CN104151433A

CN104151433A - 一种结核分枝杆菌融合蛋白及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN104151433A
Application number: CN201410390880.8A
Authority: CN
Inventors: 祝秉东; 刘勋; 雒艳萍; 牛红霞; 白春香; 彭金秀; 王倩; 胡丽娜; 王秉翔; 于红娟; 郭焱
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2014-08-11
Filing date: 2014-08-11
Publication date: 2014-11-19

Abstract

本发明提供一种结核分枝杆菌融合蛋白，是序列表中序列2和序列4中的蛋白质。并提供了其制备方法和应用。本发明将融合蛋白LT70与佐剂DDA+PolyI:C进行联合构建结核亚单位疫苗，实验结果显示该疫苗可以在小鼠体内有效诱导结核抗原特异性的细胞和体液免疫应答，并且在小鼠毒力株攻击保护效率试验中具有较强的免疫保护力，保护时间较为持久，保护效果强于BCG，亦具有强化BCG免疫的作用，是一有效的结核病候选疫苗。

Description

一种结核分枝杆菌融合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种结核分枝杆菌融合蛋白，本发明还涉及该融合蛋白的制备方法以及其在制备结核亚单位疫苗中的应用。

背景技术

结核病由结核分枝杆菌感染引起，是全球传播范围最广、持续时间最久、危害最为严重的传染病。二十世纪八十年代以来，随着耐药菌株尤其是耐多药结核菌的出现与流行及人类免疫缺陷病毒(HIV)和获得性免疫缺陷综合症(艾滋病，AIDS)的传播与流行，在世界各地结核病的发病率呈现回升趋势，发病率和死亡率高居不下。结核分枝杆菌作为结核病的病原体，其难于控制的原因之一在于结核菌可以在人体免疫细胞中以潜伏感染状态存在很长时间，以此逃避机体特异性免疫反应对其的清除，并且可在人体免疫力低下时发展成为活动性结核病。

现阶段结核病防治所使用的疫苗卡介苗（BCG）是一种减毒牛分枝杆菌活疫苗。卡介苗自1921年用于人类接种，能够有效预防新生儿和儿童患严重的脑膜结核及全身粟粒性结核病，但是不能有效的防止成人肺结核的发生。因此，新型疫苗和疫苗接种策略的主要目标是延长疫苗保护时间或在BCG初免基础上进行加强免疫。和以BCG及其它微生物为载体的疫苗相比，结核亚单位疫苗具有加强BCG免疫效果的优势，并具有安全可靠的特征。切实有效的结核病疫苗不但要对活动期结核病具有保护作用，而且要能够针对潜伏期结核菌产生免疫应答。因此，理想的结核病疫苗必须融合结核分枝杆菌活动期及潜伏期的多个抗原。

研究发现，结核分枝杆菌活动期抗原ESAT-6为早期分泌蛋白，能够刺激机体T淋巴细胞增殖，分泌干扰素-γ，在保护性细胞免疫中发挥重要作用。Ag85复合物是结核分枝杆菌和卡介苗中的主要分泌性蛋白，在结核分枝杆菌H₃₇R_V株中占分泌蛋白总量的30%，是一组重要的分枝杆菌分泌蛋白，具有分枝菌酸转移酶的活性，在分枝杆菌细胞壁合成的最后阶段发挥重要作用，可诱导产生特异的细胞免疫应答。在前期研究中，我们对构建的六种融合蛋白ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4(EAMM)、Mtb10.4-HspX(MH)、 ESAT6- Mtb8.4、Mtb10.4-Ag85B、ESAT6-Ag85B和ESAT6-RpfE进行了免疫保护评价，发现EAMM（由结核分枝杆菌活动期抗原融合构成）显示出较强的免疫保护效果，尤其是当EAMM和MH（含有结核菌潜伏期抗原HspX）进行联合应用时（即EAMM+MH疫苗），显著降低了脾和肺的细菌载量，达到了和BCG相同的保护效果。结果表明联合生长期和潜伏相关抗原构建的蛋白亚单位疫苗免疫保护，可以促进机体对细菌，特别是休眠菌的有效识别，提高免疫力，从而清除杀灭细菌。

发明内容

本发明提供了一种结核分枝杆菌融合蛋白，其联合了生长期和潜伏期相关抗原构建而成，可以促进机体对细菌，特别是休眠菌的有效识别，提高免疫力，从而清除杀灭细菌。

结核分枝杆菌Hrp1(Rv2626c) 在结核分枝杆菌潜伏期高表达，并能够结合到巨噬细胞的表面，诱导促炎性细胞因子白细胞介素-12和肿瘤坏死因子的显著表达，引起肺结核患者强烈的免疫应答，是理想的休眠期抗原。

因此，本发明将结核分枝杆菌活动期抗原ESAT6、Ag85B、Mtb8.4及MPT64的190-198位的氨基酸多肽（CD8+T细胞表位）和结核分枝杆菌潜伏期抗原Hrp1（Rv2626c）融合，构建EAMM-Rv2626融合蛋白（分子量约70kD，故简称LT70）。

本发明提供一种结核分枝杆菌融合蛋白，是序列表中序列2和序列4中的蛋白质。

在序列表2中，1-95位为ESAT6的氨基酸序列，96-97位为酶切位点的氨基酸序列，98-382位为Ag85B的氨基酸序列，383-384位为酶切位点的氨基酸序列，385-393位为MPT64的190-198位氨基酸序列，394-503位为Mtb8.4的氨基酸序列，504-505位为酶切位点的氨基酸序列，506-660位为Rv2626c的氨基酸序列。

在序列表4中，1-95位为ESAT6的氨基酸序列，96-97位为酶切位点的氨基酸序列，98-412位为加linker的Ag85B的氨基酸序列，413-414位为酶切位点的氨基酸序列，415-423位为MPT64的190-198位氨基酸序列，424-533位为Mtb8.4的氨基酸序列，534-535位为酶切位点的氨基酸序列，536-690位为Rv2626c的氨基酸序列。

本发明的第二个目的是提供上述结核分枝杆菌融合蛋白的编码基因。

优选地，是如下1）或2）所述的基因：

1) 其核苷酸序列是序列表中的序列1或3；

2) 与序列表中序列1或3互补的核苷酸序列；

3) 在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码所述融合蛋白的DNA分子。

在序列表1中，1-285位为ESAT6的编码基因，286-291位为酶切位点的编码基因，292-1146位为Ag85B的编码基因，1147-1152位为酶切位点的编码基因，1153-1179位为MPT64的190-198位氨基酸的编码基因，1180-1509位为Mtb8.4的编码基因，1510-1515位为酶切位点的编码基因，1516-1980位为Rv2626c的编码基因。

在序列表3中，1-285位为ESAT6的编码基因，286-291位为酶切位点的编码基因，292-1236位为Ag85B的编码基因，1237-1242位为酶切位点的编码基因，1243-1269位为MPT64的190-198位氨基酸的编码基因，1270-1599位为Mtb8.4的编码基因，1600-1605位为酶切位点的编码基因，1606-2070位为Rv2626c的编码基因。

