CN109912684A - 一种用于抗体药物偶联物的药物-连接子mc-mmaf的制备方法及其中间体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于抗体偶联药物的药物‑连接子MC‑MMAF的制备方法及其中间体。本发明的制备方法提高了N端的反应活性，从而有效的控制了消旋反应的发生；不直接使用毒素MMAF，而采用毒性较低的片段肽，降低了大量生产时的操作难度；无需反相制备，操作简便。

Description

一种用于抗体药物偶联物的药物-连接子MC-MMAF的制备方法 及其中间体
技术领域
本发明涉及有机合成领域，特别涉及一种用于抗体药物偶联物的药物-连接子MC-MMAF的制备方法及其中间体。
背景技术
抗体药物偶联物(Antibody drug conjugate，简称ADC)是一类新型的抗肿瘤药物，其原理是将细胞毒素连接在抗体上，通过抗体对癌细胞表面特定抗原的识别，通过内吞作用进入癌细胞，从而将细胞毒素运输到靶点，达到靶向性治疗恶性肿瘤的目的。ADC与传统的小分子抗肿瘤药物相比，因能借助抗体的靶向识别性与毒素的高活性，故更具备特异性和有效性。
ADC包括三个不同的组成部分，即抗体、连接子和细胞毒素。抗体实现靶向性，连接子保证在ADC在血液转运过程中的稳定性，而到达作用靶点后，毒素发挥对癌细胞的杀伤作用。根据作用机制的不同，适用于ADC的毒素分为微管类抑制剂(Microtubuleinhibitors)，DNA损伤剂(DNA damaging agents)，RNA聚合酶抑制剂(RNA polymeraseinhibitors)等。目前，市场上销售和临床试验中的ADC所采用的毒素主要为微管类抑制剂，主要包括基于海兔毒素(Dolastatin-based)设计的化合物，比如MMAE、MMAF和MMAD，以及基于美登素(Maytansine-based)设计的化合物，比如DM1和DM4。连接子方面，主要应用的为不可裂解型，如缬氨酸-瓜氨酸(Valine-Citriline)和环己基甲酸(MCC)，经过溶酶体水解后，药物仍然具有活性，并通过连接区与某个氨基酸残基结合在一起。
抗体药物偶联物的形成方式有多种。既可以通过抗体上的氨基或巯基和药物连接子进行化学反应偶联，也可以对抗体进行修饰，在抗体上引入特定功能基后，再和药物连接子进行化学反应偶联或酶催化反应偶联。本发明涉及的抗体药物偶联物MC-MMAF结构如下所示。
目前文献报道的MC-MMAF的合成路线为使用毒素MMAF与MC-hex-Acid(1-马来酰亚胺基正己酸)发生脱水反应，得到MC-MMAF。MMAF的结构为：
文献报道的合成方案为：
该路线MMAF的N终端缬氨酸的N上带有一个甲基，位阻较大，在这种情况下，将1-马来酰亚氨基正己酸接到MMAF上反应速度就会较慢，即使采用不同的酰胺缩合剂，也会造成MMAF的苯丙酰胺基连接的手性碳消旋。该路线用于小于1g的MC-MMAF合成，最后要应用高压反相制备除去异构杂质，产率低于50％。
该反应路线在放大生产时表现出一定的缺陷，比如：1.该方法因为缩合剂会同时活化MMAF上的羧基，而造成30-50％的消旋，形成难以除去的异构体杂质，影响产率；2.由于前述的位阻原因，反应时间长，杂质多，给反应的后处理和纯化造成困难；3.最终产物需要高压反相制备除去异构体，增加操作成本；4.直接应用毒素MMAF为原料，在大量合成操作上需做好防护，选择好防护设备，为生产操作带来障碍。
发明内容
一方面，针对现有技术存在的缺陷，本发明提供一种MC-MMAF的合成方法，该反应的关键是用结构式为的化合物与MMAF的结构片段肽Dap-Phe-OH发生缩合反应直接得到MC-MMAF或其盐，R选自氢、琥珀酰亚胺基、五氟苯基、对硝基苯基、邻苯二甲酰胺基中的一种或多种。
Dap-Phe-OH的化学结构如下所示：
本发明的上述目的采用以下技术方案来实现。
该合成方法包括如下步骤：1)将化合物溶解于合适的溶剂中，与Dap-Phe-OH发生酰胺缩合反应，得到MC-MMAF。
