегии гетерологичной первичной-повторной иммунизации индуцируют более высокие уровни ответов эффекторных Т-клеток у животных и людей, чем гомологичная повторная иммунизация той же самой вакциной (8с1ше1бег. 1. е!. а1. (1998) Να!. Меб. 4, 397-402, Мс8йапе, Н. е! а1 (2001) 1п£ес!. 1шшип. 69, 681-686).

Механизм, лежащий в основе постепенной потери эффективности ВСС (прививаемой новорожденным), когда индивидуум достигает возраста 10-15 лет, плохо понятен. Одним из возможных предположений является то, что иммунитет, формируемый ВСС, исчезает, и индивидуум становится эквивалентным хозяину, не подвергавшемуся вакцинации, который может быть вакцинирован новой кандидатной вакциной, разработанной для индукции первичного иммунитета. Хотя повторная вакцинация ВСС, повидимому, дополнительно не увеличивает защиту против ТВ (ссылка Робпдиех Ь е! а1, Байсе! 2005), включение ВСС в гетерологичный режим первичной-повторной иммунизации сохраняло бы защитные эффекты ВСС. Ранее была подтверждена иммуногенность и защитная эффективность повторной ВСС иммунизации с использованием вирусных векторов, экспрессирующих антиген 85А (Ад85А) в нескольких животных моделях (Соопе!Шеке, Ν.Ρ. е!. а1. (2003) 1. 1ттипо1. 171, 1602-1609; ^1Шаш8 А е!. а1, 1п£ес!юп апб 1ттиш1у (73(6):3814-6), но индукция защитного ответа Т-клеток памяти не была подтверждена.

Поэтому согласно данному изобретению также предложен способ усиления Т-клеточного иммунного ответа у пациента-человека, включающий стадию введения указанному пациенту по меньшей мере одного микобактериального антигена в комбинации с векторной вакциной, содержащей нереплицирующийся или дефектный по репликации вирусный вектор, экспрессирующий продукт трансляции микобактериального гена 85а (Ад85А). Предпочтительно Т-клеточный иммунный ответ представляет собой иммунный ответ Т-клеток памяти.

Согласно данному изобретению также предложено применение: (а) по меньшей мере одного микобактериального антигена; и (б) векторной вакцины, содержащей нереплицирующийся или дефектный по репликации вирусный вектор, экспрессирующий продукт трансляции микобактериального гена 85а (Ад85А), в изготовлении лекарственного средства для введения пациенту для индукции Т-клеточного иммунного ответа.

Векторную вакцину, содержащую нереплицирующийся или дефектный по репликации вирусный вектор, экспрессирующий продукт трансляции микобактериального гена 85а (Ад85А), и микобактериальный(е) антиген(ы) можно вводить одновременно, последовательно или раздельно. Например, микобактериальный(е) антиген(ы) можно вводить для примирования пациента до или после введения векторной вакцины для усиления иммунного ответа пациента на векторную вакцину.

Кроме того, согласно данному изобретению также предложен способ индукции Т-клеточного иммунного ответа у пациента-человека, включающий стадию введения указанному пациенту-человеку иммуногенной композиции, содержащей нереплицирующийся или дефектный по репликации вирусный вектор, экспрессирующий продукт трансляции микобактериального гена Ад85А, где данный пациент был подвергнут предварительному воздействию по меньшей мере одного микобактериального антигена. Предпочтительно Т-клеточный иммунный ответ представляет собой иммунный ответ Т-клеток памяти.

Согласно данному изобретению также предложено применение иммуногенной композиции, содержащей векторную вакцину, содержащую нереплицирующийся или дефектный по репликации вирусный вектор, экспрессирующий продукт трансляции микобактериального гена 85а (Ад85А), в изготовлении

- 5 012436 лекарственного средства для лечения или предупреждения микобактериального заболевания у пациентачеловека, который был подвергнут предварительному воздействию микобактериального антигена.

Микобактериальный антиген может происходить из М. 1иЬетси1о818 и/или может происходить из одной или более других микобактерий, таких как М. аушт-ш1тасе11и1аге, М. капкакп, М. тапиит и/или из М. и1сегаи8. Когда пациент был предварительно подвергнут воздействию только одного антигена, тогда данный антиген может представлять собой антиген, который дает защитный иммунный ответ против микобактериальной инфекции. В одном из воплощений данного изобретения антиген, воздействию которого был предварительно подвергнут пациент, не является Ад85А.

Альтернативно или дополнительно, пациент возможно был предварительно подвергнут воздействию одной или более самих микобактерий. Например, предварительное воздействие на пациента по меньшей мере одного микобактериального антигена может иметь место до воздействия М. ШЬегси1о5й. Альтернативно или дополнительно, предварительное воздействие на пациента по меньшей мере одного микобактериального антигена может иметь место до воздействия микобактерий из окружающей среды, таких как М. аушт-ш1тасе11и1аге, М. капкакй, М. тапиит и/или из М. и1сегатк. Предпочтительно, пациент является латентно инфицированным микобактериями. Например, данный пациент возможно был предварительно подвергнут воздействию М. 1иЬегси1о818 и может быть латентно инфицирован туберкулезом. Когда лекарственное средство предназначено для лечения пациента, который латентно инфицирован микобактерией, данное лечение предпочтительно уничтожает микобактериальную инфекцию.

Альтернативно или дополнительно, предварительное воздействие может включать неонатальную или предварительную вакцинацию ВСС. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что у добровольцев, которых ранее вакцинировали ВСС и которые затем получили повторную иммунизирующую дозу векторной вакцины по настоящему изобретению, были индуцированы значительно более высокие уровни антигенспецифических Т-клеток, секретирующих интерферон-γ, и через 24 недели после вакцинации эти уровни были в 5-30 раз выше, чем у вакцинированных, которым проводили однократную вакцинацию ВСС.

Соответственно, согласно этому аспекту изобретения предложен способ индукции Т-клеточного иммунного ответа у пациента-человека, включающий стадии воздействия на пациента по меньшей мере одним микобактериальным антигеном и усиления иммунного ответа путем введения композиции для повторной иммунизации, включающей иммуногенную композицию, содержащую нереплицирующийся или дефектный по репликации вирусный вектор, экспрессирующий продукт трансляции микобактериального гена 85а (Ад85А).

Этот аспект данного изобретения также относится к способу формирования Т-клеточного иммунного ответа у пациента-человека, включающему стадии:

1) воздействия на пациента по меньшей мере одним микобактериальным антигеном;

2) введения указанному пациенту по меньшей мере одной дозы композиции для повторной иммунизации, включающей векторную вакцину, содержащую нереплицирующийся или дефектный по репликации вирусный вектор, экспрессирующий продукт трансляции микобактериального гена 85а (Ад85А).

В одном из воплощений данного изобретения, когда пациент подвергается воздействию только одного микобактериального антигена на стадии 1), данный антиген представляет собой антиген, который дает защитный иммунный ответ, но не Ад85А.

Стадию 1) можно осуществить с пациентом любого возраста, например, в период новорожденности, в раннем детстве, во время пубертатного периода или во взрослом состоянии. Предпочтительно пациента подвергают воздействию по меньшей мере одного микобактериального антигена в период новорожденности.

Введение иммуногенной композиции может происходить по меньшей мере через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более недель, или через 0,25, 0,5, 0,75, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40 или более лет после предварительного воздействия по меньшей мере одного микобактериального антигена. Предпочтительно, когда стадию 1) осуществляют, когда пациент находится в раннем детстве, тогда стадию 2) осуществляют в раннем детстве или пубертатном возрасте.

Когда стадия 2) включает введение пациенту более чем одной дозы композиции для повторной иммунизации, тогда более чем одну дозу можно вводить в течение короткого периода времени или в течение длительного периода времени. Например, дозы композиции для повторной иммунизации можно вводить в течение периода, длящегося часы, сутки, недели, месяцы или годы. Например, вторую дозу повторной иммунизации можно вводить от 0,5 до 24 ч после первой дозы повторной иммунизации, от 1 до 7 суток после первой дозы повторной иммунизации, от 1 недели до 1 месяца после первой дозы повторной иммунизации, от 1 месяца до 6 месяцев после первой дозы повторной иммунизации, от 6 месяцев до 1 года после первой дозы повторной иммунизации, или от 1 до 2, от 2 до 5, от 6 до 10 или более чем через 10 лет после первой дозы повторной иммунизации. Эти временные интервалы с соответствующими изменениями предпочтительно также применяются к периоду между любыми последовательными дозами.

Во втором аспекте данного изобретения помимо иммунного ответа, индуцированного против антигена 85а (Ад85А), вирусный вектор стимулирует векторспецифичный Т-клеточный ответ. Согласно это

- 6 012436 му аспекту изобретения введение векторной вакцины по изобретению стимулирует Т-клеточный иммунный ответ против вируса, из которого происходит вирусный вектор. Например, применение вектора МУА в векторной вакцине по изобретению стимулирует Т-клеточный иммунный ответ против вируса осповакцины. Предпочтительно, этот Т-клеточный ответ является защитным Т-клеточным ответом. Об эффекте этого типа ранее не сообщалось, и он является явно полезным в том, что векторная вакцина играет двойную роль во-первых, в защите против микобактериальных заболеваний и, во-вторых, в защите против заболевания, опосредованного вирусами, родственными данному вектору. В случае вектора МУА таким заболеванием является натуральная оспа.

Заболевания вирусного происхождения, которые можно лечить или предупреждать с помощью векторной вакцины по настоящему изобретению, будут очевидны специалистам в данной области; их примеры включают в себя натуральную оспу, обезьянью оспу и диссеминированную инфекцию осповакциной.

Соответственно, согласно этому аспекту данного изобретения предложен способ индукции Тклеточного иммунного ответа против микобактериального антигена и вируса у пациента-человека, включающий стадию введения иммуногенной композиции, содержащей нереплицирующийся или дефектный по репликации вирусный вектор, экспрессирующий продукт трансляции микобактериального гена Ад85А, пациенту-человеку. Предпочтительно Т-клеточный иммунный ответ представляет собой ответ Т-клеток памяти.

