ES2708763T3 - Compuestos de monometilvalina que tienen modificaciones de la cadena lateral de fenilalanina en el extremo C - Google Patents

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Abstract

Un compuesto que tiene la fórmula:**Fórmula** o una sal o un solvato de mismo farmacéuticamente aceptables, en la que: R2 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-C8; R3 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo C1-C8, X1- (carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y X1-(heterociclo C3-C8); R4 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8 alquilo, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, alquil C1- C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y X1-(heterociclo C3-C8); R5 se selecciona entre el grupo que consiste en H y metilo; o R4 y R5 forman juntos un anillo carbocíclico y tiene la fórmula -(CRaRb)n- en la que Ra y Rb se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8 y carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre el grupo que consiste en 2, 3, 4, 5 y 6; R6 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-C8; R7 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, X1-(carbociclo C3- C8), heterociclo C3-C8 y X1-(heterociclo C3-C8); cada R8 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, OH, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8 y O-(alquilo C1-C8); cada X1 es independientemente alquileno C1-C10; el resto -NR9Z1 es un bioisóstero de fenilalanina con con una cadena lateral de aminoácido modificado en donde el resto bioisóstero de fenilalanina**Fórmula** tiene la estructura:**Fórmula**

Description

DESCRIPCION
Compuestos de monometilvalina que tienen modificaciones de la cadena lateral de fenilalanina en el extremo C
Campo de la invencion
La presente divulgacion se refiere a compuestos de farmaco, a conjugados farmaco-enlazador-ligando, compuestos de farmaco-enlazador y conjugados farmaco-ligando; as! como a composiciones que incluyen los mismos y a metodos para usar los mismos para tratar el cancer, una enfermedad autoinmune, una enfermedad infecciosa y otras afecciones patologicas. La divulgacion tambien se refiere a metodos de uso de compuestos de conjugado anticuerpo-farmaco in vitro, in situ e in vivo para el diagnostico o el tratamiento de celulas de mamlferos o afecciones patologicas asociadas.
Antecedentes de la invencion
Un gran interes ha rodeado el uso de anticuerpos monoclonales (mAb) para el suministro selectivo de agentes citotoxicos a las celulas tumorales. MMAF (N-metilvalina-valina-dolaisoleulna-dolaprolna-fenilalanina) es una auristatina que es relativamente atoxica, sin embargo, es altamente potente en actividad cuando se conjuga con mAb de internalizacion. MMAF tiene un resto de fenilalanina C-terminal cargado que atenua su actividad citotoxica en comparacion con su homologo neutro, MMAE; esta diferencia se debe muy probablemente al acceso intracelular alterado. Sin embargo, la conjugacion de MMAF con los anticuerpos de internalizacion, como AC10 o 1F6, a traves de un enlazador escindible por proteasa dio como resultado conjugados que son > 2000 veces mas potentes sobre celulas positivas al antlgeno en comparacion con el farmaco sin conjugar. La direccion activa con mAb facilita el suministro intracelular de MMAF; una vez que MMAF se libera del conjugado dentro de las celulas, el farmaco presumiblemente queda atrapado debido a su reducida capacidad de atravesar las membranas celulares aumentando as! su concentracion intracelular y por tanto la potencia del conjugado. El uso de farmacos citotoxicos con una captacion intracelular pasiva alterada puede conducir potencialmente a conjugados mAb-farmaco con menor toxicidad sistemica.
En efecto, la escision inespeclfica del enlazador en circulacion liberarla un farmaco relativamente atoxico.
El documento WO2004/073656 desvela anticuerpos anti-CD70 conjugados con citotoxicos, inmunosupresores u otros agentes terapeuticos, para el tratamiento de canceres que expresan CD70 y trastornos inmunologicos.
El documento WO2004/010957 desvela conjugados farmaco-enlazador-ligando en los que un farmaco se enlaza a un ligando, por ejemplo un anticuerpo, a traves de una unidad enlazadora a base de peptidos. Tambien se desvelan compuestos de farmaco-enlazador y compuestos de farmaco. Tambien se desvelan metodos para el tratamiento del cancer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa usando los conjugados.
El documento W02005/001038 se refiere a metodos y composiciones para el tratamiento de la enfermedad de Hodgkin, que comprenden protelnas que administran caracterizadas por su capacidad para unirse a CD30.
El documento W02005/081711 describe peptidos auristatina, incluyendo MMAE y MMAF, unidos a ligandos a traves de diversos enlazadores.
El documento WO 94/13695 desvela analogos de dolastatina con un efecto antineoplasico y el documento WO 01/18032 tambien proporciona peptidos de dolastatina. El documento US 5767237 desvela derivados peptldicos con actividad antitumoral util como agente anticanceroso o antitumoral.
Para expandir y mejorar la clase de farmaco de auristatina, y los conjugados de anticuerpos dmg (ADC) correspondientes, se ha modificado la cadena lateral del residuo de fenilalanina C-terminal de MMAF. La modification estructural de TM imparte propiedades inesperadas a la resistencia libre resultante y al ADC.
La enumeration de cualquier referencia en la presente solicitud no es una admision de que la referencia sea la tecnica anterior a la presente solicitud.
Sumario de la invencion
En un aspecto, la presente invencion proporciona compuestos como se definen en las reivindicaciones adjuntas.
Los compuestos son utiles para tratar trastornos, como el cancer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa, en un paciente, o util como un intermedio para la slntesis de un compuesto de farmaco-enlazador o un conjugado farmaco-enlazador-ligando (por ejemplo, un conjugado farmaco-enlazador-anticuerpo, un conjugado de farmaco-ligando o un conjugado farmaco-ligando que tiene una unidad de farmaco escindible).
En otro aspecto, se proporcionan composiciones que incluyen una cantidad eficaz de las reivindicaciones adjuntas, o una sal farmaceuticamente aceptable de las mismas y un compuesto aceptable del diluyente, vehlculo o excipiente aceptable.
En otro aspecto, los compuestos se proporcionan de acuerdo con las presentes reivindicaciones, o una sal farmaceuticamente aceptable o solvato del mismo, que son eficaces para destruir o inhibir la proliferacion de las celulas tumorales o celulas cancerosas, para usar en un metodo para matar o inhibir la proliferacion de celulas tumorales o celulas cancerlgenas. En otro aspecto mas, los compuestos se proporcionan de acuerdo con las presentes reivindicaciones, o una sal farmaceuticamente aceptable o solvato del mismo, siendo dicha cantidad eficaz para tratar el cancer, la enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa, para uso en un metodo para tratar una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en cancer, enfermedad autoinmune y una enfermedad infecciosa.
En otro aspecto, se proporciona un metodo para inhibir la proliferacion celular que comprende exponer celulas de mamlfero en un medio de cultivo celular al compuesto conjugado de farmaco de anticuerpo de las reivindicaciones adjuntas, y medir una actividad citotoxica del compuesto, por lo que se inhibe la proliferacion de las celulas.
En otro aspecto, se proporciona un artlculo de fabrication que comprende un compuesto conjugado de farmaco de anticuerpo de las reivindicaciones adjuntas; un recipiente; y un prospecto o etiqueta que indica que el compuesto se puede usar para tratar el cancer caracterizado por la sobreexpresion de al menos uno de CD20, CD30, CD33, CD40, CD70, BCMA y antlgeno Y de Lewis.
La invention se entendera mejor por referencia a la siguiente description detallada de los ejemplos de ejemplos, tomada en conjunto con los dibujos, figuras y esquemas que se acompanan. La discusion a continuation es descriptiva, ilustrativa y a modo de ejemplo.
Descripcion detallada de la invencion
Definiciones y abreviaturas
A menos que se indique lo contrario, se pretende que los siguientes terminos y frases como se usan en el presente documento tengan los siguientes significados. Cuando se usan nombres comerciales en el presente documento, el nombre comercial incluye la formulation del producto, el farmaco generico y el principio o principios activos farmaceuticos del producto de nombre comercial, a menos que se indique lo contrario por el contexto.
El termino "anticuerpo" se usa en el presente documento en el sentido mas amplio y cubre especlficamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoespeclficos, anticuerpos multiespeclficos (por ejemplo, anticuerpos biespeclficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos, que presenten la actividad biologica deseada. Un anticuerpo intacto tiene principalmente dos regiones: una region variable y una region constante. La region variable se une a e interactua con un antlgeno diana. La region variable incluye una region determinante complementaria (RDC) que reconoce y se une a un sitio de union especlfico en un antlgeno particular. La region constante puede ser reconocido por, e interactuar con, el sistema inmunitario (vease, por ejemplo, Janeway et al., 2001, Immuno. Biology, 5a edition., Garland Publishing, Nueva York). Un anticuerpo puede ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase. El anticuerpo puede derivarse de cualquier especie adecuada. En un aspecto, sin embargo, el anticuerpo es de origen humano, murino o de conejo. Un anticuerpo puede ser, por ejemplo, humano, humanizado o quimerico, un anticuerpo de una sola cadena, un fragmento Fv, un fragmento Fab, un fragmento F(ab'), un fragmento F(ab')2, un fragmento o fragmentos producidos por una biblioteca de expresion de Fab, anticuerpos antiidiotfpicos (anti-Id) y fragmentos de union a epltopo de cualquiera de los anteriores que se unen inmunoespeclficamente a un antlgeno diana (por ejemplo, un antlgeno de celula de cancer, un antlgeno viral o un antlgeno microbiano).
Las expresiones "se une especlficamente" y "union especlfica" se refieren a la union del anticuerpo a un antlgeno predeterminado. Normalmente, el anticuerpo se une con una afinidad de al menos aproximadamente 1 x 107 M-1, y se une al antlgeno predeterminado con una afinidad que es al menos dos veces mayor que su afinidad por la union a un antlgeno no especlfico (por ejemplo, BSA, caselna) distinto del antlgeno predeterminado o un antlgeno estrechamente relacionado.
La expresion "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente especlficos, estando dirigidos contra un solo sitio antigenico. El modificador "monoclonal" indica el caracter del anticuerpo al obtenerse de una poblacion sustancialmente homogenea de anticuerpos y no debe interpretarse como que requiere la production del anticuerpo mediante cualquier metodo particular.
La expresion "anticuerpos monoclonales" incluye especlficamente anticuerpos "quimericos" en los que una portion de la cadena pesada y/o ligera es identica u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena o cadenas son identicas u homologas a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, as! como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biologica deseada.
Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porcion de un anticuerpo intacto, que comprende preferentemente la region variable o de union a antlgeno del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, anticuerpos lineales, moleculas de anticuerpo de cadena sencilla, scFv, scFv-Fc y anticuerpos multiespeclficos formados a partir de fragmento o fragmentos de anticuerpos.
Un anticuerpo "intacto" es aquel que comprende una region variable de union a antlgeno as! como un dominio constante de cadena ligera (Cl) y dominios constantes de cadena pesada, Ch1, Ch2, Ch3 y Ch4, segun corresponda a la clase de anticuerpos. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo, los dominios constantes de secuencia humana nativa de) o una variante de secuencia de aminoacidos de los mismos.
Un anticuerpo intacto puede tener uno o mas "funciones efectoras", que se refiere a las actividades biologicas atribuibles a la region Fc (por ejemplo, una region Fc de secuencia nativa o una region Fc de variante de secuencia de aminoacidos) de un anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos incluyen la union a C1q; la citotoxicidad dependiente del complemento; la union al receptor de Fc; la citotoxicidad dependiente de anticuerpos mediada por celulas (CDAC); la fagocitosis; la regulacion negativa de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, el receptor de celulas B; BCR), etc.
Un polipeptido de "secuencia nativa" es aquel que tiene la misma secuencia de aminoacidos que un polipeptido, por ejemplo, un receptor de antlgeno asociado a tumor, derivado de la naturaleza. Dichos polipeptidos de secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza o pueden producirse por medios recombinantes o de slntesis. Por tanto, un polipeptido de secuencia nativa puede tener la secuencia de aminoacidos de un polipeptido humano de origen natural, de un polipeptido murino o de un polipeptido de cualquier otra especie de mamlfero.
La expresion "variante de secuencia de aminoacidos" se refiere a polipeptidos que tienen secuencias de aminoacidos que difieren hasta cierto punto de un polipeptido de secuencia nativa. Habitualmente, las variantes de secuencia de aminoacidos poseeran al menos aproximadamente un 70 % de homologla con al menos un dominio de union al receptor de un ligando nativo, o con al menos un dominio de union al ligando de un receptor nativo, tal como un antlgeno asociado a tumor. En otros aspectos, que seran homologos al menos aproximadamente al 80 %, al menos aproximadamente al 90 % o al menos al 95 % con dichos dominios de union al receptor o al ligando. Las variantes de secuencia de aminoacidos poseen sustituciones, deleciones y/o inserciones en ciertas posiciones dentro de la secuencia de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos nativa.
La "identidad de secuencia" se define como el porcentaje de restos en la variante de secuencia de aminoacidos que son identicos despues de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el maximo porcentaje de identidad de secuencia. Un ejemplo preferido, no limitante de un algoritmo matematico utilizado para la comparacion de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modificado como en Karlin y Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Dicho algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410. Las busquedas de nucleotidos BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, puntuacion = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleotidos homologas a un acido nucleico que codifica una protelna de interes. Las busquedas de protelnas BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuacion = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoacidos homologas a la protelna de interes. Para obtener alineamientos con huecos con fines de comparacion, puede usarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389­ 3402. Como alternativa, puede usarse PSI-Blast para realizar una busqueda por iteraciones que detecta relaciones remotas entre moleculas (Id.). Cuando se usan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, pueden usarse los parametros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Otro ejemplo preferido, no limitativo de un algoritmo matematico utilizado para la comparacion de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989). Un algoritmo de este tipo se incorpora en el programa ALIGN (version 2.0) que es parte del paquete de software de alineamiento de secuencias GCG. Cuando se usa el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoacidos, pueden usarse una tabla de restos de peso PAM120, una penalization de longitud de hueco de 12 y una penalizacion por hueco de 4. Se conocen en la tecnica algoritmos adicionales para el analisis de secuencias e incluyen ADVANCE y ADAM como se describen en Torellis y Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5; y FASTA descrito en Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8. Dentro de fAsTA, ktup es una option de control que establece la sensibilidad y la velocidad de la busqueda. Si ktup = 2, se encuentran regiones similares en las dos secuencias que se comparan examinado pares de restos alineados; si ktup = 1, se examinan aminoacidos alineados individuales. ktup puede ajustarse a 2 o 1 para secuencias de protelnas o de 1 a 6 para secuencias de ADN. El valor por defecto, o si no se especifica ktup, es de 2 para protelnas y de 6 para el ADN. Como alternativa, el alineamiento de secuencia de protelnas puede realizarse usando el algoritmo c Lu STAL W, como se describe por Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402. En algunas realizaciones, las dos secuencias que se comparan tienen la misma longitud despues de que se introducen huecos en las secuencias, segun sea apropiado (por ejemplo, excluyendo la secuencia adicional que se prolonga mas alla de las secuencias que se comparan).
"Citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos" y "CDAC" se refieren a una reaction mediada por celulas en la que celulas citotoxicas no especlficas que expresan receptores Fc (FcR) (por ejemplo, los linfocitos citollticos naturales (NK), los neutrofilos y los macrofagos) reconocen el anticuerpo unido sobre una celula diana y posteriormente provocan la lisis de la celula diana. Las celulas principales que median la CDAC, los NK, expresan FcyRIII solamente, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresion de FcR en celulas hematopoyeticas se resume en la Tabla 3 en la pagina 464 de Ravetch y Kinet, 1991, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92. Para evaluar la actividad CDAC de una molecula de interes, puede realizarse un ensayo de CDAC in vitro, tal como el descrito en la Patente de los EE.UU. N.° 5.500.362 o 5.821.337. Las celulas efectoras utiles para dichos ensayos incluyen celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) y linfocitos citollticos naturales (NK). Como alternativa o adicionalmente, la actividad CDAC de la molecula de interes puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el desvelado en Clynes et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656.
Las expresiones "receptor de Fc" o "FcR" se usan para describir un receptor que se une a la region Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es una secuencia nativa de FcR humano. Ademas, un FcR preferido es uno que se une un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluyendo variantes alelicas y formas con empalme alternativo de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor activador") y FcyRIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoacidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmaticos de los mismos. El receptor activador FcyRIIA contiene un motivo inmunoreceptor con activacion basada en tirosina (ITAM) en su dominio citoplasmico. El receptor inhibidor FcyRIIB contiene motivo inmunoreceptor con inhibicion basada en tirosina (ITIM) en su dominio citoplasmatico. (Vease revision en M. Daeron, 1997, Annu Rev. Immunol. 15:203-234). Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, 1991, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel et al., 1994, Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med.
126:330-41. Otros FcR, incluyendo los que se identifiquen en el futuro, estan incluidos en el termino "FcR" en el presente documento. El termino tambien incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (vease, por ejemplo, Guyer et al., 1976, J. Immunol 117: 587; y Kim et al., 1994, J. Immunol.
24:249).
"Citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la capacidad de una molecula de lisar una diana en presencia del complemento. La via de activacion del complemento se inicia por la union del primer componente del sistema del complemento (C1q) a una molecula (por ejemplo, un anticuerpo) complejada con un antlgeno afln. Para evaluar la activacion del complemento, puede realizarse un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al., 1996, J. Immunol. Methods 202:163.
El termino "variable" se refiere a ciertas porciones de los dominios variables de los anticuerpos que difieren ampliamente en la secuencia y se usan en la union y la especificidad de cada anticuerpo particular por su antlgeno particular. Esta variabilidad se concentra en tres segmentos denominados "regiones hipervariables" en los dominios variables de la cadena ligera y de la cadena pesada. Las partes mas altamente conservadas de los dominios variables se denominan las regiones marco conservadas (RMC). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro RMC conectadas por tres regiones hipervariables.
La expresion "region hipervariable" cuando se usa en el presente documento se refiere a los restos de aminoacidos de un anticuerpo que son responsables de la union al antlgeno. La region hipervariable comprende generalmente restos de aminoacidos de una "region determinante de complementariedad" o "RDC" (por ejemplo, restos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) y/o los restos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, los restos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (h 2) y 96­ 101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk, 1987, J. Mol Biol. 196:901-917) Los restos de "region marco conservada" o "RMC" son los restos del dominio variable diferentes de los restos de la region hipervariable como se definen en el presente documento.
Los fragmentos de anticuerpos "Fv de cadena unica" "scFv" comprenden los dominios Vh y Vl del anticuerpo, en los que estos dominios estan presentes en una unica cadena polipeptldica. Normalmente, el polipeptido Fv comprende adicionalmente un enlazador polipeptldico entre los dominios Vh y Vl que permite que el scFv forme la estructura deseada para la union al antlgeno. Para una revision de scFv, ver Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pags. 269-315 (1994).
El termino "diacuerpos" se refiere a pequenos fragmentos de anticuerpos con dos sitios de union a antlgeno, fragmentos que comprenden un dominio pesado variable (Vh) conectado a un dominio ligero variable (Vl) en la misma cadena polipeptldica. Mediante el uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de union a antlgeno. Los diacuerpos se describen mas en detalle en, por ejemplo, el documento EP 0404 097; el documento WO 93/11161; y Hollinger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444­ 6448.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de roedor) son anticuerpos quimericos que contienen una secuencia minima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que restos de una region hipervariable del receptor se reemplazan por restos de una region hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como raton, rata, conejo o primate no humano que tengan la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de region marco conservada (RMC) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los correspondientes restos no humanos. Ademas, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente la totalidad de al menos uno y normalmente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las RMC son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente tambien comprendera al menos una porcion de una region constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, vease Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-329; y Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596.
Como se usa en el presente documento, "aislado" significa separado de otros componentes de (a) una fuente natural, tal como una celula vegetal o animal o cultivo celular o (b) una mezcla de reaccion qulmica de slntesis organica. En el presente documento, "purificado" significa que cuando se alsla, el aislado contiene al menos el 95 % y en otro aspecto, al menos el 98 %, de un compuesto (por ejemplo, un conjugado) en peso del aislado.
Un anticuerpo "aislado" es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirfan con los usos diagnosticos o terapeuticos para el anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificara (1) hasta mas del 95 % en peso de anticuerpo como se determina por el metodo de Lowry y mas preferentemente mas del 99 % en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de secuencia de aminoacidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria o (3) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando Coomassie azul o, preferentemente, tincion de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de celulas recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estara presente. Habitualmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparara mediante al menos una etapa de purificacion.
Un anticuerpo "que se une" a un antlgeno de interes es aquel capaz de unirse a ese antlgeno con suficiente afinidad de manera que el anticuerpo sea util en la seleccion de una celula que exprese el antlgeno.
Un anticuerpo que "induce apoptosis" es aquel que induce la muerte celular programada como se determina mediante la union de anexina V, la fragmentacion del a Dn , la contraccion celular, la dilatacion del retlculo endoplasmico, la fragmentacion celular y/o la formacion de veslculas de membrana (llamadas cuerpos apoptoticos). La celula es una celula tumoral, por ejemplo, una celula de mama, ovario, estomago, endometrio, glandula salivar, pulmon, rinon, colon, tiroides, pancreas o vejiga. Hay disponibles diversos metodos para evaluar los acontecimientos celulares asociados a la apoptosis. Por ejemplo, la translocacion de fosfatidil serina (PS) puede medirse mediante la union de anexina; la fragmentacion de ADN puede evaluarse a traves del encadenamiento de ADN; y la condensacion nuclear/cromatina junto con la fragmentacion del ADN pueden evaluarse mediante cualquier incremento en las celulas hipodiploides.
La expresion "cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un farmaco eficaz para tratar una enfermedad o trastorno en un mamlfero. En el caso del cancer, la cantidad terapeuticamente eficaz del farmaco puede reducir el numero de celulas cancerosas; reducir el tamano del tumor; inhibir (es decir, ralentizar en cierto grado y preferentemente detener) la infiltracion de celulas cancerosas en organos perifericos; inhibir (es decir, ralentizar en cierto grado y preferentemente detener) la metastasis tumoral; inhibir, en cierto grado, el crecimiento tumoral; y/o aliviar en cierto grado uno o mas de los slntomas asociados al cancer. En la medida en que el farmaco pueda prevenir el crecimiento y/o destruir las celulas cancerosas existentes, puede ser citostatico y/o citotoxico. Para la terapia del cancer, la eficacia puede, por ejemplo, medirse mediante la evaluacion del tiempo hasta la progresion de la enfermedad (TPE) y/o la determinacion de la tasa de respuesta (TR).
La expresion "cantidad sustancial" se refiere a una mayorla, es decir, > 50 % de una poblacion, de una coleccion o una muestra.
La expresion "metabolito intracelular" se refiere a un compuesto resultante de un proceso o una reaccion metabolicos dentro de una celula sobre un conjugado farmaco-enlazador-ligando (por ejemplo, un conjugado anticuerpo farmaco (ADC)). El proceso o reaccion metabolicos pueden ser un proceso enzimatico, tal como la escision proteolltica de un enlazador peptldico del ADC, por hidrolisis de un grupo funcional tal como una hidrazona, ester o amida o por la degradacion proteolltica del conjugado farmaco-enlazador-ligando (por ejemplo, liberando un fragmento de cistiloenlazador-farmaco). Los metabolitos intracelulares incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos y farmaco libre que han experimentado escision intracelular despues de la entrada, la difusion, la absorcion o el transporte en una celula.
Las expresiones "escindido intracelularmente" y "escision intracelular" se refieren a un proceso o una reaccion metabolicos dentro de una celula sobre un conjugado farmaco-ligando, un conjugado farmaco-enlazador-ligando, un conjugado anticuerpo farmaco (ADC) o similares, con lo que la union covalente, por ejemplo, el enlazador, entre el resto de farmaco (D, del ingles drug) y el anticuerpo (Ab, del ingles antibody) se rompe, dando como resultado el farmaco libre, un compuesto de farmaco-enlazador u otro metabolito del conjugado disociado del anticuerpo dentro de la celula. Los restos escindidos del conjugado farmaco-ligando, un conjugado farmaco-enlazador-ligando o el ADC son por tanto metabolitos intracelulares.
El termino "biodisponibilidad" se refiere a la disponibilidad sistemica (es decir, concentraciones sangulneas/plasmaticas) de una cantidad dada de farmaco administrado a un paciente. Biodisponibilidad es un termino absoluto que indica la medicion tanto del tiempo (velocidad) como de la cantidad total (alcance) del farmaco que alcanza la circulacion general desde una forma de dosificacion administrada.
La expresion "actividad citotoxica" se refiere a un efecto de destruccion celular, citostatico o anti-proliferativo de un compuesto de conjugado anticuerpo farmaco o un metabolito intracelular de un compuesto de conjugado anticuerpo farmaco. La actividad citotoxica puede expresarse como el valor de CI50 que es la concentracion (molar o masa) por unidad de volumen a la que la mitad de las celulas sobreviven.
Un "trastorno" es cualquier afeccion que se beneficiarla del tratamiento. Esto incluye enfermedades o trastornos cronicos y agudos incluyendo las afecciones patologicas que predisponen al mamlfero al trastorno en cuestion. Los ejemplos no limitantes de trastornos que se tratan en la presente invencion incluyen los tumores benignos y malignos; la leucemia y los tumores malignos linfoides, en particular de mama, ovario, estomago, endometrio, glandula salivar, pulmon, rinon, colon, tiroides, pancreas, prostata o cancer de vejiga; trastornos neuronales, gliales, astrocitarios, hipotalamicos y de otras glandulas, macrofagicos, epiteliales, estromales y blastocelicos; y trastornos inflamatorios, angiogenicos e inmunologicos.
Los terminos "cancer" y "canceroso" se refieren o describen la afeccion o trastorno fisiologico en mamlferos que se caracteriza normalmente por un crecimiento celular desregulado. Un "tumor" comprende una o mas celulas cancerosas. Los ejemplos de cancer incluyen, pero no se limitan a, el carcinoma, el linfoma, el blastoma, el sarcoma y la leucemia o las neoplasias malignas linfoides. Mas ejemplos particulares de dichos canceres incluyen el cancer de celulas escamosas (por ejemplo, el cancer de celulas escamosas epiteliales), el cancer de pulmon incluyendo el cancer de pulmon microcltico, el cancer de pulmon no microcltico ("CPNM"), el adenocarcinoma del pulmon y el carcinoma de celulas escamosas del pulmon, el cancer del peritoneo, el cancer hepatocelular, el cancer gastrico o de estomago incluyendo el cancer gastrointestinal, el cancer pancreatico, el glioblastoma, el cancer cervical, el cancer de ovario, el cancer de hlgado, el cancer de vejiga, el hepatoma, el cancer de mama, el cancer de colon, el cancer rectal, el cancer colorrectal, el carcinoma endometrial o uterino, el carcinoma de glandulas salivares, el cancer de rinon o renal, el cancer de prostata, el cancer de vulva, el cancer de tiroides, el carcinoma hepatico, el carcinoma anal, el carcinoma de pene, as! como el cancer de cabeza y cuello.
La expresion "agente citotoxico" como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o impide la funcion de las celulas y/o provoca la destruccion de las celulas. La expresion pretende incluir isotopos radioactivos (por ejemplo, 211A, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 60C y los isotopos radiactivos de Lu), agentes quimioterapicos y toxinas tales como toxinas de molecula pequena o toxinas enzimaticamente activas de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, incluyendo los analogos de slntesis y los derivados de los mismos. En un aspecto, el termino no incluye ningun isotopo o isotopos radiactivos.
El termino "citocina" es un termino generico para las protelnas liberadas por una poblacion de celulas que actuan sobre otra celula como mediadores intercelulares. Son ejemplos de dichas citocinas las linfocinas, las monocinas y las hormonas polipeptldicas tradicionales. Entre las citocinas se incluyen las hormonas de crecimiento tales como la hormona del crecimiento humano, la N-metionil hormona del crecimiento humano y la hormona de crecimiento bovina; la hormona paratiroidea; la tiroxina; la insulina; la proinsulina; la relaxina; la prorelaxina; las hormonas de glicoprotelnas, tales como la hormona estimulante del follculo (FSH), la hormona estimulante del tiroides (TSH) y la hormona luteinizante (LH); el factor de crecimiento hepatico; el factor de crecimiento de fibroblastos; la prolactina; el lactogeno placentario; el factor de necrosis tumoral a y p; la sustancia inhibidora mulleriana; el peptido asociado a la gonadotropina de raton; la inhibina; la activina; el factor de crecimiento vascular endotelial; la integrina; la trombopoyetina (TPO); los factores de crecimiento nervioso, tales como NGF-p; el factor de crecimiento plaquetario; los factores de crecimiento transformantes (TGF) tales como TGF-a y TGF-p; el factor de crecimiento similar a la insulina I y II; la eritropoyetina (EPO); los factores osteoinductores; los interferones tales como el interferon-a, -p y -y; los factores estimulantes de colonias (CSF) tales como los CSF de macrofagos (M-CSF); los CSF de granulocitos macrofagos (GM-CSF); y los CSF de granulocitos (G-CSF); las interleucinas (IL) tales como IL-1, IL-1 a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 e IL-12; un factor de necrosis tumoral como el TNF-a o TNF-p; y otros factores polipeptldicos que el incluyen LIF y el ligando kit (KL). Como se usa en el presente documento, el termino citocina incluye protelnas de fuentes naturales o de cultivo de celulas recombinantes y equivalentes biologicamente activos de las citocinas de secuencia nativa.
El termino "profarmaco" como se usa en la presente solicitud se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia farmaceuticamente activa que es menos citotoxica para las celulas tumorales en comparacion con el farmaco parental y es capaz de activarse o convertirse enzimaticamente o hidrollticamente en la forma parental mas activa. Vease, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy Biochemical Society Transactions, 14, pags.
375-382, 615a Reunion, Belfast (1986) y Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery', Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pags. 247-267, Humana Press (1985). Los profarmacos incluyen, pero no se limitan a, profarmacos que contienen fosfato, profarmacos que contienen tiofosfato, profarmacos que contienen sulfato, profarmacos que contienen peptidos, profarmacos modificados con D-aminoacidos, profarmacos glicosilados, profarmacos que contienen p-lactama, profarmacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profarmacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5-fluorocitosina y otros profarmacos de 5-fluorouridina que pueden convertirse en el farmaco libre citotoxico mas activo. Los ejemplos de farmacos citotoxicos que pueden derivatizarse en una forma de profarmaco incluyen, pero no se limitan a, los agentes quimioterapicos descritos anteriormente.
Un "liposoma" es una veslcula pequena compuesta de diversos tipos de llpidos, fosfollpidos y/o tensioactivo que es util para la administracion de un farmaco (tal como, por ejemplo, anti-CD20, CD30, CD33, CD40, CD70, BCMA o anticuerpos Y de Lewis y, opcionalmente, un agente quimioterapico) a un mamlfero. Los componentes del liposoma se disponen habitualmente en una formacion de bicapa, similar a la disposicion de los llpidos de las membranas biologicas.
El termino "prospecto" se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en envases comerciales de productos terapeuticos, que contienen information acerca de la indication o indicaciones, el uso, la dosificacion, la administracion, las contraindicaciones y/o las advertencias concernientes al uso de dichos productos terapeuticos.
Una molecula "aislada" de acido nucleico es una molecula de acido nucleico que se identifica y se separa de al menos una molecula de acido nucleico contaminante a la que esta asociada normalmente en la fuente natural del acido nucleico. Una molecula aislada de acido nucleico es distinta en la forma o la configuration en la que se encuentra en la naturaleza. Por tanto, las moleculas aisladas de acido nucleico se distinguen de la molecula de acido nucleico como existe en las celulas naturales. Sin embargo, una molecula aislada de acido nucleico incluye una molecula de acido nucleico contenida en celulas que normalmente expresan el acido nucleico donde, por ejemplo, la molecula de acido nucleico esta en una localization cromosomica diferente de la de las celulas naturales.
La expresion "secuencias de control "se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresion de una secuencia codificante enlazada operativamente en un organismo hospedador particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia de operador y un sitio de union al ribosoma. Se sabe que las celulas eucariotas usan promotores, senales de poliadenilacion y potenciadores.
Un acido nucleico esta "enlazado operativamente" cuando esta situado en una relation funcional con otra secuencia de acido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o llder secretor esta enlazado operativamente al ADN que codifica un polipeptido si se expresa como una preprotelna que participa en la secretion del polipeptido; un promotor o potenciador esta enlazado operativamente a una secuencia codificante, por ejemplo, si afecta a la transcription de la secuencia; o un sitio de union al ribosoma esta enlazado operativamente a una secuencia codificante si esta colocado de manera que facilita la traduction. En general, "enlazado operativamente" significa que las secuencias de ADN que se enlazan estan contiguas y, en el caso de un llder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que estar contiguos. El enlazamiento puede conseguirse mediante el ligamiento en sitios de restriction convenientes. Si dichos sitios no existen, los adaptadores de oligonucleotidos de slntesis o enlazadores pueden usarse de acuerdo con la practica convencional.
Como se usa en el presente documento, las expresiones "celula", "estirpe celular" y "cultivo celular" se usan indistintamente y todas las designaciones de este tipo incluyen la progenie. Por tanto, las palabras "transformantes" y "celulas transformadas" incluyen la celula primaria sujeto y cultivos derivados de la misma independientemente del numero de transferencias. Tambien se entiende que toda la progenie puede no ser precisamente identica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma funcion o actividad biologica que se detecta en la celula originalmente transformada. Donde se pretendan designaciones diferentes, quedara claro a partir del contexto.
Una "enfermedad autoinmune" en el presente documento es una enfermedad o trastorno que surge de y se dirige contra los propios tejidos de un individuo o un co-segregado o manifestation de la misma o afeccion resultante de ello. Los ejemplos de enfermedades o trastornos autoinmunes incluyen, pero no se limitan a la artritis (artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriasica y espondilitis anquilosante), la psoriasis, la dermatitis incluyendo la dermatitis atopica; la urticaria idiopatica cronica, incluyendo la urticaria cronica autoinmune, la polimiositis/dermatomiositis, la necrolisis epidermica toxica, la esclerodermia y la esclerosis sistemicas, las respuestas asociadas a la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) (enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa) y la EII con cosegregado de pioderma gangrenoso, el eritema nodoso, la colangitis esclerosante primaria, y/o la episcleritis), el slndrome de dificultad respiratoria, incluyendo el slndrome de dificultad respiratoria del adulto (SDRA), la meningitis, las enfermedades mediadas por IgE tales como la anafilaxia y la rinitis alergica, la encefalitis, tal como la encefalitis de Rasmussen, la uveitis, la colitis tal como la colitis microscopica y la colitis colagenosa, la glomerulonefritis (GN) tal como la GN membranosa, la GN membranosa idiopatica, la Gn membranosa proliferativa (GNMP), incluyendo la de Tipo I y la de Tipo II y la GN rapidamente progresiva, las afecciones alergicas, el eczema, el asma, las afecciones que implican la infiltration de linfocitos T y las respuestas inflamatorias cronicas, la aterosclerosis, la miocarditis autoinmune, la deficiencia de adhesion de los leucocitos, el lupus eritematoso sistemico (LES) tal como el LES cutaneo, el lupus (incluyendo la nefritis, la cerebritis, el pediatrico, el no renal, el discoide, la alopecia), la diabetes de inicio juvenil, la esclerosis multiple (EM), tal como la EM espino-optica, la encefalomielitis alergica, las respuestas inmunologicas asociadas a la hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T, la tuberculosis, la sarcoidosis, la granulomatosis, incluyendo la granulomatosis de Wegener, la agranulocitosis, la vasculitis (incluyendo la vasculitis de vasos grandes (incluyendo la polimialgia reumatica y la arteritis de celulas gigantes (de Takayasu)), la vasculitis de vasos medianos (incluyendo la enfermedad de Kawasaki y la poliarteritis nodosa), la vasculitis del SNC y la vasculitis asociada a ANCA, tal como la vasculitis o el slndrome de Churg-Strauss (SCS)), la anemia aplasica, la anemia de Coombs positiva, la anemia de Diamond Blackfan, la anemia hemolltica inmunitaria incluyendo la anemia hemolltica autoinmune (AHAI), la anemia perniciosa, l aplasia pura de celulas rojas (APCR), la deficiencia del factor VIII, la hemofilia A, la neutropenia autoinmune, la pancitopenia, la leucopenia, las enfermedades que implican diapedesis de leucocitos, los trastornos inflamatorios del sistema nervioso central, el slndrome de lesion de multiples organos, la miastenia grave, las enfermedades mediadas por el complejo antlgeno-anticuerpo, la enfermedad de la membrana basal anti-glomerular, el slndrome de los anticuerpos antifosfollpidos, la neuritis alergica, la enfermedad de Bechet, el slndrome de Castleman, el slndrome de Goodpasture, el slndrome miastenico de Lambert-Eaton, el slndrome de Raynaud, el slndrome de Sjorgen, el slndrome de Stevens-Johnson, el rechazo del trasplante de organos solidos (incluyendo el tratamiento previo para los tltulos de anticuerpos reactivos de panel alto, el deposito de IgA en los tejidos y el rechazo que surge del trasplante renal, el trasplante de hlgado, el trasplante intestinal, el trasplante cardlaco, etc.), la enfermedad del injerto contra hospedador (EICH), el penfigoide ampollar, el penfigo (incluyendo el vulgar, el foliaceo y la mucosidad penfigosa-penfigo de membrana), las poliendocrinopatlas autoinmunes, la enfermedad de Reiter, el slndrome del hombre rlgido, la nefritis por complejos inmunes, las polineuropatlas por IgM o la neuropatla mediada por IgM, la purpura trombocitopenica idiopatica (PTI), la purpura trombocitopenica trombotica (PTT), la trombocitopenia (desarrollada por los pacientes con infarto de miocardio, por ejemplo), incluyendo la trombocitopenia autoinmune, la enfermedad autoinmune del testlculo y el ovario incluyendo la orquitis y la ooforitis autoinmunes, el hipotiroidismo primario; las enfermedades endocrinas autoinmunes incluyendo la tiroiditis autoinmune, la tiroiditis cronica (tiroiditis de Hashimoto), la tiroiditis subaguda, el hipotiroidismo idiopatico, la enfermedad de Addison, la enfermedad de Grave, los slndromes poliglandulares autoinmunes (o slndromes de endocrinopatla poliglandular), la diabetes de tipo I tambien conocida como diabetes mellitus insulinodependiente (DMID), incluyendo la IDDM pediatrica y el slndrome de Sheehan; la hepatitis autoinmune, la neumonitis intersticial linfoide (VIH), la bronquiolitis obliterante (no trasplantados) vs NSIP, el slndrome de Guillain-Barre, la enfermedad de Berger (nefropatla por IgA), la cirrosis biliar primaria, el esprue cellaco (enteropatla por gluten), el esprue refractario con co-segregado de dermatitis herpetiforme, la crioglobulinemia, la esclerosis lateral amiotrofica (ELA, enfermedad de Lou Gehrig), la arteriopatla coronaria, la enfermedad autoinmune del oldo interno (EAOI), la perdida de la audicion autoinmune, el slndrome de mioclonla opsoclonia (SMO), la policondritis tal como la policondritis refractaria, la proteinosis alveolar pulmonar, la amiloidosis, la hepatitis de celulas gigantes, la escleritis, la gammapatia monoclonal de significado incierto/desconocido (GMSI), la neuropatia periferica, el sindrome paraneoplasico, las canalopatias tales como la epilepsia, la migrana, las arritmias, los trastornos musculares, la sordera, la ceguera, la paralisis periodica y las canalopatias del sistema nervioso central; el autismo, la miopatia inflamatoria y la glomerulosclerosis segmentaria focal (GSF).
El termino "alquilo" se refiere a un hidrocarburo de cadena lineal o ramificada, saturado o insaturado que tiene del numero indicado de atomos de carbono (por ejemplo, "alquilo Ci -Cs" se refiere a un grupo alquilo que tiene de 1 a 8 atomos de carbono). Cuando no se indica el numero de atomos de carbono, el grupo alquilo tiene de 1 a 8 atomos de carbono. Los grupos "alquilo C1-Cs" representativos de cadena lineal incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, npropilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo y n-octilo; mientras que los alquilos C1-C8 ramificados incluyen, pero no se limitan a, -isopropilo, -sec-butilo, -isobutilo, -ferc-butilo, -isopentilo y 2-metilbutilo; los alquilos C1-C8 insaturados incluyen, pero no se limitan a, -vinilo, -alilo, -1-butenilo,-2-butenilo, -isobutilenilo, -1-pentenilo, -2-pentenilo, -3-metil-1-butenilo, -2-metil-2-butenilo, -2,3-dimetil-2-butenilo, 1-hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo, -acetilenilo, -propinilo, -1-butinilo, -2-butinilo, -1-pentinilo, -2-pentinilo y -3-metil-1-butinilo. Un grupo alquilo puede estar sin sustituir o sustituido con uno o mas grupos incluyendo, pero no limitados a, -O-(alquilo C1-Cs), arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -OH -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -SR', -halogeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; donde cada R' se selecciona independientemente entre H, alquilo C1-C8 sin sustituir y arilo.
"Alquenilo" se refiere a un hidrocarburo C2-C18 que contiene atomos de carbono normales, secundarios, terciarios o ciclicos con al menos un sitio de insaturacion, es decir, un doble enlace sp2 carbono-carbono. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: etileno o vinilo (-CH=CH2), alilo (-CH2CH=CH2), ciclopentenilo (-C5H7), y 5-hexenilo (-CH2CH2CH2CH2CH=CH2).
"Alquinilo" se refiere a un hidrocarburo C2-C18 que contiene atomos de carbono normales, secundarios, terciarios o ciclicos con al menos un sitio de insaturacion, es decir, un triple enlace sp carbono-carbono. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: acetilenico (-CECH) y propargilo (-CH2CECH).
"Alquileno" se refiere a un radical hidrocarbonado saturado de cadena ramificada o lineal, o ciclico, de 1-18 atomos de carbono, y que tiene dos centros radicales monovalentes derivados de la eliminacion de dos atomos de hidrogeno del mismo atomo de carbono o de dos atomos de carbono diferentes de un alcano parental. Los radicales alquileno tipicos incluyen, pero no se limitan a: metileno (-CH2-), 1,2-etilo (-CH2CH2-), 1,3-propilo (-CH2CH2CH2-), 1,4-butilo (CH2CH2CH2CH2-) y similares. Un "alquileno C1-C10" es un grupo hidrocarbonado saturado de cadena lineal, de formula -(CH2)i -i0-. Los ejemplos de un alquileno C1-C10 incluyen metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, octileno, nonileno y decaleno.
"Alquenileno" se refiere a un radical hidrocarbonado insaturado de cadena ramificada o lineal, o clclico, de 2-18 atomos de carbono, y que tiene dos centros radicales monovalentes derivados de la eliminacion de dos atomos de hidrogeno del mismo atomo de carbono o de dos atomos de carbono diferentes de un alqueno parental. Los radicales alquenileno tlpicos incluyen, pero no se limitan a: 1,2-etileno (-CH=CH-).
"Alquinileno" se refiere a un radical hidrocarbonado insaturado de cadena ramificada o lineal, o clclico, de 2-18 atomos de carbono, y que tiene dos centros radicales monovalentes derivados de la eliminacion de dos atomos de hidrogeno del mismo atomo de carbono o de dos atomos de carbono diferentes de un alquino parental. Los radicales alquinileno tlpicos incluyen, pero no se limitan a: acetileno (-CEC-), propargilo (-CH2CEC-) y 4-pentinilo (-CH2CH2CH2CECH-)
"Arilo" significa un radical hidrocarbonado aromatico monovalente de 6-20 atomos de carbono derivado de la eliminacion de un atomo de hidrogeno de un solo atomo de carbono de un sistema de anillo aromatico parental. Algunos grupos arilo se representan en las estructuras a modo de ejemplo como "Ar". Los grupos arilo tlpicos incluyen, pero no se limitan a, radicales derivados de benceno, benceno sustituido, naftaleno, antraceno, bifenilo y similares. Un grupo aromatico carboclclico (arilo) o un grupo aromatico heteroclclico (heteroarilo) puede estar sin sustituir o sustituido con uno o mas grupos incluyendo, pero no limitados a alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2-NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halogeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en la que cada R' se selecciona independientemente entre H, alquilo C1-C8 y arilo sin sustituir.
"Arilalquilo" se refiere a un radical alquilo aclclico en el que uno de los atomos de hidrogeno unidos a un atomo de carbono, normalmente un atomo de carbono terminal o sp3, esta reemplazado por un radical arilo. Los grupos arilalquilo tlpicos incluyen, pero no se limitan a, bencilo, 2-feniletan-1-ilo, 2-fenileten-1-ilo, naftilmetilo, 2-naftiletan-1-ilo, 2-naftileten-1-iio, naftobencilo, 2-naftofeniletan-1-ilo y similares. El grupo arilalquilo comprende de 6 a 20 atomos de carbono, por ejemplo, el resto alquilo, incluyendo los grupos alcanilo, alquenilo o alquinilo, del grupo arilalquilo tiene de 1 a 6 atomos de carbono y el resto arilo tiene de 6 a 14 atomos de carbono.
"Heteroarilalquilo" se refiere a un radical alquilo aclclico en el que uno de los atomos de hidrogeno unidos a un atomo de carbono, normalmente un atomo de carbono terminal o sp3, esta reemplazado por un radical heteroarilo. Los grupos heteroarilalquilo tlpicos incluyen, pero no se limitan a, 2-bencimidazolilmetilo, 2-furiletilo y similares. El grupo heteroarilalquilo comprende de 6 a 20 atomos de carbono, por ejemplo, el resto alquilo, incluyendo los grupos alcanilo, alquenilo o alquinilo, del grupo heteroarilalquilo tiene de 1 a 6 atomos de carbono y el resto heteroarilo tiene de 5 a 14 atomos en el anillo, por lo general de 1 a 3 heteroatomos seleccionados entre N, O, P y S, siendo el resto atomos de carbono. El resto heteroarilo del grupo heteroarilalquilo puede ser un monociclo que tenga de 3 a 7 miembros en el anillo (de 2 a 6 atomos de carbono y de 1 a 3 heteroatomos seleccionados entre N, O, P y S) o un biciclo que tenga de 7 a 10 miembros en el anillo (de 4 a 9 atomos de carbono y de 1 a 3 heteroatomos seleccionados entre N, o, P y S), por ejemplo: un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6].
"Alquilo sustituido", "arilo sustituido" y "arilalquilo sustituido" significan alquilo, arilo y arilalquilo respectivamente, en los que uno o mas atomos de hidrogeno estan reemplazados cada uno independientemente por un sustituyente. Los sustituyentes tlpicos incluyen, pero no se limitan a, -X, -R, -O', -OR, -SR, -S', -NR2, -NR3, =NR, -CX3, -c N, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2 , =N2 , -N3 , -NRC(=O)R, -C(=O)R, -C(=O)NR2 , -SO3- , -SO3 H, -S(=O)2R, -OS(=O)2OR, -S(=O)2NR, -S(=O)R, -OP(=O)(OR)2, -P(=O)(OR)2, -PO-3, -PO3H2, -AsO2H2, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(=S)R, -CO2R, -CO2-, -C(=S)OR, -C(=O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)Nr 2, -C(=S)NR2 o -C(=NR)NR2, donde cada X es independientemente un halogeno: F, Cl, Br o I; y cada R es independientemente H, alquilo C1-C20, arilo C6-C20, heterociclo C3-C14, un grupo protector o un resto de profarmaco. Los grupos alquileno, alquenileno y alquinileno como se han descrito anteriormente tambien pueden estar sustituidos de manera similar.
"Heteroarilo" y "heterociclo" se refieren a un sistema de anillo en el que uno o mas atomos del anillo son un heteroatomo, por ejemplo, nitrogeno, oxlgeno y azufre. El radical heterociclo comprende de 1 a 20 atomos de carbono y de 1 a 3 heteroatomos seleccionados entre N, O, P y S. Un heterociclo puede ser un monociclo que tenga de 3 a 7 miembros en el anillo (de 2 a 6 atomos de carbono y de 1 a 3 heteroatomos seleccionados entre N, O, P y S) o un biciclo que tenga de 7 a 10 miembros en el anillo (de 4 a 9 atomos de carbono y de 1 a 3 heteroatomos seleccionados entre N, O, P y S), por ejemplo: un sistema biciclo [4,5 ], [5,5], [5,6] o [6,6].
Se describen heterociclos en Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry (W.A. Benjamin, Nueva York, 1968), particularmente los capltulos 1, 3, 4, 6, 7 y 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, Nueva York, desde 1950 hasta el presente), en particular los volumenes 13, 14, 16, 19 y 28; y J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566
Los ejemplos de heterociclos incluyen, a modo de ejemplo y no de limitacion, piridilo, dihidropiridilo, tetrahidropiridilo (piperidilo), tiazolilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiofenilo con azufre oxidado, pirimidinilo, furanilo, tienilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tetrazolilo, benzofuranilo, tianaftalenilo, indolilo, indolenilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, piperidinilo, 4-pi peridonilo, pirrolidinilo, 2-pirrolidonilo, pirrolinilo, tetrahidrofuranilo, bistetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, bis-tetrahidropiranilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, decahidroquinolinilo, octahidroisoquinolinilo, azocinilo, triazinilo, 6H-1,2,5-tiadiazinilo, 2H,6H-1,5,2-ditiazinilo, tienilo, tiantrenilo, piranilo, isobenzofuranilo, cromenilo, xantenilo, fenoxatinilo, 2H-pirrolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, pirazinilo, piridazinilo, indolizinilo, isoindolilo, 3H-indolilo, 1 H-indazolilo, purinilo, 4H-quinolizinilo, ftalazinilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinolinilo, pteridinilo, 4aH-carbazolilo, carbazolilo, p-carbolinilo, fenantridinilo, acridinilo, pirimidinilo, fenantrolinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, furazanilo, fenoxazinilo, isocromanilo, cromanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, piperazinilo, indolinilo, isoindolinilo, quinuclidinilo, morfolinilo, oxazolidinilo, benzotriazolilo, bencisoxazolilo, oxindolilo, benzoxazolinilo e isatinollo.
A modo de ejemplo y no de limitacion, los heterociclos unidos a carbono estan unidos en la posicion 2, 3, 4, 5 o 6 de una piridina, la posicion 3, 4, 5 o 6 de una piridazina, la posicion 2, 4, 5 o 6 de una pirimidina, la posicion 2, 3, 5 o 6 de una pirazina, la posicion 2, 3, 4 o 5 de un furano, tetrahidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol o tetrahidropirrol, la posicion 2, 4 o 5 de un oxazol, imidazol o tiazol, la posicion 3, 4 o 5 de un isoxazol, pirazol o isotiazol, la posicion 2 o 3 de una aziridina, la posicion 2, 3 o 4 de una azetidina, la posicion 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de un quinolina o la posicion 1, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de una isoquinolina. Aun mas normalmente, los heterociclos unidos a carbono incluyen 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 5-piridilo, 6-piridilo, 3-piridazinilo, 4-piridazinilo, 5-piridazinilo, 6-piridazinilo, 2-pirimidinilo, 4-pirimidinilo, 5-pirimidinilo, 6-pirimidinilo, 2-pirazinilo, 3-pirazinilo, 5-pirazinilo, 6-pirazinilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo o 5-tiazolilo.
A modo de ejemplo y no de limitacion, los heterociclos unidos a nitrogeno estan unidos en la posicion 1 de una aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina, 1H-indazol, la posicion 2 de un isoindol o isoindolina, la posicion 4 de una morfolina y la posicion 9 de un carbazol o p-carbolina. Aun mas normalmente, los heterociclos unidos a nitrogeno incluyen 1 -aziridilo, 1-azetedilo, 1-pirrolilo, 1 -imidazolilo, 1 -pirazolilo y 1 -piperidinilo.
