CN106518963A - Auristatin衍生物及其与接头片段的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种Auristatin衍生物以及Auristatin衍生物-接头片段的合成方法,该方法采用全固相合成的方式,这种方法能够降低产品的杂质,提高产品的收率,缩短生产周期。其主要步骤如下:将各氨基酸或者其它化合物片段依次偶联到树脂上,将得到的树脂多肽进行裂解,按需求再偶联上氨基酸或者其它化合物片段,得到Auristatin衍生物以及Auristatin衍生物-接头片段。
Description
技术领域:
本发明是一种关于Auristatin衍生物以及Auristatin衍生物-接头片段的合成新方法,这种方法能够降低产品的杂质,提高产品的收率,缩短生产周期。
技术背景:
抗体-药物偶联物(ADCs,Antibody-drug conjugate)是近年的研究热点,其主要的作用机制是运用抗体(Antibody)将药物(Drug)靶向运输到靶细胞(如肿瘤细胞),在靶组织或者靶细胞内释放药物。Takeda/Seattle Genetics在原有ADC技术的基础上,通过一定的技术改进,利用自己的抗体偶联技术开发了新型ADC,brentuximab vedotin(商品名Adcetris),于2011年被FDA批准用于治疗霍奇金淋巴瘤和***性间变性大细胞淋巴瘤。
ADCs药物主要由三部分组成,分别是Antibody(抗体)、Linker(接头)和Payload(药物弹头),其中抗体(Antibody)和药物弹头(Payload)部分通过接头(Linker)相连,弹头部分包括MMAE,MMAD和MMAF等一系列化合物,mc-Valine-citrulline-PABC(Vc)等是最常用的接头,目前合成ADC最常用的方法是将药物弹头-接头合成好后将其与抗体蛋白偶联就可以得到ADC,而药物弹头-接头的合成方法主要是分别合成药物和接头后,在液相中将药物和接头偶联起来,其合成方法分别可以见US7750116,US2005238649,WO2007008603,WO2014072888。
由于austatin衍生物以及药物弹头-接头的合成主要在液相中进行,液相中合成时需要将氨基酸进行重复的保护脱保护,使得反应变得特别冗长,而且中间体需要不断的重结晶或者纯化,降低了反应的收率。得到的衍生物及药物弹头-接头杂质较多,纯化比较困难,由于这些难题的存在,austatin衍生物以及药物弹头-接头的大量生产变的较难实现而且价格非常昂贵。
1963年,Merrifield首次提出了固相多肽合成方法,这个在多肽化学上具有里程碑意义的合成方法,一出现就由于其合成方便,迅速,成为多肽合成的首选方法,带来了多肽有机合成上的一次革命,后来经过Lou Carpino等人的努力,将Fmoc方法用于固相多肽的合成并且方法逐渐成熟,经典的Fmoc方法是将多肽的C端固定于树脂上,将N端裸露,用缩合试剂将C端裸露的氨基酸连接到上一个氨基酸的氨基上,脱除该氨基酸氨基上的Fmoc保护后,连接下一个氨基酸,直到肽链的完成,最终将整个肽链从树脂上裂解下来进行纯化就可以得到纯品多肽。跟液相法合成多肽相比,固相方法的羧基端不需要保护,多肽合成过程中的过量的反应物可以简单除去,从而大大的缩短了反应周期。
经过多年业界人员的努力,已经有了多种树脂可以选择,例如2Cl-CTC,Wang树脂,MBHA树脂,THP树脂等,在工业上已经可以大规模的提供,使得固相合成多肽的工业化成为了可能。
文中所使用的英文和英文缩写注明如下:
Aib 2,2’-二甲基甘氨酸
Ala 丙氨酸
Boc 叔丁氧羰基
BOP-Cl 双(2-氧代’-3-恶唑烷基)次磷酰氯
Cit 瓜氨酸
Dap (2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-吡咯酮-2-基)丙酸
DCC 二环己基碳二亚胺
DEPT 3-(二乙氧基磷酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮
DIC N,N'-二异丙基碳二亚胺
DIEA(DIPEA) N,N-二异丙基乙胺
Dil (3R,4S)-3-甲氧基-5-甲基-4-甲氨基己酸
DMAP 4-二甲氨基吡啶
DMF N,N-二甲基甲酰胺
EEDQ 2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉
Fmoc 笏甲氧羰基
Fmoc-OSu 9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯
HATU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
HBTU 苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
HCTU 6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯
HOAt N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑
HOBt 1-羟基苯并***
MMAD 单甲基澳瑞他汀D
MMAE 单甲基澳瑞他汀E
MMAF 单甲基澳瑞他汀F