Согласно этому аспекту данного изобретения также предложено применение иммуногенной композиции, содержащей нереплицирующийся или дефектный по репликации вирусный вектор, экспрессирующий продукт трансляции микобактериального гена Ад85А, в изготовлении лекарственного средства для индукции у пациента-человека Т-клеточного иммунного ответа против микобактериального антигена и вируса.

Вакцины по изобретению доставляют пациенту иммунологически эффективное количество по меньшей мере одного антигена. Под иммунологически эффективным количеством подразумевают, что введение этого количества индивидууму либо в однократной дозе, либо как часть серии, является эффективным для лечения или предупреждения. Это количество варьирует в зависимости от здоровья и физического состояния индивидуума, которого лечат, возраста, активности иммунной системы индивидуума, степени желательной защиты, препарата вакцины, оценки медицинской ситуации лечащим врачом и других релевантных факторов. Ожидается, что данное количество будет попадать в относительно широкий интервал, который может быть определен обычными исследованиями.

В третьем аспекте данного изобретения вирусный вектор может дополнительно экспрессировать продукт трансляции одного или более дополнительных генов антигена, которые могут быть использованы для индукции антигенспецифического иммунного ответа против таких дополнительных антигенов. Данный иммунный ответ может представлять собой СЭ8+. СЭ4+ и/или антительный ответ. Предпочтительно один или более дополнительных генов антигена происходят из М. 1иЬегси1о8к, Р1а8шобшш §р, вируса гриппа, ВИЧ, вируса гепатита С, цитомегаловируса, вируса папилломы человека, паразитов, вызывающих малярию, лейшманию, или, предпочтительно, из любого вида микобактерий. Предпочтительно, один или более дополнительных генов антигена кодируют антиген, выбранный из группы, состоящей из антигена из семейства антигена 85 из любой микобактерий или любого антигена, экспрессируемого видами микобактерий; более предпочтительно, из одного или более антигенов латентного периода, таких как 16 кДа антиген или гепарин-связывающий гемагглютинин (НВНА), или Е8АТ7, или слитый белок, известный как 72Е.

Также предусматривается, что дополнительный антиген может иметь эндогенное происхождение, чтобы индуцированный иммунный ответ был направлен против опухоли. Антигены эндогенного происхождения, которые подходят для применения в настоящем изобретении, представляют собой: белки теплового шока человека и опухолеассоциированные антигены, такие как СЕА, Р8А, Мис-1, Нег2пеи.

Вирусный вектор может быть сконструирован для экспрессии гена Ад85А и одного или более дополнительных генов антигена в виде последовательности эпитопов. Преимущественно эпитопы в последовательности многочисленных эпитопов связаны друг с другом без промежуточных последовательностей так, что исключается вещество нуклеиновых кислот и/или аминокислот, которое не является необходимым. Создания последовательности эпитопов предпочтительно можно достичь с использованием конструкции рекомбинантной ДНК, которая кодирует аминокислотную последовательность последовательности эпитопов, с ДНК, кодирующей Ад85А в той же рамке считывания, что и ДНК, кодирующая дополнительный(е) антиген(ы). В качестве альтернативы, Ад85А и дополнительный(е) антиген(ы) можно экспрессировать как отдельные полипептиды.

Согласно этому аспекту изобретения также предложено применение векторной вакцины, содержащей нереплицирующийся или дефектный по репликации вирусный вектор, экспрессирующий продукт трансляции микобактериального гена Ад85А и продукт трансляции по меньшей мере одного дополнительного гена антигена или эпитопа в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения как микобактериального заболевания, так и по меньшей мере одного дополнительного заболевания у пациента-человека путем индукции Т-клеточного ответа у данного пациента.

- 7 012436

Согласно этому аспекту изобретения векторную вакцину можно использовать для защиты как против микобактериального заболевания, так и против одного или более заболеваний, выбранных из группы, состоящей из ВИЧ, малярии и натуральной оспы, путем индукции у пациента-человека Т-клеточного иммунного ответа, предпочтительно иммунного ответа Т-клеток памяти.

Хотя векторную вакцину по настоящему изобретению можно использовать отдельно, ее можно также объединять с другими режимами вакцинации или терапевтическими режимами для лечения или предупреждения дополнительного заболевания. Следовательно, также как и предложение векторных вакцин, как описано выше, согласно данному изобретению предложена композиция, содержащая векторную вакцину по изобретению и один или более других антигенов или эпитопов, происходящих из агента, вызывающего заболевание.

Антигены и эпитопы, подходящие для применения в композициях по изобретению, могут иметь бактериальное или вирусное происхождение. Подходящие антигены можно дополнительно классифицировать как белковые антигены, углеводные антигены или гликоконъюгированные антигены. Композиции по изобретению могут включать один или более дополнительных антигенов или эпитопов. Примеры представляют собой другой микобактериальный антиген или эпитоп;

антиген или эпитоп ВИЧ;

антиген или эпитоп плазмодия;

малярийный антиген или эпитоп;

сахаридный антиген из 81тер1ососси5 рпеишошае;

белковый антиген из 8. рпеишошае (например, из ΡΙιΐΛ. ΡΗίΌ, РЫВ, РЫБ, 8р§А, Ьу1В. Ьу1С, Ьу1А, 8р125, 8р101, 8р128, 8р130 и 8р133);

антиген или эпитоп из вируса гепатита А, такого как инактивированный вирус;

антиген или эпитоп из вируса гепатита В, такие как поверхностные и/или коровые антигены; антиген или эпитоп из вируса гепатита С;

сахаридный антиген из НаеторЫ1и§ шПиепхае типа Ь;

полиомиелитные антиген(ы) или эпитопы, такие как в 1РУ (инактивированная полиовакцина); дифтерийная вакцина или составляющие ее эпитопы, или антигены, или токсоид;

столбнячная вакцина или составляющие ее эпитопы, или антигены, или токсоид; антигены или эпитопы из вирусов кори, свинки и/или краснухи;

антиген(ы) или эпитопы из вируса гриппа, такие как поверхностные белки гемагглютинин и/или нейраминидаза. Антиген из вируса гриппа может быть выбран из пандемического штамма, например, из вируса птичьего гриппа, например, штамма Η5Ν1;

антиген или эпитоп из 81арйу1ососси8 аитеик;

раковый антиген или эпитоп.

Когда используют сахаридный антиген, тогда он предпочтительно конъюгирован с носителем для усиления иммуногенности. Антигены токсичных белков могут быть детоксифицированы, при необходимости, например, химическими и/или генетическими способами.

Сахаридные антигены предпочтительно находятся в форме конъюгатов. Предпочтительные белкиносители для конъюгатов представляют собой бактериальные токсины или токсоиды, такие как дифтерийный токсоид или столбнячный токсоид. Особенно предпочтительным носителем является мутант СКМ197 дифтерийного токсина, а также дифтерийный токсоид. Другие подходящие белки-носители включают белок наружной мембраны Ν. шешпдШйщ, синтетические пептиды, белки теплового шока, коклюшные белки, цитокины, лимфокины, гормоны, факторы роста, искусственные белки, содержащие множество эпитопов человеческих 0Ό4+ Т-клеток из разных патогенов-происходящих антигенов, таких как белок N19, белок Ό из Н. 1пГ1иепуае, пневмококковый поверхностный белок РкрА, пневмолизин, белки поглощения железа, токсин А или В из С, ШГПсПе и пр.

Каждый дополнительный антиген в данной композиции обычно будет присутствовать в концентрации по меньшей мере 1 мкг/мл. В общем, концентрация любого данного антигена будет достаточной для индукции иммунного ответа против этого антигена.

В качестве альтернативы использованию дополнительных белковых антигенов в смеси можно использовать нуклеиновую кислоту, кодирующую данный антиген. Белковые компоненты смеси, таким образом, можно заменить нуклеиновой кислотой (предпочтительно ДНК, например, в форме плазмиды), которая кодирует данный белок. Аналогично, композиции по изобретению могут содержать белки, которые имитируют сахаридные антигены, например, мимеотопы или антиидиотипические антитела.

Кроме того, согласно данному изобретению также предложена композиция, содержащая векторную вакцину по изобретению и одно или более чем одно противомикробное соединение. Примерами противомикробных соединений для применения в композициях по изобретению являются противотуберкулезные, химиотерапевтические соединения, такие как рифампицин, изониазид, этамбутол, пиризинамид и т.д.

Соответственно, согласно данному изобретению предложен способ усиления Т-клеточного иммунного ответа у пациента-человека против по меньшей мере одного антигена, включающий стадию введе

- 8 012436 ния указанному пациенту векторной вакцины, содержащей нереплицирующийся или дефектный по репликации вирусный вектор, экспрессирующий продукт трансляции микобактериального гена Ад 85А (Ад85А) в комбинации с по меньшей мере одним дополнительным антигеном и/или противомикробным агентом.

Согласно данному изобретению также предложено применение: (а) векторной вакцины, содержащей нереплицирующийся или дефектный по репликации вирусный вектор, экспрессирующий продукт трансляции микобактериального гена Ад85А (Ад85А); и (б) по меньшей мере один дополнительный антиген и/или микробный агент, в изготовлении лекарственного средства для введения пациенту-человеку для индукции Т-клеточного иммунного ответа.

Векторную вакцину, содержащую нереплицирующийся или дефектный по репликации вирусный вектор, экспрессирующий продукт трансляции микобактериального гена Ад85А (Ад85А), и дополнительный антиген(ы) и/или противомикробный(ые) агент(ы), можно вводить одновременно, последовательно или раздельно. Например, векторную вакцину можно вводить для примирования пациента до введения антигена(ов)/противомикробного(ых) средств(а) или после введения антигена(ов) для усиления иммунного ответа пациента на этот антиген. Векторную вакцину и антиген(ы)/противомикробное(ые) средство(а) предпочтительно вводят в смеси.