优选地，在步骤1)中，所述合适的溶剂选自二氯甲烷、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、四氢呋喃、1,4-二氧六环和2-甲基四氢呋喃中的一种或多种；更优选地，所述合适的溶剂选自二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺中的一种或多种。
优选地，在步骤1)中，如R为氢，在试剂M的作用下加入试剂N，所述试剂M选自选自DCC、DCEP、EDC、DIC、HATU、HBTU、HBPIPU、HBPyU、HSPyU、HCTU、HOTU、HOTT、HSTU、HDMA、TATU、TBTU、TCTU、TCFH、TDBTU、TOTU、TOTT、TPTU、TFFH、BTFFH、TNTU、TSTU、COMU、T3P、BOP、PyBOP、PyBrOP、PyClOP、BrOP、PyAOP、PyCIU、CDI、TPSI、TSTU、DEPBT、DMTMM、EEDQ、CIP、CIB、DMC、HOBt和EDCI中的一种或多种；更优选地，所述试剂M选自EDCI、EDC、DIC、HOAt和HOBt中的一种或多种；进一步优选地，所述试剂M为EDCI、EDC或DIC与HOAt或HOBt的混合物；最优选地，所述试剂M为EDCI和HOBt的混合物。所述试剂N选自三乙胺、二异丙基乙胺(DIEA)、吡啶、N，N-二甲基-4-吡啶，优选为二异丙基乙胺(DIEA)。反应的反应温度为-20℃～40℃，优选为-10℃～25℃。
优选地，在步骤1)中，如R为珀酰亚胺基、五氟苯基、对硝基苯基、邻苯二甲酰胺基中的一种或多种，在试剂P的作用下，与Dap-Phe-OH发生反应，得到MC-MMAF。所述试剂P选自三乙胺、二异丙基乙胺(DIEA)、吡啶、N，N-二甲基-4-吡啶、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸锂和碳酸氢锂中的一种或多种，优选为碳酸钠，或二异丙基乙胺(DIEA)。反应温度为0℃～100℃，优选为15℃～50℃。
优选地，在步骤1)中，还包括在反应完成后，将MC-MMAF从反应液中分离的步骤。
优选地，所述分离包括通过减压蒸干溶剂，然后用中压色谱纯化或重结晶，以得到MC-MMAF。
本发明的制备方法提高了N端的反应活性，从而有效的控制了消旋反应的发生；不直接使用毒素MMAF，而采用毒性较低的片段肽，降低了大量生产时的操作难度；无需反相制备，操作简便。如上所述，该方法降低了操作难度，使得质量标准较易控制，制备百克级别都可以应用。
另一方面，本专利还提供合成MC-MMAF的中间体化合物，其结构式为其中，R选自氢、琥珀酰亚胺基、五氟苯基、对硝基苯基、邻苯二甲酰胺基中的一种。优选为如下化合物，如表1所示：
表1
再一方面，本发明还提供了一种合成的方法，合成步骤如下，
本路线中包含合成重要中间体D，该化合物之前没有合成方法的报道。
化合物D无法用不带保护基的多肽X合成，实验中得到多肽X自身缩合的产物。即下示合成路线无法直接合成化合物D。
本发明所采用的技术方案中，使用带保护基的多肽先合成化合物C，再在酸性条件下脱保护基得到化合物D。然而实验中发现化合物C和化合物D在酸性条件下很不稳定，分子中间的酰胺键会断裂，导致产率很低。经进一步研究发现，提高酸的浓度会大大增加脱保护基的速度，对副反应的速度提升不大。三氟乙酸浓度(该浓度指反应液中三氟乙酸在溶剂如二氯甲烷中的浓度)范围为30％～50％，优选为35％，脱保护基的反应会很快完成，然后立刻淬灭反应，最终可以把化合物D的产率从5％提高到50％。
副反应：
通过选择酸试剂，并控制酸浓度的反应条件，大大提高了化合物D的产率，使该路线具有应用于生产的可能。
本发明放弃已有的MMAF合成路线，把MC-MMAF看做一个整体来合成。其中最大的问题是MC连接子是反应活性比较高的片段，提前把MC接上去会使合成难度增加，本领域技术人员不会想到这一路线。我们通过很多研究，解决了提前引入MC片段化合物在合成中不稳定的问题，使这条整体合成路线能够实现。
如本文所用，常用的有机物缩写的定义及其相应的CAS号如表2所示：
表2
附图说明
图1是本发明合成的DMT-3的高效液相色谱图。
图2是本发明合成的化合物A的液相色谱图。
图3是本发明合成的化合物A的质谱图。
图4是本发明合成的化合物C的液相色谱图。
图5是本发明合成的化合物C的质谱图。