Un "heterociclo C3-C8" se refiere a un carbociclo C3-C8 aromatico o no aromatico en el que de uno a cuatro de los atomos de carbono del anillo estan reemplazados independientemente por un heteroatomo del grupo que consiste en O, S y N. Los ejemplos representativos de un heterociclo C3-C8 incluyen, pero no se limitan a, benzofuranilo, benzotiofeno, indolilo, benzopirazolilo, cumarinilo, isoquinolinilo, pirrolilo, tiofenilo, furanilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, triazolilo, quinolinilo, pirimidinilo, piridinilo, piridonilo, pirazinilo, piridazinilo, isotiazolilo, isoxazolilo y tetrazolilo. Un heterociclo C3-C8 puede estar sin sustituir o sustituido con hasta siete grupos incluyendo, pero no limitados a, -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halogeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en los que cada R' se selecciona independientemente entre H, -alquilo C1-C8 y arilo. "Heterociclo C3-C8" se refiere a un grupo heterociclo C3-C8 definido anteriormente en el que uno de los atomos de hidrogeno del grupo heterociclo esta reemplazado por un enlace. Un heterociclo C3-C8 puede estar sin sustituir o sustituido con hasta seis grupos, incluyendo, pero no limitados a, -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halogeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y-CN; en los que cada R' se selecciona independientemente entre H, -alquilo C1-C8 y arilo.
"Carbociclo" significa un anillo saturado o insaturado que tiene de 3 a 7 atomos de carbono como un monociclo o de 7 a 12 atomos de carbono como un biciclo. Los carbociclos monoclclicos tienen de 3 a 6 atomos en el anillo, aun mas normalmente 5 o 6 atomos en el anillo. Los carbociclos biclclicos tienen de 7 a 12 atomos en el anillo, por ejemplo, dispuestos como un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6], o 9 o 10 atomos de anillo dispuestos como un sistema biciclo [5,6] o [6,6]. Los ejemplos de carbociclos monoclclicos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 1-ciclopent-1-enilo, 1-ciclopent-2-enilo, 1-ciclopent-3-enilo, ciclohexilo, 1-ciclohex-1-enilo, 1-ciclohex-2-enilo, 1-ciclohex-3-enilo, cicloheptilo y ciclooctilo. Un "carbociclo C3-C8" es un anillo carboclclico no aromatico saturado o insaturado de 3, 4, 5, 6, 7 u 8 miembros. Los carbociclos C3-C8 representativos incluyen, pero no se limitan a, -ciclopropilo, -ciclobutilo, -ciclopentilo, -ciclopentadienilo, -ciclohexilo, -ciclohexenilo, -1,3-ciclohexadienilo, -1,4-ciclohexadienilo, -cicloheptilo, -1,3-cicloheptadienilo, -1,3,5-cicloheptatrienilo, -ciclooctilo y -ciclooctadienilo. Un grupo carbociclo C3-C8 puede estar sin sustituir o sustituido con uno o mas grupos incluyendo, pero no limitados a, -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R' -S(O)R', -OH, -halogeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; donde cada R' se selecciona independientemente entre H, -alquilo C1-C8 y arilo. Un "carbociclo C3-C8" se refiere a un grupo carbociclo C3-C8 definido anteriormente en el que uno de los atomos de hidrogeno de los grupos carbociclo esta reemplazado por un enlace.
Un "arileno" es un grupo arilo que tiene dos enlaces covalentes y pueden estar en las configuraciones orto, meta o para como se muestra en las siguientes estructuras:
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en las que el grupo fenilo puede estar sin sustituir o sustituido con hasta cuatro grupos, incluyendo, pero no limitados a, -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halogeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en la que cada R' se selecciona independientemente entre H, -alquilo C1-C8 y arilo.
El termino "quiral" se refiere a moleculas que tienen la propiedad de no superposicion del companero de imagen especular, mientras que el termino "aquiral" se refiere a moleculas que son superponibles sobre su companero de imagen especular.
El termino "estereoisomeros" se refiere a compuestos que tienen una constitucion qulmica identica, pero difieren con respecto a la disposicion de los atomos o grupos en el espacio.
"Diastereoisomero" se refiere a un estereoisomero con dos o mas centros de quiralidad y cuyas moleculas no son imagenes especulares entre si. Los diastereomeros tienen diferentes propiedades flsicas, por ejemplo, puntos de fusion, puntos de ebullicion, propiedades espectrales y reactividades. Las mezclas de diastereomeros pueden separarse con procedimientos anallticos de alta resolucion tales como electroforesis y cromatografla.
Las definiciones y convenciones estereoqulmicas utilizadas en el presente documento generalmente siguen S.P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms, McGraw-Hill Book Company, Nueva York (1984); y Eliel y Wilen, Stereochemistry of Organic Compounds, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York (1994). Muchos compuestos organicos existen en formas opticamente activas, es decir, tienen la capacidad de rotar el plano de luz polarizada en un plano. En la descripcion de un compuesto opticamente activo, los prefijos D y L o R y S, se usan para indicar la configuracion absoluta de la molecula alrededor de su centro o centros quirales. Los prefijos d y l, o (+) y (-) se emplean para designar el signo de rotacion en el plano de la luz polarizada por el compuesto, significando (-) o l que el compuesto es levogiro. Un compuesto con el prefijo (+) o d es dextrogiro. Para una estructura qulmica dada, estos estereoisomeros son identicos, excepto porque son imagenes especulares entre si. Un estereoisomero especlfico tambien puede definirse como enantiomero y una mezcla de dichos isomeros con frecuencia se llama mezcla enantiomerica. Una mezcla 50:50 de enantiomeros se denomina como mezcla racemica o racemato, lo cual puede producirse cuando no ha habido estereoseleccion o estereoespecificidad en una reaccion o proceso qulmico. Las expresiones "mezcla racemica" y "racemato" se refieren a una mezcla equimolar de dos especies enantiomericas, carentes de actividad optica.
Ejemplos de un "grupo protector de hidroxilo" incluyen, pero no se limitan a, metoximetil eter, 2-metoxietoximetil eter, tetrahidropiranil eter, bencil eter, p-metoxibencil eter, trimetilsilil eter, trietilsilil eter, triisopropil silil eter, t-butildimetil silil eter, trifenilmetil silil eter, ester de acetato, esteres de acetato sustituidos, pivaloato, benzoato, metanosulfonato y ptoluenosulfonato.
"Grupo saliente" se refiere a un grupo funcional que puede estar sustituido por otro grupo funcional. Dichos grupos salientes son bien conocidos en la tecnica y los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, un haluro (por ejemplo, cloruro, bromuro, yoduro), metanosulfonilo (mesilo), p-toluenosulfonilo (tosilo), trifluorometilsulfonilo (triflato) y trifluorometilsulfonato.
Los ejemplos de "paciente" incluyen, pero no se limitan a, un ser humano, rata, raton, cobaya, mono, cerdo, cabra, vaca, caballo, perro, gato, pajaro y ave. En una realizacion a modo de ejemplo, el paciente es un ser humano.
La frase "sal farmaceuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, se refiere a sales organicas o inorganicas farmaceuticamente aceptables de un compuesto (por ejemplo, un farmaco, un compuesto de farmacoenlazador o un compuesto de farmaco-enlazador-ligando). El compuesto contiene normalmente al menos un grupo amino y, en consecuencia, pueden formarse sales de adicion de acido con este grupo amino. Las sales a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, sales de sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfato, fosfato acido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato acido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato y pamoato (es decir, 1,1 '-metileno-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)). Una sal farmaceuticamente aceptable puede implicar la inclusion de otra molecula tal como un ion acetato, un ion succinato u otro contraion. El contraion puede ser cualquier resto organico o inorganico que estabilice la carga sobre el compuesto parental. Ademas, una sal farmaceuticamente aceptable puede tener mas de un atomo cargado en su estructura. Los casos en los que multiples atomos cargados son parte de la sal farmaceuticamente aceptable pueden tener multiples contraiones. Por tanto, una sal farmaceuticamente aceptable puede tener uno o mas atomos cargados y/o uno o mas contraiones.
"Solvato farmaceuticamente aceptable" o "solvato" se refieren a una asociacion de una o mas moleculas de disolvente y un compuesto, por ejemplo, un compuesto a modo de ejemplo o un conjugado a modo de ejemplo. Los ejemplos de disolventes que forman solvatos farmaceuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, agua, isopropanol, etanol, metanol, DMSO, acetato de etilo, acido acetico y etanolamina.
Las siguientes abreviaturas se usan en el presente documento y tienen las definiciones indicadas: AE es auristatina E, Boc es N-(t-butoxicarbonilo), cit es citrulina, dap es dolaprolna, DCC es 1,3-diciclohexilcarbodiimida, DCM es diclorometano, DEA es dietilamina, DEAD es dietilazodicarboxilato, DEPC es dietilfosforilcianidato, DIAD es diisopropilazodicarboxilato, DIEA es N,N-diisopropiletilamina, dil es dolaisoleulna, DMAP es 4-dimetilaminopiridina, DME es etilenglicol dimetil eter (o 1,2-dimetoxietano), DMF es N,N-dimetilformamida, DMSO es dimetilsulfoxido, doe es dolafenina, dov es N,N-dimetilvalina, DTNB es 5,5'-ditiobis(acido 2-nitrobenzoico), DTPA es el acido dietilentriaminopentaacetico, DTT es ditiotreitol, EDCI es clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, EEDQ es 2-etoxi-1-etoxicarbonil-1,2-dihidroquinolina, EN-EM es espectrometrla de masas con electronebulizacion, EtOAc es acetato de etilo, Fmoc es N-(9-fluorenilmetoxicarbonilo), gly es glicina, HATU es hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-W,W,W,W-tetrametiluronio, HOBt es 1-hidroxibenzotriazol, HPLC es cromatografla llquida de alta presion, Ile es isoleucina, Lys es lisina, MeCN (CH3CN) es acetonitrilo, MeOH es metanol, Mtr es 4-anisildifenilmetil (o 4-metoxitritilo), nor es (7S,2R)-(+)-norefedrina, PAB es p-aminobencilo, PBS es solucion salina tamponada con fosfato (pH 7,4), PEG es polietilenglicol, Ph es fenilo, PNP es p-nitrofenilo, MC es 6-maleimidocaproilo, phe es L-fenilalanina, PyBrop es hexafluorofosfato de bromo tris-pirrolidino fosfonio, SEC es cromatografla de exclusion por tamano, Su es succinimida, TBTU es tetrafluoroborato de 0-benzotriazol-1-il-N,N,N,N-tetrametiluronio, TFA es acido trifluoroacetico, TLC es cromatografla de capa fina, UV es ultravioleta y Val es valina.
Las siguientes abreviaturas de enlazadores se usan en el presente documento y tienen las definiciones indicadas: Val Cit o vc es un sitio de dipeptido valina-citrulina de enlazador escindible por proteasa; PAB es p-aminobencilcarbamollo; (Me)vc es N-metil-valina-citrulina, donde el enlace peptldico enlazador ha sido modificado para impedir su escision por catepsina B; MC(PEG)6-OH es maleimidocaproil-polietilenglicol; SPP es 4-(2-piridiltio)pentanoato de N-succinimidilo; y SMCC es 1-carboxilato de N-succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano.
Los terminos "tratar" o "tratamiento", a menos que se indique otra cosa por el contexto, se refieren tanto al tratamiento terapeutico como a medidas profilacticas o preventivas, en las que el objeto es prevenir o ralentizar (reducir) un cambio o trastorno fisiologico indeseado, tal como el desarrollo o la propagacion del cancer. Los resultados cllnicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, el alivio de los slntomas, la disminucion del alcance de la enfermedad, la estabilizacion (es decir, el no empeoramiento) del estado de la enfermedad, el retardo o la ralentizacion de la progresion de la enfermedad, la mejora o la paliacion de la patologla y la remision (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable. "Tratamiento" tambien puede significar prolongar la supervivencia en comparacion con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya tienen la afeccion o trastorno as! como aquellos propensos a tener la afeccion o trastorno o aquellos en los que se ha de prevenir la afeccion o trastorno.
En el contexto del cancer, el termino "tratar" incluye cualquiera o todos de: prevenir el crecimiento de las celulas tumorales, de las celulas de cancerosas o de un tumor; prevenir la replicacion de las celulas tumorales o las celulas cancerosas, la disminucion de la carga tumoral global o disminuir el numero de celulas cancerosas y mejorar uno o mas slntomas asociados a la enfermedad.
En el contexto de una enfermedad autoinmune, el termino "tratar" incluye cualquiera o todos de: prevenir la replicacion de las celulas asociadas a una patologla autoinmune, incluyendo, pero no limitadas a, las celulas que producen un anticuerpo autoinmune, disminuir la carga de anticuerpos autoinmunes y mejorar uno o mas slntomas de una enfermedad autoinmune.
En el contexto de una enfermedad infecciosa, el termino "tratar" incluye cualquiera o todos de: prevenir el crecimiento, la multiplicacion o la replicacion del patogeno que causa la enfermedad infecciosa y mejorar uno o mas slntomas de una enfermedad infecciosa
Las siguientes abreviaturas de farmacos citotoxicos se usan en el presente documento y tienen las definiciones indicadas: "MMAF" es N-metilvalina-valina-dolaisoleulna-dolaprolna-fenilalanina (PM 731,5); "MMAZ" es N-metilvalina-valina-dolaisoleulna-dolaprolna con un analogo de fenilalanina en el extremo C. Z es -NR9Z1.
Realizaciones de la invencion
Esta invencion se define en las reivindicaciones adjuntas. El resto de la divulgacion proporciona ejemplos utiles para comprender la invencion.
Compuestos y conjugados
La presente divulgacion se dirige a una serie de compuestos y conjugados que contienen un compuesto de farmaco (D, del ingles drug). Los compuestos de farmaco son utiles como entidades individuales o pueden conjugarse con ligandos (L, por ejemplo, anticuerpos), ya sea directamente o a traves de una unidad de enlazador (LU, del ingles linker unit). La unidad de enlazador puede funcionar para proporcionar una liberation adecuada de D o el espaciamiento entre D y L. Ademas, algunas unidades de enlazador pueden tener multiples farmacos unidos (por ejemplo, de uno a cuatro farmacos adjuntos pueden representarse como -LU-(D)1-4).
La divulgacion proporciona compuestos que tienen la Formula I:
L-(D)p (I)
o una sal o un solvato farmaceuticamente aceptables de los mismos, en la que L es una unidad de ligando; p es un numero entero de 1 a aproximadamente 20; y D es un resto de farmaco que tiene la Formula D:
Figure imgf000014_0001
en la que: R2 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo Ci -Cs; R3 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo Ci -Cs, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, X1-(carbociclo C3-Cs), heterociclo C3-C8 y X1-(heterociclo C3-Cs); R4 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, X1-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-Cs y X1-(heterociclo C3-Cs); R5 se selecciona entre el grupo que consiste en H y metilo; o R4 y R5 forman conjuntamente un anillo carbocfclico y tienen la formula -(CRaRb)n- en la que Ra y Rb se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8 y carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre el grupo que consiste en 2, 3, 4, 5 y 6; R6 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-Cs; R7 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-Cs, arilo, X1-arilo, X1-(carbociclo C3-Cs), heterociclo C3-C8 y X1-(heterociclo C3-Cs); cada Rs se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, OH, alquilo C1-Cs, carbociclo C3-C8 y O-(alquilo C1-Cs); cada X1 es independientemente alquileno C1-C10; y el resto -NR9Z1 es un bioisostero de fenilalanina con una cadena lateral de aminoacido modificado.
En un ejemplo, el resto de bioisostero de fenilalanina
Figure imgf000014_0002
se selecciona entre el grupo que consiste en:
Figure imgf000014_0003
R9 se selecciona entre el grupo que consiste en H y un grupo protector de amino;
R10 se selecciona entre el grupo que consiste en H y -(CR13R14)xR15;
cada R11 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C20, halogeno, arilo, arilalquilo C1-C20, haloalquilo C1-C10, OR16 y N(R16)2;
R12 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C20, halogeno, arilo, aril-alquilo C1-C20, aril-alquenilo C2-C20, aril-alquinilo C2-C20, OR16, N(R16)2 y -C(O)R16;
cada R13 y R14 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C20, halogeno, arilalquilo, haloalquilo C1-C10, OR16, SR16, N(R16)2, -OC(O)R16, -N(R16)C(O)R16, -COOR16, -CON(R16)2, X1-SO3H, X1-sO 3-alquilo C1-C20, X1-OSO3H, X1-OSO3-alquilo C1-C20, X 1-SO2-alquilo C1-C20, X1-SO-alquilo C1-C20, -OP(O)(OR16)2, -OP(O)(NR16)2 , -OP(O)N(R16)2OR16, -OP(O)(R16)OR16, -OP(O)(R16)N(R16)2, -P(O)(OR16)2, -P(O)(Nr 16)2, -P(O)N(R16)2OR16, alquilo C1-C20, carbociclo C3-C8, arilo, X 1-arilo, X1-carbociclo C3-C8, heterociclo C3-C20 y X1-heterociclo C3-C8;
o R13 y R14 se combinan entre si para formar un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en =O, =N-NH-R17, =N-NH-C(O)-R17 y un carbociclo C3-C8;
cada R15 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C20, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, alquil C1-C20-carbociclo C3-C8, heterociclo C3-C20, X1-heterociclo C3-C8, -COOR16, -CON(R16)2, -C(O)R16 e Y1(CR13R14)xR18; y las porciones de carbociclo, arilo y heterociclo estan opcionalmente sustituidas con de uno a tres grupos R12.
cada R16 es independientemente H o alquilo C1-C20;
R17 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C20, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, alquil C1-C20-carbociclo C3-C8, heterociclo C3-C8 y X1-heterociclo C3-C8;
cada R18 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C20, carbociclo C3-C8, arilo, X 1-arilo, X1-carbociclo C3-C8, heterociclo C3-C20, X1-heterociclo C3-C8, -COOR16, -CON(R16)2 y -C(O)R16; Y1 es O, S, NR16, SO, SO2 o Se;
cada X 1 es independientemente alquileno C1-C10;
el subfndice x es un numero entero de 0 a 10;
los subfndices n, o, q, r, s, t y u son independientemente numeros enteros de 0 a 2;
Z2 es COZ3R19;
Z3 es O, S, NH o NR20, en el que R20 es alquilo C1-C8;
R19 se selecciona entre H, alquilo C1-C20, arilo, heterociclo C3-C8, -(X1O)v-R22, OR-(X1O)v-CH(R23)2;
v es un numero entero que varfa de 1 a 1000;
R22 es H o alquilo C1-C8;
cada R23 es independientemente H, COOH, -(CH2)1-N(R24)2, -(CH2)1-SO3H o -(CH2)1-SO3-alquilo C1-C8; y cada R24 es independientemente H, alquilo C1-C8 o -(CH2)1-c Oo H; donde; 1 es un numero entero que varfa de 0 a 6; a condicion de que cuando n y o sean 0 y R11 es H, entonces R10 sea distinto de arilo-CH2 o cH 2-heterociclo C3-C8.
En un ejemplo, R9 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C20, carbociclilo C3-C8, X1-arilo, X1-(carbociclilo C3-C8) y X 1-heterociclilo C3-C8. En otro ejemplo R9 es H.
En un ejemplo, el resto de bioisostero de fenilalanina es
Figure imgf000015_0001
en la que R9 es H; R10 es bencilo; R11 es H; Z2 es CO2H; el subfndice n es un numero entero de 0 a 2; y el subfndice o es un numero entero de 0 a 1 a condicion de que n o sea al menos 1.
En un ejemplo, el resto de bioisostero de fenilalanina se selecciona entre el grupo que consiste en
Figure imgf000015_0002
En un ejemplo, el resto de bioisostero de fenilalanina es
Figure imgf000016_0001
en la que R9 es H o un grupo protector de amino; R10 es H y -(CR13R14)xR15; cada R11 es independientemente H, alquilo C1-C20, halogeno, arilo, aril-alquilo C1-C20, haloalquilo C1-C10, OR16 y N(R16)2; R12 es H, alquilo C1-C20, halogeno, arilo, aril-alquilo C1-C20, aril-alquenilo C2-C20, aril-alquinilo C2-C20, OR16, N(R16)2 y -C(O)R16; cada R13 y R14 es independientemente H, alquilo C1-C20, halogeno, arilalquilo, haloalquilo C1-C10, OR16, SR16, N(R16)2, -oC(O)R16, -N(R16)C(O)R16, -COOR16, -CON(R16)2, -X1-SO3H, -X1-SO3-alquilo C1-C20, -X1-OSO3H, -X1-OSO3-alquilo C1-C20, -X1-SO2-alquilo C1-C20, -X1-SO-alquilo C1-C20, -OP(O)(OR16)2, -OP(O)(NR16)2, -OP(O)N(R16)2O16, -OP(O)(R16)OR16, -OP(O)(R16)N(R16)2, -P(O(OR16)2, -P(O)(NR16)2, -P(O)N(R16)2O16, alquilo C1-C20, carbociclo C3-C8, arilo, -X1-arilo, -X1-carbociclo C3-C8, heterociclo C3-C8 y -X1-heterociclo C3-C8; o R13 y R14 se combinan entre si para formar un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en =O, =N-NH-R17, =N-NH-C(O)-R17 y un carbociclo C3-C8; cada R15 es independientemente H, alquilo C1-C20, carbociclo C3-C8, arilo, -X1-arilo, alquil C1-C20-carbociclo C3-C8, heterociclo C3-C8 , -X1-heterociclo C3-C8, -COOR16, -CON(R16)2, -C(O)R16 y -Y1(CR13R14)xR18 en el que las porciones carbociclo, arilo y heterociclo estan opcionalmente sustituidas con de uno a tres grupos R12, cada R16 es independientemente H o alquilo C1-C20; R17 es H, alquilo C1-C20, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, alquil C1-C20-carbociclo C3-C8, heterociclo C3-C8 y X1-heterociclo C3-C8; cada R18 es independientemente H, alquilo C1-C20, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, X1-carbociclo C3-C8, heterociclo C3-C8, X1-heterociclo C3-C, -COOR16, -CON(R16)2 y -C(O)R16; Y1 es O, S, NR16, SO, SO2 o Se; cada X1 es independientemente alquileno C1-C10; el subfndice x es un numero entero de 0 a 10; los subfndices n, o, q, r, s, t y u son independientemente numeros enteros de 0 a 2 a condicion de que n o sea al menos 1; Z2 es COZ3R19; Z3 es O, S, NH o NR20, en el que R20 es alquilo C1-C8; R19 se selecciona entre H, alquilo C1-C20, arilo, heterociclo C3-C8, -(X1O)v-R22, o -(X1O)v-c H(R23)2; v es un numero entero de 1 a 1000; R22 es H o alquilo C1-C8; y cada R23 es independientemente H, COOH, -(CH2)1-N(R24)2, -(CH2)1-SO3H o -(CH2 )1-SO3-alquilo C1-C8; cada R24 es independientemente H, alquilo C1-C8 o -(CH2)1-COOH; donde; 1 es un numero entero que varfa de 0 a 6; a condicion de cuando n y o sean 0, R11 sea H, el R10 sea distinto de arilo-CH2 o CH2-heterociclo C3-C8.
En un ejemplo, el resto de bioisostero de fenilalanina es
Figure imgf000016_0002
en la que R12 y R14 son como se ha descrito anteriormente; Z2 es CO2H; y el subfndice x es un numero entero de 0 a 2.
En un ejemplo, el resto de bioisostero de fenilalanina es
Figure imgf000016_0003
en la que R10 es CH2-heterociclo C3-C8 o arilo-CH2; R11 es H; y Z2 es como se ha descrito anteriormente. En algunos ejemplos, R10 se selecciona entre el grupo que consiste en:
Figure imgf000016_0004
en la que R12 es como se ha descrito anteriormente; cada X2 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en N, NR16, S, O, CR16 y CHR16; y el subrndice z es un numero entero de 0 a 2. En otros ejemplos, R10 se selecciona entre el grupo que consiste en:
Figure imgf000017_0001
en la que R12 es como se ha descrito anteriormente; cada X2 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en N, NR16, S, O, CR16 y CHR16; y el subrndice z es un numero entero de 0 a 2; y no mas de dos grupos X2 adyacentes son distintos de CR16 o CHR16. En otras realizaciones mas, R10 se selecciona entre el grupo que consiste en:
Figure imgf000017_0002
en la que R12 se selecciona entre el grupo: H, alquilo, halogeno, amino, carboxi, amido, carboetoxi, formilo, fenilo, E-2-feniletenilo, Z-2-feniletenilo y 2-feniletinilo.
E
Figure imgf000017_0003
n un grupo de ejemplos, el resto de bioisostero de fenilalanina se selecciona entre el grupo que consiste en:
Figure imgf000018_0001
En un ejemplo, el resto de bioisostero de fenilalanina se selecciona entre el grupo que consiste en:
Figure imgf000018_0002
En un ejemplo, el resto de bioisostero de fenilalanina es la amida de un a-aminoacido seleccionado entre el grupo que consiste en:
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000020_0001
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Figure imgf000042_0001
En un ejemplo, el resto de bioisostero de fenilalanina es la amida de un a-aminoacido seleccionado entre el grupo que consiste en: 4-cloro-fenilalanina, 4-fluoro-fenilalanina, 4-nitro-fenilalanina, N-a-metil-fenilalanina, a-metil-fenilalanina, acido glutamico, acido aspartico, triptofano, isoleucina, leucina, metionina, tirosina, glutamina, treonina, valina, asparagina, fenilglicina, O-bencil-serina, O-t-butil-serina, O-t-butil-treonina, homofenilalanina, metionina-DL-sulfoxido, metionina-sulfona, acido a-aminobutirico, acido a-aminoisobutirico, acido 4-amino-1-piperidina-4-carboxilico, acido 4-amino-tetrahidropiran-4-carboxilico, acido aspartico, benzotiazol-2-il-alanina, a-t-butil-glicina, ciclohexilalanina, norleucina, norvalina, S-acetamidometil-penicilamina, p-3-piperidin-3-il-alanina, piperidinil-glicina, pirrolidinil-alanina, selenocisteina, tetrahidropiran-4-il-glicina, O-bencil-treonina, O-t-butiltirosina, 3-(p-acetilfenil)alanina, 3-fenilserina y acido 1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-carboxilico.
En un ejemplo, el resto de bioisostero de fenilalanina es
Figure imgf000042_0002
en la que Z2 es CO2H; R10 es bencilo; y los subindices q, r y s son independientemente numeros enteros de 0 a 1. En un ejemplo, el resto de bioisostero de fenilalanina se selecciona entre el grupo que consiste en:
Figure imgf000042_0003
En un ejemplo, el resto de bioisostero de fenilalanina es
Figure imgf000042_0004
en la que Z2 es CO2H; R10 es bencilo; R11 es H; y los subindices t y u son independientemente numeros enteros de 1 a 3.
En un ejemplo, el resto de bioisostero de fenilalanina se selecciona entre el grupo que consiste en
Figure imgf000043_0001
En un ejemplo, el resto de bioisostero de fenilalanina es
Figure imgf000043_0002
en la que Z2 es CO2H; R12 es como se ha descrito anteriormente; y los subfndices q, r y s son independientemente numeros enteros de 1 a 3.
En un ejemplo, el resto de bioisostero de fenilalanina es
Figure imgf000043_0003
En un ejemplo, el resto de bioisostero de fenilalanina es
Figure imgf000043_0004
en la que Z2 es CO2H; R10 es bencilo; y R12 es como se ha descrito anteriormente.
En un ejemplo, el resto de bioisostero de fenilalanina es
Figure imgf000043_0005
En un ejemplo, el resto de bioisostero de fenilalanina es
Figure imgf000043_0006
en la que Z2 es CO2H; R12 es como se ha descrito anteriormente; y los subfndices q, r y s son independientemente numeros enteros de 1 a 3.
En un ejemplo, el resto de bioisostero de fenilalanina es
Figure imgf000044_0001
En un aspecto relacionado, la presente divulgacion proporciona conjugados en los que los compuestos comprenden adicionalmente una unidad de enlazador (LU), teniendo los conjugados la formula:
L-(LU-(D)1-4)p
o una sal o un solvato farmaceuticamente aceptables de los mismos, en la que L es una unidad de ligando; -LU- es una unidad de enlazador; y D es una unidad de farmaco, como se expone en el presente documento.
En otro aspecto relacionado, la presente divulgacion proporciona conjugados que tienen la formula:
LU-(D)1-4
o una sal o un solvato farmaceuticamente aceptables de los mismos, en la que, -LU- es una unidad de enlazador; y D es un resto de farmaco que tiene la Formula D:
Figure imgf000044_0002
de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores.
Se proporcionan conjugados farmaco-enlazador-ligando que tienen la formula la:
Figure imgf000044_0003
o una sal o un solvato farmaceuticamente aceptables de los mismos, en la que L-es una unidad de ligando; -Aa-Ww-Yy- es una unidad de enlazador (LU), en la que --A- es una unidad de extensor, el subfndice a es 0 o 1, cada -W- es independientemente una unidad de aminoacidos, w es un numero entero que varfa de 0 a 12, -Y- es una unidad de espaciador, e y es 0, 1 o 2; p es un numero entero de 1 a aproximadamente 20; y D es una unidad de farmaco que tiene la Formula D:
Figure imgf000044_0004
en la que R2 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-C8; R3 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo C1-C8, X1-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y X1-(heterociclo C3-C8); R4 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y X1-(heterociclo C3-C8); R5 se selecciona entre el grupo que consiste en H y metilo; o R4 y R5 forman conjuntamente un anillo carbocfclico y tienen la formula -(CRaRb)n-, en el que Ra y Rb se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8 y carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre el grupo que consiste en 2, 3, 4, 5 y 6; R6 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-C8; R7 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo Ci-Cs, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, X1-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y X1-(heterociclo C3-C8); cada R8 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, OH, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8 y O-(alquilo C1-C8); cada X1 es independientemente alquileno C1-C10; y el resto -NR9Z1 es un bioisostero de fenilalanina de cualquiera de los ejemplos anteriores.
Otro aspecto de la divulgacion son los compuestos de farmaco que tienen la Formula lb. Estos compuestos de farmacos son los descritos anteriormente en los que la lfnea ondulada esta reemplazada por un atomo de hidrogeno. Especfficamente, los compuestos se representan a continuacion:
Figure imgf000045_0001
o sales o solvatos farmaceuticamente aceptables de los mismos, en los que, R2 se selecciona entre H y alquilo C1-C8; R3 se selecciona entre H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8); R4 se selecciona entre H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8); R5 se selecciona entre H y metilo; o R4 y R5 forman conjuntamente un anillo carbocfclico y tienen la formula -(CRaRb)n-, en la que Ra y Rb se seleccionan independientemente entre H, alquilo C1-C8 y carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre 2, 3, 4, 5 y 6; R6 se selecciona entre H y alquilo C1-C8; R7 se selecciona entre H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8); cada R8 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, Oh , alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8 y O-(alquilo C1-C8); y el resto -NR9Z1 es un bioisostero de fenilalanina de cualquiera de los ejemplos anteriores.
En un ejemplo, R3, R4 y R7 son independientemente isopropilo o sec-butilo y R5 es -H. En un ejemplo a modo de ejemplo, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R5 es -H y R7 es sec-butilo.
En otro ejemplo, R2 y R6 son cada uno metilo y R9 es -H.
En otro ejemplo mas, cada aparicion de R8 es -OCH3.
En un ejemplo a modo de ejemplo, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R2 y R6 son cada uno metilo, R5 es -H, R7 es secbutilo, cada aparicion de R8 es -OCH3 y R9 es -H.
Los compuestos ilustrativos de Formula (Ib), cada uno de los cuales puede usarse como restos de farmaco (D) en un ADC, incluyen compuestos que tienen las siguientes estructuras:
Figure imgf000045_0002
y sales farmaceuticamente aceptables o solvatos de los mismos.
Se proporcionan conjugados farmaco-enlazador-ligando en los que el ligando es un anticuerpo. Los conjugados se representan por la Formula Ia':
Ab-(Aa-Ww-Yy-D)p Formula Ia'
o sales o solvatos farmaceuticamente aceptables de los mismos, en la que Ab es un anticuerpo, A es una unidad de extensor, a es 0 o 1, cada W es independientemente una unidad de aminoacidos, w es un numero entero de 0 a 12, Y es una unidad de espaciador, e y es 0, 1 o 2, p es un numero entero de 1 a aproximadamente 20 y D es un resto de farmaco de Formula D:
Figure imgf000046_0001
en la que R2, R3, R4, R5, R6, R7, cada R8 y -N(R9)Z1 tienen los significados proporcionados anteriormente.
El anticuerpo Ab puede ser cualquier anticuerpo unido covalentemente a una o mas unidades de farmaco. Por ejemplo, Ab puede ser un anticuerpo que se une especlficamente a CD20, CD30, CD33, CD40, CD70, BCMA o antlgeno Y de Lewis.
En un ejemplo -Ww- es -Val-Cit-.
En otro ejemplo, R3, R4 y R7 son independientemente isopropilo o sec-butilo y R5 es -H. En un ejemplo a modo de ejemplo, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R5 es -H y R7 es sec-butilo. En otro ejemplo mas, R2 y R6 son cada uno metilo y R9 es -H.
En otro ejemplo, cada aparicion de R8 es -OCH3.
En un ejemplo a modo de ejemplo, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R2 y R6 son cada uno metilo, R5 es -H, R7 es secbutilo, cada aparicion de R8 es -OCH3 y R9 es -H.
En un ejemplo, el anticuerpo Ab es AC10 quimerico, BR96 quimerico, S2C6 quimerico, 1F6 quimerico, 2F2 quimerico, AC10 humanizado, BR96 humanizado, S2C6 humanizado, 1F6 humanizado, M195, M195 humanizado o 2F2 humanizado.
Los ejemplos a modo de ejemplo de Formula Ia' tienen las siguientes estructuras:
Figure imgf000046_0002
o
Figure imgf000046_0003
La carga de farmaco se representa por p, el numero promedio de moleculas de farmaco por ligando (por ejemplo, un anticuerpo) (por ejemplo, de formula I, Ia, Ia'). La carga de farmaco puede variar de 1 a 20 unidades de farmaco (D) por ligando (por ejemplo, Ab o mAb). La unidad de farmaco puede conjugarse directamente o indirectamente a la unidad de ligando (por ejemplo, a traves de una unidad de enlazador). Las composiciones de Formula la y Formula Ia' incluyen colecciones de anticuerpos conjugados con un intervalo de farmacos, de 1 a 20.
En algunos ejemplos, p es de aproximadamente 1 a aproximadamente 8 unidades de farmaco por unidad de ligando. En algunos ejemplos, p es de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 unidades de farmaco por unidad de ligando.
En algunos ejemplos, p es de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 o de 2 a aproximadamente 4 unidades de farmaco por unidad de ligando. En algunos ejemplos, p es de aproximadamente 2, aproximadamente 4, aproximadamente 6 o aproximadamente 8 unidades de farmaco por unidad de ligando.
El numero promedio de unidades de farmaco por unidad de ligando en la preparacion de las reacciones de conjugacion puede caracterizarse por medios convencionales tales como espectroscopla de masas, ensayo de ELISA y HPLC. La distribucion cuantitativa de conjugados ligando-farmaco en terminos de p tambien puede determinarse. En algunos casos, la separacion, purification y caracterizacion de los conjugados ligando-farmaco homogeneos donde p es un valor determinado de conjugados ligando-farmacos con otras cargas de farmaco puede conseguirse por medios tales como HPLC en fase inversa o electroforesis.
Volviendo a la Formula la', los conjugados que comprenden un anticuerpo unido covalentemente a una o mas unidades de farmaco (restos): A, a, W, w, Y e y son como se ha descrito anteriormente. Los compuestos de conjugado farmaco anticuerpo incluyen sales o solvatos farmaceuticamente aceptables de los mismos.
La carga de farmaco se representa por p, el numero medio de unidades de farmaco por anticuerpo en una molecula de formula I. La carga de farmaco puede variar de 1 a 20 farmacos (D) por anticuerpo (Ab o mAb). La Unidad de Farmaco puede conjugarse directamente o indirectamente con la unidad de ligando (por ejemplo, a traves de una unidad de enlazador). Las composiciones de ADC de formula Ic incluyen colecciones de anticuerpos conjugados con un intervalo de farmacos, de 1 a 20. En algunos ejemplos, p es de aproximadamente 1 a aproximadamente 8 unidades de farmaco por anticuerpo. En algunos ejemplos, p es de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 unidades de farmaco por anticuerpo. En algunos ejemplos, p es de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 o de 2 a aproximadamente 4 unidades de farmaco por anticuerpo. En algunos ejemplos, p es aproximadamente 2, aproximadamente 4, aproximadamente 6 o aproximadamente 8 unidades de farmaco por anticuerpo.
El numero promedio de farmacos por anticuerpo en las preparaciones de ADC de reacciones de conjugacion puede caracterizarse mediante medios convencionales tales como espectroscopla de UV/visible, espectrometrla de masas, ensayo de ELISA y HPLC. La distribucion cuantitativa de los ADC en terminos de p tambien puede determinarse. En algunos casos, la separacion, purificacion y caracterizacion de ADC homogeneo donde p es un valor determinado de ADC con otras cargas de farmaco puede conseguirse por medios tales como HPLC en fase inversa o electroforesis.
Para algunos conjugados de farmaco anticuerpo, p puede estar limitado por el numero de sitios de union en el anticuerpo. Por ejemplo, cuando la union es un tiol de cistelna, un anticuerpo puede tener solo uno o varios grupos tiol de cistelna o puede tener solo uno o varios grupos tiol suficientemente reactivos a traves de los cuales puede estar unido un enlazador.
Normalmente, menos del maximo teorico de restos de farmacos se conjugan a un anticuerpo durante una reaction de conjugacion. Un anticuerpo puede contener, por ejemplo, muchos restos de lisina que no reaccionan con el intermedio farmaco-enlazador o el reactivo enlazador. Solo los grupos de lisina mas reactivos pueden reaccionar con un reactivo enlazador reactivo con amina. En general, los anticuerpos no contienen muchos, en caso de haberlos, grupos tiol de cistelna libres y reactivos que puedan estar vinculados a un resto farmaco. La mayorla de los restos de tiol de cistelna en los anticuerpos existen como puentes disulfuro y deben reducirse con un agente reductor tal como ditiotreitol (DTT). Ademas, el anticuerpo debe ser sometido a condiciones de desnaturalizacion para revelar grupos nucleofilos reactivos, tales como lisina o cistelna. La carga (relation farmaco/anticuerpo) de un a Dc puede controlarse de varias maneras diferentes, incluyendo: (i) limitar el exceso molar de intermedio farmaco-enlazador o reactivo enlazador con respecto al anticuerpo, (ii) limitar el tiempo de reaccion de conjugacion o la temperatura y (iii) parcializar o limitar las condiciones reductoras para la modification del tiol de cistelna.
Cuando mas de un grupo nucleofilo reacciona con un intermedio farmaco-enlazador o reactivo enlazador seguido de reactivo de resto de farmaco, el producto resultante es una mezcla de compuestos de ADC con una distribucion de uno o mas restos de farmaco unidos a un anticuerpo. El numero promedio de farmacos por anticuerpo puede calcularse a parti r de la mezcla mediante el ensayo de anticuerpos ELISA dual, especlfico para el anticuerpo y especlfico para el farmaco. Pueden identificarse moleculas de ADC individuales en la mezcla mediante espectroscopia de masas y pueden separarse mediante HPLC, por ejemplo, cromatografla de interaction hidrofoba ("Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate", Hamblett, KJ, et al., Resumen n.° 624, American Association for Cancer Research; Hamblett et al., 2004, Cancer Research 10: 7063; reunion anual de 2004, del 27 al 31 de marzo, 2004, Proceedings of the AACR, Volumen 45, marzo de 2004; "Controlling the Location of Drug Attachment in Antibody-Drug Conjugates", Alley, S.C., et al., resumen n.° 627, American Association for Cancer Research; reunion anual de 2004, del 27 al 31 de marzo, 2004, Proceedings of the AACR, Volumen 45, marzo de 2004). Por tanto, un ADC homogeneo con un unico valor de carga puede aislarse de la mezcla de conjugacion mediante electroforesis o cromatografla.
La unidad de enlazador (LU)
Una "unidad de enlazador" (LU) es un compuesto bifuncional que puede usarse para enlazar una unidad de farmaco y una unidad de ligando para formar conjugados farmaco-enlazador-ligando, o que son utiles en la formation de inmunoconjugados dirigidos contra antlgenos asociados a tumores. Dichos inmunoconjugados permiten el suministro selectivo de farmacos toxicos a celulas tumorales.
En un ejemplo, la unidad de enlazador del compuesto farmaco-enlazador y del conjugado farmaco-enlazador-ligando tiene la formula:
-Aa-Ww-Yy-
en la que -A- es una unidad de extensor; a es 0 o 1; cada -W- es independientemente una unidad de aminoacido; w es independientemente un numero entero que varla de 0 a 12; -Y- es una unidad de espaciador; e y es 0, 1 o 2.
En el conjugado farmaco-enlazador-ligando, el enlazador sirve para unir el resto de farmaco y la unidad de ligando.
La unidad de extensor
La unidad de extensor (-A-), cuando esta presente, es capaz de enlazar una unidad de ligando a una unidad de aminoacido (-W-). En este sentido un ligando (L) tiene un grupo funcional que puede formar un enlace con un grupo funcional de un extensor. Los grupos funcionales utiles que pueden estar presentes en un ligando, ya sea naturalmente o por medio de manipulacion qulmica incluyen, pero no se limitan a, sulfhidrilo (-SH), amino, hidroxilo, carboxilo, el grupo hidroxilo anomerico de un hidrato de carbono y carboxilo. En un aspecto, los grupos funcionales de ligando son sulfhidrilo y amino. Pueden generarse grupos sulfhidrilo por reduccion de un enlace disulfuro intramolecular de un ligando. Como alternativa, los grupos sulfhidrilo pueden generarse mediante la reaccion de un grupo amino de un resto de lisina de un ligando usando 2-iminotiolano (reactivo de Traut) u otro reactivo de generacion de sulfhidrilo.
En un ejemplo, la unidad de extensor forma un enlace con un atomo de azufre de la unidad de ligando. El atomo de azufre puede derivarse de un grupo sulfhidrilo de un ligando. Se representan unidades de extensor representativas dentro de los corchetes de las Formulas Illa y Illb, en las que L-, -W-, -Y-, -D, w e y son como se han definido anteriormente y R17 se selecciona entre -alquileno C1-C10, -carbociclo C3-C8-, -O-(alquilo C1-C8)-, -arileno-, -alquilen C1-C10-arileno-, arilen-alquileno C1-C10, -alquilen C1-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10, -heterociclo C3-C8-, -alquilen C1-C10-(heterociclo C3-C8)-, -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10, -(CH2CH2OV- y -(CH2CH2O)r-CH2-; y r es un numero entero que varla de 1 a 10. Ha de entenderse de todos los ejemplos de formula la, tal como III-VI, que incluso cuando no se indica de forma expresa, se enlazan de 1 a 20 restos de farmaco a un ligando (p = 1-20).
Figure imgf000048_0001
L[CH2-CONH-R17-C(O) -Ww-Yy-D]p Illb
Una unidad de extensor ilustrativa es la de Formula Illa en la que R17 es -(CH2)5-:
Figure imgf000048_0002
Otra unidad de extensor ilustrativa es la de Formula Illa en la que R17 es -(CH2CH2O)r-CH2-; y r es 2:
Figure imgf000048_0003
Otra unidad de extensor ilustrativa mas es la de Formula Illb en la que R17 es -(CH2)5-:
Figure imgf000049_0001
En otro ejemplo, la unidad de extensor se enlaza a la unidad de ligando mediante un enlace disulfuro entre un atomo de azufre de la unidad de ligando y un atomo de azufre de la unidad de extensor. Una unidad de extensor representativa de esta realization se representa dentro de los corchetes de la formula IV, en la que R17, L-, -W-, -Y-, -D, w e y son como se han definido anteriormente.
Figure imgf000049_0005
En otro ejemplo mas, el grupo reactivo del extensor contiene un sitio reactivo que puede formar un enlace con un grupo amino primario o secundario de un ligando. Los ejemplos de estos sitios reactivos incluyen, pero no se limitan a, esteres activados tales como esteres de succinimida, esteres de 4-nitrofenilo, esteres de pentafluorofenilo, esteres de tetrafluorofenilo, anhldridos, cloruros de acido, cloruros de sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos. Se representan unidades de extensor representativas dentro de los corchetes de las Formulas Va-Vc, en las que -R17-, L-, -W-, -Y-, -D, w e y son como se han definido anteriormente;
Figure imgf000049_0004
En otro ejemplo mas, el grupo reactivo del extensor contiene un sitio reactivo que es reactivo a un grupo de hidrato de carbono modificado (-CHO) que puede estar presente en un ligando. Por ejemplo, un hidrato de carbono puede oxidarse suavemente usando un reactivo tal como peryodato de sodio y la unidad de hidrato de carbono oxidado (­ CHO) resultante puede condensarse con un extensor que contenga un grupo funcional tal como una hidrazida, una oxima, una amina primaria o secundaria, una hidrazina, una tiosemicarbazona, un carboxilato de hidrazina y una arilhidrazida tal como las descritas por Kaneko, T. et al. (1991) Bioconjugate Chem 2:133-41. Se representan unidades de extensor representativas dentro de los corchetes de las Formulas Via, VIb y VIc, en las que -R17-, L-, -W-, -Y-, -D, w e y son como se han definido anteriormente.
Figure imgf000049_0003
La unidad de aminoacido
La unidad de aminoacido (-W-), cuando esta presente, enlaza la unidad de extensor a la unidad de espaciador si la unidad de espaciador esta presente, enlaza la unidad de extensor al resto de farmaco si la unidad de espaciador esta ausente y enlaza la unidad de ligando a la unidad de farmaco si la unidad de extensor y la unidad de espaciador estan ausentes.
Ww- es una unidad de dipeptido, tripeptido, tetrapeptido, pentapeptido, hexapeptido, heptapeptido, octapeptido, nonapeptido, decapeptido, undecapeptido o dodecapeptido. Cada unidad -W- tiene independientemente la formula indicada a continuation en los corchetes y w es un numero entero que varla de 0 a 12:
Figure imgf000049_0002
en la que R190 es hidrogeno, metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, bencilo, p-hidroxibencilo, -CH2OH, -CH(OH)CH3, CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, -(CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2, -(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, -(CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-piridilmetilo-, 3-piridilmetilo-, 4-piridilmetilo-, fenilo, ciclohexilo,
Figure imgf000050_0001
La unidad de aminoacido puede ser escindida enzimaticamente por una o mas enzimas, incluyendo una proteasa asociada a tumor, para liberar la unidad de farmaco (-D), que puede protonarse in vivo tras la liberacion para proporcionar un farmaco (D).
Las unidades Ww ilustrativas se representan por las formulas (VII)-(IX):
Figure imgf000050_0002
en la que R200 y R201 son como se indica a continuacion:
Figure imgf000050_0003
Figure imgf000051_0001
en la que R200, R201, R202 y R203 son como se indica a continuacion:
Figure imgf000051_0002
Las unidades de aminoacido a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, unidades de formula (VII) donde: R200 es bencilo y R201 es -(CH2)4NH2; R200 es isopropilo y R201 es -(CH2)4NH2; R200 es isopropilo y R201 es -(Ch 2)3NHCONH2. Otra unidad de aminoacido a modo de ejemplo es una unidad de formula (VIII) en la que R200 es bencilo, R201 es bencilo y R202 es -(CH2)4NH2-.
Las unidades -Ww- utiles pueden disenarse y optimizarse en su selectividad para la escision enzimatica por una enzima particular, por ejemplo, una proteasa asociada a tumor. En un ejemplo, una unidad -Ww- es aquella cuya escision esta catalizada por la catepsina B, C y D o una proteasa de plasmina.
En un ejemplo, -Ww- es un dipeptido, tripeptido, tetrapeptido o pentapeptido.
Cuando R190, R200, R201, R202 o R203 es diferente de hidrogeno, el atomo de carbono al que R190, R200, R201, R202 o R203 esta unido, es quiral.
Cada atomo de carbono al que R190, R200, R201, R202 o R203 esta unido esta independientemente en la configuration (S) o (R).
La unidad de aminoacido puede ser valina-citrulina. La unidad de aminoacido puede ser fenilalanina-lisina (es decir, fk). La unidad de aminoacido puede ser N-metilvalina-citrulina. La unidad de aminoacido puede ser acido 5-aminovalerico, homo fenilalanina lisina, tetraisoquinolinacarboxilato lisina, ciclohexilalanina lisina, acido isonepecotico lisina, beta-alanina lisina, glicina serina valina glutamina o acido isonepecotico.
La unidad de aminoacido puede comprender aminoacidos naturales. La unidad de aminoacido puede comprender aminoacidos no naturales.
La unidad de espaciador
La unidad de espaciador (-Y-), cuando esta presente, enlaza una unidad de aminoacido al resto de farmaco cuando una unidad de aminoacido esta presente. Como alternativa, la unidad de espaciador enlaza la unidad de extensor al resto de farmaco cuando la unidad de aminoacido es ausente. La unidad de espaciador tambien enlaza el resto de farmaco a la unidad de ligando cuando tanto la unidad de aminoacido como la unidad de extensor estan ausentes. Las unidades de espaciador son de dos tipos generales: autodestructivas y no autodestructivas. Una unidad de espaciador no autodestructiva es una en la que parte o la totalidad de la unidad de espaciador permanece unida al resto de farmaco despues de la escision, en particular enzimatica, de una unidad de aminoacido del conjugado farmaco-enlazador-ligando o el compuesto farmaco-enlazador. Los ejemplos de una unidad de espaciador no autodestructiva incluyen, pero no se limitan a, una unidad de espaciador (glicina-glicina) y una unidad de espaciador glicina (ambas representadas en el Esquema 1) (a continuacion). Cuando un compuesto a modo de ejemplo que contiene una unidad de espaciador de glicina-glicina o una unidad de espaciador glicina sufre una escision enzimatica por medio de una proteasa asociada a celulas tumorales, una proteasa asociada a celulas cancerosas o una proteasa asociada a linfocitos, un resto de glicina-glicina-farmaco o un resto de glicina-farmaco se escinde de L-Aa-Ww-. En un ejemplo, una reaction de hidrolisis se realiza independiente dentro de la celula diana, escindiendo el enlace del resto glicina-farmaco y la liberation del farmaco.
Figure imgf000052_0001
Una unidad de espaciador no autodestructiva (-Y-) puede ser -Gly-Gly-. Una unidad de espaciador no autodestructiva (-Y-) puede ser -Gly-.
-Yy- puede ser una unidad de alcohol p-aminobencflico (PAB) (veanse los Esquemas 2 y 3, a continuacion) cuya portion fenileno esta sustituida con Qm en la que Q es -alquilo Ci-Cs, -O-(alquilo Ci-Cs), -halogeno, -nitro o -ciano; y m es un numero entero que varfa de 0 a 4.
En un ejemplo, se proporciona un compuesto de farmaco-enlazador o un conjugado farmaco-enlazador-ligando en los que la unidad de espaciador esta ausente (y = 0) o una sal o un solvato farmaceuticamente aceptables del mismo.
Como alternativa, un compuesto a modo de ejemplo que contiene una unidad de espaciador autodestructiva puede liberar -D sin la necesidad de una etapa de hidrolisis separada. En esta realization, -Y- es un grupo PAB que se enlaza a -Ww- a traves del atomo de nitrogeno de amino del grupo PAB y se conecta directamente a -D por medio de un carbonato, un carbamato o un grupo eter. Sin quedar ligado a teorfa alguna o mecanismo particular, el Esquema 2 representa un posible mecanismo de liberacion del farmaco de un grupo PAB que esta unido directamente a -D por medio de un grupo carbamato o carbonato, expuesto por Toki et al., 2002, J Org. Chem. 67:1866-1872.
Figure imgf000052_0002
en el que Q es -alquilo C1-C8 , -O-(alquilo C1-C8), -halogeno, -nitro o -ciano; m es un numero entero que varfa de 0 a 4; y p es un numero entero de 1 a 20.
Sin quedar ligado a teoria alguna o mecanismo particular, el Esquema 3 representa un posible mecanismo de liberacion del farmaco de un grupo PAB que esta unido directamente a -D por medio de un enlace de eter o amina.
Figure imgf000053_0001
en el que Q es -alquilo C1-C8, -O-(alquilo Ci-Cs), -halogeno, -nitro o -ciano; m es un numero entero que varia de 0 a 4; y p es un numero entero de 1 a aproximadamente 20.