Согласно данному изобретению также предложено применение по меньшей мере одного антигена и/или противомикробного средства в изготовлении лекарственного средства для индукции у пациента Тклеточного иммунного ответа, где данное лекарственное средство вводят вместе с векторной вакциной, содержащей нереплицирующийся или дефектный по репликации вирусный вектор, экспрессирующий продукт трансляции микобактериального гена Ад85А (Ад85А). Аналогично, согласно данному изобретению предложено применение векторной вакцины, содержащей нереплицирующийся или дефектный по репликации вирусный вектор, экспрессирующий продукт трансляции микобактериального гена Ад85А (Ад85А), в изготовлении лекарственного средства для индукции у пациента Т-клеточного иммунного ответа, где данное лекарственное средство вводят по меньшей мере с одним дополнительным антигеном и/или противомикробным средством.

Согласно данному изобретению также предложено применение по меньшей мере одного антигена и/или противомикробного средства в изготовлении лекарственного средства для индукции у пациента Тклеточного иммунного ответа, где указанный пациент был предварительно обработан векторной вакциной, содержащей нереплицирующийся или дефектный по репликации вирусный вектор, экспрессирующий продукт трансляции микобактериального гена Ад85А. Согласно данному изобретению также предложено применение векторной вакцины, содержащей нереплицирующийся или дефектный по репликации вирусный вектор, экспрессирующий продукт трансляции микобактериального гена Ад85А, в изготовлении лекарственного средства для индукции у пациента Т-клеточного иммунного ответа, где указанный пациент был предварительно обработан по меньшей мере одним антигеном и/или противомикробным средством.

Настоящее изобретение можно использовать для индукции или усиления целого ряда иммунных ответов, как описано выше. Конкретно, целью этого изобретения является именно идентификация эффективных способов иммунизации против заболеваний, в которые вовлечены микобактерии. Такие заболевания включают болезнь Гансена, туберкулез, остеомиелит, болезнь Крона, лепру, лимфаденит, болезнь Джона.

Вышеописанные аспекты данного изобретения применимы к целому ряду различных пациентов, включая, например, детей, пациентов, которые имеют ВИЧ, СПИД, имеют ослабленный/подавленный иммунитет, или которые были подвергнуты трансплантациям органов, трансплантациям костного мозга, или которые страдают от генетических иммунонодефицитов. Когда вакцина предназначена для профилактического применил, тогда пациентом может быть ребенок (например младенец или ребенок в возрасте 1-5 лет), ребенок более старшего возраста или подросток; когда вакцина предназначена для терапевтического применения, пациентом предпочтительно является взрослый. Вакцину, предназначенную для детей, также можно вводить и взрослым, например, для оценки безопасности, дозировки, иммуногенности и т. д.

Согласно данному изобретению также предложена фармацевтическая композиция, содержащая (1) иммуногенную композицию по изобретению и (2) фармацевтически приемлемый носитель.

Согласно данному изобретению предложен способ получения фармацевтического препарата, включающий стадии: (1) получения векторной вакцины по изобретению; (2) смешивания указанной иммуногенной композиции с одним или более чем одним фармацевтически приемлемым носителем.

Носитель (2) может представлять собой любое вещество, которое само не индуцирует продукцию антител, вредных для пациента, получающего данную композицию, и которое можно вводить без чрезмерной токсичности. Подходящие носители могут представлять собой большие, медленно метаболизирующиеся макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и неактивные вирусные частицы. Такие носители хорошо известны специалистам в данной области. Фармацевтически приемлемые носители могут включать жидкости, такие как вода, физиологический раствор, глицерин и этанол. В таких носите

- 9 012436 лях также могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как увлажняющие или эмульгирующие агенты, соединения, забуферивающие рН, и тому подобное. Также могут присутствовать стабилизирующие агенты, такие как трегалоза или вещества, которые обеспечивают образование водорастворимой стекловидной сахарной массы при температурах окружающей среды. Последнее включает применение смешанной технологии стабилизации растворимой стекловидной массы в формате микросфер, суспендированных в перфторуглеродных жидкостях. Липосомы также являются подходящими носителями. Детальное обсуждение фармацевтических носителей доступно в Сеппаго (2000) Кеттд1ои: ТНе 8с1еисе аиб Ргаейее о! РНагтасу. 201П еб., Ι8ΒΝ: 0683306472.

Фармацевтические композиции по изобретению также можно использовать профилактически, например, в ситуации, когда ожидается контакт с микробами и когда следует предотвратить инфицирование. Например, данную композицию можно вводить перед хирургическим вмешательством.

Фармацевтическая композиция является предпочтительно стерильной. Она является предпочтительно апирогенной. Она является предпочтительно забуференной, например, от рН 6 до рН 8, обычно около рН 7. Предпочтительно данная композиция является, по существу, изотоничной жидкостям из организма человека.

Композиции по изобретению можно вводить множеством разных путей. Некоторые пути могут быть предпочтительными для определенных композиций, как приводящие к формированию более эффективного ответа, или за счет меньшей вероятности индукции побочных эффектов, или в результате более легкого введения.

Например, композиции, используемые в этом изобретении, можно вводить многими путями, включая, но не ограничиваясь этим, пероральное, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, интрамедуллярное, интратекальное, интравентрикулярное, трансдермальное или чрескожное применения, подкожный, интраперитонеальный, интраназальный, энтеральный, местный, сублингвальный, интравагинальный или ректальный способы. Композиции могут быть приготовлены для интраназального введения в виде назального спрея, назальных капель, геля или порошка, или в виде инъецируемых препаратов в виде либо жидких растворов, либо суспензий; также могут быть получены твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией.

Прямая доставка композиций обычно будет осуществляться путем инъекции, подкожно, интраперитонеально, внутривенно или внутримышечно, интраназально, или доставка будет осуществляться в интерстициальное пространство ткани. Дозировка при лечении может представлять собой схему с однократной дозой или со многими дозами.

Различные аспекты и воплощения настоящего изобретения теперь будут описаны более подробно с помощью примера со ссылкой на следующие графические материалы.

Краткое описание графических материалов фиг. 1: Медиана ΙΡΝ-γ ответов, определенных с помощью ЕЬ18РОТ, после вакцинации в каждой группе вакцинации: только ВСС; только МУА85А; первичная иммунизация ВСС - повторная иммунизация МУА85А. (а) временная шкала для вакцинаций (недели) в каждой группе; (б) ответы на очищенное белковое производное туберкулина (РРЭ); (в) ответы на очищенный белок антиген 85 (Ад85А); (г) ответы на суммарные объединенные пептиды; (д) для каждого из трех измеренных антигенов ответы между каждой группой вакцинации в каждый момент времени сравнивали с использованием статистики МаннаУитни. Указаны статистически достоверные сравнения; (е) обнаружение Т-клеточных эпитопов после повторной МУА иммунизации у индивидуумов, вакцинированных ВСС. Все ответы на индивидуальные пептиды были полностью отменены СЭ4+ Т-клеточным истощением;

фиг. 2: Скрининг ответов крови, определенных с помощью ЕЫ8РОТ в культуре, на РРИ М.1Ь; РРИ М.аущт и рекомбинантный антиген 85А (Ад85А); от 4 добровольцев в исследовании только МУА85А, до вакцинации; каждый доброволец идентифицирован кодом ТХХХХХХ, где первые три X соответствуют номеру испытания, а последние три X соответствуют номеру добровольца, например, Т002022 означает, что Т002 представляет собой номер испытания, а 022 представляет собой номер добровольца;

фиг. 3: Ответы ЕЫ8РОТ в культуре (меченая культура) и ех νίνο на пулы пептидов Ад85А (обозначенных прописными буквами) у пяти добровольцев (каждый идентифицирован кодом ТХХХХ, где ХХХХ представляет собой номер из четырех цифр, причем первая цифра соответствует номеру испытания, и вторая, третья и четвертая цифры соответствуют номеру волонтера, например, Т2003 означает, что Т2 представляет собой номер испытания, а 003 представляет собой номер волонтера (Т2 является тем же самым, что и Т002 на фиг. 2, приведенной выше), через три недели после проведения однократной иммунизации МУА85А. Ответы после вакцинации являются очень сильными и более сильными, чем ответы до вакцинации. Добровольцы ранее не были вакцинированы ВСС;

фиг. 4: Последующее наблюдение Т-клеточных ответов на МУА-Ьас-х, который используют в качестве антигена в ЕЫ8РОТ анализе ех νίνο у здоровых добровольцев, иммунизированных МУА-85А, иммунизированных один раз в неделю 1. Добровольцев ранее вакцинировали ВСС;

фиг. 5(а): Медиана ответов в ЕЫ8РОТ на РРЭ. рекомбинантный антиген 85А (Ад85А) и на суммарные пептидные пулы антигена 85А (Ад85А) после однократной вакцинации МУА85А у субъектов, латентно инфицированных М.(Ь;

- 10 012436 фиг. 5(б): Сравнение МУА85А-индуцированных ответов на суммарные объединенные пептиды антигена 85А (Ад85А) у субъектов, примированных ВСО (Т005, т.е. испытание 5; смотри пример 1), и субъектов, латентно инфицированных МбЬ (Т007, т.е. испытание 7);

фиг. 5(в): Сравнение МУА85А-индуцированных ответов на рекомбинантный антиген 85А (Ад85А) у субъектов, примированных ВСО (Т005), и субъектов, латентно инфицированных М.1Ь (Т007);

фиг. 6(а): Постоянство МУА85А-индуцированных иммунных ответов в течение по меньшей мере 1 года после вакцинации в группе субъектов с длительным (более 10 лет) интервалом между первичной (ВСО) и повторной (МУА85А) иммунизациями;

фиг. 6(6): Постоянство МУА85А-индуцированных иммунных ответов в течение по меньшей мере 1 года после вакцинации в группе субъектов с коротким (1 месяц) интервалом между первичной (ВСО) и повторной (МУА85А) иммунизациями;

фиг. 7(а): Отсутствие корелляции между интервалом между ВСО и МУА85А вакцинациями и Тклеточными ответами на суммарные пептидные пулы антигена 85А (Ад85А) через 1 неделю после введения МУА85А;

фиг. 7(б): Отсутствие корелляции между интервалом между ВСО и МУА85А вакцинациями и Тклеточными ответами на суммарные пептидные пулы антигена 85А (Ад85А) через 24 недели после введения МУА85А;

на фиг. 8(а) показаны средние уровни ΙΡΝ-γ после вакцинации;

на фиг. 8(б) показаны средние уровни ΙΡΝ-у после стимула;

на фиг. 9(а) показаны ΙΡΝ-γ ответы, определенные в ЕЬ18РОТ ех-νίνο, на МУА85А у добровольцев из Великобритании, не подвергавшихся воздействию ВСО; и на фиг. 9(б) показаны ΙΡΝ-γ ответы, определенные в ЕЫ8РОТ ех-νίνο, на МУА85А у добровольцев из Гамбии, не подвергавшихся воздействию ВСО.