NMeVal N-甲基缬氨酸
NMM N-甲基吗啉
PAB 4-氨基二苯甲酮
PABC 4-氨基苯乙酸
Phe 苯丙氨酸
Phe-OMe 苯丙氨酸甲酯
pNP 对硝基苯酚
PyAoP (3H-1,2,3-***并[4,5-B]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鏻六氟磷酸盐
PyBoP 六氟磷酸苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基磷
PyBroP 三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐
T3P 1-丙基磷酸酐
TBTU O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯
TFA 三氟乙酸
TPTU 2-(2-吡啶酮-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐
Val 缬氨酸
发明内容:
本专利旨在解决austatin衍生物及其与接头片段合成过程中的杂质多,周期长的问题,本方法采用全固相合成的方法解决这些问题。
其中#1表示与羰基碳的连接位点,R1可以是H,甲基,Fmoc,Boc或者接头,R2可以是H或者1-8个C的任意碳链,R3可以是H或者1-8个C的任意碳链,D是下式的基团
其中
#2表示与氮原子的连接位点,
R4是氢或甲基,
R5是异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基,
或者
R4和R5与它们所键合的碳原子一起形成下式的(1S,2R)-2-苯基环丙烷-1,1-二基基团
其中
#3表示与相邻氮原子的连接位点,
#4表示与羰基的连接位点,
在其中存在N-O部分的环A是下式的任选地被取代的单环或二环杂环
其中
#5表示与羰基的连接位点,
R9是氢、羟基或苄氧基,
R6是氢或甲基,
R7是异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基,
或者
R6和R7与它们所键合的碳原子一起形成下式的(1S,2R)-2-苯基环丙烷-1,1-二基基团
其中
#6表示与相邻氮原子的连接位点,
#7表示与基团T1的连接位点,
T1是式-C(C=O)-OR10、-C(C=O)-NR11R12、-C(C=O)-NH-NH-R13或-CH2-O-R14的基团,
其中
R10是氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基,
R11是氢或甲基,
R12是氢、甲基、乙基、正丙基或苄基,
或者
R11和R12与它们所键合的氮原子一起形成4-7元杂环,
R13是苯甲酰基,
R14是苄基,其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代,
R8是氢、甲基、羧基或下式的基团
其中
#8表示与-CHC(R17)-T2的连接位点,
R15是苯基,其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代,
R16是苯基,其可以被甲氧基羰基或羧基取代,
R17是氢或羟基,
T2是苯基、苄基、1H-吲哚-3-基或1H-吲哚-3-基甲基。
本发明提供两个技术方案:
当D为非Phe基团时,技术方案一包括以下几个步骤:
(1)将Fmoc-Dap-OH偶联到树脂上,将保护基脱除,进行下一步顺序偶联,直到完成Val-Dil-Dap-树脂。
(2)R1是H或者甲基时,偶联好Z后将得到的多肽到树脂上裂解下来。
(3)R1为接头或者其他结构时,将R1按照顺序偶联完成后从树脂上裂解下来。
(4)将(2)(3)得到的片段与D的片段进行偶联后,得到产物,如果有保护基团,则需要根据实际需求脱除后得到最终产物。
当D为Phe基团时,技术方案二包括以下几个步骤:
(1)将Fmoc-Phe-OH偶联到树脂上,将保护基脱除,进行下一步顺序偶联,直到完成Val-Dil-Dap-Phe-树脂。
(2)R1为接头或者其他结构(不包括H或者甲基)时,将R1按照顺序偶联完成后从树脂上裂解下来,得到产物。
根据技术方案一
步骤(1)中我们采用的Fmoc保护的氨基酸为Fmoc-Dap-OH,Fmoc-Dil-OH,Fmoc-Val-OH。
步骤(1)中,本专利采用2Cl-Trt树脂或者Wang树脂,取代度在0.2-2.0mol/g之间均可,考虑到工业化生产的需要,2Cl-Trt树脂优选的树脂取代度在0.3-1.6mmol/g。Wang树脂优选的树脂取代度0.3-1.8mmol/g。
步骤(1)中偶联第一个氨基酸到树脂上时,Wang树脂采用DIC/HOBt/DMAP,2Cl-Trt树脂采用DIEA或者NMM。
步骤(1)中使用到的缩合剂包括DIC/HOBt、DIC/HOAt,DCC/HOBt,DCC/HOAt,HATU/DIPEA,HBTU/DIPEA,TBTU/DIPEA,PyAOP/HOBt,PyBOP/HOBt,BOP-Cl,PyBrOP,T3P,EEDQ或者DECP,脱Fmoc的试剂为20%的哌啶/DMF。
步骤(1)中,当使用的树脂为2Cl-Trt树脂或者Wang树脂时,得到的Val-Dil-Dap-树脂结构如下:
步骤(3)中偶联Fmoc-PAB-pNP时,使用的是有机碱如DIPEA,NMM,2,6-二甲基吡啶或者他们的任意组合。
步骤(2)和步骤(3)中的缩合剂可以采用DIC/HOBt、DIC/HOAt,DCC/HOBt,DCC/HOAt,HATU/DIPEA,HBTU/DIPEA,TBTU/DIPEA,PyAOP/HOBt,PyBOP/HOBt,BOP-Cl,PyBrOP,T3P,EEDQ或者DECP,都能顺利进行反应,考虑到工业化生产成本的需要,优先选择DIC/HOBt作为缩合试剂,缩合试剂为氨基酸的2-4个当量。2Cl-Trt树脂选用的裂解液为1-3%TFA/DCM溶液,Wang树脂用的裂解液为95%TFA/DMF溶液。
步骤(3)中的R1包括以下结构:
步骤(3)中裂解液选择1-3%TFA/DCM溶液或者95%TFA/DMF溶液。
步骤(1)、(2)和(3)中,所述偶联氨基酸或者片段的方法,所得到的片段包括Dap-树脂,Dil-Dap-树脂,Val-Dil-Dap-树脂,NMeVal-Val-Dil-Dap-树脂,Boc-NMeVal-Val-Dil-Dap-树脂,Fmoc-NMeVal-Val-Dil-Dap-树脂,PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-树脂,Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-树脂,Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-树脂以及mc-Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-树脂。
步骤(2)和(3)中,从树脂上裂解下来的片段包括Fmoc-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH,Boc-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH,Boc-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH,Fmoc-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH,Boc-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH,Fmoc-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH,Boc-Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH,Fmoc-Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH及Mal-Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH,NMeVal-Val-Dil-Dap-OH,PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH,Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH,Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH及Mal-Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH。
步骤(4)中D的结构式包含但不限于以下结构:
步骤(4)偶联好D片段后,如果R1为Fmoc,则采用20%哌啶/DMF,如果R1为Boc,则采用比例为95/5的TFA/H2O脱除。如果D上存在叔丁基,采用比例为95/5的TFA/H2O同时脱除。根据技术方案二
步骤(1)中我们采用的Fmoc保护的氨基酸为Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Dap-OH,Fmoc-Dil-OH,Fmoc-Val-OH。
步骤(1)中,本专利采用2Cl-Trt树脂或者Wang树脂,取代度在0.2-2.0mol/g之间均可,考虑到工业化生产的需要,2Cl-Trt树脂优选的树脂取代度在0.3-1.6mmol/g。Wang树脂优选的树脂取代度0.3-1.8mmol/g。
步骤(1)中偶联第一个氨基酸到树脂上时,Wang树脂采用DIC/HOBt/DMAP,2Cl-Trt树脂采用DIEA或者NMM。
步骤(1)中使用到的缩合剂包括DIC/HOBt、DIC/HOAt,DCC/HOBt,DCC/HOAt,HATU/DIPEA,HBTU/DIPEA,TBTU/DIPEA,PyAOP/HOBt,PyBOP/HOBt,BOP-Cl,PyBrOP,T3P,EEDQ或者DECP,脱Fmoc的试剂为20%的哌啶/DMF。
步骤(2)中偶联Fmoc-PAB-pNP时,使用的是有机碱如DIEA,NMM,2,6-二甲基吡啶或者他们的任意组合。