Otros ejemplos de espaciadores autodestructivos incluyen, pero no se limitan a, compuestos aromaticos que son electronicamente similar al grupo PAB tales como los derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (vease, por ejemplo, Hay et al., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) y orto o para-aminobencilacetales. Pueden usarse espaciadores que experimenten ciclacion tras la hidrolisis del enlace amida, tales como amidas de acido 4-aminobutirico sustituidas y sin sustituir (vease, por ejemplo, Rodrigues et al., 1995, Chemistry Biology 2:223), sistemas de anillos biciclo[2.2.1] y biciclo[2.2.2] apropiadamente sustituidos (vease, por ejemplo, Storm et al., 1972, J. Amer. Chem. Soc. 94:5815). y amidas de acido 2-aminofenilpropionico (vease, por ejemplo, Amsberry et al., 1990, J. Org. Chem. 55:5867). Eliminacion de los farmacos que contienen aminas que estan sustituidas en la posicion a de glicina (vease, por ejemplo, Kingsbury et al., 1984, J. Med. Chem. 27:1447) son tambien ejemplos de espaciador autodestructivo util en compuestos a modo de ejemplo.
La unidad de espaciador puede ser una unidad de bis(hidroximetil)estireno (BHMS) ramificado como se representa en el Esquema 4, que puede usarse para incorporar y liberar multiples farmacos.
Figure imgf000053_0002
en el que Q es -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -halogeno, -nitro o -ciano; m es un numero entero que varia de 0 a 4; n es 0 o 1; y p varia de 1 a aproximadamente 20.
Los restos -D pueden ser iguales. Los restos -D pueden ser diferentes.
En un ejemplo, las unidades de espaciador (-Yy-) se representan por las formulas (X)-(XII):
Figure imgf000054_0001
en la que Q es -alquilo Ci-Cs, -O-(alquilo Ci-Cs), -halogeno, -nitro o -ciano; y m es un numero entero que varfa de 0 a 4;
Figure imgf000054_0002
Los ejemplos de los compuestos de conjugado anticuerpo-farmaco de Formula Ia' incluyen:
Figure imgf000054_0003
en la que w e y son cada uno 0,
Figure imgf000054_0004
y
Figure imgf000055_0001
El resto de farmaco (D) es del tipo dolastatina/auristatina (vease, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. n.° 5.635.483;. y 5.780.588), que se ha demostrado que interfiere con la dinamica de los microtubulos, la hidrolisis de GTP y la division nuclear y celular (vease, Woyke et al., 2001, Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) y tienen actividad antineoplasica (vease, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. n.° 5.663.149). Algunas dolastinas tienen actividad antifungica (vease, por ejemplo, Pettit et al., 1998, Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965).
Como se senalo anteriormente, D se refiere a una unidad de farmaco (resto) que tiene un atomo de nitrogeno u otro atomo que puede formar un enlace con la unidad espaciador cuando y = 1 o 2, con el grupo carboxilo C-terminal de una unidad de aminoacido cuando y = 0, con la de una unidad de extensor cuando w e y = 0, y con el sitio reactivo de una unidad de ligando cuando a, w e y = 0. Ha de entenderse que las expresiones "unidad de farmaco" y "resto de farmaco" son sinonimos y se usan indistintamente en el presente documento.
En un ejemplo, -D es la formula D:
Figure imgf000055_0002
en la que, independientemente en cada ubicacion:
R2 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-C8;
R3 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo C1-C8, X1-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y X1-(heterociclo C3-C8);
R4 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y X1-(heterociclo C3-C8);
R5 se selecciona entre el grupo que consiste en H y metilo;
o R4 y R5 forman conjuntamente un anillo carbocfclico y tienen la formula -(CRaRb)n- en la que Ra y Rb se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8 y carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre el grupo que consiste en 2, 3, 4, 5 y 6;
R6 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-C8;
R7 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, X1-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y X1-(heterociclo C3-C8);
cada R8 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, OH, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8 y O-(alquilo C1-C8);
cada X1 es independientemente alquileno C1-C10; y
el resto -NR9Z1 es un bioisostero de fenilalanina de cualquiera de los ejemplos anteriores.
En un ejemplo, R3, R4 y R7 son independientemente isopropilo o sec-butilo y R5 es -H. En un ejemplo a modo de ejemplo, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R5 es H y R7 es sec-butilo.
En otro ejemplo, R2 y R6 son cada uno metilo y R9 es H.
En otro ejemplo, cada aparicion de R8 es -OCH3.
En un ejemplo a modo de ejemplo, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R2 y R6 son cada uno metilo, R5 es H, R7 es secbutilo, cada aparicion de R8 es -OCH3 y R9 es H.
Las unidades de farmaco (-D) ilustrativas incluyen las unidades de farmaco que tienen la siguiente estructura:
Figure imgf000056_0001
y sales o solvatos farmaceuticamente aceptables de las mismas, en las que R10 y Z2 tienen los significados proporcionados anteriormente.
Pueden unirse grupos hidrofilos, tales como, pero no limitados a, esteres de trietilenglicol (TEG), a la unidad de farmaco. Sin quedar ligado por teorla alguna, los grupos hidrofilos colaboran en la internalizacion y no aglomeracion de la unidad de farmaco.
La Unidad de ligando (L)
La unidad de ligando (L-) incluye dentro de su alcance cualquier unidad de un ligando (L) que se una o se asocie reactivamente o se compleje con un receptor, antlgeno u otro resto receptivo asociado a una poblacion de celulas diana dada. Una unidad de ligando es una molecula que se une a, se compleja con o reacciona con un receptor, antlgeno u otro resto receptivo de una poblacion celular que se busca modificar terapeuticamente o, por el contrario, biologicamente. La unidad de ligando puede actuar para suministrar la unidad de farmaco a la poblacion de la celula diana particular con la que la unidad de ligando interactua. Dichos ligandos incluyen, pero no se limitan a, protelnas de gran peso molecular tales como, por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpos, protelnas de peso molecular mas pequeno, polipeptido o peptidos, lectinas, glicoprotelnas, no peptidos, vitaminas, moleculas de transporte de nutrientes (tales como, pero no limitadas a, transferrina) o cualquier otra celula molecula o sustancia de union.
Una unidad de ligando puede formar un enlace a una unidad de extensor, una unidad de aminoacido, una unidad de espaciador o una unidad de farmaco. Una unidad de ligando puede formar un enlace a una unidad de enlazador a traves de un heteroatomo del ligando. Los heteroatomos que pueden estar presentes en una unidad de ligando incluyen el azufre (por ejemplo, de un grupo sulfhidrilo de un ligando), el oxlgeno (por ejemplo, de un grupo carbonilo, carboxilo o hidroxilo de un ligando) y el nitrogeno (por ejemplo, de un grupo amino primario o secundario de un ligando). Estos heteroatomos pueden estar presentes en el ligando, en el estado natural del ligando, por ejemplo un anticuerpo de origen natural o pueden introducirse en el ligando a traves de la modificacion qulmica.
En un ejemplo, un ligando tiene un grupo sulfhidrilo y el ligando se une a la unidad de enlazador a traves de un atomo de azufre del grupo sulfhidrilo.
En otro ejemplo, el ligando tiene restos de lisina que pueden reaccionar con esteres activados (dichos esteres incluyen, pero no se limitan a, N-hidroxisuccinimida, pentafluorofenilo y esteres de p-nitrofenilo) del enlazador y de este modo forman un enlace amida que consiste en el atomo de nitrogeno del ligando y el grupo C=O del enlazador.
El ligando puede tener uno o mas restos de lisina que pueden modificarse qulmicamente para introducir uno o mas grupos sulfhidrilo. La unidad de ligando se une a la unidad de enlazador a traves del atomo de azufre del grupo sulfhidrilo. Los reactivos que pueden usarse para modificar lisinas incluyen, pero no se limitan a, S-acetiltioacetato de N-succinimidilo (SATA) y clorhidrato de 2-iminotiolano (reactivo de Traut).
El ligando puede tener uno o mas grupos de hidrato de carbono que pueden modificarse qulmicamente para tener uno o mas grupos sulfhidrilo. La unidad de ligando se une a la unidad de enlazador, tal como la unidad de extensor, a traves de un atomo de azufre del grupo sulfhidrilo.
El ligando puede tener uno o mas grupos de hidrato de carbono que pueden oxidarse para proporcionar un grupo aldehldo (-CHO) (vease, por ejemplo, Laguzza, et al., 1989, J. Med. Chem. 32(3):548-55). El aldehldo correspondiente puede formar un enlace con un sitio reactivo en un extensor. Los sitios reactivos de un extensor que pueden reaccionar con un grupo carbonilo de un ligando incluyen, pero no se limitan a, hidrazina e hidroxilamina. Otros protocolos para la modificacion de protelnas para la union o asociacion de unidades de farmaco se describen en Coligan et al., Current Protocols in Protein Science, vol. 2, John Wiley & Sons (2002).
Los ligandos de protelna no inmunorreactiva, de polipeptido o de peptido utiles incluyen, pero no se limitan a, transferrina, factores de crecimiento epidermico ("e Gf"), bombesina, gastrina, peptido liberador de gastrina, factor de crecimiento derivado de plaquetas, IL-2, IL-6, factores de crecimiento transformante ("TGF"), tales como TGF-a y TGF-p, factor de crecimiento de vacuna ("VGF"), insulina y factores de crecimiento insullnico I y II, somatostatina, lectinas y apoprotelna de lipoprotelnas de baja densidad.
Los anticuerpos policlonales utiles son poblaciones heterogeneas de moleculas de anticuerpo derivadas de los sueros de animales inmunizados. Son anticuerpos monoclonales las utiles poblaciones homogeneas de anticuerpos para un determinante antigenico particular (por ejemplo, un antlgeno de celula cancerosa, un antlgeno viral, un antlgeno microbiano, una protelna, un peptido, un hidrato de carbono, un producto qulmico, un acido nucleico o fragmentos de los mismos). Un anticuerpo monoclonal (mAb) para un un antlgeno de interes puede prepararse mediante el uso de cualquier tecnica conocida en la tecnica que proporcione la produccion de moleculas de anticuerpo mediante cultivo de estirpes celulares continuos.
Los anticuerpos monoclonales utiles incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales humanos, anticuerpos monoclonales humanizados, fragmentos de anticuerpos o anticuerpos monoclonales quimericos de humano-raton (u otras especies). Los anticuerpos monoclonales humanos pueden prepararse mediante cualquiera de las numerosas tecnicas conocidas en la tecnica (por ejemplo, Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:7308-7312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72-79; y Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16).
El anticuerpo tambien puede ser un anticuerpo biespeclfico. Los metodos para fabricar anticuerpos biespeclficos son conocidos en la tecnica y se discuten a continuacion.
El anticuerpo puede ser un fragmento, derivado o analogo de un anticuerpo funcionalmente activo que se une inmunoespeclficamente a las celulas diana (por ejemplo, antlgenos de celulas cancerlgenas, antlgenos virales o antlgenos microbianos) u otros anticuerpos unidos a celulas tumorales o a una matriz. A este respecto, "funcionalmente activo" significa que el fragmento, derivado o analogo es capaz de inducir anticuerpos anti-anti-idiotipo que reconocen el mismo antlgeno que reconocla el anticuerpo del que se deriva el fragmento, derivado o analogo. Especlficamente, la antigenicidad del idiotipo de la molecula de inmunoglobulina puede potenciarse mediante la delecion de las secuencias marco conservadas y RDC que son C-terminal a la secuencia RDC que reconoce especlficamente el antlgeno. Para determinar que secuencias RDC se unen al antlgeno, pueden usarse peptidos de slntesis que contienen las secuencias RDC en ensayos de union con el antlgeno mediante cualquier metodo de ensayo de union conocido en la tecnica (por ejemplo, el ensayo de nucleo BIA) (vease, por ejemplo, Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edicion, National Institute of Health, Bethesda, MD; Kabat E et al., 1980, J. Immunology 125 (3): 961-969).
Otros anticuerpos utiles incluyen fragmentos de anticuerpos tales como, pero no limitados a, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab, Fv, anticuerpos de cadena sencilla, diacuerpos, tricuerpos, tetracuerpos, scFv, scFv-FV o cualquier otra molecula con la misma especificidad que el anticuerpo.
De forma adicional, los anticuerpos recombinantes, tales como los anticuerpos monoclonales quimericos y humanizados, que comprenden tanto porciones humanas como no humanas, que pueden hacerse usando tecnicas de ADN recombinante convencionales, son anticuerpos utiles. Un anticuerpo quimerico es una molecula en la que diferentes porciones se derivan de diferentes especies animales, tales como por ejemplo, las que tienen una region variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino y las regiones constantes de inmunoglobulina humana. (Vease, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. n.° 4.816.567; y la Patente de los EE.UU. n.° 4.816.397). Los anticuerpos humanizados son moleculas de anticuerpo de especies no humanas que tienen una o mas regiones determinantes de la complementariedad (RDC) de las especies no humanas y una region marco conservada de una molecula de inmunoglobulina humana. (Vease, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. n.° 5.585.089). Dichos anticuerpos monoclonales quimericos y humanizados pueden producirse mediante tecnicas de ADN recombinante conocidas en la tecnica, por ejemplo usando metodos descritos en la Publication Internacional n.° WO 87/02671; Publication de Patente Europea n.° 0184 187; Publicacion de Patente Europea n.° 0171 496; Publicacion de Patente Europea n.° 0 173 494; Publicacion Internacional n.° WO 86/01533; Patente de los EE.UU. n.° 4.816.567; Publicacion de Patente Europea n.° 012023; Berter et al., 1988, Science 240:1041-1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439­ 3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Cancer. Res. 47:999-1005; Wood et al., 1985, Nature 314:446-449; y Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559; Morrison, 1985, Science 229:1202-1207; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Patente de los EE.UU. n.° 5.225.539; Jones et al., 1986, Nature 321: 552-525; Verhoeyan et al., 1988, Science 239: 1534; y Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141:4053-4060.
Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables y pueden producirse usando ratones transgenicos que son incapaces de expresar genes de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas endogenas, pero que pueden expresar genes de cadena pesada y ligera humanos. Los ratones transgenicos se inmunizan de manera normal con un antlgeno seleccionado, por ejemplo, una portion de un polipeptido o uno completo. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antlgeno pueden obtenerse usando tecnologla de hibridoma convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana albergados por los ratones transgenicos se reordenan durante la diferenciacion de celulas B y posteriormente se someten a cambio de clase y mutation somatica. Por tanto, usando una tecnica de este tipo, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapeuticamente utiles. Para una vision general de esta tecnologla para producir anticuerpos humanos, vease Lonberg y Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93). Para un analisis detallado de esta tecnologla para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir dichos anticuerpos vease, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. n.° 5.625.126, 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806. Otros anticuerpos humanos pueden obtenerse en el mercado de, por ejemplo, Abgenix, Inc. (ahora Amgen, Freemont, CA) y Medarex (Princeton, NJ).
Los anticuerpos completamente humanos que reconocen un epitopo seleccionado pueden generarse usando una tecnica denominada como "seleccion guiada". En este enfoque un anticuerpo monoclonal seleccionado no humano, por ejemplo, un anticuerpo de raton se utiliza para guiar la seleccion de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epitopo. (Vease, por ejemplo, Jespers et al., 1994, Biotechnology 12: 899-903). Los anticuerpos humanos tambien pueden producirse usando diversas tecnicas conocidas en la tecnica, incluyendo bibliotecas de presentacion en fagos (vease, por ejemplo, Hoogenboom y Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581; Quan y Carter, 2002, The rise of monoclonal antibodies as therapeutics, In Anti-IgE and Allergic Disease, Jardieu y Fick, eds, Marcel Dekker, Nueva York, NY, capitulo 20, pags. 427-.469).
El anticuerpo puede ser una proteina de fusion de un anticuerpo o un fragmento funcionalmente activo del mismo, por ejemplo, en el que el anticuerpo esta fusionado a traves de un enlace covalente (por ejemplo, un enlace peptidico), ya sea al extremo N o al extremo C a una secuencia de aminoacidos de otra proteina (o una porcion de la misma, preferentemente una porcion de al menos 10, 20 o 50 aminoacidos de la proteina) que no es de un anticuerpo. Preferentemente, el anticuerpo o fragmento del mismo se une covalentemente a la otra proteina en el extremo N del dominio constante.
Los anticuerpos incluyen analogos y derivados que estan ya sea modificados, es decir, por la union covalente de cualquier tipo de molecula siempre que dicha union covalente permita que el anticuerpo conserve su inmunoespecificidad de union al antigeno. Por ejemplo, pero no a modo de limitacion, los derivados y analogos de los anticuerpos incluyen aquellos que se han modificado adicionalmente, por ejemplo, por glicosilacion, acetilacion, pegilacion, fosforilacion, amidacion, derivatizacion por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escision proteolitica, enlace a una unidad de anticuerpo celular u otra proteina, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones quimicas puede realizarse mediante tecnicas conocidas, incluyendo, pero no limitadas a, la escision quimica especifica, la acetilacion, la formilacion, la sintesis metabolica en presencia de tunicamicina, etc. De forma adicional, el analogo o derivado puede contener uno o mas aminoacidos no naturales.
Los anticuerpos pueden tener modificaciones (por ejemplo, sustituciones, deleciones o adiciones) en restos de aminoacidos que interaction con receptores Fc. En particular, los anticuerpos pueden tener modificaciones en los restos de aminoacidos identificados como que estan implicados en la interaccion entre el dominio anti-Fc y el receptor FcRn (vease, por ejemplo, la publicacion internacional n.° WO 97/34631).
Los anticuerpos inmunoespecificos para un antigeno de celula cancerosa puede obtenerse en el mercado o producirse mediante cualquier metodo conocido para un experto en la materia tal como, por ejemplo, la sintesis quimica o las tecnicas de expresion recombinantes. La secuencia de nucleotidos que codifica los anticuerpos inmunoespecificos para un antigeno de celula cancerosa puede obtenerse, por ejemplo, de la base de datos GenBank o de una base de datos como esta, las publicaciones de la bibliografia o por clonacion y secuenciacion sistematicas.
Pueden usarse anticuerpos conocidos para el tratamiento o prevencion del cancer. Los anticuerpos inmunoespecificos para un antigeno de celula cancerosa pueden obtenerse en el mercado o producirse mediante cualquier metodo conocido para un experto en la materia tal como, por ejemplo, tecnicas de expresion recombinantes. La secuencia de nucleotidos que codifica los anticuerpos inmunoespecificos para un antigeno de celula cancerosa puede obtenerse, por ejemplo, de la base de datos GenBank o de una base de datos como esta, las publicaciones de la bibliografia o por clonacion y secuenciacion sistematicas. Los ejemplos de anticuerpos disponibles para el tratamiento del cancer incluyen, pero no se limitan a, RITUXAN® (rituximab; Genentech) que es un anticuerpo monoclonal anti-CD20 quimerico para el tratamiento de pacientes con linfoma no Hodgkin; OVAREX que es un anticuerpo murino para el tratamiento del cancer de ovario; PANOREX (Glaxo Wellcome, NC), que es un anticuerpo de IgG2a murino para el tratamiento del cancer colorrectal; Cetuximab ERBITUX (Imclone Systems Inc., NY) que es un anticuerpo quimerico de IgG anti-EGFR para el tratamiento de canceres positivos para el factor de crecimiento epidermico, tales como el cancer de cabeza y cuello; Vitaxin (MedImmune, Inc., MD) que es un anticuerpo humanizado para el tratamiento del sarcoma; CAMPATH I/H (LeukoSite, MA) que es un anticuerpo de IgG1 humanizado para el tratamiento de la leucemia linfocitica cronica (LLC); SMART MI95 (Protein Design Labs, Inc., CA) y SGN-33 (Seattle Genetics, Inc., WA) que es un anticuerpo de IgG anti-CD33 humanizado para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda (LMA); LYMPHOCIDE (Immunomedics, Inc., NJ), que es un anticuerpo de IgG anti-CD22 humanizado para el tratamiento del linfoma no Hodgkin; SMART ID10 (Protein Design Labs, Inc., CA) que es un anticuerpo anti-HLA-DR humanizado para el tratamiento del linfoma no Hodgkin; ONCOLYM (Techniclone, Inc., CA) que es un anticuerpo anti-HLA-DR10 murino radiomarcado para el tratamiento del linfoma no Hodgkin; ALLOMUNE (Bio Transplant, CA) que es un mAb anti-CD2 humanizado para el tratamiento de la enfermedad de Hodgkin o del linfoma no Hodgkin; AVASTIN (Genentech, Inc., CA) que es un anticuerpo anti-VEGF humanizado para el tratamiento del cancer de pulmon y el colorrectal; EPRATUZAMAB (Immunomedics, Inc., NJ y Amgen, CA) que es un anticuerpo anti-CD22 para el tratamiento del linfoma no Hodgkin; y CEACIDE (Immunomedics, NJ), que es un anticuerpo humanizado anti-CEA para el tratamiento del cancer colorrectal.
Otros anticuerpos utiles en el tratamiento del cancer incluyen, pero no se limitan a, los anticuerpos contra los siguientes antigenos (donde los canceres a modo de ejemplo que pueden tratarse con el anticuerpo estan entre parentesis): CA125 (ovario), CA15-3 (carcinomas), CA19-9 (carcinomas), L6 (carcinomas), Lewis Y (carcinomas), Lewis X (carcinomas), fetoproteina alfa (carcinomas), CA 242 (colorrectal), fosfatasa alcalina placentaria (carcinomas), antigeno especifico de la prostata (prostata), antigeno de membrana especifico de la prostata (prostata), fosfatasa acida prostatica (prostata), factor de crecimiento epidermico (carcinomas), MAGE-1 (carcinomas), MAGE-2 (carcinomas), MAGE-3 (carcinomas), MAGE-4 (carcinomas), receptor de anti-transferrina (carcinomas), p97 (melanoma), MUC1-KLH (cancer de mama), CEA (colorrectal), gp100 (melanoma), MART1 (melanoma), receptor de IL-2 (leucemia y linfomas de linfocitos T), CD20 (linfoma no Hodgkin), CD52 (leucemia), CD33 (leucemia), CD22 (linfoma), gonadotropina corionica humana (carcinoma), CD38 (mieloma multiple), CD40 (linfoma), mucina (carcinomas), P21 (carcinomas), MPG (melanoma) y producto del oncogen Neu (carcinomas). Algunos anticuerpos especificos utiles incluyen, pero no se limitan a, mAb BR96 (Trail et al., 1993, Science 261: 212-215), BR64 (Trail et al., 1997, Cancer Research 57: 100-105), mAb contra el antigeno CD40, tales como mAb S2C6 (Francisco et al., 2000, Cancer Res 60: 3.225-3.231), mAb contra el antigeno CD70, tales como mAb 1F6, mAb 1F6 humanizado, mAb 2F2 y mAb 2F2 humanizado (vease, por ejemplo, la Solicitud Internacional Publicada n.° WO 04/073656 y la solicitud publicada de los EE.UU. n.° 2006-0083736) y mAb contra el antigeno CD30, tales como AC10 (Bowen et al., 1993, J. Immunol 151:5896-5906; Wahl et al., 2002 Cancer Res 62 (13): 3736-42) y MDX-060. Pueden usarse muchos otros anticuerpos de internalizacion que se unen a antigenos asociados a tumores y se han revisado (vease, por ejemplo, Franke et al., 2000, Cancer Biother Radiopharm 15, 459-76; Murray, 2000, Semin Oncol. 27:64-70; Breitling y Dubel, Recombinant Antibodies, John Wiley y Sons, Nueva York, 1998).
Los anticuerpos para el tratamiento o prevention de una enfermedad autoinmune se usan de acuerdo con las composiciones y metodos de la divulgation. Los anticuerpos inmunoespecificos para un antigeno de una celula que es responsable de la production de anticuerpos autoinmunes pueden obtenerse de cualquier organization (por ejemplo, un cientifico de una universidad o una empresa) o pueden producirse por cualquier metodo conocido para un experto en la materia tal como, por ejemplo, la sintesis quimica o las tecnicas de expresion recombinante. Los anticuerpos utiles que son inmunoespecificos para el tratamiento de enfermedades autoinmunes incluyen, pero no se limitan a, el anticuerpo anti-nuclear; anti-ADN bc; anti-ADN mc, anticuerpo de IgM, IgG anti-cardiolipina; anticuerpo de IgM, IgG anti-fosfolipido; anticuerpo anti-EM; anticuerpo anti-mitocondrial; anticuerpos tiroideos; anticuerpo microsomal; anticuerpos de tiroglobulina; anticuerpo anti-SCL-70; anticuerpo anti-Jo; anticuerpo anti-U1RNP; anticuerpo anti-La/SSB; anti-SSA; anticuerpo anti-SSB; anticuerpo anti-celulas peritales; anticuerpo anti-histonas; anticuerpo anti-RNP; anticuerpo C-ANCA; anticuerpo P-ANCA; anticuerpo anti-centromero; anticuerpo anti-Fibrilarina y anticuerpo anti-GBM.
Los anticuerpos utiles pueden unirse a un receptor o un complejo de receptor expresado en un linfocito activado. El receptor o complejo de receptor puede comprender un miembro de la superfamilia del gen de las inmunoglobulinas, un miembro de la superfamilia de receptores de TNF, una integrina, un receptor de citocinas, un receptor de quimiocinas, una proteina principal de histocompatibilidad, una lectina o una proteina de control del complemento. Son ejemplos no limitantes de miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas adecuados: CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD22, CD28, CD79, CD90, CD152/CTLA-4, PD-1 e ICOS. Son ejemplos no limitantes de miembros de la superfamilia de receptores de TNF adecuados: CD27, CD40, CD95/Fas, CD134/OX40, CD137/4-1BB, TNF-R1, TNFR-2, RANK, TACI, BCMA, osteoprotegerina, Apo2/TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TRAIL-R4 y APO-3. Son ejemplos no limitantes de integrinas adecuados: CD11a, CD11b, CD11c, CD18, CD29, CD41, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD103 y CD104. Son ejemplos no limitantes de lectinas adecuadas: lectina de tipo C, de tipo S y de tipo I.
La unidad de ligando puede unirse a un linfocito activado que se asocia a una enfermedad autoinmune.
Los ligandos utiles inmunoespecificos para un antigeno viral o microbiano son anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales quimericos, humanizados o humanos. Como se usa en el presente documento, la expresion "antigeno viral" incluye, pero no se limita a, cualquier peptido viral, proteina de polipeptido (por ejemplo, gp120 de VIH, nef del VIH, glicoproteina RSV F, neuraminidasa del virus de la gripe, hemaglutinina del virus de la gripe, HTLV tax, glicoproteina del virus del herpes simple (por ejemplo, gB, gC, gD, gE y) y antigeno de superficie de la hepatitis B) que sea capaz de provocar una respuesta inmune. Como se usa en el presente documento, la expresion "antigeno microbiano" incluye, pero no se limita a, cualquier peptido, polipeptido, proteina, sacarido, polisacarido o molecula de lipido microbianos (por ejemplo, un polipeptido bacteriano, fungico, de protozoos patogenos o de levadura, incluyendo, por ejemplo, el LPS y el polisacarido capsular 5/8) que sea capaz de provocar una respuesta inmune.
Los anticuerpos inmunoespecificos para un antigeno viral o microbiano pueden obtenerse en el mercado, por ejemplo, de BD Biosciences (San Francisco, CA), Chemicon International, Inc. (Temecula, CA) o Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA) o pueden producirse por cualquier metodo conocido para un experto en la materia tal como, por ejemplo, la sintesis quimica o las tecnicas de expresion recombinantes. La secuencia de nucleotidos que codifica anticuerpos que son inmunoespecificos para un antigeno viral o microbiano puede obtenerse, por ejemplo, de la base de datos GenBank o de una base de datos como esta, de las publicaciones de la bibliografia o por donation y secuenciacion sistematicas.
Los ligandos utiles son aquellos que son utiles para el tratamiento o la prevencion de la infection viral o microbiana de acuerdo con los metodos desvelados en el presente documento. Los ejemplos de anticuerpos disponibles utiles para el tratamiento de una infeccion viral o una infeccion microbiana incluyen, pero no se limitan a, SYNAGIS (MedImmune, Inc., MD) que es un anticuerpo monoclonal anti-virus respiratorio sincitial (VRS) humanizado util para el tratamiento de la los pacientes con infeccion por VRS; PRO542 (Progenics) que es un anticuerpo de fusion de CD4 util para el tratamiento de la infeccion por VIH; OSTAVIR (Protein Design Labs, Inc., CA) que es un anticuerpo humano util para el tratamiento del virus de la hepatitis B; PROTOVIR (Protein Design Labs, Inc., CA) que es un anticuerpo de IgGi humanizado util para el tratamiento del citomegalovirus (CMV); y los anticuerpos anti-LPS.
Otros anticuerpos utiles en el tratamiento de enfermedades infecciosas incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos contra los antlgenos de las cepas patogenas de bacterias (Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrheae, Neisseria meningitidis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Hemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenas, Klebsiella rhinoscleromotis, Staphylococc aureus, Vibrio colerae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter (Vibrio) fetus, Aeromonas hidrophila, Bacillus cereus, Edwardsiella tarda, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Treponema pallidum, Treponema pertenue, Treponema carateneum, Borrelia vincentii, Borrelia burgdorferi, Leptospira icterohemorrhagiae, Mycobacterium tuberculosis, Pneumocystis carinii, Francisella tularensis, Brucella abortus, Brucella suis, Brucella melitensis, Mycoplasma spp., Rickettsia prowazeki, Rickettsia tsutsugumushi y Chlamydia spp.); hongos patogenos (Coccidioides immitis, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Blastomyces dermatitidis, Cryptococcus neoformans e Histoplasma capsulatum); protozoos (Entomoeba histolytica, Toxoplasma gondii, Trichomonas tenas, Trichomonas hominis, Trichomonas vaginalis, Tryoanosoma gambiense, Trypanosoma rhodesiense, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Leishmania tropica, Leishmania braziliensis, Pneumocystis pneumonia, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium malaria); o helmintos (Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura, Ascaris lumbricoides, Trichinella spiralis, Strongyloides stercoralis, Schistosoma japonicum, Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium y anquilostomas).
Otros anticuerpos utiles para el tratamiento de enfermedades virales incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos contra antlgenos de virus patogenos, incluyendo como ejemplos y no como limitacion: Poxviridae, Herpesviridae, virus del herpes simple 1, virus del herpes simple 2, Adenoviridae, Papovaviridae, Enteroviridae, Picornaviridae, Parvoviridae, Reoviridae, Retroviridae, virus de la gripe, virus de la parainfluenza, paperas, sarampion, virus sincitial respiratorio, rubeola, Arboviridae, Rhabdoviridae, Arenaviridae, hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis E, virus de la hepatitis no A/no B, Rhinoviridae, Coronaviridae, Rotoviridae y virus de la inmunodeficiencia humana.
En los intentos por descubrir dianas celulares eficaces para el diagnostico y la terapia del cancer, los investigadores han buscado identificar o polipeptidos transmembrana o asociados a tumores de otro modo que se expresen especlficamente en la superficie de uno o mas tipos particulares de celulas cancerosas en comparacion con la expresion en una o mas celulas no cancerosas normales. Con frecuencia, dichos polipeptidos asociados a tumores se expresan mas abundantemente en la superficie de las celulas cancerosas en comparacion con la superficie de las celulas no cancerosas. La identificacion de dichos polipeptidos antlgenos de la superficie celular asociados a tumores ha dado origen a la capacidad de dirigirse especlficamente a las celulas cancerosas para su destruccion a traves de terapias basadas en anticuerpos.
En un ejemplo a modo de ejemplo, el conjugado ligando-enlazador-farmaco tiene la Formula ilia, donde el ligando es un anticuerpo Ab que se une al menos a uno de CD20, CD30, CD33, CD40, CD70, BCMA y antlgeno Y de Lewis, w = 0, y = 0 y D tiene la formula Ib. Los conjugados a modo de ejemplo de formula ilia incluyen aquellos en los que R17 es -(CH2)5-. Tambien se incluyen dichos conjugados de formula ilia que contienen de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 o de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 restos de farmaco D por unidad de ligando (es decir, conjugados de formula ia en Ia que p es un valor en el intervalo de aproximadamente 2-8, por ejemplo aproximadamente 2-6). Los conjugados que contienen combinaciones de las caracterlsticas estructurales indicadas en este parrafo.
En otro ejemplo, el conjugado ligando-enlazador-farmaco tiene la Formula iiia, donde el ligando es un anticuerpo Ab que se une al menos a uno de CD20, CD30, CD33, CD40, CD70, BCMA y antlgeno Y de Lewis, w = 0, y = 0 y D tiene la formula Ib. Se incluyen dichos conjugados de formula iiia en los que R17 es -(CH2)5-. Tambien se incluyen dichos conjugados de Formula iiia que contienen de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 o de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 restos de farmaco D por unidad de ligando (es decir, conjugados de formula ia en Ia que p es un valor en el intervalo de aproximadamente 2-8, por ejemplo aproximadamente 2-6). Los conjugados que contienen combinaciones de las caracterlsticas estructurales indicadas en este parrafo tambien a modo de ejemplo.
En otro ejemplo, el conjugado ligando-enlazador-farmaco tiene la Formula llla, donde el ligando es un anticuerpo Ab que se une a uno de c D20, CD30, CD33, CD40, CD70, BCMA y antlgeno Y de Lewis, w = 0, y = 0 y D tiene la formula Ib. Se incluyen conjugados de formula iiia en los que R17 es -(CH2)5-. Tambien se contemplan las combinaciones que contienen conjugados de las caracterlsticas estructurales indicadas en este parrafo.
Produccion de anticuerpos recombinantes
Pueden producirse anticuerpos usando cualquier metodo conocido en la tecnica que sea util para la slntesis de anticuerpos, en particular, mediante slntesis qulmica o mediante expresion recombinante.
La expresion recombinante de anticuerpos, o un fragmento, un derivado o un analogo de los mismos, requiere la construccion de un acido nucleico que codifique el anticuerpo. Si se conoce la secuencia de nucleotidos del anticuerpo, un acido nucleico que codifica el anticuerpo puede ensamblarse a partir de oligonucleotidos sintetizados qulmicamente (por ejemplo, como se describe en Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242), lo que implica la slntesis de oligonucleotidos superpuestos que contienen porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, la hibridacion y la ligamiento de esos oligonucleotidos y, despues, la amplificacion de los oligonucleotidos ligados, por ejemplo, por PCR.
Como alternativa, una molecula de acido nucleico que codifica un anticuerpo puede generarse a partir de una fuente adecuada. Si no hay un clon disponible que contenga el acido nucleico que codifica el anticuerpo particular, pero se conoce la secuencia del anticuerpo, puede obtenerse un acido nucleico que codifica el anticuerpo a partir de una fuente adecuada (por ejemplo, una biblioteca de ADNc de anticuerpo o una biblioteca de ADNc generada a partir de cualquier tejido o celulas que expresen la inmunoglobulina) por, por ejemplo, amplificacion por PCR usando cebadores sinteticos hibridables a los extremos 3' y 5' de la secuencia o por clonacion usando una sonda de oligonucleotidos especlfica para la secuencia del gen particular.
Si no hay disponible en el mercado un anticuerpo que reconozca especlficamente un antlgeno particular (o una fuente para una biblioteca de ADNc para clonar un acido nucleico que codifique una inmunoglobulina de este tipo), pueden generarse anticuerpos especlficos para un antlgeno particular mediante cualquier metodo conocido en la tecnica, por ejemplo, mediante la inmunizacion de un animal no humano o modelo animal adecuado, tal como un conejo o raton, para generar anticuerpos policlonales o, mas preferentemente, mediante la generation de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, como se describe por Kohler y Milstein (1975, Nature 256: 495-497) o como se describe por Kozbor et al. (1983, Immunology Today 4:72) o Cole et al. (1985 en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pags. 77-96). Como alternativa, puede obtenerse un clon que codifique al menos la portion Fab del anticuerpo mediante la exploration de bibliotecas de expresion de Fab (por ejemplo, como se describe en Huse et al., 1989, Science 246: 1275-1281) para clones de fragmentos Fab que se unen al antlgeno especlfico o explorando bibliotecas de anticuerpos (vease, por ejemplo, Clackson et al., 1991, Nature 352: 624; Hane et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4937).
Una vez que se obtiene una secuencia de acido nucleico que codifica al menos el dominio variable del anticuerpo, puede introducirse en un vector que contenga la secuencia de nucleotidos que codifica las regiones constantes del anticuerpo (vease, por ejemplo, Publication Internacional n.° WO 86/05807; WO 89/01036; y la Patente de los EE.UU. n.° 5.122.464). Hay disponibles vectores que contienen la cadena ligera o pesada completa que permite la expresion de una molecula de anticuerpo completa. El acido nucleico que codifica el anticuerpo puede usarse para introducir las sustituciones o deleciones de nucleotidos necesarias para sustituir (o borrar) los uno o mas restos de cistelna de la region variable que participan en un enlace disulfuro intracatenario con un resto de aminoacido que no contiene un grupo sulfhidrilo. Dichas modificaciones pueden realizarse por cualquier metodo conocido en la tecnica para la introduction de mutaciones o deleciones especlficas en una secuencia de nucleotidos, por ejemplo, pero no limitados a, la mutagenesis qulmica y la mutagenesis dirigida al sitio in vitro (Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 6551)
Ademas, pueden usarse tecnicas desarrolladas para la produccion de "anticuerpos quimericos" (vease, por ejemplo, Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314: 452-454) mediante el corte y empalme de genes de una molecula de anticuerpo de raton de especificidad de antlgeno apropiada junto con genes de una molecula de anticuerpo humano de actividad biologica apropiada. Un anticuerpo quimerico es una molecula en la que diferentes porciones se derivan de diferentes especies animales, tal como la que tiene una region variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino y una region constante de inmunoglobulina humana, por ejemplo, los anticuerpos humanizados.
Como alternativa, pueden adaptarse tecnicas descritas para la produccion de anticuerpos de cadena sencilla (Patente de Estados Unidos 4.694.778; Bird, 1988, Science 242: 423-42; Huston et al., 1988, Proc Natl Acad Sci USA 85:5879­ 5883; y Ward et al., 1989, Nature 334:544-54) para producir anticuerpos de cadena sencilla. Los anticuerpos de cadena sencilla se forman uniendo los fragmentos de cadena pesada y ligera de la region Fv mediante un puente de aminoacidos, dando como resultado un polipeptido de cadena sencilla. Tambien puede usarse tecnicas para el montaje de fragmentos Fv funcionales en E. coli (Skerra et al., 1988, Science 242: 1038-1041).
Pueden generarse fragmentos de anticuerpo que reconocen epltopos especlficos mediante tecnicas conocidas. Por ejemplo, dichos fragmentos incluyen fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab, fragmentos Fv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, anticuerpos de cadena sencilla, scFv, scFv-Fc y similares.
Una vez que se ha obtenido una secuencia de acido nucleico que codifica un anticuerpo, el vector para la produccion del anticuerpo puede producirse mediante tecnologla de ADN recombinante usando tecnicas bien conocidas en la tecnica. Pueden usarse metodos que son bien conocidos para los expertos en la materia para construir vectores de expresion que contengan las secuencias de codificacion del anticuerpo y senales de control transcripcional y traduccional apropiadas. Estos metodos incluyen, por ejemplo, tecnicas de ADN recombinante in vitro, tecnicas de slntesis y recombinacion genetica in vivo. Vease, por ejemplo, las tecnicas descritas en Sambrook et al. (1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edicion, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York; 2001; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a ed, Cold Spring Harbor Publicar, Cold Spring Harbor, Nueva York) y Ausubel et al., eds., en la serie de manuales de tecnicas de laboratorio Current Protocols in Molecular Biology, 1987­ 1999, Current Protocols, © 1994-199 John Wiley and Sons, Inc.).
Puede transferirse un vector de expresion que comprende la secuencia de nucleotidos de un anticuerpo o la secuencia de nucleotidos de un anticuerpo a una celula hospedadora mediante tecnicas convencionales (por ejemplo, electroporacion, transfeccion liposomal y precipitacion con fosfato de calcio) y despues las celulas transfectadas se cultivan mediante tecnicas convencionales para producir el anticuerpo. La expresion del anticuerpo esta regulada por un promotor constitutivo, inducible o especlfico de tejido.
Las celulas hospedadoras utilizadas para expresar el anticuerpo recombinante pueden ser o bien celulas bacterianas tales como Escherichia coli o celulas eucariotas, especialmente para la expresion de la molecula de inmunoglobulina recombinante completa. En particular, las celulas de mamlfero tales como las celulas de ovario de hamster chino (CHO), en conjuncion con un vector tal como el elemento promotor del gen temprano intermedio principal del citomegalovirus humano es un sistema de expresion eficaz para inmunoglobulinas (Foecking et al., 198, Gene 45: 101; Cockett et al., 1990, Biotechnology 8: 2).
Puede usarse diversos sistemas de vectores de expresion en hospedador para expresar los anticuerpos de inmunoglobulina. Dichos sistemas de expresion en hospedador representan vehlculos por los cuales las secuencias codificantes del anticuerpo pueden producirse y posteriormente purificarse, pero tambien representan celulas que, cuando se transforman o se transfectan con las secuencias de codificacion de nucleotidos apropiadas, pueden expresar una molecula de inmunoglobulina de anticuerpo in situ. Estos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. co liy B. subtilis) transformadas con a Dn de bacteriofago recombinante, vectores de expresion de ADN de plasmido o de ADN de cosmido que contienen secuencias de codificacion de inmunoglobulina; levadura (por ejemplo, Saccharomyces Pichia) transformada con vectores de expresion de levadura recombinantes que contienen secuencias de codificacion de inmunoglobulina; sistemas celulares de insectos infectados con vectores de expresion de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen las secuencias de codificacion de inmunoglobulina; sistemas de celulas vegetales infectadas con vectores de expresion de virus recombinantes (por ejemplo, el virus del mosaico de la coliflor (VMC) y el virus del mosaico del tabaco (VMT)) o transformados con vectores de expresion de plasmidos recombinantes (por ejemplo, Plasmido Ti) que contienen secuencias de codificacion de inmunoglobulina; o sistemas de celulas de mamlferos (por ejemplo, celulas COS, CHO, BH, 293, 293T o 3T3) que albergan construcciones de expresion recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de celulas de mamlfero (por ejemplo, promotor de metalotionelna) o de virus de mamlferos (por ejemplo, el promotor tardlo del adenovirus; el promotor de 7,5 K del virus de la vacuna).
En sistemas bacterianos, puede seleccionarse ventajosamente una serie de vectores de expresion dependiendo del uso previsto para el anticuerpo que se expresa. Por ejemplo, cuando se ha de producir una gran cantidad de una protelna de este tipo, podrlan ser deseables vectores que dirijan la expresion de altos niveles de productos de protelnas de fusion que se purifique facilmente. Dichos vectores incluyen, pero no se limitan, el vector de expresion de E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2: 1791), en el que la secuencia que codifica el anticuerpo puede ligarse individualmente en el vector en marco con la region de codificacion lac Z de modo que se produce una protelna de fusion; vectores pIN (Inouye y Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509); y similares. Tambien pueden usarse vectores pGEX para expresar polipeptidos extranos como protelnas de fusion con glutation S-transferasa (GST). En general, dichas protelnas de fusion son solubles y pueden purificarse facilmente a partir de celulas lisadas por adsorcion y union a una matriz de perlas de glutationagarosa seguido de la elucion en presencia de glutation libre. Los vectores pGEX estan disenados para incluir sitios de escision de proteasa de trombina o factor Xa de manera que el producto genico diana clonado puede liberarse del resto de GST.
En un sistema de insectos, pueden usarse el virus de la poliedrosis nuclear Autographa californica (VPNAc) o el virus analogo a partir de Drosophilia Melanogaster como un vector para expresar genes extranos. El virus crece en celulas de Spodoptera defrugiperda. La secuencia de codificacion del anticuerpo puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo el gen de polihedrina) del virus y colocarse bajo el control de un promotor de VPNAc (por ejemplo el promotor de la polihedrina).
En las celulas hospedadoras de mamlfero, pueden usarse una serie de sistemas de expresion basados en virus. En los casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresion, la secuencia de codificacion del anticuerpo de interes puede ligarse a un complejo de control de la transcripcion/traduccion del adenovirus, por ejemplo, el promotor tardlo y la secuencia llder tripartita. Despues, este gen quimerico puede insertarse en el genoma del adenovirus mediante recombinacion in vitro o in vivo. La insercion en una region no esencial del genoma viral (por ejemplo, la region E1 o E3) da como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molecula de inmunoglobulina en hospedadores infectados. (p.ej, ver Logan y Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 355359). Tambien pueden ser necesarias senales de iniciacion especlficas para la traduccion eficiente de las secuencias codificantes de anticuerpos insertadas. Estas senales incluyen el codon de iniciacion ATG y secuencias adyacentes. Ademas, el codon de iniciacion debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia de codificacion deseada para asegurar la traduccion del inserto completo. Estas senales de control de traduccion y codones de iniciacion exogenos pueden ser de diversos orlgenes, tanto naturales como sinteticos. La eficacia de la expresion puede potenciarse mediante la inclusion de elementos potenciadores de la transcripcion apropiados, terminadores de la transcripcion, etc. (vease, por ejemplo, Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 51-544). Los anticuerpos pueden expresarse usando el sistema CHEF (vease, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. n.° 5.888.809).
Ademas, puede elegirse una cepa de celula hospedadora para modular la expresion de las secuencias insertadas o modifica y procesa el producto genico en la forma especlfica deseada. Dichas modificaciones (por ejemplo, la glicosilacion) y procesamiento (por ejemplo, la escision) de productos proteicos puede ser importante para la funcion de la protelna. Diferentes celulas hospedador tienen mecanismos caracterlsticos y especlficos para el procesamiento post-traduccional y la modificacion de protelnas y productos genicos. Pueden elegirse estirpes celulares o sistemas hospedadores apropiados para asegurar la modificacion y el procesamiento correctos de la protelna extrana expresada. Con este fin, pueden usarse celulas hospedadoras eucariotas que posean la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcrito primario, la glicosilacion y la fosforilacion del producto del gen. Dichas celulas hospedadoras de mamlfero incluyen, pero no se limitan a, CHO (por ejemplo, DG44), VERY, BH, Hela, COS, MDCK, 293, 293T, 3T3, WI38, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D, CRL7030 y Hs578Bst .
Para el largo plazo, se utiliza normalmente la produccion de alto rendimiento de protelnas recombinantes, la expresion estable. Por ejemplo, las estirpes celulares que expresan de manera estable un anticuerpo pueden modificarse por ingenierla genetica. En lugar de usar vectores de expresion que contengan orlgenes de replicacion virales, las celulas hospedadoras pueden transformarse con ADN controlado por elementos de control de la expresion apropiados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de transcripcion, sitios de poliadenilacion, etc.) y un marcador seleccionable. Despues de la introduccion del ADN extrano, las celulas manipuladas pueden dejarse crecer durante 1-2 dlas en un medio enriquecido y, despues, se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plasmido recombinante confiere resistencia a la seleccion y permite que las celulas integren de forma estable el plasmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos que a su vez pueden clonarse y expandirse en estirpes celulares. Este metodo puede usarse ventajosamente para obtener por ingenierla genetica estirpes celulares que expresen el anticuerpo. Dichas estirpes celulares modificadas por ingenierla genetica pueden ser particularmente utiles en la exploracion y la evaluacion de los antlgenos tumorales que interaction directamente o indirectamente con el anticuerpo.
Pueden usarse una serie de sistemas de seleccion, incluyendo pero no limitados a los genes de la timidina quinasa del virus del herpes simple de (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, 1992, Proc Natl Acad Sci USA 48: 202) y la adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817) en celulas tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. Tambien, puede usarse la resistencia a antimetabolitos como la base de seleccion para los siguientes genes: DHFR, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77: 357; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78: 1527); gpt, que confiere resistencia al acido micofenolico (Mulligan y Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78: 2072); neo, que confiere resistencia al aminoglucosido G-418 (Clinical Pharmacy 12: 488-505; Wu y Wu, 1991, Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann Rev. Pharmacol Toxicology 32: 573-596; Mulligan, 1993, Science 260: 926-932; y Morgan y Anderson, 1993, Ann Rev. Biochem 62: 191-217; Mayo de 1993, TIB TECH 11 (5): 155-215) e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147). Se describen metodos habitualmente conocidos en la tecnica de la tecnologla del ADN recombinante que puede usarse en Ausubel et al. (citado anteriormente; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, Nueva York y en los capltulos 12 y 13, Dracopoli et al (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, Nueva York; Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol Biol 150: 1).
Los niveles de expresion de un anticuerpo pueden incrementarse mediante la amplificacion del vector (para una revision, vease Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3. (Academic Press, Nueva York, 1987)). Cuando un marcador en el sistema vector que expresa un anticuerpo es amplificable, un aumento en el nivel de inhibidor presente en el cultivo de la celula hospedador aumentara el numero de copias del gen marcador. Puesto que la region amplificada esta asociada a la secuencia de nucleotidos del anticuerpo, la produccion del anticuerpo tambien aumentara (vease, por ejemplo, Crouse et al., 1983, Mol Cell Biol 3: 257).
La celula hospedadora puede co-transfectarse con dos vectores de expresion, el primer vector que codifica un polipeptido derivado de la cadena pesada y el segundo vector que codifica un polipeptido derivado de la cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables identicos que permiten igual expresion de polipeptidos de cadena pesada y ligera. Como alternativa, un unico vector puede usarse para codificar ambos polipeptidos de cadena pesada y ligera. En dichas situaciones, la cadena ligera se coloca normalmente antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre toxica (vease, por ejemplo, Proudfoot, 1986, Nature 322: 52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77: 2197). Las secuencias de codificacion para las cadenas pesada y ligera pueden comprender ADNc o ADN genomico.
Una vez que el anticuerpo se ha expresado de forma recombinante, puede purificarse usando cualquier metodo conocido en la tecnica para la purificacion de un anticuerpo, por ejemplo, mediante cromatografla (por ejemplo, cromatografla de intercambio ionico, de afinidad, particularmente por afinidad por el antlgeno especlfico despues de la protelna A y cromatografla en columna de exclusion molecular), centrifugacion, solubilidad diferencial o mediante cualquier otra tecnica convencional para la purificacion de protelnas.
En otro ejemplo a modo de ejemplo, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
Produccion de anticuerpos
La produccion de anticuerpos se ilustrara con referencia a anticuerpos anti-CD30, pero sera evidente para los expertos en la materia que pueden producirse y modificarse anticuerpos para otras dianas (por ejemplo, miembros de la familia del receptor del TNF) de una manera similar. El uso de CD30 para la produccion de anticuerpos es solamente a modo de ejemplo y no pretende ser limitante.
El antlgeno CD30 que se usa para la produccion de anticuerpos puede ser, por ejemplo, una forma soluble del dominio extracelular de CD30 o una porcion del mismo, que contenga el epltopo deseado. Como alternativa, pueden usarse celulas que expresan CD30 en su superficie celular (por ejemplo, l540 (estirpe celular derivada de linfoma de Hodgkin con un fenotipo de linfocitos T) y L428 (estirpe celular derivada de linfoma de Hodgkin con un fenotipo de celulas B)) para generar anticuerpos. Otras formas de CD30 utiles para generar anticuerpos seran evidentes para los expertos en la materia.
(i) Anticuerpos policlonales
Los anticuerpos policlonales se desarrollan preferentemente en animales mediante multiples inyecciones subcutaneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antlgeno relevante y un adyuvante. Puede ser util conjugar el antlgeno relevante con una protelna que sea inmunogenica en las especies a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, albumina serica, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, ester de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugacion a traves de restos de cistelna), N-hidroxisuccinimida (a traves de restos de lisina), glutaraldehldo, anhldrido succlnico, SOCl2, o R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes.
Los animales se inmunizan contra el antlgeno, conjugados inmunogenicos o derivados mediante la combinacion de, por ejemplo, 100 pg o 5 pg de la protelna o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volumenes de adyuvante completo de Freund y la inyeccion de la solucion por via intradermica en multiples sitios. Un mes mas tarde los animales se refuerzan con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de peptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyeccion subcutanea en multiples sitios. De siete a 14 dlas mas tarde los animales se sangran y se analiza el suero para determinar el tltulo de anticuerpos. Los animales se refuerzan hasta que el tltulo se estabiliza. Normalmente, el animal se estimula con el conjugado del mismo antlgeno, pero conjugado con una protelna diferente y/o a traves de un reactivo de reticulacion diferente. Los conjugados tambien pueden hacerse en cultivo de celulas recombinantes como fusiones de protelnas. Tambien, se usan adecuadamente agentes agregantes como el alumbre para mejorar la respuesta inmune.