Примеры

Пример 1. Вакцина МУА85А

Конструкция МУА85А была описана ранее (Мс8йапе, Н. е1 а1. (2002) 1пГес1. 1ттип. 70, 1623-1626). МУА85А клинического качества была получена ИпрГкЮПЗтегке Эеккап-Тотаи в соответствии с хорошим стандартом производственной практики. Свидетельство об освобождении от уплаты налогов для врачей и стоматологов было выдано Регулирующим агентством по медицинским продуктам и продуктам для заботы о здоровье (Мебкшек апб НеаИйсате ргобпс1к К.еди1а1оту Адепсу), Лондон, для применения МУА85А в клинических испытаниях.

Клинические испытания

Добровольцев для исследований иммунизации набирали в соответствии с протоколами, одобренными Комитетом по этике научных исследований Оксфордшира (ОхГотбкЫте Яекеатсй Ебпск СоттШее), и регистрировали только после получения письменного информированного согласия. Возрастной диапазон для включения в испытание составлял 18-55 лет, и все исследованные добровольцы были серонегативными на ВИЧ, НВУ (вирус гепатита В) и НСУ (вирус гепатита С) при скрининге. До вакцинации выполняли обычные лабораторные исследования по гематологии и биохимии, и все значения находились в пределах нормы. Всех добровольцев наблюдали в течение 6 месяцев, причем образцы крови отбирали в определенные моменты времени. Пациенты, которые получали иммунизации МУА85А, заполняли ежедневные карты, фиксирующие местные и системные побочные эффекты и температуру тела в течение 7 суток после вакцинации.

Вакцинации

Первые два испытания были проведены на здоровых добровольцах, не подвергавшихся воздействию ВСО, что было установлено с использованием пробы Гифа (НеаГ 1ек1). Проба Гифа включает помещение очищенного белкового производного туберкулина (РРИ) на кожу и затем использование пистолета для производства множества проколов. Положительным ответом является более чем 4 папулы в местах проколов через 72 ч. Положительная кожная проба указывает на активную туберкулезную инфекцию или предварительную вакцинацию ВСО. Добровольцев с отрицательной (балл 0) пробой Гифа (эквивалентной туберкулиновому кожному тесту 0 мм) вакцинировали либо ВСО (однократная иммунизация штаммом ВСО О1ахо, 100 мкл вводили внутрикожно, п=11), либо МУА85А (5х10⁷ БОЕ (бляшкообразующих единиц), введенных интрадермально, 2 иммунизации проводили с интервалом 3 недели, п=14). В третьем испытании набирали добровольцев, которые ранее были вакцинированы ВСО (п=17). Медиана времени между вакцинацией ВСО и иммунизацией МУА85А составляла 18 лет (интервал от 0,5 до 38 лет). Добровольцев с пробой Гифа, не превышающей уровень ΙΙ (эквивалентный туберкулиновой кожной пробе <15 мм), регистрировали для испытания и иммунизировали однократной дозой 5 х 10 БОЕ МУА85А интрадермально в кожу, находящуюся над дельтовидной мышцей руки, противоположной по отношению к руке, в которую осуществляли вакцинацию ВСО. В целом, 31 здорового добровольца вакцинировали МУА85А. 11 из 14 добровольцев, не подвергавшихся обработке ВСО, получали 2 иммунизации с интервалом 3 недели. Остальные 3 получали однократную иммунизацию. Все 17 добровольцев, примированных ВСО, получали однократную иммунизацию МУА85А. Все добровольцы завершили 6

- 11 012436 месячный период наблюдения, и ни в одном из этих испытаний не было серьезных или тяжелых неблагоприятных событий.

Показатели иммуногенности

Главным иммунологическим показателем, используемым для определения иммуногенности вакцины, был анализ ΙΡΝ-γ с помощью ЕЫ8РОТ ех νίνο. Его осуществляли на крови, взятой в следующие моменты времени: в момент скрининга до туберкулиновой кожной пробы и затем через 1,4, 12 и 24 недели после вакцинации. Эти измерения осуществляли на свежих РВМС, используя РРЭ туберкулина (20 мкг/мл, 88Ι), комплекс очищенного антигена 85 (Ад85А) (10 мкг/мл) и 7 пулов 9-10 15-мерных пептидов, имеющих перекрытие в 10 аминокислот (конечная концентрация каждого пептида в лунке для ЕЬ18РОТ 10 мкг/мл). Вкратце, 300000 РВМС на лунку в 100 мкл К.10 (КРМ1 плюс 10% фетальной телячьей сыворотки) непосредственно высевали на планшет для ЕЫ8РОТ (МА1Р 84510, Мййроге) в присутствии антигена и инкубировали в течение 18 ч. Во всех анализах в качестве положительных контролей использовали стрептокиназу (250 ед./мл)/стрептодорназу (12,5 ед./мл) и фитогемагглютинин (10 мкг/мл). Анализы осуществляли в двойной повторности и результаты усредняли.

Картирование эпитопов

Ответы на индивидуальные пептиды тестировали на первом или последующем образце после вакцинации. Истощение с использованием магнитных шариков (Эупа1) осуществляли на индивидуальных пептидных ответах. Истощения СЭ4+ и СЭ8+ Т-клеток осуществляли посредством 30-минутной инкубации с моноклональными антителами на СЭ4 и СЭ8. коньюгированными с железными шариками, в соотношении 5 шариков на 1 клетку, используя М-450 (Эупа1, О§1о, Νοητήν) в 200 мкл К10 на льду. Клетки, покрытые антителами, удаляли с использованием магнита (Эупа1). Образцы анализировали в отношении групп с неистощенными, истощенными СЭ4+ и истощенными СЭ8+ Т-клетками. Истощения клеток подтверждали с помощью РАС8 сканирования, и они всегда составляли >90% для СЭ8+ Т-клеток и >97% для СЭ4+ Т-клеток (данные не показаны).

Анализ иммуногенности

Данные ЕЬ18РОТ анализировали путем вычитания среднего количества пятен в контрольных лунках, содержащих только среду и клетки, из среднего количества пятен в лунках с антигенами или пептидными пулами и клетками. Количества менее 5 пятен/лунку не учитывали. Лунка считалась положительной, если количество было по меньшей мере в два раза выше, чем в лунках с отрицательным контролем, и по меньшей мере на 5 пятен больше, чем в лунках с отрицательным контролем. Для лунок с пептидными пулами результаты суммировали по всем пептидным пулам для каждого добровольца в каждый момент времени. Например, там, где присутствуют 7 пептидных пулов, каждый из которых содержит 910 пептидов, каждый пул тестируют в двойной повторности. Для получения результата для этого пула рассчитывают среднее этой двойной повторности для каждого пула и вычитают среднее для лунки с отрицательным контролем. Результаты для 7 индивидуальных пулов затем складывают вместе. При этом потенциально будут дважды учитывать Т-клетку, которая отвечает на любой из 10-мерных перекрывающихся участков, которые встречаются в двух пулах со смежными пептидами.

Статистический анализ

Анализ дисперсии повторных измерений с использованием исходного результата при скрининге в качестве ковариации осуществляли на логарифмически преобразованных данных для сравнения групп. Затем для всех сравнений между группами использовали критерий Манна-Уитни, а для попарного сравнения скрининговых и 24-недельных образцов в группе с первичной иммунизацией ВСС -повторной иммунизацией МУА85А использовали критерий Уилкоксона (^Неохоп).

Метод ЕЫ8РОТ в культуре

Для ЕЫ8РОТ в культуре, 1х10⁶ хранившихся при криогенной температуре РВМС стимулировали 20 мкг/мл М.1Ь РРЭ (РРЭ-Т), М.атшш РРЭ (РРЭ-А) или 10 мкг/мл рекомбинантного антигена 85А (Ад85А) в 24-луночном планшете. После 3-суточного периода инкубации при +37°С в атмосфере 5% СО₂ удаляли 500 мкл клеточного культурального супернатанта и заменяли 5 МЕ/мл Ьутр1юеи11-Т (Вю1е5Г Пге1е1ей, Сегтапу) в К10. Эту процедуру повторяли на 7-е сутки. На 9-е сутки клетки промывали три раза и оставляли в покое на ночь при +37°С в атмосфере 5% СО₂ в К10. На 10-е сутки клетки промывали и ресуспендировали в 2 мл К10, 50 мкл культивируемых клеток (2,5х10⁴ первоначально посеянных клеток) переносили в дублированные лунки на планшете для ЕЬ18РОТ и стимулировали в течение 18 ч с помощью РРЭ-Т 20 мкг/мл, РРЭ-А 20 мкг/мл и Ад85А 10 мкг/мл. Планшет для ЕЫ8РОТ затем проявляли, как описано ранее.