本发明的第三个目的是提供含有上述编码基因的重组表达载体。

本发明的第四个目的是提供含有上述重组表达载体的宿主细胞。

本发明的第五个目的是提供上述结核分枝杆菌融合蛋白的制备方法，包括融合蛋白的表达与纯化，其特征在于：所述结核分枝杆菌融合蛋白的表达为：将含有融合蛋白的菌体加入LB培养基中振荡培养，加入终浓度为0.5mmol/L的蛋白诱导剂IPTG，29℃诱导振荡培养4h，后处理后获得上清即为表达产物。

本发明的第六个目的是提供上述结核分枝杆菌融合蛋白在制备结核亚单位疫苗中的应用。

本发明的第七个目的是提供一种结核亚单位疫苗，其含有上述的结核分枝杆菌融合蛋白。

优选地，所述结核亚单位疫苗是由权利要求1所述的结核分枝杆菌融合蛋白、DDA和PolyI:C组成的。

本发明的第八个目的是提供上述结核亚单位疫苗的制备方法，每200μL结核亚单位疫苗的制备方法如下：将融合蛋白用PBS缓冲液稀释到0.2mg/ml；PolyI:C用PBS缓冲液溶解至1mg/ml；DDA用PBS配制成2.5mg/ml，水浴后冷却至室温；取PolyI:C溶液50μl与等量融合蛋白溶液充分混匀，室温放置；在混合溶液中逐滴加入100μL DDA溶液，然后充分乳化，使疫苗呈均一的乳油状即得到结核亚单位疫苗。

本发明的结核分枝杆菌的有益效果如下：

一、本发明利用基因工程技术构建无任何标签融合蛋白LT70表达质粒pET30a(+)-LT70（ESAT6-Ag85B- MPT64_190-198- Mtb8.4-Rv2626c）和pET30a(+)-LT70（ESAT6-linker-Ag85B- linker-MPT64_190-198- Mtb8.4-Rv2626c），将质粒转入大肠杆菌E. col-i BL-21(DE3)菌体中，融合蛋白以可溶性形式表达于上清中。对目的蛋白LT70在上清可溶性形式表达的条件进行了优化。

二、本发明利用无标签蛋白纯化技术，通过疏水柱层析和分子筛层析两种纯化方法，成功对LT70蛋白进行了纯化。

三、本发明将融合蛋白LT70与佐剂DDA+PolyI:C进行联合构建结核亚单位疫苗，通过C57BL/6小鼠模型分别进行免疫学评价及保护效率评价，全面评价LT70疫苗的免疫保护效果。实验结果显示该疫苗可以在小鼠体内有效诱导结核抗原特异性的细胞和体液免疫应答，并且在小鼠毒力株攻击保护效率试验中具有较强的免疫保护力，保护时间较为持久，保护效果强于BCG，亦具有强化BCG免疫的作用，是一有效的结核病候选疫苗。

四、为了增强融合蛋白的可溶性表达，便于生产，我们对该融合蛋白基因序列及抗原结构做了如下优化：（1）优化了Ag85B及Rv2626c的基因序列：按照homo sapiens进行优化和使用大肠杆菌优势表达的密码子，以使融合蛋白在大肠杆菌宿主细胞更好地表达；（2）为了保持各个抗原充分折叠成各自的天然构象，我们在Ag85B前后引入由低疏水性、低电荷效应的氨基酸组成的接头linker，将融合蛋白的各个抗原分开，使各个抗原各自充分折叠，上清表达量相比于未加linker时有提升（参见图1），增强了LT70融合蛋白的表达功能。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为融合蛋白LT70和LT70（加linker）在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中的表达结果；其中，（a）为融合蛋白LT70的表达结果。M, marker；1，BL21空菌破碎后全菌夜；2，LT70菌体破碎后全菌液；3，LT70菌体破碎后上清。（b）为融合蛋白LT70和LT70（加linker）的表达结果。M, marker；1，LT70菌体破碎后全菌液；2，LT70菌体破碎后上清；3，LT70菌体破碎后沉淀；4, LT70（加linker）菌体破碎后全菌液；5，LT70（加linker）菌体破碎后上清；6，LT70（加linker）菌体破碎后沉淀。

图2为融合蛋白LT70在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表达时，不同IPTG诱导浓度对表达的影响。其中，M，marker，1，2，3分别为0.5mM IPTG终浓度LT70破碎后全菌，LT70破碎后上清，LT70破碎后沉淀；4，5，6分别为0.2mM IPTG终浓度LT70破碎后全菌，LT70破碎后上清，LT70破碎后沉淀；7，8，9分别为0.1mM IPTG终浓度LT70破碎后全菌，LT70破碎后上清，LT70破碎后沉淀。

图3为融合蛋白LT70在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表达时，不同表达温度对表达的影响。其中，( a ) M，marker；1，2，3分别为37℃诱导LT70破碎后全菌，LT70破碎后上清，LT70破碎后沉淀；4，5，6分别为34℃诱导LT70破碎后全菌，LT70破碎后上清，LT70破碎后沉淀；7，8分别为25℃诱导LT70破碎后全菌，LT70破碎后上清。( b ) M，marker；1，2分别为31℃诱导LT70破碎后上清，LT70破碎后沉淀；3为31℃诱导LT70破碎后上清；4，5分别为29℃诱导LT70破碎后上清，LT70破碎后沉淀；6为31℃诱导LT70破碎后沉淀；7，8分别为27℃诱导LT70破碎后上清，LT70破碎后沉淀。( c ) M，marker；1，2分别为31℃诱导LT70破碎后上清，LT70破碎后沉淀；3为31℃诱导LT70破碎后上清；4为31℃诱导LT70破碎后沉淀；5，6分别为29℃诱导LT70破碎后上清，LT70破碎后沉淀；7，8分别为27℃诱导LT70破碎后上清，LT70破碎后沉淀。( d ) M，marker；1，LT70破碎后全菌；2，BL21空菌； 3，4分别为30℃诱导LT70破碎后沉淀，LT70破碎后上清；5，6分别为29℃诱导LT70破碎后沉淀，LT70破碎后上清；7，8分别为28℃诱导LT70破碎后沉淀，LT70破碎后上清。

图4为融合蛋白LT70在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中的纯化和分析结果。其中，（a）疏水层析纯化。M，marker; 1, 融合蛋白LT70经饱和度为15%硫酸铵盐析后；2，疏水层析Butyl FF柱流川峰；3，疏水层析Butyl FF柱洗脱峰；4，融合蛋白LT70破碎后上清；（b）分子筛层析纯化。M，marker；1，融合蛋白LT70破碎后上清；2，融合蛋白LT70经饱和度为15%硫酸铵盐析后过滤上机样品；3，4，凝胶Superdex 75过滤层析；5为融合蛋白LT70经饱和度为15%硫酸铵盐析后样品。（c）LT70免疫印迹分析结果：M，蛋白分子量标准；1，抗Rv2626c鼠血清；2，鼠抗Esat-6单克隆抗体；3，阴性对照；4，兔抗Ag85B单克隆抗体；5，阴性对照。