(ii) Anticuerpos monoclonales
Los anticuerpos monoclonales se obtienen de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. De este modo, el modificador "monoclonal" indica el caracter del anticuerpo que no es una mezcla de anticuerpos individuales.
Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden fabricarse usando el metodo del hibridoma descrito primero por Kohler et al., 1975, Nature 256: 495, o pueden fabricarse mediante metodos de ADN recombinante (Patente de los EE.UU. n.° 4.816.567)
En el metodo del hibridoma, un raton u otro animal hospedador apropiado, tal como un hamster, se inmuniza como se ha descrito anteriormente en el presente documento para inducir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se uniran especlficamente a la protelna utilizada para la inmunizacion. Como alternativa, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Despues, los linfocitos se fusionan con celulas de mieloma usando un agente de fusion adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una celula de hibridoma (vease, por ejemplo, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pags. 59-103 (Academic Press, 1986)).
Las celulas de hibridoma preparadas de este modo se siembran y se cultivan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o mas sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las celulas de mieloma parentales no fusionadas. Por ejemplo, si las celulas de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRt o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluira normalmente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que previenen el crecimiento de celulas deficientes en HGPRT.
Las celulas de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan la produccion de alto nivel estable de anticuerpo por las celulas productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre estas, las estirpes celulares de mieloma preferidas son la estirpes de mieloma murino, tales como las derivados de tumores de raton MOPC-21 y MPC-11 disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EE.UU. y celulas SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles en la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EE.UU. Tambien se han descrito estirpes celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratonhumano para la produccion de anticuerpos monoclonales humanos (vease, por ejemplo, Kozbor, 1984, J. Immunol 133: 3001; y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pags. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).
El medio de cultivo en el que las celulas de hibridoma estan creciendo se ensaya para determinar la produccion de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antlgeno. Preferentemente, la especificidad de union de los anticuerpos monoclonales producidos por celulas de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitacion o mediante un ensayo de union in vitro, tal como el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA). La afinidad de union del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse mediante el analisis Scatchard de Munson et al., 1980, Anal. Biochem. 107: 220.
Despues de identificar las celulas de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilucion limitante y pueden cultivarse mediante metodos convencionales (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pags. 59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Ademas, las celulas de hibridoma pueden crecer in vivo como tumores de ascitis en un animal.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, fluido de ascitis o suero mediante procedimientos de purificacion de anticuerpos convencionales tales como, por ejemplo, protelna A-Sepharose, cromatografla de hidroxilapatita, electroforesis en gel, dialisis o cromatografla de afinidad.
El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales puede aislarse y secuenciarse facilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas de oligonucleotidos que son capaces de unirse especlficamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Las celulas de hibridoma sirven como fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede situarse en vectores de expresion, que despues se transfectan en celulas hospedadoras tales como celulas de E. coli, celulas COS de simio, celulas de ovario de hamster chino (CHO) o celulas de mieloma que de otro modo no producen protelna de anticuerpo, para obtener la slntesis de anticuerpos monoclonales en las celulas hospedadoras recombinantes. Los artlculos de revision sobre la expresion recombinante en bacterias de ADN que codifica el anticuerpo incluyen Skerra et al., 1993, Curr. Opinion in Immunol. 5: 256-262 y Pluckthun, 1992, Immunol. Revs. 130: 151-188.
Los anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de bibliotecas de fagos de anticuerpos generadas usando las tecnicas descritas en McCafferty et al., 1990, Nature 348: 552-554. Clackson et al., 1991, Nature, 352: 624-628 y Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597 describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Publicaciones posteriores describen la produccion de alta afinidad (intervalo nM) de anticuerpos humanos mediante combinacion aleatoria de cadenas (Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10: 779-783), as! como la infeccion combinatoria y la recombinacion in vivo como estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (vease, por ejemplo, Waterhouse et al., 1993, Nuc Acids Res., 21: 2265­ 2266). Por tanto, estas tecnicas son alternativas viables a las tecnicas tradicionales de hibridoma de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.
El ADN tambien puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante para los dominios constantes de la cadena pesada y la cadena ligera humanas por secuencias murinas homologas (vease, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. n.° 4.816.567; y Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81: 6851) o uniendo covalente a la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia de codificacion para un polipeptido no inmunoglobulina.
Normalmente, los dominios constantes de un anticuerpo se sustituyen por dichos polipeptidos no inmunoglobulina, o se sustituyen los dominios variables de un solo sitio de combinacion de antlgeno de un anticuerpo por dichos polipeptidos no inmunoglobulina para crear un anticuerpo bivalente quimerico que comprende un solo sitio de combinacion de antlgeno que tiene especificidad por un antlgeno y otro sitio de combinacion de antlgeno que tiene especificidad para un antlgeno diferente.
(iii) Anticuerpos humanizados
Un anticuerpo humanizado puede tener uno o mas restos de aminoacidos introducidos en el de una fuente que no es humana. Estos restos de aminoacidos no humanos se denominan con frecuencia restos "importados", que normalmente se obtienen a partir de un dominio variable "importado". La humanizacion puede realizarse esencialmente siguiendo el metodo de Winter y colaboradores (vease, por ejemplo, Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536), sustituyendo las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano por secuencias de la region hipervariable. En consecuencia, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quimericos (vease, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. n.° 4.816.567) en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la practica, los anticuerpos humanizados son anticuerpos normalmente humanos en los que algunos restos de la region hipervariable y posiblemente algunos restos RMC se sustituyen por restos de sitios analogos en anticuerpos de roedores.
La eleccion de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para usar en la preparacion de anticuerpos humanizados es importante para reducir la antigenicidad. Da acuerdo con el metodo denominado "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se explora frente a toda la biblioteca de secuencias de dominios variables humanos conocidos. La secuencia humana que esta mas proxima a la del roedor se acepta como la region marco conservada (RMC) humana para el anticuerpo humanizado (Sims et al., 1993, J. Immunol. 151: 2296; Chotia et al., 1987, J. Mol. Biol. 196: 901). Otro metodo usa una region marco conservada particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. El mismo marco puede usarse para varios anticuerpos humanizados diferentes (vease, por ejemplo, Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 89: 4285; Presta et al., 1993, J. Immunol 151: 2623).
Los anticuerpos pueden humanizarse mediante la retencion de alta afinidad por el antlgeno y otras propiedades biologicas favorables. Los anticuerpos humanizados pueden prepararse mediante un proceso de analisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Habitualmente hay modelos tridimensionales de inmunoglobulina disponibles y son familiares para los expertos en la materia. Hay programas informaticos disponibles que ilustran y muestran estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La inspeccion de estas presentaciones permite el analisis del papel probable de los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el analisis de restos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antlgeno. De esta manera, los restos de RMC pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias del receptor e importadas de manera que se consiga la caracterlstica deseada del anticuerpo, tal como una mayor afinidad por el antlgeno o antlgenos diana. En general, los restos de la region hipervariable estan directamente y mas sustancialmente implicados en influenciar la union al antlgeno.
Se consideran diversas formas del anticuerpo humanizado. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, anticuerpos de cadena sencilla, scFv, scFv-Fc y similares. Como alternativa, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo de IgG1 intacto.
(iv) Anticuerpos humanos
Como alternativa a la humanizacion, pueden generarse anticuerpos humanos. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgenicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, tras la inmunizacion, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de production de inmunoglobulina endogena. Por ejemplo, se ha descrito que la deletion homocigotica de la region de union de cadena pesada de anticuerpo (Jh) en ratones quimericos y mutantes de llnea germinal da como resultado la inhibition completa de la produccion endogena de anticuerpos. La transferencia de la serie de genes de inmunoglobulina humana de la llnea germinal en dichos ratones mutantes de llnea germinal dara como resultado la produccion de anticuerpos humanos tras la exposition al antlgeno. Vease, por ejemplo, Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551; Jakobovits et al., 1993, Nature 362: 255-258; Bruggermann et al., 1993, Year in Inmuno. 07: 33; y la Patente de los EE.UU. n.° 5.591.669, 5.589.369 y 5.545.807
Como alternativa, la tecnologla de presentation en fagos (vease, por ejemplo, McCafferty et al., 1990, Nature 348: 552-553) puede usarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, de repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. De acuerdo con esta tecnica, los genes del dominio V del anticuerpo se clonan en marco en genes de protelna de la cubierta ya sea mayor o menor de un bacteriofago filamentoso, tal como M13 o fd y se muestran como fragmentos de anticuerpo funcionales en la superficie de la partlcula de fago. Debido a que la partlcula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo tambien dan como resultado la selection del gen que codifica el anticuerpo que presenta esas propiedades. Por tanto, el fago imita algunas de las propiedades de la celula B. La presentacion en fagos puede realizarse en diversos formatos; para su revision vease, por ejemplo, Johnson y Chiswell, 1993, Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571. Pueden usarse varias fuentes de segmentos de genes V para la presentacion en fagos. Clackson et al., 1991, Nature 352: 624-628 aislaron una gama diversa de anticuerpos anti-oxazolona a partir de una pequena biblioteca combinatoria aleatoria de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Puede construirse un repertorio de genes V de donantes humanos no inmunizados y pueden aislarse anticuerpos para una serie diversa de antlgenos (incluyendo auto-antlgenos) esencialmente siguiendo las tecnicas descritas por Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597) o Griffith et al., 1993, EMBO J. 12: 725-734. Vease tambien la Patente de los EE.UU. n.° 5.565.332 y 5.573.905. Como se ha analizado anteriormente, los anticuerpos humanos tambien pueden generarse mediante celulas B activadas in vitro (vease, por ejemplo, las Patentes de los EE.UU. n.° 5.567.610 y 5.229.275). Se describen anticuerpos anti-CD30 humanos en la Publication de Solicitud de Patente de los EE.UU. n.° 2004-0006215.
(v) Fragmentos de anticuerpos
Se han desarrollado diversas tecnicas para la production de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaban mediante la digestion proteolltica de anticuerpos intactos (vease, por ejemplo, Morimoto et al., 1992, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117; y Brennan et al., 1985, Science 229: 81). Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden producirse directamente mediante celulas hospedador recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de las bibliotecas de fagos de anticuerpos analizadas anteriormente. Como alternativa, pueden recuperarse fragmentos Fab'-SH directamente de E. coli y acoplarse qulmicamente para formar fragmentos F(ab')2 (vease, por ejemplo, Carter et al., 1992, Bio/Technology 10: 163-167). De acuerdo con otro enfoque, pueden aislarse fragmentos F(ab')2 directamente del cultivo de celulas hospedadoras recombinantes. Otras tecnicas para la produccion de fragmentos de anticuerpos seran evidentes para el medico experto. En otros ejemplos, el anticuerpo de election es un fragmento Fv de cadena unica (scFv). Vease el documento WO 93/16185; la Patente de los EE.UU. n.° 5.571.894; y la Patente de los EE.UU. n.° 5.587.458. El fragmento de anticuerpo tambien puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe en la Patente de los EE.UU. n.° 5.641.870, por ejemplo. Dichos fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespeclficos o biespeclficos.
(vi) Anticuerpos biespeclficos
Los anticuerpos biespeclficos son anticuerpos que tienen especificidades de union para al menos dos epltopos diferentes. Anticuerpos biespeclficos a modo de ejemplo pueden unirse a dos epltopos diferentes de una protelna diana. Como alternativa, un brazo del anticuerpo puede combinarse con un brazo que se une a receptores Fc para IgG (FcyR), tales como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16) con el fin de focalizar los mecanismos de defensa celular en la celula que expresa la diana. Los anticuerpos biespeclficos tambien pueden usarse para localizar agentes citotoxicos en celulas que expresan la diana.
La produccion tradicional de anticuerpos biespeclficos de longitud completa se basa en la coexpresion de dos pares cadenas pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen especificidades diferentes (vease, por ejemplo, Millstein et al., 1983, Nature 305: 537-539). Debido a la variedad aleatoria de cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moleculas de anticuerpo diferentes, de las cuales solo una tiene la estructura biespeclfica correcta. La purification de la molecula correcta, que normalmente se realiza mediante etapas de cromatografla de afinidad, es bastante engorrosa y los rendimientos de producto son bajos. Se desvelan procedimientos similares en el documento WO 93/08829 y en Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10: 3655-3659. De acuerdo con un enfoque diferente, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de union deseadas (sitios de combination anticuerpo-antlgeno) se fusionan con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusion preferentemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de la bisagra, regiones Ch2 y Ch3. Se prefiere que la primera region constante de cadena pesada (Ch1) contenga el sitio necesario para la union a la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresion separados y se co-transfectan en un organismo hospedador adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipeptido en realizaciones donde proporciones desiguales de las tres cadenas de polipeptido utilizadas en la construction proporcionan los rendimientos optimos. Es posible, sin embargo, insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptldicas en un vector de expresion cuando la expresion de al menos dos cadenas polipeptldicas en proporciones iguales da como resultado rendimientos elevados o cuando las proporciones no tiene particular importancia.
En un enfoque, los anticuerpos biespeclficos estan compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina hlbrida con una primera especificidad de union en un brazo y un par cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina hlbrida (que proporciona una segunda especificidad de union) en el otro brazo. Se descubrio que esta estructura asimetrica facilita la separation del compuesto biespeclfico deseado de las combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, puesto que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo una mitad de la molecula biespeclfica proporciona un modo facil de separacion. Este enfoque se desvela en el documento WO 94/04690. Para detalles adicionales sobre generation de anticuerpos biespeclficos vease, por ejemplo, Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121: 210.
De acuerdo con otro enfoque descrito en la Patente de los EE.UU. n.° 5.731.168, la interfaz entre un par de moleculas de anticuerpo puede modificarse por ingenierla genetica para maximizar el porcentaje de heterodlmeros que se recuperan del cultivo de celulas recombinantes. La interfaz preferida comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este metodo, una o mas cadenas laterales pequenas de aminoacidos de la interfaz de la primera molecula de anticuerpo se reemplazan por cadenas laterales mas grandes (por ejemplo, tirosina o triptofano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamano identico o similar a la cadena o cadenas laterales grandes en la interface de la segunda molecula de anticuerpo mediante el reemplazo de cadenas laterales grandes de aminoacidos por otras mas pequenas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodimero por sobre otros productos finales no deseados tales como homodimeros.
Tambien se han descrito tecnicas para generar anticuerpos biespecificos a partir de fragmentos de anticuerpos en la bibliografia. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos biespecificos usando union quimica. Brennan et al., 1985, Science, 229: 81 describe un procedimiento en el que anticuerpos intactos se escinde proteoliticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante de ditiol, arsenito de sodio, para estabilizar los ditioles vecinales e impedir la formacion de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados se convierten en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados Fab'-TNB se reconvierte a continuation en el Fab'-tiol mediante reduction con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecifico. Los anticuerpos biespecificos producidos pueden usarse como agentes para la inmovilizacion selectiva de enzimas.
El progreso reciente ha facilitado la recuperation directa de fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli, que pueden acoplarse quimicamente para formar anticuerpos biespecificos. Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med. 175: 217-225 describen la production de un anticuerpo biespecifico completamente humanizado molecula F(ab')2. Cada fragmento Fab' se secreto por separado de E. coli y se sometio a acoplamiento quimico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecifico.
Tambien se han descrito diversas tecnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecificos directamente del cultivo de celulas recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecificos usando cremalleras de leucina. Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148 (5): 1547-1553. Los peptidos de cremallera de leucina de las proteinas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusion genica. Los homodimeros de anticuerpo se redujeron en la region bisagra para formar monomeros y despues se volvieron a oxidar para formar los heterodimeros de anticuerpo. Este metodo tambien puede usarse para la produccion de homodimeros de anticuerpo. La tecnologia de "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpos biespecificos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (Vh) conectado a un dominio variable de cadena ligera (Vl) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. En consecuencia, los dominios de Vh y Vl de un fragmento estan obligados a emparejarse con los dominios Vl y Vh complementarios de otro fragmento, formando de ese modo dos sitios de union a antigeno. Tambien se ha notificado otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpo biespecificos mediante el uso de dimeros de cadena simple Fv (sFv). Vease Gruber et al., 1994, J. Immunol. 152: 5368.
Se consideran anticuerpos con mas de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecificos. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).
(vii) Otras modificaciones de la secuencia de aminoacidos
Se consideran la modification o modificaciones de la secuencia de aminoacidos de los anticuerpos descritas en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de union y/u otras propiedades biologicas del anticuerpo. Se preparan variantes de la secuencia de aminoacidos de los anticuerpos mediante la introduction de cambios de nucleotidos apropiados en el acido nucleico del anticuerpo o mediante la sintesis de peptidos. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de restos dentro de las secuencias de aminoacidos del anticuerpo. Cualquier combination de deletion, insertion y sustitucion se hace para llegar a la construction final, siempre que la construction final posea las caracteristicas deseadas. Los cambios de aminoacidos tambien pueden alterar los procesos post-traduccionales del anticuerpo, tales como cambiar el numero o position de los sitios de glicosilacion.
Un metodo util para la identification de ciertos restos o regiones del anticuerpo que son ubicaciones favorecidas para la mutagenesis se llama "mutagenesis de rastreo con alanina", como se describe por Cunningham y Wells, 1989, Science, 244: 1081-1085. En este caso, se identifican un resto o un grupo de restos diana (por ejemplo, restos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y se reemplazan por un aminoacido neutro o cargado negativamente (mas preferentemente alanina o polialanina) para influir en la interaction de los aminoacidos con el antigeno. Esas ubicaciones de aminoacidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones despues se refinan introduciendo mas u otras variantes en o para, los sitios de sustitucion. Asi, mientras que el sitio para introducir una variation de secuencia de aminoacidos esta predeterminado, la naturaleza de la mutation por si misma no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutacion en un sitio dado, el rastreo con ala o la mutagenesis aleatoria se realizan en el codon o region diana y las variantes de anticuerpos expresadas se exploran para determinar la actividad deseada.
Las inserciones de secuencias de aminoacidos incluyen fusiones amino- y/o carboxilo-terminales que varian en longitud desde un resto a polipeptidos que contienen cien o mas restos, asi como inserciones intrasecuencia de restos de aminoacidos individuales o multiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un resto metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado a un polipeptido citotoxico. Otras variantes de insercion de la molecula de anticuerpo incluyen la fusion a los extremos N- o C-terminal del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipeptido que aumenta la semivida en suero del anticuerpo.
Otro tipo de variante es una variante de sustitucion de aminoacidos. Estas variantes tienen al menos un resto de aminoacido en la molecula de anticuerpo reemplazado por un resto diferente. Los sitios de mayor interes para la mutagenesis de sustitucion incluyen las regiones hipervariables, pero tambien se consideran las alteraciones de RMC.
Se logran modificaciones sustanciales en las propiedades biologicas del anticuerpo seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto del polipeptido en el area de la sustitucion, por ejemplo, como una conformacion en lamina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobia de la molecula en el sitio diana o (c) el grueso de la cadena lateral. Los restos de origen natural pueden dividirse en grupos basados en propiedades comunes de la cadena lateral:
(1) hidrofobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;
(2) hidrofilos neutros: cys, ser, thr;
(3) acidos: asp, glu;
(4) basicos: asn, gln, his, lys, arg;
(5) restos que influyen en la orientacion de la cadena: gly, pro; y
(6) aromaticos: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservativas implicaran el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.
Un tipo particularmente preferido de variante de sustitucion implica la sustitucion de uno o mas restos de region hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la variante o variantes resultantes seleccionadas para el desarrollo adicional tendran propiedades biologicas mejoradas en relacion con el anticuerpo parental del que se generan. Una forma conveniente de generar dichas variantes por sustitucion implica la maduracion de afinidad usando la presentacion en fagos. Brevemente, se mutan varios sitios de region hipervariable (por ejemplo, los sitios 6-7) para generar todas las posibles sustituciones de amino en cada sitio. Las variantes de anticuerpo generadas de este modo se presentan de una manera monovalente a partir de partlculas de fagos filamentosos como fusiones al producto del gen III de M13 empaquetado dentro de cada partlcula. Despues, las variantes de presentacion en fagos se exploran para determinar su actividad biologica (por ejemplo, la afinidad de union) como se describe en el presente documento. Con el fin de identificar los sitios de region hipervariable candidatos para la modificacion, puede realizarse la mutagenesis de rastreo con alanina para identificar restos de la region hipervariable que contribuyan significativamente a la union del antlgeno. Como alternativa o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antlgeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antlgeno. Dichos restos de contacto y restos vecinos son candidatos para la sustitucion de acuerdo con las tecnicas elaboradas en el presente documento. Una vez se generan dichas variantes, el panel de variantes se somete a exploracion como se describe en el presente documento y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o mas ensayos pertinentes pueden seleccionarse para un mayor desarrollo.
Puede ser deseable modificar el anticuerpo con respecto a la funcion efectora, por ejemplo, a fin de potenciar la citotoxicidad dependiente de antlgeno mediada por celulas (CDAC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto puede conseguirse introduciendo una o mas sustituciones de aminoacidos en una region Fc del anticuerpo. Alternativa o adicionalmente, pueden introducirse restos de cistelna en la region Fc, permitiendo de ese modo la formacion de enlaces disulfuro entre cadenas en esta region. El anticuerpo homodimerico generado de este modo puede tener una capacidad de internalizacion mejorada y/o la destruction celular mediada por el complemento y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CDAC) aumentadas. Vease Caron et al., 1992, J. Exp Med. 176: 1191-1195 y Shopes, 1992, J. Immunol. 148: 2918-2922. Los anticuerpos homodimericos con actividad antitumoral mejorada tambien pueden prepararse usando reticuladores heterobifuncionales como se describe en Wolff et al., 1993, Cancer Research 53: 2560-2565. Como alternativa, un anticuerpo puede modificarse por ingenierla genetica que tiene regiones Fc duales y de ese modo puede tener la lisis de complemento y las capacidades de CDAC potenciadas. Vease Stevenson et al., 1989, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230.
Para incrementar la semivida en suero del anticuerpo, uno puede incorporar un epltopo de union al receptor de recuperation en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) como se describe en la Patente de los EE.Uu . n.° 5.739.277, por ejemplo. Como se usa en el presente documento, la expresion "epltopo de union al receptor de recuperacion" se refiere a un epltopo de la region Fc de una molecula de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4) que es responsable de aumentar la semivida en suero in vivo de la molecula de IgG.
(viii) Variantes de glicosilacion
Los anticuerpos en el CAF pueden estar glicosilados en posiciones conservadas en sus regiones constantes (vease, por ejemplo, Jefferis y Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128; Wright y Morrison, 1997, Tibtech 15: 26-32). Las cadenas laterales de oligosacaridos de las inmunoglobulinas influyen en la funcion de la protelna (vease, por ejemplo, Boyd et al., 1996, Mol Immunol 32: 1311-1318; Wittwe y Howard, 1990, Biochem 29: 4175-4180) y la interaction intramolecular entre las porciones de la glicoprotelna puede influir en la conformacion y la superficie tridimensional presentada de la glicoprotelna (Hefferis y Lund, citado anteriormente; Wyss y Wagner, 1996, Current Opin Biotech 7: 409-416.). Los oligosacaridos tambien pueden servir para dirigir una glicoprotelna dada hacia ciertas moleculas basandose en estructuras de reconocimiento especlficas. Por ejemplo, se ha notificado que en IgG agalactosilada, el resto de oligosacarido 'voltea' el espacio inter-CH2 y los restos de N-acetilglucosamina terminales estan disponibles para unirse a la protelna de union a manosa (Malhotra et al., 1995, Nature Med. 1: 237-243). La eliminacion por glicopeptidasa de los oligosacaridos de CAMPATH-1H (un anticuerpo de IgG1 monoclonal murino humanizado recombinante que reconoce el antlgeno CDw52 de linfocitos humanos) producido en celulas de ovario de hamster chino (CHO) dio como resultado una reduction completa de la lisis mediada por complemento (LCMC) (Boyd. et al., 1996, Mol Immunol. 32: 1311-1318), mientras que la eliminacion selectiva de restos de acido sialico usando neuraminidasa no dio como resultado ninguna perdida de DMCL. Tambien se ha notificado que la glicosilacion de anticuerpos influye en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CDAC). En particular, se notifico que las celulas CHO con expresion regulada por tetraciclina de p(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), una glicosiltransferasa que cataliza la formation de GlcNAc de bisection, tienen una actividad de CDAC mejorada (Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17: 176-180).
La glicosilacion de anticuerpos normalmente esta ligada a N o ligada a O. Ligada a N se refiere a la union del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de un resto de asparagina. Las secuencias de tripeptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoacido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la union enzimatica del grupo hidrato de carbono a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripeptidos en un polipeptido crea un sitio de glicosilacion potencial. Glicosilacion ligada a O se refiere a la union de uno de los azucares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoacido, mas habitualmente serina o treonina, aunque tambien puede usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.
Variantes de glicosilacion de anticuerpos son variantes en las que se altera el patron de glicosilacion de un anticuerpo. Por alteration se entiende la eliminacion de uno o mas restos de hidratos de carbono que se encuentren en el anticuerpo, la adicion de uno o mas restos de hidrato de carbono al anticuerpo, cambiando la composition de la glicosilacion (patron de glicosilacion), la extension de la glicosilacion, etc.
La adicion de sitios de glicosilacion al anticuerpo se consigue alterando convenientemente la secuencia de aminoacidos de forma que contenga una o mas de las secuencias de tripeptidos descritas anteriormente (para sitios de glicosilacion ligados a N). La alteracion tambien puede hacerse mediante la adicion de, o la sustitucion por, uno o mas restos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilacion ligados a O). De forma similar, la eliminacion de sitios de glicosilacion puede realizarse mediante la alteracion de aminoacidos dentro de los sitios de glicosilacion nativos del anticuerpo.
La secuencia de aminoacidos se altera por lo general mediante la alteracion de la secuencia de acido nucleico subyacente. Estos metodos incluyen, pero no se limitan a, el aislamiento de una fuente natural (en el caso de las variantes de secuencia de aminoacidos de origen natural) o la preparation mediante mutagenesis mediada por oligonucleotidos (o dirigida al sitio), mutagenesis por PCR y mutagenesis de casete de una variante preparada anteriormente o una version no variante del anticuerpo.
La glicosilacion (incluyendo el patron de glicosilacion) de los anticuerpos tambien pueden alterarse sin alterar la secuencia de aminoacidos o la secuencia de nucleotidos subyacente. La glicosilacion depende mucho de la celula hospedadora utilizada para expresar el anticuerpo. Puesto que el tipo de celula utilizada para la expresion de las glicoprotelnas recombinantes, por ejemplo, anticuerpos, como agentes terapeuticos potenciales es raramente la celula nativa, pueden esperarse variaciones significativas en el patron de glicosilacion de los anticuerpos. Vease, por ejemplo, Hse et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 9062-9070. Ademas de la election de las celulas hospedadoras, los factores que afectan a la glicosilacion durante la production recombinante de anticuerpos incluyen el modo de crecimiento, la formulation del medio, la densidad de cultivo, la oxigenacion, el pH, los esquemas de purification y similares. Se han propuesto diversos metodos para alterar el patron de glicosilacion conseguido en un organismo hospedador particular incluyendo la introduction o la sobreexpresion de ciertas enzimas implicadas en la produccion de oligosacaridos (Patentes de los EE.UU. n.° 5.047.335; 5.510.261; y 5.278.299). La glicosilacion, o ciertos tipos de glicosilacion, pueden eliminarse enzimaticamente de la glicoprotelna, por ejemplo usando endoglicosidasa H (Endo H). Ademas, la celula hospedadora recombinante puede modificarse mediante ingenierla genetica, por ejemplo, haciendola defectuosa en el procesamiento de ciertos tipos de polisacaridos. Estas y otras tecnicas similares son bien conocidas en la tecnica.
La estructura de la glicosilacion de anticuerpos puede analizarse facilmente mediante tecnicas convencionales de analisis de hidrato de carbonos, incluyendo cromatografla de lectina, la RMN, la espectrometrla de masas, la HPLC, la GPC, el analisis composicional de monosacaridos, la digestion enzimatica secuencial y la HPAEC-PAD, que utiliza cromatografla de intercambio anionico de alto pH para separar oligosacaridos basandose en la carga. Tambien se conocen metodos para la liberation de oligosacaridos con fines de analisis, e incluyen, sin limitation, el tratamiento enzimatico (habitualmente realizado usando peptido-N-glicosidasa F/endo-p-galactosidasa), la eliminacion usando ambiente alcalino duro para liberar principalmente estructuras ligadas a O y los metodos qulmicos usando hidrazina anhidra para liberar oligosacaridos ligados tanto a N como a O.
Exploracion de conjugados ligando-enlazador-farmaco
Los animales transgenicos y las estirpes celulares son particularmente utiles en la exploracion de conjugados farmacoenlazador-ligando (por ejemplo, conjugados anticuerpo farmaco (CAF)) para tratamientos profilacticos o terapeuticos de enfermedades o trastornos que implican la sobreexpresion de una protelna diana (por ejemplo, CD20, CD30, CD33, CD40, CD70, BCMA e Y de Lewis). La exploracion de conjugados farmaco-enlazador-ligando como CAF se ejemplifica en el presente documento.
Los animales transgenicos y las estirpes celulares son particularmente utiles en la exploracion de conjugados anticuerpo farmaco (CAF). La exploracion para encontrar un CAF util puede incluir la administracion de CAF candidato en un intervalo de dosis al animal transgenico y ensayar a diferentes puntos temporales para determinar el efecto o efectos del CAF sobre la enfermedad o trastorno que se esta evaluando. Como alternativa o adicionalmente, el farmaco puede administrarse antes de o simultaneamente con la exposicion a un inductor de la enfermedad, si es aplicable. El CAF candidato puede explorarse en serie y de forma individual o en paralelo con formato de exploracion de medio o alto rendimiento. La velocidad a la que un CAF puede explorarse para determinar su utilidad para tratamientos profilacticos o terapeuticos de enfermedades o trastornos solo esta limitada por la tasa de slntesis o la metodologla de exploracion, incluyendo la deteccion/medicion/analisis de los datos.
Se divulga en el presente documento un metodo de exploracion que comprende (a) trasplantar celulas de una estirpe celular estable de cancer de celulas renales en un animal no humano, (b) administrar un candidato a farmaco CAF al animal no humano y (c) determinar la capacidad del candidato para inhibir la formacion de tumores de la estirpe celular trasplantada.
Tambien se divulga un metodo de exploracion que comprende (a) poner en contacto celulas de una estirpe celular estable de enfermedad de Hodgkin con un candidato a farmaco c Af y (b) evaluar la capacidad del CAF candidato para bloquear la activacion por ligando de CD40.
Tambien se divulga un metodo de exploracion que comprende (a) poner en contacto celulas de una estirpe celular estable de la enfermedad de Hodgkin con un candidato a farmaco CAF y (b) evaluar la capacidad del CAF candidato para inducir la muerte celular. En una realizacion se evalua la capacidad del CAF candidato para inducir la apoptosis.
Tambien se divulga un metodo de exploracion que comprende (a) trasplantar celulas de una estirpe celular estable de cancer en un animal no humano, (b) administrar un candidato a farmaco CAF al animal no humano y (c) determinar la capacidad del candidato para inhibir la formacion de tumores a partir de la estirpe celular trasplantada.
Tambien se divulga un metodo de exploracion que comprende (a) poner en contacto celulas de una estirpe celular estable de cancer con un candidato a farmaco CAF y (b) evaluar la capacidad del CAF candidato para inducir la muerte celular. En una realizacion se evalua la capacidad del CAF candidato para inducir la apoptosis.
En un ejemplo, se exploran CAF candidatos administrandolos al animal transgenico en un intervalo de dosis y evaluando la respuesta fisiologica del animal a los compuestos en el tiempo. La administracion puede ser oral o por inyeccion adecuada, dependiendo de la naturaleza qulmica del compuesto que se evalua. En algunos casos, puede ser apropiado administrar el compuesto conjuntamente con co-factores que potenciarlan la eficacia del compuesto. Si se usan estirpes celulares derivadas de los animales transgenicos objeto para la exploracion de compuestos utiles en el tratamiento de diversos trastornos, los compuestos de ensayo se anaden al medio de cultivo celular en un momento apropiado y la respuesta celular al compuesto se evalua a lo largo del tiempo usando los ensayos bioqulmicos y/o histologicos apropiados. En algunos casos, puede ser apropiado aplicar el compuesto de interes al medio de cultivo conjuntamente con co-factores que potenciarlan la eficacia del compuesto.
Por tanto, en el presente documento se proporcionan ensayos para la identificacion de conjugados farmaco-enlazadorligando (tales como CAF) que se dirigen y se unen especlficamente a una protelna diana, la presencia de la cual se correlaciona con la funcion celular anormal y en la patogenesis de la proliferacion y/o diferenciacion celular que se relaciona causalmente con el desarrollo de tumores.
Para identificar compuestos inhibidores del crecimiento que se dirigen especlficamente a un antlgeno de interes, pueden explorarse compuestos que inhiban el crecimiento de las celulas cancerosas que sobreexpresan el antlgeno de interes derivado de animales transgenicos, puede realizarse el ensayo descrito en la Patente de los EE.UU. n.° 5.677.171. De acuerdo con este ensayo, las celulas cancerosas que sobreexpresan el antlgeno de interes se cultivan en una mezcla 1:1 de F12 y medio DMEM complementado con suero bovino fetal al 10 %, glutamina y penicilina estreptomicina. Las celulas se siembran en placas a 20.000 celulas en una placa de cultivo celular de 35°mm (2 ml/35 mm de plato) y el compuesto de ensayo se anade a diversas concentraciones. Despues de seis dlas, el numero de celulas, en comparacion con las celulas no tratadas se conto usando un contador de celulas COULTER™ electronico. Los compuestos que inhiben el crecimiento celular en aproximadamente un 20 a un 100 % o en aproximadamente un 50 a un 100 % pueden seleccionarse como compuestos inhibidores del crecimiento.
Para seleccionar compuestos que induzcan la muerte celular, puede evaluarse, con respecto al control, la perdida de integridad de la membrana tal como se indica mediante, por ejemplo, captacion de PI, azul de tripano o 7AAD. El ensayo de captacion de PI utiliza celulas aisladas del tejido tumoral de interes de un animal transgenico. De acuerdo con este ensayo, las celulas se cultivan en medio de Eagle modificado por Dulbecco (D-MEM):F-12 de Ham (50:50) complementado con FBS inactivado por calor al 10 % (Hyclone) y L-glutamina 2°mM. Por tanto, el ensayo se realiza en ausencia de complemento y celulas efectoras inmunes. Las celulas se siembran a una densidad de 3 * 106 por plato en platos de 100 * 20°mm y se deja que se unan durante la noche. Despues, el medio se retira y se reemplaza por medio recien preparado solo o medio recien preparado que contiene diversas concentraciones del compuesto. Las celulas se incuban durante un periodo de tiempo de 3 dlas. Despues de cada tratamiento, las monocapas se lavan con PBS y se separan mediante tripsinizacion. Las celulas se centrifugan a 1200 rpm durante 5 minutos a 4 °C, el sedimento se vuelve a suspender en 3 ml de tampon de union a Ca2+ frlo (Hepes 10°mM, pH 7,4, NaCl 140°mM, CaCl2 2,5°mM) y se divide en allcuotas en tubos de 12 * 75°mm tapados con tamiz de 35°mm (1 ml por tubo, 3 tubos por grupo de tratamiento) para retirar grumos de celulas. Despues, los tubos reciben PI (10 pg/ml). Las muestras pueden analizarse usando un citometro de flujo FACScan™ y software FACSCONVERT™ CellQuest (Becton Dickinson). Los compuestos que inducen niveles estadlsticamente significativos de muerte celular segun se determina por la captacion de PI pueden seleccionarse como compuestos que inducen la muerte celular.
Con el fin de seleccionar compuestos que induzcan la apoptosis, se realiza un ensayo de union a anexina usando celulas del tejido tumoral de interes del animal transgenico. Las celulas se cultivan y se siembran en placas como las analizadas en el parrafo anterior. Despues, el medio se retira y se reemplaza por medio recien preparado solo o medio recien preparado que contiene 10 pg/ml del conjugado anticuerpo farmaco (CAF). Despues de un periodo de incubacion de tres dlas, las monocapas se lavan con PBS y se separan mediante tripsinizacion. Despues, las celulas se centrifugan, se vuelven a suspender en tampon de union de Ca2+ y se dividen en allcuotas en tubos como los analizados anteriormente para el ensayo de la muerte celular. Los tubos reciben anexina marcada (por ejemplo, anexina V-FITC) (1 pg/ml). Las muestras pueden analizarse usando un citometro de flujo FACScan™ y software FACSCONVERT™ CellQuest (Becton Dickinson). Los compuestos que inducen niveles estadlsticamente significativos de union a anexina con respecto al control se seleccionan como compuestos inductores de la apoptosis.
Ensayos de proliferacion celular in v itro
En general, la actividad citotoxica o citostatica de un conjugado farmaco-enlazador-ligando, tal como un conjugado anticuerpo farmaco (CAF), se mide: exponiendo celulas de mamlfero que tengan protelnas receptoras para el anticuerpo del conjugado en un medio de cultivo celular; cultivando las celulas durante un periodo de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 5 dlas; y midiendo la viabilidad celular. Se usan ensayos celulares in vitro para medir la viabilidad (proliferacion), la citotoxicidad y la induccion de apoptosis (activacion de las caspasas) de un conjugado farmaco-enlazador-ligando. La exploracion de conjugados farmaco-enlazador-ligando como se los CAF se ejemplifica en el presente documento.
La potencia in vitro de los conjugados anticuerpo farmaco se mide mediante un ensayo de proliferacion celular (veanse los ejemplos). El ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® es un metodo de ensayo homogeneo disponible en el mercado (Promega Corp., Madison, WI), basado en la expresion recombinante de luciferasa de Coleoptera (Patente de los EE.UU. n.° 5.583.024; 5.674.713 y 5.700.670). Este ensayo de proliferacion celular determina el numero de celulas viables en cultivo basandose en la cuantificacion del ATP presente, un indicador de las celulas metabolicamente activas (Crouch et al., 1993, J. Immunol Meth. 160: 81-88, Patente de los EE.UU. n.° 6.602.677). El ensayo CellTiter-Glo® se realiza en formato de 96 pocillos, por lo que es susceptible de exploracion automatizada de alto rendimiento (HTS) (Cree et al. (1995) Anticancer Drugs 6: 398-404). El procedimiento de ensayo homogeneo implica anadir el reactivo individual (Reactivo CellTiter-Glo®) directamente a las celulas cultivadas en medio complementado con suero. No son necesarios el lavado de celulas, la retirada del medio ni las etapas de pipeteado multiple. El sistema detecta tan solo 15 celulas/pocillo en un formato de 384 pocillos en 10 minutos despues de la adicion de reactivo y la mezcla. Las celulas pueden tratarse continuamente con CAF o pueden tratarse y separarse del CAF. Generalmente, las celulas tratadas brevemente, es decir, durante 3 horas, muestran los mismos efectos de potencia que las celulas tratadas de forma continua.
El formato "anadir-mezclar-medir" homogeneo da como resultado la lisis celular y la generacion de una senal luminiscente proporcional a la cantidad de ATP presente. La cantidad de ATP es directamente proporcional al numero de celulas presentes en el cultivo. El Ensayo CellTiter-Glo® genera una senal luminiscente "de tipo brillo", producida por la reaccion de la luciferasa, que tiene una semivida generalmente superior a cinco horas, dependiendo del tipo de celula y del medio utilizados. Las celulas viables se reflejan en unidades de luminiscencia relativa (ULR). El sustrato, la luciferina de escarabajo, es descarboxilada oxidativamente por la luciferasa de luciernaga recombinante con conversion simultanea de ATP en AMP y generacion de fotones. La semivida extendida elimina la necesidad de utilizar inyectores de reactivos y proporciona flexibilidad para el procesamiento en modo continuo o por lotes de multiples placas. Este ensayo de proliferacion celular puede usarse con diversos formatos de multiples pocillos, por ejemplo, formatos de 96 o 384 pocillos. Los datos pueden registrarse mediante un luminometro o un dispositivo de formacion de imagenes por camara CCD. Los resultados de la luminiscencia se presentan como unidades de luz relativa (ULR), medidas a lo largo del tiempo.
Luciferasa
ATP Luciferina+ 0 2 -------------- Oxiluciferina AMP PPi C 02 luz
. Mg+2
Los efectos anti-proliferativos de los conjugados anticuerpo farmaco pueden medirse mediante el ensayo de destruccion celular in vitro y de proliferacion celular anterior contra diferentes estirpes celulares de tumor de mama.
Aclaramiento plasmatico y estabilidad in v iv o
El aclaramiento plasmatico farmacocinetico y la estabilidad de los conjugados farmaco-enlazador-ligando, tales como los CAF, pueden investigarse en ratas y macacos a lo largo del tiempo. La exploration de conjugados farmacoenlazador-ligando como los CAF se ejemplifica en el presente documento.
Toxicidad en roedores
Los conjugados anticuerpo farmaco y un control CAF-menos, "vehlculo", se evaluan en un modelo de toxicidad aguda en rata. La toxicidad del CAF se investiga mediante el tratamiento de ratas Sprague-Dawley macho y hembra con el CAF y la posterior inspection y analisis de los efectos en diversos organos. Las observaciones globales incluyen los cambios en el peso corporal y los signos de lesiones y hemorragias. Los parametros de patologla cllnica (hematologla y qulmica de suero), la histopatologla y la necropsia se realizan en animales tratados. Se considera que la perdida de peso o el cambio de peso con respecto a los animales tratados solamente con vehlculo, en los animales despues del tratamiento con CAF es un indicador global y general de toxicidad sistemica o localizada.
La hepatotoxicidad se mide por las enzimas hepaticas elevadas, los numeros aumentados de formas mitoticas y apoptoticas y la necrosis de los hepatocitos. La toxicidad hematolinfoide se observa por el agotamiento de leucocitos, principalmente granulocitos (neutrofilos) y/o plaquetas y la implication de los organos linfoides, es decir, la atrofia o la actividad apoptotica. La toxicidad tambien se observa por lesiones del tracto gastrointestinal, tales como el aumento del numero de formas mitoticas y apoptoticas y la enterocolitis degenerativa.
Las enzimas indicativas de lesion hepatica que se estudian incluyen:
AST (aspartato aminotransferasa)
- Localization: citoplasmica, hlgado, corazon, musculo esqueletico, rinon
- Relation hlgado:plasma de 7000:1
- T1/2: 17 h
ALT (alanina aminotransferasa)
- Localizacion: citoplasmica; hlgado, rinon, corazon, musculo esqueletico
- Relacion hlgado:plasma de 3000:1
- T1/2: 42 horas; variation diurna
GGT (g-glutamil transferasa)
- Localizacion: membrana plasmatica de las celulas con alta capacidad de absorcion o de secretion; hlgado, rinon, intestino
- Factor predictivo pobre de lesion hepatica; habitualmente elevada en los trastornos de las vlas biliares
Toxicidad/Seguridad en macacos
Al igual que en el estudio de toxicidad/seguridad en rata, los macacos se tratan con CAF seguido de mediciones de enzimas hepaticas e inspeccion y analisis de los efectos en diversos organos. Las observaciones globales incluyen los cambios en el peso corporal y los signos de lesiones y hemorragias. Los parametros de patologla cllnica (hematologla y qulmica de suero), la histopatologla y la necropsia se realizan en animales tratados.
Sfntesis de los compuestos
Los compuestos a modo de ejemplo y conjugados a modo de ejemplo pueden fabricarse usando los procedimientos de slntesis que se esbozan a continuation en los Esquemas 5-16. Como se describe en mas detalle a continuation, los compuestos a modo de ejemplo o conjugados a modo de ejemplo pueden prepararse convenientemente usando un enlazador que tenga un sitio reactivo para la union al farmaco y al ligando. En un aspecto, un enlazador tiene un sitio reactivo que tiene un grupo electrofilo que es reactivo a un grupo nucleofilo presente en un ligando, tal como, pero no limitado a un anticuerpo. Los grupos nucleofilos utiles en un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, los grupos sulfhidrilo, hidroxilo y amino. El heteroatomo del grupo nucleofilo de un anticuerpo es reactivo a un grupo electrofilo en un enlazador y forma un enlace covalente con una unidad de enlazador. Los grupos electrofilos utiles incluyen, pero no se limitan a, los grupos maleimida y haloacetamida. El grupo electrofilo proporciona un sitio conveniente para la union de anticuerpos.
En otro ejemplo, un enlazador tiene un sitio reactivo que tiene un grupo nucleofilo que es reactivo a un grupo electrofilo presente en un anticuerpo. Los grupos electrofilos utiles en un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, los grupos carbonilo aldehldo y cetona. El heteroatomo de un grupo nucleofilo de un enlazador puede reaccionar con un grupo electrofilo en un anticuerpo y formar un enlace covalente con una unidad de anticuerpo. Los grupos nucleofilos utiles en un enlazador incluyen, pero no se limitan a, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida. El grupo electrofilo en un anticuerpo proporciona un sitio conveniente para la union a un enlazador.
Los grupos funcionales de acido carboxllico y los grupos funcionales de cloroformiato son tambien sitios reactivos utiles para un enlazador, ya que pueden reaccionar con grupos amino secundarios de un farmaco para formar un enlace amida. Tambien es util como un sitio reactivo un grupo funcional carbonato en un enlazador, tal como, pero no limitado a carbonato de p-nitrofenilo, que puede reaccionar con un grupo amino de un farmaco, tal como, pero no limitado a, N-metil valina, para formar un enlace carbamato. Normalmente, los farmacos a base de peptidos pueden prepararse mediante la formacion de un enlace peptldico entre dos o mas aminoacidos y/o fragmentos de peptidos. Dichos enlaces peptldicos pueden prepararse, por ejemplo, de acuerdo con el metodo de slntesis en fase llquida (vease Schroder y Lubke, "The Peptides", volumen 1, pags. 76-136, 1965, Academic Press) que es bien conocido en el campo la qulmica de peptidos.
La slntesis de un extensor ilustrativo que tiene un grupo maleimida electrofilo se ilustra a continuacion en los Esquemas 8-9. En el Esquema 10 se describen metodos de slntesis generales utiles para la slntesis de un enlazador. El Esquema 11 muestra la construccion de una unidad de enlazador que tiene un grupo val-cit, un grupo maleimida electrofilo y un grupo espaciador autodestructivo PAB. El Esquema 12 representa la slntesis de un enlazador que tiene un grupo phelys, un grupo maleimida electrofilo, con y sin el grupo espaciador autodestructivo PAB. El Esquema 13 presenta un esbozo general para la slntesis de un compuesto de farmaco-enlazador, mientras que el Esquema 14 presenta una via alternativa para preparar un compuesto de farmaco-enlazador. El Esquema 15 representa la slntesis de un enlazador ramificado que contiene un grupo BHMS. El Esquema 16 esboza la union de un anticuerpo a un compuesto de farmaco-enlazador para formar un conjugado farmaco-enlazador-anticuerpo y el Esquema 14 ilustra la slntesis de conjugados farmaco-enlazador-anticuerpo que tienen, por ejemplo, pero sin limitacion, 2 o 4 farmacos por anticuerpo.
Como se describe en mas detalle a continuacion, los conjugados a modo de ejemplo se preparan convenientemente usando un enlazador que tiene dos o mas sitios reactivos para la union al farmaco y a un ligando. En un aspecto, un enlazador tiene un sitio reactivo que tiene un grupo electrofilo que es reactivo a un grupo nucleofilo presente en un ligando, tal como un anticuerpo. Los grupos nucleofilos utiles en un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, los grupos sulfhidrilo, hidroxilo y amino. El heteroatomo del grupo nucleofilo de un anticuerpo es reactivo a un grupo electrofilo en un enlazador y forma un enlace covalente con una unidad de enlazador. Los grupos electrofilos utiles incluyen, pero no se limitan a, los grupos maleimida y haloacetamida. El grupo electrofilo proporciona un sitio conveniente para la union de anticuerpos.
En otro ejemplo, un enlazador tiene un sitio reactivo que tiene un grupo nucleofilo que es reactivo a un grupo electrofilo presente en un ligando, tal como un anticuerpo. Los grupos electrofilos utiles en un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, los grupos carbonilo aldehldo y cetona. El heteroatomo de un grupo nucleofilo de un enlazador puede reaccionar con un grupo electrofilo en un anticuerpo y formar un enlace covalente con una unidad de anticuerpo. Los grupos nucleofilos utiles en un enlazador incluyen, pero no se limitan a, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida. El grupo electrofilo en un anticuerpo proporciona un sitio conveniente para la union a un enlazador.
Un farmaco que contiene oxido de arsina aromatico puede unirse directamente a una unidad de ligando que contiene ditioles proximales para formar estructuras clclicas arsina-ditiol estables.
Slntesis de restos de farmaco
Normalmente, los farmacos basados en peptidos pueden prepararse mediante la formacion de un enlace peptldico entre dos o mas aminoacidos y/o fragmentos de peptidos. Dichos enlaces peptldicos pueden prepararse, por ejemplo, de acuerdo con el metodo de slntesis en fase llquida (vease E. Schroder y K. Lubke, "The Peptides", volumen 1, pags.
76-136, 1965, Academic Press) que es bien conocido en el campo de la qulmica de peptidos.
Los restos de farmaco de auristatina/dolastatina pueden prepararse de acuerdo con los metodos generales de: Patente de los EE.UU. n.° 5.635.483; Patente de los EE.UU. n.° 5.780.588; Pettit et al., 1989, J. Am. Chem. Soc. 111: 5463­ 5465; Pettit et al., 1998, Anticancer Drug Design 13: 243-277; y Pettit et al., 1996, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15: 859-863.
En un ejemplo, un medicamento se prepara combinando aproximadamente un equivalente estequiometrico de un dipeptido y un tripeptido, preferentemente en una reaccion en una sola etapa en condiciones de condensacion adecuadas. Este enfoque se ilustra en los Esquemas 5-7, a continuacion.
El Esquema 5 ilustra la slntesis de una unidad de tripeptido N-terminal F, que es un intermedio util para la slntesis de los compuestos del farmaco de la Formula Ib.
Esquem a 5
Figure imgf000075_0001
Como se ilustra en Esquema 5, un aminoacido protegido A (donde GP representa un grupo protector de amina, R4 se selecciona entre hidrogeno, alquilo Ci-Cs, carbociclo C3-C8, -O-(alquilo Ci-Cs), arilo, X1-arilo, X1-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8, X1-(heterociclo C3-C8) y R5 se selecciona entre H y metilo; o R4 y R5 juntos, tienen la formula -(CRaRb)n en la que Ra y Rb se seleccionan independientemente entre hidrogeno, alquilo C1-C8 y carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre 2, 3 , 4 , 5 y 6 y forma un anillo con el atomo de carbono al que estan unidos) se acopla a ester de t-butilo B (donde R6 se selecciona entre -H y -alquilo C1-C8 y R7 se selecciona entre hidrogeno, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, -O-(alquilo C1-C8), arilo, X1-arilo, X1-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y X1-(heterociclo C3-C8)) en condiciones de acoplamiento adecuadas, por ejemplo, en presencia de PyBrop y diisopropiletilamina o usando DCC (vease, por ejemplo, Miyazaki et. al., 1995, Chem. Pharm. Bull. 43 (10): 1706-1718).
Los grupos protectores adecuados GP y los metodos de slntesis adecuados para proteger un grupo amino con un grupo protector son bien conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Greene y Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, segunda edicion, 1991, John Wiley & Sons. Son aminoacidos protegidos a modo de ejemplo A: GP-Ile y, en particular, GP-Val, mientras que otros aminoacidos protegidos adecuados incluyen, sin limitacion: GP-ciclohexilglicina, GP-ciclohexilalanina, acido GP-aminociclopropano-1-carboxllico, acido GP-aminoisobutlrico, GP-fenilalanina, GP-fenilglicina y GP-terc-butilglicina. Z es un grupo protector a modo de ejemplo. Fmoc es otro grupo protector a modo de ejemplo. Un t-butil ester B a modo de ejemplo es ester t-butllico de dolaisoleulna.