步骤(2)中的缩合剂可以采用DIC/HOBt、DIC/HOAt,DCC/HOBt,DCC/HOAt,HATU/DIPEA,HBTU/DIPEA,TBTU/DIPEA,PyAOP/HOBt,PyBOP/HOBt,BOP-Cl,PyBrOP,T3P,EEDQ或者DECP,都能顺利进行反应,考虑到工业化生产成本的需要,优先选择DIC/HOBt作为缩合试剂,缩合试剂为氨基酸的2-4个当量。2Cl-Trt树脂选用的裂解液为1-3%TFA/DCM溶液,Wang树脂用的裂解液为95%TFA/DMF溶液。
步骤(2)中的R1包括以下结构:
步骤(2)中裂解液选择1-3%TFA/DCM溶液或者95%TFA/DMF溶液。
步骤(2)中D的结构式包含但不限于以下结构:
步骤(2)中,所得到的片段包括PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-树脂,Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-树脂,Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-树脂,Mal-Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-树脂及Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-树脂。
步骤(2)中,从树脂上裂解下来的片段包括PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH,Fmoc-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH,Fmoc-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH,Fmoc-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH,Boc-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH,Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH,Fmoc-Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH,Boc-Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH,Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH。
具体实施方式:
本反应中使用到的试剂及相关原料都来自于普通市售。
实施例一MMAD的合成
将Fmoc-Dap-OH(1.0eq.)和DIPEA(4.0eq.)溶于干燥的DCM中,加入2Cl-Trt树脂后搅拌2个小时,抽干并用DCM洗涤两次,加入甲醇和DIPEA进行封端处理,然后再抽滤,用DCM洗涤三次,DMF洗涤三次,DCM再洗涤三次后抽干,取出树脂在室温下真空干燥5小时后,在得到的Fmoc-Dap-树脂中加入20%哌啶/DMF溶液后,搅拌30分钟,抽干,加入DMF洗涤五次后,抽干直接进行下一步反应。
将Fmoc-Dil-OH(1.5eq.)、HOBt(3.0eq.)加入DMF溶解,冷却到0摄氏度,加入DIC进行活化10分钟,加入到上步得到的树脂中,室温下搅拌3.5小时,抽滤,用DMF洗涤5遍,抽干,加入20%哌啶/DMF溶液后,搅拌30分钟分钟,抽干,加入DMF洗涤五次后,抽干直接进行下一步反应。
将Fmoc-Val-OH(3eq.),DEPT(3eq.),DIPEA(3.3eq.)加入到上步得到的树脂中,加入DMF溶解,反应搅拌3小时,抽干反应液,加入DMF洗涤5次后用20%哌啶/DMF溶液脱除保护基进行下一步。
将Fmoc-NMeVal-OH(3eq.),DEPT(3eq.),DIPEA(3.3eq.)加入到上步得到的树脂中,加入DMF溶解,反应搅拌3小时,抽干反应液,用DMF溶液洗涤三遍后用甲醇洗涤3遍,抽干溶液,干燥树脂后加入2%TFA/DCM溶液,加入DIPEA中和过量的TFA后真空除去多余的溶剂。
将上面得到的固体中加入DMF溶解后,加入(S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙胺(1.1eq.),DEPT(1.1eq.),DIPEA(1.1eq.)后搅拌5小时后用HPLC监控反应已经完成,将反应溶液真空蒸出溶剂后得到Fmoc-MMAD,用20%哌啶/DMF溶液脱去Fmoc保护,将得到的产品倒入***中,析出的固体过滤,将过滤的产品用HPLC纯化就可以得到MMAD。
实施例二Aib取代的MMAD的合成
将Wang树脂与Fmoc-Dap-OH(1.1eq.)加入到DMF中,加入DIC(2eq.),HOBt(2eq.),DMAP(0.2eq.),反应搅拌三个小时后,抽干,用DMF洗涤树脂5遍后加入甲醇,DIC,HOBt和DMAP封端,抽干,用DMF洗涤3遍后甲醇洗涤3遍,抽干待用。在得到的Fmoc-Dap-树脂中加入20%哌啶/DMF溶液后,搅拌30分钟,抽干,加入DMF洗涤五次后,抽干直接进行下一步反应。
将Fmoc-Dil-OH(1.5eq.)、HOBt(3.0eq.)加入DMF溶解,冷却到0摄氏度,加入DIC进行活化10分钟,加入到上述实验得到的树脂中,室温下搅拌3.5小时,抽滤,用DMF洗涤5遍,抽干,在树脂中加入20%哌啶/DMF溶液后,搅拌30分钟分钟,抽干,加入DMF洗涤五次后,抽干直接进行下一步反应。