图5为结核亚单位疫苗LT70的细胞免疫原性检测结果；* p<0.05 vs PBS, BCG。

图6为结核亚单位疫苗LT70的体液免疫原性检测结果，其中a为IgG1，b为IgG2c；* p<0.05 vs PBS, BCG。

图7为结核亚单位疫苗的保护效果评价：将LT70疫苗分别在第0、2、4周免疫小鼠三次，末次免疫后30周进行呼吸道气雾攻击结核分枝杆菌H37Rv毒株，攻击后10周进行脏器CFU计数。* p<0.05 vs PBS, BCG，** p<0.01 vs PBS, BCG, EAMM+MH。

图8为结核亚单位疫苗免疫和毒株攻击后小鼠肺组织病理反应结果。

图9为结核亚单位疫苗免疫和毒株攻击后小鼠肺组织结核性病变面积占切片面积的比值的柱状图。

图10为结核亚单位疫苗LT70强化BCG的细胞免疫反应结果；* p<0.05 vs PBS, BCG。

图11为结核亚单位疫苗LT70强化BCG的体液免疫反应结果，其中a为IgG1，b为IgG2c； * p<0.05 vs PBS, BCG。

图12为结核亚单位疫苗LT70加强BCG的保护效果评价；* p<0.05 vs PBS，** p<0.01 vs PBS。

图13为结核亚单位疫苗强化BCG免疫和毒株攻击后小鼠肺组织病理反应；** p<0.01 vs PBS。

图14为结核亚单位疫苗强化BCG免疫和毒株攻击后小鼠肺组织结核性病变面积占切片面积比值的柱状图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

本发明构建一种新型去标签融合蛋白，并将其与佐剂混合构建新型结核亚单位疫苗。

材料：

预包被ELISPOT试剂盒购自北京达科为生物技术有限公司；

pET30a(+)-Rv2626c由Aeras公司赠与；

PolyI:C购自开平牵牛生化制药有限公司；

阳离子脂质体二甲基三十六烷基铵（dimo-thylidioctyl ammonium bromide，DDA）购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；

T4连接酶购自Takara公司。

实施例1

1.融合蛋白的构建和纯化

1.1 构建融合蛋白LT70表达质粒pET30a(+)-LT70和pET30a(+)-LT70（加linker）

（1）构建重组基因载体pET30a(+)-LT69(ESAT6-Ag85B-MPT64_190-198- Mtb8.4-HspX)。

A，pET30a(+)-EA（ESAT6-Ag85B）的构建:

以临床分枝杆菌菌液为模板，PCR扩增ESAT6，Ag85B相应基因，并将其克隆构建至质粒pET30a中。

其中，RCR反应体系：

水 16.25μl

5×PCR buffer 5μl

dNTP 2μl

上游引物P1 0.5μl

下游引物P2 0.5μl

DNA模板 0.5μl

DNA聚合酶（Primer STAR,takara公司） 0.25μl

总体系 25μl。

PCR反应参数：98℃变性15s，60℃退火15 s，72℃延伸50 s，共30个循环。

B，设计引物扩增EA（ESAT6-Ag85B）基因片段。引物分别为：上游（5’-3’ CGGCATATGACAGAGCAGCAGTGGAAT，其中下划线部分为Nde I限制性酶切位点)；下游（5’-3’ GAAGATCTGCCGGCGCCTAACGAACTCTGGAG，其中下划线部分为Bgl II限制性酶切位点)。以pET30a(+)-EA质粒为载体，用上述两条引物，PCR扩增出EA（ESAT6-Ag85B）融合基因产物。

其中，RCR反应体系：

水 16.25μl

5×PCR buffer 5μl

dNTP 2μl

上游引物P1 0.5μl

下游引物P2 0.5μl

DNA模板 0.5μl

DNA聚合酶（Primer STAR,takara公司） 0.25μl

总体系 25μl。

PCR反应参数：98℃变性15s，63℃退火15 s，72℃延伸50 s，共35个循环。

该PCR产物经纯化后，用Nde I和Bgl II进行双酶切，克隆构建在质粒pET30a(+)-MMH（即pET30a(+)-MPT64_190-198- Mtb8.4-HspX）上，构建成pET30a(+)-LT69(ESAT6-Ag85B -MPT64_190-198-Mtb8.4-HspX)载体。MPT64_190-198是指MPT64的190-198位的氨基酸序列。

其中，质粒pET30a(+)-MMH的构建方法为：

用酶切位点Sac I 和Hind 在质粒pET30a(+)-MH（即pET30a(+)-Mtb8.4-Hspx）(构建方法已公开，发明专利：一种结核杆菌融合蛋白制备方法和应用。专利号：ZL 201010613320.6)上切下Hspx和在质粒pET30a(+)-MM（即pET30a(+)-MPT64_190-198- Mtb8.4）后切开，通过T4连接酶，16℃过夜连接。

其中,质粒pET30a(+)-MM（即pET30a(+)-MPT64_190-198- Mtb8.4）为直接合成。

（2）构建重组基因载体pET30a(+)-LT70(ESAT6-Ag85B- MPT64_190-198- Mtb8.4-Rv2626c)。

设计引物扩增Rv2626c基因片段。引物分别为：上游（5’-3’ ACGAGCTCATGACCACGG，其中下划线部分为Sac I限制性酶切位点)；下游（5’-3’ CCCAAGCTTCTATGCATTTAG，其中下划线部分为Hind 限制性酶切位点)。以pET30a(+)-Rv2626c质粒为模板，用上述两条引物，PCR扩增出Rv2626c基因序列。该PCR产物经纯化后，用Sac I和Hind 进行双酶切，克隆构建在质粒pET30a(+)-LT69上，构建成pET30a(+)-LT70(ESAT6-Ag85B -MPT64_190-198-Mtb8.4-Rv2626c)载体。

其中，RCR反应体系：

水 16.25μl

5×PCR buffer 5μl

dNTP 2μl

上游引物P1 0.5μl

下游引物P2 0.5μl

DNA模板 0.5μl

DNA聚合酶（Primer STAR,takara公司） 0.25μl

总体系 25μl

（3）构建重组基因载体pET30a(+)-LT70(ESAT6-Ag85B- MPT64_190-198- Mtb8.4-Rv2626c)（加linker）。

设计引物扩增Ag85B基因片段。引物分别为：上游引物（5’-3’ CGG GAATTC GGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCT TTCTCC CGG CCGG，其中单下划线部分为EcoR I限制性酶切位点，双下划线部分为linker序列)；下游引物（5’-3’ CCCAGATCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTG GTGGTGGTGGTTCT ACCAGCACCCAGAGAAG，其中单下划线部分为Bgl II限制性酶切位点，双下划线部分为linker序列)。以pET30a(+)-LT70质粒为载体，用上述两条引物，PCR扩增出Ag85B(加linker)基因序列。