El dipeptido C puede purificarse, por ejemplo, usando cromatografla y posteriormente se desprotege, por ejemplo, usando H2 y Pd-C al 10 % en etanol cuando GP es benciloxicarbonilo o usando dietilamina para la elimination de un grupo protector Fmoc. La amina resultante D forma facilmente un enlace peptldico con un aminoacido BB (en el que R1 se selecciona entre -H, -alquilo C1-C8 y -carbociclo C3-C8; y R2 se selecciona entre -H y -alquilo C1-C8 o R1 y R2 unidos, tienen la formula -(CRaRb)n- en la que Ra y Rb se seleccionan independientemente entre -H, -alquilo C1-C8 y -carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre 2, 3, 4, 5 y 6 y forman un anillo con el atomo de nitrogeno al que estan unidos y R3 se selecciona entre hidrogeno, alquilo C1-C8 , C3- C8 carbociclo, -O-(alquilo C1-C8), arilo, X1-arilo, X1-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y X1-(heterociclo C3-C8)). Los N,N-dialquilaminoacidos son aminoacidos a modo de ejemplo para BB, tales como N,N-dimetilvalina disponible en el mercado. Otros N,N-dialquilaminoacidos puede prepararse por bis-alquilacion reductora usando procedimientos conocidos (vease, por ejemplo, Bowman et al., 1950, J. Chem. Soc.
1342-1340). Fmoc-Me-L-Val y Fmoc-Me-L-glicina son dos aminoacidos a modo de ejemplo BB utiles para la slntesis de derivados de N-monoalquilo. La amina D y el aminoacido BB reaccionan para proporcionar el tripeptido E usando un reactivo de acoplamiento DEPC con trietilamina como base. El grupo C-terminal protector de E posteriormente se desprotege con HCl para proporcionar el compuesto tripeptidico de formula F.
Los ejemplos ilustrativos de la metodologla de acoplamiento con DEPC y la metodologla de acoplamiento con PyBrop del Esquema 5 se describen a continuacion en el Procedimiento General A y el Procedimiento General B, respectivamente. La metodologla ilustrativa para la desproteccion de una amina protegida con Cbz por hidrogenacion catalltica se describe a continuacion en el Procedimiento General C.
Procedimiento general A: Slntesis de peptidos usando DEPC
El aminoacido o peptido N-protegido o N,N-disustituido D (1,0 equiv.) y una mina BB (1,1 equiv.) se diluyen con un disolvente organico aprotico, tal como diclorometano (0,1 a 0,5 M). Despues, se anade una base organica tal como trietilamina o diisopropiletilamina (1,5 equiv.), seguida de DEPC (1,1 equiv.). La solucion resultante se agita, preferentemente en atmosfera de argon, durante hasta 12 horas mientras se controla mediante HPLC o TLC. El disolvente se retira al vaclo a temperatura ambiente y el producto en bruto se purifica usando, por ejemplo, HPLC o cromatografla en columna ultrarrapida (columna de gel de sllice). Las fracciones pertinentes se combinan y se concentran al vaclo para proporcionar tripeptido E que se seca al vaclo durante la noche.
Procedimiento general B: slntesis de peptidos usando PyBrop
El aminoacido B (1,0 eq), que tiene opcionalmente un grupo protector de carboxilo, se diluye con un disolvente organico aprotico tal como diclorometano o DME para proporcionar una solucion de una concentration de entre 0,5 y 1,0°mM, despues, se anade diisopropiletilamina (1,5 equiv.). Se anade aminoacido A protegido con Fmoc- o CBZ (1,1 equiv.) en forma de un solido en una portion, despues, se anade PyBrop (1,2 equiv.) a la mezcla resultante. La reaction se controla por TLC o HPLC, seguido de un procedimiento de tratamiento similar al descrito en el procedimiento general A.
Procedimiento general C: Elimination de Z a traves de hidrogenacion catalltica
Se diluye el aminoacido o peptido C protegido con CBZ con etanol para proporcionar una solucion de una concentracion de entre 0,5 y 1,0°mM en un recipiente adecuado, tal como un matraz de fondo redondo de pared gruesa. Se anade paladio al 10 % sobre carbon (5-10 % p/p) y la mezcla de reaccion se coloca en una atmosfera de hidrogeno. El progreso de la reaccion se vigila mediante HPLC y se completa generalmente en el plazo de 1 a 2 h. La mezcla de reaccion se filtra a traves de un lecho prelavado de Celite y el Celite se lava de nuevo con un disolvente organico polar, tal como metanol despues de la filtration. La solucion de eluyente se concentra al vaclo para proporcionar un residuo que se diluye con un disolvente organico, preferentemente tolueno. El disolvente organico se retira despues al vaclo para proporcionar la amina desprotegida C.
El Esquema 6 muestra un metodo util para la fabrication de un dipeptido C-terminal de formula K y un metodo para el acoplamiento del dipeptido de formula K con el tripeptido de formula F para fabricar compuestos de farmaco de Formula Ib. Este metodo es aplicable a los restos de reemplazo de fenilalanina H que tienen un grupo protector de carboxilo labil en medio acido, preferentemente el grupo oxibencilo.
Esquema 6
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El dipeptido K puede prepararse facilmente por condensation del aminoacido modificado N-protegido GP-Dolaprolna (G) con una amina de formula H usando agentes de condensacion bien conocidos en la qulmica de peptidos, tales como, por ejemplo, DEPC en presencia de trietilamina, tal como se muestra en los Esquemas 5 y 6. Los grupos N-protegidos adecuados para Dolaprolna incluyen, pero no se limitan a, un grupo protector Fmoc.
El dipeptido de formula K despues puede acoplarse con un tripeptido de formula F usando el Procedimiento general D para hacer los compuestos de farmacosj protegidos con Fmoc de formula L que posteriormente pueden desprotegerse usando el procedimiento general E a fin de proporcionar los compuestos de farmacosj de formula (Ib).
Procedimiento general D: Slntesis de farmaco
Una mezcla de dipeptido K (1,0 equiv.) y tripeptido F (1 equiv.) se diluye con un disolvente organico aprotico, tal como diclorometano, para formar una solution 0,1 M, despues, se anade un acido fuerte, tal como acido trifluoroacetico (1/2 v/v) y la mezcla resultante se agita en una atmosfera de nitrogeno durante dos horas a 0 °C. La reaction puede controlarse usando TLC o, preferentemente, HPLC. El disolvente se retira al vaclo y el residuo resultante se seca azeotropicamente dos veces, preferentemente usando tolueno. El residuo resultante se seca a alto vaclo durante 12 h y despues se diluye con un disolvente organico aprotico, tal como diclorometano. Despues, se anade una base organica tal como trietilamina o diisopropiletilamina (1,5 equiv.), seguida de PyBrop (1,2 equiv.) o DEPC (1,2 equiv.) dependiendo del grupo funcional del resto. La mezcla de reaccion se controla por TLC o HPLC y tras la finalization, la reaccion se somete a un procedimiento de tratamiento similar o identico al descrito en el procedimiento general A.
Procedimiento General E: Elimination de Fmoc usando dietilamina
Un farmaco L protegido con Fmoc se diluye con un disolvente organico aprotico tal como diclorometano y a la solucion resultante se le anadio dietilamina v/v). El progreso de la reaccion se controla por TLC o HPLC y normalmente se completa en 2 h. La mezcla de reaccion se concentra al vaclo y el residuo resultante se seca azeotropicamente, preferentemente con tolueno, despues se seca a alto vaclo para proporcionar farmaco Ib que tiene un grupo amino desprotegido. Por tanto, el metodo anterior es util para farmacos que pueden usarse.
Como alternativa, pueden prepararse compuestos de farmaco convenientemente mediante slntesis de peptidos en fase solida usando la qulmica de Fmoc convencional bien conocida en la tecnica (vease, por ejemplo, catalogo de Novabiochem® 2006/2007, Notas de slntesis) como se muestra en el Esquema 6 bis (a continuacion). Pueden prepararse aminoacidos protegidos con Fmoc a partir de aminoacidos no protegidos usando, por ejemplo, Fmoc-OSu a traves de procedimientos bien establecidos (vease, por ejemplo, Greene y Wuts, Protective Groups in Organic Slntesis, segunda edicion, 1991, John Wiley & Sons, p. 506).
Esquema 6a. Via de sintesis en fase solida
Figure imgf000078_0001
Los aminoacidos no estan disponibles en el mercado pre-cargados en una resina labil en medio acido apropiado, preferentemente resina de 2-clorotritilo, pueden cargarse en resina de cloruro de 2-clorotritilo como se ha descrito en el Procedimiento general SP(a). La carga puede determinarse mediante el ensayo de cuantificacion de Fmoc espectrofotometrico. Los niveles de carga (mmol/g) de aminoacidos disponibles en el mercado pre-cargados en resina de clorotritilo pueden determinarse como se ha descrito en el Procedimiento general SP(b). Despues, los peptidos entonces pueden ensamblarse en la resina cargada con el primer aminoacido mediante el acoplamiento de Fmoc-Dolaproina usando un agente de acoplamiento apropiado, preferentemente HATU/DIEA, seguido de desproteccion de Fmoc y posterior acoplamiento de tripeptido Fmoc-MeVal-Val-Dil. La rutina de acoplamiento en fase solida esta bien establecida en la tecnica y se describe en el Procedimiento General SP(c). La desproteccion final de los peptidos y la escision de la resina puede realizarse facilmente siguiendo el Procedimiento General SP(d).
Procedimiento General SP(a). Carga de la resina
Se suspende Fmoc-aminoacido (0,84°mmol) en CH2O 2 anhidro (4 ml) y DIEA (585 pl, 3,36°mmol, 4 equiv). La mezcla resultante se anade a una jeringa de 10 ml que contiene resina de cloruro de 2-Clorotritilo (500 mg, 0,70°mmol, 1,4°mmol/g). La mezcla se agita durante 6 horas a temperatura ambiente. Despues, la resina se filtra, se lava con DCM/MeOH/DlEA (17:2:1; 5 ml, 4 veces), MeOH (5 ml, 1 vez), DCM (5 ml, 2 veces), DMF (5 ml, 2 veces), DCM (5 ml, 2 veces), eter etilico (5 ml, 4 veces) y se seca al vacio durante 2 h. La resina se deja al vacio durante la noche para producir resina SP1.
La carga se determina mediante la cuantificacion de Fmoc. Una cantidad conocida de resina SP1 (4,4 mg) se pesa en un matraz aforado de 10 ml. Al matraz se le transfiere piperidina al 20 %/DMF (2 ml). La mezcla se deja escindir durante 1 h, con agitacion ocasional a mano. Al matraz se le transfiere DMF (8 ml) para llevar el volumen total a 10 ml. Se prepara una solucion de blanco con 10 ml, piperidina al 20 %/DMF en un matraz aforado de 10 ml. El espectrofotometro se pone a cero con la solucion de blanco. La absorbancia se midio a 301 nm y el nivel de carga viene dado por:
Carga (mmol/g) = A301 x 10 ml/7800 * peso
por la que A301 es la absorbancia a 301 nm, 7800 es el coeficiente de extincion del aducto de piperidina-fluorenona y peso es el peso de la resina utilizada en miligramos. La cuantificacion de Fmoc se realiza generalmente por duplicado.
Procedimiento General SP(b). Cuantificacion de Fmoc de resinas pre-cargadas disponibles en el mercado
Se disuelve Fmoc-Cl (259 mg, 1°mmol) en CH2Cl2 anhidro (2 ml) para hacer una solucion de trabajo 0,5 M. Esta solucion se transfiere a una jeringa de plastico de 3 ml que contiene resina de aminoacido-2-clorotritilo (0,86°mmol/g, 0,0215°mmol). La mezcla se agita durante 2 h. Despues, la resina se filtra y se lava con DMF (5 ml, 2 veces), CH2Cl2 (5 ml, 2 veces), eter etflico (5 ml, 2 veces) y se seco al vacfo durante 2 h. La resina se somete al ensayo de amina de Kaiser. Tras los resultados negativos (amina libre totalmente protegida) se realiza la cuantificacion de Fmoc para obtener un nivel de carga como se muestra en el Procedimiento General SP(a).
Procedimiento general SP(c). Acoplamiento de peptidos en fase solida usando HATU
Una solucion de piperidina al 20 % en DMF (5 ml) se anade a la jeringa que contiene resina SP1, y la mezcla se agita durante 2 h. Despues la resina se filtra, se lava con DMF (5 ml, 4 veces), DCM (5 ml, 4 veces), DMF (5 ml, 4 veces), DCM (5 ml, 4 veces), eter etflico (5 ml, 4 veces) y se seca al vacfo durante 2 h.
Se suspenden Fmoc-Dap (278 mg, 0,680°mmol) y HATU (259 mg, 0,680°mmol, 2 equiv.) en DMF anhidro (5 ml) y DIEA (237 pl, 1,36°mmol, 4 equiv.). La mezcla resultante se transfiere a la jeringa de plastico de 10 ml que contiene resina de H-aminoacido-2-clorotritilo (555,6 mg, 0,340°mmol). La mezcla se agita durante la noche, a temperatura ambiente. La finalizacion de la reaccion se determina mediante el ensayo de amina de Kaiser y el analisis por CLEM del material retirado por escision de una pequena cantidad de resina (usando TFA al 2 %/CH2Cl2). Despues se filtra la resina, se lava con DMF (5 ml, 4 veces), d Cm (5 ml, 4 veces), DMF (5 ml, 4 veces), DCM (5 ml, 4 veces), eter etflico (5 ml, 4 veces) y se seca al vacfo durante 2 h.
Una solucion de piperidina al 20 % en DMF (5 ml) se anade a la jeringa que contiene resina de Fmoc-Dap-aminoacido-2-clorotritilo y la mezcla se agita durante 2 h. La resina se filtra, se lava con DMF (5 ml, 4 veces), DCM (5 ml, 4 veces), DMF (5 ml, 4 veces), DCM (5 ml, 4 veces), eter etflico (5 ml, 4 veces) y se seca al vacfo durante 2 h.
Se suspenden Fmoc-MeVal-Val-Dil-OH (510 mg, 0,680°mmol, 2 equiv.) y HATU (259 mg, 0,680°mmol, 2 equiv.) en DMF anhidro (5-ml) y DIEA (237 pl, 1,70°mmol, 5 equiv.). La mezcla resultante se transfiere a la jeringa de plastico de 10 ml que contiene la resina H-Dap-aminoacido-2-clorotritilo. La mezcla se agita durante 6 h. La finalizacion de la reaccion se determina mediante analisis por CLEM del material retirado por escision de una pequena cantidad de resina (usando TFA al 2 %/CH2Cl2). Despues se filtra la resina, se lava con DMF (5 ml, 4 veces), DCM (5 ml, 4 veces), DMF (5 ml, 4 veces), DCM (5 ml, 4 veces), eter etflico (5 ml, 4 veces) y se seca al vacfo durante 2 h.
Procedimiento general SP(d). Desproteccion final y escision de la resina
Una solucion de piperidina al 20 % en DMF (5 ml) se anade a la jeringa que contiene resina de Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-Aminoacido-2-clorotritilo y la mezcla se agita durante 2 h. La resina se filtra, se lava con DMF (5 ml, 4 veces), DCM (5 ml, 4 veces), DMF (5 ml, 4 veces), DCM (5 ml, 4 veces), eter etflico (5 ml, 4 veces) y se seca al vacfo durante 2 h. El secado adicional puede lograrse, si es necesario, dejando la resina durante la noche al vacfo.
Una solucion de TFA al 2 %/CH2Cl2 (5 ml) se transfiere a una jeringa de plastico de 10 ml que contiene resina de MeVal-Val-Dil-DAP-Aminoacido-2-clorotritilo y la mezcla se agita, a temperatura ambiente, durante 5 minutos. El filtrado se recoge en un matraz de fondo redondo de 100 ml. El proceso se repite tres veces. El filtrado se evapora para dejar un solido de color blanco. Los peptidos Ib puede aislarse mediante HPLC preparativa.
Sfntesis de farmaco-enlazador
Para preparar un compuesto de farmaco-enlazador, el farmaco se hace reaccionar con un sitio reactivo en el enlazador. En general, el enlazador puede tener la estructura:
Figure imgf000079_0001
cuando tanto una unidad de espaciador (-Y-) como una unidad de extensor (-A-) estan presentes. Como alternativa, el enlazador puede tener la estructura:
Figure imgf000079_0002
cuando la unidad de espaciador (-Y-) esta ausente.
El enlazador tambien puede tener la estructura:
Figure imgf000080_0005
cuando tanto la unidad de extensor (-A-) como la unidad de espaciador (-Y-) estan ausentes.
El enlazador tambien puede tener la estructura:
Figure imgf000080_0006
cuando tanto la unidad de aminoacido (W) como la unidad de espaciador (y) estan ausentes.
En general, un enlazador adecuado tiene una unidad de aminoacido unida a una unidad de extensor opcional y una unidad de espaciador opcional. El sitio reactivo 1 esta presente en el extremo del espaciador y el sitio reactivo 2 esta presente en el extremo del extensor. Si una unidad de espaciador no esta presente, entonces el sitio reactivo 1 esta presente en el extremo C de la unidad de aminoacido.
En un ejemplo modo de ejemplo, el sitio reactivo n.° 1 es reactivo a un atomo de nitrogeno del farmaco y el sitio reactivo n.° 2 es reactivo a un grupo sulfhidrilo del ligando. Los sitios reactivos 1 y 2 pueden ser reactivos a diferentes grupos funcionales.
En otro ejemplo a modo de ejemplo, el sitio reactivo n.° 2 es reactivo a los grupos amino de las lisinas del ligando. En un aspecto de la invencion, el sitio reactivo n.° es
Figure imgf000080_0001
En otro aspecto, el sitio reactivo n.° 1 es
Figure imgf000080_0002
En otro aspecto el, el sitio reactivo n.° 1 es un carbonato de p-nitrofenilo que tiene la formula
Figure imgf000080_0003
En un aspecto, el sitio reactivo n.° 2 es un grupo aceptor de tiol. Los grupos aceptores de tiol adecuados incluyen los grupos halo-acetamida que tienen la formula
Figure imgf000080_0004
en la que X representa un grupo saliente, preferentemente O-mesilo, O-tosilo, -Cl, -Br o -I; o un grupo maleimida que tiene la formula
Figure imgf000081_0001
Pueden obtenerse enlazadores utiles a traves de fuentes comerciales, tales como Molecular BioSciences Inc. (Boulder, CO) o pueden prepararse como se resume en los Esquemas 8-10 a continuacion.
Figure imgf000081_0002
en el que X es -CH2- o -CH2OCH2-; y n es un numero entero que varfa ya sea de 0 a 10, cuando X es -CH2-; o de 1 a 10, cuando X es -CH2OCH2-.
El metodo mostrado en el Esquema 9 combina maleimida con un glicol en condiciones de Mitsunobu para hacer un extensor de maleimida polietilenglicol (vease, por ejemplo, ejemplo, Walker, 1995, J. Org. Chem. 60, 5352-5), seguido de instalacion de un grupo sitio reactivo de carbonato de p-nitrofenilo.
Figure imgf000082_0001
en el que E es -CH2- o -CH2OCH2-; y e es un numero entero que que varla de 0 a 8;
Como alternativa, pueden prepararse extensores de PEG-maleimida y PEG-haloacetamida como se describe por Frisch et al., 1996, Bioconjugate Chem. 7: 180-186.
El esquema 10 ilustra una slntesis general de una unidad de enlazador ilustrativa que contiene un grupo extensor de maleimida y, opcionalmente, un espaciador autodestructivo de eter de p-aminobencilo.
Esquem a 10
Figure imgf000082_0002
en el que Q es -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -halogeno, -nitro o -ciano; m es un numero entero que varla de 0 a 4; y n es un numero entero que varla de 0 a 10.
Pueden incorporarse extensores utiles en un enlazador usando los intermedios disponibles en el mercado de Molecular Biosciences (Boulder, CO) descritos a continuacion mediante la utilizacion de tecnicas conocidas de sfntesis organica.
Los extensores de formula (ilia) pueden introducirse en un enlazador haciendo reaccionar los siguientes intermedios con el extremo N de una unidad de aminoacido como se representa en los Esquemas 11 y 12:
Figure imgf000083_0001
en la que n es un numero entero que varfa de 1 a 10 y T es -H o -SO3Na;
Figure imgf000083_0002
Las unidades de extensor de formula (iiib) pueden introducirse en un enlazador haciendo reaccionar los siguientes intermedios con el extremo N de una unidad de aminoacido:
Figure imgf000084_0001
donde X es -Br o -I; y
Figure imgf000084_0002
Pueden introducirse unidades de extensor de formula (IV) en un enlazador haciendo reaccionar los siguientes intermedios con el extremo N de una unidad de aminoacido:
Figure imgf000084_0003
Pueden introducirse unidades de extensor de formula (Va) en un enlazador haciendo reaccionar los siguientes intermedios con el extremo N de una unidad de aminoacido:
Figure imgf000085_0003
Otros extensores utiles pueden sintetizarse de acuerdo con procedimientos conocidos. Pueden prepararse extensores de aminooxi de la formula que se muestra a continuacion mediante el tratamiento de haluros de alquilo con N-Bochidroxilamina de acuerdo con los procedimientos descritos en Jones et al., 2000, Tetrahedron Letters 41 (10): 1531­ 1533; y Gilon et al., 1967, Tetrahedron 23(11): 4441 -4447.
Figure imgf000085_0001
en la que -R17- se selecciona entre -alquileno C1-C10, -carbociclo C3-C8-, -O-(alquilo C1-C8)-, -arileno-, -alquilen C1-C10-arileno-, -arilen-alquileno C1-C10-, -alquilen C1-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C10-C10, -heterociclo C3-C8-, -alquileno C1-C10-(heterociclo C3-C8)-, -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -(CH2CH2O)r-,-(CH2CH2O)r-CH2-; y r es un numero entero que varfa de 1 a 10;
Los extensores de isotiocianato de la formula que se muestra a continuacion pueden prepararse a partir de cloruros del acido isotiocianatocarboxflico como se describe en Angew. Chem., 87(14): 517 (1975).
Figure imgf000085_0002
en la que -R17- es como se describe en el presente documento.
El esquema 11 muestra un metodo para obtener de un enlazador de dipeptido val-cit que tiene un extensor de maleimida y, opcionalmente, un espaciador autodestructivo de p-aminobenzoflo.
Figure imgf000086_0001
en la que Q es -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -halógeno, -nitro o -ciano; y m es un número entero que varía de 0 a 4.
El esquema 12 ilustra la slntesis de una unidad de enlazador de dipeptido phe-lys(Mtr) que tiene una unidad de extensor de maleimida y una unidad de espaciador autodestructiva de p-aminobencilo. El material de partida AD (Lys(MTR)) esta disponible en el mercado (Bachem, Torrance, CA) o puede prepararse de acuerdo con Dubowchik, et al., 1997 Tetrahedron Letters 38: 5257-60.
Figure imgf000087_0001
en el que Q es -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -halógeno, -nitro o -ciano; y m es un número entero que varía de 0 a 4.
Como se muestra en el Esquema 13, un enlazador puede hacerse reaccionar con un grupo amino de un compuesto de farmaco de formula (Ib) para formar un compuesto de farmaco-enlazador que contenga un grupo amida o carbamato, que une la unidad de farmaco a la unidad de enlazador. Cuando el sitio reactivo n.° 1 es un grupo de acido carboxllico, como en el enlazador AJ, la reaccion de acoplamiento puede realizarse usando HATU o PyBrop y una base de amina apropiada, dando como resultado un compuesto de farmaco-enlazador AK, que contiene un enlace amida entre la unidad de farmacos y la unidad de enlazador. Cuando el sitio reactivo n.° 1 es un carbonato, como en el enlazador AL, el enlazador puede acoplarse al farmaco usando HOBt en una mezcla de DMF/piridina para proporcionar un compuesto de farmaco-enlazador AM , que contiene un enlace carbamato entre la unidad de Farmaco y la unidad de enlazador.
Como alternativa, cuando el sitio reactivo n.° 1 es un buen grupo saliente, tal como en enlazador AN, el enlazador puede acoplarse con un grupo amino de un farmaco a traves de un proceso de sustitucion nucleofila para proporcionar un compuesto de farmaco-enlazador que tiene un enlace de amina (AO) entre la unidad de farmaco y la unidad de Enlazador.
Se representan metodos ilustrativos utiles para enlazar un farmaco a un ligando para formar un compuesto de farmacoenlazador, en el Esquema 13 y se esbozan en los procedimientos generales de G-H.
Figure imgf000088_0001
Procedimiento general G: Formación de amida usando HATU
Un farmaco (Ib) (1,0 equiv.) y un enlazador N-protegido que contiene un sitio reactivo de acido carboxllico (1,0 equiv.) se diluyen con un disolvente organico adecuado, tal como diclorometano y la solucion resultante se trata con HATU (1,5 equiv.) y una base organica, preferentemente piridina (1,5 equiv.). La mezcla de reaccion se deja en agitacion en una atmosfera inerte, preferentemente de argon, durante 6 horas, durante cuyo tiempo la mezcla de reaccion se controla usando HPLC. La mezcla de reaccion se concentra y el residuo resultante se purifico usando HPLC para producir la amida de formula AK .
Procedimiento H: Formacion de carbamato usando HOBt
Una mezcla de un enlazador AL que tiene un sitio reactivo de carbonato de p-nitrofenilo (1,1 equiv.) y farmaco (Ib) (1,0 equiv.) se diluyen con un disolvente organico aprotico, tal como DMF, para proporcionar una solucion que tiene una concentracion de 50-100°mM y la solucion resultante se trata con HOBt (0,2 equiv.) y se coloca en una atmosfera inerte, preferentemente de argon. La mezcla de reaccion se deja en agitacion durante 15 min, despues, una base organica, tal como piridina (1/4 v/v), se anade y el progreso de reaccion se controla usando HPLC. El enlazador se consume normalmente en el plazo de 16 h. La mezcla de reaccion se concentra al vaclo y el residuo resultante se purifica usando, por ejemplo, HPLC para proporcionar el carbamato AM .
Procedimiento General S: Formacion de enlace de amida entre el enlazador y el farmaco
Un enlazador que contiene acido carboxllico (30 mg) y anhidro DMF (10 pl) se coloca en una atmosfera inerte, preferentemente de argon, y se enfrla en hielo seco durante aproximadamente 5 min. A esta mezcla se le anade cloruro de oxalilo (1 ml) gota a gota mediante una jeringa. Normalmente, despues de unos minutos, la mezcla se deja calentar a temperatura ambiente y se deja durante 30 min con agitacion manual ocasional. Los productos volatiles se retiran a presion reducida. El residuo se vuelve a suspender en CH2O 2 anhidro (1 ml) y el disolvente se retira al vaclo. El residuo se seca durante la noche en bomba de vaclo para producir enlazador AN.
El cloruro de acilo AN se suspende en CH2O 2 anhidro (3 ml). Un farmaco Ib (0,006°mmol) y N,N-diisopropil-etilamina (4 pl, ~4 equiv.) se suspenden en CH2O 2 anhidro (100 pl) y la mezcla se enfrla en el bano de hielo normalmente durante aproximadamente 10 min. A esta mezcla, se le anaden 150 pl de cloruro de acilo en CH2O 2 (~1,1 equiv.) mediante una jeringa. Despues de 15 min en hielo, la mezcla de reaccion se deja calentar hasta temperatura ambiente y la agitacion continuo durante aproximadamente 2 horas mas. El progreso de la reaccion puede monitorizarse mediante RP-HPLC. Despues, el disolvente entonces se retira al vaclo. El residuo se suspende en DMSO (0,5 ml). Se anadio agua (100 pl) y despues de 0,5 h la mezcla se purifica, por ejemplo, usando HPLC preparativa para producir farmaco-enlazador AO.
Procedimiento General T: preparation de enlazador-farmaco de ester de N-hidroxisuccinimida
El esquema 13a representa un ejemplo de preparacion de compuestos de farmaco-enlazador AA2 que contienen esteres de N-hidroxisuccinimida a traves de la formacion de enlaces amida entre una unidad de farmaco y un enlazador. Este procedimiento es particularmente util para las unidades de farmacos que no contienen un grupo carboxllico libre o para farmacos que tienen un grupo carboxllico protegido como esteres labiles en medio acido, preferentemente un ester de dimetoxibencilo.
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Se diluyen farmaco (Ib) (1,0 equiv.) y un anhldrido clclico adecuado, preferentemente anhldrido glutarico (1,0 equiv.), con un disolvente organico adecuado, tal como diclorometano y la solucion resultante se trata con una base organica, preferentemente DIEA (3 equiv.). Se deja la mezcla de reaccion en agitacion en una atmosfera inerte, preferentemente de argon, durante 24 horas, tiempo durante el cual la mezcla de reaccion se controla usando HPLC. El producto de reaccion AA1 se alsla usando cromatografla de ultrarrapida sobre gel de sllice. El material AA1 secado al vaclo y carbonato de N,N'-disuccinimidilo (3 equiv.) se diluyen con un disolvente organico adecuado, tal como diclorometano y la solucion resultante se trata con una base organica, preferentemente DIEA (3 equiv.). Se deja la mezcla de reaccion en agitacion en una atmosfera inerte, preferentemente de argon, durante 24 horas, tiempo durante el cual la mezcla de reaccion se controla usando HPLC. El producto de reaccion AA2 se alsla mediante cromatografla ultrarrapida sobre gel de sllice. Si es necesario, el grupo protector de acido del farmaco-enlazador AA2 puede retirarse ahora mediante el tratamiento adecuado, preferentemente con TFA al 1 % en diclorometano para proporcionar ester de dimetoxibencilo.
Un metodo alternativo de preparacion de compuestos de farmaco-enlazador se esboza en el Esquema 14. Usando el metodo del Esquema 14, el farmaco se une a una unidad de enlazador parcial (ZA, por ejemplo), que no tiene una unidad de extensor unida. Esto proporciona intermedio AP, que tiene una unidad de aminoacido que tiene un extremo N protegido con Fmoc. El grupo Fmoc despues se retira y el intermedio de amina AQ resultante se une despues a una unidad de extensor a traves de una reaccion de acoplamiento catalizada usando PyBrop o DEPC. La construccion de los compuestos farmaco-enlazador que contienen o bien un extensor de bromoacetamida AR o un extensor de PEG maleimida AS como se ilustra en el Esquema 14.
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La aplicacion de esta estrategia general para la preparacion de enlazador-farmaco de ester de N-hidroxisuccinimida reactivo a lisinas se representa en el Esquema 14a.
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Procedimiento General U
Metodo alternativo de preparacion de enlazador-farmaco de ester de N-hidroxisuccinimida
El intermedio AQ (1 equiv.) se suspende en piridina y esta mezcla se anade gota a gota a la suspension de suberato de disuccinimidilo (5 eq) en piridina. Despues, la mezcla de reaccion se deja en agitacion en una atmosfera inerte, preferentemente de argon, durante aproximadamente 4 h, tiempo durante el cual el progreso de la reaccion se controla usando HPLC. Despues, la piridina se retira al vaclo, el residuo se suspende en un disolvente organico adecuado, tal como diclorometano y el farmaco-enlazador AQ1 se alsla usando cromatografla ultrarrapida sobre gel de sllice. Si es necesario, el grupo protector de carboxilo del farmaco puede retirarse ahora mediante el tratamiento adecuado, preferentemente con TFA al 1 % en diclorometano para proporcionar ester de dimetoxibencilo.
La metodologla util para la preparacion de una unidad de enlazador que contiene un espaciador ramificado se muestra en el Esquema 15.
y una unidad de bis(4-hidroximetil)estireno (BHMS). La slntesis del intermedio de BHMS (AW) se ha mejorado a partir de los procedimientos anteriores (vease, por ejemplo, la Publicacion Internacional WO 98/13059 de Firestone et al. y Crozet et al., 1985, Tetrahedron Lett. 26: 5133-5134) y utiliza como materiales de partida, (4-nitrobencil)fosfonato de dietilo (AT) disponible en el mercado y 2,2-dimetil-1,3-dioxan-5-ona (AU) disponible en el mercado. Los enlazadores AY y BA pueden prepararse a partir del intermedio AW usando la metodologla descrita en el Esquema 9.
Enlazadores dendrfticos
El enlazador puede ser un enlazador de tipo dendrltico para la union covalente de mas de un resto de farmaco a traves de un resto enlazador multifuncional ramificado, a un ligando, tal como, pero no limitado a un anticuerpo (vease, por ejemplo, Sun et al., 2002, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12: 2213-2215; Sun et al., 2003, Bioorganic & Medicinal Chemistry 11: 1761-1768). Los enlazadores dendrlticos pueden aumentar la relacion molar de farmaco a anticuerpo, es decir, la carga, que se relaciona con la potencia del conjugado farmaco-enlazador-ligando. Por tanto, cuando un anticuerpo modificado por ingenierla genetica con cistelna soporta un solo grupo cistelna tiol reactivo, una multitud de restos de farmaco pueden unirse a traves de un enlazador dendrltico.
Los siguientes ejemplos de reactivos enlazadores dendrlticos permiten que hasta nueve reactivos de resto de farmaco nucleofilo se conjuguen por reaccion con los grupos funcionales cloroetil mostaza nitrogenada:
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Conjugacion de restos de farmaco a anticuerpos
El esquema 16 ilustra la metodologla util para hacer conjugados de farmaco-enlazador-ligando que tiene de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 farmacos por anticuerpo. Un anticuerpo se trata con un agente reductor, tal como ditiotreitol (DTT) para reducir algunos o todos los residuos de disulfuro de cistelna para formar grupos tiol de cistelna altamente nucleofilos (-CH2SH). Por tanto, el anticuerpo parcialmente reducido reacciona con los compuestos de farmaco-enlazador, o reactivos enlazadores, con grupos funcionales electrofilos tales como maleimida o a-halo carbonilo, de acuerdo con el metodo de conjugacion de la pagina 766 de Klussman et al., 2004, Bioconjugate Chemistry 15 (4): 765-773.
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Por ejemplo, un anticuerpo, por ejemplo, AC10, disuelto en borato de sodio 500°mM y cloruro de sodio 500°mM a pH 8,0 se trata con un exceso de ditiotreitol 100°mM (DTT). Despues de la incubacion a 37 °C durante aproximadamente 30 minutos, el tampon se intercambia por elucion sobre resina Sephadex G25 y se eluye con PBS con DTPA 1°mM. El valor de tiol/Ab se comprueba determinando la concentracion de anticuerpo reducido a partir de la absorbancia a 280 nm de la solucion y la concentracion de tiol mediante la reaccion con DTNB (Aldrich, Milwaukee, WI) y la determinacion de la absorbancia a 412 nm. El anticuerpo reducido se disuelve en PBS y se enfrla en hielo. El enlazador de farmaco, por ejemplo, MC-val-cit-PAB-MMAZ en DMSO, disuelto en acetonitrilo y agua a una concentracion conocida, se anade al anticuerpo reducido enfriado en PBS. Despues de aproximadamente una hora, se anade un exceso de maleimida para interrumpir la reaccion y proteger con caperuza cualesquier grupos tiol de anticuerpo sin reaccionar. La mezcla de reaccion se concentra por ultrafiltracion centrlfuga y el CAF, por ejemplo, AC10-MC-vc-PAB-MMAZ, se purifica y desala mediante elucion a traves de resina G25 en PBS, se filtra a traves filtros de 0,2 pM en condiciones esteriles y se congela para su almacenamiento.
Puede prepararse diversos conjugados de anticuerpo farmaco (CAF), con diversos enlazadores y los restos de farmaco, MMAZ siguiendo los protocolos de los Ejemplos y caracterizados mediante HPLC y ensayo de carga de farmaco.
Composiciones y metodos de administracion
Se describe una composicion que incluye una cantidad eficaz de un compuesto a modo de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo y un excipiente o vehlculo farmaceuticamente aceptable. Por comodidad, las unidades de farmaco y los compuestos de farmaco-enlazador pueden denominarse compuestos a modo de ejemplo, mientras que los conjugados farmaco-ligando y los conjugados farmaco-enlazador-ligando pueden denominarse conjugados a modo de ejemplo. Las composiciones son adecuadas para la administracion veterinaria o humana.
Las presentes composiciones pueden estar en cualquier forma que permita que la composicion se administre a un paciente. Por ejemplo, la composicion puede estar en forma de un solido, llquido o gas (aerosol). Las vlas tlpicas de administracion incluyen, sin limitacion, la oral, topica, parenteral, sublingual, rectal, vaginal, ocular, intratumoral e intranasal. La administracion parenteral incluye las inyecciones subcutaneas, intravenosas, intramusculares, la inyeccion intraesternal o las tecnicas de infusion. En un aspecto, las composiciones se administran por via parenteral. En otro aspecto mas, los compuestos a modo de ejemplo y/o conjugados o composiciones a modo de ejemplo se administran por via intravenosa.
Las composiciones farmaceuticas pueden formularse de manera que permitan que un compuesto a modo de ejemplo y/o un conjugado a modo de ejemplo esten biodisponible tras la administracion de la composicion a un paciente. Las composiciones pueden tomar la forma de una o mas unidades de dosificacion, donde por ejemplo, un comprimido puede ser una unidad de dosificacion individual y un recipiente de un compuesto a modo de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo en forma de aerosol puede contener una pluralidad de unidades de dosificacion.
Los materiales utilizados en la preparacion de las composiciones farmaceuticas pueden ser atoxicos en las cantidades utilizadas. Sera evidente para los expertos en la materia que la dosis optima del principio o principios activos en la composicion farmaceutica dependera de diversos factores. Los factores relevantes incluyen, sin limitacion, el tipo de animal (por ejemplo, un ser humano), la forma particular del compuesto a modo de ejemplo o conjugado a modo de ejemplo, la forma de administracion y la composicion empleadas.
El excipiente o vehlculos farmaceuticamente aceptables pueden ser partlculas, de manera que las composiciones son, por ejemplo, en forma de comprimidos o polvo. El vehlculo o vehlculos pueden ser llquidos, siendo las composiciones, por ejemplo, un jarabe oral o llquido inyectable. Ademas, el vehlculo o vehlculos pueden ser gaseosos o partlculas, a fin de proporcionar una composicion de aerosol util en, por ejemplo, la administracion por inhalacion.
Cuando se destina a la administracion oral, la composicion esta preferentemente en forma solida o llquida, donde las formas semi-solidas, semi-llquidas, de suspension y de gel se incluyen dentro de las formas consideradas en el presente documento como solidas o llquidas.
Como composicion solida para la administracion oral, la composicion puede formularse en forma de polvo, granulo, comprimido, plldora, capsula, chicle, oblea o similar. Una composicion solida de este tipo contiene normalmente uno o mas diluyentes inertes. Ademas, uno o mas de los siguientes pueden estar presentes: aglutinantes tales como carboximetilcelulosa, etilcelulosa, celulosa microcristalina o gelatina; excipientes tales como almidon, lactosa o dextrinas, agentes disgregantes tales como acido aiglnico, alginato de sodio, Primogel, almidon de malz y similares; lubricantes tales como estearato de magnesio o Sterotex; sustancias de deslizamiento tales como dioxido de silicio coloidal; agentes edulcorantes tales como sacarosa o sacarina, un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja y un agente colorante.
Cuando la composicion esta en forma de una capsula, por ejemplo, una capsula de gelatina, puede contener, ademas de los materiales del tipo anterior, un vehlculo llquido tal como polietilenglicol, ciclodextrina o un aceite graso.
La composicion puede estar en forma de un llquido, por ejemplo, un elixir, jarabe, solucion, emulsion o suspension. El llquido puede ser util para la administration oral o para la entrega por inyeccion. Cuando se destina a la administration oral, una composicion puede comprender uno o mas de un agente edulcorante, conservantes, un tinte/colorante y un potenciador del sabor. En una composicion para la administracion por inyeccion, tambien pueden incluirse uno o mas de un tensioactivo, conservante, agente humectante, agente dispersante, agente de suspension, tampon, estabilizador y agente isotonico.
Las composiciones llquidas, ya sean soluciones, suspensiones u otra forma similar, tambien puede incluir uno o mas de los siguientes: diluyentes esteriles tales como agua para inyeccion, solucion salina, preferentemente solucion salina fisiologica, solucion de Ringer, cloruro de sodio isotonico, aceites no volatiles tales como mono o digliceridos sinteticos que pueden servir como disolvente o medio de suspension, polietilenglicoles, glicerina, ciclodextrina, propilenglicol u otros disolventes; agentes antibacterianos tales como alcohol bencllico o parabeno de metilo; antioxidantes tales como acido ascorbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como el acido etilendiaminotetraacetico; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. Una composicion parenteral puede incluirse en una ampolla, una jeringa desechable o un vial de multiples dosis hechos de vidrio, plastico u otro material. La solucion salina fisiologica es un adyuvante a modo de ejemplo. Una composicion inyectable es preferentemente esteril.
La cantidad del compuesto de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo que es eficaz en el tratamiento de un trastorno o condition particular dependera de la naturaleza del trastorno o condition y puede ser determinada por la norma tecnicas cllnicas. Ademas, se pueden emplear ensayos in vitro o in vivo opcionalmente para ayudar a identificar intervalos de dosificacion optimos. La dosis precisa a emplear en las composiciones tambien dependera de la via de administracion y la gravedad de la enfermedad o trastorno y debe decidirse de acuerdo con el juicio del medico y las circunstancias de cada paciente.
Las composiciones comprenden una cantidad eficaz de un compuesto a modo de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo de manera que se obtendra una dosificacion adecuada. Normalmente, esta cantidad es al menos aproximadamente el 0,01 % de un compuesto a modo de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo en peso de la composicion. Cuando se destinan a la administracion oral, esta cantidad puede variarse en el intervalo de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 80 % en peso de la composicion. En un aspecto, las composiciones orales pueden comprender de aproximadamente el 4 % a aproximadamente el 50 % del compuesto a modo de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo en peso de la composicion. En otro aspecto mas, las composiciones presentes se preparan de modo que una unidad de dosificacion parenteral contiene de aproximadamente el 0,01 % a aproximadamente el 2 % en peso del compuesto a modo de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo.
Para la administracion intravenosa, la composicion puede comprender de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 mg de un compuesto a modo de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo por kg de peso corporal del animal. En un aspecto, la composicion puede incluir de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg de un compuesto a modo de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo por kg de peso corporal del animal. En otro aspecto, la cantidad administrada estara en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal del compuesto a modo de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo.
Generalmente, la dosificacion de un compuesto a modo de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo administrada a un paciente es normalmente de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 2000 mg/kg de peso corporal del animal. En un aspecto, la dosificacion administrada a un paciente es de entre aproximadamente 0,01 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal del animal, en otro aspecto, la dosificacion administrada a un paciente es de entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 250 mg/kg de peso corporal del animal, en otro aspecto mas, la dosificacion administrada a un paciente es de entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal del animal, en otro aspecto, la dosis administrada es de entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal del animal y en otro aspecto mas, la dosis administrada es de entre aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal del animal.
Los compuestos a modo de ejemplo y/o conjugados a modo de ejemplo o composiciones pueden administrarse por cualquier via conveniente, por ejemplo por infusion o inyeccion en bolo, por absorcion a traves de revestimientos epiteliales o mucocutaneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.). La administracion puede ser sistemica o local. Se conocen diversos sistemas de liberation, por ejemplo, encapsulation en liposomas, micropartlculas, microcapsulas, capsulas, etc. y pueden usarse para administrar un compuesto a modo de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo o composicion. Puede administrarse a un paciente mas de un compuesto a modo de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo o composicion.
Puede ser deseable administrar uno o mas compuestos a modo de ejemplo y/o conjugados a modo de ejemplo o composiciones localmente a la zona que necesita tratamiento. Esto puede lograrse, por ejemplo y no a modo de limitacion, por infusion local durante la cirugla; aplicacion topica, por ejemplo, en conjuncion con un aposito para heridas despues de la cirugla; por inyeccion; por medio de un cateter; por medio de un supositorio; o por medio de un implante, siendo el implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo las membranas, tales como las membranas sialasticas, o fibras. La administracion puede ser por inyeccion directa en el sitio (o sitio anterior) de un cancer, tumor o tejido neoplasico o preneoplasico. La administracion puede ser por inyeccion directa en el sitio (o sitio anterior) de una manifestacion de una enfermedad autoinmune.
Puede ser deseable introducir uno o mas compuestos a modo de ejemplo y/o conjugados a modo de ejemplo o composiciones en el sistema nervioso central por cualquier via adecuada, incluyendo la inyeccion intraventricular e intratecal. La inyeccion intraventricular puede facilitarse mediante un cateter intraventricular, por ejemplo, unido a un deposito, tal como un deposito Ommaya.
La administracion pulmonar tambien puede emplearse, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador y una formulacion con un agente de aerosolizacion o por medio de perfusion en un fluorocarbono o tensioactivo pulmonar sintetico.
Los compuestos a modo de ejemplo y/o conjugados a modo de ejemplo o composiciones pueden suministrarse en un sistema de liberacion controlada, tal como, pero no limitado a, una bomba, o pueden usarse diversos materiales polimericos. Un sistema de liberacion controlada puede colocarse en la proximidad de la diana de los compuestos a modo de ejemplo y/o conjugados a modo de ejemplo o composiciones, por ejemplo, el cerebro, necesitando de este modo solo una fraccion de la dosis sistemica (vease, por ejemplo, Goodson Medical Applications of Controlled Release, citado anteriormente, vol. 2, pags. 115-138 (1984)). Pueden usarse otros sistemas de liberacion controlada analizados en la revision de Langer (Science 249: 1527-1533 (1990)).
El termino "vehlculo" se refiere a un diluyente, adyuvante o excipiente, con el que se administra un compuesto a modo de ejemplo y/o un conjugado a modo de ejemplo. Dichos vehlculos farmaceuticos pueden ser llquidos, tales como agua y aceites, incluyendo los de petroleo, animales, vegetales o sinteticos, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sesamo y similares. Los vehlculos pueden ser solucion salina, goma arabiga, gelatina, pasta de almidon, talco, queratina, sllice coloidal, urea y similares. Ademas, pueden usarse agentes auxiliares, estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes. Cuando se administra a un paciente, el compuesto a modo de ejemplo y/o el conjugado a modo de ejemplo o composiciones y los vehlculos farmaceuticamente aceptables son esteriles. El agua es un vehlculo a modo de ejemplo, cuando los compuestos a modo de ejemplo y/o conjugados a modo de ejemplo se administran por via intravenosa. Las soluciones salinas y soluciones de dextrosa y glicerol acuosas tambien pueden emplearse como vehlculos llquidos, en particular para soluciones inyectables. Los vehlculos farmaceuticos adecuados tambien incluyen excipientes tales como almidon, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sllice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. Las presentes composiciones, si se desea, tambien pueden contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes o agentes tamponantes del pH.
Las presentes composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, plldoras, granulos, capsulas, capsulas que contienen llquidos, polvos, formulaciones de liberacion sostenida, supositorios, emulsiones, aerosoles, pulverizaciones, suspensiones o cualquier otra forma adecuada para su uso. Otros ejemplos de vehlculos farmaceuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martin.
En una realizacion, los compuestos a modo de ejemplo y/o conjugados a modo de ejemplo se formulan de acuerdo con procedimientos sistematicos en forma de una composicion farmaceutica adaptada para la administracion intravenosa a animales, en particular seres humanos. Normalmente, los excipientes o vehlculos para la administracion intravenosa son soluciones tampon acuosas isotonicas esteriles. Cuando sea necesario, las composiciones tambien pueden incluir un agente solubilizante. Las composiciones para la administracion intravenosa pueden comprender opcionalmente un anestesico local tal como lignocalna para aliviar el dolor en el sitio de la inyeccion. En general, los ingredientes se suministran por separado o mezclados juntos en formas de dosificacion unitarias, por ejemplo, en forma de un polvo liofilizado en seco o un concentrado libre de agua en un recipiente hermeticamente sellado tal como una ampolla o sobre que indique la cantidad de agente activo. Cuando un compuesto a modo de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo se administre por infusion, puede dosificarse, por ejemplo, con una botella de infusion que contenga agua de calidad farmaceutica o solucion salina esteriles. Cuando el compuesto a modo de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo se administran por inyeccion, puede proporcionarse una ampolla de agua para inyeccion o de solucion salina esteriles para que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administracion.
Las composiciones para la administracion oral pueden estar en forma de comprimidos, pastillas para chupar, suspensiones acuosas u oleosas, granulos, polvos, emulsiones, capsulas, jarabes o elixires, por ejemplo. Las composiciones administradas por via oral pueden contener uno o mas agentes opcionales, por ejemplo, agentes edulcorantes tales como fructosa, aspartamo o sacarina; agentes aromatizantes tales como menta, aceite de gaulteria o cereza; agentes colorantes; y agentes conservantes, para proporcionar una preparacion farmaceuticamente agradable al paladar. Ademas, cuando estan en forma de comprimido o plldora, las composiciones pueden recubrirse para retardar la desintegracion y absorcion en el tracto gastrointestinal proporcionando de este modo una accion sostenida durante un periodo prolongado de tiempo. Las membranas selectivamente permeables que rodean un compuesto accionador osmoticamente activo tambien son adecuadas para los compuestos administrados por via oral. En estas ultimas plataformas, el fluido del entorno que rodea la capsula es absorbido por el compuesto accionador, que se hincha para desplazar el agente o composicion de agente a traves de una abertura. Estas plataformas de administracion pueden proporcionar un perfil de liberacion esencialmente de orden cero en oposicion a los perfiles de pico de las formulaciones de liberacion inmediata. Tambien puede usarse un material de retardo temporal tal como monoestearato de glicerol o estearato de glicerol.
Las composiciones pueden estar destinadas a la administracion topica, en cuyo caso el vehlculo puede ser en forma de una base de solucion, emulsion, pomada o gel. Si esta destinada a la administracion transdermica, la composicion puede estar en forma de un parche transdermico o un dispositivo de iontoforesis. Las formulaciones topicas pueden comprender una concentracion de un compuesto a modo de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo de aproximadamente el 0,05 % a aproximadamente el 50 % p/v (peso por unidad de volumen de la composicion), en otro aspecto, del 0,1 % al 10 % p/v.
La composicion puede estar destinada a la administracion rectal, en forma, por ejemplo, de un supositorio que se fundira en el recto y liberara el compuesto a modo de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo.
La composicion puede incluir diversos materiales que modifican la forma flsica de una unidad de dosificacion solida o llquida. Por ejemplo, la composicion puede incluir materiales que formen una cubierta de recubrimiento alrededor de los principios activos. Los materiales que forman la cubierta de recubrimiento son normalmente inertes y pueden seleccionarse entre, por ejemplo, azucar, goma laca y otros agentes de recubrimiento enterico. Como alternativa, los principios activos pueden encapsularse en una capsula de gelatina.
Las composiciones pueden consistir en unidades de dosificacion gaseosas, por ejemplo, pueden estar en forma de un aerosol. El termino aerosol se usa para indicar diversos sistemas que varla de aquellos de naturaleza coloidal a los sistemas que consisten en paquetes presurizados. La liberacion puede ser mediante un gas licuado o comprimido o mediante un sistema de bombeo adecuado que dosifica los principios activos.
Ya sea en forma solida, llquida o gaseosa, las presentes composiciones pueden incluir un agente farmacologico utilizado en el tratamiento del cancer, de una enfermedad autoinmune o de una enfermedad infecciosa.
Usos terapeuticos de los conjugados a modo de ejemplo
Los compuestos a modo de ejemplo y/o conjugados a modo de ejemplo son utiles para el tratamiento del cancer, de una enfermedad autoinmune o de una enfermedad infecciosa en un paciente.