将Fmoc-Val-OH(3eq.),DEPT(3eq.),DIPEA(3.3eq.)加入到树脂中,加入DMF溶解,反应搅拌3小时,抽干反应液,加入DMF洗涤5次后用20%哌啶/DMF溶液脱除保护基进行下一步。
在上述方法得到的Val-Dil-Dap-Wang Resin中加入DMF,将Fmoc-Aib-OH(3eq.),DEPT(3eq.),DIPEA(3.3eq.)加入到树脂中,搅拌三个小时后,茚三酮检测呈阴性,抽干反应液,用DMF溶液洗涤三遍后用甲醇洗涤3遍,抽干溶液,干燥树脂后加入95/5的TFA/H2O溶液,搅拌三个小时后,过滤,将滤液倒入***中析出固体,将固体洗涤几遍后干燥。
将上面得到的估计加入DMF溶解后,加入(S)-2-苯基-1-(噻唑-2-基)乙胺(1.1eq.),DEPT(1.1eq.),DIEA(1.1eq.)后搅拌5小时后用HPLC监控反应已经完成,将反应溶液真空蒸出溶剂后得到Fmoc保护的产物,用20%哌啶/DMF溶液脱去Fmoc保护,将得到的产品倒入***中,析出的固体过滤,将过滤的产品用HPLC纯化就可以得到Aib取代的MMAD。
实施例三VcMMA-PHE的合成
在根据实施例一中的方法得到Fmoc-NMeVal-Val-Dil-Dap-Resin中,加入20%用哌啶/DMF溶液后搅拌三十分钟,抽干,加入DMF洗涤五次后,抽干直接进行下一步反应。
将Fmoc-PAB-PNP(1.5eq.)加入到以上所得到的树脂中,加入DIPEA(4eq.),2,6-二甲基吡啶(4eq.)和HOAt(0.2eq.),搅拌3小时后,取出少量裂解,用HPLC监控反应完成,加入20%用哌啶/DMF溶液后搅拌三十分钟,抽干,加入DMF洗涤五次后,抽干直接进行下一步反应。
将Fmoc-Cit-OH(3eq.)、HOBt(3.0eq.)加入DMF溶解,冷却到0摄氏度,加入DIC进行活化10分钟,加入到上一步得到的树脂中,室温下搅拌3.5小时,抽滤,用DMF洗涤5遍,抽干,加入20%哌啶/DMF溶液后,搅拌30分钟分钟,抽干,加入DMF洗涤五次后,抽干直接进行下一步反应。用这种方法依次偶联Fmoc-Val-OH及6-马来酰胺基己酸后,用2%TFA/DCM将mc-Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap从树脂上切割下来。用***将得到的粗品反复洗涤后干燥得到mc-Val-Cit-PAB-NMeVal-Dap用于最后一步偶联反应。将mc-Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap溶解于NMP/DMF(1:1)的溶液中,加入Phe-OMe(1.2eq.),PyBrOP(3.0eq.)后,反应室温下搅拌8小时后,HPLC检测反应完成,将产品倒入***中析出固体后,将固体过滤洗涤,HPLC纯化后得到产品。
实施例四VcMMAF的合成
将Fmoc-Phe-OH(1.0eq.)和DIPEA(4.0eq.)溶于干燥的DCM中,加入2Cl-Trt树脂后搅拌2个小时,抽干并用DCM洗涤两次,加入甲醇和DIPEA进行封端处理,然后再抽滤,用DCM洗涤三次,DMF洗涤三次,DCM再洗涤三次后抽干,取出树脂在室温下真空干燥5小时后,在得到的Fmoc-Phe-树脂中加入20%哌啶/DMF溶液后,搅拌30分钟,抽干,加入DMF洗涤五次后,抽干直接进行下一步反应。
将Fmoc-Dap-OH(1.5eq.)、HOBt(3.0eq.)加入DMF溶解,冷却到0摄氏度,加入DIC进行活化10分钟,加入到上步得到的树脂中,室温下搅拌3.5小时,抽滤,用DMF洗涤5遍,抽干,加入20%哌啶/DMF溶液后,搅拌30分钟,抽干,加入DMF洗涤五次后,抽干直接进行下一步反应。
将Fmoc-Dil-OH(1.5eq.)、HOBt(3.0eq.)加入DMF溶解,冷却到0摄氏度,加入DIC进行活化10分钟,加入到上步得到的树脂中,室温下搅拌3.5小时,抽滤,用DMF洗涤5遍,抽干,加入20%哌啶/DMF溶液后,搅拌30分钟,抽干,加入DMF洗涤五次后,抽干直接进行下一步反应。
将Fmoc-Val-OH(3eq.),DEPT(3eq.),DIPEA(3.3eq.)加入到上步得到的树脂中,加入DMF溶解,反应搅拌3小时,抽干反应液,加入DMF洗涤5次后用20%哌啶/DMF溶液脱除保护基进行下一步。
将Fmoc-NMeVal-OH(3eq.),DEPT(3eq.),DIPEA(3.3eq.)加入到上步得到的树脂中,加入DMF溶解,反应搅拌3小时,抽干反应液,用DMF溶液洗涤三遍后用甲醇洗涤3遍,
在根据上述方法得到Fmoc-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-Resin中,加入20%用哌啶/DMF溶液后搅拌三十分钟,抽干,加入DMF洗涤五次后,抽干直接进行下一步反应。
将Fmoc-PAB-PNP(1.5eq.)加入到以上所得到的树脂中,加入DIPEA(4eq.),2,6-二甲基吡啶(4eq.)和HOAt(0.2eq.),搅拌3小时后,取出少量裂解,用HPLC监控反应完成,加入20%用哌啶/DMF溶液后搅拌三十分钟,抽干,加入DMF洗涤五次后,抽干直接进行下一步反应。