RCR反应体系：

水 16.25μl

5×PCR buffer 5μl

dNTP 2μl

上游引物P1 0.5μl

下游引物P2 0.5μl

DNA模板 0.5μl

DNA聚合酶（Primer STAR,takara公司） 0.25μl

总体系 25μl

该PCR产物经纯化后，用EcoR I和Bgl II进行双酶切，克隆构建在质粒pET30a(+)-LT70上，构建成pET30a(+)-LT70(ESAT6-Ag85B -MPT64_190-198-Mtb8.4-Rv2626c)（加linker）载体。

1.2 融合蛋白LT70和LT70（加linker）的表达

将构建成功的pET30a(+)-LT70(ESAT6-Ag85B -MPT64_190-198- Mtb8.4-Rv2626c)载体转入大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中。活化表达有LT70蛋白的E. coli BL-21(DE3)菌体，取1ml活化后菌体加入200ml LB培养基中震荡培养4h；加入蛋白诱导剂IPTG(1.0mol/L)100μl（终浓度为0.5mmol/L），29℃诱导振荡培养4h；4℃，10000rpm离心30min收集菌体；菌体重悬于20mM PB缓冲液（Na₂HPO₄·12H₂O 20mmol/L，Na₂HPO₄·12H₂O 20mmol/L，pH7.4），10ml/g湿菌，冰浴下超声破碎细菌1h(180～200 W, 每超声3s，停5s)；10000rpm离心30min 后分别收集上清和沉淀，将上清和沉淀分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；电泳图参见图1，经SDS-PAGE电泳分析，与E. coli BL21(DE3)空菌相比，分子量在70KD左右有明显的特异蛋白表达条带，以上清形式表达为主，沉淀中蛋白相对较少。

融合蛋白LT70（加linker）的表达过程和条件与融合蛋白LT70完全相同。电泳图参见图1。由图1可知，加linker后上清表达量相比于未加linker时有提升。

上述融合蛋白表达条件进行了以下方面的优化：

1.2.1 诱导剂IPTG浓度优化

活化表达有LT70蛋白的E. coli BL-21(DE3)菌体，取1ml活化后菌体加入200mlLB培养基中震荡培养4h。加入蛋白诱导剂IPTG(1.0mol/L)三种终浓度：a: 100μl（终浓度为0.5mmol/L）；b: 40μl（终浓度为0.2mmol/L）；c: 20μl（终浓度为0.1mmol/L），37℃诱导振荡培养4h。4℃，10000rpm离心30min分别收集菌体。菌体重悬于20mM PB缓冲液（Na₂HPO₄·12H₂O 20mmol/L，Na₂HPO₄·12H₂O 20mmol/L，pH7.4）10ml/g湿菌，冰浴下超声破碎细菌1h(180～200 W, 每超声3s，停5s)。10000rpm，4℃离心30min 后分别收集上清和沉淀，将上清和沉淀分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。分析结果显示，在IPTG终浓度为三种浓度时均可诱导目的蛋白LT70的表达，在终浓度为0.5mmol/L时目的蛋白LT70表达量最多。

1.2.2 LT70诱导表达温度的优化

活化表达有LT70蛋白的E. coli BL-21(DE3)菌株，取1ml活化后菌体加入200mlLB培养基中震荡培养4h；加入蛋白诱导剂IPTG(1.0mol/L)20ul，分别于不同温度条件下（37℃/34℃/31℃/30℃/29℃/28℃/27℃/25℃）诱导振荡培养4h；4℃，10000rpm离心30min收集菌体；菌体重悬于20mM PB缓冲液（Na₂HPO₄·12H₂O 20mmol/L，Na₂HPO₄·12H₂O 20mmol/L，pH7.4），10ml/g湿菌，冰浴下超声破碎细菌1h(180～200 W, 每超声3s，停5s)；10000rpm离心30min 后分别收集上清和沉淀，将上清和沉淀分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；经SDS-PAGE电泳分析，在不同诱导温度条件下，LT70目的蛋白均能在上清可溶性表达，以诱导温度在29℃左右时上清表达量最高。

1.3 融合蛋白LT70的纯化方法

将LT70菌体重悬于20mM PB缓冲液中，冰浴下超声破碎1h左右，4℃，10000rpm离心10min, 离心后收集含LT70蛋白的上清。

1.3.1 盐析粗提纯：将该融合蛋白用饱和度为15%的硫酸铵溶液进行盐析；将盐析出的蛋白用20mM PB缓冲液进行重悬。

1.3.2 将盐析后的融合蛋白进行层析纯化

1.3.2.1 疏水柱层析纯化：选用疏水预装柱 HiTrap Butyl FF 对盐析后LT70蛋白进一步纯化，收集不同梯度洗脱液进行聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分析纯化产物。将最终得到的蛋白纯化物用Lorry酚试剂法测定浓度之后即可使用，每次使用前都用PBS稀释至0.2mg/ml。

1.3.2.2 分子筛层析纯化：选用凝胶过滤介质Superdex 75 pre grade（superdex为交联琼脂糖和葡萄糖的符合填料；分离范围为：3000～70000）进行纯化，收集不同梯度洗脱液进行聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分析得最终纯化物。将最终得到的蛋白纯化物用Lorry酚试剂法测定浓度之后即可使用，每次使用前都用PBS稀释至0.2mg/ml。

融合蛋白LT70和LT70（加linker）纯化过程和方法完全相同，经实验验证发现两者的纯化结果是相同的。

1.4 Western Blot验证融合蛋白LT70的活性

（1）将纯化后蛋白跑SDS-PAGE电泳；

（2）转膜：首先将PVDF膜剪裁成5.3×8.3cm大小，滤纸剪裁8×10cm大小浸入甲醇1-2min。然后，按照白板/海绵/四层滤纸/PVDF膜/胶/四层滤纸/海绵/黑板的顺序依次排列制作三明治固相载体。冰浴状态下连接电极，转移槽中冰盒放置在黑板侧，内外槽中加满转移缓冲液。转膜条件：200V，200mA（恒流快转），1h；

（3）封闭：将PVDF膜用TBST冲洗，冲洗一下即可（1-2min）。用封闭液将膜覆盖（2张PVDF膜背靠背，交叉放入5%脱脂奶粉中），水平摇床缓慢轻摇4h；

（4）洗膜：将封闭后的PVDF膜放入TBST中，水平摇床缓慢轻摇，清洗10次，10min/次；

（5）孵育一抗（抗原免疫小鼠血清）：根据maker显示，将PVDF膜上目的蛋白所在位置的PVDF膜剪裁掉，注意切角标记。将剪裁好的PVDF膜条放入装有稀释好的一抗离心管中(一抗将膜条覆盖,一个离心管只能加两条，且背靠背）。室温水平摇床缓慢轻摇12h；