Tratamiento del cancer
Los compuestos a modo de ejemplo y/o conjugados a modo de ejemplo son utiles para inhibir la multiplicacion de una celula tumoral o celula cancerosa, provocando la apoptosis en una celula tumoral o cancerosa o para tratar el cancer en un paciente. Los compuestos a modo de ejemplo y/o conjugados a modo de ejemplo pueden usarse, en consecuencia, en diversas configuraciones para el tratamiento de los canceres animales. Los conjugados farmacoenlazador-ligando pueden usarse para suministrar una unidad de farmaco o farmacos a una celula tumoral o celula cancerosa. Sin quedar ligado por teorla alguna, en un ejemplo, la unidad de ligando de un conjugado a modo de ejemplo se une o se asocia a un antlgeno asociado a celulas cancerosas o celulas tumorales, y el conjugado a modo de ejemplo puede captarse (interiorizarse) dentro de una celula tumoral o celula cancerosa a traves de endocitosis mediada por receptor. El antlgeno puede estar unido a una celula tumoral o celula cancerosa o puede ser una protelna de la matriz extracelular asociada a la celula tumoral o celula cancerosa. Una vez dentro de la celula, una o mas secuencias especlficas de peptido dentro de la unidad de enlazador se escinden hidrollticamente por una o mas proteasas asociadas a celulas tumorales o celulas cancerosas, dando como resultado la liberacion de un farmaco o un compuesto de farmaco-enlazador. El farmaco o un compuesto de farmaco-enlazador liberado esta entonces libre para migrar dentro de la celula e inducir actividades citotoxicas o citostaticas. El conjugado de farmaco-enlazadorligando tambien puede ser escindido por la proteasa intracelular para liberar el resto de farmaco, el compuesto de farmaco-enlazador, y/o un fragmento activo del conjugado farmaco-enlazador-ligando (por ejemplo, cistilo-enlazadorfarmaco). Alternativamente, el farmaco o la unidad de farmaco se escinde del conjugado a modo de ejemplo fuera de la celula tumoral o la celula cancerosa, y el farmaco o compuesto de farmaco-enlazador posteriormente penetra en la celula. En un ejemplo alternativo, el farmaco o unidad de farmaco se escinde del conjugado a modo de ejemplo fuera de la celula tumoral o la celula cancerosa y el farmaco o compuesto de farmaco-enlazador posteriormente penetra en la celula.
En un ejemplo, la unidad de ligando se une a la celula tumoral o celula cancerosa.
En otro ejemplo, la unidad de ligando se une a un antigeno de celula tumoral o celula cancerosa que esta en la superfine de la celula tumoral o celula cancerosa.
En otro ejemplo, la unidad de ligando se une a un antigeno de celula tumoral o celula cancerosa que es una proteina de la matriz extracelular asociada a la celula tumoral o la celula cancerosa.
La especificidad de la unidad de ligando para una celula tumoral o celula cancerosa particular puede ser importante para la determinacion de los tumores o canceres que se tratan con mayor eficacia. Por ejemplo, los conjugados a modo de ejemplo que tienen una unidad de ligando BR96 pueden ser utiles para el tratamiento de carcinomas positivos a antigenos incluyendo los de pulmon, mama, colon, ovarios y pancreas. Los conjugados a modo de ejemplo que tienen una unidad de ligando anti-CD30 o anti-CD40 pueden ser utiles para el tratamiento de neoplasias malignas hematicas.
Otros tipos particulares de canceres que pueden tratarse con conjugados a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, los que se describen en la Tabla 1:
TABLA 1
Los tumores solidos, incluyendo pero no limitados a:
fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogenico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, cancer de colon, cancer colorrectal, cancer de rinon, cancer de pancreas, cancer oseo, cancer de mama, cancer de ovario, cancer de prostata, cancer de esofago, cancer de estomago, cancer oral, cancer nasal, cancer de garganta, carcinoma de celulas escamosas, carcinoma de celulas basales, adenocarcinoma, carcinoma de glandulas sudoriparas, carcinoma de glandulas sebaceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogenico, carcinoma de celulas renales, hepatoma, carcinoma del conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cancer cervical, cancer de utero, cancer testicular, carcinoma de pulmon microcitico, carcinoma de vejiga, cancer de pulmon, carcinoma epitelial, glioma, glioblastoma multiforme, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acustico, oligodendroglioma, meningioma, cancer de piel, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, canceres transmitidas por la sangre, incluyendo, pero no limitados a:
leucemia aguda linfobl astica "LAL", leucemia de celulas B linfoblastica aguda, leucemia de linfocitos T linfoblastica aguda, leucemia mieloblastica aguda "LMA", leucemia promielocitica aguda "LPA", leucemia monoblastica aguda, leucemia eritroleucemica aguda, leucemia megacarioblastica aguda, leucemia mielomonocitica aguda, leucemia no linfocitica aguda, leucemia indiferenciada aguda, leucemia mieloide cronica "LMC", leucemia linfocitica cronica "LLC", leucemia de celulas pilosas, mieloma multiple
leucemias agudas y cronicas:
leucemias linfoblastica, mieloide, linfoide, mielocitica
Linfomas:
enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, mieloma multiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadena pesada, Policitemia vera
Los conjugados a modo de ejemplo proporcionan conjugacion orientada al tumor o cancer especifico, lo que reduce la toxicidad general de estos compuestos. Las unidades de enlazador estabilizan los conjugados a modo de ejemplo en la sangre, sin embargo, son escindibles por proteasas especificas del tumor dentro de la celula, liberando un farmaco.
Terapia multi-modalidad para el cancer
Los canceres, incluyendo, pero no limitados a, un tumor, metastasis u otra enfermedad o trastorno caracterizado por un crecimiento celular incontrolado, puede tratarse o prevenirse mediante la administracion de un conjugado a modo de ejemplo y/o un compuesto a modo de ejemplo.
Se proporcionan metodos para tratar o prevenir el cancer, incluyendo la administracion a un paciente que lo necesite de una cantidad eficaz de un ejemplo de conjugado y un agente quimioterapico. En un ejemplo, el agente quimioterapico es aquel con el que se ha descubierto que el tratamiento del cancer no es refractario. En otro ejemplo, el agente quimioterapico es aquel con el que se ha descubierto que el tratamiento del cancer es refractario. Los conjugados a modo de ejemplo pueden administrarse a un paciente que tambien ha sido sometido a cirugia como tratamiento para el cancer.
En algunos ejemplos, el paciente tambien recibe un tratamiento adicional, tal como la radioterapia. El conjugado a modo de ejemplo puede administrarse simultaneamente con el agente quimioterapico o con radioterapia. El agente quimioterapico o la radioterapia pueden administrarse antes o despues de la administracion de un conjugado a modo de ejemplo, en un aspecto al menos una hora, cinco horas, 12 horas, un dla, una semana, un mes, en otros aspectos varios meses (por ejemplo, hasta tres meses) antes o despues de la administracion de un conjugado a modo de ejemplo.
Un agente quimioterapico puede administrarse a lo largo de una serie de sesiones. Puede administrarse uno cualquiera o una combinacion de los agentes quimioterapicos enumerados en la Tabla 4. Con respecto a la radiacion, puede usarse cualquier protocolo de radioterapia dependiendo del tipo de cancer que se trate. Por ejemplo, pero no a modo de limitacion, puede administrarse radiacion de rayos x; en particular, megavoltaje de alta energla (radiacion de mas de 1 MeV de energla) para tumores profundos, y pueden usarse haz de electrones y radiacion de rayos X de ortovoltaje para canceres de piel. Tambien pueden administrarse radioisotopos emisores de rayos gamma, tales como isotopos radiactivos de radio, cobalto y otros elementos.
De forma adicional, se proporcionan metodos de tratamiento del cancer con un compuesto a modo de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo como una alternativa a la quimioterapia o la radioterapia donde la quimioterapia o la radioterapia han demostrado ser o pueden resultar ser demasiado toxicas, por ejemplo, dando como resultado efectos secundarios inaceptables o intolerables, para el sujeto que se trata. El animal que se trata puede, opcionalmente, tratarse con otro tratamiento para el cancer tal como cirugla, radioterapia o quimioterapia, dependiendo de que tratamiento se encuentre que es aceptable o tolerable.
Los compuestos a modo de ejemplo y/o conjugados a modo de ejemplo tambien puede usarse de forma in vitro o ex vivo, tal como para el tratamiento de ciertos tipos de cancer, incluyendo, pero no limitados a, leucemias y linfomas, implicando dicho tratamiento los trasplantes de celulas madre autologas. Esto puede implicar un proceso de multiples etapas en el que las celulas madre hematopoyeticas autologas del animal se recogen y se purgan de todas las celulas de cancer, la poblacion restante de celulas de medula osea del animal se erradica despues a traves de la administracion de una alta dosis de un compuesto a modo de ejemplo y/o conjugado a modo de ejemplo con o sin acompanamiento de radioterapia de alta dosis y el injerto de celulas madre se infunde de nuevo en el animal. Despues, se proporciona cuidado de apoyo, mientras que la funcion de la medula osea se restaura y el animal se recupera.
Terapia para el cancer con multiples farmacos
Los metodos para tratar el cancer incluyen la administracion a un paciente que lo necesite de una cantidad eficaz de un conjugado a modo de ejemplo y otro agente terapeutico que es un agente antineoplasico. Un "agente antineoplasico" o un "agente quimioterapico" es un compuesto qulmico util en el tratamiento del cancer.
Los agentes antineoplasicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, metotrexato, taxol, L-asparaginasa, mercaptopurina, tioguanina, hidroxiurea, citarabina, ciclofosfamida, ifosfamida, nitrosoureas, cisplatino, carboplatino, mitomicina, dacarbazina, procarbazina, topotecan, mostazas nitrogenadas, Cytoxan, etoposido, 5-fluorouracilo, BCNU, irinotecan, camptotecinas, bleomicina, doxorrubicina, idarrubicina, daunorrubicina, dactinomicina, plicamicina, mitoxantrona, asparaginasa, vinblastina, vincristina, vinorelbina, paclitaxel y docetaxel.
Los ejemplos de agentes quimioterapicos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida CYTOXAN®; sulfonatos de alquilo, tales como busulfan, improsulfaan, piposulfan y treosulfan; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretarnina, trietilenemelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; TLK 286 (TELCYTA™); acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona); delta-9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapachol; colchicina; acido betullnico; una camptotecina (incluyendo el analogo sintetico topotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina, crisnatol; y 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus analogos sinteticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina; acido podofillnico; teniposido; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los analogos sinteticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; esponjistatina; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de oxido de mecloretamina, melfalan, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida y mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina (BCNU), clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; triazinas, tales como dacarbazina; bifosfonatos, tales como clodronato; antibioticos tales como los antibioticos de enedina (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamma1I y caliqueamicina omega 1 (vease, por ejemplo, Agnew, 1994, Chem. Intl. Ed. Engl. 33:183­ 186) y antraciclinas tales como anamicina, AD 32, alcarrubicina, daunorrubicina, dexrazoxano, DX-52-1, epirubicina, GPX-100, idarrubicina, pirarrubicina, zorubicina, mitoxantrona, KRN5500, menogarilo, dinemicina, incluyendo dinemicina A, un esperamicina, cromoforo de neocarzinostatina y cromoforos de antibioticos de enedina de cromoprotelna relacionados, aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas (por ejemplo, A2 o B2), cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina ADRIAMYCIN® (incluyendo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorubicin, doxorrubicina liposomal y desoxidoxorrubicina), EICAR, esorrubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, acido micofenolico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, ribavirina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tiazofurina, tubercidina, ubenimex, zinostatina y zorrubicina; analogos de acido folico tales como denopterina, pteropterina y trimetrexato; analogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina y tioguanina; analogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, citoarabinosido, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina y fludarabina; androgenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano y testolactona; anti-suprarrenales tales como aminoglutetimida, mitotano y trilostano; rellenador de acido folico tales como acido follnico (leucovorina); aceglatona; agentes antineoplasicos anti-folato tales como ALIMTA®, pemetrexed LY231514, inhibidores de la dihidrofolato reductasa como metotrexato y trimetrexato, antimetabolitos tales como 5-fluorouracilo (5-FU) y sus profarmacos tales como UFT, S-1 y capecitabina y los inhibidores de la timidilato sintasa e inhibidores de glicinamida ribonucleotido formiltransferasa tales como raltitrexed (TOMUDEXM, TDX); inhibidores de la deshidrogenasa de dihidropirimidina tal como eniluracilo; glucosido de aldofosfamida; acido aminolevullnico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; defereoxamina; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de polisacarido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; acido tenuazonico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente la toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides y taxanos, por ejemplo, paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncologla, Princeton, NJ), ABRAXANE™ sin Cremophor, formulacion de paclitaxel de nanopartlculas de albumina modificada por ingenierla genetica (American Pharmaceutical Partners, Schaumburg, Illinois) y docetaxel TAXOTERE® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); cloranbucilo; gemcitabina (GEMZAR®); 6-tioguanina; mercaptopurina; analogos de platino o analogos a base de platino, como el cisplatino, oxaliplatino; platino y carboplatino; vinblastina (VELBAN®); etoposido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); vinblastina; vindesina; vinorelbina; alcaloides de la vinca, vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; Xeloda; ibandronato; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); Inhibidores de MDR tales como verapamilo; retinoides tales como acido retinoico; inhibidores del ciclo celular, tales como estaurosporina; lovastatina; REVLIMID (lenalidomida); THALAMI (talidomida); VELADE (bortezomib); sales, acidos o derivados farmaceuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; as! como combinaciones de dos o mas de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura de una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona y FOLFOX, una abreviatura de una pauta de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN ™) combinado con 5-FU y leucovorina.
Tambien se incluyen en la presente definicion los agentes anti-hormonales que actuan para regular o inhibir la accion hormonal sobre tumores tales como los anti-estrogenos y los moduladores selectivos de receptores estrogenicos (SERM), incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno FARESTON®; inhibidores de la aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la produccion de estrogenos en las glandulas suprarrenales citadas anteriormente, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, megestrol, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestano, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA®, anastrozol ARIMIDEX®; y anti-androgenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida (por ejemplo, acetato de leuprolida) y goserelina; as! como troxacitabina (un analogo de citosina de nucleosido 1,3-dioxolano); oligonucleotidos antisentido, particularmente los que inhiben la expresion de genes en las vlas de serialization implicadas en la proliferation celular aberrante, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras y receptor del factor de crecimiento epidermico (EGF-R); vacunas tales como las vacunas de terapia genica, por ejemplo, la vacuna ALLOVECTIN®, la vacuna LEUVECTiN® y la vacuna VAXID®; PROLEUKIN® RIL-2; LURTOTEc An® inhibidor de la topoisomerasa 1; ABARELIX® rmRH; y sales, acidos o derivados farmaceuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
Tambien se incluyen en la presente definicion analogos de la vitamina D3, tales como EB 1089, CB 1093 y KH 1060; y terapias fotodinamicas, tales como vertoporfin (BPD-MA), ftalocianina, fotosensibilizador Pc4, desmetoxi-hipocrelina A y 2BA-2-DMHA.
Tratamiento de enfermedades autoinmunes
Los conjugados a modo de ejemplo son utiles para destruir o inhibir la replication de una celula que produce una enfermedad autoinmune o para el tratamiento de una enfermedad autoinmune. Los conjugados a modo de ejemplo pueden usarse, en consecuencia, en diversas configuraciones para el tratamiento de una enfermedad autoinmune en un paciente. Los conjugados de farmaco-enlazador-ligando pueden usarse para suministrar un farmaco a una celula diana. Sin quedar ligado por teorla alguna, en un ejemplo, los conjugados farmaco-enlazador-ligando asociados a un antlgeno en la superficie de una celula diana, y el conjugado a modo de ejemplo se recoge despues dentro de una celula diana a traves de endocitosis mediada por receptor. Una vez dentro de la celula, una o mas secuencias especlficas de peptidos dentro de la unidad de enlazador se escinden enzimaticamente o hidrollticamente, dando como resultado la liberation de un farmaco. Despues, el farmaco liberado queda libre para migrar en el citosol e inducir actividades citotoxicas o citostaticas. El conjugado farmaco-enlazador-ligando tambien puede escindirse por una proteasa intracelular para liberar el resto de farmaco, el compuesto farmaco-enlazador y/o un fragmento activo del conjugado farmaco-enlazador-ligando (por ejemplo, cistilo-enlazador-farmaco). Alternativamente, el farmaco se escinde del conjugado a modo de ejemplo fuera de la celula diana y posteriormente el farmaco penetra en la celula.
La unidad de ligando puede unirse a un antlgeno autoinmune. El antlgeno puede estar sobre la superficie de una celula implicada en una afeccion autoinmune.
La unidad de ligando puede unirse a un antigeno autoinmune que esta sobre la superficie de una celula.
El ligando puede unirse une a los linfocitos activados que se asocian a la patologia autoinmune.
En un ejemplo adicional, los conjugados a modo de ejemplo destruyen o inhiben la multiplicacion de celulas que producen un anticuerpo autoinmune asociado a una enfermedad autoinmune en particular.
Los tipos particulares de enfermedades autoinmunes que pueden tratarse con los conjugados a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, trastornos relacionados con linfocitos Th2 (por ejemplo, dermatitis atopica, asma atopica, rinoconjuntivitis, rinitis alergica, sindrome de Omenn, esclerosis sistemica y enfermedad injerto contra hospedador); trastornos relacionados con linfocitos Th1 (por ejemplo, artritis reumatoide, esclerosis multiple, psoriasis, sindrome de Sjorgren, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Grave, cirrosis biliar primaria, granulomatosis de Wegener y tuberculosis); trastornos relacionados con linfocitos B activados (por ejemplo, lupus eritematoso sistemico, sindrome de Goodpasture, artritis reumatoide y diabetes de tipo I); y los desvelados en la Tabla 3.
TABLA 3
Hepatitis cronica activa, enfermedad de Addison, alveolitis alergica, reaccion alergica, rinitis alergica, sindrome de Alport, anafilaxia, espondilitis anquilosante, sindrome antifosfolipidico, artritis, ascariasis, aspergilosis, alergia atopico, dermatitis atopica, rinitis atopica, enfermedad de Behcet, pulmon de Bird-Fancier, asma bronquial, sindrome de Caplan, miocardiopatia, enfermedad celiaca, enfermedad de Chagas, glomerulonefritis cronica, sindrome de Cogan, enfermedad por crioaglutininas, infeccion por rubeola congenita, sindrome de CREST, enfermedad de Crohn, crioglobulinemia, Sindrome de Cushing, dermatomiositis, lupus discoide, sindrome de Dressler, sindrome de Lambert-Eaton, infeccion por Ecovirus, encefalomielitis, oftalmopatia endocrina, infeccion por virus de Epstein-Barr, nauseas equinas, eritematosis, sindrome de Evan, sindrome de Felty, fibromialgia, ciclitis de Fuch, atrofia gastrica, alergia gastrointestinal, arteritis de celulas gigantes, glomerulonefritis, sindrome de Goodpasture, enfermedad de injerto contra hospedador, enfermedad de Graves, enfermedad de Guillain-Barre, tiroiditis de Hashimoto, anemia hemolitica, purpura de Henoch Schonlein, atrofia suprarrenal idiopatica, fibritis pulmonar idiopatica, nefropatia por IgA, enfermedades inflamatorias del intestino, diabetes mellitus insulinodependiente, artritis juvenil, diabetes mellitus juvenil (tipo I), sindrome de Lambert-Eaton, laminitis, liquen plano, hepatitis lupoide, lupus, linfopenia, enfermedad de Meniere, enfermedad mixta del tejido conectivo, esclerosis multiple, miastenia grave, anemia perniciosa, sindromes poliglandulares, demencia presenil, agamaglobulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis psoriasica, fenomeno de Raynaud, aborto recurrente, sindrome de Reiter, fiebre reumatica, artritis reumatoide, sindrome de Sampter, esquistosomiasis, esclerodermia, sindrome de Sjorgen, sindrome de Shulman, sindrome de Schmidt, sindrome del hombre rigido, oftalmia simpatica, lupus eritematoso sistemico, arteritis de Takayasu, artritis temporal, tiroiditis, trombocitopenia, tirotoxicosis, necrolisis epidermica toxica, resistencia a la insulina de tipo B, diabetes mellitus de tipo I, colitis ulcerosa, uveitis, vitiligo, macroglobulinemia de Waldenstrom, granulomatosis de Wegener.
Terapia de enfermedades autoinmunes con multiples farmacos
Tambien se desvelan metodos para el tratamiento de una enfermedad autoinmune, incluyendo la administracion a un paciente que lo necesite de una cantidad eficaz de un conjugado a modo de ejemplo y otro agente terapeutico conocido para el tratamiento de una enfermedad autoinmune. En un ejemplo, el agente contra la enfermedad anti-autoinmune incluye, pero no se limita a, los agentes enumerados en la Tabla 4.
Tabla 4
ciclosporina, ciclosporina A, micofenolato de mofetilo, sirolimus, tacrolimus, enanercept, prednisona, azatioprina, metotrexato, ciclofosfamida, prednisona, acido aminocaproico, cloroquina, hidroxicloroquina, hidrocortisona, dexametasona, clorambucilo, DHEA, danazol, bromocriptina, meloxicam, infliximab
Tratamiento de enfermedades infecciosas
Los conjugados a modo de ejemplo son utiles para destruir o inhibir la multiplicacion de una celula que produce una enfermedad infecciosa o para tratar una enfermedad infecciosa. Los conjugados a modo de ejemplo pueden usarse, en consecuencia, en diversas configuraciones para el tratamiento de una enfermedad infecciosa en un paciente. Los conjugados farmaco-enlazador-ligando pueden usarse para suministrar un farmaco a una celula diana. En un ejemplo, la unidad de ligando se une a la celula de la enfermedad infecciosa.
Los conjugados pueden destruir o inhibir la multiplicacion de celulas que producen una enfermedad infecciosa particular.
Los tipos particulares de enfermedades infecciosas que pueden tratarse con los conjugados a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, los desvelados en la Tabla 5.
TABLA 5
Enfermedades bacterianas:
difteria, tosferina, bacteriemia oculta, infeccion del tracto urinario, gastroenteritis, celulitis, epiglotitis, traqueltis, hipertrofia de la adenoides, absceso retrofarlngeo, impetigo, ectima, neumonla, endocarditis, artritis septica, neumococos, peritonitis, bacteriemia, meningitis, meningitis purulenta aguda, uretritis, cervicitis, proctitis, faringitis, salpingitis, epididimitis, gonorrea, slfilis, listeriosis, antrax, nocardiosis, salmonella, fiebre tifoidea, disenterla, conjuntivitis, sinusitis, brucelosis, tularemia, colera, peste bubonica, tetanos, enteritis necrotizante, actinomicosis, infecciones anaerobias mixtas, slfilis, fiebre recurrente, leptospirosis, enfermedad de Lyme, fiebre por mordedura de rata, tuberculosis, linfadenitis, lepra, clamidia, neumonla por clamidia, tracoma, conjuntivitis por inclusion
Enfermedades fungicas sistemicas:
Histoplasmosis, coccidioidomicosis, blastomicosis, esporotricosis, criptococosis, candidiasis sistemica, aspergilosis, mucormicosis, micetoma, cromomicosis
Enfermedades por Rickettsias:
Tifus, rickettsiosis exantematica, ehrlichiosis, rickettsiosis transmitida por garrapatas orientales, rickettsiosis pustulosa, fiebre Q, bartonelosis
Enfermedades parasitarias:
Malaria, babesiosis, enfermedad del sueno africana, enfermedad de Chagas, leishmaniasis, fiebre Dum-Dum, toxoplasmosis, meningoencefalitis, queratitis, entamebiasis, giardiasis, criptosporidiasis, isosporiasis, ciclosporiasis, microsporidiosis, ascariasis, infeccion por tricuros, infeccion por anquilostoma, infeccion por nematodos, larva migratoria ocular, triquinosis, dracunculosis, filariasis linfatica, loiasis, oncocercosis, infeccion canina por Dirofilaria immitis, esquistosomiasis, cercariosis cutanea, infeccion por Paragonimus westermanii, infeccion por Clonorchis sinensis, fascioliasis, fasciolopsiasis, opistorquiasis, infecciones por tenia, hidatidosis, hidatidosis alveolar
Enfermedades virales:
Sarampion, panencefalitis esclerosante subaguda, resfriado comun, paperas, rubeola, roseola, eritema infeccioso, varicela, infeccion por virus sincitial respiratorio, crup, bronquiolitis, mononucleosis infecciosa, poliomielitis, herpangina, fiebre aftosa, enfermedad de Bornholm, herpes genital, verrugas genitales, meningitis aseptica, miocarditis, pericarditis, gastroenteritis, slndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), virus de inmunodeficiencia humana (VIH), slndrome de Reye, slndrome de Kawasaki, gripe, bronquitis, neumonla errante viral, enfermedad respiratoria febril aguda, fiebre faringoconjuntival aguda, queratoconjuntivitis epidemica, virus del herpes simple 1 (HSV-1), virus del herpes simple tipo 2 (VHS-2), herpes zoster, citomegalovirosis, rabia, leucoencefalopatla multifocal progresiva, Kuru, insomnio letal familiar, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, paraparesia espastica tropical, encefalitis equina occidental, encefalitis de California, encefalitis de San Luis, fiebre amarilla, dengue, coriomeningitis linfocltica, fiebre de Lassa, fiebre hemorragica, slndrome pulmonar por Hantavirus, infecciones por virus de Marburgo, infecciones por virus del Ebola, viruela
Terapia de enfermedades infecciosas con multiples farmacos
Se desvelan metodos para el tratamiento de una enfermedad infecciosa incluyendo la administracion a un paciente que lo necesita un conjugado a modo de ejemplo y otro agente terapeutico que es un agente anti-enfermedad infecciosa. En un ejemplo, el agente anti-enfermedad infecciosa es, pero no se limita a, agentes enumerados en la Tabla 6.
TABLA 6
Antibioticos p-lactamicos:
Penicilina G, penicilina V, Cloxacilina, dicloxacilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, ampicilina, amoxicilina, bacampicilina, azlocilina, carbenicilina, mezlocilina, piperacilina, ticarcilina
Aminoglucosidos:
Amikacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, estreptomicina, tobramicina
Macrolidos:
Azitromicina, claritromicina eritromicina, lincomicina, clindamicina
Tetraciclinas:
Demeclociclina, doxiciclina, minociclina, oxitetraciclina, tetraciclina
Quinolonas:
Cinoxacina, acido nalidlxico
Fluoroquinolonas:
Ciprofloxacino, enoxacino, grepafloxacino, levofloxacino, lomefloxacino, norfloxacino, ofloxacino, esparfloxacino, trovafloxicino
Polipeptidos:
Bacitracina, colistina, polimixina B
Sulfonamidas:
Sulfisoxazol, sulfametoxazol, sulfadiazina, sulfametizol, sulfacetamida
Agentes antibacterianos diversos:
Trimetoprim, sulfametazol, cloranfenicol, vancomicina, metronidazol, quinupristina, dalfopristina, rifampicina, espectinomicina, nitrofurantoina
Agentes antivirales:
Agentes antivirales generales:
Idoxuradina, vidarabina, trifluridina, aciclovir, famciciclovir, penciciclovir, valaciclovir, ganciciclovir, foscarnet, ribavirina, amantadina, rimantadina, cidofovir, oligonucleotidos antisentido, inmunoglobulinas, interferones Farmacos para la infeccion por VIH:
Tenofovir, emtricitabina, zidovudina, didanosina, zalcitabina, estavudina, lamivudina, nevirapina, delavirdina, saquinavir, ritonavir, indinavir, nelfinavir
Ejemplos
Ejemplo 1 - Preparacion del compuesto AB
Figure imgf000102_0001
Se diluyo Fmoc-val-cit-PAB-OH (14,61 g, 24,3°mmol, 1,0 equiv.; vease, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. n.° 6.214.345 a Firestone et al.) con DMF (120 ml, 0,2 M) y a esta solucion se le anadio una dietilamina (60 ml). La reaccion se controlo mediante HPLC y se descubrio que se completo en 2 h. La mezcla de reaccion se concentro y el residuo resultante se precipito usando acetato de etilo (aproximadamente 100 ml) con ultrasonidos durante 10 min. Se anadio eter (200 ml) y el precipitado se sometio a ultrasonidos durante 5 minutos adicionales. La solucion se dejo reposar durante 30 min sin agitacion y despues se filtro y se seco a alto vacio para proporcionar Val-cit-PAB-OH, que se uso en la siguiente etapa sin purification adicional. Rendimiento: 8,84 g (96 %). Se diluyo Val-cit-PAB-OH (8,0 g, 21°mmol) con DMF (110 ml) y la solucion resultante se trato con MC-OSu (Willner et al., 1993, Bioconjugate Chem. 4: 521; 6,5 g, 21°mmol, 1,0 equiv.). La reaccion se completo de acuerdo con el analisis por HPLC despues de 2 h. La mezcla de reaccion se concentro y el aceite resultante se precipito usando acetato de etilo (50 ml). Despues del tratamiento con ultrasonidos durante 15 minutos, se anadio eter (400 ml) y la mezcla se sometio a ultrasonidos adicionalmente hasta que todas las particulas grandes se rompieron. Despues, la solucion se filtro y el solido se seco para proporcionar un intermedio solido de color blanquecino. Rendimiento: 11,63 g (96 %); EN-EM m/z 757,9 [M-H]
El intermedio solido de color blanquecino (8,0 g, 14,0°mmol) se diluyo con DMF (120 ml, 0,12 M) y a la solucion resultante se le anadio bis(4-nitrofenil)carbonato (8,5 g, 28,0°mmol, 2,0 equiv.) y DIEA (3,66 ml, 21,0°mmol, 1,5 equiv.). La reaccion se completo en 1 h de acuerdo con el analisis por HPLC. La mezcla de reaccion se concentro para proporcionar un aceite que se precipito con EtOAc y despues se trituro con EtOAc (aproximadamente 25 ml). El soluto se precipito adicionalmente con eter (aproximadamente 200 ml) y se trituro durante 15 minutos. El solido se filtro y se seco a alto vacio para proporcionar el Compuesto AB, que tenia una pureza del 93 % de acuerdo con el analisis por HPLC y se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional. Rendimiento: 9,7 g (94 %).
Ejemplo 2 - Preparacion de compuestos MMAZ mediante sfntesis en fase solida
Figure imgf000102_0002
Se prepararon resinas Fmoc-aminoacido-2-clorotritilo (SP1) de acuerdo con el Procedimiento General SP(a). Los siguientes ejemplos ilustran la preparacion de ciertas resinas.
Resina de Fmoc-2-cloro-Phe-2-clorotritilo (SP1-z)
Se disolvio Fmoc-2-cloro-L-fenilalanina (354 mg, 0,84°mmol) en CH2O 2 anhidro (4 ml) y DIEA (585 pl, 3,36°mmol, 4 equiv). La solucion resultante se anadio a una jeringa de 10 ml que contenla resina de cloruro de 2-clorotritilo (500 mg, 0,70°mmol, 1,4°mmol/g). La mezcla se agito durante 6 horas a temperatura ambiente. La resina se filtro, se lavo con DCM/MeOH/DlEA (17:2:1; 5 ml, 4 veces), MeOH (5 ml, 1 vez), DCM (5 ml, 4 veces), DMF (5 ml, 4 veces), DCM (5 ml, 2 veces) y eter etllico (5 ml, 4 veces) y se seco al vaclo durante 2 h. La resina se dejo al vaclo durante la noche. La carga se determino mediante cuantificacion de Fmoc. Una cantidad conocida (4,4 mg) de resina de 2-cloro-Phe-2-clorotritilo se peso en un matraz aforado de 10 ml. Al matraz se le transfirio piperidina al 20 %/DMF (2 ml). La mezcla se dejo escindir durante 1 h, con agitacion ocasional a mano. Al matraz se le transfirio DMF (8 ml) para llevar el volumen total a 10 ml. Una solucion de blanco se preparo con 10 ml de piperidina al 20 %/DMF en un matraz aforado de 10 ml. El espectrofotometro se puso a cero con la solucion de blanco. La absorbancia se midio a 301 nm y el nivel de carga se proporciono por:
Carga (mmol/g) = A301 * 10 ml/7800 * peso
A301 es la absorbancia a 301 nm, 7800 es el coeficiente de extincion del aducto de piperidina-fluorenona y peso es el peso de la resina utilizada en miligramos. La cuantificacion de Fmoc se realiza generalmente por duplicado. Se determino que el nivel de carga de la resina Fmoc-2-cloro-Phe-2-clorotritilo era de 0,612°mmol/g.
Resina de Fmoc-Me-Phe-2-clorotritilo (SP1-b)
Se cargo Fmoc-Me-L-fenilalanina (337 mg, 0,84°mmol) en resina de cloruro de 2-clorotritilo como se ha descrito en el Procedimiento general SP(a). Se determino que el nivel de carga de la resina de Fmoc-Me-L-Phe-2-clorotritilo era de 0,4908°mmol/g.
Resina de Fmoc-Tic-2-clorotritilo (SP1-c)
Se cargo Fmoc-Tic-OH (335 mg, 0,84°mmol) en resina de cloruro de 2-clorotritilo como se ha descrito en el Procedimiento general SP(a). Se determino que el nivel de carga de la resina de Fmoc-Tic-2-clorotritilo era de 0,638°mmol/g.
Resina de Fmoc-L-B-homoPhe-2-clorotritilo (SP1-d)
Se cargo Fmoc-L-p-homofenilalanina (337 mg, 0,84°mmol) en resina de cloruro de 2-clorotritilo como se ha descrito en el Procedimiento general SP(a). Se determino que el nivel de carga de la resina de Fmoc-L-p-homoPhe-2-clorotritilo era de 0,579°mmol/g.
Resina de Boc-p-amino-Phe(Fmoc)-2-clorotritilo (SP1-e)
Se cargo Boc-p-amino-Phe(Fmoc)-OH (704 mg, 0,70°mmol) en resina de cloruro de 2-clorotritilo como se ha descrito en el Procedimiento general SP(a). Se determino que el nivel de carga de la resina de Boc-p-amino-Phe(Fmoc)-2-clorotritilo era de 0,650°mmol/g.
Resina de Fmoc-3-ciclohexil-L-Ala-2-clorotritilo (SP1-f)
Se cargo Fmoc-3-ciclohexil-L-alanina (550 mg, 0,70°mmol) en resina de cloruro de 2-clorotritilo como se ha descrito en el Procedimiento general SP(a). Se determino que el nivel de carga de la resina de Fmoc-3-ciclohexil-L-Ala-2-clorotritilo era de 0,660°mmol/g.
Resina de Fmoc-L-4-Tiazolilalanina-2-clorotritilo (SP1-g)
Se cargo Fmoc-L-4-Tiazolilalanina (552 mg, 0,70°mmol) en resina de cloruro de 2-clorotritilo como se ha descrito en el Procedimiento general SP(a). Se determino que el nivel de carga de la resina de Fmoc-L-4-Tiazolilalanina-2-clorotritilo era de 0,790°mmol/g.
Resina de Fmoc-3-(3-piridil)-L-Ala-2-clorotritilo (SP1-h)
Se cargo Fmoc-3-(3-piridil)-L-alanina (543 mg, 0,70°mmol) en resina de cloruro de 2-clorotritilo como se ha descrito en el Procedimiento general SP(a). Se determino que el nivel de carga de la resina de Fmoc-3-(3-piridil)-L-Ala-2-clorotritilo era de 0,790°mmol/g.
La cuantificacion de Fmoc de resinas pre-cargados disponibles en el mercado se realizo de acuerdo con el Procedimiento General SP(b).
Resina de H-Leu-2-clorotritilo (SP1-i)
Se disolvio Fmoc-Cl (259 mg, 1°mmol) en CH2CI2 anhidro (2 ml) para hacer una solucion de trabajo 0,5 M. La solucion se transfirio a una jeringa de plastico de 3 ml que contenla resina de H-Leu-2-clorotritilo (25 mg, 0,86°mmol/g, 0,0215°mmol). La mezcla se agito durante 2 horas. La resina se filtro y se lavo con DMF (5 ml, 2 veces), CH2O 2 (5 ml, 2 veces) y eter etllico (5 ml, 2 veces) y se seco al vaclo durante 2 horas. La resina se ensayo mediante el ensayo de amina de Kaiser. Tras los resultados negativos (amina libre completamente protegida), se realizo la cuantificacion de Fmoc para obtener el nivel de carga, como se ha descrito en el Procedimiento general SP(a). Se determino que nivel de carga de la resina de H-Leu-2-clorotritilo era de 0,85°mmol/g.
Resina de H-Met-2-clorotritilo (SP1-j)
Se acilo resina de H-Met-2-clorotritilo (25 mg, 0,64°mmol/g, 0,016°mmol) con un exceso de Fmoc-Cl (259 mg, 1°mmol), como se ha descrito en el Procedimiento general SP(b). Se determino que el nivel de carga de la resina de H-Met-2-clorotritilo era de 0,27°mmol/g.
Resina de H-Trp(Boc)-2-clorotritilo (SP1-k)
Se acilo resina de H-Trp(Boc)-2-clorotritilo (25 mg, 0,74°mmol/g, 0,033°mmol) con un exceso de Fmoc-Cl (259 mg, 1°mmol), como se ha descrito en el Procedimiento general SP(b). Se determino que el nivel de carga de la resina de H-Trp(Boc)-2-clorotritilo era de 0,70°mmol/g.
H-Glu(OtBu)-2-clorotritilo resina (SP1-l)
Se acilo resina de H-Glu(OtBu)-2-clorotritilo (25 mg, 0,90°mmol/g, 0,022°mmol) con un exceso de Fmoc-Cl (259 mg, 1°mmol), como se ha descrito en el Procedimiento general SP(b). Se determino que el nivel de carga de la resina de H-Glu(OtBu)-2-clorotritilo era de 0,88°mmol/g.
Resina de MeVal-Val-Dil-Dap-2-cloro-Phe-2-clorotritilo
Se preparo resina de MeVal-Val-Dil-Dap-2-cloro-Phe-2-clorotritilo siguiendo el Procedimiento general SP(c). Brevemente, se anadio una piperidina al 20 % en solucion de DMF (5 ml) a la jeringa que contenla resina de Fmoc-2-cloro-Phe-2-clorotritilo y la mezcla se agito durante 2 horas. La resina se filtro, se lavo con DMF (5 ml, 4 veces), DCM (5 ml, 4 veces), DMF (5 ml, 4 veces), DCM (5 ml, 4 veces) y eter etllico (5 ml, 4 veces) y se seco al vaclo durante 2 h.
Se disolvieron Fmoc-Dap (278 mg, 0,680°mmol) y HATU (259 mg, 0,680°mmol, 2 equiv.) en DMF anhidro (5 ml) y DIEA (237 pl, 1,36°mmol, 4 equiv.). La solucion resultante se transfirio a la jeringa de plastico de 10 ml que contenla resina de H-2-cloro-Phe-2-clorotritilo (555,6 mg, 0,340°mmol). La mezcla se agito durante la noche a temperatura ambiente. La finalizacion de la reaccion se determino mediante el ensayo de amina de Kaiser y el analisis por CLEM de material retirado por escision de una pequena cantidad de resina (usando TFA al 2 %/CH2Cl2). La resina se filtro, se lavo con DMF (5 ml, 4 veces), DCM (5 ml, 4 veces), DMF (5 ml, 4 veces), DCM (5 ml, 4 veces) y eter etllico (5 ml, 4 veces) y se seco al vaclo durante 2 h.
Se anadio piperidina al 20 % en solucion de DMF (5 ml) a la jeringa que contenla resina de Fmoc-Dap-2-cloro-Phe-2-clorotritilo y la mezcla se agito durante 2 horas. La resina se filtro, se lavo con DMF (5 ml, 4 veces), DCM (5 ml, 4 veces), DMF (5 ml, 4 veces), DCM (5 ml, 4 veces) y eter etllico (5 ml, 4 veces) y se seco al vaclo durante 2 h.
Se disolvieron Fmoc-MeVal-Val-Dil-OH (510 mg, 0,680°mmol, 2 equiv.) y HATU (259 mg, 0,680°mmol, 2 equiv.) en DMF anhidro (5 ml) y DIEA (237 pl, 1,70°mmol, 5 equiv.). La solucion resultante se transfirio a la jeringa de plastico de 10 ml que contenla resina de H-Dap-2-cloro-Phe-2-clorotritilo. La mezcla se agito durante 6 horas. La finalizacion de la reaccion se determino mediante analisis por CLEM del material retirado por escision de una pequena cantidad de resina (usando TFA al 2 %/CH2Cl2). La resina se filtro, se lavo con DMF (5 ml, 4 veces), DCM (5 ml, 4 veces), DMF (5 ml, 4 veces), DCM (5 ml, 4 veces) y eter etllico (5 ml, 4 veces) y se seco al vaclo durante 2 h.
MeVal-Val-Dil-Dap-2-cloro-Phe-OH (SP2-a)
Se preparo MeVal-Val-Dil-Dap-2-cloro-Phe siguiendo el Procedimiento general SP(d). Brevemente, se anadio piperidina al 20 % en solucion de DMF (5 ml) a la jeringa que contenla la resina de Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-2-cloro-Phe-2-clorotritilo y la mezcla se agito durante 2 horas. La resina se filtro, se lavo con DMF (5 ml, 4 veces), DCM (5 ml, 4 veces), DMF (5 ml, 4 veces), DCM (5 ml, 4 veces) y eter etllico (5 ml, 4 veces) y se seco al vaclo durante 2 h. Se consiguio un secado adicional dejando resina durante la noche al vaclo.
Una solucion de TFA al 2 %/CH2Cl2 (5 ml) se transfirio a una jeringa de plastico de 10 ml que contenla resina de MeVal-Val-Dil-Dap-2-cloro-Phe-2-clorotritilo y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 5 minutos. El filtrado se recogio en un matraz de fondo redondo de 100 ml. El proceso se repitio tres veces. El filtrado se evaporo para dejar un solido de color blanco. La purification mediante HPLC preparativa proporciono 200 mg (67 % de sal de TFA) de un solido de color blanco. Analisis por HPLC de fase inversa: 96 % a los 6,72 minutos. CL-EM m/z (EN+) calculado para C39H64ClN5O8, 765,44; encontrado 767,063 (M+H)+.
Resina de Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-Me-Phe-2-clorotritilo
Se acoplaron Fmoc-Dap-OH y Fmoc-MeVal-Val-Dil-OH, respectivamente, en resina de H-Me-L-Phe-2-clorotritilo como se ha descrito en el Procedimiento general SP(c).
MeVal-Val-Dil-Dap-Me-Phe-OH (SP2-b)
Se retiro MeVal-Val-Dil-Dap-Me-Phe-OH por escision de la resina como se ha descrito en el Procedimiento general SP(d). El filtrado se evaporo para dejar un solido de color blanco. La purificacion mediante HPLC preparativa proporciono 62,3 mg (26 % de sal de TFA) de un solido de color blanco. Analisis por HPLC de fase inversa: 98 % a los 6,88 minutos. CL-Em m/z (EN+) calculado para C40H67N5O8, 745,5; encontrado 746,908 (M+H)+.
Resina de Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-Tic-2-clorotritilo
Se acoplaron Fmoc-Dap-OH y Fmoc-MeVal-Val-Dil-OH, respectivamente, en resina de H-Tic-2-clorotritilo como se ha descrito en el Procedimiento general SP(c).
MeVal-Val-Dil-Dap-Tic-OH (SP2-c)
Se retiro MeVal-Val-Dil-Dap-Tic-OH por escision de la resina como se ha descrito en el Procedimiento general SP(d). El filtrado se evaporo para dejar un solido de color blanco. La purificacion mediante HPLC preparativa proporciono 178,40 mg (55 % de sal de t Fa ) de un solido de color blanco. Analisis por HPLC de fase inversa: 98 % a los 6,74 minutos. CL-EM m/z (EN+) calculado para C40H65N5O8, 743,48; encontrado, 744,839 (M+H)+.
Resina de Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-L-B-homoPhe-2-clorotritilo
Se acoplaron Fmoc-Dap-OH y Fmoc-MeVal-Val-Dil-OH, respectivamente, en resina de resina de H-L-p-homoPhe-2-clorotritilo como se ha descrito en el Procedimiento general SP(c).
MeVal-Val-Dil-Dap-L-B-homoPhe-OH (SP2-d)
Se retiro MeVal-Val -Dil-Dap-L-p-homoPhe-OH por escision de la resina como se ha descrito en el Procedimiento general SP(d). El filtrado se evaporo para dejar un solido de color blanco. La purificacion mediante HPLC preparativa proporciono 282,9 mg (99 % de sal de TFA) de un solido de color blanco. Analisis por HPLC de fase inversa: 98 % a los 6,65 minutos. CL-EM m/z (EN+) calculado para C40H67N5O8, 745,5; encontrado, 746,869 (M+H)+.
Resina de Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-Boc-p-amino-Phe-2-clorotritilo
Se acoplaron Fmoc-Dap-OH y Fmoc-MeVal-Val-Dil-OH, respectivamente, en una resina de Boc-p-amino-Phe-2-clorotritilo como se ha descrito en el Procedimiento general SP(c).
MeVal-Val-Dil-Dap-Boc-p-amino-Phe-OH (SP2-e)
Se retiro MeVal-Val-Dil-Dap-Boc-p-amino-Phe-OH por escision de la resina como se ha descrito en el Procedimiento general SP(d). El filtrado se evaporo para dejar un solido de color blanco. La purificacion mediante HPLC preparativa proporciono 210,6 mg (48 % de sal de TFA) de un solido de color blanco. Analisis por HPLC de fase inversa: 98 % en 6,9 minutos. CL-EM m/z (EN+) calculado para C44H74N6O10, 846,55; encontrado, 847,459 (M+H)+.
Resina de Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-3-ciclohexil-L-Ala-2-clorotritilo
Se acoplaron Fmoc-Dap-OH y Fmoc-MeVal-Val-Dil-OH, respectivamente, en una resina de H-3-ciclohexil-L-Ala-2-clorotritilo como se ha descrito en el Procedimiento general SP(c).
MeVal-Val-Dil-Dap-3-ciclohexil-L-Ala-OH (SP2-f)
Se retiro MeVal-Val-Dil-Dap-3-ciclohexil-L-Ala-OH por escision de la resina como se ha descrito en el Procedimiento general SP(d). El filtrado se evaporo para dejar un solido de color blanco. La purificacion mediante HPLC preparativa proporciono 343,4 mg (99 % de sal de TFA) de un solido de color blanco. Analisis por HPLC de fase inversa: 98 % a los 6,87 minutos. CL-EM m/z (EN+) calculado para C39H71N5O85, 737,53; encontrado, 738,974 (M+H)+.
Resina de Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-L-4-Tiazolilalanina-2-clorotritilo
Se acoplaron Fmoc-Dap-OH y Fmoc-MeVal-Val-Dil-OH, respectivamente, en resina de H-L-4-Tiazolilalanina-2-clorotritilo como se ha descrito en el Procedimiento general SP(c).
MeVal-Val-Dil-Dap-L-4-Tiazolilalanina (SP2-g)
Se retiro MeVal-Val-Dil-Dap-L-4-Tiazolilalanina por escision de la resina como se ha descrito en el Procedimiento general SP(d). El filtrado se evaporo para dejar un solido de color blanco. La purificacion mediante HPLC preparativa proporciono 357 mg (87 % de sal de TFA) de un solido de color blanco. Analisis por HPLC de fase inversa: 98 % a los 6,23 minutos. CL-EM m/z (EN+) calculado para C39H62N6O8S, 738,43; encontrado, 739,889 (M+H)+.
Resina de Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-3-(3-piridil)-L-Ala-2-clorotritilo
Se acoplaron Fmoc-Dap-OH y Fmoc-MeVal-Val -Dil-OH, respectivamente, en resina de H-3-(3-piridil)-L-Ala-2-Clorotritilo como se ha descrito en el Procedimiento general SP(c).
MeVal-Val-Dil-Dap-3 (3-piridil)-L-Ala-OH (SP2-h)
Se retiro MeVal-Val-Dil-Dap-3-(3-piridil)-L-Ala-OH por escision de la resina como se ha descrito en el Procedimiento general SP(d). El filtrado se evaporo para dejar un solido de color blanco. La purificacion mediante HPLC preparativa proporciono 388,6 mg (94 % de sal de TFA) de un solido de color blanco. Analisis por HPLC de fase inversa: 98 % a 6,13 minutos. CL-EM m/z (EN+) calculado para C38H64N6O8, 732,48; encontrado, 733,842 (M+H)+.
Resina de Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-Leu-2-clorotritilo
Se acoplaron Fmoc-Dap-OH y Fmoc-MeVal-Val-Dil-OH, respectivamente, en resina de H-Leu-2-clorotritilo como se ha descrito en el Procedimiento general SP(c).
MeVal-Val-Dil-Dap-Leu-OH (SP2-i)
Se retiro MeVal-Val-Dil-Dap-Leu-OH por escision de la resina como se ha descrito en el Procedimiento general SP(d). El filtrado se evaporo para dejar un solido de color blanco. La purificacion mediante HPLC preparativa proporciono 217,4 mg (62 % de sal de TFA) de un solido de color blanco. Analisis por HPLC de fase inversa: 98 % a los 6,43 minutos. CL-EM m/z (EN+) calculado para C36H67N6O8, 697,5; encontrado 698,999 (M+H)+.
Resina de Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-Met-2-clorotritilo
Se acoplaron Fmoc-Dap-OH y Fmoc-MeVal-Val-Dil-OH, respectivamente, en resina de H-Met-2-clorotritilo como se ha descrito en el Procedimiento general SP(c).
MeVal-Val-Dil-Dap-Met-OH (SP2-j)
Se retiro MeVal-Val-Dil-Dap-Met-OH por escision de la resina como se ha descrito en el Procedimiento general SP(d). El filtrado se evaporo para dejar un solido de color blanco. La purificacion mediante HPLC preparativa proporciono 90,7 mg (82 % de sal de TFA) de un solido de color blanco. Analisis por HPLC de fase inversa: 98 % a los 6,39 minutos. CL-EM m/z (EN+) calculado para C35H65N5O8S, 715,46; encontrado 716,399 (M+H)+.
Resina de Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-Trp(Boc)-2-clorotritilo
Se acoplaron Fmoc-Dap-OH y Fmoc-MeVal-Val-Dil-OH, respectivamente, en resina de H-Trp-(Boc)-2-clorotritilo como se ha descrito en el Procedimiento general SP(c).
Trp MeVal-Val-Dil-DAP-OH (Boc) (P2-k)
Se retiro MeVal-Val-Dil-Dap-Trp(Boc)-OH por escision de la resina como se ha descrito en el Procedimiento general SP(d). El filtrado se evaporo para dejar un solido de color blanco. La purificacion mediante HPLC preparativa proporciono 151,7 mg (42 % de sal de TFA) de un solido de color blanco. Analisis por HPLC de fase inversa: 98 % a los 7,39 minutos. CL-EM m/z (EN+) calculado para C46H74N6O10, 870,55; encontrado 871,645 (M+H)+.
Resina de Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-Glu(OtBu)-2-clorotritilo
Se acoplaron Fmoc-Dap-OH y Fmoc-MeVal-Val-Dil-OH, respectivamente, en resina de H-Glu(OtBu)-2-clorotritilo como se ha descrito en el Procedimiento general SP(c).
MeVal-Val-Dil-Dap-Glu(OtBu)-OH (SP2-1)
Se retiro MeVal-Val-Dil-Dap-Glu(OtBu)-OH por escision de la resina como se ha descrito en el Procedimiento general SP(d). El filtrado se evaporo para dejar un solido de color blanco. La purificacion mediante HPLC preparativa proporciono 219,4 mg (55 % de sal de TFA) de un solido de color blanco. Analisis por HPLC de fase inversa: 98 % a los 6,67 minutos. CL-EM m/z (EN+) calculado para C39H71N5O10, 769,52; encontrado 770,989 (M+H)+.
Ejemplo 3. Preparacion de MC-Val-Cit-PAB-MMAZ
Figure imgf000107_0001
Meleimidocaproil-Val-Cit-PAB-MeVal-Val-Dil-DAP-2-cloro-Phe-OH (SP3-a)
Se unio maleimidocaproil-Val-Cit-PAB-OCOpNP a MeVal-Val-Dil-Dap-2-cloro-Phe-OH como se ha descrito en el Procedimiento general H. La purificacion mediante HPLC preparativa proporciono 13,50 mg (14 %) de un solido de color blanco. Analisis por HPLC de fase inversa: 96 % a los 7,23 minutos. CL-EM m/z (EN+) calculado para C68H102ClN11O16, 1363,72; encontrado 1364,766 (M+H)+.