将Fmoc-Cit-OH(3eq.)、HOBt(3.0eq.)加入DMF溶解,冷却到0摄氏度,加入DIC进行活化10分钟,加入到上一步得到的树脂中,室温下搅拌3.5小时,抽滤,用DMF洗涤5遍,抽干,加入20%哌啶/DMF溶液后,搅拌30分钟,抽干,加入DMF洗涤五次后,抽干直接进行下一步反应。用这种方法依次偶联Fmoc-Val-OH及6-马来酰胺基己酸后,用2%TFA/DCM将粗品从树脂上切割下来,经过制备HPLC纯化就可以得到纯的VcMMAF。
Claims (10)
1.一种制备以下austatin及其衍生物的固相合成方法,
其中#1表示与羰基碳的连接位点,
R1可以是H,甲基,Fmoc,Boc或者以下接头,
R2可以是H或者1-8个C的任意碳链,
R3可以是H或者1-8个C的任意碳链,
D是下式的基团
其中
#2表示与氮原子的连接位点,
R4是氢或甲基,
R5是异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基,
或者
R4和R5与它们所键合的碳原子一起形成下式的(1S,2R)-2-苯基环丙烷-1,1-二基基团
其中
#3表示与相邻氮原子的连接位点,
#4表示与羰基的连接位点,
在其中存在N-O部分的环A是下式的任选地被取代的单环或二环杂环
其中
#5表示与羰基的连接位点,
R9是氢、羟基或苄氧基,
R6是氢或甲基,
R7是异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、苯基、苄基、1-羟基乙基、4-羟基苄基、4-羟基-3-硝基苄基、4-羟基-3-氨基苄基、1-苯基乙基、二苯基甲基、1H-咪唑-4-基甲基或1H-吲哚-3-基甲基,
或者
R6和R7与它们所键合的碳原子一起形成下式的(1S,2R)-2-苯基环丙烷-1,1-二基基团
其中
#6表示与相邻氮原子的连接位点,
#7表示与基团T1的连接位点,
T1是式-C(C=O)-OR10、-C(C=O)-NR11R12、-C(C=O)-NH-NH-R13或-CH2-O-R14的基团,
其中
R10是氢、甲基、乙基、正丙基、叔丁基、苄基或金刚烷基甲基,
R11是氢或甲基,
R12是氢、甲基、乙基、正丙基或苄基,
或者
R11和R12与它们所键合的氮原子一起形成4-7元杂环,
R13是苯甲酰基,
R14是苄基,其可以在苯基中被甲氧基羰基或羧基取代,
R8是氢、甲基、羧基或下式的基团
其中
#8表示与-CHC(R17)-T2的连接位点,
R15是苯基,其可以被甲氧基羰基、羧基或式-S(O)2OH的基团取代,
R16是苯基,其可以被甲氧基羰基或羧基取代,
R17是氢或羟基,
T2是苯基、苄基、1H-吲哚-3-基或1H-吲哚-3-基甲基,
当D不为Phe基团时,技术方案一包括以下几个步骤:
(1)将Fmoc-Dap-OH偶联到树脂上,将保护基脱除,进行下一步顺序偶联,直到完成Val-Dil-Dap-树脂。
(2)R1是H或者甲基时,偶联好Z后将得到的多肽到树脂上裂解下来。
(3)R1为接头或者其他结构时,将R1按照顺序偶联完成后从树脂上裂解下来。
(4)将(2)(3)得到的片段与D的片段进行偶联后,得到产物,如果有保护基团,则需要根据实际需求脱除后得到最终产物。
2.根据权利要求1的所述的方法,偶联使用到的缩合剂包括DIC/HOBt,DIC/HOAt,DCC/HOBt,DCC/HOAt,HATU/DIPEA,HBTU/DIPEA,TBTU/DIPEA,PyAOP/HOBt,PyBOP/HOBt,BOP-Cl,PyBrOP,T3P,EEDQ或者DECP。
3.根据权利要求1所述偶联氨基酸或者片段的方法,所得到的片段包括Dap-树脂,Dil-Dap-树脂,Val-Dil-Dap-树脂,NMeVal-Val-Dil-Dap-树脂,Boc-NMeVal-Val-Dil-Dap-树脂,Fmoc-NMeVal-Val-Dil-Dap-树脂,PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-树脂,Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-树脂,Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-树脂以及
mc-Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-树脂。
4.根据权利要求1和权利要求3,其特征在于,所选用的固相树脂包括Wang树脂和2Cl-Trt树脂。
5.根据权利要求3和权利要求4,中间体Val-Dil-Dap-wang树脂结构和中间体Val-Dil-Dap-2Cl-Trt树脂结构如下:
6.根据权利要求1所述,从树脂上裂解下来的片段包括Fmoc-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH,Boc-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH,Boc-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH,Fmoc-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH,Boc-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH,Fmoc-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH,Boc-Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH,Fmoc-Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH及
Mal-Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH,NMeVal-Val-Dil-Dap-OH,PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH,Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH,Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH及mc-Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-OH。
7.一种制备以下austatin及其衍生物的固相合成方法,
其中#1表示与羰基碳的连接位点,
R1可以是Fmoc,Boc或者以下接头,
R2可以是H或者1-8个C的任意碳链,
R3可以是H或者1-8个C的任意碳链,
D是下式的基团:
技术方案二包括以下几个步骤:
(1)将Fmoc-Phe-OH偶联到树脂上,将保护基脱除,进行下一步顺序偶联,直到完成Val-Dil-Dap-Phe-树脂。
(2)R1为接头或者其他结构(不包括H或者甲基)时,将R1按照顺序偶联完成后从树脂上裂解下来,得到产物。
8.根据权利要求7所述偶联氨基酸或者片段的方法,所得到的片段包括
PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-树脂,Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-树脂,
Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-树脂,
mc-Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-树脂。
9.根据权利要求8,其特征在于,所选用的固相树脂包括Wang树脂和2Cl-Trt树脂。
10.根据权利要求7所述,从树脂上裂解下来的片段包括PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH,Fmoc-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH,Fmoc-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH,Fmoc-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH,Boc-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH,Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH,Fmoc-Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH,Boc-Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH,Val-Cit-PAB-NMeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH。
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CN109824759A (zh) * | 2019-03-08 | 2019-05-31 | 联宁(苏州)生物制药有限公司 | 一种用于抗体药物偶联物的药物-连接子mc-mmaf的制备方法及其中间体 |
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WO2007008603A1 (en) * | 2005-07-07 | 2007-01-18 | Seattle Genetics, Inc. | Monomethylvaline compounds having phenylalanine side-chain modifications at the c-terminus |
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WO2020181686A1 (zh) * | 2019-03-08 | 2020-09-17 | 联宁(苏州)生物制药有限公司 | 一种用于抗体药物偶联物的药物-连接子mc-mmaf的制备方法及其中间体 |
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