（6）洗膜：将一抗孵育后的PVDF膜放入TBST中，水平摇床缓慢轻摇，清洗3次，10min/次；

（7）孵育二抗（兔抗鼠多克隆抗体）：将清洗好的PVDF膜放入含有稀释好的二抗（1:5000）的大离心管中（与一抗相同，一个离心管只能加两条，且背靠背）。室温，水平摇床避光缓慢轻摇3h；

（8）洗膜：将二抗孵育后的PVDF膜放入TBST中，水平摇床缓慢轻摇，清洗5次，10min/次；

（9）显影（暗室中操作）：在曝光盒中平整铺好保鲜膜，将PVDF膜平整放在下层保鲜膜上，每条PVDF膜逐滴加上ECL超敏发光液，将上层保鲜膜覆盖PVDF膜（注意赶出气泡）。在暗室中观察荧光强度，考虑曝光胶片厚度（张数）。剪裁1张胶片，压在PVDF膜上，避免移动，盖上曝光盒，避光放置30min。将胶片取出依次放置于显影液，超纯水，定影液中。最后自来水冲洗胶片后观察结果。

2.2 结核亚单位疫苗LT70和LT70（加linker）的免疫学活性评价

结核亚单位疫苗LT70（加linker）是从基因水平上加入linker，在氨基酸合成时增加了15个氨基酸的表达。由于这段linker无免疫原性，不会对蛋白的功能造成影响，所以不会改变疫苗的保护效果，可作为疫苗使用。同时，经试验验证，结核亚单位疫苗LT70和LT70（加linker）的免疫效果相同，以下以结核亚单位疫苗LT70为例对其免疫学活性进行详细评价。

2.2.1实验材料：结核亚单位疫苗LT70-DDA/PolyI:C；卡介苗（BCG）；磷酸盐缓冲液（PBS）。

结核亚单位疫苗LT70-DDA/PolyI:C的制备方法如下：将融合蛋白LT70用PBS缓冲液稀释到0.2mg/ml；PolyI:C用PBS缓冲液溶解至1mg/ml；阳离子脂质体二甲基三十六烷基铵（dimo-thylidioctyl ammonium bromide，DDA）用PBS配制成2.5mg/ml，80℃水浴10min，冷却至室温。取PolyI:C溶液50μl与等量融合蛋白LT70溶液充分混匀，室温放置1min。在混合溶液中逐滴加入100μL DDA溶液，然后充分乳化，使疫苗呈均一的乳油状，即得到结核亚单位疫苗LT70-DDA/PolyI:C。该疫苗用于免疫时，用量为200μL/只小鼠。

2.2.2实验动物：C57BL/6小鼠；

2.2.3实验动物分组（共四组）：

对照组：PBS；BCG；

实验组：(EAMM+MH)- DDA/PolyI:C；LT70-DDA/PolyI:C。

2.2.4免疫动物时间点：

第0周：腹股沟皮下免疫对照组PBS和BCG组（5×10⁶CFU /只），同时用亚单位疫苗腹股沟皮下免疫实验组（第组和组）动物200μl/只；

第2、4周：亚单位疫苗腹股沟皮下以相同剂量加强免疫实验组动物两次。

2.2.5 免疫指标检测

2.2.5.1 ELISPOT方法检测小鼠分泌抗原特异性IFN-γ的水平

末次免疫小鼠6周后，无菌分离脾脏淋巴细胞，应用酶联免疫斑点实验（ELISPOT）技术检测脾脏淋巴细胞在ESAT6，Ag85B，Mtb8.4，Rv2626c和PPD(结核菌素)刺激后IFN-γ的分泌水平。

具体步骤：无菌摘除脾脏，研磨后经200目尼龙网过滤，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。将分离出的淋巴细胞加入96孔IFN-γ预包被的ELISPOT板中，终浓度为5×10⁶/孔，分别给予ESAT6（10 ug/ml）,Ag85B（5 ug/ml）,Mtb8.4（200ug/ml，为我们自己合成的肽段），Rv2626c（10 ug/ml）及PPD(5ug/ml)刺激。在37℃、5%CO₂条件下共同孵育48小时后，按ELISPOT操作说明依次加入检测抗体等试剂，洗板、显色，计数斑点数。结果参见图5。

2.2.5.2 ELISA方法检测小鼠分泌抗原特异性抗体（IgG1, IgG2c）的水平

用ESAT6(10ug/ml)、Ag85B(5ug/ml)及Rv2626c (10ug/ml)分别包被96孔板（100μl/well）4℃过夜；用PBST溶液300μl/well洗板5次×1min/次；从1∶100 开始倍比稀释至1∶102400，加入对倍稀释的血清样品（末次免疫小鼠6周后得到的血清），37℃放置1h。洗板后，加入200μl/well的1∶15000稀释的兔抗鼠IgG1、1∶10000稀释的兔抗鼠IgG2c，37℃放置1h。洗板后，加入100μl/well TMB显色液，室温避光反应15分钟显色后，加入50μl/well终止液(2N的H₂SO₄)终止反应；在450nm检测OD值。结果参见图6。

2.3 结核亚单位疫苗LT70的保护效果评价

将LT70疫苗分别在第0、2、4周免疫小鼠三次，末次免疫后第30周进行呼吸道气雾攻击结核分枝杆菌毒株H37Rv株，剂量为50-100CFU/只小鼠，攻击后第10周进行肺脏及脾脏结核菌载量的检测。本实验在武汉大学ABSL-3实验室进行。

具体方法：无菌取小鼠肺脏及脾脏，在研钵中将脏器研碎，加入2ml的PBS缓冲液，然后将该液体倍比稀释五个梯度，将每个梯度液体0.1ml接种到7H11培养基上。37℃孵箱培养18天，进行CFU计数。结果参见图7。

2.4 结核亚单位疫苗LT70对小鼠的组织病理损伤检测

实验小鼠脏器组织切片观察：攻毒小鼠解剖后，取右肺组织，采用石蜡切片苏木精-伊红（HE）染色法染色，观察肺脏病理损伤程度；并对组织切片做抗酸染色，观察组织中存结核杆菌数目。病理检测委托武汉大学ABSL-3完成。结果参见图8和图9：PBS组：结核性病变面积占切片面积的平均值为 17%，BCG组：结核性病变面积占切片面积的平均值为 11%，EAMM+MH疫苗组：结核性病变面积占切片面积的平均值为 14%，LT70疫苗组：结核性病变面积占切片面积的平均值为 12%。