Maleimidocaproil-Val-Cit-PAB-MeVal-Val-Dil-Dap-Me-Phe-OH (SP3-b)
Se unio maleimidocaproil-Val-Cit-PAB-OCOpNP a MeVal-Val-Dil-Dap-Me-Phe-OH como se ha descrito en el Procedimiento general H. La purificacion mediante HPLC preparativa proporciono 17,1 mg (13 %) de un solido de color blanco. Analisis por HPLC de fase inversa: 96 % a los 7,24 minutos. CL-EM m/z (EN+) calculado para C69H105N11O16, 1343,77; encontrado, m/z 1344,835 (M+H)+.
Maleimidocaproil-Val-Cit-PAB-MeVal-Val-Dil-Dap-Tic-OH (SP3-c)
Se unio maleimidocaproil-Val-Cit-PAB-OCOpNP a MeVal-Val-Dil-Dap-Tic-OH como se ha descrito en el Procedimiento general H. La purificacion mediante HPLC preparativa proporciono 2,7 mg (2 %) de un solido de color blanco. Analisis por HPLC de fase inversa: 95 % a los 7,21 minutos. Cl-EM m/z (EN+) calculado para C69H103N11O16, 1341,76; encontrado, m/z 1342,844 (M+H)+.
Maleimidocaproil-Val-Cit-PAB-MeVal-Val-Dil-Dap-L-B-homoPhe-OH (SP3-d)
Se unio maleimidocaproil-Val-Cit-PAB-OCOpNP a MeVal-Val-Dil-Dap-L-B-homoPhe-OH como se ha descrito en el Procedimiento general H. La purificacion mediante HPLC preparativa proporciono 3,1 mg (1,5 %) de un solido de color blanco. Analisis por HPLC de fase inversa: 95 % a los 7,26 minutos. CL-EM m/z (EN+) calculado para C69H105N11O16, 1343,77; encontrado, m/z 1344,788 (M+H)+.
Maleimidocaproil-Val-Cit-PAB-MeVal-Val-Dil-Dap-p-amino-Phe-OH (SP3-e)
Se unio maleimidocaproil-Val-Cit-PAB-OCOpNP a MeVal-Val-Dil-Dap-Boc-p-amino-Phe-OH como se ha descrito en el Procedimiento general H. La purificacion mediante HPLC preparativa proporciono 4,4 mg (2,5 %) de un solido de color blanco. Analisis por HPLC de fase inversa: 95 % a los 7,54 min. Cl Em calculado para C73H112N12O18 (MH)+ 1.444,82; encontrado, m/z 1445,972. Una solucion al 50 % de TFA/CH2O 2 (1 ml) se transfirio a maleimidocaproil-ValCit-PABC-MeVal-Val-Dil-Dap-Boc-p-amino-Phe-OH (3,0 mg, 0,00263°mmol). La desproteccion del grupo Boc se completo despues de 3 horas. El disolvente se retiro para dejar un solido de color blanco. La purificacion mediante HPLC preparativa proporciono 2,3 mg (82 %) de un solido de color blanco. Analisis por HPLC de fase inversa: 96 % a los 7,54 minutos. Cl-Em m/z (e N+) calculado para C68H104N12O16, 1344,77; encontrado, 1345,539 (M+H)+.
Maleimidocaproil-Val-Cit-PAB-MeVal-Val-Dil-DAP-3-ciclohexil-L-Ala-OH (SP3-f)
Se unio maleimidocaproil-Val-Cit-PAB-OCOpNP a MeVal-Val-Dil-Dap-3-ciclohexilo-L-Ala-OH como se ha descrito en el Procedimiento general H. La purificacion mediante HPLC preparativa proporciono 1,5 mg (1 %) de un solido de color blanco. Analisis por HPLC de fase inversa: 95 % a los 7,28 minutos. c L-EM m/z (EN+) calculado para C68H109N11O16, 1336,66; encontrado, 1337,166 (M+H)+.
Maleimidocaproil-Val-Cit-PAB-MeVal-Val-Dil-Dap-L-4-Tiazolilalanina (SP3-g)
Se unio maleimidocaproil-Val-Cit-PAB-OCOpNP a MeVal-Val-Dil-Dap-L-4-Tiazolialanina como se ha descrito en el Procedimiento general H. La purificacion mediante HPLC preparativa proporciono 0,5 mg (0,2 %) de un solido de color blanco. Analisis por HPLC de fase inversa: 96 % a los 6,91 minutos. CL-Em m/z (EN+) calculado para C65H100N12O16S, 1336,71; encontrado, 1337,867 (M+H)+.
Maleimidocaproil-Val-Cit-PAB-MeVal-Val-Dil-Dap-3 (3-piridil)-L-Ala-OH (SP3-h)
Se unio maleimidocaproil-Val-Cit-PAB-OCOpNP a MeVal-Val-Dil-Dap-3-(3-piridil)-L-Ala-OH como se ha descrito en el Procedimiento general H. La purificacion mediante HPLC preparativa proporciono 4,4 mg (1,6 %) de un solido de color blanco. Analisis por HPLC de fase inversa: 98 % a los 6,94 minutos. CL-EM m/z (EN+) calculado para C67H102N12O16, 1330,75; encontrado, 1331,682 (M+H)+.
Maleimidocaproil-Val-Cit-PAB-MeVal-Val-Dil-Dap-Leu-OH (SP3-i)
Se unio maleimidocaproil-Val-Cit-PAB-OCOpNP a MeVal-Val-Dil-Dap-Leu-OH como se ha descrito en el Procedimiento general H. La purificacion mediante HPLC preparativa proporciono 10,3 mg (4,1 %) de un solido de color blanco. Analisis por HPLC de fase inversa: 98 % a los 7,16 minutos. CL-EM m/z (EN+) calculado para C65H105N11O16, 1295,77; encontrado, 1296,524 (M+H)+.
Maleimidocaproil-Val-Cit-PAB-MeVal-Val-Dil-Dap-Met-OH (SP3-j)
Se unio maleimidocaproil-Val-Cit-PAB-OCOpNP a MeVal-Val-Dil-Dap-Met-OH como se ha descrito en el Procedimiento general H. La purificacion mediante HPLC preparativa proporciono 7,2 mg (6 %) de un solido de color blanco. Analisis por HPLC de fase inversa: 98 % a los 7,06 minutos. CL-EM m/z (EN+) calculado para C64H103N11O16S, 1313,73; encontrado 1314,729 (M+H)+.
Maleimidocaproil-Val-Cit-PAB-MeVal-Val-Dil-Dap-Trp(Boc)-OH (SP3-k)
Se unio maleimidocaproil-Val-Cit-PAB-OCOpNP a MeVal-Val-Dil-Dap-Trp(Boc)-OH como se ha descrito en el Procedimiento general H. La purificacion mediante HPLC preparativa proporciono 7,4 mg (12 %) de un solido de color blanco. Analisis por HPLC de fase inversa: 98 % a los 7,62 minutos. CL-EM m/z (EN+) calculado para C75H112N12O18, 1468,82; encontrado 1469,471 (M+H)+.
Maleimidocaproil-Val-Cit-PAB-MeVal-Val-Dil-Dap-Glu(OtBu)-OH (SP3-1)
Se unio maleimidocaproil-Val-Cit-PAB-OCOpNP a MeVal-Val-Dil-Dap-Glu(OtBu)-OH como se ha descrito en el Procedimiento general H. La purificacion mediante HPLC preparativa proporciono 2,9 mg (1,6 %) de un solido de color blanco. Analisis por HPLC de fase inversa: 95 % a los 7,47 minutos. CL-EM m/z (EN+) calculado para C68H109N11O18, 1367,8; encontrado 1368,452 (M+H)+.
Ejemplo 4. Preparacion de MMAZ (1) en fase de solucion
Figure imgf000108_0001
La slntesis de MMAZ se describe en los Esquemas 5 y 6. Pueden prepararse aminoacidos protegidos con Fmoc a partir de aminoacidos no protegidos usando, por ejemplo, Fmoc-OSu a traves de procedimientos bien establecidos (vease, por ejemplo, Greene y Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2a edicion, 1991, John Wiley & Sons, p.
506).
Preparacion de Fmoc-Dolaprolna (Fmoc-Dap)
Se suspendio Boc-Dolaprolna (58,8 g, 0,205 mol) en HCl 4 N en 1,4-dioxano (256 ml, 1,02 mol, Aldrich). Despues de agitar durante 1,5 horas, el analisis por TLC indico que la reaccion se habla completado (MeOH al 10 %/CH2Cl2) y la mezcla se concentro hasta casi sequedad. Se cargo de 1,4-dioxano (50 ml) adicional y la mezcla se concentro a sequedad y se seco al vaclo durante la noche. El solido de color blanco resultante se disolvio en H2O (400 ml) y se transfirio a un matraz de de fondo redondo de 3 l, de tres bocas, con un agitador mecanico y sonda de temperatura. Se anadio N,N-diisopropiletilamina (214,3 ml, 1,23 mol, Acros) a lo largo de un minuto, causando una exotermia de 20,5 a 28,2 °C (interna). La mezcla se enfrio en un bano de hielo y se anadio 1,4-dioxano (400 ml). Una solucion de Fmoc-OSu (89,90 g, 0,267 mol, Advanced Chem Tech) en 1,4-dioxano (400 ml) se anadio desde un embudo de adicion durante 15 minutos, manteniendo la temperatura de reaccion por debajo de 9 °C. La mezcla se dejo calentar a temperatura ambiente y se agito durante 19 horas, despues de lo cual la mezcla se concentro por evaporacion rotatoria a una suspension acuosa (390 g). La suspension se diluyo con H2O (750 ml) y Et2O (750 ml). Las capas se separaron, manteniendo cualquier solido con la capa organica. La capa acuosa se acidifico usando HCl conc. (30 ml) y se extrajo con EtOAc (500 ml, 3 veces). Los extractos combinados se secaron sobre MgSO4 , se filtraron y se concentraron. El extracto de Et2O se extrajo una vez con una solucion sat. de NaHCO3 (200 ml), manteniendo cualquier solido con la fase acuosa. La suspension acuosa se acidifico usando HCl conc. (50 ml) y se extrajo con Et2O (50 ml), manteniendo cualquier solido con la capa organica. La capa organica se filtro y se concentro. Los dos productos se combinaron y se purificaron mediante cromatografla ultrarrapida sobre gel de sllice eluyendo con CH2O 2 (3,5 l), despues MeOH al 3 %/CH2Cl2 (9 l) para proporcionar 68,23 g de Fmoc-Dolaprolna en forma de una espuma de color blanco (81 %, pureza del 97,5 % mediante Hp LC (ABC)).
Preparacion de Fmoc-Dap-Z
La sal y/o forma protegida del bioisostero de fenilalanina (3°mmol), W-Boc-Dolaprolna (668 mg, 1 equiv.), DEPC (820 pl, 1,5 equiv.) y DIEA (1,2 ml) se diluyeron con diclorometano (3 ml). Despues de 2 horas (h) a temperatura ambiente (aproximadamente 28 grados Celsius), la mezcla de reaccion se diluyo con diclorometano (20 ml), se lavo sucesivamente con una solucion acuosa saturada (ac.) de NaHCO3 (10 ml, 2 veces) y solucion ac. de NaCl (10 ml, 2 veces). La capa organica se separo y se concentro. El residuo resultante se volvio a suspender en acetato de etilo y se purifico mediante cromatografla ultrarrapida en acetato de etilo. Las fracciones pertinentes se combinaron y se concentraron para proporcionar el dipeptido. Los grupos protectores se escindieron por metodos conocidos para los expertos en la materia.
Preparacion alternativa de Fmoc-Dap-Z
Se suspendio Aminoacido Z con el grupo carboxi protegido (48,3°mmol) en DMF anhidra (105 ml, Acros) durante 5 minutos y se agrego Fmoc-Dap (19,80 g, 48,3°mmol). La mezcla se enfrio en un bano de hielo y se anadio TBTU (17,08 g, 53,20°mmol, Innovaciones Matrix). Se anadio N,N-diisopropiletilamina (25,3 ml, 145,0°mmol, Acros) mediante una jeringa durante 3 min. Despues de 1 hora, el bano de hielo se retiro y la mezcla se dejo calentar durante 30 min. La mezcla se vertio en agua (1 l) y se extrajo con acetato de etilo (300 ml). Despues de la separacion, la capa acuosa se volvio a extraer con acetato de etilo (150 ml, 2 veces). Las capas organicas combinadas se lavaron con salmuera (150 ml), se secaron (MgSO4) y se filtraron (papel de filtro) para retirar los productos insolubles (inorganicos y algunos de dibenzofulveno). Despues de la concentration, el residuo se adsorbio sobre sllice (41 g) y se purifico mediante cromatografla (columna de 22°cm * 8°cm; heptano al 65 %/EtOAc (2,5 l);. heptano al 33 %/EtOAc (3,8 l), para proporcionar el producto.
Preparacion de Dap-Z
Un matraz de fondo redondo de 1 l se cargo con Fmoc-Dap-Z, CH2O 2 (122 ml) y dietilamina (61 ml, Acros). La solucion se agito a temperatura ambiente y la finalization se controlo mediante HPLC. Despues de 7 horas, la mezcla se concentro (temperatura del bano < 30 °C). El residuo se suspendio en CH2O 2 (300 ml) y se concentro. Esto se repitio dos veces. Al residuo se le anadio MeOH (20 ml) y CH2O 2 (300 ml) y la solucion se concentro. El residuo se suspendio en CH2O 2 (100 ml) y tolueno (400 ml), se concentro y el residuo se dejo al vaclo durante la noche para proporcionar el producto.
Preparacion de Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-Z
El tripeptido Fmoc-MeVal-val-dil-O-t-Bu (preparado como se describe en el documento WO 02/088172, titulado "Pentapeptide Compound and Uses Related Thereto"; 0,73°mmol) se trato con TFA (3 ml) y diclorometano (3 ml) durante 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla se concentro a sequedad. El residuo se co-evaporo con tolueno (20 ml, 3 veces) y se seco al vaclo durante la noche. El residuo se diluyo con diclorometano (5 ml) y se anadio al dipeptido desprotegido (287 mg, 0,73°mmol), seguido de DIEA (550 pl, 4 equiv.) y DEPC (201 pl, 1,1 equiv.). Despues de 2 horas a temperatura ambiente, la mezcla de reaccion se diluyo con acetato de etilo (50 ml), se lavo sucesivamente con acido cltrico ac. al 10 % (20 ml, 2 veces), solucion ac. de NaHCO3 (10 ml, 2 veces) y NaCl ac. saturado (10 ml). La capa organica se separo y se concentro. El residuo resultante se volvio a suspender en acetato de etilo y se purifico mediante cromatografla ultrarrapida en acetato de etilo. Las fracciones relevantes se combinaron y se concentraron para proporcionar Fmoc-MeVal-val-dil-dap-Z.
Preparacion alternativa de Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-Z
Se suspendio Dap-Z en bruto (39,1°mmol) en DMF anhidro (135 ml, Acros) durante 5 minutos y se anadio Fmoc-MeVal-Val-Dil-OH (24,94 g, 39,1°mmol, vease el Ejemplo 2 para la preparacion). La mezcla se enfrio en un bano de hielo y se anadio TBTU (13,81 g, 43,0°mmol, Matrix Innovations). Se anadio N,N-diisopropiletilamina (20,5 ml, 117,3°mmol, Acros) mediante una jeringa durante 2 minutos. Despues de 1 hora, el bano de hielo se retiro y la mezcla se dejo calentar durante 30 min. La mezcla se vertio en agua (1,5 l) y se diluyo con acetato de etilo (480 ml). Despues de reposar durante 15 minutos, las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (300 ml). Las capas organicas combinadas se lavaron con salmuera (200 ml), se secaron (MgSO4) y se filtraron (papel de filtro), para eliminar los productos insolubles (inorganicos y algunos de dibenzofulveno). Despues de la concentracion, el residuo (49 g) se raspo del matraz y se adsorbio sobre sllice (49 g) y se purifico mediante cromatografla (columna de diametro 15°cm x 10°cm; EtOAc/heptano 2:1 (3 l), EtOAc (5 l); fracciones 250 ml) para proporcionar Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-Z.
Preparacion de MeVal-Val-Dil-Dap-Z
El producto (0,2°mmol) se diluyo con diclorometano (3 ml) y dietilamina (1 ml). La mezcla de reaccion se agito durante la noche a temperatura ambiente. Los disolventes se retiraron para proporcionar un aceite que se purifico mediante cromatografla en gel de sllice en un gradiente por etapas de MeOH al 0-10 % en diclorometano para proporcionar el Compuesto 1.
Utilizando el procedimiento anterior, se prepararon los compuestos de la siguiente formula:
Figure imgf000110_0001
Ejemplo 5 - Sfntesis de compuestos de MMAZ
Esta slntesis se describe la preparacion de compuestos de MMAZ en en los que
Figure imgf000110_0002
La 3-fenilserina esta disponible en Aldrich.
Sfntesis de dimetilvalina-Val-Dil-Dap-fenilserina
Figure imgf000110_0003
A una suspension de Fmoc-Dap (1,2 g, 2,93°mmol) en CH2O 2 anhidro (10 ml) se le anadio carbonato de N,N'disuccinimidilo (901 mg, 1,2 eq) seguido de DIEA (1,28 ml, 2,5 eq). La mezcla de reaccion se dejo en agitacion a temperatura ambiente durante la noche. Se cargaron cantidades adicionales de carbonato de N,N'-disuccinimidilo (901 mg, 1,2 eq), seguido de DIEA (1,28 ml, 2,5 eq) y se continuo agitando durante 18 h mas. La mezcla de reaccion se diluyo con EtOAc; la capa organica se lavo con HCl ac. 0,1 M dos veces, despues se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro al vaclo. La cromatografla en columna de gel de sllice en un gradiente escalonado de MeOH del 0 al 5 % en CH2O 2 proporciono 1,12 g (rendimiento del 75 %) de Fmoc-Dap-OSu en forma de una espuma de color blanco.
Se suspendio Fmoc-Dap-OSu (0,615 g, 1,21°mmol) en DMSO seco (6 ml). Se anadio D,L-treo-3-fenil serina (0,2 g, 1,1°mmol) y la mezcla de reaccion se agito durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla se cargo directamente en RP-HPLC preparativa y el producto se aislo en un gradiente lineal de MeCN del 10 al 90 % en TFA acuoso al 0,1 %. La Fmoc-Dap-fenilserina obtenida, 280 mg (rendimiento del 44 %), se suspendio en CH2O 2 seco (2 ml) y se trato con dimetilamina (2 ml) durante 4 horas a temperatura ambiente. Los productos volatiles se retiraron a presion reducida. El residuo se co-evaporo con Et3N/CH2Cl23 veces para retirar la mayor cantidad posible de dietilamina, despues se seco al vaclo durante la noche. El residuo se trituro con eter exhaustivamente para retirar el DBF. La Dap-fenilserina se seco y se uso sin purification adicional.
Se suspendieron dimetilVal-Val-Dil-COOH (130 mg, 0,3°mmol, 1 eq), N-hidroxisuccinimida (39 mg, 0,3°mmol, 1 eq) y DCC (93 mg, 1,5 eq) en CH2O 2 seco (1,5 ml). A esto, se le anadio DMAP (1 mg, cat.) y la mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante la noche. El precipitado se separo por filtracion. El dimetilVal-Val-Dil-OSu obtenido de este modo se suspendio en CH2O 2 (2 ml) y la mezcla se anadio a Dap-fenilserina, seguido de DMSO (4 ml) y DIEA (100 ul). La reaccion se dejo en agitacion a temperatura ambiente durante la noche. El precipitado se separo por filtracion. Se reemplazo el CH2O 2 por DMSO y el producto se aislo por RP-HPLC preparativa (gradiente lineal de MeCN, del 10 al 90 % en TFA ac. al 0,005 %) como dos diastereomeros. Isomero A: 84 mg, espuma de color blanco. CL-EM m/z (EN+) 762,67 (M+H)+ a 10,58 min. Isomero B: 62 mg de solido de color blanco. CL-EM m/z (EN+) 762,54 (M+H)+ a 10,67 min.
Sfntesis de N-metilvalina-Val-Dil-Dap-fenilserina
Figure imgf000111_0001
Puede prepararse MeVal-Val-Dil-Dap-fenilserina como se ha descrito anteriormente usando tripeptido de Fmoc-MeVal-Val-Dil. El Fmoc puede retirarse por escision mas tarde del farmaco final de acuerdo con el Procedimiento General E.
La 3-fenilserina apropiadamente protegida puede someterse a condiciones de oxidation, por ejemplo, clorocromato de piridinio (PCC)/piridina (vease, por ejemplo, Syntheses, 1982, 245, 881, revision), a fin de proporcionar la cetona correspondiente. La cetona puede convertirse ademas en diversos hidrazonas (hidrazonas, acil hidrazonas, semicarbazonas, tiosemicarbazonas, etc.) como se describe, por ejemplo, por Kaneko et al. Bioconjugate Chemistry, 1991,2(3), 133-141. Como alternativa el grupo hidroxilo de la 3-fenilserina protegida en el amino y el carboxilato puede condensarse facilmente con diversos acidos usando la qulmica DCC/DMAp para proporcionar esteres (Larock, R.C., Comprehensive Organic Transformations, Wiley-VCH, 1999, pag.1937).
El ester de metilfosfonato de 3-fenilserina puede generarse haciendo reaccionar diimidazolida metilfosfonica (a partir de dicloruro metilfosfonico disponible en el mercado, Aldrich) con 3-fenilserina protegida seguida de hidrolisis acuosa.
Figure imgf000111_0002
Puede generarse ester de fosfato de 3-fenilserina mediante un procedimiento similar a partir de oxicloruro de fosforo (Aldrich). Pueden usarse qulmicas similares a las descritas anteriormente para la preparation de diversos derivados de serina y treonina.
S e p re pa ra M M A Z usa nd o el an a lo g o de fe n ila la n in a a n te r io r y co n ju g a n d o con F m o c -M e V a l-va l-d il-O -t-B u s ig u ie n d o el p ro ce d im ie n to de l E je m p lo 4.
Ejemplo 6 - Sintesis de compuestos de MMAZ
Esta sintesis describe la preparacion de compuestos de MMAZ en los que
Figure imgf000112_0001
es
Figure imgf000112_0002
Pueden prepararse convenientemente diaminoacidos enantiomericamente puros que se muestran a continuation en los que Hal es un halogeno como se describe en Zhou et al. 1999, Tetrahedron: Asymmetry 10 (5): 855-862.
Figure imgf000112_0003
Se prepara MMAZ usando el analogo de fenilalanina anterior y conjugando con Fmoc-MeVal-val-dil-O-t-Bu siguiendo el procedimiento del Ejemplo 4.
Ejemplo 7 - Sintesis de compuestos de MMAZ
Esta sintesis describe la preparacion de compuestos de MMAZ en los que:
Figure imgf000112_0004
es
Figure imgf000112_0005
Pueden prepararse acido 3-aril-glutamico y otros acidos glutamicos y piroglutamicos 3-sustituidos como se describe en Tetrahedron 9 (2): 217-229 (2002) o Journal o f Organic Chemistry 66 (4): 1339-1350 (2001).
S e p re pa ra M M A Z usando el a n a lo g o de fe n ila la n in a a n te rio r y c o n ju g a n d o con F m o c -M e V a l-va l-d il-O -t-B u s ig u ie nd o el p ro ce d im ie n to del E je m p lo 4.
Ejemplo 8 - Sfntesis de compuestos de MMAZ
Esta slntesis describe la preparacion de compuestos de MMAZ en los que:
Figure imgf000113_0001
es
Figure imgf000113_0002
Puede prepararse 3-fenilcistelna como se describe en Lago et al., 1992, Journal of Organic Chemistry 57 (12): 3493­ 6.
Se prepara MMAZ usando el analogo de fenilalanina anterior y conjugando con Fmoc-MeVal-val-dil-O-t-Bu siguiendo el procedimiento del Ejemplo 4.
Ejemplo 9 - Sfntesis de compuestos de MMAZ
Esta slntesis describe la preparacion de compuestos de MMAZ en los que:
Figure imgf000113_0003
es
Figure imgf000113_0004
Puede sintetizarse 2-bromo-fenilalanina como se describe en Righi et al., 1996, Tetrahedron Letters 37 (38): 6893­ 6896.
Se prepara MMAZ usando el analogo de fenilalanina anterior y conjugando con Fmoc-MeVal-val-dil-O-t-Bu siguiendo el procedimiento del Ejemplo 4.
Ejemplo 10 - Sfntesis de compuestos de MMAZ
Esta slntesis describe la preparacion de compuestos de MMAZ en los que:
Figure imgf000114_0001
es
Figure imgf000114_0002
Los beta-alcoxi-aminoacidos anteriores, donde R = alquilo, ciclohexilo, fenilo, bencilo, etc., pueden sintetizarse como se describe en Bulletin of the Chemicals Society of Japan, 1982, 55 (9): 3049-50.
Se prepara MMAZ usando el analogo de fenilalanina anterior y conjugando con Fmoc-MeVal-val-dil-O-t-Bu siguiendo el procedimiento del Ejemplo 4.
Ejemplo 11 - Sintesis de compuestos de MMAZ
Esta sintesis describe la preparacion de compuestos de MMAZ en los que:
Figure imgf000114_0003
es
Figure imgf000114_0004
Los analogos de fenilalanina se sintetizan como se describe a continuacion. Se escindieron aziridinas (Azi) (a continuacionj, en las que Z = PhCH2O2C; R = H o Me y R1= PhCH2 o Me, mediante alcoholes, R2OH, en los que R2 = Me, Me2CH, EtCHMe, Me3C, ciclohexilo, PhCH2, Ph o similares, en presencia de BF3Et2O para proporcionar derivados de serina y treonina opticamente puros R2OCHRCH(NHZ)CO2R1. Estos ultimos se desprotegieron mediante hidrogenolisis y saponificacion para proporcionar el correspondiente R2OCHRCH(NH2)CO2H.
Figure imgf000114_0005
Se prepara MMAZ usando el analogo de fenilalanina anterior y conjugando con Fmoc-MeVal-val-dil-O-t-Bu siguiendo el procedimiento del Ejemplo 4.
Ejemplo 12 - Sfntesis de compuestos de MMAZ
Esta sfntesis describe la preparacion de compuestos de MMAZ en los que:
Figure imgf000115_0001
es
Figure imgf000115_0002
Se sintetizan deshidrofenilalanina y otros deshidroaminoacidos como se describe en Mathur et al., 2004, Biopolymers 76 (2): 150-161.
Se prepara MMAZ usando el analogo de fenilalanina anterior y conjugando con Fmoc-MeVal-val-dil-O-t-Bu siguiendo el procedimiento del Ejemplo 4.
Ejemplo 11 - Sfntesis de compuestos de MMAZ
Esta sfntesis describe la preparacion de compuestos de MMAZ en los que:
Figure imgf000115_0003
es
Figure imgf000115_0004
Pueden sintetizarse p,p-dimetil-fenilalanina y p,p-dimetil-tirosina como se describe por Jonsson y Mikiver, 1976, Acta Pharmaceutica Suecica 13 (1): 75-8. El calentamiento a reflujo de PhCMe2CH(CN)CO2Et con N2H4 en MeOH proporciona un 93 % de la hidrazida con un producto secundario de pirazolidina con un rendimiento del 3,5 %. La diazotacion secuencial, la degradacion de Curtius y la hidrolisis proporcionan un 74 % de PhCMe2CH(NH2)CO2H. Puede prepararse p,p-dimetiltirosina de manera similar.
Se prepara MMAZ usando el analogo de fenilalanina anterior y conjugando con Fmoc-MeVal-val-dil-O-t-Bu siguiendo el procedimiento del Ejemplo 4.
Ejemplo 14 - Sfntesis de compuestos de MMAZ
Esta sfntesis describe la preparacion de compuestos de MMAZ en los que:
Figure imgf000116_0001
es
Figure imgf000116_0002
Puede prepararse acido 4-(1-amino-2-feniletil)benzoico como se describe en Journal of Medicinal Chemistry 38 (10): 1600-7 (1995).
Se prepara MMAZ usando el analogo de fenilalanina anterior y conjugando con Fmoc-MeVal-val-dil-O-t-Bu siguiendo el procedimiento del Ejemplo 4.
Ejemplo 15 - Sfntesis de compuestos de MMAZ
Esta sfntesis describe la preparacion de compuestos de MMAZ en los que:
Figure imgf000116_0003
es
Figure imgf000116_0004
Los analogos de fenilalanina se sintetizan siguiendo los procedimientos descritos en Toth et al., 2004, Journal of the American Chemical Society 126 (34): 10538-10539.
S e p repa ra M M A Z usa nd o el an a lo g o de fe n ila la n in a a n te r io r y c o n ju g a n d o con F m o c -M e V a l-va l-d il-O -t-B u s ig u ie nd o el p ro ce d im ie n to de l E je m p lo 4.
Ejemplo 16 - Sfntesis de compuestos de MMAZ
Esta sfntesis describe la preparacion de compuestos de MMAZ en los que:
Figure imgf000117_0001
es
Figure imgf000117_0002
Se sintetizan analogos p,p-difluoro del acido a-oxo-p-fenilpropionico y fenilalanina como se muestra a continuacion siguiendo los procedimientos descritos en Schlosser et al., 2004, Tetrahedron 60 (35): 7731-7742 y Roff et al., 2004, Journal of the American Chemical Society 126 (13): 4098-4099. Un procedimiento simple de tres etapas convierte los (2-bromo-1,1-difluoroetil)arenos facilmente accesibles en a-aril-a,a-difluoroacetaldehfdos. Las posteriores hidrocianacion, hidrolisis, oxidacion e hidrolisis adicional proporcionaron acidos p-aril-p,p-difluoro-a-oxopropionicos. La aminacion reductora transforma los oxo acidos en una mezcla separable de a-hidroxiacidos y derivados de p,pdifluoro-p-fenilalanina racemica. Se obtiene p,p-difluorofenilalanina enantiomericamente pura cuando se condensa a,a-difluoro-a-fenilacetaldehfdo con 1-feniletilamina homoquiral, se anade cianuro de hidrogeno a la imina resultante, la mezcla diastereomerica producida de este modo se hidroliza a las carboxamidas que se pueden separar mediante cristalizacion fraccionada o cromatograffa.
Ejemplo 17 - Sfntesis de compuestos de MMAZ
Esta sfntesis describe la preparacion de compuestos de MMAZ en los que:
Figure imgf000117_0003
es
Figure imgf000117_0004
Puede prepararse una serie de diastereoisomeros ((2R,3S)-, (2S,3R)-, (2S,3S)- y (2R,3R)) de analogos de p-metil-parilalanina en forma enantiomericamente pura usando una combinacion de quimiocatalisis y biocatalisis. A partir de MeL-treoninato, se obtiene una gama de dideshidroaminoacidos p,p-disustituidos en forma de sus isomeros (Z). La hidrogenacion asimetrica, usando ya sea [Rh(R,R)-Et-DuPhos(COD)]BF4 o [Rh(S,S)-Et-DuPhos(COD)]BF4 como catalizador, seguida de hidrolisis proporciono los isomeros (2R,3S) y (2S,3R), respectivamente. La posterior estereoinversion enzimatica del isomero (2R,3S) con D-aminoacido oxidasa y la estereoinversion del isomero (2S,3R) con L-aminoacido oxidasa en combinacion con NH3^BH3 proporcionan los isomeros (2S,3S) y (2R,3R) restantes, respectivamente.
Ejemplo 18 - Sfntesis de compuestos de MMAZ
Esta sfntesis describe la preparacion de compuestos de MMAZ en los que:
Figure imgf000118_0001
es
Figure imgf000118_0002
Slntesis de acidos 2-amino-4-fosfonobutanoicos:
Los acidos 2-amino-4-fosfonobutanoicos anteriores, donde Ar = fenilo, 3-piridilo y 2-tienilo, se sintetizan como se describe en Ruiz et al., 2003, Journal of Organic Chemistry 68 (20): 7634-7645.
Se prepara MMAZ usando el analogo de fenilalanina anterior y conjugando con Fmoc-MeVal-val-dil-O-t-Bu siguiendo el procedimiento del Ejemplo 4.
Ejemplo 19 - Sintesis del MMAZ de la formula anterior en la que:
Las adiciones de conjugado de eteres de bislactima litiados derivados de ciclo[Gly-Val] y ciclo[Ala-Val] a vinilfosfonatos a-, p- o a,p-sustituidos permiten el acceso directo y estereoselectivo a diversos acidos 2-amino-4-fosfonobutanoicos 3- o 4-monosustituidos y 2,3-, 2,4- o 3,4-disustituidos (derivados AP4) en forma enantiomericamente pura. La estereoqulmica relativa puede asignarse mediante analisis por difraccion de rayos X o estudios por RMN de derivados de 1,2-oxafosforinano. Se recurre a estructuras del estado de transition "compacto" y "relajado" de 8 miembros, competitivas, parar racionalizar el resultado estereoqulmico de las adiciones de conjugado.
Ejemplo 20 - Sintesis de compuestos de MMAZ
Esta sintesis describe la preparation de compuestos de MMAZ en los que:
Figure imgf000118_0003
es
Figure imgf000118_0004
La sintesis de histidinas beta-sustituidas se describe en Wang et al., 2000, Tetrahedron Letters 41 (9): 1307-1310.
Se prepara MMAZ usando el analogo de fenilalanina anterior y conjugando con Fmoc-MeVal-val-dil-O-t-Bu siguiendo el procedimiento del Ejemplo 4.
Ejemplo 21 - Sintesis de compuestos de MMAZ
Esta sintesis describe la preparacion de compuestos de MMAZ en los que:
Figure imgf000119_0001
es
Figure imgf000119_0002
Se sintetizan beta-fluoroaminoacidos como se describe en Davis et al., 1999, Journal of Organic Chemistry 64 (18): 6931-6934.
Se prepara MMAZ usando el analogo de fenilalanina anterior y conjugando con Fmoc-MeVal-val-dil-O-t-Bu siguiendo el procedimiento del Ejemplo 4.
Ejemplo 22- Sfntesis de compuestos de MMAZ
Esta slntesis describe la preparacion de compuestos de MMAZ en los que:
Figure imgf000119_0003
es
Figure imgf000119_0004
Pueden prepararse acidos glutamicos beta-sustituidos, como el anterior, como se describe en Ezquerra et al., 1999, Journal of Organic Chemistry 64 (18): 6554-6565. La reaccion de los enolatos de litio de esteres de glicina protegidos en N aquirales con complejos de cromo de alcoxialquenilcarbeno quirales proporciona los aductos de Michael correspondientes, con alta selectividad anti o sin dependiendo de la naturaleza del grupo protector de nitrogeno y alta selectividad diastereofacial cuando se emplean complejos de carbeno que contienen el grupo (-)-8-fenilmetiloxi. La posterior oxidacion del resto de metalcarbeno seguida de la desproteccion del grupo amina y la hidrolisis de ambos esteres carboxllicos proporciona acidos glutamicos 3-sustituidos enantiomericamente enriquecidos de estereoqulmica natural as! como no natural. Por ejemplo, puede hacerse reaccionar complejo de carbeno con enolato de litio de glicina para proporcionar el aducto de adicion de Michael, que puede oxidarse para proporcionar un glutamato protegido sin ninguna perdida de estereoqulmica. El glutamato se desprotege en dos etapas para proporcionar sal de clorhidrato de acido (2R,3S)-3-(3-furil)glutamico. Como alternativa, cuando la etapa de desproteccion se realiza antes de la oxidacion, se forman complejos de aminocarbeno clclicos, que conduciran a acidos piroglutamicos 3-sustituidos opticamente activos.
Se prepara MMAZ usando el analogo de fenilalanina anterior y conjugando con Fmoc-MeVal-val-dil-O-t-Bu siguiendo el procedimiento del Ejemplo 3.
Ejemplo 23 - Sfntesis de otros compuestos de MMAZ
Tambien pueden prepararse compuestos de MMAZ usando los siguientes analogos de fenilalanina disponibles en el mercado, ya sea en forma de sus aminoacidos protegidos o desprotegidos incorporados en la slntesis en fase solida o de solucion como se ha descrito anteriormente:
Figure imgf000120_0001
(disponible en el mercado de Tyger Scientific, Inc. Ewing, NJ);
Figure imgf000120_0002
(disponible en el mercado de Acros Organics);
Figure imgf000120_0003
(disponible en el mercado de Advanced ChemTech);
Figure imgf000120_0004
(disponible en el mercado de Acros);
Figure imgf000120_0005
(disponible en el mercado de Advanced ChemTech);
Figure imgf000120_0006
(disponible en el mercado de Advanced ChemTech);
Figure imgf000121_0001
(disponible en el mercado de Pharmacore Products);
Figure imgf000121_0002
(disponible en el mercado de Fluka);
Figure imgf000121_0003
(disponibles en el mercado de Peptech),
Figure imgf000121_0004
(disponible en el mercado de Bachem);
Figure imgf000121_0005
(disponible en el mercado de ChemStep);
Figure imgf000121_0006
(disponible en el mercado de Chem IMPX);
Ċ
Figure imgf000122_0001
(disponibles en el mercado de Advanced ChemTech);
Figure imgf000122_0002
Figure imgf000123_0001
Figure imgf000124_0001
Figure imgf000125_0001
(disponibles en el mercado de Chemstep);
Figure imgf000125_0002
(disponibles en el mercado de Aldrich);
Figure imgf000125_0003
Figure imgf000126_0001
10 (disponibles en el mercado de Sigma);
Figure imgf000126_0002
Figure imgf000127_0001
Figure imgf000128_0001
(disponibles en el mercado de Apolo Scientific Ltd.);
Figure imgf000128_0002
(disponible en el mercado de DSL Chemicals (Shanghai) Co., Ltd.);
Figure imgf000129_0001
(disponibles en el mercado de Salor);
Figure imgf000129_0002
(disponibles en el mercado de Synchem OHG);
Figure imgf000129_0003
(disponible en el mercado de Sequoia Research Products Ltd.);
Figure imgf000129_0004
(disponible en el mercado de MicroChemistry Building Blocks);
Figure imgf000130_0001
(disponibles en el mercado de Lancanster);
Figure imgf000130_0002
(disponible en el mercado de Ambinter, Paris, Francia);
Figure imgf000130_0003
Figure imgf000131_0001
Figure imgf000132_0001
Figure imgf000133_0001
Figure imgf000134_0001
Figure imgf000135_0001
(disponibles en el mercado de Biomol Research Labs);
Figure imgf000135_0002
(disponibles en el mercado de AstaTech);
Figure imgf000135_0003
(disponible en el mercado de ChemBridge Screening Library);
Figure imgf000135_0004
(disponible en el mercado de LaboTest);
Figure imgf000135_0005
Figure imgf000136_0001
(disponibles en el mercado de JRD Fluorochemicals);
Figure imgf000136_0002
(disponibles en el mercado de Fluka);
Figure imgf000136_0003
Figure imgf000137_0001
(d isp o n ib le s en el m e rca do de S enn C h e m ica ls A G );
Figure imgf000138_0001
(disponibles en el mercado de Advanced ChemTech);
Figure imgf000138_0002
(disponibles en el mercado de Tyger Scientific);
Figure imgf000138_0003
(disponible en el mercado de AMRI Fine Chemicals);
Figure imgf000138_0004
(d isp o n ib le s en el m e rca do de S yn th e te ch ) ;
Figure imgf000139_0001
(disponibles en el mercado de Apin Chemicals);
Figure imgf000139_0002
(disponibles en el mercado de Biocatalytics, Inc.);
Figure imgf000139_0003
(d isp o n ib le s en el m e rca do de A G S c ien tific );
Figure imgf000140_0001
(disponibles en el mercado de Synthelec);
Figure imgf000140_0002
(disponible en el mercado de TimTec Stock Library);
Figure imgf000140_0003
(disponibles en el mercado de CSPS);
Figure imgf000141_0001
(disponibles en el mercado de Qventas);
Figure imgf000142_0001
(disponibles en el mercado de Encyclopedia of Amino Acid Analogs and Chiral Building Blocks);
Figure imgf000142_0002
(disponibles en el mercado de Bachem);
Figure imgf000142_0003
Figure imgf000143_0001
Figure imgf000144_0001
(disponibles en el mercado de Matrix Scientific);
5
Figure imgf000145_0001
(disponibles en el mercado de TCI America);
Figure imgf000145_0002
(disponibles en el mercado de Acros);
Figure imgf000146_0001
(disponible en el mercado de Organics);
Figure imgf000146_0002
(disponibles en el mercado de ChemPacific);
Figure imgf000146_0003
(disponible en el mercado de Rare Chemicals GmbH)
Figure imgf000147_0001
(disponible en el mercado de AstaTech);
Figure imgf000147_0002
(disponible en el mercado de Austin);
Figure imgf000147_0003
(disponible en el mercado de Advanced Asymmetrics, Inc.);
Figure imgf000147_0004
(disponible en el mercado de Tocris Cookson Inc.);
Figure imgf000147_0005
(disponible en el mercado de Chem Service, Inc.); y
Figure imgf000147_0006
(disponible en el mercado de Synchem OHG, Alemania).
Ejemplo 24 - Sfntesis de compuestos de MMAZ
Tambien pueden prepararse compuestos de MMAZ usando los siguientes analogos de fenilalanina disponibles en el mercado, ya sea en forma de sus aminoacidos protegidos o no protegidos incorporados en la sfntesis en fase solida o en solucion como se ha descrito anteriormente: 4-cloro-fenilalanina, 4-fluoro-fenilalanina, 4-nitro-fenilalanina, N-a metil-fenilalanina, a-metil-fenilalanina, acido glutamico, acido aspartico, triptofano, isoleucina, leucina, metionina, tirosina, glutamina, treonina, valina, asparagina, fenilglicina, O-bencil-serina, O-t-butil-serina, O-t-butil-treonina, homofenilalanina, metionina-DL-sulfoxido, metionina-sulfona, acido a-aminobutlrico, acido a-aminoisobutlrico, acido 4-amino-1-piperidina-4-carboxllico, acido 4-amino-tetrahidropiran-4-carboxllico, acido aspartico, benzotiazol-2-ilalanina, a-t-butil-glicina, ciclohexilalanina, norleucina, norvalina, S-acetamidometilo-penicilamina, p-3-piperidin-3-ilalanina, piperidinilo-glicina, pirrolidinilalanina, selenocistelna, tetrahidropiran-4-il-glicina, O-bencil-treonina, O-t-butiltirosina, 3-(p-acetilfenil)alanina, 3-fenilserina y acido 1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolin-3-carboxllico.
Ejemplo 25 - Sintesis de MC-MMAZ
Puede prepararse maleimidocaproil-MeVal-Val-Dil-Dap-Z siguiendo el Procedimiento general S.
En resumen, se enfrlan acido maleimidocaproico (30 mg, Molecular BioSciences) y DMF anhidro (10 pl) en un matraz de vidrio de 10 ml en atmosfera de Ar (globo), en hielo seco durante 5 min. A esta mezcla se le anade cloruro de oxalilo (1 ml) con una jeringa. (Se produce un aumento vigoroso de la reaccion y la presion). Despues de 5 min, la mezcla se deja calentar a temperatura ambiente y se deja durante 30 min con agitacion manual ocasional. Los productos volatiles se retiran en rotavapor, el residuo se co-evapora con ChhCh anhidro (1 ml) y se seca en bomba de vaclo durante la noche. El producto se genera inicialmente en forma de un solido de color blanco, volviendose progresivamente un solido de color blanquecino a marron. RMN-1H en CDCla: 1,26-1,32 (2H, m), 1,51-1,59 (2H, m), 1,63-1,70 (2H, m), 2,82 (2H, t), 3,46 (2H, t), 6,70 (2H, s) ppm. El material hidrolizado puede detectarse mediante un triplete a 2,35 ppm. El producto se usa si la integral del triplete a 2,42 ppm no excede del 20 % del triplete a 3,46 ppm.
Puede prepararse cloruro de maleimidocaprollo como se ha descrito anteriormente y se disuelve en CH2O 2 anhidro (3 ml).
Se disuelven MMAZ (1 equiv.) y diisopropiletilamina (~ 4 equiv.) en CH2O 2 anhidro en un matraz de vidrio equipado con barra de agitacion magnetica y tapon de goma. La mezcla de reaccion se enfrla en el bano de hielo durante 10 min y se anade solucion de cloruro de maleimidocaprollo (-1,1 equiv.) mediante una jeringa. Despues de 15 min en hielo, se deja que la mezcla de reaccion se caliente hasta la temperatura ambiente y la agitacion continua durante 2 horas mas. Despues, el disolvente se retira al vaclo. El residuo se suspende en DMSO (0,5 ml). Despues, se anade agua (100 pl) y despues de 0,5 h la mezcla se carga en una columna de HPLC preparativa para la separacion: columna C12 Phenomenex Synergi MAX-RP, 4 pl, 250 x 10°mm, 80 A. El control se realiza a 215 nm. Las fracciones que contienen producto se concentran en rotavapor, se co-evaporan con acetonitrilo (5 ml, 2 veces), despues con la mezcla de CH2O 2 y hexano para proporcionar el material final.
Ejemplo 26 - Sintesis de un analogo de MC-MMAZ
La sintesis de un analogo de MC-MMAZ se muestra a continuation.
Figure imgf000149_0001
Se suspende MeVal-Val-Dil-Dap-Z-GP (compuesto 1, 0,044°mmol) en DMF (0,250 ml). Se anaden acido 4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-pirrol-1 -il)-benzoico (11 mg, 0,049°mmol) y HATU (17 mg, 0,044°mmol) seguidos de DIEA (0,031 ml, 0,17°mmol). Esta mezcla de reaccion se deja en agitacion durante 2,0 h. El analisis por HPLC indica el consumo completo del compuesto de partida 1. El producto se alsla mediante RP-HPLC preparatoria usando una columna de 80 A Phenomenex C12 Synergi Max-RP (250 * 21,20°mm). El eluyente es un gradiente lineal de MeCN del 10 % al 80 %/TFA al 0,05 % (ac.) durante 8 minutos, despues, MeCN al 80 %/TFA al 0,05 % (ac.) isocratico durante 12 minutos adicionales. Se suspende MB-MeVal-Val-Dil-Dap-Z-GP (0,0385°mmol) en CH2O 2 (1 ml) y TFA (1 ml). La mezcla se agita durante 2 h y despues los extractos organicos volatiles se evaporan a presion reducida. El producto (MB-MeVal-Val-Dil-Dap-Z) se purifica mediante RP-HPLC preparatoria, usando una columna de 80 A Phenomenex C12 Synergi Max-RP (250 * 21,20°mm). El eluyente es un gradiente lineal de MeCN del 10 % al 80 %/TFA al 0,05 % (ac.) durante 8 minutos, despues, MeCN al 80 %/TFA al 0,05 % (ac.) isocratico durante 12 minutos adicionales..
Ejemplo 27 - Preparacion de MC-val-cit-PAB-MMAZ (9)
Figure imgf000149_0002
0,2 equiv.), en DMF seca (1,5 ml) y piridina (0,3 ml), mientras estan en atmosfera de argon. Despues de 30 h, se encuentra que la reaccion esta esencialmente completa mediante HPLC. La mezcla se evapora, se recoge en una cantidad minima de DMSO y se purifica mediante HPLC preparativa (columna C12-RP, 5 pl, 100 A, gradiente lineal de MeCN en agua (que contiene TFA al 0,1 %) del 10 al 100 % en 40 min seguido de 20 min al 100 %, a un caudal de 25 ml/min) para proporcionar el Compuesto 9.
Se suspende Compuesto 8 (32°|jmol) en cloruro de metileno (6 ml) seguido de la adicion de TFA (3 ml). La solucion resultante se deja en reposo durante 2 horas. La mezcla de reaccion se concentra al vaclo y se purifica mediante HPLC preparativa (columna C12-RP, 5 j l , 100 A, gradiente lineal de MeCN en agua (que contiene TFA al 0,1 %) del 10 al 100 % en 40 min seguido de 20 min al 100 %, a un caudal de 25 ml/min). Las fracciones deseadas se concentran para proporcionar maleimidocaproil-valina-citrulina-p-hidroximetilaminobenceno-MMAZ (MC-val-cit-PAB-MMAZ) 9.
Ejemplo 28 - Preparacion de AC10-MC-MMAZ por conjugacion del anticuerpo y MC-MMAZ
El anticuerpo (por ejemplo, AC10 o 1 F6), disuelto en borato de sodio 500°mM y cloruro de sodio 500°mM a pH 8,0, se trata con un exceso de ditiotreitol 100°mM (DTT). Despues de la incubacion a 37 °C durante aproximadamente 30 minutos, el tampon se intercambia por elucion sobre resina Sephadex G25 y se eluye con PBS con DTPA 1°mM. El valor de tiol/Ab se comprueba determinando la concentracion de anticuerpo reducido a partir de la absorbancia a 280 nm de la solucion y la concentracion de tiol mediante la reaccion con DTNB (Aldrich, Milwaukee, WI) y la determinacion de la absorbancia a 412 nm. El anticuerpo reducido disuelto en PBS se enfrla en hielo.
El reactivo enlazador de farmaco, maleimidocaproil-monometil auristatina Z, es decir, MC-MMAZ, disuelto en DMSO, se diluye en acetonitrilo y agua a una concentracion conocida y se anade al anticuerpo reducido enfriado en PBS. Despues de aproximadamente una hora, se anade un exceso de maleimida para interrumpir la reaccion y proteger con caperuza cualesquier grupos tiol de anticuerpo sin reaccionar. La mezcla de reaccion se concentra mediante ultrafiltracion centrlfuga y el anticuerpo-MC-MMAZ se purifica y se desala mediante elucion a traves de resina G25 en PBS, se filtra a traves de filtros de 0,2 jm en condiciones esteriles y se congela para su almacenamiento.
Ejemplo 29 - Preparacion de anticuerpo-MC-val-cit-PAB-MMAZ por conjugacion de anticuerpo y MC-val-cit-PAB-MMAZ (SP3, 9)
Se prepara anticuerpo-MC-val-cit-PAB-MMAZ (por ejemplo, AC10-MC-val-cit-PAB-MMAZ o 1F6-MC-val-cit-PAB-MMAZ) por conjugacion del anticuerpo y MC-val-cit-PAB-MMAZ (9,SP3) siguiendo el procedimiento del Ejemplo 28.
Ejemplo 30 - Preparacion de MC-MeVal-Cit-PAB-MMAZ
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A una suspension a temperatura ambiente de Fmoc-MeVal-OH (3,03 g, 8,57°mmol) y carbonato de N,N'-disuccimidilo (3,29 g, 12,86°mmol) en CH2Cl2 (80 ml) se le anadio DIEA (4,48 ml, 25,71°mmol). Esta mezcla de reaccion se deja en agitacion durante 3 h y despues se vierte en un embudo de decantacion donde la mezcla organica se extrae con HCl 0,1 M (ac). El residuo organico en bruto se concentra a presion reducida y el producto se alsla mediante cromatografla en columna ultrarrapida sobre gel de sllice usando un gradiente lineal de acetato de etilo al 20-100 %/hexanos (por ejemplo, puede recuperarse un total de 2,18 g de Fmoc-MeVal-OSu puro (4,80°mmol, rendimiento del 56 %)).
A una suspension a temperatura ambiente de Fmoc-MeVal-OSu (2,18 g, 4,84°mmol) en DME (13 ml) y THF (6,5 ml) se le anade una solucion de L-citrulina (0,85 g, 4,84°mmol) y NaHCO3 (0,41 g, 4,84°mmol) en H2O (13 ml). La suspension se deja en agitacion a temperatura ambiente durante 16 h, despues se extrae en terc-BuOH/CHCb/H2O y se acidifica a pH = 2-3 con HCl 1 M. La fase organica se separa, se seca y se concentra a presion reducida. El residuo se tritura con eter dietllico dando como resultado Fmoc-MeVal-Cit-COOH (por ejemplo, 2,01 g) que se usa sin purificacion adicional.
El Fmoc-MeVal-Cit-COOH en bruto se suspende en CH2Cl2/MeOH 2:1 (100 ml) y se le anaden alcohol paminobencllico (0,97 g, 7,9°mmol) y EEDQ (1,95 g, 7,9°mmol). Esta suspension se deja en agitacion durante 125 h, despues los extractos organicos volatiles se retiran a presion reducida y el residuo se purifica mediante cromatografla en columna ultrarrapida sobre gel de sllice usando MeOH al 10 %/CH2Cl2. Se recupera Fmoc-MeVal-Cit-PAB-OH puro (por ejemplo, 0,55 g, 0,896°mmol, rendimiento del 18,5 %).