Результаты

Иммунизация МУА85А была безопасной и хорошо переносимой (табл. 1). Сравнивали кинетику и амплитуду антигенспецифического Т-клеточного ответа, индуцированного вакцинацией только ВСС, только МУА85А и первичной иммунизацией ВСС - повторной иммунизацией МУА85А. В анализах все три схемы вакцинации индуцируют значительные иммунные ответы с использованием в качестве антигена любого из РРЭ-Т, белка антигена 85 (Ад85А) или перекрывающихся пептидов из антигена 85А (Ад85А) (табл. 2, фиг. 1). Имел место статистически достоверный основной эффект вакцины в группе

- 12 012436

ΡΡΌ-Τ (Ρ = 3,624; Р = 0,037), антигена 85 (Лд85Л) (Ρ = 16,605; Р < 0,001) и суммарных объединенных пептидов антигена 85 А (Ад85А) (Ρ 39,982; Р < 0,001). Иммунизация ВСС индуцировала умеренные уровни антигенспецифических Т-клеток, секретирующих ΙΡΝ-γ, которые имели пик через 4 недели после иммунизации (табл. 2, фиг. 1б-г). Ответы на объединенные пептиды антигена 85А (Ад85А) после вакцинации ВСС были удивительно слабыми (фиг. 1г). Только 4 из 11 добровольцев отвечали на любой из 7 пептидных пулов в анализе ЕЬ1§РОТ ех-νίνο. Все эти ответы на пептидные пулы относились к пептидам 12, 13, 27 и 28 и полностью отменялись истощением СЭ4+ Т-клеток.

Таблица 1. Сопутствующие неблагоприятые события после иммунизации МУА85А

Неблагоприятое событие	Количество субъектов (п ~ 31)
Местное	Краснота	31
	Зуд	31
	Боль	30
	Уплотнение	31
Системное3	Лихорадка**	5
	Гриппозное состояние	11
	Артралгия	10
	Головная боль	и
	Миалгия	12
	Тошнота	3
	Вазовагальный обморок	1 (предыдущая история вазовагальных приступов)
	Изменения в гематологии/биохимии

Не было различий ни в частоте, ни в тяжести описанных нежелательных событий между группами добровольцев, не подвергавшихся воздействию ВСС и подвергавшихся первичной иммунизации ВСС

Все системные симптомы проходили в течение 7 суток

Интервал 37,7-38,1°С; все спонтанно проходило в течение 24 ч

У добровольцев, не подвергавшихся воздействию ВСС, однократная иммунизация МУА85А индуцировала высокие уровни антигенспецифических Т-клеток, секретирующих ΙΡΝ-γ, которые достигали пика через 7 суток после вакцинации у 13/14 добровольцев (табл. 2, фиг. 1б-в). К 4 неделям этот ответ падал до уровня, лишь слегка превышающего исходный. Не наблюдалось усиливающего эффекта второй вакцинации МУА85А, проведенной на 3-ей неделе. У одного добровольца после иммунизации МУА85А не обнаруживались специфические к вставке Т-клетки, однако у этого добровольца обнаруживались специфические Т-клеточные ответы на вектор МУА, несмотря на то, что он не имел предыдущей истории иммунизации вирусом осповакцины (данные не показаны). Затем исследовали ответы на МУАЧае-Ζ у добровольцев, вакцинированных МУА85А, путем проведения анализов ЕЫ8РОТ ех-νίνο с использованием антигена МУАЧае-Ζ. Методология анализа является такой же, как обсуждалось выше в Показателях иммуногенности. Здоровые добровольцы, вакцинированные МУА85А, демонстрировали сильные анти-МУА Т-клеточные ответы, которые длились в течение вплоть до 24 недель после вакцинации.

В отличие от ВСС вакцинации вакцинация МУА85А индуцировала сильные ответы на некоторые пептидные пулы у всех 13/14 отвечающих добровольцев (табл. 2, фиг. 1 г). Были зарегистрированы ответы на широкий спектр пептидов по всей длине антигена 85А (Ад85А). Все эти ответы на индивидуальные пептиды полностью отменялись истощением СЭ4+ Т-клеток (данные не показаны).

У 16/17 добровольцев в группе с первичной иммунизацией ВСС - повторной иммунизацией МУА85А наблюдали значительное увеличение числа антигенспецифических Т-клеток через 1 неделю после вакцинации (табл. 2, фиг. 1). Максимальный ответ через 1 неделю после иммунизации был значительно выше в группе с первичной иммунизацией ВСС - повторной иммунизацией МУА85А, чем в любой из групп с иммунизацией только ВСС или только МУА85А (фиг. 1б-д). Эти ответы поддерживались на значительно более высоком уровне, чем после вакцинации только ВСС или только МУА85А, в течение по меньшей мере 24 недель (фиг. 1д). Исходные ответы при скрининге были более сильными у добровольцев, ранее вакцинированных ВСС, чем в группе добровольцев, не подвергавшихся воздействию ВСС, как ожидалось. Тем не менее, ответы через 24 недели после вакцинации МУА85А в группе с первичной иммунизацией ВСС - повторной иммунизацией МУА85А были значительно более сильными, чем исходные показатели в этой группе для ΡΡΌ (Уилкоксон ζ = -3,010, Р = 0,003), антиген 85 (Ад85А) (Уилкоксон ζ = -3,516, Р < 0,001) и суммарные объединенные пептиды (Уилкоксон ζ = -3,408, Р = 0,001).

Широта пептидных ответов, наблюдаемых в группе, иммунизированной только МУА85А (не пока

- 13 012436 зано), и в группе с первичной иммунизацией ВСС - повторной иммунизацией МУА85А (фиг. 1е) была очень сходной. Однако амплитуда ответов была значительной выше в группе с первичной иммунизацией ВСС - повторной иммунизацией МУА85А (фиг. 1д). РВМС от 12 добровольцев в группе с первичной иммунизацией ВСС - повторной иммунизацией МУА85А анализировали со всеми 66 пептидами из антигена 85А (Ад85А). Некоторые из этих пептидов распознавались более чем у 50% субъектов (фиг. 1е), иллюстрируя различное распознавание этих пептидов разными молекулами НЬА Класса II, как сообщалось ранее (Ьаипо1к, Р. е1 а1. (1994) 1и£ес1. 1ттип. 62, 3679-3687.

Таблица 2. Среднее арифметическое (8Е) и медиана (ΙΟΚ) ответов в ЕЫ8РОТ на РРБ, антиген 85 (Ад85А) и суммарные объединенные пептиды в каждой группе вакцинации в каждый момент времени.

Время после вакцинации (недели)

ΡΡϋ, среднее

Антиген 85,

Суммарные объединенные пептиды арифме-

Группа	арифметическое	среднее арифме-	____тнческое среднее мсДиана
вакцинации	Кол-во	(5Е)	медиана <25-75%)тическое (ЗЕ)	медиана (25-75%)	' (25-75%)
вс©	11	15(6}	0(0-28)	6(5)	0(0-0)	15(4)	20 (0-22)
МУА85А ВСО-	14	18(7)	0(0-22)	4(4)	0(0-0)	3(3)	0(0-0)
ΜΫΜ5Α	17	129(33)	60 (26-218)	24(6)	18(0-37)	26(11)	0(0-^50)
вес	11	173(52)	132 (42-249)	79(22)	82 (23-122)	38(9)	2В (20-52)
МУАВбА всс-	14	460(93)	434 (175-553)	419 (98)	338 (140-540)	1365 (378)	1153(531-1432}
М7А05А	17	917 (148)	783 (403-1653)	895 (150)	707 (438-1653)	3248(592)	2455 (1315-5187)
ВСС	11	233(60)	182 (104-314)	64(12)	67 (37-94)	31(7}	35 (13-40)
ΜνΑ85Α ВСО	14	107 (21)	81 (53-167)	117(42)	65(33-138)	306(95)	156 (60-533)
МУА65А	17	362(86)	343 <165—421)	341 (67)	322(180-405)	1123(256)	953 (609-1219)
вес	11	76(25)	47 (27-85)	21(8)	15(0-33)	15(9)	0(0-17)
МУА85А всс-	14	70(25)	41 (22-02)	59(26)	27(18-52)	167(58)	68 ¢21-205)
МУА85А	17	299(83)	223 (68-387)	227(72)	92 (42-287)	739 (199)	390 (212-910)
все	11	53 «17)	53(10-95)	12(6)	0(0-22}	23(7)	20 (0-35)
МУА85А ВСО	14	62(19)	38(25-63)	32(13)	18(0-45)	113(27)	105 (32-152)
МУА85А	16	328(89)	249 (150-385)	240(77)	119 (82-293)	669 (177)	385 (223-1043)

Амплитуда Т-клеточных ответов, наблюдаемых в группе, иммунизированной только МУА85А, является примерно в 10 раз более сильной, чем амплитуда, которую наблюдали с другими рекомбинантными МУА, используемыми до настоящего времени (МсСопкеу, 8.1. е1 а1., Епйапсей Т-се11 иптиподешсИу о£ р1акт1й ΩΝΛ уассшек ЬооЧей Ьу гесотЬшап! тойШей уассша νίπικ Апкага ίη йитапк. N1. Мей., 9, 729-735 (2003)); М^аи, М. е1 а1., А йитап 1ттипойе1ю1епсу νίπικ 1 (Н1У-1) с1айе А уассше ш с11шса1 ΐήа1к: кПтЫаПоп о£ Н1У-кресШс Т-се11 гекропкек Ьу ^NА апй гесотЬшап! тойШей уассша νίπικ Апкага (МУА) ш йитапк, I. Сеп. У1го1., 85, 911-919 (2004)). Рекомбинантный МУА, экспрессирующий антиген из Р. £а1с1рагит, индуцировал средний суммарный пептидный ответ 908ЕС/106 РВМС через 7 суток после вакцинации (МсСопкеу, 8.1. е1 а1. (2003) Νΐ. Мей. 9, 729-735). В отличие от этого, авторы данного изобретения наблюдают средний ответ на суммарные пептиды 1365 8ЕС/106 РВМС через 7 суток после вакцинации МУА85А (табл. 2). Одним из объяснений этого является то, что эти добровольцы имеют некоторый предсуществующий антимикобактериальный иммунитет, который усиливается иммунизацией МУА85А. Чтобы дополнительно исследовать это, авторы данного изобретения использовали ЕЫ8РОТ анализ в культуре, а не ЕЫ8РОТ анализ ех-У1уо. Ранее было показано, что ЕЫ8РОТ анализ в культуре определяет центральные Т-клетки памяти, а не активированные эффекторные Т-клетки, которые определяются в ЕЫ8РОТ ех-У1уо (РеесеЛУ.Н. е1 а1. (2004) №11. Мей. 10, 406-410, Сойкш, А.1. е1 а1. (2002) I. 1ттипо1. 169, 2210-2214).