2.5 结核亚单位疫苗LT70加强BCG的免疫活性评价

2.5.1实验材料：亚单位疫苗LT70-DDA/PolyI:C；卡介苗（BCG）；磷酸盐缓冲液（PBS）。

2.5.2实验动物：C57BL/6小鼠；

2.5.3实验动物分组（共三组）：

对照组PBS；BCG；实验组BCG初免， LT70-DDA/PolyI:C疫苗加强组。

2.5.4免疫动物时间点

第0周：卡介苗（BCG）5×10⁶CFU腹股沟皮下免疫实验组动物一次；同时免疫对照组PBS和BCG组（5×10⁶CFU /只）。

第18、21周：亚单位疫苗LT70腹股沟皮下以200ul/只加强免疫实验组动物两次。

2.5.5免疫指标测定方法

2.5.5.1 ELISPOT方法检测小鼠分泌抗原特异性IFN-γ的水平

末次免疫6周后，检测小鼠脾细胞在抗原ESAT6，Ag85B及Rv2626c的刺激下，分泌细胞因子的水平。具体方法与步骤同2.2.5.1。结果参见图10。

2.5.5.2 ELISA方法检测小鼠分泌抗原特异性抗体（IgG1, IgG2c）的水平

末次免疫后6周后，检测小鼠脾细胞在抗原ESAT6，Ag85B及Rv2626c的刺激下，抗体的水平。具体方法与步骤同2.2.5.2。结果参见图11。

2.6 结核亚单位疫苗LT70加强BCG的保护效果评价

小鼠在第0周进行BCG初免，LT70疫苗在第18、21周加强免疫两次，末次免疫后在第12周进行呼吸道气雾攻击结核分枝杆菌毒株H37Rv株，剂量为50-100CFU/只小鼠，攻击后第10周进行肺脏及脾脏结核菌载量的检测。

具体方法：无菌取小鼠肺脏及脾脏，在研钵中将脏器研碎，加入2ml的PBS缓冲液，然后将该液体倍比稀释五个梯度，将每个梯度液体0.1ml接种到7H11培养基上。37℃孵箱培养18天，进行CFU计数。结果参见图12。

2.7 结核亚单位疫苗LT70强化BCG免疫和毒株攻击后对小鼠的组织病理损伤检测

实验小鼠脏器组织切片观察：攻毒小鼠解剖后，取右肺组织，采用石蜡切片苏木精-伊红（HE）染色法染色，观察肺脏病理损伤程度；并对组织切片做抗酸染色，观察组织中存结核杆菌数目。结果参见图13和图14：PBS组：结核性病变面积占切片面积的平均值为 17%，BCG组：结核性病变面积占切片面积的平均值为 11%，LT70疫苗强化BCG组：结核性病变面积占切片面积的平均值为 7%。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 兰州大学

<120> 一种结核分枝杆菌融合蛋白及其制备方法和应用

<210> 1

<211> 1980

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgacagagc agcagtggaa tttcgcgggt atcgaggccg cggcaagcgc aatccaggga 60

aatgtcacgt ccattcattc cctccttgac gaggggaagc agtccctgac caagctcgca 120

gcggcctggg gcggtagcgg ttcggaggcg taccagggtg tccagcaaaa atgggacgcc 180

acggctaccg agctgaacaa cgcgctgcag aacctggcgc ggacgatcag cgaagccggt 240

caggcaatgg cttcgaccga aggcaacgtc actgggatgt tcgcagaatt cttctcccgg 300

ccggggctgc cggtcgagta cctgcaggtg ccgtcgccgt cgatgggccg cgacatcaag 360

gttcagttcc agagcggtgg gaacaactca cctgcggttt atctgctcga cggcctgcgc 420

gcccaagacg actacaacgg ctgggatatc aacaccccgg cgttcgagtg gtactaccag 480

tcgggactgt cgatagtcat gccggtcggc gggcagtcca gcttctacag cgactggtac 540

agcccggcct gcggtaaggc tggctgccag acttacaagt gggaaacctt cctgaccagc 600

gagctgccgc aatggttgtc cgccaacagg gccgtgaagc ccaccggcag cgctgcaatc 660

ggcttgtcga tggccggctc gtcggcaatg atcttggccg cctaccaccc ccagcagttc 720

atctacgccg gctcgctgtc ggccctgctg gacccctctc aggggatggg gcctagcctg 780

atcggcctcg cgatgggtga cgccggcggt tacaaggccg cagacatgtg gggtccctcg 840

agtgacccgg catgggagcg caacgaccct acgcagcaga tccccaagct ggtcgcaaac 900

aacacccggc tatgggttta ttgcgggaac ggcaccccga acgagttggg cggtgccaac 960

atacccgccg agttcttgga gaacttcgtt cgtagcagca acctgaagtt ccaggatgcg 1020

tacaacgccg cgggcgggca caacgccgtg ttcaacttcc cgcccaacgg cacgcacagc 1080

tgggagtact ggggcgctca gctcaacgcc atgaagggtg acctgcagag ttcgttaggc 1140

gccggcagat ctttcgcagt cacgaacgac ggggtgatta tgaggctgtc gttgaccgca 1200

ttgagcgccg gtgtaggcgc cgtggcaatg tcgttgaccg tcggggccgg ggtcgcctcc 1260

gcagatcccg tggacgcggt cattaacacc acctgcaatt acgggcaggt agtagctgcg 1320

ctcaacgcga cggatccggg ggctgccgca cagttcaacg cctcaccggt ggcgcagtcc 1380

tatttgcgca atttcctcgc cgcaccgcca cctcagcgcg ctgccatggc cgcgcaattg 1440

caagctgtgc cgggggcggc acagtacatc ggccttgtcg agtcggttgc cggctcctgc 1500

aacaactatg agctcatgac cacggcgcgt gatatcatga atgcgggtgt cacctgtgtt 1560

ggcgagcacg aaacgttgac cgcagcagca cagtacatgc gcgaacatga tatcggcgca 1620

ttgccgattt gcggcgacga tgatcgtctg cacggtatgc tgaccgaccg cgatatcgtt 1680

atcaagggtc tggccgcagg cttggacccg aacaccgcga ccgccggtga actggcacgt 1740

gacagcatct attacgtcga cgcgaacgcc agcattcaag agatgctgaa cgtgatggaa 1800

gagcatcagg tgcgtcgtgt cccggttatc agcgaacatc gtctggttgg tatcgttacc 1860

gaagccgaca tcgcacgtca cctgccggag cacgcgattg ttcagttcgt gaaagcgatt 1920

tgcagcccga tggcgttggc gtctcgtcaa aagggcgaca caaaatttat tctaaatgca 1980

<210> 2

<211> 660

<212> PRT

<213> 人工蛋白

<400> 2

Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser

1 5 10 15

Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly

20 25 30

Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser

35 40 45

Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu

50 55 60

Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly

65 70 75 80

Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala Glu

85 90 95

Phe Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser

100 105 110

Pro Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Asn

115 120 125

Asn Ser Pro Ala Val Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp

130 135 140

Tyr Asn Gly Trp Asp Ile Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Tyr Gln

145 150 155 160

Ser Gly Leu Ser Ile Val Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr

165 170 175

Ser Asp Trp Tyr Ser Pro Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr

180 185 190

Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu Leu Pro Gln Trp Leu Ser Ala