图6是本发明合成的化合物D的液相色谱图。
图7是本发明合成的化合物D的质谱图。
图8是本发明合成的化合物F的液相色谱图。
图9是本发明合成的化合物F的质谱图。
图10是本发明合成的目标产物MC-MMAF的液相色谱图。
图11是本发明合成的目标产物MC-MMAF的质谱图。
图12是本发明合成的目标产物MC-MMAF的核磁共振谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步非限制性的详细说明。需要指出的是，下述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
LCMS表示液质联用检测方法；HPLC表示高效液相色谱检测。
本发明所涉及的每一步反应的原料和试剂可从市场购得或依本发明所述方法制得。
本发明提供了一种合成MC-MMAF的方法，该合成方法包括如下步骤：
1)将化合物溶解于合适的溶剂中，所述合适的溶剂选自二氯甲烷、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、四氢呋喃、1,4-二氧六环和2-甲基四氢呋喃中的一种或多种，与Dap-Phe-OH发生酰胺缩合反应，得到MC-MMAF，Dap-Phe-OH结构式为
在步骤1)中，如R为氢，则在试剂M的作用下，加入试剂N，所述试剂M选自DCC、DCEP、EDC、DIC、HATU、HBTU、HBPIPU、HBPyU、HSPyU、HCTU、HOTU、HOTT、HSTU、HDMA、TATU、TBTU、TCTU、TCFH、TDBTU、TOTU、TOTT、TPTU、TFFH、BTFFH、TNTU、TSTU、COMU、T3P、BOP、PyBOP、PyBrOP、PyClOP、BrOP、PyAOP、PyCIU、CDI、TPSI、TSTU、DEPBT、DMTMM、EEDQ、CIP、CIB、DMC、HOBt和EDCI中的一种或多种；更优选地，所述试剂M选自EDCI、EDC、DIC、HOAt和HOBt中的一种或多种；进一步优选地，所述试剂M为EDCI、EDC或DIC与HOAt或HOBt的混合物；最优选地，所述试剂M为EDCI和HOBt的混合物。所述试剂N选自三乙胺、二异丙基乙胺(DIEA)、吡啶、N，N-二甲基-4-吡啶，优选为二异丙基乙胺(DIEA)。反应温度为-20℃～40℃，优选为-10℃～25℃。
在步骤1)中，如R为珀酰亚胺基、五氟苯基、对硝基苯基、邻苯二甲酰胺基中的一种或多种，则在试剂P的作用下，与Dap-Phe-OH发生反应，得到MC-MMAF。所述试剂P选自三乙胺、二异丙基乙胺(DIEA)、吡啶、N，N-二甲基-4-吡啶、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸锂和碳酸氢锂中的一种或多种，优选为碳酸钠，或二异丙基乙胺(DIEA)。反应温度为0℃～100℃，优选为15℃～50℃。
在步骤1)中，还包括在反应完成后，将MC-MMAF从反应液中分离的步骤，优选地，所述分离包括通过减压蒸干溶剂，然后用中压色谱纯化或重结晶，以得到MC-MMAF。
本发明还提供了一种合成的方法，使用带保护基的多肽与反应先合成化合物再在酸性条件下脱保护基得到化合物三氟乙酸浓度范围30％～50％，优选为35％，脱保护基的反应会很快完成，然后立刻淬灭反应，最终可以把化合物D的产率从5％提高到50％。
实施例1
本实施例的反应路线如下：
在3L三口瓶中，加入1.5L二氯甲烷和Dil.HCl(202.3g,0.683mol 1.0eq)，磁力搅拌，氮气保护，依次加入Z-Val-OH(163.23g,0.65mol，0.95eq)和HATU(311.6g,0.82mol，1.20eq)，室温搅拌30min钟后降温至冰浴，控温10度滴加DIEA(452.5ml，4.0eq)，滴加完毕，冰浴下搅拌30min后，移至室温，反应16h，HPLC检测，主峰为产品峰(保留时间29.98min)，原料Dil.HCl反应完全，反应结束。反应液以柠檬酸水溶液洗涤(2L*1),饱和碳酸氢钠溶液洗涤(2L*1),饱和食盐水洗涤(2L*1)，有机层以无水硫酸钠干燥后，抽滤，脱溶得粗品531g.该粗品溶于800ml甲醇，冰浴搅拌下滴加1.1ml(1mol/L)稀盐酸(约1小时)，室温搅拌12h，停止搅拌，分层，分离上层水层，下层产品以油泵拉干，得325g DMT-1,收率91％