Анализ ΙΕΝ-γ с помощью ЕЫ8РОТ в культуре осуществляли на скрининированных РВМС до вакцинации от 4 добровольцев в группе, иммунизированной только МУА85А. Клетки культивировали с РРБ М.!Ь, РРБ М.аушт и рекомбинантным антигеном 85А (Ад85А). Все 4 добровольца отвечали на РРБ М.аушт, 2/4 отвечали на РРБ М.!Ь и 2/4 отвечали на рекомбинантный антиген 85А (Ад85А) (фиг. 2). Ни один из этих добровольцев не имел каких-либо исходных ответов ни на РРБ М.!Ь, ни на очищенный антиген 85 (Ад85А) при скрининге с помощью ЕЫ8РОТ ех-У1уо.

Для дальнейшего исследования индукции ответа Т-клеток памяти после вакцинации МУА85А осуществляли ЕЫ8РОТ анализ ех-У1уо и в культуре на 3-ей неделе после вакцинации РВМС. Клетки культивировали с РРБ М.!Ь, РРБ М.аушт и рекомбинантным антигеном 85А (Ад85А). На 3-ей неделе ответ ех-У1уо является очень слабым или недетектируемым, однако у всех 5 исследованных добровольцев наблюдались сильные ответы в ЕЫ8РОТ в культуре, что указывает на индукцию вакцинацией центральных Т-клеток памяти, специфических в отношении антигена 85А (Ад85А) (фиг. 3).

Пример 2. Данные по безопасности и иммуногенности у субъектов, которые являются латентно инфицированными М.!Ь здоровых взрослых, которые были латентно инфицированы МусоЬас1епит 1иЬегси1ок1к (М.!Ь), вакцинировали МУА85А. Сывороточные маркеры воспаления определяли у каждого субъекта после вакцинации с регулярными интервалами в течение двенадцати месяцев. У каждого субъекта до вакцинации и через 10 недель после вакцинации осуществляли КТ (компьютерная томография) сканирование

- 14 012436 легких высокого разрешения. Эти анализы проводили для того, чтобы определить любые субклинические признаки воспаления легких. Результаты ЕЬ18РОТ ех νίνο от 9 латентно инфицированных добровольцев показаны на фиг. 5а.

Безопасность МУА85А в этой группе идентична безопасности, наблюдавшейся в предыдущих испытаниях, описанных в примере 1. Не обнаружили увеличения ни местных, ни системных побочных эффектов и не обнаружили никаких признаков какого-либо воспаления легких. После вакцинации не было изменений в маркерах воспаления, и после вакцинации не было воспаления легких, регистрируемого КТ сканированием. Для сравнения, 17 здоровых взрослых, которые ранее получали инъекцию ВСС от 0,5 до 37 лет назад, подвергали повторной иммунизации вакциной МУА85А. Результаты описаны в примере 1. Иммунные ответы после вакцининации, наблюдаемые в латентно инфицированной группе (испытание 7, Т007), имеют амплитуду, аналогичную амплитуде ответов, наблюдаемой в группе, получившей первичную иммунизацию ВСС (испытание 5, Т005). Результаты показаны на фиг. 5б и 5в.

Эти данные являются значимыми, так как важно, что любая новая ТВ вакцина является безопасной у латентно инфицированных субъектов, при условии преобладания латентной инфекции во всем развивающемся мире. Кроме того, обнадеживающая иммуногенность поддерживает применение этой вакцины в качестве вакцины для применения после контакта с источником инфекции, вводимой латентно инфицированному человеку с целью уничтожения такой латентной инфекции.

Продолжительность иммунного ответа

Ответы, регистрируемые в ЕЬ18РОТ ех-νίνο у добровольцев, примированных ВСС, после повторной иммунизации МУА85А длятся в течение по меньшей мере 1 года после вакцинации как при коротком (1 месяц), так и при длительном (более 10 лет) интервале между первичной (ВСС) и повторной (МУА85А) иммунизациями.

Данные долгосрочного наблюдения за 12 добровольцами, вакцинированными МУА85А более чем через 10 лет после ВСС, и за 10 добровольцами, вакцинированными МУА85А через 1 месяц после ВСС, показаны на фиг. 6. Данные из обеих групп добровольцев показывают, что постоянство иммунных ответов через 1 год после вакцинации имеет ту же амплитуду, которая наблюдается через 6 месяцев после вакцинации.

Постоянство иммунных ответов, индуцированных вакциной, демонстрирует индукцию вторичного иммунного ответа (тетогу гекропке). Нельзя было бы ожидать наблюдения постоянных ответов, индуцированных вакциной, через 1 год после вакцинации нереплицирующейся вакциной, если бы не был индуцирован вторичный иммунный ответ.

Корреляция между интервалом первичной иммунизации - повторной иммунизации и уровнем иммунного ответа

Данные, представленные на фиг. 3, показывают, что усиление иммунных ответов, индуцированных ВСС, наблюдаемое после повторной вакцинации МУА85А, не зависит от интервала между первичной иммунизацией ВСС и повторной иммунизацией МУА85А. Равное усиление наблюдали при коротком (1 месяц) и длительном (более 10 лет) интервале повторной иммунизации.

Не существует корреляции между интервалом между первичной (ВСС) и повторной (МУА85А) вакцинациями, и пиком (1 неделя), и плато (6 месяцев) иммунных ответов, индуцированных МУА85А (фиг. 7).

Таким образом, одинаково возможным является усиление иммунитета против микобактерий как вскоре после вакцинации ВСС (например в раннем детстве в развивающихся странах), так и в более поздние моменты времени (например в пубертатном возрасте). Как повторная иммунизация в раннем детстве, так и повторная иммунизация в пубертатном возрасте являются возможными вариантами для исследований эффективности и потенциальных показаний для бустерной ТВ вакцины.

Иммуногенность и защитная эффективность первичной иммунизации ВСС -повторной иммунизации МУА85А у макак-резусов

В эксперименте по иммуногенности и контрольному заражению макак-резусов (6/группу) вакцинировали либо 1) только ВСС, 2) ВСС и затем через 9 недель подвергали повторной иммунизации МУА85А, либо 3) физиологическим раствором (контрольная группа). Всех животных подвергали контрольному заражению интратекально через 18 недель после вакцинации ВСС (или вакцинации физиологическим раствором для контрольной группы) и затем наблюдали за ними в течение 16 недель перед тем, как умертвить их. Результаты по иммуногенности показаны на фиг. 8.

На фиг. 8а показаны средние уровни ΙΡΝ-γ после вакцинации (измеренные к 3 суткам теста по стимуляции лимфоцитов) во всех трех группах в пределах этого эксперимента по контрольному заражению. В то время как уровни ΙΡΝ-у в ответ на РРЭ в группе ВСС и в группе с первичной иммунизацией ВСС повторной иммунизацией МУА85А кажутся сравнимыми, ответы на Ад85А являются явно более сильными в группе с первичной иммунизацией ВСС - повторной иммунизацией МУА85А. Таким образом, имеет место значительное увеличение Ад85А-специфической секреции ΙΡΝ-γ после вакцинации МУА85А (группа 2), которое не заметно в группе, иммунизированной только ВСС (группа 1) (фиг. 8а).

На фиг. 8б показаны средние уровни ΙΡΝ-γ после контрольного заражения (измеренные к 3 суткам

- 15 012436 теста по стимуляции лимфоцитов) во всех трех группах в пределах этого эксперимента по контрольному заражению. После контрольного заражения М.1Ь. группа ВСО-МУА85А (группа 2) имела значительно более высокие Ад85А-специфические ответы, чем группа, иммунизированная только ВСО (группа 1). Также и ответы Е8АТ6/СЕР10 (рано секретируемый антигенный белок-мишень/белок 10 из культурального фильтрата), которые являются МТЬ-специфическими иммунными ответами (амплитуда относится к бактериальной нагрузке), являются более слабыми в группах ВСО и ВСС-МУА85А по сравнению с группой, иммунизированной физиологическим раствором. Ответы на ΡΡΌ сравнимы между этими двумя группами. Результаты в отношении Е8АТ6/СРР10 являются важными (самая нижняя панель), поскольку эти антигены являются ТВ-специфическими, и уровни иммунных ответов на эти антигены коррелируют с бактериальной нагрузкой (т.е. чем выше бактериальная нагрузка (группа, иммунизированная физиологическим раствором), тем сильнее иммунный ответ на Е8АТ6 и СРР10). Защитная эффективность вакцины определяется относительно более низким уровнем ответа Е8АТ6/СРР10 в группах ВСО и ВСОМУА85А по сравнению с группой, иммунизированной физиологическим раствором.

При аутопсии, в группе ВСО-МУА85А наблюдалась значительно меньшая патология, чем в группе, иммунизированной только ВСО. Снижение бактериальной нагрузки в этих 2 группах составляло 0,97 для группы ВСО-МУА85А и 0,42 для группы, иммунизированной только ВСО.

Макак-резус является хорошей моделью заболевания человека, и это многообещающее улучшение защитной эффективности, несмотря на небольшое количество животных, говорит о том, что у человека ожидаются похожие результаты в отношении эффективности.