195 200 205

Asn Arg Ala Val Lys Pro Thr Gly Ser Ala Ala Ile Gly Leu Ser Met

210 215 220

Ala Gly Ser Ser Ala Met Ile Leu Ala Ala Tyr His Pro Gln Gln Phe

225 230 235 240

Ile Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Ala Leu Leu Asp Pro Ser Gln Gly Met

245 250 255

Gly Pro Ser Leu Ile Gly Leu Ala Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys

260 265 270

Ala Ala Asp Met Trp Gly Pro Ser Ser Asp Pro Ala Trp Glu Arg Asn

275 280 285

Asp Pro Thr Gln Gln Ile Pro Lys Leu Val Ala Asn Asn Thr Arg Leu

290 295 300

Trp Val Tyr Cys Gly Asn Gly Thr Pro Asn Glu Leu Gly Gly Ala Asn

305 310 315 320

Ile Pro Ala Glu Phe Leu Glu Asn Phe Val Arg Ser Ser Asn Leu Lys

325 330 335

Phe Gln Asp Ala Tyr Asn Ala Ala Gly Gly His Asn Ala Val Phe Asn

340 345 350

Phe Pro Pro Asn Gly Thr His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu

355 360 365

Asn Ala Met Lys Gly Asp Leu Gln Ser Ser Leu Gly Ala Gly Arg Ser

370 375 380

Phe Ala Val Thr Asn Asp Gly Val Ile Met Arg Leu Ser Leu Thr Ala

385 390 395 400

Leu Ser Ala Gly Val Gly Ala Val Ala Met Ser Leu Thr Val Gly Ala

405 410 415

Gly Val Ala Ser Ala Asp Pro Val Asp Ala Val Ile Asn Thr Thr Cys

420 425 430

Asn Tyr Gly Gln Val Val Ala Ala Leu Asn Ala Thr Asp Pro Gly Ala

435 440 445

Ala Ala Gln Phe Asn Ala Ser Pro Val Ala Gln Ser Tyr Leu Arg Asn

450 455 460

Phe Leu Ala Ala Pro Pro Pro Gln Arg Ala Ala Met Ala Ala Gln Leu

465 470 475 480

Gln Ala Val Pro Gly Ala Ala Gln Tyr Ile Gly Leu Val Glu Ser Val

485 490 495

Ala Gly Ser Cys Asn Asn Tyr Glu Leu Met Thr Thr Ala Arg Asp Ile

500 505 510

Met Asn Ala Gly Val Thr Cys Val Gly Glu His Glu Thr Leu Thr Ala

515 520 525

Ala Ala Gln Tyr Met Arg Glu His Asp Ile Gly Ala Leu Pro Ile Cys

530 535 540

Gly Asp Asp Asp Arg Leu His Gly Met Leu Thr Asp Arg Asp Ile Val

545 550 555 560

Ile Lys Gly Leu Ala Ala Gly Leu Asp Pro Asn Thr Ala Thr Ala Gly

565 570 575

Glu Leu Ala Arg Asp Ser Ile Tyr Tyr Val Asp Ala Asn Ala Ser Ile

580 585 590

Gln Glu Met Leu Asn Val Met Glu Glu His Gln Val Arg Arg Val Pro

595 600 605

Val Ile Ser Glu His Arg Leu Val Gly Ile Val Thr Glu Ala Asp Ile

610 615 620

Ala Arg His Leu Pro Glu His Ala Ile Val Gln Phe Val Lys Ala Ile

625 630 635 640

Cys Ser Pro Met Ala Leu Ala Ser Arg Gln Lys Gly Asp Thr Lys Phe

645 650 655

Ile Leu Asn Ala

660

<210> 3

<211> 2070

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgacagagc agcagtggaa tttcgcgggt atcgaggccg cggcaagcgc aatccaggga 60