在2L单口瓶中，加入800ml甲醇和DMT-1(LN114-38,325g,0.66mol)和110g Pd(OH)2/C，H2置换三次，室温反应5h，TLC监测原料DMT-1反应完全。于砂芯漏斗加入硅藻土，抽滤，并以1L甲醇洗涤滤饼，收集滤液,滤液蒸干，油泵抽至产品不起泡，得DMT-2 230.2g，纯度94％；收率：97％。
在3L三口瓶中，将DMT-2(LN114-40-01，230.2g，实际0.60mol,1.0eq)溶于500mlDCM中，充分搅拌，加入Fmoc-Me-val(202.6g，0.57mol，0.95eq)和HATU(292.9g,0.77mol，1.20eq)，再加入1L DCM,室温搅拌30min后降温至冰浴，控温10度滴加DIEA(212.7ml，2.0eq)，滴加完毕，冰浴下搅拌30min后，移至室温，反应16.0h，HPLC检测，主峰为产品峰(保留时间为36.00min)，原料DMT-2反应完全,反应结束。反应液以水洗涤(2.0L*1)，柠檬酸水溶液洗涤(2L*1),饱和碳酸氢钠溶液洗涤(2L*1),饱和食盐水洗涤(1L*1)，有机层以无水硫酸钠干燥后，抽滤，脱溶得粗品655g.该粗品溶于650ml甲醇，搅拌下滴加360ml(1mol/L)稀盐酸，室温搅拌12h，停止搅拌，分层，分离上层水层，如此两遍。下层产品以油泵拉干，得373g DMT-3,HPLC纯度为96.7％，收率90％。
将化合物DMT-3(5.0g，7.22mmol)和二乙胺(5mL)加入到二氯甲烷(20mL)，氮气保护下室温搅拌反应4小时，LCMS显示反应液中化合物DMT-3少于3％视为反应结束。反应液旋干，粗品用中压反相纯化(选用220g的工业填充C18反相柱)，纯化梯度水/乙腈(90/10-10/90,v/v),时间1小时。收集纯的产品冻干，得到白色固体化合物A(白色固体，3.15g，收率93％)。MS：472.26(M+H+)
将化合物B(1.77g，8.04mmol)、HATU(3.82g，10.05mmol)和DIEA(1.72g，13.4mmol)加入到二氯甲烷(50mL)，氮气保护下室温搅拌反应30分钟，再加入化合物A(3.15g，6.68mmol)，氮气保护下室温搅拌反应4小时，LCMS显示反应液中化合物A少于3％视为反应结束。反应液依次用柠檬酸水溶液(50mL)，饱和食盐水(50mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干，粗品用中压反相纯化(选用120g的工业填充C18反相柱)，纯化梯度水/乙腈(90/10-10/90,v/v),时间1小时。收集纯的产品冻干，得到白色固体化合物C(白色固体，3.86g，收率87％)。MS：665.37(M+H+)
将化合物C(3.86g，5.81mmol)溶于二氯甲烷和三氟乙酸的混合溶剂(20mL，2/1,v/v)，氮气保护下室温搅拌反应20分钟，LCMS显示反应液中化合物C少于5％视为反应结束。反应液加入40mL乙腈稀释，低温浓缩至约10mL体积，用中压反相纯化(选用220g的工业填充C18反相柱)，纯化梯度水/乙腈(90/10-10/90,v/v),时间2小时。收集纯的产品冻干，得到白色固体化合物D(1.59g，收率45％，)。MS：609.30(M+H+)
将化合物D(1.59g，2.61mmol)，化合物E(0.36g，3.13mmol)和化合物EDCI(0.60g，3.13mmol)溶于二氯甲烷(20mL)，氮气保护下室温搅拌反应2小时，LCMS显示反应液中化合物D少于5％视为反应结束。反应液用饱和食盐水(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干，粗品用中压反相纯化(选用40g的工业填充C18反相柱)，纯化梯度水/乙腈(90/10-10/90,v/v),时间1小时。收集纯的产品冻干，得到白色固体化合物F(白色固体，1.79g，收率97％)。MS：706.32(M+H+)