A una suspension de Fmoc-MeVal-Cit-PAB-OH (0,55 g, 0,896°mmol) en CH2O 2 (40 ml) se le anade STRATOSPHERES™ (piperazina-resina ligadas) (> 5°mmol/g, 150 mg). Despues de agitarse a temperatura ambiente durante 16 h, la mezcla se filtra a traves de celite (prelavado con MeOH) y se concentra a presion reducida. El residuo se tritura con eter dietllico y hexanos. El material solido resultante, MeVal-Cit-PAB-OH, se suspende en CH2Cl2 (20 ml) y se le anaden MC-OSu (0,28 g, 0,896°mmol), DIEA (0,17 ml, 0,99°mmol) y DMF (15 ml). Esta suspension se agita durante 16 h. Si el analisis por HPLC de la mezcla de reaccion indica una reaccion incompleta, la suspension se concentra a presion reducida a un volumen de 6 ml, despues se anade una solucion al 10 % de NaHCO3 (ac.) y la suspension se agita durante 16 h adicionales. El disolvente se retira a presion reducida y el residuo se purifica mediante cromatografla en columna ultrarrapida sobre gel de sllice usando un gradiente de MeOH al 0-10 %/CH2Cl2, dando como resultado MC-MeVal-Cit-PAB-OH (por ejemplo, 42 mg (0,072°mmol, rendimiento del 8 %)).
A una suspension de MC-MeVal-Cit-PAB-OH (2,37 g, 4,04°mmol) y bis(nitrofenil)carbonato (2,59 g, 8,52°mmol) en CH2O 2 (10 ml) se le anade DIEA (1,06 ml, 6,06°mmol). Esta suspension se agita durante 5,5 h, se concentra a presion reducida y se purifica mediante trituracion con eter dietllico. Se suspende MC-MeVal-Cit-PAB-OCO-pNP (147 mg, 0,196°mmol) en una solucion 1:5 de piridina/DMF (3 ml) y se les anaden HOBt (5 mg, 0,039°mmol), DlEA (0,17 ml, 0,978°mmol) y MMAZ (0,205°mmol). Esta mezcla de reaccion se agita durante 16 horas a temperatura ambiente y despues se purifica mediante RP-HPLC preparativa (3 veces), usando una columna de 80 A Phenomenex C12 Synergi Max-RP (250 x 21,20°mm). El eluyente es un gradiente lineal de MeCN del 10 % al 90 %/TFA al 0,05 % (ac) durante 30 minutos, despues MeCN al 90 %/TFA al 0,05 % (ac) isocratico durante 20 minutos. Se obtiene MC-MeVal-Cit-PAB-MMAZ.
Ejemplo 31 - Preparacion de ester de succinim ida de suberil-Val-Cit-PAB-MMAZ
Figure imgf000151_0001
Se suspenden Compuesto 1 (0,38°mmol), Fmoc-Val-Cit-PAB-pNP (436 mg, 0,57°mmol, 1,5 equiv.) en piridina anhidra, se anaden 5 ml de HOBt (10 mg, 0,076°mmol, 0,2 equiv.) seguido de DIEA (199 pl, 1,14°mmol, 3 equiv.). La mezcla de reaccion se somete a ultrasonidos durante 10 min y despues se agita durante la noche a temperatura ambiente. La piridina se retira a presion reducida y el residuo se vuelve a suspender en CH2O 2. La mezcla se separa mediante cromatografla ultrarrapida en gel de sllice en un gradiente por etapas de MeOH, del 0 al 10 %, en CH2O 2. Las fracciones que contienen el producto se recogen, se concentran y se secan al vaclo durante la noche para proporcionar Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAZ.
Se suspende Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAZ en CH2O 2 (2 ml), dietilamina (2 ml) y DMF (2 ml). La mezcla se agita durante 2 horas a temperatura ambiente. El disolvente se retira a presion reducida. El residuo se co-evapora con piridina (2 ml), despues con tolueno (5 ml, 2 veces) y se seca al vaclo. Se obtiene Val-Cit-PAB-MMAZ.
Todo el Val-Cit-PAB-MMAZ preparado a parti r de Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAZ se suspende en piridina (2 ml) y se anade a una solucion de suberato de disuccinimidilo (74 mg, 0,2°mmol, 4 equiv.), en piridina (1 ml). La mezcla de reaccion se agita a temperatura ambiente. Despues de 3 horas se anade eter (20 ml). El precipitado se recoge y se lavo con una cantidad adicional de eter. El solido de color rojizo se suspende en MeOH al 30 %/CH2Cl2 y se filtra a traves de un lecho de gel de sllice con MeOH al 30 %/CH2Cl2 como eluyente.
Ejemplo 32 - Determinacion de la citotoxicidad de compuestos seleccionados
La actividad citotoxica de MMAZ y conjugados anticuerpo-farmaco se evalua en las estirpes celulares positivas para CD70+, por ejemplo, Caki-1, carcinoma de celulas renales; L428, enfermedad de Hodgkin; U251, glioblastoma. Para evaluar la citotoxicidad de los compuestos, las celulas pueden sembrarse a aproximadamente 5-10000 por pocillo en 150 pl de medio de cultivo, despues, pueden tratarse con dosis graduadas de compuestos por cuadruplicado al inicio del ensayo. Los ensayos de citotoxicidad se realizan generalmente durante 96 horas despues de la adicion de los compuestos de ensayo. Pueden anadirse 50 pl de colorante de resazurina a cada pocillo durante las ultimas 4 a 6 horas de la incubacion para evaluar las celulas viables al final del cultivo. La reduccion del colorante puede determinarse mediante espectrometria de fluorescencia usando las longitudes de onda de excitacion y de emision de 535 nm y 590 nm, respectivamente. Para el analisis, el grado de reduccion de la resazurina por las celulas tratadas puede compararse con el de las celulas de control sin tratar.
Ejemplo 33 - Determinacion de la citotoxicidad in vitro general
Para evaluar la citotoxicidad de los conjugados, las celulas se siembran a aproximadamente 5-10000 por pocillo en 150 gl de medio de cultivo y despues se tratan con dosis graduadas de conjugados por cuadruplicado al inicio del ensayo. Los ensayos de citotoxicidad se realizan durante 96 horas despues de la adicion de los compuestos de ensayo. Se anaden 50 gl de colorante de resazurina a cada pocillo durante las ultimas 4 a 6 horas de la incubacion para evaluar las celulas viables al final del cultivo. La reduccion del colorante se determina mediante espectrometrfa de fluorescencia usando las longitudes de onda de excitacion y de emision de 535 nm y 590 nm, respectivamente. Para el analisis, el grado de reduccion de la resazurina por las celulas tratadas se compara con el de las celulas de control sin tratar.
Ejemplo 34 - Ensayo de proliferacion celular in vitro
La eficacia del CAF puede medirse mediante un ensayo de proliferacion celular que emplea el siguiente protocolo (Boletfn tecnico de Promega Corp. TB288; Mendoza et al., 2002, Cancer Res. 62: 5485-5488):
1. Una alfcuota de 100 gl de cultivo celular que contiene aproximadamente 104 celulas (por ejemplo, SKBR-3, BT474, MCF7 o MDA-MB-468) en medio, se deposita en cada pocillo de una placa de paredes opacas de pocillos 96.
2. Se preparan pocillos de control que contienen medio y sin celulas.
3. Se anade CAF a los pocillos experimentales y se incuban durante 3-5 dfas.
4. Las placas se equilibraron a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos.
5. Se anade un volumen de reactivo CellTiter-Glo igual al volumen del medio de cultivo celular presente en cada pocillo.
6. Los contenidos se mezclan durante 2 minutos en un agitador orbital para inducir la lisis celular.
7. La placa se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos para estabilizar la senal de luminiscencia. 8. La luminiscencia se registra y se presenta en los graficos como ULR = unidades de luminiscencia relativa. La Tabla 7 muestra la actividad in vitro de los conjugados hlF6-anticuerpo-MMAZ (h1F6-mc-vc-PAB-MMAZ) contra estirpes celulares CD70+ (U251, L428 y Caki-1). Los conjugados contienen aproximadamente 4 farmacos por anticuerpo.
Tabla 7.
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Ejemplo 35 - Aclaramiento plasmatico en ratas
La farmacocinetica del aclaramiento plasmatico de conjugados de farmaco anticuerpo y del anticuerpo total se estudia en ratas Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, 250-275 gramos cada una). Los animales se tratan mediante inyeccion en la vena de la cola en embolada (inyeccion I.V. lenta). Se recogen aproximadamente 300 pl de sangre completa a traves de una canula yugular o por pinchazo de la cola, en recipientes anticoagulantes con litio/heparina en cada punto temporal: 0 (antes de la dosis), 10 y 30 minutos; 1, 2, 4, 8, 24 y 36 horas; y 2, 3, 4, 7, 14, 21 y 28 dfas despues de la dosis. El anticuerpo total se mide mediante ELISA-ECD/GxhuFc-HRP. El conjugado farmaco anticuerpo se mide mediante ELISA - M MAZ/ECD-Bio/SA-HRP.
Ejemplo 36 - Aclaramiento plasmatico en monos
La farmacocinetica del aclaramiento plasmatico de conjugados de farmaco anticuerpo y del anticuerpo total puede estudiarse en macacos, usando un procedimiento similar al descrito anteriormente.
Ejemplo 37 - Eficacia in vivo sobre el volumen tumoral en ratones explantados transgenicos
Pueden obtenerse animales adecuados para experimentos transgenicos de fuentes comerciales convencionales tales como Taconic (Germantown, NY). Muchas cepas son adecuadas, pero se prefieren los ratones hembra FVB debido a su mayor susceptibilidad a la formacion de tumores. Pueden usarse machos FVB para el apareamiento y pueden usarse sementales CD.1 vasectomizados para estimular la seudoprenez. Pueden obtenerse ratones vasectomizados de cualquier proveedor comercial. Los fundadores pueden ser criarse ya sea con ratones FVB o con ratones heterocigotos 129/BL6 x FVB p53. Los ratones con heterocigosidad en el alelo p53 puede usarse para aumentar potencialmente la formacion de tumores. Algunos tumores F1 son de cepa mixta. Los tumores fundadores pueden ser FVB solamente.
Los animales que tienen tumores (aloinjerto propagado desde ratones transgenicos Fo5 mmtv) pueden tratarse con una dosis unica o multiple mediante inyeccion I.V. de CAF. El volumen del tumor puede evaluarse en diversos puntos temporales despues de la inyeccion.
Ejemplo 38 - Eficacia in vivo de conjugados anticuerpo-farmaco de mcMMAZ
La eficacia de cAC10-mcMMAZ puede evaluarse en xenoinjertos de LCGA Karpas-299. Se usa AC10-mcMMAZ quimerico con un promedio de 4 restos de farmaco por anticuerpo (cAC10-mcF4). Las celulas de LCGA Karpas-299 humanas se implantan por via subcutanea en ratones CB-17 IDCG inmunodeficientes (5*106 celulas por raton). Los volumenes tumorales se calculan usando la formula (0,5 * L * A2) en la que L y A son la mas larga y la mas corta de dos mediciones bidireccionales.
Eficacia de cBR96-mcMMAZ en xenoinjertos de CPNM L2987
cBR96 es un anticuerpo quimerico que reconoce el antfgeno LeY. Para evaluar la eficacia in vivo de cBR96-mcMMAZ con 4 farmacos por anticuerpo (cBR96-mcF4), se implantan fragmentos de tumor de cancer de pulmon no microcftico (CPNM) L2987 en ratones desnudos atlmicos. Cuando los tumores tienen un promedio de aproximadamente 100 mm3, los ratones se dividen en 3 grupos: sin tratamiento y 2 grupos con terapia. La eficacia de los conjugados anticuerpo farmaco se evaluo como se ha descrito anteriormente.
Depositos en la ATCC
Se hizo un deposito en la ATCC (American Type Culture Collection (Coleccion Estadounidense de Cultivos de Referencia) del anticuerpo monoclonal S2C6 el 25 de mayo de 1999 de conformidad con los terminos del Tratado de Budapest acerca del reconocimiento internacional del deposito de microorganismos con fines de procedimiento de patentes. A este deposito en la ATCC se le proporciono el numero de referencia PTA-110.
Se hizo un deposito en la ATCC del anticuerpo monoclonal murino AC10 el 26 de abril de 2005 de conformidad con los terminos del Tratado de Budapest acerca del reconocimiento internacional del deposito de microorganismos con fines de procedimiento de patentes. A este deposito en la ATCC se le proporciono el numero de referencia PTA-6679.
Se hizo un deposito en la ATCC del anticuerpo monoclonal humanizado AC10 el 23 de agosto de 2005 de conformidad con los terminos del Tratado de Budapest acerca del reconocimiento internacional del deposito de microorganismos con fines de procedimiento de patentes. A este deposito en la ATCC se le proporciono el numero de referencia PTA-6951.
La ATCC se encuentra en University Boulevard, n.° 10801, Manassas, Virginia 20110-2209, EE.UU. Cualquier deposito se proporciona como una comodidad para los expertos en la materia y no es una admision de que se requiera un deposito. Lo descrito en el presente documento no debe limitarse en su alcance por el anticuerpo depositado, puesto que la realization depositada pretende ser una ilustracion individual de ciertos aspectos de la divulgation.
Los siguientes parrafos numerados (parrs.) contienen declaraciones de combinaciones mas amplias de las caracterlsticas tecnicas de la invention descritas en el presente documento:-
1. Un compuesto que tiene la formula:
Figure imgf000155_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato del mismo, en la que:
R2 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-C8;
R3 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo C1-C8, X1-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y X1- (heterociclo C3-C8);
R4 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y X1- (heterociclo C3-C8);
R5 se selecciona entre el grupo que consiste en H y metilo;
o R4 y R5 forman juntos un anillo carboclclico y tienen la formula -(CRaRb)n- en la que Ra y Rb se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8 y carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre el grupo que consiste en 2, 3, 4, 5 y 6;
R6 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-C8;
R7 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, X1 - (carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y X1 - (heterociclo C8-C8);
cada R8 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, OH, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8 y O-(Q-Q alquilo);
cada X1 es independientemente alquileno C1-C10; y
el resto -NR9Z1 es un bioisostero de fenilalanina con una cadena lateral de aminoacido modificado.
2. El c o m p u e s to del parr. 1 que t ie n e la fo rm u la :
Figure imgf000156_0001
o una sal farmaceuticamente aceptable o solvato del mismo.
3. Un compuesto del parr. 1, en el que el resto bioisostero de fenilalanina
Figure imgf000156_0002
se selecciona entre el grupo que consiste en:
Figure imgf000156_0003
— representa un enlace sencillo o doble;
R9 se selecciona entre el grupo que consiste en H y un grupo protector amino; R10 se selecciona entre el grupo que consiste en H y -(CR13R14)xR15; cada R11 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C20, halogeno, arilo, arilalquilo C1-C20, haloalquilo C1-C10, OR16 y N(R16)2 ;
R12 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C20, halogeno, arilo, arilalquilo C1-C20, arilalquenilo C2-C20, arilalquinilo C2-C20, OR16, N(R16)2 y -C(O)R16;
cada R13 y R14 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C20, halogeno, arilalquilo, haloalquilo C1-C10, OR16, SR16, N(R16)2, -OC(O)R16, - N(R16)C(O)R16, -COOR16, -CON(R16)2 , X1-SO3H, X1-SO3-alquilo C1-C20, X1-OSO3H, -X1-OSO3-alquilo C1-C20, X1-SO2-alquilo C1-C20, X1-SO-alquilo C1-C20, - OP(O)(OR16)2, -OP(O)(NR16)2, -OP(O)N(R16)2OR16, -OP(O)(R16)OR16, - OP(O)(R16)N(R16)2, -P(O)(OR16)2, -P(O)(NR16)2, -P(O)N(R16)2OR16, alquilo C1-C20, carbociclo C3-C8, arilo, X1- alquil-arilo, X1-carbociclo C3-C8, heterociclo C3-C20 y X1-heterociclo C3-C8;
o R13 y R14 se combinan juntos para formar un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en =O, =N-NH-R17, =N-NH-C(O)-R17 y un carbociclo C3-C8;
cada R15 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C20, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, alquil C1-C20-carbociclo C3-C8, heterociclo C3-C20, X1-heterociclo C3-C8, -COOR16, -CON(R16)2 , -C(O)R16 e Y1(c R13R14)xR18; en la que las porciones de arilo, carbociclo y heterociclo estan opcionalmente sustituidos con uno a tres grupos R12;
cada R16 es independientemente H o alquilo C1-C20;
R17 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C20, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, alquil C1-C20-carbociclo C3-C8, heterociclo C3-C8 y X1-heterociclo C3-C8;
cada R18 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C20, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, X1-carbociclo C3-C8, heterociclo C3-C20, X1-heterociclo C3-C8, -COOR16, -CON(R16)2 y -C(O)R16; Y1 es O, S, NR16, SO, SO2 o Se;
cada X1 es independientemente alquileno C1-C10;
el sublndice x es un numero entero de 0 a 10;
los subindices n, o, c, r, s, t y u son numeros enteros independientemente de 0 a 2;
Z2 es COZ3R19;
Z3 es O, S, NH, o NR20, en el que R20 es alquilo C1-C8;
R19 se selecciona entre H, alquilo C1-C20, arilo, heterociclo C3-C8, -(X1O)v-R22, o -(X1O)v-CH(R23)2;
V es un numero entero en el intervalo de 1-1000;
R22 es H o alquilo C1-C8;
cada R23 es independientemente H, COOH, -(CH2)j-N(R24)2, -(CH2)j-SO3H o -(CH2)1-SO3-alquilo C1-C8; cada R24 es independientemente H, alquilo C1-C8 o -(CH2)1-COOH; en el que; 1 es un numero entero en el intervalo de 0 a 6; con la condicion de que cuando n y o son 0, y R11 es H, entonces R10 es distinto de CH2-arilo o CH2-heterociclo C3-C8.
4. El compuesto del parr. 3, en el que R9 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C20, carbociclilo C3-C8, X1-arilo, X1-(carbociclilo C3-C8) y X1-heterociclilo C3-C8.
5. El compuesto del parr. 3, en el que R9 es H.
6. El compuesto del parr. 3, en el que el resto bioisostero de fenilalanina es
Figure imgf000157_0001
en la que R9 es H; R10 es bencilo; R11 es H; Z2 es CO2H; el sublndice n es un numero entero de entre 0 a 2; y el sublndice o es un numero entero de entre 0 a 1 con la condicion de que n o es al menos 1.
7. El compuesto del parr. 3, en el que el resto bioisostero de fenilalanina se selecciona entre el grupo que consiste en
Figure imgf000158_0001
8. El compuesto del parr. 3, en el que el resto bioisostero de fenilalanina es
Figure imgf000158_0002
en la que
R9 es H y un grupo protector amino;
R10 es H y -(CR13R14)xR15;
cada R11 es independientemente H, alquilo C1-C20, halogeno, arilo, arilalquilo C1-C20, haloalquilo C1-C10, OR16 y N(R16)2;
R12 es H, alquilo C1-C20, halogeno, arilo arilalquilo C1-C20, arilalquenilo C2-C20, arilalquinilo C2-C20, OR16, N(R16)2 y -C(O)R16;
cada R13 y R14 es independientemente H, alquilo C1-C20, halogeno, arilalquilo, haloalquilo C1-C10, OR16, SR16, N(R16)2, -OC(O)R16, -N(R16)C(O)R16, -COOR16, - CON(R16)2, X1-SO3H, X1-SO3-alquilo C1-C20, X1-OSO3H, - X1-OSO3-alquilo C1-C20, X1-SO2-alquilo C1-C20, X1-SO-alquilo C1-C20, -OP(O)(OR16)2, -OP(O)(NR16)2, -OP(O)N(R16)2OR16, -OP(O)(R16)OR16, -OP(O)(R16)N(R16)2, -P(O)(OR16)2, - P(O)(NR16)2, -P(O)N(R16)2OR16, alquilo C1-C20, carbociclo C3-C8, arilo, X1-alquil-arilo, X1-carbociclo C3-C8, heterociclo C3-C8 y X1-heterociclo C3-Ca;
o R13 y R14 se combinan juntos para formar un miembro =O, =N-NH-R17, =N-NH- C(O)-R17 y un carbociclo C3-C8;
cada R15 es independientemente H, alquilo C1-C20, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, alquil C1-C20-carbociclo C3-Ca, heterociclo C3-C8, X1-heterociclo C3-C8, -COOR16, - CON(R16)2, -C(O)R16 e Y1(CR13R14)xR18;
cada R16 es independientemente H o alquilo C1-C20;
R17 es H, alquilo C1-C20, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, alquil C1-C20-carbociclo C3-C8, heterociclo C3-C8 y X1-heterociclo C3-C8;
cada R18 es independientemente H, alquilo C1-C20, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, X1-carbociclo C3-C8, heterociclo C3-C8, X1-heterociclo C3-C, -COOR16, -CON(R16)2 y -C(O)R16;
Y1 es O, S, NR16, SO, SO2 o Se;
cada X1 es independientemente alquileno C1-C10;
el sublndice x es un numero entero de 0 a 10;
los subindices n, o, c, r, s, t y u son numeros enteros independientemente de 0 a 2;
Z2 es COZ3R19;
Z3 es O, S, NH, o NR20, en el que R20 es alquilo C1-C8;
R19 se selecciona entre H, alquilo C1-C20, arilo, heterociclo C3-C8, -(X1O)v-R22, o -(X1O)v- CH(R23)2;
V es un numero entero en el intervalo de 1-1000;
R22 es H o alquilo C1-C8;
cada R23 es independientemente H, COOH, -(CH2)1-N(R24)2, -(CH2VSO3H o -(CH2)1-SO3-alquilo C1-C3; cada R24 es independientemente H, alquilo C1-C8 o -(CH2)1COOH; en el que; 1 es un numero entero en el intervalo de 0 a 6; con la condicion de que cuando n y o son 0, y R11 es H, entonces R10 es distinto de CH2-arilo o CH2-heterociclo C3-C8.
9. El c o m p u e s to del parr. 3 , en el que el resto b io iso s te ro de fe n ila la n in a es
Figure imgf000159_0001
en la que Z2 es CO2H; y el sublndice x es un numero entero de entre 0 a 2.
10. El compuesto del parr. 3, en el que el resto bioisostero de fenilalanina es
Figure imgf000159_0002
en la que R10 es CH2-heterociclo C3-C8 o CH2-arilo; y R11 es H.
11. El compuesto del parr. 3, en el que R10 se selecciona entre el grupo que consiste en:
Figure imgf000159_0003
en la que cada X2 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en N, NR16, S, O, CR16 y CHR16; y el sublndice z es un numero entero de entre 0 a 2.
12. El compuesto del parr. 3, en el que R10 se selecciona entre el grupo que consiste en:
Figure imgf000159_0004
y no mas de dos grupos X2 adyacentes son distintos de CR16 o CHR16.
13. El co m p u e s to del parr. 3 , en el que R 10 se se le c c io n a en tre el g ru p o que co n s is te en:
Figure imgf000160_0001
R12 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo, halogeno, amino, carboxi, amido, carboetoxi, formilo, fenilo, E-2-feniletenilo, Z-2-feniletenilo, y 2- feniletinilo.
14. El compuesto del parr. 3, en el que el resto bioisostero de fenilalanina se selecciona entre el grupo que consiste en:
Figure imgf000160_0002
15. El compuesto del parr. 3, en el que
Figure imgf000160_0003
es un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en
Figure imgf000161_0001
5 16. El compuesto del parr. 3, en el que el resto bioisostero de fenilalanina es una amida de un aminoacido seleccionado entre el grupo que consiste en:
Figure imgf000162_0001
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Figure imgf000186_0001
17. El compuesto del parr. 3, en el que el resto bioisostero de fenilalanina es el a-amino amida de un aminoacido seleccionado entre el grupo que consiste en 4- cloro-fenilalanina, 4-fluoro-fenilalanina, 4-nitro-fenilalanina, N-anetil-fenilalanina, a-netil-fenilalanina, acido glutamico, acido aspartico, triptofano, isoleucina, leucina, metionina, tirosina, glutamina, treonina, valina, asparagina, fenilglicina, O-bencil-serina, O-t-butil-serina, O-t-butil-treonina, homofenilalanina, metionina-DL-sulfoxido, metionina-sulfona, acido a-aminobutlrico, acido a-aminoisobutlrico, acido 4-amino-1-piperidin-4-carboxllico, acido 4-amino-tetrahidropiran-4-carboxllico, acido aspartico, benzotiazol-2- il-alanina, a-t-butil-glicina, ciclohexilalanina, norleucina, norvalina, S-acetamidometil-penicilamina, p-3-piperidin-3- il-alanina, piperidinil-glicina, pirrolidinil-alanina, selenocisteina, tetrahidropiran-4-il-glicina, O-bencil-treonina, O-tbutil-tirosina, 3-(p-acetilfenil)alanina, 3-fenilserina y acido 1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolina-3-carboxllico.
18. El compuesto del parr. 3, en el que el resto bioisostero de fenilalanina es
Figure imgf000187_0001
en la que Z2 es CO2H; R10 es bencilo; y los subindices q, r y s independientemente son numeros enteros de entre 0 a 1.
19. El compuesto del parr. 3, en el que el resto bioisostero de fenilalanina se selecciona entre el grupo que consiste en:
Figure imgf000187_0002
20. El compuesto del parr. 3, en el que el resto bioisostero de fenilalanina es
Figure imgf000187_0003
en la que Z2 es CO2H; R10 es bencilo; R11 es H; y los subindices t y u independientemente son numeros enteros de entre 1 a 3.
21. El compuesto del parr. 3, en el que el resto bioisostero de fenilalanina se selecciona entre el grupo que consiste en
Figure imgf000188_0001
22. El compuesto del parr. 3, en el que el resto bioisostero de fenilalanina es
Figure imgf000188_0002
en la que Z2 es CO2H; los subindices q, r y s independientemente son numeros enteros de entre 1 a 3.
23. El compuesto del parr. 3, en el que el resto bioisostero de fenilalanina es
Figure imgf000188_0003
24. El compuesto del parr. 3, en el que el resto bioisostero de fenilalanina es
Figure imgf000188_0004
en la que Z2 es CO2H.
25. El compuesto del parr. 3, en el que el resto bioisostero de fenilalanina es
Figure imgf000188_0005
26. El compuesto del parr. 3, en el que el resto bioisostero de fenilalanina es
Figure imgf000189_0001
en la que Z2 es CO2H; y los subindices q, r y s independientemente son numeros enteros de entre 1 a 3.
27. El compuesto del parr. 3, en el que el resto bioisostero de fenilalanina es
Figure imgf000189_0002
28. Un compuesto que tiene la formula:
L-((LU)c,-i-(D)m)p
o una sal farmaceuticamente aceptable o solvato del mismo
en la que,
L- es una unidad de ligando;
LU es una unidad de enlazador;
p es un numero entero de 1 a aproximadamente 20; y
D es un resto de farmaco que tiene la Formula D:
Figure imgf000189_0003
en la que,
R2 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-C8;
R3 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo C1-C8, X1-(carbociclo C3-C8 ), heterociclo C3-C8 y X1-(heterociclo C3-C8);
R4 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8 , arilo, X1-arilo, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y X1-(heterociclo C3-C8);
R5 se selecciona entre el grupo que consiste en H y metilo;
o R4 y R5 forman juntos un anillo carboclclico y tienen la formula -(CRaRb)n- en la que Ra y Rb se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8 y carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre el grupo que consiste en 2, 3, 4, 5 y 6;
R6 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-C8;
R7 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8 , arilo, X1-arilo, X1-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y X1-(heterociclo C3-C8);
cada R8 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, OH, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C3 y O-(alquilo C1-C8);
cada X1 es independientemente alquileno C1-C10; y
el resto -NR9Z1 es un bioisostero de fenilalanina de acuerdo con un cualquiera de los parrs. 1 a 27.
29. Un compuesto del parr. 28, que tiene la formula:
L-LU-D
o una sal farmaceuticamente aceptable o solvato del mismo.
30. Un compuesto que tiene la formula:
LU-(D)i -4
o una sal farmaceuticamente aceptable o solvato del mismo
en la que,
LU- es una unidad de enlazador; y
D es un resto de farmaco que tiene la Formula D:
Figure imgf000190_0001
de acuerdo con el parr. 28.
31. El compuesto de acuerdo con uno cualquiera de los parrs. 28 a 30, en el que el compuesto es un compuesto que tiene la Formula Ia':
Ab-(Aa-Ww-Yy-(D)i-4)p Ia'
o una sal farmaceuticamente aceptable o solvato del mismo, en la que:
Ab es un anticuerpo,
A es una unidad de extensor,
a es 0 o 1,
cada W es independientemente una unidad de aminoacido,
w es un numero entero en el intervalo de 0 a 12,
Y es una unidad espaciadora, e
y es 0, 1 o 2,
p es un numero entero de entre 1 a 20, y
D es un resto de farmaco que tiene la Formula D:
Figure imgf000190_0002
Ab-(D)p.
33. El compuesto del parr. 31, en el que el anticuerpo se une al resto de farmaco a traves de un residuo de cistelna del anticuerpo.
34. El compuesto del parr. 33 en el que p es de 2 a 5.
35. El compuesto del parr. 31 en el que p es de 2 a 8.
36. El compuesto del parr. 31 en el que p es de 2 a 5.
37. El compuesto de los parrs. 31 o 33 que tiene la formula:
Figure imgf000191_0001
en la que L es un anticuerpo y R17 es alquilen C1-C10-, -carbociclo C3-C8-, -O-(alquil Ci-Cs)-, -arileno-, -alquilen Ci-Cio-arilen-, -arilen-alquilen C1-C10-, -alquilen C1-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-Cs)-alquilen C1-C10-, -heterociclo C3-C8-, -alquilen C1-C10-(heterociclo C3-C8)-, -(heterociclo C3-C8)-alquilen C1-C10 -, -(CH2CH2O)r- y -(CH2CH2O)r-CH2-; y r es un numero entero de entre 1-10.
38. El compuesto del parr. 37 que tiene la formula:
Figure imgf000191_0002
en la que w y y son cada uno 0.
39. El compuesto del parr. 37 o 38 en el que D tiene la formula:
Figure imgf000191_0003
40. El compuesto del párr. 31 que tiene la fórmula:
Figure imgf000191_0004
41. El compuesto del párr. 31 que tiene la fórmula:
Figure imgf000192_0001
42. El compuesto del parr. 31 que tiene la formula:
Figure imgf000192_0002
43. El compuesto de uno cualquiera de los parrs. 40 a 42 en el que D tiene la formula:
Figure imgf000192_0003
44. El compuesto del parr. 31 que tiene la formula:
Figure imgf000192_0004
45. El compuesto del parr.31 en el que w es un numero entero en el intervalo de 2 a 12.
46. El compuesto del parr.31 en el que w es 2.
47. El compuesto del parr.46 en el que Ww es -valina-citrulina-.
48. El compuesto del parr. 45 en el que Ww es acido 5-aminovalerico, homofenilalanina lisina, tetraisoquinolinacarboxilato de lisina, ciclohexilalanina lisina, acido isonepecotico lisina, beta-alanina lisina, glicina serina valina glutamina y acido isonepecotico.
49. El compuesto del parr. 31, en el que D tiene la formula:
Figure imgf000193_0001
50. El compuesto del parr. 31, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
51. El compuesto del parr. 31, en el que el anticuerpo es un anticuerpo biespeclfico.
52. El compuesto del parr. 31, en el que el anticuerpo es un anticuerpo quimerico.
53. El compuesto del parr. 31, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
54. El compuesto del parr. 31, en el que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.
55. El compuesto del parr. 54, en el que el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab.
56. El compuesto del parr. 31, en el que una cantidad sustancial del resto de farmaco no se escinde del anticuerpo hasta que el compuesto se internaliza en una celula con un receptor de superficie celular especlfico para el anticuerpo del compuesto.
57. El compuesto del parr. 31, en el que la biodisponibilidad del compuesto o un metabolito intracelular del compuesto en un mamlfero se mejora cuando se compara con un compuesto farmacologico que comprende el resto de farmaco del compuesto.
58. El compuesto del parr. 31, en el que la biodisponibilidad del compuesto o un metabolito intracelular del compuesto en un mamlfero se mejora cuando se compara con un analogo del compuesto que no tiene el resto de farmaco.
59. El compuesto del parr. 31 en el que el resto de farmaco se escinde intracelularmente en un mamlfero del anticuerpo del compuesto, o un metabolito intracelular del compuesto.
60. Un compuesto que tiene las formulas:
Figure imgf000193_0002
o
Figure imgf000193_0003
en la que mAb es un anticuerpo monoclonal y
Figure imgf000194_0001
es un resto bioisostero de fenilalanina, se define de acuerdo con uno cualquiera de los parrs. 1 a 27.
61. El compuesto del parr. 60 en el que el anticuerpo es BR96 quimerico, AC10 quimerico, 1F5 humanizado, M195 humanizado, 2F2 humanizado, S2C6 humanizado o 1F6 humanizado..
62. El compuesto del parr. 29, en el que la unidad de enlazador (LU) comprende:
Figure imgf000194_0002
en la que -A- es una unidad de extensor, a es 0 o 1, cada -W- es independientemente una unidad de aminoacido, w es un numero entero en el intervalo de 0 a 12, -Y- es una unidad espaciadora, e y es 0, 1 o 2.
63. El compuesto del parr. 30, en el que la unidad de enlazador comprende:
-Aa-Ww-Yy-
en la que
-A- es una unidad de extensor,
a es 0 o 1,
cada -W- es independientemente una unidad de aminoacido, w es un numero entero en el intervalo de 0 a 12, -Y- es a unidad espaciadora, e
y es 0, 1 o 2.
64. Un compuesto que tiene la formula:
Figure imgf000194_0004
o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato del mismo, en la que,
L- es una unidad de ligando;
-A- es una unidad de extensor;
a es 0 o 1;
cada -W- es independientemente una unidad de aminoacido;
w es un numero entero en el intervalo de 0 a 12;
cada n es independientemente 0 o 1;
p es un numero entero de entre 1 a 20; y
cada aparicion de D es independientemente un resto de farmaco que tiene la Formula D:
Figure imgf000194_0003
R se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-C8;
R3 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8 , arilo, alquil-arilo C1-C8, X1-(carbociclo C3-C8 ), heterociclo C3-C8 y X1-(heterociclo C3-C8);
R4 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8 , arilo, X1-arilo, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y X1-(heterociclo C3-C8);
R5 se selecciona entre el grupo que consiste en H y metilo;
o R4 y R5 forman juntos un anillo carbociclico y tiene la formula -(CRaRb)n- en la que Ra y Rb se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo Ci-Cs y carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre el grupo que consiste en 2, 3, 4, 5 y 6;
R6 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo Ci-Cs;
R7 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo Ci-Cs, carbociclo C3-C8 , arilo, X1- arilo, X1-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y X1-(heterociclo C3.Cs);
cada R8 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, OH, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8 y O-(alquilo C1-C8);
cada X1 es independientemente alquileno C1-C10; y
el resto -NR9Z1 es un bioisostero de fenilalanina de acuerdo con uno cualquiera de los parrs. 28 a 27.
65. El compuesto del parr. 64 en el que w es un numero entero en el intervalo de 2 a 12.
66. El compuesto o sal farmaceuticamente aceptable o solvato del compuesto de acuerdo con uno cualquiera de los parrs. 28 a 65 en el que la unidad de ligando es un anticuerpo.
67. El compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable o solvato del compuesto del parr. 66, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
68. El compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable o solvato del compuesto del parr. 67 en el que el anticuerpo monoclonal es BR96 quimerico, AC10 quimerico, 1F5 humanizado, M195 humanizado, 2F2 humanizado, S2C6 humanizado o 1F6 humanizado.
69. El compuesto de acuerdo con uno cualquiera de los parrs. 28 a 68 que tienen las formulas
Figure imgf000195_0002
o una sal farmaceuticamente aceptable o solvato del mismo, en la que el resto bioisostero de fenilalanina
Figure imgf000195_0001
se define de acuerdo con uno cualquiera de los parrs. 28 a 27.
70. El compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable o solvato del compuesto de uno cualquiera de los parrs.
28 a 69 que esta en forma aislada y purificada.
71. El compuesto del parr. 31 en el que el anticuerpo se une a CD20, CD30, CD33, CD40, CD70, BCMA o antlgeno Y de Lewis.
72. El compuesto del parr. 46 en el que Ww es -fenilalanina-lisina-.
73. El compuesto del parr. 46 en el que Ww es -N-metil valina-citrulina-.
74. Una composicion farmaceutica que comprende una cantidad eficaz del compuesto de uno cualquiera de los parrs. 1 a 73, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, y un diluyente, vehlculo o excipiente farmaceuticamente aceptables.
75. La composicion farmaceutica del parr. 74 que comprende ademas una cantidad terapeuticamente eficaz de agente quimioterapeutico seleccionado de un inhibidor de formacion de tubulina, un inhibidor de topoisomerasa y un aglutinante de ADN.
76. Un metodo para destruir o inhibir la proliferacion de celulas tumorales o celulas cancerosas que comprende tratar celulas tumorales o celulas cancerosas con una cantidad del compuesto de cualquiera de los parrs. 1 a 73, o una de sus sales o solvatos farmaceuticamente aceptables, siendo eficaces para destruir o inhibir la proliferacion de las celulas tumorales o celulas cancerosas.
77. Un metodo para tratar el cancer que comprende administrar a un paciente una cantidad del compuesto o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo de cualquiera de los parrs. 1 a 73, siendo dicha cantidad efectiva para tratar el cancer.
78. El metodo del parr. 77 que comprende ademas administrar una cantidad eficaz de un agente anticancerlgeno adicional, un agente inmunosupresor o un agente antiinfeccioso.
79. Un metodo para tratar una enfermedad autoinmune, que comprende administrar a un paciente una cantidad del compuesto o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo de cualquiera de los parrs. 1 a 73, siendo la cantidad efectiva para tratar la enfermedad autoinmune.
80. Un metodo para tratar una enfermedad infecciosa, que comprende administrar a un paciente una cantidad del compuesto o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo de cualquiera de los parrs. 1 a 73, siendo la cantidad efectiva para tratar la enfermedad infecciosa.
81. El metodo de 80, en el que el compuesto es una formulacion que comprende un diluyente, vehlculo o excipiente farmaceuticamente aceptable.
82. El metodo del parr. 80, que comprende ademas administrar una cantidad eficaz de un agente anticancerlgeno adicional.
83. El metodo del parr. 80, que comprende ademas administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente inmunosupresor.
84. El metodo del parr. 80, que comprende ademas administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente antiinfeccioso.
85. El metodo del parr. 80 en el que la cantidad de compuesto administrado al paciente esta en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg de peso del paciente
86. El metodo del parr. 80 en el que el compuesto se administra a intervalos de aproximadamente tres semanas.
87. El metodo del parr. 80 en el que dicho compuesto se administra por via parenteral o intravenosa.
88. El metodo del parr. 80 en el que dicho compuesto esta formulado con un vehlculo parenteral farmaceuticamente aceptable.
89. El metodo del parr. 80, en el que el compuesto se formula en una forma inyectable de dosificacion unitaria.
90. El metodo de cualquiera de los parrs. 76 a 89, en el que el paciente es un ser humano.
91. Un metodo para inhibir la proliferacion celular que comprende:
la exposicion de celulas de mamlferos en un medio de cultivo celular al compuesto conjugado de farmaco de anticuerpo de cualquiera de los parrs. 28 a 73, y midiendo una actividad citotoxica del compuesto, por lo que se inhibe la proliferacion de las celulas.
92. El metodo del parr. 91 que comprende ademas cultivar las celulas durante un perlodo de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 5 dlas.
93. El metodo del parr. 91 en el que las celulas de mamlfero son celulas tumorales de mama SK-BR-3.
94. El metodo del parr. 91 en el que la actividad citotoxica del compuesto es mas del doble que la de un compuesto de farmaco que consiste esencialmente en el resto de farmaco del compuesto.
95. Un metodo para tratar el cancer que comprende administrar a un paciente una formulacion de un compuesto de uno cualquiera de los parrs. 28 a 73 y un diluyente, vehlculo o excipiente farmaceuticamente aceptables. 96. El metodo del parr. 95 en el que la cantidad de compuesto administrado al paciente esta en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg de peso del paciente.
97. El metodo del parr. 95 en el que el compuesto se administra a intervalos de aproximadamente tres semanas.
98. El metodo del parr. 95 en el que dicho compuesto se administra por via parenteral.
99. El metodo del parr. 98 en el que dicho compuesto esta formulado con un vehlculo parenteral farmaceuticamente aceptable.
100. El metodo del parr. 95 en el que dicho compuesto se formula en una forma inyectable de dosificacion unitaria.
101. El metodo del parr. 95 en el que dicho compuesto se administra por via intravenosa.
102. Un metodo para inhibir el crecimiento de celulas tumorales que sobreexpresan un antlgeno asociado a tumor que comprende administrar a un paciente un compuesto conjugado de farmaco de anticuerpo de uno de los parrs.
28 a 73 que se une especlficamente a dicho antlgeno asociado a tumor, y un agente quimioterapeutico en el que dicho conjugado de farmaco de anticuerpo y dicho agente quimioterapeutico se administran cada uno en cantidades eficaces para inhibir el crecimiento de celulas tumorales en el paciente.
103. El metodo del parr. 102 en el que dicho compuesto conjugado de farmaco de anticuerpo sensibiliza las celulas tumorales a dicho agente quimioterapeutico.
104. El metodo del parr.102 en el que el anticuerpo del compuesto es un anticuerpo inhibidor del crecimiento.
105. El metodo del parr.102 en el que el compuesto induce la muerte celular.
106. El metodo del parr.102 en el que el compuesto induce apoptosis.
107. El metodo del parr. 102 en el que el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama, ovario, estomago, endometrio, glandula salival, pulmon, rinon, colon, colorrectal, tiroides, pancreas, prostata y vejiga. 108. El metodo del parr.102 en el que el anticuerpo del compuesto es un fragmento de anticuerpo.
109. El metodo del parr.102 en el que el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab.
110. Un ensayo para detectar celulas cancerosas que comprende:
exponer las celulas a un compuesto conjugado farmacologico de anticuerpos de cualquiera de los parrs. 28 a 73 y determinando la extension de la union del compuesto a las celulas.
111. El ensayo del parr. 110 en el que la extension de la union se determina midiendo los niveles de acido nucleico que codifica antlgeno asociado a tumor mediante hibridacion in situ fluorescente (FISH).
112. El ensayo del parr. 110 en el que el grado de union se determina mediante inmunohistoqulmica (fflC). 113. Un artlculo de fabricacion que comprende un compuesto conjugado de farmaco de anticuerpo de uno cualquiera de los parrs. 28 a 73; un recipiente; y un prospecto o etiqueta que indica que el compuesto se puede usar para tratar el cancer caracterizado por la sobreexpresion de al menos uno de CD20, CD30, CD33, CD40, CD70, BCMA y antlgeno Y de Lewis.
114. Un compuesto que tiene la formula:
L-[(LU)o-r(D)i-4]P
en la que L es un ligando, LU es una unidad de enlazador y cada D es una unidad de farmaco como se proporciona en el presente documento.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto que tiene la formula:
Figure imgf000199_0001
o una sal o un solvato de mismo farmaceuticamente aceptables, en la que:
R2 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo Ci-Cs;
R3 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo Ci-Cs, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo Ci-Cs, X1-(carbociclo C3-Cs), heterociclo C3-C8 y X1-(heterociclo C3-Cs);
R4 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8 alquilo, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, alquil C1-Cs-(carbociclo C3-Cs), heterociclo C3-C8 y X1-(heterociclo C3-Cs);
R5 se selecciona entre el grupo que consiste en H y metilo;
o R4 y R5 forman juntos un anillo carboclclico y tiene la formula -(CRaRb)n- en la que Ra y Rb se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8 y carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre el grupo que consiste en 2, 3, 4, 5 y 6;
R6 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-Cs;
R7 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, X1-(carbociclo C3-Cs), heterociclo C3-C8 y X1-(heterociclo C3-Cs);
cada Rs se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, OH, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8 y O-(alquilo C1-Cs);
cada X1 es independientemente alquileno C1-C10;
el resto -NR9Z1 es un bioisostero de fenilalanina con con una cadena lateral de aminoacido modificado en donde el resto bioisostero de fenilalanina
Figure imgf000199_0002
tiene la estructura:
Figure imgf000199_0003
2. Un compuesto que tiene la formula:
Figure imgf000199_0004
o una sal o un solvato farmaceuticamente aceptables del mismo,
en la que,
L- es una unidad de ligando;
LU es una unidad de enlazador;
p es un numero entero de 1 a aproximadamente 20; y
D es un resto de farmaco que tiene la Formula D:
Figure imgf000200_0001
R2 se selecciona entre el grupo que consiste en hidrogeno y alquilo Ci-Cs;
R3 se selecciona entre el grupo que consiste en hidrogeno, alquilo Ci-Cs, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo Ci-Cs, X1-(carbociclo C3-Cs), heterociclo C3-Cs y X1-(heterociclo C3-Cs);
R4 se selecciona entre el grupo que consiste en hidrogeno, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, X1- arilo, alquil C1-C8 alquil-(carbociclo C3-Cs), heterociclo C3-Cs y X1-(heterociclo C3-Cs);
R5 se selecciona entre el grupo que consiste en hidrogeno y metilo;
o R4 y R5 forman juntos un anillo carboclclico y tiene la formula -(CRaRb)n- en la que Ra y Rb se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en hidrogeno, alquilo C1-C8 y carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre el grupo que consiste en 2, 3, 4, 5 y 6;
R6 se selecciona entre el grupo que consiste en hidrogeno y alquilo C1-Cs;
R7 se selecciona entre el grupo que consiste en hidrogeno, alquilo C1-C8, carbociclo Cs-Cs, arilo, X1-arilo, X1-(carbociclo Cs-Cs), heterociclo Cs-Cs y X1-(heterociclo Cs-Cs);
cada Rs se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrogeno, OH, alquilo C1-Cs, carbociclo C3-Cs y 0-(alquilo C1-Cs);
cada X1 es independientemente alquileno C1-C10; y
el resto -NR9Z1 es un bioisostero de fenilalanina de acuerdo con la reivindicacion 1,
en donde, opcionalmente, el compuesto tiene la formula:
L-LU-D
o una sal o un solvato farmaceuticamente aceptables del mismo;
o
(ii) LU-(D)1-4
o una sal o un solvato farmaceuticamente aceptables del mismo
en la que,
LU- es una unidad de enlazador; y
D es un resto de farmaco que tiene la Formula D:
Figure imgf000200_0002
de acuerdo con la parte (i).
3. El compuesto de acuerdo con la reivindicacion 2, en donde el compuesto es un compuesto que tiene la Formula la':
Ab-(Aa-Ww-Yy- (D) 1 -Op la’
o una sal o un solvato farmaceuticamente aceptables del mismo, en la que:
Ab es un anticuerpo,
A es una unidad de extensor,
a es 0 o 1,
cada W es independientemente una unidad de aminoacido,
w es un numero entero en el intervalo de 0 a 12,
Y es una unidad espaciadora, e
y es 0, 1 o 2,
p es un numero entero de entre 1 a 20, y
D es un resto de farmaco que tiene la Formula D:
Figure imgf000201_0004
4. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 3:
(a) en la que p es de 2 a 5;
(b) que tiene la formula:
Figure imgf000201_0001
en la que L es un anticuerpo y R17 es alquilen C1-C10-, -carbociclo C3-C8-, -O-(alquil C1-C8)-, -arileno-, -alquilen C1-C10-arilen-, -arilen-alquilen C1-C10-, -alquilen C1-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8)-alquilen C1-C10-, -heterociclo C3-C8-, -alquilen C1-C10-(heterociclo C3-C8)-, -(heterociclo C3-C8)-alquilen C1-C10-, -(CH2CH2O)r- y -(CH2CH2O)r-CH2-; y r es un numero entero de entre 1-10;
opcionalmente en donde w e y son cada uno 0;
y opcionalmente en donde D tiene la formula:
Figure imgf000201_0002
(c) que tiene la formula:
Figure imgf000201_0003
opcionalmente en donde D tiene la formula:
Figure imgf000202_0001
(d) que tiene la formula:
Figure imgf000202_0002
opcionalmente en donde D tiene la formula:
Figure imgf000202_0003
(e) que tiene la formula:
Figure imgf000202_0004
opcionalmente en donde D tiene la formula:
Figure imgf000202_0005
(f) que tiene la formula:
Figure imgf000203_0001
(g) en donde w es un numero entero en el intervalo de 2 a 12, opcionalmente en donde Ww es acido 5-aminovalerico, homofenilalanina lisina, tetraisoquinolinacarboxilato lisina, ciclohexilalanina lisina, acido isonepecotico lisina, beta-alanina lisina, glicina serina valina glutamina y acido isonepecotico;
(h) en donde w es 2, opcionalmente en donde Ww es -valina-citrulina-;
(i) en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal;
(j) en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo;
(k) en donde una cantidad sustancial del resto de farmaco no se escinde del anticuerpo hasta que el compuesto no se internaliza en una celula con un receptor de superficie celular especlfico para el anticuerpo del compuesto; (l) en donde el anticuerpo se une a CD20, CD30, Cd 33, CD40, CD70, BCMA o al antlgeno Y de Lewis.
5. Un compuesto que tiene las formulas:
Figure imgf000203_0004
o
Figure imgf000203_0005
en las que mAb es un anticuerpo monoclonal y
Figure imgf000203_0002
es un resto bioisostero de fenilalanina como se define de acuerdo con la reivindicacion 1.
6. Un compuesto que tiene la formula:
Figure imgf000203_0003
o una sal o un solvato farmaceuticamente aceptables del mismo,
en la que,
L- es una unidad de ligando;
-A-es una unidad de extensor;
a es 0 o 1;
cada -W- es independientemente una unidad de aminoacido;
w es un numero entero en el intervalo de 0 a 12;
cada n es independientemente 0 o 1;
p es un numero entero de 1 a 20; y
cada aparicion de D es independientemente un resto de farmaco que tiene la Formula D:
Figure imgf000204_0001
R2 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-C8;
R3 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquil-arilo C1-C8, X1-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y X1-(heterociclo C3-C8);
R4 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y X1-(heterociclo C3-C8);
R5 se selecciona entre el grupo que consiste en H y metilo;
o R4 y R5 forman juntos un anillo carboclclico y tiene la formula -(CRaRb)n- en la que Ra y Rb se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8 y carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre el grupo que consiste en 2, 3, 4, 5 y 6;
R6 se selecciona entre el grupo que consiste en H y alquilo C1-C8;
R7 se selecciona entre el grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, X1-arilo, X1-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y X1-(heterociclo C3-C8);
cada R8 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en H, OH, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8 y O-(alquilo C1-C8);
cada X1 es independientemente alquileno C1-C10; y
el resto -NR9Z1 es un bioisostero de fenilalanina de acuerdo con la reivindicacion 1.
7. Una composicion farmaceutica que comprende una cantidad eficaz del compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, y un diluyente, un vehlculo o un excipiente farmaceuticamente aceptables.
8. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o una sal o un solvato farmaceuticamente aceptables del mismo, que es eficaz para destruir o inhibir la proliferacion de las celulas tumorales o celulas cancerosas, para uso en un metodo para matar o inhibir la proliferacion de celulas tumorales o celulas cancerlgenas.
9. El compuesto o una sal o un solvato farmaceuticamente aceptables del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, siendo dicha cantidad eficaz para tratar el cancer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa, para uso en un metodo para tratar una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en cancer, enfermedad autoinmune y una enfermedad infecciosa.
10. Un metodo para inhibir la proliferacion celular, que comprende:
exponer celulas de mamlfero en un medio de cultivo celular al compuesto conjugado de farmaco de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, y medir una actividad citotoxica del compuesto, por lo que se inhibe la proliferacion de las celulas.
11. Un artlculo de fabricacion que comprende un compuesto conjugado de farmaco de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6; un recipiente; y un prospecto o una etiqueta que indican que el compuesto se puede usar para tratar el cancer caracterizado por la sobreexpresion de al menos uno de CD20, CD30, CD33, CD40, CD70, BCMA y antlgeno Y de Lewis.
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