aatgtcacgt ccattcattc cctccttgac gaggggaagc agtccctgac caagctcgca 120

gcggcctggg gcggtagcgg ttcggaggcg taccagggtg tccagcaaaa atgggacgcc 180

acggctaccg agctgaacaa cgcgctgcag aacctggcgc ggacgatcag cgaagccggt 240

caggcaatgg cttcgaccga aggcaacgtc actgggatgt tcgcagaatt cggtggtggt 300

ggttctggtg gtggtggttc tggtggtggt ggttctttct cccggccggg gctgccggtc 360

gagtacctgc aggtgccgtc gccgtcgatg ggccgcgaca tcaaggttca gttccagagc 420

ggtgggaaca actcacctgc ggtttatctg ctcgacggcc tgcgcgccca agacgactac 480

aacggctggg atatcaacac cccggcgttc gagtggtact accagtcggg actgtcgata 540

gtcatgccgg tcggcgggca gtccagcttc tacagcgact ggtacagccc ggcctgcggt 600

aaggctggct gccagactta caagtgggaa accttcctga ccagcgagct gccgcaatgg 660

ttgtccgcca acagggccgt gaagcccacc ggcagcgctg caatcggctt gtcgatggcc 720

ggctcgtcgg caatgatctt ggccgcctac cacccccagc agttcatcta cgccggctcg 780

ctgtcggccc tgctggaccc ctctcagggg atggggccta gcctgatcgg cctcgcgatg 840

ggtgacgccg gcggttacaa ggccgcagac atgtggggtc cctcgagtga cccggcatgg 900

gagcgcaacg accctacgca gcagatcccc aagctggtcg caaacaacac ccggctatgg 960

gtttattgcg ggaacggcac cccgaacgag ttgggcggtg ccaacatacc cgccgagttc 1020

ttggagaact tcgttcgtag cagcaacctg aagttccagg atgcgtacaa cgccgcgggc 1080

gggcacaacg ccgtgttcaa cttcccgccc aacggcacgc acagctggga gtactggggc 1140

gctcagctca acgccatgaa gggtgacctg cagagttcgt taggcgccgg cggtggtggt 1200

ggttctggtg gtggtggttc tggtggtggt ggttctagat ctttcgcagt cacgaacgac 1260

ggggtgatta tgaggctgtc gttgaccgca ttgagcgccg gtgtaggcgc cgtggcaatg 1320

tcgttgaccg tcggggccgg ggtcgcctcc gcagatcccg tggacgcggt cattaacacc 1380

acctgcaatt acgggcaggt agtagctgcg ctcaacgcga cggatccggg ggctgccgca 1440

cagttcaacg cctcaccggt ggcgcagtcc tatttgcgca atttcctcgc cgcaccgcca 1500

cctcagcgcg ctgccatggc cgcgcaattg caagctgtgc cgggggcggc acagtacatc 1560

ggccttgtcg agtcggttgc cggctcctgc aacaactatg agctcatgac cacggcgcgt 1620

gatatcatga atgcgggtgt cacctgtgtt ggcgagcacg aaacgttgac cgcagcagca 1680

cagtacatgc gcgaacatga tatcggcgca ttgccgattt gcggcgacga tgatcgtctg 1740

cacggtatgc tgaccgaccg cgatatcgtt atcaagggtc tggccgcagg cttggacccg 1800

aacaccgcga ccgccggtga actggcacgt gacagcatct attacgtcga cgcgaacgcc 1860

agcattcaag agatgctgaa cgtgatggaa gagcatcagg tgcgtcgtgt cccggttatc 1920

agcgaacatc gtctggttgg tatcgttacc gaagccgaca tcgcacgtca cctgccggag 1980

cacgcgattg ttcagttcgt gaaagcgatt tgcagcccga tggcgttggc gtctcgtcaa 2040

aagggcgaca caaaatttat tctaaatgca 2070

<210> 4

<211> 690

<212> PRT

<213> 人工蛋白

<400> 4

Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser

1 5 10 15

Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly

20 25 30

Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser

35 40 45

Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu

50 55 60

Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly

65 70 75 80

Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala Glu

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro

115 120 125

Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Asn Asn

130 135 140

Ser Pro Ala Val Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Tyr

145 150 155 160

Asn Gly Trp Asp Ile Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Tyr Gln Ser

165 170 175

Gly Leu Ser Ile Val Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser

180 185 190

Asp Trp Tyr Ser Pro Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys

195 200 205

Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu Leu Pro Gln Trp Leu Ser Ala Asn

210 215 220

Arg Ala Val Lys Pro Thr Gly Ser Ala Ala Ile Gly Leu Ser Met Ala

225 230 235 240

Gly Ser Ser Ala Met Ile Leu Ala Ala Tyr His Pro Gln Gln Phe Ile

245 250 255

Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Ala Leu Leu Asp Pro Ser Gln Gly Met Gly

260 265 270

Pro Ser Leu Ile Gly Leu Ala Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala

275 280 285

Ala Asp Met Trp Gly Pro Ser Ser Asp Pro Ala Trp Glu Arg Asn Asp

290 295 300

Pro Thr Gln Gln Ile Pro Lys Leu Val Ala Asn Asn Thr Arg Leu Trp

305 310 315 320

Val Tyr Cys Gly Asn Gly Thr Pro Asn Glu Leu Gly Gly Ala Asn Ile

325 330 335

Pro Ala Glu Phe Leu Glu Asn Phe Val Arg Ser Ser Asn Leu Lys Phe

340 345 350

Gln Asp Ala Tyr Asn Ala Ala Gly Gly His Asn Ala Val Phe Asn Phe

355 360 365

Pro Pro Asn Gly Thr His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn

370 375 380

Ala Met Lys Gly Asp Leu Gln Ser Ser Leu Gly Ala Gly Gly Gly Gly

385 390 395 400

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Ser Phe Ala

405 410 415

Val Thr Asn Asp Gly Val Ile Met Arg Leu Ser Leu Thr Ala Leu Ser

420 425 430

Ala Gly Val Gly Ala Val Ala Met Ser Leu Thr Val Gly Ala Gly Val

435 440 445

Ala Ser Ala Asp Pro Val Asp Ala Val Ile Asn Thr Thr Cys Asn Tyr

450 455 460

Gly Gln Val Val Ala Ala Leu Asn Ala Thr Asp Pro Gly Ala Ala Ala

465 470 475 480

Gln Phe Asn Ala Ser Pro Val Ala Gln Ser Tyr Leu Arg Asn Phe Leu

485 490 495

Ala Ala Pro Pro Pro Gln Arg Ala Ala Met Ala Ala Gln Leu Gln Ala

500 505 510

Val Pro Gly Ala Ala Gln Tyr Ile Gly Leu Val Glu Ser Val Ala Gly

515 520 525

Ser Cys Asn Asn Tyr Glu Leu Met Thr Thr Ala Arg Asp Ile Met Asn

530 535 540

Ala Gly Val Thr Cys Val Gly Glu His Glu Thr Leu Thr Ala Ala Ala

545 550 555 560

Gln Tyr Met Arg Glu His Asp Ile Gly Ala Leu Pro Ile Cys Gly Asp

565 570 575

Asp Asp Arg Leu His Gly Met Leu Thr Asp Arg Asp Ile Val Ile Lys

580 585 590

Gly Leu Ala Ala Gly Leu Asp Pro Asn Thr Ala Thr Ala Gly Glu Leu

595 600 605

Ala Arg Asp Ser Ile Tyr Tyr Val Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gln Glu

610 615 620

Met Leu Asn Val Met Glu Glu His Gln Val Arg Arg Val Pro Val Ile

625 630 635 640

Ser Glu His Arg Leu Val Gly Ile Val Thr Glu Ala Asp Ile Ala Arg

645 650 655

His Leu Pro Glu His Ala Ile Val Gln Phe Val Lys Ala Ile Cys Ser

660 665 670

Pro Met Ala Leu Ala Ser Arg Gln Lys Gly Asp Thr Lys Phe Ile Leu

675 680 685

Asn Ala

690

Claims

1.一种结核分枝杆菌融合蛋白，是序列表中序列2和序列4中的蛋白质。

2.权利要求1所述的结核分枝杆菌融合蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：是如下1）或2）所述的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中的序列1或3；

2)与序列表中序列1或3互补的核苷酸序列；

3)在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码所述融合蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组表达载体。

5.含有权利要求4所述重组表达载体的宿主细胞。

6.权利要求1所述的结核分枝杆菌融合蛋白的制备方法，包括融合蛋白的表达与纯化，其特征在于：所述结核分枝杆菌融合蛋白的表达为：将含有融合蛋白的菌体加入LB培养基中振荡培养，加入终浓度为0.5mmol/L的蛋白诱导剂IPTG，27℃-31℃（29℃为最优）诱导振荡培养4h，后处理后获得上清即为表达产物。

7.权利要求1所述的结核分枝杆菌融合蛋白在制备结核亚单位疫苗中的应用。

8.一种结核亚单位疫苗，其含有权利要求1所述的结核分枝杆菌融合蛋白。

9.根据权利要求8所述的结核亚单位疫苗，其特征在于：所述结核亚单位疫苗是由权利要求1所述的结核分枝杆菌融合蛋白、DDA和PolyI:C组成的；作为优选，权利要求1所述的结核分枝杆菌融合蛋白、DDA和PolyI:C的质量比为：1：25：5。

10.权利要求8所述的结核亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：每200μL结核亚单位疫苗的制备方法如下：将融合蛋白用PBS缓冲液稀释到0.2mg/ml；PolyI:C用PBS缓冲液溶解至1mg/ml；DDA用PBS配制成2.5mg/ml，水浴后冷却至室温；取PolyI:C溶液50μl与等量融合蛋白溶液充分混匀，室温放置；在混合溶液中逐滴加入100μL DDA溶液，然后充分乳化，使疫苗呈均一的乳油状即得到结核亚单位疫苗。