Данные по безопасности и иммуногенности из Фазы II испытаний на взрослых в Южной Африке

Фаза II исследования безопасности и иммуногенности была начата в ХУеЧегп Саре, Южная Африка. Это испытание проводят на взрослых, и его объектом являются 24 субъекта. Субъекты, которые являются латентно инфицированными, исключены из этого испытания. К настоящему моменту было вакцинировано 12 субъектов. Все 12 субъектов имели значительные иммунные ответы, индуцированные МУА85А, в первую неделю после их вакцинации в анализе ЕЫ8Р0Т.

Профиль безопасности к настоящему моменту является таким же, как и профиль безопаслоти, наблюдавшийся в испытаниях в Великобритании и в Гамбии. Результаты испытаний в Великобритании показаны на фиг. 1 и фиг. 9а, а результаты испытания в Гамбии показаны на фиг. 9б.

В целом, в Гамбии были вакцинированы 11 добровольцев, не подвергавшихся воздействию ВСО, и 10 добровольцев, примированных ВСО. Результаты по иммуногенности в группе, не подвергавшейся иммунизации ВСО (фиг. 96), имели сходство с результатами по иммуногенности в группе, примированной ВСО, в Великобритании (фиг. 1б, в, г) в том, что она сохранялась на уровне, превышающем исходный, на протяжении периода последующего наблюдения. Вероятно, это отражает большую степень примирования микобактериями из окружающей среды в исходный момент времени, а также продолжающееся воздействие микробактерий из окружающей среды, которое поддерживает этот ответ.

В Гамбии нет достоверного различия между группой, не подвергавшейся иммунизации ВСО, и группой, примированной ВСО, что, как и выше, объясняется более высоким уровнем примирования из окружающей среды в этой группе. В отличие от этого, в Великобритании результаты по иммуногенности в группе, не подвергавшейся иммунизации ВСО, возвращались к исходному уровню на протяжении последующего наблюдения (фиг. 9а и фиг. 1б, в и г), тогда как иммуногенность в группе, примированной ВСО, оставалась выше исходного уровня на протяжении последующего наблюдения (фиг. 1б, в и г).

В литературе, касающейся ВСО, существует много примеров широкой вариабельности защитной эффективности в разных странах и на разных континентах. Согласующийся профиль безопасности и иммуногенности МУА85А в Великобритании, Западной Африке и Восточной Африке является очень важным.

Иммуногенность аденовируса, экспрессирующего антиген 85А (Ад85А), у мышей

Было показано, что рекомбинантный аденовирус (человеческий штамм 5, с делецией Е1 и Е2), экспрессирующий антиген 85А (Ад85А), индуцирует сильные иммунные ответы у мышей при введении его одного (СЭ4 ответ около 800 пятен/миллион спленоцитов; СЭ8 ответ около 1200 пятен/миллион спленоцитов). При введении мышам, которые ранее получили ВСО, этот аденовирус, экспрессирующий антиген 85А (Ад85А), стимулирует еще более сильный ответ (СЭ4 ответ около 1400 пятен/миллион спленоцитов; СЭ8 ответ около 2500 пятен/миллион спленоцитов). Таким образом, удивительно, что этот аденовирусный вектор, как здесь показано, помимо очень сильного СЭ4 ответа, индуцирует очень сильные СО8Т-клеточные ответы, и их индукция одной и той же вакциной, по-видимому, полезна как в профилактике, так и в лечении микобактериального заболевания. Раньше аденовирусные векторы рассматривали как хорошие средства для индукции СЭ8Т-клеточных ответов, но в данном описании авторы данного изобретения демонстрируют сильную индукцию как СЭ4, так и СЭ8 ответов. Эти данные свидетельствуют о том, что аденовирусные векторы могут быть мощным усилителем Т-клеточных ответов, примированных ВСО.

Данное изобретение было описано выше только с помощью примера. Понятно, что можно осуществить модификацию деталей без отклонения от объема изобретения.

- 16 012436

Специфические последовательности АС85А 8ЕС ΙΌ NО: 1 (Полипептидная последовательность АС85А)

МОЬУПЗУКСАУТОМЗННЬУУеАУеААЬУЗСЬУбАУССТАТАСАГЗКРСЬРУЕУЕОУРЗРЗМС ΚΟΙΚναΗΏ3σβΑΝ5ΡΑ1Υ1ΣΟ(3Ι₁ίΙΑαϋΟΓ5σ«ΟΙΝΤΡΑΕ’ΕΚΥΟΟΒ<3ϊ,5ννΜΡν6βζ135ίΎ30 адРАССКАССОТУКИЕТБЪТЗЕЬРСИЪОАМЙНУКРТСЗАУУСЬЗМААЗЗАЬТЬАХУНРаОЕ’ УУАСАМЗСЬЬОР 32АМ6 РТЬ КЗЬАМОТАССУКАЗ ШЙКЗРКЕОРАИОКЯОРЬ1ЖСКЬΙΑΝΝΤ ΗΥΗΥΥ ССЫС КРЗ РЬССИ КЬ РАКРЬЕСЕУКТ 3ΝI КГООЛУИАбССНМС V ГР ГРРЗ ЕТН5ИЕ ΥΜ

ЗАОЬМАМКРОЬОКАЬСАТРЫТСРАРОСА

8ЕС ΙΌ NО: 2 (Нуклеотидная последовательность АС85А) аГдсадсИЕдЕЕдасадддЕйсдЕддсдссдЪсасдддЕаЕдЕсдсдЕсдасСсдЕд дСсддддссдЪсддсдсддсссЪадСдйсддд^с-еддйсддсдссдйсддйддсасд дсдасадсдддддсаЬЪЪСсссддссдддсйЪдссддЪддадСасскдсаддЬдссд ^сдссдйсдаЁдддссдЪдасаксааддйссаайЪссааадЕддЬдд^дссаасЬсд сссдссскдЪассйдсЪсдасддссЪдсдсдсдсаддасдасЪйсадсддсЬдддас айсаасассссддсдйСсдадйддСасдассад^сдддссЪдЬсддйддЪса'Ьдссд дЕдддЕддссадУсаадс'ЬЕсЕас'ЬссдасЕддЕассадассдссЕдсддсааддсс ддЪЬдссадасЪйасаадЪдддадассЪйссЪдассадсдадсЪдссддддЪддсЪд саддссаасаддсасд^саадсссассддаадсдссдЪсд^сддЬсЪ-ЬЪсда-еддс'е дс^ЪсЪЪсддсдсЪдасдсйддсдаЪсйаЪсасссссадсадЪЪсдйсЕасдсддда дсда1:д1сдддсс-едЪ1:ддассссисссаддсдаЪддд-есссасссЪда1:сддссгд дсдаЕдддудасдсСддсддсЕасааддссУссдаса'ЕдЪддддсссдааддаддас ссддсд£ддсадсдсаасдасссдс£дЕ£даасдйсдддаадс±даЬсдссаасаас асссдсдйсЬдддЪдЪасЬдсддсаасддсаадссдСсддаЪсйдддйддсаасаас сйдссддссаадЪЪссЪсдадддсЪксдХдсддассадсаасайсаадЬЪссаадас дссЪасаасдссддЪддсддссасаасддсдСдС^сдасСЪсссддасадсддЪасд сасадсЪдддадСасйддддсдсдсадсйсаасдсЪайдаадсссдассЪдсаасдд дсасйдддйдссасдсссаасассдддсссдсдссссадддсдссЪад

8ЕС ΙΌ NО: 3 (Полипептидная последовательность АС85А, укороченного на 15 аминокислот)

МОЬУОНУКСАУТбМЗВВЪУУбАУСААЬУЗЗЬУСАУССТАТАбАГЗКРСЬРУЕУИЗУРЗРЗМб

ΚϋΙ КУаГйЗССАЫЗ РАЪУЬЬазЬКАОООРЗСИ ΡΙΝΤ РАГЕИУООЗСЬЗУУМРУбСОЗ 5ΓΥ3 О НУОРАССКАбСОТУКИЕТЕЬТЗ Е ЬРСЙЪОАЫКНУКРТСЗАУУбЬЗМААЗЗА1ДТА1ΥΗ РООГ УУАаАМЗСЪЬОР80АМбРТЫа1ЛМ130АССУКА30МИСРКЕ0РАН0НМ0РЬЬЫУ6КЫАЫНТ Κν^νΥθαΝαΚΡ3ΟΕασΝΝΕΡΑΚΕΧΕ6ΡνΚΤ3ΝΙΚΓ<20ΑΥΝΑ66σΗΝ6νΓΟΓΡΡ56ΤΗ5ΗΕΥ«

САОЬМАМКРОЬОР

8ЕС ΙΌ 4 (НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ АС85А, УКОРОЧЕННОГО НА 15 АМИНОКИСЛОТ) аЕдсадсЕЬдЕЬдасаддд-СЪсдЕддсдссдЕсасдддгаЕдЕсдсдЕсдас+сдйддгсдд ддссдЕсддсдсддсссЕадЕдЕсдддЕсЕддЕсддсдссдЬсддЕддсасддсдассдсдд дддсаЕСЕЕсссддссдддсЕЕдссддЕддадЕассЕдсаддЕдссдЕсдссдЕсдаЕдддс сд-СдасаЕсааддЕссааЕ’Ьссааад^ддЕддЬдссаасЕсдсссдсссЕдЕасс'Ьдс'Ьсда сддсс£дсдсдсдсаддасдасЪ1:садсддсЕдддасаЕсаасассссддсд1:ЬсдадЕддЕ асдассадЕсдддссЬдЬсддЕддЕсаЪдссддЪдддкддссадЪсаадс'ШсЪасЕссдас •ЬддЕассадсссдссЕдсддсааддссддЕЕдссадасЕЕасаад^дддадассЬЕссЕдас садсдадсЪдссдддд^ддсЕдсаддссаасаддсасдЕсаадсссассддаадсдссдЕсд ЕсддСсЕЕЕсдаЕддсСдсЕЕсЕЕсддсдс'ЬдасдсЕддсдаксЕаЕсасссссадсадЕЪс дЕс^асдсдддадсдаЕдЕсдддссИдГкддассссЪсссаддсдакдддЕсссассс'Ь.да-Ь сддссЕддсда^дддЪдасдсЕддсддсйасааддссЬссдасаЬдЪддддсссдааддадд асссддсдЕддсадсдсаасдасссдсЪдЬЪдаасдЕсдддаадсЪдаЕсдссаасаасасс сдсдЬскдддЕдЕасЕдсддсаасддсаадссдЕсдда^сЕдддЕддсаасаассЕдссддс саадЕЕссЕсдадддсЕЕ.сд'ЬдсддассадсаасаЪсаадЕЕссаадасдссЕасаасдссд дЬддсддссасаасддсд^дЕЕсдасЪЬсссддасадсддйасдсасадсЕдддадЬасЕдд ддсдсдсадсЬсаасдсЬаЪдаадсссдассйдсаасдд