将化合物F(1.79g，2.53mmol)，化合物G(0.93g，2.78mmol)和DIEA(0.72g，5.56mmol)溶于二氯甲烷(20mL)，氮气保护下室温搅拌反应18小时，LCMS显示反应液中化合物F少于3％视为反应结束。反应液依次用柠檬酸水溶液(20mL)和饱和食盐水(20mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干，粗品用中压反相纯化(选用80g的工业填充C18反相柱)，纯化梯度水/乙腈(90/10-10/90,v/v),时间1小时。收集纯的产品冻干，得到白色固体化合物MC-MMAF(白色固体，2.01g，收率86％，HPLC纯度99％by UV 220nm)。MS：925.66(M+H+)

Claims (10)

1.一种合成MC-MMAF的中间体化合物，其结构式为：
其中，R选自氢、琥珀酰亚胺基、五氟苯基、对硝基苯基、邻苯二甲酰胺基中的一种。
2.一种合成MC-MMAF的方法，其特征在于，所述方法为使结构式为的化合物与结构式为的化合物在溶剂中发生缩合反应，
R为氢，反应时在试剂M的作用下，加入试剂N，所述试剂M选自DCC、DCEP、EDC、DIC、HATU、HBTU、HBPIPU、HBPyU、HSPyU、HCTU、HOTU、HOTT、HSTU、HDMA、TATU、TBTU、TCTU、TCFH、TDBTU、TOTU、TOTT、TPTU、TFFH、BTFFH、TNTU、TSTU、COMU、T3P、BOP、PyBOP、PyBrOP、PyClOP、BrOP、PyAOP、PyCIU、CDI、TPSI、TSTU、DEPBT、DMTMM、EEDQ、CIP、CIB、DMC、HOAt、HOBt和EDCI中的一种或多种，所述试剂N选自三乙胺、二异丙基乙胺(DIEA)、吡啶、N，N-二甲基-4-吡啶中的一种或多种；
所述溶剂选自二氯甲烷、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、四氢呋喃、1,4-二氧六环和2-甲基四氢呋喃中的一种或多种；
反应温度为-20℃～40℃。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述试剂M为EDCI和HOBt的混合物，所述试剂N为二异丙基乙胺(DIEA)。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，反应温度为-10℃～25℃。
5.一种合成MC-MMAF的的方法，其特征在于，所述方法为使结构式为的化合物与结构式为的化合物在溶剂中发生缩合反应，
R选自琥珀酰亚胺基、五氟苯基、对硝基苯基、邻苯二甲酰胺基中的一种或多种，在试剂P的作用下发生反应，所述试剂P选自三乙胺、二异丙基乙胺(DIEA)、吡啶、N，N-二甲基-4-吡啶、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸锂和碳酸氢锂中的一种或多种；
所述溶剂选自二氯甲烷、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、四氢呋喃、1,4-二氧六环和2-甲基四氢呋喃中的一种或多种；
反应温度为0℃～100℃。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，试剂P为碳酸钠或二异丙基乙胺(DIEA)。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，反应温度为15℃～50℃。
8.根据权利要求2-7任一项所述的方法，其特征在于，所述反应完成后，将MC-MMAF从反应液中分离。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述分离操作包括通过减压蒸干溶剂，然后用中压色谱纯化或重结晶。
10.一种合成的方法，其特征在于，用带保护基的多肽先与反应合成化合物再在酸性条件下脱保护基得到化合物其中，可选择三氟乙酸提供酸性条件，酸浓度范围为30％～50％。
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