- 17 012436

8Е0 ΙΌ N0: 5. Последовательность вставки из 1176 нуклеотидов является следующей (экспрессируемая последовательность показана прописными буквами, кодирующая последовательность Ад85А подчеркнута): ЪсЪдВасдддсссдВасддЪассдадсВсддаЕсВдсдсдссдссассАТОбАТОСА АТбААСАбАавССТСТбСТСТбТбСТбСТбСТОТбТббАбСАвТСТТССТТТСбССС АбССАбдАААТССАТбСССбАТТСАдААбА66АТСТАТ5САбСТТ6ТТбАСАбббТТ СбТСбССССбТСАСббСТАТбТСбСбТСбАСТСбТббТСббббСССТСбдСдсббСС СТАбТ5ТСС65ТСТССТСдбС5ССбТССбТ65САСССССАСС5ССССбеСАТТТТСС ссдсссессттсссдстсбАбТАСстасАСстдссстсдссбтссАтссзссдтбАС АТСАА6бТССААТТССАААбТббТ6СТ6ССААСТСбСССдСССТ6ТАССТбСТС6АС 66ССТ6С6С6С6СА56АС6АСТТСА6СС6СТСС6АСАТСААСАСССС6СС6ТТС6АС ТббТАСбАССАбТССССССТбТСббТббТСАТбССббТбббТббССАбТСААбСТТС ТАСТССбАСТСОТАССАбССССССТбСббСААСОССОбТТОССАбАСТТАСААбТбб ОАбАСсттсстбАССАдсбАдстдссддддтддстдсАвсссААСАбдсАсдтсААд сссАСссдААбсдссдтсдтссдтстттсбАтдостбсттсттссдсбствАсдстд дсдАтстАтсАССССслдсАаттсдтстАсдсддоАдссАТстсдвдсстоттдсАС ссстсссАсдсдАтсастсссАссстдАтссссстсдсеАтдсдтсАссстддсддс ТАСАДдбССТССбАСАТдТбббСССССААССАббАСССббСбТбССАбСбСААСбАС ССбСТбТТСААСбТСдОбААОСТбАТСбССААСААСАСССбСдТСТбССГбТАСТбС ббСААСббСААбСТбТСдСАТС1бббТдОСААСААССТбСССОССААбТТССТСбАО ббСТТСОТССеСАССАбСААСАТСААСТТССААСАССССТАСААСССССбТббСддС САСААССбСбТвТТСбАСТТСССббАСАбСббТАСбСАСАбСТбСОАбТАСТбСдбС ССбСАбСТСААСеСТАТдААбСССбАССТвСААСбТ СОАТССАТТССАААСССТТТССТСдСАТТССАСЬдасВдсадаВаЕссаксасасЬд

8ЕС) ΙΌ N0:6

МСАМККОЬССУЬЬЬСбАУЕУЗ Р ЗОЕ IНАКЕККС ЗМОЬУОКУВОАУТбМЗ ВНЬУУЗАУ ОААЪУЗбЬУбАУаОТАТАСАГЗНРСЬРУЕГЪОУРЗРЗМОКОХКУОГОЗООАЦЗРАЬУ ЬЬОСЬКАОООГЗСИОХЫТРАГЕМУООЗбЬЗУУМРУбСОЗЗЕГЗОИГОРАСбКАОСОТ УКИЕТЕЬТЗЕЦРбИЬОАКВНУКРТбЗАУУбЬЗМААЗЗАЬТЬАХУНРООЕУУАСАМЗб ЫРРЗОАМбРТЫСГАМбОАОбУКАЗОМИбРКЕОРАНОМОРЬЬНУбКЫАМДТКУНУ УСбЫ6КЬЗОЬССМКЬРАКЕ’ЬЕбГУКТЗЫ1КРООАУ1'1А6ССННбУ?ОЕРОЗбТНЗЙЕУ ИСАОЬМАМКРОЬОКбЗIРМРЬЪбЬО

Claims (26)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ индукции иммунного ответа центральных Т-клеток памяти против по меньшей мере одного антигена у пациента-человека, включающий стадию введения указанному пациенту иммуногенной композиции, содержащей нереплицирующийся или дефектный по репликации поксвирусный вектор, экспрессирующий продукт трансляции нуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 4 и дополнительно включающий С-концевую РК метку и лидерную последовательность ТРА.
2. 2. Способ по п.1, где иммуногенная композиция представляет собой векторную вакцину.
3. 3. Способ по п.1 или 2, где Т-клеточный иммунный ответ представляет собой ССЯ7+ ответ.
4. 4. Способ по любому из пп.1-3, где нереплицирующийся поксвирусный вектор представляет собой МУА (модифицированный вирус осповакцины Анкара).
5. 5. Способ по любому из пп.1-4, где поксвирусный вектор экспрессирует продукт трансляции 8Е0 ΙΌ N0:5.
6. 6. Способ по любому из пп.1-5, где поксвирусный вектор дополнительно экспрессирует продукт трансляции по меньшей мере одного дополнительного гена(ов) антигена из микобактериального вида.
7. 7. Способ по любому из пп.1-6, где иммуногенную композицию вводят по меньшей мере с одним дополнительным антигеном и/или противомикробным средством.
8. 8. Способ по п.7, где по меньшей мере один дополнительный антиген и/или противомикробное средство вводят одновременно, раздельно или последовательно.
9. 9. Способ по любому из пп.1-8, где ответ представляет собой антигенспецифический иммунный ответ.
10. 10. Способ по любому из пп.1-9, где ответ является терапевтическим или профилактическим.
11. 11. Способ по любому из пп.1-10, где Т-клеточный ответ является защитным против заболевания, выбранного из группы, состоящей из туберкулеза, лепры, инфекции, вызванной МусоЬас1егшш аушш, нетуберкулезной микобактериальной инфекции, язвы Бурули, инфекции или заболевания, вызванных МусоЬас1ег1пш Ьоук, натуральной оспы, обезьяньей оспы, инфекции, вызванной МусоЬас1егшш рага!иЬегси1о818, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, аутоиммунного заболевания, рака и рака мочевого пузыря.
12. 12. Способ по любому из пп.1-10, где пациент выбран из группы, состоящей из детей, пациентов, которые имеют ВИЧ-инфекцию или СПИД, имеют ослабленный иммунитет или были подвергнуты пересадке органов.

    - 18 012436
13. 13. Способ по любому из пп.1-10, где пациент ранее подвергался воздействию микобактерий.
14. 14. Способ по п.13, где пациент ранее подвергался воздействию М. 1иЬсгси1ох1Х.
15. 15. Способ по п.13 или 14, где пациент является латентно инфицированным микобактериями.
16. 16. Способ по любому из пп.1-10, где пациента ранее подвергали воздействию ВСС (бацилла Кальметта-Герена).
17. 17. Применение иммуногенной композиции, содержащей нереплицирующийся или дефектный по репликации поксвирусный вектор, экспрессирующий продукт трансляции нуклеотидной последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 4 и дополнительно включающий С-концевую РК метку и лидерную последовательность ТРА, в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения микобактериального заболевания у пациента путем индукции иммунного ответа центральных Т-клеток памяти у указанного пациента.
18. 18. Применение по п.17, где Т-клеточный иммунный ответ представляет собой ССР7+ ответ.
19. 19. Применение по п.17 или 18, где поксвирусный вектор дополнительно экспрессирует продукт трансляции по меньшей мере одного дополнительного гена антигена и где указанное лекарственное средство предназначено для лечения или предупреждения как микобактериального заболевания, так и по меньшей мере одного дополнительного заболевания у указанного пациента.
20. 20. Применение по любому из пп.17-19, где иммуногенная композиция дополнительно индуцирует Т-клеточный иммунный ответ против вируса, из которого происходит поксвирусный вектор.
21. 21. Применение иммуногенной композиции, содержащей нереплицирующийся или дефектный по репликации поксвирусный вектор, экспрессирующий продукт трансляции нуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 4, и дополнительно включающий С-концевую РК метку и лидерную последовательность ТРА, в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения по меньшей мере одного заболевания у пациента путем индукции иммунного ответа центральных Т-клеток памяти, где указанное лекарственное средство вводят по меньшей мере с одним дополнительным антигеном.
22. 22. Применение по п.21, где Т-клеточный иммунный ответ представляет собой ССР7+ ответ.
23. 23. Векторная вакцина, содержащая нереплицирующийся или дефектный по репликации поксвирусный вектор, экспрессирующий продукт трансляции нуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 4 и дополнительно включающий С-концевую РК метку и лидерную последовательность ТРА.
24. 24. Векторная вакцина по п.23, где вирусный вектор экспрессирует продукт трансляции нуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 5.
25. 25. Векторная вакцина по п.23 или 24, где нереплицирующийся вирусный вектор представляет собой МУА.
26. 26. Векторная вакцина по любому из пп.23-25, где вирусный вектор дополнительно экспрессирует продукт трансляции по меньшей мере одного дополнительного гена(ов) антигена из микобактериального вида.